CN106459125A - 酶特异性的细胞内滞留性荧光化合物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种包含下述式(I')所表示的化合物或其盐的酶特异性滞留性荧光化合物,其在靶细胞、特别是β‑半乳糖苷酶等报告酶表达细胞中特异性地发出荧光,并且与该细胞内的蛋白质进行共价键合,由此表现出优异的细胞内滞留性。式(I')中的A、X、Y、R1~R9如权利要求1中所记载。
Description
技术领域
本发明涉及一种滞留于靶细胞中并能够在该细胞中特异性地起作用的新型荧光化合物;以及利用该化合物特异性地对表达了特定酶的靶细胞进行成像的方法、该成像中使用的探针和包含该探针的检测试剂盒、检测剂、诊断剂或试剂盒。更详细而言,涉及一种选择性地将表达β-半乳糖苷酶等报告酶的细胞可视化的荧光化合物和使用了该荧光化合物的成像方法、成像探针、检测剂、诊断剂或试剂盒。
背景技术
报告蛋白对于生命科学发展的贡献是不可估量的。报告蛋白之中最为通用的是β-半乳糖苷酶。近年来有文献暗示老化与细胞的β半乳糖苷酶的表达存在关联(非专利文献1),β-半乳糖苷酶的酶特异性成像探针作为用于阐明细胞的老化机理的分子工具也很重要。此外,有文献显示在某种癌细胞中β半乳糖苷酶活性上升(非专利文献2、非专利文献3),因此,认为β-半乳糖苷酶的酶特异性成像探针也可以用作癌细胞选择性的荧光成像探针。
以往,以X-Gal作为底物来对酶活性进行成像的方法得到广泛利用(非专利文献4),但X-Gal无法应用于活细胞,因此希望开发出能够应用于活细胞的酶活性成像探针。迄今为止已开发了许多能够应用于活细胞的成像探针。例如,作为通过在分子内控制螺环化反应而能够激发可见光的、能够应用于活细胞和活的生物体组织的β半乳糖苷酶荧光探针,正在进行HMDER-βGal等的开发(非专利文献5、专利文献1)。但是,这些荧光探针均有酶反应产物从细胞漏出,或者使用细胞损伤性的紫外光作为激发光,因此难以以单细胞水平明确地对活细胞等进行成像。另外,迄今为止的癌探针还存在为了进行病理诊断而将切片固定化、由此漏出到细胞外而无法用于病理诊断的问题。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:国际公开2005/024049号
非专利文献
非专利文献1:G.P.Dimri et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1995,92,9363-9367.
非专利文献2:H.B.Bosmann et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1974,71,1833-1837.
非专利文献3:S.K.Chatterjee et al.,Cancer Res.,1979,39,1943-1951.
非专利文献4:F.D.-Chainiaux et al.,Nat.Protoc.,2009,4,1798-1806.
非专利文献5:M.Kamiya et al.,J.Am.Chem.Soc.2011,133,12960-12963.
发明内容
发明所要解决的课题
本发明所要解决的课题在于提供一种荧光化合物、使用了该荧光化合物的荧光成像探针、使用了该荧光探针的检测方法、检测试剂盒或检测剂,该荧光化合物在以酶活性特异性的方式产生荧光的同时,滞留于具有该酶的细胞内,由此能够在不固定该细胞的情况下或者在固定的状态下以单细胞水平选择性地将该细胞可视化。
用于解决课题的方法
本发明人为了解决上述课题进行了深入研究,结果发现,通过合成具有在以呫吨环作为荧光团的荧光色素与报告酶的反应之后使荧光色素变为醌甲基化物的取代基的酶底物并进行其结构的优化,能够得到通过与β半乳糖苷酶等报告酶的反应才显示出荧光性、并且显示出优异的细胞内滞留性的荧光成像探针。基于该见解,完成了本发明。
即,本发明在一个方式中提供一种酶特异性滞留性荧光化合物,其包含下述式(I)所表示的化合物或其盐。
(式中,A表示可被酶切断的一价基团;R1表示氢原子或与苯环键合的1个~4个相同或不同的取代基;R3、R4、R5和R6各自独立地表示-CFR10R11或-CF2R12、或者氢原子、羟基、烷基或卤原子;R2和R7各自独立地表示氢原子、羟基、烷基或卤原子;R8和R9各自独立地表示氢原子或烷基;R10、R11和R12各自独立地表示氢原子、烷基或烯基;X表示氧原子、Se、CR13R14或SiR15R16;R13、R14、R15和R16各自独立地表示氢原子或烷基;Y表示C1-C3亚烷基;Z表示氧原子或NR17;R17表示氢原子或烷基,此处,R3、R4、R5和R6中的至少一者表示-CFR10R11或-CF2R12。)
在优选的方式中,该酶特异性滞留性荧光化合物由下式所表示。
(式中,A、R1~R9、X、Y与式(I)相同。)
在优选的方式中,R3、R4、R5和R6中的至少一者为-CFR10R11。
在优选的方式中,R3、R4、R5和R6中的至少一者为-CH2F。
在优选的方式中,A为可被包含报告酶的水解酶、或者在癌细胞中特异性地表达或活化的酶所切断的基团,更优选A为吡喃半乳糖基、报告酶为β-半乳糖苷酶。
在进一步优选的方式中,酶特异性滞留性荧光化合物或其盐为(Ia)~(Ic)所表示的化合物或其盐。
在其它方式中,本发明涉及一种荧光探针,其含有式(I)、(I’)或(Ia)~(Ic)所表示的酶特异性滞留性荧光化合物。
在其它方式中,本发明涉及一种用于检测表达了特定酶的靶细胞或用于将该靶细胞可视化的组合物或试剂盒,其含有式(I)、(I’)或(Ia)~(Ic)所表示的酶特异性滞留性荧光化合物。优选该靶细胞为β-半乳糖苷酶表达细胞,进一步优选靶细胞为癌细胞。
在其它方式中,本发明涉及一种检测表达了特定酶的靶细胞的方法,该方法使用式(I)、(I’)或(Ia)~(Ic)所表示的酶特异性滞留性荧光化合物来检测表达了特定酶的靶细胞。优选的是,在该方法中,使酶特异性滞留性荧光化合物与在该靶细胞中特异性表达的酶在生物体外或生物体内接触来检测表达了特定酶的靶细胞。更优选的是,涉及一种检测上述表达了特定酶的靶细胞的方法,其特征在于,包括下述步骤:使酶特异性滞留性荧光化合物与在该靶细胞中特异性表达的酶在生物体外或生物体内接触的步骤;和进行激发光照射而产生荧光的步骤。更优选在该方法中靶细胞为β-半乳糖苷酶表达细胞,进一步优选靶细胞为癌细胞。
在其它方式中,本发明涉及在用于制造式(I)时使用的、下述式(II)所表示的化合物。
(式中,R3、R4、R5和R6各自独立地表示-C(=O)H、氢原子、羟基、烷基或卤原子;R2和R7各自独立地表示氢原子、羟基、烷基或卤原子;R8和R9各自独立地表示氢原子或烷基;X表示氧原子或Se、CR13R14或SiR15R16;R13、R14、R15和R16各自独立地表示氢原子或烷基;Y表示C1-C3亚烷基,此处,R3、R4、R5和R6中的至少一者表示-C(=O)H。)
在更优选的方式中,式(II)的化合物为下述式(IIa)或(IIb)所表示的化合物。
发明的效果
本发明的酶特异性滞留性荧光化合物通过酶反应而使可见光吸收发生变化,同时利用生成的醌甲基化物与细胞内共存的蛋白质进行共价键合,由此表现出优异的细胞内滞留性。这些效果进行组合的结果,能够将表达该酶的靶细胞在活细胞的状态或者固定的状态下以单细胞水平这样详细的水平进行可视化。本发明的酶特异性滞留性荧光化合物除了可以作为用于阐明细胞的老化机理的分子工具来利用外,认为其还可以在某种癌细胞中作为选择性的荧光成像探针来利用。此外,利用本发明的酶特异性滞留性荧光化合物的成像方法可以使用通常的能够进行细胞成像的显微镜来实施,不需要特别的设备。并且,能够以单细胞水平进行荧光成像,因而能够追踪各个细胞的经时变化,还能够利用癌细胞选择性的荧光成像,在不残留癌组织的情况下进行外科切除。如此,认为本发明的酶特异性滞留性荧光化合物的工业上的利用价值、经济效益极大。
附图说明
图1是示出通过作为本发明的酶特异性滞留性荧光化合物的2-CHF2-HMDER-βGal与β-半乳糖苷酶的酶反应而生成的荧光的强度(a)、吸收光谱变化(b)、荧光光谱(c)的图。
图2是示出通过作为本发明的酶特异性滞留性荧光化合物的4-CHF2-HMDER-βGal与β-半乳糖苷酶的酶反应而生成的荧光的强度(a)、吸收光谱变化(b)、荧光光谱(c)的图。
图3是示出通过作为本发明的酶特异性滞留性荧光化合物的4-CH2F-HMDER-βGal与β-半乳糖苷酶的酶反应而生成的荧光强度(a)、吸收光谱变化(b)、荧光光谱(c)的图。
图4是示出通过使作为本发明的酶特异性滞留性荧光化合物的2-CHF2-HMDER-βGal、4-CHF2-HMDER-βGal和4-CH2F-HMDER-βGal与β-半乳糖苷酶进行酶反应、从而能够对溶液中共存的蛋白质BSA进行荧光标记的图。(a)是利用波长488nm的激发光来激发SDS-PAGE凝胶时得到的荧光图像。泳道1:2.5μM4-CH2F-HMDER-βGal和0.5mg/mL BSA、泳道2:2.5μM4-CH2F-HMDER-βGal、0.5mg/mL BSA和5Uβ-半乳糖苷酶、泳道3:2.5μM 4-CHF2-HMDER-βGal、0.5mg/mL BSA和5Uβ-半乳糖苷酶、泳道4:2.5μM 2-CHF2-HMDER-βGal、0.5mg/mL BSA和5Uβ-半乳糖苷酶、泳道5:2.5μM HMDER-βGal、0.5mg/mL BSA和5Uβ-半乳糖苷酶。(b)对上述SDS-PAGE凝胶进行了考马斯染色。
图5是示出作为本发明的酶特异性滞留性荧光化合物的2-CHF2-HMDER-βGal、4-CHF2-HMDER-βGal和4-CH2F-HMDER-βGal对细胞内蛋白质进行酶活性特异性的荧光标记的图。(a)是利用波长488nm的激发光来激发SDS-PAGE凝胶时得到的荧光图像。泳道1:2.5μM4-CH2F-HMDER-βGal和20μL 1.5mg/mL HEK细胞裂解物、泳道2:2.5μM 4-CH2F-HMDER-βGal和20μL 1.5mg/mL HEK-lacZ细胞裂解物、泳道3:2.5μM 4-CHF2-HMDER-βGal和20μL 1.5mg/mLHEK-lacZ细胞裂解物、泳道4:2.5μM2-CHF2-HMDER-βGal和20μL 1.5mg/mL HEK-lacZ细胞裂解物、泳道5:2.5μM HMDER-βGal和20μL 1.5mg/mL HEK-lacZ细胞裂解物。(b)对上述SDS-PAGE凝胶进行了考马斯染色。
图6是示出作为本发明的酶特异性滞留性荧光化合物的4-CH2F-HMDER-βGal能够用于单细胞水平的活细胞荧光成像的图。
图7是示出作为本发明的酶特异性滞留性荧光化合物的4-CH2F-HMDER-βGal具有优异的细胞内滞留性的图。
图8是示出通过使用作为本发明的酶特异性滞留性荧光化合物的4-CH2F-HMDER-βGal,对于进行了固定处理的试样也能够与活细胞同样地进行荧光成像的图。
图9是示出通过利用作为本发明的酶特异性滞留性荧光化合物的4-CH2F-HMDER-βGal而能够利用流式细胞术对酶活性不同的细胞进行检测或区分的图。(a)是与4-CH2F-HMDER-βGal反应后的HEK细胞、HEK-LacZ细胞、和它们的混合物的流式细胞术结果。(b)是与HMDER-βGal反应后的HEK细胞、HEK-LacZ细胞和它们的混合物的流式细胞术结果。
图10是示出作为本发明的酶特异性滞留性荧光化合物的4-CH2F-HMDER-βGal能够应用于生物体组织的荧光成像的图。(a)是与4-CH2F-HMDER-βGal反应后的蝇翅原基组织的图像。左起为荧光图像、明视野图像、它们的合并图像。(b)是与HMDER-βGal反应后的蝇翅原基组织的图像。左起为荧光图像、明视野图像、它们的合并图像。
图11是示出作为本发明的酶特异性滞留性荧光化合物的4-CH2F-HMDER-βGal能够应用于单细胞荧光成像的图。(a)是与4-CH2F-HMDER-βGal反应后的果蝇(esg-lacZ)的图像。左起为荧光图像、明视野图像、它们的合并图像。(b)为果蝇肠道细胞(esg-GFP)。左起为荧光图像、明视野图像、它们的合并图像。
图12是示出作为本发明的酶特异性滞留性荧光化合物的4-CH2F-HMDER-βGal能够应用于癌部位选择性荧光成像的荧光光谱图像。白色箭头表示肿瘤的位置。解混(Unmixed)是利用荧光光谱将自身荧光与荧光光谱进行了分离。
图13是示出作为本发明的酶特异性滞留性荧光化合物的4-CH2F-HMDER-βGal能够应用于生物体内的未固定细胞群的荧光成像的图。
图14是示出作为本发明的酶特异性滞留性荧光化合物的4-CH2F-HMDER-βGal能够应用于在生物体组织内随机表达的β半乳糖苷酶活性的单细胞荧光成像的图。
具体实施方式
以下,对本发明的实施方式进行说明。本发明的范围不受这些说明的限制,在下述例示之外,也可以在不损害本发明的主旨的范围内适当变更而实施。
本说明书中,烷基或烯基可以为由直链状、支链状、环状或它们的组合构成的烷基或烯基中的任一种。烷基或烯基的碳原子数没有特别限定,例如碳原子数为1~6个左右、优选碳原子数为1~4个左右、更优选碳原子数为1或2个左右。本说明书中,烷基或烯基可以具有1个以上的任意取代基。作为该取代基,可以举出例如烷氧基、卤原子(可以为氟原子、氯原子、溴原子或碘原子中的任一种)、氨基、单取代氨基或二取代氨基、取代甲硅烷基、酰基或芳基等,但不限于这些。在烷基或烯基具有2个以上取代基的情况下,它们可以相同也可以不同。对于包含烷基部分或烯基部分的其它取代基(例如烷氧基或芳烷基等)的烷基部分或烯基部分也是同样。
(1)酶特异性滞留性荧光化合物
本发明的酶特异性滞留性荧光化合物在一个方式中为具有下述通式(I)所表示的结构的化合物。
上述通式(I)中,R1表示氢原子或与苯环键合的1个~4个取代基。作为取代基,可以举出例如烷基、烷氧基、卤原子、氨基、单取代氨基或二取代氨基、取代甲硅烷基或酰基等,但不限于这些。在苯环上具有2个以上取代基的情况下,它们可以相同也可以不同。作为R1,更优选为氢原子、低级烷基或低级烷氧基。特别优选氢原子。
R3、R4、R5和R6各自独立地表示-CFR10R11或-CF2R12、或者氢原子、羟基、烷基或卤原子,R10、R11和R12各自独立地表示氢原子、烷基或烯基,进一步,此处,R3、R4、R5和R6中的至少一者表示-CFR10R11或-CF2R12。优选R3、R4、R5和R6中的至少一者为-CFR10R11。进一步优选R3、R4、R5和R6中的至少一者为-CH2F。
R2和R7各自独立地表示氢原子、羟基、烷基或卤原子。R2、R7优选为氢原子。
R8和R9各自独立地表示氢原子或烷基。在R8和R9均表示烷基的情况下,它们可以相同也可以不同。例如,优选R8和R9各自独立地为甲基或乙基,进一步优选R8和R9均为乙基的情况。
X表示氧原子、Se、CR13R14或SiR15R16。R13、R14、R15和R16各自独立地表示氢原子或烷基。这些之中优选氧原子。
Y表示C1-C3亚烷基。亚烷基可以为直链状亚烷基或支链状亚烷基中的任一种。例如,除了亚甲基(-CH2-)、亚乙基(-CH2-CH2-)、亚丙基(-CH2-CH2-CH2-)外,还可以使用作为支链状亚烷基的-CH(CH3)-、-CH2-CH(CH3)-、-CH(CH2CH3)-等。这些之中,优选亚甲基或亚乙基,进一步优选亚甲基。
Z表示氧原子或NR17,R17表示氢原子或烷基。这些之中优选氧原子。
基团A表示可被酶切断的一价基团,具体而言,可以举出例如β-吡喃半乳糖基、α-甘露糖基、β-N-乙酰葡糖胺基、β-内酰胺环、磷酸酯、氨基苯氧基、羟基苯氧基、γ-谷氨酸等,但不限于这些。
作为用于切断A的酶,可以举出例如还原酶、氧化酶或水解酶等,可以举出报告酶或在癌细胞中特异性地表达或活化的酶,更具体而言,可以举出β-半乳糖苷酶、β-内酰胺酶、α-甘露糖苷酶、酯酶、碱性磷酸酶、荧光素酶、过氧化物酶、细胞色素P450氧化酶、β-葡糖苷酶、β-葡萄糖醛酸酶、β-氨基己糖苷酶、乳糖酶、γ-谷氨酰转移酶等,但不限于这些。优选为β-半乳糖苷酶、β-内酰胺酶、碱性磷酸酶、荧光素酶、β-氨基己糖苷酶、过氧化物酶或γ-谷氨酰转移酶。最优选为β-半乳糖苷酶。
上述式(I)所表示的化合物(包括式(I’)、(Ia)~(Ic)的方式的情况。下述记载中也相同。)有时以盐的形式存在。作为盐,可以举出碱加成盐、酸加成盐、氨基酸盐等。作为碱加成盐,可以举出例如钠盐、钾盐、钙盐、镁盐等金属盐、铵盐、或三乙胺盐、哌啶盐、吗啉盐等有机胺盐,作为酸加成盐,可以举出例如盐酸盐、硫酸盐、硝酸盐等无机酸盐、甲磺酸盐、对甲苯磺酸盐、柠檬酸盐、草酸盐等有机酸盐。作为氨基酸盐,可以例示甘氨酸盐等。但是,本发明的化合物的盐不限于这些。
式(I)所表示的化合物根据取代基的种类有时具有1个或2个以上的不对称碳,有时存在光学异构体或非对映异构体等立体异构体。纯粹形态的立体异构体、立体异构体的任意的混合物、外消旋体等均包含于本发明的范围内。
式(I)所表示的化合物或其盐有时也以水合物或溶剂化物的形式存在,这些物质均包含于本发明的范围内。形成溶剂化物的溶剂的种类没有特别限定,可以例示例如乙醇、丙酮、异丙醇等溶剂。
本说明书的实施例中具体示出了关于通式(I)所表示的本发明的化合物中包含的代表性化合物的制造方法,因此,本领域技术人员通过参照本说明书的公开内容、并且根据需要适当选择起始原料、试剂、反应条件等,能够容易地制造通式(I)中包含的任意的化合物。
(2)本发明的化合物的荧光发光和细胞内滞留的机理
认为:在将由本发明提供的式(I)所表示的酶特异性滞留性荧光化合物摄取到细胞内的情况下,在表达了能够将A所表示的基团切断的酶的细胞中,在该细胞内,A所表示的基团被切断,同时氟化氢从位于R3、R4、R5或R6处的-CFR10R11或-CF2R12上脱离,生成醌甲基化物。醌甲基化物迅速受到周围的亲核试剂的攻击,因而在细胞内生成醌甲基化物的情况下,与周围的蛋白质所具有的亲核基团迅速反应,与蛋白质不可逆地发生结合。
例如,在式(Ib)的化合物的情况下,如下所述利用β-半乳糖苷酶产生基团A的切断和螺环的开环,生成与细胞内蛋白质进行共价键合的荧光化合物(III)。关于与式(III)类似的化合物发出荧光的机理,如国际公开2005/024049号所记载,本领域技术人员知晓其详细情况。
通式(I)所表示的化合物或其盐在中性区域照射例如440~550nm左右的激发光的情况下,几乎不发出荧光,但利用酶活性而产生的开环化合物在相同条件下具有发出极强的荧光的性质。因此,在摄取了式(I)所表示的酶特异性滞留性荧光化合物的细胞不表达能够将A所表示的基团切断的酶的情况下,不生成式(III)所表示的那样的开环化合物,在该细胞内不会生成荧光物质。这样,通过使用式(I)所表示的酶特异性滞留性荧光化合物,仅在表达和活化了能够将A所表示的基团切断的酶的细胞中选择性地生成荧光。此外,式(III)等所表示的反应生成化合物由于与细胞内蛋白质进行了共价键合而抑制了向细胞外的漏出,由此,能够特异性地将表达和活化了该酶的细胞以单细胞水平这样的详细水平进行可视化。
基于上述特性,本发明的式(I)所表示的化合物能够在不对细胞进行固定处理的情况下、或者在固定处理后以单细胞水平详细地将细胞可视化,除了作为荧光探针用于细胞系中的细胞生物学的研究用工具外,还具有在癌症等的手术现场的快速病理检查中使用的检查剂、诊断剂等广泛的用途。
(3)利用本发明的酶特异性滞留性荧光化合物的选择性细胞可视化方法
由于显示出上述特性,因而可以将本发明的细胞内滞留性荧光化合物用于将表达了特定酶的靶细胞的细胞特异性地可视化的方法。具体而言,通过进行下述步骤,能够仅将表达了β-半乳糖苷酶等的靶细胞特异性地可视化,所述步骤为:使式(I)的酶特异性滞留性荧光化合物与在靶细胞中特异性表达的β-半乳糖苷酶等酶接触的步骤;接着,对通过进行激发光照射而产生的荧光进行检测的步骤。
作为使本发明的细胞内滞留性荧光化合物与在靶细胞中特异性表达的酶接触的手段,代表性地可以举出将包含酶特异性滞留性荧光化合物的溶液进行试样添加、涂布或喷雾,可以根据其用途适当选择。另外,在将本发明的细胞内滞留性荧光化合物应用于动物个体的诊断或辅助诊断、或者特定的细胞或组织的检测时,作为使该化合物与在靶细胞或组织中表达的酶接触的手段,没有特别限定,可以使用例如静脉内给药等该领域中常用的给药手段。
另外,关于对靶细胞进行的光照射,可以对该细胞直接照射光或经由波导(光纤维等)照射光。作为光源,只要能够照射包含受到酶切断后的本发明的酶特异性滞留性荧光化合物的吸收波长的光,则可以使用任意的光源,可以根据实施本发明的方法的环境等适当选择。
作为本发明的酶特异性滞留性荧光化合物,可以直接使用上述通式(I)所表示的化合物或其盐,但也可以根据需要混配通常用于试剂制备的添加剂而以组合物的形式使用。例如,作为用于在生理性环境下使用试剂的添加剂,可以使用助溶剂、pH调节剂、缓冲剂、等渗剂等添加剂,本领域技术人员可以适当选择它们的混配量。这些组合物一般以粉末形态的混合物、冷冻干燥物、颗粒剂、片剂、液剂等适当形态的组合物的形式来提供,使用时可以溶解于注射用蒸馏水或适当的缓冲液中来应用。
实施例
以下,通过实施例更详细地说明本发明,但本发明不限定于这些实施例。
(1)根据以下的路线1~3,合成了作为本发明的酶特异性滞留性荧光化合物的2-CHF2-HMDER-βGal、4-CHF2-HMDER-βGal和4-CH2F-HMDER-βGal。
路线1:2-CHF2-HMDER-βGal的合成
路线2:4-CHF2-HMDER-βGal的合成
路线3:4-CH2F-HMDER-βGal的合成
以下,对各合成反应的详细情况进行说明。
○使用的合成试剂、装置等
市售的原料由试剂制造商(和光纯药株式会社、东京化成工业株式会社、Sigma-Aldrich Co.Ltd.)购入。
利用高效液相色谱进行的纯化所使用的装置和柱。
·泵:PU-2080和PU-2087(日本分光株式会社)
·检测器:MD-2010(日本分光株式会社)
·柱:Inertsil ODS-3
(10x 250mm或20x 250mm,GL Science Inc.)
利用HPLC进行的分离纯化所使用的溶剂。
A:100mM三乙胺乙酸盐
B:99%乙腈、1%milliQ
HPLC分离中的液体输送分别以25mL/min(泵:PU-2087,柱:20x250mm)
5mL/min(泵:PU-2080,柱:10x250mm)进行。
利用中压柱层析的纯化使用YFLC-AI580(山善株式会社)进行。
NMR测定使用AVANCE III 400Nanobay(Bruker,Co.Ltd.)进行(对于1H NMR为400MHz、对于13C NMR为101MHz)。
质谱测定使用MicrOTOF(ESI-TOF,Bruker,Co.Ltd.)进行。对于高分辨MS(HRMS)测定,使用甲酸钠作为外标物。
缩写的说明
THF:四氢呋喃
DMF:N,N-二甲基甲酰胺
TFA:三氟乙酸
DAST:N,N-二乙氨基三氟化硫
PLC:制备用薄层板
(合成例1)6-(二乙氨基)-9-(2-(羟甲基)苯基)-9H-呫吨-3-醇(leuco-HMDER)的合成
将2-(4-二乙氨基-2-羟基苯甲酰基)苯甲酸(2.54g,8.05mmol)、间苯二酚(900mg,8.17mmol)、85%H3PO4(15mL)在90℃搅拌42小时。通过蒸发除去水分后,加入MeOH(60mL,47.5g,1483mmol)、H2SO4(13.5mL,24.8g,253mmol),在70℃搅拌整夜。通过蒸发除去MeOH,加入饱和NaHCO3水溶液进行中和。加入CH2Cl2进行3次分液操作,向有机相中加入Na2SO4进行干燥,通过蒸发除去溶剂,得到作为红色固体的DER-Me。在氩气气氛下加入LiAlH4(1680mg,44.3mmol)、无水THF(80mL)并在室温下搅拌20小时。在冰冷却下加入饱和罗谢尔盐水溶液并搅拌1小时,加入EtOAc进行3次分液操作,向有机相中加入Na2SO4进行干燥,通过蒸发除去溶剂。利用中压硅胶柱层析(洗脱液:CH2Cl2/MeOH=98/2)对所得到的残渣进行纯化,得到作为粉红色固体(2.40g,3步的产率79%)的目标化合物leuco-HMDER。
1H NMR(CDCl3):δ.7.31-7.29(m,1H),7.14(brs,3H),6.61-6.56(m,2H),6.48(d,1H,J=2.0Hz),6.34(d,1H,J=2.3Hz),6.23-6.21(m,2H),5.25(s,1H),4.55-4.45(m,2H),3.23(q,4H,J=7.0Hz),1.07(t,6H,J=7.0Hz).13C NMR(CDCl3):δ.155.8,151.5,151.3,147.9,144.7,137.7,131.4,130.3,130.0,129.5,128.3,127.0,116.3,111.3,111.0,108.0,103.3,99.2,62.9,44.4,39.8,12.5.HRMS-ESI(m/z):[M+Na]+计算值398.1727(C24H25NNaO3),实测值398.1722.
(合成例2)6-(二乙氨基-3-羟基-9-(2-(羟甲基)苯基)-9H-呫吨-2-甲醛(leuco-2-CHO-HMDER)的合成
在氩气气氛下于70℃用5小时加入leuco-HMDER(2.20g,5.86mmol)、六亚甲基四胺(838mg,5.98mmol)、TFA(10mL),加入H2O(10mL),于70℃搅拌10分钟。通过蒸发将TFA和H2O除去。加入饱和NaHCO3水溶液进行中和,加入EtOAc进行3次分液操作,通过蒸发将有机相进行浓缩。利用中压硅胶柱层析(洗脱液:CH2Cl2/MeOH=98/2)进行纯化,得到作为粉红色固体(344mg,产率15%)的目标化合物leuco-2-CHO-HMDER。
1H NMR(CDCl3):δ.11.09(s,1H),9.53(d,1H,J=0.4Hz),7.43-7.41(m,1H),7.27-7.25(m,2H),7.19-7.16(m,1H),7.11(d,1H,J=0.9Hz),6.67(dd,1H,J=0.5and8.7Hz),6.64(s,1H),6.39(d,1H,J=2.6Hz),6.31(dd,1H,J=2.6and 8.7Hz),5.45(s,1H),4.75-4.59(m,2H),3.32(q,4H,J=7.1Hz),1.15(t,6H,J=7.1Hz).13C NMR(CDCl3):δ.194.9,161.9,157.9,150.8,148.2,144.4,138.1,136.1,131.4,130.0,129.4,128.8,127.4,118.2,117.5,110.2,108.6,104.2,98.9,63.3,44.5,38.8,12.7.HRMS-ESI(m/z):[M+H]+计算值404.1856(C25H26NO4),实测值404.1845.
(合成例3)(2S,3R,4S,5R,6R)-2-((6’-(二乙氨基)-2’-(二氟甲基)-3H-螺[异苯并呋喃-1,9’-呫吨]-3’-基)氧)-6-(羟甲基)四氢-2H-吡喃-3,4,5-三醇(2-CHF2-HMDER-βGal)的合成
2,3,4,6-四-O-乙酰基-α-D-吡喃半乳糖溴化物的合成根据现有报道(J.L.Montero等人,Carbohydr.Res.1997,297,175.)来进行。在氩气气氛下将leuco-2-CHO-HMDER(210mg,0.520mmol)、2,3,4,6-四-O-乙酰基-α-D-吡喃半乳糖溴化物(260mg,0.632mmol)、Cs2CO3(293mg,0.899mmol)、Na2SO4(321mg,2.26mmol)、DMF(1mL)在室温下搅拌整夜。通过蒸发将DMF除去,加入CH2Cl2和饱和NH4Cl水溶液,进行3次分液操作,向有机相中加入Na2SO4进行干燥,通过蒸发进行浓缩。利用中压硅胶柱层析(洗脱液:CH2Cl2/EtOAc=98/2)对所得到的残渣进行纯化,得到leuco-2-CHO-HMDER-βGal-Ac-Ac(137mg,0.177mmol)。在氩气气氛下溶解于无水CH2Cl2(5mL)中,加入DAST(300μL,366mg,2.27mmol)并在室温搅拌2个半小时。在冰冷却下加入MeOH(10mL),将反应淬灭,通过蒸发除去溶剂。向所得到的残渣中加入MeOH(28mL)进行溶解,加入NaOMe(1.38g,25.5mmol)并在室温下搅拌30分钟。通过蒸发除去溶剂,向残渣中加入CH2Cl2并进行硅藻土过滤,通过蒸发将滤液浓缩。利用中压硅胶柱层析(洗脱液:CH2Cl2/MeOH=97/3~96/4)和PLC(洗脱液:CH2Cl2/MeOH=9/1)进行纯化,得到作为浅紫色固体(15.2mg,3步的产率5.1%)的目标化合物2-CHF2-HMDER-βGal。
1H NMR(CD3OD):δ.7.46-7.39(m,2H),7.30(t,1H,J=7.3Hz),7.14(s,0.5H),7.13(s,0.5H),7.07(s,1H),7.03(t,0.5H,J=55.5Hz),7.02(t,0.5H,J=55.5Hz),6.84(d,0.5H,J=7.6Hz),6.83(d,0.5H,J=7.6Hz),6.72(d,0.5H,J=8.8Hz),6.72(d,0.5H,J=8.8Hz),6.47-6.43(m,2H),5.26(s,2H),4.97(dd,1H,J=7.8and 11.5Hz),3.94(d,1H,J=2.6Hz),3.86-3.78(m,4H),3.63-3.60(m,1H),3.38(q,4H,J=7.0Hz),1.15(t,6H,J=7.0Hz).13C NMR(CD3OD):δ.157.2(t,J=5.5Hz),154.7,154.6,152.9,152.9,150.3,145.8,145.7,140.4,140.3,130.7,129.5,129.4,128.0-127.8(m),124.7,124.7,122.0,121.0(t,J=22.9Hz),120.9(t,J=22.9Hz),120.7,120.6,112.5(t,J=234.2Hz),112.1,109.9,104.7,104.6,103.5,103.4,98.6,85.2,85.2,77.3,74.8,72.7,72.7,72.1,70.2,62.4,45.4,12.8.HRMS-ESI(m/z):[M+Na]+计算值608.2066(C31H33F2NNaO8),实测值608.2075.
(合成例4)3-(二乙基亚胺鎓)-5-甲酰基-9-(2-(羟甲基)苯基)-3H-呫吨-6-醇盐(4-CHO-HMDER)的合成
HMDER的合成参考现有报道(M.Kamiya等人,J.Am.Chem.Soc.2011,133,12960.)进行。向HMDER(2.35g,6.29mmol)中加入六亚甲基四胺(894mg,6.38mmol)和TFA(8mL),在95℃搅拌14小时,加入H2O(10mL)并在95℃搅拌2小时。通过蒸发除去TFA和H2O,加入CH2Cl2和饱和NaHCO3水溶液并进行3次分液操作,通过蒸发浓缩有机相。利用中压硅胶柱层析(洗脱液:CH2Cl2/MeOH=98/2)对残渣进行纯化,得到作为红色固体(963mg,产率38%)的目标化合物4-CHO-HMDER。
1H NMR(CDCl3):δ12.09(s,1H),10.67(s,1H,CHO),7.35-7.34(m,2H),7.27-7.23(m,1H),7.07(d,1H,J=8.8Hz),6.91(d,1H,J=7.6Hz),6.75(d,1H,J=8.7Hz),6.57(d,1H,J=8.8Hz),6.44(d,1H,J=2.5Hz),6.41(dd,1H,J=2.5and 8.7Hz),5.25(d,2H,J=5.4Hz),3.33(q,4H,J=7.1Hz),1.15(t,6H,J=7.1Hz).13C NMR(CDCl3):δ193.9,163.3,152.6,150.8,148.8,144.4,139.5,138.6,129.6,128.4,128.2,123.9,120.8,115.9,112.5,111.0,109.0,108.8,97.4,83.1,71.7,44.4,12.6.HRMS-ESI(m/z):[M+H]+计算值402.1700(C25H24NO4),实测值402.1684.
(合成例5)3-(二乙基亚胺鎓)-5-(1,3-二氧六环-2-基)-9-(2-(羟甲基)苯基)-3H-呫吨-6-醇盐(4-acetal-HMDER)的合成
向4-CHO-HMDER(745mg,1.86mmol)中加入1,3-丙二醇(12mL,12.7g,167mmol)和对甲苯磺酸(27mg,0.157mmol),在60℃搅拌整夜。加入饱和NaHCO3水溶液进行中和,加入CH2Cl2进行3次分液操作,通过蒸发浓缩有机相。利用中压硅胶柱层析(洗脱液:CH2Cl2/MeOH=98/2)对所得到的残渣进行纯化,得到作为红色固体(648mg,产率76%)的目标化合物4-acetal-HMDER。
1H NMR(CDCl3):δ.8.45(s,1H),7.34-7.30(m,2H),7.25-7.21(m,1H),6.88(d,1H,J=7.6Hz),6.79(d,1H,J=8.7Hz),6.72(d,1H,J=8.5Hz),6.56(d,1H,J=8.7Hz),6.39-6.36(m,3H),5.22(s,2H),4.36-4.30(m,2H),4.18-4.11(m,2H),3.34(q,4H,J=7.0Hz),2.36-2.24(m,1H),1.52(d,1H,J=13.7Hz),1.15(t,6H,J=7.0Hz).13C NMR(CDCl3):δ.156.9,151.6,148.7,148.6,145.0,139.6,131.0,129.5,128.2,127.8,124.1,120.6,116.6,112.5,111.6,109.2,108.6,99.1,97.8,83.9,71.5,68.0,67.8,44.4,25.9,12.7.HRMS-ESI(m/z):[M+H]+计算值460.2119(C28H30NO5),实测值460.2120.
(合成例6)6-(二乙基氨基)-4-(1,3-二氧六环-2-基)-9-(2-(羟甲基)苯基)-9H-呫吨-3-醇(leuco-4-acetal-HMDER)的合成
在氩气气氛下向4-acetal-HMDER(182mg,0.396mmol)中加入MeOH(5mL)和NaBH4(81mg,2.14mmol),在室温下搅拌1个半小时。通过蒸发除去溶剂,加入饱和NaHCO3水溶液将反应淬灭,加入CH2Cl2进行2次分液操作。通过蒸发浓缩有机相,得到作为浅粉红色固体(151mg,产率83%)的目标化合物leuco-4-acetal-HMDER。
1H NMR(CDCl3):δ.8.30(s,1H),7.39-7.35(m,1H),7.22-7.15(m,3H),6.72(d,1H,J=8.6Hz),6.65(d,1H,J=8.6Hz),6.46(d,1H,J=8.6Hz),6.35(d,1H,J=2.5Hz),6.34(s,1H),6.27(dd,1H,J=2.5and 8.6Hz),5.33(s,1H),4.60-4.50(m,2H),4.34-4.31(m,2H),4.14(t,2H,J=12.0Hz),3.30(q,4H,J=7.0Hz),2.35-2.23(m,1H),1.80(brs,1H),1.52(d,1H,J=13.7Hz),1.14(t,6H,J=7.0Hz).13C NMR(CDCl3):δ.155.8,151.1,148.3,147.9,144.5,138.3,131.4,131.2,129.9,129.2,128.2,127.0,115.9,112.0,111.2,109.7,108.2,99.1,98.9,67.9,67.9,63.0,44.3,39.6,25.9,12.7.HRMS-ESI(m/z):[M+H]+计算值462.2275(C28H32NO5),实测值462.2278.
(合成例7)6-(二乙基氨基)-3-羟基-9-(2-(羟甲基)苯基)-9H-呫吨-4-甲醛(leuco-4-CHO-HMDER)的合成
在氩气气氛下向leuco-4-acetal-HMDER(151mg,0.327mmol)中加入TFA-H2O(2/1,15mL),在室温下搅拌3小时。通过蒸发除去TFA和H2O,加入5%K2CO3水溶液和CH2Cl2,进行2次分液操作,通过蒸发浓缩有机相。向所得到的残渣中加入MeOH(5mL)和NaOMe(18mg,0.333mmol),在室温下搅拌5分钟。通过蒸发除去溶剂,加入CH2Cl2和饱和NH4Cl水溶液并进行分液操作,通过蒸发浓缩有机相。利用中压硅胶柱层析(洗脱液:CH2Cl2/MeOH=98/2)对所得到的残渣进行纯化,得到作为浅粉红色固体(134mg,产率:定量)的目标化合物leuco-4-CHO-HMDER。
1H NMR(CDCl3):δ.11.85(s,1H),10.62(s,1H),7.41-7.39(m,1H),7.25-7.23(m,2H),7.17-7.15(m,1H),7.06(d,1H,J=8.7Hz),6.71(d,1H,J=8.7Hz),6.48(d,1H,J=8.7Hz),6.39(d,1H,J=2.6Hz),6.33(dd,1H,J=2.6and 8.7Hz),5.40(s,1H),4.74-4.61(m,2H),3.33(q,4H,J=7.1Hz),1.16(t,6H,J=7.1Hz).13C NMR(CDCl3):δ.194.1,162.2,152.7,150.5,148.1,144.5,139.1,138.1,131.4,130.2,129.3,128.7,127.3,115.3,111.9,110.4,109.4,108.7,98.7,63.3,44.5,38.8,12.7.HRMS-ESI(m/z):[M+Na]+计算值426.1676(C25H25NNaO4),实测值426.1670.
(合成例8)(2S,3R,4S,5R,6R)-2-((3’-(二乙基氨基)-5’-(二氟甲基)-3H-螺[异苯并呋喃-1,9’-呫吨]-6’-基)氧)-6-(羟甲基)四氢-2H-吡喃-3,4,5-三醇(4-CHF2-HMDER-βGal)的合成
在氩气气氛下向leuco-4-CHO-HMDER(134mg,0.332mmol)中加入无水DMF(3mL)、2,3,4,6-四-O-乙酰基-α-D-吡喃半乳糖溴化物(705mg,1.71mmol)、Cs2CO3(970mg,2.98mmol)、Na2SO4(390mg,2.75mmol),在室温下搅拌整夜。通过蒸发除去溶剂,加入CH2Cl2和饱和NH4Cl水溶液并进行3次分液操作,向有机相中加入Na2SO4进行干燥,进行硅藻土过滤,通过蒸发浓缩滤液。利用中压硅胶柱层析(洗脱液:CH2Cl2/EtOAc=98/2)对所得到的残渣进行纯化,得到leuco-4-CHO-HMDER-βGal-Ac-Ac。在氩气气氛下加入无水CH2Cl2(5mL)和DAST(200μL,244mg,1.51mmol),在室温下搅拌4小时。在冰冷却下加入MeOH(10mL)将反应淬灭,通过蒸发除去溶剂。向所得到的残渣中加入MeOH(40mL)和NaOMe(600mg,11.1mmol),在室温下搅拌1小时,通过蒸发除去溶剂。向残渣中加入饱和NH4Cl水溶液进行中和,加入CH2Cl2进行3次分液操作。向有机相中加入Na2SO4进行干燥,进行硅藻土过滤,通过蒸发浓缩滤液,利用PLC(洗脱液:CH2Cl2/MeOH=9/1)和HPLC(A/B=50/50)对所得到的残渣进行纯化,得到作为浅粉红色固体(8.0mg,3步的产率4.1%)的目标化合物4-CHF2-HMDER-βGal。
1H NMR(CD3CN):δ.7.45(t,1H,J=53.7Hz),7.42(d,1H,J=7.6Hz),7.40-7.36(m,1H),7.28-7.24(m,1H),7.06-7.03(m,1H),6.92(d,1H,J=8.9Hz),6.83(d,0.5H,J=7.6Hz),6.83(d,0.5H,J=7.6Hz),6.74(d,0.5H,J=8.8Hz),6.73(d,0.5H,J=8.8Hz),6.48(dd,1H,J=2.6and 8.8Hz),6.44(d,1H,J=2.6Hz),4.88(dd,1H,J=7.7and 12.9Hz),3.83(d,1H,J=3.1Hz),3.72-3.58(m,4H),3.53-3.48(m,1H),3.37(q,4H,J=7.0Hz),1.13(t,6H,J=7.0Hz).13C NMR(100MHz,CD3CN):δ.157.1,151.9,151.9,150.5,149.9,146.3,146.2,140.2,140.2,133.8,133.8,130.4,129.3,129.2,129.1,124.2,122.1,121.7,112.7(t,J=233.5Hz),112.1,111.8,111.7,110.7(t,J=22.0Hz),110.6(t,J=22.0Hz),109.8,102.5,102.4,98.1,83.9,83.9,76.5,76.5,74.1,74.1,72.9,71.9,71.9,69.7,62.2,62.2,45.0,12.8.HRMS-ESI(m/z):[M+Na]+计算值608.2066(C31H33F2NNaO8),实测值608.2064.
(合成例9)(2S,3R,4S,5R,6R)-2-((3’-(二乙基氨基)-5’-(氟甲基)-3H-螺[异苯并呋喃-1,9’-呫吨]-6’-基)氧)-6-(羟甲基)四氢-2H-吡喃-3,4,5-三醇(4-CH2F-HMDER-βGal)的合成
在氩气气氛下向leuco-4-CHO-HMDER(249mg,0.616mmol)中加入无水DMF(6mL)、2,3,4,6-四-O-乙酰基-α-D-吡喃半乳糖溴化物(550mg,1.34mmol)、Cs2CO3(1.50g,4.60mmol)、Na2SO4(400mg,2.82mmol),在室温下搅拌2个半小时。向反应液中加入Ac2O(100μL,108mg,1.06mmol),在室温下进一步搅拌1小时。通过蒸发除去溶剂,加入CH2Cl2和饱和NH4Cl水溶液并进行3次分液操作,向有机相中加入Na2SO4进行干燥,进行硅藻土过滤,通过蒸发浓缩滤液。利用中压硅胶柱层析(洗脱液:CH2Cl2/EtOAc=98/2)对残渣进行纯化,得到leuco-4-CHO-HMDER-βGal-Ac-Ac。在氩气气氛下加入无水THF(5mL)和溶解于THF中的1.0M LiAlH(OtBu)3(1mL,1.00mmol),在0℃搅拌50分钟,在冰冷却下加入饱和NH4Cl水溶液(3mL),将反应淬灭。加入EtOAc(7mL)并在室温下搅拌1小时,对有机相进行萃取。向水相中加入CH2Cl2和饱和罗谢尔盐水溶液并进行搅拌,对有机相进行萃取,将上述操作进行2次。合并有机相,通过蒸发进行浓缩,利用中压硅胶柱层析(洗脱液:CH2Cl2/EtOAc=98/2)对残渣进行纯化,得到leuco-4-CH2OH-HMDER-βGal-Ac-Ac。在氩气气氛下加入无水CH2Cl2(5mL)和DAST(200μL,244mg,1.51mmol),在室温下搅拌30分钟,在冰冷却下添加MeOH(10mL),将反应淬灭。通过蒸发除去溶剂,向所得到的残渣中加入MeOH(20mL)和NaOMe(700mg,13.0mmol),在室温下搅拌5分钟,加入饱和NH4Cl水溶液(2mL),将反应淬灭。通过蒸发进行浓缩后,加入CH2Cl2和饱和NaHCO3水溶液并进行3次分液操作。向水相中加入CH2Cl2并进行分液,合并有机相。向有机相中加入Na2SO4进行干燥,并进行硅藻土过滤,通过蒸发浓缩滤液。向残渣中加入MeOH(10mL)和四氯对苯醌(80mg,0.325mmol),在室温下搅拌5分钟。通过蒸发除去溶剂,加入CH2Cl2和饱和NaHCO3水溶液并进行3次分液操作,向有机相中加入饱和NaCl水溶液,进行清洗操作。对有机相进行硅藻土过滤,通过蒸发浓缩滤液。利用中压硅胶柱层析(洗脱液:CH2Cl2/MeOH=98/2~94/6)和HPLC(A/B=50/50)对所得到的残渣进行纯化,得到作为浅粉红色固体(65.9mg,6步的产率18%)的目标化合物4-CH2F-HMDER-βGal。
1H NMR(400MHz,CD3CN):δ.7.42(d,1H,J=7.6Hz),7.37(t,1H,J=7.4Hz),7.26(t,1H,J=7.5Hz),6.97(d,0.5H,J=8.9Hz),6.97(d,0.5H,J=8.9Hz),6.90(d,0.5H,J=8.9Hz),6.89(d,0.5H,J=8.9Hz),6.82(d,0.5H,J=7.6Hz),6.81(d,0.5H,J=7.6Hz),6.74(d,0.5H,J=8.8Hz),6.73(d,0.5H,J=8.8Hz),6.52(d,1H,J=2.5Hz),6.47(dd,1H,J=2.5and 8.8Hz),5.81(d,2H,J=48.1Hz),5.25(s,2H),4.86(dd,1H,J=7.7and 12.8Hz),3.83(d,1H,J=3.2Hz),3.74-3.48(m,5H),3.38(q,4H,J=7.0Hz),1.14(t,6H,J=7.0Hz).13C NMR(100MHz,CD3CN):δ.157.8,157.7,152.3,152.2,151.0,149.8,146.5,146.3,140.3,140.2,132.4(d,J=4.6Hz),132.3(d,J=4.7Hz),130.4,129.2,129.0,124.2,122.0,121.1,121.0,113.0(d,J=15.1Hz),113.0(d,J=15.2Hz),112.4,112.3,111.5(d,J=8.6Hz),111.5(d,J=8.4Hz),109.6,102.4,102.3,98.2,98.2,84.3,84.2,76.4,76.3,74.5(d,J=158.7Hz),74.2,72.8,72.7,72.0,72.0,69.7,62.2,62.2,45.0,12.8.HRMS-ESI(m/z):[M+H]+计算值568.2341(C31H35FNO8),实测值568.2343.
通过下述试验例确认了本申请发明的酶特异性滞留性荧光化合物作为荧光成像探针具有优异的性质。
试验例1
与β-半乳糖苷酶的酶反应特异性荧光发光
确认了2-CHF2-HMDER-βGal、4-CHF2-HMDER-βGal和4-CH2F-HMDER-βGal通过β-半乳糖苷酶的酶处理特异性地产生荧光。
(材料和方法)
在磷酸钠缓冲液200mM存在下(pH7.4),对通过使作为本发明的酶特异性滞留性荧光化合物的2-CHF2-HMDER-βGal、4-CHF2-HMDER-βGal或4-CH2F-HMDER-βGal与β-半乳糖苷酶进行30分钟酶反应而产生的吸收光谱变化和荧光光谱变化(激发波长550nm)进行了测定。测定使用Shimadzu UV-2450(岛津制作所)和Hitachi F-7000(日立制作所)进行。
(结果)
2-CHF2-HMDER-βGal、4-CHF2-HMDER-βGal和4-CH2F-HMDER-βGal通过与β-半乳糖苷酶发生酶反应而产生了荧光(图1~3)。
由这些结果表明,2-CHF2-HMDER-βGal、4-CHF2-HMDER-βGal和4-CH2F-HMDER-βGal以β-半乳糖苷酶的酶活性特异性的方式产生荧光。
试验例2
基于β-半乳糖苷酶酶反应的、荧光色素与共存蛋白的结合
使用2-CHF2-HMDER-βGal、4-CHF2-HMDER-βGal和4-CH2F-HMDER-βGal,确认了被β-半乳糖苷酶切断的这些化合物对溶液中共存的牛血清白蛋白(BSA)进行荧光标记。
(材料和方法)
使(1)2.5μM 4-CH2F-HMDER-βGal和0.5mg/mL BSA、(2)2.5μM4-CH2F-HMDER-βGal、0.5mg/mL BSA和5Uβ-半乳糖苷酶(3)2.5μM4-CHF2-HMDER-βGal、0.5mg/mL BSA和5Uβ-半乳糖苷酶(4)2.5μM2-CHF2-HMDER-βGal、0.5mg/mL BSA和5Uβ-半乳糖苷酶(5)2.5μM HMDER-βGal、0.5mg/mL BSA和5Uβ-半乳糖苷酶分别在水溶液中(500mM磷酸钠缓冲液、pH7.4)进行反应,之后对反应产物进行SDS-PAGE(分离胶10%、浓缩胶4%、电泳电压200V)。对通过SDS-PAGE得到的凝胶照射488nm的激发光,在PMT电压1000V下观察540-600nm的荧光(图4的(a))。观察后,对该凝胶进行考马斯染色,确认凝胶上的BSA的位置(图4的(b))。
(结果)
通过使2-CHF2-HMDER-βGal、4-CHF2-HMDER-βGal和4-CH2F-HMDER-βGal与β-半乳糖苷酶在BSA存在下进行反应,在SDS电泳后的BSA的位置确认到荧光(图4的泳道2~4、75kDa附近的条带)。在不含β-半乳糖苷酶的试样(图4的泳道1)、或使用HMDER-βGal的试样(图4的泳道5)的情况下,未确认到荧光。
上述结果暗示,2-CHF2-HMDER-βGal、4-CHF2-HMDER-βGal和4-CH2F-HMDER-βGal通过以β半乳糖苷酶活性特异性的方式发生变化而与BSA进行了共价键合,从而证实,通过使用本发明的酶特异性滞留性荧光化合物,能够以酶活性特异性的方式对溶液中共存的蛋白质进行荧光标记。
试验例3
基于β-半乳糖苷酶酶反应的、荧光色素与细胞内蛋白质的结合
确认了2-CHF2-HMDER-βGal、4-CHF2-HMDER-βGal和4-CH2F-HMDER-βGal以酶活性特异性的方式对细胞内蛋白质进行荧光标记。
(材料和方法)
使用了表达β-半乳糖苷酶的HEK细胞(HEK-lacZ细胞)和通常的HEK细胞。
将(1)2.5μM 4-CH2F-HMDER-βGal和20μL 1.5mg/mL HEK细胞裂解物(2)2.5μM4-CH2F-HMDER-βGal和20μL 1.5mg/mL HEK-lacZ细胞裂解物(3)2.5μM4-CHF2-HMDER-βGal和20μL 1.5mg/mL HEK-lacZ细胞裂解物(4)2.5μM2-CHF2-HMDER-βGal和20μL 1.5mg/mL HEK-lacZ细胞裂解物(5)2.5μM HMDER-βGal和20μL 1.5mg/mL HEK-lacZ细胞裂解物分别在5%CO2存在下于37℃进行30分钟温育后,对反应产物进行SDS-PAGE(分离胶10%、浓缩胶4%、电泳电压200V)。对通过SDS-PAGE得到的凝胶照射488nm的激发光,在PMT电压1000V下观察540-600nm的荧光(图5的(a))。观察后,对该凝胶进行考马斯染色,确认凝胶上的BSA的位置(图5的(b))。
(结果)
在将2-CHF2-HMDER-βGal、4-CHF2-HMDER-βGal和4-CH2F-HMDER-βGal与HEK-lacZ细胞进行了温育的试样中,在细胞内蛋白质确认到荧光(图5的泳道2~4)。在使用了不表达β-半乳糖苷酶的HEK细胞的试样(图5的泳道1)、或使用了HMDER-βGal的试样(图5的泳道5)中,未确认到荧光。
上述结果暗示,2-CHF2-HMDER-βGal、4-CHF2-HMDER-βGal和4-CH2F-HMDER-βGal通过以β半乳糖苷酶活性特异性的方式发生变化而与细胞内蛋白质进行了共价键合,从而证实,通过使用本发明的酶特异性滞留性荧光化合物,能够以酶活性特异性的方式对细胞内蛋白质进行荧光标记。
试验例4
表达β-半乳糖苷酶的活细胞的荧光成像
确认了本申请发明的酶特异性滞留性荧光化合物能够用于活细胞的荧光成像。
(材料和方法)
将HEK细胞、HEK-lacZ细胞和这些细胞的混合物与1μM的4-CH2F-HMDER-βGal或HMDER-βGal一同温育30分钟(37℃、5%CO2存在下)后,直接或者利用培养基清洗2次后,使用共聚焦显微镜获取这些细胞的荧光图像和微分干涉图像(DIC)。另外,与4-CH2F-HMDER-βGal进行温育后,加入4%PFA并在室温下进行10分钟温育,由此对细胞进行固定,对于固定后的细胞也同样地进行了观察。共聚焦显微镜使用具备白色激光和物镜HCX PL APO CS40x/1.25(Leica公司制造)的TCS SP5X(Leica公司制造),利用LAS AF软件进行控制。观察条件如下:白光激光(WLL):80%-25%、激发波长:525nm、观测波长:535-595nm、增益:800V(PMT1)/350V(Scan-DIC)、偏移:0%、针孔:67.88μM(1个艾里斑).
(结果)
与试验化合物进行温育后,在不用培养基清洗细胞的情况下进行观察,结果,利用4-CH2F-HMDER-βGal进行了温育的HEK-LacZ细胞显示出清晰的荧光(图6左侧)。另外,在HEK-LacZ细胞与HEK细胞的混合物中,各个细胞中的荧光水平观察到明确的差异,表明能够对每个细胞的β-半乳糖苷酶活性进行检测和荧光成像。另一方面,在使用了HMDER-βGal的情况下,无法对各个细胞的β-半乳糖苷酶活性进行荧光成像(图6右侧)。
此外,在与试验化合物进行温育后利用培养基对细胞进行了2次清洗后进行观察的情况下,使用4-CH2F-HMDER-βGal时的荧光强度也基本没有变化,表明在4-CH2F-HMDER-βGal与β-半乳糖苷酶的酶反应后生成的荧光色素基本不从细胞漏出(图7)。
另外,在与4-CH2F-HMDER-βGal进行温育后进行了固定处理的试样中,也能够进行与活细胞同样的荧光成像(图8)。
上述结果证实:通过使用本发明的酶特异性滞留性荧光化合物,能够进行单细胞水平的详细的活细胞荧光成像;并且可得到优异的细胞内滞留性;即便进行固定化处理,荧光色素也基本不漏出到细胞外。
试验例5
使用流式细胞术的活细胞的β-半乳糖苷酶活性的检测
确认了通过利用本申请发明的酶特异性滞留性荧光化合物,能够使用流式细胞术检测活细胞的每个细胞的酶活性。
(材料和方法)
将HEK细胞、HEK-lacZ细胞和这些细胞的混合物与1μM的4-CH2F-HMDER-βGal或HMDER-βGal一同进行30分钟温育(37℃、5%CO2存在下)。使用流式细胞仪Accuri C6(AccriCytometers)以488nm的激发光对这些细胞进行了解析。
(结果)
利用流式细胞术对与4-CH2F-HMDER-βGal温育后的HEK-LacZ细胞和HEK细胞的混合物进行了解析,结果清楚地观察到与HEK-LacZ细胞、HEK细胞分别对应的峰,能够基于荧光强度之差明确地区分和检测出这些细胞(图9的(a))。另一方面,在与HMDER-βGal温育后的HEK-LacZ细胞和HEK细胞的混合物的情况下,在流式细胞术的结果上无法区分这些细胞(图9的(b))。
上述结果证实:通过使用本发明的酶特异性滞留性荧光化合物,能够利用流式细胞术明确地检测和区分具有不同酶活性的细胞。
试验例6
具有β-半乳糖苷酶活性的生物体组织的非固定荧光成像
确认了能够将本申请发明的酶特异性滞留性荧光化合物应用于生物体组织的荧光成像。
(材料和方法)
将表达β-半乳糖苷酶的(en-lacZ)果蝇(Drosophila melanogaster)的翅原基(wing discs)与20μM的4-CH2F-HMDER-βGal或HMDER-βGal一同在室温下进行30分钟温育后,在共聚焦显微镜(TCS SP5:Leica公司制造、利用LAS AF软件进行控制)下进行观察。观察条件如下:Ar:40%-25%、激发光:514nm、观测光:535-595nm(HyD2)、20倍.
(结果)
在使用4-CH2F-HMDER-βGal进行荧光成像的情况下,作为酶反应产物的荧光色素不扩散,因此能够选择性地对具有β-半乳糖苷酶活性的部位(后部)进行荧光成像(图10的(a))。另一方面,在使用HMDER-βGal进行荧光成像的情况下,作为酶反应产物的荧光色素随时间推移而扩散,无法判别具有β-半乳糖苷酶活性的部位(图10的(b))。
上述结果证实:通过使用本发明的酶特异性滞留性荧光化合物,荧光色素的扩散得到抑制,能够进行生物体组织中的非固定荧光成像。
试验例7
表达β-半乳糖苷酶活性的固定处理后的蝇肠道细胞的单细胞荧光成像
确认了:使用本申请发明的酶特异性滞留性荧光化合物,能够以单细胞水平对组织内的细胞进行荧光成像。
(材料和方法)
制作了在中肠表达β-半乳糖苷酶的果蝇(esg-lacZ)。将该蝇解剖后,利用4%PFA进行固定处理,添加4-CH2F-HMDER-βGal反应10分钟后进行清洗,利用80%甘油进行透明化处理,利用荧光显微镜(TCS SP5:Leica公司制造、利用LAS AF软件进行控制)进行观察。作为对照,观察了表达GFP的果蝇肠道细胞(esg-GFP)。观察条件如下:激发光:514nm、观测光:535-595nm(HyD2)、40倍.
(结果)
通过使果蝇(esg-lacZ)与4-CH2F-HMDER-βGal反应,能够在组织内确认到发出荧光的细胞(图11的(a))。该图像与果蝇肠道细胞(esg-GFP)的荧光图像(图11的(b))类似。
上述结果证实:通过使用本发明的酶特异性滞留性荧光化合物,能够进行单细胞荧光成像。
需要说明的是,确认了在未进行固定处理的β-半乳糖苷酶表达肠道细胞中,也能够进行同样的荧光成像。
试验例8
卵巢癌接种模型小鼠的体外(ex vivo)荧光成像
确认了:使用本申请发明的酶特异性滞留性荧光化合物,能够选择性地对癌部位进行荧光成像。
(材料和方法)
接种卵巢癌细胞SHIN3,制作了癌模型小鼠。已知在卵巢癌细胞中酸性β-半乳糖苷酶活性上升。对该癌模型小鼠腹腔内注射4-CH2F-HMDER-βGal,1小时后使用Maestro体内成像系统(CRi)进行荧光观察。观察条件如下:激发光:490-530nm、观测光:550-800nm
(结果)
荧光观察的结果,由被认为是癌部位的组织部位(由白色箭头表示)观察到来自于酶反应后生成的荧光色素的荧光(图12)。利用荧光光谱进行了分离荧光的操作(解混),结果能够将自身荧光和荧光光谱分离。
上述结果证实:通过使用本发明的酶特异性滞留性荧光化合物,能够选择性地对生物体中的癌部位进行荧光成像
试验例9
未固定果蝇组织中的以镶嵌状表达的β-半乳糖苷酶活性的荧光成像
确认了:使用本申请发明的酶特异性滞留性荧光化合物,能够在未固定的条件下对在生物体组织内以镶嵌状分布的β-半乳糖苷酶活性细胞群进行荧光成像。
(材料和方法)
使雄性的具有His2Av-mRFP1、FRT80B/TM6B的果蝇(Drosophila melanogaster)和雌性的具有hs-flp;arm-lacZ、FRT80B的果蝇交配,对其卵进行孵化,在30小时后的一龄幼虫时于37℃进行1小时热休克,使翅原基(wing discs)以镶嵌状表达下述三种基因型的细胞。(1)仅表达β-半乳糖苷酶的细胞(arm-lacZ)、(2)仅表达红色荧光蛋白(mRFP1)的细胞(His2Av-mRFP1)、(3)同时表达β-半乳糖苷酶和mRFP1的细胞(arm-lacZ/His2Av-mRFP1)。将由三龄(终龄)幼虫解剖得到的翅原基在包含10μM的4-CH2F-HMDER-βGal的培养基中浸渍30分钟,在共聚焦荧光显微镜(TCS SP5:Leica公司制造、利用LAS AF软件进行控制)下进行观察。观察条件如下:(4-CH2F-HMDER-βGal)激发光:514nm、观测光:525-585nm、(mRFP1)激发光:594nm、观测光:610-700nm、63倍。
(结果)
使用4-CH2F-HMDER-βGal进行荧光成像的结果,具有上述三种基因型的细胞以镶嵌状存在的情况被清晰地可视化(图13)。
上述结果证实:通过使用本发明的酶特异性滞留性荧光化合物,能够将生物体组织中存在的β-半乳糖苷酶表达细胞以非固定的方式明确地进行可视化和判别。
试验例10
表达β-半乳糖苷酶活性的蝇脂肪体细胞的单细胞荧光成像
确认了:使用本申请发明的酶特异性滞留性荧光化合物,能够以单细胞水平对在生物体组织内随机表达的β-半乳糖苷酶活性进行荧光成像。
(材料和方法)
为了进行果蝇(Drosophila melanogaster)脂肪体的克隆分析,使用Flip-out技术使UAS-lacZ与hs-flp122;Actin>y>Gal4杂交,由此使β-半乳糖苷酶过表达。为了进行活细胞荧光成像,由三龄(终龄)的蝇解剖出脂肪体,在包含10μM的4-CH2F-HMDER-βGal和16μM的Hoechst 33342(细胞核染色剂)的培养基中温育20分钟,用PBS进行清洗,在80%甘油中进行固定。另外,为了进行免疫化学染色,将解剖的脂肪体在含有4%多聚甲醛(PFA)的PBS中浸渍20分钟,进行固定处理。封闭后,将脂肪体在抗β-半乳糖苷酶的小鼠来源单克隆抗体(1:250、Promega公司)中浸渍30分钟,加入10μM的4-CH2F-HMDER-βGal、16μM的Hoechst33342、Alexa647修饰二次抗体,在共聚焦荧光显微镜(TCS SP5:Leica公司制造、利用LASAF软件进行控制)下进行观察。观察条件如下:(Hoechst 33342)激发光:405nm、观测光:415-490nm、(4-CH2F-HMDER-βGal)激发光:514nm、观测光:525-600nm、(Alexa 647修饰二次抗体)激发光:633nm、观测光:640-700nm、40倍。
(结果)
确认了:使用4-CH2F-HMDER-βGal进行荧光成像,能够以逐个单细胞对在生物体组织内随机表达的β-半乳糖苷酶活性细胞进行荧光成像(图14)。
上述结果证实:通过使用本发明的酶特异性滞留性荧光化合物,能够以逐个单细胞对在生物体组织内随机表达的β-半乳糖苷酶活性细胞进行可视化和判别。
工业实用性
根据本发明,提供一种荧光化合物、使用该荧光化合物的荧光成像探针、使用该荧光探针的检测方法、检测试剂盒或检测剂,该荧光化合物在以酶活性特异性的方式发出荧光的同时,滞留于具有该酶的活细胞内,由此能够在不对该细胞进行固定的情况下、或者在固定的状态下以单细胞水平选择性地将该细胞可视化。本发明的酶特异性滞留性荧光化合物和使用了该荧光化合物的成像方法除了能够作为用于阐明细胞的老化机理的分子工具利用外,还作为癌细胞选择性荧光成像探针在检查、诊断等领域中具有广泛的用途。
Claims (18)
1.一种酶特异性滞留性荧光化合物,其包含下述式(I')所表示的化合物或其盐,
[化1]
式中,A表示可被酶切断的一价基团;R1表示氢原子或与苯环键合的1个~4个相同或不同的取代基;R3、R4、R5和R6各自独立地表示-CFR10R11或-CF2R12、或者氢原子、羟基、烷基或卤原子;R2和R7各自独立地表示氢原子、羟基、烷基或卤原子;R8和R9各自独立地表示氢原子或烷基;R10、R11和R12各自独立地表示氢原子、烷基或烯基;X表示氧原子、Se、CR13R14或SiR15R16;R13、R14、R15和R16各自独立地表示氢原子或烷基;Y表示C1-C3亚烷基,此处,R3、R4、R5和R6中的至少一者表示-CFR10R11或-CF2R12。
2.如权利要求1所述的酶特异性滞留性荧光化合物,其中,所述酶为包含报告酶的水解酶。
3.如权利要求1所述的酶特异性滞留性荧光化合物,其中,所述酶是在癌细胞中特异性地表达或活化的酶。
4.如权利要求1~3中任一项所述的酶特异性滞留性荧光化合物,其中,所述报告酶为β-半乳糖苷酶,A为吡喃半乳糖基。
5.如权利要求1~4中任一项所述的酶特异性滞留性荧光化合物,其中,R3、R4、R5和R6中的至少一者为-CFR10R11。
6.如权利要求1~4中任一项所述的酶特异性滞留性荧光化合物,其中,R3、R4、R5和R6中的至少一者为-CH2F。
7.一种酶特异性滞留性荧光化合物,其包含下述式(Ia)~(Ic)所表示的化合物或其盐,
[化2]
8.一种荧光成像探针,其含有权利要求1~7中任一项所述的酶特异性滞留性荧光化合物。
9.一种用于检测表达了特定酶的靶细胞或用于将该靶细胞可视化的组合物或试剂盒,其含有权利要求1~7中任一项所述的酶特异性滞留性荧光化合物。
10.如权利要求9所述的组合物或试剂盒,其中,所述靶细胞为β-半乳糖苷酶表达细胞。
11.如权利要求9所述的组合物或试剂盒,其中,所述靶细胞为癌细胞。
12.一种检测表达了特定酶的靶细胞的方法,使用权利要求1~7中任一项所述的酶特异性滞留性荧光化合物来检测表达了特定酶的靶细胞。
13.一种检测表达了特定酶的靶细胞的方法,使权利要求1~7中任一项所述的酶特异性滞留性荧光化合物与在该靶细胞中特异性表达的酶在生物体外接触来检测表达了特定酶的靶细胞。
14.如权利要求12或13所述的方法,其特征在于,包括下述步骤:使权利要求1~7中任一项所述的酶特异性滞留性荧光化合物与在该靶细胞中特异性表达的酶在生物体外接触的步骤;和进行激发光照射而产生荧光的步骤。
15.如权利要求12~14中任一项所述的方法,其中,所述靶细胞为β-半乳糖苷酶表达细胞。
16.如权利要求12~15中任一项所述的方法,其中,所述靶细胞为癌细胞。
17.一种下述式(II)所表示的化合物,
[化3]
式中,R3、R4、R5和R6各自独立地表示-C(=O)H、氢原子、羟基、烷基或卤原子;R2和R7各自独立地表示氢原子、羟基、烷基或卤原子;R8和R9各自独立地表示氢原子或烷基;X表示氧原子、Se、CR13R14或SiR15R16;R13、R14、R15或R16各自独立地表示氢原子或烷基;Y表示C1-C3亚烷基,此处,R3、R4、R5和R6中的至少一者表示-C(=O)H。
18.一种下述式(IIa)或(IIb)所表示的化合物,
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