JPWO2015163424A1 - 標的マーカー検出用組合せ物 - Google Patents

標的マーカー検出用組合せ物 Download PDF

Info

Publication number
JPWO2015163424A1
JPWO2015163424A1 JP2015559352A JP2015559352A JPWO2015163424A1 JP WO2015163424 A1 JPWO2015163424 A1 JP WO2015163424A1 JP 2015559352 A JP2015559352 A JP 2015559352A JP 2015559352 A JP2015559352 A JP 2015559352A JP WO2015163424 A1 JPWO2015163424 A1 JP WO2015163424A1
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
binding
molecule
binding agent
antibody
labeling substance
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP2015559352A
Other languages
English (en)
Other versions
JP6019254B2 (ja
Inventor
林 弘 一 大
林 弘 一 大
田 佳誉子 藤
田 佳誉子 藤
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nichirei Biosciences Inc
Original Assignee
Nichirei Biosciences Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nichirei Biosciences Inc filed Critical Nichirei Biosciences Inc
Application granted granted Critical
Publication of JP6019254B2 publication Critical patent/JP6019254B2/ja
Publication of JPWO2015163424A1 publication Critical patent/JPWO2015163424A1/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/536—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/5306—Improving reaction conditions, e.g. reduction of non-specific binding, promotion of specific binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • C12Q1/28—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving peroxidase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/535—Production of labelled immunochemicals with enzyme label or co-enzymes, co-factors, enzyme inhibitors or enzyme substrates
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/581—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with enzyme label (including co-enzymes, co-factors, enzyme inhibitors or substrates)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • G01N33/6857—Antibody fragments
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/42—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving phosphatase

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本発明は、標的マーカーを簡易にかつ高感度で検出するための組合せ物に関する。より詳細には、本発明は、生物学的試料中の標的マーカーと特異的に結合可能な標的マーカー結合分子と併用して生物学的試料中の標的マーカーを検出するための組合せ物であって、（ａ）上記標的マーカー結合分子と直接または間接的に特異的に結合可能な第一結合分子と、標的物質とを含む、第一結合剤、（ｂ）上記第一結合剤と特異的に結合可能なリンカー分子、および（ｃ）上記リンカー分子と特異的に結合可能な第二結合剤であって、第二結合分子と、標識物質とを含む、第二結合剤を少なくとも含む、組合せ物に関する。

Description

関連出願の参照
本特許出願は、２０１４年４月２３日に出願された日本国特許出願２０１４−８９６７５号に基づく優先権の主張を伴うものであり、かかる先の特許出願における全開示内容は、引用することにより本明細書の一部とされる。
本発明は、標的マーカーを検出するための組合せ物およびそれを用いた検出方法に関する。
近年の免疫化学の進歩により、抗原抗体反応を用いて微量の物質を感度良く検出する免疫測定法が広く用いられている。免疫測定法の中で一般的なものとして免疫染色法などが挙げられる。
免疫染色法は、細胞や組織切片上の特定の物質を、それを認識する抗体などを用いて検出する方法である。その免疫染色法のうち、検出可能物質が酵素の場合は酵素抗体法と称される。酵素抗体法としては、一次抗体を可視化できる酵素で標識したものを用いる直接法や一次抗体を標識せずに二次抗体を標識する間接法といった方法が開発されてきた。
さらに、近年では、組織・細胞内に分布する少量の抗原蛋白の可視化、あるいはホルマリン固定やパラフィン包埋の処理によって抗原性が著しく損なわれた抗原物質の証明のために、さらなる高感度が必要となり、酵素抗体法の変法である各種増感法がつぎつぎと開発されている。それら増感法として、感度の低い順に、直接法＜間接法＜PAP（peroxidase anti-peroxidase）法＜ABC（avidin-biotin-peroxidase complex）法＜LSAB(labeled streptavidin biotin)法＜ポリマー法＜CSA(catalyzed signal amplification)法などが挙げられる。（非特許文献１）
上記増感法のうち、現在、高感度で簡便な方法として、最も普及している方法はポリマー法である。
従来ポリマー法の一つとしては、抗原などの標的マーカーに対し一次抗体を反応させた後に、ポリマー試薬（ポリマーに多数の酵素と二次抗体が結合されている）を反応させることで、抗原・一次抗体・二次抗体・ポリマー・酵素の複合体を形成させる方法が挙げられる。この複合体中の酵素活性を利用して基質を発色することにより、標的マーカーを可視化できる。（非特許文献１）
また、別のポリマー法としては、上述の従来ポリマー法における一次抗体とポリマー試薬の間に、ブリッジ試薬（その他、メーカーによりリンカー、プローブ、ポストプライマリーなどと様々に名付けられている）を反応させることによりシグナルの増感を行う方法が挙げられる。その結果、上記方法よりも２〜５倍高い感度が期待できると言われている（非特許文献１）。
近年、さらに、新たなポリマー法として、上記のポリマー試薬（第一のポリマー試薬）に対して、さらなるポリマー試薬（第二のポリマー試薬）を反応させることによりシグナルの増感を行う方法も開発された（特許文献１）。
しかしながら、従来のポリマー法を用いたとしても、標的マーカーが極めて微少であるか抗原性が低下しているなどの理由により望むレベルの染色が得られないことがある。このような技術状況下、簡便に、より一層の高感度で標的マーカーを検出する手段が依然として求められている。
鴨志田伸吾、基礎からの免疫染色術−いかに確実に染め出すか−、組織細胞化学2012、日本組織細胞化学会編、2012、p.11-25
特表２００７−５１３３３４号公報
本発明は、生物学的試料において発現している標的マーカーを、簡便にかつ高感度で検出することを目的としている。
本発明者らは、今般、標識物質で標識された複数の結合剤と、特定のリンカー分子とを組み合わせて標的マーカーの検出に用いたところ、標的マーカーを簡便にかつ顕著な高感度で検出しうることを見出した。本発明はかかる知見に基づくものである。
本発明には、以下の発明が包含される。
（１）生物学的試料中の標的マーカーと特異的に結合可能な標的マーカー結合分子と併用して該標的マーカーを検出するための組合せ物であって、
（ａ）上記標的マーカー結合分子と直接または間接的に特異的に結合可能な第一結合分子と、標識物質とを含む、第一結合剤、
（ｂ）上記第一結合剤と特異的に結合可能なリンカー分子、および
（ｃ）上記リンカー分子に特異的に結合可能な第二結合剤であって、第二結合分子と、標識物質とを含む、第二結合剤
を少なくとも含む、組合せ物。
（２）上記リンカー分子が、上記標識物質に特異的に結合可能である、（１）に記載の組合せ物。
（３）上記リンカー分子が抗体またはその抗原結合フラグメントである、（１）または（２）に記載の組合せ物。
（４）標識物質が、化学発光標識、金属粒子、蛍光標識、酵素標識、補酵素標識、標識された抗体、色素、生物発光標識、ハプテン、および、ポリマー粒子
から選択される少なくとも１種以上である、（１）〜（３）のいずれかに記載の組合せ物。
（５）上記第一結合剤が、上記第一結合分子と上記標識物質とが直接的に、または担体を介して間接的に連結してなる構造体である、（１）〜（４）のいずれかに記載の組合せ物。
（６）上記第二結合剤が、上記第二結合分子と上記標識物質とが直接的に、または担体を介して間接的に連結してなる構造体である、（１）〜（５）のいずれかに記載の組合せ物。
（７）上記第一結合分子が、抗体またはその抗原結合フラグメントである、（１）〜（６）のいずれかに記載の組合せ物。
（８）上記第二結合分子が、抗体またはその抗原結合フラグメントである、（１）〜（７）のいずれかに記載の組合せ物。
（９）上記標的マーカー結合分子とさらに組み合せてなる、（１）〜（８）のいずれかに記載の組合せ物。
（１０）キットの形態である、（１）〜（９）のいずれかに記載の組合せ物。
（１１）被験体から得られた生物学的試料中の標的マーカーを検出する方法であって、
(i)予め標的マーカーと特異的に結合させた標的マーカー結合分子と、第一結合剤とを接触させて第一複合体を得る工程、
(ii)該第一複合体と、リンカー分子とを接触させて第二複合体を得る工程、および
(iii)該第二複合体と、第二結合剤とを接触させて第三複合体を得る工程
を含み、
上記第一結合剤が、上記標的マーカー結合分子と直接または間接的に特異的に結合可能な第一結合分子と、標識物質とを含み、
上記リンカー分子が上記第一結合剤と特異的に結合可能であり
上記第二結合剤が、上記リンカー分子と特異的に結合可能であって、第二結合分子と標識物質とを含む、方法。
（１２）上記第三複合体中の標識物質を検出する工程をさらに含んでなる、（１１）に記載の方法。
（１３）上記リンカー分子が抗体またはその抗原結合フラグメントである、（１１）または（１２）に記載の方法。
（１４）上記リンカー分子が、上記標識物質に特異的に結合可能である、（１１）〜（１３）のいずれかに記載の方法。
（１５）上記標識物質が、化学発光標識、金属粒子、蛍光標識、酵素標識、補酵素標識、標識された抗体、色素、生物発光標識、ハプテンおよびポリマー粒子
から選択される少なくとも１種以上の標識物質である、（１１）〜（１４）のいずれかに記載の方法。
（１６）上記第一結合剤が、第一結合分子と上記標識物質とが直接的に、または担体を介して間接的に連結してなる構造体である、（１１）〜（１５）のいずれかに記載の方法。
（１７）上記第二結合剤が、第二結合分子と上記標識物質とが直接的に、または担体を介して間接的に連結してなる構造体である、（１１）〜（１６）のいずれか一項に記載の方法。
（１８）上記第一結合分子が、抗体またはその抗原結合フラグメントである、（１１）〜（１７）のいずれかに記載の方法。
（１９）上記第二結合分子が、抗体またはその抗原結合フラグメントである、（１１）〜（１８）のいずれかに記載の方法。
（２０）標的マーカーと特異的に結合可能な標的マーカー結合分子と併用して生物学的試料中の標的マーカーを検出するための組合せ物の使用であって、
（ａ）上記標的マーカー結合分子と直接または間接的に特異的に結合可能な第一結合分子と、標識物質とを含む、第一結合剤、
（ｂ）上記第一結合剤と特異的に結合可能なリンカー分子、および
（ｃ）第二結合分子と、標識物質とを含む、上記リンカー分子と特異的に結合可能な第二結合剤
を少なくとも含み、
上記リンカー分子が、標識物質に特異的に結合可能である、使用。
本発明によれば、標的マーカーを簡便にかつ顕著な高感度で検出することができる。
本発明の標的マーカーの検出方法に関する模式図である。 試験例１（比較例１、２）の免疫組織化学染色の結果を示す写真である。 試験例２（実施例１、２、比較例３、４）の免疫組織化学染色の結果を示す写真である。 試験例３（実施例３〜５、比較例５〜７）の免疫組織化学染色の結果を示す写真である。 試験例４：４−１（実施例６、７、比較例８、９）の免疫組織化学染色の結果を示す写真である。 試験例４：４−２（実施例８、９、比較例１０、１１）の免疫組織化学染色の結果を示す写真である。 試験例４：４−３（実施例１０〜１２、比較例１２〜１４）の免疫組織化学染色の結果を示す写真である。 試験例５（実施例１３〜１６、比較例１５〜２２）の免疫組織化学染色の結果を示す写真である。 試験例６：６−１（実施例１７、比較例２３、２４）の免疫組織化学染色の結果を示す写真である。 試験例６：６−２（実施例１８、比較例２５、２６）の免疫組織化学染色の結果を示す写真である。 試験例７：ポリエチレングリコールの非存在下で実施した実施例２０およびポリエチレングリコールの存在下で実施した実施例２１〜２４の免疫組織化学染色の結果を示す写真である。
発明の具体的説明
組合せ物
本発明の組合せ物は、標的マーカーと特異的に結合可能な標的マーカー結合分子と併用して生物学的試料中の標的マーカーを検出するための組合せ物であって、
（ａ）上記標的マーカー結合分子と直接または間接的に特異的に結合可能な第一結合分子と、標識物質とを含む、第一結合剤、
（ｂ）上記第一結合剤と特異的に結合可能なリンカー分子、および
（ｃ）第二結合分子と、標識物質とを含む、上記リンカー分子と特異的に結合可能な第二結合剤
を少なくとも含むことを特徴としている。
以下、本発明を特に限定するものではないが、本発明の組合せ物を用いた検出方法の一態様を図１に従って説明する。
図１では、生物学的試料１上に検出対象の標的マーカー２が発現している。この標的マーカー２を捕捉するために、標的マーカー２に対して標的マーカー結合分子３を予め特異的に結合させる。
次に、標的マーカー２を検出するための試薬として、第一結合剤４、リンカー分子５、および第二結合剤６を準備する。
ここで、第一結合剤４は、標的マーカー結合分子３と直接または間接的に特異的に結合可能な第一結合分子７、標識物質８、および担体９（ポリマーなど）とから構成されている。
また、第二結合剤６は、リンカー分子５に特異的に結合可能な構造体である。図１では、第二結合剤６は、リンカー分子５に特異的に結合可能な第二結合分子１０、標識物質８’、および担体９’（ポリマーなど）とから構成されている。
また、リンカー分子５は、標識物質８、第二結合分子１０および標識物質８’に特異的に結合可能な少なくとも三つの結合部位を含んでいる。
図１では、上記のように予め準備した検出用試薬の組合せを用いて、以下の第１工程〜第３工程を介して標的マーカーを検出することができる。
第１工程では、標的マーカー２と結合した標的マーカー結合分子３と、第一結合剤４とを接触させて第一複合体（１〜４）を得る。
次に、第２工程では、第一複合体（１〜４）と、リンカー分子５とを接触させて第二複合体（１〜５）を得る。
次に、第３工程では、第二複合体（１〜５）と、第二結合剤６とを接触させて第三複合体（１〜６）を得る。ここで、リンカー分子５と、第二結合剤６とは、第二結合分子１０と、標識物質８’という少なくとも２種類の結合部位を介して安定的に結合される。
以上の第１〜３工程により、標的マーカー２は、標識物質８および標識物質８’の両方によって標識され、高い検出感度で検出することが可能となる。
生物学的試料
本発明の生物学的試料は、いずれかの被験体、例えば、動物（好ましくは哺乳動物であり、より好ましくはヒト）、植物または細菌に由来する試料をいう。上記生物学的試料は真核生物細胞または原核生物細胞よりなるものであってよく、組織または細胞よりなるものであってもよい。
標的マーカー
本発明の生物学的試料中の標的マーカーは、生物学的試料に存在する何れの分子もいう。上記標的マーカーはタンパク質およびそれらタンパク質断片、ペプチド、核酸、脂質、糖脂質、糖、多糖、澱粉などが挙げられる。ここで、タンパク質は糖タンパク質、リポタンパク質、燐タンパク質、メチル化タンパク質などの修飾されたタンパク質を含み、核酸はDNAやRNAなどを含む。また、上記標的マーカーは膜結合などの生物学的試料の表面に発現することができるものであってもよいし、生物学的試料の内部、例えば、細胞膜内、細胞質内、核内に含まれるものであってもよい。
標的マーカー結合分子
本発明の標的マーカー結合分子は、生物学的試料中の標的マーカーと特異的に結合可能であれば、特に限定されないが、例えば、抗体またはそのフラグメント（抗原結合フラグメントを含む。）、DNA、RNA、ペプチド核酸(PNA)などの核酸プローブ、リガンドまたは受容体などが挙げられる。
第一結合剤
本発明の第一結合剤は、標的マーカー結合分子と直接または間接的に特異的に結合可能な第一結合分子と、標識物質とを含む。本発明の第一結合分子と、標識物質とは、本発明の効果を妨げない限り、任意の部位で直接的に結合していてもよい。また、本発明の第一結合分子と標識物質と共に、担体を含んでもよい。また、本発明の第一結合剤は、ハプテン標識を包含していてもよい。
第一結合分子
第一結合分子は、標的マーカー結合分子と直接または間接的に特異的に結合が可能であれば限定されないが、例えば、抗体またはその抗原結合フラグメントが好ましい。ここで、抗体は、何れのアイソタイプ、すなわち、IgG、IgM、IgA、IgDまたはIgEであってもよい。また、抗体フラグメントとしては例えば抗原結合フラグメント、好ましくはFab、Fab’、（Fab’）２、Fv、scFv、ジアボディ、トリアボディー、テトラボディー、または、シングルドメイン抗体などが挙げられる。
また、第一結合分子が、標的マーカー結合分子と「間接的に」特異的に結合するとは、標的マーカー結合分子と第一結合分子の間に、ブリッジ試薬などの分子を介在させ、第一結合分子が当該ブリッジ試薬などの分子に特異的に結合可能であることを意味する。ブリッジ試薬としては、本発明の効果を妨げない限り特に限定されないが、抗体、Fab、Fab’、（Fab’）２、FvまたはscFvなどの抗原結合フラグメントが挙げられる。上記ブリッジ試薬は、ハプテン標識や蛍光標識をさらに包含していてもよい。
第一結合剤における標識物質
本発明の第一結合剤における標識物質は、本発明の効果を妨げない限り特に限定されず、化学発光標識、金属粒子、蛍光標識、酵素標識、補酵素標識、標識された抗体、色素、生物発光標識、ハプテン、および、ポリマー粒子などが挙げられる。また、上記標識物質は、酵素抗体法において使用できる酵素などによる標識がより好ましく、かかる酵素としては、例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)、アルカリホスファターゼ(AP)、β-ガラクトシダーゼ(GAL)、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ、β-Ｎ-アセチルグルコサミニダーゼ、β-グルクロニダーゼ、インベルターゼ、キサンチンオキシダーゼ、ホタルルシフェラーゼ、グルコースオキシダーゼ(GO)などが挙げられる。
また、標識物質として酵素を用いる場合、その基質としては、上記標識物質と反応し発色する物質であれば限定されない。ホースラディッシュペルオキシダーゼに対し通常に使用される基質の例には、3,3’−ジアミノベンジジン（DAB）、ニッケルで増強されるジアミノベンジジン、3−アミノ−9−エチルカルバゾール（AEC）、ベンジジン二塩酸塩（BDHC）、Hanker−Yates試薬（HYR）、ヨードファンブルー（IB）、テトラメチルベンジジン（TMB）、4−クロロ−1−ナフトール（CN）、α−ナフトールピロミン（α−NP）、o−ジアニシジン（OD）、5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリルホスフェート（BCIP）、ニトロブルーテトラゾリウム（NBT）、2−（p−ヨードフェニル）−3−p−ニトロフェニル−5−フェニルテトラゾリウムクロライド（INT）、テトラニトロブルーテトラゾリウム（TNBT）、5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−ベータ−D−ガラクトシド／フェロ−フェリシアナイド（BCIG／FF）などが挙げられる。
また、アルカリホスファターゼに対し通常に使用される基質の例には、ナフトール−AS−B1−ホスフェート／ファストレッドTR（NABP／FR）、ナフトール−AS−MX−ホスフェート／ファストレッドTR（NAMB／FR）、ナフトール−AS−B1−ホスフェート／ファストレッドTR（NABP／FR）、ナフトール−AS−MX−ホスフェート／ファストレッドTR（NAMP／FR）、ナフトール−AS−B1−ホスフェート／ニューフクシン（NABP／NF）、ブロモクロロインドリルホスフェート／ニトロブルーテトラゾリウム（BCIP／NBT）、5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−b−d−ガラクトピラノシド（BCIG）などが挙げられる。
第一結合剤における担体
また、第一結合剤における担体は、本発明の効果を妨げない限り特に限定されないが、天然または合成由来のポリマーであることが好ましい。また、本発明のポリマーの分子量は、本発明の効果が奏される限り特に限定されるものではないが、好適な一例としては、平均分子量（Ｍｗ）を２，０００〜５００，０００とすることができる。かかる平均分子量は、例えば、当該ポリマーの標準品を指標として用い、ゲル濾過（ＧＰＣ）により決定することができる。ただし、上記の分子量の範囲は一応の目安を示したものであって、本発明の目的が達成されるのであれば上記範囲よりも大きな分子量のものであっても小さい分子量のものでも使用可能である。かかるポリマーの好適な例としては、ポリアミノ酸、蛋白質、ポリヌクレオチド、多糖類または有機合成ポリマーが挙げられる。また、本発明の担体には、免疫測定の感度を上げるには多数の標識物質を担体に結合させることが望ましい。
また、本発明のポリアミノ酸としては、例えば、結合性を有する２個以上の多数のアミノ基を含有するペプチドを用いてもよい。その１例としては、リジン、アルギニン、オルニチン、グルタミン、各種塩基性アミノ酸などα−アミノ基、ε−アミノ基その他を有するアミノ基を有するポリアミノ酸が例示される。更にその具体例としては、ε−アミノ基を有するリジンのポリマーであるポリリジンのほか、リジンを有するとともに他のアミノ酸も有する各種ポリアミノ酸が挙げられる。そして後者のペプチドポリマーの例として、リジンとグリシンのランダムコポリマー、リジンとセリンのランダムコポリマー、リジンとグルタミン酸のランダムコポリマーなどが挙げられ、各種分子量のものが市販されている。
また、本発明の蛋白質としては、例えば、アルブミン、免疫グロブリンまたはウイルス様タンパク質（VLP）などが挙げられる。
本発明のポリヌクレオチドとしては、DNA、PNAおよびLNAなどから選択される１以上の構成単位を含むものが挙げられる。また、本発明のポリヌクレオチドは、デンドリマー構築体の形態であってもよい。
また、本発明の多糖類としては、デキストラン、アガロース、デキストリン、可溶性澱粉などが例示される。また、かかる多糖類として、アルデヒド基、アミノ基あるいはその他の活性基を導入した多糖類も使用することができる。アルデヒド基を有する多糖類は、多糖類に過よう素酸ナトリウムを反応させることにより容易に調製できる。また、アミノ基も公知の方法により多糖類に導入できる。例えばアミノ基を有するデキストランは、デキストランを過よう素酸ナトリウムで処理しアルデヒド基を生成させた後、ジアミンと反応させ水素化ホウ素ナトリウムにて還元することにより調製できる。また、多糖類への活性基の導入も公知の方法で行える。例えば、デキストランにジビニルスルホンを反応させることにより、ビニル基を有するデキストランが得られる。上記多糖類としては、例えば、デキストラン、カルボキシメチルデキストラン、デキストランポリアルデヒド、カルボキシメチルデキストランラクトン、およびシクロデキストリンを含む多糖類；プルラン、シゾフィラン、スクレログルカン、キサンタン、ゲラン、O−エチルアミノグアラン、6−O−カルボキシメチルキチン、N−カルボキシメチルキトサンを含むキチン、キトサン類；カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、6−アミノ−6−デオキシセルロースおよびO−エチルアミンセルロースを含む誘導体化されたセルロース類；ヒドロキシル化デンプン、ヒドロキシプロピルデンプン、ヒドロキシエチルデンプン、カラゲナン、アルギナート、およびアガロース；フィコールおよびカルボキシメチル化フィコールを含む合成多糖類などが挙げられる。
また、本発明の有機合成ポリマーとしては、好ましくは（メタ）アクリル酸、（メタ）アクリルアミド、（メタ）アクリルエステル、メチルメタクリレート、マレイン酸、無水マレイン酸、ビニルアセテート、ビニルアルコール、ビニルクロロアセテート、エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン、ジイソシアネート、スチレン、イソプレン、アリルアミンおよびエチレンイミンからなる群から選択される少なくとも一つの構成単位からなるポリマーが挙げられる。より具体的には、有機合成ポリマーとしては、ポリ（アクリル酸）、ポリ（アクリルアミド）、ポリ（アクリル酸エステル）、ポリ（2−ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（マレイン酸）、ポリ（無水マレイン酸）、ポリ（エチル−コ−ビニルアセテート）、ポリ（メタクリル酸）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルアルコール−コ−ビニルクロロアセテート）、アミン化ポリ（ビニルアルコール）、およびそれらのコブロックポリマーを含むビニルポリマー類；直鎖状、くし形の、または分岐したデンドリマーを含むポリマー骨格を含むポリエチレングリコール（PEG）またはポリプロピレングリコールまたはポリ（エチレンオキシド−コ−プロピレンオキシド）；ポリ（エチレンイミン）；ポリ（アリルアミン）などが挙げられる。
第二結合剤
本発明の第二結合剤は、リンカー分子と特異的に結合可能であり、第二結合分子と、標識物質とを含む。本発明の第二結合分子と、標識物質とは、本発明の効果を妨げない限り、任意の部位で直接的に結合していてもよい。また、本発明の第二結合分子と標識物質と共に、担体を含んでもよい。また、本発明の第二結合剤は、ハプテン標識を包含していてもよい。
第二結合分子
第二結合分子は、リンカー分子と特異的に結合が可能であれば限定されないが、例えば、抗体またはそのフラグメントが好ましい。ここで、抗体は、何れのアイソタイプ、すなわち、IgG、IgM、IgA、IgDまたはIgEであってもよい。また、抗体フラグメントとしては、例えば抗原結合フラグメント、好ましくはFab、Fab’、（Fab’）２、Fv、scFv、ジアボディ、トリアボディー、テトラボディー、またはシングルドメイン抗体などが挙げられる。
第二結合剤における標識物質
本発明の第二結合剤における標識物質は、標的マーカーの検出を妨げない限り特に限定されず、例えば、第一結合剤において例示した標識物質から選択することができる。したがって、第二結合剤における標識物質は、第一結合剤における標識物質と同一の標識物質であっても異なる標識物質であってもよいが、同一の標識物質であることが好ましい。同一の標識物質を用いる場合、簡易にかつ高レベルの検出感度で標的マーカーを検出する上で特に有利である。
第二結合剤における担体
第二結合剤における担体は、本発明の効果を妨げない限り特に限定されず、例えば、第一結合剤において例示した担体から選択することができる。したがって、第二結合剤における担体は、第一結合剤における担体と同一であっても異なってもよい。
リンカー分子
本発明のリンカー分子は、上述の通り、第一結合剤と特異的に結合することができる。また、本発明のリンカーは、標的マーカーの効果的な検出を勘案すれば、第一結合剤および第二結合剤の両者と特異的に結合可能であることが好ましい。したがって、本発明の一つの態様によれば、リンカー分子は、第一結合剤および第二結合剤の両者と特異的に結合することができる。本発明のリンカー分子は、本発明の効果を妨げない限り、第一結合剤および第二結合剤のいずれの部位に特異的に結合してもよいが、好ましくは第一結合剤における標識物質および／または第二結合剤における標識物質に特異的に結合可能であり、より好ましくは第一結合剤における標識物質および第二結合剤における標識物質の両者に特異的に結合可能である。
また、本発明のリンカー分子が、第二結合剤中の第二結合分子によって特異的に結合される部位は、図１にも示される通り、標識物質とは別の部位であってもよい。したがって、本発明の一つの態様によれば、リンカー分子は、第二結合剤と特異的に結合可能な少なくとも二つの結合部位を含んでなる。
上記リンカー分子としては、例えば、抗体またはそのフラグメントなどが挙げられる。ここで、抗体は、何れのアイソタイプ、すなわち、IgG、IgM、IgA、IgDまたはIgEであってもよい。また、抗体フラグメントとしてはFab、Fab’、（Fab’）２、FvまたはscFvなどの抗原結合フラグメントを含む。なお、上記リンカー分子は、リンカー分子作製時の免疫原とは異なるハプテン標識や蛍光物質標識をさらに包含していてもよい。また、本発明の一つの態様によれば、上記リンカー分子は、複数の抗体またはその抗原結合フラグメントがポリマーなどの担体を介して連結するものを除く。
ポリエチレングリコール
本発明では、標的マーカーの検出において、第一結合剤、リンカー分子および第二結合剤のうち少なくとも一つの試薬をポリエチレングリコールの共存下で免疫反応させることが好ましい。いかなる順序により、上記試薬と、ポリエチレングリコールとを混合して共存せしめるかについて、本発明では特に制限はない。例えば、上記試薬を用いた免疫反応を開始して速やかにポリエチレングリコールを順次添加してもよく、または上記試薬とポリエチレングリコールとを予め混合して免疫反応を実施してもよい。本発明による免疫反応の効果的な増強の観点からは、免疫反応が開始と同時または開始前から上記試薬とポリエチレングリコールとを共存させておくことが好ましい。
本発明のポリエチレングリコールの分子量は、本発明の効果が奏される限り特に限定されるものではないが、好適な一例としては、平均分子量（ＭＷ）を２，０００〜２０，０００とすることができる。かかる平均分子量は、例えば、ポリエチレングリコールの標準品を指標として用い、ゲル濾過（ＧＰＣ）により決定することができる。
組合せ物
本発明の組合せ物は、標的マーカーと特異的に結合可能な標的マーカー結合分子と併用することにより生物学的試料中の標的マーカーを検出するために、上記（ａ）第一結合剤、（ｂ）リンカー分子、および（ｃ）第二結合剤を組み合わせてなる。本発明の組合せ物は、本発明の効果を妨げない限りその態様は特に限定されず、例えば、（ａ）第一結合剤、（ｂ）リンカー分子、および（ｃ）第二結合剤は組成物のように一体的に構成されていてもよく、例えば、検出キットまたは検出システムのように（ａ）〜（ｃ）が別体として構成されていてもよい。したがって、本発明の組合せ物は、好ましくは組成物またはキットの形態で提供される。また、本発明の組合せ物には、本発明の効果を妨げない限り、（ａ）〜（ｃ）の他の試薬が含まれていてもよい。
また、本発明の一つの態様によれば、本発明の組合せ物は、上記（ａ）〜（ｃ）に加えて、上記標的マーカー結合分子をさらに組み合わせてなる。
生物学的試料中の標的マーカーを検出する方法
本発明によれば、上述の通り、（ａ）第一結合剤、（ｂ）リンカー分子、および（ｃ）第二結合剤と、標的マーカー結合分子とを共に用いて、被験体から得られた生物学的試料中の標的マーカーを簡易にかつ高レベルの検出感度で検出することができる。したがって、本発明の一つの態様によれば、被験体から得られた生物学的試料中の標的マーカーを検出する方法であって、
（i）予め標的マーカーと特異的に結合させた標的マーカー結合分子と、第一結合剤とを接触させて第一複合体を得る工程、
（ii）該第一複合体と、リンカー分子とを接触させて第二複合体を得る工程、および
（iii）該第二複合体と、第二結合剤とを接触させて第三複合体を得る工程を含み、
上記第一結合剤が、上記標的マーカー結合分子と直接または間接的に特異的に結合可能な第一結合分子と、標識物質とを含み、
上記結合可能なリンカー分子が上記第一結合剤と特異的に結合可能であり、
上記第二結合剤が、上記リンカー分子と特異的に結合可能な第二結合剤であって、第二結合分子と標識物質とを含む、方法が提供される。
上記（i）〜（iii）の各接触工程では、各成分を混合するなどの公知手法を用いて、第一複合体、第二複合体および第三複合体を得ることができる。
上記（i）〜（iii）の各接触工程において、第一結合剤、リンカー分子、および第二結合剤は好ましくは溶液として添加することができる。
工程（i）の上記溶液における第一結合剤の濃度は、特に限定されないが、１〜１５μｇ／ｍＬとすることができる。
工程（ii）の上記溶液におけるリンカー分子の濃度は、特に限定されないが、０．５〜１５μｇ／ｍＬとすることができる。
工程（iii）の上記溶液における第二結合剤の濃度は、特に限定されないが、１〜１５μｇ／ｍＬとすることができる。
また、（i）〜（iii）の各接触工程のうち少なくとも一工程または全工程は、標的マーカーの検出感度の増強を勘案すれば、ポリエチレングリコールの共存下で実施することが好ましい。（i）〜（iii）に用いられる上記溶液におけるポリエチレングリコールの濃度は、特に限定されないが、０．５〜２０ｗｔ％とすることができる。
また、本発明の方法は、第一結合剤における標識物質および第二結合剤における標識物質を検出する工程をさらに含んでいてもよい。
本発明の第一結合剤における標識物質および第二結合剤における標識物質の検出方法は、標識物質の種類、性質に応じて適宜当業者が設定してもよく、例えば、免疫染色法、インサイチュハイブリダイゼーション、フローサイトメトリー、酵素免疫−アッセイ（EIA）、および酵素結合免疫−検定法（ELISA）、ウエスタンブロットを含めた種々の公知の検出方法として用いることができるが、好ましくは、免疫組織化学染色法、色素インサイチュハイブリダイゼーション(Chromogenic in situ hybridization : CISH)などのインサイチュハイブリダイゼーションである。
本発明の（i）〜（iii）の各接触工程および標識物質の検出の反応条件の詳細は、公知手法に従い、当業者が決定することができる。
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。なお、本発明の単位および測定条件の詳細は、特段に記載のない限り、ＪＩＳ（日本工業規格）の規定に準じる。
試験例１：第一結合剤のみを用いた高感度染色法、ならびに第一結合剤および第二結合剤のみを用いた高感度染色法の検討
本試験例では、標的マーカーの検出感度に関して、第一結合剤のみを用いた反応系（比較例１）と、第一結合剤および第二結合剤のみを用いた反応系（比較例２）とを比較した。
試薬の調製
１．第一結合剤の調製
第一結合剤（ポリマー試薬）は、特開２００１−１８１２９９号公報の段落番号［００３１］〜［００４０］の記載に準じて製造した。
具体的には、アミノ酸ポリマーにペルオキシダーゼとFab’にした抗マウスIg（動物種：ヤギ）を結合させたポリマー試薬（M）とアミノ酸ポリマーにペルオキシダーゼとFab’にした抗ウサギIg（動物種：ヤギ）を結合させたポリマー試薬（R）を各5μg/mL ずつ混合し、カクテルポリマー試薬（MULTI）を調製した。
２．第二結合剤の調製
アミノ酸ポリマーにペルオキシダーゼとFab’にした抗ヤギIg（動物種：ウサギ）を結合させたポリマー試薬（G）を7.5μg/mLに調製した。
免疫組織化学染色
１．脱パラフィン、脱ペルオキシダーゼ、抗原賦活化処理
Ａ．標本スライドの準備
組織切片を3μmに薄切し、MASコートのスライドガラスに付着させた。その後、37℃のインキュベータ内で一晩乾燥させた。
Ｂ．脱パラフィン
（I）キシレン処理（3分×3回）
スライドをキシレンに3分間浸した。その後、余分な液を振り払い、別のキシレンに3分間浸した。その後、余分な液を振り払い、さらに別のキシレンに3分間浸した。
（II）エタノール処理（3分×4回）
100%エタノールに3分間浸した。余分な液を振り払い、別の100%エタノールに3分間浸した。この操作をあと2回行った。
（III）洗浄
余分なエタノールを振り払い、PBSで洗浄した（3分間ずつ容器を2度かえた）。
Ｃ．抗原賦活化による処理
抗原賦活化液pH9（ニチレイバイオサイエンス社）を使用し、オートクレーブで20分間加熱処理を行い、室温にて20分間放置した。その後、PBSで3分間×2回洗浄した。
Ｄ．脱ペルオキシダーゼ
内因性ペルオキシダーゼの除去を行った。水気を切ったのち、スライドを3V/V%過酸化水素水に10分間浸した。その後、PBSで3分間×2回洗浄した。
２．第一抗体または陰性コントロール（第一抗体希釈液）の添加・反応
余分な液を振り払ったスライドガラスに、第一抗体または、第一抗体希釈液を滴下し、湿潤箱中で、25℃、30分間反応させた。その後、PBSで3分間×2回洗浄した。検討に使用した組織と第一抗体の組み合わせは、以下の通りである。
・胃癌……抗ヒトp53遺伝子産物モノクローナル抗体（DO-7）（ニチレイバイオサイエンス社）3倍希釈にて使用。
・大腸癌…抗CDX-2ウサギモノクローナル抗体（ニチレイバイオサイエンス社） そのまま使用。
３．第一結合剤との反応
余分な液を振り払ったスライドガラスに、カクテルポリマー試薬（MULTI）を滴下し、湿潤箱中で、25℃、10分間反応させた。その後、PBSで3分間×2回洗浄した。なお、本反応は、比較例１および２の両者で行った。
４．第二結合剤との反応
余分な液を振り払ったスライドガラスに、ポリマー試薬（G）を滴下し、湿潤箱中で、25℃、10分間反応させた。その後、PBSで3分間×2回洗浄した。なお、本反応は、比較例２のみで行った。
５．基質溶液の添加・反応
余分な液を振り払ったスライドガラスに、N-Histofine(登録商標)DAB-2V（ニチレイバイオサイエンス社）を滴下し、室温で5分間反応させた。その後、流水で5分間洗浄した。
６．対比染色、脱水・透徹、封入
Ａ．対比染色
水気を切ったのち、マイヤーヘマトシキリン溶液に30秒浸した。その後、流水で5分間洗浄した。
Ｂ．脱水・透徹
水気を切り、エタノールによる脱水とキシレンによる透徹を行った。ここで、エタノールは、通過×3回、静置5分×1回で脱水を行った。キシレンは、通過×1回、静置5分×2回で透徹を行った。
Ｃ．封入
非水溶性封入剤（ニチレイバイオサイエンス社）を用いて封入を行った。
上記染色結果は図２に示される通りであった。ここで、図２中の写真は、各染色組織を、光学顕微鏡（オリンパス株式会社）にて、接眼レンズは１０倍を用い、対物レンズは４倍を用いて撮影したものである。
第一結合剤および第二結合剤のみの反応系（比較例２）は、第一結合剤のみの反応系（比較例１）と比べて、染色感度はわずかに向上していた。しかしながら、望むレベルの増感効果は得られなかった。
なお、陰性コントロールには、バック染色は生じていなかった。
試験例２：第一結合剤、リンカー分子および第二結合剤を用いた高感度染色法の検討
第一結合剤、リンカー分子および第二結合剤を用いた反応系、つまり、リンカー分子を第一結合剤と第二結合剤の間に介在させる反応系によって、第一結合剤のみを用いた反応系、または第一結合剤および第二結合剤のみを用いた反応系よりも染色感度を向上させることができるか検討を行った。
本試験では、第一結合剤、リンカー分子および第二結合剤を用いた反応系のうち、リンカー分子（抗HRP抗体1μg/mL）を用いる場合を実施例１、リンカー分子（抗HRP抗体5μg/mL）を用いる場合を実施例２とした。
また、第一結合剤のみを用いた反応系を比較例３とし、第一結合剤および第二結合剤のみを用いた反応系を比較例４とした。
試薬の調製
１．第一結合剤の調製
アミノ酸ポリマーにペルオキシダーゼとFab’にした抗マウスIg（動物種：ヤギ）を結合させたポリマー試薬（M）とアミノ酸ポリマーにペルオキシダーゼとFab’にした抗ウサギIg（動物種：ヤギ）を結合させたポリマー試薬（R）を各5μg/mL ずつ混合し、カクテルポリマー試薬（MULTI）を調製した。
２．リンカー分子の調製
ヤギ抗HRP抗体（ポリクローナル）（Pierce社）を1μg/mLまたは5μg/mLに調製した。
３．第二結合剤の調製
アミノ酸ポリマーにペルオキシダーゼとFab’にした抗ヤギIg（動物種：ウサギ）を結合させたポリマー試薬（G）を7.5μg/mLに調製した。
免疫組織化学染色
１．脱パラフィン、脱ペルオキシダーゼ、抗原賦活化処理
試験例1と同様の方法で行った。
２．第一抗体または陰性コントロール（第一抗体希釈液）の添加・反応
試験例1と同様の方法で行った。
３．第一結合剤との反応
余分な液を振り払ったスライドガラスに、カクテルポリマー試薬（MULTI）を滴下し、湿潤箱中で、25℃、10分間反応させた。その後、PBSで3分間×2回洗浄した。なお、本反応は、実施例１、実施例２、比較例３および比較例４で行った。
４．リンカー分子との反応
余分な液を振り払ったスライドガラスに、ヤギ抗HRP抗体を滴下し、湿潤箱中で、25℃、10分間反応させた。その後、PBSで3分間×2回洗浄した。なお、本反応は、実施例１および２のみで行った。
５．第二結合剤との反応
余分な液を振り払ったスライドガラスに、ポリマー試薬（G）を滴下し、湿潤箱中で、25℃、10分間反応させた。その後、PBSで3分間×2回洗浄した。なお、本反応は、実施例１、実施例２および比較例４で行った。
６．基質溶液の添加・反応
試験例1と同様の方法で行った。
７．対比染色、脱水・透徹、封入
試験例1と同様の方法で行った。
結果は図３に示される通りであった。ここで、図３中の写真は、各染色組織を、光学顕微鏡（オリンパス株式会社）にて、接眼レンズ１０倍を用い、対物レンズは４倍を用いて撮影したものである。
第一結合剤と第二結合剤の反応の間にリンカー分子（抗HRP抗体）を挟む反応系（実施例１および２）では、第一結合剤のみを用いた反応系または第一結合剤および第二結合剤のみを用いた反応系より染色感度が著しく向上していた。
なお、陰性コントロールには、バック染色は生じていなかった。
試験例３：リンカー分子として用いられる抗体の種類の検討
抗HRP抗体の免疫動物種（マウス、ウサギまたはヤギ）を変えて、下記表１のようなポリマー試薬、抗HRP抗体を用い、試験例２と同様な試験方法で行った。
その結果は図４に示される通りであった。ここで、図４中の写真は、各染色組織を、光学顕微鏡（オリンパス株式会社）にて、接眼レンズは１０倍を用い、対物レンズは４倍を用いて撮影したものである。
いずれの免疫動物種の抗体をリンカー分子として用いても、第一結合剤、リンカー分子および第二結合剤を用いた反応系（実施例３〜５）の方がそれぞれ、第一結合剤および第二結合剤のみを用いた反応系（比較例５〜７）よりも、染色感度が著しく向上していた。なお、陰性コントロールには、バック染色は生じていなかった。
試験例４：第一結合剤および第二結合剤の種類の検討
４−１：ホール抗体およびデキストラン（担体）の結合体（第一結合剤および第二結合剤）の使用
ホールIgG抗体とペルオキシダーゼがデキストランに結合しているポリマー試薬（EnVision Dual Link System-HRP、DAKO社）を第一結合剤および第二結合剤として用い、以下の手順に従って、染色感度の比較試験を行った。
なお、第一結合剤、リンカー分子（マウス抗HRP抗体）および第二結合剤を用いた反応系は実施例６とし、第一結合剤、リンカー分子（ウサギ抗HRP抗体）および第二結合剤を用いた反応系は実施例７とし、第一結合剤のみを用いた反応系を比較例８とし、第一結合剤および第二結合剤のみを用いた反応系を比較例９とした。
試薬の調製
１．第一結合剤の調製
ホールIgG抗体とペルオキシダーゼがデキストランに結合しているポリマー試薬（EnVision Dual Link System-HRP、DAKO社）をそのままで使用した。具体的には、デキストランポリマーにペルオキシダーゼと抗マウスIgG（動物種：ヤギ）を結合させたポリマー試薬（M）とデキストランポリマーにペルオキシダーゼと抗ウサギIgG（動物種：ヤギ）を結合させたポリマー試薬（R）が混合したポリマー試薬である。
２．リンカー分子の調製
マウス抗HRP抗体（クローン：HP-03）（TFS社）を5μg/mLに調製した。
ウサギ抗HRP抗体（ポリクローナル）（ニチレイバイオサイエンス社）を5μg/mLに調製した。
３．第二結合剤の調製
ホールIgG抗体とペルオキシダーゼがデキストランに結合しているポリマー試薬（EnVision Dual Link System-HRP、DAKO社）をそのままで使用した。
免疫組織化学染色
１．脱パラフィン、脱ペルオキシダーゼ、抗原賦活化処理
試験例1と同様の方法で行った。
２．第一抗体または陰性コントロール（第一抗体希釈液）の添加・反応
余分な液を振り払ったスライドガラスに、第一抗体または、第一抗体希釈液を滴下し、湿潤箱中で、25℃、30分間反応させた。その後、PBSで3分間×2回洗浄した。検討に使用した組織と標的マーカー結合分子（第一抗体）の組み合わせは、以下の通りである。
・胃癌……抗ヒトp53遺伝子産物モノクローナル抗体（DO-7） （ニチレイバイオサイエンス社） そのまま使用。
・大腸癌…抗CDX-2ウサギモノクローナル抗体（ニチレイバイオサイエンス社） そのまま使用。
３．第一結合剤の反応
余分な液を振り払ったスライドガラスに、EnVision Dual Link System-HRP（DAKO社）を滴下し、湿潤箱中で、25℃、10分間反応させた。その後、PBSで3分間×2回洗浄した。なお、本反応は、実施例６、実施例７、比較例８および比較例９で行った。
４．リンカー分子との反応
余分な液を振り払ったスライドガラスに、マウス抗HRP抗体（実施例６）または、ウサギ抗HRP抗体（実施例７）を滴下し、湿潤箱中で、25℃、10分間反応させた。その後、PBSで3分間×2回洗浄した。なお、本反応は、実施例６および実施例７のみで行った。
５．第二結合剤との反応
余分な液を振り払ったスライドガラスに、EnVision Dual Link System-HRP（DAKO社）を滴下し、湿潤箱中で、25℃、10分間反応させた。その後、PBSで3分間×2回洗浄した。
本反応は、実施例６、実施例７および比較例９のみで行った。
６．基質溶液の添加・反応
試験例1と同様の方法で行った。
７．対比染色、脱水・透徹、封入
試験例1と同様の方法で行った。
結果は図５に示される通りであった。ここで、図５中の写真は、各染色組織を、光学顕微鏡（オリンパス株式会社）にて、接眼レンズ１０倍を用い、対物レンズは４倍を用いて撮影したものである。
担体としてデキストランを使用し、結合分子としてホール抗体を用いた場合であっても、第一結合剤、リンカー分子および第二結合剤を用いた反応系（実施例６および７）の方が、第一結合剤のみを用いた反応系（比較例８）、ならびに、第一結合剤および第二結合剤のみを用いた反応系（比較例９）よりも、検出感度が著しく向上していた。
なお、陰性コントロールには、バック染色は生じていなかった。
４−２：ホール抗体およびHRPの直接結合体（第一結合剤および第二結合剤）の使用
ホールIgG抗体とpoly-HRPが直接結合している試薬を第一結合剤および第二結合剤として使用し、標的マーカーの検出効果を検討した。
なお、以下の実験では、第一結合剤（抗マウス抗体とpoly-HRPの直接結合体）、リンカー分子（マウス抗HRP抗体）および第二結合剤（抗マウス抗体とpoly-HRPの直接結合体）を用いた反応系は実施例８（生物学的試料：p53 胃癌）とし、第一結合剤（抗ウサギ抗体とpoly-HRPの直接結合体）、リンカー分子（ウサギ抗HRP抗体）および第二結合剤（抗ウサギ抗体とpoly-HRPの直接結合体）を用いた反応系は実施例９（生物学的試料：CDX-2 大腸癌）とした。また、第一結合剤（抗マウス抗体とpoly-HRPの直接結合体）および第二結合剤（抗マウス抗体とpoly-HRPの直接結合体）のみを用いた反応系を比較例１０（生物学的試料：p53 胃癌）とし、第一結合剤（抗ウサギ抗体とpoly-HRPの直接結合体）および第二結合剤（抗ウサギ抗体とpoly-HRPの直接結合体）のみを用いた反応系を比較例１１（生物学的試料：CDX-2 大腸癌）とした。
試薬の調製
１．第一結合剤の調製
ホールIgG抗体にpoly-HRPを直接標識している試薬（Goat Anti-Mouse Poly-HRP、Pierce社）を１０倍希釈した。
ホールIgG抗体にpoly-HRPを直接標識している試薬（Goat Anti-Rabbit Poly-HRP、Pierce社）を１０倍希釈した。
２．リンカー分子の調製
マウス抗HRP抗体（クローン：HP-03、TFS社）を5μg/mLに調製した。
ウサギ抗HRP抗体（ポリクローナル）（ニチレイバイオサイエンス社）を5μg/mLに調製した。
３．第二結合剤の調製
ホールIgG抗体にpoly-HRPを直接標識している試薬（Goat Anti-Mouse Poly-HRP、Pierce社）を１０倍希釈した。
ホールIgG抗体にpoly-HRPを直接標識している試薬（Goat Anti-Rabbit Poly-HRP、Pierce社）を１０倍希釈した。
免疫組織化学染色
１．脱パラフィン、脱ペルオキシダーゼ、抗原賦活化処理
試験例1と同様の方法で行った。
２．第一抗体または陰性コントロール（第一抗体希釈液）の添加・反応
試験例4-1と同様の方法で行った。
３．第一結合剤との反応
余分な液を振り払ったスライドガラスに、Goat Anti-Mouse Poly-HRP（Pierce社）（実施例８、比較例１０）またはGoat Anti-Rabbit Poly-HRP（Pierce社）（実施例９、比較例１１）を滴下し、湿潤箱中で、25℃、10分間反応させた。その後、PBSで3分間×2回洗浄した。なお、本反応は、実施例８、実施例９、比較例１０および比較例１１で行った。
４．リンカー分子との反応
余分な液を振り払ったスライドガラスに、マウス抗HRP抗体（実施例８）または、ウサギ抗HRP抗体（実施例９）を滴下し、湿潤箱中で、25℃、10分間反応させた。その後、PBSで3分間×2回洗浄した。なお、本反応は、実施例８、９で行なった。
５．第二結合剤との反応
余分な液を振り払ったスライドガラスに、Goat Anti-Mouse Poly-HRP（Pierce社）（実施例８、比較例１０）またはGoat Anti-Rabbit Poly-HRP（Pierce社）（実施例９、比較例１１）を滴下し、湿潤箱中で、25℃、10分間反応させた。その後、PBSで3分間×2回洗浄した。なお、本反応は、実施例８、実施例９、比較例１０および比較例１１で行った。
６．基質溶液の添加・反応
試験例1と同様の方法で行った。
７．対比染色、脱水・透徹、封入
試験例1と同様の方法で行った。
結果は図６に示される通りであった。ここで、図６中の写真は、各染色組織を、光学顕微鏡（オリンパス株式会社）にて、接眼レンズ１０倍を用い、対物レンズは４倍を用いて撮影したものである。
第一結合剤および第二結合剤として、ホール抗体と標識物質(poly-HRP)との直接結合体を使用した場合であっても、第一結合剤、リンカー分子および第二結合剤を用いた反応系（実施例８および９）の方がそれぞれ、第一結合剤および第二結合剤のみを用いた反応系（比較例１０および１１）よりも、検出感度が著しく向上していた。
なお、実施例８および９の陰性コントロールには、バック染色が生じていたが、主に細胞質に生じており、細胞核にはほぼ生じていなかった。p53とCDX-2は細胞核が染まる抗体であるので、評価の際、バック染色の影響はほぼなかった。
４−３：酵素マイクロポリマー（第一結合剤および第二結合剤）の使用
高活性かつ高密度の酵素と抗体が結合している酵素マイクロポリマー（ImmPRESS UNIVERSAL Reagent, Anti-Mouse/Rabbit IgまたはImmPRESS Reagent, Anti-Goat Ig、VECTOR社）を第一結合剤および第二結合剤として用い、以下の手順に従って、染色感度の比較試験を行った。
なお、第一結合剤（ImmPRESS UNIVERSAL Reagent, Anti-Mouse/Rabbit Ig）、リンカー分子（マウス抗HRP抗体）および第二結合剤（ImmPRESS UNIVERSAL Reagent, Anti-Mouse/Rabbit Ig）を用いた反応系は実施例１０とし、第一結合剤（ImmPRESS UNIVERSAL Reagent, Anti-Mouse/Rabbit Ig）、リンカー分子（ウサギ抗HRP抗体）および第二結合剤（ImmPRESS UNIVERSAL Reagent, Anti-Mouse/Rabbit Ig）を用いた反応系は実施例１１とし、第一結合剤（ImmPRESS UNIVERSAL Reagent, Anti-Mouse/Rabbit Ig）、リンカー分子（ヤギ抗HRP抗体）および第二結合剤（ImmPRESS Reagent, Anti-Goat Ig）を用いた反応系は実施例１２とした。
また、第一結合剤（ImmPRESS UNIVERSAL Reagent, Anti-Mouse/Rabbit Ig）のみを用いた反応系を比較例１２とし、第一結合剤（ImmPRESS UNIVERSAL Reagent, Anti-Mouse/Rabbit Ig）および第二結合剤（ImmPRESS UNIVERSAL Reagent, Anti-Mouse/Rabbit Ig）のみを用いた反応系を比較例１３とし、第一結合剤（ImmPRESS UNIVERSAL Reagent, Anti-Mouse/Rabbit Ig）および第二結合剤（ImmPRESS Reagent, Anti-Goat Ig）のみを用いた反応系を比較例１４とした。
試薬の調製
１．第一結合剤の調製
高活性かつ高密度の酵素と抗体が結合している酵素マイクロポリマー（ImmPRESS UNIVERSAL Reagent, Anti-Mouse/Rabbit Ig、VECTOR社）をそのままで使用した。
２．リンカー分子の調製
マウス抗HRP抗体（クローン：HP-03、TFS社）を5μg/mLに調製した。
ウサギ抗HRP抗体（ポリクローナル）（ニチレイバイオサイエンス社）を5μg/mLに調製した。
ヤギ抗HRP抗体（ポリクローナル）（Pierce社）を5μg/mLに調製した。
３．第二結合剤の調製
高活性かつ高密度の酵素と抗体が結合している酵素マイクロポリマー（ImmPRESS UNIVERSAL Reagent, Anti-Mouse/Rabbit Ig、VECTOR社）をそのままで使用した。
また、高活性かつ高密度の酵素と抗体が結合している別の酵素マイクロポリマー（ImmPRESS Reagent, Anti-Goat Ig、VECTOR社）をそのままで使用した。
免疫組織化学染色
１．脱パラフィン、脱ペルオキシダーゼ、抗原賦活化処理
試験例1と同様の方法で行った。
２．第一抗体または陰性コントロール（第一抗体希釈液）の添加・反応
試験例4-1と同様の方法で行った。
３．第一結合剤との反応
余分な液を振り払ったスライドガラスに、ImmPRESS UNIVERSAL Reagent, Anti-Mouse/Rabbit Ig（VECTOR社）を滴下し、湿潤箱中で、25℃、10分間反応させた。その後、PBSで3分間×2回洗浄した。なお、本反応は、実施例１０〜１２および比較例１２〜１４で行った。
４．リンカー分子との反応
余分な液を振り払ったスライドガラスに、マウス抗HRP抗体（実施例１０）、ウサギ抗HRP抗体（実施例１１）、または、ヤギ抗HRP抗体（実施例１２）を滴下し、湿潤箱中で、25℃、10分間反応させた。その後、PBSで3分間×2回洗浄した。なお、本反応は、実施例１０〜１２のみで行った。
５．第二結合剤との反応
余分な液を振り払ったスライドガラスに、ImmPRESS UNIVERSAL Reagent, Anti-Mouse/Rabbit Ig（VECTOR社）（実施例１０、１１、比較例１３）、ImmPRESS Reagent, Anti-Goat Ig（VECTOR社）（実施例１２、比較例１４）を滴下し、湿潤箱中で、25℃、10分間反応させた。その後、PBSで3分間×2回洗浄した。なお、本反応は、実施例１０〜１２および比較例１３および１４で行った。
６．基質溶液の添加・反応
試験例1と同様の方法で行った。
７．対比染色、脱水・透徹、封入
試験例1と同様の方法で行った。
結果は図７に示される通りであった。ここで、図７中の写真は、各染色組織を、光学顕微鏡（オリンパス株式会社）にて、接眼レンズ１０倍を用い、対物レンズは４倍を用いて撮影したものである。
第一結合剤および第二結合剤として高活性かつ高密度の酵素と抗体が結合している酵素マイクロポリマーを使用した場合であっても、第一結合剤、リンカー分子および第二結合剤を用いた反応系（実施例10〜12）の方がそれぞれ、第一結合剤のみを用いた反応系（比較例12）、ならびに、第一結合剤および第二結合剤のみを用いた反応系（比較例13および14）よりも、検出感度が著しく向上していた。
なお、実施例１０〜１２の陰性コントロールには、バック染色が生じていたが、主に細胞質に生じており、細胞核にはほぼ生じていなかった。p53とCDX-2は細胞核が染まる抗体であるので、評価の際、バック染色の影響はほぼなかった。
試験例５：第一結合剤および第二結合剤におけるポリマー担体の有無およびポリマー担体の分子量の検討
下記表２〜５のようにポリマー担体の分子量の異なるポリマー試薬、またはポリマー担体を持たないpoly-HRPタイプの試薬を第一結合剤および第二結合剤として選択した。そして、生物学的試料として胃癌組織のみを用い、かつ標的マーカー結合分子（第一抗体：抗ヒトp53遺伝子産物モノクローナル抗体（DO-7）（ニチレイバイオサイエンス社））を２倍希釈で用いる以外は試験例２と同様な試験を行い、標的マーカーの検出感度を比較した。
試薬の調製
１．第一結合剤の調製
第一結合剤（ポリマー試薬）は、特開２００１−１８１２９９号公報の段落番号［００３１］〜［００４０］の記載に準じて製造した。
具体的には、ポリマー担体の平均分子量をそれぞれ2,700、7,500、9,200とする以外は試験例１のポリマー試薬(M)と同様に製造し、5μg/mLに調製した。なお、試験例１で使用したポリマー試薬（M）のポリマー担体の平均分子量は、9,200である。
また、ポリマー担体を持たないpoly-HRPタイプの試薬に関しては、Fab’にした抗マウスIg（動物種：ヤギ）にpoly-HRPが結合している試薬（M）を5μg/mLに調製した。
２．リンカー分子の調製
マウス抗HRP抗体（クローン：HP-03、TFS社）を5μg/mLに調製した。
３．第二結合剤の調製
上記第一結合剤を7.5μg/mLに調製した。
その結果は図８に示される通りであった。ここで、図８中の写真は、各染色組織を、光学顕微鏡（オリンパス株式会社）にて、接眼レンズ１０倍を用い、対物レンズは４倍を用いて撮影したものである。
リンカー分子を用いた実施例１３〜１６では、第一結合剤および第二結合剤における分子量の差異またはポリマー担体（ポリ-L-リシン(PLL)）の有無にかかわらず、それぞれ、リンカー分子を用いない比較例１５〜２２と比較して検出感度の著しい向上が確認された。なお、陰性コントロールには、バック染色は生じていなかった。
試験例６：標識物質の検討
６−１：標識物質（アルカリフォスファターゼ：AP）、リンカー分子（マウス抗AP抗体）を用いた反応系
ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)に代えて、アルカリフォスファターゼ（AP）を標識物質として用い、かつリンカー分子（マウス抗AP抗体）を用いた反応系について、標的マーカーの検出感度を検討した。
なお、以下の試験において、第一結合剤および第二結合剤（アルカリフォスファターゼ（AP）を標識物質として用いたアミノ酸ポリマー：APポリマー試薬(M)）ならびにリンカー分子（マウス抗AP抗体）を用いた反応系は実施例１７とし、第一結合剤（APポリマー試薬(M)）のみを用いた反応系は比較例２３とし、第一結合剤および第二結合剤（APポリマー試薬(M)）のみを用いた反応系は比較例２４とした。
試薬の調製
１．第一結合剤の調製
アミノ酸ポリマーにアルカリフォスファターゼ(AP)とFab’にした抗マウスIg(動物種：ヤギ）を結合したAPポリマー試薬(M)を10μg/mLに調製した。
２．リンカー分子の調製
マウス抗AP抗体（クローン：AP1B9、NOVUS BIOLOGICALS社）を5μg/mLに調製した。
３．第二結合剤の調製
APポリマー試薬（M）（ニチレイバイオサイエンス社）を10μg/mL に調製した。
免疫組織化学染色
１．脱パラフィン、脱ペルオキシダーゼ、抗原賦活化処理
試験例1と同様の方法で行った。
２．第一抗体または陰性コントロール（第一抗体希釈液）の添加・反応
余分な液を振り払ったスライドガラスに、第一抗体または、第一抗体希釈液を滴下し、湿潤箱中で、25℃、30分間反応させた。その後、PBSで3分間×2回洗浄した。検討に使用した組織と第一抗体の組み合わせは、以下の通りである。
・胃癌……抗ヒトp53遺伝子産物モノクローナル抗体（DO-7） （ニチレイバイオサイエンス社） そのまま使用。
３．第一結合剤との反応
余分な液を振り払ったスライドガラスに、APポリマー試薬(M)を滴下し、湿潤箱中で、25℃、10分間反応させた。その後、PBSで3分間×2回洗浄した。なお、本反応は、実施例１７、比較例２３および２４で行った。
４．リンカー分子との反応
余分な液を振り払ったスライドガラスに、マウス抗AP抗体を滴下し、湿潤箱中で、25℃、10分間反応させた。その後、PBSで3分間×2回洗浄した。なお、本反応は、実施例１７のみで行った。
５．第二結合剤との反応
余分な液を振り払ったスライドガラスに、APポリマー試薬(M)を滴下し、湿潤箱中で、25℃、10分間反応させた。その後、PBSで3分間×2回洗浄した。なお、本反応は、実施例１７および比較例２４のみで行った。
６．基質溶液の添加・反応
余分な液を振り払ったスライドガラスに、ファーストレッドII基質キット（ニチレイバイオサイエンス社）を滴下し、室温で10分間反応させた。その後、流水で5分間洗浄した。
７．対比染色、脱水・透徹、封入
Ａ．対比染色
水気を切ったのち、マイヤーヘマトシキリン溶液に30秒浸した。その後、流水で5分間洗浄した。
Ｂ．風乾
水気を切ったのち、ドライヤーを用いて風乾を行った。
Ｃ．封入
キシレンに軽く浸し、その後、非水溶性封入剤（ニチレイバイオサイエンス社）を用いて封入を行った。
結果は図９に示される通りであった。ここで、図９中の写真は、各染色組織を、光学顕微鏡（オリンパス株式会社）にて、接眼レンズは１０倍を用い、対物レンズは４倍を用いて撮影したものである。
標識物質としてアルカリフォスファターゼ（AP）を用いた場合、第一結合剤、リンカー分子および第二結合剤を用いた実施例１７では、第一結合剤のみを用いた比較例２３、ならびに第一結合剤および第二結合剤のみを用いた比較例２４よりも、検出感度が著しく向上していた。
なお、陰性コントロールには、バック染色は生じていなかった。
試験例６−２：標識物質（アルカリフォスファターゼ：AP）、リンカー分子（ウサギ抗AP抗体）を用いた反応系
ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)に代えて、アルカリフォスファターゼ（AP）を標識物質として用い、かつリンカー分子（ウサギ抗AP抗体）を用いた反応系について、標的マーカーの検出感度を検討した。
なお、以下の試験において、第一結合剤および第二結合剤（アルカリフォスファターゼ（AP）を標識物質として用いたアミノ酸ポリマー：APポリマー試薬(R)）ならびにリンカー分子（ウサギ抗AP抗体）を用いた反応系は実施例１８とし、第一結合剤（APポリマー試薬(R)）のみを用いた反応系は比較例２５とし、第一結合剤および第二結合剤（APポリマー試薬(R)）のみを用いた反応系は比較例２６とした。
試薬の調製
１．第一結合剤の調製
アミノ酸ポリマーにアルカリフォスファターゼ(AP)とFab’にした抗ウサギIg(動物種：ヤギ）を結合したAPポリマー試薬(R)を10μg/mLに調製した。
２．リンカー分子の調製
ウサギ抗AP抗体（ポリクローナル、NOVUS BIOLOGICALS社）を5μg/mLに調製した。
３．第二結合剤の調製
APポリマー試薬(R)を10μg/mLに調製した。
免疫組織化学染色
１．脱パラフィン、脱ペルオキシダーゼ、抗原賦活化処理
試験例1と同様の方法で行った。
２．第一抗体または陰性コントロール（第一抗体希釈液）の添加・反応
余分な液を振り払ったスライドガラスに、第一抗体または、第一抗体希釈液を滴下し、湿潤箱中で、25℃、30分間反応させた。その後、PBSで3分間×2回洗浄した。検討に使用した組織と第一抗体の組み合わせは、以下の通りである。
・大腸癌…抗CDX-2ウサギモノクローナル抗体（ニチレイバイオサイエンス社） そのままにて使用。
３．第一結合剤との反応
余分な液を振り払ったスライドガラスに、APポリマー試薬(R)を滴下し、湿潤箱中で、25℃、10分間反応させた。その後、PBSで3分間×2回洗浄した。なお、本反応は、実施例１８および比較例２５、２６で行った。
４．リンカー分子との反応
余分な液を振り払ったスライドガラスに、ウサギ抗AP抗体を滴下し、湿潤箱中で、25℃、10分間反応させた。その後、PBSで3分間×2回洗浄した。なお、本反応は、実施例１８のみで行った。
５．第二結合剤との反応
余分な液を振り払ったスライドガラスに、APポリマー試薬(R)を滴下し、湿潤箱中で、25℃、10分間反応させた。その後、PBSで3分間×2回洗浄した。なお、本反応は、実施例１８および比較例２６のみで行った。
６．基質溶液の添加・反応
余分な液を振り払ったスライドガラスに、ファーストレッドII基質キット（ニチレイバイオサイエンス社）を滴下し、室温で10分間反応させた。その後、流水で5分間洗浄した。
７．対比染色、脱水・透徹、封入
試験例６−１と同様の方法で行った。
結果は図１０に示される通りであった。ここで、図１０中の写真は、各染色組織を光学顕微鏡（オリンパス株式会社）にて、接眼レンズは１０倍を用い、対物レンズは４倍を用いて撮影したものである。
標識物質としてアルカリフォスファターゼ（AP）を用いた場合、第一結合剤、リンカー分子および第二結合剤を用いた実施例１８では、第一結合剤のみを用いた比較例２５、ならびに第一結合剤および第二結合剤のみを用いた比較例２６よりも、検出感度が著しく向上していた。
なお、陰性コントロールには、バック染色は生じていなかった。
試験例７：CISH法における高感度染色法の検討
本試験では、CISH法(Chromogenic in situ Hybridization： 3,3’−ジアミノベンジジン（DAB）等の色素を用いて組織標本上でDNAおよびmRNAを検出するin situ Hybridization(ISH))に、本発明を応用できるか、以下の手順に従って検討を行った。標的マーカー結合分子としてジゴキシゲニン(DIG)で標識したプローブを組織標本に適用し、ブロッキング後、DIGと直接的に結合しうる検出試薬を用いてプローブの検出が行われた。
本試験では、標的マーカー結合分子として、HER2 Probeを用いた。
そして、実施例１９では、検出試薬として、第一結合剤（ヤギ抗DIG-HRPポリマー試薬（ニチレイバイオサイエンス社））、リンカー分子（ウサギ抗HRP抗体（ポリクローナル）（ニチレイバイオサイエンス社））および第二結合剤（ ヒストファイン（登録商標）
シンプルステイン（登録商標）MAX-PO(R)、（ニチレイバイオサイエンス社））を用いた反応系を選択した。
また、比較例２７では、検出試薬として、第一結合剤（ヤギ抗DIG-HRPポリマー試薬）のみを用いた反応系を選択した。さらに、比較例２８では、検出試薬として、第一結合剤（ヤギ抗DIG抗体）および第二結合剤（ヒストファイン（登録商標） シンプルステイン（登録商標）MAX-PO(G) （ニチレイバイオサイエンス社））を用いた反応系を選択した。
CISH
１．脱パラフィン、脱ペルオキシダーゼ、抗原賦活化処理、脱水・風乾
Ａ．標本スライドの準備
組織切片を5μmに薄切し、MASコートのスライドガラスに付着させた。その後、37℃のインキュベータ内で一晩乾燥させた。
Ｂ．脱パラフィン、脱ペルオキシダーゼ、抗原賦活化処理、脱水・風乾
（I）キシレン処理（3分×3回）
スライドをキシレンに3分間浸した。その後、余分な液を振り払い、別のキシレンに3分間浸した。その後、余分な液を振り払い、さらに別のキシレンに3分間浸した。
（II）エタノール処理（3分×4回）
100%エタノールに3分間浸した。余分な液を振り払い、別の100%エタノールに3分間浸した。この操作をあと2回行った。
（III）脱ペルオキシダーゼ
内因性ペルオキシダーゼの除去を行った。水気を切ったのち、スライドを3V/V%過酸化水素水に5分間浸した。
（IV）洗浄
PBSで洗浄した（1分間ずつ2回）。
（V）抗原賦活化処理
前処理として、抗原賦活化液（10mM クエン酸ナトリウム緩衝液（pH6.0） を使用し、98℃で30分間加熱処理を行った。
（VI）洗浄
PBSで洗浄した（2分間ずつ2回）。
（VII）抗原賦活化処理
湿潤箱中で、室温で3分間プロテアーゼ処理を行った。
（VIII）洗浄
PBSで洗浄した。
（IX）脱水
スライドを70%エタノール、90%エタノール、100%エタノールにそれぞれ1分間浸した後、風乾させた。
変性およびハイブリダイゼーション
（I）HER2 Probeをボルテックスし、スライドにのせた。
（II）泡を避けながら、カバーガラスをのせ、周りをペーパーボンドでシールした。
（III）ホットプレートを用いて、82℃で5分間変性させた。
（IV）スライドを湿潤箱に移動し、37℃オーバーナイトでハイブリダイズさせた。
ポストハイブリダイゼーションおよび検出
(I)注意してペーパーボンドをはがした後、2×SSCにて室温で5分間洗浄し、カバーガラスを外した。
(II)2×SSCにて72℃で5分間洗浄した。
(III) PBSにて1分間2回洗浄した。
(IV)下記の表６の通り、実施例１９、比較例２７および２８について反応を行った。ここで、反応は全て25℃で実施した。それぞれの工程の間にはPBSにて1分間３回の洗浄を行った。
(V)PBSにて1分間3回洗浄し、その後PBSをよく切った。
(VI)余分な液を振り払ったスライドガラスに、N-Histofine(登録商標)DAB-2V（ニチレイバイオサイエンス社）を滴下し、室温で5分間反応させた。
(VII)流水で5分間洗浄した。
(VIII)水気を切ったのち、マイヤーヘマトシキリン溶液に15秒浸し、対比染色を行った。
(IX)流水で5分間洗浄した。
(X) 水気を切り、100%エタノール3分間による脱水を行った。
(XI)キシレンにて5分間2回の透徹を行った。
(XII)非水溶性封入剤（ニチレイバイオサイエンス社）を用いて封入を行った。
CISHでの染色強度は光学顕微鏡（オリンパス株式会社）（接眼レンズ１０倍、対物レンズ１００倍で観察。）を使用し、目視にて観察し、比較例２７のシグナルを１＋とし判断した結果、下記表７に示される通りであった。実施例１９では、比較例２７および比較例２８よりも、検出感度が著しく向上していた。
試験例８：免疫反応の増強の検討
ポリエチレングリコールの使用
本発明の三段階の免疫反応のいずれかをポリエチレングリコールの共存下で実施した場合に標的マーカーの検出感度がどのように変化するかを検討するため、比較試験を行った。
具体的には、実施例２０では、ポリエチレングリコールを共存させることなく、第一結合剤、リンカー分子および第二結合剤を用いて三段階の免疫反応を行った。
実施例２１では、ポリエチレングリコールおよび第一結合剤の共存下で第一段階の免疫反応を行い、次いで、リンカー分子および第二結合剤を用いて第二段階および第三段階の免疫反応をそれぞれ行った。
実施例２２では、第一結合剤を用いて第一段階の免疫反応を行い、ポリエチレングリコールおよびリンカー分子の共存下で第二段階の免疫反応を行い、次いで、第二結合剤を用い第三段階の免疫反応を行った。
実施例２３では、第一結合剤を用いて第一段階の免疫反応を行い、リンカー分子を用いて第二段階の免疫反応を行い、次いで、ポリエチレングリコールおよび第二結合剤の共存下で第三段階の免疫反応を行った。
実施例２４では、第一結合剤、リンカー分子および第二結合剤を用いた三段階の免疫反応の全てをポリエチレングリコールの共存下で行った。
なお、具体的な手順は、生物学的試料として大腸癌組織のみを用い、かつ標的マーカー結合分子（第一抗体：抗CDX-2ウサギモノクローナル抗体（ニチレイバイオサイエンス社））を5倍希釈で用いる以外は試験例２に準じて実施した。
試薬の調製
１．第一結合剤の調製
アミノ酸ポリマーにペルオキシダーゼとFab’にした抗マウスIg（動物種：ヤギ）を結合させたポリマー試薬（M）とアミノ酸ポリマーにペルオキシダーゼとFab’にした抗ウサギIg（動物種：ヤギ）を結合させたポリマー試薬（R）を各5μg/mL ずつ混合し、カクテルポリマー試薬（MULTI）を調製した。
２．リンカー分子の調製
マウス抗HRP抗体（クローン：HP-03）（TFS社）およびマウス抗HRP抗体（クローン：2H11）（Novus Biologicals社）を各2.5μg/mLずつ混合し、調製した。
３．第二結合剤の調製
アミノ酸ポリマーにペルオキシダーゼとFab’にした抗マウスIg（動物種：ヤギ）を結合させたポリマー試薬（M）を5μg/mLに調製した。
４．ポリエチレングリコール
実施例２１〜２４では、第一結合剤、リンカー分子および第二結合剤を構成する水溶液のいずれかにおいて、ポリエチレングリコール（平均分子量（ＭＷ）：８，０００、和光純薬工業株式会社）を２．５wt%で溶解させた。
結果は図１１に示される通りであった。ここで、図１１中の写真は、各染色組織を、光学顕微鏡（オリンパス株式会社）にて、接眼レンズ１０倍を用い、対物レンズは４倍を用いて撮影したものである。
いずれかの免疫反応においてポリエチレングリコールを共存させた実施例２１〜２４の検出感度は、いずれの免疫反応でもポリエチレングリコールを共存させなかった実施例２０と比較して向上していた。特に、全ての段階（第一段階〜第三段階）においてポリエチレングリコールを共存させた実施例２４の検出感度は、実施例２０と比較して著しく向上していた。

Claims (20)

  1. 標的マーカーと特異的に結合可能な標的マーカー結合分子と併用して生物学的試料中の標的マーカーを検出するための組合せ物であって、
    （ａ）前記標的マーカー結合分子と直接または間接的に特異的に結合可能な第一結合分子と、標識物質とを含む、第一結合剤、
    （ｂ）前記第一結合剤と特異的に結合可能なリンカー分子、および
    （ｃ）前記リンカー分子に特異的に結合可能な第二結合剤であって、第二結合分子と、標識物質とを含む、第二結合剤
    を少なくとも含む、組合せ物。
  2. 前記リンカー分子が、前記標識物質に特異的に結合可能である、請求項１に記載の組合せ物。
  3. 前記リンカー分子が抗体またはその抗原結合フラグメントである、請求項１または２に記載の組合せ物。
  4. 標識物質が、化学発光標識、金属粒子、蛍光標識、酵素標識、補酵素標識、標識された抗体、色素、生物発光標識、ハプテンおよびポリマー粒子から選択される少なくとも１種以上である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組合せ物。
  5. 前記第一結合剤が、前記第一結合分子と前記標識物質とが直接的に、または担体を介して間接的に連結してなる構造体である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組合せ物。
  6. 前記第二結合剤が、前記第二結合分子と前記標識物質とが直接的に、または担体を介して間接的に連結してなる構造体である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組合せ物。
  7. 前記第一結合分子が、抗体またはその抗原結合フラグメントである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組合せ物。
  8. 前記第二結合分子が、抗体またはその抗原結合フラグメントである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組合せ物。
  9. 前記標的マーカー結合分子とさらに組み合せてなる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組合せ物。
  10. キットの形態である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組合せ物。
  11. 被験体から得られた生物学的試料中の標的マーカーを検出する方法であって、
    (i)予め標的マーカーと特異的に結合させた標的マーカー結合分子と、第一結合剤とを接触させて第一複合体を得る工程、
    (ii)該第一複合体と、リンカー分子とを接触させて第二複合体を得る工程、および
    (iii)該第二複合体と、第二結合剤とを接触させて第三複合体を得る工程
    を含み、
    前記第一結合剤が、前記標的マーカー結合分子と直接または間接的に特異的に結合可能な第一結合分子と、標識物質とを含み、
    前記リンカー分子が前記第一結合剤と特異的に結合可能であり、
    前記第二結合剤が、前記リンカー分子と特異的に結合可能であって、第二結合分子と標識物質とを含む、方法。
  12. 前記第三複合体中の標識物質を検出する工程をさらに含んでなる、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記リンカー分子が抗体またはその抗原結合フラグメントである、請求項１１または１２に記載の方法。
  14. 前記リンカー分子が、前記標識物質に特異的に結合可能である、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. 前記標識物質が、化学発光標識、金属粒子、蛍光標識、酵素標識、補酵素標識、標識された抗体、色素、生物発光標識、ハプテン、および、ポリマー粒子から選択される少なくとも１種以上の標識物質である、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. 前記第一結合剤が、第一結合分子と前記標識物質とが直接的に、または担体を介して間接的に連結してなる構造体である、請求項１１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. 前記第二結合剤が、第二結合分子と前記標識物質とが直接的に、または担体を介して間接的に連結してなる構造体である、請求項１１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. 前記第一結合分子が、抗体またはその抗原結合フラグメントである、請求項１１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. 前記第二結合分子が、抗体またはその抗原結合フラグメントである、請求項１１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
  20. 標的マーカーと特異的に結合可能な標的マーカー結合分子と併用して生物学的試料中の標的マーカーを検出するための組合せ物の使用であって、
    （ａ）前記標的マーカー結合分子と直接または間接的に特異的に結合可能な第一結合分子と、標識物質とを含む、第一結合剤、
    （ｂ）前記第一結合剤と特異的に結合可能なリンカー分子、および
    （ｃ）第二結合分子と、標識物質とを含む、前記リンカー分子と特異的に結合可能な第二結合剤
    を少なくとも含み、
    前記リンカー分子が、標識物質に特異的に結合可能である、使用。
JP2015559352A 2014-04-23 2015-04-23 標的マーカー検出用組合せ物 Active JP6019254B2 (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2014089675 2014-04-23
JP2014089675 2014-04-23
PCT/JP2015/062423 WO2015163424A1 (ja) 2014-04-23 2015-04-23 標的マーカー検出用組合せ物

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2016194154A Division JP6293837B2 (ja) 2014-04-23 2016-09-30 標的マーカー検出用組合せ物

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP6019254B2 JP6019254B2 (ja) 2016-11-02
JPWO2015163424A1 true JPWO2015163424A1 (ja) 2017-04-20

Family

ID=54332586

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2015559352A Active JP6019254B2 (ja) 2014-04-23 2015-04-23 標的マーカー検出用組合せ物
JP2016194154A Active JP6293837B2 (ja) 2014-04-23 2016-09-30 標的マーカー検出用組合せ物

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2016194154A Active JP6293837B2 (ja) 2014-04-23 2016-09-30 標的マーカー検出用組合せ物

Country Status (8)

Country Link
US (2) US10324084B2 (ja)
EP (1) EP3136096B1 (ja)
JP (2) JP6019254B2 (ja)
KR (1) KR102190207B1 (ja)
CN (1) CN106233142B (ja)
BR (1) BR112016024624B1 (ja)
RU (1) RU2678108C2 (ja)
WO (1) WO2015163424A1 (ja)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SE538541C2 (en) * 2015-01-19 2016-09-13 Fogelstrand Per Method for preparing a biological sample for use in an immunolabeling process
FR3044680B1 (fr) * 2015-12-02 2017-12-22 Univ Limoges Methode de detection de cellules souches cancereuses
US11340218B2 (en) * 2016-05-25 2022-05-24 Kromnigon Ab Method for preparing a biological sample for use in an immunolabeling process
WO2019197365A1 (en) * 2018-04-09 2019-10-17 Expedeon Ltd. Chemical and biological complexes and conjugates with multiple labels and applications thereof
CN112834736B (zh) * 2020-12-02 2024-09-06 杭州百凌生物科技有限公司 一种检测多种抗原的病理检测试剂盒及其制备方法和应用
CN113588936A (zh) * 2021-06-30 2021-11-02 株洲市中医伤科医院 用于纸质酶联免疫吸附测定的酶标板的制作方法

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB2098730B (en) * 1981-04-21 1985-02-06 Welsh Nat School Med Immunolocalisation
US4657853A (en) 1984-09-14 1987-04-14 E. I. Du Pont De Nemours And Company Immunoassays utilizing covalent conjugates of polymerized enzyme and antibody
PT752102E (pt) 1995-01-23 2001-04-30 Pasteur Sanofi Diagnostics Conjugado imunoenzimatico seu processo de preparacao e as suas aplicacoes
JP3524401B2 (ja) 1998-09-16 2004-05-10 株式会社ニチレイ 酵素抗体複合体およびその製造方法
JP3781934B2 (ja) 1999-12-22 2006-06-07 株式会社ニチレイバイオサイエンス 酵素−タンパク質複合体
JP4422291B2 (ja) * 2000-04-21 2010-02-24 大日精化工業株式会社 ヒトメダラシンの免疫学的測定方法
EP1437594B1 (en) * 2001-09-19 2011-01-12 Sekisui Medical Co., Ltd. Luminescent polymer and use thereof in bioassay
CA2544577C (en) 2003-12-01 2013-01-08 Dako Denmark A/S Methods and compositions for immuno-histochemical detection
CA2554801C (en) 2004-02-03 2011-12-06 Asahi Kasei Kabushiki Kaisha Method of detecting analyte using magnetic beads
JP4982687B2 (ja) 2004-12-09 2012-07-25 株式会社テクノネットワーク四国 標識分子含有シリカ球の調製方法
MX2010008820A (es) * 2008-02-12 2010-09-07 Novartis Ag Metodo para aislar acidos nucleicos fetales o apoptoticos libres de celulas.
JP5721638B2 (ja) 2009-02-19 2015-05-20 ダコ・デンマーク・エー／エス コンジュゲート分子
DK2533049T3 (en) 2010-02-05 2015-10-26 Nichirei Biosciences Inc PREPARATION SOLUTION FOR immunohistochemical staining AND CONCENTRATED SOLUTION THEREOF
CN101833000A (zh) * 2010-05-13 2010-09-15 北京海瑞祥天生物科技有限公司 高效级联放大的抗体检测法
EP2630498A4 (en) 2010-10-22 2014-10-01 Vermillion Inc PROGNOSTIC BIOMARKERS IN PATIENTS WITH OVARIAN CANCER
CN103189050B (zh) 2010-10-26 2017-09-29 Ac免疫有限公司 包含通过疏水部分修饰的肽的基于脂质体的构建体
JP2012132753A (ja) * 2010-12-21 2012-07-12 Kaneka Corp 糖鎖相互作用解析法
JP5899908B2 (ja) 2011-12-26 2016-04-06 株式会社Ｊｖｃケンウッド 試料分析用ディスク
CN102565383B (zh) 2011-12-30 2013-12-11 吴坚 信号放大型免疫荧光探针及其制备方法和应用
WO2014009474A1 (en) 2012-07-13 2014-01-16 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for the detection of a multispecific binder
JP6311608B2 (ja) 2012-09-24 2018-04-18 三菱ケミカル株式会社 肝臓癌の検出方法および肝硬変の検出方法

Also Published As

Publication number Publication date
KR20160147830A (ko) 2016-12-23
EP3136096A1 (en) 2017-03-01
EP3136096B1 (en) 2021-12-01
CN106233142A (zh) 2016-12-14
US11156602B2 (en) 2021-10-26
JP6293837B2 (ja) 2018-03-14
RU2016145600A3 (ja) 2018-05-25
RU2678108C2 (ru) 2019-01-23
BR112016024624B1 (pt) 2023-10-24
BR112016024624A2 (pt) 2017-08-15
JP2017026631A (ja) 2017-02-02
US20190324020A1 (en) 2019-10-24
US20170045502A1 (en) 2017-02-16
KR102190207B1 (ko) 2020-12-15
WO2015163424A1 (ja) 2015-10-29
JP6019254B2 (ja) 2016-11-02
US10324084B2 (en) 2019-06-18
EP3136096A4 (en) 2017-09-13
CN106233142B (zh) 2019-03-08
RU2016145600A (ru) 2018-05-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6293837B2 (ja) 標的マーカー検出用組合せ物
JP5619603B2 (ja) 抗グリピカン３抗体を用いる肝癌細胞の検出法
CN111551709B (zh) 一种酶标二抗复合物及其制备方法
US11988673B2 (en) Multiplexed immunohistochemistry using recombinant antibodies with epitope tags
JP2007513334A (ja) 免疫組織化学的検出のための方法および組成物
JP2015158515A (ja) ＨｂＡ１ｃの免疫学的測定方法
CN103597089A (zh) 用于酶介导的信号放大的新方法
JPWO2009066787A1 (ja) 血液試料の品質評価方法
KR20200128689A (ko) Magea4 검출 방법
JP5993967B2 (ja) 細胞内生体分子の検出に用いる標準試料及び細胞内生体分子の検出方法
WO2022259810A1 (ja) 病理検査向けコントロールスライドガラス及びその製造方法
JP7280339B2 (ja) ペプチド核酸コンジュゲート
US9134308B2 (en) Antibody immobilization using poly(ethylene glycol) crosslinking
WO2017142956A1 (en) Methods, compositions and devices for improving the sensitivity of assays
CA3224687A1 (en) Use of single cell elisa starting from deparaffinzed cells for the detection of molecules of interest
JP2017029080A (ja) マイクロアレイを用いた標的物質の検出方法及びキット
JP2010243430A (ja) 抗体精製方法

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20160812

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20160902

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20161003

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 6019254

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250