CN114354945A - 基于时间分辨免疫荧光分析仪检测抗体配对的抗体筛选方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于时间分辨免疫荧光分析仪检测抗体配对的抗体筛选方法，具体包括以下步骤：S1：制备荧光标记物，使用制备的荧光标记物标记抗体；S2：将抗体包被至固相载体中，并进行封闭；S3：将待检抗原加入所述步骤S2的固相载体中，使抗原与抗体相结合，形成抗原抗体复合物；S4：向所述步骤S3的固相载体中加入所述步骤S1中已荧光标记的抗体，进行孵育后，放入时间分辨免疫荧光分析仪进行检测，筛选抗体。该基于时间分辨免疫荧光分析仪检测抗体配对的抗体筛选方法提高了抗体筛选配对成功率，减轻了工作量，具有高通量筛选抗体配对的优点，同时提高了与POCT免疫层析技术平台抗体配对符合率。
Description
技术领域
本发明涉及单克隆抗体配对筛选技术领域，尤其涉及一种基于时间分辨免疫荧光分析仪检测抗体配对的抗体筛选方法。
背景技术
双抗体夹心法，属于非竞争结合测定，适用于检测分子中具有至少两个抗原决定簇的多价抗原，其基本工作原理是利用连接于固相载体上的抗体和标记物标记抗体分别与样品中被检测抗原分子上两个抗原决定簇结合，形成固相抗体-抗原-标记物抗体免疫复合物，由于反应系统中固相抗体和标记抗体的量相对于待测抗原的是过量的，因此免疫复合物的量与待测抗原的量成正比(在可检测范围内)。
荧光微球标记技术：羧基聚苯乙烯微球具有分散性好、比表面积大、吸附性强、凝集作用大，机械性能好和生物不可降解性，已经广泛应用于酶固定、色谱分离、药物传递和生物传感等诸多领域。羧基聚苯乙烯微球由于表面富含羧基，易与氨基结合，从而在生物医疗和诊断领域受到广泛关注，常用的羧基荧光微球的激发波长和发射波长分别是365nm和615nm。
时间分辨免疫荧光分析仪，可同时检测波长和时间两个参数进行信号分辨，可有效地排除非特异荧光的干扰，极大地提高了分析灵敏度，时间分辨免疫荧光分析仪采用紫外LED作为激发光源，紫外LED的峰值波长为345nm，与羧基荧光微球的峰值激发波长接近，滤光片的透射光谱在345nm处的透过率为0.03％，在613nm处的透过率为82.9％。
目前抗体标记有以下几种，但都具有相应的技术缺陷。
1.抗体的酶标记：通过共价键经适当方法将酶联结在抗体上，制成酶标抗体，再借酶对底物的特异催化作用，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，这些有色产物可用肉眼、光学显微镜和电子显微镜观查，也可以用分光光度计测定。但酶标抗体的质量取决于抗体制备方法，易受游离的氨基和其它干扰性物质影响标记效率。
2.抗体的生物素化标记：亲和素与生物素都可与蛋白质(包括抗原、抗体、酶等)、荧光素等分子结合而不影响后者的生物活性，是理想的标记剂。一个抗体分子可偶联数十个生物素或亲和素分子，而亲和素或生物素分子又可与酶或荧光素结合，从而组成一个生物放大系统，显著提高检测的灵敏度。但当游离ε- 氨基(赖氨酸残基的氨基)存在于抗体的抗原结合位点时，或位于酶的催化位点时，生物素化会降低或损伤抗体蛋白的结合力或活性。此时，应试用其它交联方法。
3.抗体的荧光素标记：荧光抗体标记技术是将荧光素以化学方法与特异性抗体共价结合，形成荧光素-蛋白质结合物(即荧光标记抗体)，此结合物仍保留着抗体活性，同时具有荧光素的示踪作用。当它与相应的抗原特异结合后，借助于荧光显微镜观察呈现明亮的特异荧光。但FITC唯一的缺陷是易被光淬灭，因此复合物必须始终避光保存。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，提供一种基于时间分辨免疫荧光分析仪检测抗体配对的抗体筛选方法，此方法可以提供一种标记物，用于高通量的快速筛选抗体配对，提高与POCT免疫层析技术平台抗体配对符合率。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：基于时间分辨免疫荧光分析仪检测抗体配对的抗体筛选方法，具体包括以下步骤：
S1：制备荧光标记物，使用制备的荧光标记物标记抗体；
S2：将抗体包被至固相载体中，并进行封闭；
S3：将待检抗原加入所述步骤S2的固相载体中，使抗原与抗体相结合，形成抗原抗体复合物；
S4：向所述步骤S3的固相载体中加入所述步骤S1中已荧光标记的抗体，进行孵育后，放入时间分辨免疫荧光分析仪进行检测，筛选抗体。
作为本发明的优选技术方案，所述步骤S1中制备的荧光标记物为羧基荧光微球；所述步骤S1的具体步骤为：
S11清洗：检查荧光微球的状况，取荧光微球颗粒采用清洗缓冲液清洗荧光微球颗粒；
S12活化：将荧光微球颗粒与清洗缓冲液复溶混匀并超声，采用活化液进行活化孵育，孵育后离心，进行清洗；
S13偶联：将孵育后的荧光微球颗粒与抗体进行偶联反应；
S14封闭：将偶联反应后的荧光微球颗粒与抗体进行封闭，获得中间品；
S15保存：将所述步骤S14中获得的中间品，加入甘氨酸封闭液重复清洗后，吹打混匀，避光保存，待用。
采用上述技术方案，提高了抗体筛选配对成功率，减轻工作量，高通量的筛选抗体配对，同时提高了与POCT免疫层析技术平台抗体配对符合率。其中羧基荧光微球的标记受标记工艺影响较大，如缓冲液的pH，封闭剂的选择，活化效率的影响，均对抗体的标记效率造成一定的影响。根据大量实验研究表明，该技术方案中选择的清洗缓冲液的缓冲能力强，溶液被稀释后PH变化小；使用的封闭剂的封闭效率高。
作为本发明的优选技术方案，所述步骤S11清洗的具体步骤为：
S111：检查荧光微球颗粒，确保其表面无凝聚、无漂浮物；
S112：取荧光微球颗粒吹打混匀，并加入干净的离心管中；
S113：加入荧光微球颗粒的两倍体积的清洗缓冲液，置于高速冷冻离心机离心后，去除上层清液后待用。
作为本发明的优选技术方案，所述步骤S12活化的具体步骤为：
S121：加入清洗缓冲液150μL，将所述步骤S113离心后的荧光微球颗粒复溶吹打混匀并超声，确保荧光微球颗粒全部混匀；加入清洗缓冲溶液150μL，是为了保证复溶后体积为200μL；
S122：称取20mg的NHS和20mg的EDC，分别取1mL清洗缓冲液溶解 NHS与EDC，再分别加入10mM磷酸盐缓冲液配制成20mg/mL NHS溶液和20 mg/mL EDC溶液；
S123：取步骤S122中配制的20mg/mL NHS溶液25μL加入步骤S113处理后的离心管中，并震荡使之完全混匀，再边振荡边加入20mg/mL EDC溶液 25μL，超声，全部混匀；
S124：将步骤S123中混匀后的物料的离心管放入37℃的恒温振荡器中，置于200r/min进行活化反应；
S125：清洗步骤S124活化后的荧光微球颗粒，转移至干净的离心管中，置于高速冷冻离心机离心，去除上层清液，加入清洗缓冲液重复清洗一次后去上清，待用。
作为本发明的优选技术方案，所述步骤S13偶联的具体步骤为：将抗体、 10mM磷酸盐缓冲液与步骤S125中活化后荧光微球颗粒加入离心管，并将离心管放入37℃的恒温振荡器中，置于200r/min反应3h，并每隔30min超声一次；其中抗体量与10mM磷酸盐缓冲液的总量为0.2mL，所述荧光微球颗粒与抗体比例为10:1。
作为本发明的优选技术方案，所述步骤S14封闭的具体步骤为：在步骤S13 偶联后的离心管中加入等体积的10％BSA，吹打混匀，超声5min后，放入37℃的恒温振荡器中，置于200r/min反应25min后，加入等体积的甘氨酸封闭液，吹打混匀并超声，再放入37℃的恒温振荡器中，置于200r/min反应25min后，实现封闭。
作为本发明的优选技术方案，所述步骤S15保存的具体步骤为：
S151：将所述步骤S14处理后的中间品，置于高速冷冻离心机进行离心，去除上层清液；
S152：再加入0.4mL甘氨酸封闭液重复清洗一次后去除上层清液；
S153：重复步骤S152再清洗一次；
S154：加入恢复至室温的保存液，吹打混匀并超声，并确保全部混匀避光存放于2～8℃，待用。
作为本发明的优选技术方案，所述步骤S2具体步骤为：采用10mM磷酸盐缓冲液将所需配对的捕获抗体稀释至0.5μg/mL～2μg/mL后包被至固相载体上，包被后置于4℃过夜或37℃中2h，采用10mM磷酸盐缓冲液清洗3遍后加入 1％BSA，置于4℃中2h，封闭。
作为本发明的优选技术方案，所述步骤S3的具体步骤为：采用10mM磷酸盐缓冲液清洗3遍，根据检测范围稀释待检抗原后，将稀释后的抗原加入固相载体中，与步骤S2中的固相载体上的抗体结合，37℃孵育1h，形成抗原抗体复合物。
作为本发明的优选技术方案，所述步骤S4的具体步骤为：
S41：将所述步骤S3中的抗原抗体复合物进行多次清洗；
S42：向清洗后的所述抗原抗体复合物中加入所述步骤S1中已荧光标记好的抗体，37℃下孵育，清洗；
S43：放入时间分辨免疫荧光分析仪进行检测并读数，筛选抗体。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：该技术方案提供了一种高效高通量筛选抗体配对的技术，提高了抗体筛选配对成功率，减轻了工作量，具有高通量筛选抗体配对的优点，同时提高了与POCT免疫层析技术平台抗体配对符合率。
具体实施方式
为了加深对本发明的理解，下面将结合实施例对本发明做进一步详细描述，该实施例仅用于解释本发明，并不对本发明的保护范围构成限定。
实施例：该基于时间分辨免疫荧光分析仪检测抗体配对的抗体筛选方法，具体包括以下步骤：
S1：制备荧光标记物，使用制备的荧光标记物标记抗体；
所述步骤S1中制备的荧光标记物为羧基荧光微球；所述步骤S1的具体步骤为：
S11清洗：检查荧光微球的状况，确保无凝聚、无漂浮物等变质情况下，用移液器取0.2mL荧光微球颗粒，采用清洗缓冲液清洗荧光微球颗粒；
所述步骤S11清洗的具体步骤为：
S111：检查荧光微球颗粒，确保其表面无凝聚、无漂浮物；
S112：用移液器取0.2mL荧光微球颗粒吹打混匀，并加入干净的离心管中；
S113：加入荧光微球颗粒的两倍体积(0.4mL)的清洗缓冲液，置于高速冷冻离心机以转速15000rpm离心15min后，去除上层清液后待用；
S12活化：将荧光微球颗粒与清洗缓冲液复溶混匀并超声，采用活化液进行活化孵育，孵育后离心，进行清洗；
所述步骤S12活化的具体步骤为：
S121：加入清洗缓冲液150μL，将所述步骤S113离心后的荧光微球颗粒复溶吹打混匀并超声5min，确保荧光微球颗粒0.191μm全部混匀；
S122：称取20mg的NHS和20mg的EDC，分别取1mL清洗缓冲液溶解 NHS与EDC，再分别加入10mM磷酸盐缓冲液配制成20mg/mL NHS溶液和20 mg/mL EDC溶液；
S123：取步骤S122中配制的20mg/mL NHS溶液25μL加入步骤S121处理后的离心管中，并震荡使之完全混匀，再边振荡边加入20mg/mL EDC溶液25μL，超声5min，全部混匀；
S124：将步骤S123中混匀后的物料的离心管放入37℃的恒温振荡器 (CRYSTAL)中，置于200r/min进行活化反应25min；
S125：清洗步骤S124活化后的荧光微球颗粒，转移至干净的离心管中，置于4℃的高速冷冻离心机16000r/min离心15min后，去除上层清液，加入0.4mL 清洗缓冲液重复清洗一次后去上清，待用。
S13偶联：将孵育后的荧光微球颗粒与抗体进行偶联反应；
所述步骤S13偶联的具体步骤为：将抗体、10mM磷酸盐缓冲液与步骤S125 中活化后荧光微球颗粒加入离心管，并将离心管放入37℃的恒温振荡器中，置于200r/min反应3h，并每隔30min超声一次，每次超声3～5min；其中抗体量与10mM磷酸盐缓冲液的总量为0.2mL，所述荧光微球颗粒与抗体比例为10:1；其中荧光微球颗粒一共2mg，抗体量为0.2mg；10mM磷酸盐缓冲液的配方为： 0.155g二水合磷酸二氢钠溶于100mL纯水，PH：6.0；
S14封闭：将偶联反应后的荧光微球颗粒与抗体进行封闭，获得中间品；
所述步骤S14封闭的具体步骤为：在步骤S13偶联后的离心管中加入等体积(0.2mL)的10％BSA，吹打混匀，超声5min后，放入37℃的恒温振荡器中，置于200r/min反应25min后，加入等体积(0.2mL)的甘氨酸封闭液，吹打混匀并超声，再放入37℃的恒温振荡器中，置于200r/min速度中反应25min 后，实现封闭；所使用的甘氨酸封闭液的配方，以配制100mL pH7.8为例各组分为：二水合磷酸二氢钠0.115g；甘氨酸0.376g；吐温20 10μL；纯化水99mL；氟表面活性剂：1mL；
S15保存：将所述步骤S14中获得的中间品，加入甘氨酸封闭液重复清洗后，吹打混匀，避光保存，待用；所述步骤S15保存的具体步骤为：
S151：将所述步骤S14处理后的中间品，置于4℃的高速冷冻离心机以 15000r/min转速进行离心15min，去除上层清液；
S152：再加入0.4mL的甘氨酸封闭液重复清洗一次后去除上层清液；
S153：重复步骤S152再清洗一次；
S154：加入恢复至室温的保存液，吹打混匀并超声，并确保全部混匀避光存放于2～8℃，待用；保存液为微球保存液，所用的微球保存液的配方，以配制100mL pH8.5为例,各组分为：Tris：0.79g；氯化钠：0.85g；吐温20：50μL；BSA-0： 0.5g；纯化水：99mL；氟表面活性剂：1mL；
S2：将抗体包被至固相载体(96孔板)中，并进行封闭；
所述步骤S2具体步骤为：采用10mM磷酸盐缓冲液将所需配对的捕获抗体稀释至0.5μg/mL～2μg/mL后包被至固相载体(96孔板)上，包被后置于4℃过夜或37℃中2h，采用10mM磷酸盐缓冲液清洗3遍后加入1％BSA，置于4℃中 2h，封闭；
S3：将待检抗原加入所述步骤S2的固相载体中，使抗原与抗体相结合，形成抗原抗体复合物；
所述步骤S3的具体步骤为：采用10mM磷酸盐缓冲液清洗3遍，根据检测范围稀释待检抗原后，将稀释后的抗原加入固相载体(96孔板)中，与步骤S2 中的固相载体上的抗体结合，37℃孵育1h，形成抗原抗体复合物。
S4：向所述步骤S3的固相载体中加入所述步骤S1中已标记的抗体，进行孵育后，放入时间分辨免疫荧光分析仪进行检测，筛选抗体；
所述步骤S4的具体步骤为：
S41：将所述步骤S3中的抗原抗体复合物进行多次清洗(采用10mM磷酸盐缓冲液清洗3遍)，洗去多余抗原或其余游离的杂质；
S42：向清洗后的所述抗原抗体复合物中加入所述步骤S1中已荧光标记好的抗体，37℃下孵育30min，清洗；
S43：放入时间分辨免疫荧光分析仪进行检测并读数，筛选抗体。
对于本领域的普通技术人员而言，具体实施例只是对本发明进行了示例性描述，显然本发明具体实现并不受上述方式的限制，只要采用了本发明的方法构思和技术方案进行的各种非实质性的改进，或未经改进将本发明的构思和技术方案直接应用于其它场合的，均在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种基于时间分辨免疫荧光分析仪检测抗体配对的抗体筛选方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
S1：制备荧光标记物，使用制备的荧光标记物标记抗体；
S2：将抗体包被至固相载体中，并进行封闭；
S3：将待检抗原加入所述步骤S2的固相载体中，使抗原与抗体相结合，形成抗原抗体复合物；
S4：向所述步骤S3的固相载体中加入所述步骤S1中已荧光标记的抗体，进行孵育后，放入时间分辨免疫荧光分析仪进行检测，筛选抗体。
2.根据权利要求1所述的基于时间分辨免疫荧光分析仪检测抗体配对的抗体筛选方法，其特征在于，所述步骤S1中制备的荧光标记物为羧基荧光微球；所述步骤S1的具体步骤为：
S11清洗：检查荧光微球的状况，取荧光微球颗粒采用清洗缓冲液清洗荧光微球颗粒；
S12活化：将荧光微球颗粒与清洗缓冲液复溶混匀并超声，采用活化液进行活化孵育，孵育后离心，进行清洗；
S13偶联：将孵育后的荧光微球颗粒与抗体进行偶联反应；
S14封闭：将偶联反应后的荧光微球颗粒与抗体进行封闭，获得中间品；
S15保存：将所述步骤S14中获得的中间品，加入甘氨酸封闭液重复清洗后，吹打混匀，避光保存，待用。
3.根据权利要求2所述的基于时间分辨免疫荧光分析仪检测抗体配对的抗体筛选方法，其特征在于，所述步骤S11清洗的具体步骤为：
S111：检查荧光微球颗粒，确保其表面无凝聚、无漂浮物；
S112：取荧光微球颗粒吹打混匀，并加入干净的离心管中；
S113：加入荧光微球颗粒的两倍体积的清洗缓冲液，置于高速冷冻离心机离心后，去除上层清液后待用。
4.根据权利要求3所述的基于时间分辨免疫荧光分析仪检测抗体配对的抗体筛选方法，其特征在于，所述步骤S12活化的具体步骤为：
S121：加入清洗缓冲液150μL，将所述步骤S113离心后的荧光微球颗粒复溶吹打混匀并超声，确保荧光微球颗粒全部混匀；
S122：称取20mg的NHS和20mg的EDC，分别取1mL清洗缓冲液溶解NHS与EDC，再分别加入10mM磷酸盐缓冲液配制成20mg/mL NHS溶液和20mg/mL EDC溶液；
S123：取所述步骤S122中配制的20mg/mL NHS溶液25μL加入所述步骤S113处理后的离心管中，并震荡使之完全混匀，再边振荡边加入20mg/mL EDC溶液25μL，超声，全部混匀；
S124：将所述步骤S123中混匀后的物料的离心管放入37℃的恒温振荡器中，置于200r/min进行活化反应；
S125：清洗所述步骤S124活化后的荧光微球颗粒，转移至干净的离心管中，置于高速冷冻离心机离心，去除上层清液，加入清洗缓冲液重复清洗一次后去上清，待用。
5.根据权利要求4所述的基于时间分辨免疫荧光分析仪检测抗体配对的抗体筛选方法，其特征在于，所述步骤S13偶联的具体步骤为：将抗体、10mM磷酸盐缓冲液与所述步骤S125中活化后荧光微球颗粒加入离心管，并将离心管放入37℃的恒温振荡器中，置于200r/min反应3h，并每隔30min超声一次；其中抗体量与10mM磷酸盐缓冲液的总量为0.2mL，所述荧光微球颗粒与抗体比例为10:1。
6.根据权利要求5所述的基于时间分辨免疫荧光分析仪检测抗体配对的抗体筛选方法，其特征在于，所述步骤S14封闭的具体步骤为：在所述步骤S13偶联后的离心管中加入等体积的10％BSA，吹打混匀并超声后，放入37℃的恒温振荡器中，置于200r/min反应25min后，加入等体积的甘氨酸封闭液，吹打混匀并超声，再放入37℃的恒温振荡器中，进行反应实现封闭。
7.根据权利要求2所述的基于时间分辨免疫荧光分析仪检测抗体配对的抗体筛选方法，其特征在于，所述步骤S15保存的具体步骤为：
S151：将所述步骤S14处理后的中间品，置于高速冷冻离心机进行离心，去除上层清液；
S152：再加入甘氨酸封闭液重复清洗一次后去除上层清液；
S153：重复所述步骤S152再清洗一次；
S154：加入恢复至室温的保存液，吹打混匀并超声，并确保全部混匀避光存放于2～8℃，待用。
8.根据权利要求2所述的基于时间分辨免疫荧光分析仪检测抗体配对的抗体筛选方法，其特征在于，所述步骤S2具体步骤为：采用10mM磷酸盐缓冲液将所需配对的捕获抗体稀释至0.5μg/mL～2μg/mL后包被至固相载体上，包被后置于4℃过夜或37℃中2h，采用10mM磷酸盐缓冲液清洗3遍后加入1％BSA置于4℃中2h，封闭。
9.根据权利要求2所述的基于时间分辨免疫荧光分析仪检测抗体配对的抗体筛选方法，其特征在于，所述步骤S3的具体步骤为：采用10mM磷酸盐缓冲液清洗3遍，根据检测范围稀释待检抗原后，将稀释后的抗原加入固相载体中，与步骤S2中的固相载体上的抗体结合，37℃孵育1h，形成抗原抗体复合物。
10.根据权利要求9所述的基于时间分辨免疫荧光分析仪检测抗体配对的抗体筛选方法，其特征在于，所述步骤S4的具体步骤为：
S41：将所述步骤S3中的抗原抗体复合物进行多次清洗；
S42：向清洗后的所述抗原抗体复合物中加入所述步骤S1中已荧光标记好的抗体，37℃下孵育，清洗；
S43：放入时间分辨免疫荧光分析仪进行检测并读数，筛选抗体。
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