CN113444099B - 一种反应型硫化氢荧光探针及其制备与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种反应型硫化氢荧光探针及其制备与应用。该方法包括：将5‑(4‑吡啶基)‑10,15,20‑三(4‑磺酸基苯基)卟啉(p‑PyTS)与2‑取代苯甲酸‑4‑溴甲基苯酯衍生物(2‑PBr)以摩尔比为2:1的比例溶于二甲基亚砜中，形成2‑PBr为0.2mmol/mL的溶液，加热回流反应2h，提纯后得到最终产物卟啉—苯酯(p‑Pium)探针。该探针水溶性好，对水溶液中的硫化氢进行荧光检测时，荧光信号有明显增强，具有较高的灵敏性与选择性；结合激光共聚焦扫描显微技术，还可实现该探针在活细胞内对硫化氢的荧光检测成像。

Description

一种反应型硫化氢荧光探针及其制备与应用
技术领域
本发明涉及一种反应型硫化氢荧光探针，具体涉及一种以酯基为识别基团，4-羟基苄基为连接基团，卟啉分子为荧光发色团的卟啉—苯酯(p-Pium)类荧光探针的制备方法，以及该探针分子应用于水溶液及细胞中硫化氢的检测。
背景技术
硫化氢(H2S)是一种具有臭鸡蛋气味的有毒气体。它是一种易燃危化品，但其危险性不局限于易燃易爆，吸入一定浓度的该气体后，会导致头痛、头晕等中枢神经系统受损的症状，还会导致呼吸困难，粘膜刺激甚至死亡。但是近些年来的研究表明硫化氢与人体的生理过程有密切关系。硫化氢是人类发现的继一氧化碳和一氧化氮后的第三种气体递质。硫化氢在人体中有相应的生物合成途径，无论是缺乏还是过量，都会导致许多异常的症状发生。许多疾病也与硫化氢息息相关，例如阿尔兹海默症，肝硬化等等。因此不论作为一种环境污染物，还是作为一种气体递质，快速而灵敏的对硫化氢进行检测具有重要的研究价值和应用前景。
目前，国内外检测硫化氢的方法主要有亚甲基蓝法、电化学法、单溴二胺法、比色法、沉淀法和气相色谱法等。这些检测方法除了具有样品难以回收，检测仪器复杂等缺陷，还受到生物相容性的限制，难以应用于体内和细胞的实时检测。而荧光分析法具有高选择性、低检测限、快速检测以及较好的生物相容性的优点，有望实现在细胞和组织中的实时检测，是近些年的研究热点之一。
硫化氢分子在水溶液中有三种存在形式，分别为：H2S、HS-和S2-。在中性水溶液中，即生理条件下，主要存在形式为HS-阴离子。此外，硫化氢具有较好的还原性、较强的亲核性以及对某些重金属有较好的亲和性的化学性质。根据这些性质设计的硫化氢荧光探针绝大多数属于反应型荧光探针，即与硫化氢反应前后，荧光探针分子的化学结构发生了变化，进而触发了光学性能的改变，从而实现了检测。根据反应机理的不同，反应型探针又可以分为还原型、亲核反应型以及沉淀型三大类。在反应型荧光探针的设计中，识别基团的选择和连接基团的引入都十分重要，决定了探针分子的灵敏度、选择性和响应时间。目前报道的硫化氢探针分子都具有一定的选择性和灵敏度，但是实际应用中尤其是在生物成像和检测中仍然面临着很多问题：例如反应时间长、水溶性较差、毒性较大、容易受背景干扰等。改善探针分子的水溶性、选择具有良好稳定性且反应快速的硫化氢荧光探针，最终实现生物体内硫化氢的高选择性灵敏检测是解决上述问题的关键所在。
发明内容
针对现有荧光探针所存在的制备繁琐、水溶性差、以及生物相容性差等问题，本发明第一个目的是提供一种水溶性的反应型硫化氢荧光探针。
本发明采用的技术方案是；
一种反应型硫化氢荧光探针卟啉—苯酯(p-Pium)，具有如下结构通式：
Figure BDA0002423317910000021
其中，
Figure BDA0002423317910000022
本发明的第二个目的是提供一种水溶性反应型硫化氢荧光探针的制备方法，包括如下步骤：
(1)将吡咯、苯甲醛、4-吡啶甲醛以4:3:1的摩尔比混合溶于二甲苯中，形成吡咯为0.4mmol/mL的溶液，加热回流反应2h。反应结束后，反应液冷却至常温，加入与反应液等体积的石油醚，使部分杂质析出，静置0.5h后减压蒸馏除去溶剂，得到5-(4-吡啶基)-10,15,20-三苯基卟啉(p-Py)粗品。将该粗品用硅胶柱进行纯化分离，以二氯甲烷和乙酸乙酯的混合液为洗脱剂(两者体积比为2:1)进行梯度洗脱，收集第二色带，可得到5-(4-吡啶基)-10,15,20-三苯基卟啉(p-Py)，其结构式如下：
Figure BDA0002423317910000031
(2)将5-(4-吡啶基)-10,15,20-三苯基卟啉(p-Py)溶于浓硫酸中，形成14.6mg/mL的溶液，加热回流反应9～15h，通过薄层色谱法(TLC)监控反应，至原料点消失停止反应。向反应液中加入氢氧化钠溶液中和至反应液pH至中性，于1000kDa的透析袋中透析 48～64h，冷冻干燥24～36h后，得到5-(4-吡啶基)-10,15,20-三(4-对磺酸基苯基)卟啉 (p-PyTS)，其结构式如下：
Figure BDA0002423317910000032
(3)将邻位取代苯甲酸衍生物(2-PA)溶于溶剂一中，形成0.3mmol/mL的溶液，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐，搅拌0.5h，然后加入4-甲基苯酚和4-二甲氨基吡啶，于室温下反应12～16h。其中邻位取代苯甲酸衍生物(2-PA)、1-乙基 -(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、4-甲基苯酚和4-二甲氨基吡啶的摩尔比为 1:1:1:0.1。反应结束后，采用薄层色谱法(TLC)验证无反应物残留后，反应液用水洗涤多次，收集有机相，干燥，减压蒸馏除去溶剂，粗产物经硅胶柱纯化分离，得到2-取代苯甲酸-4-甲基苯酯衍生物(2-PB)，其结构如下：
Figure BDA0002423317910000041
其中，
Figure BDA0002423317910000042
(4)将2-取代苯甲酸-4-甲基苯酯衍生物(2-PB)、N-溴代琥珀酰亚胺、过氧化苯甲酰以摩尔比为1:1:0.02的比例溶于溶剂二中，形成2-PB为0.2mmol/mL的溶液。磁力搅拌下加热回流2h，采用薄层色谱法(TLC)跟踪反应。反应液过滤，用溶剂二洗涤滤渣，合并滤液，减压蒸馏除去溶剂，粗产品经硅胶柱层析纯化分离得到2-取代苯甲酸-4-溴甲基苯酯衍生物(2-PBr)，其结构如下：
Figure BDA0002423317910000043
其中，
Figure BDA0002423317910000044
(5)将2-取代苯甲酸-4-溴甲基苯酯衍生物(2-PBr)与5-(4-吡啶基)-10,15,20-三(4- 对磺酸基苯基)卟啉(p-PyTS)以摩尔比为2:1的比例溶于溶剂三中，形成2-PBr为0.2mmol/mL的溶液，加热回流反应2h。反应结束后，冷却，溶液于1000kDa的透析袋中透析20～36h后冷冻干燥12～20h，得到终产物卟啉—苯酯(p-Pium)，其结构如下：
Figure BDA0002423317910000051
其中，
Figure BDA0002423317910000052
所述的溶剂一是二氯甲烷，溶剂二是四氯化碳，溶剂三是二甲基亚砜。
所述的邻位取代苯甲酸衍生物(2-PA)分别为2-甲酰基苯甲酸(2-PA(1))、2-亚甲基丙二腈苯甲酸(2-PA(2))和2-亚甲基氢乙酸乙酯苯甲酸(2-PA(3))。选择上述三种衍生物的原因：①这三种衍生物容易获得，可通过直接购买市售品或者经过一步Knoevengel缩合反应即可得到；②在实际反应中，产生的副产物较少。
所述的步骤(1)中吡咯、苯甲醛、4-吡啶甲醛的摩尔比优选为4:3:1，实验证明该摩尔比下5-(4-吡啶基)-10,15,20-三苯基卟啉(p-Py)的产率较高，同时减少了其他副产物的生成，有利于后续的纯化分离工作。
所述的步骤(2)中5-(4-吡啶基)-10,15,20-三(4-对磺酸基苯基)卟啉(p-PyTS)的合成参照文献：一种简便的合成与纯化四(4-磺酸基苯基)卟啉的方法(SrivastavaT.S., Tsutsui M.Unusual metalloporphyrins.XVI.Preparation and purification oftetrasodium meso-tetra(p-sulfophenyl)porphine.Easy procedure[J].The Journalof Organic Chemistry,1973, 38(11):2103-2103.)中报道的方法，优化了投料比和反应时间，从而提高了产率。
所述的步骤(1)中邻位取代苯甲酸衍生物(2-PA)应当先与1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐在溶剂中搅拌0.5h，产生活性的中间体，然后再加入4-甲基苯酚和4-二甲氨基吡啶进行终产物的生成。这样可保证最终产物具有较高的产率。该步骤中采用的投料顺序完全根据反应的机理进行设计，反应效果良好。
所述的步骤(4)中2-取代苯甲酸-4-溴甲基苯酯衍生物(2-PBr)的合成严格参照文献：一个合成盐酸奥扎格雷的新途径(Yu C.,Zhao B.,Zhao Y.,et al.A new route forthe synthesis of ozagrel hydrochloride[J].Organic Preparations and ProceduresInternational,2010,42(2): 183-185.)中报道方法进行。
所述的步骤(5)中2-取代苯甲酸-4-溴甲基苯酯衍生物(2-PBr)与5-(4-吡啶基) -10,15,20-三(4-对磺酸基苯基)卟啉(p-PyTS)的摩尔比优选为2:1，该比例提高了水溶性卟啉的转化率，缩短了反应时间，提高了后续透析冻干得到的产物的纯度。选用二甲基亚砜作为溶剂是因为该溶剂的沸点较高，并且两种反应物在该溶剂中的溶解度较大，利于反应的进行。
所述的反应型硫化氢荧光探针卟啉—苯酯(p-Pium)与硫化氢作用后，首先发生亲核加成反应，在苄位生成一个活泼的巯基，然后巯基进攻酯键发生分子内环合反应释放出游离的酚氧负离子，进而进行分子内的1,6-消除，释放出5-(4-吡啶基)-10,15,20-三(4-对磺酸基苯基)卟啉(p-PyTS)荧光团分子，从而造成卟啉信号基团的颜色及荧光特性发生改变，实现硫化氢的专一性检测。具体反应机理如下所示：
Figure BDA0002423317910000061
其中，
Figure BDA0002423317910000062
其中，
Figure BDA0002423317910000063
本发明提供了基于上述反应机理的反应型硫化氢荧光探针的制备方法制备的荧光探针卟啉—苯酯(p-Pium),具有良好水溶性和膜穿透性，可实现水溶液和活细胞中的微量硫化氢检测的应用。
本发明具有如下优点：
(1)本发明的反应型硫化氢荧光探针卟啉—苯酯(p-Pium)的合成方法简便、产物分离简便；
(2)本发明利用硫化氢可促使含酯键的探针发生特殊的分子内1,6-消除反应的特性，实现了硫化氢检测的专一性与准确性；
(3)本发明以卟啉分子为荧光基团，该分子光学性能优异、结构稳定、有较大的Stocks 位移、较多的修饰位点和较好的生物相容性；
(4)本发明的反应型硫化氢荧光探针卟啉—苯酯(p-Pium)具有良好的水溶性，无需其他有机溶剂辅助溶解，可实现水溶液中低浓度硫化氢的检测，同时具有很高的选择性；
(5)借助于激光共聚焦扫描显微技术，本发明的反应型硫化氢荧光探针卟啉—苯酯 (p-Pium)可实现活细胞内的硫化氢荧光成像。
附图说明
图1为实施例1制备的卟啉—苯酯(p-Pium(1))探针溶液对不同离子的荧光变化图；
图2为实施例1制备的卟啉—苯酯(p-Pium(1))探针的硫化氢滴定荧光光谱图；
图3为实施例1制备的卟啉—苯酯(p-Pium(1))探针的细胞内硫化氢检测的荧光显微镜图片。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明做进一步说明，但不限于此。
本发明所用原料，如无特殊说明均为市购产品。
本发明所用的有机溶剂均为重新蒸馏之后的溶剂，所用的水均为蒸馏水。
实施例1
将吡咯(2.7g,0.04mol)、苯甲醛(3.18g,0.03mol)和4-吡啶甲醛(1.07g,0.01mol)溶于100mL二甲苯中，形成吡咯为0.4mmol/mL的溶液，加热至120℃，反应2h后停止加热，冷却至常温；反应液加入100mL石油醚，静置0.5h后，将混合液减压蒸馏除去溶剂，得到黑色油状固体。以二氯甲烷和乙酸乙酯体积比为2:1为洗脱剂，通过硅胶柱进行纯化分离，收集第二色带，除去溶剂得到紫色固体，即为5-(4-吡啶基)-5,10,15-三苯基卟啉(p-Py)；
将5-(4-吡啶基)-5,10,15-三苯基卟啉(p-Py)(117mg,0.19mmol)溶于8mL浓硫酸中，形成14.6mg/mL的溶液，加热回流反应9h，然后停止加热冷却至常温；反应液中加入1mol/L的氢氧化钠溶液至pH为7左右，于1000kDa的透析袋中透析48h，冷冻干燥24h后得到5-(4-吡啶基)-10,15,20-三(4-对磺酸基苯基)卟啉(p-PyTS)；
将2-甲酰基苯甲酸(450mg,3mmol)溶于10mL二氯甲烷中形成0.3mmol/mL的溶液，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(573mg,3mmol)搅拌0.5h，然后加入4-甲基苯酚(324mg,3mmol)和4-二甲氨基吡啶(37mg,0.3mmol)，于室温反应13h。反应结束后，反应液用水洗涤3次，干燥，减压蒸馏除去溶剂，以石油醚和乙酸乙酯混合液为洗脱剂(两者体积比为石油醚：乙酸乙酯＝9:1)，经硅胶柱纯化分离得到2- 甲酰基苯甲酸-4-甲基苯酯(2-PB(1))；
将2-甲酰基苯甲酸-4-甲基苯酯(2-PB(1))(480mg,2mmol)溶于10mL四氯化碳中，加入N-溴代琥珀酰亚胺(356mg,2mmol)和过氧化苯甲酰(10mg,0.04mmol)，搅拌下加热回流反应2h，冷却至常温。反应液过滤，用四氯化碳洗涤滤渣，合并滤液，减压蒸馏除去溶剂，以石油醚和乙酸乙酯混合液为洗脱剂(两者体积比为石油醚：乙酸乙酯＝7:1)，经硅胶柱纯化分离得到2-甲酰基苯甲酸-4-溴甲基苯酯(2-PBr(1))；
将2-甲酰基苯甲酸-4-溴甲基苯酯(2-PBr(1))(638mg,2mmol)与5-(4-吡啶基) -10,15,20-三(4-磺酸基苯基)卟啉(p-PyTS)(852mg,1mmol)溶于10mL二甲基亚砜中，加热回流反应2h。反应液于1000kDa的透析袋中透析30h后冷冻干燥18h，得到终产物卟啉—苯酯(p-Pium(1))。其结构式如下：
Figure BDA0002423317910000081
实施例2：
5-(4-吡啶基)-10,15,20-三(4-磺酸基苯基)卟啉(p-PyTS)的合成方法同实施例1。
将2-亚甲基丙二腈苯甲酸(594mg,3mmol)溶于10mL二氯甲烷中形成0.3mmol/mL的溶液，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(573mg,3mmol)搅拌0.5 h，然后加入4-甲基苯酚(324mg,3mmol)和4-二甲氨基吡啶(37mg,0.3mmol)，于室温下反应12h。反应结束后，反应液用水洗涤3次，干燥，减压蒸馏除去溶剂，经硅胶柱纯化分离得到2-亚甲基丙二腈苯甲酸-4-甲基苯酯(2-PB(2))；
将2-亚甲基丙二腈苯甲酸-4-甲基苯酯(2-PB(2))(576mg,2mmol)溶于10mL四氯化碳中，加入N-溴代琥珀酰亚胺(356mg,2mmol)和过氧化苯甲酰(10mg,0.04mmol)，搅拌下加热回流反应2h，冷却至常温。反应液过滤，用四氯化碳洗涤滤渣，合并滤液，减压蒸馏除去溶剂，经硅胶柱纯化分离得到2-亚甲基丙二腈苯甲酸-4-溴甲基苯酯 (2-PBr(2))；
将2-亚甲基丙二腈苯甲酸-4-溴甲基苯酯(2-PBr(2))(734mg,2mmol)与5-(4-吡啶基)-10,15,20-三(4-磺酸基苯基)卟啉(p-PyTS)(852mg,1mmol)溶于10mL二甲基亚砜中，加热回流反应2h。反应液于1000kDa的透析袋中透析30h后冷冻干燥18h，，得到终产物卟啉—苯酯(p-Pium(2))。其结构式如下：
Figure BDA0002423317910000091
实施例3：
5-(4-吡啶基)-10,15,20-三(4-磺酸基苯基)卟啉(p-PyTS)的合成方法同实施例1。
将2-亚甲基氰乙酸乙酯苯甲酸(735mg,3mmol)溶于10mL二氯甲烷中形成0.3mmol/mL的溶液，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(573mg,3mmol) 搅拌0.5h，然后加入4-甲基苯酚(324mg,3mmol)和4-二甲氨基吡啶(37mg,0.3mmol)，于室温下反应12h。反应结束后，反应液用水洗涤3次，干燥，减压蒸馏除去溶剂，经硅胶柱纯化分离得到2-亚甲基氰乙酸乙酯苯甲酸-4-甲基苯酯(2-PB(3))；
将2-亚甲基氰乙酸乙酯苯甲酸-4-甲基苯酯(2-PB(3))(670mg,2mmol)溶于10mL四氯化碳中，加入N-溴代琥珀酰亚胺(356mg,2mmol)和过氧化苯甲酰(10mg,0.04mmol)，搅拌下加热回流反应2h，冷却至常温。反应液过滤，用四氯化碳洗涤滤渣，合并滤液，减压蒸馏除去溶剂，经硅胶柱纯化分离得到2-亚甲基氰乙酸乙酯苯甲酸-4-溴甲基苯酯 (2-PBr(3))；
将2-亚甲基氰乙酸乙酯苯甲酸-4-溴甲基苯酯(2-PBr(3))(828mg,2mmol)与5-(4-吡啶基)-10,15,20-三(4-磺酸基苯基)卟啉(p-PyTS)(852mg,1mmol)溶于10mL二甲基亚砜中，加热回流反应2h。反应液于1000kDa的透析袋中透析30h后冷冻干燥18h，，得到终产物卟啉—苯酯(p-Pium(3))。其结构式如下：
Figure BDA0002423317910000101
应用例1
卟啉—苯酯(p-Pium)探针分子对水溶液中硫化氢的选择性检测：由于只有硫化氢可促使含酯键的探针发生特殊的分子内1,6-消除反应的特性，引起卟啉信号基团发生光谱信号响应，因此可将一定浓度的p-Pium分子水溶液中分别加入等浓度的不同离子，测定相应的荧光光谱。具体过程如下：取若干10mL容量瓶，分别在其中加入实施例1中制备的 p-Pium(1)水溶液5.0mL(10μM)后，再在每个容量瓶中分别加入等当量的其他离子水溶液5.0mL，静置5分钟后，采用荧光光谱分别测定每个容量瓶中溶液的荧光变化谱图。结果如图1所示。只有硫化氢的加入可使p-Pium(1)分子水溶液的荧光强度发生显著增强，其他离子均无明显荧光强度变化，说明p-Pium(1)探针对有硫化氢有较高的选择性(图1)。
荧光光谱仪的参数如下：激发波波长为420nm；接收波波段为525nm～775nm。
应用例2
卟啉—苯酯(p-Pium)探针分子对水溶液中不同浓度硫化氢的荧光滴定：在10mL容量瓶中加入实施例1中制备的卟啉—苯酯(p-Pium(1))水溶液5.0mL(10μM)后，再分别加入不同浓度的硫化氢，采用蒸馏水稀释定容至10.0mL，静置5分钟后，采用荧光光谱测定加入不同硫化氢的荧光变化谱图。结果如图2所示。随着硫化氢浓度的增强，溶液的荧光强度逐渐增强，说明p-Pium(1)溶液对于硫化氢表现出荧光增强型(turn-on)荧光响应。
荧光光谱仪的参数如下：激发波波长为420nm；接收波波段为525nm～775nm。
应用例3
实验之前采用磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.4)配制1mM的由实施例1制备的卟啉—苯酯(p-Pium(1))探针分子储备液。取上述150μL p-Pium(1)分子储备液分别加入含有贴壁细胞的培养基中，置于37℃的5％培养箱中孵育15min后，用磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.4)清洗3次，以除去培养基中过量的未进入细胞的p-Pium(1)探针分子。取其中一个经 p-Pium(1)分子孵育的细胞培养基，进一步加入2当量的硫化氢水溶液150μL，置于37℃的5％培养箱中孵育15min后，用磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.4)清洗3次，以除去培养基中过量的未进入细胞的硫化氢。将以上两组细胞分别固定在96孔板上后，采用奥林巴斯FV1000激光共聚焦显微镜观察成像情况。结果如图3所示。可以看出，未加入硫化氢之前，细胞内无明显荧光；硫化氢加入后，细胞内呈现出明显的荧光增强。说明所合成的 p-Pium(1)分子具有良好的细胞膜穿透性，且对细胞内硫化氢表现出优异的检测性能。
激光共聚焦显微镜的参数如下：a.激光功率是氩离子激光器总输出功率50mW的20％，激发光波长488nm，分光镜为TD 488/543/633nm，检测发射波段为575nm～700nm；b.激光扫描强度是激光输出功率的10％；c.探测针孔为1Airy单位；d.光电倍增管电压为1000V。
对比实施例
本发明对比已报道的荧光探针，具有水溶性好、背景干扰低和制备简便等优点，具体对比实施例如下。
对比实施例1
在文献(Cheng J.,Song J.,Niu H.,et al.A new rosamine-based fluorescentchemodosimeter for hydrogen sulfide and its bioimaging in live cells[J].NewJournal of Chemistry,2016,40(7):6384-6388.)中，作者基于还原反应机理，设计合成了探针RosN3。该探针以红色碱性染料为荧光团，以叠氮基为识别基团，经环合、还原和叠氮化三步反应得到。但作者在使用该探针时，需要在DMF/PBS缓冲液(体积比为6:4)中对硫化氢进行检测。DMF是有毒的有机溶剂，尽管可以增大探针的溶解，但是不利于进一步生物应用。同时该探针属于猝灭型探针，可以实现细胞内的荧光成像，但是无法进一步的进行硫化氢的体内追踪，也限制了该探针的应用。
对比实施例2
在文献(Wang K.,Zhang Q.,Wang X.,et al.A fluorescent probe based ontetrahydro[5]helicene derivative with large Stokes shift for rapid and highlyselective recognition of hydrogen sulfide[J].Spectrochimica Acta Part A:Molecular and Biomolecular Spectroscopy,2019,214:487-495.)中，作者基于亲核取代反应机理，通过溴化、酯化、偶联和磺酸酯化四步反应得到探针H-DNP。尽管四步反应的产率都较高，但是其中偶联反应条件较为苛刻，限制了其应用。该探针在检测时，需要大量的DMSO辅助溶解，表明该探针的水溶性有限。探针H-DNP的荧光发射波长在500nm左右，该区段的背景干扰相对更强。综合来看，上述几个缺陷都限制了该探针进一步的生物应用。
而本发明中报道的探针，反应步骤均为简单的反应过程，后处理方便。同时探针分子水溶性很强，荧光发射波长在650nm附近，更加接近红光区。综上，本专利报道的分子更具优势。
对比实施例3
在文献(Yang L.,Wang J.,Yang L.,et al.Fluorescent paper sensorfabricated by carbazole-based probes for dual visual detection of Cu2+andgaseous H2S[J].RSC Advances, 2016,6(61):56384-56391.)中，作者以3-氨基-9-乙基咔唑为起始原料，经卤代和肼解两步反应得到探针CAH。该探针基于沉淀反应机理设计，先形成CAH-Cu2+复合物然后才能应用于硫化氢的检测，同时该探针仅有水溶液和空气中的检测，并未报道在细胞成像中的应用。
而本发明中探针的使用无需任何前处理过程，而且实现了水溶液中的检测以及活细胞中的生物成像，具有更广泛的开发应用潜力。

Claims (6)

1.一种反应型硫化氢荧光探针，其特征在于，所述的探针分子的结构式如下：
Figure FDA0003601782960000011
其中，
Figure FDA0003601782960000012
2.如权利要求1所述的一种反应型硫化氢荧光探针的制备方法，包括如下步骤：
(1)将邻位取代苯甲酸衍生物溶于溶剂一中，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐搅拌均匀，然后加入4-甲基苯酚和4-二甲氨基吡啶，于室温下反应12～16h；其中邻位取代苯甲酸衍生物、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、4-甲基苯酚和4-二甲氨基吡啶的摩尔比为1:1:1:0.1；反应结束后，反应液用水洗涤多次，干燥，减压蒸馏除去溶剂，所得固体经硅胶柱纯化分离得到2-取代苯甲酸-4-甲基苯酯衍生物2-PB；
(2)将2-取代苯甲酸-4-甲基苯酯衍生物2-PB、N-溴代琥珀酰亚胺与过氧化苯甲酰以摩尔比为1:1:0.02的比例溶于溶剂二中，搅拌下加热回流反应2～4h，冷却至常温；反应液过滤，用溶剂二洗涤滤渣，合并滤液，减压蒸馏除去溶剂，所得固体经硅胶柱纯化分离得到2-取代苯甲酸-4-溴甲基苯酯衍生物2-PBr；
(3)将2-取代苯甲酸-4-溴甲基苯酯衍生物2-PBr与5-(4-吡啶基)-10,15,20-三(4-对磺酸基苯基)卟啉p-PyTS以2:1的摩尔比溶于溶剂三中，加热回流2h；反应液于1000kDa的透析袋中透析20～36h，冷冻干燥12～20h，得到终产物卟啉—苯酯p-Pium；
所述卟啉—苯酯p-Pium为：
Figure FDA0003601782960000021
其中，
Figure FDA0003601782960000022
2-取代苯甲酸-4-溴甲基苯酯衍生物2-PBr为：
Figure FDA0003601782960000023
其中，
Figure FDA0003601782960000024
3.根据权利要求2所述的一种反应型硫化氢荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤(1)(2)(3)中所述溶剂一是二氯甲烷，所述溶剂二是四氯化碳，所述溶剂三是二甲基亚砜。
4.根据权利要求2所述的一种反应型硫化氢荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤(1)中邻位取代苯甲酸衍生物分别为2-甲酰基苯甲酸(2-PA1)、2-亚甲基丙二腈苯甲酸(2-PA2)和2-亚甲基氰乙酸乙酯苯甲酸(2-PA3)，其结构式如下：
Figure FDA0003601782960000025
5.根据权利要求2所述的一种反应型硫化氢荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤(1)中邻位取代苯甲酸衍生物与1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐在溶剂一中需搅拌0.5h再加入其它反应物。
6.根据权利要求2所述的一种反应型硫化氢荧光探针的制备方法制备的荧光探针卟啉—苯酯(p-Pium)在水溶液中硫化氢检测的应用。
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