WO2018079859A1 - 細胞の標識方法 - Google Patents

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WO2018079859A1
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fluorescent
cell
hydrophilic
enzyme
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片山　佳樹
森　健
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国立大学法人九州大学
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
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    • G—PHYSICS
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    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor

Definitions

  • the present invention relates to a method for labeling cells using a complex in which a hydrophilic group is bonded to a conjugate of a fluorescent group and a hydrophobic group.
  • Flow cytometry is an indispensable technique for identifying and separating cell types in cell biology.
  • the principle is that fluorescence detection is performed by labeling a target antigen protein on a cell with a fluorescently labeled antibody.
  • small devices have begun to be marketed by various companies for use in the medical field.
  • conventional flow cytometry has a significant problem in terms of sensitivity.
  • In the conventional method only proteins present in 10,000 copies or more can be detected (Non-patent Document 4), and with this sensitivity, only proteins with the highest 35% of expression copy numbers can be seen in the proteome (Non-patent Document 4). Reference 5).
  • There should be many diagnostically useful proteins below the detection sensitivity and there is a great need for higher sensitivity in flow cytometry.
  • Non-patent Document 4 Conventional flow cytometry has a major problem in terms of sensitivity.
  • Non-patent Document 4 only proteins present in 10,000 copies or more can be detected (Non-patent Document 4), and with this sensitivity, only proteins with the highest 35% of expression copy numbers can be seen in the proteome (Non-patent Document 4).
  • Reference 5 As a method for increasing the sensitivity, there is a CARD (catalyzed reporter deposition) method. This uses a reaction of peroxidase (HRP) fused with an antibody to covalently fix fluorescent molecules to cells (FIG. 1). As a result, results such as the presence of an unknown marker were obtained (Non-Patent Document 3).
  • HRP peroxidase
  • concentration quenching occurs because fluorescent molecules are densely bound around the antigen protein, and in principle there is an upper limit of sensitivity enhancement.
  • interference by endogenous substances occurs (the tyrosine residue contained in the endogenous protein becomes a substrate for HRP.
  • Careful optimization of the staining conditions is necessary (Non-Patent Document 4).
  • toxic hydrogen peroxide is used as a substrate, there is damage to the cells, and it is difficult to culture the cells after sorting.
  • An object of the present invention is to provide a method for labeling cells with high sensitivity.
  • a complex comprising a conjugate of a fluorescent group and a hydrophobic group and a hydrophilic group further bound thereto, and an enzyme that catalyzes the complex is a cell membrane.
  • the present inventors have succeeded in labeling cells by reacting with cells fixed on the surface, and completed the present invention.
  • the present invention is as follows.
  • R 12 represents a C 1-10 alkyl group, a C 2-10 alkenyl group, a C 2-10 alkynyl group, a C 3-15 cycloalkyl group, a C 3-15 cycloalkenyl group, a C 6-20 aryl group, or 5 to Represents a 14-membered heteroaryl group
  • R 11 and R 12 one group and ring are substituted with a fluorescent group, and the other group and ring are substituted with a hydrophilic group
  • R 13 and R 14 are each independently a hydrogen atom, a C 1-10 alkyl group, a C 2-10 alkenyl group, a C 2-10 alkynyl group, a C 3-15 cycloalkyl group, or a C 3-15 cycloalkenyl.
  • R 101 , R 102 and R 103 are each independently a hydrogen atom, C 1- Represents a 6 alkyl group or a C 2-6 alkenyl group), n and m each independently represents an integer of 0 to 20.
  • Formula II Wherein R 21 is a C 1-10 alkyl group, a C 2-10 alkenyl group, a C 2-10 alkynyl group, a C 3-15 cycloalkyl group, a C 3-15 cycloalkenyl group, a C 6-20 aryl.
  • R 22 represents a C 1-10 alkyl group, a C 2-10 alkenyl group, a C 2-10 alkynyl group, a C 3-15 cycloalkyl group, a C 3-15 cycloalkenyl group, a C 6-20 aryl group, or 5 to Represents a 14-membered heteroaryl group, Of the R 21 and R 22 , one group and ring are substituted with a fluorescent group, and the other group and ring are substituted with a hydrophilic group.
  • R 31 is a C 1-10 alkyl group, a C 2-10 alkenyl group, a C 2-10 alkynyl group, a C 3-15 cycloalkyl group, a C 3-15 cycloalkenyl group, or a C 6-20 aryl.
  • R 32 represents a fluorescent group
  • R 31 is substituted with a hydrophilic group
  • X represents a hetero atom.
  • R 41 represents 1 to 10 hydrophilic groups
  • m1 and n1 each independently represents an integer of 0 to 22
  • R 42 and R 43 each independently represents an ether, a thioether or an ester. Represents a bond through thioester, amide, amine, urethane, urea, thiourea or amino acid
  • R 44 represents a fluorescent group.
  • the hydrophilic group is any group selected from the group consisting of a phosphate group, ⁇ -galactosyl group, sulfate group, ⁇ -glucosyl group, ⁇ -xylosyl group, ⁇ -glucuronic acid group and ⁇ -glucuronic acid group.
  • the substrate complex according to any one of (1) to (5) is reacted with a cell in which an enzyme that catalyzes the substrate complex is immobilized on a cell membrane,
  • a method of labeling a cell comprising diffusing a complex from which a hydrophilic group has been removed and having acquired membrane affinity into or into the cell membrane of the cell and allowing the complex to permeate into the cell.
  • a method for detecting a cell comprising detecting a labeled cell by the method according to any one of (6) to (8).
  • a cell labeling or detection kit comprising the substrate complex according to any one of (1) to (5) and an enzyme that catalyzes the complex.
  • the present invention provides a cell labeling method and a detection method. Unlike the CARD method, the present invention does not cause concentration quenching because fluorescent molecules are not concentrated in the antigen protein and are widely distributed in the intracellular membrane. Moreover, since hydrogen peroxide is unnecessary, there is no damage to a cell.
  • the detection according to the present invention achieved a fluorescence sensitization of about 100 times.
  • a substrate complex containing a fluorescent group, a hydrophobic group and a hydrophilic group is reacted with a cell on which an enzyme that catalyzes the substrate complex is immobilized on a cell membrane, and the hydrophilic group is removed by the enzyme catalyst.
  • the present invention also relates to a method for labeling a cell, characterized in that a complex having acquired membrane affinity is diffused on or in the cell membrane of the cell and permeated into the cell.
  • the present invention also relates to a method for detecting a cell, wherein the cell labeled by the labeling method is detected.
  • a tyramide-ized small molecule (dye) is radicalized by peroxidase (FIG. 1, HRP) and attached to a nearby membrane protein.
  • FOG. 1, HRP peroxidase
  • the present invention provides a new sensitization method for overcoming the above-mentioned problems. That is, by avoiding concentration quenching, cell labeling and detection can be realized with 100 times higher sensitivity than conventional methods, and the method is damage free. This is because, for example, two enzymes (alkaline phosphatase and ⁇ -galactosidase) often used alongside HRP in biochemical analysis such as ELISA and an enzyme that does not exist on the surface of mammalian cells (sulfatase, ⁇ -glucosidase, ⁇ -xylosidase) The sensitization reaction is performed by the above.
  • the substrate complex used in the present invention comprises a fluorescent group, a hydrophobic group, and a hydrophilic group (for example, a phosphate group, ⁇ -galactosyl group, sulfate group, ⁇ -glucosyl group, ⁇ -xylosyl group, ⁇ -Glucuronic acid group or ⁇ -glucuronic acid group), or two components of a fluorescent group and a hydrophilic group.
  • Enzymes such as alkaline phosphatase and ⁇ -galactosidase are presented on the cell surface via antibodies (immobilized via antibodies against cell surface antigens). This enzyme removes the hydrophilic group in the substrate complex to make it hydrophobic and acquire membrane affinity.
  • This complex binds to and penetrates the cell membrane, so that the target cell is selectively stained.
  • concentration quenching does not occur because fluorescent molecules are not concentrated in the antigen protein and are widely distributed in the intracellular membrane. Moreover, since hydrogen peroxide is unnecessary, there is no damage to a cell.
  • the substrate complex is one in which a hydrophilic group is bound to a fluorescent group or a conjugate of a fluorescent group and a hydrophobic group (fluorescent group-hydrophobic group). .
  • a hydrophilic group is bound to a fluorescent group or a conjugate of a fluorescent group and a hydrophobic group (fluorescent group-hydrophobic group).
  • the number of hydrophilic groups is 1 or more. Therefore, such a substrate complex can be represented by the following formula (1) or (2).
  • Formula (1) represents a complex in which a hydrophilic group is bonded to a conjugate of a fluorescent group and a hydrophobic group (j1 is 1 or more), and a complex in which a hydrophilic group is bonded to a fluorescent group (j1 is 0).
  • Formula (2) represents a complex in which a hydrophilic group is bonded to a conjugate of a fluorescent group and a hydrophobic group (j2 is 1 or more), and a complex in which a hydrophilic group is bonded to a fluorescent group (j2 is 0). Yes.
  • examples of the substrate complex include the following formula I: Wherein R 11 is a C 1-10 alkyl group, a C 2-10 alkenyl group, a C 2-10 alkynyl group, a C 3-15 cycloalkyl group, a C 3-15 cycloalkenyl group, a C 6-20 aryl.
  • R 12 represents a C 1-10 alkyl group, a C 2-10 alkenyl group, a C 2-10 alkynyl group, a C 3-15 cycloalkyl group, a C 3-15 cycloalkenyl group, a C 6-20 aryl group, or 5 to Represents a 14-membered heteroaryl group, the group and the ring are substituted with a fluorescent group;
  • R 13 and R 14 are each independently a hydrogen atom, a C 1-10 alkyl group, a C 2-10 alkenyl group, a C 2-10 alkynyl group, a C 3-15 cycloalkyl group, or a C 3-15 cycloalkenyl group.
  • R 101 , R 102 and R 103 are each independently a hydrogen atom, C 1-6 An alkyl group or a C 2-6 alkenyl group).
  • n and m each independently represents an integer of 0 to 20.
  • the hydrophobic group is a portion excluding the hydrophilic group and the fluorescent group.
  • the substrate complex is represented by the following formula II: Wherein R 21 is a C 1-10 alkyl group, a C 2-10 alkenyl group, a C 2-10 alkynyl group, a C 3-15 cycloalkyl group, a C 3-15 cycloalkenyl group, a C 6-20 aryl.
  • R 22 represents a C 1-10 alkyl group, a C 2-10 alkenyl group, a C 2-10 alkynyl group, a C 3-15 cycloalkyl group, a C 3-15 cycloalkenyl group, a C 6-20 aryl group, or 5 to Represents a 14-membered heteroaryl group, Of the R 21 and R 22 , one group and ring are substituted with a fluorescent group, and the other group and ring are substituted with a hydrophilic group.
  • R 31 is a C 1-10 alkyl group, a C 2-10 alkenyl group, a C 2-10 alkynyl group, a C 3-15 cycloalkyl group, a C 3-15 cycloalkenyl group, or a C 6-20 aryl.
  • R 32 represents a fluorescent group
  • R 31 is substituted with a hydrophilic group
  • X represents a hetero atom.
  • R 41 represents 1 to 10 hydrophilic groups
  • m1 and n1 each independently represents an integer of 0 to 22
  • R 42 and R 43 each independently represents an ether, a thioether or an ester. Represents a bond through thioester, amide, amine, urethane, urea, thiourea or amino acid, and R 44 represents a fluorescent group.
  • C 1-10 alkyl group” and “C 1-6 alkyl group” are linear or branched hydrocarbons having 1 to 10 and 1 to 6 carbon atoms, respectively. Means group.
  • alkyl group include a methyl group, an ethyl group, a 1-propyl group, a 2-propyl group, a 2-methyl-1-propyl group (i-butyl group), and a 2-methyl-2-propyl group ( t-butyl group), 1-butyl group, 2-butyl group, 1-pentyl group, hexyl group, 1-methylbutyl group, 2-methylbutyl group, 3-methylbutyl group, etc., preferably methyl group, ethyl Group, 1-propyl group, 2-propyl group and the like.
  • alkyl groups having other carbon numbers can be understood by those skilled in the art in the same manner as described above. Moreover, it can understand similarly about the following other substituent.
  • C 2-10 alkenyl group and “C 2-6 alkenyl group” mean a linear or branched hydrocarbon group having 2 to 10 and 2 to 6 carbon atoms, respectively. Has one double bond.
  • alkenyl groups include ethenyl group (vinyl group), 1-propenyl group, 2-propenyl group (allyl group), 1-butenyl group, 2-butenyl group, 3-butenyl group, pentenyl group and the like. It is done.
  • the “C 2-10 alkynyl group” means a linear or branched hydrocarbon group having 2 to 10 carbon atoms and has one triple bond.
  • alkynyl group examples include ethynyl group, 1-propynyl group, 2-propynyl group, 1-butynyl group, 2-butynyl group, 3-butynyl group, pentynyl group and the like.
  • the “C 3-15 cycloalkyl group” means a cyclic alkyl group having 3 to 15 carbon atoms, and examples thereof include a cyclopentyl group, a cyclohexyl group, a cyclopropyl group, and a cyclobutyl group.
  • the “C 3-15 cycloalkenyl group” means a cyclic alkenyl group having 3 to 15 carbon atoms and has one double bond. Examples include cyclopropenyl, cyclobutenyl, cyclopentenyl, cyclohexynyl and the like.
  • the “C 6-20 aryl group” means an aromatic hydrocarbon group having 6 to 20 carbon atoms, and examples thereof include a phenyl group, a 1-naphthyl group, a 2-naphthyl group, an indenyl group, and the like. Is a phenyl group.
  • a “5- to 14-membered heteroaryl group” has 5 to 14 atoms constituting a ring, and contains 1 to 5 hetero atoms (nitrogen atom, oxygen atom or sulfur atom) in the atoms. An aromatic group is meant.
  • heteroaryl groups examples include furyl, thienyl, pyrrolyl, imidazolyl, triazolyl, tetrazolyl, thiazolyl, pyrazolyl, oxazolyl, isoxazolyl, isothiazolyl, furazanyl, thiadiazolyl, oxadiazolyl Group, pyridyl group, pyrazinyl group, pyridazinyl group, pyrimidinyl group and the like.
  • “Hetero atom” means an atom other than a hydrogen atom and a carbon atom. In the present invention, examples include a nitrogen atom, an oxygen atom, and a sulfur atom.
  • examples of the fluorescent group include any group selected from the group consisting of a fluorescein fluorescent group, a rhodamine fluorescent group, a coumarin fluorescent group, a pyrene fluorescent group, and a cyanine fluorescent group.
  • Illustrative fluorescent groups are as follows. Fluorescein series: fluorescein, Tokyo green, calcein green Rhodamine series fluorescent groups: rhodamine 123, tetramethylrhodamine, rhodamine B, Texas red, Alexa 488 Coumarin-based fluorescent groups: Pacific blue, calcein blue Pyrene-based fluorescent groups: Pyrene Cyanine-based fluorescent groups: Cy3, Cy5, Cy5.5, Cy7, Indocyanine green Hemicyanine-based fluorescent groups: Qy: 0.57
  • BODIPY fluorescent group BODIPY FL, BODIPY R6G, BODIPY TMR, BODIPY 581/591, BODIPY TR, BODIPY 630/650, BODIPY 650/665
  • fluorescent groups nitrobenzooxadiazole, anilinonaphthalene sulfonic acid, pacific orange, bromobimene, acridine orange
  • the hydrophilic group used in the present invention is a group consisting of a phosphate group, ⁇ -galactosyl group, sulfate group, ⁇ -glucosyl group, ⁇ -xylosyl group, ⁇ -glucuronic acid group and ⁇ -glucuronic acid group. Any group selected from is mentioned.
  • These hydrophilic groups can be single, dimer, trimer, or more in consideration of the balance with the hydrophobic group. In order to balance hydrophilicity / hydrophobicity, it is not particularly limited to bind to the cell membrane when the hydrophilic group is present, and to bind to the cell membrane when the hydrophilic group is removed. In the present invention, the number of hydrophilic groups is 1 or more, for example, 1 to 10 (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10). It is.
  • the compound represented by Formula II is a conjugate of a fluorescent group and a hydrophilic group, and does not include a hydrophobic group. As long as the balance between hydrophilicity and hydrophobicity is maintained, it is not necessary to introduce a hydrophobic group.
  • the structure of a substrate compound that does not contain a hydrophobic group is as follows. This compound is obtained by modifying a hydrophilic group to a fluorescent group having high hydrophobicity.
  • R 21 represents a C 1-10 alkyl group, a C 2-10 alkenyl group, a C 2-10 alkynyl group, a C 3-15 cycloalkyl group, a C 3-15 cycloalkenyl group, a C 6-20.
  • R 22 represents a C 1-10 alkyl group, a C 2-10 alkenyl group, a C 2-10 alkynyl group, a C 3-15 cycloalkyl group, a C 3-15 cycloalkenyl group, a C 6-20 aryl group, or Represents a 5- to 14-membered heteroaryl group.
  • R 21 and R 22 one group and ring are substituted with a fluorescent group, and the other group and ring are substituted with a hydrophilic group.
  • a substrate compound shown by Formula III the thing of the following structures is mentioned, for example.
  • the hydrophilic-hydrophobic balance can be controlled.
  • fluorescence and benzyl groups serve as hydrophobic groups.
  • Examples of the compound represented by the formula IV include those represented by the following formula.
  • This compound can also control the hydrophilic-hydrophobic balance by using ⁇ -galactosyl as a dimer.
  • fluorescence and phenoxy groups serve as hydrophobic groups.
  • the complex of the present invention can be synthesized by a usual solid phase synthesis method, liquid phase synthesis method or the like.
  • the cell labeling method and detection method using the complex of the present invention can be carried out by the following procedure.
  • the enzyme is bound to an antibody against a cell surface protein or antigen via avidin or the like.
  • This enzyme-antibody complex is bound to a membrane protein or antigen on the cell surface.
  • the antibody and the enzyme can be bound.
  • the substrate complex of the present invention is reacted with the enzyme-antibody complex.
  • the hydrophilic part is cleaved by the enzyme, the hydrophobic group of the complex appears and acquires membrane affinity.
  • the complex that has acquired membrane affinity can freely diffuse on the membrane and can pass through the membrane. Since the fluorescent group is bound to the complex, the cell surface or the inside of the cell is labeled. Cells labeled in this way can be detected by a suitable technique.
  • the detection method is not particularly limited, and includes detection by visual observation, detection by fluorescence microscope, detection by flow cytometry, detection by imaging cytometer, etc., but detection by flow cytometry and imaging cytometer Is preferred.
  • Kit provides a kit for labeling or detecting a cell comprising the substrate complex and an enzyme that catalyzes the complex.
  • the kit of the present invention can contain an appropriate reagent in addition to the above complex and enzyme.
  • the auxiliary reagent include a reaction buffer and a blocking buffer in the case of labeling cells for flow cytometry. Can be included.
  • the said cell and reagent are illustrations and are not limited to these cells and reagents.
  • the substrate was washed twice with a medium containing 10% FBS to remove unreacted substrate molecules.
  • the cells were resuspended in an appropriate amount of medium, and fluorescence intensity was determined by fluorescence microscopy and imaging cytometry. Optimization was performed for substrate 1 and substrate 2.
  • the results of cell staining using a dephosphorylated substrate are shown in FIG. From the fluorescence microscope image, it can be seen that the substrate 1 stains cells better. From the graph showing the fluorescence intensity for each reaction time, it can be seen that the substrate 1 stains cells well, and the substrate 2 hardly stains cells even after 60 minutes. From this result, it can be said that this substrate molecule stains cells better as the carbon chain length is longer. On the other hand, if the carbon chain is too long, non-specific binding is considered, so the carbon chain did not extend any further and substrate 1 was selected as the membrane anchor substrate.
  • Rhodamine was modified to an anti-human EGFR antibody (cetuximab preparation (Arbitux)).
  • MWCO 200 ⁇ g of cetuximab formulation was added on a 3 kDa ultrafiltration membrane. It was washed twice with DPBS and dissolved in 100 ⁇ L of 10 mM PB (pH 8.5). A 1 mg / mL NHS-rhodamine (Thermo) in DMSO solution was prepared, and added to the ultrafiltration membrane under the conditions that the fluorescent groups were 3 and 7 equivalents with respect to cetuximab. Ultrafiltration was repeated at 20 ° C. and 8000 G for 10 minutes. The absorption of the filtrate was measured, and the purification was completed when no absorption from rhodamine was measured. Biotin was modified to anti-human EGFR antibody and CIAP.
  • the present invention provides a cell labeling method.
  • Cell labeling by flow cytometry can be performed with high sensitivity by the method of the present invention, and the method and complex of the present invention are useful as a cell labeling method and a cell labeling reagent, respectively.

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Abstract

蛍光基、又は蛍光基と疎水基との結合体に親水基が結合した基質複合体と、当該基質複合体を触媒する酵素が細胞膜上に固定された細胞とを反応させ、前記酵素の触媒により親水基が除去されて膜親和性を獲得した複合体を、前記細胞の細胞膜上又は細胞膜内に拡散させるとともに細胞内に透過させることを特徴とする細胞の標識方法。

Description

細胞の標識方法
　本発明は、蛍光基と疎水基との結合体に親水基が結合した複合体を用いて細胞を標識する方法に関する。
　フローサイトメトリーは、細胞生物学において、細胞の種類の同定と分離を行うために不可欠の技術である。その原理は、蛍光標識した抗体により、細胞上の注目する抗原タンパク質を標識して、蛍光検出を行うものである。最近、医療の現場で使用するために、各社より小型の装置が発売されはじめた。しかしながら、従来のフローサイトメトリーには感度の面で大きな問題がある。従来法では、１万コピー以上存在するタンパク質のみが検出可能であり（非特許文献４）、この感度では、プロテオームのうち、発現コピー数が上位３５％までのタンパク質しか見ることができない（非特許文献５）。検出感度以下のタンパク質にも診断上、有用なものが多数存在するはずであり、フローサイトメトリーの高感度化に対するニーズは高い。
　従来のフローサイトメトリーには感度の面で大きな問題がある。従来法では、１万コピー以上存在するタンパク質のみが検出可能であり（非特許文献４）、この感度では、プロテオームのうち、発現コピー数が上位３５％までのタンパク質しか見ることができない（非特許文献５）。
　高感度化させる方法として、ＣＡＲＤ（ｃａｔａｌｙｚｅｄ　ｒｅｐｏｒｔｅｒ　ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ）法が存在する。これは抗体と融合させたペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の反応を利用して、蛍光分子を細胞に共有結合固定するものである（図１）。これにより、未知のマーカーの存在が示されるなどの成果を上げた（非特許文献３）。しかしながら、ＣＡＲＤ法はいくつかの問題がある。まず、蛍光分子が抗原タンパク質の周辺に密集して結合するため濃度消光が起こり、原理的に高感度化の上限が存在する。また、内在性の物質による妨害が起こるため（内在性のタンパク質が含有するチロシン残基がＨＲＰの基質となる。あるいは、内在性のペルオキダーゼと基質が反応することによる蛍光分子の非特異的な吸着が起こりやすい。）、染色条件の丁寧な最適化が必要である（非特許文献４）。さらに毒性のある過酸化水素を基質とするため、細胞へのダメージがあり、ソーティングの後、細胞の培養が困難である。
Ｄａｖｉｄ　Ｋａｐｌａｎ　ａｎｄ　Ｄａｗｎ　Ｓｍｉｔｈ，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ　４０，８１−８５（２０００）． Ｄａｖｉｄ　Ｋａｐｌａｎ，Ｈｏｗａｒｄ　Ｍｅｙｅｒｓｏｎ，ａｎｄ　Ｋｒｉｓｔｉｎｅ　Ｌｅｗａｎｄｏｗｓｋａ，Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．，１１６，４２９−４３６（２００１）． Ｄａｖｉｄ　Ｋａｐｌａｎ，Ｄａｗｎ　Ｓｍｉｔｈ，Ｈｏｗａｒｄ　Ｍｅｙｅｒｓｏｎ，Ｎｉｃｏｌｅ　Ｐｅｃｏｒａ，ａｎｄ　Ｋｒｉｓｔｉｎｅ　Ｌｅｗａｎｄｏｗｓｋａ，ＰＮＡＳ，９８，１３８５０−１３８５３（２００１）． Ｍａｔｔｈｅｗ　Ｒ．Ｃｌｕｔｔｅｒ，Ｇａｒｒｅｔｔ　Ｃ．Ｈｅｆｆｎｅｒ，Ｐｅｔｅｒ　Ｏ．Ｋｒｕｔｚｉｋ，Ｋａｃｅｙ　Ｌ．Ｓａｃｈｅｎ，Ｇａｒｒｙ　Ｐ．Ｎｏｌａｎ，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ　Ａ，７７Ａ，１０２０−１０３１（２０１０）． Ｂｅｃｋ　Ｍ，Ｓｃｈｍｉｄｔ　Ａ，Ｍａｌｍｓｔｒｏｅｍ　Ｊ，Ｃｌａａｓｓｅｎ　Ｍ，Ｏｒｉ　Ａ，Ｓｚｙｍｂｏｒｓｋａ　Ａ，Ｈｅｒｚｏｇ　Ｆ，Ｒｉｎｎｅｒ　Ｏ，Ｅｌｌｅｎｂｅｒｇ　Ｊ，Ａｅｂｅｒｓｏｌｄ　Ｒ．，Ｍｏｌ．Ｓｙｓｔｅｍ．Ｂｉｏ．２０１１，７，５４９
　本発明は、高感度に細胞を標識する方法を提供することを目的とする。
　本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、蛍光基と疎水基との結合体にさらに親水基を結合させた含む複合体と、当該複合体を触媒する酵素が細胞膜表面に固定された細胞とを反応させることにより細胞を標識し得ることに成功し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）蛍光基、又は蛍光基と疎水基との結合体に親水基が結合した基質複合体。
（２）次式Ｉ：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
 （式中、Ｒ１１は、Ｃ１−１０アルキル基、Ｃ２−１０アルケニル基、Ｃ２−１０アルキニル基、Ｃ３−１５シクロアルキル基、Ｃ３−１５シクロアルケニル基、Ｃ６−２０アリール基又は５~１４員ヘテロアリール基を表し、
　Ｒ１２は、Ｃ１−１０アルキル基、Ｃ２−１０アルケニル基、Ｃ２−１０アルキニル基、Ｃ３−１５シクロアルキル基、Ｃ３−１５シクロアルケニル基、Ｃ６−２０アリール基又は５~１４員ヘテロアリール基を表し、
　前記Ｒ１１及びＲ１２のうち、一方の基及び環は蛍光基で置換され、他方の基及び環は親水基で置換されており、
　Ｒ１３及びＲ１４は、それぞれ独立して、水素原子、Ｃ１−１０アルキル基、Ｃ２−１０アルケニル基、Ｃ２−１０アルキニル基、Ｃ３−１５シクロアルキル基、Ｃ３−１５シクロアルケニル基、Ｃ６−２０アリール基、５~１４員ヘテロアリール基、アミノ基、又はＯＲ１０１、ＣＯＲ１０２若しくはＣＯＯＲ１０３（Ｒ１０１、Ｒ１０２及びＲ１０３は、それぞれ独立して水素原子、Ｃ１−６アルキル基又はＣ２−６アルケニル基を表す。）で示される基を表し、
ｎ及びｍは、それぞれ独立して０~２０の整数を表す。）、
　次式ＩＩ：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
 （式中、Ｒ２１は、Ｃ１−１０アルキル基、Ｃ２−１０アルケニル基、Ｃ２−１０アルキニル基、Ｃ３−１５シクロアルキル基、Ｃ３−１５シクロアルケニル基、Ｃ６−２０アリール基又は５~１４員ヘテロアリール基を表し、
　Ｒ２２は、Ｃ１−１０アルキル基、Ｃ２−１０アルケニル基、Ｃ２−１０アルキニル基、Ｃ３−１５シクロアルキル基、Ｃ３−１５シクロアルケニル基、Ｃ６−２０アリール基又は５~１４員ヘテロアリール基を表し、
　前記Ｒ２１及びＲ２２のうち、一方の基及び環は蛍光基で置換され、他方の基及び環は親水基で置換されている。）、
　次式ＩＩＩ：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
 （式中、Ｒ３１は、Ｃ１−１０アルキル基、Ｃ２−１０アルケニル基、Ｃ２−１０アルキニル基、Ｃ３−１５シクロアルキル基、Ｃ３−１５シクロアルケニル基、Ｃ６−２０アリール基、５~１４員ヘテロアリール基又はベンジル基を表し、
　Ｒ３２は蛍光基を表し、
　前記Ｒ３１は親水基で置換されており、
　Ｘはヘテロ原子を表す。）、又は
　次式ＩＶ：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
 （式中、Ｒ４１は１~１０個の親水基を表し、ｍ１及びｎ１は、それぞれ独立して０~２２の整数を表し、Ｒ４２及びＲ４３は、それぞれ独立してエーテル、チオエーテル、エステル、チオエステル、アミド、アミン、ウレタン、尿素、チオ尿素又はアミノ酸を介する結合を表し、Ｒ４４は蛍光基を表す。）
で示される、（１）に記載の基質複合体。
（３）蛍光基がフルオレセイン系蛍光基、ローダミン系蛍光基、クマリン系蛍光基、ピレン系蛍光基、シアニン系蛍光基、ヘミシアニン系蛍光基及びＢＯＤＩＰＹ系蛍光基からなる群から選ばれるいずれかの基である、（１）又は（２）に記載の基質複合体。
（４）親水基がリン酸基、β−ガラクトシル基、硫酸基、β−グルコシル基、β−キシロシル基、α−グルクロン酸基及びβ−グルクロン酸基からなる群から選ばれるいずれかの基である、（１）~（３）のいずれか１項に記載の基質複合体。
（５）フローサイトメトリーに使用される、（１）~（４）のいずれか１項に記載の基質複合体。
（６）前記（１）~（５）のいずれか１項に記載の基質複合体と、当該基質複合体を触媒する酵素が細胞膜上に固定された細胞とを反応させ、前記酵素の触媒により親水基が除去されて膜親和性を獲得した複合体を、前記細胞の細胞膜上又は細胞膜内に拡散させるとともに細胞内に透過させることを特徴とする細胞の標識方法。
（７）前記酵素が、細胞表面抗原に対する抗体を介して固定されたものである、（６）に記載の方法。
（８）酵素がアルカリホスファターゼである（６）又は（７）に記載の方法。
（９）前記（６）~（８）のいずれか１項に記載の方法により標識された細胞を検出することを特徴とする、細胞の検出方法。
（１０）前記（１）~（５）のいずれか１項に記載の基質複合体と、当該複合体を触媒する酵素とを含む、細胞の標識又は検出用キット。
（１１）細胞表面抗原に対する抗体であって前記酵素を結合する抗体をさらに含む、（１０）に記載のキット。
（１２）酵素がアルカリホスファターゼである（１０）又は（１１）に記載のキット。
　本発明により、細胞の標識方法及び検出方法が提供される。本発明は、ＣＡＲＤ法と異なり、抗原タンパク質に蛍光分子が密集せず、細胞内膜に広く分布するため、濃度消光が起こらない。また、過酸化水素が不要であるため、細胞へのダメージがない。アルカリフォスファターゼによる増感を用いた細胞表面のＥＧＦＲの検出に成功した。蛍光標識した抗ＥＧＦＲ抗体を用いる従来法に対して、本発明による検出ではおよそ１００倍の蛍光増感が達成できた。
ＣＡＲＤ（ｃａｔａｌｙｚｅｄ　ｒｅｐｏｒｔｅｒ　ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ）法による細胞の蛍光標識の原理を示す図である。 本発明による細胞の蛍光標識の原理を示す図である。 膜アンカー基質の炭素鎖の長さによる標識感度を検討した結果を示す図である。 膜アンカー基質の細胞内局在を示す図である。 精製酵素ＣＩＡＰによる膜アンカー基質の脱リン酸化を示す図である。 膜アンカー基質を用いてＥＧＦＲを検出した結果を示す図である。
　本発明は、蛍光基、疎水基及び親水基を含む基質複合体と、当該基質複合体を触媒する酵素が細胞膜上に固定された細胞とを反応させ、前記酵素の触媒により親水基が除去されて膜親和性を獲得した複合体を、前記細胞の細胞膜上又は細胞膜内に拡散させるとともに細胞内に透過させることを特徴とする細胞の標識方法に関する。また、本発明は、前記標識方法により標識された細胞を検出することを特徴とする細胞の検出方法に関する。
　まず、従来の方法である前記ＣＡＲＤ法の原理を図１に示す。
　従来のＣＡＲＤ法では、チラミド化した低分子（色素）をペルオキシダーゼ（図１、ＨＲＰ）によってラジカル化させ、これを近傍の膜タンパク質に付着させる。しかし、この方法では、局所濃度上昇による濃度消光、膜タンパク質への色素の過剰な吸着による変性などが起こる。
１．概要
　本発明では、上記の課題を克服するための新しい増感法を提供するものである。すなわち、濃度消光を回避することにより、従来の１００倍の高感度で細胞標識及び検出を実現でき、かつダメージフリーの方法である。これは、例えば、ＥＬＩＳＡなどの生化学分析でＨＲＰに並びよく用いられる二つの酵素（アルカリフォスファターゼ、およびβ−ガラクトシダーゼ）および哺乳類細胞表面には存在しない酵素（スルファターゼ、β−グルコシダーゼ、β−キシロシダーゼ）等によって、増感反応を行うものである。
　図２に示す通り、本発明において使用される基質複合体は、蛍光基、疎水基、親水基（例えばリン酸基、β−ガラクトシル基、硫酸基、β−グルコシル基、β−キシローシル基、α−グルクロン酸基又はβ−グルクロン酸基）の三成分、又は蛍光基と親水基との二成分から構成される。
　アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼなどの酵素は、抗体を介して細胞表面に提示されている（細胞表面抗原に対する抗体を介して固定されている）。この酵素によって基質複合体中の親水基が除去されて疎水化し、膜親和性を獲得する。この複合体が細胞膜に結合・膜透過することにより、標的細胞が選択的に染色される。本発明の基質複合体を用いると、抗原タンパク質に蛍光分子が密集せず、細胞内膜に広く分布するため、濃度消光が起こらない。また、過酸化水素が不要であるため、細胞へのダメージがない。
２．基質複合体
　本発明においては、上記基質複合体は、蛍光基に親水基が結合したもの、又は蛍光基と疎水基との結合体（蛍光基−疎水基）に親水基が結合したものである。ここで、疎水基は無くてもよく、１つ以上の疎水基が複数連結したものであってもよい。また、親水基の数は１以上である。
　したがって、そのような基質複合体は下記式（１）又は（２）により表すことができる。
　「蛍光基−（疎水基）ｊ１−（親水基）ｋ１」　（１）
　「（親水基）ｋ２−蛍光基−（疎水基）ｊ２」　（２）
　式（１）において、ｊ１は０又は１以上の整数を表し、ｋ１は１以上の整数を表す。
　式（２）において、ｊ２は０又は１以上の整数を表し、ｋ２は１以上の整数を表す。
　ｋ１及びｊ１、並びにｋ２及びｊ２は、例えばともに１である。
　式（１）は、蛍光基と疎水基との結合体に親水基が結合した複合体（ｊ１が１以上）、及び蛍光基に親水基が結合した複合体（ｊ１が０）を表しており、式（２）は、蛍光基と疎水基との結合体に親水基が結合した複合体（ｊ２が１以上）、及び蛍光基に親水基が結合した複合体（ｊ２が０）を表している。
　本発明において、基質複合体としては、例えば次式Ｉ：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
 （式中、Ｒ１１は、Ｃ１−１０アルキル基、Ｃ２−１０アルケニル基、Ｃ２−１０アルキニル基、Ｃ３−１５シクロアルキル基、Ｃ３−１５シクロアルケニル基、Ｃ６−２０アリール基又は５~１４員ヘテロアリール基を表し、前記基及び環は、親水基で置換されており、
　Ｒ１２は、Ｃ１−１０アルキル基、Ｃ２−１０アルケニル基、Ｃ２−１０アルキニル基、Ｃ３−１５シクロアルキル基、Ｃ３−１５シクロアルケニル基、Ｃ６−２０アリール基又は５~１４員ヘテロアリール基を表し、前記基及び環は、蛍光基で置換されており、
　Ｒ１３及びＲ１４は、それぞれ独立して、水素原子、Ｃ１−１０アルキル基、Ｃ２−１０アルケニル基、Ｃ２−１０アルキニル基Ｃ３−１５シクロアルキル基、Ｃ３−１５シクロアルケニル基、Ｃ６−２０アリール基、５~１４員ヘテロアリール基、アミノ基、又はＯＲ１０１、ＣＯＲ１０２若しくはＣＯＯＲ１０３（Ｒ１０１、Ｒ１０２及びＲ１０３は、それぞれ独立して水素原子、Ｃ１−６アルキル基又はＣ２−６アルケニル基を表す。）で示される基を表し、
ｎ及びｍは、それぞれ独立して０~２０の整数を表す。）
で示されるものを挙げることができる。
　式Ｉにおいて、疎水基は、親水基及び蛍光基を除いた部分である。
　また、本発明において、基質複合体としては、次式ＩＩ：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
 （式中、Ｒ２１は、Ｃ１−１０アルキル基、Ｃ２−１０アルケニル基、Ｃ２−１０アルキニル基、Ｃ３−１５シクロアルキル基、Ｃ３−１５シクロアルケニル基、Ｃ６−２０アリール基又は５~１４員ヘテロアリール基を表し、
　Ｒ２２は、Ｃ１−１０アルキル基、Ｃ２−１０アルケニル基、Ｃ２−１０アルキニル基、Ｃ３−１５シクロアルキル基、Ｃ３−１５シクロアルケニル基、Ｃ６−２０アリール基又は５~１４員ヘテロアリール基を表し、
　前記Ｒ２１及びＲ２２のうち、一方の基及び環は蛍光基で置換され、他方の基及び環は親水基で置換されている。）で示されるもの、次式ＩＩＩ：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
 （式中、Ｒ３１は、Ｃ１−１０アルキル基、Ｃ２−１０アルケニル基、Ｃ２−１０アルキニル基、Ｃ３−１５シクロアルキル基、Ｃ３−１５シクロアルケニル基、Ｃ６−２０アリール基、５~１４員ヘテロアリール基又はベンジル基を表し、
　Ｒ３２は蛍光基を表し、
　前記Ｒ３１は親水基で置換されており、
　Ｘはヘテロ原子を表す。）で示されるもの、又は次式ＩＶ：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
 （式中、Ｒ４１は１~１０個の親水基を表し、ｍ１及びｎ１は、それぞれ独立して０~２２の整数を表し、Ｒ４２及びＲ４３は、それぞれ独立してエーテル、チオエーテル、エステル、チオエステル、アミド、アミン、ウレタン、尿素、チオ尿素又はアミノ酸を介する結合を表し、Ｒ４４は蛍光基を表す。）
で示されるものを挙げることができる。
　本明細書において、「Ｃ１−１０アルキル基」、「Ｃ１−６アルキル基」とは、炭素数がそれぞれ１~１０個、１~６個の直鎖状又は分枝鎖状の炭化水素基を意味する。このようなアルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、１−プロピル基、２−プロピル基、２−メチル−１−プロピル基（ｉ−ブチル基）、２−メチル−２−プロピル基（ｔ−ブチル基）、１−ブチル基、２−ブチル基、１−ペンチル基、ヘキシル基、１−メチルブチル基、２−メチルブチル基、３−メチルブチル基などが挙げられ、好ましくは、メチル基、エチル基、１−プロピル基、２−プロピル基などである。他の炭素数を有するアルキル基の例も、当業者であれば上記と同様に理解することができる。また、下記の他の置換基についても同様に理解することができる。
　「Ｃ２−１０アルケニル基」、「Ｃ２−６アルケニル基」とは、炭素数がそれぞれ２~１０個、２~６個の直鎖状又は分枝鎖状の炭化水素基を意味し、二重結合を１個有する。このようなアルケニル基としては、例えばエテニル基（ビニル基）、１−プロペニル基、２−プロペニル基（アリル基）、１−ブテニル基、２−ブテニル基、３−ブテニル基、ペンテニル基などが挙げられる。
　「Ｃ２−１０アルキニル基」とは、炭素数が２~１０個の直鎖状又は分枝鎖状の炭化水素基を意味し、三重結合を１個有する。このようなアルキニル基としては、例えばエチニル基、１−プロピニル基、２−プロピニル基、１−ブチニル基、２−ブチニル基、３−ブチニル基、ペンチニル基などが挙げられる。
　「Ｃ３−１５シクロアルキル基」とは、炭素数が３~１５個の環状のアルキル基を意味し、例えばシクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロプロピル基、シクロブチル基等が挙げられる。
　「Ｃ３−１５シクロアルケニル基」とは、炭素数が３~１５個の環状のアルケニル基を意味し、二重結合を１個有する。例えばシクロプロペニル、シクロブテニル、シクロペンテニル、シクロヘキシニル等が挙げられる。
　「Ｃ６−２０アリール基」とは、炭素数が６~２０個の芳香族炭化水素基を意味し、例えばフェニル基、１−ナフチル基、２−ナフチル基、インデニル基などが挙げられ、好ましくはフェニル基である。
　「５~１４員ヘテロアリール基」とは、環を構成する原子数が５~１４個であり、その原子中に１~５個のヘテロ原子（窒素原子、酸素原子又は硫黄原子）を含有する芳香族基を意味する。このようなヘテロアリール基としては、例えばフリル基、チエニル基、ピロリル基、イミダゾリル基、トリアゾリル基、テトラゾリル基、チアゾリル基、ピラゾリル基、オキサゾリル基、イソオキサゾリル基、イソチアゾリル基、フラザニル基、チアジアゾリル基、オキサジアゾリル基、ピリジル基、ピラジニル基、ピリダジニル基、ピリミジニル基などが挙げられる。
　「ヘテロ原子」とは、水素原子及び炭素原子以外の原子を意味するが、本発明においては例えば窒素原子、酸素原子、硫黄原子などが挙げられる。
　本発明において、蛍光基としては、フルオレセイン系蛍光基、ローダミン系蛍光基、クマリン系蛍光基、ピレン系蛍光基及びシアニン系蛍光基からなる群から選ばれるいずれかの基が挙げられる。
　蛍光基を例示すると以下の通りである。
　フルオレセイン系：フルオレセイン、トーキョーグリーン、カルセイングリーン
　ローダミン系蛍光基：ローダミン１２３、テトラメチルローダミン、ローダミンＢ、　テキサスレッド、Ａｌｅｘａ４８８
　クマリン系蛍光基：パシフィックブルー、カルセインブルー
　ピレン系蛍光基：ピレン
　シアニン系蛍光基：Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、インドシアニングリーン
　ヘミシアニン系蛍光基：Ｑｙ：０．５７
ＢＯＤＩＰＹ系蛍光基：ＢＯＤＩＰＹ　ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ　Ｒ６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹ　ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ　５８１／５９１、ＢＯＤＩＰＹ　ＴＲ、ＢＯＤＩＰＹ　６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ　６５０／６６５
その他の蛍光基：ニトロベンゾオキサジアゾール、アニリノナフタレンスルホン酸、パシフィックオレンジ、ブロモビメン、アクリジンオレンジ
　また、本発明において使用される親水基としては、リン酸基、β−ガラクトシル基、硫酸基、β−グルコシル基、およびβ−キシロシル基、α−グルクロン酸基及びβ−グルクロン酸基からなる群から選ばれるいずれかの基が挙げられる。これらの親水基は、疎水基とのバランスを考慮して、単独、二量体、三量体、又はそれ以上とすることもできる。親疎水のバランスをとるためには、親水基があるときには細胞膜に結合せず、親水基を脱離させたときには細胞膜に結合するようにすればよく、特に限定されるものではない。本発明において、親水基の数は１以上であり、例えば１~１０個（１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個又は１０個）である。
　本発明において、式ＩＩで示される化合物は蛍光基と親水基との結合体であり、疎水基は含まれない。親疎水のバランスが保たれる限り、疎水基を導入する必要はない。
　疎水基を含まない基質化合物の構造は以下の通りである。この化合物は、疎水性の高い蛍光基に親水基を修飾したものである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
　上記式ＩＩにおいて、Ｒ２１は、Ｃ１−１０アルキル基、Ｃ２−１０アルケニル基、Ｃ２−１０アルキニル基、Ｃ３−１５シクロアルキル基、Ｃ３−１５シクロアルケニル基、Ｃ６−２０アリール基又は５~１４員ヘテロアリール基を表す。また、Ｒ２２は、Ｃ１−１０アルキル基、Ｃ２−１０アルケニル基、Ｃ２−１０アルキニル基、Ｃ３−１５シクロアルキル基、Ｃ３−１５シクロアルケニル基、Ｃ６−２０アリール基又は５~１４員ヘテロアリール基を表す。
　前記Ｒ２１及びＲ２２のうち、一方の基及び環は蛍光基で置換され、他方の基及び環は親水基で置換されている。
　また、式ＩＩＩで示される基質化合物としては、例えば以下の構造のものが挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
　β−ガラクトシルを二量体とすることで、親水−疎水のバランスを制御することができる。この化合物の場合は、蛍光とベンジル基が疎水基として働く。
　式ＩＶで示される化合物としては、例えば下記式で示されるものが挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
 　この化合物も、β−ガラクトシルを二量体とすることで、親水−疎水のバランスを制御することができる。この化合物の場合は、蛍光とフェノキシ基が疎水基として働く。
　本発明の複合体は、通常の固相合成法、液相合成法等により合成することができる。
３．細胞の標識方法及び検出方法
　本発明の複合体を用いた細胞標識方法及び検出方法は、以下の手順で実施することができる。
　細胞表面タンパク質又は抗原に対する抗体に、アビジン等を介して前記酵素を結合させる。この酵素−抗体複合体を細胞表面上の膜タンパク質又は抗原に結合させる。但し、最初に抗体を細胞と結合させた後に、抗体と酵素とを結合させることもできる。
　次に、本発明の基質複合体を前記酵素−抗体複合体と反応させる。酵素により親水部が切断されると、複合体の疎水基が表れて膜親和性を獲得する。膜親和性を獲得した複合体は、膜上を自由に拡散することができ、また膜を透過することが可能となる。複合体には蛍光基が結合しているので、これにより、細胞表面又は細胞内が標識される。
　このようにして標識された細胞を、適当な手法により検出することができる。
　検出方法は、特に限定されるものではなく、目視による検出、蛍光顕微鏡による検出、フローサイトメトリーによる検出、イメージングサイトメーターによる検出などが挙げられるが、フローサイトメトリーおよびイメージングサイトメーターによる検出であることが好ましい。
４．キット
　本発明は、前記基質複合体と、当該複合体を触媒する酵素とを含む、細胞の標識用又は検出用キットを提供する。
　本発明のキットには、上記複合体及び酵素のほか、適宜、付属試薬を含めることができる、付属試薬としては、例えば、フローサイトメトリー用に細胞を標識する場合は、反応バッファー、ブロッキングバッファー等の試薬を含めることができる。但し、上記細胞や試薬は例示であり、これらの細胞及び試薬に限定されるものではない。
　以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明の範囲はこれらの実施例により限定されるものではない。
［実施例１］
膜アンカー基質の合成・精製
　Ｆｍｏｃ固相合成法にて、基質の合成を行った。（ｎ，ｍ）＝（１２，１１），（６，１１）について基質（下記式の左）およびその脱リン酸化分子（下記式の右）を合成した。（ｎ，ｍ）＝（１２，１１）の基質を１、（ｎ，ｍ）＝（６，１１）の基質を２とする。合成スケールは０．０２５ｍｍｏｌとした。高速液体クロマトグラフィーで精製した。精製物を凍結乾燥し、メタノールに溶かしてストック溶液とした。ストック濃度は蛍光基の吸収から算出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
膜アンカー基質を用いた細胞染色
　２．０×１０５個の白血病細胞株（Ｋ５６２細胞）を９６ウェルプレート又は１．５ｍＬのプラスチックチューブに入れた。遠心後上澄みを除去し、その後ＨＥＰＥＳ／ｍａｎｎｉｔｏｌ溶液で２回洗浄し、５０μＬのＨＥＰＥＳ／ｍａｎｎｉｔｏｌ溶液に再懸濁した。ここに、事前に膜アンカー基質１０μＭ，ｍ−β−ＣＤ（マウスβシクロデキストリン）１０ｍＭの組成で３０分間平衡化した基質溶液５０μＬを加え、３７℃で５分−６０分間静置した。
　修飾反応後、１０％　ＦＢＳ含有培地で２回洗浄を行い未反応の基質分子を除去した。細胞を適量の培地に再懸濁して、蛍光顕微鏡観察とイメージングサイトメトリーによる蛍光強度定量を行った。
　基質１と基質２について最適化を行った。基質の脱リン酸化体を用いて細胞染色した結果を図３に示した。蛍光顕微鏡画像から、基質１の方が良く細胞を染色していることが分かる。蛍光強度を反応時間ごとに示したグラフからも、基質１が細胞を良く染色し、基質２は６０分後にもほとんど細胞を染色していないことが分かる。この結果から、本基質分子は炭素鎖長が長いほど細胞を良く染色すると言える。一方、炭素鎖が長すぎると非特異的な結合が考えられるため炭素鎖はこれ以上伸ばさずに、基質１を膜アンカー基質として選択した。
　また、Ｈｏｅｃｈｓｔ　３３３４３による核染色と合わせることで、この基質が細胞質をほぼ均一に染色していることが分かる（図４）。これは蛍光基が疎水性かつ正電荷を帯びていることで基質が膜透過したためだと考えられ、本基質分子は膜透過によって脱離が抑制されると期待できる。これによって、細胞染色の半減期が劇的に伸びる上に、基質が脱離して別の細胞に移ることによる色移りを抑制できると考えられる。
精製酵素ＣＩＡＰによる膜アンカー基質の脱リン酸化
　合成した基質分子がアルカリホスファターゼ（ＣＩＡＰ）による脱リン酸化反応を受けることを確認するために、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによって分子の脱リン酸化を評価した。酵素には精製酵素ＣＩＡＰ（タカラバイオ）を用いた。表１の組成で酵素−基質反応溶液を作製し、３７℃で５分間酵素反応を行った。酵素反応による脱リン酸化反応をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳで評価した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
　３Ｕ（１Ｕ：１μｍｏｌのｐ−ＮＰＰを１分間で脱リン酸化する（ｐＨ９．５，３７℃））の精製酵素ＣＩＡＰと５μＭの膜アンカー基質を混合し、３７℃で５分間酵素反応を行った。酵素反応による脱リン酸化反応をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳで評価した結果を図５に示した。５分間の酵素反応によって膜アンカー基質がほぼ完全に脱リン酸化されている。膜アンカー基質はアルカリホスファターゼの基質として作用すると言える。
蛍光修飾抗体・ビオチン化抗体・ビオチン化ＣＩＡＰの作製
　抗ヒトＥＧＦＲ抗体（セツキシマブ製剤（アービタクス））にローダミンを修飾した。ＭＷＣＯ：３ｋＤａの限外ろ過膜上に２００μｇのセツキシマブ製剤を添加した。ＤＰＢＳで２度洗浄し、１０ｍＭ　ＰＢ（ｐＨ８．５）１００μＬ中に溶かした。１ｍｇ／ｍＬのＮＨＳ−ローダミン（Ｔｈｅｒｍｏ）ｉｎ　ＤＭＳＯ溶液を準備し、セツキシマブに対して蛍光基が３等量、７等量となる条件で限外ろ過膜上に加えた。２０℃、８０００Ｇ、１０分で限外ろ過を繰り返した。ろ液の吸収を測定し、ローダミン由来の吸収が計測されなくなった時に精製完了とした。
　抗ヒトＥＧＦＲ抗体とＣＩＡＰにビオチンを修飾した。
膜アンカー基質による膜タンパク質検出
　本検出システムの原理実証を試みた。０．３５ｗｔ％リドカインで剥離した４．０×１０５個のＡ５４９細胞に対して、セツキシマブ−ＳＡ複合体を添加し、４℃で３０分放置した後、洗浄し、次いでビオチン化ＣＩＡＰを加え（終濃度２０μｇ／ｍＬ）、細胞表面にＣＩＡＰを結合させた。洗浄した後、１０ｍＭのレバミゾールを加えて、４℃で放置した。その後、５μＭの基質を加え、３７℃で３０分間反応した。１０％ＦＢＳ含有培地で未反応の基質を洗浄し、蛍光顕微鏡および蛍光サイトメトリーで評価した。
　一方、従来の染色法として、以下の操作を行った。ビオチン化セツキシマブとＤｙｌｉｇｈｔ　６５０標識ストレプトアビジン（ＳＡ）（Ｔｈｅｒｍｏ）をモル比１：３で混合し、１５分間放置して、複合体を形成させた。これを終濃度５μｇ／ｍＬで２．０×１０５個のＡ５４９細胞に添加し、４℃で３０分間放置した。未結合の複合体を洗浄・除去した後、蛍光顕微鏡および蛍光サイトメトリーで評価した。
　その結果、従来法に対して、本発明で染色した場合には、細胞内部まで均一な染色が起こっていた（図６）。また、蛍光強度は、従来法の１００倍以上であった（図６）。
　本発明により、細胞標識方法が提供される。本発明の方法により、フローサイトメトリーによる細胞標識を高感度で行うことができ、本発明の方法及び複合体は、それぞれ細胞標識方法及び細胞標識用試薬として有用である。

Claims (12)

  1. 蛍光基、又は蛍光基と疎水基との結合体に親水基が結合した基質複合体。
  2. 次式Ｉ：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     （式中、Ｒ１１は、Ｃ１−１０アルキル基、Ｃ２−１０アルケニル基、Ｃ２−１０アルキニル基、Ｃ３−１５シクロアルキル基、Ｃ３−１５シクロアルケニル基、Ｃ６−２０アリール基又は５~１４員ヘテロアリール基を表し、
    　Ｒ１２は、Ｃ１−１０アルキル基、Ｃ２−１０アルケニル基、Ｃ２−１０アルキニル基、Ｃ３−１５シクロアルキル基、Ｃ３−１５シクロアルケニル基、Ｃ６−２０アリール基又は５~１４員ヘテロアリール基を表し、
    　前記Ｒ１１及びＲ１２のうち、一方の基及び環は蛍光基で置換され、他方の基及び環は親水基で置換されており、
    　Ｒ１３及びＲ１４は、それぞれ独立して、水素原子、Ｃ１−１０アルキル基、Ｃ２−１０アルケニル基、Ｃ２−１０アルキニル基、Ｃ３−１５シクロアルキル基、Ｃ３−１５シクロアルケニル基、Ｃ６−２０アリール基、５~１４員ヘテロアリール基、アミノ基、又はＯＲ１０１、ＣＯＲ１０２若しくはＣＯＯＲ１０３（Ｒ１０１、Ｒ１０２及びＲ１０３は、それぞれ独立して水素原子、Ｃ１−６アルキル基又はＣ２−６アルケニル基を表す。）で示される基を表し、
    ｎ及びｍは、それぞれ独立して０~２０の整数を表す。）、
    　次式ＩＩ：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     （式中、Ｒ２１は、Ｃ１−１０アルキル基、Ｃ２−１０アルケニル基、Ｃ２−１０アルキニル基、Ｃ３−１５シクロアルキル基、Ｃ３−１５シクロアルケニル基、Ｃ６−２０アリール基又は５~１４員ヘテロアリール基を表し、
    　Ｒ２２は、Ｃ１−１０アルキル基、Ｃ２−１０アルケニル基、Ｃ２−１０アルキニル基、Ｃ３−１５シクロアルキル基、Ｃ３−１５シクロアルケニル基、Ｃ６−２０アリール基又は５~１４員ヘテロアリール基を表し、
    　前記Ｒ２１及びＲ２２のうち、一方の基及び環は蛍光基で置換され、他方の基及び環は親水基で置換されている。）、
    　次式ＩＩＩ：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     （式中、Ｒ３１は、Ｃ１−１０アルキル基、Ｃ２−１０アルケニル基、Ｃ２−１０アルキニル基、Ｃ３−１５シクロアルキル基、Ｃ３−１５シクロアルケニル基、Ｃ６−２０アリール基、５~１４員ヘテロアリール基又はベンジル基を表し、
    　Ｒ３２は蛍光基を表し、
    　前記Ｒ３１は親水基で置換されており、
    　Ｘはヘテロ原子を表す。）、又は
    　次式ＩＶ：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     （式中、Ｒ４１は１~１０個の親水基を表し、ｍ１及びｎ１は、それぞれ独立して０~２２の整数を表し、Ｒ４２及びＲ４３は、それぞれ独立してエーテル、チオエーテル、エステル、チオエステル、アミド、アミン、ウレタン、尿素、チオ尿素又はアミノ酸を介する結合を表し、Ｒ４４は蛍光基を表す。）
    で示される、請求項１に記載の基質複合体。
  3. 蛍光基がフルオレセイン系蛍光基、ローダミン系蛍光基、クマリン系蛍光基、ピレン系蛍光基、シアニン系蛍光基、ヘミシアニン系蛍光基及びＢＯＤＩＰＹ系蛍光基からなる群から選ばれるいずれかの基である、請求項１又は２に記載の基質複合体。
  4. 親水基がリン酸基、β−ガラクトシル基、硫酸基、β−グルコシル基、β−キシロシル基、α−グルクロン酸基及びβ−グルクロン酸基からなる群から選ばれるいずれかの基である、請求項１~３のいずれか１項に記載の基質複合体。
  5. フローサイトメトリーに使用される、請求項１~４のいずれか１項に記載の基質複合体。
  6. 請求項１~５のいずれか１項に記載の基質複合体と、当該基質複合体を触媒する酵素が細胞膜上に固定された細胞とを反応させ、前記酵素の触媒により親水基が除去されて膜親和性を獲得した複合体を、前記細胞の細胞膜上又は細胞膜内に拡散させるとともに細胞内に透過させることを特徴とする細胞の標識方法。
  7. 前記酵素が、細胞表面抗原に対する抗体を介して固定されたものである、請求項６に記載の方法。
  8. 酵素がアルカリホスファターゼである請求項６又は７に記載の方法。
  9. 請求項６~８のいずれか１項に記載の方法により標識された細胞を検出することを特徴とする、細胞の検出方法。
  10. 請求項１~５のいずれか１項に記載の基質複合体と、当該複合体を触媒する酵素とを含む、細胞の標識又は検出用キット。
  11. 細胞表面抗原に対する抗体であって前記酵素を結合する抗体をさらに含む、請求項１０に記載のキット。
  12. 酵素がアルカリホスファターゼである請求項１０又は１１に記載のキット。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020250998A1 (ja) * 2019-06-14 2020-12-17 株式会社同仁化学研究所 細胞滞留性蛍光化合物並びにそれを用いた細胞の染色方法及び高感度検出方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2881186A (en) * 1954-11-12 1959-04-07 Geigy Ag J R New derivatives of 7-aminocoumarin
US3074963A (en) * 1958-12-17 1963-01-22 Bayer Ag Derivatives of p-[coumarinyl-(3)]-phenyl-carbamic acid
JP2001526380A (ja) * 1997-12-05 2001-12-18 ファルマシア・アンド・アップジョン・カンパニー プロテインキナーゼおよびホスファターゼ用の蛍光ベース−高処理量スクリーニングアッセイ
CN102286025A (zh) * 2011-08-23 2011-12-21 四川汇宇制药有限公司 Fitc-ip3的制备方法及在荧光偏振分析中的应用
US20120088720A1 (en) * 2009-04-08 2012-04-12 Indiana University Research & Technology Corporati Inhibitors of protein tyrosine phosphatases

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2881186A (en) * 1954-11-12 1959-04-07 Geigy Ag J R New derivatives of 7-aminocoumarin
US3074963A (en) * 1958-12-17 1963-01-22 Bayer Ag Derivatives of p-[coumarinyl-(3)]-phenyl-carbamic acid
JP2001526380A (ja) * 1997-12-05 2001-12-18 ファルマシア・アンド・アップジョン・カンパニー プロテインキナーゼおよびホスファターゼ用の蛍光ベース−高処理量スクリーニングアッセイ
US20120088720A1 (en) * 2009-04-08 2012-04-12 Indiana University Research & Technology Corporati Inhibitors of protein tyrosine phosphatases
CN102286025A (zh) * 2011-08-23 2011-12-21 四川汇宇制药有限公司 Fitc-ip3的制备方法及在荧光偏振分析中的应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MUJUMDAR, R. B. ET AL.: "Cyanine dye labeling reagents containing isothiocyanate groups", CYTOMETRY, vol. 10, 1989, pages 11 - 19, XP000034880 *
RICHARDSON, R. W. ET AL.: "Biotin and fluorescent labeling of RNA using T4 RNA ligase", NUCLEIC ACIDS RESEARCH, vol. 11, no. 18, 1983, pages 6167 - 6184, XP009098117 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020250998A1 (ja) * 2019-06-14 2020-12-17 株式会社同仁化学研究所 細胞滞留性蛍光化合物並びにそれを用いた細胞の染色方法及び高感度検出方法
JP7385850B2 (ja) 2019-06-14 2023-11-24 株式会社同仁化学研究所 細胞滞留性蛍光化合物並びにそれを用いた細胞の染色方法及び高感度検出方法

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