KR102190207B1 - 표적 마커 검출용 조합물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 표적 마커를 간편하고 고감도로 검출하기 위한 조합물에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 표적 마커와 특이적으로 결합 가능한 표적 마커 결합 분자와 결합하여 생물학적 시료 중에서 표적 마커를 검출하기 위한 조합물로서
(a) 상기 표적 마커 결합 분자와 직접 또는 간접적으로 특이적으로 결합 가능한 제1 결합 분자와 표지 물질을 포함하는 제1 결합제;
(b) 상기 제1 결합제와 특이적으로 결합 가능한 링커 분자; 및
(c) 상기 링커 분자와 특이적으로 결합할 수있는 제2 결합제이며, 제2 결합 분자와 표지 물질을 포함하는 제2 결합제를 적어도 포함하는 조합물에 관한 것이다.

Description

표적 마커 검출용 조합물{COMBINATION FOR TARGET MARKER DETECTION}
관련 출원의 참조
본 특허 출원은 2014 년 4 월 23 일에 출원된 일본 특허 출원 2014-89675 호에 의한 우선권 주장을 수반하는 것이며, 이러한 앞선 특허출원의 전체 개시 내용은 인용하는 것에 의해 본 명세서의 일부가 된다.
본 발명은 표적 마커를 검출하기 위한 조합물 및 이를 이용한 검출 방법에 관한 것이다.
최근 면역 화학의 발전으로 항원 항체 반응을 이용하여 미량의 물질을 감도 좋게 검출하는 면역 측정법이 널리 이용되고 있다. 면역 측정법 중에서 일반적인 것으로, 면역 염색법 등을 들 수 있다.
면역 염색법은 세포 또는 조직 절편에서 특정 물질을 인식하는 항체 등을 이용하여 검출하는 방법이다. 그 면역 염색법 중 검출 가능한 물질이 효소인 경우에는 효소 항체법으로 불린다. 효소 항체법으로는 일차 항체를 시각화할 수 있는 효소로 표지한 것을 이용하는 직접법이나 일차 항체를 표지(標識)하지 않고 이차 항체를 표지하는 간접법 등의 방법이 개발되어 왔다.
또한 최근에는, 조직 ㆍ 세포 내에 분포하는 소량의 항원 단백질의 시각화 또는 포르말린 고정파라핀 포매(包埋) 처리에 의해 항원성이 현저하게 저하된 항원 물질의 증명을 위해 더욱 고감도가 요구되고, 효소 항체법의 변형 방법법인 각종 증감법들이 속속 개발되고 있다. 그 증감법으로서 감도가 낮은 순서대로 직접법 < 간접법 < PAP (퍼옥시아다제 항 퍼옥시다아제, peroxidase anti-peroxidase) 법 < ABC (아비딘-비오틴-퍼옥시다아제 복합체, avidin-biotin-peroxidase complex) 법 < LSAB (표지된 스트렙타비딘 바이오틴, labeled streptavidin biotin) 법 < 폴리머법 < CSA (촉매화된 신호 증감, catalyzed signal amplification) 법 등이 있다. (비-특허 문헌 1)
상기 증감법 중에서 현재 고감도에서 간편한 방법으로 가장 널리 사용되는 방법은 폴리머법이다.
기존 폴리머법의 하나로서, 항원 등의 표적 마커에 대해 일차 항체를 반응시킨 후, 폴리머 시약 (수많은 효소와 이차 항체가 폴리머에 결합되어 있음)을 반응 생성물과 반응시킴으로써 항원ㆍ일차 항체ㆍ이차 항체ㆍ폴리머ㆍ효소 복합체를 형성시키는 방법이 있다. 이 복합체 중의 효소 활성을 이용하여 기질을 발색하여 표적 마커를 시각화할 수 있다. (비-특허 문헌 1)
또한, 다른 폴리머법으로서, 상기의 종래 폴리머법에 있어서 일차 항체와 폴리머 시약 사이에 브리지 시약 (그 외에 제조업체에 따라 링커, 프로브 또는 포스트프라이머리 등 다양하게 명명됨)을 반응시켜 신호 증감을 하는 방법이 있다. 그 결과, 이 방법은 상기 방법보다 2 - 5 배 높은 감도를 기대할 수 있는 것으로 알려져 있다 (비-특허 문헌 1).
최근, 더욱 새로운 폴리머법으로서, 상기 폴리머 시약 (제 1 폴리머 시약)에 대해 추가로 폴리머 시약 (제 2 폴리머 시약)을 반응시킴으로써 신호 증감을 하는 방법도 개발되었다 (특허 문헌 1).
특허문헌 1: 특표2007-513334호 공보
비특허문헌 1: 신고 카모시다, 기초부터 면역염색술-어떻게 확실하게 염색을 하나 - 조직세포화학 2012, 일본조직세포화학회편, 2012, p.11-25
그러나 기존의 폴리머법을 사용하더라도 표적 마커가 극히 미소하거나 항원성을 저하하는 등의 이유로 원하는 수준의 염색을 얻지 못할 수 있다. 이러한 기술 상황 하에서, 간편하게 보다 고감도로 표적 마커를 검출하는 수단이 여전히 요구되고 있다.
본 발명은 생물학적 시료에서 발현하는 표적 마커를 간편하게 고감도로 검출하는 것을 목적으로 하고 있다.
본 발명자들은 이번에 표지 물질로 표지된 복수의 결합제와 특정 링커 분자와 결합하여 표적 마커의 검출에 이용했을 때, 표적 마커를 간편하게 하고 현저한 고감도로 검출될 수 있는 것을 발견했다. 본 발명은 이러한 발견에 근거한 것이다.
본 발명은 다음의 발명을 포함한다.
[1] 생물학적 시료 중에서 표적 마커와 특이적으로 결합 가능한 표적 마커 결합 분자와 결합하여 표적 마커를 검출하기 위한 조합물로서:
　　(a) 상기 표적 마커 결합 분자와 직접 또는 간접적으로 특이적으로 결합 가능한 제1 결합 분자와 표지 물질을 포함하는 제1 결합제,
　　(b) 상기 제1 결합제와 특이적으로 결합 가능한 링커 분자, 및
　　(c) 상기 링커 분자에 특이적으로 결합할 수 있는 제2 결합제이며, 제2 결합 분자와 표지 물질을 포함하는 제2 결합제
를 적어도 포함하는 조합물.
[2] 상기 링커 분자가 상기 표지 물질에 특이적으로 결합 가능한, [1]에 기재된 조합물.
[3] 상기 링커 분자가 항체 또는 그의 항원 결합 단편인, [1] 또는 [2]에 기재된 조합물.
[4] 표지 물질이 화학 발광 표지, 금속 입자, 형광 표지, 효소 표지, 보조 효소 표지, 표지된 항체, 색소, 생물 발광 표지, 햅텐 및 폴리머 입자
로부터 선택되는 적어도 1 종 이상인, [1] ~ [3] 중 어느 하나에 기재된 조합물.
[5] 상기 제1 결합제가 상기 제1 결합 분자와 상기 표지 물질이 직접적으로 또는 담체를 통해서 간접적으로 연결된 구조체인, [1] ~ [4] 중 어느 하나에 기재된 조합물.
[6] 상기 제2 결합제는 상기 제2 결합 분자와 상기 표지 물질이 직접적으로 또는 담체를 통해서 간접적으로 연결된 구조체인, [1] ~ [5] 중 어느 하나에 기재된 조합물.
[7] 상기 제1 결합 분자는 항체 또는 그 항원 결합 단편인, [1] ~ [6] 중 어느 하나에 기재된 조합물.
[8] 상기 제2 결합 분자는 항체 또는 그 항원 결합 단편인, [1] ~ [7] 중 어느 하나에 기재된 조합물.
[9] 상기 표적 마커 결합 분자와 더욱 결합된, [1] ~ [8] 중 어느 하나에 기재된 조합물.
[10] 키트의 형태인, [1] ~ [9] 중 어느 하나에 기재된 조합물.
[11] 피험체로부터 얻어진 생물학적 시료 중에서 표적 마커를 검출하는 방법으로서,
　　(i) 미리 표적 마커와 특이적으로 결합된 표적 마커 결합 분자와 제1 결합제를 접촉시켜 제1 복합체를 얻는 단계;
　　(ii) 상기 제1 복합체와 링커 분자를 접촉시켜 제2 복합체를 얻는 단계; 및
　　(iii) 상기 제2 복합체와 제2 결합제와 접촉시켜 제3 복합체를 얻는 단계를 포함하고,
　　상기 제1 결합제는 상기 표적 마커 결합 분자와 직접 또는 간접적으로 특이적으로 결합 가능한 제1 결합 분자와 표지 물질을 포함하고;
　　상기 링커 분자가 상기 제1 결합제와 특이적으로 결합할 수 있고; 및
　　상기 제2 결합제는 상기 링커 분자와 특이적으로 결합 가능하며, 제2 결합 분자 및 표지 물질을 포함하는, 방법.
[12] 상기 제3 복합체 중에서 표지 물질을 검출하는 단계를 더 포함하는, [11]에 기재된 방법.
[13] 상기 링커 분자가 항체 또는 그의 항원 결합 단편인, [11] 또는 [12]에 기재된 방법.
[14] 상기 링커 분자가 상기 표지 물질에 특이적으로 결합할 수 있는, [11] ~ [13] 중 어느 하나에 기재된 방법.
[15] 상기 표지 물질이 화학 발광 표지, 금속 입자, 형광 표지, 효소 표지, 보조 효소 표지, 표지된 항체, 색소, 생물 발광 표지, 햅텐 및 폴리머 입자로부터 선택되는 적어도 1 종 이상의 표지 물질인, [11] ~ [14] 중 어느 하나에 기재된 방법.
[16] 상기 제1 결합제가 제1 결합 분자와 상기 표지 물질이 직접적으로 또는 담체를 통해 간접적으로 연결된 구조체인, [11] ~ [15] 중 어느 하나에 기재된 방법.
[17] 상기 제2 결합제가 제2 결합 분자와 상기 표지 물질이 직접적으로 또는 담체를 통해 간접적으로 연결된 구조체인, [11] ~ [16] 중 어느 하나에 기재된 방법.
[18] 상기 제1 결합 분자는 항체 또는 그 항원 결합 단편인, [11] ~ [17] 중 하나에 기재된 방법.
[19] 상기 제2 결합 분자는 항체 또는 그 항원 결합 단편인, [11] ~ [18] 중 하나에 기재된 방법.
[20] 표적 마커와 특이적으로 결합 가능한 표적 마커 결합 분자와 결합하여 생물학적 시료 중에서 표적 마커를 검출하기 위한 조합물의 사용으로서,
　　(a) 상기 표적 마커 결합 분자와 직접 또는 간접적으로 특이적으로 결합 가능한 제1 결합 분자와 표지 물질을 포함하는 제1 결합제;
　　(b) 상기 제1 결합제와 특이적으로 결합 가능한 링커 분자; 및
　　(c) 제2 결합 분자와 표지 물질을 포함하고, 상기 링커 분자와 특이 적으로 결합할 수 있는 제2 결합제,
를 적어도 포함하며, 상기 링커 분자가 표지 물질에 특이적으로 결합 가능한 용도.
본 발명에 의하면, 표적 마커를 간편하게 하고 현저한 고감도로 검출할 수 있다.
도 1은 본 발명의 표적 마커 검출 방법에 대한 모식도이다.
도 2는 시험예 1(비교예 1, 2)에서 면역 조직 화학 염색의 결과를 나타내는 사진이다.
도 3은 시험예 2(실시예 1, 2 및 비교예 3, 4)에서 면역 조직 화학 염색의 결과를 나타내는 사진이다.
도 4는 시험예 3(실시예 3-5 및 비교예 5-7)에서 면역 조직 화학 염색의 결과를 나타내는 사진이다.
도 5는 시험예 4: 4-1(실시예 6, 7 및 비교예 8, 9)에서 면역 조직 화학 염색의 결과를 나타내는 사진이다.
도 6은 시험예 4: 4-2 (실시예 8, 비교예 10, 11)에서 면역 조직 화학 염색의 결과를 나타내는 사진이다.
도 7은 시험예 4: 4-3 (실시예 10-12, 비교예 12-14)에서 면역 조직 화학 염색의 결과를 나타내는 사진이다.
도 8은 시험예 5(실시예 13-16, 비교예 15-22)에서 면역 조직 화학 염색의 결과를 나타내는 사진이다.
도 9는 시험예 6: 6-1 (실시예 17, 비교예 23, 24)에서 면역 조직 화학 염색의 결과를 나타내는 사진이다.
도 10은 시험예 6: 6-2 (실시예 18, 비교예 25, 26)에서 면역 조직 화학 염색의 결과를 나타내는 사진이다.
도 11은 시험예 7: 폴리에틸렌글리콜의 비존재하에서 실시한 실시예 20 및 폴리에틸렌 글리콜의 존재 하에서 실시한 실시예 21-24의 면역 조직 화학 염색의 결과를 나타낸 사진이다.
조합물
　본 발명의 조합물은 표적 마커와 특이적으로 결합 가능한 표적 마커 결합 분자와 결합하여 생물학적 시료 중의 표적 마커를 검출하기 위한 조합물로서,
　　(a) 상기 표적 마커 결합 분자와 직접 또는 간접적으로 특이적으로 결합 가능한 제1 결합 분자와 표지 물질을 포함하는 제1 결합제;
　　(b) 상기 제1 결합제와 특이적으로 결합 가능한 링커 분자; 및
　　(c) 제2 결합 분자와 표지 물질을 포함하는 상기 링커 분자와 특이 적으로 결합할 수 있는 제2 결합제;
를 적어도 포함하는 것을 특징으로 한다.
이하, 본 발명을 특별히 한정하는 것은 아니지만, 본 발명의 조합물을 이용한 검출 방법의 하나의 구현예를 도 1에 따라 설명한다.
도 1은 생물학적 시료 (1) 위에 검출 대상의 표적 마커 (2)가 발현하고 있다. 이 표적 마커 (2)를 포착하기 위해 표적 마커 (2)에 표적 마커 결합 분자 (3)를 미리 특이적으로 결합시킨다.
다음, 표적 마커 (2)를 검출하기 위한 시약으로 제1 결합제 (4), 링커 분자 (5) 및 제2 결합제 (6)를 준비한다.
여기에서, 제1 결합제 (4)는 표적 마커 결합 분자 (3)와 직접 또는 간접적으로 특이적으로 결합 가능한 제1 결합 분자 (7), 표지 물질 (8) 및 담체 (9) (폴리머 등)로 구성되어 있다.
또한, 제2 결합제 (6)는 링커 분자 (5)에 특이적으로 결합할 수 있는 구조이다. 도 1은 제2 결합제 (6)는 링커 분자 (5)에 특이적으로 결합할 수 있는 제2 결합 분자 (10), 표지 물질 (8') 및 담체 (9') (폴리머 등)로 구성되어 있다.
또한, 링커 분자 (5)는 표지 물질 (8), 제2 결합 분자 (10)와 표지 물질 (8')에 특이적으로 결합 가능한 적어도 세 가지 결합 부위를 포함한다.
도 1은 상술한 바와 같이 미리 준비한 검출용 시약의 조합을 사용하여 다음의 제 1 공정 - 제 3 공정을 통해 표적 마커를 검출할 수 있다.
제 1 공정에서는 표적 마커 (2)와 결합된 표적 마커 결합 분자 (3)는 제1 결합제 (4)와 접촉시켜 제1 복합체 (1-4)를 얻는다.
다음, 제 2 공정에서는 제1 복합체 (1-4)와 링커 분자 (5)를 접촉시켜 제2 복합체 (1 - 5)를 얻는다.
다음, 제 3 공정에서는 제2 복합체 (1-5)와 제2 결합제 (6)를 접촉시켜 제3 복합체 (1-6)을 얻는다. 여기서, 링커 분자 (5)와 제2 결합제 (6)는 즉, 제2 결합 분자 (10)와 표지 물질 (8')인 적어도 2종류의 결합 부위를 통해 안정적으로 결합된다.
상기 제 1-3 공정에 의해, 표적 마커 (2)는 표지 물질 (8) 및 표지 물질 (8') 모두에 의해 표지되고 높은 감도로 검출될 수 있다.
생물학적 시료
본 발명의 생물학적 시료는 임의의 피험체, 예를 들어 동물 (바람직하게는 포유 동물이며, 보다 바람직하게는 인간), 식물 또는 세균에서 유래하는 시료와 관련있다. 상기 생물학적 시료는 진핵 또는 원핵 생물 세포로 이루어진 것이어도 좋고, 또는 조직 또는 세포로 이루어진 것이어도 좋다.
표적 마커
본 발명의 생물학적 시료에서 표적 마커는 생물학적 시료에 존재하는 임의의 분자를 말한다. 상기 표적 마커는 단백질 및 그 단백질 단편, 펩타이드, 핵산, 지질, 당지질, 당, 다당 및 전분 등을 포함한다. 여기에서 단백질은 당 단백질, 지방 단백질, 인 단백질 및 메틸화 단백질 등의 개질된 단백질을 포함하고, 핵산은 DNA 나 RNA를 포함한다. 또한, 상기 표적 마커는 막 결합 등 생물학적 시료의 표면에 발현할 수 있는 것이어도 좋고, 생물학적 시료의 내부 예를 들어, 세포막내, 세포질내 또는 핵내에 포함된 것이어도 좋다.
표적 마커 결합 분자
본 발명의 표적 마커 결합 분자는 생물학적 시료 중에서 표적 마커와 특이 적으로 결합 가능하면 특별히 한정되지 않고, 예를 들면, 항체 또는 그의 단편 (항원-결합 단편을 포함), DNA, RNA, 펩타이드 핵산 (PNA) 등의 핵산 프로브 리간드 또는 수용체가 포함된다.
제1 결합제
본 발명의 제1 결합제는 표적 마커 결합 분자와 직접 또는 간접적으로 특이 적으로 결합 가능한 제1 결합 분자와 표지 물질을 포함한다. 본 발명의 제1 결합 분자와 표지 물질로는 본 발명의 효과를 방해하지 않는한 임의의 부위에 직접적으로 결합될 수 있다. 또한, 본 발명의 제1 결합 분자와 표지 물질은 함께 담체를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 제1 결합제는 햅텐 표지를 포함할 수 있다.
제1 결합 분자
제1 결합 분자는 표적 마커 결합 분자와 직접 또는 간접적으로 특이적으로 결합이 가능하다면 한정되지 않지만, 예를 들면, 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 바람직하다. 여기에서, 항체는 임의의 동종형, 즉 IgG, IgM, IgA, IgD 또는 IgE 일 수 있다. 또한, 항체 단편으로는 예를 들면 항원 결합 단편, 바람직하게는 Fab, Fab', (Fab')2, Fv, scFv, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디 또는 단일 도메인 항체 등을 들 수 있다.
또한, 제1 결합 분자가 표적 마커 결합 분자와 "간접적으로" 특이적으로 결합한다는 것은 표적 마커 결합 분자와 제1 결합 분자 사이에 브리지 시약 등의 분자를 삽입시켜 제1 결합 분자가 해당 브리지 시약 등의 분자에 특이적으로 결합 할 수 있다는 것을 의미한다. 브리지 시약으로는 본 발명의 효과가 방해받지 않는한 특별히 한정되지 않지만, 항체, Fab, Fab', (Fab')2, Fv 또는 scFv 등의 항원 결합 단편을 들 수 있다. 상기 브리지 시약은 햅텐 표지와 형광 표지를 더욱 포함할 수 있다.
제1 결합제의 표지 물질
본 발명의 제1 결합제의 표지 물질은 본 발명의 효과가 방해받지 않는한 특별히 한정되지 않고, 그 예로 화학 발광 표지, 금속 입자, 형광 표지, 효소 표지, 보조 효소 표지, 표지된 항체, 색소, 생물 발광 표지, 햅텐 및 폴리머 입자를 들 수 있다. 또한, 상기 표지 물질은 효소 항체법에서 사용할 수 있는 효소로 표지가 되는 것이 바람직하고, 그러한 효소로는, 예를 들어 호스래디시 퍼옥시다아제 (HRP), 알칼린 포스파타아제 (AP), β-갈락토시다아제 (GAL), 글루코스-6-인산 탈수소효소, β-N-아세틸글루코사미니다아제, β-글루쿠로니다아제, 인베르타아제, 잔틴산화효소, 파이어플라이 루시퍼레이즈, 및 글루코스 산화효소 (GO) 등을 들 수 있다.
또한, 표지 물질로 효소를 이용하는 경우, 그 기질로는 상기 표지 물질과 반응하여 발색하는 물질이면 한정되지 않는다. 호스래디시 퍼옥시다아제에 일반적으로 사용되는 기질의 예로는 3,3'-디아미노벤지딘 (DAB), 니켈로 증강되는 디아미노벤지딘, 3-아미노-9-에틸카바졸 (AEC), 벤지딘 이염산염 (BDHC), 한커-예이츠(Hanker-Yates) 시약 (HYR), 요도판 블루 (IB), 테트라메틸벤지딘 (TMB), 4-클로로-1-나프톨 (CN), α-나프톨 피로민 (α-NP), o-디아니시딘 (OD), 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴포스페이트 (BCIP), 니트로 블루 테트라졸륨 (NBT), 2-(p-요도페닐)-3-p-니트로페닐-5-페닐테트라졸륨 클로라이드 (INT), 테트라니트로 블루 테트라졸륨 (TNBT) 및 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-갈락토시드/페로-페리시아니드 (BCIG/FF) 등을 들 수 있다.
또한 알칼리포스파타제에 일반적으로 사용되는 기질의 예로는 나프톨-AS-B1- 포스페이트/패스트 레드 TR (NABP/FR), 나프톨-AS-MX-포스페이트/패스트 레드 TR (NAMB/FR), 나프톨-AS-B1-포스페이트/패스트 레드 TR (NABP/FR), 나프톨-AS-MX-포스페이트/패스트 레드 TR (NAMP/FR), 나프톨-AS-B1-포스페이트/뉴 푸크신 (NABP/NF) , 브로모클로로인돌릴 포스페이트/니트로 블루 테트라졸륨 (BCIP/NBT), 및 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-b-d-갈락토피라노시드 (BCIG) 등을 들 수 있다.
제1 결합제의 담체
또한, 제1 결합제의 담체는 본 발명의 효과가 방해받지 않는한 특별히 한정되지 않지만, 천연 또는 합성 유래의 폴리머가 바람직하다. 또한, 본 발명의 폴리머의 분자량은 본 발명의 효과가 방해받지 않는한 특별히 한정되는 것은 아니지만, 바람직한 일례로는, 평균 분자량 (Mw) 2,000 내지 500,000의 범위로 정의될 수 있다. 그러한 평균 분자량은 예를 들어, 해당 폴리머의 표준품을 지표로 사용하여 겔 여과 (GPC)에 의해 결정될 수 있다. 그러나 상기 분자량의 범위는 일단 기준을 나타낸 것으로서, 본 발명의 목적이 달성되는 것이면 상기 범위보다 크거나 작은 분자량의 것이라도 사용될 수 있다. 그러한 폴리머의 바람직한 예로는 폴리아미노산, 단백질, 폴리뉴클레오티드, 다당류 또는 유기 합성 폴리머 등을 들 수 있다. 또한, 본 발명의 담체는 면역 측정의 감도를 높이려면 다수의 표지 물질을 담체에 결합시키는 것이 바람직하다.
본 발명의 폴리아미노산은 예를 들어, 결합성을 갖는 적어도 2개 이상의 다수 아미노기를 함유하는 펩티드가 이용될 수 있다. 폴리아미노산의 예로는, 리신, 아르기닌, 오르니틴, 글루타민 또는 각종 염기성 아민산 등의 α-아미노기, ε- 아미노기 또는 그 이외의 아미노기를 포함하는 폴리아미노산을 포함한다. 또한, 폴리아미노산의 구체적인 예로는, ε-아미노기를 갖는 리신의 폴리머인 폴리리신, 리신 외에 다른 아미노산을 갖는 각종 폴리아미노산을 들 수 있다. 후자의 펩티드 폴리머의 예로는 리신과 글리신의 랜덤 코폴리머, 리신과 세린의 랜덤 코 폴리머, 및 리신과 글루탐산의 랜덤 코폴리머, 및 다양한 분지량을 갖는 것들이 시판되고 있다.
또한, 본 발명의 단백질 예로는, 알부민, 면역글로불린 또는 바이러스성 단백질 (VLP)을 들 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드의 예는 DNA, PNA, LNA 등으로부터 선택되는 하나 이상의 구성 단위를 포함한다. 또한, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 덴드리머 구축체의 형태일 수 있다.
또한, 본 발명의 다당류 예로는, 덱스트란, 아가로스, 덱스트린 및 가용성 전분 등을 들 수 있다. 또한, 이러한 다당류로, 알데히드기, 아미노기 또는 각종 활성기를 도입한 다당류도 사용될 수 있다. 알데히드기를 갖는 다당류는 다당류에 나트륨 퍼이도데이트를 반응시킴으로써 쉽게 제조될 수 있다. 또한 아미노기도 공지된 방법으로 다당류에 도입될 수 있다. 예를 들어, 아미노기를 갖는 덱스트란은 덱스트란을 나트륨 퍼이도데이트로 처리하여 알데히드기를 생성시키고, 디아민과 반응시킨 후 나트륨 보로하이드레이트로 반응물을 환원시킴으로써 제조할 수 있다. 또한 다당류의 활성기 도입도 공지된 방법으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 덱스트란에 디비닐 술폰을 반응시킴으로써 비닐기를 갖는 덱스트란을 얻을 수 있다. 상기 다당류로는 예를 들어, 덱스트란, 카복시메틸 덱스트란, 덱스트란 폴리알데히드, 카복시메틸 덱스트란 락톤 및 시클로덱스트린을 포함하는 다당류; 풀루란, 시조필란, 스클레로글루칸, 잔탄, 젤란, O-에틸아민 구아란, 6-O-카복시메틸키틴과 N-카복시메틸 키토산과 같은 키틴 및 키토산류; 카복시메틸 셀룰로오스, 카복시메틸 히드록시에틸 셀룰로오스, 히드록시에틸 셀룰로오스, 6-아미노-6-데옥시 셀룰로오스 및 O-에틸아민 셀룰로오스와 같은 유도체화된 셀룰로오스류; 히드록실화 전분, 히드록시프로필 전분, 히드록시에틸 전분, 카라기난, 알지네이트 및 아가로오스; 피콜 및 카복시메틸화 피콜과 같은 합성 다당류 등을 들 수 있다.
또한, 본 발명의 유기 합성 폴리머 예로는 바람직하게는 (메타)아크릴산, (메타)아크릴아미드, (메타)아크릴 에스테르, 메틸 메타크릴레이트, 말레산, 말레산 무수물, 비닐 아세테이트, 비닐 알코올, 비닐 클로로아세테이트, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 글리세린, 디이소시아네이트, 스티렌, 이소프렌, 알릴아민 및 에틸렌이민으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 구성 단위로 이루어진 폴리머를 포함한다. 보다 구체적으로, 유기 합성 폴리머 예로는 폴리(아크릴산), 폴리(아크릴아미드), 폴리(아크릴에스테르), 폴리(2-히드록시에틸 메타크릴레이트), 폴리(메틸 메타크릴레이트), 폴리(말레산), 폴리(말레산 무수물), 폴리(에틸-코-비닐 아세테이트), 폴리(메타크릴산), 폴리(비닐 알코올), 폴리(비닐 알코올-코-비닐 클로로아세테이트), 아민화 폴리(비닐 알코올) 및 그 코-블록 폴리머를 포함하는 비닐 폴리머류; 직쇄상, 빗 모양 또는 지분쇄 덴드리머를 포함하는 폴리머 백본을 포함하는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 또는 폴리프로필렌 글리콜 또는 폴리(에틸렌 옥시드-코-프로필렌 옥시드); 폴리(에틸렌이민); 폴리(알릴아민) 등을 들 수 있다.
제2 결합제
본 발명의 제2 결합제는 링커 분자와 특이적으로 결합 가능하며, 제2 결합 분자와 표지 물질을 포함한다. 본 발명의 제2 결합 분자와 표지 물질은 본 발명의 효과를 방해하지 않는한 임의의 부위에 직접적으로 결합될 수 있다. 또한, 제2 결합제는 본 발명의 제2 결합 분자 및 표지 물질과 함께 담체를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 제2 결합제는 햅텐 표지를 포함할 수 있다.
제2 결합 분자
제2 결합 분자는 링커 분자와 특이적으로 결합이 가능하다면 한정되지 않지만, 예를 들면, 항체 또는 그 단편이 바람직하다. 여기에서 항체는 임의의 동종형, 즉 IgG, IgM, IgA, IgD 또는 IgE 일 수 있다. 또한 항체 단편으로는, 예를 들어 항원 결합 단편, 바람직하게는 Fab, Fab', (Fab')2, Fv, scFv, 디아바디, 트리아 바디, 테트라바디, 또는 단일 도메인 항체 등을 들 수 있다.
제2 결합제의 표지 물질
본 발명의 제2 결합제에서 표지 물질은 표적 마커의 검출을 방해하지 않는한 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, 제1 결합제에서 예시한 표지 물질에서 선택될 수 있다. 따라서, 제2 결합제에서 표지 물질은 제1 결합제의 표지 물질과 동일하거나 상이한 표지 물질일 수 있지만, 동일한 표지 물질인 것이 바람직하다. 동일한 표지 물질을 이용하는 경우 고감도에서 간편하게 표적 마커를 검출하는데 특히 유리하다.
제2 결합제의 담체
제2 결합제의 담체는 본 발명의 효과를 방해하지 않는한 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 제1 결합제에서 예시한 담체에서 선택될 수 있다. 따라서, 제2 결합제의 담체는 제1 결합제의 담체와 동일하거나 상이할 수 있다.
링커 분자
본 발명의 링커 분자는 언급한 바와 같이 제1 결합제와 특이적으로 결합할 수 있다. 또한, 본 발명의 링커는 표적 마커의 효과적인 검출을 감안하면 제1 결합제 및 제2 결합제 모두와 특이적으로 결합이 가능한 것이 바람직하다. 따라서, 본 발명의 하나의 구현예에 의하면, 링커 분자는 제1 결합제 및 제2 결합제의 모두와 특이적으로 결합할 수 있다. 본 발명의 링커 분자는 본 발명의 효과를 방해하지 않는한 제1 결합제 및 제2 결합제의 임의의 부위에 특이적으로 결합될 수 있으나, 바람직하게는 제1 결합제의 표지 물질 및/또는 제2 결합제의 표지 물질에 특이 적으로 결합할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 제1 결합제의 표지 물질 및 제2 결합제의 표지 물질 모두에 특이적으로 결합이 가능하다.
또한, 본 발명의 링커 분자가 제2 결합제 중의 제2 결합 분자에 의해 특이적으로 결합되는 부위는 도 1에 표시된바와 같이 표지 물질과는 별개의 부위에 있어도 좋다. 따라서, 본 발명의 하나의 구현예에 의하면, 링커 분자는 제2 결합제와 특이적으로 결합 가능한 적어도 두 개의 결합 부위를 포함한다.
상기 링커 분자로는 예를 들어, 항체 또는 그 단편 등을 들 수 있다. 여기에서 항체는 임의의 동종형, 즉, IgG, IgM, IgA, IgD 또는 IgE 일 수 있다. 또한, 항체 단편으로는 Fab, Fab', (Fab')2, Fv 또는 scFv 등의 항원-결합 단편을 포함한다. 상기 링커 분자는 링커 분자 제조에서 사용되는 면역원과는 상이한 햅텐 표지 또는 형광 물질 표지를 더욱 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 하나의 구현예에 따르면, 상기 링커 분자는 다수의 항체 또는 그것의 항원-결합 단편이 폴리머와 같은 담체를 통해서 연결되는 것을 제외한다.
폴리에틸렌 글리콜
본 발명은 표적 마커의 검출에서 제1 결합제, 링커 분자와 제2 결합제 중 적어도 하나의 시약을 폴리에틸렌 글리콜의 공존 하에서 면역 반응시키는 것이 바람직하다. 공존을 위해 상기 시약과 폴리에틸렌 글리콜을 혼합하는 순서는, 본 발명에서는 특히 제한되지 않는다. 예를 들어, 상기 시약을 이용한 면역 반응을 시작하고 신속하게 폴리에틸렌 글리콜을 순차적으로 첨가하여도 되고, 또는 상기 시약 및 폴리에틸렌 글리콜과 미리 혼합하여 면역 반응을 실시해도 된다. 본 발명에 따른 면역 반응의 효과적인 강화의 관점에서, 면역 반응이 시작과 동시 또는 시작 전부터 상기 시약 및 폴리에틸렌 글리콜과 공존시켜 두는 것이 바람직하다.
본 발명의 폴리에틸렌 글리콜의 분자량은 본 발명의 효과를 얻는한 특별히 한정되는 것은 아니지만, 적합한 일례로는, 평균 분자량 (MW)은 2,000 ~ 20,000 범위로 정의될 수 있다. 이러한 평균 분자량은 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 표준품을 지표로 사용하여 겔 여과 (GPC)에 의해 결정될 수 있다.
조합물
본 발명의 조합물은 표적 마커와 특이적으로 결합 가능한 표적 마커 결합 분자와 결합하여 생물학적 시료 중의 표적 마커를 검출하기 위해, 상기 (a) 제1 결합제, (b) 링커 분자 및 (c) 제2 결합제를 포함한다. 본 발명을 따르는 조합물의 구현예는 본 발명의 효과를 방해하지 않는한 특별히 한정되지 않는다. 예를 들어, (a) 제1 결합제 (b) 링커 분자 및 (c) 제2 결합제는 조성물과 같이 일체적으로 구성되어 있을 수 있고, 예를 들어, 검출 키트 또는 검출 시스템 같이 (a) ~ (c)가 별개로 구성될 수 있다. 따라서, 본 발명의 조합물은 바람직하게는 조성물 또는 키트의 형태로 제공된다. 또한, 본 발명의 조합물은 본 발명의 효과를 방해하지 않는한 (a) - (c) 외의 시약을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 하나의 구현예에 따르면, 본 발명의 조합물은 상기 (a) - (c) 이외에, 상기 표적 마커 결합 분자를 조합에서 더욱 포함한다.
생물학적 시료 중의 표적 마커를 검출하는 방법
본 발명에 의하면 언급한 바와 같이 (a) 제1 결합제 (b) 링커 분자 및 (c) 제2 결합제와 표적 마커 결합 분자를 함께 사용하여 피험체로부터 얻어진 생물학적 시료 중의 표적 마커를 간편하고 고감도로 검출하는 것을 가능하게 한다. 따라서, 본 발명의 하나의 구현예에 의하면, 피험체로부터 얻어진 생물학적 시료 중의 표적 마커를 검출하는 방법으로서,
　(i) 미리 표적 마커와 특이적으로 결합한 표적 마커 결합 분자와 제1 결합제와 접촉시켜 제1 복합체를 얻는 공정;
　(ii) 상기 제1 복합체와 링커 분자를 접촉시켜 제2 복합체를 얻는 공정; 및
　(iii) 상기 제2 복합체와 제2 결합제와 접촉시켜 제3 복합체를 얻는 공정을 포함하고,
　여기에서 상기 제1 결합제는 상기 표적 마커 결합 분자와 직접 또는 간접적으로 특이적으로 결합 가능한 제1 결합 분자와 표지 물질을 포함하고,
　여기에서 상기 결합 가능한 링커 분자가 상기 제1 결합제와 특이적으로 결합 가능하고,
　여기에서 상기 제2 결합제는 상기 링커 분자와 특이적으로 결합 가능한 제2 결합 분자와 표지 물질을 포함한다.
　상기 (i) - (iii)의 각각의 접촉 공정에서는 각각의 성분을 혼합하는 등의 공지된 방법을 사용하여 제1 복합체, 제2 복합체 및 제3 복합체를 얻을 수 있다.
　상기 (i) ~ (iii)의 각각의 접촉 공정에서 제1 결합제, 링커 분자 및 제2 결합제는 바람직하게는 용액으로 첨가될 수 있다.
　공정 (i)에서 상기 용액의 제1 결합제의 농도는 특별히 한정되지 않지만, 1 - 15㎍ / mL의 범위에서 정의될 수 있다.
　공정 (ii) 상기 용액의 링커 분자의 농도는 특별히 한정되지 않지만, 0.5 - 15㎍ / mL의 범위에서 정의될 수 있다.
　공정 (iii) 상기 용액에서의 제2 결합제의 농도는 특별히 한정되지 않지만, 1 - 15㎍ / mL의 범위에서 정의될 수 있다.
　또한, (i) - (iii)의 각각의 접촉 단계 중 적어도 하나 또는 전체 공정은 표적 마커의 검출 감도의 향상을 감안하면, 폴리에틸렌 글리콜의 공존 하에서 실시하는 것이 바람직하다. (i) - (iii) 공정에서 사용되는 상기 용액의 폴리에틸렌 글리콜의 농도는 특별히 한정되지 않지만, 0.5 - 20wt %의 범위에서 정의될 수 있다.
　또한, 본 발명의 방법은 제1 결합제의 표지 물질 및 제2 결합제의 표지 물질을 검출하는 단계를 추가로 포함할 수도 있다.
　본 발명에 따라 제1 결합제의 표지 물질 및 제2 결합제의 표지 물질의 검출 방법은 표지 물질의 종류와 성질에 따라 적절히 당업자에게 설정될 수 있다. 예를 들어 면역 염색법, 직접 접합법, 유동 세포 계측법, 효소 면역분석 (EIA), 효소-결합 면역 검정법 (ELISA) 및 웨스턴 블롯(Western blot)을 포함하는 다양한 공지된 검출 방법이 사용될 수 있다. 바람직한 검출 방법은 면역 조직 화학 염색법 또는 색소 직접 접합법 (Chromogenic in situ hybridization : CISH)와 같은 직접 접합법이다.
본 발명에 따른 (i) - (iii)의 각각의 접촉 공정 및 표지 물질의 검출 반응 조건의 상세한 내용은 공지된 기술에 따라 당업자에 의해 결정될 수 있다.
실시예
이하, 실시예에 의해 본 발명을 보다 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이러한 실시예에 한정되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 단위 및 측정 조건의 상세한 내용은 별도로 지정하지 않는 한, JIS (일본 공업 규격)의 규정에 준한다.
시험예 1 : 제1 결합제만을 이용한 고감도 염색법, 및 제1 결합제 및 제2 결합제만을 이용한 고감도 염색법의 검토
본 시험예에서는 표적 마커의 검출 감도에 대해 제1 결합제만을 이용한 반응계(비교예 1)와 제1 결합제 및 제2 결합제만을 이용한 반응계(비교예 2)를 비교했다.
시약의 조제
1. 제1 결합제의 조제
　제1 결합제 (폴리머 시약)는 특개 2001-181299 호 공보의 단락 번호 [0031] - [0040]의 기재에 준하여 제조되었다.
　구체적으로는, 아미노산 폴리머에 퍼옥시다아제와 마우스의 Fab' 단편 Ig (동물 종 : 염소)을 결합시킨 폴리머 시약 (M)과 아미노산 폴리머에 퍼옥시다아제와 항-토끼의 Fab' 단편 Ig (동물종 : 염소)를 결합시킨 폴리머 시약 (R)을 각 5㎍ / mL 씩 혼합하여, 칵테일 폴리머 시약 (MULTI)를 조제하였다.
2. 제2 결합제의 조제
아미노산 폴리머에 퍼옥시다아제와 항-염소의 Fab' 단편 Ig (동물 종 : 토끼)를 결합시킨 폴리머 시약 (G)를 7.5㎍ / mL로 조제하였다.
면역조직화학 염색
1. 탈파라핀, 퍼옥시다아제 블로킹 및 항원 부활화 처리
A. 표본 슬라이드의 준비
　조직 절편을 3㎛로 박절하여 MAS-코트 슬라이드 유리에 부착시켰다. 그 후, 슬라이드 유리는 37 ℃ 배양기에서 하룻밤 동안 건조되었다.
B. 탈파라핀화
(I) 크실렌 처리 (3 분 × 3 회)
　슬라이드를 크실렌에 3 분간 담근다. 그 후, 여분의 액을 떨쳐버리고 다른 크실렌에 3 분간 담근다. 그 후, 여분의 액을 떨쳐버리고 또 다른 크실렌에 3 분간 담근다.
(II) 에탄올 처리 (3 분 × 4 회)
　100 % 에탄올에 3 분간 담근다. 여분의 액을 떨쳐버리고 다른 100 % 에탄올에 3 분간 담근다. 이 조작을 2 회 더 실시했다.
(III) 세척
　여분의 에탄올을 떨쳐버리고, 슬라이드를 PBS(용기는 각 3 분간 두 번 변경된다)로 세척한다.
C. 항원 부활로 인한 처리
　항원 부활된 용액 pH9 (니치레이 바이오사이언스 사)을 사용하여 오토 클레이브에서 20 분간 가열 처리하여 실온에서 20 분간 방치했다. 그 후, 슬라이드를 PBS로 3 분 × 2 회 세척하였다.
D. 퍼옥시다아제 블로킹
　내생의 퍼옥시다아제의 제거를 실시했다. 드레인드 후, 슬라이드를 3V / V % 과산화수소에 10 분간 담근다. 그 후, 슬라이드를 PBS로 3 분 × 2 회 세척하였다.
2. 제1 항체 또는 대조군 (제1 항체 희석액)의 첨가ㆍ반응
　여분의 액을 떨쳐버린 슬라이드 글라스 위에 제1 항체 또는 제1 항체 희석액을 적하하고 습윤 상자에서 25 ℃에서 30 분간 반응시켰다. 그 후, 슬라이드 글라스를 PBS로 3 분 × 2 회 세척하였다. 검토에 사용된 조직과 제1 항체의 조합은 다음과 같다.
ㆍ 위암 ...... 항-인간 p53 유전자 산물 단클론 항체(DO-7)(니치레이 바이오사이언스 사)를 3 배 희석해서 사용했다.
ㆍ 대장암 ... 항-CDX-2 토끼 단클론 항체(니치레이 바이오사이언스 사)를 그대로 사용했다.
3. 제1 결합제와의 반응
　여분의 액을 떨쳐버린 슬라이드 글라스 위에 칵테일 폴리머 시약 (MULTI)을 적하하고 습윤 상자에서 25 ℃에서 10 분간 반응시켰다. 그 후, 슬라이드 글라스를 PBS로 3 분 × 2 회 세척하였다. 부수적으로, 본 반응은 비교예 1 및 2의 모두에서 실시되었다.
4. 제2 결합제와의 반응
　여분의 액을 떨쳐버린 슬라이드 글라스 위에 폴리머 시약 (G)을 적하하고 습윤 상자에서 25 ℃에서 10 분간 반응시켰다. 그 후, 슬라이드 글라스를 PBS로 3 분 × 2 회 세척하였다. 부수적으로, 본 반응은 비교예 2에서만 실시되었다.
5. 기질 용액의 첨가ㆍ반응
　여분의 액을 떨쳐버린 슬라이드 글라스 위에 N-Histofine®(등록 상표) DAB-2V (니치레이 바이오사이언스)을 적하하여 실온에서 5 분간 반응시켰다. 그 후, 슬라이드 글라스를 흐르는 물로 5 분간 세척하였다.
6. 대비 염색, 탈수ㆍ세정, 봉입
A. 대비 염색
　드레인드 후, 슬라이드 글라스를 Mayer의 헤마톡실린 용액에 30 초간 담근다. 그 후, 슬라이드 글라스를 흐르는 물에 5 분간 세척하였다.
B. 탈수ㆍ세정
　드레이닝은 에탄올로 탈수되고 크실렌으로 세정된다. 여기서, 탈수에 사용되는 에탄올은 통로를 3 회 통과하고 5 분간 1 회 정지한다. 세정에 사용되는 크실렌은 통로를 1 회 통과하고 5 분간 2 회 정지한다.
C. 봉입
　영구적인 봉입제(비-수용성) (니치레이 바이오사이언스 사)가 봉입에 사용되었다.
상기 염색 결과는 도 2에 도시되었다. 여기서, 도 2에서는 각각의 염색된 조직을 나타낸 현미경 사진은 접안 렌즈(10 배)와 대물 렌즈(4 배)인 광학 현미경 (올림푸스 주식회사)을 이용하여 촬영한 것이다.
제1 결합제 및 제2 결합제만의 반응계 (비교예 2)는 제1 결합제만의 반응계 (비교예 1)에 비해 염색 감도가 약간 증가했다. 그러나 원하는 수준에서 염색 감도는 얻을 수 없었다.
부수적으로, 대조군에서 백그라운드 염색은 발생되지 않았다.
시험예 2 : 제1 결합제, 링커 분자와 제2 결합제를 이용한 고감도 염색법의 검토
제1 결합제, 링커 분자와 제2 결합제를 이용한 반응계, 즉, 링커 분자를 제1 결합제 및 제2 결합제 사이에 개재시키는 반응계로, 제1 결합제만을 이용한 반응계 또는 제1 결합제 및 제2 결합제만을 이용한 반응계와 비교하여 염색 감도가 향상될 수 있는지 검토를 실시했다.
본 시험에서, 제1 결합제, 링커 분자와 제2 결합제를 이용한 반응계 중 링커 분자 (항-HRP 항체 1㎍/mL)를 이용하는 반응계는 실시예 1, 링커 분자 (항-HRP 항체 5㎍/mL)을 이용하는 반응계를 실시예 2로 정의했다.
또한, 제1 결합제만을 이용한 반응계를 비교예 3, 및 제1 결합제 및 제2 결합제만을 이용한 반응계를 비교예 4로 정의했다.
시약의 조제
1. 제1 결합제의 조제
아미노산 폴리머에 퍼옥시다아제와 마우스의 Fab' 단편 Ig (동물종 : 염소)을 결합시킨 폴리머 시약 (M)과 아미노산 폴리머에 퍼옥시다아제와 항-토끼의 Fab' 단편 Ig (동물 종 : 염소)을 결합시킨 폴리머 시약 (R)을 각 5㎍/mL 씩 혼합하여, 칵테일 폴리머 시약 (MULTI)를 조제하였다.
2. 링커 분자의 조제
염소 항-HRP 항체 (폴리클론성) (Pierce 사)를 1㎍/mL 또는 5㎍/mL로 조제하였다.
3. 제2 결합제의 조제
아미노산 폴리머에 퍼옥시다아제와 항-염소의 Fab' 단편 Ig (동물 종 : 토끼)를 결합시킨 폴리머 시약 (G)를 7.5㎍/mL로 조제하였다.
면역조직화학 염색
1. 탈파라핀, 퍼옥시다아제 블로킹 및 항원 부활화 처리
　시험예 1과 동일한 방법으로 실시하였다.
2. 제1 항체 또는 대조군 (제1 항체 희석액)의 첨가ㆍ반응
　시험예 1과 동일한 방법으로 실시하였다.
3. 제1 결합제와의 반응
여분의 액을 떨쳐버린 슬라이드 글라스 위에 칵테일 폴리머 시약 (MULTI)을 적하하고 습윤 상자에서 25 ℃에서 10 분간 반응시켰다. 그 후, 슬라이드 글라스를 PBS로 3 분 × 2 회 세척하였다. 부수적으로, 본 반응은 비교예 1과 비교예2 및 비교예 3과 비교예 4에서 실시되었다.
4. 링커 분자와의 반응
여분의 액을 떨쳐버린 슬라이드 글라스 위에 염소 항-HRP 항체를 적하하고 습윤 상자에서 25 ℃에서, 10 분간 반응시켰다. 그 후, 슬라이드 글라스를 PBS로 3 분 × 2 회 세척하였다. 부수적으로, 본 반응은 실시예 1 및 실시예 2에서만 실시되었다.
5. 제2 결합제와의 반응
여분의 액을 떨쳐버린 슬라이드 글라스 위에 폴리머 시약 (G)을 적하하고 습윤 상자에서 25 ℃에서, 10 분간 반응시켰다. 그 후, 슬라이드 글라스를 PBS로 3 분 × 2 회 세척하였다. 부수적으로, 본 반응은 실시예 1 및 실시예 2와 비교예 4에서만 실시되었다.
6. 기질 용액의 첨가ㆍ반응
시험예 1과 동일한 방법으로 실시하였다.
7. 대비 염색, 탈수ㆍ세정, 봉입
시험예 1과 동일한 방법으로 실시하였다.
상기 염색 결과는 도 3에 도시되었다. 여기서, 도 3에서는 각각의 염색된 조직을 나타낸 현미경 사진은 접안 렌즈(10 배)와 대물 렌즈(4 배)인 광학 현미경 (올림푸스 주식회사)을 이용하여 촬영한 것이다.
제1 결합제와 제2 결합제 사이에 유지되는 링커 분자 (항 HRP 항체)를 포함하는 반응계 (실시예 1 및 실시예 2)는 제1 결합제만을 이용한 반응계 또는 제1 결합제 및 제2 결합제만을 이용한 반응계와 비교하여 염색 감도가 크게 향상되었다.
부수적으로, 대조군에서 백그라운드 염색은 발생되지 않았다.
시험예 3 : 링커 분자로 사용되는 항체의 종류 검토
시험은 항-HRP 항체의 면역화 동물종 (마우스, 토끼 또는 염소)을 변경하고, 다음 표 1에 표시된 것 같은 폴리머 시약 및 항-HRP 항체를 이용하여 시험예 2와 동일한 시험 방법으로 실시되었다.　
Figure 112016111325295-pct00001
상기 염색 결과는 도 4에 도시되었다. 여기서, 도 4에서는 각각의 염색된 조직을 나타낸 현미경 사진은 접안 렌즈(10 배)와 대물 렌즈(4 배)인 광학 현미경 (올림푸스 주식회사)을 이용하여 촬영한 것이다.
링커분자와 제1 결합제, 링커 분자 및 제2 결합제를 사용하는 반응계 (비교예 3-5)를 사용하는 면역화 동물 종-항체는 어는 것이든지 제1 결합제 및 제2 결합제만의 반응계 (비교예 5-7)에 비해 각각의 염색 감도가 크게 향상되었다. 부수적으로, 대조군에서 백그라운드 염색은 발생되지 않았다.
시험예 4 : 제1 결합제 및 제2 결합제의 종류 검토
4-1 : 전체의 항체 및 덱스트란(담체)의 결합체 (제1 결합제 및 제2 결합제) 사용
전체의 IgG 항체와 퍼옥시다아제가 덱스트란에 결합되어 있는 폴리머 시약 (EnVision Dual Link System-HRP, DAKO 사)를 제1 결합제와 제2 결합제로 사용되고, 다음 단계에 따라 염색 감도의 비교 시험을 실시했다.
부수적으로, 제1 결합제, 링커 분자 (마우스 항-HRP 항체) 및 제2 결합제를 이용한 반응계는 실시예 6으로 정의되었고; 제1 결합제, 링커 분자 (토끼 항-HRP 항체) 및 제2 결합제 이용한 반응계는 실시예 7로 정의되었고; 제1 결합제만을 이용한 반응계는 비교예 8로 정의되었고; 제1 결합제 및 제2 결합제만을 이용한 반응계는 비교예 9로 정의되었다.
시약의 조제
1. 제1 결합제의 조제
전체의 IgG 항체와 퍼옥시다아제가 덱스트란에 결합되어있는 고분자 시약 (EnVision Dual Link System-HRP, DAKO 사)를 그대로 사용했다. 구체적으로는, 덱스 트란 폴리머에 퍼옥시다아제와 항-마우스 IgG 항체(동물 종 : 염소)를 결합시킨 폴리머 시약 (M)과 덱스트란 폴리머에 퍼옥시다아제와 항-토끼 IgG 항체 (동물 종 : 염소)를 결합시킨 폴리머 시약 (R)이 혼합된 고분자 시약이다.
2. 링커 분자의 조제
마우스 항-HRP 항체 (클론 : HP-03) (TFS 사)를 5㎍ / mL 조제하였다.
토끼 항-HRP 항체 (폴리클론성) (니치레이 바이오사이언스 사)를 5㎍/mL에 조제하였다.
3. 제2 결합제의 조제
전체의 IgG 항체와 퍼옥시다아제가 덱스트란에 결합되어 있는 폴리머 시약 (EnVision Dual Link System-HRP, DAKO 사)를 그대로 사용했다.
면역조직화학 염색
1. 탈파라핀, 퍼옥시다아제 블로킹 및 항원 부활화 처리
　시험예 1과 동일한 방법으로 실시하였다.
2. 제1 항체 또는 대조군 (제1 항체 희석액)의 첨가ㆍ반응
　여분의 액을 떨쳐버린 슬라이드 글라스 위에 제1 항체 또는 제1 항체 희석액을 적하하고 습윤 상자에서 25 ℃에서, 30 분간 반응시켰다. 그 후, 슬라이드 글라스를 PBS로 3 분 × 2 회 세척하였다. 검토에 사용된 조직과 표적 마커 결합 분자 (제1 항체)의 조합은 다음과 같다.
ㆍ 위암 ...... 항 인간 p53 유전자 산물 단클론 항체 (DO-7) (니치레이 바이오사이언스)를 그대로 사용했다.
ㆍ 대장암 ... 항 CDX-2 토끼 단클론 항체 (니치레이 바이오사이언스)를 그대로 사용했다.
3. 제1 결합제와의 반응
여분의 액을 떨쳐버린 슬라이드 글라스 위에 EnVision Dual Link System-HRP (DAKO 사)를 적하하고 습윤 상자에서 25 ℃에서, 10 분간 반응시켰다. 그 후, 슬라이드 글라스를 PBS로 3 분 × 2 회 세척하였다. 부수적으로, 본 반응은 실시예 6과 실시예 7 및 비교예 8과 비교예 9에서 실시되었다.
4. 링커 분자와의 반응
여분의 액을 떨쳐버린 슬라이드 글라스 위에 마우스 항-HRP 항체(실시예 6) 또는 토끼 항 HRP 항체(실시예 7)를 적하하고 습윤 상자에서 25 ℃에서, 10 분간 반응시켰다. 그 후, 슬라이드 글라스를 PBS로 3 분 × 2 회 세척하였다. 부수적으로, 본 반응은 실시예 6와 실시예 7에서만 실시되었다.
5. 제2 결합제와의 반응
여분의 액을 떨쳐버린 슬라이드 글라스 위에 EnVision Dual Link System-HRP (DAKO 사)을 적하하고 습윤 상자에서 25 ℃에서, 10 분간 반응시켰다. 그 후, 슬라이드 글라스를 PBS로 3 분 × 2 회 세척하였다.
본 반응은 실시예 6과 실시예 7 및 비교예 9에서만 실시되었다.
6. 기질 용액의 첨가ㆍ반응
　시험예 1과 동일한 방법으로 실시하였다.
7. 대비 염색, 탈수ㆍ세정, 봉입
　시험예 1과 동일한 방법으로 실시하였다.
상기 염색 결과는 도 5에 도시되었다. 여기서, 도 5에서는 각각의 염색된 조직을 나타낸 현미경 사진은 접안 렌즈(10 배)와 대물 렌즈(4 배)인 광학 현미경 (올림푸스 주식회사)을 이용하여 촬영한 것이다
담체로 사용되는 덱스트란과 결합 분자로 사용되는 전체의 항체 경우에도, 제1 결합제, 링커 분자와 제2 결합제를 이용한 반응계 (실시예 6 및 실시예 7)는, 제1 결합제만을 이용한 반응계 (비교예 8) 및 제1 결합제 및 제2 결합제만을 이용한 반응계 (비교예 9)보다 검출 감도가 크게 향상되었다.
부수적으로, 대조군에서 백그라운드 염색은 발생되지 않았다.
4-2 : 전체의 항체와 HRP의 직접 결합체 (제 1 결합제 및 제2 결합제)의 사용
전체의 IgG 항체와 폴리-HRP가 직접 서로 결합된 시약을 제1 결합제와 제2 결합제로 사용하여 표적 마커의 검출 효과를 검토했다.
다음 실험에서는, 제1 결합제(항-마우스 항체와 폴리-HRP의 직접 결합체), 링커 분자(마우스 항-HRP 항체) 및 제2 결합제(항-마우스 항체와 폴리-HRP의 직접 결합체)를 이용한 반응계는 실시예 8 (생물학적 시료 : p53 위암)로 정의되었고; 및 제1 결합제 (항-토끼 항체와 폴리-HRP의 직접 결합체), 링커 분자(토끼 항-HRP 항체)와 제2 결합제 (항-토끼 항체와 폴리-HRP의 직접 결합체)를 이용한 반응계는 실시예 9 (생물학적 시료 : CDX-2 대장 암)으로 정의되었다. 또한, 제1 결합제 (항-마우스 항체와 폴리-HRP의 직접 결합체)와 제2 결합제(항-마우스 항체와 폴리-HRP의 직접 결합체)만을 이용한 반응계는 비교예 10 (생물학적 시료 : p53 위암)으로 정의되었고; 및 제1 결합제 (항-토끼 항체와 폴리-HRP의 직접 결합체)와 제2 결합제 (항-토끼 항체와 폴리-HRP의 직접 결합체)만을 이용한 반응계는 비교예 11 (생물학적 시료 : CDX-2 대장 암)으로 정의되었다.
시약의 조제
1. 제1 결합제의 조제
　전체의 IgG 항체에 폴리-HRP로 직접 표지된 시약 (염소 항-마우스 폴리-HRP, Pierce 사)을 10 배 희석하였다.
　전체의 IgG 항체에 폴리-HRP로 직접 표지된 시약 (염소 항-토끼 폴리-HRP, Pierce 사)을 10 배 희석하였다.
2. 링커 분자의 조제
마우스 항-HRP 항체 (클론 : HP-03, TFS 사)는 5㎍/mL로 제조하였다.
토끼 항-HRP 항체 (폴리클론성) (니치레이 바이오사이언스)는 5㎍/mL로 제조하였다.
3. 제2 결합제의 조제
전체의 IgG 항체에 폴리-HRP로 직접 표지된 시약 (염소 항-마우스 폴리-HRP, Pierce 사)을 10 배 희석하였다.
전체의 IgG 항체에 폴리-HRP로 직접 표지된 시약 (염소 항-토끼 폴리-HRP, Pierce 사)을 10 배 희석하였다.
면역조직화학 염색
1. 탈파라핀, 퍼옥시다아제 블로킹 및 항원 부활화 처리
　시험예 1과 동일한 방법으로 실시하였다.
2. 제1 항체 또는 대조군 (제1 항체 희석액)의 첨가ㆍ반응
　시험예 4-1과 동일한 방법으로 실시하였다.
3. 제1 결합제와의 반응
여분의 액을 떨쳐버린 슬라이드 글라스 위에 염소 항-마우스 폴리-HRP (Pierce 사) (실시예 8 및 비교예 10) 또는 염소 항-토끼 폴리-HRP (Pierce 사) (실시예 9 및 비교예 11)를 적하하고 습윤 상자에서 25 ℃에서, 10 분간 반응시켰다. 그 후, 슬라이드 글라스를 PBS로 3 분 × 2 회 세척하였다. 부수적으로, 본 반응은 실시예 8와 실시예 9 및 비교예 10과 비교예 11에서 실시되었다.
4. 링커 분자와의 반응
여분의 액을 떨쳐버린 슬라이드 글라스 위에 마우스 항-HRP 항체 (실시예 8) 또는 토끼 항-HRP 항체 (실시예 9)을 적하하고 습윤 상자에서 25 ℃에서, 10 분 반응시켰다. 그 후, 슬라이드 글라스를 PBS로 3 분 × 2 회 세척하였다. 부수적으로, 본 반응은 실시예 8과 실시예 9에서 실시되었다.
5. 제2 결합제와의 반응
여분의 액을 떨쳐버린 슬라이드 글라스 위에 염소 항-마우스 폴리-HRP (Pierce 사) (실시예 8 및 비교예 10) 또는 염소 항-토끼 폴리-HRP (Pierce 사) (실시예 9 및 비교예 11)를 적하하고 습윤 상자에서 25 ℃에서, 10 분간 반응시켰다. 그 후, 슬라이드 글라스를 PBS로 3 분 × 2 회 세척하였다. 부수적으로, 본 반응은 실시예 8과 실시예 9 및 비교예 10과 비교예 11에서 실시되었다.
6. 기질 용액의 첨가ㆍ반응
　시험예 1과 동일한 방법으로 실시하였다.
7. 대비 염색, 탈수ㆍ세정, 봉입
　시험예 1과 동일한 방법으로 실시하였다.
상기 염색 결과는 도 6에 도시되었다. 여기서, 도 6에서는 각각의 염색된 조직을 나타낸 현미경 사진은 접안 렌즈(10 배)와 대물 렌즈(4 배)인 광학 현미경 (올림푸스 주식회사)을 이용하여 촬영한 것이다
제1 결합제 및 제2 결합제로 전체의 항체와 표지 물질 (폴리-HRP)와 직접 결합체로 사용하는 경우에도 제1 결합제, 링커 분자와 제2 결합제를 이용한 반응계 (실시예 8 및 실시예 9)는 각각 제1 결합제 및 제2 결합제만을 이용한 반응계(비교 예 10 및 비교예 11)보다 검출 감도가 크게 향상되었다.
부수적으로, 실시예 8 및 실시예 9의 대조군에는 백그라운드 염색이 발생되었지만, 주로 세포질에 발생하고 세포 핵에는 거의 발생되지 않았다. p53과 CDX-2는 세포핵이 염색 항체이기 때문에, 평가 시 백그라운드 염색의 영향은 거의 없었다.
4-3 : 효소 마이크로폴리머 (제1 결합제 및 제2 결합제)의 사용
고활성 및 고감도인 효소와 항체가 서로 결합하는 효소 마이크로폴리머 (ImmPRESS UNIVERSAL 시약, 항-마우스/토끼 Ig 또는 ImmPRESS 시약, 항-염소 Ig, VECTOR LABORATORIES 사)를 제1 결합제와 제2 결합제로 사용하여 다음 단계에 따라 염색 감도의 비교 시험을 실시했다.
부수적으로, 제1 결합제(ImmPRESS UNIVERSAL 시약, 항-마우스/토끼 Ig), 링커 분자 (마우스 항-HRP 항체) 및 제2 결합제(ImmPRESS UNIVERSAL 시약, 항-마우스/토끼 Ig)을 이용한 반응계는 실시예 10로 정의되었고; 제1 결합제 (ImmPRESS UNIVERSAL 시약, 항-마우스/토끼 Ig), 링커 분자 (토끼 항-HRP 항체) 및 제2 결합제(ImmPRESS UNIVERSAL 시약, 항-마우스/토끼 Ig)를 이용한 반응계는 실시예 11로 정의되었고; 제1 결합제(ImmPRESS UNIVERSAL 시약, 항-마우스/토끼 Ig), 링커 분자(염소 항-HRP 항체) 및 제2 결합제(ImmPRESS 시약, 항-염소 Ig)를 이용한 반응계는 실시예 12로 정의되었다.
또한, 제1 결합제(ImmPRESS UNIVERSAL 시약, 항-마우스/토끼 Ig)만을 이용한 반응계는 비교예 12로 정의되었고; 제1 결합제(ImmPRESS UNIVERSAL 시약, 항-마우스/토끼 Ig)와 제2 결합제(ImmPRESS UNIVERSAL 시약, 항-마우스/토끼 Ig)만을 이용한 반응계는 비교예 13으로 정의되었고; 제1 결합제(ImmPRESS UNIVERSAL 시약, 항-마우스/토끼 Ig) 및 제2 결합제(ImmPRESS 시약, 항-염소 Ig)만을 이용한 반응계는 비교예 14로 정의되었다.
시약의 조제
1. 제1 결합제의 조제
고활성 및 고감도인 효소와 항체가 결합하는 효소 마이크로폴리머 (ImmPRESS UNIVERSAL 시약, 항-마우스/토끼 Ig, VECTOR LABORATORIES 사)를 그대로 사용했다.
2. 링커 분자의 조제
마우스 항-HRP 항체 (클론: HP-03, TFS 사)를 5㎍/mL로 제조하였다.
토끼 항-HRP-항체 (폴리클론성) (니치레이 바이오사이언스 사)를 5㎍/mL로 제조하였다.
염소 항-HRP 항체 (폴리클론성) (Pierce 사)를 5㎍/mL로 제조하였다.
3. 제2 결합제의 조제
고활성 및 고감도인 효소와 항체가 결합하는 효소 마이크로폴리머 (ImmPRESS UNIVERSAL 시약, 항-마우스/토끼 Ig, VECTOR LABORATORIES 사)를 그대로 사용했다.
또한, 고활성 및 고감도인 효소와 항체가 결합하는 다른 효소 마이크로폴리머 (ImmPRESS 시약, 항-염소 Ig, VECTOR LABORATORIES 사)를 그대로 사용했다.
면역조직화학 염색
1. 탈파라핀, 퍼옥시다아제 블로킹 및 항원 부활화 처리
　시험예 1과 동일한 방법으로 실시하였다.
2. 제1 항체 또는 대조군 (제1 항체 희석액)의 첨가ㆍ반응
　시험예 4-1과 동일한 방법으로 실시하였다.
3. 제1 결합제와의 반응
여분의 액을 떨쳐버린 슬라이드 글라스 위에 ImmPRESS UNIVERSAL 시약, 항-마우스/토끼 Ig (VECTOR 사)을 적하하고 습윤 상자에서 25 ℃에서, 10 분간 반응시켰다. 그 후, 슬라이드 글라스를 PBS로 3 분 × 2 회 세척하였다. 부수적으로, 본 반응은 실시예 10 - 12 및 비교예 12 - 14에서 실시되었다.
4. 링커 분자와의 반응
여분의 액을 떨쳐버린 슬라이드 글라스 위에 마우스 항-HRP 항체(실시예 10), 토끼 항-HRP 항체 (실시예 11) 또는 염소 항-HRP 항체 (실시예 12)를 적하하고 습윤 상자에서 25 ℃에서, 10 분간 반응시켰다. 그 후, 슬라이드 글라스를 PBS로 3 분 × 2 회 세척하였다. 부수적으로, 본 반응은 실시예 10 ~ 12에서만 실시되었다.
5. 제2 결합제와의 반응
여분의 액을 떨쳐버린 슬라이드 글라스 위에 ImmPRESS UNIVERSAL 시약, 항-마우스/토끼 Ig (VECTOR 사) (실시예 10 및 비교예 13) 또는 ImmPRESS 시약, 항-염소 Ig (VECTOR LABORATORIES 사) (실시예 12 및 비교예 14)를 적하하고 습윤 상자에서 25 ℃에서, 10 분간 반응시켰다. 그 후, 슬라이드 글라스를 PBS로 3 분 × 2 회 세척하였다. 부수적으로, 본 반응은 실시예 10 - 12 및 비교예 13과 14에서 실시되었다.
6. 기질 용액의 첨가ㆍ반응
　시험예 1과 동일한 방법으로 실시하였다.
7. 대비 염색, 탈수ㆍ세정, 봉입
　시험예 1과 동일한 방법으로 실시하였다.
상기 염색 결과는 도 7에 도시되었다. 여기서, 도 7에서는 각각의 염색된 조직을 나타낸 현미경 사진은 접안 렌즈(10 배)와 대물 렌즈(4 배)인 광학 현미경 (올림푸스 주식회사)을 이용하여 촬영한 것이다.
제1 결합제 및 제2 결합제로서 고활성 및 고감도인 효소와 항체가 결합하는 효소 마이크로폴리머를 사용한 경우에도 제1 결합제, 링커 분자와 제2 결합제를 이용한 반응계 (실시예 10 - 12)가 각각 제1 결합제만을 이용한 반응계 (비교예 12) 및 제1 결합제 및 제2 결합제만을 이용한 반응계 (비교예 13 및 14)보다 검출 감도가 크게 향상되었다.
부수적으로, 실시예 10 - 12의 대조군에는 백그라운드 염색이 발생되었지만, 주로 세포질에 발생하고 세포 핵은 거의 발생되지 않았다. p53과 CDX-2는 세포 핵이 염색 항체이기 때문에, 평가 시 백그란운드 염색의 영향은 거의 없었다.
시험예 5: 제1 결합제 및 제2 결합제의 폴리머 담체의 유무 및 폴리머 담체의 분자량 검토
아래 표 2-5과 같이 폴리머 담체의 분자량이 다양한 폴리머 시약 또는 폴리머 담체가 없는 폴리-HRP 종류의 시약을 제1 결합제 및 제2 결합제로 선택했다. 그리고 생물학적 시료로 위암 조직만을 사용하고 표적 마커 결합 분자 (제1 항체: 항-인간 p53 유전자 산물 단클론 항체 (DO-7) (니치레이 바이오사이언스))를 2 배 희석 사용하는 것 이외에는 시험예 2와 동일한 시험을 실시하여 표적 마커의 검출 감도를 비교했다.
Figure 112016111325295-pct00002
Figure 112016111325295-pct00003
Figure 112016111325295-pct00004
Figure 112016111325295-pct00005
시약의 조제
1. 제1 결합제의 조제
제1 결합제 (폴리머 시약)는 특개 2001-181299 호 공보의 단락 번호 [0031] ~ [0040]의 기재에 준하여 조제하였다.
구체적으로는, 폴리머 시약은 폴리머 담체의 평균 분자량이 각각 2,700, 7,500 및 9,200로 정의되는 것 이외에는 시험예 1의 폴리머 시약 (M)과 유사하게 제조되었다. 폴리머 시약은 5㎍ / mL로 제조하였다. 부수적으로, 시험예 1에서 사용된 폴리머 시약 (M)의 폴리머 담체의 평균 분자량은 9,200이다.
또한, 폴리머 담체가 없는 폴리-HRP 종류의 시약에 관해서는, 항-마우스 Ig (동물 종: 염소)의 Fab’와 폴리-HRP가 결합된 시약 (M)를 5㎍ / mL로 제조하였다.
2. 링커 분자의 조제
　마우스 항-HRP 항체 (클론 : HP-03, TFS 사)를 5㎍ / mL로 제조하였다.
3. 제2 결합제의 조제
　상기 제1 결합제를 7.5㎍ / mL로 조제하였다.
상기 염색 결과는 도 8에 도시되었다. 여기서, 도 8에서는 각각의 염색된 조직을 나타낸 현미경 사진은 접안 렌즈(10 배)와 대물 렌즈(4 배)인 광학 현미경 (올림푸스 주식회사)을 이용하여 촬영한 것이다. 링커 분자를 이용한 실시예 13 - 16에서는 제1 결합제 및 제2 결합제의 분자량의 차이 또는 폴리머 담체 (폴리-L-리신 (PLL))의 유무에 관계없이, 각각 링커 분자를 사용하지 않는 비교예 15 - 22과 비교하여 검출 감도의 현저한 향상이 확인되었다. 부수적으로, 대조군에서 백그라운드 염색은 발생되지 않았다.
시험예 6 : 표지 물질의 검토
6-1 : 표지 물질 (알칼리 포스파타제 : AP) 및 링커 분자 (마우스 항-AP 항체)를 이용한 반응계
서양고추냉이 퍼옥시다아제 (HRP) 대신에, 알칼리 포스파타제 (AP)을 표지 물질로 사용하여, 링커 분자 (마우스 항-AP 항체)를 이용한 반응계는 표적 마커의 검출 감도에 대해서 검토되었다.
부수적으로, 다음 시험에서, 제1 결합제 및 제2 결합제 (알칼리 포스파타제 (AP)를 표지 물질로 이용한 아미노산 중합체 : AP 폴리머 시약 (M)) 및 링커 분자 (마우스 항-AP 항체)를 이용한 반응계는 실시예 17로 정의되었고; 제1 결합제 (AP 폴리머 시약 (M))만을 이용한 반응계는 비교예 23로 정의되었고; 제1 결합제 및 제2 결합제 (AP 폴리머 시약 (M)) 만를 이용한 반응계는 비교예 24로 정의되었다.
시약의 조제
1. 제1 결합제의 조제
아미노산 폴리머에 알칼리 포스파타제 (AP)와 항-마우스 Ig(동물 종: 염소)의 Fab' 단편을 결합한 AP 폴리머 시약(M)을 10㎍ / mL로 조제하였다.
2. 링커 분자의 조제
마우스 항-AP 항체 (클론 : AP1B9, NOVUS BIOLOGICALS 사)를 5㎍/mL로 제조하였다.
3. 제2 결합제의 조제
AP 폴리머 시약 (M) (니치레이 바이오사이언스 사)을 10㎍/mL로 조제하였다.
면역조직화학 염색
1. 탈파라핀. 퍼옥시다아제 블로킹 및 항원 부활화 처리
시험예 1과 동일한 방법으로 실시하였다.
2. 제1 항체 또는 대조군 (제1 항체 희석액)의 첨가ㆍ반응
여분의 액을 떨쳐버린 슬라이드 글라스 위에 제1 항체 또는 제1 항체 희석액을 적하하고 습윤 상자에서 25 ℃에서, 30 분간 반응시켰다. 그 후, 슬라이드 글라스를 PBS로 3 분 × 2 회 세척하였다. 검토에 사용된 조직과 제1 항체의 조합은 다음과 같다.
ㆍ 위암 ...... 항-인간 p53 유전자 산물 단클론 항체 (DO-7) (니치레이 바이오사이언스)를 그대로 사용했다.
3. 제1 결합제와의 반응
여분의 액을 떨쳐버린 슬라이드 글라스 위에 AP 폴리머 시약 (M)을 적하하고 습윤 상자에서 25 ℃에서, 10 분간 반응시켰다. 그 후, 슬라이드 글라스를 PBS로 3 분 × 2 회 세척하였다. 부수적으로, 본 반응은 실시예 17 및 비교예 23과 비교예 24에서 실시되었다.
4. 링커 분자와의 반응
여분의 액을 떨쳐버린 슬라이드 글라스 위에 마우스 항-AP 항체를 적하하고 습윤 상자에서 25 ℃에서, 10 분간 반응시켰다. 그 후, 슬라이드 글라스를 PBS로 3 분 × 2 회 세척하였다. 부수적으로, 본 반응은 실시예 17에서만 실시되었다.
5. 제2 결합제와의 반응
여분의 액을 떨쳐버린 슬라이드 글라스 위에 AP 폴리머 시약 (M)을 적하하고 습윤 상자에서 25 ℃에서, 10 분간 반응시켰다. 그 후, 슬라이드 글라스를 PBS로 3 분 × 2 회 세척하였다. 부수적으로, 본 반응은 실시예 17 및 비교예 24에서만 실시되었다.
6. 기질 용액의 첨가ㆍ반응
여분의 액을 떨쳐버린 슬라이드 글라스 위에 패스트-레드 II 기질 키트 (니치레이 바이오사이언스)을 적하하여 실온에서 10 분간 반응시켰다. 그 후, 슬라이드 글라스를 흐르는 물에 5 분간 세척하였다.
7. 대비 염색, 탈수ㆍ세정, 봉입
A. 대비 염색
　드레인드 후, 슬라이드 글라스를 Mayer의 헤마톡실린 용액에 30 초간 담근다. 그 후, 슬라이드 글라스를 흐르는 물에 5 분간 세척하였다.
B. 풍건
　드레인드 후, 건조기를 이용하여 풍건을 실시했다.
C. 봉입
　크실렌에 살짝 담근 후, 영구적인 봉입제 (비-수용성) (니치레이 바이오사이언스)가 봉입에 사용되었다.
상기 염색 결과는 도 9에 도시되었다. 여기서, 도 9에서는 각각의 염색된 조직을 나타낸 현미경 사진은 접안 렌즈(10 배)와 대물 렌즈(4 배)인 광학 현미경 (올림푸스 주식회사)을 이용하여 촬영한 것이다.
표지 물질로서 알칼리 포스파타제 (AP)를 이용한 경우, 제1 결합제, 링커 분자와 제2 결합제를 이용한 실시예 17은 제1 결합제만을 이용한 비교예 23 및 제1 결합제 및 제2 결합제만을 이용한 비교예 24보다 검출 감도가 크게 향상되었다.
부수적으로, 대조군에서 백그란운드 염색은 발생되지 않았다.
시험예 6-2 : 표지 물질 (알칼리 포스파타제 : AP) 및 링커 분자 (토끼 항-AP 항체)를 이용한 반응계
서양고추냉이 퍼옥시다아제 (HRP) 대신에, 알칼리 포스파타제 (AP)를 표지 물질로 사용하며 링커 분자 (토끼 항-AP 항체)를 이용한 반응계에 대한 표적 마커의 검출 감도에 대해서 검토되었다.
다음 시험에서, 제1 결합제 및 제2 결합제 (알칼리 포스파타제 (AP)를 표지 물질로 이용한 아미노산 폴리머: AP 폴리머 시약 (R)) 및 링커 분자 (토끼 항-AP 항체)를 이용한 반응계는 실시예 18로 정의되었고; 제1 결합제 (AP 폴리머 시약 (R))만을 이용한 반응계는 비교예 25로 정의되었고; 제1 결합제 및 제2 결합제 (AP 폴리머 시약 (R))만을 이용한 반응계는 비교예 26으로 정의되었다.
시약의 조제
1. 제1 결합제의 조제
　아미노산 폴리머에 알칼리 포스파타제 (AP)와 항-토끼 Ig(동물 종: 염소)의 Fab' 단편을 결합한 AP 폴리머 시약 (R)를 10㎍/mL로 조제하였다.
2. 링커 분자의 조제
　토끼 항-AP 항체 (폴리클론성, NOVUS BIOLOGICALS 사)를 5㎍ / mL로 제조하였다.
3. 제2 결합제의 조제
　AP 폴리머 시약 (R)를 10㎍ / mL로 조제하였다.
면역조직화학 염색
1. 탈파라핀, 퍼옥시다아제 블로킹 및 항원 부활화 처리
　시험예 1과 동일한 방법으로 실시하였다.
2. 제1 항체 또는 대조군 (제1 항체 희석액)의 첨가ㆍ반응
여분의 액을 떨쳐버린 슬라이드 글라스 위에 제1 항체 또는 제1 항체 희석액을 적하하고 습윤 상자에서 25 ℃에서, 30 분간 반응시켰다. 그 후, 슬라이드 글라스를 PBS로 3 분 × 2 회 세척하였다. 검토에 사용된 조직과 제1 항체의 조합은 다음과 같다.
ㆍ 대장 암 ... 항-CDX-2 토끼 단클론 항체 (니치레이 바이오사이언스)를 그대로 사용했다.
3. 제1 결합제와의 반응
여분의 액을 떨쳐버린 슬라이드 글라스 위에 AP 폴리머 시약 (R)을 적하하고 습윤 상자에서 25 ℃에서, 10 분간 반응시켰다. 그 후, 슬라이드 글라스를 PBS로 3 분 × 2 회 세척하였다. 부수적으로, 본 반응은 실시예 18 및 비교예 25와 비교예 26에서 실시되었다.
4. 링커 분자와의 반응
여분의 액을 떨쳐버린 슬라이드 글라스 위에 토끼 항-AP 항체를 적하하고 습윤 상자에서 25 ℃에서, 10 분간 반응시켰다. 그 후, 슬라이드 글라스는 PBS로 3 분 × 2 회 세척하였다. 부수적으로, 본 반응은 실시예 18에서만 실시되었다.
5. 제2 결합제와의 반응
여분의 액을 떨쳐버린 슬라이드 글라스 위에 AP 폴리머 시약 (R)을 적하하고 습윤 상자에서 25 ℃에서, 10 분간 반응시켰다. 그 후, 슬라이드 글라스는 PBS로 3 분 × 2 회 세척하였다. 부수적으로, 본 반응은 실시예 18 및 비교예 26에서만 실시되었다.
6. 기질 용액의 첨가ㆍ반응
여분의 액을 떨쳐버린 슬라이드 글라스 위에 패스트-레드 II 기질 키트 (니치레이 바이오사이언스)을 적하하여 실온에서 10 분간 반응시켰다. 그 후, 슬라이드 글라스는 흐르는 물에 5 분간 세척하였다.
7. 대비 염색, 탈수ㆍ세정, 봉입
시험예 6-1과 동일한 방법으로 실시하였다.
상기 염색 결과는 도 10에 도시되었다. 여기서, 도 10에서는 각각의 염색된 조직을 나타낸 현미경 사진은 접안 렌즈(10 배)와 대물 렌즈(4 배)인 광학 현미경 (올림푸스 주식회사)을 이용하여 촬영한 것이다
표지 물질로서 알칼리 포스파타제 (AP)를 이용한 경우 제1 결합제, 링커 분자와 제2 결합제를 이용한 실시예 18은 제1 결합제만을 이용한 비교예 25 및 제1 결합제 및 제2 결합제만을 이용한 비교예 26보다 검출 감도가 크게 향상되었다.
또한, 대조군에서 백그라운드 염색은 발생되지 않았다.
시험예 7 : CISH 법의 고감도 염색법의 검토
본 시험에서는 CISH법 (Chromogenic in situ Hybridization : 3,3'- 디아미노벤지딘 (DAB) 등의 색소를 이용하여 조직 표본에서 DNA와 mRNA를 검출 하는 in situ Hybridization (ISH))에 본 발명을 적용할 수 있는지 다음의 절차에 따라 검토를 실시했다. 표적 마커 결합 분자로 디곡시게닌 (DIG)로 표지된 프로브가 조직 표본에 적용된다. 차단 후, DIG와 직접적으로 결합할 수있는 검출 시약을 이용하여 프로브가 검출되었다.
본 시험에서는 표적 마커 결합 분자로 HER2 Probe를 사용하였다.
그리고, 실시예 19에서 검출 시약으로 제1 결합제 (염소 항-DIG-HRP 폴리머 시약 (니치레이 바이오사이언스 사)), 링커 분자 (토끼 항-HRP 항체 (폴리클론성) (니치레이 바이오사이언스 사)) 및 제2 결합제 (Histofine® Simple Stain® MAX-PO (R) (니치레이 바이오사이언스))를 이용한 반응계를 선택했다.
또한, 비교예 27에서는 검출 시약으로 제1 결합제 (염소 항-DIG-HRP 폴리머 시약)만을 이용한 반응계를 선택했다. 또한, 비교예 28에서는 검출 시약으로 제1 결합제 (염소 항-DIG 항체) 및 제2 결합제 (Histofine® Simple Stain® MAX-PO (G) (니치레이 바이오사이언스))를 이용한 반응계를 선택했다.
CISH
1. 탈파라핀, 퍼옥시다아제 블로킹 및 항원 부활화 처리, 탈수ㆍ풍건
A. 표본 슬라이드의 준비
　조직 절편을 5㎛로 박절하여 MAS-코트 슬라이드 유리에 부착시켰다. 그 후, 슬라이드 글라스를 37 ℃ 배양기에서 하룻밤 동안 건조시켰다.
B. 탈파라핀, 퍼옥시다아제 블로킹 및 항원 부활화 처리, 탈수ㆍ풍건
(I) 크실렌 처리 (3 분 × 3 회)
　슬라이드를 크실렌에 3 분간 담근다. 그 후, 여분의 액을 떨쳐버리고 다른 크실렌에 3 분간 담근다. 그 후, 여분의 액을 떨쳐버리고 또 다른 크실렌에 3 분간 담근다.
(II) 에탄올 처리 (3 분 × 4 회)
　100 % 에탄올에 3 분간 담근다. 여분의 액을 떨쳐 버리고 다른 100 % 에탄올에 3 분간 담근다. 이 조작을 2 회 실시했다.
(III) 퍼옥시다아제 블로킹
　내생의 퍼옥시다아제의 제거를 실시했다. 드레인드 후, 슬라이드를 3V/V % 과산화수소에 5 분간 담근다.
(IV) 세척
　PBS로(1 분씩 2 회) 세척한다.
(V) 항원 부활화 처리
　전처리로서, 항원 부활화 용액 (10mM 구연산 나트륨 완충액 (pH6.0))을 사용하여 98 ℃에서 30 분간 가열 처리를 실시했다.
(VI) 세척
　PBS로(2 분씩 2 회) 세척한다.
(VII) 항원 부활화 처리
　습윤 상자에서 실온에서 3 분간 프로테아제 처리를 실시했다.
(VIII) 세척
　PBS로 세척하였다.
(IX) 탈수
　슬라이드를 70 % 에탄올, 90 % 에탄올, 100 % 에탄올에 각각 1 분간 담근 후 풍건시켰다.
변성 및 하이브리드화
(I) HER2 Probe를 와동하고, 슬라이드에 올려놓았다.
(II) 커버 글라스는 거품을 피하면서 슬라이드에 올려놓고 주위를 종이 본드로 봉인했다.
(III) 핫 플레이트를 이용하여 82 ℃에서 5 분간 변성시켰다.
(IV) 슬라이드를 습윤 상자로 이동하여 37 ℃에서 하룻밤 동안 하이브리드화했다.
포스트-하이브리드화 및 검출
(I) 조심스럽게 종이 본드를 떼어낸 후, 2 × SSC에서 실온에서 5 분간 세척하고 커버 유리를 분리했다.
(II) 상기 슬라이드는 2 × SSC에서 72 ℃에서 5 분간 세척하였다.
(III) 상기 슬라이드는 PBS에서 1 분간 2 회 세척 하였다.
(IV) 아래 표 6과 같이, 본 반응은 실시예 19 및 비교예 27과 비교예 28에서 실시되었다. 여기서, 모든 반응은 25 ℃에서 실시되었다. 각 공정 사이에서, 상기 슬라이드는 PBS에서 1 분간 3 회 세척을 실시했다.
Figure 112016111325295-pct00006
(V) 슬라이드를 PBS에서 1 분간 3 회 세척하였다. 그 후 PBS를 잘 드레인드 했다.
(VI) 여분의 액을 떨쳐버린 슬라이드 글라스 위에 N-Histofine® DAB-2V (니치레이 바이오사이언스)을 적하하여 실온에서 5 분간 반응시켰다.
(VII) 슬라이드 글라스를 흐르는 물에 5 분간 세척하였다.
(VIII) 드레인드 후, 슬라이드 글라스를 Mayer의 헤마톡실린 용액에 15 초 담궈 대조 염색을 하였다.
(IX) 슬라이드 글라스를 흐르는 물에 5 분간 세척하였다.
(X) 드레이닝은 100 % 에탄올 3 분간 탈수를 실시했다.
(XI) 슬라이드는 크실렌으로 5 분간 2 회 세정을 실시했다.
(XII) 영구적인 봉입제(비-수용성) (니치레이 바이오사이언스)를 사용하여 봉입를 실시했다.
　CISH에서 염색 감도는 광학 현미경 (올림푸스 주식회사) (접안 렌즈 (10 배), 대물 렌즈 (100 배)로 관찰)를 사용하여 육안으로 관찰하고, 비교예 27의 신호를 1+으로 판단한 결과를 다음 표 7에 나타냈다. 실시예 19은 비교예 27 및 비교예 28보다 검출 감도가 크게 향상되었다.
Figure 112016111325295-pct00007
시험예 8 : 면역 반응의 증강 검토
폴리에틸렌 글리콜의 사용
본 발명의 3-단계의 면역 반응 중 하나가 폴리에틸렌 글리콜의 공존 하에서 실시한 경우에 표적 마커의 검출 감도가 어떻게 변화하는지를 검토하기 위해서 비교 시험을 실시했다.
구체적으로는, 실시예 20에서는 폴리에틸렌 글리콜의 공존 없이, 제1 결합제, 링커 분자와 제2 결합제를 사용하여 3-단계 면역 반응을 수행하였다.
실시예 21에서 폴리에틸렌 글리콜 및 제1 결합제의 공존 하에서 1-단계의 면역 반응을 실시하고, 그 다음 링커 분자와 제2 결합제를 사용하여 2-단계 및 3-단계의 면역 반응을 각각 실시했다.
실시예 23에서 제1 결합제를 사용하여 1-단계의 면역 반응을 실시하고; 폴리에틸렌 글리콜 및 링커 분자의 공존 하에서 2-단계의 면역 반응을 실시하고; 그 다음에 제2 결합제를 사용하여 3-단계 면역 반응을 실시했다.
실시예 22에서 제1 결합제를 사용하여 1-단계 면역 반응을 수행하고; 링커 분자를 사용하여 2-단계의 면역 반응을 실시하고, 그 다음, 폴리에틸렌 글리콜 및 제2 결합제의 공존 하에서 3-단계 면역 반응을 실시했다.
실시예 24에서 제1 결합제, 링커 분자와 제2 결합제를 사용하여 3-단계 면역 반응 모두를 폴리에틸렌 글리콜의 공존 하에서 실시했다.
부수적으로, 구체적인 절차는 생물학적 시료로 대장 암 조직만을 사용하 표적 마커 결합 분자 (제1 항체 : 항-CDX-2 토끼 단클론 항체 (니치레이 바이오사이언스))를 5 배 희석 사용 이외에는 시험예 2에 준하여 실시했다.
시약의 조제
1. 제1 결합제의 조제
아미노산 폴리머에 퍼옥시다아제와 항-마우스 Ig (동물 종: 염소)의 Fab' 단편을 결합시킨 폴리머 시약 (M)과 아미노산 폴리머에 퍼옥시다아제와 항-토끼 Ig (동물 종 : 염소)의 Fab' 단편을 결합시킨 폴리머 시약 (R)을 각 5㎍/mL 씩 혼합하여 칵테일 폴리머 시약 (MULTI)를 제조하였다.
2. 링커 분자의 조제
마우스 항-HRP 항체 (클론 : HP-03) (TFS 사) 및 마우스 항-HRP 항체 (클론 : 2H11) (Novus Biologicals 사)를 각 2.5㎍ / mL 씩 혼합하여 제조하였다.
3. 제2 결합제의 조제
아미노산 폴리머에 퍼옥시다아제와 항-마우스 Ig (동물 종: 염소)의 Fab' 단편을 결합시킨 폴리머 시약 (M)를 5㎍ / mL에 제조하였다.
4. 폴리에틸렌 글리콜
실시예 21 ~ 24에서는 제1 결합제, 링커 분자와 제2 결합제를 구성하는 하나의 수용액에서, 폴리에틸렌 글리콜 (평균 분자량 (MW) : 8,000, Wako Pure Chemical Industries 사) 2.5wt %로 용해시켰다.
상기 염색 결과는 도 11에 도시되었다. 여기서, 도 11에서는 각각의 염색된 조직을 나타낸 현미경 사진은 접안 렌즈(10 배)와 대물 렌즈(4 배)인 광학 현미경 (올림푸스 주식회사)을 이용하여 촬영한 것이다.
하나의 면역 반응에서 폴리에틸렌 글리콜을 공존시킨 실시예 21 - 24의 검출 감도는 하나의 면역 반응에서 폴리에틸렌 글리콜의 공존이 없는 실시예 20에 비해 향상되었다. 특히, 모든 단계 (1-단계 ~ 3-단계)에서 폴리에틸렌 글리콜을 공존시킨 실시예 24의 검출 감도는 실시예 20에 비해 현저하게 향상되었다.

Claims (20)

  1. 표적 마커와 특이적으로 결합 가능한 표적 마커 결합 분자와 결합하여 생물학적 시료 중에서 표적 마커를 검출하기 위한 조합물로서:
    　　(a) 상기 표적 마커 결합 분자와 직접 또는 간접적으로 특이적으로 결합 가능한 제1 결합 분자와 표지 물질을 포함하는 제1 결합제,
    　　(b) 링커 분자, 및
    　　(c) 상기 링커 분자에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 또는 그 항원 결합 단편인 제2 결합 분자와, 표지 물질을 포함하는 제2 결합제를 적어도 포함하되,
    상기 링커 분자가 상기 제1 결합제의 표지 물질 및 제2 결합제의 표지 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 항체 및 그 항원 결합 단편이고,
    링커 분자와 제2 결합제의 결합 부위의 종류는 제2 결합 분자를 통하는 결합 부위 및 표지 물질을 통하는 결합 부위의 적어도 2 종류인, 조합물.
  2. 제1항에 있어서, 표지 물질이 화학 발광 표지, 금속 입자, 형광 표지, 효소 표지, 보조 효소 표지, 표지된 항체, 색소, 생물 발광 표지, 햅텐 및 폴리머 입자로부터 선택되는 적어도 1 종 이상인 조합물.
  3. 제1항 또는 제2에 있어서, 상기 제1 결합제가 상기 제1 결합 분자와 상기 표지 물질이 직접적으로 또는 담체를 통해서 간접적으로 연결된 구조체인 조합물.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 제2 결합제는 상기 제2 결합 분자와 상기 표지 물질이 직접적으로 또는 담체를 통해서 간접적으로 연결된 구조체인 조합물.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 제1 결합 분자는 항체 또는 그 항원 결합 단편인 조합물.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 표적 마커 결합 분자와 더욱 결합된 조합물.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 키트의 형태인 조합물.
  8. 피험체로부터 얻어진 생물학적 시료 중에서 표적 마커를 검출하는 방법으로서,
    　　(i) 미리 표적 마커와 특이적으로 결합된 표적 마커 결합 분자와 제1 결합제를 접촉시켜 제1 복합체를 얻는 단계;
    　　(ii) 상기 제1 복합체와 링커 분자를 접촉시켜 제2 복합체를 얻는 단계; 및
    　　(iii) 상기 제2 복합체와 제2 결합제와 접촉시켜 제3 복합체를 얻는 단계를 포함하고,
    　　상기 제1 결합제는 상기 표적 마커 결합 분자와 직접 또는 간접적으로 특이적으로 결합 가능한 제1 결합 분자와 표지 물질을 포함하고;
    　　 　　상기 제2 결합제는 상기 링커 분자와 특이적으로 결합 가능한 항체 또는 그 항원 결합 단편인 제2 결합 분자 및 표지 물질을 포함하고,
    상기 링커 분자가 상기 표지 물질과 특이적으로 결합할 수 있고 제1 결합제 및 제2 결합제와 특이적으로 결합할 수 있는 항체 또는 그 항원 결합 단편이고, 링커 분자가 제2 결합제 내의 제2 결합 분자에 의하여 특이적으로 결합되고,
    링커 분자와 제2 결합제의 결합 부위의 종류는, 제2 결합 분자를 통하는 결합 부위 및 표지 물질을 통하는 결합 부위의 적어도 2 종류인, 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 제3 복합체 중에서 표지 물질을 검출하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 상기 링커 분자가 항체 또는 그의 항원 결합 단편인 방법.
  11. 제8항 또는 제9항에 있어서, 상기 표지 물질이 화학 발광 표지, 금속 입자, 형광 표지, 효소 표지, 보조 효소 표지, 표지된 항체, 색소, 생물 발광 표지, 햅텐 및 폴리머 입자로부터 선택되는 적어도 1 종 이상의 표지 물질인 방법.
  12. 제8항 또는 제9항에 있어서, 상기 제1 결합제가 제1 결합 분자와 상기 표지 물질이 직접적으로 또는 담체를 통해 간접적으로 연결된 구조체인 방법.
  13. 제8항 또는 제9항에 있어서, 상기 제2 결합제가 제2 결합 분자와 상기 표지 물질이 직접적으로 또는 담체를 통해 간접적으로 연결된 구조체인 방법.
  14. 제8항 또는 제9항에 있어서, 상기 제1 결합 분자는 항체 또는 그 항원 결합 단편인 방법.
  15. 제8항 또는 제9항에 있어서, 상기 제2 결합 분자는 항체 또는 그 항원 결합 단편인 방법.
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