KR101777054B1 - 형광 폴리도파민을 이용한 과산화수소 센서 및 측정 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 도파민으로부터 형광 폴리도파민을 제조한 후 폴리도파민의 형광세기를 이용하여 과산화수소 농도를 측정하는 과산화수소 센서 및 측정 방법에 관한 것이다.
본 발명은 구리와 과산화수소 조건에서 도파민이 형광 폴리 도파민으로 전환되는 반응을 이용하여 과산화수소 농도를 측정하는 센서를 개발하였다. 본 발명의 센서는 전기화학적 방법과 같이 금속 전극과 전압을 사용하지 않고 형광 세기로 과산화수소 농도를 측정하므로 생체에 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 생체적합성의 비독성 물질이고, 높은 열안정성과 화학적 내구성을 가지는 형광 폴리도파민을 사용하므로 효소를 사용하는 형광 프로브에 비해 안정성과 효율이 우수한 과산화수소 센서를 제공할 수 있다.
본 발명은 구리와 과산화수소 조건에서 도파민이 형광 폴리 도파민으로 전환되는 반응을 이용하여 과산화수소 농도를 측정하는 센서를 개발하였다. 본 발명의 센서는 전기화학적 방법과 같이 금속 전극과 전압을 사용하지 않고 형광 세기로 과산화수소 농도를 측정하므로 생체에 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 생체적합성의 비독성 물질이고, 높은 열안정성과 화학적 내구성을 가지는 형광 폴리도파민을 사용하므로 효소를 사용하는 형광 프로브에 비해 안정성과 효율이 우수한 과산화수소 센서를 제공할 수 있다.
Description
본 발명은 형광을 이용한 과산화수소 센서 및 측정 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 도파민으로부터 형광 폴리도파민을 제조한 후 폴리도파민의 형광세기를 이용하여 과산화수소 농도를 측정하는 과산화수소 센서 및 측정 방법에 관한 것이다.
과산화수소는 생체 내 신호전달이나 면역 반응 등의 신체 내 생리 활동의 핵심적인 부산물로 알려져 있다. 과산화수소는 세포내에 존재하는 다른 활성산소종에 비해 반감기가 길고 반응성이 낮아 세포 조직에 침투하여 생체 조직을 공격하기가 더 용이한 물질이다. 생체 내의 생리 변화를 파악하기 위해 과산화수소를 모니터링하고 정량화할 필요가 있다.
한국 특허 공개 10-2014-0090005호에는 전기화학적 방법을 이용한 과산화수소 측정 센서가 개시되어 있다. 한국 공개 특허의 과산화수소 전기화학적 센서는 표면 개질된 전극의 전위변화를 이용하여 측정한다. 그러나, 이러한 전기화학적 센서는 높은 가동 전압이 요구되고, 공존하는 물질(Substance)로부터 간섭이 유도되어 정확성이 떨어지며, 금속 전극을 사용하므로 생체 내 실험 등에 사용하기에는 어려운 문제가 있다.
이와 달리, 형광 분석은 생화학 연구에 매우 적합한 것으로 입증된 접근 방법이다. 최근 효소 링크된(과산화 효소가 사용됨) 형광 프로브는 다른 활성 산소나 질소의 존재에도 불구하고 과산화수소에 대한 매우 우수한 선택성이 있음이 보고되었다. 그러나 이러한 센서는 낮은 열 안정성과 화학적 내구성 및 고비용의 문제가 제기 되고 있다.
본 발명은 생화학 연구에 적합한 형광 분석을 이용하여 과산화수소 농도를 측정하는 센서 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 높은 열안정성과 화학적 내구성 및 낮은 비용을 가지면서도 높은 민감도와 선택성을 갖는 과산화수소 센서를 제공하는 것이다.
본 발명은 독성 물질을 방출하지 않는 과산화수소 센서를 제공하는 것이다.
본 발명의 하나의 양상은
도파민과 구리이온 혼합용액에 과산화수소를 첨가하여 폴리도파민을 생성하고, 상기 생성된 폴리도파민의 형광세기를 측정하여 첨가된 상기 과산화수소 농도를 측정하는 방법에 관련된다.
다른 양상에서 본 발명은
도파민 수용액에 산을 첨가하여 pH를 3 이하로 조절하는 단계 ;
상기 도파민 수용액에 구리이온과 미지(unknown) 농도의 과산화수소를 첨가하여 폴리도파민을 생성하는 단계 ;
생성된 폴리도파민의 형광세기를 측정하는 단계 ; 및
측정된 형광세기로부터 첨가된 과산화수소 농도를 산출하는 단계를 포함하는 과산화수소 농도 측정 방법에 관련된다.
또 다른 양상에서, 본 발명은
도파민 수용액에 구리이온이 용해된 반응부 ;
상기 반응부에 과산화수소 포함 용액을 이송하는 주입부 ;
상기 반응부에 광을 조사하고, 방사된 형광 세기를 측정하는 PL 측정부 ; 및
상기 PL 측정부로부터 형광세기 데이터를 받아 과산화수소 농도를 산출하는 콘트롤부를 포함하는 과산화수소 센서에 관련된다.
본 발명은 구리와 과산화수소 조건에서 도파민이 형광 폴리 도파민으로 전환되는 반응을 이용하여 과산화수소 농도를 측정하는 센서를 개발하였다. 본 발명의 센서는 전기화학적 방법과 같이 금속 전극과 전압을 사용하지 않고 형광 세기로 과산화수소 농도를 측정하므로 생체에 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 생체적합성의 비독성 물질이고, 높은 열안정성과 화학적 내구성을 가지는 형광 폴리도파민을 사용하므로 효소를 사용하는 형광 프로브에 비해 안정성과 효율이 우수한 과산화수소 센서를 제공할 수 있다.
도 1은 본 발명의 폴리도파민 생성 반응을 도시한 것이다.
도 2는 본 발명의 과산화수소 센서를 나타낸다.
도 3은 방사파장을 480nm로 고정하고, 여기 파장을 325에서 425nm로 변화시키면서 형광세기를 측정한 그래프이다.
도 4는 여기파장을 425nm로 조사한 경우 실시예 1과 비교예의 형광세기를 나타내는 그래프이다.
도 5는 도파민(DA)과 폴리도파민(PDA)의 FTIR 스펙트럼을 나타낸다.
도 6은 실시예 1에서 생성된 폴리도파민(PDA) 나노입자의 SEM 사진이다.
도 7은 실시예 1에서 0.2μCu2+의 조건에서 과산화수소의 농도를 25μ5μ1μ로 달리하여 폴리도파민을 생성한 후 형광세기를 시간에 따라 측정한 것이다.
도 8은 도 7에서 최대 형광 세기를 시간에 따라 과산화수소 각 농도별로 도시한 것이다.
도 9의 a는 과산화수소 농도에 따른 폴리도파민의 최대 형광세기(δI480nm, 방사파장을 480nm로 고정함)를 도시한 것이고, 도 9의 b는 상기 수학식 1(랑뮤어 흡착 속도식)을 이용하여 [H2O2](과산화수소 농도)와 [H2O2]/δI480nm를 그래프상에서 직선으로 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 과산화수소 센서를 나타낸다.
도 3은 방사파장을 480nm로 고정하고, 여기 파장을 325에서 425nm로 변화시키면서 형광세기를 측정한 그래프이다.
도 4는 여기파장을 425nm로 조사한 경우 실시예 1과 비교예의 형광세기를 나타내는 그래프이다.
도 5는 도파민(DA)과 폴리도파민(PDA)의 FTIR 스펙트럼을 나타낸다.
도 6은 실시예 1에서 생성된 폴리도파민(PDA) 나노입자의 SEM 사진이다.
도 7은 실시예 1에서 0.2μCu2+의 조건에서 과산화수소의 농도를 25μ5μ1μ로 달리하여 폴리도파민을 생성한 후 형광세기를 시간에 따라 측정한 것이다.
도 8은 도 7에서 최대 형광 세기를 시간에 따라 과산화수소 각 농도별로 도시한 것이다.
도 9의 a는 과산화수소 농도에 따른 폴리도파민의 최대 형광세기(δI480nm, 방사파장을 480nm로 고정함)를 도시한 것이고, 도 9의 b는 상기 수학식 1(랑뮤어 흡착 속도식)을 이용하여 [H2O2](과산화수소 농도)와 [H2O2]/δI480nm를 그래프상에서 직선으로 나타낸 것이다.
이하에서는 첨부한 도면을 참조하여 본 발명의 실시 예를 상세히 설명한다. 본 발명의 실시 예를 설명함에 있어 관련된 공지 기능 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 것이다. 또한, 후술 되는 용어들은 본 발명에서의 기능을 고려하여 정의된 용어들로서 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 그러므로 그 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다.
본 발명은 도파민과 구리이온 혼합용액에 과산화수소를 첨가하여 폴리도파민을 생성하고, 상기 생성된 폴리도파민의 형광세기를 측정하여 첨가된 상기 과산화수소 농도를 측정한다. 본 발명의 과산화수소 측정 방법은 pH 조절단계, 폴리도파민 생성단계, 형광 측정 단계 및 농도 산출 단계를 포함한다.
상기 pH 조절단계는 도파민 수용액에 산을 첨가하여 pH를 3 이하로 조절하는 단계이다. 상기 pH는 바람직하게는 2이하로 조절할 수 있다. 상기 pH 범위에서 도파민의 산화가 방지될 수 있다.
상기 도파민 수용액의 농도에 대해 특별한 제한이 있는 것은 아니다. 예를 들면, 상기 도파민의 농도는 0.1~100mM, 바람직하게는 1~10mM일 수 있다.
폴리도파민 생성단계는 상기 도파민 수용액에 구리이온과 미지(unknown) 농도의 과산화수소를 첨가하여 폴리도파민을 생성하는 단계이다.
상기 구리이온은 pH 조절단계에 주입할 수도 있다.
상기 구리이온은, 예를 들면, Cu2+ 이온일 수 있다. CuCl2 분말을 도파민 수용액에 첨가하여 구리 이온이 생성된다.
상기 폴리도파민은 구리 이온 조건하에서 도파민과 과산화수소의 반응으로 생성된다.
상기 폴리도파민 생성 단계는 도파민 농도 대비 구리 이온 농도를 1 : 0.01~0.5 범위로 조절될 수 있다.
도 1은 폴리도파민 생성 반응을 도시한 것이다. 상기 생성반응에서 구리이온과 과산화수소가 반응의 산화제로 사용된다.
상기 과산화수소는 산소(O)를 제공하여 도파민을 폴리도파민으로 전환시킨다. 다만, 과산화수소 대신 산소(O2)를 사용하면 폴리도파민이 형광 특성을 나타내지 않으나, 본 발명과 같이 과산화수소를 사용하면 형광 특성을 갖는다.
상기 형광세기를 측정하는 단계는 방사파장을 고정하되, 폴리도파민이 생성된 용액에 조사하는 여기파장(excitation wavelength)을 변화시키면서 폴리도파민의 형광 세기 변화를 측정한다.
예를 들면, 상기 형광세기 측정은 폴리도파민이 생성된 용액에 330nm에서 425nm로 여기파장(excitation wavelength)을 변화시키면서 광을 조사할 수 있다.
좀 더 구체적으로, 본 발명에서는 방사파장을 480nm로 고정하고, 폴리도파민이 생성된 용액에 여기파장(excitation wavelength)을 330nm에서 425nm로 증가시키면서 광을 조사하면, PL(photoluminescence) 세기( 폴리도파민의 형광 세기) 변화를 측정할 수 있다.
상기 형광 세기는 공지된 PL 분광장치를 사용하여 측정할 수 있다. 상기 과산화수소 농도는 측정된 폴리도파민의 형광세기와 폴리도파민 생성 반응에 참가한 과산화수소 농도의 상관관계로부터 산출될 수 있다.
좀 더 구체적으로는, 상기 과산화수소 농도를 산출하는 단계는 하기 수학식 1(랑뮤어 흡착 속도식)을 사용하여 [H2O2](과산화수소 농도)와 [H2O2]/δI480nm를 그래프 상에 도시하는 단계와 상기 그래프로부터 과산화수소 농도를 산출하는 단계를 포함한다.
[수학식 1]
δI는 폴리도파민(PDA)의 최대 형광세기
δImax는 saturation 에서의 최대 형광 세기
[H2O2] 는 H2O2의 농도(μ
Kd는 PDA와 H2O2의 분해 상수
상기 수학식 1을 통해 [H2O2](과산화수소 농도)와 [H2O2]/δI480nm를 그래프상에서 직선으로 나타낼 수 있다. 직선으로 도시된 그래프는 [H2O2](과산화수소 농도, x축)와 [H2O2]/δI480nm(y축)의 상관관계를 일차함수로 표현될 수 있다.
예를 들면, 과산화수소 농도 산출은 plot된 r2, 직선의 기울기와 y축 상수값을 구한 후 일차함수 식을 완성할 수 있다. 새로운 형광세기값(δI480nm)이 주어지면 [H2O2]/δI480nm(y값), [H2O2](x값), 기울기, 및 상수값을 일차함수식에 대입하여 미지의 [H2O2]값을 산출할 수 있다.
본 발명은 폴리도파민의 생성양이 반응단계에서 반응시간에도 비례하지만, 동일한 반응시간인 경우 산화 반응에 참여하는 과산화수소 농도(양)에 비례하고, 폴리도파민의 형광세기가 생성된 폴리도파민의 양에 비례한다는 사실에 근거한다.
도 2는 본 발명의 과산화수소 센서를 나타낸다. 도 2를 참고하면, 과산화수소 센서는 반응부(10), 주입부(20) 및 PL 측정부(30)을 포함한다.
상기 반응부(10)는 pH 2이하의 도파민 수용액에 구리이온이 용해되어 소정 농도로 유지될 수 있는 장치나 공간일 수 있다. 예를 들면, 상기 반응부가 소정 크기와 형상을 가지는 반응장치일 수도 있으며, 한편, 도파민 수용액이 소정 농도로 유지되고 있는 생체 내의 특정 공간일 수 있다.
상기 주입부(20)는 상기 반응부에 과산화수소 포함 용액을 이송한다.
상기 PL 측정부(30)는 상기 반응부에 광을 조사하고, 방사된 형광 세기를 측정하는 장치로서, 공지된 PL 분광장치를 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 장치는 상기 PL 측정부로부터 형광세기 데이터를 받아 과산화수소 농도를 산출하는 제어부를 포함할 수 있다. 상기 제어부는 측정된 폴리도파민의 형광세기와 폴리도파민 생성 반응에 참가한 과산화수소 농도의 상관관계를 수식으로 프로그램화하여 과산화수소 농도를 산출할 수 있다.
하기 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
1
1mM의 도파민 수용액을 준비하고 HCl을 이용하여 pH를 2로 맞추었다. 100μM의 CuCl2 와 20μL H2O2를 도파민 수용액에 주입한 후 교반하여 형광을 띠는 폴리도파민 나노입자를 형성하였다.
이어서, PL 분광장치를 사용하여, (방사파장을 480nm로 고정함) 폴리도파민이 생성된 용액에 여기파장(excitation wavelength)을 330nm에서 425nm로 변화시키면서 PL(photoluminescence) 세기(폴리도파민의 형광 세기)를 측정하였다.
비교예
도파민(DA), 구리이온 및 과산화수소를 모두 사용하지 않고, 도파민만을 사용하거나 도파민과 구리이온만을 사용하거나 도파민과 과산화수소만을 사용하는 것을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 실시하였다.
도 3은 방사파장을 480nm로 고정하고, 여기 파장을 325에서 425nm로 변화시키면서 형광세기를 측정한 그래프이다. 도 3을 참고하면, 여기파장의 증가에 따라 형광세기도 증가하였으며, 결과적으로 형광세기의 최대값이 425nm 여기 파장에서 관찰되었다.
도 4는 여기파장을 425nm로 조사한 경우 실시예 1과 비교예의 형광세기를 보여준다. 도 4를 참고하면, 비교예에 비해 실시예 1에서 매우 강한 형광 피크를 관찰할 수 있다. 즉, 실시예에서는 매우 많은 양의 폴리도파민이 생성되었음을 보여주고 있다. 도 4의 우측 상단의 (좌측)사진은 도파민 수용액(a)과 폴리도파민 수용액(b)이고, 우측 상단의 (우측) 사진은 UV 조사 후에 촬영한 도파민 수용액(a)과 폴리도파민 수용액(b)의 이미지이다. 도 4의 사진에서 형광이 균일하게 관찰되는데, 이것은 폴리도파민(b)이 아민기로 인해 수용액 중에 잘 분산되었음을 보여준다.
도 5는 도파민(DA)과 폴리도파민(PDA)의 FTIR 스펙트럼을 나타낸다. 1720cm-1 부근의 강한 다이케톤 피크는 DA-PDA(폴리도파민과 도파민이 혼재하는 경우)와 PDA를 구분시켜 주며, 특히, 이러한 피크는 도파민에는 나타나지 않음을 알 수 있다.
도 6은 실시예 1에서 생성된 폴리도파민(PDA) 나노입자의 SEM 사진이다. 도 6을 참고하면, 생성된 폴리도파민 나노입자는 원형으로서 평균 직경이 43.7nm이다.
도 7은 실시예 1에서 0.2μCu2+의 조건에서 과산화수소의 농도를 25μ5μ1μ로 달리하여 폴리도파민을 생성한 후 형광세기를 시간에 따라 측정한 것이다.
도 8은 도 7에서 최대 형광 세기를 시간에 따라 과산화수소 각 농도별로 도시한 것이다.
도 7과 도 8을 참고하면, 형광세기는 시간과 과산화수소 농도에 비례함을 알 수 있다. 즉, 반응시간이 길어지거나 과산화수소 농도가 높으면 폴리도파민의 생성량이 많아지고, 결과적으로 형광세기도 커짐을 확인할 수 있다.
도 9의 a는 과산화수소 농도에 따른 폴리도파민의 최대 형광세기(δI480nm, 방사파장을 480nm로 고정함)를 도시한 것이고, 도 9의 b는 상기 수학식 1(랑뮤어 흡착 속도식)을 이용하여 [H2O2](과산화수소 농도)와 [H2O2]/δI480nm를 그래프상에서 직선으로 나타낸 것이다. 도 9를 참조하면, 과산화수소 농도([H2O2])의 증가에 따라 폴리도파민의 최대 형광 세기가 상승함을 알 수 있다.
도 9의 b의 그래프를 이용해 r2(= 0.9935), 기울기, y축 상수값 등을 계산하여 그래프의 실험식을 완성할 수 있다. 완성된 식으로부터 새롭게 측정되는 [H2O2]/δI480nm 값으로부터 과산화수소 농도를 산출할 수 있다.
본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 따라서 본 발명의 범위는 전술한 실시예에 한정되지 않고 특허청구범위에 기재된 내용 및 그와 동등한 범위 내에 있는 다양한 실시 형태가 포함되도록 해석되어야 할 것이다.
Claims (9)
- 삭제
- 도파민 수용액에 구리이온과 농도를 알고 있는 과산화수소를 첨가하여 형광 폴리도파민을 생성하는 단계, 생성된 폴리도파민의 형광세기를 측정하는 단계 및 측정된 폴리도파민의 형광세기와 폴리도파민 생성 반응에 참가한 과산화수소 농도의 상관관계로부터 랑뮤어 흡착속도식을 도출하는 단계를 포함하는 흡착속도식 산출 단계 ;
도파민 수용액에 산을 첨가하여 pH를 3 이하로 조절하는 단계 ;
상기 도파민 수용액에 구리이온과 미지(unknown) 농도의 과산화수소를 첨가하여 형광 폴리도파민을 생성하는 단계;
생성된 폴리도파민의 형광세기를 측정하는 단계; 및
측정된 형광세기와 상기 흡착속도식으로부터 미지의 과산화수소 농도를 산출하는 단계를 포함하는 과산화수소 농도 측정 방법. - 제 2항에 있어서, 상기 방법은 도파민 농도 대비 구리 이온 농도를 1 : 0.01~0.5 범위로 조절하여 폴리도파민을 생성하는 것을 특징으로 하는 과산화수소 농도 측정 방법.
- 삭제
- 제 2항에 있어서, 상기 형광세기 측정은 폴리도파민이 생성된 용액에 330nm에서 425nm로 여기파장(excitation wavelength)을 변화시키면서 광을 조사하는 것을 특징으로 하는 과산화수소 농도 측정 방법.
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