CN103940788A - 纳米银团簇在检测次氯酸含量的应用及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种检测次氯酸含量的方法,以纳米银团簇溶液作为探针,通过荧光光谱法检测次氯酸含量。本发明将具有荧光性的纳米银团簇应用到次氯酸的定量检测中,利用次氯酸将纳米银团簇氧化而造成纳米银团簇的荧光猝灭的原理,以纳米银团簇溶液为探针,通过控制溶液的pH、纳米银团簇的量以及荧光强度的测量等步骤实现对次氯酸的定量检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种荧光检测方法,具体而言是一种将纳米银团簇作为荧光探针应用于检测氯酸含量的方法。
背景技术
有机生命体在有氧新陈代谢过程中会产生次氯酸自由基(HClO)。这种内源性次氯酸是在髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)催化下,通过过氧化氢氧化体内的氯离子而产生的。在人体日常的新陈代谢过程中,次氯酸起着重要的作用,例如宿主防御、杀死入侵体内的病原体等。在医学领域,体内次氯酸的含量也被作为一种病理指标,用于一些像老年痴呆症、动脉粥样硬化、炎症、心血管疾病、癌症器官移植排斥反应等疾病的分析。因此,生命体系中次氯酸的检测对于上述多种疾病的防治具有重要的意义。在疾病的早期诊断、治疗以及生命科学的研究中需要准确的获得次氯酸的浓度。
荧光光谱测定法具有灵敏度高、方法简单、价格低廉等优点,在测定离子方面尤其是生物体内的离子含量方面展现出重要的应用价值。
近年来,一些基于有机染料被次氯酸氧化从而造成其荧光猝灭或者产生的原理而被开发成为荧光探针用于次氯酸的检测的文献和专利已有报道。然而这些有机荧光探针也有一些缺点,例如:荧光激发光谱窄、宽发射峰、荧光稳定性差、斯托克位移小、对氧敏感、容易光漂白等。
半导体量子点(QDs)作为一种新型的荧光纳米材料具有很多独特且优异的光学性质,如耐光漂白能力强、化学稳定性好、吸收光谱宽、发射光谱窄、发射波长可调等优点,可以避免有机荧光探针的缺点。目前,研究人员们发现具有核壳结构的硒化镉(CdSe)半导体量子点的荧光发射强度对次氯酸存在很强的敏感性,因此已经被开发成为一种荧光探针用于细胞及生物体内的次氯酸浓度的检测。然而,半导体量子点也存在一些缺点,例如:毒性较大、尺寸较大(通常为10 ~ 20 nm)、强分子冥律间歇现象等。这些缺点也限制了其在生物领域的进一步应用。
因此,我们需要一种操作简单、成本较低的方法用于样品中次氯酸的检测。该方法不仅可以克服传统荧光染料激发光谱窄、斯托克位移小、光稳定性差、激发波长受限等不足之处,还具有半导体量子点所不具有的优势。
发明内容
为解决现有技术的不足,本发明提出一种采用无毒,且生物相容性好的纳米银团簇作为探针,用于检测生命体系中次氯酸浓度的新方法。该方法的特点是:简单、易于操作,对次氯酸的定量检测具有良好的灵敏性和选择性。
为实现上述目的,所采取的技术方案是:
一种检测次氯酸含量的方法,以纳米银团簇溶液作为探针,通过荧光光谱检测次氯酸含量。
在本发明一实施例中,所述方法是:取0.2 ml~0.5 ml pH值为7.4的纳米银团簇溶液作为探针,在pH值为7.4的缓冲溶液下与待测溶液混合并静置15~30 min,用荧光光谱仪在37℃下检测混合溶液在637 nm处的荧光强度。
在本发明一实施例中,所述荧光光谱仪的激发波长设置为510 nm、激发狭缝宽度为2 nm、发射狭缝宽度为3 nm。
在本发明一实施例中,所述缓冲溶液为PBS缓冲溶液。
在本发明一较优实施例中,提供一种检测次氯酸含量的方法,所述方法具体包括:
(1)制备纳米银团簇溶液:
以聚甲基丙烯酸钠为模板,以硝酸银溶液为银源,两者混合后将所得混合液pH值调节为4.5;然后,将所述混合液置于紫外灯下并不断搅拌,用365 nm的紫外光进行照射70 min,获得具有强荧光的水溶性纳米银团簇溶液;调节获得的纳米银团簇溶液的pH值为7.4;
(2)绘制标准曲线并获得线性回归方程式
取0.2 ml~0.5 ml 步骤(1)获得的pH值为7.4的纳米银团簇溶液作为探针,在pH值为7.4的PBS缓冲溶液缓冲条件下,与次氯酸标准溶液混合;调节混合液中次氯酸的浓度依次为:0、4、6、8、10、12、14、16、18、20、24 μmol/L;静置15~30 min后,用荧光光谱仪在37℃下分别检测上述各混合液在637 nm处荧光强度,获得相对荧光强度与次氯酸浓度的标准曲线;根据所得标准曲线,获得荧光强度与次氯酸浓度的线性回归方程式;
(3)检测
取0.2 ml~0.5 ml pH值为7.4的纳米银团簇溶液作为探针,在pH值为7.4的缓冲溶液下与待测溶液混合并静置15~30 min,用荧光光谱仪在37℃下检测混合溶液在637 nm处的荧光强度;
(4)计算
将步骤(3)检测到的荧光强度代入步骤(2)获得的线性回归方程式,计算得到待测溶液的次氯酸浓度;
所述荧光光谱仪的激发波长设置为510 nm、激发狭缝宽度为2 nm、发射狭缝宽度为3 nm。
本发明还提供纳米银团簇在检测次氯酸含量的应用。
在本发明一实施例中,所述应用是以纳米银团簇作为探针,通过荧光光谱测定法检测次氯酸含量。
在本发明一实施例中,所述应用是以pH值为7.4的纳米银团簇作为探针,与待测溶液混合获得混合液,用荧光光谱仪在37 ℃下检测所述混合液在637 nm处的荧光强度。
本发明将具有荧光性的纳米银团簇应用到次氯酸的定量检测中,利用次氯酸将纳米银团簇氧化而造成纳米银团簇的荧光猝灭的原理,以纳米银团簇溶液为探针,通过控制溶液的pH、纳米银团簇的量以及荧光强度的测量等步骤实现对次氯酸的定量检测。
本发明提供的方法具有探针制备简单、对环境没有毒害、检测方法快速简便、检测灵敏性好、选择性高等优点,克服了以荧光有机染料为探针存在的激发光谱窄、斯托克位移小、光稳定性差等缺点。同时,本发明提供的方法与现有技术中以半导体量子点为探针检测次氯酸的方法相比,银比半导体的生物相容性更好,毒性也更低,并且银与次氯酸作用后生成的银离子会与氯离子形成氯化银,而非半导体量子点生成具有毒性的重金属镉离子,更适合应用到生物领域。
附图说明
图1:pH为7.4条件下,含有不同浓度次氯酸的荧光纳米银团簇溶液的荧光光谱图(从上到下次氯酸钠的浓度依次为:0、4、6、8、10、12、14、16、18、20、24 μmol/L)。激发波长为510 nm。
图2:pH为7.4条件下,纳米银团簇的荧光强度与次氯酸浓度的线性关系图。激发波长为510 nm。其中I0为不含次氯酸钠时纳米银团簇在637 nm处的荧光强度,I为含有一定浓度的次氯酸钠时,纳米银团簇在637 nm处的荧光强度。
图3 :pH为7.4条件下,不同自由基对纳米银荧光强度的影响。
图4:pH为7.4条件下,不同阴(A)阳(B)离子对纳米银荧光强度的影响。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做详细的说明,实施例旨在解释而非限定本发明的技术方案。
实施例1 确定检测荧光强度
在本实施例中,以纳米银团簇溶液作为探针,检测不同标准浓度次氯酸溶液在560~800 nm处的荧光强度,获得荧光光谱图,从而确定荧光光谱测定法的检测荧光波长。具体步骤为:
(1)纳米银团簇和次氯酸溶液的配制
①pH值为7.4的纳米银团簇溶液
用移液管准确移取24 ml新鲜配制的0.05 mol/L的硝酸银溶液于烧杯中,在搅拌的情况下加入3 ml 0.8 mol/L的聚丙烯酸钠溶液,并用硝酸和氢氧化钠溶液调节混合溶液的pH值为4.5。在避光的条件下将混合溶液搅拌10 min,使Ag+与羧酸根充分络合。然后,将混合溶液置于365 nm紫外灯下进行照射,并不断搅拌,每隔10 min对混合溶液进行紫外吸收光谱和荧光发射光谱的测量。取荧光最强时的光照时间为最佳反应时间。反应完成后,将得到的纳米银团簇溶液稀释到30 ml,并用硝酸和氢氧化钠溶液调节其pH值为7.4。最后将制备的纳米银团簇溶液在避光的条件下储存在4℃的冰箱中。
②次氯酸钠标准溶液
用移液枪量取适量的市售次氯酸钠溶液,用重蒸水稀释后,调节溶液的pH值为12。然后用紫外-可见分光光度计测溶液在292 nm处的紫外吸收,根据ε292= 350 M-1cm-1计算得到次氯酸钠的浓度,然后再稀释到1.0×10-4mol/L,放于避光处备用。次氯酸钠在中性条件下的水溶液中会自发的发生酸碱平衡移动而形成次氯酸。
(2)绘制荧光光谱图
取0.2 ml~0.5 ml pH值为7.4的纳米银团簇溶液作为探针,在pH值为7.4的PBS缓冲溶液缓冲条件下,与适量次氯酸钠标准溶液混合,并用重蒸水稀释至5.0 ml,使混合液中次氯酸钠的浓度依次为:0、4、6、8、10、12、14、16、18、20、24 μmol/L。将上述混合液静置15~30 min后,用荧光光谱仪在37 ℃下分别检测上述各混合液在560~800 nm处的荧光强度,所述荧光光谱仪的激发波长设置为510 nm、激发狭缝宽度为2 nm、发射狭缝宽度为3 nm。
从而获得如图1所示的荧光光谱图。由图1确定本发明的荧光光谱测定法的检测荧光波长为637 nm。
实施例2 绘制标准曲线
在本实施例中,以纳米银团簇溶液作为探针,检测不同标准浓度次氯酸溶液在637 nm处的荧光强度,获得荧光强度与次氯酸浓度的标准曲线。具体步骤为:
以实施例1步骤(1)的方法制备纳米银团簇溶液和次氯酸钠标准溶液。
取0.2 ml~0.5 ml pH值为7.4的纳米银团簇溶液作为探针,在pH值为7.4的PBS缓冲溶液缓冲条件下,与适量次氯酸钠标准溶液混合,并用重蒸水稀释至5.0 ml,使混合液中次氯酸钠的浓度依次为:0、4、6、8、10、12、14、16、18、20、24 μmol/L。将上述混合液静置15~30 min后,用荧光光谱仪在37 ℃下分别检测上述各混合液在637 nm处荧光强度,所述荧光光谱仪的激发波长设置为510 nm、激发狭缝宽度为2 nm、发射狭缝宽度为3 nm。其中I0为不含次氯酸钠时纳米银团簇在637 nm处的荧光强度,I为含有一定浓度的次氯酸钠时,纳米银团簇在637 nm处的荧光强度。计算及绘图时取3次测量的平均值。
从而获得如图2所示的相对荧光强度与次氯酸浓度的标准曲线,根据图2所示的标准曲线,获得线性回归方程式y=-0.0386x-0.1630,R2=0.9944。
实施例3 检验不同自由基对纳米银团簇探针荧光强度的影响
在本实施例中,检测不同自由基对纳米银团簇探针荧光强度的影响。各溶液的配制方法如下。
(1)过氧化氢溶液的配制:用移液枪量取适量的有市售的过氧化氢溶液,用重蒸水稀释后,用紫外-可见分光光度计测其在230 nm处的紫外吸收,根据ε230= 81 M-1cm-1计算得到过氧化氢的浓度,然后再将其稀释到1.0×10-4 mol/L,放于避光处备用。
(2)羟基自由基(·OH)溶液的配制:首先按照上述方法配制2.0×10-3 mol/L的过氧化氢溶液,然后再与2.0×10-4 mol/L的硫酸亚铁溶液按体积比1:1混合,即可得到浓度为1.0×10-4 mol/L的羟基自由基溶液,放于避光处备用。
(3)1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)溶液的配制:准确称取35 mg DPPH,加入无水乙醇充分溶解,定容于100 ml棕色容量瓶中,得到暗紫色均一的1.0×10-4 mol/L的DPPH溶液,放于4 ℃冰箱中避光保存。
取0.2 ml~0.5 ml pH值为7.4的纳米银团簇溶液作为探针,在pH值为7.4的PBS缓冲溶液缓冲条件下,分别与适量过氧化氢溶液、羟基自由基溶液、DPPH溶液、四丁基氢氧化膦(TBPH)溶液混合,并用重蒸水稀释至5.0 ml,使混合液中各自由基的浓度为16 μmol/L。将上述混合液静置15~30 min后,用荧光光谱仪在37 ℃下分别检测上述各混合液在637 nm处荧光强度,所述荧光光谱仪的激发波长设置为510 nm、激发狭缝宽度为2 nm、发射狭缝宽度为3 nm。绘图时取3次测量的平均值。其中I0为不含上述各自由基时纳米银团簇在637 nm处的荧光强度,I为含有一定浓度的上述各自由基时,纳米银团簇在637 nm处的荧光强度。
从而获得如图3所示的pH为7.4条件下,不同自由基对纳米银团簇荧光强度的影响。由图3可以看出,不同自由基纳米银团簇荧光强度的影响并不大,对于本发明检测次氯酸的干扰很小。
实施例4不同阴(A)阳(B)离子对纳米银团簇荧光强度的影响。
在本实施例中,考察人体所含常规离子对纳米银团簇探针荧光强度的影响。主要考察Cl-、NO3 -、SO4 -、H2PO4 -、Na+、K+、Ca2 +、Mg2 +离子对纳米银团簇荧光强度的影响。
首先与实施例3相似的,先配置离子浓度分别为1.0×10-3 mol/L的溶液。然后取0.2 ml~0.5 ml pH值为7.4的纳米银团簇溶液作为探针,在pH值为7.4的PBS缓冲溶液缓冲条件下,分别与适量上述各离子溶液混合,并用重蒸水稀释至5.0 ml,使混合液中各离子的浓度为1.0×10-4 mol/L 和16 μmol/L。将上述混合液静置15~30 min后,用荧光光谱仪在37 ℃下分别检测上述各混合液在637 nm处荧光强度,所述荧光光谱仪的激发波长设置为510 nm、激发狭缝宽度为2 nm、发射狭缝宽度为3 nm。绘图时取3次测量的平均值。
从而获得如图4所示的pH为7.4条件下,不同离子对纳米银团簇荧光强度的影响。由图4可以看出,生物体组织液中的盐溶液(例如氯化钠、氯化钾等)的存在不会影响本发明对于次氯酸的检测。
实施例5 应用
在本实施例中,应用本发明提供的方法,对一待测液体进行检测,具体检测步骤如下:
以实施例1步骤(1)的方法制备pH值为7.4的纳米银团簇溶液。取0.2 ml~0.5 ml 所述纳米银团簇溶液作为探针,在pH值为7.4的缓冲溶液下与待测溶液混合并静置15~30 min,用荧光光谱仪在37 ℃下检测混合溶液在637 nm处的荧光强度。所述荧光光谱仪的激发波长设置为510 nm、激发狭缝宽度为2 nm、发射狭缝宽度为3 nm。通过实施例2的标准曲线和线性回归方程计算获得待测液体中次氯酸的含量。
本发明将具有荧光性的纳米银团簇应用到次氯酸的定量检测中,利用次氯酸将纳米银团簇氧化而造成纳米银团簇的荧光猝灭的原理,以纳米银团簇溶液为探针,通过控制溶液的pH、纳米银团簇的量以及荧光强度的测量等步骤实现对次氯酸的定量检测。
本发明提供的方法具有探针制备简单、对环境没有毒害、检测方法快速简便、检测灵敏性好、选择性高等优点,克服了以荧光有机染料为探针存在的激发光谱窄、斯托克位移小、光稳定性差等缺点。同时,本发明提供的方法与现有技术中以半导体量子点为探针检测次氯酸的方法相比,银比半导体的生物相容性更好,毒性也更低,并且银与次氯酸作用后生成的银离子会与氯离子形成氯化银,而非半导体量子点生成具有毒性的重金属镉离子,更适合应用到生物领域。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干改变、改进和润饰,这些改变、改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种检测次氯酸含量的方法,其特征在于,所述方法是以纳米银团簇溶液作为探针,通过荧光光谱检测次氯酸含量。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述方法是:取0.2 ml~0.5 ml pH值为7.4的纳米银团簇溶液作为探针,在pH值为7.4的缓冲溶液下与待测溶液混合并静置15~30 min,用荧光光谱仪在37 ℃下检测混合溶液在637 nm处的荧光强度。
3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述荧光光谱仪的激发波长设置为510 nm、激发狭缝宽度为2 nm、发射狭缝宽度为3 nm。
4.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述缓冲溶液为PBS缓冲溶液。
5.纳米银团簇在检测次氯酸含量的应用。
6.根据权利要求5所述的应用,其特征在于,所述应用是以纳米银团簇作为探针,通过荧光光谱检测次氯酸含量。
7.根据权利要求5所述的应用,其特征在于,所述应用是以pH值为7.4的纳米银团簇作为探针,与待测溶液混合获得混合液,用荧光光谱仪在37℃下检测所述混合液在637nm处的荧光强度。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20140723 |