CN115557877A - 一类谷胱甘肽激活协同增强光热/化疗的前药化合物及其制备方法与应用 - Google Patents

一类谷胱甘肽激活协同增强光热/化疗的前药化合物及其制备方法与应用 Download PDF

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杜健军
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Abstract

本发明公开了一类谷胱甘肽激活协同增强光热/化疗的前药化合物及其制备方法与在癌细胞选择性杀伤和/治疗肿瘤的应用。第一个目的在于提供一类谷胱甘肽激活协同增强光热/化疗的前药化合物，该化合物通过L‑谷胱甘肽(GSH)同步激活光敏剂和化疗药物，实现对于癌细胞和正常细胞的选择性杀伤。第二个目的在于提供前药化合物的制备方法，在无水体系下，先将含有R2基团的吲哚化合物与2‑氯‑3‑(羟基亚甲基)‑1‑环己烯‑1‑甲醛反应得到化合物Ⅳ；再将化合物Ⅳ与以R3为对位取代的苯胺类化合物反应得到化合物Ⅴ；然后化合物Ⅴ与三光气以及含有R4基团的化合物反应，得到化合物Ⅵ；最后将含有R5基团的化合物活化后与化合物Ⅵ继续反应得到目标前药化合物。

Description

一类谷胱甘肽激活协同增强光热/化疗的前药化合物及其制 备方法与应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，尤其涉及一类谷胱甘肽激活协同增强光热/化疗的前药化合物及其制备方法与应用。
背景技术
光热疗法(Photothermal Therapy,PTT)是一种精准、微创、无副作用的癌症治疗策略，即光敏剂通过非辐射跃迁的方式将光能转化为热，诱导癌细胞坏死。然而，PTT过程中热休克蛋白(Heat Shock Proteins,HSPs)表达上调会提升癌细胞的耐热性，极大地限制了治疗效率甚至引起肿瘤复发。烷基化剂作为常用的化疗药物，通过与生物大分子(DNA、RNA、酶)共价结合使其失活或断裂DNA链来杀伤癌细胞，具有更加彻底杀伤效果，弥补了PTT杀伤效率的不足。然而，常规化疗方式会使机体产生耐药性，而且药物浓度过高时，会对正常细胞产生毒副作用。目前普遍认为热疗(即温度超过41.5℃)可增加烷基化试剂的DNA烷基化程度，提升癌细胞的杀伤效果。因此，PTT联合化疗抗肿瘤体系克服了单一治疗模式的不足，具有良好的应用前景。
大多数已报道的工作是将化疗药物与光热光敏剂混合后包载到纳米载体中，实现PTT与化疗的结合。这种联合治疗体系无疑比单一治疗方式更有效。然而，由于光热光敏剂和化疗药物活性未被抑制，它们从纳米颗粒释放后可以作用于各种细胞，可能无法实现对正常细胞和癌细胞高效地选择性杀伤。因此，该策略在肿瘤治疗中效率有限。
前药通常指通过化学修饰对正常细胞无毒而在肿瘤微环境特异性激活产生毒性的物质，是提高肿瘤选择性和减少副作用的一种明智策略。L-谷胱甘肽(GSH)是典型的癌细胞中过表达生物标志物之一，可使二硫键断裂，是激活型治疗的理想生物激活剂。通过二硫键连接的GSH可激活的探针和前药可以极大地降低其毒副作用，实现对正常细胞和癌细胞的区分和选择性杀伤。
发明内容
针对现有技术存在的不易实现对正常细胞和癌细胞高效地选择性杀伤的问题，本发明的第一个目的在于提供一类谷胱甘肽激活协同增强光热/化疗的前药化合物，所述化合物通过L-谷胱甘肽(GSH)同步激活光敏剂和化疗药物，实现对于癌细胞和正常细胞的选择性杀伤。
本发明的第二个目的在于提供一类谷胱甘肽激活协同增强光热/化疗的前药化合物的制备方法，所述制备方法具有化合物原料易得，制备简单，易产业化等优点。
本发明的第三个目的在于提供一类谷胱甘肽激活协同增强光热/化疗的前药化合物在制备肿瘤治疗制剂中的应用，具有同步激活光热光敏剂和化疗药物，选择性杀伤癌细胞，并达到光热治疗和化疗协同促进的效果。
为实现上述第一个目的，本发明提供了如下技术方案：一类谷胱甘肽激活协同增强光热/化疗的前药化合物，所述前药化合物具有如下通式I的结构：
Figure BDA0003914971190000021
其中，R1为H、CH3、I、NO2或CF3；
R2为CH3、CH2CH3、(CH2)2CH3、(CH2)2COOH或(CH2)4SO3Na；
R3为O或S；
R4为-S-S-或-C-C-；
R5为-N[(CH2CH2)mX]2，其中X选自卤素、羟基、巯基或硝基；m为1-4的整数，且R5是对位取代基。
为实现上述第二个目的，本发明提供了如下技术方案：一类谷胱甘肽激活协同增强光热/化疗的前药化合物的制备方法，在无水体系下，通过下述方法制备式Ⅰ化合物：
(1)制备式Ⅳ的化合物
Figure BDA0003914971190000031
含有R2基团的吲哚化合物Ⅱ与2-氯-3-(羟基亚甲基)-1-环己烯-1-甲醛Ⅲ在第一无水有机溶剂和第一催化剂的作用下反应，得到式Ⅳ的化合物；
(2)制备式Ⅴ的化合物
Figure BDA0003914971190000032
式Ⅳ的化合物与以R3为对位取代的苯胺类化合物在第二无水有机溶剂的作用下反应，得到式Ⅴ的化合物；
(3)制备式Ⅵ的化合物
Figure BDA0003914971190000033
在第三无水有机溶剂和第三催化剂混合体系下，式Ⅴ的化合物与三光气在反应得到中间体，该中间体与含有R4基团的化合物反应，得到式Ⅵ的化合物；
(4)制备式Ⅰ的化合物
Figure BDA0003914971190000034
含有R5基团的化合物在第四催化剂和第四无水有机溶剂的作用下活化，然后加入式Ⅵ的化合物继续反应，得到式Ⅰ的化合物。
进一步地，在步骤(1)中，所述吲哚化合物Ⅱ与2-氯-3-(羟基亚甲基)-1-环己烯-1-甲醛Ⅲ的摩尔比为1：(2.5-3)，反应时间为3-5h，反应温度为25-60℃；所述第一无水有机溶剂选自乙酸酐、乙醇或乙腈；所述第一催化剂选自无水乙酸钠、无水碳酸钾。
进一步地，在步骤(2)中，式Ⅳ的化合物与以R3为对位取代基的苯胺化合物的摩尔比为1:2，反应时间为4-5h，反应温度为20-40℃，所述第二无水有机溶剂选自无水DMF或无水乙腈。
进一步地，在步骤(3)中，式Ⅴ的化合物与三光气的摩尔比为2：(1-1.5)，式Ⅴ的化合物与三光气的反应时间为2-3h，所用的第三无水有机溶剂选自无水二氯甲烷或无水乙腈，所述第三催化剂选自4-二甲氨基吡啶、N,N'-二异丙基乙胺、三乙胺或吡啶。
进一步地，在步骤(3)中，所述中间体与含有R4基团的化合物的反应时间为12-24h，反应温度为20-30℃。
进一步地，在步骤(4)中，活化反应为在冰浴下反应2-3h，所用的第四催化剂选自N,N'-二环己基碳二亚胺、4-二甲氨基吡啶或三乙胺，所述第四无水有机溶剂为无水二氯甲烷或无水DMF；
活化后的反应物与式Ⅵ的化合物的反应时间为12-24h，反应温度为20-30℃。
为实现上述第三个目的，本发明提供了如下技术方案：一类谷胱甘肽激活协同增强光热/化疗的前药化合物的应用，所述谷胱甘肽激活协同增强光热/化疗的前药化合物用于癌细胞选择性杀伤和/治疗肿瘤，所述肿瘤为谷胱甘肽过表达的肿瘤。
综上所述，本发明具有以下有益效果：
第一、本发明制得的谷胱甘肽激活协同增强光热/化疗的前药化合物吸收和发射波长在800nm左右，具有优异的近红外光敏染料特性；且前药化合物中特异性响应的连接键的引入，保证其在体外对GSH具有灵敏的响应和高选择性。
第二、本发明将光热光敏剂与化疗药结合。GSH是癌细胞过表达的物质，前药被GSH激活后释放出菁染料光敏剂和化疗药物，可以同步激活光敏剂和化疗药物，并且两种治疗方式相互协同促进。
第三、激活后菁染料具有PET效应，使荧光猝灭，吸收的光能以非辐射跃迁的形式释放，提升光敏剂的光热转化能力；通过特异性激活使化疗药物在癌细胞精准释放，展现出优异的癌细胞选择性。对于光热治疗和化疗的协同增强效果进行了更深入的讨论，菁染料的光热可以提升化疗药物的烷基化效率提升化疗效果，同样化疗药可以降低光热过程中热休克蛋白的表达提升光热治疗，二者互相协同，极大促进了癌细胞的杀伤效果。
第四、生物相容性好，在小鼠抑瘤实验中，该前药能对小鼠肿瘤进行成像和治疗，表现出优良的肿瘤抑制效果。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图做一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例公开的Cy-S-S-Cbl和Cy-NH2的吸收与荧光光谱图；A为吸收光谱图；B为荧光光谱图；
图2为本发明实施例公开的Cy-NH2，Cy-S-S-Cbl和Cy-S-S-Cbl+GSH的液相色谱；
图3为本发明实施例公开的Cy-S-S-Cbl与GSH混合在0-150min的荧光变化；
图4为选择性，其中从左到右依次为：对照；丙氨酸；精氨酸；谷氨酸；丝氨酸；苏氨酸；色氨酸；酪氨酸；钾离子；钙离子；钠离子；镁离子；二硫苏糖醇；半胱氨酸；同型半胱氨酸；谷胱甘肽；
图5为本发明实施例公开的Cy-NH2在808nm激光照射下的升温曲线图；A为不同浓度Cy-NH2的升温曲线图；B为不同激光强度Cy-NH2的升温曲线图；
图6为本发明实施例公开的Cy-S-S-Cbl，Cy-NH2和ICG分别在808nm激光(0.5W/cm-2)照射下浓度为40μM的升温曲线；
图7为本发明实施例公开的Cy-S-S-Cbl和Cy-NH2的光热升温-冷却曲线；
图8为Hela细胞在不同浓度Cy-NH2，Cy-S-S-Cbl，Cy-S-S-Cbl+NEM孵育下的细胞存活率；A为黑暗下的细胞存活率；B为808nm激光(0.5W/cm-2，5min)照射后的细胞存活率；
图9为本发明实施例公开的Cy-NH2分别在黑暗和808nm激光(0.5W/cm-2，5min)照射时对于Hela，HepG2，MCF-7，4T1和3T3细胞的细胞存活率；
图10为本发明实施例公开的Cy-S-S-Cbl分别在黑暗和808nm激光(0.5W/cm-2，5min)照射时对于Hela，HepG2，MCF-7，4T1和3T3细胞的细胞存活率；
图11为本发明实施例公开的Cy-NH2和Cy-S-S-Cbl分别在光照和黑暗条件下对pBR322 DNA烷基化的凝胶电泳成像；
图12为本发明实施例公开的Cy-NH2和Cy-S-S-Cbl分别在光照和黑暗条件下对Hela细胞γ-H2AX免疫荧光染色的共聚焦成像；
图13为本发明实施例公开的Cy-NH2和Cy-S-S-Cbl分别在光照和黑暗条件下对Hela细胞中HSP70表达量的凝胶电泳成像，其中：(1)PBS；(2)PBS+light；(3)Cy-S-S-Cbl；(4)Cy-NH2+light；(5)Cy-S-S-Cbl+light；
图14为小鼠的肿瘤体积变化曲线图；
图15为治疗后第22天肿瘤的平均重量柱状图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图1-15，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本申请所涉及的化学药品均来自安耐吉或阿拉丁化学试剂公司，生物耗材胎牛血清、胰酶、DMEM培养基购买自Giboca，所用细胞来自ATCC细胞库，其他的原料均为市售，没有特殊要求。
实施例
实施例1
本实施例公开了R1为H，R2为-(CH2)4SO3Na，R3为S；R4为-S-S-，R5为-N[(CH2CH2)Cl]2的一类谷胱甘肽激活协同增强光热/化疗的前药化合物的制备，合成方法如下：
Figure BDA0003914971190000071
(1)在N2保护下，将2,3,3-三甲基-3H-吲哚(4.78g,30mmol)和1,4-丁磺酸内酯(14.25g,90mmol)溶于1,2-二氯苯(25mL)中，加热至110℃搅拌12小时。将反应混合物冷却至室温，用丙酮(150mL)冲洗粗品，然后转入冰浴中冷却几分钟，抽滤除溶剂，收集滤渣，得到化合物1，即为R1为H，R2为-(CH2)4SO3Na的吲哚化合物，粉红色晶体，产率为97％；
在N2保护下，将化合物1(1.36g,4.6mmol)、2-氯-1-甲酰基-3-羟甲基环己烯(0.344g,2mmol)、无水乙酸钠(0.377g,4.6mmol)混合在乙酸酐(15mL)中，室温搅拌3-4小时。反应完成后，减压蒸除溶剂，得到粗产物使用硅胶柱色谱(二氯甲烷：甲醇＝10:1,v/v)纯化，得到化合物2，绿色固体，产率为82％；
(2)在N2保护下，将化合物2(0.374g,0.5mmol)和4-氨基硫酚(0.25g,2mmol)溶于无水DMF(10mL)中，室温搅拌4h。将反应液倒入乙醚(150mL)中，静置沉淀，抽滤收集得蓝黑色固体，粗产物用硅胶柱色谱(二氯甲烷：甲醇＝7:1,v/v)纯化，得到化合物Cy-NH2，深蓝色固体，产率为91％；
化合物Cy-NH2的高分辨质谱:m/z C44H52N3O6S3Na([M-Na]-):计算值814.3024,测试值814.3027.
化合物Cy-NH2的核磁氢谱分析如下:1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.72(d,J＝14.1Hz,2H),7.55(d,J＝7.3Hz,2H),7.46–7.36(m,4H),7.23(t,J＝7.2Hz,2H),6.98(d,J＝8.3Hz,2H),6.52(d,J＝8.3Hz,2H),6.34(d,J＝14.2Hz,2H),4.17(d,J＝6.1Hz,4H),2.72(s,4H),1.83–1.67(m,10H),1.53(s,12H),1.45(d,J＝7.7Hz,2H),1.20(d,J＝22.5Hz,4H).
化合物Cy-NH2的核磁碳谱分析如下:13C NMR(126MHz,DMSO-d6)δ171.63,152.26,147.45,145.53,142.13,141.03,133.28,128.48,128.00,124.74,122.28,120.91,115.03,111.34,101.54,50.68,48.68,43.58,27.35,26.04,25.81,22.50,20.57.
(3)在N2保护下，将Cy-NH2(0.2g,0.24mmol)和N,N-二异丙基乙胺(0.078g,0.6mmol)溶于无水CH2Cl2(10mL)中，冰浴下搅拌10min，然后将三光气(0.036g,0.12mmol)溶于无水CH2Cl2(5mL)中，逐滴加入反应体系，在冰浴下搅拌2-3h；气体置换除去未反应的光气，将2,2'-二硫二乙醇(0.185g,1.2mmol)溶于无水CH2Cl2(10mL)中，逐滴加入反应体系中，在室温下搅拌过夜。减压蒸除溶剂，粗产物用硅胶柱色谱(二氯甲烷：甲醇＝10:1,v/v)纯化，得到化合物3，蓝绿色固体，产率为46％；
化合物3的高分辨质谱:m/z C49H60N3O9S5Na([M-Na]-):计算值994.2939,测试值994.2946.
化合物3的核磁氢谱分析如下:1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ9.71(s,1H),8.63(d,J＝14.1Hz,2H),7.53(d,J＝7.4Hz,2H),7.43(t,J＝8.6Hz,4H),7.38(t,J＝7.6Hz,2H),7.21(dd,J＝19.9,8.1Hz,4H),6.37(d,J＝14.2Hz,2H),5.76(s,1H),4.27(t,J＝6.3Hz,2H),4.17(d,J＝6.9Hz,4H),3.60(dd,J＝12.0,6.3Hz,2H),2.97(t,J＝6.3Hz,2H),2.78(dd,J＝14.3,7.8Hz,4H),1.81-1.68(m,10H),1.45(s,12H),1.34(d,J＝9.1Hz,2H),1.23(s,4H).
化合物3的核磁碳谱分析如下:13C NMR(126MHz,DMSO-d6)δ171.77,153.10,149.58,145.09,142.09,141.06,133.32,129.67,128.49,126.46,124.83,122.30,111.44,101.75,62.08,59.35,54.88,50.68,48.69,45.46,45.42,41.03,36.79,31.25,27.24,26.08,25.82,22.50,20.46.
(4)在N2保护下，将苯丁酸氮芥(60.9mg,0.2mmol)、DCC(62mg,0.6mmol)和DMAP(12.2mg,0.1mmol)溶解于无水CH2Cl2(5mL)中，在0℃搅拌4h，然后将化合物3(102mg,0.1mmol)加入反应体系中，在室温下避光搅拌48h。减压蒸除溶剂，粗产物用硅胶柱色谱(二氯甲烷：甲醇＝9:1,v/v)纯化，得到目标化合物Cy-S-S-Cbl，深绿色固体，产率为55％。
目标化合物Cy-S-S-Cbl的高分辨质谱:m/z C63H77Cl2N4O10S5Na([M-Na]-):计算值1279.3626,测试值1279.3650.
化合物Cy-S-S-Cbl的核磁氢谱分析如下:1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ9.73(s,1H),8.60(d,J＝14.0Hz,2H),7.50(d,J＝7.3Hz,2H),7.41(d,J＝8.0Hz,4H),7.36(t,J＝7.6Hz,2H),7.19(dd,J＝18.8,7.8Hz,4H),6.97(d,J＝7.9Hz,2H),6.62(d,J＝7.9Hz,2H),6.34(d,J＝14.2Hz,2H),4.24(t,J＝6.2Hz,2H),4.20(t,J＝6.1Hz,2H),4.15(s,4H),3.68–3.61(m,8H),2.94(dd,J＝14.5,6.6Hz,4H),2.74(s,4H),2.41(t,J＝7.5Hz,2H),2.23(t,J＝7.2Hz,2H),1.77–1.69(m,10H),1.41(s,14H),1.22(d,J＝11.3Hz,4H).
化合物Cy-S-S-Cbl的核磁碳谱分析如下:13C NMR(126MHz,DMSO-d6)δ173.07,172.29,153.61,150.13,145.60,144.99,142.58,141.57,137.56,133.84,129.94,129.80,129.01,126.97,125.36,122.81,120.07,112.42,111.94,102.26,72.75,62.50,62.02,60.71,52.71,51.17,49.21,44.17,41.67,37.27,36.97,33.69,33.32,27.76,26.99,26.58,26.34,22.99,21.00.
性能检测试验
1、在上述实施例的制备过程中，将制备的Cy-S-S-Cbl和Cy-NH2分别配制3mM母液，在PBS缓冲液(0.01mol/LPBS，PBS/DMSO＝9/1，v/v)中测试其4μM浓度下的吸收与荧光光谱。
用紫外-可见3012见光分光光度计测试吸光光谱，具体如图1A所示，可以看出，Cy-S-S-Cbl和Cy-NH2具有相似的吸收光谱，最大吸收波长在800nm左右。
使用荧光光谱仪测试测试荧光光谱，具体如图1B所示，可以看出，由于氨基产生的PET作用，Cy-NH2的荧光相对于Cy-S-S-Cbl被显著猝灭。因此，可以推断Cy-NH2吸收的光能主要以非辐射跃迁产热的方式释放。
2、谷胱甘肽同步激活机制及响应后荧光变化和选择性的测试
2.1、在上述实施例制备过程中，将制备的Cy-NH2和Cy-S-S-Cbl用高效液相色谱监测其在流动相(甲醇：水＝9:1至纯水)30分钟内254nm处的吸收。将Cy-S-S-Cbl与GSH在37℃下孵育2h后，以相同的方式通过高效液相色谱监测其在254nm处的吸收变化。向Cy-S-S-Cbl中加入GSH得到Cy-S-S-Cbl+GSH，然后在37℃下孵育，每15min检测其荧光变化，结果见图2和图3。
如图2所示，Cy-NH2，Cy-S-S-Cbl和Cy-S-S-Cbl+GSH的液相色谱，说明谷胱甘肽与Cy-S-S-Cbl反应后可以释放Cy-NH2和化疗药物。如图3所示，在0-150min内，过量的谷胱甘肽会使Cy-S-S-Cbl的荧光逐渐减弱，说明谷胱甘肽可以切断Cy-S-S-Cbl的二硫键释放Cy-NH2，实现荧光猝灭的效果。
2.2、在上述实施例制备过程中，将制备的Cy-S-S-Cbl分别与丙氨酸、精氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、钾离子、钙离子、钠离子、镁离子、二硫苏糖醇、半胱氨酸、同型半胱氨酸和谷胱甘肽混合，在37℃下孵育2h后检测820nm处的荧光变化，检测结果见图4。
如图4所示，加入其他氨基酸和金属离子，Cy-S-S-Cbl只对硫醇产生响应，具有较好的选择性。
结合实施例和图2以及3可以看出，实施例制备的目标化合物Cy-S-S-Cbl与谷胱甘肽响应的机理为：
Figure BDA0003914971190000101
本申请实施例中菁染料和化疗药物通过二硫键相连，癌细胞内过表达的谷胱甘肽可以切断二硫键并使Cy-S-S-Cbl同步激活后释放光热光敏剂和化疗药物。
3、光热升温效果测试
3.1、在相同溶剂体系下(PBS,PBS/DMSO＝8:2v/v)，分别配制浓度为0、10μM、20μM、40μM的Cy-NH2溶液，采用808nm激光(功率0.5W/cm-2)下照射，检测照射下的光热升温能力。每个样品照射5min，通过红外相机每30s记录一次温度，检测结果见图5A，可以看出，当浓度为40μM时，光热升温最高。
3.2、在相同溶剂体系下(PBS,PBS/DMSO＝8:2v/v)，采用浓度为40μM的Cy-NH2溶液，采用808nm激光分别在0.1W/cm-2、0.2W/cm-2、0.4W/cm-2、0.6W/cm-2功率下照射，每个样品照射5min，通过红外相机每30s记录一次温度，检测结果如图5B，当光强为0.4W/cm-2和0.6W/cm-2，溶液的最高温度相差不大。
3.3、将Cy-NH2、Cy-S-S-Cbl和吲哚菁绿(ICG)分别在808nm激光(0.5W/cm-2，5min)下照射，检测结果如图6，可以看出，Cy-NH2的温度变化(ΔT～24℃)比激光照射后的Cy-S-S-Cbl(ΔT～16℃)和ICG(ΔT～9℃)有显著的提升，说明Cy-NH2具有更高的光热转化能力。
3.4、Cy-NH2和Cy-S-S-Cbl的加热冷却过程的研究：将40μM Cy-NH2和Cy-S-S-Cbl溶液用808nm激光(0.5W/cm-2)照射5min，然后停止光照冷却至室温。在此过程中，每隔30秒记录一次溶液的温度，检测结果如图7，可以看出，Cy-NH2的光热转换效率(η)为43.15％，远高于Cy-S-S-Cbl的光热转换效率(26.35％)。
4、细胞选择性及杀伤效果评价
4.1、将Hela细胞培养于37℃、5％CO2恒温细胞培养箱中贴壁培养，用含有10％的血清和1％双抗的DMEM高糖培养基培养。将细胞分别用Cy-NH2、Cy-S-S-Cbl、Cy-S-S-Cbl加谷胱甘肽抑制剂N-乙基顺丁烯二酰亚胺(NEM)在0-40μM的浓度下孵育，检测结果见图8A，可以看出，在浓度40μmol/L的Cy-S-S-Cbl孵育后细胞存活率下降到62％，其他组细胞存活率都很高，说明释放的药物可以杀伤癌细胞。
按照上述方式继续孵育4h后用808nm激光(0.5W/cm2)进行光照，Cy-S-S-Cbl比Cy-NH2和Cy-S-S-Cbl+NEM组对Hela细胞的杀伤效果，检测结果见图8B，可以看出，Cy-S-S-Cbl比Cy-NH2和Cy-S-S-Cbl+NEM组对Hela细胞的杀伤效果更强。这些差异表明Cy-S-S-Cbl进入细胞后二硫键被内源性的GSH切断，释放出的Cy-NH2与Cbl共同作用增强了细胞毒性。
4.2、选择不同种类的癌细胞(HepG2,MCF-7,4T1)和正常细胞(3T3)来比较Cy-S-S-Cbl对于不同细胞的杀伤效果，测试结果见图9和图10。
将40μmol/L的Cy-S-S-Cbl和Cy-NH2分别孵育四种细胞，4h后分别进行黑暗和808nm激光(0.5W/cm2)的光照处理。24h后，加入MTT溶液(5mg mL-1)，孵育4h后，加入100μLDMSO，测试490nm处的吸光度；
图9为Cy-NH2分别在黑暗和808nm激光(0.5W/cm-2，5min)照射时对不同细胞杀伤的细胞存活率图，图10为Cy-S-S-Cbl分别在黑暗和808nm激光(0.5W/cm-2，5min)照射时对不同细胞杀伤的细胞存活率图，从图9可以看出，Cy-NH2对肿瘤细胞和正常细胞的抑制率无明显差别，而从图10可以看出，Cy-S-S-Cbl对癌细胞的毒性显著高于正常细胞。这说明Cy-S-S-Cbl具有较好的癌细胞选择性。
5、光热和化疗协同增强机制
5.1、将pBR322质粒DNA先与GSH(10mM)孵育12h后，再分别与Cy-S-S-Cbl和Cy-NH2孵育，在光/暗条件下通过凝胶电泳实验测试烷基化效果，检测结果见图11，可以看出，化疗药苯丁酸氮芥可以使DNA双链烷基化从而杀伤癌细胞。Cy-S-S-Cbl孵育后的烷基化程度显著高于Cy-NH2组，在光照之后，烷基化效果进一步提升，说明光热可以促进化疗药物的烷基化作用。
5.2、通过γ-H2AX免疫荧光染色实验进一步验证：Hela细胞分别与PBS、Cy-NH2或Cy-S-S-Cbl孵育4h。用PBS冲洗细胞后，按DNA损伤检测试剂盒对细胞进行处理。通过共聚焦荧光成像并收集图像。DAPI和γ-H2AX的激发波长分别为405nm和488nm，分别在415-485nm和500-545nm范围内采集发射信号；检测结果见图12，可以看出，在808nm激光的照射下，荧光信号明显增强，烷基化比例提升。
5.3、将Hela细胞种于10cm的细胞培养皿中，分别用含Cy-S-S-Cbl或Cy-NH2(20μM)的培养基培养。在37℃黑暗中孵育4h后，用808nm光照射5min(0.5W/cm2)。孵育12h后，细胞用含蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液在冰上裂解20min。用BCA法测定蛋白质浓度后，在SDS-PAGE凝胶的每道中加入等量的蛋白质进行电泳，然后转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。膜与HSP70一抗在4℃孵育过夜，然后与过氧化物酶标记的山羊抗兔HRP二抗在室温孵育2h，随后进行凝胶电泳成像分析，检测结果见图13，可以看出，热休克蛋白的产生是限制光热治疗的重要原因，在同样经过光照处理后，Cy-S-S-Cbl组的HSP70的表达量要低于Cy-NH2组，说明化疗药物可以降低热休克蛋白的表达，促进光热作用。
6、小鼠肿瘤抑制效果测试
在6-7周的SCID/BALB/c雌鼠构建皮下宫颈癌(Hela)肿瘤模型，待肿瘤体积至130mm3时，通过瘤旁注射给药的方式给药，孵育4h后用808nm激光(0.5W cm-2)光照8min进行光照治疗，记录肿瘤体积变化，检测结果见图14和15，可以看出，在整个21天的治疗周期中，Cy-S-S-Cbl治疗组的肿瘤体积逐渐变小并无复发，而对照组则表现出8-9倍的肿瘤体积增加。实验结果证明，该前药具有良好的肿瘤抑制能力。
综上，可以看出，化疗药物和光敏剂的选择是使得该前药具有优良性质的关键，在孵育的过程中，前药被GSH切断同时激活化疗药物和光敏剂尤为重要，两种治疗方式可以相互促进协同，保证了该前药拥有良好的治疗效果。
本发明所提供的前药化合物与现有技术相比，具有包括以下方面的创造性：优异的近红外光敏染料特性；同步激活光敏剂和化疗药物，并且两种治疗方式相互协同促进；特异性识别并选择性杀伤癌症细胞。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (8)

1.一类谷胱甘肽激活协同增强光热/化疗的前药化合物，其特征在于，所述前药化合物具有如下通式I的结构：
Figure FDA0003914971180000011
其中，R1为H、CH3、I、NO2或CF3；
R2为CH3、CH2CH3、(CH2)2CH3、(CH2)2COOH或(CH2)4SO3Na；
R3为O或S；
R4为-S-S-或-C-C-；
R5为-N[(CH2CH2)mX]2，其中X选自卤素、羟基、巯基或硝基；m为1-4的整数，且R5是对位取代基。
2.权利要求1所述的一类谷胱甘肽激活协同增强光热/化疗的前药化合物的制备方法，其特征在于，在无水体系下，通过下述方法制备式I化合物：
(1)制备式Ⅳ的化合物
Figure FDA0003914971180000012
含有R2基团的吲哚化合物Ⅱ与2-氯-3-(羟基亚甲基)-1-环己烯-1-甲醛Ⅲ在第一无水有机溶剂和第一催化剂的作用下反应，得到式Ⅳ的化合物；
(2)制备式Ⅴ的化合物
Figure FDA0003914971180000013
式Ⅳ的化合物与以R3为对位取代的苯胺类化合物在第二无水有机溶剂的作用下反应，得到式Ⅴ的化合物；
(3)制备式Ⅵ的化合物
Figure FDA0003914971180000021
在第三无水有机溶剂和第三催化剂混合体系下，式Ⅴ的化合物与三光气在反应得到中间体，该中间体与含有R4基团的化合物反应，得到式Ⅵ的化合物；
(4)制备式I的化合物
Figure FDA0003914971180000022
含有R5基团的化合物在第四催化剂和第四无水有机溶剂的作用下活化，然后加入式Ⅵ的化合物继续反应，得到式I的化合物。
3.根据权利要求2所述的一类谷胱甘肽激活协同增强光热/化疗的前药化合物的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述吲哚化合物Ⅱ与2-氯-3-(羟基亚甲基)-1-环己烯-1-甲醛Ⅲ的摩尔比为1：(2.5-3)，反应时间为3-5h，反应温度为25-60℃；所述第一无水有机溶剂选自乙酸酐、乙醇或乙腈；所述第一催化剂选自无水乙酸钠、无水碳酸钾。
4.根据权利要求2所述的一类谷胱甘肽激活协同增强光热/化疗的前药化合物的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，式Ⅳ的化合物与以R3为对位取代基的苯胺化合物的摩尔比为1:2，反应时间为4-5h，反应温度为20-40℃，所述第二无水有机溶剂选自无水DMF或无水乙腈。
5.根据权利要求2所述的一类谷胱甘肽激活协同增强光热/化疗的前药化合物的制备方法，其特征在于，在步骤(3)中，式Ⅴ的化合物与三光气的摩尔比为2：(1-1.5)，式Ⅴ的化合物与三光气的反应时间为2-3h，所用的第三无水有机溶剂选自无水二氯甲烷或无水乙腈，所述第三催化剂选自4-二甲氨基吡啶、N,N'-二异丙基乙胺、三乙胺或吡啶。
6.根据权利要求2所述的一类谷胱甘肽激活协同增强光热/化疗的前药化合物的制备方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述中间体与含有R4基团的化合物的反应时间为12-24h，反应温度为20-30℃。
7.根据权利要求2所述的一类谷胱甘肽激活协同增强光热/化疗的前药化合物的制备方法，其特征在于，在步骤(4)中，活化反应为在冰浴下反应2-3h，所用的第四催化剂选自N,N'-二环己基碳二亚胺、4-二甲氨基吡啶或三乙胺，所述第四无水有机溶剂为无水二氯甲烷或无水DMF；
活化后的反应物与式Ⅵ的化合物的反应时间为12-24h，反应温度为20-30℃。
8.权利要求1所述的一类谷胱甘肽激活协同增强光热/化疗的前药化合物的应用，其特征在于，所述谷胱甘肽激活协同增强光热/化疗的前药化合物用于癌细胞选择性杀伤和/治疗肿瘤，所述肿瘤为谷胱甘肽过表达的肿瘤。
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