JP6274632B2 - メチル化dnaを蛍光標識する方法 - Google Patents
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- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/536—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase
Description
標識対象であるメチル化DNAとプローブまたはその塩とを反応させることにより、前記メチル化DNAを蛍光標識することを含み、
前記プローブは、融合タンパク質と化合物とを反応させて得られ、
前記融合タンパク質は、PYP(Photoactive Yellow Protein)またはPYP変異体と、MBD(Methyl CpG-binding domain)またはMBD由来タンパク質とを含む融合タンパク質であり、
前記化合物は、下記式(I)で表される化合物である。
Zは、下記式(i)〜(x)から選択され、
m1は、4〜6の整数であり、
前記式(vi)〜(x)中、
m2は、1または2の整数であり、
前記式(i)〜(x)中、Yは、下記式(xxxi)〜(xxxviii)から選択され、
n4は、0または1の整数であり、
前記式(xxxviii)中、
n5は、1〜3の整数であり、
R11は、水素原子または塩素原子であり。
R12は、−CH3、または−(CH2)3SCOCH3であり、
R13は、−O−、−S−または−Se−であり、
Xは、下記式(xxi)〜(xxviii)から選択され、
nは、1〜6の整数であり、
m3は、1または2の整数であり、
R1〜R5は、同一であっても異なっていてもよく、R1〜R5の1つ以上が、−NO2、−COOH、または−CO−O−CH2−O−(C=O)−CH3であり、残りが水素原子である。
標識対象であるメチル化DNAとプローブまたはその塩とを反応させることにより、前記メチル化DNAを蛍光標識することを含み、
前記プローブは、融合タンパク質と化合物とを反応させて得られ、
前記融合タンパク質は、PYP(Photoactive Yellow Protein)またはPYP変異体と、MBD(Methyl CpG-binding domain)またはMBD由来タンパク質とを含む融合タンパク質であり、
前記化合物は、DNA結合色素部分を含み、前記DNA結合色素部分は、前記MBDまたはMBD由来タンパク質部分がメチル化DNAと結合した場合前記DNA結合色素部分がメチル化DNAと結合することにより蛍光を発する化合物である、
メチル化DNAの蛍光標識方法である。
Zは、前記式(i)〜(x)から選択され、
前記式(i)〜(v)中、
m1は、4〜6の整数であり、
前記式(vi)〜(x)中、
m2は、1または2の整数であり、
前記式(i)〜(x)中、Yは、前記式(xxxi)〜(xxxviii)から選択され、
前記式(xxxvi)中、
n4は、0または1の整数であり、
前記式(xxxviii)中、
n5は、1〜3の整数であり、
R11は、水素原子または塩素原子であり。
R12は、−CH3、または−(CH2)3SCOCH3であり、
R13は、−O−、−S−または−Se−であり、
Xは、前記式(xxi)〜(xxviii)から選択され、
nは、1〜6の整数であり、
前記式(xxi)〜(xxviii)中、
m3は、1または2の整数であり、
R1〜R5は、同一であっても異なっていてもよく、R1〜R5の1つ以上が、−NO2、−COOH、または−CO−O−CH2−O−(C=O)−CH3であり、残りが水素原子である。
1)配列表の配列番号2〜7で表されるアミノ酸配列、
2)配列表の配列番号1で表されるアミノ酸配列において、第1番目から第24番目、第1番目から第25番目、第1番目から第26番目、または、第1番目から第27番目のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、
3)上記1)または2)のアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸配列の1〜数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列であって、前記融合タンパク質の前記PYPまたはPYP変異体は、前記式(I)で表される化合物と反応して、式(I)で表される化合物から基Xが脱離した残基と結合するアミノ酸配列、及び、
4)上記1)または2)のアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸配列と70%以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、前記融合タンパク質の前記PYPまたはPYP変異体は、前記式(I)で表される化合物と反応して、式(I)で表される化合物から基Xが脱離した残基と結合するアミノ酸配列であるのが好ましい。
1)配列表の配列番号8または9で表されるアミノ酸配列、
2)上記1)のアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸配列の1〜数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列であって、前記融合タンパク質の前記MBDまたはMBD由来タンパク質は、メチル化DNAと結合するアミノ酸配列、及び、
3)上記1)のアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸配列と70%以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、前記融合タンパク質の前記MBDまたはMBD由来タンパク質は、メチル化DNAと結合するアミノ酸配列であるのが好ましい。
前記プラスミドまたはベクターは、PYP(Photoactive Yellow Protein)またはPYP変異体と、MBD(Methyl CpG-binding domain)またはMBD由来タンパク質とを含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドをクローニングするため又は前記融合タンパク質を発現させるためのプラスミド又はベクターである。
好ましくは、前記プラスミドまたはベクターは、
PYP(Photoactive Yellow Protein)またはPYP変異体と、MBD(Methyl CpG-binding domain)またはMBD由来タンパク質とを、リンカー(グリシン、セリン等のアミノ酸0〜30個から構成されたペプチド)で結合された融合タンパク質であり、
前記プラスミドまたはベクターは、
1)配列表の配列番号19〜29で表される塩基配列、
2)配列表の配列番号19〜29で表される塩基配列において、第1番目から第72番目、第1番目から第75番目、第1番目から第78番目、または、第1番目から第81番目の塩基が欠失した塩基配列、
3)上記1)または2)の塩基配列のいずれかの塩基配列の1〜数個の塩基が欠失、置換、又は付加された塩基配列であって、前記融合タンパク質の前記PYPまたはPYP変異体は、前記式(I)で表される化合物と反応して、式(I)で表される化合物から基Xが脱離した残基と結合し、かつ、前記融合タンパク質の前記MBDまたはMBD由来タンパク質は、メチル化DNAと結合する塩基配列、及び、
4)上記1)または2)の塩基配列のいずれかの塩基配列と70%以上の相同性を有する塩基配列であって、前記融合タンパク質の前記PYPまたはPYP変異体は、前記式(I)で表される化合物と反応して、式(I)で表される化合物から基Xが脱離した残基と結合、かつ、前記融合タンパク質の前記MBDまたはMBD由来タンパク質は、メチル化DNAと結合する塩基配列からなる群から選択される塩基配列を含むプラスミドまたはベクターである。
式(I)の化合物は、Zが、前記式(i)で表されるのが好ましい。
Zは、下記式(i)〜(x)から選択され、
m1は、4〜6の整数であり、
前記式(vi)〜(x)中、
m2は、1または2の整数であり、
前記式(i)〜(x)中、Yは、下記式(xxxi)〜(xxxviii)から選択され、
n4は、0または1の整数であり、
前記式(xxxviii)中、
n5は、1〜3の整数であり、
R11は、水素原子または塩素原子であり。
R12は、−CH3、または−(CH2)3SCOCH3であり、
R13は、−O−、−S−または−Se−であり、
Xは、下記式(xxi)〜(xxviii)から選択され、
nは、1〜6の整数であり、
m3は、1または2の整数であり、
R1〜R5は、同一であっても異なっていてもよく、R1〜R5の1つ以上が、−NO2、−COOH、または−CO−O−CH2−O−(C=O)−CH3であり、残りが水素原子である。
標識対象であるメチル化DNAとプローブまたはその塩とを反応させることにより、前記メチル化DNAを蛍光標識することを含み、
前記プローブは、融合タンパク質と化合物とを反応させて得られ、
前記融合タンパク質は、PYP(Photoactive Yellow Protein)またはPYP変異体と、MBD(Methyl CpG-binding domain)またはMBD由来タンパク質とを含む融合タンパク質であり、
前記化合物は、DNA結合色素部分を含み、前記DNA結合色素部分は、前記MBDまたはMBD由来タンパク質部分がメチル化DNAと結合した場合前記DNA結合色素部分がメチル化DNAと結合することにより蛍光を発する化合物である、
メチル化DNAの蛍光標識方法である。
本明細書の記載において、以下の略語を使用する。
HOBt:1−ヒドロキシベンゾトリアゾール
DMF:ジメチルホルムアミド
NBS:N−ブロモスクシンイミド
AIBN:アゾビスブチロニトリル
TsCl:トルエンスルホニルクロライド
Boc:t−ブトキシカルボニル
HBTU:O−(ベンゾトリアゾール−1−イル)−N,N,N’,N’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート
DMAP:N,N−ジメチルアミノピリジン
PyBOP:ヘキサフルオロリン酸(ベンゾトリアゾール−1−イルオキシ)トリピロリジノホスホニウム
HPLC:高速液体クロマトグラフィー
化合物は、入手できる最も高いグレードのものであり、東京化成工業株式会社、和光純薬工業株式会社、およびシグマ−アルドリッチジャパン株式会社から購入して、さらなる精製を行わずに用いた。
下記化合物YOCNBを下記スキームに従い製造した。
MS (ESI+) [M+H]+計算値 393.16、測定値 393.02
MS (ESI+)[M+Na]+計算値286.14、測定値 286.07
13C NMR (100 MHz, CDCl3)δ 28.2, 40.2, 61.3, 70.0, 70.2, 70.3, 78.9, 156.0
HRMS (Fab+)[M+H]+計算値 338.2173、測定値 338.2178
13C NMR (100 MHz, CDCl3)δ28.3, 40.2, 60.0, 70.1, 70.5, 70.6, 72.3, 94.3, 113.9, 116.6, 116.8, 133.0, 138.7, 156.0, 156.6
HRMS (Fab+)[M+H]+計算値 566.1959、測定値 566.1966
13C NMR (100 MHz, CDCl3)δ28.4, 40.3, 51.6, 56.1, 69.9, 70.2, 70.5, 70.8, 79.1, 94.1, 115.6, 116.7, 117.5, 126.8, 128.2, 139.1, 141.2, 156.0, 158.6, 167.5
HRMS (Fab+) [M+H]+計算値 572.3065、測定値 572.3065
[M+Na]+計算値 594.2885、測定値 594.2885
13C NMR (100 MHz, ACETN- d6)δ 28.6, 41.0, 43.1, 43.3, 56.2, 70.6, 70.7, 70.8, 71.2, 71.3, 71.5, 78.5, 94.8, 116.5, 117.9, 124.1, 124.2, 127.1, 129.0, 129.5, 130.9, 135.5, 138.5, 139.1, 141.5, 147.9, 148.5, 156.6, 160.0, 170.9, 187.6
HRMS (Fab+) [M+Na]+計算値 864.3348、測定値 864.3370
HRMS (EI+)m/z :[M]+計算値 165.025、測定値 165.025
MS (ESI+)[M]+計算値 180.05、測定値 180.37
13C NMR (100 MHz, DMSO-d6)δ24.0, 25.4, 28.5, 30.4, 33.7, 38.9, 53.7, 73.8, 109.0, 110.6, 110.8, 117.9, 123.4, 124.2, 125.9, 126.1, 126.4, 131.3, 133.3, 137.1, 143.6, 146.0, 149.9, 161.4, 174.4
HRMS(Fab+) [M]+計算値389.1870、測定値 389.1870
13C NMR (100 MHz, DMF-d7)δ25.8 26.4, 26.5, 39.6, 42.9, 43.0, 54.9, 70.2, 70.3, 70.6, 70.8, 70.9, 71.0, 71.4, 74.6, 111.3, 111.5, 116.1, 117.3, 118.8, 122.4 124.1 124.6, 125.0, 126.7, 126.8, 127.2, 129.0, 129.8, 130.8, 132.4, 132.6, 134.1, 135.2, 136.6, 138.3, 138.7, 139.4, 141.6, 144.5, 147.5, 148.7, 151.3, 158.7, 159.6, 161.3, 168.5, 169.9, 175.8, 187.7
HRMS (MALDI+)[M]+計算値 1068.4423、測定値 1068.4462
His−PYPWT−MBD1に関しては、まず、MBD1のDNA断片は、pGEX2T−MBD1をテンプレートとして、プライマー(配列番号32)およびプライマー(配列番号33)を用いてPCRにより得た。この増幅したDNA断片と、pcDNA3.1(+)−HA−PYP−NLSのそれぞれをHindIIIとBamHIで制限酵素処理し、ライゲーションすることでpcDNA3.1(+)−HA−PYP−MBD1−NLSを得た。シークエンス解析により、目的プラスミドの配列であることを確認した。
100mg/mLのアンピシリンを20μL加えたLB培地(20mL)で、His−PYPWT−MBD1の遺伝子をもつ大腸菌(配列番号30)を37℃で16時間培養した。続いて、37℃に温めたLB培地(1L)に100mg/mLのアンピシリンを1mL加え、培養していたLB培地(20mL)を加えて37℃で3.5時間培養を行った。ここに1MのIPTGを300μL加えて20℃で16時間培養した。この培養液を5000rpm、20℃で12分間遠心分離を行い、上清を取り除き、Bind buffer(50mM リン酸ナトリウム、300mM NaCl、1mM DTT、Protease Inhibitor cocktail 1粒、pH8.0)を20mL加え懸濁し、氷上で超音波により大腸菌を破砕した。その後、15000rpm、4℃で20分間遠心分離を行い、上清をろ過し、ろ液をNiカラムに添加した。1時間撹拌後、25mLのWash buffer(50mM リン酸ナトリウム、300mM NaCl、5mM イミダゾール、1mM DTT、pH8.0)をカラムに2回添加することで洗浄操作を行い、25mLのElution buffer (50mM リン酸ナトリウム、300mM NaCl、250mM イミダゾール、1mM DTT、pH8.0)をカラムに添加しHis−PYPWT−MBD1を溶出させ、精製を行った。
前記「His−PYPWT−MBD1の発現と精製」において、His−PYPWT−MBD1の遺伝子をもつ大腸菌の代わりにHis−PYP3R−MBD1の遺伝子をもつ大腸菌(配列番号31)を用いた以外は、同様にして、His−PYP3R−MBD1を得た。なお、PYP3Rは、Cys39の近傍に位置し、負電荷を持つアミノ酸残基D71、D97およびE74を正電荷を持つアミノ酸残基アルギニン(R)に変更したPYP変異体である。
化合物YOCNB(終濃度5μM)、His−PYP3R−MBD1(終濃度5μM)を含む50μLのHEPES緩衝液(20mM HEPES、150mM NaCl、5%DMSO、pH7.4)を調製し、25℃で2時間インキュベーションし、ラベル化反応させてYOCNB−PYP3R−MBD1(終濃度5μM)を得た。YOCNB−PYP3R−MBD1(終濃度0、25、50、100、200、400、800nM)、二本鎖のDNA(DNA配列(配列番号42)とその相補鎖(配列番号43)、mC:メチル化シトシン)(終濃度50nM)、IGEPAL(終濃度0.05%)、グリセロール(終濃度5%)を含むHEPES緩衝液(20mM HEPES、150mM NaCl、5%DMSO、pH7.4)を20μL調製し、25℃で30分間インキュベーションした。
二本鎖のDNA(DNA配列(配列番号42)とその相補鎖(配列番号43)、mC:メチル化シトシン)(終濃度50nM)の存在下もしくは非存在下で、化合物YOCNB(終濃度200nM)を含む200μLのHEPES緩衝液(20mM HEPES,150mM NaCl,5%DMSO,pH 7.4)を25 ℃で30分インキュベーションし、蛍光スペクトルを測定した。
化合物YOCNB(終濃度 5 μM), His−PYPWT−MBD1あるいはHis−PYP3R−MBD1(終濃度 5 μM)を含む30 μLのHEPES緩衝液(20 mM HEPES, 150 mM NaCl,5% DMSO,pH 7.4)を調製し、25℃でHis−PYPWT−MBD1の場合は10 時間, His−PYP3R−MBD1の場合は3時間インキュベーションし、YOCNB−PYPWT−MBD1あるいはYOCNB−PYP3R−MBD1をそれぞれ調製した。
MBD1のDNA断片はpET21b(+)−His−PYP−MBD1をテンプレートとして、プライマ―(配列番号44)およびプライマー(配列番号45)を用いてPCRにより得た。この増幅したDNA断片とpcDNA3.1−HA−PYPをそれぞれEcoRIとXhoIで制限酵素処理してライゲーションすることによりプラスミドを得た。得られたプラスミドは、シークエンス解析により、目的プラスミドのpcDNA3.1(+)v2−HA−PYPWT−MBD1(1−112)をであることを確認した。
PYP3RのDNA断片は、pET21b(+)−His−PYP3Rをテンプレートとして、プライマー(配列番号46)およびプライマー(配列番号47)を用いてPCRにより得た。この増幅したDNA断片とpcDNA3.1(+)v2−HA−PYPWT−MBD1(1−112)をそれぞれHindhIIIとEcoRIで制限酵素処理してライゲーションすることによりプラスミドを得た。得られたプラスミドは、シークエンス解析により、目的遺伝子(配列番号48)を含むプラスミドのpcDNA3.1(+)v2−HA−PYP3R−MBD1(1−112)であることを確認した。
NIH3T3細胞(独立行政法人理化学研究所より購入)を10%ウシ胎児血清を含むイーグル最小必須培地(MEM)培地2mL中24時間培養し、培地を除いた後に、2mLのリン酸緩衝生理食塩水で3回洗浄し、MEM培地を2mL加えた。この細胞に、Lipofectamine3000(ライフテクノロージー社製)を用いて、pcDNA3.1(+)(HA−PYP3R−MBD1(1−112)の遺伝子断片を含まない空ベクター)及びpcDNA3.1(+)v2−HA−PYP3R−MBD1(1−112)の遺伝子を導入し、37℃で24時間インキュベーションを行った。その後、培地を除いた後、得られた細胞をハンクス平衡塩溶液(Hank’s Balanced Salt Solution、HBSS)1 mLで3回洗浄し、2μMのYOCNBおよび500nMのMitoTrackerを含むMEM培地1mLを加え、37℃で60分間インキュベーションした。更に、その細胞の培地に300μL(1mg/1mL)のHoechst33342を加えて、37℃で15分間インキュベーションを行い、HBSS(1mL)で3回洗浄し、10%ウシ胎児血清を含むMEM培地(1mL)を加えた。
上記の細胞の蛍光イメージングを共焦点レーザー走査型顕微鏡FV10i(オリンパス株式会社製)を用いて行った。YOCNB由来の蛍光像を取得する際には、473nmのレーザーを励起光として用い、490nm〜590nmの光を透過する蛍光フィルターを用い、60倍バイオ対物レンズを用いた。Hoechst33342の蛍光像を取得する際には、405nmのレーザーを励起光として用い、420nm〜460nmの光を透過する蛍光フィルターを用い、60倍バイオ対物レンズを用いて観測を行った。
Claims (8)
- メチル化DNAを蛍光標識する方法であって、
標識対象であるメチル化DNAとプローブまたはその塩とを反応させることにより、前記メチル化DNAを蛍光標識することを含み、
前記プローブは、融合タンパク質と化合物とを反応させて得られ、
前記融合タンパク質は、PYP(Photoactive Yellow Protein)またはPYP変異体と、MBD(Methyl CpG-binding domain)またはMBD由来タンパク質とを含む融合タンパク質であり、
前記化合物は、下記式(I)で表される化合物である、メチル化DNAの蛍光標識方法。
Zは、下記式(i)であり、
m1は、4〜6の整数であり、
前記式(i)中、Yは、下記式(xxxviii)であり、
n5は、1〜3の整数であり、
R11は、水素原子または塩素原子であり。
R12は、−CH3、または−(CH2)3SCOCH3であり、
R13は、−O−、−S−または−Se−であり、
Xは、下記式(xxvi)であり、
nは、1〜6の整数であり、
R1〜R5は、同一であっても異なっていてもよく、R1〜R5の1つ以上が、−NO2、−COOH、または−CO−O−CH2−O−(C=O)−CH3であり、残りが水素原子である。 - 前記融合タンパク質における前記PYPまたはPYP変異体のアミノ酸配列が、
1)配列表の配列番号2〜7で表されるアミノ酸配列、
2)配列表の配列番号1で表されるアミノ酸配列において、第1番目から第24番目、第1番目から第25番目、第1番目から第26番目、または、第1番目から第27番目のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、及び
3)上記1)または2)のアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸配列の1〜数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列であって、前記融合タンパク質の前記PYPまたはPYP変異体は、前記式(I)で表される化合物と反応して、式(I)で表される化合物から基Xが脱離した残基と結合するアミノ酸配列である、請求項1記載のメチル化DNAを蛍光標識する方法。 - 前記融合タンパク質における前記MBDまたはMBD由来タンパク質のアミノ酸配列が、
1)配列表の配列番号8または9で表されるアミノ酸配列、及び
2)上記1)のアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸配列の1〜数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列であって、前記融合タンパク質の前記MBDまたはMBD由来タンパク質は、メチル化DNAと結合するアミノ酸配列
である請求項1または2記載のメチル化DNAを蛍光標識する方法。 - 前記融合タンパク質を得ることが、前記融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを得ること、前記融合タンパク質を発現可能なプラスミド若しくはベクターを得ること、細胞内で前記融合タンパク質を発現させること、又は、発現した前記融合タンパク質を単離することを含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載のメチル化DNAを蛍光標識する方法。
- 式(I)で表わされる化合物またはその塩を含む請求項1〜4のいずれかの方法に用いるための組成物。
Zは、下記式(i)であり、
m1は、4〜6の整数であり、
前記式(i)中、Yは、下記式(xxxviii)であり、
n5は、1〜3の整数であり、
R11は、水素原子または塩素原子であり。
R12は、−CH3、または−(CH2)3SCOCH3であり、
R13は、−O−、−S−または−Se−であり、
Xは、下記式(xxvi)であり、
nは、1〜6の整数であり、
m3は、1または2の整数であり、
R1〜R5は、同一であっても異なっていてもよく、R1〜R5の1つ以上が、−NO2、−COOH、または−CO−O−CH2−O−(C=O)−CH3であり、残りが水素原子である。 - 請求項5に記載の組成物と、プラスミドまたはベクターとを含むメチル化DNAの蛍光標識方法用キットであって、
前記プラスミドまたはベクターは、PYP(Photoactive Yellow Protein)またはPYP変異体と、MBD(Methyl CpG-binding domain)またはMBD由来タンパク質とを含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドをクローニングするため又は前記融合タンパク質を発現させるためのプラスミド又はベクターであり、
前記プラスミドまたはベクターは、
1)配列表の配列番号19〜29で表される塩基配列、
2)配列表の配列番号19〜29で表される塩基配列において、第1番目から第72番目、第1番目から第75番目、第1番目から第78番目、または、第1番目から第81番目の塩基が欠失した塩基配列、及び
3)上記1)または2)の塩基配列のいずれかの塩基配列の1〜数個の塩基が欠失、置換、又は付加された塩基配列であって、前記融合タンパク質の前記PYPまたはPYP変異体は、前記式(I)で表される化合物と反応して、式(I)で表される化合物から基Xが脱離した残基と結合し、かつ、前記融合タンパク質の前記MBDまたはMBD由来タンパク質は、メチル化DNAと結合する塩基配列であって、前記融合タンパク質の前記PYPまたはPYP変異体は、前記式(I)で表される化合物と反応して、式(I)で表される化合物から基Xが脱離した残基と結合、かつ、前記融合タンパク質の前記MBDまたはMBD由来タンパク質は、メチル化DNAと結合する塩基配列からなる群から選択される塩基配列を含むプラスミドまたはベクターであるキット。
Zは、下記式(i)であり、
m1は、4〜6の整数であり、
前記式(i)中、Yは、下記式(xxxviii)であり、
n5は、1〜3の整数であり、
R11は、水素原子または塩素原子であり。
R12は、−CH3、または−(CH2)3SCOCH3であり、
R13は、−O−、−S−または−Se−であり、
Xは、下記式(xxvi)であり、
nは、1〜6の整数であり、
R1〜R5は、同一であっても異なっていてもよく、R1〜R5の1つ以上が、−NO2、−COOH、または−CO−O−CH2−O−(C=O)−CH3であり、残りが水素原子である。 - 一般式(I)で表わされる化合物またはその塩。
Zは、下記式(i)であり、
m1は、4〜6の整数であり、
前記式(i)中、Yは、下記式(xxxviii)であり、
n5は、1〜3の整数であり、
R11は、水素原子または塩素原子であり。
R12は、−CH3、または−(CH2)3SCOCH3であり、
R13は、−O−、−S−または−Se−であり、
Xは、下記式(xxvi)であり、
nは、1〜6の整数であり、
m3は、1または2の整数であり、
R1〜R5は、同一であっても異なっていてもよく、R1〜R5の1つ以上が、−NO2、−COOH、または−CO−O−CH2−O−(C=O)−CH3であり、残りが水素原子である。 - メチル化DNAを蛍光標識する方法であって、
標識対象であるメチル化DNAとプローブまたはその塩とを反応させることにより、前記メチル化DNAを蛍光標識することを含み、
前記プローブは、融合タンパク質と化合物とを反応させて得られ、
前記融合タンパク質は、PYP(Photoactive Yellow Protein)またはPYP変異体と、MBD(Methyl CpG-binding domain)またはMBD由来タンパク質とを含む融合タンパク質であり、
前記化合物は、下記式(I)で表される化合物である、
メチル化DNAの蛍光標識方法。
Zは、下記式(i)であり、
m1は、4〜6の整数であり、
前記式(i)、Yは、下記式(xxxviii)であり、
n5は、1〜3の整数であり、
R11は、水素原子または塩素原子であり。
R12は、−CH3、または−(CH2)3SCOCH3であり、
R13は、−O−、−S−または−Se−であり、
Xは、下記式(xxvi)であり、
nは、1〜6の整数であり、
R1〜R5は、同一であっても異なっていてもよく、R1〜R5の1つ以上が、−NO2、−COOH、または−CO−O−CH2−O−(C=O)−CH3であり、残りが水素原子である。
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