JP2014050396A - 高感度膵液検出用蛍光プローブ、及び膵液検出方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明の蛍光プローブは、一般式(I)で示されるキサンテン骨格上部が閉環状態では、中性領域(例えばpH5ないし9の範囲)において当該蛍光プローブ自体は実質的に無蛍光である。一方、A−NHとのアミド結合がプロテアーゼにより加水分解されると速やかに開環した互変異性体となって強蛍光性の下記化合物が生じる。
本発明の膵液検出方法では、上記蛍光プローブを体液試料と接触させ、当該試料中に含まれるプロテアーゼと蛍光プローブの反応による蛍光応答を観測することにより、膵液の存在を検出することができる。好ましい態様では、上記プロテアーゼは、キモトリプシン又はγ−グルタミルトランスフェラーゼであり、より好ましくは、キモトリプシンである。本明細書において「検出」という用語は、定量、定性など種々の目的の測定を含めて最も広義に解釈されるべきである。なお、一般式(I)で表される化合物又はその塩は、中性領域において350nm以上の波長の光をほとんど吸収しないが、膵液中に存在するプロテアーゼによって加水分解されて上記開環化合物に変化すると、その構造変化に伴って、紫外可視領域の吸収スペクトルが変化して350nm以上の波長の光も吸収するようになるので、場合によって、紫外可視吸光スペクトルの変化(例えば、特定の吸収波長における吸光度の変化)によって上記プロテアーゼと蛍光プローブの反応を検出することも可能である。
本発明の膵液検出方法においては、上記蛍光プローブを含む膵液検出用キットを用いることが好ましい。特に、上記プロテアーゼがキモトリプシンである場合、上記蛍光プローブとトリプシンを含み、測定が行われるまでの期間において蛍光プローブとトリプシンが混合することなく格納されていることが好ましい。これは、蛍光プローブとトリプシンとを長時間混在させた場合には、それらが反応するおそれもあり得るため、検体を測定する直前まで別々に保管させることが望ましいことによる。しかしながら、キットの利便性等の観点から、蛍光プローブとトリプシンは、必ずしも別個の独立した容器に格納されている必要はなく、これらが混合されない環境である限り、一体化した或いは連結した複数の格納領域を有する容器を用いることができる。
HMRG 55mg(0.174mmol、1eq.)とトリエチルアミン 53.6μL(0.167mmol、2.2eq.)をジメチルホルムアミド(DMF)2mLに溶かしアルゴン雰囲気下にて0℃で10分間撹拌した。続いて、クロロぎ酸9−フルオレニルメチル67mg(0.261mmol、1.5eq.)を溶解したDMF 0.5mLを加え15時間攪拌した。反応溶媒を減圧除去し、残渣をシリカゲルクロマトグラフィーで精製して(ジクロルメタン/メタノール=95/5)目的化合物(36mg、22%)を得た。なお、HMRGの合成については、実施例2(a)を参照。
化合物1 36mg(0.067mmol、1eq.)とN,N−ジイソプロピルエチルアミン(DIEA)30.0μL(0.167mmol、2.5eq.)をDMF2mLに溶かしアルゴン雰囲気下にて0℃で10分間撹拌した。続いてBoc−Phe−OH(N−(tert−ブトキシカルボニル)−L−フェニルアラニン)44.4mg(0.167 mmol、2.5eq.)とO−(7−アザベンゾトリアゾール−1−イル)−N,N,N',N'−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート(HATU)63.5mg(0.167mmol、2.5 eq.)を溶かしたDMF 0.5mLを加え15時間撹拌した。反応溶媒を減圧除去し、残渣をシリカゲルクロマトグラフィーで精製して(n−ヘキサン/酢酸エチル=66/34)目的化合物(42mg、81%)を得た。
化合物2 42mg(0.053 mmol、1eq.)を20%トリフルオロ酢酸(TFA)/ジクロルメタン溶液に溶解し、30分間室温で撹拌した。溶媒を減圧除去し、得られた固体をジクロルメタン及び炭酸水素ナトリウムの飽和水溶液で抽出した。有機層に硫酸ナトリウム加えてろ過した後に、溶媒を除去し固体を得た。得られた固体を5mLのジクロルメタンに溶解し、グルタル酸無水物22.8mg(0.200mmol、3.8eq.)とTEA 28.2μL(0.200mmol、3.8eq.)を加え、アルゴン雰囲気下に室温で15時間撹拌した。続いて溶媒を減圧除去し、20%ピペリジン/DMF溶液を加え、30分間室温で攪拌した。溶媒を除去し、HPLCを用いて精製を行い(eluent A (H2O 0.1%TFA) and eluent B(CH3CN 80%,H2O 20%)(A/B=80/20to0/100 40min))目的化合物(13.7mg,45%) を得た。
13C NMR (100 MHz, CD3OD): d 176.8, 175.5, 173.4, 164.6, 161.7, 160.1, 156.9, 148.3, 141.2, 137.9, 134.8, 131.7, 130.5, 130.3, 129.8, 129.5, 129.0, 128.0, 121.5, 119.5, 119.4, 118.6, 107.1, 98.5, 63.1, 57.3, 38.9, 35.6, 33.9, 22.1. HRMS (ESI+) Calcd FOR [M+H]+, 578.22911, Found, 578.22659 (−2.52 mmu).
ローダミン110 285mg(0.8mmol、1eq.)をメタノール 10mLに溶かし硫酸を加えてアルゴン雰囲気下に80℃で10時間攪拌した。反応溶媒を減圧除去し、残渣を飽和重曹水および水で洗浄した。得られた固体をテトラヒドロフラン(THF)10mLに溶解させ、アルゴン雰囲気下に0℃で5M ナトリウムメトキシド溶液(メタノール中)400μL(0.8mmol、1eq.)を加えて10分間攪拌した。続いてリチウムアルミニウムハイドライド 333mg(8mmol,10eq.)を加えて3時間攪拌した。飽和塩化アンモニウム水溶液を5mL加え、溶媒を減圧除去し、得られた固体をジクロルメタン及び酒石酸4水和物カリウム・ナトリウム塩の飽和水溶液で抽出した。有機層に硫酸ナトリウムを加えてろ過した後、溶媒を除去し、固体を得た。得られた固体をジクロルメタンに溶解し、クロラニル 196mg(1mmol、1eq.)を加えて30分間室温で攪拌した。溶媒を減圧下で除去し、残渣をシリカゲルクロマトグラフィーで精製して(ジクロルメタン/メタノール=10:1)目的化合物(104 mg,41%)を得た。
13C NMR (75 MHz, CD3OD): δ 161.5, 159.9, 159.6, 141.0, 133.4, 132.2, 131.3, 130.3, 129.5, 128.8, 118.0, 115.0, 98.4, 62.8
HRMS (ESI+) Calcd FOR [M+H]+, 317.12900, Found, 317.12862 (−0.38 mmu)
化合物3(0.05mmol 1eq.)、HATU(0.11mmol、2eq.)、及びN,N−ジイソプロピルエチルアミン(0.11mmol、2eq.)をジメチルホルムアミド(DMF)2mLに溶解し、アルゴン雰囲気下に0℃で10分間攪拌した。続いてBoc−Glu−OtBu(0.05mmol、1eq.)を溶解したDMF 0.5mLを加え15時間攪拌した。反応溶媒を減圧除去した後に得られた固体をジクロルメタン2mLとトリフルオロ酢酸(TFA)2mLに溶かし、30分間攪拌した。溶媒を除去し、HPLCを用いて精製を行い(eluent A:H2O 0.1%TFA及びeluent B:CH3CN 80%,H2O 20% 0.1% TFA;A/B=80/20 to 0/100 FOR 40 min.)、目的化合物を得た。
13C NMR (75 MHz,CD3OD): δ173.4, 171.8, 164.5, 163.1, 160.7, 157.1, 148.7, 141.2, 134.9, 131.9, 131.7, 130.5, 129.8, 129.0, 121.4, 119.4, 118.5, 106.9, 98.5, 63.1, 53.5, 33.4, 26.6
HRMS (ESI+) Calcd FOR [M+H]+, 446.17160, Found, 446.17195 (+0.36 mmu).
水酸化ナトリウム 263mg(6.56mmol)を水 1.75mLに溶解した。この水酸化ナトリウム水溶液中にBz−Tyr−OH 500mg(1.75mmol)を加えて溶解し、氷片を数個加えて0℃に冷却した。無水酢酸 620μL(6.56mmol)を加え、0℃で20分間攪拌した。次いで、酢酸エチル 20mLと水 50mLを加え、3M塩酸でpH2とした。有機層を分液し、再度酢酸エチル 20mLを加えて分液後、有機層を合わせて硫酸ナトリウムで乾燥した。酢酸エチルを減圧除去し、酢酸エチルとヘキサンを用いて再結晶して化合物4(379mg、66%)を得た。
1H NMR (400MHz,CDCl3): δ 7.68(m,2H),δ 7.51(m,1H),δ 7.41(m,2H),δ 7.20(d,J=8.3,2H),7.02(d,J=8.3,2H),δ 6.66(d,J=7.3,1H),δ 5.08(m,1H),δ 3.35(dd,J=14.2,5.5、1H)δ 3.27(dd,J=14.2,5.5、1H),δ 2.30(s,3H)
13C NMR(100MHz,CDCl3): δ 174.1,169.9,167.8,149.9,133.5,133.4,132.2,130.6,128.8.127.2,121.8,53.6,36.7,21.2
化合物4 15.1mg(0.046mmol、5eq.)とHATU 17.5mg(0.046mmol,5eq.)をDMF 1mLに溶かし窒素雰囲気下に0℃に冷却した。続いて、N,N−ジイソプロピルエチルアミン 9.9μL(0.055mmol、6eq.)を加え、3分間攪拌した。これを、化合物1 5mg(0.009mmol)をDMF 1mLに溶解して、窒素雰囲気下に0℃に冷却した溶液中に加え、ゆっくりと室温に戻して24時間攪拌した。反応溶媒を減圧除去し、残渣に20mLのジクロロメタンを加え、1M塩酸 20mLで洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥後、ジクロロメタンを減圧除去し、残渣をシリカゲルクロマトグラフィーで精製した(ヘキサン/酢酸エチル=7/3→5/5)。目的化合物を含む分画を減圧下濃縮し、残渣をTHF 2mLに溶解後、ジエチルアミン96μL(0.92mmol)を加えて室温で24時間攪拌した。反応溶媒を減圧除去し、残渣を2mLのメタノールに溶解して0.1M水酸化ナトリウム水溶液100μLを加え、室温で1時間攪拌した。1M塩酸 100μLを加えた後、反応溶媒を減圧除去し、残渣をHPLCで精製して(eluent A:H2O 0.1%TFA及びeluent B:アセトニトリル 0.1%TFA;A/B=80/20 to 0/100 FOR 30min.)、化合物5を得た。
HRMS(ESI+) Calcd FOR [M+H]+,584.21800, Found,584.21887(0.87mmu).
N−Boc保護ペプチドである化合物6及び9はProtein Technologies社製のPrelude自動固相合成装置を使って、H−Phe−Trt(2−Cl)−Resin(0.94mmol/g、100−200mesh、1%DVB(ジビニルベンゼン))を用いて以下に示す通常のFmoc固相合成法で合成した。
(1)ペプチドカップリングサイクル:Fmocアミノ酸(レジンの4当量)とO−(ベンゾトリアゾール−1−イル)−N,N,N’,N’,−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロりん酸塩(HBTU:レジンの4当量)をDMFに溶解させ、ジイソプロピルエチルアミン(DIPEA:レジンの8当量)を加えて攪拌した。この溶液を、N末脱保護ペプチドをカップリングさせたレジンに加えて2.5分攪拌した。
(2)Fmoc脱保護サイクル:Fmoc保護基の脱保護は、20%(v/v)ピペリジ
ン/DMF溶液をレジンに加え、12分攪拌することで行った。
(3)レジンからの切り出し: 酢酸10%、2,2,2−トリフルオロエタノール20%、ジクロロメタン70%の溶液をレジンに加え、1時間攪拌してペプチドをレジンから切り出した。レジンを濾過で除き、ろ液を減圧除去し、残渣に過剰量の冷却ジイソプロピルエーテルを加えて生じた沈殿をろ取し、N−Boc保護ペプチドの化合物6及び9を得た。
N−Boc保護ペプチド(化合物6) Boc−AAF−OH
ESI-MS : m/z 407[M]+
N−Boc保護ペプチド(化合物9) Boc−AAPF−OH
ESI-MS : m/z 504[M]+
N−Boc保護ペプチドの化合物6 30.0mg(0.074mmol、4eq.)とHATU 35.0mg(0.092mmol,5eq.)をDMF 1mLに溶かし窒素雰囲気下に0℃に冷却した。続いて、N,N−ジイソプロピルエチルアミン 19.7μL(0.11mmol、6eq.)を加え、3分間攪拌した。これを、化合物1 10mg(0.018mmol)をDMF 1mLに溶解して、窒素雰囲気下に0℃に冷却した溶液中に加え、 ゆっくりと室温に戻して24時間攪拌した。反応溶媒を減圧除去し、残渣をシリカゲルクロマトグラフィーで精製し(ヘキサン/酢酸エチル=5/5)、化合物7を得た。
ESI-MS : m/z 928[M]+
(b)で得られた化合物7を20%TFA/ジクロロメタン溶液に溶解し、室温で30分間攪拌した。次いで、反応溶媒を減圧除去し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液10mLとジクロロメタン10mLを加えて分液し、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥した。有機溶媒を減圧除去し、ジクロロメタン 5mL、無水グルタル酸 9.7mg(0.085mmol、4.7eq.)及びトリエチルアミン 11.8μL(0.085mmol、4.7eq.)を加え室温で20時間攪拌した。次いで、反応溶媒を減圧除去し、20%ピペリジン/DMF溶液1mLを加え室温で1時間攪拌した。反応溶媒を減圧除去し、残渣をHPLCで精製して(eluent A:H2O 0.1%TFA及びeluent B:アセトニトリル 0.1%TFA;A/B=80/20 to 0/100 FOR 30min.)、化合物8のGlt−AAF−HMRGを得た(3.0mg、23%(2工程))。
HRMS(ESI+) Calcd FOR [M+Na]+,742.28473, Found,742.28268(−2.05mmu).
N−Boc保護ペプチドの化合物9 37.3mg(0.074mmol、4eq.)とHATU 35.0mg(0.092mmol,5eq.)をDMF 1mLに溶かし窒素雰囲気下に0℃に冷却した。続いて、N,N−ジイソプロピルエチルアミン 19.7μL(0.11mmol、6eq.)を加え、3分間攪拌した。これを、化合物1 10mg(0.018mmol)をDMF 1mLに溶解して、窒素雰囲気下に0℃に冷却した溶液中に加え、 ゆっくりと室温に戻して24時間攪拌した。反応溶媒を減圧除去し、残渣をシリカゲルクロマトグラフィーで精製して(ヘキサン/酢酸エチル=7/3 to 3/7)、化合物10を得た。
ESI-MS : m/z 1025[M]+
(d)で得られた化合物10を20%TFA/ジクロロメタン溶液に溶解し、室温で30分間攪拌した。次いで、反応溶媒を減圧除去し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液10mLとジクロロメタン10mLを加えて分液し、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥した。有機溶媒を減圧除去し、ジクロロメタン 5mL、無水コハク酸 7.8mg(0.078mmol、4eq.)及びトリエチルアミン 10.9μL(0.078mmol、4eq.)を加え室温で20時間攪拌した。次いで、反応溶媒を減圧除去し、20%ピペリジン/DMF溶液1mLを加え室温で1時間攪拌した。反応溶媒を減圧除去し、残渣をHPLCで精製して(eluent A:H2O 0.1%TFA及びeluent B:アセトニトリル 0.1%TFA;A/B=80/20 to 0/100 FOR 30min.)、化合物8のSuc−AAPF−HMRGを得た(4.1mg、28%(2工程))。
HRMS(ESI+) Calcd FOR [M+Na]+,825.32185, Found,825.32122(−0.63mmu).
実施例1で合成した、N−置換フェニルアラニンに基づくアミノ酸残基を有するgPhe−HMRG化合物を中性リン酸バッファーに溶解して、キモトリプシンを作用させ、その蛍光アッセイを行った。gPhe−HMRGの2.4mM ジメチルスルホキシド(DMSO)溶液 3μLを3mLの0.1M リン酸ナトリウムバッファー(pH7.4)に最終濃度2.4μMとなるように溶解し、キモトリプシン(ウシ膵臓由来のa−キモトリプシン:SIGMA C4129−250MG)4.6 Uを加えて37℃で酵素反応を行った。励起波長は501nmとした。得られた結果を図1及び2に示す。
実施例1で合成したgPhe−HMRG、及び実施例2で合成したグルタミン酸残基を有するgGlu−HMRGを蛍光プローブとして用いて膵臓がんあるいは胆管がん患者から得られた膵液の酵素活性を評価した。蛍光プローブのDMSO溶液(1mM)のうち1μLを180μLの0.1M リン酸ナトリウムバッファー(pH7.4)に最終濃度0.9μMとなるように溶解し、膵液20μLを加え、37℃で30分間、酵素反応を行った。gPhe−HMRGの場合には、57 BAEE unitsのトリプシン(ウシ膵臓由来のトリプシン:SIGMA T1426−100MG)を添加したプローブ溶液を用いて同様の酵素反応を行った。また、比較のための阻害剤処理に関しては、gGlu−HMRGの場合、γ−グルタミルトランスフェラーゼ阻害剤(GGs−Top:和光純薬075−05471)の水溶液(10mM)のうち1μL、gPhe−HMRGの場合、キモトリプシン阻害剤(キモスタチン:SIGMA C7268)のDMSO溶液(10mM)のうち1μLをプローブ溶液にそれぞれ加えた。蛍光測定装置の励起波長は478−492nm、蛍光波長は523−548nmを用いた。gGlu−HMRG及びgPhe−HMRGについて得られた結果をそれぞれ図3及び4に示す。
上記実施例6と同様に、実施例3で合成したBz−Tyr−HMRG(化合物5)、及び実施例4で合成したGlt−AAF−HMRG(化合物8)とSuc−AAPF−HMRG(化合物11)を蛍光プローブとして用いて、キモトリプシンとの反応性を評価した。測定条件は、以下のとおりである。
<測定条件>
基質終濃度:1μM(pH3での吸光度からストック濃度を算出、調整)
緩衝液:PBS、pH7.4
阻害剤(キモスタチン):10μM
キモトリプシン:2U
インキュベーション時間:10分、20分、30分(図6は、30分後の蛍光強度値)
測定装置:コロナプレートリーダー(SH8000)
励起蛍光波長:501nm、524nm
蛍光プローブとしてgPhe−HMRG及びgGlu−HMRGを用いて、膵離断面の膵液の蛍光イメージングを行った。測定対象である膵液を保持される材料として、手術中で使用する場合等を想定し、医療現場で使用されている拭きタオルおよび実験用のろ紙(紙自体のバックグラウンド蛍光が低いもの)を用いた。具体的な手順は、外科手術で摘出した直後の膵臓片を採取し、その離断面に拭きタオルおよびろ紙を接着させて膵液を付着させた。その後、接着させた紙にgPhe−HMRG(トリプシンを含む)及びgGlu−HMRGのプローブ溶液を噴霧してイメージングを開始した。プローブ溶液は、プローブのDMSO溶液(10mM)の10μLを2mLのRPMI1640培地(GINBO 11835)に最終濃度50μMとなるよう溶解させ、gPhe−HMRGにはトリプシン(52.6 BTEE units)を加えた溶液を用いた。励起フィルターは435−480nm、蛍光フィルターは490nmのロングパスフィルターを用いた。得られたイメージ画像を図7及び図8に示す。
Claims (15)
- 前記アミノ酸が芳香族アミノ酸から選択される、請求項1に記載の蛍光プローブ。
- R10が、アセチル基、カルボベンゾキシ基、ベンゾイル基、スクシニル基、グルタリル基、あるいは、N末端にアセチル基、カルボベンゾキシ基、ベンゾイル基、スクシニル基、グルタリル基が置換したアミノ酸残基、あるいはN末端アミノ基にアセチル基、カルボベンゾキシ基、ベンゾイル基、スクシニル基、グルタリル基が置換した、1個乃至5個のアミノ酸よりなるペプチド基、又はこれらを一部に含む置換基から選択される、請求項3に記載の蛍光プローブ。
- R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8及びR9が水素原子であり、Xがメチレン基である、請求項1〜5のいずれか1項に記載の蛍光プローブ。
- Aがγ−グルタミル基である、請求項1に記載の蛍光プローブ。
- R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8及びR9が水素原子であり、Xがメチレン基である、請求項7に記載の蛍光プローブ。
- 請求項1〜8のいずれか1項に記載の蛍光プローブを体液試料と接触させ、当該試料中に含まれるプロテアーゼと蛍光プローブの反応による蛍光応答又は吸光度変化を観測することにより、膵液の存在を検出することを特徴とする、膵液検出方法。
- 前記プロテアーゼが、キモトリプシンである、請求項9に記載の検出方法。
- 前記蛍光プローブと前記体液試料を接触させる際に、当該体液試料中にトリプシンを添加することを含む、請求項10に記載の検出方法。
- 前記プロテアーゼが、γ−グルタミルトランスフェラーゼである、請求項9に記載の検出方法。
- 蛍光イメージング手段を用いて前記蛍光応答を可視化することを更なる特徴とする、請求項9〜12のいずれか1項に記載の検出方法。
- 請求項1〜8のいずれか1項に記載の蛍光プローブを含む、膵液検出用キット。
- 請求項1〜6いずれか1項に記載の蛍光プローブとトリプシンを含む膵液検出用キットであって、当該キットが使用されるまでの期間において前記蛍光プローブと前記トリプシンが混合することなく格納されていることを特徴とする、膵液検出用キット。
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