BR112016024624B1 - Produto de combinação para detectar marcador alvo, método para detectar um marcador alvo em uma amostra biológica obtida de um indivíduo e uso de um produto de combinação para detectar um marcador alvo em uma amostra biológica - Google Patents

Produto de combinação para detectar marcador alvo, método para detectar um marcador alvo em uma amostra biológica obtida de um indivíduo e uso de um produto de combinação para detectar um marcador alvo em uma amostra biológica Download PDF

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Abstract

produto de combinação para detectar marcador alvo. a presente invenção diz respeito a um produto de combinação para detectar um marcador alvo de modo simples e com alta sensibilidade. mais especificamente, a presente invenção diz respeito a um produto de combinação para detectar um marcador alvo em uma amostra biológica em combinação com uma molécula de ligação de marcador alvo que é capaz de ligar especificamente ao marcador alvo na amostra biológica, a combinação compreendendo, pelo menos: (a) um primeiro agente de ligação compreendendo uma primeira molécula de ligação que é capaz de ligar direta ou indiretamente de modo específico à molécula de ligação do marcador alvo, e uma substância rotuladora; (b) uma molécula ligadora que é capaz de ligar especificamente ao primeiro agente de ligação; e (c) um segundo agente de ligação que é capaz de ligar especificamente à molécula ligadora, e compreende uma segunda molécula de ligação e uma substância rotuladora.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA AOS PEDIDOS RELACIONADOS
[0001] O presente pedido de patente reivindica prioridade com base no Pedido de patente japonês No. 2014-89675 depositado em 23 de abril de 2014, a divulgação inteira do qual é aqui incorporada por referência.
CAMPO TÉCNICO
[0002] A presente invenção diz respeito a um produto de combinação para detectar um marcador alvo e um método de detecção usando o mesmo.
TÉCNICA FUNDAMENTAL
[0003] Em virtude do avanço recente da imunoquímica, imunoensaios que garantem a detecção sensível de uma quantidade traço de uma substância pelo uso de uma reação de antígeno-anticorpo são amplamente usados. Um imunoensaio comum é, por exemplo, um método de imunotingimento.
[0004] Os métodos de imunotingimento são intencionados para detectar uma substância específica em uma célula ou uma seção de tecido usando, por exemplo, um anticorpo que reconheça a substância. Entre estes métodos, aqueles usando uma enzima como uma substância detectável são aludidos como técnicas de imunoenzima. Os métodos que foram desenvolvidos como as técnicas de imunoenzima incluem métodos diretos usando um anticorpo primário rotulado com uma enzima capaz de visualizar o antígeno e métodos indiretos compreendendo rotular um anticorpo secundário sem rotular um anticorpo primário.
[0005] Além disso, em anos recentes, sensibilidade mais alta é requerida de modo a visualizar uma quantidade pequena de uma proteína antigênica distribuída em tecidos e células ou verificar uma substância antigênica cuja antigenicidade é significantemente prejudicada pela fixação em formalina ou tratamento incorporado em parafina, e vários métodos de amplificação, que são técnicas de imunoenzima modificadas, foram desenvolvidos um após o outro. Os exemplos destes métodos de amplificação incluem, na ordem crescente de sensibilidade, métodos diretos < métodos indiretos < método PAP (peroxidase antiperoxidase) < método ABC (complexo de avidina-biotina-peroxidase) < método LSAB (estreptavidina biotina rotulados) < método poliméricos < método CSA (amplificação de sinal catalisada). (Documento que Não de Patente 1)
[0006] Entre os métodos de amplificação acima, os métodos mais populares, altamente sensíveis e simples são, atualmente, os métodos poliméricos.
[0007] Um método polimérico convencional é, por exemplo, um método compreendendo reagir um anticorpo primário com um marcador alvo tal como um antígeno, e depois reagir um reagente polimérico (em que muitas enzimas e anticorpos secundários são ligados a um polímero) com o produto de reação, formando deste modo um complexo do antígeno, anticorpo primário, anticorpo secundário, polímero e enzima. O desenvolvimento de cor de um substrato através do uso da atividade enzimática neste complexo permite a visualização do marcador alvo (Documento que Não de Patente 1).
[0008] Também, um outro método polimérico é, por exemplo, um método compreendendo reagir um reagente em ponte (que também é chamado variadamente pelos marcadores, por exemplo, ligador, sonda ou pós-primário) entre o anticorpo primário e o reagente polimérico no método polimérico convencional acima para a amplificação de sinal. É dito que, como um resultado, este método pode ser esperado ter sensibilidade duas a cinco vezes tão alta como aquela do método acima (Documento que Não de Patente 1).
[0009] Em anos recentes, foi ainda desenvolvido um novo método polimérico compreendendo reagir um reagente polimérico adicional (segundo reagente polimérico) com o reagente polimérico acima (primeiro reagente polimérico) para a amplificação de sinal (Documento de Patente 1).
[0010] Entretanto, mesmo quando o método polimérico convencional é utilizado, o tingimento em um nível desejado não pode ser atingido, em alguns casos, porque uma quantidade extremamente pequena do marcador alvo diminuiu a antigenicidade, e assim por diante. Em uma tal situação técnica, um meio para detectar um marcador alvo de modo simples e com sensibilidade mais alta é ainda demandada.
Documentos da Técnica Anterior Documento que Não de Patente
[0011] Documento que Não de Patente 1: Shingo Kamoshida, Immunostaining technique from basics- How to surely stain-, Histochemistry and Cytochemistry 2012, editado pela Japan Society of Histochemistry and Cytochemistry, 2012, p. 11-25
[0012] Documento de Patente
[0013] Documento de Patente 1: JP 2007-513334 T
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0014] Um objetivo da presente invenção é detectar um marcador alvo expresso em uma amostra biológica de modo simples e com alta sensibilidade.
[0015] Os presentes inventores descobriram agora que, quando uma pluralidade de agentes de ligação rotulados com substâncias de rotulação e uma molécula ligadora específica são combinados para detectar um marcador alvo, o marcador alvo pode ser detectado de modo simples e com sensibilidade consideravelmente alta. A presente invenção está fundamentada em tal descoberta.
[0016] A presente invenção inclui as seguintes invenções. [1] Um produto de combinação para detectar um marcador alvo em uma amostra biológica em combinação com uma molécula de ligação de marcador alvo que é capaz de ligar especificamente ao marcador alvo, o produto de combinação compreendendo, pelo menos: a) um primeiro agente de ligação compreendendo uma primeira molécula de ligação que é capaz de ligar direta ou indiretamente de modo específico à molécula de ligação do marcador alvo, e uma substância rotuladora; b) uma molécula ligadora que é capaz de ligar especificamente ao primeiro agente de ligação, e c) um segundo agente de ligação que é capaz de ligar especificamente à molécula ligadora, e compreende uma segunda molécula de ligação e uma substância rotuladora. [2] O produto de combinação de acordo com o item [1], em que a molécula ligadora é capaz de ligar especificamente à substância rotuladora. [3] O produto de combinação de acordo com os itens [1] ou [2], em que a molécula ligadora é um anticorpo ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo. [4] O produto de combinação de acordo com qualquer um dos itens de [1] a [3], em que a substância rotuladora é pelo menos uma selecionada de um rótulo quimioluminescente, uma partícula metálica, um rótulo fluorescente, um rótulo enzimático, um rótulo de coenzima, um anticorpo rotulado, um pigmento, um rótulo bioluminescente, um hapteno e uma partícula polimérica. [5] O produto de combinação de acordo com qualquer um dos itens [1] a [4], em que o primeiro agente de ligação é uma estrutura em que a primeira molécula de ligação e a substância rotuladora são conectadas entre si direta ou indiretamente via um carregador. [6] O produto de combinação de acordo com qualquer um dos itens [1] a [5], em que o segundo agente de ligação é uma estrutura em que a segunda molécula de ligação e a substância rotuladora são conectadas entre si direta ou indiretamente via um carregador. [7] O produto de combinação de acordo com qualquer um dos itens [1] a [6], em que a primeira molécula de ligação é um anticorpo ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo. [8] O produto de combinação de acordo com qualquer um dos itens [1] a [7], em que a segunda molécula de ligação é um anticorpo ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo. [9] O produto de combinação de acordo com qualquer um dos itens [1] a [8], que é combinado ainda com a molécula de ligação do marcador alvo. [10] O produto de combinação de acordo com qualquer um dos itens [1] a [9], que está na forma de um kit. [11] Um método para detectar um marcador alvo em uma amostra biológica obtida de um indivíduo, compreendendo as etapas de: (i) contatar uma molécula de ligação de marcador alvo preliminarmente ligado especificamente ao marcador alvo com um primeiro agente de ligação, obtendo deste modo um primeiro complexo; (ii) contatar o primeiro complexo com uma molécula ligadora, obtendo deste modo um segundo complexo; e (iii) contatar o segundo complexo com um segundo agente de ligação, obtendo deste modo um terceiro complexo, em que o primeiro agente de ligação compreende uma primeira molécula de ligação que é capaz de ligar direta ou indiretamente de modo específico à molécula de ligação do marcador alvo, e uma substância rotuladora; em que a molécula ligadora é capaz de ligar especificamente ao primeiro agente de ligação; e em que o segundo agente de ligação é capaz de ligar especificamente à molécula ligadora e compreende uma segunda molécula de ligação e uma substância rotuladora. [12] O método de acordo com o item [11], compreendendo ainda a etapa de detectar a substância rotuladora no terceiro complexo. [13] O método de acordo com os itens [11] ou [12], em que a molécula ligadora é um anticorpo ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo. [14] O método de acordo com qualquer um dos itens [11] a [13], em que a molécula ligadora é capaz de ligar especificamente à substância rotuladora. [15] O método de acordo com qualquer um dos itens [11] a [14], em que a substância rotuladora é pelo menos uma substância rotuladora selecionada de um rótulo quimioluminescente, uma partícula metálica, um rótulo fluorescente, um rótulo enzimático, um rótulo de coenzima, um anticorpo rotulado, um pigmento, um rótulo bioluminescente, um hapteno e uma partícula polimérica. [16] O método de acordo com qualquer um dos itens [11] a [15], em que o primeiro agente de ligação é uma estrutura em que a primeira molécula de ligação e a substância rotuladora são conectadas entre si direta ou indiretamente via um carregador. [17] O método de acordo com qualquer um dos itens [11] a [16], em que o segundo agente de ligação é uma estrutura em que a segunda molécula de ligação e a substância rotuladora são conectada entre si direta ou indiretamente via um carregador. [18] O método de acordo com qualquer um dos itens [11] a [17], em que a primeira molécula de ligação é um anticorpo ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo. [19] O método de acordo com qualquer um dos itens [11] a [18], em que a segunda molécula de ligação é um anticorpo ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo. [20] Uso de um produto de combinação para detectar um marcador alvo em uma amostra biológica em combinação com uma molécula de ligação de marcador alvo que é capaz de ligar especificamente ao marcador alvo, o produto de combinação compreendendo, pelo menos: a) um primeiro agente de ligação compreendendo uma primeira molécula de ligação que é capaz de ligar direta ou indiretamente de modo específico à molécula de ligação do marcador alvo, e uma substância rotuladora; b) uma molécula ligadora que é capaz de ligar especificamente ao primeiro agente de ligação; e c) um segundo agente de ligação que é capaz de ligar especificamente à molécula ligadora, e compreende uma segunda molécula de ligação e uma substância rotuladora, em que a molécula ligadora é capaz de ligar especificamente à substância rotuladora.
[0017] De acordo com a presente invenção, o marcador alvo pode ser detectado de modo simples e com sensibilidade consideravelmente alta.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [FIG. 1]
[0018] A FIG. 1 é um diagrama esquemático concernente a um método para detectar um marcador alvo de acordo com a presente invenção.
[FIG. 2]
[0019] A FIG. 2 mostra fotografias microscópicas (micrographs) que apresentam os resultados do tingimento imunoistoquímico no Exemplo de Teste 1 (Exemplos Comparativos 1 e 2).
[FIG. 3]
[0020] A FIG. 3 mostra fotografias microscópicas que apresentam os resultados do tingimento imunoistoquímico no Exemplo de Teste 2 (Exemplos 1 e 2 e Exemplos Comparativos 3 e 4).
[FIG. 4]
[0021] A FIG. 4 mostra fotografias microscópicas que apresentam os resultados do tingimento imunoistoquímico no Exemplo de Teste 3 (Exemplos 3 a 5 e Exemplos Comparativos 5 a 7).
[FIG. 5]
[0022] A FIG. 5 mostra fotografias microscópicas que apresentam os resultados do tingimento imunoistoquímico no Exemplo de Teste 4:4-1 (Exemplos 6 e 7 e Exemplos Comparativos 8 e 9).
[FIG. 6]
[0023] A FIG. 6 mostra fotografias microscópicas que apresentam os resultados do tingimento imunoistoquímico no Exemplo de Teste 4:4-2 (Exemplos 8 e 9 e Exemplos Comparativos 10 e 11).
[FIG. 7]
[0024] A FIG. 7 mostra fotografias microscópicas que apresentam os resultados do tingimento imunoistoquímico no Exemplo de Teste 4:4-3 (Exemplos 10 a 12 e Exemplos Comparativos 12 a 14).
[FIG. 8]
[0025] A FIG. 8 mostra fotografias microscópicas que apresentam os resultados do tingimento imunoistoquímico no Exemplo de Teste 5 (Exemplos 13 a 16 e Exemplos Comparativos 15 a 22).
[FIG. 9]
[0026] A FIG. 9 mostra fotografias microscópicas que apresentam os resultados do tingimento imunoistoquímico no Exemplo de Teste 6:6-1 (Exemplo 17 e Exemplos Comparativos 23 e 24).
[FIG. 10]
[0027] A FIG. 10 mostra fotografias microscópicas que apresentam os resultados do tingimento imunoistoquímico no Exemplo de Teste 6:6-2 (Exemplo 18 e Exemplos Comparativos 25 e 26).
[FIG. 11]
[0028] A FIG. 11 mostra fotografias microscópicas que apresentam os resultados do tingimento imunoistoquímico no Exemplo de Teste 7: Exemplo 20 realizado na ausência de polietileno glicol e Exemplos 21 a 24 realizados na presença de polietileno glicol.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Produto de combinação
[0029] O produto de combinação da presente invenção é aquele para detectar um marcador alvo em uma amostra biológica em combinação com uma molécula de ligação de marcador alvo que é capaz de ligar especificamente ao marcador alvo, caracterizado por compreender, pelo menos: a) um primeiro agente de ligação compreendendo uma primeira molécula de ligação que é capaz de ligar direta ou indiretamente de modo específico à molécula de ligação do marcador alvo, e uma substância rotuladora; b) uma molécula ligadora que é capaz de ligar especificamente ao primeiro agente de ligação; e c) um segundo agente de ligação que é capaz de ligar especificamente à molécula ligadora, e compreende uma segunda molécula de ligação e uma substância rotuladora.
[0030] A seguir, uma forma de realização de um método de detecção usando o produto de combinação da presente invenção será explicada de acordo com a FIG. 1, embora não limitando particularmente a presente invenção.
[0031] Na FIG. 1, um marcador alvo 2 a ser detectado é expresso em uma amostra biológica 1. De modo a capturar este marcador alvo 2, uma molécula de ligação de marcador alvo 3 é preliminarmente ligada especificamente ao marcador alvo 2.
[0032] Em seguida, um primeiro agente de ligação 4, uma molécula ligadora 5 e um segundo agente de ligação 6 são fornecidos como reagentes para detectar o marcador alvo 2.
[0033] Aqui, o primeiro agente de ligação 4 é composto de uma primeira molécula de ligação 7 que é capaz de ligar direta ou indiretamente de modo específico à molécula de ligação do marcador alvo 3, uma substância rotuladora 8 e um carregador 9 (tal como um polímero).
[0034] Também, o segundo agente de ligação 6 é uma estrutura que é capaz de ligar especificamente à molécula ligadora 5. Na FIG. 1, o segundo agente de ligação 6 é composto de uma segunda molécula de ligação 10 que é capaz de ligar especificamente à molécula ligadora 5, uma substância rotuladora 8’ e um carregador 9’ (tal como um polímero).
[0035] Também, a molécula ligadora 5 compreende pelo menos três sítios de ligação que são capazes de ligar especificamente a substância rotuladora 8, a segunda molécula de ligação 10 e a substância rotuladora 8’.
[0036] Na FIG. 1, a combinação dos reagentes de detecção preliminarmente fornecidos como descrito acima pode ser usada para detectar o marcador alvo através das seguintes primeira à terceira etapas.
[0037] Na primeira etapa, a molécula de ligação do marcador alvo 3 ligada ao marcador alvo 2 é contatada com o primeiro agente de ligação 4, obtendo deste modo um primeiro complexo (1 a 4).
[0038] Então, na segunda etapa, o primeiro complexo (1 a 4) é contatado com a molécula ligadora 5, obtendo deste modo um segundo complexo (1 a 5).
[0039] Depois disso, na terceira etapa, o segundo complexo (1 a 5) é contatado com o segundo agente de ligação 6, obtendo deste modo um terceiro complexo (1 a 6). Aqui, a molécula ligadora 5 e o segundo agente de ligação 6 são estavelmente ligados entre si via pelo menos dois sítios de ligação, isto é, a segunda molécula de ligação 10 e a substância rotuladora 8’.
[0040] Através da primeira à terceira etapas acima, o marcador alvo 2 pode ser rotulado tanto pela substância rotuladora 8 quanto pela substância rotuladora 8’ e detectado com alta sensibilidade de detecção.
Amostra biológica
[0041] A amostra biológica da presente invenção se refere a uma amostra obtida de qualquer um dos indivíduos, por exemplo, um animal (preferivelmente um mamífero, mais preferivelmente um ser humano), uma planta ou uma bactéria. A amostra biológica acima pode ser composta de uma célula eucariótica ou procariótica ou de um tecido ou célula.
Marcador alvo
[0042] O marcador alvo na amostra biológica da presente invenção se refere a qualquer molécula presente na amostra biológica. Os exemplos do marcador alvo acima incluem proteínas e fragmentos de proteína do mesmo, peptídeos, ácidos nucléicos, lipídeos, glicolipídeos, açúcares, polissacarídeos e amido. Aqui, a proteína inclui proteínas modificadas tais como glicoproteínas, lipoproteínas, fosfoproteínas e proteínas metiladas, e o ácido nucléico inclui DNA e RNA. Também, o marcador alvo acima pode ser expresso na superfície da amostra biológica, por exemplo, ligado à membrana, ou contido no interior da amostra biológica, por exemplo, dentro da membrana celular, citoplasma ou núcleo.
Molécula de ligação do marcador alvo
[0043] A molécula de ligação do marcador alvo da presente invenção não é particularmente limitada contanto que a mesma seja capaz de ligar especificamente ao marcador alvo na amostra biológica, e os exemplos da mesma incluem anticorpos ou fragmentos do mesmo (incluindo um fragmento de ligação de antígeno), DNA, RNA, sondas de ácido nucléico tais como um ácido nucléico peptídico (PNA), ligantes ou receptores.
Primeiro agente de ligação
[0044] O primeiro agente de ligação da presente invenção compreende uma primeira molécula de ligação que é capaz de ligar direta ou indiretamente de modo específico a uma molécula de ligação de marcador alvo, e uma substância rotuladora. A primeira molécula de ligação e a substância rotuladora de acordo com a presente invenção podem ser direta ligadas entre si em qualquer local contanto que o efeito da presente invenção não seja inibido. Também, o primeiro agente de ligação pode compreender um carregador junto com a primeira molécula de ligação e a substância rotuladora de acordo com a presente invenção. Também, o primeiro agente de ligação da presente invenção pode incluir um rótulo de hapteno.
Primeira molécula de ligação
[0045] A primeira molécula de ligação não é limitada contanto que a mesma seja capaz de ligar direta ou indiretamente de modo específico à molécula de ligação do marcador alvo, mas é preferivelmente um anticorpo, um fragmento de ligação de antígeno do mesmo. Aqui, o anticorpo pode ser de qualquer isótipo, isto é, IgG, IgM, IgA, IgD ou IgE. Também, exemplos do fragmento de anticorpo incluem fragmentos de ligação de antígeno, preferivelmente Fab, Fab’, (Fab’)2, Fv, scFv, diacorpos, triacorpos, tetracorpos ou anticorpos de domínio único.
[0046] Também, a sentença que a primeira molécula de ligação especificamente liga “indiretamente” à molécula de ligação do marcador alvo significa que uma molécula tal como um reagente em ponte é interposto entre a molécula de ligação do marcador alvo e a primeira molécula de ligação de modo que a primeira molécula de ligação seja capaz de ligar especificamente à molécula tal como um reagente em ponte. O reagente em ponte não é particularmente limitado contanto que o efeito da presente invenção não seja inibido, e exemplos do mesmo incluem anticorpos e fragmentos de ligação de antígeno tais como Fab, Fab’, (Fab’)2, Fv ou scFv. O reagente em ponte acima pode incluir ainda um rótulo de hapteno ou um rótulo fluorescente.
Substância rotuladora no primeiro agente de ligação
[0047] A substância rotuladora no primeiro agente de ligação da presente invenção não é particularmente limitada contanto que o efeito da presente invenção não seja inibido, e exemplos do mesmo incluem rótulos quimioluminescentes, partículas metálicas, rótulos fluorescentes, rótulos de enzima, rótulos de coenzima, anticorpos rotulados, pigmentos, rótulos bioluminescentes, haptenos e partículas poliméricas. Também, a substância rotuladora acima é mais preferivelmente rotulada com uma enzima utilizável em uma técnica de imunoenzima, e os exemplos de tais enzimas incluem peroxidase de rábano (HRP), fosfatase alcalina (AP), β- galactosidase (GAL), glicose-6-fosfato desidrogenase, β-N-acetilglicosaminidase, β- glicuronidase, invertase, xantina oxidase, luciferase de vagalume, e glicose oxidase (GO).
[0048] Também, quando uma enzima é usada como a substância rotuladora, o substrato da mesma não é limitado contanto que seja uma substância que seja reagida com a substância rotuladora acima para desenvolver uma cor. Os exemplos de substratos habitualmente usados para a peroxidase de rábano incluem 3,3’- diaminobenzidina (DAB), diaminobenzidina com realce por níquel, 3-amino-9- etilcarbazol (AEC), dicloridreto de benzidina (BDHC), reagente de Hanker-Yates (HYR), azul de indofano (IB), tetrametilbenzidina (TMB), 4-cloro-1-naftol (CN), α-naftol pironina (α-NP), o-dianisidina (OD), fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolila (BCIP), nitro azul tetrazólio (NBT), cloreto de 2-(p-iodofenil)-3-p-nitrofenil-5-fenil tetrazólio (INT), tetranitro azul tetrazólio (TNBT), e 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactosideo/ferro- ferricianeto (BCIG/FF).
[0049] Também, os exemplos de substratos habitualmente usados para a fosfatase alcalina incluem naftol-AS-B1-fosfato/vermelho rápido TR (NABP/FR), naftol-AS-MX-fosfato/vermelho rápido TR (NAMP/FR), naftol-AS-B1-fosfato/vermelho rápido TR (NABP/FR), naftol-AS-MX-fosfato/vermelho rápido TR (NAMP/FR), naftol- AS-B1-fosfato/nova fucsina (NABP/NF), fosfato de bromocloroindolila/nitro azul tetrazólio (BCIP/NBT), e 5-bromo-4-cloro-3-indolil-b-d-galactopiranosídeo (BCIG).
Carregador no primeiro agente de ligação
[0050] Também, o carregador no primeiro agente de ligação não é particularmente limitado contanto que o efeito da presente invenção não seja inibido, mas é preferivelmente um polímero de ocorrência natural ou sintético. Também, o peso molecular do polímero de acordo com a presente invenção não é particularmente limitado contanto que o efeito da presente invenção não seja inibido, mas, como um exemplo preferido do mesmo, o peso molecular médio (Mw) pode ser definido dentro da faixa de 2.000 a 500.000. Um tal peso molecular médio pode ser determinado, por exemplo, usando um produto padrão do polímero como um índice, pela filtração em gel (GPC). A faixa de peso molecular acima, entretanto, é um mero guia, e os pesos moleculares que são mais altos ou mais baixos do que a faixa acima podem ser usados contanto que o objetivo da presente invenção seja atingido. Os exemplos adequados de um tal polímero incluem poliaminoácidos, proteínas, polinucleotídeos, polissacarídeos ou polímeros sintéticos orgânicos. Também, de modo a aumentar a sensibilidade do imunoensaio, muitas substâncias de rotulação são desejavelmente ligadas ao carregador da presente invenção.
[0051] Por exemplo, um peptídeo compreendendo pelo menos dois grupos amino múltiplos com propriedades de ligação pode ser usado como o poliaminoácido da presente invenção. Os exemplos do poliaminoácido incluem poliaminoácido compreendendo lisina, arginina, ornitina, glutamina ou qualquer outro aminoácido básico que tenha um grupo α-amino, um grupo ε-amino ou qualquer outro grupo amino. Além disso, exemplos específicos do poliaminoácido incluem, além das polilisinas que são polímeros de lisina tendo um grupo ε-amino, vários poliaminoácidos tendo lisina e, adicionalmente, outros aminoácidos. Os exemplos do último polímero de peptídeo incluem copolímeros aleatórios de lisina e glicina, copolímeros aleatórios de lisina e serina, e copolímeros aleatórios de lisina e ácido glutâmico, e aqueles tendo vários pesos moleculares são comercializados.
[0052] Também, os exemplos da proteína de acordo com a presente invenção incluem albuminas, imunoglobulinas ou proteínas equivalentes a vírus (VLP).
[0053] Os exemplos do polinucleotídeo de acordo com a presente invenção incluem aqueles compreendendo uma ou mais unidade(s) constituintes selecionadas de DNA, PNA, LNA, etc. Também, o polinucleotídeo da presente invenção pode estar na forma de uma construção dendrimérica.
[0054] Também, os exemplos do polissacarídeo de acordo com a presente invenção incluem dextrano, agarose, dextrina e amido solúvel. Também, um polissacarídeo no qual um grupo aldeído, um grupo amino ou qualquer outro grupo ativo é introduzido pode ser usado como um tal polissacarídeo. O polissacarídeo tendo um grupo aldeído pode ser facilmente preparado reagindo-se periodato de sódio com um polissacarídeo. Um grupo amino também pode ser introduzido em um polissacarídeo por um método conhecido. Por exemplo, dextrano tendo um grupo amino pode ser preparado tratando-se dextrano com periodato de sódio para produzir grupos aldeído, em seguida reagir os mesmos com diamina, e reduzir os produtos de reação com boroidrato de sódio. Também, a introdução de um grupo ativo em um polissacarídeo também pode ser realizada por um método conhecido. Por exemplo, dextrano tendo grupos vinila é obtido reagindo-se divinil sulfona com dextrano. Os exemplos do polissacarídeo acima incluem polissacarídeo incluindo dextrano, carboximetil dextrano, dextrano polialdeído, carboximetil dextrano lactona e ciclodextrina; pululano, esquizofilano, escleroglicano, xantana, gelana, O-etilamina guarana, quitina e quitosano tal como 6-O-carboximetil quitina e N-carboximetil quitosano; celuloses derivatizadas tais como carboximetil celulose, carboximetil hidroxietil celulose, hidroxietil celulose, 6-amino-6-desóxi celulose e O-etilamina celulose; amido hidroxilado, hidroxipropil amido, hidroxietil amido, carragenina, alginato e agarose; polissacarídeos sintéticos tais como ficol e ficol carboximetilado.
[0055] Também, os exemplos do polímero sintético orgânico de acordo com a presente invenção incluem, preferivelmente, polímeros compostos de pelo menos uma unidade constituinte selecionada do grupo consistindo de ácido (met)acrílico, (met)acrilamida, éster (met)acrílico, metacrilato de metila, ácido maléico, anidrido maléico, acetato de vinila, álcool vinílico, cloroacetato de vinila, etileno glicol, propileno glicol, glicerina, diisocianato, estireno, isopreno, alilamina e etilenoimina. Mais especificamente, os exemplos do polímero sintético orgânico incluem polímeros vinílico incluindo poli(ácido acrílico), poli(acrilamida), poli(éster acrílico), poli(metacrilato de 2-hidroxietila), poli(metacrilato de metila), poli(ácido maléico), poli(anidrido maléico), poli(acetato de etil-co-vinila), poli(ácido metacrílico), poli(álcool vinílico), poli(álcool vinílico-co-cloroacetato de vinila), poli(álcool vinílico) aminado e copolímeros de bloco dos mesmos; polietileno glicol (PEG) ou polipropileno glicol ou poli(óxido de etileno-co-óxido de propileno) contendo cadeias principais poliméricas incluindo dendrímeros lineares, na forma de pente ou ramificadas; poli(etilenoiminas); e poli(alilaminas).
Segundo agente de ligação
[0056] O segundo agente de ligação da presente invenção é capaz de ligar especificamente à molécula ligadora, e compreende uma segunda molécula de ligação e uma substância rotuladora. A segunda molécula de ligação e a substância rotuladora de acordo com a presente invenção podem ser diretamente ligados entre si em qualquer local contanto que o efeito da presente invenção não seja inibido. Também, o segundo agente de ligação pode compreender um carregador junto com a segunda molécula de ligação e a substância rotuladora de acordo com a presente invenção. Também, o segundo agente de ligação da presente invenção pode compreender um rótulo de hapteno.
Segunda molécula de ligação
[0057] A segunda molécula de ligação não é limitada contanto que a mesma seja capaz de ligar especificamente à molécula ligadora, mas é preferivelmente um anticorpo, um fragmento do mesmo. Aqui, o anticorpo pode ser de qualquer isótipo, isto é, IgG, IgM, IgA, IgD ou IgE. Também, os exemplos do fragmento de anticorpo incluem um fragmento de ligação de antígeno, preferivelmente Fab, Fab’, (Fab’)2, Fv, scFv, diacorpos, triacorpos, tetracorpos ou anticorpos de domínio único.
Substância rotuladora no segundo agente de ligação
[0058] A substância rotuladora no segundo agente de ligação da presente invenção não é particularmente limitado contanto que o mesmo não iniba a detecção de um marcador alvo, mas, por exemplo, pode ser selecionada das substâncias de rotulação exemplificadas para o primeiro agente de ligação. Assim, a substância rotuladora no segundo agente de ligação pode ser o mesmo como ou diferente daquela no primeiro agente de ligação, mas é preferivelmente a mesma substância rotuladora. A mesma substância rotuladora é especialmente vantajosa na detecção de um marcador alvo de modo simples e com sensibilidade de detecção de alto nível.
Carregador no segundo agente de ligação
[0059] O carregador no segundo agente de ligação não é particularmente limitado contanto que o efeito da presente invenção não seja inibido, mas, por exemplo, pode ser selecionado dos carregadores exemplificados para o primeiro agente de ligação. Assim, o carregador no segundo agente de ligação pode ser o mesmo como ou diferente daquele no primeiro agente de ligação.
Molécula ligadora
[0060] A molécula ligadora da presente invenção é capaz de ligar especificamente ao primeiro agente de ligação, como descrito acima. Também, é preferido que o ligador da presente invenção seja capaz de ligar especificamente tanto ao primeiro agente de ligação quanto ao segundo agente de ligação, em vista da detecção eficaz de um marcador alvo. Assim, de acordo com uma forma de realização da presente invenção, a molécula ligadora é capaz de ligar especificamente tanto ao primeiro agente de ligação quanto ao segundo agente de ligação. A molécula ligadora da presente invenção pode ligar especificamente a qualquer local do primeiro agente de ligação e do segundo agente de ligação contanto que o efeito da presente invenção não seja inibido, mas, preferivelmente, é capaz de ligar especificamente à substância rotuladora no primeiro agente de ligação e/ou à substância rotuladora no segundo agente de ligação, e, mais preferivelmente, é capaz de ligar especificamente tanto à substância rotuladora no primeiro agente de ligação quanto à substância rotuladora no segundo agente de ligação.
[0061] Também, o local no qual a molécula ligadora da presente invenção é especificamente ligada pela segunda molécula de ligação no segundo agente de ligação pode ser diferente daquele para a substância rotuladora como mostrado na FIG. 1. Assim, de acordo com uma forma de realização da presente invenção, a molécula ligadora inclui pelo menos dois sítios de ligação nos quais a mesma é capaz de ligar especificamente ao segundo agente de ligação.
[0062] Os exemplos da molécula ligadora acima incluem um anticorpo ou um fragmento do mesmo. Aqui, o anticorpo pode ser de qualquer isótipo, isto é, IgG, IgM, IgA, IgD ou IgE. Também, o fragmento de anticorpo inclui um fragmento de ligação de antígeno tal como Fab, Fab’, (Fab’)2, Fv ou scFv. A molécula ligadora acima pode incluir ainda um rótulo de hapteno diferente do imunógeno usado na produção da molécula ligadora ou um rótulo de substância fluorescente. Também, de acordo com uma forma de realização da presente invenção, uma pluralidade de anticorpos ou seus fragmentos de ligação de antígeno que são conectados via um carregador tal como um polímero é excluída da molécula ligadora acima.
Polietileno glicol
[0063] Na presente invenção, pelo menos um reagente do primeiro agente de ligação, molécula ligadora e segundo agente de ligação são preferivelmente submetidos a uma imunorreação na coexistência de polietileno glicol na detecção do marcador alvo. A ordem de mistura do reagente acima com polietileno glicol para a coexistência não é particularmente limitada na presente invenção. Por exemplo, é possível começar uma imunorreação usando o reagente acima e rapidamente adicionar polietileno glicol um após o outro, ou preliminarmente misturar o reagente acima com polietileno glicol e em seguida realizar uma imunorreação. O reagente acima e polietileno glicol são preferivelmente deixados coexistir simultaneamente com ou antes do início de uma imunorreação, do ponto de vista de realce eficaz da imunorreação de acordo com a presente invenção.
[0064] O peso molecular de polietileno glicol usado na presente invenção não é particularmente limitado contanto que o efeito da presente invenção seja obtido, mas, como um exemplo adequado, o peso molecular médio (MW) pode ser definido dentro da faixa de 2.000 a 20.000. Um tal peso molecular médio pode ser determinado, por exemplo, usando um produto padrão de polietileno glicol como um índice pela filtração em gel (GPC).
Produto de combinação
[0065] O produto de combinação da presente invenção compreende, em combinação, (a) o primeiro agente de ligação, (b) a molécula ligadora e (c) o segundo agente de ligação, acima de modo a detectar um marcador alvo em uma amostra biológica em combinação com uma molécula de ligação de marcador alvo que seja capaz de ligar especificamente ao marcador alvo. A forma de realização do produto de combinação de acordo com a presente invenção não é particularmente limitado contanto que o efeito da presente invenção não seja inibido. Por exemplo, (a) o primeiro agente de ligação, (b) a molécula ligadora e (c) o segundo agente de ligação pode ser integralmente constituído como uma composição, ou constituído como corpos separados como um kit de detecção ou um sistema de detecção. Assim, o produto de combinação da presente invenção é preferivelmente fornecido na forma de uma composição ou um kit. Também, o produto de combinação da presente invenção pode compreender reagentes outros que não (a) a (c), contanto que o efeito da presente invenção não seja inibido.
[0066] Também, de acordo com uma forma de realização da presente invenção, o produto de combinação da presente invenção compreende ainda, em combinação, a molécula de ligação do marcador alvo acima, além do (a) a (c) acima.
Método para detectar marcador alvo em amostra biológica
[0067] De acordo com a presente invenção, como descrito acima, (a) o primeiro agente de ligação, (b) a molécula ligadora e (c) o segundo agente de ligação e uma molécula de ligação de marcador alvo são usados juntos, tornando deste modo possível detectar o marcador alvo em uma amostra biológica obtida de um indivíduo de modo simples e com alto nível de sensibilidade de detecção. Assim, de acordo com uma forma de realização da presente invenção, é fornecido um método para detectar um marcador alvo em uma amostra biológica obtida de um indivíduo, compreendendo as etapas de: (i) contatar uma molécula de ligação de marcador alvo preliminarmente ligado especificamente ao marcador alvo com um primeiro agente de ligação, obtendo deste modo um primeiro complexo; (ii) contatar o primeiro complexo com uma molécula ligadora, obtendo deste modo um segundo complexo; e (iii) contatar o segundo complexo com um segundo agente de ligação, obtendo deste modo um terceiro complexo, em que o primeiro agente de ligação acima compreende uma primeira molécula de ligação que é capaz de ligar direta ou indiretamente de modo específico à molécula de ligação do marcador alvo acima, e uma substância rotuladora; em que a molécula ligadora ligável acima é capaz de ligar especificamente ao primeiro agente de ligação; e em que o segundo agente de ligação é capaz de ligar especificamente à molécula ligadora e compreende uma segunda molécula de ligação e uma substância rotuladora.
[0068] Nas respectivas etapas de contatar (i) a (iii) acima, o primeiro complexo, o segundo complexo e o terceiro complexo podem ser obtidos usando-se um método conhecido tal como misturando os respectivos ingredientes.
[0069] Nas respectivas etapas de contatar (i) a (iii) acima, o primeiro agente de ligação, a molécula ligadora e o segundo agente de ligação preferivelmente podem ser adicionados como uma solução.
[0070] A concentração do primeiro agente de ligação na solução acima na etapa (i) não é particularmente limitada, mas pode ser definido dentro da faixa de 1 a 15 μg/ml.
[0071] A concentração da molécula ligadora na solução na etapa (ii) acima não é particularmente limitada, mas pode ser definida dentro da faixa de 0,5 a 15 μg/ml.
[0072] A concentração do segundo agente de ligação na solução na etapa (iii) acima não é particularmente limitada, mas pode ser definido dentro da faixa de 1 a 15 μg/ml.
[0073] Também, pelo menos uma ou todas das respectivas etapas de contatar de (i) a (iii) é/são preferivelmente realizada(s) na coexistência de polietileno glicol, em vista do realce da sensibilidade de detecção para o marcador alvo. A concentração de polietileno glicol nas soluções acima usadas nas etapas (i) a (iii) não é particularmente limitada, mas pode ser definida dentro da faixa de 0,5 a 20% em peso.
[0074] Também, o método da presente invenção pode compreender ainda a etapa de detectar a substância rotuladora no primeiro agente de ligação e a substância rotuladora no segundo agente de ligação.
[0075] O método para detectar a substância rotuladora no primeiro agente de ligação e a substância rotuladora no segundo agente de ligação de acordo com a presente invenção pode ser apropriadamente ajustado por aqueles habilitados na técnica de acordo com os tipos e propriedades das substâncias de rotulação. Por exemplo, vários métodos de detecção conhecidos, incluindo imunotingimento, hibridização in situ, citometria de fluxo, imunoensaio enzimático (EIA), ensaio imunossorvente ligado à enzima (ELISA) e Western blot, podem ser usados. Preferivelmente, o método de detecção é o tingimento imunoistoquímico ou a hibridização in situ tal como hibridização in situ cromogênica (CISH).
[0076] Detalhes das condições de reação para as respectivas etapas de contatar (i) a (iii) e a detecção das substâncias de rotulação, de acordo com a presente invenção, podem ser determinados por aqueles habilitados na técnica de acordo com uma técnica conhecida.
EXEMPLOS
[0077] Doravante, a presente invenção é descrita em mais detalhes por via de Exemplos, mas não é limitada a estes Exemplos. Detalhes das unidades e condições de medição usadas na presente invenção estão em conformidade com as provisões da JIS (Japanese Industrial Standards), a menos que de outro modo especificado.
Exemplo de Teste 1: Estudo do método de tingimento de alta sensibilidade usando apenas o primeiro agente de ligação e o método de tingimento de alta sensibilidade usando apenas o primeiro agente de ligação e o segundo agente de ligação.
[0078] Neste Exemplo de Teste, um sistema de reação usando apenas o primeiro agente de ligação (Exemplo Comparativo 1) e um sistema de reação usando apenas o primeiro agente de ligação e o segundo agente de ligação (Exemplo Comparativo 2) foram comparados em termos de sensibilidade de detecção para o marcador alvo.
Preparação de reagente 1. Preparação do primeiro agente de ligação
[0079] O primeiro agente de ligação (reagente polimérico) foi produzido de acordo com as descrições nos parágrafos [0031] a [0040] da JP 2001-181299 A.
[0080] Especificamente, um reagente polimérico (M) compreendendo peroxidases e fragmentos Fab’ de Ig anti-camundongo (espécie de animal: cabra) ligados a um polímero de aminoácido e um reagente polimérico (R) compreendendo peroxidases e fragmentos Fab’ de Ig anti-coelho (espécie de animal: cabra) ligados a um polímero de aminoácido foram misturados em cada quantidade de 5 μg/ml, preparando deste modo um reagente de coquetel polimérico (MULTI).
2. Preparação do segundo agente de ligação
[0081] Um reagente polimérico (G) compreendendo peroxidases e fragmentos Fab’ de Ig anti-cabra (espécie de animal: coelho) ligados a um polímero de aminoácido foi preparado em 7,5 μg/ml.
Tingimento imunoistoquímico 1. Desparafinização, bloqueio de peroxidase e tratamento de recuperação de antígeno A. Provisão de lâmina de espécime
[0082] Uma seção de tecido foi fatiada em 3 μm e montada em uma lâmina de vidro revestida com MAS. Depois disso, a lâmina de vidro foi secada durante a noite em um incubador a 37 °C.
B. Desparafinização
[0083] (I) Tratamento com xileno (3 minutos x 3 vezes)
[0084] A lâmina foi imersa em xileno por 3 minutos. Depois disso, um líquido em excesso foi tirado, e em seguida a lâmina foi imersa em um outro xileno por 3 minutos. Depois disso, um líquido em excesso foi tirado, e a lâmina foi imersa ainda em um outro xileno por 3 minutos.
[0085] (II) Tratamento com etanol (3 minutos x 4 vezes)
[0086] A lâmina foi imersa em 100 % de etanol por 3 minutos. Um líquido em excesso foi tirado, e a lâmina foi imersa em um outro etanol a 100 % por 3 minutos. Esta operação foi realizada duas vezes mais.
[0087] (III) Lavagem
[0088] O excesso de etanol foi tirado, e a lâmina foi lavada em PBS (o recipiente foi mudado duas vezes, respectivamente por 3 minutos).
C. Tratamento pela recuperação de antígeno
[0089] A recuperação da Solução de antígeno pH9 (NICHIREI BIOSCIENCES INC.) foi usada para o tratamento térmico em uma autoclave por 20 minutos, e deixada repousar na temperatura ambiente por 20 minutos. Depois disso, a lâmina foi lavada em PBS por 3 minutos x duas vezes.
D. Bloqueio de peroxidase
[0090] A peroxidase endógena foi bloqueada. Depois de drenada, a lâmina foi imersa em uma solução a 3 % V/V de peróxido de hidrogênio por 10 minutos. Depois disso, a lâmina foi lavada em PBS por 3 minutos x duas vezes.
2. Adição-reação do primeiro anticorpo ou controle negativo (diluente do primeiro anticorpo)
[0091] Sobre a lâmina de vidro da qual um líquido em excesso foi tirado, um primeiro anticorpo ou um diluente do primeiro anticorpo foram adicionados às gotas para causar uma reação em uma câmara úmida a 25°C por 30 minutos. Depois disso, a lâmina de vidro foi lavada em PBS por 3 minutos x duas vezes. A combinação de tecido e primeiro anticorpo usada no estudo é como segue.
[0092] ･ Câncer gástrico anticorpo monoclonal do produto de gene p53 anti ser humano (DO-7) (NICHIREI BIOSCIENCES INC.) usado diluído 3 vezes.
[0093] ･ Câncer colorretal anticorpo monoclonal de coelho anti-CDX-2 (NICHIREI BIOSCIENCES INC.) usado como tal.
3. Reação com o primeiro agente de ligação
[0094] Sobre a lâmina de vidro da qual um líquido em excesso foi tirado, o reagente de coquetel polimérico (MULTI) foi adicionado às gotas para causar uma reação em uma câmara úmida a 25°C por 10 minutos. Depois disso, a lâmina de vidro foi lavada em PBS por 3 minutos x duas vezes. Incidentalmente, esta reação foi realizada em ambos dos Exemplos Comparativos 1 e 2.
4. Reação com o segundo agente de ligação
[0095] Sobre a lâmina de vidro da qual um líquido em excesso foi tirado, o reagente polimérico (G) foi adicionado às gotas para causar uma reação em uma câmara úmida a 25 °C por 10 minutos. Depois disso, a lâmina de vidro foi lavada em PBS por 3 minutos x duas vezes. Incidentalmente, esta reação foi realizada apenas no Exemplo Comparativo 2.
5. Adição-reação da solução de substrato
[0096] Sobre a lâmina de vidro da qual um líquido em excesso foi tirado, N- Histofine® DAB-2V (NICHIREI BIOSCIENCES INC.) foi adicionado às gotas para causar uma reação na temperatura ambiente por 5 minutos. Depois disso, a lâmina de vidro foi lavada com água corrente por 5 minutos.
6. Contra tingimento, desidratação-limpeza, montagem A. Contra tingimento
[0097] Depois de drenada, a lâmina de vidro foi imersa em uma solução de hematoxilina de Mayer por 30 segundos. Depois disso, a lâmina de vidro foi lavada com água corrente por 5 minutos.
B. Desidratação-limpeza
[0098] A drenagem foi seguida pela desidratação com etanol e limpeza com xileno. Aqui, etanol foi usado para a desidratação através da passagem x três vezes e repousando ainda por 5 minutos x uma vez. Xileno foi usado para limpeza através da passagem x uma vez e repousando ainda por 5 minutos x duas vezes.
C. Montagem
[0099] Meio de Montagem Permanente (Não Aquoso) (NICHIREI BIOSCIENCES INC.) foi usado para a montagem.
[0100] Os resultados de tingimento acima foram como mostrados na FIG. 2. Aqui, as fotografias microscópicas dos respectivos tecidos tingidos mostradas na FIG. 2 foram tiradas usando um microscópio óptico (Olympus Corporation) com uma lente ocular (10x) e uma lente objetiva (4x).
[0101] O sistema de reação apenas do primeiro agente de ligação e do segundo agente de ligação (Exemplo Comparativo 2) forneceu sensibilidade de tingimento levemente melhorado, quando comparado com o sistema de reação apenas do primeiro agente de ligação (Exemplo Comparativo 1). Entretanto, nenhuma sensibilidade de tingimento em um nível desejado pôde ser obtida.
[0102] Incidentalmente, nenhum tingimento de fundo ocorreu no controle negativo.
Exemplo de Teste 2: Estudo do método de tingimento de alta sensibilidade usando o primeiro agente de ligação, a molécula ligadora e o segundo agente de ligação
[0103] Foi revisado se a sensibilidade de tingimento poderia ser melhorada pelos sistemas de reação usando o primeiro agente de ligação, a molécula ligadora e o segundo agente de ligação, isto é, sistemas de reação compreendendo a molécula ligadora interposta entre o primeiro agente de ligação e o segundo agente de ligação, quando comparados com sistemas de reação usando apenas o primeiro agente de ligação ou sistemas de reação usando apenas o primeiro agente de ligação e o segundo agente de ligação.
[0104] Neste teste, entre tais sistemas de reação usando o primeiro agente de ligação, a molécula ligadora e o segundo agente de ligação, um sistema de reação usando a molécula ligadora (1 μg/ml de um anticorpo anti-HRP) foi definido como Exemplo 1, e um sistema de reação usando a molécula ligadora (5 μg/ml de um anticorpo anti-HRP) foi definido como Exemplo 2.
[0105] Também, um sistema de reação usando apenas o primeiro agente de ligação foi definido como Exemplo Comparativo 3, e um sistema de reação usando apenas o primeiro agente de ligação e o segundo agente de ligação foi definido como Exemplo Comparativo 4.
Preparação de reagente 1. Preparação do primeiro agente de ligação
[0106] Um reagente polimérico (M) compreendendo peroxidases e fragmentos Fab’ de Ig anti-camundongo (espécie de animal: cabra) ligados a um polímero de aminoácido e um reagente polimérico (R) compreendendo peroxidases e fragmentos Fab’ de Ig anti-coelho (espécie de animal: cabra) ligados a um polímero de aminoácido foram misturados cada um na quantidade de 5 μg/ml, preparando deste modo um reagente de coquetel polimérico (MULTI).
2. Preparação da molécula ligadora
[0107] Um anticorpo anti-HRP de cabra (policlonal) (Pierce) foi preparado em 1 μg/ml ou 5 μg/ml.
3. Preparação do segundo agente de ligação
[0108] Um reagente polimérico (G) compreendendo peroxidases e fragmentos Fab’ de Ig anti-cabra (espécie de animal: coelho) ligados a um polímero de aminoácido foi preparado em 7,5 μg/ml.
Tingimento imunoistoquímico 1. Desparafinização, bloqueio de peroxidase e tratamento de recuperação de antígeno
[0109] Estes procedimentos foram realizados similarmente como no Exemplo de Teste 1.
2. Adição-reação do primeiro anticorpo ou controle negativo (diluente do primeiro anticorpo)
[0110] Estes procedimentos foram realizados similarmente como no Exemplo de Teste 1.
3. Reação com o primeiro agente de ligação
[0111] Sobre a lâmina de vidro da qual um líquido em excesso foi tirado, o reagente de coquetel polimérico (MULTI) foi adicionado às gotas para causar uma reação em uma câmara úmida a 25°C por 10 minutos. Depois disso, a lâmina de vidro foi lavada em PBS por 3 minutos x duas vezes. Incidentalmente, esta reação foi realizada nos Exemplos 1 e 2 e Exemplos Comparativos 3 e 4.
4. Reação com molécula ligadora
[0112] Sobre a lâmina de vidro da qual um líquido em excesso foi tirado, o anticorpo anti-HRP de cabra foi adicionado às gotas para causar uma reação em uma câmara úmida a 25°C por 10 minutos. Depois disso, a lâmina de vidro foi lavada em PBS por 3 minutos x duas vezes. Incidentalmente, esta reação foi realizado apenas nos Exemplos 1 e 2.
5. Reação com o segundo agente de ligação
[0113] Sobre a lâmina de vidro da qual um líquido em excesso foi tirado, o reagente polimérico (G) foi adicionado às gotas para causar uma reação em uma câmara úmida a 25°C por 10 minutos. Depois disso, a lâmina de vidro foi lavada em PBS por 3 minutos x duas vezes. Incidentalmente, esta reação foi realizada nos Exemplos 1 e 2 e Exemplo Comparativo 4.
6. Adição-reação da solução de substrato
[0114] Estes procedimentos foram realizados similarmente como no Exemplo de Teste 1.
7. Contra tingimento, desidratação-limpeza, montagem
[0115] Estes procedimentos foram realizados similarmente como no Exemplo de Teste 1.
[0116] Os resultados foram como mostrados na FIG. 3. Aqui, as fotografias microscópicas dos respectivos tecidos tingidos mostradas na FIG. 3 foram tiradas usando um microscópio óptico (Olympus Corporation) com uma lente ocular (10x) e uma lente objetiva (4x).
[0117] Os sistemas de reação (Exemplos 1 e 2) compreendendo a molécula ligadora (anticorpo anti-HRP) mantida entre o primeiro agente de ligação e o segundo agente de ligação fornecidos significantemente melhoraram a sensibilidade de tingimento, quando comparados com o sistema de reação usando apenas o primeiro agente de ligação ou o sistema de reação usando apenas o primeiro agente de ligação e o segundo agente de ligação.
[0118] Incidentalmente, nenhum tingimento de fundo ocorreu no controle negativo.
Exemplo de Teste 3: Estudo do tipo de anticorpo usado como molécula ligadora
[0119] Um teste foi conduzido, por um método de teste similar como no Exemplo de Teste 2, usando reagentes poliméricos e anticorpos anti-HRP como indicado na seguinte Tabela 1, embora a espécie de animal imunizado (camundongo, coelho ou cabra) para os anticorpos anti-HRP fosse mudada. [Tabela 1]
[0120] Os resultados foram como mostrados na FIG. 4. Aqui, as fotografias microscópicas dos respectivos tecidos tingidos mostradas na FIG. 4 foram tiradas usando um microscópio óptico (Olympus Corporation) com uma lente ocular (10x) e uma lente objetiva (4x).
[0121] Seja qual for a espécie de animal imunizado-anticorpo usada como a molécula ligadora, os sistemas de reação (Exemplos 3 a 5) usando o primeiro agente de ligação, a molécula ligadora e o segundo agente de ligação cada um forneceu sensibilidade de tingimento significantemente melhorada, quando comparados com os sistemas de reação (Exemplos Comparativos 5 a 7) usando apenas o primeiro agente de ligação e o segundo agente de ligação. Incidentalmente, nenhum tingimento de fundo ocorreu no controle negativo.
Exemplo de Teste 4: Estudo dos tipos do primeiro agente de ligação e segundo agente de ligação 4-1: Use de conjugado de anticorpo inteiro e dextrano (carregador) (primeiro agente de ligação e segundo agente de ligação)
[0122] Um reagente polimérico (EnVision Dual Link System-HRP, DAKO) compreendendo anticorpos IgG inteiros e peroxidases ligados a um dextrano foi usado como o primeiro agente de ligação e o segundo agente de ligação, e um teste comparativo sobre a sensibilidade de tingimento foi conduzido de acordo com os seguintes procedimentos.
[0123] Incidentalmente, um sistema de reação usando o primeiro agente de ligação, a molécula ligadora (anticorpo anti-HRP de camundongo) e o segundo agente de ligação foi definido como Exemplo 6; um sistema de reação usando o primeiro agente de ligação, a molécula ligadora (anticorpo anti-HRP de coelho) e o segundo agente de ligação foi definido como Exemplo 7; um sistema de reação usando apenas o primeiro agente de ligação foi definido como Exemplo Comparativo 8; e um sistema de reação usando apenas o primeiro agente de ligação e o segundo agente de ligação foi definido como Exemplo Comparativo 9.
Preparação de reagente 1. Preparação do primeiro agente de ligação
[0124] Um reagente polimérico compreendendo anticorpos IgG inteiros e peroxidases ligados a um dextrano (EnVision Dual Link System-HRP, DAKO) foi usado como tal. Especificamente, o reagente polimérico é uma mistura de um reagente polimérico (M) compreendendo peroxidases e anticorpos IgG anti- camundongo (espécie de animal: cabra) ligados a um polímero de dextrano e um reagente polimérico (R) compreendendo peroxidases e anticorpos IgG anti-coelho (espécie de animal: cabra) ligados a um polímero de dextrano.
2. Preparação da molécula ligadora
[0125] Um anticorpo anti-HRP de camundongo (clone: HP-03) (TFS) foi preparado em 5 μg/ml.
[0126] UM anticorpo anti-HRP de coelho (policlonal) (NICHIREI BIOSCIENCES INC.) foi preparado em 5 μg/ml.
3. Preparação do segundo agente de ligação
[0127] O reagente polimérico compreendendo anticorpos IgG inteiros e peroxidases ligados a um dextrano (EnVision Dual Link System-HRP, DAKO) foi usado como tal.
Tingimento imunoistoquímico 1. Desparafinização, bloqueio de peroxidase e tratamento de recuperação de antígeno
[0128] Estes procedimentos foram realizados similarmente como no Exemplo de Teste 1.
2. Adição-reação do primeiro anticorpo ou controle negativo (diluente do primeiro anticorpo)
[0129] Sobre a lâmina de vidro da qual um líquido em excesso foi tirado, um primeiro anticorpo ou um diluente do primeiro anticorpo foi adicionado às gotas para causar uma reação em uma câmara úmida a 25 °C por 30 minutos. Depois disso, a lâmina de vidro foi lavada em PBS por 3 minutos x duas vezes. A combinação de tecido e molécula de ligação do marcador alvo (primeiro anticorpo) usado no estudo é como segue.
[0130] ･ Câncer gástrico anticorpo monoclonal do produto de gene p53 anti ser humano (DO-7) (NICHIREI BIOSCIENCES INC.) usado como tal.
[0131] ･ Câncer colorretal anticorpo monoclonal de coelho anti-CDX-2 (NICHIREI BIOSCIENCES INC.) usado como tal.
3. Reação do primeiro agente de ligação
[0132] Sobre a lâmina de vidro da qual um líquido em excesso foi tirado, EnVision Dual Link System-HRP (DAKO) foi adicionado às gotas para causar uma reação em uma câmara úmida a 25°C por 10 minutos. Depois disso, a lâmina de vidro foi lavada em PBS por 3 minutos x duas vezes. Incidentalmente, esta reação foi realizada nos Exemplos 6 e 7 e Exemplos Comparativos 8 e 9.
4. Reação com molécula ligadora
[0133] Sobre a lâmina de vidro da qual um líquido em excesso foi tirado, o anticorpo anti-HRP de camundongo (Exemplo 6) ou um anticorpo anti-HRP de coelho (Exemplo 7) foi adicionado às gotas para causar uma reação em uma câmara úmida a 25°C por 10 minutos. Depois disso, a lâmina de vidro foi lavada em PBS por 3 minutos x duas vezes. Incidentalmente, esta reação foi realizada apenas nos Exemplos 6 e 7.
5. Reação com o segundo agente de ligação
[0134] Sobre a lâmina de vidro da qual um líquido em excesso foi tirado, EnVision Dual Link System-HRP (DAKO) foi adicionado às gotas para causar uma reação em uma câmara úmida a 25 °C por 10 minutos. Depois disso, a lâmina de vidro foi lavada em PBS por 3 minutos x duas vezes.
[0135] A reação foi realizada apenas nos Exemplos 6 e 7 e Exemplo Comparativo 9.
6. Adição-reação da solução de substrato
[0136] Estes procedimentos foram realizados similarmente como no Exemplo de Teste 1.
7. Contra tingimento, desidratação-limpeza, montagem
[0137] Estes procedimentos foram realizados similarmente como no Exemplo de Teste 1.
[0138] Os resultados foram como mostrados na FIG. 5. Aqui, as fotografias microscópicas dos respectivos tecidos tingidos mostradas na FIG. 5 foram tiradas usando um microscópio óptico (Olympus Corporation) com uma lente ocular (10x) e uma lente objetiva (4x).
[0139] Também quando um dextrano foi usado como o carregador e um anticorpo inteiro foi usado como a molécula de ligação, os sistemas de reação usando o primeiro agente de ligação, a molécula ligadora e o segundo agente de ligação (Exemplos 6 e 7) forneceram sensibilidade de detecção significantemente melhorada, quando comparada com o sistema de reação (Exemplo Comparativo 8) usando apenas o primeiro agente de ligação e o sistema de reação (Exemplo Comparativo 9) usando apenas o primeiro agente de ligação e o segundo agente de ligação.
[0140] Incidentalmente, nenhum tingimento de fundo ocorreu no controle negativo.
4-2: Uso de conjugado direto de anticorpo inteiro e HRP (primeiro agente de ligação e segundo agente de ligação)
[0141] Os reagentes compreendendo um anticorpo de IgG inteiro e poli-HRP ligados direto entre si foram usados como o primeiro agente de ligação e o segundo agente de ligação para estudar o efeito de detectar o marcador alvo.
[0142] No seguinte experimento, um sistema de reação usando o primeiro agente de ligação (conjugado direto de um anticorpo anti-camundongo e poli-HRP), a molécula ligadora (anticorpo anti-HRP de camundongo) e o segundo agente de ligação (conjugado direto de um anti-camundongo anticorpo e poli-HRP) foi definido como Exemplo 8 (amostra biológica: p53 câncer gástrico); e um sistema de reação usando o primeiro agente de ligação (conjugado direto de um anticorpo anti-coelho e poli-HRP), a molécula ligadora (anticorpo anti-HRP de coelho) e o segundo agente de ligação (conjugado direto de um anticorpo anti-coelho e poli-HRP) foi definido como Exemplo 9 (amostra biológica: CDX-2 câncer colorretal). Também, um sistema de reação usando apenas o primeiro agente de ligação (conjugado direto de um anticorpo anti-camundongo e poli-HRP) e o segundo agente de ligação (conjugado direto de um anticorpo anti-camundongo e poli-HRP) foi definido como Exemplo Comparativo 10 (amostra biológica: p53 câncer gástrico); e um sistema de reação usando apenas o primeiro agente de ligação (conjugado direto de um anticorpo anti-coelho e poli-HRP) e o segundo agente de ligação (conjugado direto de um anticorpo anti-coelho e poli- HRP) foi definido como Exemplo Comparativo 11 (amostra biológica: CDX-2 câncer colorretal).
Preparação de reagente 1. Preparação do primeiro agente de ligação
[0143] Um reagente compreendendo um anticorpo de IgG inteiro rotulado direto com poli-HRP (Poli-HRP de Cabra Anti-Camundongo, Pierce) foi diluído 10 vezes.
[0144] Um reagente compreendendo um anticorpo de IgG inteiro rotulado direto com poli-HRP (Poli-HRP de Cabra Anti-Coelho, Pierce) foi diluído 10 vezes.
2. Preparação da molécula ligadora
[0145] Um anticorpo anti-HRP de camundongo (clone: HP-03, TFS) foi preparado em 5 μg/ml.
[0146] Um anticorpo anti-HRP de coelho (policlonal) (NICHIREI BIOSCIENCES INC.) foi preparado em 5 μg/ml.
3. Preparação do segundo agente de ligação
[0147] O reagente compreendendo um anticorpo de IgG inteiro rotulado direto com poli-HRP (Poli-HRP de Cabra Anti-Camundongo, Pierce) foi diluído 10 vezes.
[0148] O reagente compreendendo um anticorpo de IgG inteiro rotulado direto com poli-HRP (Poli-HRP de Cabra Anti-Coelho, Pierce) foi diluído 10 vezes.
Tingimento imunoistoquímico 1. Desparafinização, bloqueio de peroxidase e tratamento de recuperação de antígeno
[0149] Estes procedimentos foram realizados similarmente como no Exemplo de Teste 1.
2. Adição-reação do primeiro anticorpo ou controle negativo (diluente do primeiro anticorpo)
[0150] Estes procedimentos foram realizados similarmente como no Exemplo de Teste 4-1.
3. Reação com o primeiro agente de ligação
[0151] Sobre a lâmina de vidro da qual um líquido em excesso foi tirado, Poli-HRP de Cabra Anti-Camundongo (Pierce) (Exemplo 8 e Exemplo Comparativo 10) ou Poli- HRP de Cabra Anti-Coelho (Pierce) (Exemplo 9 e Exemplo Comparativo 11) foi adicionado às gotas para causar uma reação em uma câmara úmida a 25 °C por 10 minutos. Depois disso, a lâmina de vidro foi lavada em PBS por 3 minutos x duas vezes. Incidentalmente, esta reação foi realizada nos Exemplos 8 e 9 e Exemplos Comparativos 10 e 11.
4. Reação com a molécula ligadora
[0152] Sobre a lâmina de vidro da qual um líquido em excesso foi tirado, o anticorpo anti-HRP de camundongo (Exemplo 8) ou o anticorpo anti-HRP de coelho (Exemplo 9) foi adicionado às gotas para causar uma reação em uma câmara úmida a 25 °C por 10 minutos. Depois disso, a lâmina de vidro foi lavada em PBS por 3 minutos x duas vezes. Incidentalmente, esta reação foi realizada nos Exemplos 8 e 9.
5. Reação com o segundo agente de ligação
[0153] Sobre a lâmina de vidro da qual um líquido em excesso foi tirado, Poli-HRP de Cabra Anti-Camundongo (Pierce) (Exemplo 8 e Exemplo Comparativo 10) ou Poli- HRP de Cabra Anti-Coelho (Pierce) (Exemplo 9 e Exemplo Comparativo 11) foi adicionado às gotas para causar uma reação em uma câmara úmida a 25 °C por 10 minutos. Depois disso, a lâmina de vidro foi lavada em PBS por 3 minutos x duas vezes. Incidentalmente, esta reação foi realizada nos Exemplos 8 e 9 e Exemplos Comparativos 10 e 11.
6. Adição-reação da solução de substrato
[0154] Estes procedimentos foram realizados similarmente como no Exemplo de Teste 1.
7. Contra tingimento, desidratação- limpeza, montagem
[0155] Estes procedimentos foram realizados similarmente como no Exemplo de Teste 1.
[0156] Os resultados foram como mostrados na FIG. 6. Aqui, as fotografias microscópicas dos respectivos tecidos tingidos mostradas na FIG. 6 foram tiradas usando um microscópio óptico (Olympus Corporation) com uma lente ocular (10x) e uma lente objetiva (4x).
[0157] Também quando conjugados diretos de um anticorpo inteiro e uma substância rotuladora (poli-HRP) foram usados como o primeiro agente de ligação e o segundo agente de ligação, os sistemas de reação (Exemplos 8 e 9) usando o primeiro agente de ligação, a molécula ligadora e o segundo agente de ligação cada um forneceu sensibilidade de detecção significantemente melhorada, quando comparados com os sistemas de reação (Exemplos Comparativos 10 e 11) usando apenas o primeiro agente de ligação e o segundo agente de ligação.
[0158] Incidentalmente, tingimento de fundo ocorreu nos controles negativos dos Exemplos 8 e 9, mas ocorreu principalmente no citoplasma e dificilmente ocorreu no núcleo celular. Os anticorpos p53 e CDX-2 tingem o núcleo da célula, e assim foram dificilmente afetados pelo tingimento de fundo no momento da avaliação.
4-3: Uso de micropolímeros enzimáticos (primeiro agente de ligação e segundo agente de ligação)
[0159] Micropolímeros enzimáticos compreendendo enzimas com alta atividade e alta densidade e um anticorpo ligados entre si (Reagente UNIVERSAL ImmPRESS, Ig Anti-Camundongo/Coelho ou Reagente ImmPRESS, Ig anti-cabra; VECTOR LABORATORIES) foram usados como o primeiro agente de ligação e o segundo agente de ligação para um teste comparativo sobre a sensibilidade de tingimento de acordo com os seguintes procedimentos.
[0160] Incidentalmente, um sistema de reação usando o primeiro agente de ligação (Reagente UNIVERSAL ImmPRESS, Ig Anti-Camundongo/Coelho), a molécula ligadora (anticorpo anti-HRP de camundongo) e o segundo agente de ligação (Reagente UNIVERSAL ImmPRESS, Ig Anti-Camundongo/Coelho) foi definido como Exemplo 10; um sistema de reação usando o primeiro agente de ligação (Reagente UNIVERSAL ImmPRESS, Ig Anti-Camundongo/Coelho), a molécula ligadora (anticorpo anti-HRP de coelho) e o segundo agente de ligação (Reagente UNIVERSAL ImmPRESS, Ig Anti-Camundongo/Coelho) foi definido como Exemplo 11; e um sistema de reação usando o primeiro agente de ligação (Reagente UNIVERSAL ImmPRESS, Ig Anti-Camundongo/Coelho), a molécula ligadora (anticorpo anti-HRP de cabra) e o segundo agente de ligação (ImmPRESS Reagente, Ig anti-cabra) foi definido como Exemplo 12.
[0161] Também, um sistema de reação usando o primeiro agente de ligação (Reagente UNIVERSAL ImmPRESS, Ig Anti-Camundongo/Coelho) sozinho foi definido como Exemplo Comparativo 12; um sistema de reação usando apenas o primeiro agente de ligação (Reagente UNIVERSAL ImmPRESS, Ig Anti- Camundongo/Coelho) e o segundo agente de ligação (Reagente UNIVERSAL ImmPRESS, Ig Anti-Camundongo/Coelho) foi definido como Exemplo Comparativo 13; e um sistema de reação usando apenas o primeiro agente de ligação (Reagente UNIVERSAL ImmPRESS, Ig Anti-Camundongo/Coelho) e o segundo agente de ligação (ImmPRESS Reagente, Ig anti-cabra) foi definido como Exemplo Comparativo 14.
Preparação de reagente 1. Preparação do primeiro agente de ligação
[0162] Micropolímeros enzimáticos compreendendo enzimas com alta atividade e alta densidade e um anticorpo ligados entre si (Reagente UNIVERSAL ImmPRESS, Ig Anti-Camundongo/Coelho, VECTOR LABORATORIES) foram usados como tais.
2. Preparação da molécula ligadora
[0163] Um anticorpo anti-HRP de camundongo (clone: HP-03, TFS) foi preparado em 5 μg/ml.
[0164] Um anticorpo anti-HRP de coelho (policlonal) (NICHIREI BIOSCIENCES INC.) foi preparado em 5 μg/ml.
[0165] Um anticorpo anti-HRP de cabra (policlonal) (Pierce) foi preparado em 5 μg/ml.
3. Preparação do segundo agente de ligação
[0166] Micropolímeros enzimáticos compreendendo enzimas com alta atividade e alta densidade e um anticorpo ligados entre si (Reagente UNIVERSAL ImmPRESS, Ig Anti-Camundongo/Coelho, VECTOR LABORATORIES) foram usados como tais.
[0167] Também, um outro dos micropolímeros enzimáticos compreendendo enzimas com alta atividade e alta densidade e um anticorpo ligados entre si (Reagente ImmPRESS, Ig anti-cabra, VECTOR LABORATORIES) foi usado como tal.
Tingimento imunoistoquímico 1. Desparafinização, bloqueio de peroxidase e tratamento de recuperação de antígeno
[0168] Estes procedimentos foram realizados similarmente como no Exemplo de Teste 1.
2. Adição-reação do primeiro anticorpo ou controle negativo (diluente do primeiro anticorpo)
[0169] Estes procedimentos foram realizados similarmente como no Exemplo de Teste 4-1.
3. Reação com o primeiro agente de ligação
[0170] Sobre a lâmina de vidro da qual um líquido em excesso foi tirado, Reagente UNIVERSAL ImmPRESS, Ig Anti-Camundongo/Coelho (VECTOR LABORATORIES) foi adicionado às gotas para causar uma reação em uma câmara úmida a 25°C por 10 minutos. Depois disso, a lâmina de vidro foi lavada em PBS por 3 minutos x duas vezes. Incidentalmente, esta reação foi realizada nos Exemplos 10 a 12 e Exemplos Comparativos 12 a 14.
4. Reação com molécula ligadora
[0171] Sobre a lâmina de vidro da qual um líquido em excesso foi tirado, o anticorpo anti-HRP de camundongo (Exemplo 10), o anticorpo anti-HRP de coelho (Exemplo 11) ou o anticorpo anti-HRP de cabra (Exemplo 12) foi adicionado às gotas para causar uma reação em uma câmara úmida a 25°C por 10 minutos. Depois disso, a lâmina de vidro foi lavada em PBS por 3 minutos x duas vezes. Incidentalmente, esta reação foi realizada apenas nos Exemplos 10 a 12.
5. Reação com o segundo agente de ligação
[0172] Sobre a lâmina de vidro da qual um líquido em excesso foi tirado, Reagente UNIVERSAL ImmPRESS, Ig Anti-Camundongo/Coelho (VECTOR LABORATORIES) (Exemplos 10 e 11 e Exemplo Comparativo 13) ou Reagente ImmPRESS, Ig anti- cabra (VECTOR LABORATORIES) (Exemplo 12 e Exemplo Comparativo 14) foi adicionado às gotas para causar uma reação em uma câmara úmida a 25°C por 10 minutos. Depois disso, a lâmina de vidro foi lavada em PBS por 3 minutos x duas vezes. Incidentalmente, esta reação foi realizada nos Exemplos 10 a 12 e Exemplos Comparativos 13 e 14.
6. Adição-reação da solução de substrato
[0173] Estes procedimentos foram realizados similarmente como no Exemplo de Teste 1.
7. Contra tingimento, desidratação-limpeza, montagem
[0174] Estes procedimentos foram realizados similarmente como no Exemplo de Teste 1.
[0175] Os resultados foram como mostrados na FIG. 7. Aqui, as fotografias microscópicas dos respectivos tecidos tingidos mostradas na FIG. 7 foram tiradas usando um microscópio óptico (Olympus Corporation) com uma lente ocular (10x) e uma lente objetiva (4x).
[0176] Também quando micropolímeros enzimáticos compreendendo enzimas com alta atividade e alta densidade e um anticorpo ligados entre si foram usados como o primeiro agente de ligação e o segundo agente de ligação, os sistemas de reação (Exemplos 10 a 12) usando o primeiro agente de ligação, a molécula ligadora e o segundo agente de ligação cada um forneceu sensibilidade de detecção significantemente melhorada, quando comparado com o sistema de reação (Exemplo Comparativo 12) usando apenas o primeiro agente de ligação e os sistemas de reação (Exemplos Comparativos 13 e 14) usando apenas o primeiro agente de ligação e o segundo agente de ligação.
[0177] Incidentalmente, tingimento de fundo ocorreu no controle negativo dos Exemplos 10 a 12, mas ocorreu principalmente no citoplasma e dificilmente ocorreu no núcleo celular. Os anticorpos p53 e CDX-2 são tingidos no núcleo celular, e assim foram dificilmente afetados pelo tingimento de fundo no momento da avaliação.
Exemplo de Teste 5: Estudo da presença ou ausência de polímeros carregadores no primeiro agente de ligação e segundo agente de ligação e pesos moleculares dos polímeros carregadores
[0178] Como indicado nas seguintes Tabelas 2 a 5, reagentes poliméricos compreendendo polímeros carregadores variando no peso molecular ou um reagente do tipo poli-HRP não tendo nenhum polímero carregador foram selecionados como o primeiro agente de ligação e o segundo agente de ligação. Um teste similar como no Exemplo de Teste 2 foi conduzido para comparação da sensibilidade de detecção para o marcador alvo, exceto que apenas um tecido de câncer gástrico foi usado como uma amostra biológica, e que a molécula de ligação do marcador alvo (primeiro anticorpo: anticorpo monoclonal do produto de gene p53 anti-ser humano (DO-7) (NICHIREI BIOSCIENCES INC.)) foi usado diluído 2 vezes. [Tabela 2] [Tabela 3] [Tabela 4] [Tabela 5]
Preparação de reagente 1. Preparação do primeiro agente de ligação
[0179] Os primeiros agentes de ligação (reagente poliméricos) foram produzidos de acordo com as descrições nos parágrafos [0031] a [0040] da JP 2001-181299 A.
[0180] Especificamente, os reagentes poliméricos foram produzidos similarmente ao reagente polimérico (M) no Exemplo de Teste 1, exceto que os pesos moleculares médios dos polímeros carregadores foram definidos como 2.700, 7.500 e 9.200, respectivamente. Os reagentes poliméricos foram preparados em 5 μg/ml. Incidentalmente, o polímero carregador do reagente polimérico (M) usado no Exemplo de Teste 1 tem um peso molecular médio de 9.200.
[0181] Também, com respeito ao reagente do tipo poli-HRP não tendo nenhum carregador polimérico, o reagente (M) compreendendo Fab’ de Ig anti-camundongo (espécie de animal: cabra) e poli-HRP ligado a este foi preparado em 5 μg/ml.
2. Preparação da molécula ligadora
[0182] Um anticorpo anti-HRP de camundongo (clone: HP-03, TFS) foi preparado em 5 μg/ml.
3. Preparação do segundo agente de ligação
[0183] Os primeiros agentes de ligação acima foram preparados em 7,5 μg/ml.
[0184] Os resultados foram como mostrados na FIG. 8. Aqui, as fotografias microscópicas dos respectivos tecidos tingidos mostradas na FIG. 8 foram tiradas usando um microscópio óptico (Olympus Corporation) com uma lente ocular (10x) e uma lente objetiva (4x).
[0185] Os Exemplos 13 a 16 usando a molécula ligadora foram cada um confirmados fornecer sensibilidade de detecção significantemente melhorada, independente das diferenças nos pesos moleculares no primeiro agente de ligação e no segundo agente de ligação ou a presença ou ausência do polímero carregador (poli-L-lisina (PLL)), quando comparados com os Exemplos Comparativos 15 a 22 não usando nenhuma molécula ligadora. Incidentalmente, nenhum tingimento de fundo ocorreu no controle negativo.
Exemplo de Teste 6: Estudo da substância rotuladora 6-1: Sistema de reação usando substância rotuladora (fosfatase alcalina: AP) e molécula ligadora (anticorpo anti-AP de camundongo)
[0186] Um sistema de reação usando fosfatase alcalina (AP), no lugar da peroxidase de rábano (HRP), como a substância rotuladora e a molécula ligadora (anticorpo anti-AP de camundongo) foi estudado em termos de sensibilidade de detecção para o marcador alvo.
[0187] Incidentalmente, nos testes seguintes, um sistema de reação usando o primeiro agente de ligação e o segundo agente de ligação (polímero de aminoácido usando fosfatase alcalina (AP) como a substância rotuladora: reagente polimérico de AP (M)) e a molécula ligadora (anticorpo anti-AP de camundongo) foi definido como Exemplo 17; um sistema de reação usando apenas o primeiro agente de ligação (reagente polimérico de AP (M)) foi definido como Exemplo Comparativo 23; e um sistema de reação usando apenas o primeiro agente de ligação e o segundo agente de ligação (AP reagente polimérico (M)) foi definido como Exemplo Comparativo 24.
Preparação de reagente 1. Preparação do primeiro agente de ligação
[0188] Um reagente polimérico de AP (M) compreendendo fosfatases alcalinas (AP) e fragmentos Fab’ de Ig de anti-camundongo (espécie de animal: cabra) ligados a um polímero de aminoácido foi preparado em 10 μg/ml.
2. Preparação da molécula ligadora
[0189] Um anticorpo anti-AP de camundongo (clone: AP1B9, NOVUS BIOLOGICALS, LLC) foi preparado em 5 μg/ml.
3. Preparação do segundo agente de ligação
[0190] O reagente polimérico de AP (M) (NICHIREI BIOSCIENCES INC.) foi preparado em 10 μg/ml.
Tingimento imunoistoquímico 1. Desparafinização, bloqueio de peroxidase e tratamento de recuperação de antígeno
[0191] Estes procedimentos foram realizados similarmente como no Exemplo de Teste 1.
2. Adição-reação do primeiro anticorpo ou controle negativo (diluente do primeiro anticorpo)
[0192] Sobre a lâmina de vidro da qual um líquido em excesso foi tirado, um primeiro anticorpo ou um diluente do primeiro anticorpo foi adicionado às gotas para causar uma reação em uma câmara úmida a 25 °C por 30 minutos. Depois disso, a lâmina de vidro foi lavada em PBS por 3 minutos x duas vezes. A combinação de tecido e primeiro anticorpo usada no estudo é como segue.
[0193] ･Câncer gástrico anticorpo monoclonal do produto de gene p53 anti ser humano (DO-7) (NICHIREI BIOSCIENCES INC.) usado como tal.
3. Reação com o primeiro agente de ligação
[0194] Sobre a lâmina de vidro da qual um líquido em excesso foi tirado, o reagente polimérico de AP (M) foi adicionado às gotas para causar uma reação em uma câmara úmida a 25°C por 10 minutos. Depois disso, a lâmina de vidro foi lavada em PBS por 3 minutos x duas vezes. Incidentalmente, esta reação foi realizada no Exemplo 17 e Exemplos Comparativos 23 e 24.
4. Reação com a molécula ligadora
[0195] Sobre a lâmina de vidro da qual um líquido em excesso foi tirado, o anticorpo anti-AP de camundongo foi adicionado às gotas para causar uma reação em uma câmara úmida a 25 °C por 10 minutos. Depois disso, a lâmina de vidro foi lavada em PBS por 3 minutos x duas vezes. Incidentalmente, esta reação foi realizada no Exemplo 17 sozinho.
5. Reação com o segundo agente de ligação
[0196] Sobre a lâmina de vidro da qual um líquido em excesso foi tirado, o reagente polimérico de AP (M) foi adicionado às gotas para causar uma reação em uma câmara úmida a 25°C por 10 minutos. Depois disso, a lâmina de vidro foi lavada em PBS por 3 minutos x duas vezes. Incidentalmente, esta reação foi realizada apenas no Exemplo 17 e Exemplo Comparativo 24.
6. Adição-reação da solução de substrato
[0197] Sobre a lâmina de vidro da qual um líquido em excesso foi tirado, Kit do Substrato Fast-Red II (NICHIREI BIOSCIENCES INC.) foi adicionado às gotas para causar uma reação na temperatura ambiente por 10 minutos. Depois disso, a lâmina de vidro foi lavada com água corrente por 5 minutos.
7. Contra tingimento, desidratação-limpeza, montagem A. Contra tingimento
[0198] Depois de drenada, a lâmina de vidro foi imersa em uma solução de hematoxilina de Mayer por 30 segundos. Depois disso, a lâmina de vidro foi lavada com água corrente por 5 minutos.
B. Secagem ao ar
[0199] Depois da drenada, a secagem ao ar foi realizada usando-se um secador.
C. Montagem
[0200] A lâmina de vidro foi levemente imersa em xileno, e, depois disso, Meio de Montagem Permanente (Não aquoso) (NICHIREI BIOSCIENCES INC.) foi usado para a montagem.
[0201] Os resultados foram como mostrados na FIG. 9. Aqui, as fotografias microscópicas dos respectivos tecidos tingidos mostradas na FIG. 9 foram tiradas usando um microscópio óptico (Olympus Corporation) com uma lente ocular (10x) e uma lente objetiva (4x).
[0202] Quando fosfatase alcalina (AP) foi usada como a substância rotuladora, Exemplo 17 usando o primeiro agente de ligação, a molécula ligadora e o segundo agente de ligação forneceram sensibilidade de detecção significantemente melhorada, quando comparado com o Exemplo Comparativo 23 usando apenas o primeiro agente de ligação e o Exemplo Comparativo 24 usando apenas o primeiro agente de ligação e o segundo agente de ligação.
[0203] Incidentalmente, nenhum tingimento de fundo ocorreu no controle negativo.
Exemplo de Teste 6-2: Sistema de reação usando substância rotuladora (fosfatase alcalina: AP) e molécula ligadora (anticorpo anti-AP de coelho)
[0204] Um sistema de reação usando fosfatase alcalina (AP), no lugar da peroxidase de rábano (HRP), como a substância rotuladora e a molécula ligadora (anticorpo anti-AP de coelho) foi estudado em termos de sensibilidade de detecção para o marcador alvo.
[0205] No seguinte teste, um sistema de reação usando o primeiro agente de ligação e o segundo agente de ligação (polímero de aminoácido usando fosfatase alcalina (AP) como a substância rotuladora: reagente polimérico de AP (R)) e a molécula ligadora (anticorpo anti-AP de coelho) foi definido como Exemplo 18; um sistema de reação usando apenas o primeiro agente de ligação (Reagente polimérico AP (R)) foi definido como Exemplo Comparativo 25; e um sistema de reação usando apenas o primeiro agente de ligação e o segundo agente de ligação (Reagente polimérico AP (R)) foi definido como Exemplo Comparativo 26.
Preparação de reagente 1. Preparação do primeiro agente de ligação
[0206] Um reagente polimérico AP (R) compreendendo fosfatases alcalinas (AP) e fragmentos Fab’ de Ig anti-coelho (espécie de animal: cabra) ligados a um polímero de aminoácido foi preparado em 10 μg/ml.
2. Preparação de molécula ligadora
[0207] Um anticorpo anti-AP de coelho (policlonal, NOVUS BIOLOGICALS, LLC) foi preparado em 5 μg/ml.
3. Preparação do segundo agente de ligação
[0208] O reagente polimérico AP (R) foi preparado em 10 μg/ml.
Tingimento imunoistoquímico 1. Desparafinização, bloqueio de peroxidase e tratamento de recuperação de antígeno
[0209] Estes procedimentos foram realizados similarmente como no Exemplo de Teste 1.
2. Adição-reação do primeiro anticorpo ou controle negativo (diluente do primeiro anticorpo)
[0210] Sobre a lâmina de vidro da qual um líquido em excesso foi tirado, um primeiro anticorpo ou um diluente do primeiro anticorpo foi adicionado às gotas para causar uma reação em uma câmara úmida a 25°C por 30 minutos. Depois disso, a lâmina de vidro foi lavada em PBS por 3 minutos x duas vezes. A combinação de tecido e primeiro anticorpo usada no estudo é como segue.
[0211] ･Câncer colorretal ... anticorpo monoclonal de coelho anti-CDX-2 (NICHIREI BIOSCIENCES INC.) usado como tal.
3. Reação com o primeiro agente de ligação
[0212] Sobre a lâmina de vidro da qual um líquido em excesso foi tirado, o reagente polimérico AP (R) foi adicionado às gotas para causar uma reação em uma câmara úmida a 25°C por 10 minutos. Depois disso, a lâmina de vidro foi lavada em PBS por 3 minutos x duas vezes. Incidentalmente, esta reação foi realizada no Exemplo 18 e Exemplos Comparativos 25 e 26.
4. Reação com a molécula ligadora
[0213] Sobre a lâmina de vidro da qual um líquido em excesso foi tirado, o anticorpo anti-AP de coelho foi adicionado às gotas para causar uma reação em uma câmara úmida a 25°C por 10 minutos. Depois disso, a lâmina de vidro foi lavada em PBS por 3 minutos x duas vezes. Incidentalmente, esta reação foi realizada no Exemplo 18 sozinho.
5. Reação com o segundo agente de ligação
[0214] Sobre a lâmina de vidro da qual um líquido em excesso foi tirado, o reagente polimérico AP (R) foi adicionado às gotas para causar uma reação em uma câmara úmida a 25°C por 10 minutos. Depois disso, a lâmina de vidro foi lavada em PBS por 3 minutos x duas vezes. Incidentalmente, esta reação foi realizada apenas no Exemplo 18 e Exemplo Comparativo 26.
6. Adição-reação da solução de substrato
[0215] Sobre a lâmina de vidro da qual um líquido em excesso foi tirado, o Kit de Substrato Fast-Red II (NICHIREI BIOSCIENCES INC.) foi adicionado às gotas para causar uma reação na temperatura ambiente por 10 minutos. Depois disso, a lâmina de vidro foi lavada com água corrente por 5 minutos.
7. Contra tingimento, desidratação-limpeza, montagem
[0216] Estes procedimentos foram realizados similarmente como no Exemplo de Teste 6-1.
[0217] Os resultados foram como mostrados na FIG. 10. Aqui, as fotografias microscópicas dos respectivos tecidos tingidos mostradas na FIG. 10 foram tiradas usando um microscópio óptico (Olympus Corporation) com uma lente ocular (10x) e uma lente objetiva (4x).
[0218] Quando fosfatase alcalina (AP) foi usada como a substância rotuladora, Exemplo 18 usando o primeiro agente de ligação, a molécula ligadora e o segundo agente de ligação forneceram sensibilidade de detecção significantemente melhorada, quando comparado com o Exemplo Comparativo 25 usando apenas o primeiro agente de ligação e Exemplo Comparativo 26 usando apenas o primeiro agente de ligação e o segundo agente de ligação.
[0219] Incidentalmente, nenhum tingimento de fundo ocorreu no controle negativo.
Exemplo de Teste 7: Estudo do método de tingimento de alta sensibilidade pelo método CISH
[0220] Neste teste, foi revisado, de acordo com os seguintes procedimentos, se a presente invenção poderia ser aplicada ao método CISH (Hibridização Cromogênica in situ: Hibridização in situ (ISH - in situ Hybridization) envolvendo detectar o DNA e mRNA em um espécime de tecido usando um pigmento tal como 3,3’- diaminobenzidina (DAB)). Uma sonda rotulada com digoxigenina (DIG) foi aplicada, como a molécula de ligação do marcador alvo, a um espécime de tecido. Depois de bloquear, a sonda foi detectada usando um reagente de detecção capaz de ligação direta ao DIG.
[0221] Neste teste, Sonda HER2 foi usada como a molécula de ligação do marcador alvo.
[0222] Em seguida, no Exemplo 19, um sistema de reação usando o primeiro agente de ligação (reagente polimérico HRP anti-DIG de cabra (NICHIREI BIOSCIENCES INC.)), a molécula ligadora (anticorpo anti-HRP de coelho (policlonal) (NICHIREI BIOSCIENCES INC.)) e o segundo agente de ligação (Histofine® Simple Stain® MAX-PO (R), (NICHIREI BIOSCIENCES INC.)) como o reagente de detecção foi selecionado.
[0223] Também, no Exemplo Comparativo 27, um sistema de reação usando apenas o primeiro agente de ligação (reagente polimérico anti-DIG-HRP de cabra) foi selecionado como o reagente de detecção. Além disso, no Exemplo Comparativo 28, um sistema de reação usando o primeiro agente de ligação (anticorpo anti-DIG de cabra) e o segundo agente de ligação (Histofine® Simple Stain® MAX-PO (G) (NICHIREI BIOSCIENCES INC.)) como o reagente de detecção foi selecionado.
CISH 1. Desparafinização, bloqueio de peroxidase e tratamento de recuperação de antígeno, desidratação-secagem ao ar A. Provisão de lâmina de espécime
[0224] Uma seção de tecido foi fatiada em 5 μm e montada sobre uma lâmina de vidro revestida com MAS. Depois disso, a lâmina de vidro foi secada durante a noite em uma incubadora a 37°C.
B. Desparafinização, bloqueio de peroxidase e tratamento de recuperação de antígeno, desidratação-secagem ao ar (I) Tratamento com xileno (3 minutos x 3 vezes)
[0225] A lâmina foi imersa em xileno por 3 minutos. Depois disso, um líquido em excesso foi tirado, e em seguida a lâmina foi imersa em um outro xileno por 3 minutos. Depois disso, um líquido em excesso foi tirado, e a lâmina foi imersa ainda em um outro xileno por 3 minutos.
(II) Tratamento com etanol (3 minutos x 4 vezes)
[0226] A lâmina foi imersa em 100 % de etanol por 3 minutos. Um líquido em excesso foi tirado, e a lâmina foi imersa em um outro etanol a 100 % por 3 minutos. Esta operação foi realizada duas vezes mais.
(III) Bloqueio de peroxidase
[0227] A peroxidase endógena foi bloqueada. Depois de drenada, a lâmina foi imersa em uma solução a 3 V/V % peróxido de hidrogênio por 5 minutos.
(IV) Lavagem
[0228] A lâmina foi lavada em PBS (duas vezes, respectivamente por 1 minuto).
(V) Tratamento de recuperação de antígeno
[0229] Como pré-tratamento, uma solução de recuperação de antígeno (10 mM de tampão de citrato de sódio (pH 6,0)) foi usada para o tratamento térmico a 98 °C por 30 minutos.
(VI) Lavagem
[0230] A lâmina foi lavada em PBS (duas vezes, respectivamente por 2 minutos).
(VII) Tratamento de recuperação de antígeno
[0231] O tratamento com protease foi realizado em uma câmara úmida na temperatura ambiente por 3 minutos.
(VIII) Lavagem
[0232] A lâmina foi lavada em PBS.
(IX) Desidratação
[0233] A lâmina foi imersa em etanol a 70 %, etanol a 90 % e etanol a 100 %, respectivamente, por 1 minuto, e em seguida secada ao ar.
Desnaturação e hibridização
[0234] (I) A Sonda HER2 foi turbilhonada, e aplicada a uma lâmina.
[0235] (II) Uma lamínula (cover glass) foi colocada sobre a lâmina evitando-se bolhas, e seladas na sua periferia com uma união de papel.
[0236] (III) Uma placa quente foi usada para a desnaturação a 82°C por 5 minutos.
[0237] (IV) A lâmina foi movida na câmara de umidade para a hibridização a 37°C durante a noite.
Pós-hibridização e detecção
[0238] (I) Depois do descascamento cuidadoso da união de papel, a lâmina foi lavada em 2xSSC na temperatura ambiente por 5 minutos. Em seguida, a lamínula foi removida.
[0239] (II) A lâmina foi lavada em 2xSSC a 72°C por 5 minutos.
[0240] (III) A lâmina foi lavada em PBS duas vezes, respectivamente por 1 minuto.
[0241] (IV) Como indicado na Tabela 6, reações foram realizadas para o Exemplo 19 e Exemplos Comparativos 27 e 28. Aqui, todas as reações foram realizadas a 25°C. Entre as respectivas etapas, a lâmina foi lavada em PBS três vezes, respectivamente por 1 minuto. [Tabela 6]
[0242] (V) A lâmina foi lavada em PBS três vezes, respectivamente por 1 minuto. Depois disso, o PBS foi bem drenado.
[0243] (VI) Sobre a lâmina de vidro da qual um líquido em excesso foi tirado, N- Histofine® DAB-2V (NICHIREI BIOSCIENCES INC.) foi adicionado às gotas para causar uma reação na temperatura ambiente por 5 minutos.
[0244] (VII) A lâmina de vidro foi lavada com água corrente por 5 minutos.
[0245] (VIII) Depois de drenada, a lâmina de vidro foi imersa em uma solução de hematoxilina de Mayer por 15 segundos para contra tingimento.
[0246] (IX) A lâmina de vidro foi lavada com água corrente por 5 minutos.
[0247] (X) A drenagem foi seguida pela desidratação com etanol a 100 % por 3 minutos.
[0248] (XI) A lâmina foi depurada com xileno duas vezes, respectivamente por 5 minutos.
[0249] (XII) Meio de Montagem Permanente (Não aquoso) (NICHIREI BIOSCIENCES INC.) foi usado para a montagem.
[0250] A intensidade de tingimento por CISH foi visualmente determinada, com base no sinal do Exemplo Comparativo 27 definido como 1+, usando um microscópio óptico (Olympus Corporation) (com uma lente ocular (10x) e uma lente objetiva (x100)), e, como um resultado, foi como indicado na Tabela 7 seguinte. O Exemplo 19 forneceu sensibilidade de detecção significantemente melhorada, quando comparado com os Exemplos Comparativos 27 e 28. [Tabela 7]
Exemplo de Teste 8: Estudo do realce da imunorreação Uso de polietileno glicol
[0251] Um teste comparativo foi conduzido de modo a revisar como a sensibilidade de detecção para o marcador alvo variou quando qualquer uma das imunorreações de três estágios da presente invenção foi realizado na coexistência de polietileno glicol.
[0252] Especificamente, no Exemplo 20, as imunorreações de três estágios foram realizadas usando o primeiro agente de ligação, a molécula ligadora e o segundo agente de ligação, sem a coexistência de polietileno glicol.
[0253] No Exemplo 21, a imunorreação do primeiro estágio foi realizada na coexistência de polietileno glicol e do primeiro agente de ligação, e em seguida as imunorreações do segundo e terceiro estágios foram respectivamente conduzidas usando a molécula ligadora e o segundo agente de ligação.
[0254] No Exemplo 23, a imunorreação do primeiro estágio foi realizada usando o primeiro agente de ligação; a imunorreação do segundo estágio foi realizada na coexistência de polietileno glicol e da molécula ligadora; e, em seguida, a imunorreação do terceiro estágio foi realizada usando o segundo agente de ligação.
[0255] No Exemplo 22, a imunorreação do primeiro estágio foi realizada usando o primeiro agente de ligação; a imunorreação do segundo estágio foi realizada usando a molécula ligadora; e, em seguida, a imunorreação do terceiro estágio foi realizada na coexistência de polietileno glicol e do segundo agente de ligação.
[0256] No Exemplo 24, todas as imunorreações de três estágios usando o primeiro agente de ligação, a molécula ligadora e o segundo agente de ligação foram conduzidas na coexistência de polietileno glicol.
[0257] Incidentalmente, procedimentos específicos foram realizados de acordo com o Exemplo de Teste 2, exceto que apenas um tecido de câncer colorretal foi usado como uma amostra biológica, e que a molécula de ligação do marcador alvo (primeiro anticorpo: anticorpo monoclonal de coelho anti-CDX-2 (NICHIREI BIOSCIENCES INC.)) foi diluída 5 vezes.
Preparação de reagente 1. Preparação do primeiro agente de ligação
[0258] Um reagente polimérico (M) compreendendo peroxidases e fragmentos Fab’ de Ig anti-camundongo (espécie de animal: cabra) ligados a um polímero de aminoácido e um reagente polimérico (R) compreendendo peroxidases e fragmentos Fab’ de Ig anti-coelho (espécie de animal: cabra) ligados a um polímero de aminoácido foram misturados na quantidade de 5 μg/ml cada um, preparando deste modo um reagente de coquetel polimérico (MULTI).
2. Preparação de molécula ligadora
[0259] Um anticorpo anti-HRP de camundongo (clone: HP-03) (TFS) e um anticorpo anti-HRP de camundongo (clone: 2H11) (Novus Biologicals, LLC) foram misturados na quantidade de 2,5 μg/ml cada um, preparando deste modo uma molécula ligadora.
3. Preparação do segundo agente de ligação
[0260] O reagente polimérico (M) compreendendo peroxidases e fragmentos Fab’ de Ig anti-camundongo (espécie de animal: cabra) ligados a um polímero de aminoácido foi preparado em 5 μg/ml.
4. Polietileno glicol
[0261] Nos Exemplos 21 a 24, polietileno glicol (peso molecular médio (MW): 8.000, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) foi dissolvido, em uma quantidade de 2,5% em peso, em qualquer uma das soluções aquosas que constituem o primeiro agente de ligação, a molécula ligadora e o segundo agente de ligação.
[0262] Os resultados foram como mostrados na FIG. 11. Aqui, as fotografias microscópicas dos respectivos tecidos tingidos mostrados na FIG. 11 foram tiradas usando um microscópio óptico (Olympus Corporation) com uma lente ocular (10x) e uma lente objetiva (4x).
[0263] Os Exemplos 21 a 24 com a coexistência de polietileno glicol em qualquer uma das imunorreações fornecidas melhoraram a sensibilidade de detecção, quando comparados com o Exemplo 20 sem a coexistência de polietileno glicol em nenhuma das imunorreações. Especialmente, o Exemplo 24 com a coexistência de polietileno glicol em todos os estágios (primeiro ao terceiro estágios) forneceram a sensibilidade.

Claims (6)

1. Produto de combinação para detectar um marcador alvo (2) em uma amostra biológica (1) em combinação com uma molécula de ligação de marcador alvo (3) que é um anticorpo capaz de ligar especificamente ao marcador alvo (2), o produto de combinação caracterizado pelo fato de que compreende, pelo menos: (a) um primeiro agente de ligação (4) compreendendo uma primeira molécula de ligação (7) que é capaz de ligar diretamente de modo específico à molécula de ligação do marcador alvo (3), uma substância rotuladora (8), e um carregador (9), em que a primeira molécula de ligação (7) é um anticorpo ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo; (b) uma molécula ligadora (5); e (c) um segundo agente de ligação (6) compreendendo uma segunda molécula de ligação (10) que é capaz de ligar especificamente à molécula ligadora (5), uma substância rotuladora (8’), e um carregador (9’), em que a segunda molécula ligadora (10) é um anticorpo ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo, em que a molécula ligadora (5) é um anticorpo, em que a molécula ligadora (5) é capaz de ligar especificamente à substância rotuladora (8) no primeiro agente de ligação (4) e a substância rotuladora (8’) no segundo agente de ligação (6), em que a molécula ligadora (5) é capaz de ligar especificamente ao primeiro agente de ligação (4) e ao segundo agente de ligação (6), e em que a molécula ligadora (5) inclui pelo menos dois sítios de ligação em que a molécula ligadora (5) é capaz de ligar especificamente ao segundo agente de ligação (6), em que a substância rotuladora (8) no primeiro agente de ligação (4) e a substância rotuladora (8’) no segundo agente de ligação (6) é a mesma substância, em que o primeiro agente de ligação (4) é uma estrutura na qual a primeira molécula de ligação (7) e a substância de rotulagem (8) são conectadas uma com a outra indiretamente através de um carregador (9), em que o carregador (9) é poliaminoácidos, e em que o segundo agente de ligação (6) é uma estrutura em que a segunda molécula de ligação (10) e a substância de rotulagem (8’) são conectadas uma com a outra indiretamente através de um carregador (9’), em que o carregador (9’) é poliaminoácidos, e em que a substância de rotulagem (8, 8’) é um rótulo enzimático.
2. Produto de combinação, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é combinado ainda com a molécula de ligação do marcador alvo (3).
3. Produto de combinação, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que está na forma de um kit.
4. Método para detectar um marcador alvo (2) em uma amostra biológica (1) obtida de um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (i) contatar uma molécula de ligação de marcador alvo (3) que é um anticorpo preliminarmente ligada especificamente ao marcador alvo (2) com um primeiro agente de ligação (4), obtendo deste modo um primeiro complexo; (ii) contatar o primeiro complexo com uma molécula ligadora (5), obtendo deste modo um segundo complexo; e (iii) contatar o segundo complexo com um segundo agente de ligação (6), obtendo deste modo um terceiro complexo, em que o primeiro agente de ligação (4) compreende uma primeira molécula de ligação (7) que é um anticorpo capaz de ligar diretamente de modo específico à molécula de ligação do marcador alvo (3), uma substância rotuladora (8), e um carregador (9), em que a primeira molécula ligadora (7) é um anticorpo ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo; em que o segundo agente de ligação (6) compreende uma segunda molécula ligadora (10) que é capaz de ligar especificamente à molécula ligadora (5), uma substância rotuladora (8’), e um carregador (9’), em que a segunda molécula ligadora (10) é um anticorpo ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo, em que a molécula ligadora (5) é um anticorpo, em que a molécula ligadora (5) é capaz de ligar especificamente à substância rotuladora (8) no primeiro agente de ligação (4) e a sustância rotuladora (8’) no segundo agente de ligação (6), em que a molécula ligadora (5) é capaz de ligar especificamente ao primeiro agente de ligação (4) e ao segundo agente de ligação (6), e em que a molécula ligadora (5) inclui pelo menos dois sítios de ligação em que a molécula ligadora (5) é capaz de ligar especificamente ao segundo agente de ligação (6), em que a substância rotuladora (8) no primeiro agente de ligação (4) e a substância rotuladora (8’) no segundo agente de ligação (6) é a mesma substância, em que o primeiro agente de ligação (4) é uma estrutura em que a primeira molécula ligadora (7) e a substância rotuladora (8) são conectadas uma com a outra indiretamente através do carregador (9), em que o carregador (9) é poliaminoácidos, e em que o segundo agente de ligação (6) é uma estrutura em que a segunda molécula de ligação (10) e a substância de rotulagem (8’) são conectadas uma com a outra indiretamente através de um carregador (9’), em que o carregador (9’) é poliaminoácidos, e em que a substância de rotulagem (8, 8’) é um rótulo enzimático.
5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a etapa de detectar a substância rotuladora (8, 8’) no terceiro complexo.
6. Uso de um produto de combinação para detectar um marcador alvo (2) em uma amostra biológica (1) em combinação com uma molécula de ligação de marcador alvo (3) que é capaz de ligar especificamente ao marcador alvo (2), caracterizado pelo fato de que o produto de combinação compreende, pelo menos: (a) um primeiro agente de ligação (4) compreendendo uma primeira molécula de ligação (7) que é capaz de ligar diretamente de modo específico à molécula de ligação do marcador alvo (3), uma substância rotuladora (8), e um carregador (9), em que a primeira molécula de ligação (7) é um anticorpo ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo; (b) uma molécula ligadora (5); e (c) um segundo agente de ligação (6) compreendendo uma segunda molécula ligadora (10) que é capaz de ligar especificamente à molécula ligadora (5), uma substância rotuladora (8’), e um carregador (9’), em que a segunda molécula de ligação (10) é um anticorpo ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo, em que a molécula ligadora (5) é um anticorpo, em que a molécula ligadora (5) é capaz de ligar especificamente à substância rotuladora (8) no primeiro agente de ligação (4) e a substância rotuladora (8’) no segundo agente de ligação (6), em que a molécula ligadora (5) é capaz de ligar especificamente ao primeiro agente de ligação (4) e ao segundo agente de ligação (6), e em que a molécula ligadora (5) inclui pelo menos dois sítios de ligação em que a molécula ligadora (5) é capaz de ligar especificamente ao segundo agente de ligação (6), em que a substância rotuladora (8) no primeiro agente de ligação (4) e a substância rotuladora (8’) no segundo agente de ligação (6) é a mesma substância, em que o primeiro agente de ligação (4) é uma estrutura em que a primeira molécula ligadora (7) e a substância rotuladora (8) são conectadas uma com a outra indiretamente através do carregador (9), em que o carregador (9) é poliaminoácidos, e em que o segundo agente de ligação (6) é uma estrutura em que a segunda molécula de ligação (10) e a substância de rotulagem (8’) são conectadas uma com a outra indiretamente através de um carregador (9’), em que o carregador (9’) é poliaminoácidos, e em que a substância de rotulagem (8, 8’) é um rótulo enzimático.
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