WO2013180181A1 - 高感度膵液検出用蛍光プローブ、及び膵液検出方法 - Google Patents

高感度膵液検出用蛍光プローブ、及び膵液検出方法 Download PDF

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hmrg
amino acid
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泰照 浦野
雅世 坂部
哲雄 長野
武彰 石沢
俊 山下
典宏 國土
真子 神谷
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国立大学法人 東京大学
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Definitions

  • the present invention relates to a fluorescent probe for detecting pancreatic juice. More specifically, the present invention relates to a fluorescent probe for detecting protease activity in pancreatic juice, a detection method using the fluorescent probe, and a detection kit including the probe.
  • pancreatic cancer The number of deaths from pancreatic cancer has been increasing year by year, and is ranked at the top in the statistics by cause of cancer worldwide.
  • pancreatic cancer there are very few effective treatments for pancreatic cancer, and surgical resection of the cancer site is performed as the only treatment that can be expected to be completely cured.
  • simultaneous pancreatectomy is selected when cancer occurrence or metastasis is observed at the junction with the pancreas.
  • pancreatic fluid leakage in which pancreatic fluid leaks from the cross section of the pancreas after pancreatectomy.
  • pancreatic fluid leakage occurs, not only bacterial infection is caused, but also blood vessels are digested due to the self-digesting action of the pancreatic fluid to cause major bleeding, leading to death (Non-patent Document 1).
  • Non-patent Document 1 pancreatic fluid leakage has become the most important issue in pancreatectomy.
  • pancreatic fluid leakage Factors that make it difficult to prevent pancreatic fluid leakage are that the normal pancreatic duct is very thin and difficult to identify, so it is difficult to ligate all pancreatic duct stumps, and colorless transparent pancreatic fluid leaks during surgery There is no technology to make it visible.
  • ISGPF International study group on pancreatic fistula
  • pancreatic fluid leakage detection method that can replace the conventional measurement of amylase concentration in order to identify the pancreatic duct during surgery and confirm the leakage of pancreatic fluid quickly and accurately.
  • the problem to be solved by the present invention is to provide a fluorescent probe that can quickly and highly sensitively detect and image the presence of pancreatic fluid leakage during or after surgery, and a detection method and detection kit using the fluorescent probe. It is to provide.
  • chymotrypsin which is a protease contained in pancreatic juice
  • a xanthene skeleton compound having an amino acid residue as a fluorescent probe. It was also possible to detect the on / off fluorescence response, thereby detecting pancreatic juice quickly and with high sensitivity.
  • a simple procedure of attaching a cross section of the pancreas immediately after surgery to a piece of paper and spraying the fluorescent probe on the piece of paper makes it possible to image the pancreatic juice just one minute after the spraying, and to leak pancreatic juice It was found that it was very easy to identify the existence and location. Based on these findings, the present invention has been completed.
  • this invention provides the fluorescent probe for a pancreatic juice detection containing the compound or its salt represented by the following formula
  • A represents an amino acid residue or an N-substituted amino acid residue, wherein A is linked to NH in the adjacent formula by forming an amide bond;
  • R 1 is a hydrogen atom or a benzene ring.
  • Each represents 1 to 4 identical or different substituents;
  • R 2 , R 3 , R 4 , R 5 , R 6 , and R 7 each independently represents a hydrogen atom, a hydroxyl group, an alkyl group, or a halogen atom;
  • R 8 and R 9 each independently represent a hydrogen atom or an alkyl group;
  • X represents a C 1 -C 3 alkylene group.
  • R 1 , R 2 , R 3 , R 4 , R 5 , R 6 , R 7 , R 8 and R 9 are hydrogen atoms and X is a methylene group.
  • amino acid residues constituting the amino acid residues representing A and the N-substituted amino acid residues are preferably selected from hydrophobic amino acids, more preferably aromatic amino acids. These are particularly suitable when the fluorescent probe of the present invention targets chymotrypsin.
  • A is a group represented by the following formula (II).
  • the carbonyl group in formula (II) and NH in formula (I) are linked by forming an amide bond.
  • R 10 represents a substituted or unsubstituted acyl group.
  • the substituted acyl group may be an amino acid residue obtained by removing a hydroxyl group from a carboxy group, or a group obtained by removing a hydroxyl group from the C-terminal carboxy group of a peptide chain consisting of 1 to 5 amino acids.
  • the substituent may have one or more arbitrary substituents that may be the same or different.
  • R 10 is preferably selected from an acetyl group, a carbobenzoxy group, a benzoyl group, a succinyl group, a glutaryl group, or a substituent containing a part thereof.
  • R 10 is an amino acid residue obtained by removing a hydroxyl group from a carboxy group or a group obtained by removing a hydroxyl group from the C-terminal carboxy group of a peptide chain consisting of 1 to 5 amino acids, It is preferably substituted with an acetyl group, a carbobenzoxy group, a benzoyl group, a succinyl group, a glutaryl group, or a substituent containing a part thereof.
  • R 11 represents a hydrogen atom or a hydroxyl group, and when it is a hydroxyl group, R 11 is preferably in the para position.
  • A is one substituent selected from the groups represented by the following formulas (III) to (VI).
  • the carbonyl group of the phenylalanine residue part in Formula (III) and NH in Formula (I) are connected by forming an amide bond.
  • the carbonyl group of the tyrosine residue in formula (IV) and NH in formula (I) are linked by forming an amide bond.
  • the fluorescent probe of the present invention targets ⁇ -glutamyltransferase
  • an embodiment in which A is a ⁇ -glutamyl group is preferable.
  • the present invention detects the presence of pancreatic juice by contacting the fluorescent probe with a body fluid sample and observing a fluorescence response or a change in absorbance due to a reaction between the protease and the fluorescent probe contained in the sample.
  • the present invention provides a method for detecting pancreatic juice.
  • the protease is chymotrypsin or ⁇ -glutamyltransferase, more preferably chymotrypsin.
  • the protease is chymotrypsin
  • trypsin it is preferable to add trypsin to the body fluid sample when the fluorescent probe is brought into contact with the body fluid sample. Since chymotrypsin is secreted as a precursor chymotrypsinogen in pancreatic juice, it is preferable to perform measurement with the fluorescent probe of the present invention after conversion to active chymotrypsin by addition of trypsin. is there.
  • the fluorescence response can be visualized using fluorescence imaging means.
  • the fluorescent probe of the present invention is sprayed by attaching a portion suspected of leaking pancreatic juice to a piece of paper or the like, the fluorescence response by the probe molecule can be displayed in two dimensions by using the fluorescent imaging means. It becomes possible to visually recognize the location where the leakage occurs.
  • the present invention provides a pancreatic juice detection kit comprising the fluorescent probe.
  • the protease is chymotrypsin
  • it is a pancreatic juice detection kit containing the fluorescent probe and trypsin, and the fluorescent probe and trypsin are stored without mixing in the period until the kit is used.
  • a pancreatic juice detection kit characterized by
  • a xanthene skeleton compound having an amino acid residue as a fluorescent probe, chymotrypsin or the like, which is a protease contained in pancreatic juice, can be detected specifically and in an on / off fluorescent response in a short time, thereby
  • the present invention has an excellent effect that the presence and absence of pancreatic fluid leakage can be detected and imaged quickly and with high sensitivity during or after the operation.
  • pancreatic fluid can be detected in just a few minutes by simply performing a simple operation of adding a fluorescent probe to a subject.
  • Protease activity which is the main cause of the disease, can be directly measured. Therefore, it is superior in that pancreatic juice can be detected more rapidly and more reliably than conventional pancreatic juice detection based on amylase concentration measurement.
  • pancreatic fluid leakage in the pancreatic duct and pancreatic dissection can be accurately identified using the fluorescence imaging means, the leakage site of pancreatic fluid can be reliably closed by additional suture or the like to generate pancreatic fluid leakage Can be prevented, and serious complications due to pancreatic fluid leakage can be prevented.
  • pancreatic fluid leakage was significantly higher in the cases in which the fluorescence response was observed than in the cases in which the fluorescence response was not observed. Therefore, it became possible to identify the high risk group of postoperative pancreatic fluid leakage and perform postoperative drain management more safely and efficiently than before, and the occurrence of serious pancreatic fluid leakage and the resulting hospital death It contributes to the improvement of the rate.
  • the present invention can be performed with visible light that is safe for the living body, and the amount of the fluorescent probe to be used is very small. Visualization of pancreatic fluid leakage by spraying is sufficiently possible, which is extremely practical in these respects.
  • the present invention at the time of surgical laparotomy or laparoscopic surgery, the protease activity of each subject's pancreatic juice can be quickly grasped, which is also beneficial in selecting the surgical procedure.
  • FIG. 1 shows changes in absorption spectrum (FIG. 1a) and fluorescence spectrum due to addition of chymotrypsin to gPhe-HMRG, which is the fluorescent probe of the present invention (FIG. 1b).
  • FIG. 2 is a graph showing the temporal change in fluorescence intensity due to the addition of chymotrypsin to gPhe-HMRG, which is the fluorescent probe of the present invention. The arrows in the figure indicate the time of addition of chymotrypsin.
  • FIG. 3 is a graph showing changes in fluorescence intensity by adding pancreatic juice samples to gGlu-HMRG, which is the fluorescent probe of the present invention, and the ⁇ -glutamyltransferase specificity of the response.
  • FIG. 4 is a graph showing changes in fluorescence intensity by adding pancreatic juice samples to gPhe-HMRG, which is the fluorescent probe of the present invention, and chymotrypsin specificity of the response.
  • “+” indicates that the inhibitor and trypsin are added, and “ ⁇ ” indicates that the inhibitor and trypsin are not added.
  • the values in the bar graph are those obtained by calculating the standard error with 3 samples (* indicates p ⁇ 0.05, ** indicates p ⁇ 0.01).
  • FIG. 5 is a graph showing temporal changes in fluorescence intensity of gGlu-HMRG, gPhe-HMRG, and trypsin-added gPhe-HMRG (gPhe-HMRG-Try) for pancreatic juice, ascites, and intestinal fluid collected from patients.
  • FIG. 6 is a graph showing changes in fluorescence intensity by adding chymotrypsin to Bz-Tyr-HMRG, Glt-AAF-HMRG, and Suc-AAPF-HMRG, which are fluorescent probes of the present invention, and chymotrypsin specificity of the response. .
  • FIG. 7 is a view showing a fluorescence imaging image of pancreatic juice using gPhe-HMRG which is the fluorescent probe of the present invention.
  • FIG. 7a is a white light image to show the attachment site of pancreatic juice
  • the left side of FIG. 7b is a color image at 500-720 nm
  • the right side is a fluorescence image at 540 nm.
  • FIG. 8 is a view showing a fluorescence imaging image of pancreatic juice using gGlu-HMRG which is the fluorescent probe of the present invention.
  • FIG. 8a is a white light image to show the attachment site of pancreatic juice
  • the left side of FIG. 8b is a color image at 500-720 nm
  • the right side is a fluorescence image at 540 nm.
  • the alkyl group may be any of an alkyl group composed of linear, branched, cyclic, or a combination thereof.
  • the number of carbon atoms of the alkyl group is not particularly limited, but is, for example, about 1 to 6 carbon atoms, preferably about 1 to 4 carbon atoms.
  • the alkyl group may have one or more arbitrary substituents. Examples of the substituent include an alkoxy group, a halogen atom (which may be a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom, or an iodine atom), an amino group, a mono- or di-substituted amino group, a substituted silyl group, or Although an acyl group etc.
  • alkyl group has two or more substituents, they may be the same or different. The same applies to the alkyl moiety of other substituents containing an alkyl moiety (for example, an alkyloxy group or an aralkyl group).
  • the aryl group may be either a monocyclic aryl group or a condensed polycyclic aryl group, and a hetero atom (for example, an oxygen atom, a nitrogen atom, or a sulfur atom) as a ring constituent atom 1 or more may be included.
  • an aryl group may have one or more arbitrary substituents on the ring. Examples of the substituent include, but are not limited to, an alkoxy group, a halogen atom, an amino group, a mono- or di-substituted amino group, a substituted silyl group, and an acyl group.
  • the aryl group has two or more substituents, they may be the same or different. The same applies to the aryl moiety of other substituents containing an aryl moiety (for example, an aryloxy group and an aralkyl group).
  • Fluorescent probe molecule is a compound having a structure represented by the following general formula (I).
  • R 1 represents a hydrogen atom or 1 to 4 substituents bonded to a benzene ring.
  • substituents include, but are not limited to, an alkyl group, an alkoxy group, a halogen atom, an amino group, a mono- or di-substituted amino group, a substituted silyl group, and an acyl group.
  • R 1 is preferably a hydrogen atom.
  • R 2 , R 3 , R 4 , R 5 , R 6 , and R 7 each independently represent a hydrogen atom, a hydroxyl group, an alkyl group, or a halogen atom.
  • R 2 and R 7 are preferably hydrogen atoms. It is also preferred that R 3 , R 4 , R 5 , R 6 are hydrogen atoms. More preferably, R 2 , R 3 , R 4 , R 5 , R 6 , and R 7 are all hydrogen atoms.
  • R 8 and R 9 each independently represent a hydrogen atom or an alkyl group.
  • R 8 and R 9 both represent an alkyl group, they may be the same or different.
  • both R 8 and R 9 are hydrogen atoms
  • R 8 and R 9 are hydrogen atoms. Is more preferable.
  • X represents a C 1 -C 3 alkylene group.
  • the alkylene group may be a linear alkylene group or a branched alkylene group.
  • a methylene group —CH 2 —
  • an ethylene group —CH 2 —CH 2 —
  • a propylene group —CH 2 —CH 2 —CH 2 —
  • a branched alkylene group such as —CH ( CH 3 ) —, —CH 2 —CH (CH 3 ) —, —CH (CH 2 CH 3 ) — and the like can also be used.
  • a methylene group or an ethylene group is preferable, and a methylene group is more preferable.
  • A represents an amino acid residue or an N-substituted amino acid residue.
  • the “amino acid residue” means one having the same structure as the so-called N-terminal residue, which is the same as the remaining partial structure obtained by removing the hydroxyl group from the carboxy group of the amino acid.
  • A is constituted by linking a plurality of amino acid residues.
  • the C-terminal amino acid residue has a hydroxyl group from the carboxy group of the amino acid as described above.
  • a partial structure in which a hydrogen atom is removed from the amino group is sufficient, and the intermediate and N-terminal amino acid residues can be linked in the same manner as a normal peptide chain.
  • A is linked to NH in the adjacent formula by forming an amide bond, that is, the carbonyl moiety of the amino acid residue and formula (I) NH are linked to the xanthene skeleton by forming an amide bond. is doing.
  • the “N-substituted amino acid residue” refers to one in which a hydrogen atom in the amino group of the amino acid residue is substituted.
  • amino acid may be any compound as long as it is a compound having both an amino group and a carboxy group, and includes natural and non-natural compounds. It may be any of neutral amino acids, basic amino acids, or acidic amino acids. In addition to amino acids that themselves function as transmitters such as neurotransmitters, bioactive peptides (in addition to dipeptides, tripeptides, tetrapeptides, An amino acid that is a constituent component of a polypeptide compound such as an oligopeptide or a protein can be used. As the amino acid, an optically active amino acid is preferably used. For example, as the ⁇ -amino acid, either D- or L-amino acid may be used, but it may be preferable to select an optically active amino acid that functions in a living body.
  • A should be an amino acid residue that is hydrolyzed by the target protease and can cleave the amide bond of A-NH in formula (I).
  • amino acids include 20 kinds of L-amino acids constituting proteins, selenocysteine, pyrrolysine, cystine, hydroxyproline, hydroxylysine, thyroxine, O-phosphoserine, desmosine, ⁇ -Alanine, sarcosine, ornithine, creatine, ⁇ -aminobutyric acid, or opine are included.
  • the amino acid residue in A is preferably composed of an aromatic amino acid or a hydrophobic amino acid.
  • amino acids include phenylalanine, tryptophan, tyrosine, leucine, isoleucine, norleucine, valine, norvaline, methionine, and their N-substituted residues, preferably phenylalanine, tryptophan, Tyrosine and their N-substituted residues, more preferably phenylalanine and N-substituted phenylalanine residues, tyrosine and N-substituted tyrosine.
  • A is preferably ⁇ -glutamyl.
  • a preferred embodiment of A is an N-substituted phenylalanine residue and an N-substituted tyrosine residue represented by the following formula (II), which is preferable when targeting chymotopsin as described above.
  • R 10 is a substituted or unsubstituted acyl group.
  • the acyl group may contain one or more heteroatoms and may have one or more arbitrary substituents.
  • the substituent include alkyl groups, alkenyl groups, alkynyl groups, aryl groups, alkoxy groups, amide groups, halogen atoms, amino groups, mono- or di-substituted amino groups, substituted silyl groups, and acyl groups. However, it is not limited to these. When it has two or more substituents, they may be the same or different.
  • the substituted acyl group may be an amino acid residue obtained by removing a hydroxyl group from a carboxy group.
  • R 10 is an aliphatic acyl group or an aromatic acyl group, and may be an aliphatic acyl group having an aromatic group as a substituent. These substituents may also contain one or more heteroatoms, and may further have one or more optional substituents as described above.
  • R 10 is preferably an acyl group having a polar group such as a carboxy group, an amino group, a carbonyl group, an amide group, or a hydroxyl group at the terminal of R 10 .
  • R 10 is an acetyl group (CH 3 CO—), a carbobenzoxy group (cbz group) (C 6 H 5 CH 2 OCO—), a benzoyl group (C 6 H 5 CO—), a succinyl group. It is preferably (HOOC—CH 2 CH 2 CO—), a glutaryl group (HOOC—CH 2 CH 2 CH 2 CO—), or a substituent partially containing these.
  • R 10 is an amino acid residue obtained by removing a hydroxyl group from a carboxy group, or a group obtained by removing a hydroxyl group from the C-terminal carboxy group of a peptide chain consisting of 1 to 5 amino acids, the N terminus is an amino acid in any case.
  • the N terminal of the residue is a group selected from an acetyl group, a carbobenzoxy group, a benzoyl group, a succinyl group, a glutaryl group, or a substituent partially containing these.
  • R 11 represents a hydrogen atom or a hydroxyl group, and when it is a hydroxyl group, R 11 is preferably in the para position.
  • A is one substituent selected from the groups represented by the following formulas (III) to (VI). This is preferred when targeting chymotopsin as described above.
  • the compound represented by the above general formula (I) may exist as a salt.
  • the salt include base addition salts, acid addition salts, amino acid salts and the like.
  • the base addition salt include metal salts such as sodium salt, potassium salt, calcium salt, magnesium salt, ammonium salt, or organic amine salts such as triethylamine salt, piperidine salt, morpholine salt, and acid addition salt.
  • Examples thereof include mineral acid salts such as hydrochloride, sulfate, and nitrate, and organic acid salts such as methanesulfonate, paratoluenesulfonate, citrate, and oxalate.
  • Examples of amino acid salts include glycine salts.
  • the salt of the compound of the present invention is not limited to these.
  • the compound represented by the general formula (I) may have one or more asymmetric carbons depending on the type of substituent, and there are stereoisomers such as optical isomers or diastereoisomers. There is a case. Pure forms of stereoisomers, any mixture of stereoisomers, racemates, and the like are all within the scope of the present invention.
  • the compound represented by the general formula (I) or a salt thereof may exist as a hydrate or a solvate, and any of these substances is included in the scope of the present invention.
  • solvents such as ethanol, acetone, isopropanol, can be illustrated.
  • the compound represented by the general formula (I) uses, for example, a xanthene compound having an amino group at the 3-position and the 6-position and a 2-carboxyphenyl group or 2-alkoxycarbonylphenyl group at the 9-position as a raw material.
  • a xanthene compound having an amino group at the 3-position and the 6-position and a 2-carboxyphenyl group or 2-alkoxycarbonylphenyl group at the 9-position as a raw material.
  • a xanthene compound having an amino group at the 3-position and the 6-position and a 2-carboxyphenyl group or 2-alkoxycarbonylphenyl group at the 9-position as a raw material.
  • a xanthene compound having an amino group at the 3-position and the 6-position and a 2-carboxyphenyl group or 2-alkoxycarbonylphenyl group at the 9-position as a raw material.
  • 3,6-diaminoxanthene compounds that can be used as raw materials include, for example, commercially available rhodamine 110 and rhodamine 123, but are not limited thereto, and the structure of the target compound is not limited thereto.
  • An appropriate xanthene compound can be selected accordingly.
  • skeleton of the aspect which substituted the oxygen atom of the xanthene skeleton part in the compound represented by general formula (I) by the carbon atom which has a specific substituent, a silicon atom, a germanium atom, a tin atom, or a lead atom Can be used to produce a fluorescent probe having the same function as in the general formula (I) in the present invention.
  • the fluorescent probe of the present invention is substantially in the neutral region (for example, in the range of pH 5 to 9) when the upper part of the xanthene skeleton represented by the general formula (I) is closed. It is non-fluorescent.
  • the amide bond with A-NH is hydrolyzed by a protease, the ring-opened tautomer is rapidly formed, resulting in the following highly fluorescent compound.
  • the fluorescent probe of the present invention containing the compound represented by the general formula (I) or a salt thereof as an active ingredient has the property of being hydrolyzed by a protease present in pancreatic juice and giving the ring-opened compound that emits strong fluorescence. And when it is added to a subject such as a body fluid, it emits strong fluorescence in several tens of seconds to several minutes. Therefore, by using the fluorescent probe of the present invention, the protease activity can be measured by the change in fluorescence intensity, and the presence of pancreatic juice containing the protease can be detected.
  • the compound represented by the general formula (I) or a salt thereof hardly emits fluorescence when irradiated with excitation light of, for example, about 440 to 500 nm in the neutral region.
  • the compound has a property of emitting extremely strong fluorescence (for example, emission: 524 nm) under the same conditions. Therefore, when detection is performed using the fluorescent probe of the present invention, it is usually sufficient to irradiate visible light of about 440 to 500 nm, preferably about 445 to 490 nm, more preferably about 450 to 480 nm.
  • the fluorescence wavelength to be observed is usually about 510 to 800 nm. For example, it is preferable to observe fluorescence of about 516 to 556 nm.
  • pancreatic juice detection method using a fluorescent probe the presence of pancreatic fluid can be detected by bringing the fluorescent probe into contact with a body fluid sample and observing the fluorescence response due to the reaction between the protease and the fluorescent probe contained in the sample.
  • the protease is chymotrypsin or ⁇ -glutamyltransferase, more preferably chymotrypsin.
  • the term “detection” should be interpreted in the broadest sense including measurement for various purposes such as quantification and qualitative.
  • the compound represented by the general formula (I) or a salt thereof hardly absorbs light having a wavelength of 350 nm or more in the neutral region, but is hydrolyzed by a protease present in pancreatic juice to be converted into the above ring-opened compound. Then, as the structure changes, the absorption spectrum in the UV-visible region changes, and light having a wavelength of 350 nm or more is also absorbed. Therefore, in some cases, the change in the UV-visible absorption spectrum (for example, at a specific absorption wavelength) It is also possible to detect the reaction between the protease and the fluorescent probe based on changes in absorbance.
  • Chymotrypsin is secreted into the pancreatic juice as a precursor chymotrypsinogen, but is known to be activated by reaction with trypsin. Therefore, after conversion into active chymotrypsin by addition of trypsin, in order to perform measurement with the fluorescent probe of the present invention, trypsin is added to the measurement sample before or simultaneously with addition of the fluorescent probe to the measurement sample. Is preferred.
  • the form of the bodily fluid sample that is an analyte for fluorescence detection is not particularly limited.
  • liquid collected from the abdominal cavity of a patient or the like during or after surgery a piece of paper such as a filter paper or a towel removed from the excised pancreas
  • a piece of paper such as a filter paper or a towel removed from the excised pancreas
  • examples thereof include a liquid adhering to any water-absorbing material, or a liquid adhering to or flowing out of the surface of the pancreas itself remaining after the excision of the tumor.
  • a sample containing a fluorescent probe may be added, applied, or sprayed. It is possible to select appropriately according to the situation.
  • a fluorometer having a wide measurement wavelength can be used, but a fluorescence imaging apparatus capable of displaying a fluorescence emission site as a two-dimensional image can also be used.
  • fluorescence imaging means By using fluorescence imaging means, the fluorescence response can be visualized two-dimensionally, so that the position of the pancreatic duct or the location where pancreatic juice leaks can be viewed instantaneously.
  • a small-sized and portable fluorescence detector and fluorescence imaging apparatus are preferable in order to measure a body fluid sample collected from a subject during surgery or the like.
  • the pancreatic juice detection method of the present invention can be performed, for example, during surgery, during examination, or after surgery.
  • the term “surgery” refers to any application applied for the treatment of pancreatic diseases such as pancreatic cancer and bile duct cancer, including endoscopic surgery such as endoscope or laparoscope. Includes surgery.
  • the term “examination” includes examinations performed on tissues separated and collected from a living body, as well as examinations using an endoscope and treatment such as excision and collection of tissues associated with examinations. These terms must be interpreted in the broadest sense and should not be interpreted in any way restrictive.
  • the measurement of protease by the method of the present invention can generally be carried out under neutral conditions, for example, in the range of pH 5.0 to 9.0, preferably in the range of pH 6.0 to 8.0, more preferably Can be carried out in the range of pH 6.8 to 7.6.
  • any pH adjusting agent or buffer known in the art such as a phosphate buffer can be used.
  • the application concentration of the fluorescent probe of the present invention is not particularly limited, but for example, a solution having a concentration of about 1 to 1,000 ⁇ M can be applied.
  • the compound represented by the above general formula (I) or a salt thereof may be used as it is, but if necessary, a composition containing additives usually used in the preparation of reagents. It may be used as For example, additives such as a solubilizer, pH adjuster, buffer, and isotonic agent can be used as an additive for using the reagent in a physiological environment. Is possible.
  • additives such as a solubilizer, pH adjuster, buffer, and isotonic agent can be used as an additive for using the reagent in a physiological environment.
  • These compositions are generally provided as a composition in an appropriate form such as a mixture in powder form, a lyophilized product, a granule, a tablet, or a liquid, but distilled water for injection or an appropriate buffer at the time of use. It is sufficient to dissolve and apply to.
  • pancreatic fluid detection kit including the fluorescent probe.
  • the fluorescent probe and trypsin are contained without mixing the fluorescent probe and trypsin in a period until measurement is performed. This is because when a fluorescent probe and trypsin are mixed for a long time, they may react with each other, and therefore it is desirable to store them separately until immediately before measuring the specimen.
  • the fluorescent probe and trypsin do not necessarily have to be stored in separate and independent containers, and as long as they are in an environment where they are not mixed, a plurality of integrated or linked storages are stored.
  • a container having a region can be used.
  • the fluorescent probe or trypsin of the present invention is usually prepared as a solution.
  • it is provided as a composition in an appropriate form such as a powdered mixture, a lyophilized product, a granule, a tablet, or a liquid.
  • a composition in an appropriate form such as a powdered mixture, a lyophilized product, a granule, a tablet, or a liquid.
  • it can also be dissolved and applied in distilled water for injection or an appropriate buffer.
  • the kit may appropriately contain other reagents as necessary.
  • additives such as solubilizers, pH adjusters, buffers, and isotonic agents can be used as additives, and the amount of these additives can be appropriately selected by those skilled in the art.
  • gPhe-HRMG glutamyl-phenylalanine hydroxymethyl rhodamine green
  • the obtained solid was dissolved in 5 mL of dichloromethane and 22.8 mg (0.200 mmol, 3.8 eq.) Of glutaric anhydride and 28.2 ⁇ L (0.200 mmol, 3.8 eq.) Of TEA were added. For 15 hours at room temperature. Subsequently, the solvent was removed under reduced pressure, a 20% piperidine / DMF solution was added, and the mixture was stirred at room temperature for 30 minutes.
  • gGlu-HRMG ⁇ -glutamyl hydroxymethyl rhodamine green
  • gGlu-HRMG ⁇ -glutamyl hydroxymethyl rhodamine green
  • Bz-Tyr-HMRG (benzoyltyrosine hydroxymethyl rhodamine green), which is a fluorescent probe of the present invention, was synthesized according to the following scheme.
  • the fluorescent probes of the present invention Glt-Ala-Ala-Phe-HMRG (Glt-AAF-HMRG; glutaryl-alanine-alanine-phenylalanine hydroxymethyl rhodamine green) and Suc-Ala-Ala-Pro-Phe -HMRG (Suc-AAPF-HMRG; succinyl-alanine-alanine-proline-phenylalanine hydroxymethyl rhodamine green) was synthesized.
  • Glt-AAF-HMRG glutaryl-alanine-alanine-phenylalanine hydroxymethyl rhodamine green
  • Suc-Ala-Ala-Pro-Phe -HMRG Suc-AAPF-HMRG; succinyl-alanine-alanine-proline-phenylalanine hydroxymethyl rhodamine green
  • N-Boc protected peptides 6 and 9 are prelude automatic solid phases manufactured by Protein Technologies.
  • the following ordinary Fmoc solid phase synthesis method using H-Phe-Trt (2-Cl) -Resin (0.94 mmol / g, 100-200 mesh, 1% DVB (divinylbenzene)) using a synthesizer was synthesized.
  • Peptide coupling cycle Fmoc amino acid (4 equivalents of resin) and O- (benzotriazol-1-yl) -N, N, N ′, N ′,-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HBTU) : 4 equivalents of resin) was dissolved in DMF, and diisopropylethylamine (DIPEA: 8 equivalents of resin) was added and stirred. This solution was added to a resin coupled with N-terminal deprotected peptide and stirred for 2.5 minutes.
  • DIPEA diisopropylethylamine
  • Fmoc deprotection cycle The Fmoc protecting group was deprotected by adding a 20% (v / v) piperidine / DMF solution to the resin and stirring for 12 minutes.
  • Cleavage from resin A solution of 10% acetic acid, 20% 2,2,2-trifluoroethanol and 70% dichloromethane was added to the resin and stirred for 1 hour to cleave the peptide from the resin. The resin was removed by filtration, the filtrate was removed under reduced pressure, and an excessive amount of cooled diisopropyl ether was added to the residue, and the resulting precipitate was collected by filtration to obtain N-Boc protected peptide compounds 6 and 9.
  • the organic solvent was removed under reduced pressure, 5 mL of dichloromethane, 9.7 mg (0.085 mmol, 4.7 eq.) Of glutaric anhydride and 11.8 ⁇ L (0.085 mmol, 4.7 eq.) Of triethylamine were added, and the mixture was stirred at room temperature for 20 hours. Next, the reaction solvent was removed under reduced pressure, 1 mL of a 20% piperidine / DMF solution was added, and the mixture was stirred at room temperature for 1 hour.
  • Fluorescence assay using chymotrypsin The gPhe-HMRG compound having an amino acid residue based on N-substituted phenylalanine synthesized in Example 1 was dissolved in a neutral phosphate buffer, chymotrypsin was allowed to act, and the fluorescence assay was performed. .
  • gPhe-HMRG showed little fluorescence response to the precursor chymotrypsinogen, but excellent fluorescence response to chymotrypsin after activation by trypsin.
  • chymostatin which is an inhibitor of chymotrypsin
  • the fluorescence intensity decreased significantly. From these results, it was confirmed that gPhe-HMRG can specifically detect chymotrypsin activity in pancreatic juice.
  • the response behavior of the fluorescent probe to body fluids other than pancreatic juice was compared using a drain sample collected from a patient who had undergone pancreatic resection surgery. Changes in the fluorescence intensity of gGlu-HMRG, gPhe-HMRG, and trypsin-added gPhe-HMRG (gPhe-HMRG-Try) were measured for a total of 76 samples of pancreatic juice, ascites and intestinal fluid collected from 18 patients.
  • pancreatic fluid can be selectively detected by using gPhe-HMRG and trypsin in combination.
  • gPhe-HMRG (added with trypsin) showed a better fluorescence response than gGlu-HMRG, but it detected pancreatic juice with the fluorescent probe molecule alone (ie, without the addition of trypsin). In terms of being able to do so, gGlu-HMRG is considered to be very useful in an environment where intestinal fluid or the like does not exist.
  • ⁇ Measurement conditions Substrate final concentration: 1 ⁇ M (Calculate and adjust stock concentration from absorbance at pH 3) Buffer: PBS, pH 7.4 Inhibitor (chymostatin): 10 ⁇ M Chymotrypsin: 2U Incubation time: 10 minutes, 20 minutes, 30 minutes (FIG. 6 shows fluorescence intensity values after 30 minutes) Measuring device: Corona plate reader (SH8000) Excitation fluorescence wavelength: 501 nm, 524 nm
  • the obtained fluorescence response results are shown in FIG. 6 as average values of a plurality of samples.
  • an increase in fluorescence intensity was observed in all the fluorescent probes.
  • a chymotrypsin inhibitor chymostatin
  • the fluorescence intensity decreased significantly, so that it was demonstrated that all of these fluorescent probes can specifically detect chymotrypsin activity in pancreatic juice.
  • Fluorescence imaging of human pancreatic juice Using gPhe-HMRG and gGlu-HMRG as fluorescent probes fluorescent imaging of pancreatic juice in the isolated pancreas was performed. Assuming that the pancreatic juice that is the target of measurement is used during surgery, use wipe towels and laboratory filter paper used in the medical field (paper with low background fluorescence). It was. Specifically, a pancreas piece immediately after being removed by surgery was collected, and a towel and filter paper were adhered to the separated surface to attach pancreatic juice. Thereafter, gPhe-HMRG (containing trypsin) and gGlu-HMRG probe solution were sprayed on the adhered paper to start imaging.
  • gPhe-HMRG containing trypsin
  • gGlu-HMRG probe solution were sprayed on the adhered paper to start imaging.
  • FIG. 7a and FIG. 8a show white light images of places where pancreatic juice is attached.
  • the left side of FIGS. 7b and 8b is a color image at 500-720 nm, and the right side is a fluorescence image at 540 nm.
  • the pancreatic juice adhering portion was successfully visualized within a few minutes after the probe was sprayed.
  • gPhe-HMRG a clear fluorescence response that was discernable with the naked eye was recognized 1 minute after spraying.
  • pancreatic fluid was selected by confirming the fluorescence response because the fluorescence response was not observed for the body fluid adhering portion other than the pancreatic fluid (the blue solid line frame in FIG. 7a). It was demonstrated that it can be detected and imaged automatically.

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Abstract

【課題】　術中或いは術後において膵液の漏出の存在を迅速かつ高感度に検出及びイメージングすることができる蛍光プローブ、さらには、当該蛍光プローブを用いた検出方法及び検出キットを提供する。 【解決手段】　以下の式（Ｉ）で表される化合物又はその塩を含む膵液検出用蛍光プローブ： (I)（式中、Ａはアミノ酸残基又はＮ－置換アミノ酸残基を表し、ここで、Ａは隣接する式中のＮＨとアミド結合を形成して連結しており；Ｒ１は水素原子又はベンゼン環に結合する1個ないし4個の同一又は異なる置換基を表し；Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、及びＲ７はそれぞれ独立に水素原子、水酸基、アルキル基、又はハロゲン原子を表し；Ｒ８及びＲ９はそれぞれ独立に水素原子又はアルキル基を示し；ＸはＣ１-Ｃ３アルキレン基を表す）。

Description

高感度膵液検出用蛍光プローブ、及び膵液検出方法
　本発明は、膵液検出用の蛍光プローブに関する。より詳細には、膵液中のプロテアーゼ活性を検出するための蛍光プローブ、当該蛍光プローブを用いた検出方法、及び当該プローブを含む検出キットに関する。
　膵臓がんによる死亡者数は年々増加の一途を辿っており、世界的にもがんの死因別統計で上位に位置付けられている。しかしながら、膵臓がんに対する効果的な治療法は極めて少なく、完治が期待できるほぼ唯一の治療法として、がん部位の外科的切除が行われている。また、胆管がんについても、膵臓との合流地点にがんの発生や転移が認められた場合には、膵臓の同時切除が選択される。
　現在、このような膵切除の手術件数は、米国でおよそ４万件、日本でも１万件以上に至っているが、術後の死亡率は経験豊富な医療施設でも数パーセントに及び、手術経験の少ない医師による場合にはそれが更に増加することが報告されている。その原因の一つとして、膵切除後に膵断面から膵液が漏れる「膵液漏」が挙げられる。膵液漏が起こると、細菌感染を引き起こすだけでなく、膵液の自己消化作用により血管が消化され大出血を起こし、死に至る危険性がある（非特許文献１）。このため膵液漏は、膵切除術における最も重要な課題となっている。膵液漏の発生とその重篤化を防ぐために様々な膵切除法と術後管理法が検討されているものの、いまだに３０～５０％の頻度で膵液漏が生じている。
　膵液漏の防止を困難にする要因は、正常な膵管は非常に細く、同定し難いため、全ての膵管断端を結紮処理することは困難であることに加え、無色透明な膵液の漏出を術中に視認可能とする技術がないことである。現在、膵液漏を検出するための手法として、ＩＳＧＰＦ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｓｔｕｄｙ ｇｒｏｕｐ ｏｎ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｆｉｓｔｕｌａ）によって提唱されている、腹腔内ドレーン排液中における糖分解酵素であるアミラーゼの濃度の測定が用いられている（非特許文献２及び３）。しかしながら、当該手法は、検出結果を得るまでに時間を要することに加えて、重篤な術後合併症を引き起こす膵液の上記自己消化作用の主体と考えられるプロテアーゼを直接測定するものではなく、術後の膵液漏の重篤度を必ずしも正確に反映するとは限らないことが指摘されている（非特許文献４及び５）。
　このような背景から、手術中に膵管を同定し、膵液の漏出を迅速かつ的確に確認するための、従来のアミラーゼ濃度の測定に代わる新たな膵液漏の検出方法の確立が強く望まれている。
Ｄ．Ｆｕｋｓ　ｅｔ　ａｌ．、Ａｍ　Ｊ　Ｓｕｒｇ．、２００９、１９７、 ７０２－７０９． Ｃ．Ｂａｓｓｉ　ｅｔ　ａｌ．、Ｓｕｒｇｅｒｙ．、２００５，１３８、８－１３． Ｅ．Ｍｏｌｉｎａｒｉ、Ｃ．Ｂａｓｓｉ、Ｒ．Ｓａｌｖｉａ、ｅｔ　ａｌ．、Ａｎｎ　Ｓｕｒｇ．、２００７、２４６、２８１－２８７． Ｈ．Ｓｈｉｎｃｈｉ、Ｋ．Ｗａｄａ、ＬＷ．Ｔｒａｖｅｒｓｏ、Ｊ　Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ　Ｓｕｒｇ．、２００６、１０、４９０－４９８． ＹＭ．Ｓｈｙｒ、ＣＨ．Ｓｕ、 ＣＷ．Ｗｕ、ｅｔ　ａｌ．、Ｗｏｒｌｄ　Ｊ　Ｓｕｒｇ．、２００３、２７、６０６－６１０．
　本発明の解決しようする課題は、術中或いは術後において膵液の漏出の存在を迅速かつ高感度に検出及びイメージングすることができる蛍光プローブ、さらには、当該蛍光プローブを用いた検出方法及び検出キットを提供することにある。
　本発明者らは、上記課題を解決するべく鋭意検討を行った結果、アミノ酸残基を有するキサンテン骨格の化合物を蛍光プローブとして用いることにより、膵液中に含まれるプロテアーゼであるキモトリプシン等を特異的にかつｏｎ／ｏｆｆ蛍光応答で検出することができ、それによって、迅速かつ高感度に膵液の検出が可能となることを見出した。また、手術で摘出した直後の膵臓の離断面を紙片等に付着させ、当該紙片等に上記蛍光プローブを噴霧するという簡単な手順によって、噴霧からわずか１分後に膵液のイメージングが可能となり、膵液漏の存在とその場所の特定を極めて容易に行えることを見出した。これら知見に基づき、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は、一態様において、以下の式（Ｉ）で表される化合物又はその塩を含む膵液検出用蛍光プローブを提供するものである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
　式中、Ａはアミノ酸残基又はＮ－置換アミノ酸残基を表し、ここで、Ａは隣接する式中のＮＨとアミド結合を形成して連結しており；Ｒ１は水素原子又はベンゼン環に結合する1個ないし4個の同一又は異なる置換基を表し；Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、及びＲ７はそれぞれ独立に水素原子、水酸基、アルキル基、又はハロゲン原子を表し；Ｒ８及びＲ９はそれぞれ独立に水素原子又はアルキル基を示し；ＸはＣ１-Ｃ３アルキレン基を表す。好ましくは、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８及びＲ９が水素原子であり、Ｘがメチレン基である。
　上記のＡを表すアミノ酸残基及びＮ－置換アミノ酸残基を構成するアミノ酸は、好ましくは疎水性アミノ酸、より好ましくは芳香族アミノ酸から選択される。これらは、特に、本発明の蛍光プローブがキモトリプシンを標的とする場合に好適である。
　本発明の一つの好ましい態様において、Ａは以下の式（ＩＩ）で表される基である。ここで、式（ＩＩ）中のカルボニル基と式（Ｉ）中のＮＨがアミド結合を形成して連結している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
　式中、Ｒ１０は、置換又は無置換のアシル基を表す。置換アシル基はカルボキシ基から水酸基を除いたアミノ酸残基、あるいは１個乃至５個のアミノ酸よりなるペプチド鎖のＣ末端カルボキシ基から水酸基を除いた基であってもよい。当該置換基は、同一でも異なってもよい１以上の任意の置換基を有することができる。Ｒ１０は、アセチル基、カルボベンゾキシ基、ベンゾイル基、スクシニル基、グルタリル基、又はこれらを一部に含む置換基から選択されることが好ましい。Ｒ１０が、カルボキシ基から水酸基を除いたアミノ酸残基、あるいは１個乃至５個のアミノ酸よりなるペプチド鎖のＣ末端カルボキシ基から水酸基を除いた基である場合には、いずれもＮ末端が、アセチル基、カルボベンゾキシ基、ベンゾイル基、スクシニル基、グルタリル基、又はこれらを一部に含む置換基で置換されていることが好ましい。また、Ｒ１１は水素原子又は水酸基を表し、水酸基である場合には、Ｒ１１は、好ましくはパラ位である。
　本発明の一つの好ましい態様において、Ａは以下の式（ＩＩＩ）～（ＶＩ）で表される基から選択される１の置換基である。ここで、式（ＩＩＩ）中のフェニルアラニン残基部分のカルボニル基と式（Ｉ）中のＮＨがアミド結合を形成して連結している。式（Ｖ）～（ＶＩ）についても同様である。また、式（ＩＶ）中のチロシン残基部分のカルボニル基と式（Ｉ）中のＮＨがアミド結合を形成して連結している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
　また、本発明の蛍光プローブがγ－グルタミルトランスフェラーゼを標的とする場合には、Ａはγ－グルタミル基である態様が好適である。
　別の態様において、本発明は、上記蛍光プローブを体液試料と接触させ、当該試料中に含まれるプロテアーゼと蛍光プローブの反応による蛍光応答又は吸光度変化を観測することにより、膵液の存在を検出することを特徴とする、膵液検出方法を提供するものである。
　好ましい態様では、上記プロテアーゼは、キモトリプシン又はγ－グルタミルトランスフェラーゼであり、より好ましくは、キモトリプシンである。
　上記プロテアーゼがキモトリプシンである場合、蛍光プローブと体液試料を接触させる際に上記体液試料中にトリプシンを添加することが好ましい。キモトリプシンは、膵液中に前駆体であるキモトリプシノーゲンとして分泌されるため、トリプシンの添加によって活性型のキモトリプシンに変換させた後、本発明の蛍光プローブによる測定を行うことが好適であることによるものである。
　好ましくは、本発明の検出方法において、前記蛍光応答を、蛍光イメージング手段を用いて可視化することができる。膵液漏が疑われる箇所を紙片等に付着させて本発明の蛍光プローブを噴霧すれば、蛍光イメージング手段を用いることによって、プローブ分子による蛍光応答を二次元で表示できるため、膵管の位置、或いは膵液漏が生じている箇所を瞬時に視認することが可能となる。
　更に別の態様において、本発明は、上記蛍光プローブを含む膵液検出用キットを提供するものである。上記プロテアーゼがキモトリプシンである場合、好ましくは、上記蛍光プローブとトリプシンを含む膵液検出用キットであって、当該キットが使用されるまでの期間において蛍光プローブとトリプシンが混合することなく格納されていることを特徴とする、膵液検出用キットである。
　本発明は、アミノ酸残基を有するキサンテン骨格の化合物を蛍光プローブとして用いることにより、膵液中に含まれるプロテアーゼであるキモトリプシン等を特異的にかつｏｎ／ｏｆｆ蛍光応答で短時間で検出でき、それによって、術中或いは術後において膵液の漏出の存在を迅速かつ高感度に検出及びイメージングすることできるという優れた効果を奏するものである。
　本発明の蛍光プローブ及び検出方法によれば、被検体に蛍光プローブを添加するという簡便な操作を行うだけで、わずか数分で膵液の検出が可能であり、加えて、膵液漏による術後合併症の主因であるプロテアーゼ活性を直接測定することができる。従って、従来のアミラーゼ濃度測定による膵液検出に比べて、より迅速かつ高い信頼性で膵液を検出できるという点で優れている。
　また、本発明によれば、膵管及び膵臓切離における膵液漏の場所を、蛍光イメージング手段を用いて正確に特定できるため、膵液の漏出部位を追加縫合等により確実に閉鎖して膵液漏の発生を予防することができ、膵液漏による重篤な合併症の防止が可能となる。
　さらに、本発明によって手術中に膵断端からの膵液の漏出の有無を確認したところ、蛍光応答を認めた症例において、蛍光応答を認めなかった症例よりも術後膵漏の発生が有意に高かったことから、術後膵液漏の高リスク群を識別して、従来よりも安全かつ効率的に術後ドレーン管理を行うことが可能となり、重篤な膵液漏れの発生とその結果起こる在院死亡率の改善に寄与するものである。
　本発明は、上記のように検出手順が簡便であることに加えて、生体にとって安全な可視光により行うことができ、また、使用する蛍光プローブの量も極めて微量であることから体内への直接散布による膵液漏の可視化も十分に可能であり、これらの点で極めて実用性に優れたものである。
　よって、本発明を外科開腹手術時、腹腔鏡手術時に適用することで、被検者個々の膵液のプロテアーゼ活性を迅速に把握できるため、術式の選択においても有益である。
図１は、本発明の蛍光プローブであるｇＰｈｅ－ＨＭＲＧへのキモトリプシン添加による吸収スペクトル変化（図１ａ）及び蛍光スペクトル変化を示した図（図１ｂ）である。 図２は、本発明の蛍光プローブであるｇＰｈｅ－ＨＭＲＧへのキモトリプシン添加による蛍光強度の時間変化を示した図である。図中の矢印は、キモトリプシンの添加時点を示している。 図３は、本発明の蛍光プローブであるｇＧｌｕ－ＨＭＲＧへの膵液サンプル添加による蛍光強度変化及び当該応答のγ－グルタミルトランスフェラーゼ特異性を示した図である。図中、阻害剤について、添加した場合を「＋」、添加していない場合を「－」で示している。棒グラフの値は、標本数3で標準誤差を算出したものである（*はp　＜０．０５、**はｐ　＜０．０１を示す）。 図４は、本発明の蛍光プローブであるｇＰｈｅ－ＨＭＲＧへの膵液サンプル添加による蛍光強度変化及び当該応答のキモトリプシン特異性を示した図である。図中、阻害剤及びトリプシンについて、それぞれ添加した場合を「＋」、添加していない場合を「－」で示している。棒グラフの値は、標本数3で標準誤差を算出したものである（*はp　＜０．０５、**はｐ　＜０．０１を示す）。 図５は、患者から採取した膵液、腹水、及び腸液について、ｇＧｌｕ－ＨＭＲＧ、ｇＰｈｅ－ＨＭＲＧ、及び、トリプシン添加ｇＰｈｅ－ＨＭＲＧ（ｇＰｈｅ－ＨＭＲＧ－Ｔｒｙ）の蛍光強度の時間変化を示した図である。 図６は、本発明の蛍光プローブであるＢｚ－Ｔｙｒ－ＨＭＲＧ、Ｇｌｔ－ＡＡＦ－ＨＭＲＧ、及びＳｕｃ－ＡＡＰＦ－ＨＭＲＧへのキモトリプシン添加による蛍光強度変化及び当該応答のキモトリプシン特異性を示した図である。 図７は、本発明の蛍光プローブであるｇＰｈｅ－ＨＭＲＧを用いた膵液の蛍光イメージング画像を示した図である。図７ａは、膵液の付着箇所を示すため白色光画像であり、図７ｂの左側は、５００－７２０ｎｍにおけるカラーイメージであり、右側は５４０ｎｍにおける蛍光イメージである。 図８は、本発明の蛍光プローブであるｇＧｌｕ－ＨＭＲＧを用いた膵液の蛍光イメージング画像を示した図である。図８ａは、膵液の付着箇所を示すため白色光画像であり、図８ｂの左側は、５００－７２０ｎｍにおけるカラーイメージであり、右側は５４０ｎｍにおける蛍光イメージである。
　以下、本発明の実施形態について説明する。本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施することができる。
　本明細書において、アルキル基は直鎖状、分枝鎖状、環状、又はそれらの組み合わせからなるアルキル基のいずれであってもよい。アルキル基の炭素数は特に限定されないが、例えば炭素数１～６個程度、好ましくは炭素数１～４個程度である。本明細書において、アルキル基は任意の置換基を1個以上有していてもよい。該置換基としては、例えば、アルコキシ基、ハロゲン原子（フッ素原子、塩素原子、臭素原子、又はヨウ素原子のいずれであってもよい）、アミノ基、モノ若しくはジ置換アミノ基、置換シリル基、又はアシル基などを挙げることができるが、これらに限定されることはない。アルキル基が２個以上の置換基を有する場合には、それらは同一でも異なっていてもよい。アルキル部分を含む他の置換基（例えばアルキルオキシ基やアラルキル基など）のアルキル部分についても同様である。
　また、本明細書において、アリール基は単環性アリール基又は縮合多環性アルール基のいずれであってもよく、環構成原子としてヘテロ原子（例えば、酸素原子、窒素原子、又は硫黄原子など）を１個以上含んでいてもよい。本明細書において、アリール基はその環上に任意の置換基を1個以上有していてもよい。該置換基としては、例えば、アルコキシ基、ハロゲン原子、アミノ基、モノ若しくはジ置換アミノ基、置換シリル基、又はアシル基などを挙げることができるが、これらに限定されることはない。アリール基が２個以上の置換基を有する場合には、それらは同一でも異なっていてもよい。アリール部分を含む他の置換基（例えばアリールオキシ基やアラルキル基など）のアリール部分についても同様である。
（１）蛍光プローブ分子
　本発明の蛍光プローブは、一態様において、以下の一般式（Ｉ）で表される構造を有する化合物である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
　上記一般式（Ｉ）において、Ｒ１は水素原子又はベンゼン環に結合する１個ないし４個の置換基を示す。置換基としては、例えば、アルキル基、アルコキシ基、ハロゲン原子、アミノ基、モノ若しくはジ置換アミノ基、置換シリル基、又はアシル基などを挙げることができるが、これらに限定されることはない。ベンゼン環上に２個以上の置換基を有する場合には、それらは同一でも異なっていてもよい。Ｒ１としては水素原子が好ましい。
　Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、及びＲ７はそれぞれ独立に水素原子、水酸基、アルキル基、又はハロゲン原子を示す。Ｒ２及びＲ７が水素原子であることが好ましい。また、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６が水素原子であることも好ましい。Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、及びＲ７がいずれも水素原子であることがさらに好ましい。
　Ｒ８及びＲ９はそれぞれ独立に水素原子又はアルキル基を示す。Ｒ８及びＲ９がともにアルキル基を示す場合には、それらは同一でも異なっていてもよい。例えば、Ｒ８及びＲ９の両者が水素原子である場合、及びＲ８がアルキル基であり、かつＲ９が水素原子である場合が好ましく、Ｒ８及びＲ９の両者が水素原子である場合がさらに好ましい。
　ＸはＣ１－Ｃ３アルキレン基を示す。アルキレン基は直鎖状アルキレン基又は分枝鎖状アルキレン基のいずれであってもよい。例えば、メチレン基（－ＣＨ２－）、エチレン基（－ＣＨ２－ＣＨ２－）、プロピレン基（－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－）のほか、分枝鎖状アルキレン基として－ＣＨ（ＣＨ３）－、－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ３）－、－ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）－なども使用することができる。これらのうち、メチレン基又はエチレン基が好ましく、メチレン基がさらに好ましい。
　Ａはアミノ酸残基又はＮ－置換アミノ酸残基を示す。本明細書において、「アミノ酸残基」とは、アミノ酸のカルボキシ基から水酸基を除去した残りの部分構造と等しく、いわゆるＮ－末端残基と同様の構造を有するものを意味する。ただし、これは、Ａが複数のアミノ酸残基が連結して構成される場合を除外するものではなく、かかる場合はＣ－末端のアミノ酸残基が、上記のようにアミノ酸のカルボキシ基から水酸基を除去し、且つアミノ基から水素原子を除去した部分構造となれば良く、中間及びＮ－末端のアミノ酸残基は通常のペプチド鎖と同様に連結することができる。
　従って、Ａは隣接する式中のＮＨとアミド結合を形成して連結しており、すなわち、アミノ酸残基のカルボニル部分と式（Ｉ）ＮＨとがアミド結合を形成することで、キサンテン骨格と連結している。また、「Ｎ－置換アミノ酸残基」とは、上記アミノ酸残基のアミノ基における水素原子が置換されているものをいう。
　本明細書において、「アミノ酸」は、アミノ基とカルボキシ基の両方を有する化合物であれば任意の化合物を用いることができ、天然及非天然のものを含む。中性アミノ酸、塩基性アミノ酸、又は酸性アミノ酸のいずれであってもよく、それ自体が神経伝達物質などの伝達物質として機能するアミノ酸のほか、生理活性ペプチド（ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチドのほか、オリゴペプチドを含む）やタンパク質などのポリペプチド化合物の構成成分であるアミノ酸を用いることができ、例えばαアミノ酸、βアミノ酸、γアミノ酸などであってもよい。アミノ酸としては、光学活性アミノ酸を用いることが好ましい。例えば、αアミノ酸についてはD-又はL-アミノ酸のいずれを用いてもよいが、生体において機能する光学活性アミノ酸を選択することが好ましい場合がある。
　ここで、特定のプロテアーゼを特異的に検出するという観点からは、Ａは標的とするプロテアーゼによって加水分解されて、式（Ｉ）におけるＡ－ＮＨのアミド結合が切断可能なアミノ酸残基を用いることが好ましい。そのようなアミノ酸の非限定的な例としては、タンパク質を構成する20種類のＬ-アミノ酸のほか、セレノシステイン、ピロリシン、シスチン、ヒドロキシプロリン、ヒドロキシリジン、チロキシン、Ｏ-ホスホセリン、又はデスモシンや、β-アラニン、サルコシン、オルニチン、クレアチン、γアミノ酪酸、又はオパインなどが挙げられる。
　例えば、膵液中に含まれるキモトプシンを蛍光検出の標的とする場合、Ａにおけるアミノ酸残基は、芳香族アミノ酸又は疎水性アミノ酸により構成されることが好ましい。そのようなアミノ酸の非限定的な例は、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、メチオニン、及びそれらのＮ－置換残基が挙げられるが、好ましくは、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、及びそれらのＮ－置換残基であり、より好ましくは、フェニルアラニン及びＮ－置換フェニルアラニン残基、チロシン及びＮ－置換チロシンである。
　また、膵液中に含まれるγ-グルタミルトランスフェラーゼを蛍光検出の標的とする場合、Ａは、γ－グルタミルであることが好適である。
　Ａの好ましい態様は、以下式（ＩＩ）で示されるＮ－置換フェニルアラニン残基及びＮ－置換チロシン残基であり、これは、上記のようにキモトプシンを標的とする場合に好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
　式（ＩＩ）中のカルボニル基と式（Ｉ）中のＮＨがアミド結合を形成し、それによって、式（Ｉ）のキサンテン骨格と連結している。
　Ｒ１０は、置換又は無置換のアシル基である。ここで、該アシル基は、１個又は２個以上のヘテロ原子を含んでいてもよく、任意の置換基を1個以上有していてもよい。該置換基としては、例えば、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、アルコキシ基、アミド基、ハロゲン原子、アミノ基、モノ若しくはジ置換アミノ基、置換シリル基、又はアシル基などを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。２個以上の置換基を有する場合には、それらは同一でも異なっていてもよい。置換アシル基としてはカルボキシ基から水酸基を除いたアミノ酸残基であってもよい。より好ましくは、Ｒ１０は、脂肪族アシル基又は芳香族アシル基であり、芳香族基を置換基として有する脂肪族アシル基であってもよい。これらの置換基もまた、１個又は２個以上のヘテロ原子を含んでいてもよく、上記と同様、更に任意の置換基を1個以上有していてもよい。さらに、Ｒ１０は、カルボキシ基、アミノ基、カルボニル基、アミド基、水酸基などの極性基をＲ１０の末端に有するアシル基が好ましい。１つの態様において、Ｒ１０は、アセチル基（ＣＨ３ＣＯ－）、カルボベンゾキシ基（ｃｂｚ基）（Ｃ６Ｈ５ＣＨ２ＯＣＯ－）、ベンゾイル基（Ｃ６Ｈ５ＣＯ－）、スクシニル基（ＨＯＯＣ－ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ－）、グルタリル基（ＨＯＯＣ－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ－）、又はこれらを一部に含む置換基であることが好ましい。Ｒ１０が、カルボキシ基から水酸基を除いたアミノ酸残基、あるいは１個乃至５個のアミノ酸よりなるペプチド鎖のＣ末端カルボキシ基から水酸基を除いた基である場合には、いずれもＮ末端がアミノ酸残基のＮ末端が、アセチル基、カルボベンゾキシ基、ベンゾイル基、スクシニル基、グルタリル基、又はこれらを一部に含む置換基から選択される基であることが好ましい。また、Ｒ１１は水素原子又は水酸基を表し、水酸基である場合には、Ｒ１１は、好ましくはパラ位である。
　Ａの好ましい態様の一つは、以下式（ＩＩＩ）～（ＶＩ）で表される基から選択される１の置換基である。これは、上記のようにキモトプシンを標的とする場合に好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
　上記一般式（Ｉ）で表される化合物（Ａが式（ＩＩ）～式（ＶＩ）の態様の場合を含む。以下の記載においても同じ。）は塩として存在する場合がある。塩としては、塩基付加塩、酸付加塩、アミノ酸塩などを挙げることができる。塩基付加塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などの金属塩、アンモニウム塩、又はトリエチルアミン塩、ピペリジン塩、モルホリン塩などの有機アミン塩を挙げることができ、酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩などの鉱酸塩、メタンスルホン酸塩、パラトルエンスルホン酸塩、クエン酸塩、シュウ酸塩などの有機酸塩を挙げることができる。アミノ酸塩としてはグリシン塩などを例示することができる。もっとも、本発明の化合物の塩はこれらに限定されることはない。
　一般式（Ｉ）で表される化合物は、置換基の種類に応じて１個または２個以上の不斉炭素を有する場合があり、光学異性体又はジアステレオ異性体などの立体異性体が存在する場合がある。純粋な形態の立体異性体、立体異性体の任意の混合物、ラセミ体などはいずれも本発明の範囲に包含される。
　一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩は、水和物又は溶媒和物として存在する場合もあるが、これらの物質はいずれも本発明の範囲に包含される。溶媒和物を形成する溶媒の種類は特に限定されないが、例えば、エタノール、アセトン、イソプロパノールなどの溶媒を例示することができる。
　一般式（Ｉ）で表される化合物は、例えば、３位及び６位にアミノ基を有し、９位に２－カルボキシフェニル基又は２－アルコキシカルボニルフェニル基を有するキサンテン化合物などを原料として用い、９位の２－カルボキシフェニル基又は２－アルコキシカルボニルフェニル基をヒドロキシアルキル基に変換した後に３位のアミノ基にアミノ酸残基又はＮ－置換アミノ酸残基を結合させることにより容易に製造することができる。原料として使用可能な３，６－ジアミノキサンテン化合物としては、例えば、いずれも市販されているローダミン１１０やローダミン１２３などを例示することができるが、これらに限定されることはなく目的化合物の構造に応じて適宜のキサンテン化合物を選択することができる。また、一般式（Ｉ）で表される化合物におけるキサンテン骨格部分の酸素原子を、特定の置換基を有する炭素原子やケイ素原子、ゲルマニウム原子、スズ原子或いは鉛原子に置換した態様の骨格を有する化合物を用いて、本発明における一般式（Ｉ）と同様の機能を有する蛍光プローブを製造することもできる。
　本明細書の実施例には、一般式（Ｉ）で表される本発明の化合物に包含される代表的化合物についての製造方法が具体的に示されているので、当業者は本明細書の開示を参照することにより、及び必要に応じて出発原料や試薬、反応条件などを適宜選択することにより、一般式（Ｉ）に包含される任意の化合物を容易に製造することができる。
（２）蛍光プローブ分子の発光機構
　本発明の蛍光プローブは、一般式（Ｉ）で示されるキサンテン骨格上部が閉環状態では、中性領域（例えばｐＨ５ないし９の範囲）において当該蛍光プローブ自体は実質的に無蛍光である。一方、Ａ－ＮＨとのアミド結合がプロテアーゼにより加水分解されると速やかに開環した互変異性体となって強蛍光性の下記化合物が生じる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
　すなわち、一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩を有効成分として含む本発明の蛍光プローブは、膵液中に存在するプロテアーゼによって加水分解され、強い蛍光を発する上記開環化合物を与える性質を有しており、体液等の被検体に添加することによって、数十秒から数分で強い蛍光を発するようになる。従って、本発明の蛍光プローブを用いることによって、プロテアーゼ活性を蛍光強度の変化により測定し、当該プロテアーゼを含む膵液の存在を検出することが可能となる。
　より詳細には、例えば、一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩は、中性領域において例えば４４０～５００ｎｍ程度の励起光を照射した場合にはほとんど蛍光を発しないが、上記開環化合物は同じ条件下において極めて強い蛍光（例えばｅｍｉｓｓｉｏｎ：５２４ｎｍ）を発する性質を有している。従って、本発明の蛍光プローブを用いて検出を行う場合には、通常は４４０～５００ｎｍ程度の可視光、好ましくは４４５～４９０ｎｍ程度、さらに好ましくは４５０～４８０ｎｍ程度の可視光を照射すればよい。観測すべき蛍光波長は通常は５１０～８００ｎｍ程度であり、例えば５１６～５５６ｎｍ程度の蛍光を観測することが好ましい。
（３）蛍光プローブを用いた膵液検出方法。
　本発明の膵液検出方法では、上記蛍光プローブを体液試料と接触させ、当該試料中に含まれるプロテアーゼと蛍光プローブの反応による蛍光応答を観測することにより、膵液の存在を検出することができる。好ましい態様では、上記プロテアーゼは、キモトリプシン又はγ－グルタミルトランスフェラーゼであり、より好ましくは、キモトリプシンである。本明細書において「検出」という用語は、定量、定性など種々の目的の測定を含めて最も広義に解釈されるべきである。なお、一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩は、中性領域において３５０ｎｍ以上の波長の光をほとんど吸収しないが、膵液中に存在するプロテアーゼによって加水分解されて上記開環化合物に変化すると、その構造変化に伴って、紫外可視領域の吸収スペクトルが変化して３５０ｎｍ以上の波長の光も吸収するようになるので、場合によって、紫外可視吸光スペクトルの変化（例えば、特定の吸収波長における吸光度の変化）によって上記プロテアーゼと蛍光プローブの反応を検出することも可能である。
　キモトリプシンは、膵液中に前駆体であるキモトリプシノーゲンとして分泌されるが、トリプシンとの反応によって活性化されることが知られている。従って、トリプシンの添加によって活性型のキモトリプシンに変換させた後、本発明の蛍光プローブによる測定を行うため、蛍光プローブを測定試料に添加等を行う前又は同時に当該測定試料中にトリプシンを添加することが好ましい。
　蛍光検出の被検体である体液試料の形態は、特に限定されるものではないが、例えば、術中又は術後に患者等の腹腔内から採取した液体、切除した膵臓をろ紙等の紙片やタオルなど吸水性の任意の材料に付着させたもの、或いは、腫瘍部の切除後に体内に残っている膵臓自体の表面等に付着或いは流出している液体などが挙げられる。
　被検体である体液試料と蛍光プローブを接触させる手段としては、代表的には、蛍光プローブを含む溶液を試料添加、塗布、或いは噴霧することが挙げられるが、上記体液試料の形態や測定環境等に応じて適宜選択することが可能である。
　蛍光応答を観測する手段は、広い測定波長を有する蛍光光度計を用いることができるが、蛍光発光部位を２次元画像として表示可能な蛍光イメージング装置を用いることもできる。蛍光イメージングの手段を用いることによって、蛍光応答を二次元で可視化できるため、膵管の位置、或いは膵液漏が生じている箇所を瞬時に視認することが可能となる。特に、手術中等において被験者から採取した体液試料をその場で測定を行うために、小型で持ち運び可能な蛍光検出器及び蛍光イメージング装置が好ましい。
　本発明の膵液検出方法は、例えば手術中、検査中、手術後に行うことができる。本明細書において「手術」の用語は、内視鏡又は腹腔鏡などの鏡視下手術などを含めて、膵臓がん等の膵臓疾患や胆管がん等の治療のために適用される任意の手術を包含する。また、「検査」の用語は、内視鏡を用いた検査及び検査に伴う組織の切除や採取などの処置のほか、生体から分離・採取された組織に対して行う検査などを包含する。これらの用語は最も広義に解釈しなければならず、いかなる意味においても限定的に解釈してはならない。
　本発明の方法によるプロテアーゼの測定は、一般的には中性条件下に行うことができ、例えば、ｐＨ５．０～９．０の範囲、好ましくはｐＨ６．０～８．０の範囲、より好ましくはｐＨ６．８～７．６の範囲で行うことができる。ＰＨを調整する手段としては、例えば、リン酸バッファー等の当該技術分野において周知の任意のｐＨ調節剤や緩衝液を用いることができる。
　本発明の蛍光プローブの適用濃度は特に限定されないが、例えば１～１，０００μＭ程度の濃度の溶液を適用することができる。
　本発明の蛍光プローブとしては、上記一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩をそのまま用いてもよいが、必要に応じて、試薬の調製に通常用いられる添加剤を配合して組成物として用いてもよい。例えば、生理的環境で試薬を用いるための添加剤として、溶解補助剤、ｐＨ調節剤、緩衝剤、等張化剤などの添加剤を用いることができ、これらの配合量は当業者に適宜選択可能である。これらの組成物は、一般的には、粉末形態の混合物、凍結乾燥物、顆粒剤、錠剤、液剤など適宜の形態の組成物として提供されるが、使用時に注射用蒸留水や適宜の緩衝液に溶解して適用すればよい。
（４）膵液検出用キット
　本発明の膵液検出方法においては、上記蛍光プローブを含む膵液検出用キットを用いることが好ましい。特に、上記プロテアーゼがキモトリプシンである場合、上記蛍光プローブとトリプシンを含み、測定が行われるまでの期間において蛍光プローブとトリプシンが混合することなく格納されていることが好ましい。これは、蛍光プローブとトリプシンとを長時間混在させた場合には、それらが反応するおそれもあり得るため、検体を測定する直前まで別々に保管させることが望ましいことによる。しかしながら、キットの利便性等の観点から、蛍光プローブとトリプシンは、必ずしも別個の独立した容器に格納されている必要はなく、これらが混合されない環境である限り、一体化した或いは連結した複数の格納領域を有する容器を用いることができる。
　当該キットにおいて、通常、本発明の蛍光プローブ或いはトリプシンは溶液として調製されているが、例えば、粉末形態の混合物、凍結乾燥物、顆粒剤、錠剤、液剤など適宜の形態の組成物として提供され、使用時に注射用蒸留水や適宜の緩衝液に溶解して適用することもできる。
　また、当該キットには、必要に応じてそれ以外の試薬等を適宜含んでいてもよい。例えば、添加剤として、溶解補助剤、ｐＨ調節剤、緩衝剤、等張化剤などの添加剤を用いることができ、これらの配合量は当業者に適宜選択可能である。
　以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。
　以下のスキームに従って、本発明の蛍光プローブであるｇＰｈｅ－ＨＲＭＧ（グルタミル－フェニルアラニン　ヒドロキシメチル　ローダミングリーン）を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
（ａ）化合物１の合成
　ＨＭＲＧ　５５ｍｇ（０．１７４ｍｍｏｌ、１ｅｑ．）とトリエチルアミン　５３．６μＬ（０．１６７ｍｍｏｌ、２．２ｅｑ．）をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）２ｍＬに溶かしアルゴン雰囲気下にて０℃で１０分間撹拌した。続いて、クロロぎ酸９－フルオレニルメチル６７ｍｇ（０．２６１ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ．）を溶解したＤＭＦ　０．５ｍＬを加え１５時間攪拌した。反応溶媒を減圧除去し、残渣をシリカゲルクロマトグラフィーで精製して（ジクロルメタン/メタノール＝９５／５）目的化合物（３６ｍｇ、２２％）を得た。なお、ＨＭＲＧの合成については、実施例２（ａ）を参照。
　１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤ３ＯＤ）: δ ７．７８ （ｄ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ８．１ Ｈｚ）， ７．６１ （ｄ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ７．３ Ｈｚ）， ７．４４－７．３２ （ｍ， ４Ｈ）， ６．８９－６．８７ （ｍ ，３Ｈ）， ６．７４－６．７１ （ｍ， ２Ｈ）， ６．４９－６．４５ （ｍ， １Ｈ）， ６．３５ （ｄｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ ８．４ Ｈｚ， １．８Ｈｚ）， ５．２７ （ｓ， ２Ｈ）， ４．５５ （ｄ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ６．６ Ｈｚ）， ４．２７ （ｔ， １Ｈ， Ｊ ＝ ６．６ Ｈｚ）． ＨＲＭＳ （ＥＳＩ＋） Ｃａｌｃｄ ＦＯＲ [Ｍ＋Ｈ]＋， ５３９．１９７０８， Ｆｏｕｎｄ， ５３９．１９５２１ （－１．８７ ｍｍｕ）．
（ｂ）化合物２の合成
　化合物１　３６ｍｇ（０．０６７ｍｍｏｌ、１ｅｑ．）とＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）３０．０μＬ（０．１６７ｍｍｏｌ、２．５ｅｑ．）をＤＭＦ２ｍＬに溶かしアルゴン雰囲気下にて０℃で１０分間撹拌した。続いてＢｏｃ－Ｐｈｅ－ＯＨ（Ｎ－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－Ｌ－フェニルアラニン）４４．４ｍｇ（０．１６７ ｍｍｏｌ、２．５ｅｑ．）とＯ－（７－アザベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（ＨＡＴＵ）６３．５ｍｇ（０．１６７ｍｍｏｌ、２．５ ｅｑ．）を溶かしたＤＭＦ　０．５ｍＬを加え１５時間撹拌した。反応溶媒を減圧除去し、残渣をシリカゲルクロマトグラフィーで精製して（ｎ－ヘキサン／酢酸エチル＝６６／３４）目的化合物（４２ｍｇ、８１％）を得た。
　１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤ３ＯＤ）: δ ８．０１ （ｓ， １Ｈ）， ７．７７ （ｄ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ７．３ Ｈｚ）， ７．６１ （ｄ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ７．３ Ｈｚ）， ７．４１ （ｄ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ７．３ Ｈｚ）， ７．３７ （ｓ， １Ｈ）， ７．３４－７．２９ （ｍ， ５Ｈ）， ７．２３－７．２１ （ｍ ，５Ｈ）， ７．０６ （ｓ， １Ｈ）， ６．９８－６．９４ （ｍ， ２Ｈ）， ６．８４－６．８１ （ｍ， ３Ｈ）， ５．２８ （ｓ， ２Ｈ）， ４．５４ （ｄ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ６．６ Ｈｚ）， ４．５１－４．４８ （ｍ， １Ｈ）， ４．２６ （ｔ， １Ｈ， Ｊ ＝ ６．６ Ｈｚ）， ３．１３－３．１１（ｍ， ２Ｈ）， １．４０ （ｓ， ９Ｈ）． ＨＲＭＳ （ＥＳＩ＋） Ｃａｌｃｄ ＦＯＲ [Ｍ＋Ｈ]＋， ７８６．３１７９２， Ｆｏｕｎｄ， ７８６．３１６５２ （－１．４１ ｍｍｕ）．
（ｃ）ｇＰｈｅ－ＨＭＲＧの合成
　化合物２　４２ｍｇ（０．０５３ ｍｍｏｌ、１ｅｑ．）を２０％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）／ジクロルメタン溶液に溶解し、３０分間室温で撹拌した。溶媒を減圧除去し、得られた固体をジクロルメタン及び炭酸水素ナトリウムの飽和水溶液で抽出した。有機層に硫酸ナトリウム加えてろ過した後に、溶媒を除去し固体を得た。得られた固体を５ｍＬのジクロルメタンに溶解し、グルタル酸無水物２２．８ｍｇ（０．２００ｍｍｏｌ、３．８ｅｑ．）とＴＥＡ　２８．２μＬ（０．２００ｍｍｏｌ、３．８ｅｑ．）を加え、アルゴン雰囲気下に室温で１５時間撹拌した。続いて溶媒を減圧除去し、２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液を加え、３０分間室温で攪拌した。溶媒を除去し、ＨＰＬＣを用いて精製を行い（ｅｌｕｅｎｔ　Ａ　（Ｈ２Ｏ　０．１％ＴＦＡ）　ａｎｄ　ｅｌｕｅｎｔ　Ｂ（ＣＨ３ＣＮ　８０％，Ｈ２Ｏ　２０％）（Ａ／Ｂ＝８０／２０ｔｏ０／１００　４０ｍｉｎ））目的化合物（1３．７ｍｇ，４５％） を得た。
　１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤ３ＯＤ）: δ ８．４２ （ｓ， １Ｈ）， ７．７２－7.70 （ｍ， ２Ｈ）， ７．５８ （１Ｈ， ｔ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ）， ７．４２－７．１８ （ｍ， ９Ｈ）, ７．０３ （１Ｈ， ｄ， Ｊ ＝ ９．３ Ｈｚ）， ６．９５ （ｓ， １Ｈ）， ４．７５ （ｔ， １Ｈ， Ｊ ＝ ７．６ Ｈｚ）， ４．３４ （ｓ， ２Ｈ）， ３．１９－３．１３ （ｍ， １Ｈ）， ３．０３－３．００ （ｍ， １Ｈ）， ２．２９－２．２１ （ｍ， ４Ｈ）， １．８５－１．７８ （ｍ， ２Ｈ）．
１３Ｃ ＮＭＲ （１００ ＭＨｚ， ＣＤ３ＯＤ）: d １７６．８， １７５．５， １７３．４， １６４．６， １６１．７， １６０．１， １５６．９， １４８．３， １４１．２， １３７．９， １３４．８， １３１．７， １３０．５， １３０．３， １２９．８， １２９．５， １２９．０， １２８．０， １２１．５， １１９．５， １１９．４， １１８．６， １０７．１， ９８．５， ６３．１， ５７．３， ３８．９， ３５．６， ３３．９， ２２．１． ＨＲＭＳ （ＥＳＩ＋） Ｃａｌｃｄ ＦＯＲ [Ｍ＋Ｈ]＋， ５７８．２２９１１， Ｆｏｕｎｄ， ５７８．２２６５９ （－２．５２ ｍｍｕ）．
　以下のスキームに従って、本発明の蛍光プローブであるｇＧｌｕ－ＨＲＭＧ（γ－グルタミル　ヒドロキシメチル　ローダミングリーン）を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
（ａ）化合物３（ＨＭＲＧ）の合成
　ローダミン１１０　２８５ｍｇ（０．８ｍｍｏｌ、１ｅｑ．）をメタノール １０ｍＬに溶かし硫酸を加えてアルゴン雰囲気下に８０℃で１０時間攪拌した。反応溶媒を減圧除去し、残渣を飽和重曹水および水で洗浄した。得られた固体をテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）１０ｍＬに溶解させ、アルゴン雰囲気下に０℃で５Ｍ　ナトリウムメトキシド溶液（メタノール中）４００μＬ（０．８ｍｍｏｌ、１ｅｑ．）を加えて１０分間攪拌した。続いてリチウムアルミニウムハイドライド　３３３ｍｇ（８ｍｍｏｌ，１０ｅｑ．）を加えて３時間攪拌した。飽和塩化アンモニウム水溶液を５ｍＬ加え、溶媒を減圧除去し、得られた固体をジクロルメタン及び酒石酸４水和物カリウム・ナトリウム塩の飽和水溶液で抽出した。有機層に硫酸ナトリウムを加えてろ過した後、溶媒を除去し、固体を得た。得られた固体をジクロルメタンに溶解し、クロラニル　１９６ｍｇ（１ｍｍｏｌ、１ｅｑ．）を加えて３０分間室温で攪拌した。溶媒を減圧下で除去し、残渣をシリカゲルクロマトグラフィーで精製して（ジクロルメタン／メタノール＝１０：１）目的化合物（１０４ ｍｇ，４１％）を得た。
　１Ｈ ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ， ＣＤ３ＯＤ）: δ ７．６４ （ｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ ７．７ Ｈｚ）， ７．５６ （ｔ， １Ｈ， Ｊ ＝ ７．６ Ｈｚ）， ７．４４ （ｔ， １Ｈ， Ｊ ＝ ７．５ Ｈｚ）， ７．１７ （ｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ ７．５ Ｈｚ）， ７．０３ － 7.00 （ｍ， ２Ｈ）， ６．７１－６．７４ （ｍ， ４Ｈ）， ４．２３ （ｓ， ２Ｈ）
１３Ｃ ＮＭＲ （７５ ＭＨｚ， ＣＤ３ＯＤ）: δ １６１．５， １５９．９， １５９．６， １４１．０， １３３．４， １３２．２， １３１．３， １３０．３， １２９．５， １２８．８， １１８．０， １１５．０， ９８．４， ６２．８
ＨＲＭＳ （ＥＳＩ＋） Ｃａｌｃｄ ＦＯＲ [Ｍ＋Ｈ]＋， ３１７．１２９００， Ｆｏｕｎｄ， ３１７．１２８６２ （－０．３８ ｍｍｕ）
（ｂ）ｇＧｌｕ－ＨＭＲＧの合成
　化合物３（０．０５ｍｍｏｌ １ｅｑ．）、ＨＡＴＵ（０．１１ｍｍｏｌ、２ｅｑ．）、及びＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（０．１１ｍｍｏｌ、２ｅｑ．）をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）２ｍＬに溶解し、アルゴン雰囲気下に０℃で１０分間攪拌した。続いてＢｏｃ－Ｇｌｕ－ＯｔＢｕ（０．０５ｍｍｏｌ、１ｅｑ．）を溶解したＤＭＦ　０．５ｍＬを加え１５時間攪拌した。反応溶媒を減圧除去した後に得られた固体をジクロルメタン２ｍＬとトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）２ｍＬに溶かし、３０分間攪拌した。溶媒を除去し、ＨＰＬＣを用いて精製を行い（ｅｌｕｅｎｔ Ａ：Ｈ２Ｏ　０．１％ＴＦＡ及びｅｌｕｅｎｔ　Ｂ：ＣＨ３ＣＮ　８０％，Ｈ２Ｏ　２０％　０．１％　ＴＦＡ；Ａ／Ｂ＝８０／２０　ｔｏ　０／１００　ＦＯＲ　４０ ｍｉｎ．）、目的化合物を得た。
　１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤ３ＯＤ）: δ ８．３９ （ｓ， １Ｈ）， ７．６２－７．６１ （ｍ， ２Ｈ）， ７．５０－７．４７ （ｍ， １Ｈ）, 7.39 （ｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ ７．８ Ｈｚ）， ７．２４ －７．２２ （ｍ， ３Ｈ）， ６．９４ （ｄ， １Ｈ, J = ８．３ Ｈz）, ６．８６ （ｓ， １Ｈ）， ４．２５ （ｓ， ２Ｈ）， ３．９６ （ｔ， １Ｈ， Ｊ ＝ ６．３ Ｈｚ）， ２．７１－２．６９ （ｍ， ２Ｈ）， ２．３０－２．２７ （ｍ， ２Ｈ）
１３Ｃ ＮＭＲ （７５ ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）: δ１７３．４， １７１．８， １６４．５， １６３．１， １６０．７， １５７．１， １４８．７， １４１．２， １３４．９， １３１．９， １３１．７， １３０．５， １２９．８， １２９．０， １２１．４， １１９．４， １１８．５， １０６．９， ９８．５， ６３．１， ５３．５， ３３．４， ２６．６
ＨＲＭＳ （ＥＳＩ＋） Ｃａｌｃｄ ＦＯＲ [Ｍ＋Ｈ]＋， ４４６．１７１６０， Ｆｏｕｎｄ， ４４６．１７１９５ （＋０．３６ ｍｍｕ）．
　以下のスキームに従って、本発明の蛍光プローブであるＢｚ－Ｔｙｒ－ＨＭＲＧ（ベンゾイルチロシン ヒドロキシメチル　ローダミングリーン）を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
（ａ）化合物４（Ｂｚ－Ｔｙｒ（Ａｃ）－ＯＨ、Ｎ－ベンゾイル－Ｏ－アセチル－チロシン）の合成
　水酸化ナトリウム　２６３ｍｇ（６．５６ｍｍｏｌ）を水　１．７５ｍＬに溶解した。この水酸化ナトリウム水溶液中にＢｚ－Ｔｙｒ－ＯＨ　５００ｍｇ（１．７５ｍｍｏｌ）を加えて溶解し、氷片を数個加えて０℃に冷却した。無水酢酸　６２０μＬ（６．５６ｍｍｏｌ）を加え、０℃で２０分間攪拌した。次いで、酢酸エチル　２０ｍＬと水　５０ｍＬを加え、３Ｍ塩酸でｐＨ２とした。有機層を分液し、再度酢酸エチル　２０ｍＬを加えて分液後、有機層を合わせて硫酸ナトリウムで乾燥した。酢酸エチルを減圧除去し、酢酸エチルとヘキサンを用いて再結晶して化合物４（３７９ｍｇ、６６％）を得た。
　１Ｈ ＮＭＲ （４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：　δ　７．６８（ｍ，２Ｈ），δ　７．５１（ｍ，１Ｈ），δ　７．４１（ｍ，２Ｈ），δ　７．２０（ｄ，Ｊ＝８．３，２Ｈ），７．０２（ｄ，Ｊ＝８．３，２Ｈ），δ　６．６６（ｄ，Ｊ＝７．３，１Ｈ），δ　５．０８（ｍ，１Ｈ），δ　３．３５（ｄｄ，Ｊ＝１４．２，５．５、１Ｈ）δ　３．２７（ｄｄ，Ｊ＝１４．２，５．５、１Ｈ），δ　２．３０（ｓ，３Ｈ）
　１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：　δ　１７４．１，１６９．９，１６７．８，１４９．９，１３３．５，１３３．４，１３２．２，１３０．６，１２８．８．１２７．２，１２１．８，５３．６，３６．７，２１．２
（ｂ）化合物５（Ｂｚ－Ｔｙｒ－ＨＭＲＧ）の合成
化合物４　１５．１ｍｇ（０．０４６ｍｍｏｌ、５ｅｑ．）とＨＡＴＵ　１７．５ｍｇ（０．０４６ｍｍｏｌ，５ｅｑ．）をＤＭＦ　１ｍＬに溶かし窒素雰囲気下に０℃に冷却した。続いて、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン　９．９μＬ（０．０５５ｍｍｏｌ、６ｅｑ．）を加え、３分間攪拌した。これを、化合物１　５ｍｇ（０．００９ｍｍｏｌ）をＤＭＦ　１ｍＬに溶解して、窒素雰囲気下に０℃に冷却した溶液中に加え、ゆっくりと室温に戻して２４時間攪拌した。反応溶媒を減圧除去し、残渣に２０ｍＬのジクロロメタンを加え、１Ｍ塩酸　２０ｍＬで洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥後、ジクロロメタンを減圧除去し、残渣をシリカゲルクロマトグラフィーで精製した（ヘキサン／酢酸エチル＝７／３→５／５）。目的化合物を含む分画を減圧下濃縮し、残渣をＴＨＦ　２ｍＬに溶解後、ジエチルアミン９６μＬ（０．９２ｍｍｏｌ）を加えて室温で２４時間攪拌した。反応溶媒を減圧除去し、残渣を２ｍＬのメタノールに溶解して０．１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液１００μＬを加え、室温で１時間攪拌した。１Ｍ塩酸　１００μＬを加えた後、反応溶媒を減圧除去し、残渣をＨＰＬＣで精製して（ｅｌｕｅｎｔ　Ａ：Ｈ２Ｏ　０．１％ＴＦＡ及びｅｌｕｅｎｔ Ｂ：アセトニトリル　０．１％ＴＦＡ；Ａ／Ｂ＝８０／２０　ｔｏ　０／１００　ＦＯＲ　３０ｍｉｎ．）、化合物５を得た。　
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）　Ｃａｌｃｄ　ＦＯＲ　［Ｍ＋Ｈ］＋，５８４．２１８００，　Ｆｏｕｎｄ，５８４．２１８８７（０．８７ｍｍｕ）．
　以下のスキームに従って、本発明の蛍光プローブであるＧｌｔ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｐｈｅ－ＨＭＲＧ（Ｇｌｔ－ＡＡＦ－ＨＭＲＧ；グルタリル－アラニン－アラニン－フェニルアラニン　ヒドロキシメチル　ローダミングリーン）及びＳｕｃ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｐｈｅ－ＨＭＲＧ（Ｓｕｃ－ＡＡＰＦ－ＨＭＲＧ；スクシニル－アラニン－アラニン－プロリン－フェニルアラニン ヒドロキシメチル　ローダミングリーン）を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
（ａ）Ｎ－Ｂｏｃ保護ペプチドＢｏｃ－ＡＡＦ－ＯＨ（化合物６）及びＢｏｃ－ＡＡＰＦ－ＯＨ（化合物９）の合成
　Ｎ－Ｂｏｃ保護ペプチドである化合物６及び９はＰｒｏｔｅｉｎ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製のＰｒｅｌｕｄｅ自動固相合成装置を使って、Ｈ－Ｐｈｅ－Ｔｒｔ（２－Ｃｌ）－Ｒｅｓｉｎ（０．９４ｍｍｏｌ／ｇ、１００－２００ｍｅｓｈ、１％ＤＶＢ（ジビニルベンゼン））を用いて以下に示す通常のＦｍｏｃ固相合成法で合成した。
（１）ペプチドカップリングサイクル：Ｆｍｏｃアミノ酸（レジンの４当量）とＯ－（ベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロりん酸塩（ＨＢＴＵ：レジンの４当量）をＤＭＦに溶解させ、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ：レジンの８当量）を加えて攪拌した。この溶液を、Ｎ末脱保護ペプチドをカップリングさせたレジンに加えて２．５分攪拌した。
（２）Ｆｍｏｃ脱保護サイクル：Ｆｍｏｃ保護基の脱保護は、２０％（ｖ／ｖ）ピペリジ
　ン／ＤＭＦ溶液をレジンに加え、１２分攪拌することで行った。
（３）レジンからの切り出し：　酢酸１０％、２，２，２－トリフルオロエタノール２０％、ジクロロメタン７０％の溶液をレジンに加え、１時間攪拌してペプチドをレジンから切り出した。レジンを濾過で除き、ろ液を減圧除去し、残渣に過剰量の冷却ジイソプロピルエーテルを加えて生じた沈殿をろ取し、Ｎ－Ｂｏｃ保護ペプチドの化合物６及び９を得た。
　Ｎ－Ｂｏｃ保護ペプチド（化合物６）　Ｂｏｃ－ＡＡＦ－ＯＨ
　　ＥＳＩ-ＭＳ : ｍ/ｚ ４０７[Ｍ]＋
　Ｎ－Ｂｏｃ保護ペプチド（化合物９）　Ｂｏｃ－ＡＡＰＦ－ＯＨ
　　ＥＳＩ-ＭＳ : ｍ/ｚ ５０４[Ｍ]＋
（ｂ）化合物７の合成
　Ｎ－Ｂｏｃ保護ペプチドの化合物６　３０．０ｍｇ（０．０７４ｍｍｏｌ、４ｅｑ．）とＨＡＴＵ　３５．０ｍｇ（０．０９２ｍｍｏｌ，５ｅｑ．）をＤＭＦ　１ｍＬに溶かし窒素雰囲気下に０℃に冷却した。続いて、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン　１９．７μＬ（０．１１ｍｍｏｌ、６ｅｑ．）を加え、３分間攪拌した。これを、化合物１　１０ｍｇ（０．０１８ｍｍｏｌ）をＤＭＦ　１ｍＬに溶解して、窒素雰囲気下に０℃に冷却した溶液中に加え、　ゆっくりと室温に戻して２４時間攪拌した。反応溶媒を減圧除去し、残渣をシリカゲルクロマトグラフィーで精製し（ヘキサン／酢酸エチル＝５／５）、化合物７を得た。
　ＥＳＩ-ＭＳ : ｍ/ｚ ９２８[Ｍ]＋
（ｃ）化合物８（Ｇｌｔ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｐｈｅ－ＨＭＲＧ（Ｇｌｔ－ＡＡＦ－ＨＭＲＧ；グルタリル－アラニン－アラニン－フェニルアラニン ヒドロキシメチル　ローダミングリーン））の合成
　（ｂ）で得られた化合物７を２０％ＴＦＡ／ジクロロメタン溶液に溶解し、室温で３０分間攪拌した。次いで、反応溶媒を減圧除去し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液１０ｍＬとジクロロメタン１０ｍＬを加えて分液し、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥した。有機溶媒を減圧除去し、ジクロロメタン　５ｍＬ、無水グルタル酸　９．７ｍｇ（０．０８５ｍｍｏｌ、４．７ｅｑ．）及びトリエチルアミン　１１．８μＬ（０．０８５ｍｍｏｌ、４．７ｅｑ．）を加え室温で２０時間攪拌した。次いで、反応溶媒を減圧除去し、２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液１ｍＬを加え室温で1時間攪拌した。反応溶媒を減圧除去し、残渣をＨＰＬＣで精製して（ｅｌｕｅｎｔ　Ａ：Ｈ２Ｏ　０．１％ＴＦＡ及びｅｌｕｅｎｔ Ｂ：アセトニトリル　０．１％ＴＦＡ；Ａ／Ｂ＝８０／２０　ｔｏ　０／１００　ＦＯＲ　３０ｍｉｎ．）、化合物８のＧｌｔ－ＡＡＦ－ＨＭＲＧを得た（３．０ｍｇ、２３％（２工程））。
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）　Ｃａｌｃｄ　ＦＯＲ　［Ｍ＋Ｎａ］＋，７４２．２８４７３，　Ｆｏｕｎｄ，７４２．２８２６８（－２．０５ｍｍｕ）．
（ｄ）化合物１０の合成
　Ｎ－Ｂｏｃ保護ペプチドの化合物９　３７．３ｍｇ（０．０７４ｍｍｏｌ、４ｅｑ．）とＨＡＴＵ　３５．０ｍｇ（０．０９２ｍｍｏｌ，５ｅｑ．）をＤＭＦ　１ｍＬに溶かし窒素雰囲気下に０℃に冷却した。続いて、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン　１９．７μＬ（０．１１ｍｍｏｌ、６ｅｑ．）を加え、３分間攪拌した。これを、化合物１　１０ｍｇ（０．０１８ｍｍｏｌ）をＤＭＦ　１ｍＬに溶解して、窒素雰囲気下に０℃に冷却した溶液中に加え、　ゆっくりと室温に戻して２４時間攪拌した。反応溶媒を減圧除去し、残渣をシリカゲルクロマトグラフィーで精製して（ヘキサン／酢酸エチル＝７／３　ｔｏ　３／７）、化合物１０を得た。
　ＥＳＩ-ＭＳ : ｍ/ｚ １０２５[Ｍ]＋
（ｅ）化合物１１（Ｓｕｃ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｐｈｅ－ＨＭＲＧ（Ｓｕｃ－ＡＡＰＦ－ＨＭＲＧ；スクシニル－アラニン－アラニン－プロリン－フェニルアラニン ヒドロキシメチル　ローダミングリーン））の合成
　（ｄ）で得られた化合物１０を２０％ＴＦＡ／ジクロロメタン溶液に溶解し、室温で３０分間攪拌した。次いで、反応溶媒を減圧除去し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液１０ｍＬとジクロロメタン１０ｍＬを加えて分液し、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥した。有機溶媒を減圧除去し、ジクロロメタン　５ｍＬ、無水コハク酸　７．８ｍｇ（０．０７８ｍｍｏｌ、４ｅｑ．）及びトリエチルアミン　１０．９μＬ（０．０７８ｍｍｏｌ、４ｅｑ．）を加え室温で２０時間攪拌した。次いで、反応溶媒を減圧除去し、２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液１ｍＬを加え室温で1時間攪拌した。反応溶媒を減圧除去し、残渣をＨＰＬＣで精製して（ｅｌｕｅｎｔ　Ａ：Ｈ２Ｏ　０．１％ＴＦＡ及びｅｌｕｅｎｔ Ｂ：アセトニトリル　０．１％ＴＦＡ；Ａ／Ｂ＝８０／２０　ｔｏ　０／１００　ＦＯＲ　３０ｍｉｎ．）、化合物８のＳｕｃ－ＡＡＰＦ－ＨＭＲＧを得た（４．１ｍｇ、２８％（２工程））。
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）　Ｃａｌｃｄ　ＦＯＲ　［Ｍ＋Ｎａ］＋，８２５．３２１８５，　Ｆｏｕｎｄ，８２５．３２１２２（－０．６３ｍｍｕ）．
キモトリプシンを用いた蛍光アッセイ
　実施例１で合成した、Ｎ－置換フェニルアラニンに基づくアミノ酸残基を有するｇＰｈｅ－ＨＭＲＧ化合物を中性リン酸バッファーに溶解して、キモトリプシンを作用させ、その蛍光アッセイを行った。ｇＰｈｅ－ＨＭＲＧの２．４ｍＭ　ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液　３μＬを３ｍＬの０．１Ｍ　リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．４）に最終濃度２．４μＭとなるように溶解し、キモトリプシン（ウシ膵臓由来のａ－キモトリプシン：ＳＩＧＭＡ　Ｃ４１２９－２５０ＭＧ）４．６ Ｕを加えて３７℃で酵素反応を行った。励起波長は５０１ｎｍとした。得られた結果を図１及び２に示す。
　蛍光アッセイの結果、キモトリプシンの添加によって、吸収及び蛍光強度の顕著な増加が認められた（図１）。その応答速度についても、蛍光のピーク波長である５２４ｎｍについて、キモトリプシン添加直後から蛍光強度の急激な増大が観測され、ほぼ６００秒後には飽和に至ることが認められた（図２）。これらの結果は、キモトリプシンとｇＰｈｅ－ＨＭＲＧとの酵素反応により、ｇＰｈｅ－ＨＭＲＧのアミド結合が加水分解されて開環体を生じること、すなわち、ｇＰｈｅ－ＨＭＲＧがキモトリプシンに対するｏｎ／ｏｆｆ蛍光プローブとして機能することを示すものである。また、図１の吸収スペクトル変化において、５００ｎｍ付近の吸光度の大きな変化が見られたことから、当該波長領域における吸光度の変化を観測することによっても、キモトリプシンとｇＰｈｅ－ＨＭＲＧの反応を認識できることが分かる。
ヒト膵液を用いたｉｎ　ｖｉｔｒｏ蛍光アッセイ（ｇＰｈｅ－ＨＭＲＧ、ｇＧｌｕ－ＨＭＲＧ）
　実施例１で合成したｇＰｈｅ－ＨＭＲＧ、及び実施例２で合成したグルタミン酸残基を有するｇＧｌｕ－ＨＭＲＧを蛍光プローブとして用いて膵臓がんあるいは胆管がん患者から得られた膵液の酵素活性を評価した。蛍光プローブのＤＭＳＯ溶液（１ｍＭ）のうち1μＬを１８０μＬの０．１Ｍ リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．４）に最終濃度０．９μＭとなるように溶解し、膵液２０μＬを加え、３７℃で３０分間、酵素反応を行った。ｇＰｈｅ－ＨＭＲＧの場合には、５７　ＢＡＥＥ　ｕｎｉｔｓのトリプシン（ウシ膵臓由来のトリプシン：ＳＩＧＭＡ　Ｔ１４２６－１００ＭＧ）を添加したプローブ溶液を用いて同様の酵素反応を行った。また、比較のための阻害剤処理に関しては、ｇＧｌｕ－ＨＭＲＧの場合、γ－グルタミルトランスフェラーゼ阻害剤（ＧＧｓ－Ｔｏｐ：和光純薬０７５－０５４７１）の水溶液（１０ｍＭ）のうち１μＬ、ｇＰｈｅ－ＨＭＲＧの場合、キモトリプシン阻害剤（キモスタチン：ＳＩＧＭＡ　Ｃ７２６８）のＤＭＳＯ溶液（１０ｍＭ）のうち1μＬをプローブ溶液にそれぞれ加えた。蛍光測定装置の励起波長は４７８－４９２ｎｍ、蛍光波長は５２３－５４８ｎｍを用いた。ｇＧｌｕ－ＨＭＲＧ及びｇＰｈｅ－ＨＭＲＧについて得られた結果をそれぞれ図３及び４に示す。
　ｇＧｌｕーＨＭＲＧによるアッセイの結果、いずれの膵液サンプル（Ｎｏ．１～Ｎｏ．５）においても、蛍光強度の増加が観測された。また、γ－グルタミルトランスフェラーゼ特異的阻害剤を添加した場合には蛍光強度が有意に減少したことから、ｇＧｌｕーＨＭＲＧは膵液中のγ－グルタミルトランスフェラーゼ活性を特異的に検出できることが確認された。
　ｇＰｈｅ－ＨＭＲＧによるアッセイの場合、キモトリプシン阻害剤の有無による影響に加えて、ターゲットのキモトリプシンは前駆体（キモトリプシノーゲン）として膵液中に存在していることから、当該前記体を活性化するトリプシンの添加の有無による影響についても併せて測定を行った（図４）。その結果、溶液中にトリプシンを含む場合には、いずれの膵液サンプル（Ｎｏ．１～Ｎｏ．５）においても蛍光強度の顕著な増大が認められた。すなわち、ｇＰｈｅ－ＨＭＲＧは、前駆体であるキモトリプシノーゲンには蛍光応答をほとんど示さないが、トリプシンによる活性後のキモトリプシンに対して優れた蛍光応答を示した。また、キモトリプシンの阻害剤であるキモスタチンを添加した場合には、蛍光強度が有意に減少した。これらの結果から、ｇＰｈｅ－ＨＭＲＧは膵液中のキモトリプシン活性を特異的に検出できることが確認された。
　さらに、膵臓の切除手術を受けた患者から採取したドレーンサンプルを用いて、膵液以外の体液に対する蛍光プローブの応答挙動の比較を行った。１８人の患者から採取した、膵液、腹水、及び腸液の計７６サンプルについて、ｇＧｌｕ－ＨＭＲＧ、ｇＰｈｅ－ＨＭＲＧ、及び、トリプシン添加ｇＰｈｅ－ＨＭＲＧ（ｇＰｈｅ－ＨＭＲＧ－Ｔｒｙ）の蛍光強度変化を測定した。
　９６ウェルのマイクロプレートリーダー（ＳＨ－８０００、日立）の各ウェルに、１８０μＬのプローブ溶液（１．１μＭ）を入れ、次いで２０μＬの採取サンプルを添加混合し、３７℃でインキュベーションしてそれぞれ５分後、１５分後、３０分後の蛍光応答を測定した。ｇＰｈｅ－ＨＭＲＧ－Ｔｒｙには、トリプシンを最終濃度が０．５２５μＢＴＥＥ／μＬとなるよう添加した。蛍光測定装置の励起波長は４９０ｎｍ、蛍光波長は５２０ｎｍを用いた。得られた蛍光応答の結果を各サンプルの平均値として図５に示す。
　図５より、トリプシン添加しないｇＰｈｅ－ＨＭＲＧ単独の場合はいずれの体液に対しても有意な蛍光応答は観測されなかったが、トリプシンを添加したｇＰｈｅ－ＨＭＲＧ－Ｔｒｙでは、膵液に対してのみ大きな蛍光強度の増加が見られた。これは、膵液中において、ｇＰｈｅ－ＨＭＲＧが、トリプシン添加によって活性化されたキモトリプシンと特異的に反応することを示すものである。一方、ｇＧｌｕ－ＨＭＲＧでは、膵液に対して蛍光強度の増加が見られたものの、腹水及び腸液に対しても蛍光強度の増加が観測され、特に、腸液に対しては膵液の場合よりも大きな蛍光強度の増加が観測された。これは、腸液中に含まれるγ－グルタミルトランスフェラーゼに応答したものと考えられる。これらの結果から、他の体液と膵液を区別して特定するためにキモトリプシン活性を指標とすることが非常に有効であり、かつ、ｇＰｈｅ－ＨＭＲＧとトリプシンを併用することで膵液を選択的に検出できることが実証された。
　なお、上述のように、ｇＰｈｅ－ＨＭＲＧ（トリプシン添加）のほうが、ｇＧｌｕ－ＨＭＲＧに比べて優れた蛍光応答を示したが、蛍光プローブ分子単独で（すなわち、トリプシン添加を要せず）膵液を検出できるという点で、腸液等が存在しない環境の場合にはｇＧｌｕ－ＨＭＲＧが非常に有益であると考えられる。
ｉｎ　ｖｉｔｒｏ蛍光アッセイ（化合物５、８、及び１１）
　上記実施例６と同様に、実施例３で合成したＢｚ－Ｔｙｒ－ＨＭＲＧ（化合物５）、及び実施例４で合成したＧｌｔ－ＡＡＦ－ＨＭＲＧ（化合物８）とＳｕｃ－ＡＡＰＦ－ＨＭＲＧ（化合物１１）を蛍光プローブとして用いて、キモトリプシンとの反応性を評価した。測定条件は、以下のとおりである。

＜測定条件＞
　基質終濃度：１μＭ（ｐＨ３での吸光度からストック濃度を算出、調整）
　緩衝液：ＰＢＳ、ｐＨ７．４
　阻害剤（キモスタチン）：１０μＭ
　キモトリプシン：２Ｕ
　インキュベーション時間：１０分、２０分、３０分（図６は、３０分後の蛍光強度値）
　測定装置：コロナプレートリーダー(ＳＨ８０００)
　励起蛍光波長：５０１ｎｍ、５２４ｎｍ
　得られた蛍光応答の結果をそれぞれ複数サンプルの平均値として図６に示す。その結果、全ての蛍光プローブにおいて蛍光強度の増加が観測された。また、キモトリプシン阻害剤（キモスタチン）を添加した場合には蛍光強度が有意に減少したことから、これらの蛍光プローブはいずれも膵液中のキモトリプシン活性を特異的に検出できることが実証された。
ヒト膵液の蛍光イメージング
　蛍光プローブとしてｇＰｈｅ－ＨＭＲＧ及びｇＧｌｕ－ＨＭＲＧを用いて、膵離断面の膵液の蛍光イメージングを行った。測定対象である膵液を保持される材料として、手術中で使用する場合等を想定し、医療現場で使用されている拭きタオルおよび実験用のろ紙(紙自体のバックグラウンド蛍光が低いもの)を用いた。具体的な手順は、外科手術で摘出した直後の膵臓片を採取し、その離断面に拭きタオルおよびろ紙を接着させて膵液を付着させた。その後、接着させた紙にｇＰｈｅ－ＨＭＲＧ(トリプシンを含む)及びｇＧｌｕ－ＨＭＲＧのプローブ溶液を噴霧してイメージングを開始した。プローブ溶液は、プローブのＤＭＳＯ溶液（１０ｍＭ）の１０μＬを２ｍＬのＲＰＭＩ１６４０培地（ＧＩＮＢＯ　１１８３５）に最終濃度５０μＭとなるよう溶解させ、ｇＰｈｅ－ＨＭＲＧにはトリプシン（５２．６　ＢＴＥＥ　ｕｎｉｔｓ）を加えた溶液を用いた。励起フィルターは４３５－４８０ｎｍ、蛍光フィルターは４９０ｎｍのロングパスフィルターを用いた。得られたイメージ画像を図７及び図８に示す。
　図７ａ及び図８ａは、膵液の付着箇所を白色光画像で示したものである。図７ｂ及び図８ｂの左側は、５００－７２０ｎｍにおけるカラーイメージであり、右側は５４０ｎｍにおける蛍光イメージを示す。その結果、ｇＰｈｅ－ＨＭＲＧ及びｇＧｌｕ－ＨＭＲＧのいずれにおいても、プローブを噴霧してから数分で膵液付着部分の可視化に成功した。特に、ｇＰｈｅ－ＨＭＲＧでは、噴霧から１分後には、肉眼で判別可能な明確な蛍光応答が認められた。加えて、ｇＰｈｅ－ＨＭＲＧでは、膵液以外の体液付着部分（図７ａ中の青色実線枠内）については、蛍光応答が観測されなかったことから、蛍光応答を確認することによって、膵液の存在を選択的に検出及びイメージング可能であることが実証された。

Claims (15)

  1. 　以下の式（Ｉ）で表される化合物又はその塩を含む膵液検出用蛍光プローブ：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     （式中、Ａはアミノ酸残基又はＮ－置換アミノ酸残基を表し、ここで、Ａは隣接する式中のＮＨとアミド結合を形成して連結しており；Ｒ１は水素原子又はベンゼン環に結合する1個ないし4個の同一又は異なる置換基を表し；Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、及びＲ７はそれぞれ独立に水素原子、水酸基、アルキル基、又はハロゲン原子を表し；Ｒ８及びＲ９はそれぞれ独立に水素原子又はアルキル基を示し；ＸはＣ１-Ｃ３アルキレン基を表す）。
  2. 　前記アミノ酸が芳香族アミノ酸から選択される、請求項１に記載の蛍光プローブ。
  3. 　Ａが以下の式（ＩＩ）で表される基である、請求項１に記載の蛍光プローブ：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     （式中、Ｒ１０は置換又は無置換のアシル基を表し、Ｒ１１は水素原子又は水酸基を表す）。
  4. 　Ｒ１０が、アセチル基、カルボベンゾキシ基、ベンゾイル基、スクシニル基、グルタリル基、あるいは、Ｎ末端にアセチル基、カルボベンゾキシ基、ベンゾイル基、スクシニル基、グルタリル基が置換したアミノ酸残基、あるいはＮ末端アミノ基にアセチル基、カルボベンゾキシ基、ベンゾイル基、スクシニル基、グルタリル基が置換した、１個乃至５個のアミノ酸よりなるペプチド基、又はこれらを一部に含む置換基から選択される、請求項３に記載の蛍光プローブ。
  5. Ａが以下の式（ＩＩＩ）～（ＶＩ）で表される基から選択される、請求項１に記載の蛍光プローブ。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
  6. 　Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８及びＲ９が水素原子であり、Ｘがメチレン基である、請求項１～５のいずれか１項に記載の蛍光プローブ。
  7. 　Ａがγ－グルタミル基である、請求項１に記載の蛍光プローブ。
  8. 　Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８及びＲ９が水素原子であり、Ｘがメチレン基である、請求項７に記載の蛍光プローブ。
  9. 　請求項１～８のいずれか１項に記載の蛍光プローブを体液試料と接触させ、当該試料中に含まれるプロテアーゼと蛍光プローブの反応による蛍光応答又は吸光度変化を観測することにより、膵液の存在を検出することを特徴とする、膵液検出方法。
  10. 　前記プロテアーゼが、キモトリプシンである、請求項９に記載の検出方法。
  11. 　前記蛍光プローブと前記体液試料を接触させる際に、当該体液試料中にトリプシンを添加することを含む、請求項１０に記載の検出方法。
  12. 　前記プロテアーゼが、γ－グルタミルトランスフェラーゼである、請求項９に記載の検出方法。
  13. 　蛍光イメージング手段を用いて前記蛍光応答を可視化することを更なる特徴とする、請求項９～１２のいずれか１項に記載の検出方法。
  14. 　請求項１～８のいずれか１項に記載の蛍光プローブを含む、膵液検出用キット。
  15. 　請求項１～６いずれか１項に記載の蛍光プローブとトリプシンを含む膵液検出用キットであって、当該キットが使用されるまでの期間において前記蛍光プローブと前記トリプシンが混合することなく格納されていることを特徴とする、膵液検出用キット。
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