JP2023012556A

JP2023012556A - 細胞滞留性蛍光化合物並びにそれを用いた細胞の染色方法及び高感度検出方法

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Publication number: JP2023012556A
Application number: JP2019111159A
Authority: JP
Inventors: 雄也大内; Yuya Ouchi; 克也野口; Katsuya Noguchi; 宗孝石山; Munetaka Ishiyama; 佳樹片山; Yoshiki Katayama; 健森; Takeshi Mori
Original assignee: Dojindo Laboratory and Co Ltd; Kyushu University NUC
Current assignee: Dojindo Laboratory and Co Ltd; Kyushu University NUC
Priority date: 2019-06-14
Filing date: 2019-06-14
Publication date: 2023-01-26
Also published as: JP7385850B2; WO2020250998A1; JPWO2020250998A1

Abstract

【課題】標的となる細胞表面タンパク質が発現した細胞のみを特異的かつ高感度に検出することを可能にする細胞滞留性蛍光化合物並びにそれを用いた細胞の染色方法及び高感度検出方法を提供する。【解決手段】下記の一般式（Ｉ）で表される細胞滞留性蛍光化合物。Ａは酵素反応により切断される１価の親水基であり、Ｒ１、Ｒ３又はＲ５は、ベンジル位にフッ素原子を１つ又は２つ有するアルキル基であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５のいずれか１つは、疎水性の蛍光基を含み、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５のうち、隣り合う２つは、原子を共有し環を形成していてもよい。TIFF2023012556000025.tif2848【選択図】図５

Description

本発明は、特定の細胞に対し高い特異性を有する細胞の染色技術の改良に関し、より具体的には細胞滞留性蛍光化合物並びにそれを用いた細胞の染色方法及び高感度検出方法に関する。

各種疾患の診断及び治療の分野において、がん細胞等の特定の疾患に罹患した細胞上に高発現する細胞表面タンパク質を標的とする抗体医薬や高感度検出方法が注目を集めている。特定疾患のマーカーとなるタンパク質は多数知られており、疾患の早期発見、早期治療等のためにそれらのマーカータンパク質を高感度で検出する方法に対するニーズが高まりつつある。しかしながら、マーカータンパク質には発現量が少ないものが多く、従来技術では検出及び解析が困難なものが多い。例えば、フローサイトメトリーで解析可能なタンパク質は、細胞１個あたり１０^４コピー以上の発現量を有するものに限られており、このようなマーカータンパク質は、既知のマーカータンパク質全体の約３５％に過ぎず、細胞１個あたりの発現量が１０^３コピー以下であるものも、既知のマーカータンパク質全体の約３７％であると言われている。

従来法に係る細胞表面マーカータンパク質の特異的な検出方法としては、蛍光基で修飾した抗体を用い、標的となるマーカータンパク質に蛍光修飾抗体を結合させ、蛍光検出法を用いて読み出す方法が広く知られている（例えば、非特許文献１参照）。この方法の欠点は感度が低いことであり、検出限界が細胞１個あたり１０^３コピーであるため、適用対象が限られるという問題が存在する。

抗体と蛍光色素を用いる高感度検出方法として提案されているものの１つに、ＣＡＲＤ法（CAtalyzed Reporter Deposition法）と呼ばれる方法がある（例えば、非特許文献２参照）。この方法では、ＨＲＰ（セイヨウワサビペルオキシダーゼ）で修飾した抗体を標的となる細胞表面マーカータンパク質に結合させ、ＨＲＰと過酸化水素を用いてチラミド色素を酸化し、生成するチラミドラジカルとタンパク質のチロシン残基のヒドロキシフェニル基の間で結合を形成させることによりチラミド色素を細胞表面に固定化することで、細胞特異的な蛍光染色とシグナル増幅を可能にしている（下式参照）。しかしながら、この方法によるシグナル増幅の効果は蛍光標識抗体を用いた場合の１０倍程度であり、依然感度が低いという問題が残っている。また、チラミドラジカルによる細胞毒性のため、生細胞系への適用が制限されるおそれもある。

上記の課題の解決策として、ＨＲＰ以外の酵素で修飾した抗体と、疎水性の蛍光基に当該酵素の基質となる、すなわち酵素反応により切断される親水基を導入した蛍光色素を組み合わせて用いる方法（ＣＡＲＰ法）が提案された（特許文献１参照）。標的となるマーカータンパク質に酵素修飾抗体が結合した細胞に、親水基が結合した蛍光色素（親水性を有するため、細胞膜透過性を有しない）が接近し、酵素の作用により親水基が切断されると、蛍光色素は細胞膜透過性を有するようになり、細胞膜上を拡散したり、細胞膜を透過したりすることにより、細胞内に蓄積され、従来法よりも高感度での検出が可能になる（下式参照）。

特開２０１８－７０５８７号公報

Beck, M. et al., "The quantitative proteome of a human cell line", Mol. Systems Biol., 2011, 7, 549. Clutter, M. R. et al., "Tyramide signal amplification for analysis of kinase activity by intracellular flow cytometry", Cytometry Part A, 2010, 77, 1020-1031.

しかしながら、ＣＡＲＰ法で用いられる蛍光色素は細胞内滞留性が低く、細胞からの漏出や、それに伴い、標的となる細胞表面マーカータンパク質が発現していない他の細胞に対する非特異的な蛍光染色を引き起こす可能性がある。

本発明はかかる事情に鑑みてなされたもので、標的となる細胞表面タンパク質が発現した細胞のみを特異的かつ高感度に検出することを可能にする細胞滞留性蛍光化合物並びにそれを用いた細胞の染色方法及び高感度検出方法を提供することを目的とする。

前記目的に沿う本発明の第１の態様は、下記の一般式（Ｉ）で表される細胞滞留性蛍光化合物を提供することにより上記課題を解決するものである。

なお、上記一般式（Ｉ）において、
Ａは酵素反応により切断される１価の親水基であり、
Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４及びＲ^５は、それぞれ独立して、下記の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）からなる群より選択される原子又は原子団であり、
(ａ）水素原子、ヒドロキシル基、ハロゲン原子、アミノ基、スルホンアミド基、アジド基、シアノ基
(ｂ）１又は複数の水素原子が他の原子又は官能基で置換されていてもよく、かつ炭素骨格中に窒素原子、酸素原子、ケイ素原子、硫黄原子、エステル基、アミド基、ウレタン基及び尿素基を含んでいてもよい直鎖アルキル基、分岐鎖アルキル基、シクロアルキル基、アリール基及びヘテロアリール基
(ｃ）エステル基、アミド基、ウレタン基及び尿素基
Ｒ^１、Ｒ^３又はＲ^５は、ベンジル位にフッ素原子を１つ又は２つ有するアルキル基であり、
Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４及びＲ^５のいずれか１つは、疎水性の蛍光基を含み、
Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４及びＲ^５のうち、隣り合う２つは、原子を共有し環を形成していてもよい。

本発明の第１の態様に係る細胞滞留性蛍光化合物において、前記疎水性の蛍光基が細胞膜透過性を有することが好ましい。

本発明の第１の態様に係る細胞滞留性蛍光化合物を表す前記一般式（Ｉ）において、Ａがβ－Ｄ－ガラクトキシル基であってもよい。

本発明の第１の態様に係る細胞滞留性蛍光化合物を表す前記一般式（Ｉ）において、Ｒ^１又はＲ^５がフルオロメチル基若しくはジフルオロメチル基であることが好ましい。

本発明の第１の態様に係る細胞滞留性蛍光化合物が、下記の式（１）から（７）のいずれかで表されることが好ましい。

本発明の第２の態様は、標的細胞の表面に発現する抗原タンパク質に対する特異性を有する抗体に酵素を結合させた酵素標識抗体を該標的細胞に結合させる工程と、前記酵素標識抗体が結合した前記標的細胞に、下記の一般式（Ｉ）で表される細胞滞留性蛍光化合物を接触させる工程を含む細胞の染色方法を提供することにより上記課題を解決するものである。

なお、上記一般式（Ｉ）において、
Ａは前記酵素標識抗体に結合した酵素に触媒される反応により切断される１価の親水基であり、
Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４及びＲ^５は、それぞれ独立して、下記の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）からなる群より選択される原子又は原子団であり、
(ａ）水素原子、ヒドロキシル基、ハロゲン原子、アミノ基、スルホンアミド基、アジド基、シアノ基
(ｂ）１又は複数の水素原子が他の原子又は官能基で置換されていてもよく、かつ炭素骨格中に窒素原子、酸素原子、ケイ素原子、硫黄原子、エステル基、アミド基、ウレタン基及び尿素基を含んでいてもよい直鎖アルキル基、分岐鎖アルキル基、シクロアルキル基、アリール基及びヘテロアリール基
(ｃ）エステル基、アミド基、ウレタン基及び尿素基
Ｒ^１、Ｒ^３又はＲ^５は、ベンジル位にフッ素原子を１つ又は２つ有するアルキル基であり、
Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４及びＲ^５のいずれか１つは、細胞膜透過性を有する疎水性の蛍光基を含み、
Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４及びＲ^５のうち、隣り合う２つは、原子を共有し環を形成していてもよい。

本発明の第２の態様に係る細胞の染色方法において、前記標的細胞に発現する抗原タンパク質が、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＨＥＲ２、ＰＤＬ－１、ＰＤＬ－２、ＷＴ－１、ＰＤ－１、ＣＣＲ４、ＣＤ３３、ＣＤ２４、ＣＤ２９、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１０５、ＣＤ１３３、ＣＤ１６６、ＣＤ２００、ＥＳＡ、ＣＸＣＲ４、Ｓｔｒｏ－１、ＥｐＣＡＭ、Ｉｎｔｅｇｒｉｎ１２ｂ１、ＢＭＩ－１のいずれかであってもよい。

本発明の第２の態様に係る細胞の染色方法において、前記酵素標識抗体に含まれる前記酵素がβ－ガラクトシダーゼであり、前記一般式（Ｉ）において、Ａがβ－Ｄ－ガラクトキシル基であってもよい。

本発明の第２の態様に係る細胞の染色方法に用いられる前記細胞滞留性蛍光化合物を表す前記一般式（Ｉ）において、Ｒ^１又はＲ^５がフルオロメチル基若しくはジフルオロメチル基であることが好ましい。

本発明の第２の態様に係る細胞の染色方法において、前記細胞滞留性蛍光化合物が、下記の式（１）から（７）のいずれかで表されることが好ましい。

本発明の第３の態様は、本発明の第２の態様に係る細胞の染色方法を用いて、標的細胞の染色を行う工程と、蛍光法を用いて染色された前記標的細胞を検出する工程を含む細胞の高感度検出方法を提供することにより上記課題を解決するものである。

本発明の第３の態様に係る細胞の高感度検出方法において、染色された前記標的細胞の検出にフローサイトメトリー又は蛍光イメージングを用いてもよい。

一般式（Ｉ）で表される本発明の細胞滞留性蛍光化合物は、親水基Ａを有しているため、そのままでは細胞膜透過性を有しないが、酵素反応により親水基Ａが切断されると疎水性が向上し、細胞膜透過性を発現する。更に、親水基Ａの切断と同時に、ベンジル位にフッ素原子を１つ又は２つ有するアルキル基であるＲ^１、Ｒ^３又はＲ^５からフッ化水素が脱離することにより、キノンメチドが生成する。キノンメチドは求電子的なマイケル付加受容体であり、タンパク質中のアミノ基又はスルフヒドリル基等と反応し細胞に強く結合することにより細胞滞留性を発現する。このように、本発明の細胞滞留性蛍光化合物は、例えば、親水基Ａを切断する反応を触媒する活性を有する酵素で修飾された酵素修飾抗体と組み合わせることにより、酵素修飾抗体の標的となるタンパク質が細胞表面に発現した細胞を特異的に蛍光染色することができる。かくして、本発明によると、標的となる細胞表面タンパク質が発現した細胞のみを特異的かつ高感度に検出することを可能にする細胞滞留性蛍光化合物並びにそれを用いた細胞の染色方法及び高感度検出方法が提供される。

酵素反応の前後における化合物１のＵＶ－ＶＩＳスペクトルの変化を示す図である。酵素反応の前後における化合物１の蛍光発光スペクトルの変化を示す図である。酵素反応後の化合物１の蛍光強度の経時変化を示す図である。ＣＤ４４を標的としたＡ５４９細胞の特異的蛍光染色の結果を示す蛍光顕微鏡写真である。ＰＤ－Ｌ１発現ＨｅｐＧ２細胞の特異的蛍光染色の結果を示す蛍光顕微鏡写真である。

本発明の第１の実施の形態に係る細胞滞留性蛍光化合物（以下、単に「細胞滞留性蛍光化合物」と略称する場合がある。）は、下記の一般式（Ｉ）で表される。

酵素反応により切断される１価の親水基Ａとしては、加水分解酵素の基質となり得る任意のものを特に制限なく用いることができる。Ａの具体例としては、リン酸基、硫酸基、グルコシル基、ガラクトキシル基、キシロシル基、グルクロン酸基等が挙げられる。

疎水性の蛍光基としては、所望の発光波長及び励起波長を有する任意の公知のものを、特に制限なく用いることができる。疎水性の蛍光基の具体例としては、クマリン誘導体、フルオレセイン誘導体、ボロンジピロメテン誘導体、ローダミン誘導体、ロドール誘導体、シアニン誘導体、キサンテン誘導体、レゾルフィン誘導体、ピレン誘導体、ナフタルイミド誘導体、ベンゾオキサゾール誘導体、ＤＤＡＯ誘導体、ダンシル誘導体、スクアレン誘導体等が挙げられる。

Ｒ^１、Ｒ^３又はＲ^５は、ベンジル位にフッ素原子を１つ又は２つ有するアルキル基であるが、これは、Ａの切断によりｏ－又はｐ－キノンメチドを生成するための条件であり、好ましくはフルオロメチル基である。

好ましい化合物の具体例としては、下記の式（１）から（７）のいずれかで表されるものが挙げられる。

細胞滞留性蛍光化合物は、任意の公知の方法を用いて合成することができる。いくつかの具体例については、実施例において説明する。

本発明の第２の実施の形態に係る細胞の染色方法は、標的細胞の表面に発現する抗原タンパク質に対する特異性を有する抗体に酵素を結合させた酵素標識抗体を該標的細胞に結合させる工程と、前記酵素標識抗体が結合した前記標的細胞に、上記の一般式（Ｉ）で表される細胞滞留性蛍光化合物を接触させる工程を含んでいる。

酵素標識抗体の製造に用いられる抗体タンパク質としては、標的細胞の表面に発現するタンパク質、好ましくは標的細胞の表面に特異的に発現するタンパク質を抗原とする任意の抗体を特に制限なく用いることができる。抗原タンパク質の具体例としては、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＨＥＲ２、ＰＤＬ－１、ＰＤＬ－２、ＷＴ－１、ＰＤ－１、ＣＣＲ４、ＣＤ３３、ＣＤ２４、ＣＤ２９、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１０５、ＣＤ１３３、ＣＤ１６６、ＣＤ２００、ＥＳＡ、ＣＸＣＲ４、Ｓｔｒｏ－１、ＥｐＣＡＭ、Ｉｎｔｅｇｒｉｎ１２ｂ１、ＢＭＩ－１等が挙げられる。

抗体としては、ハイブリドーマを用いて作出されたモノクローナル抗体、動物（マウス、ラット、ヤギ等）への抗原の投与により得られるポリクローナル抗体、動物由来のポリクローナル抗体のＦｃ領域をヒト由来免疫グロブリンのものに置換したヒト化抗体等が挙げられる。

抗体の標識に用いられる酵素としては、Ａを切断する反応を触媒する活性を有する任意の加水分解酵素を、細胞滞留性蛍光化合物に用いたＡの種類に応じて適宜選択して用いることができる。酵素の具体例としては、アルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼなどが挙げられる。

酵素による抗体の標識は、結合基を介して酵素と抗体を結合させることをいい、酵素と抗体の標識部位及び用いられる結合基は、それぞれの機能を阻害しない限りにおいて特に制限されない。酵素による抗体の標識には、例えば、リンカーを介した共有結合、一次抗体と二次抗体の結合、ビオチンとアビジンの複合体形成が好ましく用いられる。酵素標識抗体の標的細胞表面への結合は、酵素標識抗体を直接標的細胞の表面に結合させることにより行ってもよく、一次抗体又はビオチン標識抗体を標的細胞の表面に結合させ、次いで酵素標識二次抗体又はアビジン標識酵素を、先に標的細胞表面に結合させた一次抗体又はビオチン標識抗体と結合させることにより行ってもよい。

酵素標識抗体が結合した細胞の表面に細胞滞留性蛍光化合物が接近すると、抗体に結合した酵素の作用により細胞滞留性蛍光化合物の親水基Ａが加水分解により切断される。それに伴い、細胞滞留性蛍光化合物が細胞膜透過性を発現すると共に反応性の高いキノンメチドを生成する。キノンメチドが標的細胞の表面又は内部のタンパク質と結合することにより、標的細胞は、特異的に蛍光染色される。

本発明の第３の実施の形態に係る細胞の高感度検出方法は、本発明の第２の実施の形態に係る細胞の染色方法を用いて、標的細胞の染色を行う工程と、蛍光法を用いて染色された前記標的細胞を検出する工程を含んでいる。

標的細胞は、酵素標識抗体の認識対象となるタンパク質を表面に発現する任意の細胞であってよい。標的細胞の具体例としては、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＨＥＲ２、ＰＤＬ－１、ＰＤＬ－２、ＷＴ－１、ＰＤ－１、ＣＣＲ４、ＣＤ３３、ＣＤ２４、ＣＤ２９、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１０５、ＣＤ１３３、ＣＤ１６６、ＣＤ２００、ＥＳＡ、ＣＸＣＲ４、Ｓｔｒｏ－１、ＥｐＣＡＭ、Ｉｎｔｅｇｒｉｎ１２ｂ１、ＢＭＩ－１等の特定の疾患マーカーが発現した細胞が挙げられる。

上述のとおり、酵素標識抗体において抗体に結合した酵素の作用による細胞滞留性蛍光化合物の親水基Ａの切断がトリガーとなり、細胞滞留性蛍光化合物が細胞膜透過性を発現すると共に反応性の高いキノンメチドを生成し、それが標的細胞の表面又は内部のタンパク質と結合することにより、標的細胞は蛍光染色される。蛍光染色された細胞の検出には、蛍光イメージング法やフローサイトメトリー法等の任意の公知の方法を用いることができるが、例えば、フローサイトメトリー法が好ましく用いられる。

本発明によると、特定の表面タンパク質が発現した細胞を特異的に蛍光染色し、高感度に検出できるため、それを利用した特定疾患の高感度診断方法、上述の細胞滞留性蛍光化合物及び酵素標識抗体を含む特定細胞の高感度検出キットも提供される。それらもまた、本発明の実施形態に含まれうる。

次に、本発明の作用効果を確認するために行った実施例について説明する。本実施例は具体的な実施態様の説明のためのものであり、本発明を限定するものではない。なお、以下の実施例において、「式（ｎ）で表される化合物」を「化合物ｎ」と称する場合がある。

実施例１：化合物（１）の合成
下記のスキームにしたがって化合物（１）の合成を行った。

中間体Ａの合成

３００ｍＬナスフラスコに、ヘキサメチレンテロラミン（２０ｇ、１４３ｍｍｏｌ）、４－メチルクマリン（１０ｇ、５７ｍｍｏｌ）、酢酸（７５ｍＬ）を入れた。オイルバスを９５℃にセットし、スターラーで撹拌しながら、４時間反応させた。室温に戻した後、希塩酸１４０ｍＬを加えた。９５℃に加温し、１時間更に反応させた。その後、酢酸エチル１００ｍＬを加え抽出操作を行った。酢酸エチル層を濃縮後、カラム精製し、中間体Ａを微黄白色粉末として７２０ｍｇ（３．５ｍｍｏｌ、２．５％）得た。

¹ H NMR(DMSO-d₆): δ 11.90(1H), 10.45(2H), 7.96-7.93(1H), 6.99-6.97(1H), 6.31(1H), 2.14(3H).

中間体Ｂの合成

５０ｍＬナスフラスコに、中間体Ａ５００ｍｇ（２．４５ｍｍｏｌ）、２，３，４，６－テトラ－Ｏ－アセチル－α－Ｄ－ガラクトピラノシルブロミド３．０ｇ（７．３５ｍｍｏｌ）、クロロホルム２０ｍＬ及び５％水酸化ナトリウム水溶液６ｍＬ加え、室温で終夜攪拌した。その後、クロロホルム８０ｍＬ及び飽和食塩水２０ｍＬ加え、抽出操作を行った。クロロホルム層を濃縮し、カラム精製を行い、中間体Ｂを白色粉末として６００ｍｇ（１．１ｍｍｏｌ、４６％）得た。

¹ H NMR(acetone-d₆): δ 10.46(1H), 8.04(1H), 7.39(1H), 7.37(1H), 6.29(1H), 5.68(1H), 5.35(2H), 5.19(1H), 4.57(1H), 4.24(2H), 2.49(3H), 2.48(3H), 2.18-1.91(12H).

中間体Ｃの合成

１００ｍＬ二口ナスフラスコに、中間体Ｂ０．５７ｇ（１．１ｍｍｏｌ）、脱水ＴＨＦ２０ｍＬ加え、アルゴン風船を付しアルゴンに置換した。フラスコを氷浴に浸け、ＬｉＡｌＨ（ＯｔＢｕ）_３４ｍＬをシリンジで滴下した。そのまま室温で一晩反応させた後、飽和塩化アンモニウム水溶液１０ｍＬ飽和食塩水１００ｍＬ及び酢酸エチル１００ｍＬ加え、抽出操作を行った。酢酸エチル層を濃縮後、ＨＰＬＣにて精製し、中間体Ｃを白色粉末として６８ｍｇ（０．１２ｍｍｏｌ、１２％）得た。

¹ H NMR(MeOD): δ 7.78(1H), 7.26(1H), 6.28(1H), 5.53-5.45(3H), 5.31(1H), 4.83(2H), 4.39(1H), 4.23(2H), 2.49(3H), 2.21(3H), 2.10-2.00(9H).

中間体Ｄの合成

２００ｍＬナスフラスコに、中間体Ｃ５５０ｍｇ（１．０ｍｍｏｌ）、クロロホルム１００ｍＬ及びＤＡＳＴ４００μＬ（２．０ｍｍｏｌ）加え、３０分間室温で反応させた。反応液を濃縮後、カラム精製し、目的物４を白色粉末として５３０ｍｇ（０．９９ｍｍｏｌ、９９％）得た。

¹ H NMR(MeOD): δ 7.92(1H), 7.27(1H), 6.28(1H), 5.65-5.52(1H), 5.49-5.45(5H), 5.31(1H), 4.42(1H), 4.26(3H), 2.49(3H), 2.21(3H), 2.10-1.98(9H).

化合物１の合成

５０ｍＬナスフラスコに、中間体Ｄ１００ｍｇ（０．１９ｍｍｏｌ）、メタノール５ｍＬ及びナトリウムメトキシド５ｍｇ（０．０１ｍｍｏｌ）加えた。室温で１時間反応させた後、純水を１ｍＬ滴下し、反応を終了させた。反応液を濃縮後、ＨＰＬＣにて精製し、化合物１を白色粉末として１１ｍｇ（３０μｍｏｌ、１６％）得た。

¹ H NMR(MeOD): δ 7.86(1H), 7.35(1H), 6.28(1H), 5.83(1H), 5.73(1H), 5.07(1H), 3.95(2H), 3.92(3H), 3.64(1H), 3.50(2H), 2.50(3H).

実施例２：化合物１の蛍光発光特性の検討
化合物１（５μＭ）を、β－ガラクトシダーゼ（５Ｕ／ｍＬ）とリン酸緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ７．４）中で混合し、１０分間室温で酵素反応を行った。その後、ＵＶ－ＶＩＳスペクトル（株式会社島津製作所ＵＶ－２４５０）と蛍光スペクトル（日本分光株式会社ＦＰ－６３００）を測定した。比較のため、酵素反応を行わない状態でのＵＶ－ＶＩＳスペクトル及び蛍光スペクトルの測定も行った。

図１に示すように、酵素反応の前後でＵＶ－ＶＩＳスペクトルが変化しているのが確認された。また、図２に示すように、化合物１は酵素反応によりβ－Ｄ－ガラクトシル基が切断されることにより蛍光発光を示すことが確認された。また、図３に示すように、化合物１は酵素に対して迅速な応答を示し、酵素反応後少なくとも１０分程度は経時変化を示さないことが確認された。

実施例３：ＣＤ４４を標的としたＡ５４９細胞の特異的蛍光染色
ＣＤ４４はＡ５４９細胞などのがん細胞表面に発現するマーカーとして知られている。本実施例では、ＣＤ４４を標的としたＡ５４９細胞の蛍光染色を行った。

Ａ５４９細胞に、抗ＣＤ４４抗体（アブカム社：ウサギモノクローナル抗体）(ＭＥＭ培地)を接触させ、ＣＯ_２インキュベーター内（３７℃）で１時間放置した。洗浄後、β－ガラクトシダーゼ標識抗ウサギ抗体（アブカム社）(ＭＥＭ培地 )を接触させ、ＣＯ_２インキュベーター内（３７℃）で１時間放置した。洗浄後、化合物１（ＨＢＳＳ）を添加し、ＣＯ_２インキュベーター内（３７℃）で３０分間インキュベート後、蛍光顕微鏡（キーエンスＢＺ－Ｘ７１０）を用いて細胞の蛍光観察を行った。比較としてキノンメチドを形成しない４－メチルウンベリフェリルβ－Ｄ－ガラクトピラノシド（ＭＵＧ）を用いて同様の実験を行った。

結果を図４に示す。Ａ５４９細胞を抗ＣＤ４４抗体、β－ガラクトシダーゼ標識抗ウサギ抗体及び化合物１で処理した場合、細胞内に強い蛍光を観察した。一方、抗ＣＤ４４抗体で処理しない場合には、蛍光は観察されなかった。この結果は、細胞表面に結合した酵素によって、疎水性の蛍光色素が生成し、細胞膜透過性が発現されることを示している。また、キノンメチド構造を形成しない蛍光基質ＭＵＧを用いた場合、細胞内にわずかな蛍光しか観察されなかった。この結果は、酵素反応によって生成したキノンメチド構造が細胞内滞留性を発揮し、高感度蛍光染色に寄与することを示している。

実施例４：ＰＤ－Ｌ１発現ＨｅｐＧ２細胞の特異的蛍光染色
ＰＤ－Ｌ１は、活性化Ｔ細胞の表面に発現しているＰＤ－１のリガンドであり、がん免疫サイクルに関与していることが知られているが、近年、肝細胞がん細胞のマーカーとしても注目されている。本実施例では、インターフェロンγ（ＩＦＮ－γ）によりＰＤ－Ｌ１を誘導したヒト肝細胞がん由来ＨｅｐＧ２細胞を用いて、化合物１による特異的染色を試みた。

ＰＤ－Ｌ１を誘導したＨｅｐＧ２細胞に、抗ＰＤ－Ｌ１抗体（アブカム社：ウサギモノクローナル抗体）(ＤＭＥＭ培地 )を接触させ、ＣＯ_２インキュベーター内（３７℃）で１時間放置した。洗浄後、β－ガラクトシダーゼ標識抗ウサギ抗体（アブカム社） (ＤＭＥＭ培地 )を接触させ、ＣＯ_２インキュベーター内（３７℃）で１時間放置した。洗浄後、化合物１（ＨＢＳＳ）を添加し、ＣＯ_２インキュベーター内（３７℃）で３０分間インキュベートした後、蛍光顕微鏡（キーエンスＢＺ－Ｘ７１０）を用いて細胞の蛍光観察を行った。また、一般的な二次抗体法として、抗ＰＤ－Ｌ１抗体と市販の蛍光色素（Ａｌｅｘａ４０５）標識抗ウサギ抗体を用いた実験を行った。また比較のため、ＰＤ－Ｌ１の発現を誘導していないＨｅｐＧ２細胞を用いて同様の実験を行った。

結果を図５に示す。ＰＤ－Ｌ１を発現誘導したＨｅｐＧ２細胞を抗ＰＤ－Ｌ１抗体、β－ガラクトシダーゼ標識抗体及び化合物１で処理した場合、細胞内に強い蛍光を観察した。一方、ＰＤ－Ｌ１を発現誘導していないＨｅｐＧ２細胞では蛍光が観察されなかったことから、抗原特異的に細胞を蛍光染色できることが示された。また、Ａｌｅｘａ４０５標識抗ウサギ抗体を用いた二次抗体法の場合には蛍光像が観測されなかった。これは、一般的な蛍光標識抗体を用いた方法では感度が不十分であることを示している。

Claims

下記の一般式（Ｉ）で表される細胞滞留性蛍光化合物。

なお、上記一般式（Ｉ）において、
Ａは酵素反応により切断される１価の親水基であり、
Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４及びＲ^５は、それぞれ独立して、下記の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）からなる群より選択される原子又は原子団であり、
(ａ）水素原子、ヒドロキシル基、ハロゲン原子、アミノ基、スルホンアミド基、アジド基、シアノ基
(ｂ）１又は複数の水素原子が他の原子又は官能基で置換されていてもよく、かつ炭素骨格中に窒素原子、酸素原子、ケイ素原子、硫黄原子、エステル基、アミド基、ウレタン基及び尿素基を含んでいてもよい直鎖アルキル基、分岐鎖アルキル基、シクロアルキル基、アリール基及びヘテロアリール基
(ｃ）エステル基、アミド基、ウレタン基及び尿素基
Ｒ^１、Ｒ^３又はＲ^５は、ベンジル位にフッ素原子を１つ又は２つ有するアルキル基であり、
Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４及びＲ^５のいずれか１つは、疎水性の蛍光基を含み、
Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４及びＲ^５のうち、隣り合う２つは、原子を共有し環を形成していてもよい。
前記疎水性の蛍光基が細胞膜透過性を有することを特徴とする請求項１に記載の細胞滞留性蛍光化合物。
前記一般式（Ｉ）において、Ａがβ－Ｄ－ガラクトキシル基であることを特徴とする請求項１又は２に記載の細胞滞留性蛍光化合物。
前記一般式（Ｉ）においてＲ^１又はＲ^５がフルオロメチル基若しくはジフルオロメチル基であることを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載の細胞滞留性蛍光化合物。
下記の式（１）から（７）のいずれかで表されることを特徴とする請求項１から４のいずれか１項に記載の細胞滞留性蛍光化合物。
標的細胞の表面に発現する抗原タンパク質に対する特異性を有する抗体に酵素を結合させた酵素標識抗体を該標的細胞に結合させる工程と、
前記酵素標識抗体が結合した前記標的細胞に、下記の一般式（Ｉ）で表される細胞滞留性蛍光化合物を接触させる工程を含む細胞の染色方法。

なお、上記一般式（Ｉ）において、
Ａは前記酵素標識抗体に結合した酵素に触媒される反応により切断される１価の親水基であり、
Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４及びＲ^５は、それぞれ独立して、下記の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）からなる群より選択される原子又は原子団であり、
(ａ）水素原子、ヒドロキシル基、ハロゲン原子、アミノ基、スルホンアミド基、アジド基、シアノ基
(ｂ）１又は複数の水素原子が他の原子又は官能基で置換されていてもよく、かつ炭素骨格中に窒素原子、酸素原子、ケイ素原子、硫黄原子、エステル基、アミド基、ウレタン基及び尿素基を含んでいてもよい直鎖アルキル基、分岐鎖アルキル基、シクロアルキル基、アリール基及びヘテロアリール基
(ｃ）エステル基、アミド基、ウレタン基及び尿素基
Ｒ^１、Ｒ^３又はＲ^５は、ベンジル位にフッ素原子を１つ又は２つ有するアルキル基であり、
Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４及びＲ^５のいずれか１つは、細胞膜透過性を有する疎水性の蛍光基を含み、
Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４及びＲ^５のうち、隣り合う２つは、原子を共有し環を形成していてもよい。
前記標的細胞に発現する抗原タンパク質が、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＨＥＲ２、ＰＤＬ－１、ＰＤＬ－２、ＷＴ－１、ＰＤ－１、ＣＣＲ４、ＣＤ３３、ＣＤ２４、ＣＤ２９、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１０５、ＣＤ１３３、ＣＤ１６６、ＣＤ２００、ＥＳＡ、ＣＸＣＲ４、Ｓｔｒｏ－１、ＥｐＣＡＭ、Ｉｎｔｅｇｒｉｎ１２ｂ１、ＢＭＩ－１のいずれかであることを特徴とする請求項６に記載の細胞の染色方法。
前記酵素標識抗体に含まれる前記酵素がβ－ガラクトシダーゼであり、前記一般式（Ｉ）において、Ａがβ－Ｄ－ガラクトキシル基であることを特徴とする請求項６又は７に記載の細胞の染色方法。
前記一般式（Ｉ）において、Ｒ^１又はＲ^５がフルオロメチル基若しくはジフルオロメチル基であることを特徴とする請求項６から８のいずれか１項に記載の細胞の染色方法。
前記細胞滞留性蛍光化合物が、下記の式（１）から（７）のいずれかで表されることを特徴とする請求項６から９のいずれか１項に記載の細胞の染色方法。
請求項６から１０のいずれか１項に記載の細胞の染色方法を用いて、標的細胞の染色を行う工程と、
蛍光法を用いて染色された前記標的細胞を検出する工程を含む細胞の高感度検出方法。
染色された前記標的細胞の検出にフローサイトメトリー又は蛍光イメージングを用いることを特徴とする請求項１１に記載の細胞の高感度検出方法。