CN113185498A - 一种近红外荧光靶向分子探针及其制备方法和在细胞成像中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供的一种近红外荧光靶向分子探针，其结构式如下。本发明还提供了一种上述近红外荧光分子探针的制备方法。本发明还提供了上述近红外荧光分子探针在EML4‑ALK阳性非小细胞肺癌细胞(NCIH3122细胞)中靶向成像的应用。本发明提供的近红外荧光分子探针结构新颖，制备工艺简单，能有效的避开生物自发荧光和细胞内源性物质的干扰，灵敏度高、光学稳定性好、细胞膜渗透性好，能够作为EML4‑ALK阳性非小细胞肺癌(NCIH3122细胞)荧光成像的近红外荧光探针。
Description
技术领域
本发明属于荧光分子探针技术领域，特别涉及一种近红外荧光靶向分子探针及其制备方法和在细胞成像中的应用。
背景技术
近红外荧光成像技术作为一种非侵入性诊断技术，具有无辐射、无损、实时、在位检测生物信息等优点。近红外荧光染料是最常用的荧光成像探针之一，由于其主要吸收和发射光谱在650～900nm,很大程度降低了机体组织的自发荧光干扰和自吸收，提高了其在生物体内检测的灵敏度和选择性，且减少了对生物体的损伤，有利于实现活体荧光成像检测。菁染料作为近红外荧光染料中的一类，常被用作荧光检测标记物或制成荧光成像探针[Aishan Zheng,Han Liu,Chuanhao Peng,Xiaonan Gao,Kehua Xu,BoTang.Talanta.2021,226:122152.S Siriwibool,N Kaekratoke,K Chansaenpak,KSiwawannapong,AKamkaew.Scientific Reports,2020,10(1):1283.]。吲哚七甲川菁染料是菁染料中应用最多的一类，由吲哚杂环、七甲川链和N-取代基侧链组成，由于其具有避开机体组织自发荧光干扰和自吸收的能力，当前常被用作荧光成像探针，并成为研究的热点[Chunlong Sun,Wen Du,Wei Zhang,Yang Wu,Zhigang Yao,Baoqin Wang,Tao Wu,HongjunYang,Yanmei Wang and Lili Ren,Analytical Methods,2018,10,3727-3736.]。而如何提高吲哚七甲川菁染料的光谱性能，光稳定性则成为其研究的重点，对吲哚七甲川菁染料的结构改进旨在达到这个目的，而且越来越受关注。
2011年克里唑替尼(Crizotinib)作为小分子选择抑制剂获得美国FDA批准上市，主要用于治疗诊断为ALK阳性的局部晚期或转移的EML4-ALK阳性非小细胞肺癌[TheilenTM,et al.Pediatr Blood Cancer,2018,doi:10.1002/pbc.26920.Pelaz B,et al.ACSNano.2017,11(3):2313-2381.]。当前，针对EML4-ALK阳性非小细胞肺癌的早期诊断及其治疗成为国际研究的热点。如何将近红外荧光染料与EML4-ALK阳性非小细胞肺癌治疗药物相结合，制备效果优异的诊疗一体化探针目前还没有相关的研究。
发明内容
发明目的：本发明的目的在于提供一种灵敏度高、结果准确、可用于EML4-ALK阳性非小细胞肺癌细胞靶向成像的近红外荧光探针。
本发明的第二目的在于提供上述荧光靶向分子探针的制备方法。
本发明的第三目的在于提供上述荧光靶向分子探针的应用。
技术方案：为达到上述发明目的，本发明采用如下技术方案：
一种近红外荧光靶向分子探针，其结构式如下：
本发明还提供了上述近红外荧光靶向分子探针的制备方法，包括以下步骤：
(1)在惰性气体保护下，化合物3先与Linker巯基丙酸反应，生成化合物IR782；
(2)在惰性气体保护下，化合物IR782再与化合物2反应，制得化合物1；
反应路线如下：
优选的，步骤(1)中，化合物3和巯基丙酸的摩尔比为1：(1～8)，反应温度为25～45℃，反应时间为0.5～12h，反应溶剂为DMSO，所得产物IR-782不用处理直接再与化合物2(摩尔量为化合物3的1～3倍)反应，在催化试剂NHS和DCC作用下反应1～12h，反应温度为25～45℃，得最终产物化合物1。以上反应过程都选用在溶剂DMSO中进行，因为这种溶剂所得化合物1的产率高，副产物低，且反应时间短。
更优的，步骤(1)中，化合物3和linker的摩尔比为1:3，反应温度为25～45℃，反应时间0.5～6h，得含有化合物IR-782的混合液。
更优的，步骤(2)中，将步骤(1)反应结束后含有化合物IR-782的反应液与化合物2(摩尔量为化合物3的3倍)反应，并且以NHS和DCC为催化剂的条件下反应1～12h，得产物化合物1。NHS和DCC的摩尔量均与化合物2所用摩尔量相同。
优选，所述制备方法还包括纯化工艺：步骤(2)反应结束后，减压浓缩反应液，加入醚类溶剂，过滤；滤饼经柱层析，即得。
进一步优选，所述醚类溶剂为分子量为74-186的醚类化合物，选择乙醚、甲基叔丁基醚或正己醚，醚类溶剂加入量可为减压浓缩后的反应液的体积的5～30倍。
进一步优选，色谱柱为硅胶柱，硅胶的规格为200-300目；洗脱液为体积比15:1～30:1的二氯甲烷和甲醇的混合物。之所以用过硅胶柱法纯化该化合物是因为吲哚七甲川菁类染料的稳定性很差，在制备和纯化过程中容易产生大量杂质，国外大多采用制备型高效液相分离纯化，本专利的纯化方法采用过硅胶柱法，操作简单方便，速度较快，得到产品纯度和产率较高.
本发明还提供了上述的近红外荧光靶向分子探针在细胞成像中的应用。
进一步，本发明还提供了所述的近红外荧光靶向分子探针在制备非小细胞肺癌靶向成像检测试剂中的应用。优选，所述非小细胞肺癌为EML4-ALK阳性非小细胞肺癌(NCIH3122细胞)
上述近红外荧光分子探针在NCIH3122细胞中靶向成像的应用，最佳孵育时间(40min)和投入探针的量(8μM)。
对于一般近红外荧光染料来说，其在体内代谢较快，对体内细胞没有毒性，且具有较好的荧光检测活性。本发明通过Linker(巯基丙酸)将化合物3与化合物2相结合，以增加其生物相容性，延长其在体内的代谢时间，并可能使其具有肿瘤组织靶向识别、成像和治疗的能力。通过研究证实，该探针以EML4-ALK阳性非小细胞肺癌细胞作为靶点，可用于EML4-ALK阳性非小细胞肺癌的靶向成像诊断。
有益效果：相对于现有技术，本发明提供的近红外荧光靶向分子探针结构新颖，制备工艺简单，能有效的避开生物自发荧光和细胞内源性物质的干扰，灵敏度高、光学稳定性好、细胞膜渗透性好，能够作为检测EML4-ALK阳性非小细胞肺癌靶向成像的近红外荧光探针。该荧光靶向分子探针在药物分析、生命科学、分析化学等领域具有较强的实际应用价值。
附图说明
图1是本发明的近红外荧光靶向分子探针的MS图。
图2是本发明的近红外荧光靶向分子探针的1H-NMR图。
图3是本发明的近红外荧光靶向分子探针的紫外吸收光谱图。
图4是本发明的近红外荧光靶向分子探针的荧光发射光谱图。
图5为本发明的近红外荧光靶向分子探针在活的EML4-ALK阳性非小细胞肺癌细胞(NCIH3122细胞)内靶向成像图，其中：a,b为在NCIH3122细胞中先加入化合物2后再加入化合物1的共聚焦成像图(a为白光图，b为荧光图)；c,d为在NCIH3122细胞中只加入化合物1的共聚焦成像图(c为白光图，d为荧光图)。
图6为本发明的近红外荧光靶向分子探针在小动物活体荧光成像系统中的荧光成像图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下面描述的实例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂、仪器等，若无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
将0.2mmol化合物3加入到50mL反应瓶中，加入5mL二甲基亚砜(DMSO)搅拌溶解，再加入巯基丙酸0.4mmol,加热到25℃，溶解，氩气保护下,反应3h；在上述反应后混合液中分别加入化合物2、NHS和DCC各0.6mmol，25℃搅拌反应2h，反应结束。将反应液倒入25mL甲基叔丁基醚中，析出绿色固体，滤纸过滤，收集上层固体物质。200-300目硅胶柱柱层析分离提纯，洗脱液为体积比25:1的二氯甲烷和甲醇的混合物，得6mg绿色金属色泽晶体为近红外荧光探针。
其质谱谱图见图1，氢谱谱图见图2。
ESI-MS[M+H-I]+m/z:1039.50.
1H-NMR(500MHz,DMSO-d6)δ(ppm)＝8.04(s,1H),7.81(s,1H),7.69(s,1H),7.64(d,2H),7.56(m,1H),7.45(m,3H),7.33(m,2H),7.32(m,2H),7.21(m,2H),6.88(d,2H),6.12(m,1H),6.10(d,2H),5.78(s,1H),4.71(m,1H),4.01(m,4H),3.91(d,2H),3.92(m,3H),2.53(m,4H),2.32(m,4H),1.81-1.60(m,20H),1.23(d,4H),0.93(m,6H).
其紫外吸收光谱见图3，其荧光发射光谱见图4。
实施例2
将0.4mmol化合物3加入到50mL反应瓶中，加入7mL二甲基亚砜(DMSO)搅拌溶解，再加入巯基丙酸0.4mmol,加热到25℃，溶解，氮气保护下,反应3h；在上述反应后混合液中分别加入化合物2、NHS和DCC各0.6mmol，25℃搅拌反应2h，反应结束。将反应液倒入50mL甲基叔丁基醚中，析出绿色固体，滤纸过滤，收集上层固体物质。200-300目硅胶柱柱层析分离提纯，洗脱液为体积比20:1的二氯甲烷和甲醇的混合物，得9mg绿色金属色泽晶体为近红外荧光探针。
实施例3
将0.4mmol化合物3加入到50mL反应瓶中，加入10mL二甲基亚砜(DMSO)搅拌溶解，再加入巯基丙酸0.8mmol,加热到45℃，溶解，氩气保护下,反应4h；在上述反应后混合液中分别加入化合物2、NHS和DCC各0.12mmol，45℃搅拌反应4h，反应结束。将反应液倒入50mL甲基叔丁基醚中，析出绿色固体，滤纸过滤，收集上层固体物质。200-300目硅胶柱柱层析分离提纯，洗脱液为体积比25:1的二氯甲烷和甲醇的混合物，得11.5mg绿色金属色泽晶体为近红外荧光探针。
实施例4
将0.1mmol化合物3加入到50mL反应瓶中，加入3mL二甲基亚砜(DMSO)搅拌溶解，再加入巯基丙酸0.3mmol,加热到25℃，溶解，氮气保护下,反应3h；在上述反应后混合液中分别加入化合物2、NHS和DCC各0.3mmol，25℃搅拌反应2h，反应结束。将反应液倒入25mL甲基叔丁基醚中，析出绿色固体，滤纸过滤，收集上层固体物质。200-300目硅胶柱柱层析分离提纯，洗脱液为体积比25:1的二氯甲烷和甲醇的混合物，得3mg绿色金属色泽晶体为近红外荧光探针。
实施例5
将0.2mmol化合物3加入到50mL反应瓶中，加入5mL二甲基亚砜(DMSO)搅拌溶解，再加入巯基丙酸0.4mmol,加热到35℃，溶解，氩气保护下,反应3h；在上述反应后混合液中分别加入化合物2、NHS和DCC各1.2mmol，35℃搅拌反应8h，反应结束。将反应液倒入40mL甲基叔丁基醚中，析出绿色固体，滤纸过滤，收集上层固体物质。200-300目硅胶柱柱层析分离提纯，洗脱液为体积比20:1的二氯甲烷和甲醇的混合物，得6mg绿色金属色泽晶体为近红外荧光探针。
实施例6
将0.2mmol化合物3加入到50mL反应瓶中，加入5mL二甲基亚砜(DMSO)搅拌溶解，再加入巯基丙酸0.4mmol,加热到45℃，溶解，氩气保护下,反应6h；在上述反应后混合液中分别加入化合物2、NHS和DCC各1.0mmol，45℃搅拌反应6h，反应结束。将反应液倒入50mL甲基叔丁基醚中，析出绿色固体，滤纸过滤，收集上层固体物质。200-300目硅胶柱柱层析分离提纯，洗脱液为体积比20:1的二氯甲烷和甲醇的混合物，得5.6mg绿色金属色泽晶体为近红外荧光探针。
实施例7
图5为本发明的近红外荧光靶向分子探针在活的EML4-ALK阳性非小细胞肺癌细胞(NCIH3122细胞)内靶向成像图，a,b为在NCIH3122细胞中先加入化合物2(克里唑替尼)后再加入探针化合物1的共聚焦成像图(图5a为白光图，b为荧光图)，从b图中可以看到，细胞几乎没有荧光信号。c，d为在NCIH3122细胞中只加入探针化合物1的共聚焦成像图(图5c为白光图，d为荧光图)，从d图中可以看到，细胞荧光强度较强。从图a，c中可以看到，标记新探针的NCIH3122细胞外形呈边缘光整的单核形态，该肿瘤细胞分裂增殖速度较慢，且细胞活力较弱。
通过激光共聚焦成像实验证明了荧光探针化合物1具有成像的活性。当NCIH3122细胞首先加入了ALK阳性抑制剂克里唑替尼，再加入荧光探针化合物1后，细胞中没有荧光信号；相同条件下，在细胞中直接加入荧光探针化合物1，细胞有荧光信号。实验结果说明，ALK阳性抑制剂克里唑替尼进入了含有ALK阳性肿瘤细胞中且阻碍了探针化合物1继续进入细胞，而在没有克里唑替尼的另一组实验中，探针化合物1进入细胞内部且产生了荧光信号。这充分说明，探针化合物1同克里唑替尼一样具有ALK阳性抑制的作用，且具有在ALK阳性肿瘤细胞中靶向成像的性质。本实验组的激光共聚焦显微镜(20倍物镜)最大激发波长是690nm。
将3μM化合物1装入3ml离心管中并在在小动物活体荧光成像系统中看到清晰的荧光成像(图6)。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种近红外荧光靶向分子探针，其结构式如下：
2.权利要求1所述的近红外荧光靶向分子探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)在惰性气体保护下，化合物3先与Linker巯基丙酸反应，生成化合物IR782；
(2)在惰性气体保护下，化合物IR782再与化合物2反应，制得化合物1；
3.根据权利要求2所述的近红外荧光靶向分子探针的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，化合物3和巯基丙酸的摩尔比为1：(1～8)，反应温度为25～45℃，反应时间为0.5～12h，反应溶剂为DMSO。
4.根据权利要求2所述的近红外荧光靶向分子探针的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，在步骤(1)所得反应液中直接加入化合物2进行反应，化合物2的摩尔量为步骤(1)中化合物3摩尔量的1～3倍；所述反应是在催化剂NHS和DCC的作用下进行，反应1～12h，反应温度为25～45℃。
5.根据权利要求2所述的近红外荧光靶向分子探针的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括纯化工艺：步骤(2)反应结束后，减压浓缩反应液，加入醚类溶剂，过滤；滤饼经柱层析，即得。
6.根据权利要求5所述的近红外荧光靶向分子探针的制备方法，其特征在于，所述醚类溶剂为分子量为74-186的醚类化合物，选择乙醚、甲基叔丁基醚或正己醚。
7.根据权利要求5所述的近红外荧光靶向分子探针的制备方法，其特征在于，色谱柱为硅胶柱，硅胶的规格为200-300目；洗脱液为体积比15:1～30:1的二氯甲烷和甲醇的混合物。
8.权利要求1所述的近红外荧光靶向分子探针在细胞成像中的应用。
9.权利要求1所述的近红外荧光靶向分子探针在制备非小细胞肺癌靶向成像检测试剂中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述非小细胞肺癌为EML4-ALK阳性非小细胞肺癌。
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