JP2006213705A - 前立腺の光学映像プローブ - Google Patents
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Abstract
Description
dye=Cy5.5,Cy5,Cy7,Alexa750,Alexa660,Alexa680,IR800,ランタノイド金属錯化合物及び近赤外線色素(Alexa及びIRは商標である)。
生物活性光学映像プローブの評価
本発明の前立腺ペプチド基質の両端はそれぞれポリ−L−リジン及び蛍光色素に結合し、光学映像プローブとする生物活性化合物を形成する。
高速液体クロマトグラフィー(HPLC)は、ペプチド分離、ペプチド純度分析及びペプチド基質が特定酵素により切断される特異性の探究に応用され、インビボ分子プローブ映像において、文献の研究によれば、ペプチドの純度が99%以上に達してから始めて良好な光学映像が得られる。本研究は、前立腺ペプチド基質の開発及び酵素のインビトロの実験探究に関する。
異なる時間の下で、前立腺ペプチド基質及び前立腺対照ペプチドを、酵素−前立腺特異的抗原(PSA)と反応させ、その蛍光スペクトルを記録したところ、図5に示すように、最も原始的なプローブの蛍光強度は比較的低いことが発見された。前立腺ペプチド基質と前立腺特異的抗原(PSA)との反応時間が35分間を経過した時点で、その信号強度は元来の5倍に増強した。注意すべきところは、前立腺対照ペプチドに前立腺特異的抗原の存在がある時、且つ反応条件が同一の場合、その蛍光強度の増加は1倍にも至らない。
ヒト前立腺がん細胞株を対照ペプチドプローブ及び前立腺ペプチド基質プローブとそれぞれ反応させた後、光学映像走査器を利用して造影したところ、図6に示すように、前立腺ペプチドプローブは明らかに対照ペプチドプローブよりも信号強度が増加していることが示され、前立腺ペプチド基質が明らかに細胞株のPSAにより切断され、蛍光が増強した。
実施例1:メトキシポリエチレングリコールニトリル(2)の合成方法
25グラム(5ミリモル)のメトキシポリエチレングリコールを取り、25ミリリットルの脱イオン水に溶解した後250ミリリットルのシングルネックフラスコ内に入れ、氷浴下(0−5℃)で水酸化カリウム0.5グラム(8.9ミリモル)を添加し、徐々にアセトニトリル4.3ミリリットルを添加して2.5時間反応した。しかる後、燐酸ナトリウムを反応後の溶液に添加してpH値を7.0まで調整し、ジクロロメタン200,70及び50ミリリットルで抽出を三回行い、有機層を収集した後硫酸マグネシウムで水を析出し、ろ過して液体を収集して、エチルエーテルで沈澱を行い、固体を析出した。そして、それをろ過した後真空下に置いて乾燥し白色固体23.5グラムを得た。収率は93%である。 1H−NMR(200MHz,CDCl3 ),δ(ppm):2.1ppm(t,4H,−CH2 CN),3.3ppm(s,−OCH3 ),3.5ppm(s,−OCH2 CH2 O−)。13CNMR(200MHz,CDCl3 ),δ(ppm):28.8,70.5,128.2。IR:2360cm-1(−CN)。
23.5グラム(4.7ミリモル)のメトキシポリエチレングリコールニトリル
を98ミリリットルの濃塩酸に溶解し、室温下に置いて48時間振盪攪拌した。反応終了後、この溶液を1000ミリリットルの脱イオン水で希釈すると共に、ジクロロメタン200,150及び1000ミリリットルで抽出を3回行い、有機層を収集して更に脱イオン水で2回洗浄し、硫酸ナトリウムで水を析出した後、ろ過して濾液を収集し、減圧濃縮機で抽出乾燥した。しかる後、真空下で抽出乾燥し、乾燥後21.5グラムの生成物を得た。収率は91.5%である。1H−NMR(200MHz,CDCl3 ),δ(ppm):2.47ppm(t,4H,−CH2 −CONH2 ),3.2ppm(s,−OCH3 ),3.5ppm(s,−OCH2 CH2 O−)。IR:3424cm-1(−NH2 ),1638cm-1,(−CONH2 )。
16グラム(3.2ミリモル)メトキシポリエチレングリコールアミドを1000ミリリットルの脱イオン水に溶解し、室温下で水酸化カリウム100グラム(1.79モル)を添加して24時間反応した。反応終了後、さらに塩化ナトリウム150グラム(1.91モル)を添加し、この溶液をジクロロメタン150ミリリットルで3回抽出して有機層を収集した。そして有機層収集後さらに5%蓚酸及び脱イオン水で2回洗浄してから硫酸ナトリウムで水を析出した。濾過して濾液を収集した後エチルエーテルを添加して固体を析出し、それを濾過した後真空下に置いて抽出乾燥した結果、生成物14グラムを得た。収率は87.5%である。1H−NMR(200MHz,CDCl3 ),δ(ppm):2.5ppm(t,4H,−CH2 −COOH),3.2ppm(s,−OCH3 ),3.5ppm(s,−OCH2 CH2 O−)。13CNMR(200MHz,CDCl3 ),δ(ppm):30.7,39.5,39.7,69.8,206.5。IR:3453cm-1(−OH)。
3.4グラム(1ミリモル)のメトキシ−ポリエチレングリコールプロピオン酸をジクロロメタン20ミリリットル及びN−ハイドロキシサクシニミド(2.1ミリモル)に溶解し、氷浴下(0℃)で反応して、この溶液及び徐々に添加したジシクロヘキシルカルボジイミド(2.1ミリモル)をジクロロメタン4ミリリットル中に溶解した。反応終了後、溶液を室温下で振盪攪拌して終夜反応し、エチルエーテルで沈澱を進行して固体を析出した。それをろ過した後、真空下で抽出乾燥し、生成物3.3グラムを得た。収率は95%である。1H−NMR(400MHz,CDCl3 ),δ(ppm):2.81ppm(t,4H,−NH5 ),2.92ppm(t,4H,−CH2 −COO−),3.2ppm(s,−OCH3 ),3.5ppm(s,−OCH2 CH2 O−)。13CNMR(400MHz,CDCl3 ),δ(ppm):25.2,25.3,31.2,58.8,69.9,71.1,72.3,166.7,168.8,169.4。Anal.Calcd.(found)C16H29N3O9 (5122):C,55.23(54.42);H,9.1(9.17);N,19.43(19.25)。
ペプチド系列の調製(1):
ペプチド合成容器(PS3,Rainin Instrument Co.INC)を利用してペプチドを合成し、156ミリグラムのRink Amide樹脂(0.1ミリモル)を反応瓶中に置き、5ミリリットルのジメチルホルムアミドを注入して瓶底に集中させ、窒素ガスを設定して30分間攪拌した。各種毎のアミノ酸が0.4ミリモルとなる量を秤量し、これを11個アミノ酸小瓶に分けて置き、瓶外にそのアミノ酸の名称を標示した。各アミノ酸小瓶内には、更にそれぞれ同一当量のベンゾトリアゾール−1−イル−オキシ−トリス−ピロリジン−ホスホニウムヘキサ−フルオロホスファイト(PyBOP)208ミリグラム(0.4ミリモル)を添加した。小瓶をC端からN端の順序に従って回転板3ないし13の位置に置いた。その前立腺基質及び対照ペプチドの各アミノ酸配列とその重量を実行した。以下3ないし12に選用された保護基はいずれもFmocであり、そしてN終端のみBocを保護基とした。PS3のメーンメニュー系統に進み、1を選んでEDIT及びRUNに入り、合成パラメータをPRG03(単一カップリング、先ず保護基Fmocを除去する)に設定する。次に20%ヘキサヒドロピリジンを用いてN端保護基(DEP)を2回(5分間/1回)除去するように設定する。次にアミノ酸及びカップリング試剤NMMと溶解して活性化し、その混合時間は30秒、樹脂と各アミノ酸とのカップリング攪拌(AA)時間は2時間であり、RUNキーを押して合成を開始した。しかる後、各反応の終了後、一部の樹脂を取出してKaiser test分析テストを行い、ヒドラジン7.5μl及びフェノール10μlを添加して、110〜120℃の温度下で3分間反応し、もし黄色を呈すれば保護基が存在していることを表わす。反応が最後1個のアミノ酸小瓶(回転板13)に進行して合成が確定的に完了した時、PAUSEキーを2回押して反応をしばらく停止する。EXITを押してメーンメニュー(MAIN menu)まで戻し、2を選んで(MANUAL OPERATION)に進み、3を選んで(REACTION VESSEL CONTROL)に進入する。反応瓶を外し、アルコールで樹脂を洗浄してからジクロロメタンで再度洗浄し、それをろ過した後真空下で抽出乾燥した。
0.2ミリリットルのジアミドを10ミリリットルのジメチルホルムアミドに溶解して、その濃度を2%にさせると共に樹脂と3分間反応し、洗浄ステップを2回重複した。反応が終了した後、Kaiser test分析テストを行い、樹脂が青色を呈すれば保護が完全に除去されたことを表わすので再度樹脂を抽出器ろ過瓶下に置き、アルコールで洗浄した後、再度ジクロロメタンで洗浄し、それをろ過した後真空下において抽出乾燥した。
155.8ミリグラム(0.4ミリモル)のFITCを取って樹脂と反応し、1ミリリットルのジメチルスルホキシド及びジイソプロピルエチルアミンに溶解した後、室温下で24時間振盪攪拌した。反応終了後、Kaiser test分析テストを行い、樹脂が濃厚な黄色を呈すればFITCが接合していることを表わす。次にアルコール及びジクロロメタンで樹脂を洗浄し、それをろ過した後、真空下に置いて抽出乾燥した。
5ミリリットルの既に妥当に配置された切除試剤および脱保護基の溶剤トリフルオロ酢酸/水/エタンジサルファイド/トリエチルシリコン(94.5/2.5/2.5/1)を取り、0.1グラムの樹脂と2.5時間十分に振盪攪拌反応し、アルコールで樹脂を洗浄した後、それをろ過して濾液を収集した。しかる後、濾液を減圧真空濃縮機に置いて微乾するまで抽出した。次に、氷浴下でゆっくり氷エチルエーテルを滴下して沈澱を行い、遠心機で約5分間遠心を進行し回転速度を6000rpmまでに調整して固体及び液体に分離させ、以上のステップを重複してエチルエーテルで2回ないし5回洗浄した後、このエチルエーテルを抽出乾燥し、黄色固体、即ち前立腺ペプチド系列を得た。しかる後、真空下に置いて抽出乾燥し、129.4ミリグラムの生成物を得た。収率は83%である。
得られたペプチド系列を1ミリグラム取り、1ミリリットルのメチルアルコール中に溶解して高速液体クロマトグラフィー(HPLC)で純度鑑定を行い、既に配置されている前立腺ペプチド基質の移動相を溶離溶液とした。そのESI−MS(NH+ ):前立腺ペプチド基質は1563.66(calcd),1563.62(found)であり、対照ペプチドは1563.66(cacl),1563.64(found)である。
近赤外線蛍光色素プローブの合成はスキーム3に示す通りである。
50ミリグラム(3.4ミリモル)のポリ−L−リジン(PL)を12.5ミリリットルの炭酸水素ナトリウム(0.1M,pH8.0)に溶解し、ゆっくりMPEG−SPA397.5ミリグラム(79.5ミリモル)を添加して均等に混合した後、水酸化ナトリウムでそれをpH7.7までに調整して室温下で3時間振盪攪拌した。しかる後、YM−3の薄膜を利用して限外濾過(ultrafiltration)した後、上層液を取り出して冷凍乾燥(lyophilize)を行い、結果綿糸状のグラフト共重合体(PGC,50.8ミリグラム)を得た。そして、2,4,6−トリニトロベンゼンスルホン酸(TNBS)で遊離アミノ数を分析した。
7.5ミリグラムグラフト共重合体(PGC,0.1ミリモル)を0.2ミリリットル炭酸水素ナトリウム(50ミリモル濃度)に溶解し、過量のヨード酢酸無水物(26.3ミリグラム,10ミリモル)をジメチルホルムアミド0.1ミリリットル中に溶解して均等に混合した後ヨードアセチル作用を進行し、室温下で3時間反応して遠心後、YM−3の薄膜を利用して限外濾過を行った後上層液を取り、冷凍乾燥を行ったところ、綿糸状のヨードアセチル化保護グラフト共重合体(LA−PGC,7ミリグラム)を得た。そして、2,4,6−トリニトロベンゼンスルホン酸(TNBS)で分析を行い、測定結果が無色であるので遊離アミノ基の存在が無いことを示した。
ペプチド保護グラフト共重合体(peptide protected graft copolymer,P−PGC)の調製(3)
5ミリグラムのヨードアセチル化保護グラフト共重合体(LA−PGC)を取り、それにペプチド基質3.2ミリグラム(2ミリモル)及び対照ペプチド3.2ミリグラム(2ミリモル)を添加して、0.2ミリリットルのアセトニトリル及び0.2ミリリットルの酢酸ナトリウム(0.1M,pH6.5)緩衝溶液中に溶解し、3時間反応を行った。次にSephadex G−25(20cm×1cm)を利用して精製を行った。この時の溶離液は燐酸塩緩衝溶液(10mM,pH7.0)である。次に、分別収集器(tractional collector)を利用して、各試験管内に2ミリリットル収集された液体を収集し、UV/Visスペクトログラフで波長が494nm下の各試験管の吸収度を測定した。試験管数を横座標、吸収値を縦座標とした図を作り、第1個の吸収ピーク即ち大分子量のペプチド保護グラフト共重合体を得た。すべての液体を収集して冷凍乾燥を行った結果、針状のペプチド基質及び対照ペプチドの保護グラフト共重合体(57ミリグラム及び27.6ミリグラム)を得た。
0.5ミリグラムのペプチド保護グラフト共重合体(P−PGC)を0.2ミリリットルの50mM炭酸水素ナトリウムに溶解した後、1ミリグラムのCy5.5色素(1μmol)を添加して反応を進行し、均等に混合した後、室温下で1時間振盪攪拌して遠心した。遠心後、YM−3の薄膜を利用して限外濾過を行い、上層液を取って冷凍乾燥を行った結果、青色の固体プローブ(0.7ミリグラム)を得た。そして蛍光スペクトログラフでその激発及び放射波長範囲を測量した。
Claims (4)
- 前立腺プローブを調製し且つ光学映像系統を利用して体内に対して前立腺がんを診断する方法であって、
前立腺ペプチド基質及び対照ペプチド(control peptide)の合成と、前立腺ペプチド基質光学映像プローブ(Cy−prostate−PGC)及び前立腺対照ペプチドプローブの合成とを備えてなることを特徴とする方法。 - 前立腺ペプチド基質化合物を使用して、光学映像系統により体内の前立腺がんに対して診断を行うことを特徴とする前立腺がんプローブ。
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