JP6635555B2 - 酵素特異的な細胞内滞留性蛍光化合物 - Google Patents

Description

本発明は、標的細胞に滞留し、該細胞にて特異的に作用し得る新規な蛍光化合物、及び当該化合物を用いて特定の酵素が発現している標的細胞を特異的にイメージングする方法、当該イメージングに使用するプローブ、及び当該プローブを含む検出キット、検出剤、診断薬またはキットに関する。より詳細には、β−ガラクトシダーゼ等のレポーター酵素を発現する細胞を選択的に可視化する蛍光化合物およびこれを用いたイメージング方法、イメージングプローブ、検出剤、診断薬またはキットに関する。

生命科学の発展に対するレポータータンパク質の寄与は計り知れない。レポータータンパク質の中で最も汎用されているものがβ−ガラクトシダーゼである。近年では老化と細胞のβガラクトシダーゼの発現に関連性があることが示唆されており（非特許文献１）、β−ガラクトシダーゼ酵素特異的なイメージングプローブは、細胞の老化機構を解明するための分子ツールとしても重要である。さらに、ある種の癌細胞においてはβガラクトシダーゼ活性が上昇していることが示されているため（非特許文献２、非特許文献３）、β−ガラクトシダーゼ酵素特異的なイメージングプローブは、癌細胞選択的な蛍光イメージングプローブとしても利用できると考えられる。

従来、Ｘ−Ｇａｌを基質として酵素活性をイメージングする手法が広く利用されているが（非特許文献４）、Ｘ−Ｇａｌは生細胞に適用することができないため、生細胞に適用可能な酵素活性イメージングプローブの開発が望まれている。現在までに多くの生細胞に適用可能なイメージングプローブが開発されてきた。例えば、分子内でスピロ環化反応を制御することにより可視光励起可能である、生細胞および生きた生体組織に適用可能なβガラクトシダーゼ蛍光プローブとして、ＨＭＤＥＲ−βＧａｌ等が開発されている（非特許文献５、特許文献１）。しかしながら、これらの蛍光プローブでは、いずれも酵素反応生成物が細胞から漏出してしまうため、あるいは細胞傷害性の紫外光を励起光に使用するため、生細胞等を単一細胞レベルで明確にイメージングすることが困難であった。また、これまでの癌プローブは、病理診断のために切片を固定化することにより、細胞外に漏れてしまい、病理診断に利用できないという問題点も存在していた。

国際公開２００５／０２４０４９号

Ｇ． Ｐ． Ｄｉｍｒｉ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， １９９５， ９２， ９３６３−９３６７． Ｈ． Ｂ． Ｂｏｓｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， １９７４， ７１， １８３３−１８３７． Ｓ． Ｋ． Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， １９７９， ３９， １９４３−１９５１． Ｆ． Ｄ．−Ｃｈａｉｎｉａｕｘ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｐｒｏｔｏｃ．， ２００９， ４， １７９８−１８０６． Ｍ．Ｋａｍｉｙａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ． ２０１１， １３３， １２９６０−１２９６３．

本発明の解決しようする課題は、酵素活性特異的に蛍光を発生すると同時に、当該酵素を有する細胞内に滞留することで、当該細胞を固定することなく、あるいは固定した状態で、単一細胞レベルで選択的に可視化可能な蛍光化合物、当該蛍光化合物を用いた蛍光イメージングプローブ、当該蛍光プローブを用いた検出方法、検出キット又は検出剤を提供することにある。

本発明者らは、上記課題を解決するべく鋭意検討を行った結果、キサンテン環を蛍光団とする蛍光色素に、レポーター酵素との反応後に、蛍光色素をキノンメチドに変化させる置換基を有する酵素基質を合成し、その構造の最適化を行うことにより、βガラクトシダーゼ等のレポーター酵素との反応によって、はじめて蛍光性を示すとともに、優れた細胞内滞留性を示す蛍光イメージングプローブを得られることを見出した。この知見に基づき、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、一態様において、以下の式（Ｉ）で表される化合物又はその塩を含む、酵素特異的滞留性蛍光化合物を提供するものである。

（式中、Ａは酵素によって切断される一価の基を表し；Ｒ^１は水素原子又はベンゼン環に結合する１個ないし４個の同一又は異なる置換基を表し；Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、及びＲ^６はそれぞれ独立に−ＣＦＲ^１０Ｒ^１１又は−ＣＦ_２Ｒ^１２、若しくは、水素原子、ヒドロキシル基、アルキル基、又はハロゲン原子を表し；Ｒ^２及びＲ^７はそれぞれ独立に水素原子、ヒドロキシル基、アルキル基、又はハロゲン原子を表し；Ｒ^８及びＲ^９はそれぞれ独立に水素原子又はアルキル基を表し；Ｒ^１０、Ｒ^１１及びＲ^１２はそれぞれ独立に水素原子、アルキル基又はアルケニル基を表し；Ｘは酸素原子、Ｓｅ、ＣＲ^１３Ｒ^１４、又はＳｉＲ^１５Ｒ^１６を表し；Ｒ^１３、Ｒ^１４、Ｒ^１５及びＲ^１６はそれぞれ独立に水素原子又はアルキル基を表し；ＹはＣ_１−Ｃ_３アルキレン基を表し; Ｚは酸素原子、又はＮＲ^１７を表し；Ｒ^１７は水素原子又はアルキル基を表し、ここで、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、及びＲ^６の少なくとも一つは、−ＣＦＲ^１０Ｒ^１１又は−ＣＦ_２Ｒ^１２を表す。）

好ましい態様において、当該酵素特異的滞留性蛍光化合物は、以下の式で表される。

（式中、Ａ、Ｒ^１〜Ｒ⁹、Ｘ、Ｙは式（Ｉ）と同様である。）

好ましい態様において、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、及びＲ^６の少なくとも一つは、−ＣＦＲ^１０Ｒ^１１である。

好ましい態様において、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、及びＲ^６の少なくとも一つは、−ＣＨ_２Ｆである。

好ましい態様において、Ａはレポーター酵素を含む加水分解酵素、あるいは、癌細胞において特異的に発現又は活性化している酵素によって切断される基であり、より好ましくは、Ａはガラクトピラノシル基であり、レポーター酵素はβ−ガラクトシダーゼである。

さらに好ましい態様において、酵素特異的滞留性蛍光化合物又はその塩は、（Ｉａ）〜（Ｉｃ）で表される化合物又はその塩である。

別の態様において、本発明は、式（Ｉ）、（Ｉ’）又は（Ｉａ）〜（Ｉｃ）で表される、酵素特異的滞留性蛍光化合物を含有する、蛍光プローブに関する。

別の態様において、本発明は、式（Ｉ）、（Ｉ’）又は（Ｉａ）〜（Ｉｃ）で表される、酵素特異的滞留性蛍光化合物を含有する、特定の酵素が発現している標的細胞を検出するための、又は可視化するための、組成物又はキットに関する。好ましくは、当該標的細胞は、β−ガラクトシダーゼ発現細胞であり、さらに好ましくは、標的細胞は、癌細胞である。

別の態様において、本発明は、式（Ｉ）、（Ｉ’）又は（Ｉａ）〜（Ｉｃ）で表される、酵素特異的滞留性蛍光化合物を用いて、特定の酵素が発現している標的細胞を検出する方法に関する。好ましくは、当該方法において、酵素特異的滞留性蛍光化合物と、当該標的細胞において特異的に発現する酵素とを、生体外又は生体内において接触させ、特定の酵素が発現している標的細胞を検出する。より好ましくは、酵素特異的滞留性蛍光化合物と当該標的細胞において特異的に発現する酵素とを、生体外又は生体内において接触させる工程、及び、励起光照射を行って蛍光を生じさせる工程を含むことを特徴とする、前記特定の酵素が発現している標的細胞を検出する方法に関する。より好ましくは、当該方法において、標的細胞は、β−ガラクトシダーゼ発現細胞であり、さらに好ましくは、標的細胞は、癌細胞である。

別の態様において、本発明は、式（Ｉ）を製造するために用いられる、以下の式（ＩＩ）で表される化合物に関する。

（式中、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、及びＲ^６はそれぞれ独立に−Ｃ（＝Ｏ）Ｈ、水素原子、ヒドロキシル基、アルキル基、又はハロゲン原子を表し；Ｒ^２及びＲ^７はそれぞれ独立に水素原子、ヒドロキシル基、アルキル基、又はハロゲン原子を表し；Ｒ^８及びＲ^９はそれぞれ独立に水素原子又はアルキル基を示し；Ｘは酸素原子又はＳｅ、ＣＲ^１３Ｒ^１４、又はＳｉＲ^１５Ｒ^１６を表し；Ｒ^１３、Ｒ^１４、Ｒ^１５及びＲ^１６はそれぞれ独立に水素原子又はアルキル基を表し；ＹはＣ_１−Ｃ_３アルキレン基を表し、ここで、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、及びＲ^６の少なくとも一つは、−Ｃ（＝Ｏ）Ｈを表す。）

より好ましい態様において、式（ＩＩ）の化合物は、以下の式（ＩＩａ）又は（ＩＩｂ）で表される化合物である。

本発明の酵素特異的滞留性蛍光化合物は、酵素反応によって可視光吸収を変化させること同時に、生成したキノンメチドを用いて、細胞内に共存するタンパク質に共有結合することにより、優れた細胞内滞留性を示す。これらの効果が組み合わさった結果、当該酵素を発現する標的細胞を、生細胞の状態で、あるいは固定した状態で、単一細胞レベルといった詳細なレベルで可視化することが可能となる。本発明の酵素特異的滞留性蛍光化合物は、細胞の老化機構を解明するための分子ツールとして利用し得るほか、ある種の癌細胞においては選択的な蛍光イメージングプローブとしても利用できると考えられる。さらに、本発明の酵素特異的滞留性蛍光化合物によるイメージング手法は、通常の細胞イメージングが行える顕微鏡で施行可能であり、特別な機器を必要としない。また単一細胞レベルでの蛍光イメージングが可能であることから、個々の細胞の経時的な変化を追跡可能であり、癌細胞選択的な蛍光イメージングを利用して癌組織を取り残さずに外科的に切除することも可能となる。このように、本発明の酵素特異的滞留性蛍光化合物の産業上の利用価値、経済効果は、極めて大きいと考えられる。

図１は、本発明の酵素特異的滞留性蛍光化合物である、２−ＣＨＦ_２−ＨＭＤＥＲ−βＧａｌと、β−ガラクトシダーゼとの酵素反応によって生じる蛍光の強度（ａ）、吸収スペクトル変化（ｂ）、蛍光スペクトル（ｃ）を示した図である。 図２は、本発明の酵素特異的滞留性蛍光化合物である、４−ＣＨＦ_２−ＨＭＤＥＲ−βＧａｌと、β−ガラクトシダーゼとの酵素反応によって生じる蛍光の強度（ａ）、吸収スペクトル変化（ｂ）、蛍光スペクトル（ｃ）を示した図である。 図３は、本発明の酵素特異的滞留性蛍光化合物である、４−ＣＨ_２Ｆ−ＨＭＤＥＲ−βＧａｌと、β−ガラクトシダーゼとの酵素反応によって生じる蛍光強度（ａ）、吸収スペクトル変化（ｂ）、蛍光スペクトル（ｃ）を示した図である。 図４は、本発明の酵素特異的滞留性蛍光化合物である、２−ＣＨＦ_２−ＨＭＤＥＲ−βＧａｌ、４−ＣＨＦ_２−ＨＭＤＥＲ−βＧａｌおよび４−ＣＨ_２Ｆ−ＨＭＤＥＲ−βＧａｌを、β−ガラクトシダーゼと酵素反応させることにより、溶液中に共存するタンパク質ＢＳＡを蛍光ラベル化し得ることを示した図である。（ａ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを波長４８８ｎｍの励起光で励起した際に得られた蛍光画像である。レーン１： ２．５μＭ ４−ＣＨ_２Ｆ−ＨＭＤＥＲ−βＧａｌ および０．５ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ、レーン２： ２．５μＭ ４−ＣＨ_２Ｆ−ＨＭＤＥＲ−βＧａｌ，０．５ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ および５Ｕ β−ガラクトシダーゼ、レーン３： ２．５ μＭ ４−ＣＨＦ_２−ＨＭＤＥＲ−βＧａｌ，０．５ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ および５Ｕ β−ガラクトシダーゼ、レーン４： ２．５μＭ ２−ＣＨＦ_２−ＨＭＤＥＲ−βＧａｌ，０．５ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ および５Ｕ β−ガラクトシダーゼ、レーン５： ２．５μＭ ＨＭＤＥＲ−βＧａｌ、０．５ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ および５Ｕ β−ガラクトシダーゼ。（ｂ）上記ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルをクマシー染色したもの。 図５は、本発明の酵素特異的滞留性蛍光化合物である、２−ＣＨＦ_２−ＨＭＤＥＲ−βＧａｌ、４−ＣＨＦ_２−ＨＭＤＥＲ−βＧａｌおよび４−ＣＨ_２Ｆ−ＨＭＤＥＲ−βＧａｌが、細胞内タンパク質を酵素活性特異的に蛍光ラベル化することを示す図である。（ａ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを波長４８８ｎｍの励起光で励起した際に得られた蛍光画像である。レーン１：２．５μＭ ４−ＣＨ_２Ｆ−ＨＭＤＥＲ−βＧａｌ および２０μＬ １．５ｍｇ／ｍＬ ＨＥＫ細胞ライセート、レーン２：２．５μＭ ４−ＣＨ_２Ｆ−ＨＭＤＥＲ−βＧａｌおよび２０μＬ １．５ｍｇ／ｍＬ ＨＥＫ−ｌａｃＺ細胞ライセート、レーン３：２．５ μＭ ４−ＣＨＦ_２−ＨＭＤＥＲ−βＧａｌおよび２０μＬ １．５ｍｇ／ｍＬ ＨＥＫ−ｌａｃＺ細胞ライセート、レーン４：２．５μＭ ２−ＣＨＦ_２−ＨＭＤＥＲ−βＧａｌおよび２０μＬ １．５ｍｇ／ｍＬ ＨＥＫ−ｌａｃＺ細胞ライセート、レーン５：２．５μＭ ＨＭＤＥＲ−βＧａｌおよび２０μＬ １．５ｍｇ／ｍＬ ＨＥＫ−ｌａｃＺ細胞ライセート。（ｂ）上記ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルをクマシー染色したもの。 図６は、本発明の酵素特異的滞留性蛍光化合物である４−ＣＨ_２Ｆ−ＨＭＤＥＲ−βＧａｌを、単一細胞レベルの生細胞蛍光イメージングに利用可能であることを示す図である。 図７は、本発明の酵素特異的滞留性蛍光化合物である４−ＣＨ_２Ｆ−ＨＭＤＥＲ−βＧａｌが、優れた細胞内滞留性を有することを示す図である。 図８は、本発明の酵素特異的滞留性蛍光化合物である４−ＣＨ_２Ｆ−ＨＭＤＥＲ−βＧａｌを用いることにより、固定処理を行った試料においても、生細胞と同様の蛍光イメージングが可能であることを示す図である。 図９は、本発明の酵素特異的滞留性蛍光化合物である４−ＣＨ_２Ｆ−ＨＭＤＥＲ−βＧａｌを利用することで、酵素活性の異なる細胞を、フローサイトメトリーを用いて検出又は区別し得ることを示す図である。（ａ）４−ＣＨ_２Ｆ−ＨＭＤＥＲ−βＧａｌと反応させた、ＨＥＫ細胞、ＨＥＫ−ＬａｃＺ細胞、およびこれらの混合物のフローサイトメトリー結果。（ｂ）ＨＭＤＥＲ−βＧａｌと反応させた、ＨＥＫ細胞、ＨＥＫ−ＬａｃＺ細胞、およびこれらの混合物のフローサイトメトリー結果。 図１０は、本発明の酵素特異的滞留性蛍光化合物である４−ＣＨ_２Ｆ−ＨＭＤＥＲ−βＧａｌを、生体組織の蛍光イメージングに適用し得ることを示す図である。（ａ）４−ＣＨ_２Ｆ−ＨＭＤＥＲ−βＧａｌと反応させた、ハエ羽根原基組織の画像。左から、蛍光画像、明視野画像、これらのマージ画像。（ｂ）ＨＭＤＥＲ−βＧａｌと反応させた、ハエ羽根原基組織の画像。左から、蛍光画像、明視野画像、これらのマージ画像。 図１１は、本発明の酵素特異的滞留性蛍光化合物である４−ＣＨ_２Ｆ−ＨＭＤＥＲ−βＧａｌを、単一細胞蛍光イメージングに適用し得ることを示す図である。（ａ）４−ＣＨ_２Ｆ−ＨＭＤＥＲ−βＧａｌと反応させた、ショウジョウバエ（ｅｓｇ−ｌａｃＺ）の画像。左から、蛍光画像、明視野画像これらのマージ画像。（ｂ）ショウジョウバエ腸幹細胞（ｅｓｇ−ＧＦＰ）左から、蛍光画像、明視野画像これらのマージ画像。 図１２は、本発明の酵素特異的滞留性蛍光化合物である４−ＣＨ_２Ｆ−ＨＭＤＥＲ−βＧａｌを、癌部位選択的な蛍光イメージングに適用し得ることを示す、蛍光スペクトル画像である。白い矢印は腫瘍の位置を示す。Ｕｎｍｉｘｅｄは、蛍光スペクトルにより、自家蛍光と蛍光スペクトルを分離したもの。 図１３は、本発明の酵素特異的滞留性蛍光化合物である４−ＣＨ_２Ｆ−ＨＭＤＥＲ−βＧａｌを、生体内の未固定細胞群の蛍光イメージングに適用し得ることを示す図である。 図１４は、本発明の酵素特異的滞留性蛍光化合物である４−ＣＨ_２Ｆ−ＨＭＤＥＲ−βＧａｌを、生体組織内にランダムに発現したβガラクトシダーゼ活性の、単一細胞蛍光イメージングに適用し得ることを示す図である。

以下、本発明の実施形態について説明する。本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施することができる。

本明細書において、アルキル基またはアルケニル基は、直鎖状、分枝鎖状、環状、又はそれらの組み合わせからなるアルキル基またはアルケニル基のいずれであってもよい。アルキル基またはアルケニル基の炭素数は特に限定されないが、例えば炭素数１〜６個程度、好ましくは炭素数１〜４個程度、より好ましくは炭素数１または２個程度である。本明細書において、アルキル基又はアルケニル基は、任意の置換基を１個以上有していてもよい。該置換基としては、例えば、アルコキシ基、ハロゲン原子（フッ素原子、塩素原子、臭素原子、又はヨウ素原子のいずれであってもよい）、アミノ基、モノ若しくはジ置換アミノ基、置換シリル基、アシル基、又はアリール基などを挙げることができるが、これらに限定されることはない。アルキル基又はアルケニル基が２個以上の置換基を有する場合には、それらは同一でも異なっていてもよい。アルキル部分またはアルケニル部分を含む他の置換基（例えばアルキルオキシ基やアラルキル基など）のアルキル部分またはアルケニル部分についても同様である。

（１）酵素特異的滞留性蛍光化合物
本発明の酵素特異的滞留性蛍光化合物は、一態様において、以下の一般式（Ｉ）で表される構造を有する化合物である。

上記一般式（Ｉ）において、Ｒ^１は水素原子又はベンゼン環に結合する１個ないし４個の置換基を示す。置換基としては、例えば、アルキル基、アルコキシ基、ハロゲン原子、アミノ基、モノ若しくはジ置換アミノ基、置換シリル基、又はアシル基などを挙げることができるが、これらに限定されることはない。ベンゼン環上に２個以上の置換基を有する場合には、それらは同一でも異なっていてもよい。Ｒ^１としては、水素原子、低級アルキル基又は低級アルコキシ基であることがより好ましい。水素原子が特に好ましい。

Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、及びＲ^６はそれぞれ独立に−ＣＦＲ^１０Ｒ^１１又は−ＣＦ_２Ｒ^１２、若しくは、水素原子、ヒドロキシル基、アルキル基、又はハロゲン原子を表し、Ｒ^１０、Ｒ^１１及びＲ^１２はそれぞれ独立に水素原子、アルキル基又はアルケニル基を表し、さらにここで、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、及びＲ^６の少なくとも一つは、−ＣＦＲ^１０Ｒ^１１又は−ＣＦ_２Ｒ^１２を表す。Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、及びＲ^６の少なくとも一つは、−ＣＦＲ^１０Ｒ^１１であることが好ましい。Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、及びＲ^６の少なくとも一つは、−ＣＨ_２Ｆであることがさらに好ましい。

Ｒ^２及びＲ^７はそれぞれ独立に水素原子、ヒドロキシル基、アルキル基、又はハロゲン原子を示す。Ｒ^２、Ｒ^７が水素原子であることが好ましい。

Ｒ^８及びＲ^９はそれぞれ独立に水素原子又はアルキル基を示す。Ｒ^８及びＲ^９がともにアルキル基を示す場合には、それらは同一でも異なっていてもよい。例えば、Ｒ^８及びＲ^９はそれぞれ独立に、メチル基又はエチル基であることが好ましく、Ｒ^８及びＲ^９がいずれもエチル基である場合がさらに好ましい。

Ｘは酸素原子、Ｓｅ、ＣＲ^１３Ｒ^１４、又はＳｉＲ^１５Ｒ^１６を示す。Ｒ^１３、Ｒ^１４、Ｒ^１５及びＲ^１６はそれぞれ独立に水素原子又はアルキル基を表す。これらのうち酸素原子が好ましい。

ＹはＣ^１−Ｃ^３アルキレン基を示す。アルキレン基は直鎖状アルキレン基又は分枝鎖状アルキレン基のいずれであってもよい。例えば、メチレン基（−ＣＨ_２−）、エチレン基（−ＣＨ_２−ＣＨ_２−）、プロピレン基（−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ_２−）のほか、分枝鎖状アルキレン基として−ＣＨ（ＣＨ_３）−、−ＣＨ_２−ＣＨ（ＣＨ_３）−、−ＣＨ（ＣＨ_２ＣＨ_３）−なども使用することができる。これらのうち、メチレン基又はエチレン基が好ましく、メチレン基がさらに好ましい。

Ｚは酸素原子、又はＮＲ^１７を表し、Ｒ^１７は水素原子又はアルキル基を表す。これらのうち酸素原子が好ましい。

基Ａは、酵素によって切断される一価の基を表し、具体的には、例えば、β−ガラクトピラノシル基、α−マンノシル基、β−Ｎ−アセチルグルコサミル基、β−ラクタム環、リン酸エステル、アミノフェノキシ基、ヒドロキシフェノキシ基、γ−グルタミン酸などを挙げることができるが、これらに限定されることはない。

Ａを切断するための酵素としては、例えば、還元酵素、酸化酵素、又は加水分解酵素などを挙げることができ、レポーター酵素や癌細胞において特異的に発現又は活性化する酵素、より具体的には、β−ガラクトシダーゼ、β−ラクタマーゼ、α−マンノシダーゼ、エステラーゼ、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ、ペルオキシダーゼ、チトクロームＰ４５０酸化酵素、β−グルコシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、β−ヘキソサミニダーゼ、ラクターゼ、γ−グルタミルトランスフェラーゼなどを挙げることができるが、これらに限定されることはない。好ましくは、β−ガラクトシダーゼ、β−ラクタマーゼ、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ、β−ヘキソサミニダーゼ、ペルオキシダーゼ、又はγ−グルタミルトランスフェラーゼである。最も好ましくは、β−ガラクトシダーゼである。

上記式（Ｉ）で表される化合物（式（Ｉ’）、（Ｉａ）〜（Ｉｃ）の態様の場合を含む。以下の記載においても同じ。）は塩として存在する場合がある。塩としては、塩基付加塩、酸付加塩、アミノ酸塩などを挙げることができる。塩基付加塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などの金属塩、アンモニウム塩、又はトリエチルアミン塩、ピペリジン塩、モルホリン塩などの有機アミン塩を挙げることができ、酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩などの鉱酸塩、メタンスルホン酸塩、パラトルエンスルホン酸塩、クエン酸塩、シュウ酸塩などの有機酸塩を挙げることができる。アミノ酸塩としてはグリシン塩などを例示することができる。もっとも、本発明の化合物の塩はこれらに限定されることはない。

式（Ｉ）で表される化合物は、置換基の種類に応じて１個または２個以上の不斉炭素を有する場合があり、光学異性体又はジアステレオ異性体などの立体異性体が存在する場合がある。純粋な形態の立体異性体、立体異性体の任意の混合物、ラセミ体などはいずれも本発明の範囲に包含される。

式（Ｉ）で表される化合物又はその塩は、水和物又は溶媒和物として存在する場合もあるが、これらの物質はいずれも本発明の範囲に包含される。溶媒和物を形成する溶媒の種類は特に限定されないが、例えば、エタノール、アセトン、イソプロパノールなどの溶媒を例示することができる。

本明細書の実施例には、一般式（Ｉ）で表される本発明の化合物に包含される代表的化合物についての製造方法が具体的に示されているので、当業者は本明細書の開示を参照することにより、及び必要に応じて、出発原料や試薬、反応条件などを適宜選択することにより、一般式（Ｉ）に包含される任意の化合物を容易に製造することができる。

（２）本発明の化合物の蛍光発光および細胞内滞留の機構
本発明により提供される式（Ｉ）で表される酵素特異的滞留性蛍光化合物を細胞内に取り込ませた場合、Ａで表される基を切断可能な酵素が発現している細胞では、該細胞内において、Ａで表される基が切断されるとともに、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、又はＲ^６に位置する、−ＣＦＲ^１０Ｒ^１１又は−ＣＦ_２Ｒ^１２からフッ化水素が離脱し、キノンメチドが生成される。キノンメチドは急速に周囲の求核剤による攻撃を受けることから、細胞内でキノンメチドを生成した場合、周囲のタンパク質がもつ求核基と速やかに反応し、タンパク質に不可逆的に結合するものと考えられる。

例えば、式（Ｉｂ）の化合物の場合には、以下のようにβ−ガラクトシダーゼによって基Ａの切断とスピロ環の開環が生じ、細胞内タンパク質に共有結合した蛍光化合物（ＩＩＩ）が生成する。式（ＩＩＩ）に類する化合物が蛍光を発する機構については、国際公開２００５／０２４０４９号に記載されるように、その詳細が当業者に知られている。

一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩は、中性領域において例えば４４０〜５５０ｎｍ程度の励起光を照射した場合には、ほとんど蛍光を発しないが、酵素活性によって生じた開環化合物は、同じ条件下において極めて強い蛍光を発する性質を有している。したがって、式（Ｉ）で表される酵素特異的滞留性蛍光化合物を取り込んだ細胞が、Ａで表される基を切断可能な酵素を発現していない場合には、式（ＩＩＩ）で表されるような開環化合物は生成せず、蛍光物質が該細胞内で生成することはない。このように式（Ｉ）で表される酵素特異的滞留性蛍光化合物を用いることにより、Ａで表される基を切断可能な酵素が発現および活性化している細胞のみにおいて、選択的に蛍光が生成される。さらに、式（ＩＩＩ）などで表される反応生成化合物は、細胞内タンパク質に共有結合していることから、細胞外への漏出が抑制され、これにより、当該酵素が発現および活性化している細胞を特異的に、単一細胞レベルといった詳細なレベルで可視化することが可能となる。

上記特性から、本発明の式（Ｉ）で表される化合物は、細胞を固定処理することなく、あるいは固定処理後に、単一細胞レベルで詳細に可視化することを可能とするものであり、蛍光プローブとして細胞系における細胞生物学的研究用のツールに用いる他、癌などの手術現場における迅速な病理検査に用いる検査薬、診断薬などの、幅広い利用用途を有している。

（３）本発明の酵素特異的滞留性蛍光化合物による選択的細胞可視化方法
上述の特性を示すため、本発明の細胞内滞留性蛍光化合物を、特定の酵素が発現している標的細胞の細胞を特異的に可視化する方法に用いることができる。具体的には、式（Ｉ）の酵素特異的滞留性蛍光化合物と標的細胞において特異的に発現するβ−ガラクトシダーゼ等の酵素とを接触させる工程、次いで、励起光照射を行うことで発生する蛍光を検出する工程を行うことによって、β−ガラクトシダーゼ等を発現している標的細胞のみを特異的に可視化することができる。

本発明の細胞内滞留性蛍光化合物と、標的細胞において特異的に発現する酵素とを接触させる手段としては、代表的には、酵素特異的滞留性蛍光化合物を含む溶液を試料添加、塗布、或いは噴霧することが挙げられるが、その用途に応じて適宜選択することが可能である。また、本発明の細胞内滞留性蛍光化合物を、動物個体における診断又は診断の補助、若しくは特定の細胞又は組織の検出に適用する際に、当該化合物と、標的細胞又は組織において発現する酵素とを接触させる手段としては、特に限定されることなく、例えば、静脈内投与等、当該分野において一般的な投与手段を用いることができる。

また、標的細胞に行う光照射は、当該細胞に対して光を直接或いは導波管（光ファイバー等）を介して照射することができる。光源としては、酵素切断を受けた後の、本発明の酵素特異的滞留性蛍光化合物の吸収波長を含む光を照射できるものであれば、任意の光源を用いることができ、本発明の方法を実施する環境等に応じて適宜選択され得る。

本発明の酵素特異的滞留性蛍光化合物としては、上記一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩をそのまま用いてもよいが、必要に応じて、試薬の調製に通常用いられる添加剤を配合して組成物として用いてもよい。例えば、生理的環境で試薬を用いるための添加剤として、溶解補助剤、ｐＨ調節剤、緩衝剤、等張化剤などの添加剤を用いることができ、これらの配合量は当業者に適宜選択可能である。これらの組成物は、一般的には、粉末形態の混合物、凍結乾燥物、顆粒剤、錠剤、液剤など適宜の形態の組成物として提供されるが、使用時に注射用蒸留水や適宜の緩衝液に溶解して適用することが可能である。

以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。

（１）以下のスキーム１〜３に従って、本発明の酵素特異的滞留性蛍光化合物である２−ＣＨＦ_２−ＨＭＤＥＲ−βＧａｌ、４−ＣＨＦ_２−ＨＭＤＥＲ−βＧａｌおよび４−ＣＨ_２Ｆ−ＨＭＤＥＲ−βＧａｌを合成した。

スキーム１：２−ＣＨＦ_２−ＨＭＤＥＲ−βＧａｌの合成

スキーム２：４−ＣＨＦ_２−ＨＭＤＥＲ−βＧａｌの合成

スキーム３：４−ＣＨ_２Ｆ−ＨＭＤＥＲ−βＧａｌの合成

以下に各合成反応の詳細を述べる。
○使用した合成試薬、装置等
市販の原料は試薬メーカー（和光純薬株式会社、東京化成工業株式会社、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ． Ｌｔｄ．）より購入した。
高速液体クロマトグラフィーによる精製に用いた装置およびカラム。
・ポンプ：ＰＵ−２０８０およびＰＵ−２０８７（日本分光株式会社）
・検出器：ＭＤ−２０１０（日本分光株式会社）
・カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−３
（１０ ｘ ２５０ ｍｍ ｏｒ ２０ ｘ ２５０ ｍｍ，
ＧＬ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．）
ＨＰＬＣによる分離精製用いた溶媒。
Ａ： １００ ｍＭ トリエチルアミン酢酸塩
Ｂ： ９９％ アセトニトリル、 １％ ｍｉｌｌｉＱ
ＨＰＬＣ分離における送液は、それぞれ
２５ｍＬ／ｍｉｎ（ポンプ：ＰＵ−２０８７，カラム：２０ｘ２５０ｍｍ）５ ｍＬ／ｍｉｎ（ポンプ：ＰＵ−２０８０，カラム：１０ｘ２５０ｍｍ）にて行った。
中圧カラムクロマトグラフィーによる精製はＹＦＬＣ−ＡＩ５８０（山善株式会社）を用いて行った。
ＮＭＲ測定はＡＶＡＮＣＥ ＩＩＩ ４００ Ｎａｎｏｂａｙ（Ｂｒｕｋｅｒ，Ｃｏ． Ｌｔｄ．）を用いて行った。（４００ＭＨｚ ｆｏｒ ^１Ｈ ＮＭＲ、１０１ＭＨｚ ｆｏｒ ^１３Ｃ ＮＭＲ）
質量分析測定はＭｉｃｒＯＴＯＦ（ＥＳＩ−ＴＯＦ，Ｂｒｕｋｅｒ，Ｃｏ． Ｌｔｄ．）を用いて行った。Ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ＭＳ（ＨＲＭＳ）測定については、外部標準物質としてギ酸ナトリウムを使用した。

略語の説明
ＴＨＦ： テトラヒドロフラン
ＤＭＦ： Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
ＴＦＡ： トリフルオロ酢酸
ＤＡＳＴ：三フッ化Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ硫黄
ＰＬＣ： 分取用薄層プレート

（合成例１）６−（ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）−９−（２−（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ）−９Ｈ−ｘａｎｔｈｅｎ−３−ｏｌ（ｌｅｕｃｏ−ＨＭＤＥＲ）の合成

２−（４−ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ−２−ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｙｌ）ｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ（２．５４ｇ，８．０５ｍｍｏｌ）、ｒｅｓｏｒｃｉｎｏｌ（９００ｍｇ，８．１７ｍｍｏｌ）、８５％ Ｈ_３ＰＯ_４（１５ｍＬ）を９０℃で４２時間撹拌した。エバポレーションにより水分を除去した後、ＭｅＯＨ（６０ｍＬ，４７．５ｇ，１４８３ｍｍｏｌ）、Ｈ_２ＳＯ_４（１３．５ｍＬ，２４．８ｇ，２５３ｍｍｏｌ）を加え、７０℃で終夜撹拌した。エバポレーションによりＭｅＯＨを除去し、飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液を加えて中和した。ＣＨ_２Ｃｌ_２を加えて３回分液操作を行い、有機相にＮａ_２ＳＯ_４を加えて乾燥させ、溶媒をエバポレーションにより除去し、ＤＥＲ−Ｍｅを赤色固体として得た。アルゴン雰囲気下、ＬｉＡｌＨ_４（１６８０ｍｇ，４４．３ｍｍｏｌ）、ａｎｈｙｄｒｏｕｓ ＴＨＦ（８０ｍＬ）を加えて室温で２０時間撹拌した。氷冷下で飽和ロシェル塩水溶液を加えて１時間撹拌し、ＥｔＯＡｃを加えて３回分液操作を行い、有機相にＮａ_２ＳＯ_４を加えて乾燥させ、エバポレーションにより溶媒を除去した。得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：ＣＨ_２Ｃｌ_２／ＭｅＯＨ ＝ ９８／２）により精製し、目的化合物ｌｅｕｃｏ−ＨＭＤＥＲをピンク色固体（２．４０ｇ，ｙ．７９％ ｉｎ ３ ｓｔｅｐｓ）として得た。

¹H NMR (CDCl₃): δ. 7.31-7.29 (m, 1H), 7.14 (brs, 3H), 6.61-6.56 (m, 2H), 6.48 (d, 1H, J = 2.0 Hz), 6.34 (d, 1H, J = 2.3 Hz), 6.23-6.21 (m, 2H), 5.25 (s, 1H), 4.55-4.45 (m, 2H), 3.23 (q, 4H, J = 7.0 Hz), 1.07 (t, 6H, J = 7.0 Hz). ¹³C NMR (CDCl₃): δ. 155.8, 151.5, 151.3, 147.9, 144.7, 137.7, 131.4, 130.3, 130.0, 129.5, 128.3, 127.0, 116.3, 111.3, 111.0, 108.0, 103.3, 99.2, 62.9, 44.4, 39.8, 12.5. HRMS-ESI (m/z): [M + Na]⁺ calculated for 398.1727 (C₂₄H₂₅NNaO₃), found 398.1722.

（合成例２）６−（ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ−３−ｈｙｄｒｏｘｙ−９−（２−（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ）−９Ｈ−ｘａｎｔｈｅｎｅ−２−ｃａｒｂａｌｄｅｈｙｄｅ（ｌｅｕｃｏ−２−ＣＨＯ−ＨＭＤＥＲ）の合成

アルゴン雰囲気下でｌｅｕｃｏ−ＨＭＤＥＲ（２．２０ｇ，５．８６ｍｍｏｌ）、ｈｅｘａｍｅｔｈｙｌｅｎｅｔｅｔｒａｍｉｎｅ（８３８ｍｇ，５．９８ｍｍｏｌ）、ＴＦＡ（１０ｍＬ）を７０℃で５時間、Ｈ_２Ｏ（１０ｍＬ）を加え７０℃で１０分間撹拌した。エバポレーションによりＴＦＡとＨ_２Ｏを除去した。飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液を加えて中和し、ＥｔＯＡｃを加えて３回分液操作を行い、有機相をエバポレーションにより濃縮した。中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：ＣＨ_２Ｃｌ_２／ＭｅＯＨ ＝ ９８／２）により精製し、目的化合物ｌｅｕｃｏ−２−ＣＨＯ−ＨＭＤＥＲをピンク色固体（３４４ｍｇ，ｙ．１５％）として得た。

¹H NMR (CDCl₃): δ. 11.09 (s, 1H), 9.53 (d, 1H, J = 0.4 Hz), 7.43-7.41 (m, 1H), 7.27-7.25 (m, 2H), 7.19-7.16 (m, 1H), 7.11 (d, 1H, J = 0.9 Hz), 6.67 (dd, 1H, J = 0.5 and 8.7 Hz), 6.64 (s, 1H), 6.39 (d, 1H, J = 2.6 Hz), 6.31 (dd, 1H, J = 2.6 and 8.7 Hz), 5.45 (s, 1H), 4.75-4.59 (m, 2H), 3.32 (q, 4H, J = 7.1 Hz), 1.15 (t, 6H, J = 7.1 Hz). ¹³C NMR (CDCl₃): δ. 194.9, 161.9, 157.9, 150.8, 148.2, 144.4, 138.1, 136.1, 131.4, 130.0, 129.4, 128.8, 127.4, 118.2, 117.5, 110.2, 108.6, 104.2, 98.9, 63.3, 44.5, 38.8, 12.7. HRMS-ESI (m/z): [M + H]⁺ calculated for 404.1856 (C₂₅H₂₆NO₄), found 404.1845.

（合成例３）（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ，６Ｒ）−２−（（６’−（ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）−２’−（ｄｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌ）−３Ｈ−ｓｐｉｒｏ［ｉｓｏｂｅｎｚｏｆｕｒａｎ−１，９’−ｘａｎｔｈｅｎ］−３’−ｙｌ）ｏｘｙ）−６−（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ−２Ｈ−ｐｙｒａｎ−３，４，５−ｔｒｉｏｌ（２−ＣＨＦ_２−ＨＭＤＥＲ−βＧａｌ）の合成

２，３，４，６−ｔｅｔｒａ−Ｏ−ａｃｅｔｙｌ−α−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ ｂｒｏｍｉｄｅの合成は既報（Ｊ．Ｌ．Ｍｏｎｔｅｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ． １９９７，２９７，１７５．）に従って行った。アルゴン雰囲気下、ｌｅｕｃｏ−２−ＣＨＯ−ＨＭＤＥＲ（２１０ｍｇ，０．５２０ｍｍｏｌ）、２，３，４，６−ｔｅｔｒａ−Ｏ−ａｃｅｔｙｌ−α−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ ｂｒｏｍｉｄｅ（２６０ｍｇ，０．６３２ｍｍｏｌ）、Ｃｓ_２ＣＯ_３（２９３ｍｇ，０．８９９ｍｍｏｌ）、Ｎａ_２ＳＯ_４（３２１ｍｇ，２．２６ｍｍｏｌ）、ＤＭＦ（１ｍＬ）を室温で終夜撹拌した。エバポレーションによりＤＭＦを除去し、ＣＨ_２Ｃｌ_２と飽和ＮＨ_４Ｃｌ水溶液を加えて３回分液操作を行い、有機相にＮａ_２ＳＯ_４を加えて乾燥させ、エバポレーションにより濃縮した。得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：ＣＨ_２Ｃｌ_２／ＥｔＯＡｃ ＝ ９８／２）により精製し、ｌｅｕｃｏ−２−ＣＨＯ−ＨＭＤＥＲ−βＧａｌ−Ａｃ−Ａｃ（１３７ｍｇ，０．１７７ｍｍｏｌ）を得た。アルゴン雰囲気下でａｎｈｙｄｒｏｕｓ ＣＨ_２Ｃｌ_２（５ｍＬ）に溶解させ、ＤＡＳＴ（３００μＬ，３６６ｍｇ，２．２７ｍｍｏｌ）を加えて室温で２時間半撹拌した。氷冷下でＭｅＯＨ（１０ｍＬ）を加え、反応をクエンチし、エバポレーションにより溶媒を除去した。得られた残渣にＭｅＯＨ（２８ｍＬ）を加えて溶解させ、ＮａＯＭｅ（１．３８ｇ，２５．５ｍｍｏｌ）を加えて室温で３０分間撹拌した。エバポレーションにより溶媒を除去し、残渣にＣＨ_２Ｃｌ_２を加えてセライト濾過を行い、濾液をエバポレーションにより濃縮した。中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：ＣＨ_２Ｃｌ_２／ＭｅＯＨ ＝ ９７／３ ｔｏ ９６／４）とＰＬＣ（溶離液：ＣＨ_２Ｃｌ_２／ＭｅＯＨ ＝ ９／１）により精製し、目的化合物２−ＣＨＦ_２−ＨＭＤＥＲ−βＧａｌを薄い紫色固体（１５．２ｍｇ，ｙ．５．１％ ｉｎ ３ ｓｔｅｐｓ）として得た。

¹H NMR (CD₃OD): δ. 7.46-7.39 (m, 2H), 7.30 (t, 1H, J = 7.3 Hz), 7.14 (s, 0.5H), 7.13 (s, 0.5H), 7.07 (s, 1H), 7.03 (t, 0.5H, J = 55.5 Hz), 7.02 (t, 0.5H, J = 55.5 Hz), 6.84 (d, 0.5H, J = 7.6 Hz), 6.83 (d, 0.5H, J = 7.6 Hz), 6.72 (d, 0.5H, J = 8.8 Hz), 6.72 (d, 0.5H, J = 8.8 Hz), 6.47-6.43 (m, 2H), 5.26 (s, 2H), 4.97 (dd, 1H, J = 7.8 and 11.5 Hz), 3.94 (d, 1H, J = 2.6 Hz), 3.86-3.78 (m, 4H), 3.63-3.60 (m, 1H), 3.38 (q, 4H, J = 7.0 Hz), 1.15 (t, 6H, J = 7.0 Hz). ¹³C NMR (CD₃OD): δ. 157.2 (t, J = 5.5 Hz), 154.7, 154.6, 152.9, 152.9, 150.3, 145.8, 145.7, 140.4, 140.3, 130.7, 129.5, 129.4, 128.0-127.8 (m), 124.7, 124.7, 122.0, 121.0 (t, J = 22.9 Hz), 120.9 (t, J = 22.9 Hz), 120.7, 120.6, 112.5 (t, J = 234.2 Hz), 112.1, 109.9, 104.7, 104.6, 103.5, 103.4, 98.6, 85.2, 85.2, 77.3, 74.8, 72.7, 72.7, 72.1, 70.2, 62.4, 45.4, 12.8. HRMS-ESI (m/z): [M + Na]⁺ calculated for 608.2066 (C₃₁H₃₃F₂NNaO₈), found 608.2075.

（合成例４）３−（ｄｉｅｔｈｙｌｉｍｉｎｉｏ）−５−ｆｏｒｍｙｌ−９−（２−（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ）−３Ｈ−ｘａｎｔｈｅｎ−６−ｏｌａｔｅ（４−ＣＨＯ−ＨＭＤＥＲ）の合成

ＨＭＤＥＲの合成は既報（Ｍ．Ｋａｍｉｙａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ａｍ． Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ． ２０１１，１３３，１２９６０．）を参考に行った。ＨＭＤＥＲ（２．３５ｇ，６．２９ｍｍｏｌ）にｈｅｘａｍｅｔｈｙｌｅｎｅｔｅｔｒａｍｉｎｅ（８９４ｍｇ，６．３８ｍｍｏｌ）とＴＦＡ（８ｍＬ）を加えて９５℃で１４時間撹拌し、Ｈ_２Ｏ（１０ｍＬ）を加えて９５℃で２時間撹拌した。エバポレーションによりＴＦＡとＨ_２Ｏを除去し、ＣＨ_２Ｃｌ_２と飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液を加えて３回分液操作を行い、有機相をエバポレーションにより濃縮した。残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：ＣＨ_２Ｃｌ_２／ＭｅＯＨ ＝ ９８／２）により精製し、目的化合物４−ＣＨＯ−ＨＭＤＥＲを赤色固体（９６３ｍｇ，ｙ．３８％）として得た。

¹H NMR (CDCl₃): δ 12.09 (s, 1H), 10.67 (s, 1H, CHO), 7.35-7.34 (m, 2H), 7.27-7.23 (m, 1H), 7.07 (d, 1H, J = 8.8 Hz), 6.91 (d, 1H, J = 7.6 Hz), 6.75 (d, 1H, J = 8.7 Hz), 6.57 (d, 1H, J = 8.8 Hz), 6.44 (d, 1H, J = 2.5 Hz), 6.41 (dd, 1H, J = 2.5 and 8.7 Hz), 5.25 (d, 2H, J = 5.4 Hz), 3.33 (q, 4H, J = 7.1 Hz), 1.15 (t, 6H, J = 7.1 Hz). ¹³C NMR (CDCl₃): δ 193.9, 163.3, 152.6, 150.8, 148.8, 144.4, 139.5, 138.6, 129.6, 128.4, 128.2, 123.9, 120.8, 115.9, 112.5, 111.0, 109.0, 108.8, 97.4, 83.1, 71.7, 44.4, 12.6. HRMS-ESI (m/z): [M + H]⁺ calculated for 402.1700 (C₂₅H₂₄NO₄), found 402.1684.

（合成例５）３−（ｄｉｅｔｈｙｌｉｍｉｎｉｏ）−５−（１，３−ｄｉｏｘａｎ−２−ｙｌ）−９−（２−（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ）−３Ｈ−ｘａｎｔｈｅｎ−６−ｏｌａｔｅ（４−ａｃｅｔａｌ−ＨＭＤＥＲ）の合成

４−ＣＨＯ−ＨＭＤＥＲ（７４５ｍｇ，１．８６ｍｍｏｌ）にｐｒｏｐａｎｅ−１，３−ｄｉｏｌ（１２ｍＬ，１２．７ｇ，１６７ｍｍｏｌ）とｐ−ｔｏｌｕｅｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ（２７ｍｇ，０．１５７ｍｍｏｌ）を加えて６０℃で終夜撹拌した。飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液を加えて中和し、ＣＨ_２Ｃｌ_２を加えて３回分液操作を行い、有機相をエバポレーションにより濃縮した。得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：ＣＨ_２Ｃｌ_２／ＭｅＯＨ ＝ ９８／２）により精製し、目的化合物４−ａｃｅｔａｌ−ＨＭＤＥＲを赤色固体（６４８ｍｇ，ｙ．７６％）として得た。

¹H NMR (CDCl₃):δ. 8.45 (s, 1H), 7.34-7.30 (m, 2H), 7.25-7.21 (m, 1H), 6.88 (d, 1H, J = 7.6 Hz), 6.79 (d, 1H, J = 8.7 Hz), 6.72 (d, 1H, J = 8.5 Hz), 6.56 (d, 1H, J = 8.7 Hz), 6.39-6.36 (m, 3H), 5.22 (s, 2H), 4.36-4.30 (m, 2H), 4.18-4.11 (m, 2H), 3.34 (q, 4H, J = 7.0 Hz), 2.36-2.24 (m, 1H), 1.52 (d, 1H, J = 13.7 Hz), 1.15 (t, 6H, J = 7.0 Hz). ¹³C NMR (CDCl₃):δ. 156.9, 151.6, 148.7, 148.6, 145.0, 139.6, 131.0, 129.5, 128.2, 127.8, 124.1, 120.6, 116.6, 112.5, 111.6, 109.2, 108.6, 99.1, 97.8, 83.9, 71.5, 68.0, 67.8, 44.4, 25.9, 12.7. HRMS-ESI (m/z): [M + H]⁺ calculated for 460.2119 (C₂₈H₃₀NO₅), found 460.2120.

（合成例６）６−（ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）−４−（１，３−ｄｉｏｘａｎ−２−ｙｌ）−９−（２−（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ）−９Ｈ−ｘａｎｔｈｅｎ−３−ｏｌ（ｌｅｕｃｏ−４−ａｃｅｔａｌ−ＨＭＤＥＲ）の合成

アルゴン雰囲気下で４−ａｃｅｔａｌ−ＨＭＤＥＲ（１８２ｍｇ，０．３９６ｍｍｏｌ）にＭｅＯＨ（５ｍＬ）とＮａＢＨ_４（８１ｍｇ，２．１４ｍｍｏｌ）を加えて室温で１時間半撹拌した。エバポレーションにより溶媒を除去し、飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液を加えて反応をクエンチし、ＣＨ_２Ｃｌ_２を加えて分液操作を２回行った。有機相をエバポレーションにより濃縮し、目的化合物ｌｅｕｃｏ−４−ａｃｅｔａｌ−ＨＭＤＥＲを薄いピンク色固体（１５１ｍｇ，ｙ．８３％）として得た。

¹H NMR (CDCl₃):δ. 8.30 (s, 1H), 7.39-7.35 (m, 1H), 7.22-7.15 (m, 3H), 6.72 (d, 1H, J = 8.6 Hz), 6.65 (d, 1H, J = 8.6 Hz), 6.46 (d, 1H, J = 8.6 Hz), 6.35 (d, 1H, J = 2.5 Hz), 6.34 (s, 1H), 6.27 (dd, 1H, J = 2.5 and 8.6 Hz), 5.33 (s, 1H), 4.60-4.50 (m, 2H), 4.34-4.31 (m, 2H), 4.14 (t, 2H, J = 12.0 Hz), 3.30 (q, 4H, J = 7.0 Hz), 2.35-2.23 (m, 1H), 1.80 (brs, 1H), 1.52 (d, 1H, J = 13.7 Hz), 1.14 (t, 6H, J = 7.0 Hz). ¹³C NMR (CDCl₃):δ. 155.8, 151.1, 148.3, 147.9, 144.5, 138.3, 131.4, 131.2, 129.9, 129.2, 128.2, 127.0, 115.9, 112.0, 111.2, 109.7, 108.2, 99.1, 98.9, 67.9, 67.9, 63.0, 44.3, 39.6, 25.9, 12.7. HRMS-ESI (m/z): [M + H]⁺ calculated for 462.2275 (C₂₈H₃₂NO₅), found 462.2278.

（合成例７）６−（ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）−３−ｈｙｄｒｏｘｙ−９−（２−（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ）−９Ｈ−ｘａｎｔｈｅｎｅ−４−ｃａｒｂａｌｄｅｈｙｄｅ（ｌｅｕｃｏ−４−ＣＨＯ−ＨＭＤＥＲ）の合成

アルゴン雰囲気下でｌｅｕｃｏ−４−ａｃｅｔａｌ−ＨＭＤＥＲ（１５１ｍｇ，０．３２７ｍｍｏｌ）にＴＦＡ−Ｈ_２Ｏ（２／１，１５ｍＬ）を加えて室温で３時間撹拌した。エバポレーションでＴＦＡとＨ_２Ｏを除去し、５％ Ｋ_２ＣＯ_３水溶液とＣＨ_２Ｃｌ_２を加えて分液操作を２回行い、有機相をエバポレーションにより濃縮した。得られた残渣にＭｅＯＨ（５ｍＬ）とＮａＯＭｅ（１８ｍｇ，０．３３３ｍｍｏｌ）を加えて室温で５分間撹拌した。エバポレーションにより溶媒を除去し、ＣＨ_２Ｃｌ_２と飽和ＮＨ_４Ｃｌ水溶液を加えて分液操作を行い、有機相をエバポレーションにより濃縮した。得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：ＣＨ_２Ｃｌ_２／ＭｅＯＨ ＝ ９８／２）により精製し、目的化合物ｌｅｕｃｏ−４−ＣＨＯ−ＨＭＤＥＲを薄いピンク色固体（１３４ｍｇ，ｙ．ｑｕａｎｔａｔｉｖｅ）として得た。

¹H NMR (CDCl₃): δ. 11.85 (s, 1H), 10.62 (s, 1H), 7.41-7.39 (m, 1H), 7.25-7.23 (m, 2H), 7.17-7.15 (m, 1H), 7.06 (d, 1H, J = 8.7 Hz), 6.71 (d, 1H, J = 8.7 Hz), 6.48 (d, 1H, J = 8.7 Hz), 6.39 (d, 1H, J = 2.6 Hz), 6.33 (dd, 1H, J = 2.6 and 8.7 Hz), 5.40 (s, 1H), 4.74-4.61 (m, 2H), 3.33 (q, 4H, J = 7.1 Hz), 1.16 (t, 6H, J = 7.1 Hz). ¹³C NMR (CDCl₃): δ. 194.1, 162.2, 152.7, 150.5, 148.1, 144.5, 139.1, 138.1, 131.4, 130.2, 129.3, 128.7, 127.3, 115.3, 111.9, 110.4, 109.4, 108.7, 98.7, 63.3, 44.5, 38.8, 12.7. HRMS-ESI (m/z): [M + Na]⁺ calculated for 426.1676 (C₂₅H₂₅NNaO₄), found 426.1670.

（合成例８）（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ，６Ｒ）−２−（（３’−（ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）−５’−（ｄｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌ）−３Ｈ−ｓｐｉｒｏ［ｉｓｏｂｅｎｚｏｆｕｒａｎ−１，９’−ｘａｎｔｈｅｎ］−６’−ｙｌ）ｏｘｙ）−６−（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ−２Ｈ−ｐｙｒａｎ−３，４，５−ｔｒｉｏｌ（４−ＣＨＦ_２−ＨＭＤＥＲ−βＧａｌ）の合成

アルゴン雰囲気下、ｌｅｕｃｏ−４−ＣＨＯ−ＨＭＤＥＲ（１３４ｍｇ，０．３３２ｍｍｏｌ）にａｎｈｙｄｒｏｕｓ ＤＭＦ（３ｍＬ）、２，３，４，６−ｔｅｔｒａ−Ｏ−ａｃｅｔｙｌ−α−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ ｂｒｏｍｉｄｅ（７０５ｍｇ，１．７１ｍｍｏｌ）、Ｃｓ_２ＣＯ_３（９７０ｍｇ，２．９８ｍｍｏｌ）、Ｎａ_２ＳＯ_４（３９０ｍｇ，２．７５ｍｍｏｌ）を加えて室温で終夜撹拌した。エバポレーションにより溶媒を除去し、ＣＨ_２Ｃｌ_２と飽和ＮＨ_４Ｃｌ水溶液を加えて３回分液操作を行い、有機相にＮａ_２ＳＯ_４を加えて乾燥させ、セライト濾過を行い、濾液をエバポレーションにより濃縮した。得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：ＣＨ_２Ｃｌ_２／ＥｔＯＡｃ ＝ ９８／２）により精製し、ｌｅｕｃｏ−４−ＣＨＯ−ＨＭＤＥＲ−βＧａｌ−Ａｃ−Ａｃを得た。アルゴン雰囲気下でａｎｈｙｄｒｏｕｓ ＣＨ_２Ｃｌ_２（５ｍＬ）とＤＡＳＴ（２００μＬ，２４４ｍｇ，１．５１ｍｍｏｌ）を加え、室温で４時間撹拌した。氷冷下でＭｅＯＨ（１０ｍＬ）を加えて反応をクエンチし、エバポレーションにより溶媒を除去した。得られた残渣にＭｅＯＨ（４０ｍＬ）とＮａＯＭｅ（６００ｍｇ，１１．１ｍｍｏｌ）を加えて室温で１時間撹拌し、エバポレーションにより溶媒を除去した。残渣に飽和ＮＨ_４Ｃｌ水溶液を加えて中和し、ＣＨ_２Ｃｌ_２を加えて３回分液操作を行った。有機相にＮａ_２ＳＯ_４を加えて乾燥させ、セライト濾過を行い、濾液をエバポレーションにより濃縮し、得られた残渣をＰＬＣ（溶離液：ＣＨ_２Ｃｌ_２／ＭｅＯＨ ＝ ９／１）とＨＰＬＣ（Ａ／Ｂ ＝ ５０／５０）により精製し、目的化合物４−ＣＨＦ_２−ＨＭＤＥＲ−βＧａｌを薄いピンク色固体（８．０ｍｇ，ｙ．４．１％ ｉｎ ３ ｓｔｅｐｓ）として得た。

¹H NMR (CD₃CN):δ. 7.45 (t, 1H, J = 53.7 Hz), 7.42 (d, 1H, J = 7.6 Hz), 7.40-7.36 (m, 1H), 7.28-7.24 (m, 1H), 7.06-7.03 (m, 1H), 6.92 (d, 1H, J = 8.9 Hz), 6.83 (d, 0.5H, J = 7.6 Hz), 6.83 (d, 0.5H, J = 7.6 Hz), 6.74 (d, 0.5H, J = 8.8 Hz), 6.73 (d, 0.5H, J = 8.8 Hz), 6.48 (dd, 1H, J = 2.6 and 8.8 Hz), 6.44 (d, 1H, J = 2.6 Hz), 4.88 (dd, 1H, J = 7.7 and 12.9 Hz), 3.83 (d, 1H, J = 3.1 Hz), 3.72-3.58 (m, 4H), 3.53-3.48 (m, 1H), 3.37 (q, 4H, J = 7.0 Hz), 1.13 (t, 6H, J = 7.0 Hz). ¹³C NMR (100 MHz, CD₃CN):δ. 157.1, 151.9, 151.9, 150.5, 149.9, 146.3, 146.2, 140.2, 140.2, 133.8, 133.8, 130.4, 129.3, 129.2, 129.1, 124.2, 122.1, 121.7, 112.7 (t, J = 233.5 Hz), 112.1, 111.8, 111.7, 110.7 (t, J = 22.0 Hz), 110.6 (t, J = 22.0 Hz), 109.8, 102.5, 102.4, 98.1, 83.9, 83.9, 76.5, 76.5, 74.1, 74.1, 72.9, 71.9, 71.9, 69.7, 62.2, 62.2, 45.0, 12.8. HRMS-ESI (m/z): [M + Na]⁺ calculated for 608.2066 (C₃₁H₃₃F₂NNaO₈), found 608.2064.

（合成例９）（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ，６Ｒ）−２−（（３’−（ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）−５’−（ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌ）−３Ｈ−ｓｐｉｒｏ［ｉｓｏｂｅｎｚｏｆｕｒａｎ−１，９’−ｘａｎｔｈｅｎ］−６’−ｙｌ）ｏｘｙ）−６−（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ−２Ｈ−ｐｙｒａｎ−３，４，５−ｔｒｉｏｌ（４−ＣＨ_２Ｆ−ＨＭＤＥＲ−βＧａｌ）の合成

アルゴン雰囲気下でｌｅｕｃｏ−４−ＣＨＯ−ＨＭＤＥＲ（２４９ｍｇ，０．６１６ｍｍｏｌ）にａｎｈｙｄｒｏｕｓ ＤＭＦ（６ｍＬ）、２，３，４，６−ｔｅｔｒａ−Ｏ−ａｃｅｔｙｌ−α−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ ｂｒｏｍｉｄｅ（５５０ｍｇ，１．３４ｍｍｏｌ）、Ｃｓ_２ＣＯ_３（１．５０ｇ，４．６０ｍｍｏｌ）、Ｎａ_２ＳＯ_４（４００ｍｇ，２．８２ｍｍｏｌ）を加えて室温で２時間半撹拌した。反応液にＡｃ_２Ｏ（１００μＬ，１０８ｍｇ，１．０６ｍｍｏｌ）を加えて室温でさらに１時間撹拌した。エバポレーションにより溶媒を除去し、ＣＨ_２Ｃｌ_２と飽和ＮＨ_４Ｃｌ水溶液を加えて３回分液操作を行い、有機相にＮａ_２ＳＯ_４を加えて乾燥させ、セライト濾過を行い、濾液をエバポレーションにより濃縮した。残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：ＣＨ_２Ｃｌ_２／ＥｔＯＡｃ ＝ ９８／２）により精製し、ｌｅｕｃｏ−４−ＣＨＯ−ＨＭＤＥＲ−βＧａｌ−Ａｃ−Ａｃを得た。アルゴン雰囲気下、ａｎｈｙｄｒｏｕｓ ＴＨＦ（５ｍＬ）と１．０ Ｍ ＬｉＡｌＨ（ＯｔＢｕ）_３ ｉｎ ＴＨＦ（１ｍＬ，１．００ｍｍｏｌ）を加えて０℃で５０分間撹拌し、氷冷下で飽和ＮＨ_４Ｃｌ水溶液（３ｍＬ）を加えて反応をクエンチした。ＥｔＯＡｃ（７ｍＬ）を加えて室温で１時間撹拌し、有機相を抽出した。水相にＣＨ_２Ｃｌ_２と飽和ロシェル塩水溶液を加えて撹拌し、有機相を抽出する操作を２回行った。有機相を合わせ、エバポレーションにより濃縮し、残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：ＣＨ_２Ｃｌ_２／ＥｔＯＡｃ ＝ ９８／２）により精製し、ｌｅｕｃｏ−４−ＣＨ_２ＯＨ−ＨＭＤＥＲ−βＧａｌ−Ａｃ−Ａｃを得た。アルゴン雰囲気下でａｎｈｙｄｒｏｕｓ ＣＨ_２Ｃｌ_２（５ｍＬ）とＤＡＳＴ（２００μＬ，２４４ｍｇ，１．５１ｍｍｏｌ）を加えて室温で３０分間撹拌し、氷冷下でＭｅＯＨ（１０ｍＬ）を添加して反応をクエンチした。エバポレーションにより溶媒を除去し、得られた残渣にＭｅＯＨ（２０ｍＬ）とＮａＯＭｅ（７００ｍｇ，１３．０ｍｍｏｌ）を加えて室温で５分間撹拌し、飽和ＮＨ_４Ｃｌ水溶液（２ｍＬ）を加えて反応をクエンチした。エバポレーションにより濃縮した後、ＣＨ_２Ｃｌ_２と飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液を加えて分液操作を３回行った。水相にＣＨ_２Ｃｌ_２を加えて分液し、有機相を合わせた。有機相にＮａ_２ＳＯ_４を加えて乾燥させ、セライト濾過を行い、濾液をエバポレーションにより濃縮した。残渣にＭｅＯＨ（１０ｍＬ）とｐ−ｃｈｌｏｒａｎｉｌ（８０ｍｇ，０．３２５ｍｍｏｌ）を加えて室温で５分間撹拌した。エバポレーションにより溶媒を除去し、ＣＨ_２Ｃｌ_２と飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液を加えて分液操作を３回行い、有機相に飽和ＮａＣｌ水溶液を加えて洗浄操作を行った。有機相にセライト濾過を行い、濾液をエバポレーションにより濃縮した。得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：ＣＨ_２Ｃｌ_２／ＭｅＯＨ ＝ ９８／２ ｔｏ ９４／６）とＨＰＬＣ（Ａ／Ｂ ＝ ５０／５０）により精製し、目的化合物４−ＣＨ_２Ｆ−ＨＭＤＥＲ−βＧａｌを薄いピンク色固体（６５．９ｍｇ，ｙ．１８％ ｉｎ ６ ｓｔｅｐｓ）として得た。

¹H NMR (400 MHz, CD₃CN):δ. 7.42 (d, 1H, J = 7.6 Hz), 7.37 (t, 1H, J = 7.4 Hz), 7.26 (t, 1H, J = 7.5 Hz), 6.97 (d, 0.5H, J = 8.9 Hz), 6.97 (d, 0.5H, J = 8.9 Hz), 6.90 (d, 0.5H, J = 8.9 Hz), 6.89 (d, 0.5H, J = 8.9 Hz), 6.82 (d, 0.5H, J = 7.6 Hz), 6.81 (d, 0.5H, J = 7.6 Hz), 6.74 (d, 0.5H, J = 8.8 Hz), 6.73 (d, 0.5H, J = 8.8 Hz), 6.52 (d, 1H, J = 2.5 Hz), 6.47 (dd, 1H, J = 2.5 and 8.8 Hz), 5.81 (d, 2H, J = 48.1 Hz), 5.25 (s, 2H), 4.86 (dd, 1H, J = 7.7 and 12.8 Hz), 3.83 (d, 1H, J = 3.2 Hz), 3.74-3.48 (m, 5H), 3.38 (q, 4H, J = 7.0 Hz), 1.14 (t, 6H, J = 7.0 Hz). ¹³C NMR (100 MHz, CD₃CN):δ. 157.8, 157.7, 152.3, 152.2, 151.0, 149.8, 146.5, 146.3, 140.3, 140.2, 132.4 (d, J = 4.6 Hz), 132.3 (d, J = 4.7 Hz), 130.4, 129.2, 129.0, 124.2, 122.0, 121.1, 121.0, 113.0 (d, J = 15.1 Hz), 113.0 (d, J = 15.2 Hz), 112.4, 112.3, 111.5 (d, J = 8.6 Hz), 111.5 (d, J = 8.4 Hz), 109.6, 102.4, 102.3, 98.2, 98.2, 84.3, 84.2, 76.4, 76.3, 74.5 (d, J = 158.7 Hz), 74.2, 72.8, 72.7, 72.0, 72.0, 69.7, 62.2, 62.2, 45.0, 12.8. HRMS-ESI (m/z): [M + H]⁺ calculated for 568.2341 (C₃₁H₃₅FNO₈), found 568.2343.

本願発明の酵素特異的滞留性蛍光化合物が、蛍光イメージングプローブとして優れた性質を有することを、以下の試験例により確認した。

試験例１

β−ガラクトシダーゼとの酵素反応特異的な蛍光発光
２−ＣＨＦ_２−ＨＭＤＥＲ−βＧａｌ、４−ＣＨＦ_２−ＨＭＤＥＲ−βＧａｌおよび４−ＣＨ_２Ｆ−ＨＭＤＥＲ−βＧａｌが、β−ガラクトシダーゼによる酵素処理特異的に蛍光を発生することを確認した。

（材料と方法）
本発明の酵素特異的滞留性蛍光化合物である２−ＣＨＦ_２−ＨＭＤＥＲ−βＧａｌ、４−ＣＨＦ_２−ＨＭＤＥＲ−βＧａｌまたは４−ＣＨ_２Ｆ−ＨＭＤＥＲ−βＧａｌと、β−ガラクトシダーゼを３０分間酵素反応させることによって生じる、吸収スペクトル変化及び蛍光スペクトル変化（励起波長５５０ｎｍ）を、リン酸ナトリウム緩衝液２００ｍＭ存在下（ｐＨ７．４）で測定した。測定は、Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＵＶ−２４５０（島津製作所）およびＨｉｔａｃｈｉ Ｆ−７０００（日立製作所）を用いて行った。
（結果）
２−ＣＨＦ_２−ＨＭＤＥＲ−βＧａｌ、４−ＣＨＦ_２−ＨＭＤＥＲ−βＧａｌおよび４−ＣＨ_２Ｆ−ＨＭＤＥＲ−βＧａｌは、β−ガラクトシダーゼと酵素反応することにより、蛍光を発生した（図１〜３）。

これらの結果から、２−ＣＨＦ_２−ＨＭＤＥＲ−βＧａｌ、４−ＣＨＦ_２−ＨＭＤＥＲ−βＧａｌおよび４−ＣＨ_２Ｆ−ＨＭＤＥＲ−βＧａｌが、β−ガラクトシダーゼの酵素活性特異的に、蛍光を発生することが示された。

試験例２

β−ガラクトシダーゼ酵素反応による、共存タンパク質への蛍光色素の結合
２−ＣＨＦ_２−ＨＭＤＥＲ−βＧａｌ、４−ＣＨＦ_２−ＨＭＤＥＲ−βＧａｌおよび４−ＣＨ_２Ｆ−ＨＭＤＥＲ−βＧａｌを用いて、β−ガラクトシダーゼによって切断されたこれらの化合物が、溶液中に共存するウシ血清アルブミンタンパク質（ＢＳＡ）を蛍光ラベル化することを確認した。

（材料と方法）
（１）２．５μＭ ４−ＣＨ_２Ｆ−ＨＭＤＥＲ−βＧａｌ および０．５ｍｇ，／ｍＬ ＢＳＡ、（２）２．５μＭ ４−ＣＨ_２Ｆ−ＨＭＤＥＲ−βＧａｌ，０．５ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ および５Ｕ β−ガラクトシダーゼ （３）２．５ μＭ ４−ＣＨＦ_２−ＨＭＤＥＲ−βＧａｌ，０．５ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ および５Ｕ β−ガラクトシダーゼ （４）２．５μＭ ２−ＣＨＦ_２−ＨＭＤＥＲ−βＧａｌ，０．５ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ および５Ｕ β−ガラクトシダーゼ （５）２．５μＭ ＨＭＤＥＲ−βＧａｌ、０．５ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ および５Ｕ β−ガラクトシダーゼを、それぞれ水溶液中（５００ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．４）にて反応させた後、反応産物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ランニングゲル１０％、スタッキングゲル４％、泳動電圧２００Ｖ）に供した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって得られたゲルに対して、４８８ｎｍ，の励起光を照射し、５４０−６００ｎｍの蛍光をＰＭＴ電圧 １０００Ｖにて観察した（図４（ａ））。観察後、当該ゲルをクマシー染色し、ゲル上におけるＢＳＡの位置を確認した（図４（ｂ））。
（結果）
２−ＣＨＦ_２−ＨＭＤＥＲ−βＧａｌ、４−ＣＨＦ_２−ＨＭＤＥＲ−βＧａｌおよび４−ＣＨ_２Ｆ−ＨＭＤＥＲ−βＧａｌと、β−ガラクトシダーゼを、ＢＳＡ存在下で反応させることにより、ＳＤＳ泳動後のＢＳＡの位置に蛍光が確認された（図４のレーン２〜４、７５ｋＤａ付近のバンド）。β−ガラクトシダーゼを含まない試料（同レーン１）、またはＨＭＤＥＲ−βＧａｌを用いた試料（同レーン５）では、蛍光が確認されなかった。

以上の結果は、２−ＣＨＦ_２−ＨＭＤＥＲ−βＧａｌ、４−ＣＨＦ_２−ＨＭＤＥＲ−βＧａｌおよび４−ＣＨ_２Ｆ−ＨＭＤＥＲ−βＧａｌが、βガラクトシダーゼ活性特異的に変化することで、ＢＳＡに共有結合したことを示唆するものであり、本発明の酵素特異的滞留性蛍光化合物を用いることで、酵素活性特異的に、溶液中に共存するタンパク質を蛍光ラベル化し得ることを実証するものである。

試験例３

β−ガラクトシダーゼ酵素反応による細胞内タンパク質への蛍光色素の結合
２−ＣＨＦ_２−ＨＭＤＥＲ−βＧａｌ、４−ＣＨＦ_２−ＨＭＤＥＲ−βＧａｌおよび４−ＣＨ_２Ｆ−ＨＭＤＥＲ−βＧａｌが、細胞内タンパク質を酵素活性特異的に蛍光ラベル化することを確認した。

（材料と方法）
β−ガラクトシダーゼを発現するＨＥＫ細胞（ＨＥＫ−ｌａｃＺ細胞）および通常のＨＥＫ細胞を用いた。
（１）２．５μＭ ４−ＣＨ_２Ｆ−ＨＭＤＥＲ−βＧａｌ および２０μＬ １．５ｍｇ／ｍＬ ＨＥＫ細胞ライセート（２）２．５μＭ ４−ＣＨ_２Ｆ−ＨＭＤＥＲ−βＧａｌおよび２０μＬ １．５ｍｇ／ｍＬ ＨＥＫ−ｌａｃＺ細胞ライセート（３）２．５ μＭ ４−ＣＨＦ_２−ＨＭＤＥＲ−βＧａｌおよび２０μＬ １．５ｍｇ／ｍＬ ＨＥＫ−ｌａｃＺ細胞ライセート（４）２．５μＭ ２−ＣＨＦ_２−ＨＭＤＥＲ−βＧａｌおよび２０μＬ １．５ｍｇ／ｍＬ ＨＥＫ−ｌａｃＺ細胞ライセート（５）２．５μＭ ＨＭＤＥＲ−βＧａｌおよび２０μＬ １．５ｍｇ／ｍＬ ＨＥＫ−ｌａｃＺ細胞ライセートを、それぞれ、５％ＣＯ_２存在下で３７℃３０分間インキュベートした後、反応産物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ランニングゲル１０％、スタッキングゲル４％、泳動電圧２００Ｖ）に供した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって得られたゲルに対して、４８８ｎｍ，の励起光を照射し、５４０−６００ｎｍの蛍光をＰＭＴ電圧 １０００Ｖにて観察した（図５（ａ））。観察後、当該ゲルをクマシー染色し、ゲル上におけるＢＳＡの位置を確認した（図５（ｂ））。
（結果）
２−ＣＨＦ_２−ＨＭＤＥＲ−βＧａｌ、４−ＣＨＦ_２−ＨＭＤＥＲ−βＧａｌおよび４−ＣＨ_２Ｆ−ＨＭＤＥＲ−βＧａｌを、ＨＥＫ−ｌａｃＺ細胞とインキュベートした試料において、細胞内タンパク質に蛍光が確認された（図５のレーン２〜４）。β−ガラクトシダーゼを発現しないＨＥＫ細胞を用いた試料（同レーン１）、またはＨＭＤＥＲ−βＧａｌを用いた試料（同レーン５）では、蛍光が確認されなかった。

以上の結果は、２−ＣＨＦ_２−ＨＭＤＥＲ−βＧａｌ、４−ＣＨＦ_２−ＨＭＤＥＲ−βＧａｌおよび４−ＣＨ_２Ｆ−ＨＭＤＥＲ−βＧａｌが、βガラクトシダーゼ活性特異的に変化し、細胞内タンパク質に共有結合したことを示唆するものであり、本発明の酵素特異的滞留性蛍光化合物を用いることで、酵素活性特異的に、細胞内タンパク質を蛍光ラベル化し得ることを実証するものである。

試験例４

β−ガラクトシダーゼを発現している生細胞の蛍光イメージング
本願発明の酵素特異的滞留性蛍光化合物が、生細胞の蛍光イメージングに利用可能であることを確認した。

（材料と方法）
ＨＥＫ細胞、ＨＥＫ−ｌａｃＺ細胞、およびこれらの細胞の混合物を、１μＭの４−ＣＨ_２Ｆ−ＨＭＤＥＲ−βＧａｌまたはＨＭＤＥＲ−βＧａｌとともに、３０分間インキュベート（３７^ｏＣ、５％ ＣＯ_２存在下）した後、そのまま、あるいは、培地により２回洗浄した後、共焦点顕微鏡を用いて、これらの細胞の蛍光画像および微分干渉画像（ＤＩＣ）を取得した。また、４−ＣＨ_２Ｆ−ＨＭＤＥＲ−βＧａｌとインキュベーションした後、４％ＰＦＡを加えて室温で１０分間インキュベーションすることで固定した細胞も、同様に観察した。共焦点顕微鏡には、白色レーザー光、および対物レンズＨＣＸ ＰＬ ＡＰＯ ＣＳ ４０ｘ／１．２５（Ｌｅｉｃａ社製）を備えた、ＴＣＳ ＳＰ５Ｘ（Ｌｅｉｃａ社製）を用い、ＬＡＳ ＡＦ ｓｏｆｔｗａｒｅにて制御した。観察条件は以下のとおり： ホワイトライトレーザー（ＷＬＬ）： ８０％−２５％，励起波長： ５２５ｎｍ，観測波長： ５３５−５９５ｎｍ，ゲイン： ８００ Ｖ （ＰＭＴ１）／３５０Ｖ（Ｓｃａｎ−ＤＩＣ），オフセット： ０％，ピンホール：６７．８８μＭ（１エアリーディスク）．
（結果）
試験化合物とインキュベートした後、細胞を培地で洗浄することなく観察した結果、４−ＣＨ_２Ｆ−ＨＭＤＥＲ−βＧａｌでインキュベートされたＨＥＫ−ＬａｃＺ細胞は、鮮明な蛍光を示した（図６左側）。また、ＨＥＫ−ＬａｃＺ細胞とＨＥＫ細胞の混合物においては、個々の細胞における蛍光レベルに明確な差異が観察され、細胞毎のβ−ガラクトシダーゼ活性を検出・蛍光イメージング可能であることが示された。一方、ＨＭＤＥＲ−βＧａｌを用いた場合には、個々の細胞のβ−ガラクトシダーゼ活性を蛍光イメージングすることはできなかった（図６右側）。
さらに、試験化合物とインキュベート後、細胞を培地により２回洗浄した後に観察した場合においても、４−ＣＨ_２Ｆ−ＨＭＤＥＲ−βＧａｌを用いた場合の蛍光強度には、ほとんど変化がなく、４−ＣＨ_２Ｆ−ＨＭＤＥＲ−βＧａｌとβ−ガラクトシダーゼとの酵素反応後に生成する蛍光色素が、ほとんど細胞から漏出しないことが示された（図７）。
また、４−ＣＨ_２Ｆ−ＨＭＤＥＲ−βＧａｌとインキュベーションした後に固定処理を行った試料においても、生細胞と同様の蛍光イメージングが可能であった（図８）。

以上の結果は、本発明の酵素特異的滞留性蛍光化合物を用いることで、単一細胞レベルにおける詳細な生細胞蛍光イメージングを可能とし得ること、また、優れた細胞内滞留性が得られること、固定化処理を行っても、蛍光色素が細胞外にほとんど漏出しないことを実証するものである。

試験例５

フローサイトメトリーを用いた生細胞のβ−ガラクトシダーゼ活性の検出
本願発明の酵素特異的滞留性蛍光化合物を利用することで、生細胞の細胞毎の酵素活性を、フローサイトメトリーを用いて検出し得ることを確認した。

（材料と方法）
ＨＥＫ細胞、ＨＥＫ−ｌａｃＺ細胞、およびこれらの細胞の混合物を、１ μＭの４−ＣＨ_２Ｆ−ＨＭＤＥＲ−βＧａｌまたはＨＭＤＥＲ−βＧａｌとともに、３０分間インキュベート（３７^ｏＣ 、５％ ＣＯ_２存在下）した。これらの細胞を、フローサイトメメーター Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６（Ａｃｃｒｉ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒｓ）を用いて、４８８ｎｍの励起光で解析した。
（結果）
４−ＣＨ_２Ｆ−ＨＭＤＥＲ−βＧａｌとインキュベートされたＨＥＫ−ＬａｃＺ細胞とＨＥＫ細胞の混合物を、フローサイトメトリーを用いて解析したところ、ＨＥＫ−ＬａｃＺ細胞、ＨＥＫ細胞のそれぞれに対応するピークが明瞭に観察され、これらの細胞を、蛍光強度の差に基づいて明確に区別して検出可能であった（図９（ａ））。一方、ＨＭＤＥＲ−βＧａｌとインキュベートされたＨＥＫ−ＬａｃＺ細胞とＨＥＫ細胞の混合物では、これらの細胞をフローサイトメトリーの結果上区別することはできなかった（図９（ｂ））。

以上の結果は、本発明の酵素特異的滞留性蛍光化合物を用いることで、異なる酵素活性を有する細胞を、フローサイトメトリーを用いて明確に検出および区別し得ることを実証するものである。

試験例６

β−ガラクトシダーゼ活性をもつ生体組織の非固定蛍光イメージング
本願発明の酵素特異的滞留性蛍光化合物を、生体組織の蛍光イメージングに適用し得ることを確認した。

（材料と方法）
β−ガラクトシダーゼを発現する（ｅｎ−ｌａｃＺ）ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）の羽原基（ｗｉｎｇ ｄｉｓｃｓ）を、２０μＭの４−ＣＨ_２Ｆ−ＨＭＤＥＲ−βＧａｌ又はＨＭＤＥＲ−βＧａｌとともに、３０分間室温にてインキュベーションした後、共焦点顕微鏡（ＴＣＳ ＳＰ５：Ｌｅｉｃａ社製、ＬＡＳ ＡＦ ｓｏｆｔｗａｒｅ．にて制御）下で観察した。観察条件は以下のとおり；Ａｒ：４０％−２５％，励起光：５１４ｎｍ，観測光：５３５−５９５ｎｍ（ＨｙＤ２），２０倍．
（結果）
４−ＣＨ_２Ｆ−ＨＭＤＥＲ−βＧａｌを用いて蛍光イメージングを行った場合、酵素反応生成物である蛍光色素は拡散しないため、β−ガラクトシダーゼ活性をもつ部位（後部）を選択的に蛍光イメージング可能であった（図１０（ａ））。一方、ＨＭＤＥＲ−βＧａｌを用いて蛍光イメージングを行った場合は、経時的に酵素反応生成物である蛍光色素が拡散し、β−ガラクトシダーゼ活性をもつ部位が判別できなかった（図１０（ｂ））。

以上の結果は、本発明の酵素特異的滞留性蛍光化合物を用いることで、蛍光色素の拡散が抑制され、生体組織における非固定蛍光イメージングが可能となることを実証するものである。

試験例７

β−ガラクトシダーゼ活性を発現する固定処理後のハエ腸管細胞の単一細胞蛍光イメージング
本願発明の酵素特異的滞留性蛍光化合物を用いて、組織内の細胞を単一細胞レベルで蛍光イメージングすることが可能であることを確認した。

（材料と方法）
中腸にβ−ガラクトシダーゼを発現するショウジョウバエ（ｅｓｇ−ｌａｃＺ）を作製した。当該ハエを解剖後４％ＦＰＡにより固定処理を行い、４−ＣＨ_２Ｆ−ＨＭＤＥＲ−βＧａｌを添加して１０分間反応させた後洗浄し、８０％グリセロールにて透明化処理を行い、蛍光顕微鏡（ＴＣＳ ＳＰ５：Ｌｅｉｃａ社製、ＬＡＳ ＡＦ ｓｏｆｔｗａｒｅ．にて制御）にて観察を行った。対照として、ＧＦＰを発現するショウジョウバエ腸幹細胞（ｅｓｇ−ＧＦＰ）を観察した。観察条件は以下のとおり；励起光：５１４ｎｍ，観測光：５３５−５９５ｎｍ（ＨｙＤ２），４０倍．
（結果）
ショウジョウバエ（ｅｓｇ−ｌａｃＺ）を４−ＣＨ_２Ｆ−ＨＭＤＥＲ−βＧａｌと反応させることにより、組織内に蛍光を発する細胞を確認することができた（図１１（ａ））。当該画像は、ショウジョウバエ腸幹細胞（ｅｓｇ−ＧＦＰ）の蛍光画像（図１１（ｂ））と類似していた。

以上の結果は、本発明の酵素特異的滞留性蛍光化合物を用いることで、単一細胞蛍光イメージングが可能であることを実証するものである。
なお、固定処理を行っていない、β−ガラクトシダーゼ発現腸管細胞でも、同様の蛍光イメージングが可能であることを確認している。

試験例８

卵巣癌播種モデルマウスのｅｘ ｖｉｖｏ蛍光イメージング
本願発明の酵素特異的滞留性蛍光化合物を用いて、癌部位を選択的に蛍光イメージング可能であることを確認した。

（材料と方法）
卵巣癌細胞ＳＨＩＮ３を播種して、癌モデルマウスを作製した。卵巣癌細胞においては、酸性β−ガラクトシダーゼ活性が上昇していることが知られている。当該癌モデルマウスに、４−ＣＨ_２Ｆ−ＨＭＤＥＲ−βＧａｌを腹腔内注射して１時間後に、Ｍａｅｓｔｒｏ ｉｎ−ｖｉｖｏ ｉｍａｇｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ（ＣＲｉ）を用いて蛍光観察を行った。観察条件は以下のとおり；励起光：４９０−５３０ｎｍ，観測光：５５０−８００ｎｍ
（結果）
蛍光観察の結果、癌部位と考えられる組織部位（白矢印で示す）から、酵素反応後に生成する蛍光色素由来の蛍光が観察された（図１２）。蛍光スペクトルにより蛍光を分離する操作（ｕｎｍｉｘ）を行ったところ、自家蛍光と蛍光スペクトルを分離することが可能であった。

以上の結果は、本発明の酵素特異的滞留性蛍光化合物を用いることで、生体における癌部位を、選択的に蛍光イメージング可能であることを実証するものである。

試験例９

未固定ショウジョウバエ組織における、モザイク状に発現したβ−ガラクトシダーゼ活性の蛍光イメージング
本願発明の酵素特異的滞留性蛍光化合物を用いて、生体組織内にモザイク状に分布するβ−ガラクトシダーゼ活性細胞群を未固定で蛍光イメージングすることが可能であることを確認した。
（材料と方法）
雄のＨｉｓ２Ａｖ−ｍＲＦＰ１， ＦＲＴ８０Ｂ／ＴＭ６Ｂをもつショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）と雌のｈｓ−ｆｌｐ；；ａｒｍ−ｌａｃＺ， ＦＲＴ８０Ｂをもつショウジョウバエを交配させ、その子が孵化して３０時間後の一齢幼虫のときに３７℃、１時間ヒートショックを与え、羽原基（ｗｉｎｇ ｄｉｓｃｓ）に以下の三種類の遺伝子型の細胞をモザイク状に発現させた；（１） β−ガラクトシダーゼのみが発現した細胞（ａｒｍ−ｌａｃＺ）、（２） 赤色蛍光タンパク質（ｍＲＦＰ１）のみが発現した細胞（Ｈｉｓ２Ａｖ−ｍＲＦＰ１）、（３） β−ガラクトシダーゼとｍＲＦＰ１が共に発現した細胞（ａｒｍ−ｌａｃＺ／Ｈｉｓ２Ａｖ−ｍＲＦＰ１）。三齢（終齢）幼虫から解剖した羽原基を１０ μＭの４−ＣＨ_２Ｆ−ＨＭＤＥＲ−βＧａｌを含む培地中に３０分間浸し、共焦点蛍光顕微鏡（ＴＣＳ ＳＰ５：Ｌｅｉｃａ社製、ＬＡＳ ＡＦ ｓｏｆｔｗａｒｅにて制御）下で観察した。観察条件は以下の通り；（４−ＣＨ_２Ｆ−ＨＭＤＥＲ−βＧａｌ）励起光：５１４ ｎｍ、観測光：５２５−５８５ ｎｍ、（ｍＲＦＰ１）励起光：５９４ ｎｍ、観測光：６１０−７００ ｎｍ、６３倍。
（結果）
４−ＣＨ_２Ｆ−ＨＭＤＥＲ−βＧａｌを用いて蛍光イメージングを行ったところ、上記三種類の遺伝子型をもつ細胞がモザイク状に存在する様子が鮮明に可視化された（図１３）。
以上の結果は、本発明の酵素特異的滞留性蛍光化合物を用いることで、生体組織に存在するβ−ガラクトシダーゼ発現細胞を非固定で明確に可視化・判別可能であることを実証するものである。

試験例１０

β−ガラクトシダーゼ活性を発現するハエ脂肪体細胞の単一細胞蛍光イメージング
本願発明の酵素特異的滞留性蛍光化合物を用いて、生体組織内にランダムに発現したβ−ガラクトシダーゼ活性を、単一細胞レベルで蛍光イメージングすることが可能であることを確認した。
（材料と方法）
ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）脂肪体のクローン解析を行うため、フリップアウト技術を使ってＵＡＳ−ｌａｃＺをｈｓ−ｆｌｐ^１２２；Ａｃｔｉｎ＞ｙ＞Ｇａｌ４に掛け合わせることによってβ−ガラクトシダーゼを過剰発現させた。生細胞蛍光イメージングを行うため、三齢（終齢）のハエから脂肪体を解剖し、１０ μＭの４−ＣＨ_２Ｆ−ＨＭＤＥＲ−βＧａｌと１６ μＭのＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（細胞核染色剤）を含む培地に２０分間インキュベーションし、ＰＢＳで洗浄し、８０％グリセロール中に固定した。また、免疫化学染色を行うため、解剖した脂肪体を４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）含有ＰＢＳに２０分間浸し、固定処理を行った。ブロッキングの後、脂肪体をβ−ガラクトシダーゼに対するマウス由来モノクローナル抗体（１：２５０、プロメガ社）に３０分間浸し、１０ μＭの４−ＣＨ_２Ｆ−ＨＭＤＥＲ−βＧａｌ、１６ μＭのＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２、Ａｌｅｘａ ６４７修飾二次抗体を加え、共焦点蛍光顕微鏡（ＴＣＳ ＳＰ５：Ｌｅｉｃａ社製、ＬＡＳ ＡＦ ｓｏｆｔｗａｒｅにて制御）下で観察した。観察条件は以下の通り；（Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２）励起光：４０５ ｎｍ、観測光：４１５−４９０ ｎｍ、（４−ＣＨ_２Ｆ−ＨＭＤＥＲ−βＧａｌ）励起光：５１４ ｎｍ、観測光：５２５−６００ ｎｍ、（Ａｌｅｘａ ６４７修飾二次抗体）励起光：６３３ ｎｍ、観測光：６４０−７００ ｎｍ、４０倍。
（結果）
４−ＣＨ_２Ｆ−ＨＭＤＥＲ−βＧａｌを用いて蛍光イメージングを行い、生体組織内にランダムに発現したβ−ガラクトシダーゼ活性細胞を単一細胞ずつ蛍光イメージングすることが可能であることを確認した（図１４）。
以上の結果は、本発明の酵素特異的滞留性蛍光化合物を用いることで、生体組織内にランダムに発現したβ−ガラクトシダーゼ活性細胞を単一細胞ずつ可視化・判別可能であることを実証するものである。

本発明により、酵素活性特異的に蛍光を発すると同時に、当該酵素を有する生細胞内に滞留することで、当該細胞を固定することなく、あるいは固定した状態で、単一細胞レベルで選択的に可視化可能な蛍光化合物、当該蛍光化合物を用いた蛍光イメージングプローブ、当該蛍光プローブを用いた検出方法、検出キット又は検出剤が提供される。本発明の酵素特異的滞留性蛍光化合物およびこれを用いたイメージング手法は、細胞の老化機構を解明するための分子ツールとして利用し得るほか、癌細胞選択的な蛍光イメージングプローブとして、検査、診断などの分野において、幅広い利用用途を有している。

Claims (15)

1. 以下の式（Ｉ’）で表される化合物又はその塩を含む、酵素特異的滞留性蛍光化合物：
   

   

   （式中、Ａはβ−ガラクトピラノシル基、α−マンノシル基、又はβ−Ｎ−アセチルグルコサミル基を表し；Ｒ^１は水素原子又はベンゼン環に結合する１個ないし４個の同一又は異なる置換基を表し、前記置換基は、低級アルキル基、低級アルコキシ基、ハロゲン原子、アミノ基、モノ若しくはジ置換アミノ基、置換シリル基、及びアシル基よりなる群から選択される基であり；Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、及びＲ^６はそれぞれ独立に−ＣＦＲ^１０Ｒ^１１又は−ＣＦ_２Ｒ^１２、若しくは水素原子、ヒドロキシル基、アルキル基、又はハロゲン原子を表し；Ｒ^２及びＲ^７はそれぞれ独立に水素原子、ヒドロキシル基、アルキル基、又はハロゲン原子を表し；Ｒ^８及びＲ^９はそれぞれ独立に水素原子又はアルキル基を表し；Ｒ^１０、Ｒ^１１及びＲ^１２はそれぞれ独立に水素原子、アルキル基又はアルケニル基を表し；Ｘは酸素原子、Ｓｅ、ＣＲ^１３Ｒ^１４、又はＳｉＲ^１５Ｒ^１６を表し；Ｒ^１３、Ｒ^１４、Ｒ^１５及びＲ^１６はそれぞれ独立に水素原子又はアルキル基を表し；ＹはＣ_１−Ｃ_３アルキレン基を表し、ここで、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、及びＲ^６の少なくとも一つは、−ＣＦＲ^１０Ｒ^１１又は−ＣＦ_２Ｒ^１２を表す。）
2. Ａがβ−ガラクトピラノシル基である、請求項１に記載の酵素特異的滞留性蛍光化合物。
3. Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、及びＲ^６の少なくとも一つは、−ＣＦＲ^１０Ｒ^１１である、請求項１又は２に記載の酵素特異的滞留性蛍光化合物。
4. Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、及びＲ^６の少なくとも一つは、−ＣＨ_２Ｆである、請求項１又は２に記載の酵素特異的滞留性蛍光化合物。
5. 以下の式（Ｉａ）〜（Ｉｃ）で表される化合物又はその塩を含む、酵素特異的滞留性蛍光化合物：
   

   
6. 請求項１〜５のいずれかに記載の酵素特異的滞留性蛍光化合物を含有する蛍光イメージングプローブ。
7. 請求項１〜５のいずれかに記載の酵素特異的滞留性蛍光化合物を含有する、特定の酵素が発現している標的細胞を検出するための、又は可視化するための組成物又はキット。
8. 前記標的細胞が、β−ガラクトシダーゼ発現細胞である、請求項７に記載の組成物又はキット。
9. 前記標的細胞が、癌細胞である、請求項７に記載の組成物又はキット。
10. 請求項１〜５のいずれかに記載の酵素特異的滞留性蛍光化合物と、当該標的細胞において特異的に発現する酵素とを、生体外において接触させ、特定の酵素が発現している標的細胞を検出する方法。
11. 前記酵素特異的滞留性蛍光化合物と、当該標的細胞において特異的に発現する酵素とを、生体外において接触させる工程、及び、励起光照射を行って蛍光を生じさせる工程を含むことを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
12. 前記標的細胞が、β−ガラクトシダーゼ発現細胞である、請求項１０又は１１に記載の方法。
13. 前記標的細胞が、癌細胞である、請求項１０〜１２のいずれかに記載の方法。
14. 以下の式（ＩＩ）で表される化合物：
    

    

    （式中、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、及びＲ^６はそれぞれ独立に−Ｃ（＝Ｏ）Ｈ、水素原子、ヒドロキシル基、アルキル基、又はハロゲン原子を表し；Ｒ^２及びＲ^７はそれぞれ独立に水素原子、ヒドロキシル基、アルキル基、又はハロゲン原子を表し；Ｒ^８及びＲ^９はそれぞれ独立に水素原子又はアルキル基を示し；Ｘは酸素原子、Ｓｅ、ＣＲ^１３Ｒ^１４又はＳｉＲ^１５Ｒ^１６を表し；Ｒ^１３、Ｒ^１４、Ｒ^１５又はＲ^１６はそれぞれ独立に水素原子又はアルキル基を示し；ＹはＣ_１−Ｃ_３アルキレン基を表し、ここで、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、及びＲ^６の少なくとも一つは、−Ｃ（＝Ｏ）Ｈを表す。）
15. 以下の式（ＩＩａ）又は（ＩＩｂ）で表される化合物：
    

    

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