CN113474342A - 检测癌症的荧光探针 - Google Patents

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浦野泰照
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藤田恭平
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Abstract

提供能够检测乳腺癌、肺癌、鳞状细胞癌的荧光探针。一种检测乳腺癌和乳腺良性肿瘤的荧光探针，其包含由以下的通式(I)表示的化合物或其盐。

Description

检测癌症的荧光探针
技术领域
本发明涉及能够特异性检测癌症的荧光探针。更具体而言，本发明涉及能够检测乳腺的恶性肿瘤和良性肿瘤、肺腺癌或肺鳞状细胞癌的荧光探针。
背景技术
通过评价恶性组织中的酶活性的方法，可以提供有关用于指导癌症检测的有效生物标志物的信息。癌症的荧光诱导检测是用于改善局部切除手术效率的最有前途的方法之一。本发明人等的研究小组到目前为止已开发出了活性氨肽酶反应性荧光探针(非专利文献1)，通过局部地喷雾探针溶液而在几分钟内成功地检测出人类的乳腺癌和食道癌(非专利文献2和3)。
然而，许多恶性肿瘤由于癌症与正常组织之间的氨肽酶活性没有明显差异而无法通过这些荧光探针以高的灵敏度/特异性进行检测。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：Urano,Y.et al.Science Transl Med,3,110(2011)
非专利文献2：Onoyama,H.et al.Sci.Rep.,6,26399(2016)
非专利文献3：Ueo,H.et al.Sci.Rep.,5,12080(2015)
发明内容
发明要解决的问题
本发明的目的在于，提供能够检测乳腺的恶性肿瘤和良性肿瘤、肺腺癌或肺鳞状细胞癌的荧光探针。
用于解决问题的方案
本发明人等聚焦于癌症中的糖苷酶活性，制备用于检测不同的糖苷酶活性的各种荧光探针，并利用这些荧光探针进行人外科待检体中的糖苷酶活性的综合筛选，由此发现糖苷酶活性因肿瘤的种类而不同，而且某种荧光探针对肿瘤的特异性图像化有效，以至完成了本发明。
即，本发明提供：
[1]一种检测乳腺癌和乳腺良性肿瘤的荧光探针，包含由以下的通式(I)表示的化合物或其盐。
Figure BDA0003232900740000021
式(I)中，
存在R1时，R1表示存在于苯环上的相同或不同的一价的取代基；
R2和R3各自独立地表示氢原子、碳数1～6个的烷基或卤原子；
R4和R5各自独立地表示氢原子、碳数1～6个的烷基或卤原子；
R6表示氢原子、碳数1～5个的烷基或碳数1～5个的氟代烷基；
存在R7和R8时，R7和R8各自独立地表示碳数1～6个的烷基或芳基，
此处，X为氧原子时，R7和R8不存在；
X表示氧原子、硅原子或碳原子；
n为1～3的整数；
L从以下的式(1)～(6)中任意的基团中选择，
Figure BDA0003232900740000031
[2]根据[1]所述的荧光探针，其中，X为氧原子。
[3]根据[1]或[2]所述的荧光探针，其中，R6为碳数1～5个的氟代烷基。
[4]一种检测乳腺癌和乳腺良性肿瘤的荧光探针，其包含[1]～[3]中任一项所述的荧光探针和GGT活性检测探针。
[5]一种检测肺腺癌或肺鳞状细胞癌的荧光探针，其包含由以下的通式(I)表示的化合物或其盐，
Figure BDA0003232900740000032
式(I)中，
存在R1时，R1表示存在于苯环上的相同或不同的一价的取代基；
R2和R3各自独立地表示氢原子、碳数1～6个的烷基或卤原子；
R4和R5各自独立地表示氢原子、碳数1～6个的烷基或卤原子；
R6表示氢原子、碳数1～5个的烷基或碳数1～5个的氟代烷基；
存在R7和R8时，R7和R8各自独立地表示碳数1～6个的烷基或芳基，
此处，X为氧原子时，R7和R8不存在；
X表示氧原子、硅原子或碳原子；
n为1～3的整数；
L从以下的式(5)或(6)的基团中选择，
Figure BDA0003232900740000041
[6]根据[5]所述的荧光探针，其中，X为氧原子。
[7]根据[5]或[6]所述的荧光探针，其中，R6为碳数1～5个的氟代烷基。
[8]一种检测乳腺癌和乳腺良性肿瘤的方法，其包括如下工序：(a)将[1]～[4]中任一项所述的荧光探针应用于乳房的临床待检体的工序；及(b)测定应用了上述荧光探针的乳房的临床待检体的荧光图像。
[9]一种检测肺腺癌或肺鳞状细胞癌的方法，其包括如下工序：(a)将[5]～[7]中任一项所述的荧光探针应用于肺腺癌或肺鳞状细胞癌的临床待检体的工序；及
(b)测定应用了上述荧光探针的肺腺癌或肺鳞状细胞癌的临床待检体的荧光图像。
[10]一种检测乳腺癌和乳腺良性肿瘤的荧光探针，其包含[1]～[4]中任一项所述的荧光探针和GGT活性检测探针。
[11]根据[10]所述的检测乳腺癌和乳腺良性肿瘤的荧光探针，其中，上述GGT活性检测探针为由以下的通式(II)表示的化合物或其盐，
Figure BDA0003232900740000042
式(II)中，
X表示Si(Ra)(Rb)、Ge(Ra)(Rb)、Sn(Ra)(Rb)、C(Ra)(Rb)、P(＝O)(Ra)或O，
此处，Ra和Rb各自独立地表示氢原子、烷基或芳基；
R1表示氢原子或独立地选自由分别任选被取代的烷基、羧基、酯基、烷氧基、酰胺基和叠氮基组成的组中的1～4个相同或不同的取代基；
R2表示氢原子、羟基、氰基、分别任选被取代的烷基、烷氧基、芳基或杂芳基；
R3和R4各自独立地表示：氢原子；独立地选自由羟基、卤原子、分别任选被取代的烷基、磺基、羧基、酯基、酰胺基和叠氮基组成的组中的1～3个相同或不同的取代基；
R5、R6和R7各自独立地表示氢原子或烷基，
此处，R6或R7任选分别与R4一起形成包含它们所键合的氮原子的环结构；
R8表示源自氨基酸的酰基残基。
[12]一种检测乳腺癌和乳腺良性肿瘤的荧光探针，其包含[1]～[4]中任一项所述的荧光探针和以下的式(7)的化合物或其盐，
Figure BDA0003232900740000051
[13]一种乳腺癌和乳腺良性肿瘤检测用试剂盒，其包含[1]～[4]中任一项所述的荧光探针。
[14]一种乳腺癌和乳腺良性肿瘤检测用试剂盒，其包含[1]～[4]中任一项所述的荧光探针和GGT活性检测探针。
[15]一种肺腺癌或肺鳞状细胞癌检测用试剂盒，其包含[5]～[7]中任一项所述的荧光探针。
发明的效果
根据本发明，可以提供能够检测乳腺的恶性肿瘤和良性肿瘤的荧光探针。
另外，根据本发明，可以提供能够检测肺腺癌或肺鳞状细胞癌的荧光探针。
附图说明
图1是实施例中合成的12种糖苷酶反应性荧光探针。
图2示出用于检测乳腺癌和良性的糖苷酶反应性荧光探针的筛选试验的结果。
图3是使用了糖苷酶反应性荧光探针(1、2、5、7、11和12)的乳腺癌待检体中的荧光探针的评价结果。
图4是对糖苷酶反应性荧光探针5和11在乳腺癌、乳腺纤维腺瘤(良性肿瘤)中的荧光上升进行比较的结果。
图5示出使用了12种糖苷酶反应性荧光探针得到的、乳腺癌(IDC)的荧光成像实验结果。
图6示出使用了12种糖苷酶反应性荧光探针得到的、良性肿瘤(FA)的荧光成像实验结果。
图7示出使用了糖苷酶反应性荧光探针5(HMRef-a-D-Man)得到的、乳腺肿瘤成像实验结果。
图8示出使用了糖苷酶反应性荧光探针5(HMRef-a-D-Man)得到的、乳腺肿瘤成像实验结果。
图9是组合使用糖苷酶反应性荧光探针5和gGlu-2-OMeSiR600进行了双色成像的结果。
具体实施方式
本说明书中，除另有说明以外，“烷基”或包含烷基部分的取代基(例如烷氧基等)的烷基部分是指：例如碳数1～6个、优选为碳数1～4个、进一步优选为碳数1～3个左右的直链、支链、环状、或由它们的组合组成的烷基。更具体而言，作为烷基，例如可以列举出甲基、乙基、正丙基、异丙基、环丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、环丙基甲基、正戊基、正己基等。
本说明书中称为“卤原子”时，可以为氟原子、氯原子、溴原子或碘原子中的任意者，优选为氟原子、氯原子或溴原子。
本发明人等聚焦于癌症中的糖苷酶活性，制备了用于检测不同的糖苷酶活性的各种荧光探针。然后利用制得的荧光探针，成功地在不进行均质化的情况下对外科切除而得的癌组织中的无损的糖苷酶活性进行了可视化和评价。
具体而言，本发明人等对人类外科标本中的糖苷酶活性进行了综合筛选，明确了糖苷酶活性因肿瘤的种类而不同，而且某种荧光探针对癌症特异性图像化有效。以下对其详情进行说明。
1.乳腺癌检测荧光探针
本发明的一个实施方式为检测乳腺癌和乳腺良性肿瘤的荧光探针，其包含由以下的通式(I)表示的化合物或其盐(以下也称为“实施方式1”)。
Figure BDA0003232900740000071
通式(I)中，存在R1时，R1表示存在于苯环上的相同或不同的一价的取代基。作为一价的取代基，可列举出卤素、任选被取代的烷基等。
m为0～4的整数。
本发明的一个优选的方式中，m为0，R1不存在。即，与呫吨骨架结合的苯环为非取代苯环。
通式(I)中，R2和R3各自独立地表示氢原子、碳数1～6个的烷基或卤原子。
R2和R3表示烷基时，该烷基中可以存在1个或2个以上的卤原子、羧基、磺酰基、羟基、氨基、烷氧基等，例如R2或R3所表示的烷基可以为卤代烷基、羟烷基、羧烷基等。R2和R3各自独立地优选为氢原子或卤原子。R2和R3为卤原子时，优选R2和R3均为氟原子或氯原子。
本发明的一个优选的方式中，R2和R3均为氢原子。
R4和R5各自独立地表示氢原子、碳数1～6个的烷基或卤原子，与针对R2和R3说明的情况同样。优选R4和R5均为氢原子。
R6表示氢原子、碳数1～5个的烷基或碳数1～5个的氟代烷基。作为R6的烷基，优选甲基、乙基。作为R6的氟代烷基，优选-CH2-CF3、-CH2-CH2-CF3。
本发明的一个优选的方式中，R6为-CH2-CF3。
通式(I)中，存在R7和R8时，R7和R8各自独立地表示碳数1～6个的烷基或芳基，但R7和R8各自独立地优选为碳数1～3个的烷基，更优选R7和R8均为甲基。R7和R8所表示的烷基中可以存在1个或2个以上的卤原子、羧基、磺酰基、羟基、氨基、烷氧基等，例如R7或R8所表示的烷基可以为卤代烷基、羟烷基、羧烷基等。
R7或R8表示芳基时，芳基可以为单环芳香族基或稠合芳香族基中的任意者，芳基环可以包含1个或2个以上的成环杂原子(例如氮原子、氧原子或硫原子等)。作为芳基，优选苯基。芳基环上可以存在1个或2个以上的取代基。作为取代基，例如可以存在1个或2个以上的卤原子、羧基、磺酰基、羟基、氨基、烷氧基等。
另外，后述的X为氧原子的情况下，R7和R8不存在。
X表示氧原子、硅原子或碳原子。
本发明的一个优选的方式中，X为氧原子。
n为1～3的整数，优选n为1。
通式(I)中，L从以下的式(1)～(6)中任意的基团中选择。
Figure BDA0003232900740000091
具有式(1)的基团作为L的荧光探针为α-甘露糖苷酶反应性荧光探针，具有(2)的基团作为L的荧光探针为α-L-岩藻糖苷酶反应性荧光探针，具有(3)的基团作为L的荧光探针为β-氨基己糖苷酶反应性荧光探针，具有(4)的基团作为L的荧光探针为β-N-乙酰基半乳糖苷酶反应性荧光探针，具有(5)的基团作为L的荧光探针为β-葡萄糖苷酶反应性荧光探针，具有(6)的基团作为L的荧光探针为β-半乳糖苷酶反应性荧光探针，根据本发明人等的研究结果，这些荧光探针对乳腺纤维腺瘤和浸润性导管癌、非浸润性导管癌的图像诊断有效。因此，具有式(1)～(6)中的任一基团作为L的本发明的荧光探针能够检测乳腺癌和良性肿瘤这两者。
本发明的实施方式1的一个优选的方式为检测乳腺癌和乳腺良性肿瘤的荧光探针，其包含由以下的式(Ia)表示的化合物或其盐。
Figure BDA0003232900740000092
此处，L从以下的式(1)～(6)中任意的基团中选择。
Figure BDA0003232900740000101
2.肺癌或鳞状细胞癌检测荧光探针
本发明的另一个实施方式为检测肺腺癌或肺鳞状细胞癌的荧光探针，其包含由以下的通式(I)表示的化合物或其盐(以下也称为“实施方式2”)。
Figure BDA0003232900740000102
通式(I)中的、R1～R8、X和n与实施方式1中说明的情况同样。
实施方式2中，L从以下的式(5)或(6)的基团中选择。
Figure BDA0003232900740000103
具有式(5)或(6)的基团作为L的荧光探针为β-葡萄糖苷酶或β-半乳糖苷酶反应性荧光探针，根据本发明人等的研究结果，获知不仅对用氨肽酶反应性荧光探针无法检测出的肺鳞状细胞癌、而且还对包括肺腺癌在内的主要的肺癌的特异性成像有效。因此，具有式(5)或(6)的基团作为L的本发明的荧光探针能够特异性检测出肺腺癌或肺鳞状细胞癌。
本发明的实施方式2的一个优选的方式为检测肺腺癌或肺鳞状细胞癌的荧光探针，其包含由以下的式(Ia)表示的化合物或其盐。
Figure BDA0003232900740000111
此处，L从以下的式(5)或(6)的基团中选择。
Figure BDA0003232900740000112
实施方式1和2中的由通式(I)表示的化合物可以以酸加成盐或碱加成盐的形式存在。作为酸加成盐，例如可以列举出盐酸盐、硫酸盐、硝酸盐等无机酸盐、或甲磺酸盐、对甲苯磺酸盐、草酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐等有机酸盐等，作为碱加成盐，可以列举出钠盐、钾盐、钙盐、镁盐等金属盐、铵盐、或三乙胺盐等有机胺盐等。除这些之外，也有时形成与甘氨酸等氨基酸的盐。由通式(I)表示的化合物或其盐也有时以水合物或溶剂化物的形式存在，在本发明中也可以使用这些物质。
由通式(I)表示的化合物根据取代基的种类有时具有1个或2个以上的不对称碳，在本发明中，也可以使用基于1个或2个以上不对称碳的光学活性体、基于2个以上不对称碳的非对映异构体等立体异构体、及立体异构体的任意的混合物、消旋体等。
本说明书的实施例中具体示出由通式(I)表示的化合物的代表性的化合物的制造方法。因此，本领域技术人员可以基于这些说明并适宜选择反应原料、反应条件和反应试剂等，根据需要对这些方法加以修饰、改变而制造由通式(I)表示的化合物。
3.与GGT活性检测探针组合使用的荧光探针
实施方式1的荧光探针可以与GGT活性检测探针组合使用。例如在检测乳腺癌时，若组合使用红色GGT探针和实施方式1的荧光探针，则乳腺癌(恶性肿瘤)和良性肿瘤这两者都同样地发出红色荧光，而本发明中使用的糖苷酶反应性荧光探针尤其在良性肿瘤中会发出强烈的绿色荧光。将两者的图像进行复合时，能够将乳腺癌组织成像为红色、将良性肿瘤组织成像为黄色。因此，通过组合使用糖苷酶反应性荧光探针和GGT探针，从而能够判定仅糖苷酶反应性荧光探针发出荧光的部位为良性肿瘤部、糖苷酶反应性荧光探针和GGT探针这两者发出荧光的部位为乳腺癌(恶性肿瘤)部，能够辨别良性肿瘤和恶性肿瘤。由此，在外科手术中不会将良性肿瘤部位切除，能够改善局部切除手术的效率。
即，本发明的另一个实施方式为检测乳腺癌和乳腺良性肿瘤的荧光探针，其包含实施方式1的荧光探针和GGT活性检测探针。
此处，作为GGT活性检测探针，可列举出由以下的通式(II)表示的化合物或其盐。
Figure BDA0003232900740000121
通式(II)中，X表示Si(Ra)(Rb)、Ge(Ra)(Rb)、Sn(Ra)(Rb)、C(Ra)(Rb)、P(＝O)(Ra)或O。此处，Ra和Rb各自独立地表示氢原子、烷基或芳基。
R1表示氢原子或独立地选自由分别任选被取代的烷基、羧基、酯基、烷氧基、酰胺基和叠氮基组成的组中的1～4个相同或不同的取代基。
R2表示氢原子、羟基、氰基、分别任选被取代的烷基、烷氧基、芳基或杂芳基。
R3和R4各自独立地表示：氢原子；独立地选自由羟基、卤原子、分别任选被取代的烷基、磺基、羧基、酯基、酰胺基和叠氮基组成的组中的1～3个相同或不同的取代基。
R5、R6和R7各自独立地表示氢原子或烷基。
此处，R6或R7可以分别与R4一起形成包含它们所键合的氮原子的环结构。
R8表示源自氨基酸的酰基残基。此处，该酰基残基是指：作为从氨基酸的羧基中去除了OH基后剩余的部分结构的残基。即，源自氨基酸的酰基残基的羰基部分与和式(II)的R8相邻的NH形成酰胺键，由此与罗丹明骨架连接。
“氨基酸”只要是具有氨基和羧基这两者的化合物即可，可以使用任意的化合物，包括天然和非天然的化合物。可以是中性氨基酸、碱性氨基酸或酸性氨基酸中的任意者，除了其本身作为神经递质等传递物质发挥作用的氨基酸之外，还可以使用作为生理活性肽(包括二肽、三肽、四肽及寡肽)、蛋白质等多肽化合物的构成成分的氨基酸，例如可以为α-氨基酸、β-氨基酸、γ-氨基酸等。作为氨基酸，优选使用光学活性氨基酸。例如，对于α-氨基酸，可以使用D-氨基酸或L-氨基酸中的任意者，但有时优选选择在生物体中发挥作用的光学活性氨基酸。
R8是通过与靶肽酶反应而被切断的位点。上述靶肽酶可以为γ-谷氨酰转肽酶(GGT)、二肽基肽酶IV(DPP-IV)、或钙蛋白酶。因此，靶肽酶为γ-谷氨酰转肽酶时，R8优选为γ-谷氨酰基。另外，靶肽酶为二肽基肽酶IV时，R8优选为包含脯氨酸残基的酰基。靶肽酶为钙蛋白酶时，R8例如可以是包含半胱氨酸残基的酰基，或者，作为钙蛋白酶底物，也可以使用该技术领域中公知的Suc-Leu-Leu-Val-Tyr(Suc-LLVY)、AcLM。
通式(II)表示的化合物发荧光的原理可参照作为审理中的申请的日本特愿2018-210101。
本发明的一个优选的方式为检测乳腺癌和乳腺良性肿瘤的荧光探针，其包含实施方式1的荧光探针和R8为γ-谷氨酰基的通式(II)的化合物或其盐。
由通式(II)表示的化合物中，可以适宜地使用以下的化合物。
Figure BDA0003232900740000141
由通式(II)表示的化合物可以以酸加成盐或碱加成盐的形式存在。作为酸加成盐，例如可以列举出盐酸盐、硫酸盐、硝酸盐等无机酸盐、或甲磺酸盐、对甲苯磺酸盐、草酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐等有机酸盐等，作为碱加成盐，可以列举出钠盐、钾盐、钙盐、镁盐等金属盐、铵盐、或三乙胺盐等有机胺盐等。除这些之外，也有时形成与甘氨酸等氨基酸的盐。通式(II)表示的化合物或其盐也有时以水合物或溶剂化物的形式存在，本发明中也可以使用这些物质。
由通式(II)表示的化合物根据取代基的种类有时具有1个或2个以上的不对称碳，在本发明中，也可以使用基于1个或2个以上的不对称碳的光学活性体、基于2个以上的不对称碳的非对映异构体等立体异构体、及立体异构体的任意的混合物、消旋体等。
本发明的一个优选的方式为检测乳腺癌和乳腺良性肿瘤的荧光探针，其包含实施方式1的荧光探针和式(7)的化合物或其盐。
4.使用了本发明的荧光探针的乳腺癌和乳腺良性肿瘤检测用试剂盒
本发明的另一个实施方式为乳腺癌和乳腺良性肿瘤检测用试剂盒，其包含实施方式1的荧光探针。
另外，本发明的另一个实施方式为乳腺癌和乳腺良性肿瘤检测用试剂盒，其包含实施方式1的荧光探针和GGT活性检测探针。对于GGT活性检测探针，如上述中说明所述。
另外，本发明的另一个实施方式为肺腺癌或肺鳞状细胞癌检测用试剂盒，其包含实施方式2的荧光探针。
该试剂盒中，通常将本发明的荧光探针制成溶液，但可以例如粉末形态的混合物、冷冻干燥物、颗粒剂、片剂、液体制剂等适宜的形态的组合物的形式提供，也可以在使用时溶解于注射用蒸馏水、适宜的缓冲液中而使用。
另外，该试剂盒可以根据需要适宜包含除此以外的试剂等。例如，作为添加剂，可以使用助溶剂、pH调节剂、缓冲剂、等渗剂等添加剂，本领域技术人员可以适宜选择它们的配混量。
本发明的另一个实施方式是检测乳腺癌和乳腺良性肿瘤的方法，所述方法包括：(a)将实施方式1的荧光探针用于乳房的临床待检体的工序；及(b)测定应用了上述荧光探针的乳房的临床待检体的荧光图像。
在(a)的工序中为了将荧光探针应用于乳房的临床待检体，例如可以通过将荧光探针的溶液局部地喷雾于乳房的临床待检体上而进行。
另外，本发明的另一个实施方式为一种检测肺腺癌或肺鳞状细胞癌的方法，其包括如下工序：(a)将实施方式2的荧光探针应用于肺腺癌或肺鳞状细胞癌的临床待检体的工序；及(b)测定应用了上述荧光探针的肺腺癌或肺鳞状细胞癌的临床待检体的荧光图像。
在(a)的工序中为了将荧光探针应用于肺腺癌或肺鳞状细胞癌的临床待检体，例如可以通过将荧光探针的溶液局部地喷雾于肺腺癌或肺鳞状细胞癌的临床待检体上而进行。
实施例
以下，通过实施例对本发明进行说明，但本发明不限定于这些。
[合成实施例1]
探针1(β-葡萄糖苷酶反应性探针)的合成
将HMRef(0.426g、1.07mmol)、2,3,4,6-四-O-乙酰基-α-D-吡喃葡萄糖溴化物(8.26g、20.1mmol)、Ag2O(4.71g、20.3mmol)、Na2SO4(720mg、2.00mmol)溶解于30mL的乙腈(超脱水)中，在室温下搅拌24小时。对反应溶液进行硅藻土过滤，回收滤液并减压去除乙腈。用硅胶柱色谱法(CH2Cl2：MeOH＝95：5)将残渣纯化，得到乙酰化糖加合物。将其溶解于甲醇中，添加将NaOMe(520mg、9.63mmol)溶解于5mL的甲醇中而得到的溶液，在室温下搅拌5小时。用Amberlite IR 120中和反应溶液，减压去除甲醇。用硅胶柱色谱法(CH2Cl2：MeOH＝90：10)将残渣纯化，以收率50.2％得到目标物(301mg、0.535mmol)。
[合成实施例2]
探针5(α-甘露糖苷酶反应性探针)的合成
将HMRef(96.0mg、0.24mmol)、五-O-乙酰基-D-吡喃甘露糖苷(3.33g、8.53mmol)、三氟化硼-乙醚络合物(8.0mL、63.4mmol)、Na2SO4(500mg、3.34mmol)溶解于15mL的二氯甲烷中，搅拌24小时。对反应溶液进行硅藻土过滤，使用1M NaOH通过分液操作提取二氯甲烷层，进行减压去除。将残渣溶解于15mL的甲醇中，添加将NaOMe(1.60g、29.6mmol)溶解于甲醇5mL中而得到的溶液，在室温下搅拌5小时。用Amberlite IR 120中和反应溶液，减压去除甲醇。用硅胶柱色谱法(CH2Cl2：MeOH＝90：10)将残渣纯化，得到粗产物。进而将其用HPLC(5-80％MeCN水溶液(0.1％TFA)，超过90分钟)纯化，以收率45.6％得到目标物(61.6mg、0.200mmol)。
[合成实施例3]
探针7(α-L-岩藻糖苷酶反应性探针)的合成
将HMRef(90.0mg、0.226mmol)、2,3,4-三-O-乙酰基-L-吡喃岩藻糖基三氯乙酰亚胺(862mg、1.99mmol)、TMSOTf(442mg、1.99mmol)溶解于10mL的二氯甲烷中，在-41℃下搅拌12小时。用二氯甲烷稀释反应溶液，用饱和碳酸氢钠水溶液进行中和。通过分液操作提取有机层，进行减压去除。用硅胶柱色谱法(CH2Cl2：MeOH＝95：5)将残渣纯化，得到中间体。将其溶解于甲醇5mL中，添加将NaOMe(1.33g、24.6mmol)溶解于甲醇5mL中而得到的溶液，在室温下搅拌5小时。用Amberlite IR 120中和反应溶液，减压去除甲醇。用硅胶柱色谱法(CH2Cl2：MeOH＝95：5)将残渣纯化，得到粗产物。将其进而通过HPLC(5-80％MeCN水溶液(0.1％TFA)，超过90分钟)进行纯化，以收率11.7％得到目标物(14.4mg、0.0257mmol)。
[合成实施例4]
探针12(β-N-乙酰基半乳糖苷酶反应性探针)的合成
将HMRef(46.7mg、0.117mmol)、2-乙酰胺-3,4,6-三-O-乙酰-2-脱氧-a-D-吡喃半乳糖基氯(400mg、1.09mmol)、Ag2O(400mg、1.72mmol)、NaI(88.3mg、0.589mmol)和Na2SO4(500mg、3.34mmol)溶解于10mL的乙腈(超脱水)中，在室温下搅拌24小时。对反应溶液进行硅藻土过滤，回收滤液并减压去除乙腈。用硅胶柱色谱法(CH2Cl2：MeOH＝95：5)将残渣纯化，得到乙酰化糖加合物。将其溶解于甲醇中，添加将NaOMe(0.50g、9.25mmol)溶解于5mL的甲醇中而得到的溶液，在室温下搅拌5小时。用Amberlite IR 120中和反应溶液，减压去除甲醇。用硅胶柱色谱法(CH2Cl2：MeOH＝90：10)将残渣纯化，得到粗产物。将其进而通过HPLC(5-80％MeCN水溶液(0.1％TFA)，超过90分钟)进行纯化，以收率28.2％得到目标物(11.3mg、0.0216mmol)。
关于探针2，依据Matsuzaki,H et al,Bioconju.Chem.,27(4),973-981(2016).的记载进行合成，关于探针11，依据Asanuma,D et al,Nat.Commun.,6,6463(2015).的记载进行合成。
另外，对于探针3、4、6、8、9、10，利用与上述探针同样的方法进行合成。
[实施例1]
用于检测乳腺癌和良性的糖苷酶反应性荧光探针的筛选
使用上述中合成的12种糖苷酶反应性荧光探针(参照图1)，按照以下的步骤进行了用于检测乳腺癌和良性的筛选。
在放置有乳腺临床待检体的各孔中添加50μM浓度的各荧光探针的PBS溶液200μL，使用Maestro体内成像系统(PerkinElmer)获得了1、3、5、10、20、30分钟时的540nm的荧光图像。对于各荧光强度值，在Maestro软件上获得感兴趣区域(Regions Of Interest，ROIs)并进行定量和比较。过滤器设定使用Ex/Em＝465-30nm/515nm long-pass。
将结果示于图2。
图2的a示出使用了经外科切除而得的人乳房标本的荧光探针的筛选结果。
图2的b示出各抑制剂存在下和不存在下乳房FA组织的30分钟时的荧光增加。黑色条棒表示抑制剂不存在下的荧光增加，灰色条棒表示抑制剂存在下的荧光增加。荧光探针浓度＝50μM、抑制剂浓度＝500μM。
图2的c示出使用了12种荧光探针的正常乳房、IDC(乳腺癌)和FA(良性肿瘤)组织中的无损的糖苷酶活性的综合性分析结果。荧光的增加表示在添加荧光探针后1分钟起至30分钟后的增加。各点自左边起依次表示正常乳房、IDC、DCIS和FA组织的荧光增加。根据图3的c，乳腺癌和FA(良性肿瘤)组织这两者中，糖苷酶反应性荧光探针1、2、5、7、11和12显示出荧光增加。
图2的d示出关于MAN2C1的正常乳腺、FA或IDC组织的免疫组织化学分析结果。未观察到被染色的细胞时，将组织评价为阴性，否则将它们评价为阳性。作为结果，在FA、IDC组织中确认到比正常组织更强的染色，确认MAN2C1在这些组织中过表达。
图2的e示出DEG法的结果。DEG法依据J.Am.Chem.Soc.,135,6002-6005(2013)中记载的步骤进行。
对于FA组织，使用α-甘露糖苷酶反应性探针5实施DEG法的结果是，通过二维电泳仅观察到一个荧光点，通过荧光点肽质量指纹谱从该点中鉴定出MAN2C1。另外，通过二维电泳在IDC组织中也仅确认了一个同样的荧光点。基于这些结果可知，与α-甘露糖苷酶反应性探针5的荧光上升相关的责任酶为MAN2C1。
对于图2的c中显示出荧光增加的6种糖苷酶反应性荧光探针(1、2、5、7、11和12)，进行了乳腺癌待检体中的荧光探针的评价。作为待检体，使用4例乳腺癌IDC、1例DCIS，以荧光探针浓度＝50μM进行。
将结果示于图3。由图3确认了，糖苷酶反应性荧光探针5和11的荧光上升较大，而且肿瘤与正常组织之间的荧光强度比也较大。
对于糖苷酶反应性荧光探针5(HMRef-α-D-Man)和11(HMRef-β-D-GlcNAc)，将比较了乳腺癌、良性肿瘤中的荧光上升的结果示于图4(荧光探针浓度＝50μM)。
在放置有乳腺临床待检体的各孔中添加上述浓度的荧光探针的PBS溶液200μL，使用Maestro体内成像系统(PerkinElmer)获得了1、3、5、10、20、30分钟时的540nm的荧光图像。对于各荧光强度值，在Maestro软件上获得感兴趣区域(ROIs)并进行定量和比较。过滤器设定使用Ex/Em＝465-30nm/515nm long-pass。
作为结果，与正常乳腺(Normal)相比，糖苷酶反应性荧光探针5(HMRef-α-D-Man)、11(HMRef-β-D-GlcNAc)在肿瘤组织中显示出高荧光上升，另外，与癌组织(IDC、DCIS)相比，在良性肿瘤组织(FA)中显示出高的荧光。这些结果启示，两种探针可能对乳腺癌荧光成像或良性肿瘤的特异性检测有效。
另外，对于使用了12种糖苷酶反应性荧光探针的乳腺癌(IDC)和良性肿瘤(FA)，将荧光上升的时间变化的成像图像示于图5～6。在以下的条件下进行了实验。
在放置有乳腺临床待检体的各孔中添加上述浓度的荧光探针的PBS溶液200mL，使用Maestroin体内成像系统(木)PerkinElmer)获得了1、3、5、10、20、30分钟时的540nm的荧光图像。对于各荧光强度值，在Maestro软件上获得感兴趣区域(ROIs)并进行定量和比较。过滤器设定使用Ex/Em＝465-30nm/515nm long-pass。
图5是使用了乳腺癌组织的荧光成像的结果(右图)，图6是使用了良性肿瘤(FA)的荧光成像的结果(右图)。
[实施例2]
使用了HMRef-a-D-Man的乳腺肿瘤成像
使用糖苷酶反应性荧光探针5(HMRef-a-D-Man)(浓度：50mM)在以下的条件下进行成像。
在放置有乳腺临床待检体(正常部和肿瘤部混杂的待检体)的培养皿中添加上述浓度的荧光探针的PBS溶液3mL，获得了各时间的荧光图像。以下，使用Maestro体内成像系统(PerkinElmer)获得了DCIS、FA的临床待检体的荧光图像。各过滤器设定使用Ex/Em＝465-30nm/515nm long-pass。使用与Maestro体内成像系统同等的Homme制造的便携式成像装置获得了IDC的临床待检体的荧光图像。
将结果示于图7～8。
图7的a示出经外科切除而得的IDC(乳腺癌)的成像结果。
散布探针后，20分钟左右仅IDC部位以较强的荧光被可视化。
图7的b示出上述待检体的组织学解析结果和MAN2C1的免疫染色结果。确认了可见荧光上升的部位与组织学上为IDC的部位、高表达MAN2C1的部位是一致的。
图7的c示出经外科切除而得的DCIS(乳腺癌)的成像结果。散布探针后，15分钟以内仅DCIS部位以较强的荧光被可视化。
图7的d示出上述待检体的感兴趣区域(ROIs)及其组织学解析结果、MAN2C1的免疫染色结果的例子。确认了可见荧光上升的部位与组织学上为DCIS的部位、高表达MAN2C1的部位是一致的。另外，也确认检测到1mm以下的非常微小的DCIS组织。
图7的e示出上述待检体的感兴趣区域(ROIs)在15分钟时的荧光上升值。在组织学正常部位未观察到荧光的显著上升，在组织学为DCIS的部位观察到显著的荧光上升。
图8的a示出经外科切除而得的FA(良性肿瘤)的成像结果。散布探针后，10分钟以内仅FA部位以较强的荧光被可视化。
图8的b示出上述待检体的组织学解析结果和MAN2C1的免疫染色结果。确认了可见荧光上升的部位与组织学上为FA的部位、高表达MAN2C1的部位是一致的。
[实施例3]
组合使用了HMRef-α-D-Man和GGT探针的良性肿瘤与乳腺癌的区别
组合使用糖苷酶反应性荧光探针5(HMRef-α-D-Man)(浓度：50μM)和作为GGT探针的gGlu-2-OMeSiR600(浓度：50μM)并在以下的条件下进行了双色成像。
在放置有乳腺临床待检体的各孔中添加上述浓度的荧光探针的PBS溶液200μL，使用Maestroin体内成像系统(PerkinElmer)获得了1、3、5、10、20、30分钟时的540nm和640nm的荧光图像。对于各荧光强度值，在Maestro软件上获得感兴趣区域(ROIs)并进行定量和比较。关于糖苷酶反应性荧光探针5，过滤器设定使用Ex/Em＝465-30nm/515nm long-pass。关于GGT探针，使用Ex/Em＝570-40nm/610nm long-pass。
将结果示于图9。
图9的a示出540nm处的荧光图像和500～720nm处的伪真彩色(pseudo realcolor)图像。图9的b示出640nm处的荧光图像和600～820nm处的伪真彩色图像。荧光图像的曝光时间(毫秒)示于各图像的底部。
图9的c示出将两种探针施用于乳腺癌和良性肿瘤的组织30分钟后的绿色和红色荧光图像的合成图像。对于曝光时间，绿色的图像中为40毫秒、红色的图像中为20毫秒。图9的d示出各时间点的合成图像的比较。
根据图9的c，糖苷酶反应性荧光探针5在良性肿瘤的情况下发出绿色荧光，而红色GGT探针gGlu-2OME-SiR600在乳腺癌(恶性肿瘤)和良性肿瘤这两者的情况下发出红色荧光。将两者的图像复合时，可以将乳腺癌组织成像为红色，将良性肿瘤组织成像为黄色。因此，通过组合使用糖苷酶反应性荧光探针和GGT探针，从而能够判定：仅糖苷酶反应性荧光探针发出荧光的部位为良性肿瘤部，糖苷酶反应性荧光探针和GGT探针这两者发出荧光的部位为乳腺癌(恶性肿瘤)部，能够辨别良性肿瘤和恶性肿瘤。由此，在外科手术中不会将良性肿瘤部位切除，能够改善局部切除手术的效率。

Claims (15)

1.一种检测乳腺癌和乳腺良性肿瘤的荧光探针，其包含由以下的通式(I)表示的化合物或其盐，
Figure FDA0003232900730000011
式(I)中，
存在R1时，R1表示存在于苯环上的相同或不同的一价的取代基；
R2和R3各自独立地表示氢原子、碳数1～6个的烷基或卤原子；
R4和R5各自独立地表示氢原子、碳数1～6个的烷基或卤原子；
R6表示氢原子、碳数1～5个的烷基或碳数1～5个的氟代烷基；
存在R7和R8时，R7和R8各自独立地表示碳数1～6个的烷基或芳基，
此处，X为氧原子时，R7和R8不存在；
X表示氧原子、硅原子或碳原子；
n为1～3的整数；
L从以下的式(1)～(6)中任意的基团中选择，
Figure FDA0003232900730000012
2.根据权利要求1所述的荧光探针，其中，X为氧原子。
3.根据权利要求1或2所述的荧光探针，其中，R6为碳数1～5个的氟代烷基。
4.一种检测乳腺癌和乳腺良性肿瘤的荧光探针，其包含权利要求1～3中任一项所述的荧光探针和GGT活性检测探针。
5.一种检测肺腺癌或肺鳞状细胞癌的荧光探针，其包含由以下的通式(I)表示的化合物或其盐，
Figure FDA0003232900730000021
式(I)中，
存在R1时，R1表示存在于苯环上的相同或不同的一价的取代基；
R2和R3各自独立地表示氢原子、碳数1～6个的烷基或卤原子；
R4和R5各自独立地表示氢原子、碳数1～6个的烷基或卤原子；
R6表示氢原子、碳数1～5个的烷基或碳数1～5个的氟代烷基；
存在R7和R8时，R7和R8各自独立地表示碳数1～6个的烷基或芳基，
此处，X为氧原子时，R7和R8不存在；
X表示氧原子、硅原子或碳原子；
n为1～3的整数；
L从以下的式(5)或(6)的基团中选择，
Figure FDA0003232900730000022
6.根据权利要求5所述的荧光探针，其中，X为氧原子。
7.根据权利要求5或6所述的荧光探针，其中，R6为碳数1～5个的氟代烷基。
8.一种检测乳腺癌和乳腺良性肿瘤的方法，其包括如下工序：(a)将权利要求1～4中任一项所述的荧光探针应用于乳房的临床待检体的工序；及(b)测定应用了所述荧光探针的乳房的临床待检体的荧光图像。
9.一种检测肺腺癌或肺鳞状细胞癌的方法，其包括如下工序：(a)将权利要求5～7中任一项所述的荧光探针应用于肺腺癌或肺鳞状细胞癌的临床待检体的工序；及(b)测定应用了所述荧光探针的肺腺癌或肺鳞状细胞癌的临床待检体的荧光图像。
10.一种检测乳腺癌和乳腺良性肿瘤的荧光探针，其包含权利要求1～4中任一项所述的荧光探针和GGT活性检测探针。
11.根据权利要求10所述的检测乳腺癌和乳腺良性肿瘤的荧光探针，其中，所述GGT活性检测探针为由以下的通式(II)表示的化合物或其盐，
Figure FDA0003232900730000031
式(II)中，
X表示Si(Ra)(Rb)、Ge(Ra)(Rb)、Sn(Ra)(Rb)、C(Ra)(Rb)、P(＝O)(Ra)或O，
此处，Ra和Rb各自独立地表示氢原子、烷基或芳基；
R1表示氢原子或独立地选自由分别任选被取代的烷基、羧基、酯基、烷氧基、酰胺基和叠氮基组成的组中的1～4个相同或不同的取代基；
R2表示氢原子、羟基、氰基、分别任选被取代的烷基、烷氧基、芳基或杂芳基；
R3和R4各自独立地表示：氢原子；独立地选自由羟基、卤原子、分别任选被取代的烷基、磺基、羧基、酯基、酰胺基和叠氮基组成的组中的1～3个相同或不同的取代基；
R5、R6和R7各自独立地表示氢原子或烷基，
此处，R6或R7任选分别与R4一起形成包含它们所键合的氮原子的环结构；
R8表示源自氨基酸的酰基残基。
12.一种检测乳腺癌和乳腺良性肿瘤的荧光探针，其包含权利要求1～4中任一项所述的荧光探针和以下的式(7)的化合物或其盐，
Figure FDA0003232900730000041
13.一种乳腺癌和乳腺良性肿瘤检测用试剂盒，其包含权利要求1～4中任一项所述的荧光探针。
14.一种乳腺癌和乳腺良性肿瘤检测用试剂盒，其包含权利要求1～4中任一项所述的荧光探针和GGT活性检测探针。
15.一种肺腺癌或肺鳞状细胞癌检测用试剂盒，其包含权利要求5～7中任一项所述的荧光探针。
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