JP2023066021A - 化合物およびその用途 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明はＣｙｓ－ＳＳＨに対する反応選択性に優れ、細胞内のＣｙｓ－ＳＳＨを蛍光ラベルできる化合物、および前記化合物の用途を提供する。【解決手段】下式（１）で表される化合物およびその塩。TIFF2023066021000014.tif52170Ｙ：ＳＯ２－Ｒ１基。Ｒ１：置換基を有してもよい炭素数１～１０のアルキル基。Ｚ：ハロゲン原子、ニトロ基またはシアノ基。Ｌ１：蛍光化合物由来の原子団。ｎ：１～４の整数。ｎ個のＲ２のうち少なくとも１個はカルボキシル基である。【選択図】なし

Description

本発明は、化合物およびその用途に関する。

Ｓ－ｓｕｌｆｈｙｄｒａｔｉｏｎと呼ばれるタンパク質の翻訳後修飾反応が知られている。Ｓ－ｓｕｌｆｈｙｄｒａｔｉｏｎにおいては、Ｃｙｓ残基のチオール基部分がｈｙｄｒｏｐｅｒｓｕｌｆｉｄｅとなり、Ｃｙｓ－ＳＳＨ構造が生成する。

近年、様々なタンパク質においてＳ－ｓｕｌｆｈｙｄｒａｔｉｏｎが起こることが明らかになっている。このＣｙｓ残基の翻訳後修飾は、例えば、タンパク質の機能調節、遺伝子発現等に関与すると考えられている。
しかし、この翻訳後修飾を受けたＳ－ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ化タンパク質の生合成経路や細胞内における局在、その生理的意義については不明な点が多い。そのため、細胞内のＳ－ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ化タンパク質の高感度な検出系の開発が望まれている。

活性硫黄種としてのＨ_２Ｓ_２（ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ）を検出する蛍光プローブは、いくつか提案されている（例えば、非特許文献１～４）。

しかし、ＮＲＴ－ＨＰ、ＳＳＰ４、ＱＳ_ｎはいずれもＣｙｓ－ＳＳＨを検出できない。Ｃｙ－ＤｉｓｅはＣｙｓ－ＳＳＨを検出できることが報告されているが、検出反応において競合する化学種となるＨ_２Ｓ_２とも反応し得る。そのため、Ｃｙｓ－ＳＳＨに対する反応選択性が不充分である。
加えて、これらのプローブはいずれもＨ_２Ｓ_２等の活性硫黄種と反応して蛍光が変化するため、Ｃｙｓ－ＳＳＨをラベルできない。

特許文献１では、特定のニトロベンゼン誘導体およびその塩によって、がん細胞で過剰発現するグルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼＰ１の活性を選択的に検出することが提案されている。
しかし、特許文献１の実施例では、生細胞内に存在するＣｙｓ－ＳＳＨを検出していない。また、Ｃｙｓ－ＳＳＨに対する反応選択性にも改善の余地がある。

国際公開第２０１８／１７４２５３号

Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，８８，７２０６（２０１６） Ｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，４，２８９２（２０１３） Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，８７，３００４（２０１５） Ｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，７，５０９８（２０１６）

本発明は、Ｃｙｓ－ＳＳＨに対する反応選択性に優れ、細胞内のＣｙｓ－ＳＳＨを蛍光ラベルできる化合物；および前記化合物の用途を提供する。

本発明は、下記の態様を有する。
［１］ 下式（１）で表される、化合物およびその塩。

式（１）中、ＹはＳＯ_２－Ｒ^１基であり、
Ｒ^１は、置換基を有してもよい炭素数１～１０のアルキル基であり、
Ｚは、ハロゲン原子、ニトロ基またはシアノ基であり、
Ｒ^２は、水素原子、置換基を有してもよい炭素数１～２０のアルキル基、置換基を有してもよい炭素数１～２０のアルコキシ基、カルボキシル基およびアミド基からなる群から選ばれる少なくとも１種以上であり、
ｎは１～４の整数であり、
ｎ個のＲ^２のうち少なくとも１個は、カルボキシル基であり、
Ｌ^１は、蛍光化合物に由来する原子団である。

［２］ 前記Ｒ^１が、置換基を有してもよい炭素数１～３のアルキル基である、［１］の化合物およびその塩。
［３］ 前記Ｚが、ニトロ基である、［１］または［２］の化合物およびその塩。
［４］ 前記Ｚが、ベンゼン環に結合したアミド結合に対してパラ位に結合している、［１］～［３］のいずれかの化合物およびその塩。
［５］ 前記Ｙが、ベンゼン環に結合したＺに対してオルト位に結合している、［１］～［４］のいずれかの化合物およびその塩。
［６］ 前記蛍光化合物が、クマリン、ローダミン誘導体、ロドール、ＴｏｋｙｏＧｒｅｅｎ、ＴｏｋｙｏＭａｇｅｎｔａおよびＳｉｎｇａｐｏｒｅＧｒｅｅｎからなる群から選ばれる１種以上である、［１］～［５］のいずれかの化合物およびその塩。
［７］ 前記Ｌ^１が、下式（ｇ１）で表される基である、［１］～［６］のいずれかの化合物およびその塩。

Ｘ^１およびＸ^２は、それぞれ独立して水素原子またはハロゲン原子であり、
Ｒ^３、Ｒ^４は、それぞれ独立して、水素原子、水酸基、ケトン基、置換基を有してもよいアミノ基または置換基を有してもよい炭素数２～２０のアシル基である。

［８］ 前記ｎが１であり、かつ、前記Ｒ^２がカルボキシル基である、［１］～［７］のいずれかの化合物およびその塩。
［９］ ［１］～［８］のいずれかの化合物および前記化合物の塩からなる群から選ばれる少なくとも１種以上を用い、Ｃｙｓ－ＳＳＨを蛍光ラベリングする、方法。
［１０］ Ｃｙｓ－ＳＳＨを蛍光ラベリングするための試薬であり；［１］～［８］のいずれかの化合物および前記化合物の塩からなる群から選ばれる少なくとも１種以上を含む、蛍光ラベリング用試薬。

本発明によれば、Ｃｙｓ－ＳＳＨに対する反応選択性に優れ、細胞内のＣｙｓ－ＳＳＨを蛍光ラベルできる化合物；および前記化合物の用途が提供される。

化合物Ｆ－７２のＣｙｓ－ＳＳＨに対する反応選択性の評価結果を示す。 化合物Ｆ－８２のＣｙｓ－ＳＳＨに対する反応選択性の評価結果を示す。 化合物Ｆ－４２のＣｙｓ－ＳＳＨに対する反応選択性の評価結果を示す。 Ｃｙｓ－ＳＳＨの生細胞イメージングを行った結果を示す。 図４の生細胞イメージングにおいて蛍光強度の定量を行った結果を示す。

本明細書において、式（１）で表される化合物を化合物（１）と記載する。他の式で表される化合物も同様に記載する。
本明細書において、式（ｇ１）で表される基を基（ｇ１）と記載する。他の式で表される基も同様に記載する。
数値範囲を示す「～」は、その前後に記載された数値を下限値および上限値として含むことを意味する。

１．化合物の実施の態様
本発明の化合物（１）は、以下に示す通りである。

式（１）中、ＹはＳＯ_２－Ｒ^１基である。ＳＯ_２－Ｒ^１基は、ＣｙｓＳＳＨの硫黄原子により求核攻撃を受けて脱離することにより、Ｃｙｓ－ＳＳＨ構造と共有結合を形成し得る。そのため、化合物（１）はＣｙｓ－ＳＳＨを検出できる。
加えて、ＳＯ_２－Ｒ^１基は、ＣｙｓＳＳＨの硫黄原子に対する求電子性が適度に高いため、化合物（１）のＣｙｓ－ＳＳＨに対する反応選択性が高くなる。

ＳＯ_２－Ｒ^１基におけるＲ^１は、置換基を有してもよい炭素数１～１０のアルキル基である。Ｒ^１における置換基は特に限定されない。任意の置換基が挙げられる。
任意の置換基としては、例えば、アルコキシ基、ハロゲン原子（フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等）、アミノ基、シリル基、アシル基が挙げられる。ただし、任意の置換基はこれらの例示に限定されない。

Ｒ^１は、任意の置換基を１個だけ有してもよく、２個以上の任意の置換基を有してもよい。Ｒ^１が任意の置換基を２個以上有する場合、２個以上の任意の置換基は互いに同一でも異なっていてもよい。ただし、Ｒ^１としてのアルキル基は任意の置換基を有さないこと、すなわち、Ｒ^１は非置換であることが好ましい。

Ｃｙｓ－ＳＳＨに対する反応選択性がさらに優れる点から、Ｒ^１としては置換基を有してもよい炭素数１～３のアルキル基が好ましく、置換基を有してもよいイソプロピル基、置換基を有してもよいエチル基、置換基を有してもよいメチル基がより好ましく、置換基を有してもよいメチル基がさらに好ましい。
置換基を有してもよいイソプロピル基、エチル基、メチル基における置換基としては、ハロゲン原子が好ましい。

Ｒ^１が置換基を有してもよいメチル基であるとき、Ｙは置換基を有してもよいメシル基となる。メシル基は－ＳＯ_２－ＣＨ_３である。
置換基を有してもよいメシル基における置換基としては、ハロゲン原子が好ましい。

式（１）中、Ｚは、ハロゲン原子、ニトロ基またはシアノ基である。Ｃｙｓ－ＳＳＨに対する反応性を制御しやすい点から、Ｚとしては、ニトロ基が好ましい。

式（１）中、Ｒ^２は、水素原子、置換基を有してもよい炭素数１～２０のアルキル基、置換基を有してもよい炭素数１～２０のアルコキシ基、カルボキシル基およびアミド基からなる群から選ばれる少なくとも１種以上である。

式（１）中、ｎは１～４の整数である。また、ｎ個のＲ^２のうち少なくとも１個はカルボキシル基である。化合物（１）においては、Ｒ^２の少なくとも１個がカルボキシル基である。そのため、Ｃｙｓ－ＳＳＨに対する反応性が向上する、親水性および水溶性が向上する等の利点がある。
ｎは、１～３が好ましく、１～２がより好ましく、１がさらに好ましい。

Ｒ^２の置換基を有してもよい炭素数１～２０のアルキル基、置換基を有してもよい炭素数１～２０のアルコキシ基における置換基は、特に限定されない。任意の置換基が挙げられる。例えば、アルコキシ基、ハロゲン原子（フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等）、アミノ基、シリル基、アシル基が挙げられる。
Ｒ^２における置換基を有してもよいアルキル基の炭素数は１～１２が好ましく、１～８がより好ましく、１～４がさらに好ましく、１または２が特に好ましく、１が最も好ましい。
Ｒ^２における置換基を有してもよいアルコキシ基の炭素数は１～１２が好ましく、１～８がより好ましく、１～４がさらに好ましく、１または２が特に好ましく、１が最も好ましい。

式（１）中、Ｌ^１は、蛍光化合物に由来する原子団である。
蛍光化合物は蛍光標識化合物として使用されうる化合物であれば特に限定されない。蛍光化合物としては、例えば、フルオレセイン、ローダミン、ＢＯＤＩＰＹ（ボロン－ジピロメテン）、クマリン、ローダミン誘導体、ＴｏｋｙｏＧｒｅｅｎ、ＴｏｋｙｏＭａｇｅｎｔａ、ＳｉｎｇａｐｏｒｅＧｒｅｅｎ、ナフタルイミド、ロドール（Ｒｈｏｄｏｌ）が挙げられる。

なかでも、脂溶性、細胞膜透過性の点から、蛍光化合物としては、クマリン、ローダミン誘導体、ロドール、ＴｏｋｙｏＧｒｅｅｎ、ＴｏｋｙｏＭａｇｅｎｔａおよびＳｉｎｇａｐｏｒｅＧｒｅｅｎからなる群から選ばれる１種以上が好ましく、ＴｏｋｙｏＧｒｅｅｎが特に好ましい。これは、細胞膜透過性がよいと、生細胞に適用する際に蛍光ラベリング用試薬等の種々の用途に適用しやすいためである。

ローダミン誘導体としては、例えば、ローダミンＢ、ローダミン６Ｇ、ローダミン１１０、ローダミン１２３、これらのローダミン誘導体の１０位酸素原子をジメチルシリルに置換したシリルローダミンが挙げられる。ただし、ローダミン誘導体はこれらの例示に限定されず、ローダミン骨格を有する種々の誘導体が適用され得る。

化合物（１）において、Ｌ^１は下記の基（ｇ１）が好ましい。基（ｇ１）は、蛍光化合物としてのＴｏｋｙｏＧｒｅｅｎに由来する原子団の一例である。

基（ｇ１）において、Ｘ^１およびＸ^２は、それぞれ独立して、水素原子またはハロゲン原子である。ハロゲン原子は、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子のいずれであってもよい。なかでも、フッ素原子、塩素原子が好ましく、塩素原子がより好ましい。
Ｃｙｓ－ＳＳＨに対する反応選択性の点から、Ｘ^１およびＸ^２のいずれか一方または両方が水素原子であることが好ましく、Ｘ^１およびＸ^２の両方が水素原子であることがより好ましい。

基（ｇ１）において、Ｒ^３、Ｒ^４はそれぞれ独立して、水素原子、水酸基、ケトン基、置換基を有してもよいアミノ基または置換基を有してもよい炭素数２～２０のアシル基である。

Ｒ^３、Ｒ^４の置換基を有してもよいアミノ基における置換基は、特に限定されない。例えば、炭素数１～２０のアルキル基、ハロゲン原子（フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等）が挙げられる。
Ｒ^３、Ｒ^４の置換基を有してもよい炭素数２～２０のアシル基における置換基は、特に限定されない。例えば、アルコキシ基、ハロゲン原子（フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等）、アミノ基、シリル基が挙げられる。
置換基を有してもよいアミノ基、置換基を有してもよい炭素数２～２０のアシル基は任意の置換基を１個だけ有してもよく、２個以上の任意の置換基を有してもよい。これらが任意の置換基を２個以上有する場合、２個以上の任意の置換基は互いに同一でも異なっていてもよい。

蛍光ラベリング用試薬とした際の脂溶性、細胞膜透過性の点から、Ｒ^３、Ｒ^４はそれぞれ独立して炭素数２～２０のアシル基であることが好ましい。これは、細胞膜透過性がよいと、生細胞に適用する際に蛍光ラベリング用試薬等の種々の用途に適用しやすいためである。

Ｒ^３、Ｒ^４のアシル基としては、炭素数２～１２のアシル基が好ましく、炭素数２～８のアシル基がより好ましく、炭素数２～４のアシル基がさらに好ましく、炭素数２～３のアシル基が特に好ましく、炭素数２のアシル基が最も好ましい。

Ｒ^３、Ｒ^４におけるアシル基は、脂肪族アシル基、芳香族アシル基のいずれでもよく、芳香族基を置換基として有する脂肪族アシル基であってもよい。アシル基は１個または２個以上のヘテロ原子を含んでいてもよい。
アシル基としては、例えば、アルキルカルボニル基（アセチル基等）、アルキルオキシカルボニル基（アセトキシカルボニル基等）、アリールカルボニル基（ベンゾイル基等）、アリールオキシカルボニル基（フェニルオキシカルボニル基等）、アラルキルカルボニル基（ベンジルカルボニル基等）、アルキルチオカルボニル基（メチルチオカルボニル基等）、アルキルアミノカルボニル基（メチルアミノカルボニル基等）、アリールチオカルボニル基（フェニルチオカルボニル基等）、またはアリールアミノカルボニル基（フェニルアミノカルボニル基等）等のアシル基が挙げられる。ただし、アシル基はこれらの例示に限定されない。

本発明の一態様において、Ｚがベンゼン環に結合したアミド結合に対してパラ位に結合していることが、Ｃｙｓ－ＳＳＨに対する反応性が高い点で好ましい。
本発明の一態様において、Ｙがベンゼン環に結合したＺに対してオルト位に結合していることが、Ｃｙｓ－ＳＳＨに対する反応選択性がさらに優れる点で好ましい。
本発明の一態様において、Ｚがベンゼン環に結合したアミド結合に対してパラ位に結合し、かつ、Ｙがベンゼン環に結合したＺに対してオルト位に結合していることが、Ｃｙｓ－ＳＳＨに対する反応選択性がさらに優れる点でさらに好ましい。
これらの態様においても、Ｃｙｓ－ＳＳＨに対する反応選択性の点でＺはニトロ基が好ましく、ＹにおけるＲ^１としては置換基を有してもよい炭素数１～３のアルキル基が好ましく、置換基を有してもよいイソプロピル基、置換基を有してもよいエチル基、置換基を有してもよいメチル基がより好ましく、置換基を有してもよいメチル基がさらに好ましい。

したがって本発明の一態様としては、化合物（１１）が特に好ましい。

式（１１）中、Ｍｓは置換基を有してもよいメシル基である。
その他、各符号の詳細および好ましい態様は、式（１）と同様である。

化合物（１）等は塩として存在する場合がある。塩としては、例えば、塩基付加塩、酸付加塩、アミノ酸塩が挙げられる。
塩基付加塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等の金属塩；アンモニウム塩、トリエチルアミン塩、ピペリジン塩、モルホリン塩等の有機アミン塩が挙げられる。
酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩等の鉱酸塩；メタンスルホン酸塩、パラトルエンスルホン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、シュウ酸塩、トリフルオロ酢酸塩等の有機酸塩が挙げられる。
アミノ酸塩としては、例えば、グリシン塩、アラニン塩が挙げられる。
ただし、化合物（１）の塩はこれらの例示に限定されない。

これらのなかでも、化合物（１）の親水性、水溶性、細胞膜透過性の点で、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、メタンスルホン酸塩、パラトルエンスルホン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、シュウ酸塩、グリシン塩、トリフルオロ酢酸塩が好ましく、ナトリウム塩、塩酸塩、トリフルオロ酢酸塩がより好ましく、ナトリウム塩、塩酸塩がさらに好ましく、ナトリウム塩が特に好ましい。

化合物（１）等は、置換基の種類に応じて１個または２個以上の不斉炭素を有する場合があり、エナンチオマーまたはジアステレオマー等の立体異性体が存在する場合がある。純粋な形態の立体異性体、立体異性体の任意の混合物、ラセミ体等はいずれも化合物（１）に包含される。

化合物（１）等またはその塩は、水和物、溶媒和物として存在する場合もある。これら水和物、溶媒和物はいずれも本発明の技術的範囲に包含される。
溶媒和物を形成する溶媒の種類は特に限定されない。例えば、エタノール、アセトン、イソプロパノールが挙げられる。

化合物（１）等およびその塩は、生体内環境としてのｐＨ（例えば、ｐＨ７．０～８．０、好ましくはｐＨ７．４）の条件下において非イオン性の状態で存在することが好ましい。生体内環境で非イオン性の状態で存在すると、細胞膜透過性がよく、生細胞に適用する際に蛍光ラベリング用試薬等の種々の用途に適用しやすい。

化合物（１）等の合成方法は特に限定されない。種々の合成技術が使用され得る。
後述の実験結果の記載においては、化合物（１）の一例についての合成方法が具体的に示されている。当業者は本明細書の開示を参照し、また、必要に応じて本願出願時の技術常識を参酌することで出発原料や試薬、反応条件等を適宜選択することにより、化合物（１）に包含される任意の化合物を合成できる。

合成技術に関して、例えば、下記の文献が参照され得る。
・Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１３０，１４５３３（２００８）．
・Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．，５５，８１２２（２０１９）．
・Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１４１，１０４０９（２０１９）．
その他、種々の文献に開示の合成技術が使用され得る。

（作用機序）
化合物（１）はアミド結合が結合したベンゼン環において、ＹおよびＺが結合している。Ｚは、Ｈ_２Ｓ_２等の活性硫黄種に対する反応性を高めることに寄与する。一方、Ｙ、すなわち、ＳＯ_２－Ｒ^１基はＣｙｓ－ＳＳＨの硫黄原子に対する求電子性が適度に高い。そのため、Ｈ_２Ｓ_２等の活性硫黄種に対する化合物（１）の反応性は、相対的に低くなる。その結果として、化合物（１）のＣｙｓ－ＳＳＨ構造に対する反応選択性が高くなると考えられる。
加えて、化合物（１）においては、ｎ個のＲ^２のうち少なくとも１個はカルボキシル基である。そのため、Ｃｙｓ－ＳＳＨに対する反応性の向上、親水性および水溶性の向上が期待でき、細胞膜透過性も向上する。そのため、細胞内のＣｙｓ－ＳＳＨを蛍光ラベルでき、細胞への応用が可能になる。
そして、化合物（１）はＬ^１の蛍光原子団を有する。化合物（１）において、Ｌ^１はＣｙｓ－ＳＳＨ構造と反応した後も検出対象のＣｙｓ－ＳＳＨ構造から遊離しないよう設計されている。そのため、Ｃｙｓ－ＳＳＨを蛍光ラベルでき、生細胞内のＣｙｓ－ＳＳＨ構造を含有するタンパク質等の生体高分子の局在を調査できる。
以上より、得られる化合物（１）において、Ｃｙｓ－ＳＳＨ構造に対する優れた反応選択性が発揮され、細胞内のＣｙｓ－ＳＳＨを蛍光ラベルできる。

本発明の化合物（１）は、Ｈ_２Ｓ_２に対する反応性と比べてＣｙｓ－ＳＳＨに対して高い反応選択性を示す。加えて、本発明の化合物（１）はＣｙｓ－ＳＳＨを蛍光ラベル化できる点で従来技術と大きく異なる。また、生細胞系でもＣｙｓ－ＳＳＨを検出できる点で優位性がある。

本発明の化合物（１）は、生体内でＣｙｓ残基の翻訳後修飾が起こり得るタンパク質、すなわち、Ｃｙｓ－ＳＳＨを含有し得るタンパク質の蛍光ラベリング用途に好適に利用できる。
Ｃｙｓ－ＳＳＨを含有し得るタンパク質としては、例えば、血清アルブミン、ＧＡＰＤＨ（Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ ３－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）、ＫＥＡＰ１（Ｋｅｌｃｈ－ｌｉｋｅ ＥＣＨ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ１）が挙げられる。

２．化合物の用途
本発明の一実施形態によれば、上述した化合物（１）および化合物（１）の塩からなる群から選ばれる少なくとも１種以上を含む、蛍光ラベリング用試薬が提供される。
蛍光ラベリング用試薬において、化合物（１）は１種を単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。

本発明の蛍光ラベリング用試薬は、Ｃｙｓ－ＳＳＨを蛍光ラベリングするための試薬である。本発明の蛍光ラベリング用試薬によれば、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ等）、タンパク質、核酸－タンパク質複合体（ＲＮＰ等）の生体高分子に特異的に結合または分布して蛍光を発することにより、生体高分子、細胞、組織の観察を容易にすることができる。

蛍光ラベリング用試薬は、化合物（１）および化合物（１）の塩からなる群から選ばれる少なくとも１種以上を含む。化合物（１）およびその塩は１種を単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。
蛍光ラベリング用試薬としては、上述した本発明に係る化合物（１）およびその塩をそのまま用いてもよく、必要に応じて、試薬の調製に通常用いられる添加剤を配合してもよい。添加剤としては、例えば、溶解補助剤、ｐＨ調整剤、緩衝剤、等張化剤が挙げられる。これらの添加剤の配合量は当業者に適宜選択可能である。

蛍光ラベリング用試薬は、一般的には粉末形態の混合物、凍結乾燥物、顆粒、錠剤、液剤等任意の形態の組成物として提供されるが、使用時に注射用滅菌水や、適宜の緩衝液に溶解して使用してもよい。

蛍光ラベリング用試薬における化合物（１）の含有量は、特に限定されない。例えば、Ｃｙｓ－ＳＳＨの蛍光ラベリングを所望する試料に対して、例えば、１～１０００μＭ程度とすることができる。
蛍光ラベリング用試薬のｐＨは、例えば、ｐＨ７．０～７．５の範囲が好ましい。

本発明の一実施形態によれば、上述した化合物（１）および化合物（１）の塩からなる群から選ばれる少なくとも１種以上を用い、Ｃｙｓ－ＳＳＨを蛍光ラベリングする、方法が提供される。
当該方法において、化合物（１）は１種を単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。

例えば、Ｃｙｓ－ＳＳＨを検出可能な本発明に係る蛍光ラベリング用試薬を試料に塗布することでＣｙｓ－ＳＳＨの有無を評価できる。
Ｃｙｓ－ＳＳＨの有無、検出、判定はｉｎ ｖｉｔｒｏで行われてもよく、ｅｘ ｖｉｖｏで行われてもよく、ｉｎ ｖｉｖｏで行われてもよい。

被験者の血液細胞中の細胞を検出後、取得することにより、取得した細胞について別途解析手法を適用できる。結果、遺伝子解析、発現解析、局在解析等の性状解析も可能となる。
例えば、本発明の化合物（１）、蛍光ラベリング用試薬は、Ｃｙｓ－ＳＳＨの生細胞イメージング、Ｃｙｓ－ＳＳＨの局在の解明、Ｃｙｓ－ＳＳＨの機能解明の用途に好適に適用できる。
本発明の化合物（１）、蛍光ラベリング用試薬は、Ｃｙｓ－ＳＳＨの蛍光ラベル化によるＣｙｓ－ＳＳＨ含有タンパク質の網羅的同定、Ｃｙｓ－ＳＳＨ含有タンパク質の機能解析の用途にも好適に適用できる。

例えば、保持された生体試料に対して、本発明に係る化合物、蛍光ラベリング用試薬またはその溶液を加える。これにより化合物（１）と生体試料を接触させ、所定の時間インキュベートした後に、蛍光顕微鏡やマイクロプレートリーダーを用いて励起光を生体試料に照射し、生じた蛍光を検出することができる。
以上の操作を通じて蛍光を発する細胞部分にＣｙｓ－ＳＳＨ含有タンパク質が局在していることが分かる。また、蛍光を発する細胞をがん細胞と判定することもできる。

試料の取得の容易性の観点から、生体試料としては血液が好ましく、血液から得られた細胞が好ましい。
ただし、生体試料の由来は血液に何ら制限されない。血液以外の生体由来の試料であってもよく、非生体由来の試料であってもよい。血液以外の生体由来の試料の種類は特に制限されない。例えば、リンパ液、髄液その他の体液；細胞抽出物（ホモジネート）等が挙げられる。

本発明に係る化合物（１）、蛍光ラベリング用試薬は、プレパラート、ガラスボトムディッシュやスライドガラス、マルチウェルプレート等、生体イメージングの手法において一般的に用いられる観察容器に保持した生体試料に対して作用させることができる。例えば、国際公開第２０１１／１４９０３２号に記載の生体試料固定装置に保持した生体試料に対して作用させることもできる。

例えば、蛍光ラベリング用試薬を組織に適用してインキュベートした後に、フローサイトメトリーや蛍光顕微鏡による画像取得とそれに続くマイクロピペットによる細胞分取技法を用いることで、細胞数の計測、細胞の選別等を行うこともできる。

３．実験結果
以下、本発明者が行った実験の結果を示す。ただし、本発明は以下の記載に限定されない。本発明はその他の様々な形態で実施可能であり、発明の要旨を逸脱しない範囲で、種々の省略、置換、変更が可能である。

＜化合物Ｆ－１の合成＞
以下に示す反応スキームにて、化合物Ｆ－１を合成した。

４－アミノフルオレセイン（２０６ｍｇ，０．５９４ｍｍｏｌ）および炭酸セシウム（５１９ｍｇ，１．５９ｍｍｏｌ，２．７ｅｑ）のアセトニトリル（１５ｍＬ）溶液に氷浴下にて無水酢酸（１４０μＬ，１．４８ｍｍｏｌ，２．５ｅｑ）を加え、室温で４０分間撹拌した。沈殿物を濾過し、濾液を減圧下留去した。得られた残渣を０．０４Ｎ塩酸に溶解させ酢酸エチルを用いて抽出した。集めた酢酸エチル層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥して減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ－ヘキサン／酢酸エチル＝２／３）で精製することにより化合物Ｆ－１（１４１ｍｇ，０．３２８ｍｍｏｌ，５５％）を白色結晶として得た。
^１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３，５００ＭＨｚ，δ；ｐｐｍ）７．１９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．３Ｈｚ），７．０６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．３Ｈｚ），６．９５（２Ｈ，ｍ），６．８９（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ），６．８０（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，２．３Ｈｚ），４．０６（２Ｈ，ｓ），２．３１（６Ｈ，ｓ）．ＭＳ（ＥＳＩ^＋）ｍ／ｚ；４３２［Ｍ＋Ｈ］^＋．

＜化合物Ｆ－７２の合成＞
以下に示す反応スキームにて、化合物Ｆ－７２を合成した。

４－フルオロ－３－ニトロ安息香酸（２５５ｍｇ，１．３８ｍｍｏｌ）およびメチルメルカプタンナトリウム（３２９ｍｇ，４．７０ｍｍｏｌ，３．４ｅｑ）をイソプロパノール（８ｍＬ）に懸濁させ室温で５０分間撹拌した。反応液を酢酸エチルおよび１Ｎの塩酸で希釈後、酢酸エチル層を分離した。酢酸エチル層を１Ｎの塩酸および飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥して減圧濃縮した。得られた残渣を酢酸エチルに溶解させ、ｎ－ヘキサンを加えることにより沈殿を析出させた。得られた沈殿をろ取し減圧下乾燥させることで化合物Ｆ－７０－１（１３３ｍｇ，０．６２５ｍｍｏｌ，４５％）を橙色個体として得た。
^１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤ_３ＯＤ，５００ＭＨｚ，δ；ｐｐｍ）８．７９（１Ｈ，ｓ），８．２３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ），７．６６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ），２．５８（３Ｈ，ｓ）．

化合物Ｆ－７０－１（１３３ｍｇ，０．６２５ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（１．５ｍＬ）および３０％Ｈ_２Ｏ_２（６ｍＬ，５８．７ｍｍｏｌ）に溶解させ、リン酸カリウムを気泡の発生が止まるまで加えた。反応液を室温で４０分間撹拌した後、１ＮのＨＣｌで希釈し酢酸エチルで抽出した。酢酸エチル層を１Ｎの塩酸および飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥して減圧濃縮した。得られた残渣を酢酸エチルに溶解させ、ｎ－ヘキサンを加えることにより沈殿を析出させた。得られた沈殿をろ取し減圧下乾燥させることで化合物Ｆ－７０（２１．３ｍｇ，０．０８６９ｍｍｏｌ，１４％）を白色個体として得た。
^１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤ_３ＯＤ，５００ＭＨｚ，δ；ｐｐｍ）８．４４（２Ｈ，ｍ），８．２９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ），３．４６（３Ｈ，ｓ）．

化合物Ｆ－７０（２０．９ｍｇ，０．０８５２ｍｍｏｌ，１．０７ｅｑ）およびＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（１滴）の脱水ジクロロメタンＣＨ_２Ｃｌ_２（３ｍＬ）溶液に氷浴下にて塩化チオニル（５０μＬ）を加え、４０分間加熱還流した。反応液を減圧留去後、得られたオイル状物質に無水ジクロロメタン（５ｍＬ）を加えた。化合物Ｆ－１（３４．３ｍｇ，０．０７９５ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（１ｍＬ）溶液に先のジクロロメタン溶液を室温にて滴下後、室温で４０分間撹拌した。反応液を０．５Ｎの塩酸で希釈した後、酢酸エチルで抽出した。集めた酢酸エチル層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥して減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ－ヘキサン／酢酸エチル＝１／１）で精製することにより化合物Ｆ－７１（１０．５ｍｇ）を得た。
^１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３，５００ＭＨｚ，δ；ｐｐｍ）９．０３（１Ｈ，ｓ），８．３９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．７Ｈｚ），８．３５（２Ｈ，ｍ），８．３１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ），８．２１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，２．０Ｈｚ），７．０９（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．５Ｈｚ），６．８３（４Ｈ，ｍ），３．４８（３Ｈ，ｓ），２．３３（６Ｈ，ｓ）．
^１３Ｃ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３，１２５ＭＨｚ，δ；ｐｐｍ）１７５．６０，１６９．０４，１６２．１３，１５２．２５，１５１．７１，１４４．８０，１４０．５７，１３６．６５，１３２．２２，１２８．８７，１２７．３２，１２４．２０，１１７．９６，１１７．９５，１１６．２０，１１５．９７，１１０．５９，１００．６５，４５．１４，３５．４０，２１．１５．
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ^－）ｍ／ｚ：ｃａｌｃｄ６５７．０８１５２，ｆｏｕｎｄ６５７．０８１６８［Ｍ－Ｈ］^－（＋０．１６ｍＤａ）．

化合物Ｆ－７１（１０．５ｍｇ）および炭酸カリウム（２０．５ｍｇ，０．１４８ｍｍｏｌ）のメタノール溶液（３ｍＬ）を氷浴下にて１０分間撹拌した後、反応液を０．５Ｎの塩酸で希釈した。酢酸エチルを用いて抽出した後、集めた酢酸エチル層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥して減圧濃縮した。得られた残渣を逆相ＨＰＬＣで精製することにより化合物Ｆ－７２（２．７７ｍｇ，０．００４８２ｍｍｏｌ，６％（総収率））を黄色個体として得た。
純度：９７．９％（２５４ｎｍ）、ＨＰＬＣ条件：ｓｏｌｖｅｎｔＡ，ＭｉｌｌｉＱ（０．１％ＴＦＡ）；ｓｏｌｖｅｎｔＢ，ＭｅＣＮ（０．１％ＴＦＡ）；Ｂｃｏｎｃ，２０％ｔｏ１００％（２０ｍｉｎ）．
^１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤ_３ＯＤ，５００ＭＨｚ，δ；ｐｐｍ）８．５４（１Ｈ，ｓ），８．４９（１Ｈ，ｓ），８．４６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ），８．３６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ），８．０６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ），７．２３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ），６．６９（２Ｈ，ｓ），６．６４（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ），６．５５（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ），３．４９（３Ｈ，ｓ）．
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ^－）ｍ／ｚ：ｃａｌｃｄ５７３．０６０３９，ｆｏｕｎｄ５７３．０６０２３［Ｍ－Ｈ］^－（－０．１６ｍＤａ）．

＜化合物Ｆ－８２，化合物Ｆ－８２－ＤＡの合成＞
以下に示す反応スキームにて、化合物Ｆ－８２，化合物Ｆ－８２－ＤＡを合成した。

３－フルオロ－４－ニトロ安息香酸（５８４ｍｇ，３．１５ｍｍｏｌ）およびメチルメルカプタンナトリウム（６５８ｍｇ，９．３９ｍｍｏｌ，３．０ｅｑ）をＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（１５ｍＬ）に溶解させ７０℃で２時間撹拌した。反応液を放冷し酢酸エチルおよび１Ｎの塩酸で希釈後、酢酸エチル層を分離した。酢酸エチル層を１Ｎの塩酸および飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥して減圧濃縮した。得られた残渣を酢酸エチルに溶解させ、ｎ－ヘキサンを加えることにより沈殿を析出させた。得られた沈殿をろ取し減圧下乾燥させることで化合物Ｆ－８０－１（５３５ｍｇ，２．５１ｍｍｏｌ，８０％）を橙色個体として得た。
^１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３，５００ＭＨｚ，δ；ｐｐｍ）８．３２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），８．１２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．５Ｈｚ），７．９３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，１．８Ｈｚ），２．５９（３Ｈ，ｓ）．

化合物Ｆ－８０－１（３０４ｍｇ，１．４３ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（４ｍＬ）および３０％Ｈ_２Ｏ_２（１０ｍＬ，９７．８ｍｍｏｌ）に溶解させ、リン酸カリウムを気泡の発生が止まるまで加えた。反応液を室温で１時間撹拌した後、０．５ＮのＨＣｌで希釈し酢酸エチルで抽出した。酢酸エチル層を１Ｎの塩酸および飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥して減圧濃縮した。得られた残渣を酢酸エチルに溶解させ、ｎ－ヘキサンを加えることにより沈殿を析出させた。得られた沈殿をろ取し減圧下乾燥させることで化合物Ｆ－８０（７８．４ｍｇ，０．３２０ｍｍｏｌ，２２％）を白色個体として得た。
^１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤ_３ＯＤ，５００ＭＨｚ，δ；ｐｐｍ）８．７２（１Ｈ，ｓ），８．４９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ），８．０４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ），３．４５（３Ｈ，ｓ）．

化合物Ｆ－８０（３２．７ｍｇ，０．１３３ｍｍｏｌ，１．１ｅｑ）およびＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（１滴）の脱水ジクロロメタンＣＨ_２Ｃｌ_２（５ｍＬ）溶液に氷浴下にて塩化チオニル（８０μＬ）を加え、５０分間加熱還流した。反応液を減圧留去後、得られたオイル状物質に無水ジクロロメタン（５ｍＬ）を加えた。化合物Ｆ－１（５１．６ｍｇ，０．１２０ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（１．５ｍＬ）溶液に先のジクロロメタン溶液を室温にて滴下後、室温で１時間撹拌した。反応液を０．５Ｎの塩酸で希釈した後、酢酸エチルで抽出した。集めた酢酸エチル層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥して減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ－ヘキサン／酢酸エチル＝１／１）で精製することにより化合物Ｆ－８１（化合物Ｆ－８２－ＤＡ）（３８．２ｍｇ）を得た。
^１Ｈ－ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ_６，５００ＭＨｚ，δ；ｐｐｍ）８．６６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．７Ｈｚ），８．５８－８．５６（２Ｈ，ｍ），８．３３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ），８．１２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，２．０Ｈｚ），７．４７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ），７．３０（２Ｈ，ｓ），６．９８（４Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．１Ｈｚ），３．５６（３Ｈ，ｓ），２．３０（６Ｈ，ｓ）．
^１３Ｃ－ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ_６，１２５ＭＨｚ，δ；ｐｐｍ）１６８．９２，１６８．２７，１６３．１６，１５２．１２，１５０．８８，１４９．６８，１４７．５５，１３８．２０，１３４．９３，１３３．１０，１３０．６３，１２９．２５，１２７．９５，１２６．３５，１２５．４１，１２４．７５，１１８．６９，１１６．１６，１１５．２９，１１０．５３，１１０．５１，８１．１３，４４．５２，２０．８９．
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ^－）ｍ／ｚ：ｃａｌｃｄ６５７．０８１５２，ｆｏｕｎｄ６５７．０８２０６［Ｍ－Ｈ］^－（＋０．５４ｍＤａ）．

化合物Ｆ－８１（３８．２ｍｇ）および炭酸カリウム（４５．４ｍｇ，０．３２８ｍｍｏｌ）のメタノール溶液（５ｍＬ）を氷浴下にて１２分間撹拌した後、反応液を０．５Ｎの塩酸で希釈した。酢酸エチルを用いて抽出した後、集めた酢酸エチル層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥して減圧濃縮した。得られた残渣を逆相ＨＰＬＣで精製することにより化合物Ｆ－８２（１９．７ｍｇ，０．０３４３ｍｍｏｌ，２９％（３工程総収率））を黄色個体として得た。
純度：９７．２％（２５４ｎｍ）、ＨＰＬＣ条件：ｓｏｌｖｅｎｔＡ，ＭｉｌｌｉＱ（０．１％ＴＦＡ）；ｓｏｌｖｅｎｔＢ，ＭｅＣＮ（０．１％ＴＦＡ）；Ｂｃｏｎｃ，２０％ｔｏ１００％（２０ｍｉｎ）．
^１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤ_３ＯＤ，５００ＭＨｚ，δ；ｐｐｍ）８．７５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．８Ｈｚ），８．５３（１Ｈ，ｓ），８．４９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，２．２Ｈｚ），８．１１（２Ｈ，ｍ），７．２７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ），６．７７（６Ｈ，ｍ），３．４９（３Ｈ，ｓ）．
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ^－）ｍ／ｚ：ｃａｌｃｄ５７３．０６０３９，ｆｏｕｎｄ５７３．０６０１７［Ｍ－Ｈ］^－（－０．２２ｍＤａ）．

＜活性硫黄種間での反応選択性の評価＞
化合物Ｆ－７２、化合物Ｆ－８２の活性硫黄種間（Ｎａ_２Ｓ，Ｎａ_２Ｓ_２，Ｃｙｓ，Ｃｙｓ－ＳＳＨ）での反応選択性を評価した。
比較対象の化合物として、化合物Ｆ－４２についても同様に反応選択性を評価した。この化合物Ｆ－４２の合成方法は公知である。例えば、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１３０，１４５３３（２００８）に記載されている通りに合成して得られる。

９６穴プレート（Ｃｏｓｔａｒ）にアッセイバッファー（１００ｍＭのＨＥＰＥＳ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４））に溶解させた２０μＭの各プローブ（３０μＬ，ｆｉｎａｌ １０μＭ）および２０，２００，２０００μＭの各活性硫黄種（Ｎａ_２Ｓ，Ｎａ_２Ｓ_２，Ｃｙｓ，Ｃｙｓ－ＳＳＨ，３０μＬ，ｆｉｎａｌ１０，１００，１０００μＭ）を添加し、室温で１０分間インキュベーションした。反応後、プレートリーダーにて蛍光強度（励起波長：４８５ｎｍ，蛍光波長：５３５ｎｍ）を測定した。Ｃｙｓ－ＳＳＨはＣｙｓとＮａ_２Ｓを３７℃で１５分間インキュベーションしたものを用いた。また、コントロールでは活性硫黄種の代わりにバッファーを３０μＬ加えた。実験は全てｎ＝３で行い、測定結果は平均±標準偏差で示した。

結果、化合物Ｆ－７２、化合物Ｆ－８２は、化合物Ｆ－４２と比較してＣｙｓやＨ_２Ｓ_２等の他の活性硫黄種に対して低い反応性を示してＣｙｓ－ＳＳＨに対して高い反応選択性を示した。（図１、図２、図３）。特に、化合物Ｆ－８２はＣｙｓ－ＳＳＨに対して高い反応選択性を示すことが明らかになった。

＜Ｃｙｓ－ＳＳＨの生細胞イメージング＞
化合物Ｆ－８２－ＤＡは化合物Ｆ－８２と比較して細胞膜透過性が高い。化合物Ｆ－８２－ＤＡを用いて、細胞内Ｒ－ＳＳＨの蛍光イメージングを行った。
これまでＣｙｓ－ＳＳＨは生体内でＣＳＥ（ｃｙｓｔａｔｈｉｏｎｉｎｅ γ－ｌｙａｓｅ）やＣＢＳ（ｃｙｓｔａｔｈｉｏｎｉｎｅ β－ｓｙｎｔｈａｓｅ）等の酵素反応により産生されると考えられてきた。ところが近年、ＣＡＲＳ２（ｃｙｓｔｅｉｎｙｌ－ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ２）により同時翻訳的にＣｙｓ－ＳＳＨが産生されること、また、ＣＡＲＳ２経路によるＣｙｓ－ＳＳＨの産生が支配的であることが示された（Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．８，１１７７（２０１７））。

そこで、ＣＡＲＳ２ ＷＴ，ＣＡＲＳ２ ＫＯのＨＥＫ２９３Ｔ細胞を用いてＣｙｓ－ＳＳＨをラベリングして生細胞イメージングを行った。
ＣＡＲＳ２ ＷＴ ＨＥＫ２９３Ｔ細胞およびＣＡＲＳ２ ＫＯ ＨＥＫ２９３Ｔをそれぞれ３５ｍｍガラスボトムディッシュ（松浪硝子工業社製品）に２．０×１０^５細胞（２ｍＬ）播種し２４時間、３７℃で培養した。Ｄ－ＰＢＳ（１ｍＬ）にて細胞を１回洗浄した後、新しいＤ－ＰＢＳ（１ｍＬ）を添加した。１ｍＭの化合物Ｆ－８２－ＤＡ（１０μＬ，ｆｉｎａｌ １０μＭ，１％ＤＭＳＯ）を添加し、６０分間３７℃で細胞を培養した。その間、２０分毎に共焦点蛍光顕微鏡（オリンパス社製品「ＩＸ－７１」）にてそれぞれの細胞をＧＦＰフィルターで蛍光観察した（図４）。各細胞における蛍光強度の定量は画像処理ソフトウェア「ｉｍａｇｅ Ｊ」を用いて行った。また、有意差検定は統計処理ソフト（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ社製品「ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ６」）を用いて行った。

化合物Ｆ－８２－ＤＡを用いて処理した後の蛍光強度の比較を行った結果、ＣＡＲＳ２ ＷＴ ＨＥＫ２９３Ｔ細胞でＫＯ細胞と比べて有意に強い蛍光強度を示した（図５）。弧の結果から、様々な求核種が存在する夾雑環境下においても化合物Ｆ－８２－ＤＡはＣｙｓ－ＳＳＨを検出できる可能性が示された。

＜Ｃｙｓ－ＳＳＨのラベリング機構＞
化合物Ｆ－８２を一例に、本発明の化合物（１）によるＣｙｓ－ＳＳＨのラベリング機構を説明する。

化合物Ｆ－８２においては、Ｍｓ、すなわち、ＳＯ_２－ＣＨ_３は、ＣｙｓＳＳＨの硫黄原子により求核攻撃を受けて脱離することにより、Ｃｙｓ－ＳＳＨ構造と共有結合を形成する。そのため、化合物（１）はＣｙｓ－ＳＳＨを検出できる。
また、このＣｙｓ－ＳＳＨの硫黄原子に対する求電子性が適度に高いため、Ｃｙｓ－ＳＳＨに対する反応選択性が高くなると考えられる。

以上の実験結果に示すように、化合物Ｆ－７２、化合物Ｆ－８２は化合物Ｆ－４２と比較してＣｙｓやＨ２Ｓ２等他の活性硫黄種に対して反応性が低く、Ｃｙｓ－ＳＳＨに対する反応選択性が高い。

特に、化合物Ｆ－８２はＣｙｓ－ＳＳＨに対して高い反応選択性を示した。加えて、化合物Ｆ－８２ＤＡにおいて、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のＣＡＲＳ２ＷＴおよびＫＯを用いて蛍光強度の比較を行った結果、ＣＡＲＳ２ＷＴ細胞でＫＯ細胞と比べて有意に強い蛍光強度を示した。

本発明によれば、Ｃｙｓ－ＳＳＨに対する反応選択性に優れ、細胞内のＣｙｓ－ＳＳＨを蛍光ラベルできる化合物；および前記化合物の用途が提供される。

Claims (10)

1. 下式（１）で表される、化合物およびその塩。
   

   

   式（１）中、ＹはＳＯ_２－Ｒ^１基であり、
   Ｒ^１は、置換基を有してもよい炭素数１～１０のアルキル基であり、
   Ｚは、ハロゲン原子、ニトロ基またはシアノ基であり、
   Ｒ^２は、水素原子、置換基を有してもよい炭素数１～２０のアルキル基、置換基を有してもよい炭素数１～２０のアルコキシ基、カルボキシル基およびアミド基からなる群から選ばれる少なくとも１種以上であり、
   ｎは１～４の整数であり、
   ｎ個のＲ^２のうち少なくとも１個は、カルボキシル基であり、
   Ｌ^１は、蛍光化合物に由来する原子団である。
2. 前記Ｒ^１が、置換基を有してもよい炭素数１～３のアルキル基である、請求項１に記載の化合物およびその塩。
3. 前記Ｚが、ニトロ基である、請求項１または２に記載の化合物およびその塩。
4. 前記Ｚが、ベンゼン環に結合したアミド結合に対してパラ位に結合している、請求項１～３のいずれか一項に記載の化合物およびその塩。
5. 前記Ｙが、ベンゼン環に結合したＺに対してオルト位に結合している、請求項１～４のいずれか一項に記載の化合物およびその塩。
6. 前記蛍光化合物が、クマリン、ローダミン誘導体、ロドール、ＴｏｋｙｏＧｒｅｅｎ、ＴｏｋｙｏＭａｇｅｎｔａおよびＳｉｎｇａｐｏｒｅＧｒｅｅｎからなる群から選ばれる１種以上である、請求項１～５のいずれか一項に記載の化合物およびその塩。
7. 前記Ｌ^１が、下式（ｇ１）で表される基である、請求項１～６のいずれか一項に記載の化合物およびその塩。
   

   

   Ｘ^１およびＸ^２は、それぞれ独立して水素原子またはハロゲン原子であり、
   Ｒ^３、Ｒ^４は、それぞれ独立して、水素原子、水酸基、ケトン基、置換基を有してもよいアミノ基または置換基を有してもよい炭素数２～２０のアシル基である。
8. 前記ｎが１であり、かつ、前記Ｒ^２がカルボキシル基である、請求項１～７のいずれか一項に記載の化合物およびその塩。
9. 請求項１～８のいずれか一項に記載の化合物および前記化合物の塩からなる群から選ばれる少なくとも１種以上を用い、Ｃｙｓ－ＳＳＨを蛍光ラベリングする、方法。
10. Ｃｙｓ－ＳＳＨを蛍光ラベリングするための試薬であり、
    請求項１～８のいずれか一項に記載の化合物および前記化合物の塩からなる群から選ばれる少なくとも１種以上を含む、蛍光ラベリング用試薬。

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