CN113024436B - 一种检测还原应激下DNA靶向的Cys荧光分子探针及其制备方法和应用 - Google Patents
一种检测还原应激下DNA靶向的Cys荧光分子探针及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种检测还原应激下DNA靶向的Cys荧光分子探针及其制备方法和应用，所述荧光分子探针结构式如式（1）所示：
Description
技术领域
本发明涉及半胱氨酸检测技术领域，具体涉及一种检测还原应激下DNA靶向的Cys荧光分子探针及其制备方法和应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
半胱氨酸（Cys）作为一种生物硫醇在蛋白质合成、解毒、代谢、信号转导和基因调控等生物过程中发挥着重要作用。此外，Cys还对蛋白质的氧化还原状态和蛋白质结构的调控起着至关重要的作用。更重要的是，它参与许多重要功能的实现，例如，半胱氨酸（Cys）与多种人类疾病有关，如神经毒性、皮肤损伤、水肿、肌肉无力、嗜睡、生长缓慢、毛发脱色、心血管和阿尔茨海默病等。
近年来，分子荧光探针因为其高灵敏、高选择性和反应迅速等优点得到迅速发展，但大多数报道的探针都是在短波长下激发和发射。后来，因近红外激发和发射荧光探针对细胞和组织穿透深度深、组织自荧光和自吸收低以及对细胞损伤小等显著优点获得较多关注。除此之外，本发明人发现大多数检测Cys的荧光探针只能检测肿瘤细胞大环境下的Cys，而难以检测细胞器或亚细胞器内还原应激微环境下产生的Cys，然而，还原应激微环境下的Cys对揭示其循环作用更加重要。
发明内容
针对上述的问题，本发明提供一种检测还原应激下DNA靶向的Cys荧光分子探针及其制备方法和应用，其突出的光控特点有助于实时监测可能因DNA周围还原应激下Cys的表达异常而导致DNA复制过程出现差错而引起的疾病，并有望应用于有关Cys表达异常而导致的基因疾病的预防、治疗等。为实现上述目的，本发明公开如下的技术方案：
在本发明的第一方面，提供一种检测还原应激下DNA靶向的Cys荧光分子探针（简称为CPC），其结构式如式（1）所示：
式（1）。
在本发明的第二方面，提供一种检测还原应激下DNA靶向的Cys荧光分子探针（CPC）的制备方法，包括如下步骤：
（1）将溶解了三氯氧磷的CH2Cl2溶液加入到冷却的DMF和CH2Cl2形成的混合溶剂中，完成后继续加入环己酮，并将得到的混合液加热回流，完成后对得到的反应液冷却结晶，得到的固体产物记为产物1，备用。
（2）将2,3,3-三甲基吲哚和碘乙烷溶解在甲苯中，将得到的混合物加热回流，完成后将得到的反应液冷却结晶，将得到的固体产物洗涤干净，记为产物2，备用。
（3）将所述产物1、产物2、乙酸钠溶解在乙酸酐中，将得到的混合物进行加热反应，完成后将得到的反应液冷却结晶，将得到的固体产物洗涤干净后烘干，记为产物3，备用。
（4）将所述产物3和乙酸钠溶于无水溶剂中，然后在保护气氛中将得到的混合物加热反应，完成后用饱和碘化钾溶液洗涤得到的反应液，再用二氯甲烷萃取反应液，将得到的萃取液进行浓缩，然后对得到的固体产物进行纯化，纯化后产物记为产物4，备用。
（5）将4-溴甲基-3-硝基苯甲酸、二氯甲烷和DMF混合后冷却，然后加入草酰氯，待气体逸出停止，对反应液搅拌，反应完成后浓缩反应液，得4-溴甲基-3-硝基苯甲酰氯，备用。
（6）将所述产物4溶解在无水二氯甲烷中，然后在保护气氛下先加入三乙胺，再加入溶解在无水二氯甲烷中的所述4-溴甲基-3-硝基苯甲酰氯，并使反应在低于室温的冷却环境中进行，待反应液由红色变为绿色后继续在所述冷却环境下静置，然后将反应液恢复至室温并静置，反应完成后除去溶剂，对得到的固体产物进行纯化，纯化后产物记为产物5，备用。
（7）在二氯甲烷和在碳酸氢钠存在下，于保护气氛中用苯丁酸氮芥与所述产物5反应，反应结束后除去反应液中溶剂，对得到的固体产物进行纯化，即得所述荧光分子探针（简称为CPC）。
进一步地，所述步骤（1）中，加热回流的温度为20~40℃，时间为3~5h（小时，下同）。在本发明中，通过加热回流不仅有助于提高反应物的利用率，提高转化率，而且有助于减少反应物混入生成物中，提高产物的纯度。
进一步地，所述步骤（1）中，所述混合溶剂的温度需要控制在零下15~10℃；可选地，所述CH2Cl2和DMF的体积比=1:1~3:1。
进一步地，所述步骤（1）中，CH2Cl2溶液中三氯氧磷的浓度为0.3~0.9 μmol/L。
进一步地，所述步骤（2）中，2,3,3-三甲基吲哚和碘乙烷的摩尔比为5:9~2:3。
进一步地，所述步骤（2）中，加热回流的温度为80~100℃，时间为20h。同样地，本步骤中通过加热回流，不仅有助于提高反应物的利用率，提高转化率，而且有助于减少反应物混入生成物中，提高产物纯度。
进一步地，所述步骤（2）中，可以采用石油醚、DMF等中的任意一种对结晶得到的固体产物进行洗涤，以去除产物表面的残留液。
需要说明的是，所述（1）、（2）步骤中，产物1和产物2的制备顺序并无严格的眼球，即可以先制备产物1，再制备产物2，也可以先制备产物2，再制备产物1，或者产物1和产物2同时制备。基于此，上述（1）、（2）步骤的排序主要目的是便于技术方案的说明，并不构成特定的步骤执行顺序的限定。
进一步地，所述步骤（3）中，产物1、产物2、乙酸钠的添加比例依次序为1：3：0.5，摩尔比。所述乙酸酐的添加量能够充分溶解产物1、产物2和乙酸钠即可，技术人员可根据实际需要进行选择，本发明不做具体限定。
进一步地，所述步骤（3）中，所述加热反应温度为50~80℃，时间为3h；优选地，反应过程中对反应液进行搅拌，有助于促进反应进行。
进一步地，所述步骤（3）中，采用饱和的碳酸氢钠缓冲液洗涤固体产物，直到没有气泡出现，然后将固体产物用水洗涤后烘干，即可。通过采用饱和的碳酸氢钠缓冲液作为洗涤液有助于提纯和提高产率。
进一步地，所述步骤（4）中，产物3和乙酸钠的摩尔比为1:2，反应全程以铝箔操作，并暗箱避光。
进一步地，所述步骤（4）中，无水溶剂包括DMF、DMSO等中任意一种。需要说明的是，在溶解所述花菁荧光团和乙酸钠时，无水溶剂的添加量同样能够充分溶解花菁荧光团和乙酸钠即可，本发明不做具体限定。
进一步地，所述步骤（4）中，加热反应温度为80~90℃，时间为5h。
进一步地，所述步骤（5）中，冷却温度为0℃，以提高产率和保障安全。
进一步地，所述步骤（6）中，产物4、三乙胺、溶解在无水二氯甲烷中的4-溴甲基-3-硝基苯甲酰氯的添加比例依次序为1:0.1:2，摩尔比。
进一步地，所述步骤（6）中，低于室温的冷却环境是指温度为0~5℃的环境。
进一步地，所述步骤（7）中，二氯甲烷：NaHCO3：苯丁酸氮芥=20~30 mL：3~5g：0.2~0.5g。
进一步地，所述步骤（4）、（6）、（7）中，保护气氛包括惰性气体、氮气等中的任意一种。在本发明中，保护气氛的主要作用是排尽装置内的空气，有助于避免氧化及水分干扰问题。
进一步地，所述步骤（4）、（6）、（7）中，均可以采用二氯甲烷和甲醇洗脱的硅胶色谱法对固体产物进行纯化，以保证产物的纯度。
在本发明的第三方面，公开所述检测还原应激下DNA靶向的Cys荧光分子探针在分析化学、生命有机分析化学、生物遗传与变异、疾病预诊及医学临床检测等领域中的应用。
相较于现有技术，本发明具有以下有益效果：
（1）本发明提出的这种荧光分子探针以氮芥基团作为DNA靶向基团，通过实时光控使CPC产生CPD荧光分子，其以醛基为识别基团，在H2S辅助机制下，经硝基还原以及醛基的加成协同作用产生更加强烈的荧光信号，实现在近红外区特异性成像细胞内DNA附近还原应激下产生的Cys。
（2）本发明制备的荧光分子探针能够在肿瘤细胞内H2S的辅助下，结合了光控制（人为可控）/红发射（深层组织穿透）/DNA靶向/特异性（增强响应的选择性）检测Cys等功能，采用光损伤较小的红外光，由于激发光源波长较长，受光散射影响较小，使得入射光的损耗较小，对细胞的损伤小，在介质中的穿透性较好。
（3）本发明地这种荧光分子探针突出的光控特点有助于实时监测细胞内DNA附近还原应激下产生的Cys，实现了细胞器或亚细胞器内还原应激微环境下产生的Cys的检测，而且检测灵敏度高。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1为本发明第一实施例合成的荧光分子探针CPC的H谱。
图2为本发明第一实施例合成的荧光分子探针CPC的C谱。
图3为本发明第一实施例合成的荧光分子探针CPC的核磁共振谱。
图4为本发明第二实施例制备的分子探针CPD的H谱。
图5为本发明第二实施例制备的分子探针CPD的质谱。
图6为本发明第二实施例制备的分子探针CPD2的质谱。
图7为本发明第二实施例制备的分子探针CPD3的质谱。
图8为本发明第三实施例中分子探针CPD随光照时间变化的F725/F790比值图。
图9为本发明第三实施例中分子探针CPD随光照波长变化的F725/F790比值图。
图10为本发明第四实施例中分子探针CPD与不同浓度Cys反应后的荧光光谱图。
图11为本发明第四实施例中分子探针CPD与不同浓度H2S反应后的荧光光谱图。
图12为本发明第五实施例中干扰物对探针CPD的荧光强度的影响。
图13为本发明第五实施例中干扰离子对探针CPD荧光强度的影响。
图14为本发明第六实施例中探针CPD与Cys的反应时间响应图。
图15为本发明第六实施例中探针CPD与H2S的反应时间响应图。
图16为本发明第六实施例中探针CPC光解过程中的荧光光谱变化图。
图17为本发明第六实施例中探针CPC光解后加入Cys随时间强度变化图。
图18为本发明第六实施例中探针CPC光解后加入H2S随时间强度变化图。
图19为本发明第六实施例中 Cys和H2S与探针CPC反应的F/F0变化曲线。
图20为本发明第七实施例中探针CPC的组织细胞共聚焦成像图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。本发明所使用的试剂或原料均可通过常规途径购买获得，如无特殊说明，本发明所使用的试剂或原料均按照本领域常规方式使用或者按照产品说明书使用。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。本发明中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
正如前文所述，目前的大多数检测Cys的荧光探针只能检测肿瘤细胞大环境下的Cys，难以检测细胞器或亚细胞器内还原应激微环境下产生的Cys。为此，本发明提出一种检测还原应激下DNA靶向的Cys荧光分子探针及其制备方法和应用。现根据说明书附图和具体实施方式对本发明进一步说明。
第一实施方式
一种检测还原应激下DNA靶向的Cys荧光分子探针（CPC）的制备方法，其合成路线如路线1所示，具体地，包括如下步骤：
（1）将溶解了三氯氧磷（18.5mL，198mmol）的CH2Cl2（17.5mL）溶液缓慢滴加到零下10℃的DMF（20mL，258mmol）和CH2Cl2（20mL）混合溶剂中。加完后，通过注射器加入环己酮（5g，50mmol）。然后将得到的混合物搅拌回流3h，将混合物趁热（35度以上）倒入装满碎冰的烧杯中进行冷却结晶，待结晶完成后过滤得到黄色固体产物1.65 g（记为产物1）。
（2）将2,3,3-三甲基吲哚（6.1g，38.3mmol）和碘乙烷（10.74g，68.8mmol）溶解在30mL甲苯中，然后将得到混合物在100℃下搅拌回流20h，王传给你后将反应液冷却至室温并过滤，用石油醚洗涤德得到的粉红色固体产物11.3 g（记为产物1）。
（3）将所述产物（取0.70g，4.05mmol）、产物2（取2.67g，8.52mmol，）和乙酸钠（取0.35g，4.25mmol）溶解在25mL乙酸酐中，然后将得到的混合物加热至60℃并搅拌3h，反应完成后将得到的反应液冷却至室温，过滤出其中的固体产物，并用饱和的碳酸氢钠缓冲液对该固体产物进行洗涤，直到没有气泡出现。然后将固体用水洗涤两次，将洗涤干净的固体产物放入真空干燥箱烘干（40℃，3h），得到绿色固体产物1.64 g（记为产物3）。
（4）将所述产物3（0.2g，0.33mmol）和乙酸钠（0.56g，0.66mmol）溶于10ml无水DMF中。在Ar气保护下，于90℃条件下反应5h，然后用饱和碘化钾溶液洗涤反应所得液体三次，然后用二氯甲烷萃取（20ml）。将混合物在旋转蒸发仪上浓缩，得到的粗产物用二氯甲烷：甲醇=80：1（v:v）洗脱的硅胶色谱法进行纯化，得到红色固体产物0.1g（记为产物4）。
（5）在氩气保护下将4-溴甲基-3-硝基苯甲酸（0.2g，0.77mmol）、二氯甲烷（3.8ml）和DMF（0.1ml）混合后置于在冰水浴中（0-2℃），然后向该混合液中滴加草酰氯（0.195g，0.15mmol），待气体逸出停止，将得到的反应液搅拌3h，然后将该反应液再旋转蒸发仪上浓缩，得4-溴甲基-3-硝基苯甲酰氯。
（6））将所述产物4（0.1g，0.13mmol）溶解在无水二氯甲烷（5mL）中并在冰水浴中冷却至0℃，然后在氩气保护下先加入三乙胺（0.1ml），再逐滴加入溶解在无水二氯甲烷（5mL）中的所述4-溴甲基-3-硝基苯甲酰氯（0.2g，0.68mmol），反应产生白色烟雾，且反应液由红色变为绿色，将该反应液在0℃下反应30分钟，然后移开冰水浴并加热至室温保持5h。通过TLC监测反应完成后，蒸发除去反应液中的溶剂，并将得到的粗产物通过快速柱色谱法纯化（二氯甲烷：甲醇＝30∶1，v：v），得到绿色固体产物0.042g（记为产物5）。
（7）向氩气保护的二氯甲烷（10ml）中，先后添加碳酸氢钠（0.01g，0.11mmol）、苯丁酸氮芥（0.088g，0.29mmol）以及所述产物5（取0.1g，0.13mmol），室温6h后得到紫色溶液，将该紫色溶液在旋转蒸发仪上蒸干溶剂，得到的粗产物用二氯甲烷：甲醇=20：1（v:v）洗脱的硅胶色谱法纯化。得到绿色固体产物0.022g，即得荧光分子探针（CPC，记为产物6），其H谱、C谱、核磁共振谱分别如图1、图2、图3所示，从图中可以看出化合物6为预期目标分子。
路线1。
第二实施方式
本实施例中对第一实施例中制备的荧光分子探针（CPC）与Cys和H2S的反应可行性进行了研究，具体包括如下步骤：
（1）参考路线2，将所述CPC（10μM）置于HEPES缓冲液（pH=7.2，10mM）中，并于37°C用500nm波长下照射10min，产生探针CPD，其H谱和质谱分别如图4、图5所示，然后分别取21μMCys和20μM H2S加入后分别出现荧光，这说明CPC按照预期原理发生了反应，并得到了式（1）所示的产物。
路线2。
（2）参考路线3，将探针CPD加入HEPES缓冲液（pH7.2，10mM）中后于37°C孵育80min，然后加入21μM Cys，得待测液。制备六份相同的所述待测液，分别加入不同浓度的H2S（0μM、3μM、6μM、9μM、12μM、20μM），激发波长为680nm，发射波长为725nm。参考图6和图7，随着H2S的浓度逐渐增大，探针CPD的荧光强度越来越强，可见在H2S的辅助机制下，该探针特异性识别Cys的效果更好。
路线3。
第三实施方式
1、将探针CPC（10μM）加到HEPES缓冲液（pH7.2，10mM）中，控制温度在37°C，然后采用500nm波长的近红外光照射10min，结果如图8所示，可以看出：F725与F790nm的比值逐渐增大。
2、将探针CPC分别在不同波长（350nm，400nm，450nm，500nm，550nm，600nm)的近红外光下光照射10min，结果如图9所示，可以看出：F725与F790nm的比值在350nm，400nm，450nm，500nm的光照下逐渐增大，550nm光照下的F725与F790nm的比值保持不变，600nm的光照下F725与F790的比值逐渐降低，其中500nm光照下F725与F790的比值增加的最快。证明CPC最佳的光控分解条件是500nm左右。
第四实施方式
本实施例对第二实施例制备的探针CPD的光谱性质进行研究，包括：
1、探针CPD的激发波长为680nm，将探针CPD加入HEPES缓冲液（pH7.2，10mM）后于37°C孵育80min，加入Cys后发射波长为725nm。探针CPD与不同浓度Cys反应后的荧光光谱图如图10所示，可以看出：随着Cys的浓度的增加（0μM、3μM、6μM、9μM、12μM、15μM、18μM、21μMμM），荧光探针CPD的荧光强度逐渐增强。
2、将探针CPD加入HEPES缓冲液（pH7.2，10mM）后于37°C孵育80min，然后加入21μMCys，得待测液。制备六份相同的所述待测液，分别加入不同浓度的H2S（H2S:0μM、3μM、6μM、9μM、12μM、20μM），激发波长为680nm，发射波长为725nm。探针CPD与不同浓度H2S反应后的荧光光谱图如图11所示，可以看出：随着H2S的浓度逐渐增大，荧光探针CPD的荧光强度逐渐增强。
第五实施方式
本实施例对第二实施例制备的探针CPD的选择性进行了研究，包括：
1、对干扰物对荧光探针CPD的荧光强度的影响进行研究，具体如下：将探针CPD加入HEPES缓冲液（pH7.2，10mM）中后，按下列条件添加包括：1.Hcy（0.1mM）、2.Gsh（5mM）、3.Cystine（0.1mM） 4.Lys（0.1mM） 5.Tyr（0.1mM） 6.Gly（0.1mM） 7.Arg（0.1mM） 8.Try（0.1mM）、9.SO2（100μM）、10.H2S（20μM）、11.Cys（20μM）、12.Cys（20μM）+H2S（20μM）。
测试结果如图12所示（横坐标序号代表上述各干扰物），可以看出，相对于各种反应物种的荧光相对强度图，加入其他干扰物时，荧光强度并未明显增强。由此可得出，探针CPD对Cys有很强的选择性，并且可以发现在H2S的辅助下，探针检测Cys的荧光强度显著增加。
2、对干扰离子对荧光探针CPD的荧光强度的影响进行研究，具体如下：将探针CPD加入HEPES缓冲液（pH7.2，10mM）中后，干扰离子按下列剂量分别测试：
1.SO3 2-（100μM）、2.SO4 2-（100μM）、3.S2O3 2-（100μM）、4. HSO3 -（100μM）、5. NO2 -（100μM）、6. NO（100μM）、7.H2O2（100μM）、8.ONOO-（100μM）、9. ClO-(100 μM）、10.O2-（100μM）、11.-HO（100μM）、12. H2S（20μM）、13.Cys（20μM）、14. Cys（20μM）+H2S（20μM）。
测试结果如图13所示（横坐标序号代表上述各干扰物），可以看出，相对于各种反应物种的荧光相对强度图，加入其他干扰离子时，荧光强度并未明显增强，由此可得出，荧光探针CPD对Cys有很强的选择性，并且可以发现在H2S的辅助下，探针检测Cys的荧光强度显著增加。
第六实施方式
本实施例对第二实施例制备的探针CPD的时间依赖性进行了研究，包括：
1、探针分子与待测物的反应效率与反应程度在一定程度上受到反应时间的影响，反应时间也将决定最终信号的强度与稳定性。因此，本实施例在10μM的探针CPD中加入Cys（20μM），然后加入至HEPES缓冲液（pH7.2，10mM）中于37°C记录不同时间下的荧光强度。测试结果如图14所示，从图中可以看出，10μM的荧光探针CPD与Cys（20μM）溶液的反应在80min中达到稳定。
2、探针分子与待测物的反应效率与反应程度在一定程度上受到反应时间的影响，反应时间也将决定最终信号的强度与稳定性。因此，本实施例在10μM的探针CPD中加入H2S（20μM），然后加入至HEPES缓冲液（pH7.2，10mM）中于37°C记录不同时间下的荧光强度。测试结果如图15所示，从图中可以看出，最佳反应时间为100分钟左右。
3、将探针CPC（10μM）置于HEPES缓冲液（pH7.2，10mM）中，控制温度37°C，然后在500nm波长下照射该缓冲液10min。结果如图16所示，可以看出：探针CPC在800nm波长处的荧光强度逐渐降低，在725nm波长处的荧光强度逐渐升高，荧光光谱发生了显著的蓝移，这是因为在光的照射下CPC光解产生了CPD。
4、在探针CPC光解后加入Cys（20μM）和H2S（20μM），在37°C进行时间跟踪测试结果如图17和18所示，可以看出，刚开始两者的荧光强度可以忽略不计，随着时间的推移，Cys和H2S两者荧光强度都逐渐增强，但Cys的荧光强度明显大于H2S的荧光强度。如图19所示，相同的时间Cys的F/F0的明显要比H2S的F/F0大，表明Cys与探针CPC的反应速率明显快于H2S与探针的反应速率，并且两者的F/F0与时间成良好的线性关系。
第七实施方式
本实施例对第一实施例合成的荧光分子探针CPC的选择性检测组织细胞内还原应激下Cys的能力进行了验证，具体如下：
在37℃，PH=7.2环境下孵育细胞，向已经加入Cys培养好的组织细胞中，加入5μM的荧光探针CPC，通过500nm波长的近红外光使探针CPC光解产生CPD荧光分子。在加入探针CPC或CPC未光解前，该细胞内几乎没有荧光呈现。而通过光照控制CPC光解后，如图20所示，可以看到明显的荧光出现，而且随着时间的增加，CPD的产生的浓度越来越大，荧光强度也越来越强。当添加少量的H2S时荧光亮度进一步显著增强，说明H2S辅助机制增强了该探针的发光效率，由此证明了在光控制下，利用硫化氢的辅助机制，本发明实施例合成的荧光分子探针CPC可应用于组织细胞层面微环境下DNA附近因还原应激产生的Cys的特异性检测。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (23)
1.一种检测还原应激下DNA靶向的Cys荧光分子探针，其结构式如式（1）所示：
式（1）。
2.一种检测还原应激下DNA靶向的Cys荧光分子探针的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将溶解了三氯氧磷的CH2Cl2溶液加入到冷却的DMF和CH2Cl2形成的混合溶剂中，完成后继续加入环己酮，并将得到的混合液加热回流，完成后对得到的反应液冷却结晶，得到的固体产物记为产物1，备用；
（2）将2,3,3-三甲基吲哚和碘乙烷溶解在甲苯中，将得到的混合物加热回流，完成后将得到的反应液冷却结晶，将得到的固体产物洗涤干净，记为产物2，备用；
（3）将所述产物1、产物2、乙酸钠溶解在乙酸酐中，将得到的混合物进行加热反应，完成后将得到的反应液冷却结晶，将得到的固体产物洗涤干净后烘干，记为产物3，备用；
（4）将所述产物3和乙酸钠溶于无水溶剂中，然后在保护气氛中将得到的混合物加热反应，完成后用饱和碘化钾溶液洗涤得到的反应液，再用二氯甲烷萃取反应液，将得到的萃取液进行浓缩，然后对得到的固体产物进行纯化，纯化后产物记为产物4，备用；
（5）将4-溴甲基-3-硝基苯甲酸、二氯甲烷和DMF混合后冷却，然后加入草酰氯，待气体逸出停止，对反应液搅拌，反应完成后浓缩反应液，得4-溴甲基-3-硝基苯甲酰氯，备用；
（6）将所述产物4溶解在无水二氯甲烷中，然后在保护气氛下先加入三乙胺，再加入溶解在无水二氯甲烷中的所述4-溴甲基-3-硝基苯甲酰氯，并使反应在低于室温的冷却环境中进行，待反应液由红色变为绿色后继续在所述冷却环境下静置，然后将反应液恢复至室温并静置，反应完成后除去溶剂，对得到的固体产物进行纯化，纯化后产物记为产物5，备用；
（7）在二氯甲烷和在碳酸氢钠存在下，于保护气氛中用苯丁酸氮芥与所述产物5反应，反应结束后除去反应液中溶剂，对得到的固体产物进行纯化，即得所述荧光分子探针。
3.根据权利要求2所述的检测还原应激下DNA靶向的Cys荧光分子探针的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中，加热回流的温度为20~40℃，时间为3~5h。
4.根据权利要求2所述的检测还原应激下DNA靶向的Cys荧光分子探针的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中，所述混合溶剂的温度需要控制在零下15~10℃。
5.根据权利要求2所述的检测还原应激下DNA靶向的Cys荧光分子探针的制备方法，其特征在于，所述CH2Cl2和DMF的体积比=1:1~3:1。
6.根据权利要求2所述的检测还原应激下DNA靶向的Cys荧光分子探针的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中，CH2Cl2溶液中三氯氧磷的浓度为0.3~0.9 μmol/L。
7.根据权利要求2所述的检测还原应激下DNA靶向的Cys荧光分子探针的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中，2,3,3-三甲基吲哚和碘乙烷的摩尔比为5:9~2:3。
8.根据权利要求2所述的检测还原应激下DNA靶向的Cys荧光分子探针的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中，加热回流的温度为80~100℃，时间为20h。
9.根据权利要求2所述的检测还原应激下DNA靶向的Cys荧光分子探针的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中，可以采用石油醚、DMF中的任意一种对结晶得到的固体产物进行洗涤。
10.根据权利要求2所述的检测还原应激下DNA靶向的Cys荧光分子探针的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中，产物1、产物2、乙酸钠的添加比例依次序为1：3：0.5，摩尔比。
11.根据权利要求2所述的检测还原应激下DNA靶向的Cys荧光分子探针的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中，所述加热反应温度为50~80℃，时间为3h。
12.根据权利要求2所述的检测还原应激下DNA靶向的Cys荧光分子探针的制备方法，其特征在于，反应过程中对反应液进行搅拌。
13.根据权利要求2所述的检测还原应激下DNA靶向的Cys荧光分子探针的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中，采用饱和的碳酸氢钠缓冲液洗涤固体产物，直到没有气泡出现，然后将固体产物用水洗涤后烘干，即可。
14.根据权利要求2所述的检测还原应激下DNA靶向的Cys荧光分子探针的制备方法，其特征在于，所述步骤（4）中，产物3和乙酸钠的摩尔比为1:2。
15.根据权利要求2所述的检测还原应激下DNA靶向的Cys荧光分子探针的制备方法，其特征在于，所述步骤（4）中，无水溶剂包括DMF、DMSO中任意一种。
16.根据权利要求2所述的检测还原应激下DNA靶向的Cys荧光分子探针的制备方法，其特征在于，所述步骤（4）中，加热反应温度为80~90℃，时间为5h。
17.根据权利要求2所述的检测还原应激下DNA靶向的Cys荧光分子探针的制备方法，其特征在于，所述步骤（5）中，冷却温度为0℃。
18.根据权利要求2所述的检测还原应激下DNA靶向的Cys荧光分子探针的制备方法，其特征在于，所述步骤（6）中，产物4、三乙胺、溶解在无水二氯甲烷中的4-溴甲基-3-硝基苯甲酰氯的添加比例依次序为1:0.1:2，摩尔比。
19.根据权利要求2所述的检测还原应激下DNA靶向的Cys荧光分子探针的制备方法，其特征在于，所述步骤（6）中，低于室温的冷却环境是指温度为0~5℃的环境。
20.根据权利要求2所述的检测还原应激下DNA靶向的Cys荧光分子探针的制备方法，其特征在于，所述步骤（7）中，二氯甲烷：NaHCO3：苯丁酸氮芥=20~30mL：3~5g：0.2~0.5g。
21.根据权利要求2所述的检测还原应激下DNA靶向的Cys荧光分子探针的制备方法，其特征在于，所述步骤（4）、（6）、（7）中，保护气氛包括惰性气体、氮气中的任意一种。
22.根据权利要求2所述的检测还原应激下DNA靶向的Cys荧光分子探针的制备方法，其特征在于，所述步骤（4）、（6）、（7）中，采用二氯甲烷和甲醇洗脱的硅胶色谱法对固体产物进行纯化。
23.权利要求1所述的检测还原应激下DNA靶向的Cys荧光分子探针和/或权利要求2-21任一项所述的制备方法制备的荧光分子探针在分析化学、生命有机分析化学或生物遗传与变异领域中的应用。
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| Membrane permeable esterase-activated fluorescent imaging probe;Youngmi Kim，et al.;《Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters》;20071231;第17卷;第5054-5057页 * |
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