CN106233142B - 用于检测目的标志物的组合产品 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于简易且高灵敏度地检测目的标志物的组合产品。更详细而言，本发明涉及一种用于与目的标志物结合分子并用而检测生物学试样中的目的标志物的组合产品，上述目的标志物结合分子能够与生物学试样中的目的标志物特异性结合，该组合产品至少包含：(a)第一结合剂，其包含能够与上述目的标志物结合分子直接或间接地特异性结合的第一结合分子、和标记物质；(b)能够与上述第一结合剂特异性结合的连接分子；以及(c)第二结合剂，其为能够与上述连接分子特异性结合的第二结合剂，包含第二结合分子和标记物质。

Description

用于检测目的标志物的组合产品
相关申请的参照
本专利申请主张基于2014年4月23日申请的日本专利申请2014-89675号的优先权，该在先专利申请中的全部公开内容通过引用而成为本说明书的一部分。
技术领域
本发明涉及用于检测目的标志物的组合产品以及使用其的检测方法。
背景技术
随着近年来免疫化学的进步，使用抗原抗体反应以良好灵敏度检测微量的物质的免疫测定法被广泛使用。作为免疫测定法中的通常的方法，可列举免疫染色法等。
免疫染色法是使用识别细胞、组织切片上的特定物质的抗体来检测该细胞、组织切片上的特定物质的方法。该免疫染色法中，可检测的物质为酶的情况被称为酶抗体法。作为酶抗体法，开发出了使用经能够将一抗(primary antibody)可视化的酶进行了标记的物质的直接法、不标记一抗而标记二抗(secondary antibody)的间接法等方法。
进一步，近年来，为了实现组织、细胞内分布的少量抗原蛋白的可视化、或者为了证明由于福尔马林固定、石蜡包埋的处理从而抗原性显著受损的抗原物质，要求进一步的高灵敏度，从而逐步开发了作为酶抗体法的变形方法的各种扩增法。作为这些扩增法，按照灵敏度低的顺序，可列举直接法＜间接法＜PAP(过氧化物酶-抗过氧化物酶，peroxidaseanti-peroxidase)法＜ABC(抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶复合物，avidin-biotin-peroxidase complex)法＜LSAB(标记的链霉亲和素-生物素，labeled streptavidinbiotin)法＜聚合物法＜CSA(催化信号放大，catalyzed signal amplification)法等(非专利文献1)。
上述扩增法中，目前，作为高灵敏度且简便的方法，最普及的方法为聚合物法。
作为以往聚合物法的一种，可列举如下的方法：对于抗原等目的标志物使一抗反应后，与聚合物试剂(聚合物上结合有大量的酶和二抗)反应，从而形成抗原-一抗-二抗-聚合物-酶的复合体。利用该复合体中的酶活性使基质显色，从而使目的标志物可视化(非专利文献1).
另外，作为其他的聚合物法，可列举如下的方法：在上述的以往聚合物法中的一抗和聚合物试剂之间，使架桥(bridge)试剂(此外，还被制造商赋予了连接子、探针、原发后(post primary)等各种名称)反应，从而进行信号的扩增。其结果，据说可以期待与上述方法相比高2～5倍的灵敏度(非专利文献1)。
近年来，进一步，作为新的聚合物法，开发了如下的方法：对于上述的聚合物试剂(第一聚合物试剂)，使进一步的聚合物试剂(第二聚合物试剂)反应，从而进行信号的扩增(专利文献1)。
然而，即使使用以往的聚合物法，由于目的标志物极其微少、或者抗原性降低等理由，有时无法获得期望水平的染色。在这样的技术状况下，仍然需要简便并且以更加高的灵敏度检测目的标志物的手段。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：鸭志田伸吾，基礎からの免疫染色術-いかに確実に染め出すか-(从基础开始的免疫染色技术-如何可靠地进行染色)，组织细胞化学2012，日本组织细胞化学汇编，2012，p.11-25。
专利文献
专利文献1：日本特表2007-513334号公报
发明内容
本发明的目的在于简便且以高灵敏度检测生物学试样中出现的目的标志物。
本发明人这次将由标记物质标记的多种结合剂与特定的连接分子组合而用于目的标志物的检测，结果发现，能够简便且以显著高的灵敏度检测目的标志物。本发明是基于该见解而作出。
本发明中，包含以下的发明。
(1)一种用于与目的标志物结合分子并用而检测该目的标志物的组合产品，上述目的标志物结合分子能够与生物学试样中的目的标志物特异性结合，所述组合产品至少包含：
(a)第一结合剂，包含能够与上述目的标志物结合分子直接或间接地特异性结合的第一结合分子、和标记物质，
(b)能够与上述第一结合剂特异性结合的连接分子，以及
(c)第二结合剂，其为能够与上述连接分子特异性结合的第二结合剂，包含第二结合分子和标记物质。
(2)如(1)所记载的组合产品，其中，上述连接分子能够与上述标记物质特异性结合。
(3)如(1)或(2)所记载的组合产品，其中，上述连接分子为抗体或其抗原结合片段。
(4)如(1)～(3)中任一项记载的组合产品，其中，标记物质为选自化学发光标记、金属粒子、荧光标记、酶标记、辅酶标记、经标记的抗体、色素、生物发光标记、半抗原和聚合物粒子中的至少一种以上。
(5)如(1)～(4)中任一项记载的组合产品，其中，上述第一结合剂为上述第一结合分子与述标记物质直接地、或者通过载体间接地连接而成的结构体。
(6)如(1)～(5)中任一项记载的组合产品，其中，上述第二结合剂为上述第二结合分子与上述标记物质直接地、或者通过载体间接地连接而成的结构体。
(7)如(1)～(6)中任一项记载的组合产品，其中，上述第一结合分子为抗体或其抗原结合片段。
(8)如(1)～(7)中任一项记载的组合产品，其中，上述第二结合分子为抗体或其抗原结合片段。
(9)如(1)～(8)中任一项记载的组合产品，其进一步与上述目的标志物结合分子组合而成。
(10)如(1)～(9)中任一项记载的组合产品，其为试剂盒的形式。
(11)一种检测从被测物获得的生物学试样中的目的标志物的方法，包括：
(i)使预先与目的标志物特异性结合的目的标志物结合分子和第一结合剂接触而得到第一复合体的工序，
(ii)使该第一复合体和连接分子接触而得到第二复合体的工序，以及
(iii)使该第二复合体和第二结合剂接触而得到第三复合体的工序，
上述第一结合剂包含能够与上述目的标志物结合分子直接或间接地特异性结合的第一结合分子、和标记物质，
上述连接分子能够与上述第一结合剂特异性结合，
上述第二结合剂能够与上述连接分子特异性结合，且包含第二结合分子和标记物质。
(12)如(11)所记载的方法，其进一步包括检测上述第三复合体中的标记物质的工序。
(13)如(11)或者(12)所记载的方法，其中，上述连接分子为抗体或其抗原结合片段。
(14)如(11)～(13)中任一项记载的方法，其中，上述连接分子能够与上述标记物质特异性结合。
(15)如(11)～(14)中任一项记载的方法，其中，上述标记物质为选自化学发光标记、金属粒子、荧光标记、酶标记、辅酶标记、经标记的抗体、色素、生物发光标记、半抗原和聚合物粒子中的至少一种以上的标记物质。
(16)如(11)～(15)中任一项记载的方法，其中，上述第一结合剂为第一结合分子和上述标记物质直接地、或者通过载体间接地连接而成的结构体。如
(17)如(11)～(16)中任一项所记载的方法，其中，上述第二结合剂为第二结合分子和上述标记物质直接地、或者通过载体间接地连接而成的结构体。
(18)如(11)～(17)中任一项记载的方法，其中，上述第一结合分子为抗体或其抗原结合片段。
(19)如(11)～(18)中任一项记载的方法，其中，上述第二结合分子为抗体或其抗原结合片段。
(20)一种用于与目的标志物结合分子并用而检测生物学试样中的目的标志物的组合产品的用途，上述目的标志物结合分子能够与目的标志物特异性结合，所述组合产品至少包含：
(a)第一结合剂，包含能够与上述目的标志物结合分子直接或间接地特异性结合的第一结合分子、和标记物质，
(b)能够与上述第一结合剂特异性结合的连接分子，以及
(c)第二结合剂，包含第二结合分子和标记物质、并且能够与上述连接分子特异性结合,
上述连接分子能够特异性结合于标记物质。
根据本发明，能够简便且以显著高的灵敏度检测目的标志物。
附图说明
图1为关于本发明的目的标志物的检测方法的模式图。
图2为示出试验例1(比较例1、2)的免疫组织化学染色的结果的照片。
图3为示出试验例2(实施例1、2、比较例3、4)的免疫组织化学染色的结果的照片。
图4为示出试验例3(实施例3～5、比较例5～7)的免疫组织化学染色的结果的照片。
图5为示出试验例4：4-1(实施例6、7、比较例8、9)的免疫组织化学染色的结果的照片。
图6为示出试验例4：4-2(实施例8、9、比较例10、11)的免疫组织化学染色的结果的照片。
图7为示出试验例4：4-3(实施例10～12、比较例12～14)的免疫组织化学染色的结果的照片。
图8为示出试验例5(实施例13～16、比较例15～22)的免疫组织化学染色的结果的照片。
图9为示出试验例6：6-1(实施例17、比较例23、24)的免疫组织化学染色的结果的照片。
图10为示出试验例6：6-2(实施例18、比较例25、26)的免疫组织化学染色的结果的照片。
图11为示出在试验例7的不存在聚乙二醇的情况下实施的实施例20以及在存在聚乙二醇的情况下实施的实施例21～24的免疫组织化学染色的结果的照片。
组合产品
本发明的组合产品为用于与目的标志物结合分子并用而检测生物学试样中的目的标志物的组合产品，上述目的标志物结合分子能够与目的标志物特异性结合，其特征在于，所述组合产品至少包含：
(a)第一结合剂，包含能够与上述目的标志物结合分子直接或间接地特异性结合的第一结合分子、和标记物质，
(b)能够与上述第一结合剂特异性结合的连接分子，以及
(c)第二结合剂，包含第二结合分子和标记物质，并且能够与上述连接分子特异性结合。
以下，不特别限定本发明，按照图1对使用了本发明组合产品的检测方法的一个方式进行说明。
图1中，在生物学试样1上出现作为检测对象的目的标志物2。为了捕捉该目的标志物2，对于目的标志物2预先特异性结合目的标志物结合分子3。
接下来，作为用于检测目的标志物2的试剂，准备第一结合剂4、连接分子5和第二结合剂6。
这里，第一结合剂4由能够与目的标志物结合分子3直接或间接地特异性结合的第一结合分子7、标记物质8和载体9(聚合物等)构成。
另外，第二结合剂6是能够特异性结合于连接分子5的结构体。图1中，第二结合剂6由能够特异性结合于连接分子5的第二结合分子10、标记物质8’以及载体9’(聚合物等)构成。
另外，连接分子5包含能够特异性结合于标记物质8、第二结合分子10和标记物质8’的至少三个结合部位。
图1中，使用上述那样预先准备的检测用试剂的组合，可通过以下的第1工序～第3工序检测目的标志物。
第1工序中，使与目的标志物2结合的目的标志物结合分子3和第一结合剂4接触而得到第一复合体(1～4)。
接下来，第2工序中，使第一复合体(1～4)与连接分子5接触而得到第二复合体(1～5)。
接下来，第3工序中，使第二复合体(1～5)与第二结合剂6接触而得到第三复合体(1～6)。这里，连接分子5和第二结合剂6通过第二结合分子10和标记物质8’至少这两种结合部位稳定结合。
通过以上的第1～3工序，目的标志物2被标记物质8及标记物质8’这两者标记，变得能够以高检测灵敏度进行检测。
生物学试样
本发明的生物学试样是来源于任意的被测物、例如动物(优选哺乳动物，更优选人类)、植物或细菌的试样。上述生物学试样可以是包含真核生物细胞或者原核生物细胞的试样，也可以是包含组织或者细胞的试样。
目的标志物
本发明的生物学试样中的目的标志物是指生物学试样中存在的任何分子。上述目的标志物可列举蛋白质及这些蛋白质的片段、肽、核酸、脂质、糖脂质、糖、多糖、淀粉等。这里，蛋白质包括糖蛋白、脂蛋白、磷蛋白、甲基化蛋白质等经修饰的蛋白质，核酸包括DNA、RNA等。另外，上述目的标志物只要是能够膜结合等在生物学试样的表面出现的物质即可，可以是生物学试样的内部、例如细胞膜内、细胞质内、核内所包含的物质。
目的标志物结合分子
本发明的目的标志物结合分子只要能够与生物学试样中的目的标志物特异性结合，则没有特别限定，例如可列举抗体或其片段(包括抗原结合片段。)、DNA、RNA、肽核酸(PNA)等核酸探针、配体或者受体等。
第一结合剂
本发明的第一结合剂包含能够与目的标志物结合分子直接或间接地特异性结合的第一结合分子、和标记物质。在不妨碍本发明效果的情况下，本发明的第一结合分子和标记物质可以在任意的部位直接结合。另外，本发明的第一结合分子和标记物质均可以包含载体。另外，本发明的第一结合剂可包含半抗原标记。
第一结合分子
第一结合分子只要能与目的标志物结合分子直接或间接地特异性结合，则没有限定，例如优选抗体或其抗原结合片段。这里，抗体可以是任意的同种型，即IgG、IgM、IgA、IgD或者IgE。另外，作为抗体片段，可列举例如抗原结合片段，优选Fab、Fab’、(Fab’)2、Fv、scFv、二抗体(diabody)、三抗体(triabody)、四抗体(tetrabody)、或者单结构域抗体等。
另外，第一结合分子与目的标志物结合分子“间接地”特异性结合的意思是，使架桥试剂等分子介于目的标志物结合分子与第一结合分子之间，第一结合分子能够特异性结合于该架桥试剂等分子。作为架桥试剂，在不妨碍本发明效果的情况下没有特别限定，可列举抗体、Fab、Fab’、(Fab’)2、Fv或者scFv等抗原结合片段。上述架桥试剂可进一步包含半抗原标记、荧光标记。
第一结合剂中的标记物质
在不妨碍本发明效果的情况下，本发明的第一结合剂中的标记物质没有特别限定，可列举化学发光标记、金属粒子、荧光标记、酶标记、辅酶标记、经标记的抗体、色素、生物发光标记、半抗原和聚合物粒子等。另外，上述标记物质更优选被能够在酶抗体法中使用的酶等标记，作为这样的酶，可列举例如辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)、β-半乳糖苷酶(GAL)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶、β-葡糖醛酸酶、转化酶、黄嘌呤氧化酶、萤火虫萤光素酶、葡萄糖氧化酶(GO)。
另外，作为标记物质而使用酶时，作为其基质，只要是与上述标记物质反应并显色的物质则没有限定。通常对于辣根过氧化物酶所使用的基质的例子中，可列举3,3’-二氨基联苯胺(DAB)、用镍增强的二氨基联苯胺、3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)、联苯胺二盐酸盐(BDHC)、Hanker-Yates试剂(HYR)、碘酚蓝(IB)、四甲基联苯胺(TMB)、4-氯-1-萘酚(CN)、α-萘酚派洛宁(α-NP)、邻联茴香胺(OD)、5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐(BCIP)、硝基四氮唑蓝(NBT)、2-(对碘苯基)-3-对硝基苯基-5-苯基四唑氯化物(INT)、四硝基四氮唑蓝(TNBT)、5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷/亚铁-铁氰化物(BCIG/FF)等。
另外，通常对于碱性磷酸酶所使用的基质的例子中，可列举萘酚-AS-B1-磷酸盐/快红TR(NABP/FR)、萘酚-AS-MX-磷酸盐/快红TR(NAMB/FR)、萘酚-AS-B1-磷酸盐/快红TR(NABP/FR)、萘酚-AS-MX-磷酸盐/快红TR(NAMP/FR)、萘酚-AS-B1-磷酸盐/新品红(NABP/NF)、溴氯吲哚基磷酸盐/硝基四氮唑蓝(BCIP/NBT)、5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-d-半乳糖苷(BCIG)等。
第一结合剂中的载体
另外，第一结合剂中的载体在不妨碍本发明效果的情况下没有特别限定，优选为天然或者合成来源的聚合物。另外，本发明的聚合物的分子量在实现本发明的效果的情况下没有特别限定，作为一个适宜的例子，可以将平均分子量(MW)设为2,000～500,000。该平均分子量可使用例如该聚合物的标准品作为指标，通过凝胶过滤(GPC)确定。但是，上述的分子量范围只给出了大致标准，只要能实现本发明的目的，则可以使用比上述范围大的分子量，也可以使用比上述范围小的分子量。作为该聚合的适宜例子，可列举聚氨基酸、蛋白质、多核苷酸、多糖类或者有机合成聚合物。另外，本发明的载体中，为了提高免疫测定的灵敏度，优选将多种标记物质结合于载体。
另外，作为本发明的聚氨基酸，可使用例如具有结合性的含有两个以上的多个氨基的肽。作为一个例子，可例示赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、谷氨酰胺、各种碱性氨基酸等具有α-氨基、ε-氨基、其他氨基的聚氨基酸。进一步作为具体例子，除了作为具有ε-氨基的赖氨酸的聚合物的聚赖氨酸之外，可列举在具有赖氨酸的同时还具有其他氨基酸的各种聚氨基酸。并且，作为后者的肽聚合物的例子，可列举赖氨酸与甘氨酸的无规共聚物、赖氨酸与丝氨酸的无规共聚物、赖氨酸与谷氨酰胺酸的无规共聚物等，市售有各种分子量的物质。
另外，作为本发明的蛋白质，可列举例如白蛋白、免疫球蛋白或者病毒样蛋白质(VLP)等。
作为本发明的多核苷酸，可列举选自DNA、PNA及LNA等的包含一个以上的构成单元的物质。另外，本发明的多核苷酸也可以是树状聚合物构建体的形式。
另外，作为本发明的多糖类，可例示葡聚糖、琼脂糖、糊精、可溶性淀粉等。另外，作为该多糖类，还可以使用导入有醛基、氨基或其他活性基的多糖类。具有醛基的多糖类可通过使多糖类与过碘酸钠反应而容易地调制。另外，氨基也可以通过公知的方法导入至多糖类。例如具有氨基的葡聚糖可通过如下方法调制：将葡聚糖用过碘酸钠处理而生成醛基后，与二胺反应，用硼氢化钠还原。另外，向多糖类的活性基的导入也可以用公知的方法进行。例如通过使葡聚糖与二乙烯基砜反应，得到具有乙烯基的葡聚糖。作为上述多糖类，可列举例如包括葡聚糖、羧甲基葡聚糖、葡聚糖多醛、羧甲基葡聚糖内脂以及环糊精的多糖类；普鲁兰多糖、裂裥多糖、硬葡聚糖、黄原胶、胶凝糖、O-乙基氨基半乳甘露聚糖、包括6-O-羧甲基几丁质、N-羧甲基壳聚糖的几丁质、壳聚糖类；包括羧甲基纤维素、羧甲基羟乙基纤维素、羟乙基纤维素、6-氨基-6-脱氧纤维素及O-乙胺纤维素的衍生纤维素类；羟基化淀粉、羟丙基淀粉、羟乙基淀粉、卡拉胶、褐藻胶及琼脂糖；聚蔗糖及羧甲基化聚蔗糖的合成多糖类等。
另外，作为本发明的有机合成聚合物，优选可列举选自由(甲基)丙烯酸、(甲基)丙烯酰胺、(甲基)丙烯酸酯、甲基丙烯酸甲酯、马来酸、马来酸酐、乙酸乙烯酯、乙烯醇、氯乙酸乙烯酯、乙二醇、丙二醇、丙三醇、二异氰酸酯、苯乙烯、异戊二烯、烯丙胺及亚乙基亚胺(ethylene imine)组成的组中的至少一个构成单元所构成的聚合物。更具体而言，作为有机合成聚合物，可列举包括聚(丙烯酸)、聚(丙烯酰胺)、聚(丙烯酸酯)、聚(2-羟乙基甲基丙烯酸酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(马来酸)、聚(马来酸酐)、共聚(乙基-乙酸乙烯酯)、聚(甲基丙烯酸)、聚(乙烯醇)、共聚(乙烯醇-氯乙酸乙烯酯)、胺化聚(乙烯醇)以及它们的嵌段共聚物的乙烯基聚合物类；包含直链状、梳形的、或者含支链的树状聚合物的聚合物骨架的聚乙二醇(PEG)或者聚丙二醇或者共聚(环氧乙烷-环氧丙烷)；聚(亚乙基亚胺)；聚(烯丙胺)等。
第二结合剂
本发明的第二结合剂能够与连接分子特异性结合，并且包含第二结合分子和标记物质。在不妨碍本发明效果的情况下，本发明的第二结合分子与标记物质可以在任意的部位直接结合。另外，本发明的第二结合分子和标记物质均可包含载体。另外，本发明的第二结合剂可包含半抗原标记。
第二结合分子
第二结合分子只要能与连接分子特异性结合则没有限定，例如优选抗体或其片段。这里，抗体可以是任何同种型，即IgG、IgM、IgA、IgD或者IgE。另外，作为抗体片段，可列举例如抗原结合片段、优选Fab、Fab’、(Fab’)2、Fv、scFv、二抗体、三抗体、四抗体或者单结构域抗体等。
第二结合剂中的标记物质
本发明的第二结合剂中的标记物质在不妨碍目的标志物的检测的情况下没有特别限定，例如可以选自第一结合剂中例示的标记物质。因此，第二结合剂中标记物质可以是与第一结合剂中的标记物质相同的标记物质，也可以是不同的标记物质，优选为相同的标记物质。在使用相同的标记物质时，在简易且以高水平的检测灵敏度检测目的标志物方面特别有利。
第二结合剂中的载体
第二结合剂中的载体在不妨碍本发明效果的情况下没有特别限定，例如可以选自第一结合剂中例示的载体。因此，第二结合剂中的载体可以与第一结合剂中的载体相同也可以不同。
连接分子
如上所述，本发明的连接分子能够与第一结合剂特异性结合。另外，考虑到目的标志物的有效检测，本发明的连接子优选能够与第一结合剂和第二结合剂这两者特异性结合。因此，根据本发明的一个方式，连接分子能够与第一结合剂及第二结合剂这两者特异性结合。在不妨碍本发明效果的情况下，本发明的连接分子可以在第一结合剂及第二结合剂的任何部位特异性结合，优选能够特异性结合于第一结合剂中的标记物质和/或第二结合剂中的标记物质，更优选能够特异性结合于第一结合剂中的标记物质和第二结合剂中的标记物质这两者。
另外，本发明的连接分子被第二结合剂中的第二结合分子特异性结合的部位可以是与图1所示的标记物质不同的其他部位。因此，根据本发明的一个方式，连接分子包含能够与第二结合剂特异性结合的至少两个结合部位。
作为上述连接分子，可列举例如抗体或其片段等。这里，抗体可以是任何同种型，即IgG、IgM、IgA、IgD或者IgE。另外，作为抗体片段，包括Fab、Fab’、(Fab’)2、Fv或者scFv等抗原结合片段。予以说明的是，上述连接分子进一步可以包含与制作连接分子时的免疫原不同的半抗原标记、荧光物质标记。另外，根据本发明的一个方式，上述连接分子不包括多个抗体或其抗原结合片段通过聚合物等载体而连接的情况。
聚乙二醇
本发明中，在目的标志物的检测中，优选使第一结合剂、连接分子及第二结合剂中的至少一个试剂在聚乙二醇共存的条件下进行免疫反应。关于按照何种顺序使上述试剂与聚乙二醇混合而共存，本发明中没有特别限制。例如可以开始使用上述试剂的免疫反应，迅速顺次添加聚乙二醇，也可以将上述试剂与聚乙二醇预先混合而实施免疫反应。从增强根据本发明的免疫反应效果的观点考虑，优选在免疫反应开始的同时或开始前使上述试剂与聚乙二醇共存。
本发明的聚乙二醇的分子量在实现本发明效果的情况下没有特别限定，作为一个适宜的例子，可以使平均分子量(MW)为2,000～20,000。该平均分子量可使用例如聚乙二醇的标准品作为指标，通过凝胶过滤(GPC)确定。
组合产品
为了通过与能够特异性结合于目的标志物的目的标志物结合分子并用而检测生物学试样中的目的标志物，本发明的组合产品由上述(a)第一结合剂、(b)连接分子、及(c)第二结合剂组合而成。本发明的组合产品在不妨碍本发明效果的情况下其方式没有特别限定，例如(a)第一结合剂、(b)连接分子、及(c)第二结合剂可以以组合物的方式一体构成，也可以以例如检测试剂盒或者检测系统的方式作为分离体而构成(a)～(c)。因此，本发明的组合产品优选以组合物或者试剂盒的形式提供。另外，本发明的组合产品中，在不妨碍本发明效果的情况下，可以包含(a)～(c)以外的试剂。
另外，根据本发明的一个方式，本发明的组合产品是在上述(a)～(c)中进一步组合上述目的标志物结合分子而成。
检测生物学试样中的目的标志物的方法
根据本发明，如上所述，同时使用(a)第一结合剂、(b)连接分子、及(c)第二结合剂、目的标志物结合分子，能够简易地且以高水平的检测灵敏度检测从被测物获得的生物学试样中的目的标志物。因此，根据本发明的一个方式，提供一种方检测从被测物获得的生物学试样中的目的标志物的方法，包括：
(i)使预先与目的标志物特异性结合的目的标志物结合分子和第一结合剂接触而得到第一复合体的工序，
(ii)使该第一复合体和连接分子接触而得到第二复合体的工序，以及
(iii)使该第二复合体和第二结合剂接触而得到第三复合体的工序，
上述第一结合剂包含能够与上述目的标志物结合分子直接或间接地特异性结合的第一结合分子、和标记物质，
上述能够结合的连接分子能够与上述第一结合剂特异性结合，
上述第二结合剂是能够与上述连接分子特异性结合的第二结合剂，并且包含第二结合分子和标记物质。
上述(i)～(iii)的各接触工序中，可使用将各成分混合等公知方法，得到第一复合体、第二复合体及第三复合体。
上述(i)～(iii)的各接触工序中，第一结合剂、连接分子及第二结合剂可优选以溶液形式添加。
工序(i)的上述溶液中第一结合剂的浓度没有特别限定，可以设为1～15μg/mL。
工序(ii)的上述溶液中连接分子的浓度没有特别限定，可以设为0.5～15μg/mL。
工序(iii)的上述溶液中第二结合剂的浓度没有特别限定，可以设为1～15μg/mL。
另外，考虑到增强目的标志物的检测灵敏度，(i)～(iii)的各接触工序中至少一个工序或者全部工序优选为聚乙二醇共存的条件下实施。(i)～(iii)中所使用的上述溶液中聚乙二醇的浓度没有特别限定，可以设为0.5～20wt％。
另外，本发明的方法可以进一步包括对第一结合剂中的标记物质及第二结合剂中的标记物质进行检测的工序。
关于本发明的第一结合剂中的标记物质及第二结合剂中的标记物质的检测方法，本领域技术人员可以根据标记物质的种类、性质适当设定，可以使用例如包括免疫染色法、原位杂交、流式细胞术、酶免疫测定(EIA)及酶联免疫-测定法(ELISA)、蛋白质印迹(western blot)在内的各种公知的检测方法，优选为免疫组织化学染色法、色素原位杂交(Chromogenic in situ hybridization：CISH)等原位杂交。
关于本发明的(i)～(iii)的各接触工序及标记物质的检测的反应条件的详细内容，本领域技术人员可以根据公知的方法确定。
实施例
以下，通过实施例具体说明本发明，但本发明不限于这些实施例。予以说明的是，本发明的单位及测定条件的详细内容没有特别记载时，以JIS(日本工业规格)的规定为准。
试验例1：仅使用第一结合剂的高灵敏度染色法、以及仅使用第一结合剂及第二结 合剂的高灵敏度染色法的讨论
本试验例中，关于目的标志物的检测灵敏度，将仅使用第一结合剂的反应体系(比较例1)与仅使用第一结合剂及第二结合剂的反应体系(比较例2)进行比较。
试剂的调制
1.第一结合剂的调制
第一结合剂(聚合物试剂)按照日本特开2001-181299号公报的段号[0031]～[0040]的记载制造。
具体而言，混合将过氧化物酶和制成Fab’的抗小鼠Ig(动物种类：山羊)结合于氨基酸聚合物而成的聚合物试剂(M)、以及将过氧化物酶和制成Fab’的抗兔子Ig(动物种类：山羊)结合于氨基酸聚合物而成的聚合物试剂(R)各5μg/mL，调制混合式聚合物试剂(MULTI)。
2.第二结合剂的调制
将过氧化物酶和制成Fab’的抗山羊Ig(动物种类：兔子)结合于氨基酸聚合物而成的聚合物试剂(G)调制为7.5μg/mL。
免疫组织化学染色
1.脱蜡、脱过氧化物酶、抗原修复处理
A.标本载玻片的准备
将组织切片切成3μm的薄片，附着至涂有MAS的载玻片。然后，在37℃的孵育箱内干燥一晚。
B.脱蜡
(I)二甲苯处理(3分钟×三次)
将载玻片在二甲苯中浸渍3分钟浸。然后，抖掉多余的液体，在另外的二甲苯中浸渍3分钟。然后，抖掉多余的液体，进一步在另外的二甲苯中浸渍3分钟。
(II)乙醇处理(3分钟×四次)
在100％乙醇中浸渍3分钟。抖掉多余的液体，在另外的100％乙醇中浸渍3分钟。将该操作再进行两次。
(III)清洗
抖掉多余的乙醇，用PBS清洗(每次3分钟，更换两次容器)。
C.通过抗原修复的处理
使用抗原修复液pH9(株式会社日冷生物科学)，用高压釜进行20分钟加热处理，在室温放置20分钟。然后，用PBS清洗3分钟×两次。
D.脱过氧化物酶
除去内源性过氧化物酶。将水气排出后，将载玻片在3V/V％过氧化氢溶液中浸渍10分钟。然后，用PBS清洗3分钟×两次。
2.第一抗体或者阴性对照(第一抗体稀释液)的添加、反应
在抖掉了多余液体的载玻片上，滴加第一抗体或者第一抗体稀释液，在保湿箱中，在25℃反应30分钟反应。然后，用PBS清洗3分钟×两次。讨论中使用的组织和第一抗体的组合如下。
·胃癌……抗人p53基因产物单克隆抗体(DO-7)(株式会社日冷生物科学)稀释3倍而使用。
·大肠癌…直接使用抗CDX-2兔子单克隆抗体(株式会社日冷生物科学)。
3.与第一结合剂的反应
在抖掉多余液体的载玻片上，滴加混合式聚合物试剂(MULTI)，在保湿箱中，在25℃反应10分钟。然后，用PBS清洗3分钟×两次。予以说明的是，本反应在比较例1及2这两者中进行。
4.与第二结合剂的反应
在抖掉多余液体的载玻片上，滴加聚合物试剂(G)，在保湿箱中，在25℃反应10分钟。然后，用PBS清洗3分钟×两次。予以说明的是，本反应仅在比较例2中进行。
5.基质溶液的添加、反应
在抖掉多余液体的载玻片上，滴加N-Histofine(注册商标)DAB-2V(株式会社日冷生物科学)，在室温反应5分钟。然后，用流水清洗5分钟。
6.对比染色，脱水、净化，封入
A.对比染色
将水气排出后，在Mayer苏木精溶液中浸渍30秒。然后，用流水清洗5分钟。
B.脱水、净化
排出水气，用乙醇进行脱水，用二甲苯进行净化。这里，关于乙醇，通过×三次、静置5分钟×一次，从而进行脱水。关于二甲苯，通过×一次、静置5分钟×两次，从而进行净化。
C.封入
使用非水溶性封入剂(株式会社日冷生物科学)进行封入。
上述染色结果如图2所示。这里，图2中的照片是用光学显微镜(奥林巴斯株式会社)、目镜使用10倍、物镜使用4倍拍摄各染色组织的照片。
仅有第一结合剂及第二结合剂的反应体系(比较例2)中，与仅有第一结合剂的反应体系(比较例1)相比，染色灵敏度稍有提高。然而，没有获得期望水平的扩增效果。
予以说明的是，阴性对照中，没有出现返染。
试验例2：使用了第一结合剂、连接分子及第二结合剂的高灵敏度染色法的讨论
讨论基于使用了第一结合剂、连接分子及第二结合剂的反应体系、也就是使连接分子介于第一结合剂和第二结合剂之间的反应体系，是否能够相比于仅使用第一结合剂的反应体系、或者仅使用第一结合剂及第二结合剂的反应体系提高染色灵敏度。
本试验中，使用了第一结合剂、连接分子及第二结合剂的反应体系中，将使用连接分子(抗HRP抗体1μg/mL)的情况作为实施例1，将使用连接分子(抗HRP抗体5μg/mL)的情况作为实施例2。
另外，将仅使用第一结合剂的反应体系作为比较例3，将仅使用第一结合剂及第二结合剂的反应体系作为比较例4。
试剂的调制
1.第一结合剂的调制
混合将过氧化物酶和制成Fab’的抗小鼠Ig(动物种类：山羊)结合于氨基酸聚合物而成的聚合物试剂(M)、以及将过氧化物酶和制成Fab’的抗兔子Ig(动物种类：山羊)结合于氨基酸聚合物而成的聚合物试剂(R)各5μg/mL，调制混合式聚合物试剂(MULTI)。
2.连接分子的调制
将山羊抗HRP抗体(多克隆)(Pierce公司)调制为1μg/mL或者5μg/mL。
3.第二结合剂的调制
将过氧化物酶和制成Fab’的抗山羊Ig(动物种类：兔子)结合于氨基酸聚合物而成的聚合物试剂(G)调制为7.5μg/mL。
免疫组织化学染色
1.脱蜡、脱过氧化物酶、抗原修复处理
通过与试验例1同样的方法进行。
2.第一抗体或者阴性对照(第一抗体稀释液)的添加、反应
通过与试验例1同样的方法进行。
3.与第一结合剂的反应
在抖掉多余液体的载玻片上，滴加混合式聚合物试剂(MULTI)，在保湿箱中，在25℃反应10分钟。然后，用PBS清洗3分钟×两次。予以说明的是，本反应在实施例1、实施例2、比较例3及比较例4中进行。
4.与连接分子的反应
在抖掉多余液体的载玻片上，滴加山羊抗HRP抗体，在保湿箱中，在25℃反应10分钟。然后，用PBS清洗3分钟×两次。予以说明的是，本反应仅在实施例1和2中进行。
5.与第二结合剂的反应
在抖掉多余液体的载玻片上，滴加聚合物试剂(G)，在保湿箱中，在25℃反应10分钟。然后，用PBS清洗3分钟×两次。予以说明的是，本反应在实施例1、实施例2及比较例4中进行。
6.基质溶液的添加、反应
通过与试验例1同样的方法进行。
7.对比染色，脱水、净化，封入
通过与试验例1同样的方法进行。
结果如图3所示。这里，图3中的照片是用光学显微镜(奥林巴斯株式会社)、目镜使用10倍、物镜使用4倍拍摄各染色组织的照片。
在第一结合剂和第二结合剂的反应之间夹有连接分子(抗HRP抗体)的反应体系(实施例1及2)中，相比于仅使用第一结合剂的反应体系或者仅使用第一结合剂及第二结合剂的反应体系，染色灵敏度显著提高。
予以说明的是，阴性对照中没有出现返染。
试验例3：用作连接分子的抗体的种类的讨论
改变抗HRP抗体的免疫动物种类(小鼠、兔子或者山羊)，使用下述表1那样的聚合物试剂、抗HRP抗体，通过与试验例2同样的试验方法进行。
[表1]
其结果如图4所示。这里，图4中的照片是使用光学显微镜(奥林巴斯株式会社)、目镜使用10倍、物镜使用4倍拍摄各染色组织的照片。
无论用任一种免疫动物种类的抗体作为连接分子，使用了第一结合剂、连接分子及第二结合剂的反应体系(实施例3～5)的情况相比于仅使用第一结合剂及第二结合剂的反应体系(比较例5～7)，染色灵敏度显著提高。予以说明的是，阴性对照中没有出现返染。
试验例4：第一结合剂及第二结合剂的种类的讨论
4-1：全分子抗体及葡聚糖(载体)的结合体(第一结合剂及第二结合剂)的使用
使用全分子IgG抗体和过氧化物酶结合于葡聚糖的聚合物试剂(EnVision DualLink System-HRP，DAKO公司)作为第一结合剂及第二结合剂，按照以下的流程，进行染色灵敏度的比较试验。
予以说明的是，将使用了第一结合剂、连接分子(小鼠抗HRP抗体)及第二结合剂的反应体系作为实施例6，将使用了第一结合剂、连接分子(兔子抗HRP抗体)及第二结合剂的反应体系作为实施例7，将仅使用了第一结合剂的反应体系作为比较例8，将仅使用了第一结合剂及第二结合剂的反应体系作为比较例9。
试剂的调制
1.第一结合剂的调制
直接使用全分子IgG抗体和过氧化物酶结合于葡聚糖的聚合物试剂(EnVisionDual Link System-HRP，DAKO公司)。具体而言，其为混合将过氧化物酶和抗小鼠IgG(动物种类：山羊)结合于葡聚糖聚合物而成的聚合物试剂(M)、以及将过氧化物酶和抗兔子IgG(动物种类：山羊)结合于葡聚糖聚合物而成的聚合物试剂(R)从而得到的聚合物试剂。
2.连接分子的调制
将小鼠抗HRP抗体(克隆：HP-03)(TFS公司)调制为5μg/mL。
将兔子抗HRP抗体(多克隆)(株式会社日冷生物科学)调制为5μg/mL。
3.第二结合剂的调制
直接使用全分子IgG抗体和过氧化物酶结合于葡聚糖的聚合物试剂(EnVisionDual Link System-HRP，DAKO公司)。
免疫组织化学染色
1.脱蜡、脱过氧化物酶、抗原修复处理
通过与试验例1同样的方法进行。
2.第一抗体或者阴性对照(第一抗体稀释液)的添加、反应
在抖掉多余液体的载玻片上，滴加第一抗体或者第一抗体稀释液，在保湿箱中，在25℃反应30分钟。然后，用PBS清洗3分钟×两次。讨论中使用的组织和目的标志物结合分子(第一抗体)的组合如下。
·胃癌……直接使用抗人p53基因产物单克隆抗体(DO-7)(株式会社日冷生物科学)。
·大肠癌…直接使用抗CDX-2兔子单克隆抗体(株式会社日冷生物科学)。
3.第一结合剂的反应
在抖掉多余液体的载玻片上，滴加EnVision Dual Link System-HRP(DAKO公司)，在保湿箱中，在25℃反应10分钟。然后，用PBS清洗3分钟×两次。予以说明的是，本反应在实施例6、实施例7、比较例8及比较例9中进行。
4.与连接分子的反应
在抖掉多余液体的载玻片上，滴加小鼠抗HRP抗体(实施例6)或者兔子抗HRP抗体(实施例7)，在保湿箱中，在25℃反应10分钟。然后，用PBS清洗3分钟×两次。予以说明的是，本反应仅在实施例6及实施例7中进行。
5.与第二结合剂的反应
在抖掉多余液体的载玻片上，滴加EnVision Dual Link System-HRP(DAKO公司)，在保湿箱中，在25℃反应10分钟。然后，用PBS清洗3分钟×两次。
本反应仅在实施例6、实施例7及比较例9中进行。
6.基质溶液的添加、反应
通过与试验例1同样的方法进行。
7.对比染色，脱水、净化，封入
通过与试验例1同样的方法进行。
结果如图5所示。这里，图5中的照片是使用光学显微镜(奥林巴斯株式会社)、目镜使用10倍、物镜使用4倍拍摄各染色组织的照片。
即使在使用葡聚糖作为载体，使用全分子抗体作为结合分子的情况下，使用第一结合剂、连接分子和第二结合剂的反应体系(实施例6和7)与仅使用第一结合剂的反应体系(比较例8)、以及仅使用第一结合剂及第二结合剂的反应体系(比较例9)相比，检测灵敏度也显著提高。
予以说明的是，阴性对照中没有出现返染。
4-2：全分子抗体及HRP的直接结合体(第一结合剂及第二结合剂)的使用
使用全分子IgG抗体与多聚HRP直接结合的试剂作为第一结合剂及第二结合剂，讨论目的标志物的检测効果。
予以说明的是，以下的实验中，将使用了第一结合剂(抗小鼠抗体和多聚HRP的直接结合体)、连接分子(小鼠抗HRP抗体)及第二结合剂(抗小鼠抗体和多聚HRP的直接结合体)的反应体系作为实施例8(生物学试样：p53胃癌)，将使用了第一结合剂(抗兔子抗体和多聚HRP的直接结合体)、连接分子(兔子抗HRP抗体)及第二结合剂(抗兔子抗体和多聚HRP的直接结合体)的反应体系作为实施例9(生物学试样：CDX-2大肠癌)。另外，将仅使用了第一结合剂(抗小鼠抗体和多聚HRP的直接结合体)及第二结合剂(抗小鼠抗体和多聚HRP的直接结合体)的反应体系作为比较例10(生物学试样：p53胃癌)，将仅使用了第一结合剂(抗兔子抗体和多聚HRP的直接结合体)及第二结合剂(抗兔子抗体和多聚HRP的直接结合体)的反应体系作为比较例11(生物学试样：CDX-2大肠癌)。
试剂的调制
1.第一结合剂的调制
将在全分子IgG抗体上直接标记多聚HRP的试剂(山羊抗小鼠多聚HRP，Pierce公司)稀释10倍。
将在全分子IgG抗体上直接标记多聚HRP的试剂(山羊抗兔子多聚HRP，Pierce公司)稀释10倍。
2.连接分子的调制
将小鼠抗HRP抗体(克隆：HP-03，TFS公司)调制为5μg/mL。
将兔子抗HRP抗体(多克隆)(株式会社日冷生物科学)调制为5μg/mL。
3.第二结合剂的调制
将在全分子IgG抗体上直接标记多聚HRP的试剂(山羊抗小鼠多聚HRP，Pierce公司)稀释10倍。
将在全分子IgG抗体直接标记多聚HRP的试剂(山羊抗兔子多聚HRP，Pierce公司)稀释10倍。
免疫组织化学染色
1.脱蜡、脱过氧化物酶、抗原修复处理
通过与试验例1同样的方法进行。
2.第一抗体或者阴性对照(第一抗体稀释液)的添加、反应
通过与试验例4-1同样的方法进行。
3.与第一结合剂的反应
在抖掉多余液体的载玻片上，滴加山羊抗小鼠多聚HRP(Pierce公司)(实施例8、比较例10)或者山羊抗兔子多聚HRP(Pierce公司)(实施例9、比较例11)，在保湿箱中，在25℃反应10分钟。然后，用PBS清洗3分钟×两次。予以说明的是，本反应在实施例8、实施例9、比较例10及比较例11中进行。
4.与连接分子的反应
在抖掉多余液体的载玻片上，滴加小鼠抗HRP抗体(实施例8)或者兔子抗HRP抗体(实施例9)，在保湿箱中，在25℃反应10分钟。然后，用PBS清洗3分钟×两次。予以说明的是，本反应在实施例8、9中进行。
5.与第二结合剂的反应
在抖掉多余液体的载玻片上，滴加山羊抗小鼠多聚HRP(Pierce公司)(实施例8、比较例10)或者山羊抗兔子多聚HRP(Pierce公司)(实施例9、比较例11)，在保湿箱中，在25℃反应10分钟。然后，用PBS清洗3分钟×两次。予以说明的是，本反应在实施例8、实施例9、比较例10及比较例11中进行。
6.基质溶液的添加、反应
通过与试验例1同样的方法进行。
7.对比染色，脱水、净化，封入
通过与试验例1同样的方法进行。
结果如图6所示。这里，图6中的照片是使用光学显微镜(奥林巴斯株式会社)、目镜使用10倍、物镜使用4倍拍摄各染色组织的照片。
即使在使用全分子抗体和标记物质(多聚HRP)的直接结合体作为第一结合剂及第二结合剂的情况下，使用了第一结合剂、连接分子及第二结合剂的反应体系(实施例8及9)与分别仅使用了第一结合剂及第二结合剂的反应体系(比较例10及11)相比，检测灵敏度也显著提高。
予以说明的是，虽然实施例8及9的阴性对照中发生返染，但主要发生于细胞质中，而在细胞核中几乎不发生。p53和CDX-2是细胞核染色的抗体，因此在评价时，几乎没有受到返染的影响。
4-3：酶微聚物(第一结合剂及第二结合剂)的使用
使用高活性且高密度的酶与抗体结合的酶微聚物(micropolymer)(ImmPRESS通用试剂，抗小鼠/兔子Ig或者ImmPRESS试剂，抗山羊Ig，VECTOR公司)作为第一结合剂及第二结合剂，按照以下的流程，进行染色灵敏度的比较试验。
予以说明的是，将使用了第一结合剂(ImmPRESS通用试剂，抗小鼠/兔子Ig)、连接分子(小鼠抗HRP抗体)及第二结合剂(ImmPRESS通用试剂，抗小鼠/兔子Ig)的反应体系作为实施例10，将使用了第一结合剂(ImmPRESS通用试剂，抗小鼠/兔子Ig)、连接分子(兔子抗HRP抗体)及第二结合剂(ImmPRESS通用试剂，抗小鼠/兔子Ig)的反应体系作为实施例11，将使用了第一结合剂(ImmPRESS通用试剂，抗小鼠/兔子Ig)、连接分子(山羊抗HRP抗体)及第二结合剂(ImmPRESS试剂，抗山羊Ig)的反应体系作为实施例12。
另外，将仅使用了第一结合剂(ImmPRESS通用试剂，抗小鼠/兔子Ig)的反应体系作为比较例12，将仅使用了第一结合剂(ImmPRESS通用试剂，抗小鼠/兔子Ig)及第二结合剂(ImmPRESS通用试剂，抗小鼠/兔子Ig)的反应体系作为比较例13，将仅使用了第一结合剂(ImmPRESS通用试剂，抗小鼠/兔子Ig)及第二结合剂(ImmPRESS试剂，抗山羊Ig)的反应体系作为比较例14。
试剂的调制
1.第一结合剂的调制
直接使用高活性且高密度的酶与抗体结合的酶微聚物(ImmPRESS通用试剂，抗小鼠/兔子Ig，VECTOR公司)。
2.连接分子的调制
将小鼠抗HRP抗体(克隆：HP-03，TFS公司)调制为5μg/mL。
将兔子抗HRP抗体(多克隆)(株式会社日冷生物科学)调制为5μg/mL。
将山羊抗HRP抗体(多克隆)(Pierce公司)调制为5μg/mL。
3.第二结合剂的调制
直接使用高活性且高密度的酶与抗体结合的酶微聚物(ImmPRESS通用试剂，抗小鼠/兔子Ig，VECTOR公司)。
另外，直接使用高活性且高密度的酶与抗体结合的另外的酶微聚物(ImmPRESS试剂，抗山羊Ig，VECTOR公司)。
免疫组织化学染色
1.脱蜡、脱过氧化物酶、抗原修复处理
通过与试验例1同样的方法进行。
2.第一抗体或者阴性对照(第一抗体稀释液)的添加、反应
通过与试验例4-1同样的方法进行。
3.与第一结合剂的反应
在抖掉多余液体的载玻片上，滴加ImmPRESS通用试剂、抗小鼠/兔子Ig(VECTOR公司)，在保湿箱中，在25℃反应10分钟。然后，用PBS清洗3分钟×两次。予以说明的是，本反应在实施例10～12及比较例12～14中进行。
4.与连接分子的反应
在抖掉多余液体的载玻片上，滴加小鼠抗HRP抗体(实施例10)、兔子抗HRP抗体(实施例11)或者山羊抗HRP抗体(实施例12)，在保湿箱中，在25℃反应10分钟。然后，用PBS清洗3分钟×两次。予以说明的是，本反应仅在实施例10～12中进行。
5.与第二结合剂的反应
在抖掉多余液体的载玻片上，滴加ImmPRESS通用试剂、抗小鼠/兔子Ig(VECTOR公司)(实施例10、11、比较例13)，ImmPRESS试剂、抗山羊Ig(VECTOR公司)(实施例12、比较例14)，在保湿箱中，在25℃反应10分钟。然后，用PBS清洗3分钟×两次。予以说明的是，本反应在实施例10～12及比较例13及14中进行。
6.基质溶液的添加、反应
通过与试验例1同样的方法进行。
7.对比染色，脱水、净化，封入
通过与试验例1同样的方法进行。
结果如图7所示。这里，图7中的照片是使用光学显微镜(奥林巴斯株式会社)、目镜使用10倍、物镜使用4倍拍摄各染色组织的照片。
即使在使用高活性且高密度的酶与抗体结合的酶微聚物作为第一结合剂及第二结合剂时，使用了第一结合剂、连接分子及第二结合剂的反应体系(实施例10～12)相比于分别仅使用了第一结合剂的反应体系(比较例12)、以及仅使用第一结合剂及第二结合剂的反应体系(比较例13及14)，检测灵敏度也显著提高。
予以说明的是，实施例10～12的阴性对照中发生返染，但主要发生于细胞质中，而在细胞核中几乎不发生。p53和CDX-2是细胞核染色的抗体，因此在评价时，几乎没有受到返染的影响。
试验例5：第一结合剂及第二结合剂中的聚合物载体的有无和聚合物载体的分子 量的讨论
选择下述表2～5那样的聚合物载体的分子量不同的聚合物试剂、或者不具有聚合物载体的多聚HRP型的试剂作为第一结合剂及第二结合剂。并且，仅使用胃癌组织作为生物学试样，且将目的标志物结合分子(第一抗体：抗人p53基因产物单克隆抗体(DO-7)(株式会社日冷生物科学))稀释2倍使用，除此之外，与试验例2同样地进行试验，比较目的标志物的检测灵敏度。
[表2]
[表3]
[表4]
[表5]
试剂的调制
1.第一结合剂的调制
第一结合剂(聚合物试剂)是按照日本特开2001-181299号公报的段号[0031]～[0040]的记载制造。
具体而言，使聚合物载体的平均分子量分别为2,700、7,500、9,200，除此之外，与试验例1的聚合物试剂(M)同样地制造，调制为5μg/mL。予以说明的是，试验例1中使用的聚合物试剂(M)的聚合物载体的平均分子量为9,200。
另外，关于不具有聚合物载体的多聚HRP型的试剂，将制成Fab’的抗小鼠Ig(动物种类：山羊)上结合多聚HRP的试剂(M)调制为5μg/mL。
2.连接分子的调制
将小鼠抗HRP抗体(克隆：HP-03，TFS公司)调制为5μg/mL。
3.第二结合剂的调制
将上述第一结合剂调制为7.5μg/mL。
其结果如图8所示。这里，图8中的照片是使用光学显微镜(奥林巴斯株式会社)、目镜使用10倍、物镜使用4倍拍摄各染色组织的照片。
使用了连接分子的实施例13～16中，无论第一结合剂及第二结合剂中的分子量的差异如何或者有无聚合物载体(多聚-L-赖氨酸(PLL))，分别与没有使用连接分子的比较例15～22比较，都确认到检测灵敏度的显著提高。予以说明的是，阴性对照中没有出现返染。
试验例6：标记物质的讨论
6-1：使用了标记物质(碱性磷酸酶：AP)、连接分子(小鼠抗AP抗体)的反应体系
对于替代辣根过氧化物酶(HRP)而使用了碱性磷酸酶(AP)作为标记物质、并且使用了连接分子(小鼠抗AP抗体)的反应体系，讨论目的标志物的检测灵敏度。
予以说明的是，以下的试验中，将使用了第一结合剂及第二结合剂(使用碱性磷酸酶(AP)作为标记物质的氨基酸聚合物：AP聚合物试剂(M))和连接分子(小鼠抗AP抗体)的反应体系作为实施例17，将仅使用了第一结合剂(AP聚合物试剂(M))的反应体系作为比较例23，将仅使用了第一结合剂及第二结合剂(AP聚合物试剂(M))的反应体系作为比较例24。
试剂的调制
1.第一结合剂的调制
将碱性磷酸酶(AP)和制成Fab’的抗小鼠Ig(动物种类：山羊)结合于氨基酸聚合物而成的AP聚合物试剂(M)调制为10μg/mL。
2.连接分子的调制
将小鼠抗AP抗体(克隆：AP1B9，NOVUS BIOLOGICALS公司)调制为5μg/mL。
3.第二结合剂的调制
将AP聚合物试剂(M)(株式会社日冷生物科学)调制为10μg/mL。
免疫组织化学染色
1.脱蜡、脱过氧化物酶、抗原修复处理
通过与试验例1同样的方法进行。
2.第一抗体或者阴性对照(第一抗体稀释液)的添加、反应
在抖掉多余液体的载玻片上，滴加第一抗体或者第一抗体稀释液，在保湿箱中，在25℃反应30分钟。然后，用PBS清洗3分钟×两次。讨论中使用的组织和第一抗体的组合如下。
·胃癌……直接使用抗人p53基因产物单克隆抗体(DO-7)(株式会社日冷生物科学)。
3.与第一结合剂的反应
在抖掉多余液体的载玻片上，滴加AP聚合物试剂(M)，在保湿箱中，在25℃反应10分钟。然后，用PBS清洗3分钟×两次。予以说明的是，本反应在实施例17、比较例23及24中进行。
4.与连接分子的反应
在抖掉多余液体的载玻片上，滴加小鼠抗AP抗体，在保湿箱中，在25℃反应10分钟。然后，用PBS清洗3分钟×两次。予以说明的是，本反应仅在实施例17中进行。
5.与第二结合剂的反应
在抖掉多余液体的载玻片上，滴加AP聚合物试剂(M)，在保湿箱中，在25℃反应10分钟。然后，用PBS清洗3分钟×两次。予以说明的是，本反应仅在实施例17及比较例24中进行。
6.基质溶液的添加、反应
在抖掉多余液体的载玻片上，滴加快红II基质试剂盒(株式会社日冷生物科学)，在室温反应10分钟。然后，用流水清洗5分钟。
7.对比染色，脱水、净化，封入
A.对比染色
将水气排出后，在Mayer苏木精溶液中浸渍30秒。然后，用流水清洗5分钟。
B.风干
将水气排出后，使用干燥器进行风干。
C.封入
稍微浸渍于二甲苯，然后，用非水溶性封入剂(株式会社日冷生物科学)进行封入。
结果如图9所示。这里，图9中的照片是使用光学显微镜(奥林巴斯株式会社)、目镜使用10倍、物镜使用4倍拍摄各染色组织的照片。
使用了碱性磷酸酶(AP)作为标记物质时，在使用了第一结合剂、连接分子及第二结合剂的实施例17中，与仅使用了第一结合剂的比较例23、以及仅使用第一结合剂及第二结合剂的比较例24相比，检测灵敏度显著提高。
予以说明的是，阴性对照中没有出现返染。
试验例6-2：使用了标记物质(碱性磷酸酶：AP)、连接分子(兔子抗AP抗体)的反应 体系
对于替代辣根过氧化物酶(HRP)而使用了碱性磷酸酶(AP)作为标记物质、并且使用了连接分子(兔子抗AP抗体)的反应体系，讨论目的标志物的检测灵敏度。
予以说明的是，以下的试验中，将使用了第一结合剂及第二结合剂(使用了碱性磷酸酶(AP)作为标记物质的氨基酸聚合物：AP聚合物试剂(R))和连接分子(兔子抗AP抗体)的反应体系作为实施例18，将仅使用了第一结合剂(AP聚合物试剂(R))的反应体系作为比较例25，将仅使用了第一结合剂及第二结合剂(AP聚合物试剂(R))的反应体系作为比较例26。
试剂的调制
1.第一结合剂的调制
将碱性磷酸酶(AP)和制成Fab’的抗兔子Ig(动物种类：山羊)结合于氨基酸聚合物而成的AP聚合物试剂(R)调制为10μg/mL。
2.连接分子的调制
将兔子抗AP抗体(多克隆，NOVUS BIOLOGICALS公司)调制为5μg/mL。
3.第二结合剂的调制
将AP聚合物试剂(R)调制为10μg/mL。
免疫组织化学染色
1.脱蜡、脱过氧化物酶、抗原修复处理
通过与试验例1同样的方法进行。
2.第一抗体或者阴性对照(第一抗体稀释液)的添加、反应
在抖掉多余液体的载玻片上，滴加第一抗体或者第一抗体稀释液，在保湿箱中，在25℃反应30分钟。然后，用PBS清洗3分钟×两次。讨论中使用的组织和第一抗体的组合如下。
·大肠癌…直接使用抗CDX-2兔子单克隆抗体(株式会社日冷生物科学)。
3.与第一结合剂的反应
在抖掉多余液体的载玻片上，滴加AP聚合物试剂(R)，在保湿箱中，在25℃反应10分钟。然后，用PBS清洗3分钟×两次。予以说明的是，本反应在实施例18及比较例25、26中进行。
4.与连接分子的反应
在抖掉多余液体的载玻片上，滴加兔子抗AP抗体，在保湿箱中，在25℃反应10分钟。然后，用PBS清洗3分钟×两次。予以说明的是，本反应仅在实施例18中进行。
5.与第二结合剂的反应
在抖掉多余液体的载玻片上，滴加AP聚合物试剂(R)，在保湿箱中，在25℃反应10分钟。然后，用PBS清洗3分钟×两次。予以说明的是，本反应仅在实施例18及比较例26中进行。
6.基质溶液的添加、反应
在抖掉多余液体的载玻片上，滴加快红II基质试剂盒(株式会社日冷生物科学)，在室温反应10分钟。然后，用流水清洗5分钟。
7.对比染色，脱水、净化，封入
通过与试验例6-1同样的方法进行。
结果如图10所示。这里，图10中的照片是使用光学显微镜(奥林巴斯株式会社)、目镜使用10倍、物镜使用4倍拍摄各染色组织的照片。
使用碱性磷酸酶(AP)作为标记物质时，在使用了第一结合剂、连接分子及第二结合剂的实施例18中，与仅使用第一结合剂的比较例25、以及仅使用第一结合剂及第二结合剂的比较例26相比，检测灵敏度显著提高。
予以说明的是，阴性对照中没有出现返染。
试验例7：CISH法中的高灵敏度染色法的讨论
本试验中，按照以下的流程，讨论本发明能否应用于CISH法(色素原位杂交：使用3,3’-二氨基联苯胺(DAB)等色素在组织标本上检测DNA及mRNA的原位杂交(ISH))。将地高辛(DIG)标记的探针作为目的标志物结合分子应用于组织标本，封闭后，使用能与DIG直接结合的检测试剂进行探针的检测。
本试验中，作为目的标志物结合分子，使用了HER2探针。
并且，实施例19中，选择了使用第一结合剂(山羊抗DIG-HRP聚合物试剂(株式会社日冷生物科学))、连接分子(兔子抗HRP抗体(多克隆)(株式会社日冷生物科学))及第二结合剂(Histofine(注册商标)Simple Stain(注册商标)MAX-PO(R)，(株式会社日冷生物科学))作为检测试剂的反应体系。
另外，比较例27中，选择了仅使用第一结合剂(山羊抗DIG-HRP聚合物试剂)作为检测试剂的反应体系。进一步，比较例28中，选择了使用第一结合剂(山羊抗DIG抗体)及第二结合剂(Histofine(注册商标)Simple Stain(注册商标)MAX-PO(G)(株式会社日冷生物科学))作为检测试剂的反应体系。
CISH
1.脱蜡，脱过氧化物酶，抗原修复处理，脱水、风干
A.标本载玻片的准备
将组织切片切成5μm的薄片，附着至涂有MAS的载玻片。然后，37℃的孵育箱内干燥一晚。
B.脱蜡，脱过氧化物酶，抗原修复处理，脱水、风干
(I)二甲苯处理(3分钟×三次)
将载玻片在二甲苯中浸渍3分钟。然后，抖掉多余的液体，在另外的二甲苯中浸渍3分钟。然后，抖掉多余的液体，进一步在另外的二甲苯中浸渍3分钟。
(II)乙醇处理(3分钟×四次)
在100％乙醇中浸渍3分钟。抖掉多余的液体，在另外的100％乙醇中浸渍3分钟。将该操作再进行两次。
(III)脱过氧化物酶
除去内源性过氧化物酶。将水气排出后，将载玻片在3V/V％过氧化氢溶液中浸渍5分钟。
(IV)清洗
用PBS清洗(每次1分钟，进行两次)。
(V)抗原修复处理
作为前处理，使用抗原修复液(10mM柠檬酸钠缓冲液(pH6.0)，在98℃加热处理30分钟。
(VI)清洗
用PBS清洗(每次2分钟，进行两次)。
(VII)抗原修复处理
在保湿箱中，在室温进行蛋白酶处理3分钟。
(VIII)清洗
用PBS清洗。
(IX)脱水
将载玻片在70％乙醇、90％乙醇、100％乙醇中分别浸渍1分钟后，风干。
变性及杂交
(I)对HER2探针进行涡旋(Vortex)，置于载玻片。
(II)在避免气泡的情况下，放置盖玻片，并将周围用纸质粘结带密封。
(III)使用热板，在82℃变性5分钟。
(IV)将载玻片移至保湿箱中，在37℃杂交过夜。
后杂交及检测
(I)小心地剥掉纸质粘结带，然后在2×SSC中室温清洗5分钟，移除盖玻片。
(II)在2×SSC中，在72℃清洗5分钟。
(III)在PBS中清洗1分钟，进行两次。
(IV)如下述表6所示，对于实施例19、比较例27及28进行反应。这里，反应全部在25℃实施。各个工序之间进行使用PBS的1分钟清洗，进行三次。
[表6]
(V)用PBS清洗1分钟，进行三次，然后将PBS去除干净。
(VI)在抖掉多余液体的载玻片上，滴加N-Histofine(注册商标)DAB-2V(株式会社日冷生物科学)，在室温反应5分钟。
(VII)用流水清洗5分钟。
(VIII)将水气排出后，在Mayer苏木精溶液中浸渍15秒，进行对比染色。
(IX)用流水清洗5分钟。
(X)排出水气，用100％乙醇脱水3分钟。
(XI)利用二甲苯净化5分钟，进行两次。
(XII)使用非水溶性封入剂(株式会社日冷生物科学)进行封入。
关于CISH的染色强度，使用光学显微镜(奥林巴斯株式会社)(以目镜10倍、物镜100倍观察。)，通过目视观察，将比较例27的信号作为1+而判断，结果，如下述表7所示。实施例19中，与比较例27及比较例28相比，检测灵敏度显著提高。
[表7]
比较例27 比较例28 实施例19
信号 1+ 1.5+ 3+
返染 无 无 无
试验例8：免疫反应的增强的讨论
聚乙二醇的使用
讨论当本发明的三个阶段的免疫反应均在聚乙二醇共存的条件下实施时，目的标志物的检测灵敏度如何变化，进行比较试验。
具体而言，实施例20中，在不使聚乙二醇共存的情况下使用第一结合剂、连接分子及第二结合剂进行三个阶段的免疫反应。
实施例21中，在聚乙二醇及第一结合剂共存的条件下进行第一阶段的免疫反应，接着使用连接分子及第二结合剂分别进行第二阶段及第三阶段的免疫反应。
实施例23中，使用第一结合剂进行第一阶段的免疫反应，在聚乙二醇及连接分子共存的条件下进行第二阶段的免疫反应，接着使用第二结合剂进行第三阶段的免疫反应。
实施例22中，使用第一结合剂进行第一阶段的免疫反应，使用连接分子进行第二阶段的免疫反应，接着在聚乙二醇及第二结合剂共存的条件下进行第三阶段的免疫反应。
实施例24中，使用了第一结合剂、连接分子及第二结合剂的三个阶段的免疫反应全部在聚乙二醇共存的条件下进行。
予以说明的是，关于具体的流程，仅使用大肠癌组织作为生物学试样、并且将目的标志物结合分子(第一抗体：抗CDX-2兔子单克隆抗体(株式会社日冷生物科学))稀释5倍而使用，除此之外按照试验例2来实施。
试剂的调制
1.第一结合剂的调制
混合将过氧化物酶和制成Fab’的抗小鼠Ig(动物种类：山羊)结合于氨基酸聚合物而成的聚合物试剂(M)、以及将过氧化物酶和制成Fab’的抗兔子Ig(动物种类：山羊)结合于氨基酸聚合物而成的聚合物试剂(R)各5μg/mL，调制混合式聚合物试剂(MULTI)。
2.连接分子的调制
混合小鼠抗HRP抗体(克隆：HP-03)(TFS公司)及小鼠抗HRP抗体(克隆：2H11)(Novus Biologicals公司)各2.5μg/mL，进行调制。
3.第二结合剂的调制
将过氧化物酶和制成Fab’的抗小鼠Ig(动物种类：山羊)结合于氨基酸聚合物而成的聚合物试剂(M)调制为5μg/mL。
4.聚乙二醇
实施例21～24中，对于构成第一结合剂、连接分子及第二结合剂的水溶液中的任一者中，以2.5wt％溶解聚乙二醇(平均分子量(MW)：8,000，和光纯药工业株式会社)。
结果如图11所示。这里，图11中的照片是使用光学显微镜(奥林巴斯株式会社)、目镜使用10倍、物镜使用4倍拍摄各染色组织的照片。
任一个免疫反应中使聚乙二醇共存的实施例21～24的检测灵敏度相比于任一个免疫反应中都不使聚乙二醇共存的实施例20有所提高。特别是，在全部阶段(第一阶段～第三阶段)使聚乙二醇共存的实施例24的检测灵敏度相比于实施例20显著提高。

Claims (14)

1.一种用于与目的标志物结合分子并用而检测生物学试样中的目的标志物的组合产品，所述目的标志物结合分子能够与目的标志物特异性结合，所述组合产品至少包含：
(a)第一结合剂，包含能够与所述目的标志物结合分子直接或间接地特异性结合的第一结合分子、和标记物质，
(b)连接分子，以及
(c)第二结合剂，包含能够与所述连接分子特异性结合的抗体或作为其抗原结合片段的第二结合分子和标记物质，
所述连接分子为能够与所述第一结合剂和第二结合剂中的标记物质特异性结合且能够与第一结合剂和第二结合剂特异性结合的抗体或其抗原结合片段，并且被第二结合剂中的第二结合分子特异性结合，
连接分子与第二结合剂的结合部位的种类至少有通过第二结合分子的结合部位和通过标记物质的结合部位这两种。
2.根据权利要求1所述的组合产品，其中，标记物质为选自化学发光标记、金属粒子、荧光标记、酶标记、辅酶标记、经标记的抗体、色素、生物发光标记、半抗原和聚合物粒子中的至少一种以上。
3.根据权利要求1或2所述的组合产品，其中，所述第一结合剂为所述第一结合分子与所述标记物质直接地、或通过载体间接地连接而成的结构体。
4.根据权利要求1或2所述的组合产品，其中，所述第二结合剂为所述第二结合分子与所述标记物质直接地、或者通过载体间接地连接而成的结构体。
5.根据权利要求1或2所述的组合产品，其中，所述第一结合分子为抗体或其抗原结合片段。
6.根据权利要求1或2所述的组合产品，其进一步与所述目的标志物结合分子组合而成。
7.根据权利要求1或2所述的组合产品，其为试剂盒的形式。
8.一种检测从被测物获得的生物学试样中的目的标志物的方法，包括：
(i)使预先与目的标志物特异性结合而成的目的标志物结合分子和第一结合剂接触而得到第一复合体的工序；
(ii)使该第一复合体和连接分子接触而得到第二复合体的工序；以及
(iii)使该第二复合体和第二结合剂接触而得到第三复合体的工序；
所述第一结合剂包含能够与所述目的标志物结合分子直接或间接地特异性结合的第一结合分子、和标记物质，
所述第二结合剂包含能够与所述连接分子特异性结合的抗体或作为其抗原结合片段的第二结合分子和标记物质，
所述连接分子为能够与所述第一结合剂和第二结合剂中的标记物质特异性结合且能够与第一结合剂和第二结合剂特异性结合的抗体或其抗原结合片段，并且被第二结合剂中的第二结合分子特异性结合，
连接分子与第二结合剂的结合部位的种类至少有通过第二结合分子的结合部位和通过标记物质的结合部位这两种。
9.根据权利要求8所述的方法，其进一步包括检测所述第三复合体中的标记物质的工序。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其中，所述标记物质为选自化学发光标记、金属粒子、荧光标记、酶标记、辅酶标记、经标记的抗体、色素、生物发光标记、半抗原和聚合物粒子中的至少一种以上的标记物质。
11.根据权利要求8或9所述的方法，其中，所述第一结合剂为第一结合分子与所述标记物质直接地、或者通过载体间接地连接而成的结构体。
12.根据权利要求8或9所述的方法，其中，所述第二结合剂为第二结合分子与所述标记物质直接地、或者通过载体间接地连接而成的结构体。
13.根据权利要求8或9所述的方法，其中，所述第一结合分子为抗体或其抗原结合片段。
14.一种用于与目的标志物结合分子并用而检测生物学试样中的目的标志物的组合产品的用途，所述目的标志物结合分子能够与目的标志物特异性结合，所述组合产品至少包含：
(a)第一结合剂，包含能够与所述目的标志物结合分子直接或间接地特异性结合的第一结合分子、和标记物质，
(b)连接分子，以及
(c)第二结合剂，包含能够与所述连接分子特异性结合的抗体或作为其抗原结合片段的第二结合分子和标记物质，
所述连接分子为能够与所述第一结合剂和第二结合剂中的标记物质特异性结合且能够与第一结合剂和第二结合剂特异性结合的抗体或其抗原结合片段，并且被第二结合剂中的第二结合分子特异性结合，
连接分子与第二结合剂的结合部位的种类至少有通过第二结合分子的结合部位和通过标记物质的结合部位这两种。
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