CN108623658B - 一种检测人癌细胞的亲和肽及其应用 - Google Patents

一种检测人癌细胞的亲和肽及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测人癌细胞的亲和肽及其应用。本发明提供了一种多肽，为满足如下通式(a1)或(a2)的多肽：(a1)T‑S‑Q‑F‑X‑X‑X‑K‑V‑I‑L‑I‑R‑I‑S；(a2)T‑S‑Q‑F‑R‑T‑X‑K‑V‑I‑L‑I‑R‑I‑S；所述X为任意氨基酸残基。本发明还保护所述多肽与其他物质偶联获得的偶联物。本发明保护的多肽序列较短，易于实现大规模生产，并且对细胞无毒性，弥补了抗体等生物制剂制备繁琐、稳定性较差、造价昂贵、易引起免疫反应，穿透力弱等缺点，可作为人肝癌等癌的诊断试剂。

Description

一种检测人癌细胞的亲和肽及其应用
技术领域
本发明涉及一种检测人癌细胞的亲和肽及其应用。
背景技术
恶性肿瘤严重威胁着人类的健康。由于其发病机制尚未完全阐明，一直存在着早期诊断难、源头创新药物少和有效治疗手段缺乏等问题。恶性肿瘤的早期诊断和治疗可显著提高患者生存期和治愈率，但是现在通用的诊断方法具有技术繁复、误诊漏诊率高、耗时长等局限，因此早期诊断仍然是该领域亟待攻关的关键难题。如果能针对癌细胞所特有的生物标志物，发展快速灵敏的检测新方法，开发简单有效副作用小的癌症早期诊断工具，对癌症的早期诊断和术后转移预警具有重大意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测人癌细胞的亲和肽及其应用。
本发明提供了一种多肽，为满足如下通式(a1)或(a2)的多肽：
(a1)T-S-Q-F-X-X-X-K-V-I-L-I-R-I-S；
(a2)T-S-Q-F-R-T-X-K-V-I-L-I-R-I-S；
所述X为任意氨基酸残基。
所述多肽具体可为如下(b1)-(b8)中任一种：
(b1)由序列表的序列2所示的氨基酸残基组成；
(b2)由序列表的序列5所示的氨基酸残基组成；
(b3)由序列表的序列1所示的氨基酸残基组成；
(b4)由序列表的序列3所示的氨基酸残基组成；
(b5)由序列表的序列4所示的氨基酸残基组成；
(b6)由序列表的序列6所示的氨基酸残基组成；
(b7)由序列表的序列7所示的氨基酸残基组成；
(b8)由序列表的序列8所示的氨基酸残基组成。
本发明还保护以上任一所述多肽的应用，如下(c1)-(c7)中至少一种：
(c1)制备用于检测癌细胞的试剂盒；
(c2)制备用于检测LAPTM4B蛋白的试剂盒；
(c3)制备用于检测十五肽EL1的试剂盒；
(c4)制备用于诊断癌症的试剂盒；
(c5)检测人癌细胞；
(c6)检测LAPTM4B蛋白；
(c7)检测十五肽EL1。
本发明还保护以上任一所述多肽的应用，为如下(d1)-(d9)中至少一种：
(d1)作为靶向癌细胞的载体；
(d2)作为将功能成分靶向癌细胞的载体；
(d3)作为将药物靶向癌细胞的载体；
(d4)制备靶向癌细胞的载体；
(d5)制备将功能成分靶向癌细胞的载体；
(d6)制备将药物靶向癌细胞的载体；
(d7)制备治疗癌症的药物；
(d8)制备抑制癌细胞增殖的药物；
(d9)制备杀伤癌细胞的药物。
本发明还保护所述多肽与其他物质的偶联物。
具体来说，所述偶联物可为所述多肽与药物的偶联物。所述药物的功能为如下(1)和/或(2)和/或(3)和/或(4)和/或(5)：(1)抑制癌细胞增殖；(2)杀伤癌细胞；(3)抑制癌组织生长；(4)治疗癌症；(5)预防癌症。所述药物的功能为如下(6)和/或(7)：(6)抑制细胞增殖；(7)杀伤细胞。该偶联物中，所述多肽作为将所述药物靶向癌细胞或癌组织的载体。所述药物可为化合物或蛋白质。所述药物可为毒素、细胞因子、酶、凝集素等。
具体来说，所述偶联物可为所述多肽与标记基团的偶联物。该偶联物可作为检测探针，检测癌细胞。所述标记基团可为放射性元素、荧光基团、量子点、高吸光系数发色团等。所述荧光基团具体可为Cy7荧光基团。
所述多肽偶联物具体可为由以上任一所述的多肽与叠氮Cy7偶联获得的偶联物。
所述叠氮Cy7的结构式如式(I)所示。
Figure BDA0001247294610000021
所述偶联物的制备方法包括如下步骤：将末端带炔基的所述多肽和叠氮Cy7偶联，得到所述偶联物。所述偶联步骤具体包括如下步骤：将末端带炔基多肽、CuSO4和Cy7叠氮化物在溶液甲(将三乙胺加至由1体积份水和2体积份DMF组成的混合溶液中，使三乙胺的终浓度为1mL/100mL)中混合，氮气保护下加入抗坏血酸钠，室温避光搅拌反应1小时后，将反应产物用HPLC纯化，收集洗脱液，冻干后得到所述偶联物。
所述末端带炔基多肽、CuSO4、Cy7叠氮化物和抗坏血酸钠的摩尔浓度比为1∶1.2∶1.2∶2.4。
所述HPLC纯化的参数如下：色谱柱：Diamonsil C18(2)250×4.6mm；流动相由溶液A和B组成，溶液A为0.1％(体积百分含量)三氟乙酸水溶液，溶液B为0.1％(体积百分含量)三氟乙酸乙腈溶液；洗脱程序为：0min：10％溶液B；0min-20min：溶液B百分比从10％上升至80％；20min：80％溶液B；20min-20.01min：溶液B百分比从80％上升至100％；20.01min：100％溶液B；20.01min-24min：溶液B百分比保持100％不变；24min：100％溶液B；收集保留时间为9.10min出现的色谱峰对应的洗脱液。
所述末端带炔基的所述多肽的制备方法包括如下步骤：用FMOC固相多肽合成法在Wang树脂上直接合成末端带炔基的多肽。所述方法具体可为：由C端开始合成多肽序列，最后在N端连接炔丙基甘氨酸，然后脱去末端FMOC保护基，之后在强酸下将肽链从树脂上裂解，同时去除侧链保护基团。
所述叠氮Cy7的制备方法包括如下步骤：IR-780碘化物和3-叠氮基丙胺反应，得到叠氮Cy7。所述叠氮Cy7的制备方法包括如下步骤：将100mg IR-780碘化物和18mg3-叠氮基丙胺溶于15mL DMF中，在80℃加热16小时后，减压蒸馏除去溶剂，残余物通过硅胶柱色谱纯化(二氯甲烷/甲醇，20∶1，v/v)，得到47mg深蓝色固体，即为叠氮Cy7。
本发明还保护以上任一所述偶联物的应用，为如下(c1)-(c7)中至少一种：
(c1)制备用于检测癌细胞的试剂盒；
(c2)制备用于检测LAPTM4B蛋白的试剂盒；
(c3)制备用于检测十五肽EL1的试剂盒；
(c4)制备用于诊断癌症的试剂盒；
(c5)检测人癌细胞；
(c6)检测LAPTM4B蛋白；
(c7)检测十五肽EL1。
本发明还保护含有以上任一所述多肽的试剂盒；所述试剂盒的应用为如下(e1)-(e10)中至少一种：
(e1)检测癌细胞；
(e2)检测LAPTM4B蛋白；
(e3)检测十五肽EL1；
(e4)诊断癌症；
(e5)制备靶向癌细胞的载体；
(e6)制备将功能成分靶向癌细胞的载体；
(e7)制备将药物靶向癌细胞的载体；
(e8)制备治疗癌症的药物；
(e9)制备抑制癌细胞增殖的药物；
(e10)制备杀伤癌细胞的药物。
本发明还保护含有以上任一所述偶联物的试剂盒；所述试剂盒的应用为如下(f1)-(f4)中至少一种：
(f1)检测癌细胞；
(f2)检测LAPTM4B蛋白；
(f3)检测十五肽EL1；
(f4)诊断癌症。
以上任一所述癌症为以LAPTM4B蛋白为标志物的癌症。所述癌症具体可为人肝癌、人肺癌、人肝外胆管癌、人胆囊癌、人卵巢癌、人乳腺癌、人子宫癌、人宫颈癌、人膀胱癌、人前列腺癌或人结肠癌等癌症。
以上任一所述癌细胞具体可为人肝癌细胞、人肺癌细胞、人肝外胆管癌细胞、人胆囊癌细胞、人卵巢癌细胞、人乳腺癌细胞、人子宫癌细胞、人宫颈癌细胞、人膀胱癌细胞、人前列腺癌细胞或人结肠癌等癌细胞。
所述人肝癌细胞具体可为HepG2细胞。
以上任一所述十五肽EL1由序列表的序列9所示的氨基酸残基组成。
本发明中的多肽可以采用现有技术中的公知方法获得，既可以利用固相肽合成方法(BOC方法或FMOC方法)手工合成，也可以利用多肽自动合成仪进行合成，亦可克隆到表达载体中生物合成。
多肽既是蛋白质的重要组成部分，也是重要的生理活性物质，参与并调控着生物体内许多重要的生理、生化功能。相比于抗体等常用的生物试剂，多肽具有制备简单，分子量小，稳定性高，靶向穿透能力强等优点。因此，以活性多肽为工具，发展新的肿瘤早期分析检测方法和技术，有可能为有效肿瘤筛查和治疗提供新的思路和手段。
溶酶体四次穿膜蛋白LAPTM4B是由hLAPTM4B基因表达的一个35kD的4次跨膜蛋白质，其具有两个胞外区。LAPTM4B蛋白第1、第2穿膜区之间的第一胞外区含有亲水性好的十五肽序列EL1(N端139-153aa)。EL1可作为检测人肝癌等癌的靶点。
本发明的多肽及多肽偶联物除了能特异性地结合于人肝癌等癌细胞表面的LAPTM4B蛋白外，还能够进入人肝癌等癌细胞，特异性地结合于细胞内的LAPTM4B蛋白，可作为人肝癌等癌的诊断试剂。
本发明的多肽序列较短，易于实现大规模生产，并且对细胞无毒性，弥补了抗体等生物制剂制备繁琐、稳定性较差、造价昂贵、易引起免疫反应，穿透力弱等缺点，可作为人肝癌等癌的诊断试剂。
附图说明
图1为探针EL1-TPE的化学结构示意图。
图2为八条多肽与EL1-TPE结合相对荧光强度统计结果。
图3为AP2、AP5及其他多肽、蛋白与EL1-TPE结合荧光强度统计结果。
图4为叠氮Cy7的结构式以及质谱鉴定结果。
图5为AP2-Cy7、AP5-Cy7与人肝癌细胞系HepG2和人胚肾细胞系HEK293结合荧光观察及统计结果。
图6为AP2、AP5的MTT实验统计结果。
图7为AP2-Cy7、AP5-Cy7与细胞核染料DAPI亚细胞共定位的实验结果。
图8为AP2-Cy7、AP5-Cy7与溶酶体染料LysoTracker亚细胞共定位的实验结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂公司购买得到。以下实施例中的定量实验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
亮氨酸脑啡肽(leu-enkephalin)：Advanced ChemTech，货号：PP4558。
促甲状腺素释放激素(TRH)：Advanced ChemTech，货号：PP5128。
甲硫氨酸脑啡肽(Met-enkephalin)：Advanced ChemTech，货号：PP4650。
血管紧张素II(Angiotensin II)：Advanced ChemTech，货号：PP3797。
加压素([Arg 8]-Vasopressin)：Advanced ChemTech，货号：PP3154。
还原型谷胱甘肽(Glutathione)：上海化学试剂采购供应站试剂厂。
胆红素(Bilirubin)：Sigma Aldrich，货号：B4126。
L-甲状腺素(L-thyroxine)：中国科学院上海生物化学研究所。
胰岛素(Insulin)：Sigma Aldrich，货号：I2767。
免疫球蛋白G(IgG)：中科晨宇，货号：161001。
胰蛋白酶(Trypsin)：Sigma Aldrich，货号：T8003。
IR-780碘化物(Cy7)的CAS号为：207399-07-3，结构式如下：
Figure BDA0001247294610000061
3-叠氮基丙胺的CAS号为：88192-19-2，结构式如下：
Figure BDA0001247294610000062
实施例1、检测人癌细胞的亲和肽
一、亲和肽的设计
经过大量预实验和功能验证，设计了特异结合“人肝癌等癌细胞LAPTM4B蛋白第一胞外区中十五肽(简称EL1)”的一组功能多肽，分别命名为AP1、AP2、AP3、AP4、AP5、AP6、AP7和AP8，EL1和8个功能多肽的序列见表1。
其中各字母代表氨基酸如下：丙氨酸A、天冬氨酸D、脯氨酸P、谷氨酰胺Q、酪氨酸Y、天冬酰胺N、苯丙氨酸F、丝氨酸S、谷氨酸E、亮氨酸L、甘氨酸G、异亮氨酸I、精氨酸R、缬氨酸V、赖氨酸K、苏氨酸T。
表1.EL1序列和多肽序列
Figure BDA0001247294610000063
Figure BDA0001247294610000071
二、多肽筛选荧光探针的制备
用FMOC固相多肽合成法在Wang树脂上由C端开始合成多肽筛选探针(简称EL1-TPE)，具体方法为：将多肽EL1的氨基酸逐个偶联到固相树脂上，最后在N端连接具有羧基侧链的荧光打开型分子TPE，然后在强酸下将肽链从树脂上裂解，同时去除侧链保护基团(方法参照参考文献：Y.Ding，L.Shi，H.Wei.A“turn On”Fluorescent Probe for Heparin andIts Oversulfated Chondroitin Sulfate Contaminant.Chem.Sci.，2015，6：6361-6366.)。
TPE可通过购买得到也按照参考文献：S.Gui，Y.Huang，F.Hu，Y.Jin，G.Zhang，L.Yan，D.Zhang，R.Zhao.Fluorescence Turn-On Chemosensor for Highly Selectiveand Sensitive Detection and Bioimaging of Al3+in Living Cells Based on Ion-Induced Aggregation.Analytical Chemistry，2015，87：1470-1474.中的方法合成。
TPE的结构式如下：
Figure BDA0001247294610000072
EL1-TPE的化学结构示意图如图1所示。
有实例说明，TPE与多肽偶联之后构成的荧光探针，在多肽与其他分子发生相互作用时呈现荧光打开的特性(Y.Hong，J.Lam，B.Tang.Aggregation-induced Emission：Phenomenon，Mechanism and Applications.Chem.Commun.，2009，(29)：4332-4353)。利用该特性，可以通过探针的荧光强度来考察8条多肽与EL1之间特异性相互作用的强弱。
三、亲和肽的筛选
功能多肽为：AP1、AP2、AP3、AP4、AP5、AP6、AP7或AP8。
1、分别采用溶液1-5作为体系，将EL1-TPE与功能多肽共同孵育20min(EL1-TPE在体系中的浓度为1.0×10-5mol/L，功能多肽在体系中的浓度为2.0×10-5mol/L)，然后使用荧光仪对各溶液进行荧光扫描并记录激发波长为330nm的荧光发射谱图，取波长470nm的荧光强度数据进行对比。
溶液1：10mmol/L磷酸盐缓冲液+50mmol/L NaCl(pH6.0)；
溶液2：10mmol/L磷酸盐缓冲液+50mmol/L NaCl(pH6.5)；
溶液3：10mmol/L磷酸盐缓冲液+50mmol/L NaCl(pH7.0)；
溶液4：10mmol/L磷酸盐缓冲液+50mmol/LNaCl(pH7.4)；
溶液5：10mmol/L磷酸盐缓冲液+50mmol/L NaCl(pH8.0)。
荧光仪(Hitachi F-4600)：激发波长为330nm，发射波长记录340nm至650nm。
结果如图2所示。结果表明，AP1、AP2、AP3、AP4、AP5、AP6、AP7和AP8这八条多肽与EL1的结合能力不同，pH 6.5和pH 7.4条件下AP2多肽，以及pH 7.0条件下AP5多肽对EL1的靶向结合较强。
2、采用步骤1中的溶液4作为体系，将EL1-TPE与待测物质共同孵育20min(EL1-TPE在体系中的浓度为1.0×10-5mol/L)，然后使用荧光仪(Hitachi F-4600)对各溶液进行荧光扫描并记录激发波长为330nm的荧光发射谱图，取波长470nm的荧光强度数据进行对比。
待测物质及其在体系中的浓度分别如下：
(1)多肽AP2，在体系中的浓度为2.0×10-5mol/L；
(2)多肽AP5，在体系中的浓度为2.0×10-5mol/L；
(3)亮氨酸脑啡肽(leu-enkephalin)，在体系中的浓度为2.0×10-5mol/L；
(4)促甲状腺素释放激素(TRH)，在体系中的浓度为2.0×10-5mol/L；
(5)甲硫氨酸脑啡肽(Met-enkephalin)，在体系中的浓度为2.0×10-5mol/L；
(6)血管紧张素II(Angiotensin II)，在体系中的浓度为2.0×10-5mol/L；
(7)加压素([Arg 8]-Vasopressin)，在体系中的浓度为2.0×10-5mol/L；
(8)还原型谷胱甘肽(Glutathione)，在体系中的浓度为2.0×10-5mol/L；
(9)胆红素(Bilirubin)，在体系中的浓度为2.0×10-5mol/L；
(10)L-甲状腺素(L-thyroxine)，在体系中的浓度为2.0×10-5mol/L；
(11)胰岛素(Insulin)，在体系中的浓度为2.0×10-5mol/L；
(12)免疫球蛋白G(IgG)，在体系中的浓度为2.0×10-5mol/L；
(13)胰蛋白酶(Trypsin)，在体系中的浓度为2.0×10-5mol/L；
(14)编号(3)-(13)的混合物，每种在体系中的浓度为2.0×10-5mol/L。
将EL1-TPE在步骤1的溶液4中(EL1-TPE在体系中的浓度为1.0×10-5mol/L)孵育20min，作为空白对照(blank)。
结果如图3所示。结果表明，除多肽AP2和多肽AP5外，其余多肽或蛋白与EL1无特异性结合，荧光信号弱于多肽AP2和多肽AP5，数值接近空白样品。
3、将EL1-TPE与功能多肽孵育20min(体系为步骤1的溶液4)，然后用酶标仪(Enspire Multimode Plate Reader)对溶液进行快速扫描，激发波长为330nm，记录发射波长470nm的荧光强度数据。并用sigmaPlot软件计算平衡解离常数KD，记录在表2中。
EL1-TPE在体系中的浓度为1.0×10-5mol/L。
功能多肽在体系中的浓度为2.00×10-6mol/L，5.00×10-6mol/L，1.00×10-5mol/L，1.50×10-5mol/L，2.00×10-5mol/L，3.00×10-5mol/L，4.00×10-5mol/L或5.00×10- 5mol/L。
结果表明，多肽AP2和多肽AP5的KD最低。通过与靶标EL1亲和力的定量考察，选择AP2和AP5作为最佳亲和多肽。
表2.八条多肽与EL1-TPE荧光探针的相互作用平衡解离常数值
Figure BDA0001247294610000091
实施例2、亲和肽在检测人癌细胞中的应用
一、AP2-Cy7和AP5-Cy7偶联物的制备
1、将100mgIR-780碘化物和18mg3-叠氮基丙胺溶于15mL DMF中，80℃反应16小时，减压蒸馏除去溶剂，残余物通过硅胶柱色谱纯化(二氯甲烷/甲醇，20∶1，v/v)，得到47mg深蓝色固体，即为叠氮Cy7。叠氮Cy7的结构式以及质谱鉴定结果见图4。
2、用FMOC固相多肽合成法在Wang树脂上直接合成末端带炔基的多肽AP2和AP5。具体方法为：由C端开始合成多肽序列，最后在N端连接炔丙基甘氨酸，经Kaiser试剂检测反应完全后脱去末端FMOC保护基，然后在强酸下将肽链从树脂上裂解，同时去除侧链保护基团。
3、将步骤2制备的末端带炔基的多肽AP2、CuSO4和步骤1制备的叠氮Cy7在溶液甲中混合，然后氮气保护下加入抗坏血酸钠，得到初始体系(体系中，多肽AP2的浓度为0.29mM，CuSO4的浓度为0.35mM，叠氮Cy7的浓度为0.35mM，抗坏血酸钠的浓度为0.70mM)，室温避光搅拌反应1小时后，分析反应混合物并用HPLC纯化，收集洗脱液，冻干后得到蓝色固体，即为AP2-Cy7。
溶液甲：将三乙胺加至由1体积份水和2体积份DMF组成的混合溶液中，使三乙胺的终浓度为1mL/100mL。
所述HPLC纯化的参数如下：色谱柱：Diamonsil C18(2)250×4.6mm；流动相由溶液A和B组成，溶液A为0.1％(体积百分含量)三氟乙酸水溶液，溶液B为0.1％(体积百分含量)三氟乙酸乙腈溶液；洗脱程序为：0min：10％溶液B；0min-20min：溶液B百分比从10％线性上升至80％；20min：80％溶液B；20min-20.01min：溶液B百分比从80％线性上升至100％；20.01min：100％溶液B；20.01min-24min：溶液B百分比保持100％不变；24min：100％溶液B；收集保留时间为9.10min的色谱峰对应的洗脱液。
4、采用步骤2制备的多肽AP5替代多肽AP2，按照步骤3进行操作，得到AP5-Cy7。
由于荧光分子Cy7的最强发射波长大于700nm，组织穿透性较强，所以AP2-Cy7和AP5-Cy7偶联物适用于生物活体检测和成像。
二、AP2和AP5与人肝癌细胞系HepG2特异性结合
1、将人胚肾细胞系HEK293细胞和人肝癌细胞系HepG2细胞分别用DMEM培养基(含有10mL/100mL FBS、100U/mL青霉素和100U/mL链霉素)培养，以约1×105个/mL的浓度将细胞植入圆形玻底培养皿(Φ＝35mm)，在37℃，5％CO2条件下培养过夜。
2、完成步骤1后，取所述培养皿，进行如下分组操作：
组I：弃去培养液，加入含有2.5×10-5mol/L AP2-Cy7的DMEM培养液(含有0.5mL/100mL DMSO)，37℃避光孵育1小时后，弃去培养液，用PBS清洗3次。
组II：弃去培养液，加入含有2.5×10-5mol/L AP5-Cy7的DMEM培养液(含有0.5mL/100mL DMSO)，37℃避光孵育1小时后，弃去培养液，用PBS清洗3次。
组III：弃去培养液，加入含有2.5×10-5mol/L多肽AP2的DMEM培养液(含有0.5mL/100mL DMSO)，37℃避光孵育1小时后，弃去培养液，用PBS清洗3次，再加入含有2.5×10- 5mol/L AP2-Cy7的DMEM培养液(含有0.5mL/100mL DMSO)，37℃避光孵育1小时后，弃去培养液，用PBS清洗3次。
组IV：弃去培养液，加入含有2.5×10-5mol/L多肽AP5的DMEM培养液(含有0.5mL/100mL DMSO)，37℃避光孵育1小时后，弃去培养液，用PBS清洗3次，再加入含有2.5×10- 5mol/L AP5-Cy7的DMEM培养液(含有0.5mL/100mL DMSO)，37℃避光孵育1小时后，弃去培养液，用PBS清洗3次。
3、用激光扫描共聚焦显微镜(Olympus FV1000-IX81，日本)检测细胞中的荧光分布。
结果如图5所示。加入AP2-Cy7或AP5-Cy7的HepG2细胞对比HEK293细胞，有明显的红色荧光信号(图5a-图5d)，说明AP2-Cy7和AP5-Cy7偶联物与人肝癌细胞HepG2具有专一性的识别。为了验证AP2和AP5的靶向识别，进行竞争性结合测定。在用AP2-Cy7和AP5-Cy7处理之前，HepG2细胞与多肽AP2或AP5预孵育60分钟，HepG2细胞内几乎观察不到荧光(图5e和5f)。这种现象最有可能是由于AP2和AP5对LAPTM4B蛋白上的EL1位点的结合，阻断了来自AP2-Cy7和AP5-Cy7的结合。亲和肽和Cy7标记的亲和肽之间的这种竞争性关系验证了AP2和AP5对HepG2细胞中EL1位点的识别。
三、AP2和AP5对人细胞的毒性
1、将人胚肾细胞系HEK293细胞和人肝癌细胞系HepG2细胞分别用DMEM培养基(含有10mL/100mL FBS、100U/mL青霉素和100U/mL链霉素)培养，以约5000个/mL的浓度将细胞植入96孔板，在37℃，5％CO2条件下培养过夜。
2、完成步骤1后，弃去培养液，加入不同浓度的多肽AP2或AP5(2.5×10-5mol/L，5.0×10-5mol/L，和1.0×10-4mol/L)，对照组加入空白培养液，继续在37℃，5％CO2条件下培养48小时。
3、完成步骤2后，小心吸去孔中培养液，每孔加100微升新配置的MTT溶液(0.5mg/mL，用新鲜DMEM配置)，孵育4小时后，移去MTT溶液，每孔加入150微升DMSO，摇晃混匀10min，用酶标仪检测490nm吸光度。计算公式为：细胞存活率＝A/A0×100％，其中A为实验组吸光度值，A0为空白组吸光度值。
结果如图6所示。图6中，横坐标为多肽浓度，纵坐标为细胞存活率。多肽AP2和AP5对人正常细胞HEK293和人肝癌细胞HepG2均无毒性。以该多肽作为人癌细胞的靶向“弹头”对人体几乎无害。
四、亲和肽荧光探针在人肝癌细胞中的亚细胞结构定位
1、将人肝癌细胞系HepG2细胞培养于含100mL/L胎牛血清的DMEM培养基中，以约1×105个/mL的浓度将细胞植入圆形玻底培养皿(Φ＝35mm)，在37℃，5％CO2条件下培养过夜。
2、完成步骤1后，弃去培养液，加入溶解有AP2-Cy7或AP5-Cy7(2.5×10-5mol/L)的DMEM培养液中(含有0.5mL/100mL DMSO)，37℃避光孵育1小时。
3、完成步骤2后，弃去溶液，用PBS清洗3次，加入200微升细胞核染料DAPI溶液避光孵育10分钟后，弃去溶液，用PBS清洗后用激光扫描共聚焦显微镜检测细胞中的荧光分布。
4、完成步骤2后，弃去溶液，用PBS清洗后，加入200微升溶酶体染料LysoTrackerGreen DND-26(LysoTracker)溶液避光孵育30分钟后，弃去溶液，用PBS清洗后用激光扫描共聚焦显微镜检测细胞中的荧光分布。
结果如图7所示。两种多肽荧光探针与细胞核染料DAPI共定位的实验结果表明，红色荧光围绕着呈蓝色荧光的细胞核，荧光信号的这种分布表明AP2-Cy7和AP5-Cy7可以内化到HepG2细胞中并在细胞质中积累，但不存在于细胞核中。为了考察多肽荧光探针的确切亚细胞定位，用溶酶体染料(LysoTracker)与AP2-Cy7或AP5-Cy7染色的HepG2细胞进一步染色，结果如图8所示。从图8的共聚焦结果来看，来自AP2-Cy7或AP5-Cy7的红色荧光与来自LysoTracker的绿色信号良好地重叠，清楚地表明AP2-Cy7或AP5-Cy7内化后在溶酶体中积累。LAPTM4B蛋白主要位于溶酶体中。因此，AP2和AP5在溶酶体中的积累可能由靶蛋白LAPTM4B介导。
综上所述，AP2和AP5通过识别膜定位的LAPTM4B蛋白结合HepG2细胞，结合的AP2和AP5作为货物运输，随LAPTM4B蛋白从膜到溶酶体的细胞内运动而进入细胞。AP2与AP5可用于组织化学和细胞化学鉴定组织或细胞中LAPTM4B蛋白的表达水平，具有诊断肿瘤和评价术后转移程度的应用价值。在癌细胞靶向药物递送和癌症治疗方面也有其潜在应用价值。
<110> 中国科学院化学研究所
<120> 一种检测人癌细胞的亲和肽及其应用
<160> 9
<210> 1
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 1
Thr Ser Gln Phe Gly Gly Gly Lys Val Ile Leu Ile Arg Ile Ser
1 5 10 15
<210> 2
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 2
Thr Ser Gln Phe Arg Arg Arg Lys Val Ile Leu Ile Arg Ile Ser
1 5 10 15
<210> 3
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 3
Thr Ser Gln Phe Ala Ala Ala Lys Val Ile Leu Ile Arg Ile Ser
1 5 10 15
<210> 4
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 4
Thr Ser Gln Phe Thr Thr Thr Lys Val Ile Leu Ile Arg Ile Ser
1 5 10 15
<210> 5
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 5
Thr Ser Gln Phe Arg Thr Gly Lys Val Ile Leu Ile Arg Ile Ser
1 5 10 15
<210> 6
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 6
Thr Ser Gln Phe Arg Thr Arg Lys Val Ile Leu Ile Arg Ile Ser
1 5 10 15
<210> 7
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 7
Thr Ser Gln Phe Arg Thr Ala Lys Val Ile Leu Ile Arg Ile Ser
1 5 10 15
<210> 8
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 8
Thr Ser Gln Phe Arg Thr Thr Lys Val Ile Leu Ile Arg Ile Ser
1 5 10 15
<210> 9
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 9
Ala Asp Pro Asp Gln Tyr Asn Phe Ser Ser Ser Glu Leu Gly Gly
1 5 10 15

Claims (7)

1.一种多肽，为如下（b1）或（b2）：
（b1）由序列表的序列2所示的氨基酸残基组成；
（b2）由序列表的序列5所示的氨基酸残基组成。
2.权利要求1所述多肽的应用，为如下（c1）-（c4）中至少一种：
（c1）制备用于检测癌细胞的试剂盒；
（c2）制备用于检测LAPTM4B蛋白的试剂盒；
（c3）制备用于检测十五肽EL1的试剂盒；
（c4）制备用于诊断癌症的试剂盒；
所述十五肽EL1由序列表的序列9所示的氨基酸残基组成。
3.权利要求1所述多肽的应用，为如下（d1）-（d3）中至少一种：
（d1）制备靶向癌细胞的载体；
（d2）制备将功能成分靶向癌细胞的载体；
（d3）制备将药物靶向癌细胞的载体。
4.权利要求1所述的多肽与其他物质偶联获得的偶联物；所述其他物质为Cy7荧光基团。
5.权利要求4所述的偶联物的应用，为如下（c1）-（c4）中至少一种：
（c1）制备用于检测癌细胞的试剂盒；
（c2）制备用于检测LAPTM4B蛋白的试剂盒；
（c3）制备用于检测十五肽EL1的试剂盒；
（c4）制备用于诊断癌症的试剂盒；
所述十五肽EL1由序列表的序列9所示的氨基酸残基组成。
6.含有权利要求1所述多肽的试剂盒；所述试剂盒的应用为如下（e1）-（e7）中至少一种：
（e1）检测癌细胞；
（e2）检测LAPTM4B蛋白；
（e3）检测十五肽EL1；
（e4）诊断癌症；
（e5）制备靶向癌细胞的载体；
（e6）制备将功能成分靶向癌细胞的载体；
（e7）制备将药物靶向癌细胞的载体；
所述十五肽EL1由序列表的序列9所示的氨基酸残基组成。
7.含有权利要求4所述的偶联物的试剂盒；所述试剂盒的应用为如下（f1）-（f4）中至少一种：
（f1）检测癌细胞；
（f2）检测LAPTM4B蛋白；
（f3）检测十五肽EL1；
（f4）诊断癌症；
所述十五肽EL1由序列表的序列9所示的氨基酸残基组成。
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101781357A (zh) * 2009-01-21 2010-07-21 中国科学院化学研究所 检测人癌细胞的多肽及其应用
CN106334194A (zh) * 2015-07-14 2017-01-18 中国科学院化学研究所 缀合物及其制备方法和用途

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101781357A (zh) * 2009-01-21 2010-07-21 中国科学院化学研究所 检测人癌细胞的多肽及其应用
CN106334194A (zh) * 2015-07-14 2017-01-18 中国科学院化学研究所 缀合物及其制备方法和用途

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Rapid,sensitive,and in-solution screening of peptide probes for targeted imaging of live cancer cells based on peptide recognition-induced emission;Jiayuan He等;《Chemical Communications》;20170919(第80期);第11091-11094页 *
Tetraphenylethylene Conjugated With a Specific Peptide as a Fluorescence Turn-On Bioprobe for the Highly Specific Detection and Tracing of Tumor Markers in Live Cancer Cells;Yanyan Huang等;《Chemistry》;20140103;第20卷(第1期);第158-164页 *
基于靶向多肽探针的蛋白质分析检测新方法;黄嫣嫣等;《分析测试学报》;20120930;第31卷(第9期);第1184-1190页 *

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