KR102179944B1

KR102179944B1 - 티오페놀 검출용 전기화학발광 프로브

Info

Publication number: KR102179944B1
Application number: KR1020190030981A
Authority: KR
Inventors: 홍종인; 김경록
Original assignee: 서울대학교 산학협력단
Priority date: 2019-03-19
Filing date: 2019-03-19
Publication date: 2020-11-17
Also published as: KR20200111375A

Abstract

본 발명은 티오페놀과 반응하여 전기화학발광을 나타내는 티오페놀 선택성을 갖는 전기화학발광 프로브에 관한 것이다.

Description

티오페놀 검출용 전기화학발광 프로브{Electrochemiluminescent probe for detection of thiophenol}

본 발명은 티오페놀 검출용 전기화학발광 프로브에 관한 것으로, 보다 상세하게는 티오페놀과 민감하게 반응하여 전기화학발광을 나타내는 티오페놀 선택성을 갖는 이리듐 착화합물을 포함하는 티오페놀 검출용 전기화학발광 프로브에 관한 것이다.

전기화학발광(electrochemiluminescenc, ECL)은 전극 표면에서 전기화학적으로 생성된 라디컬들 사이의 연속적인 전자전달을 통해 빛이 유도되는 발광현상이다. 전기화학 발광은 작동 원리상 별도의 광원이나 부피가 큰 분석 장비를 필요하지 않기 때문에 장비의 소형화 및 검출 방법을 간소화할 수 있으며, 높은 감도를 가지므로 질병/독성오염물질을 위한 현장진단(Point-Of-Care Testing, POCT) 시스템에 최적화된 기술이다. 지금까지 발표된 전기화학적 발광 기반 센서들은 대부분 면역분석법(immunoassay)에 기반을 두고 전기화학적 발광 기술을 접목시켜왔다. 이때 사용되는 면역 분석법으로는 DNA 혼성화나 항원-항체 반응과 같은 생물학적 결합이 대표적으로 활용하고 있으나, 특정 생물학적 결합에 의존하기 때문에 검출할 수 있는 분석물이 주로 단백질이나 효소 혹은 DNA로 제한되며, 분석을 위해서는 정밀한 환경을 조성해 주어야 한다는 한계점이 있다. 또한, 분석 과정에서 대부분 전기화학적 발광 신호 물질의 표지(labeling) 과정이 요구되기 때문에 추가적인 세척 과정이 필요한 단점이 있다.

이에 대한 대안으로 특정 수용체를 가진 형광 단분자 화학 센서에 대한 연구가 꾸준히 진행되어 왔지만, 형광 기반 센서의 경우 신호 변화 확인을 위해 별도의 광원을 통한 분자 여기(excitation) 과정이 필요하여 장비의 소형화 및 기기 가격 인하가 어렵다는 한계점이 있다. 또한, 상기와 같은 방법들은 전문가가 아닌 일반인이 분석기기를 다루거나 데이터를 해석하는 것이 용이하지 않으므로, 누구나 간편하고, 상시적으로 질병을 진단할 수 있는 개념의 현장 진단용 장비에 활용하기는 어렵다는 한계를 가진다.

티오페놀(thiophenol) 혹은 벤젠티올(benezenethiol)이라고도 불리는 화학 물질은 제약, 농약, 고분자, 염료 등 다양한 분야에서 사용되는 중요한 원료이자 중간체이다. 하지만 티오페놀은 인체에 대해 높은 독성을 가지고 있기 때문에 사용에 주의가 필요하다. 실제 독성평가에서는 물고기의 티오페놀에 대한 LC₅₀ 값은 0.01-0.4 mM이고, 쥐의 티오페놀에 대한 LD₅₀값은 46.2 mg/kg을 나타낸 만큼 높은 독성을 가지고 있다고 보고되었다. 티오페놀은 사람의 몸에 호흡이나 음식물 섭취로 쉽게 흡수될 수 있으며, 이러한 경우 심각한 중추신경 손상, 근 손상, 혼수상태를 일으킬 수 있고, 심할 경우 사망에도 이를 수 있다고 보고되었다.

티오페놀의 농도를 결정하는 방법으로 표면 증감 라만 산란(SERS) 분석, 크로마토그래피 기반 분석, 비색분석, 형광 분자센서와 같은 방법들이 제시되었다. [(a) Spectrochim. Acta, Part A 2011, 79, 456-461; (b) Int. J. Environ. Anal. Chem. 2010, 90, 948-961; (c) ChemPhysChem 2017, 18, 1752-1754; (d) Angew. Chem., Int. Ed. 2007, 46, 8445-8448] 특히, 형광 분자센서는 대상 물질에 대해 비 파괴적이며 실시간 모니터링에 적용할 수 있다는 장점으로 지난 수십 년 동안 폭넓게 사용되어 왔다. 하지만, 상기 방법들은 티오페놀의 농도 측정에 우수한 성능을 나타내나, 분석을 위해서는 부피가 큰 분석 장비와 복잡한 분석절차를 거쳐야 한다는 단점이 있다. 이전에 보고된 형광 분석법의 대부분은 탈양성자화 (deprotonation) 정도가 다르기 때문에 지방족 티올 (pKa = 약 8.5)보다 티오페놀 (pKa 6.5)을 선택적으로 검출하기 위해서는 생리적인 조건이 요구된다.

따라서, 티오페놀의 농도를 실시간으로 정확히 검출할 수 있도록 간단하고 쉬운 분석법이 요구된다.

본 발명이 해결하고자 하는 첫 번째 과제는 티오페놀의 농도를 정성적 또는 정량적으로 측정할 수 있는 티오페놀 검출용 전기화학발광 프로브를 제공하는 것이다.

본 발명이 해결하고자 하는 두 번째 과제는 티오페놀 검출용 전기화학발광 프로브를 이용한 티오페놀의 검출방법을 제공하는 것이다.

본 발명이 해결하고자 하는 세 번째 과제는 티오페놀 검출용 전기화학발광 프로브를 포함하는 티오페놀 센서를 제공하는 것이다.

특정 수용체나 반응자리에 발광체를 도입함으로써 특정 분석물과 결합 또는 반응시 선택적으로 신호 변화를 유발하는 단분자 화학센서는 분석 대상의 제한이 없고, 특히 분석물의 존재 여부에 따라 분자의 특성이 자체적으로 변화함으로써 신호의 변화를 유발하기 때문에 세척 등의 추가적인 분석 과정이 전혀 필요하지 않는다는 장점이 있다.

전기화학발광(electrochemiluminescence; ECL)과 결합된 화학요법 접근법은 기존의 분석 기술에 비해 여러 가지 이점이 있다. 전기화학은 부피가 큰 장비, 추가 시약 또는 동위원소를 필요로 하지 않으며, 간단하고 경제적인 화학분석을 가능하게 한다. 발광은 전기화학적으로 유발된 화학 발광 과정을 통해서만 생성될 수 있기 때문에 배경(background) 형광 방출 없이 매우 민감하다. 또한 화학적인 방법은 합성 프로브와 표적 분자 사이의 비가역적인 화학반응으로 인해 표적분자를 우수하게 선택적으로 인식하고 감지할 수 있다.

본 발명의 발명자들은 고리형 이리듐 착화합물 기반의 단분자와 티오페놀의 선택적 반응과 전기화학발광 기법을 통해 티오페놀의 양을 정량적 또는/및 정성적으로 검출할 수 있는 전기화학발광 프로브를 개발하였으며, 이를 이용하여 티오페놀 노출사고에 대한 조기대응, 티오페놀 농축성 질환, 예를 들어 다양한 심혈관계, 중추신경계 질환 등의 조기 진단에 활용할 수 있는 가능성을 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 티오페놀 검출용 전기화학발광 프로브를 제공한다:

[화학식 1]

상기 화학식 1에서,

L는 비발광성 리간드이며;

A는 N 및 Z₁을 포함하는 2 내지 3환의 축합헤테로아릴이며; 상기 축합헤테로아릴은 퀴놀린, 벤조이소퀴놀린, 페난트리딘, 벤조티아졸, 벤조옥사졸 및 벤조이미다졸 중에서 선택되고; 상기 축합헤테로아릴은 비치환되거나, 또는 C_1-10알킬, C_3-8시클로알킬, C_1-10알킬옥시, 니트로 및 시아노 중에서 선택되는 1 내지 3개로 치환되며;

R₁, R₂ 및 R₃은 서로 동일하거나 또는 상이하고, 각각 독립적으로 H, 히드록시, 시아노, 포밀(formyl), C_1-10알킬, C_3-12시클로알킬, C_5-12아릴, C_1-10알킬옥시 및 C_5-12아릴옥시 중에서 선택되고; 상기 C_1-10알킬 또는 상기 C_1-10알킬옥시는 비치환되거나, C_5-12아릴로 치환되고; 상기 C_5-12아릴 또는 C_5-12아릴옥시는 비치환되거나 C_1-6알킬 또는 C_1-6알킬옥시로 치환되고;

Z₁은 O, S 및 NR_a 중에서 선택되며; R_a는 H 또는 C_1-10알킬이다.

본 발명에 있어서, 상기 A는 티오페놀과의 반응에 영향을 주지 않으면서도 화학식 1의 화합물이 가지는 LUMO 에너지 레벨을 낮추는데 기여하는 구조로서, 티오페놀과의 반응에도 전기화학발광을 방출할 수 있는 것이면 제한없이 이용이 가능하며, 바람직하게는 N 및 Z₁을 포함하는 2 내지 3환의 축합헤테로아릴 화합물이고, 보다 바람직하게는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.

상기 화학식에서,

R₄는 수소, C_1-10알킬, C_3-8시클로알킬, C_1-10알킬옥시, 니트로 및 시아노 중에서 선택되고,

m은 0 내지 3의 정수이며,

A가 상기와 같은 구조를 가지는 경우, 제조되는 화학식 1의 화합물의 LUMO 에너지 레벨이 안정화되어, 낮은 LUMO 에너지 레벨을 가지며, 티오페놀과의 반응 이후에도, 안정적으로 전기화학발광을 방출할 수 있다. 특히, 퀴놀린 또는 페난트리딘의 구조를 가지는 경우, 티오페놀과의 반응에서 높은 전기화합발광 효율을 나타내는 것을 확인하였다.

본 발명에 있어서, 상기 R₁, R₂ 및 R₃ 치환기는 이리듐 착화합물의 리간드장 안정화 에너지(ligand field stabilization energy; LFSE)에 영향을 미치며, 티오페놀과의 반응속도를 향상시키는데 기여할 수 있다. 구체적으로 상기 R₂가 포밀기인 이리듐 착화합물이 바람직하다. 상기 R₂가 포밀기인 경우, 강한 전자 구인성 성질을 가지며, 적색 편이된 방출 및 높은 HOMO 수준을 나타내었고, 반응속도가 비약적으로 향상되는 결과를 얻었다.

본 발명에 의하면, R₂가 포밀기인 이리듐 착화합물은 빠른 반응속도 및 낮은 검출 한계를 나타내었다.

본 발명에 있어서, 상기 L은 이리듐 착물을 제조하는데 이용되는 리간드이면 제한은 없으나, 바람직하게는 비발광성 리간드이고, 보다 바람직하게는 티오페놀과의 반응성에 직접적인 영향을 나타내지 않으면서, 동시에 전기화학발광 변화에 영향을 주지 않는 구조인 것일 수 있으며, 가장 바람직하게는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 화학식에서,

R₆, R₇, R₈, R₉, R₁₀, R₁₁ 및 R₁₂는 서로 동일하거나 또는 상이하고, 각각 독립적으로 수소, C_1-10알킬, 할로C_1-6알킬 및 C_5-12아릴 중에서 선택된다.

본 발명에 있어서, 상기 리간드를 구체적으로 예시하면 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 화학식 1의 화합물은 티오페놀과 선택적으로 반응하여 전기화학발광 신호를 증가시키는 것일 수 있으며, 바람직하게는 상기 화학식 1의 화합물이 티오페놀과 반응하여 화학식 1의 화합물의 디니트로페닐기가 분해되면서, 전기화학발광 신호를 증가시키는 것일 수 있다.

보다 바람직하게는, 본 발명에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 이리듐 착화합물로서, 티오페놀과 반응하여 치환기인 디니트로페닐기가 분해되며, 이때, 강한 전기화학발광(electrochemiluminescence; ECL)을 나타내게 된다.

상기 전기화학발광은 화학식 1의 화합물과 티오페놀의 반응 생성물의 LUMO 에너지 레벨이 전기화학발광 공반응물의 HOMO 에너지 레벨보다 낮기 때문에 발생되는 것일 수 있다.

본 발명에 따른 상기 화학식 1의 화합물은 LUMO 에너지 레벨이 현저하게 낮도록 설계되었기 때문에 티오페놀과의 반응으로 디니트로페닐기가 사라져서 LUMO 에너지 레벨이 증가한다 하더라도 전기화학발광 전자 전달 과정을 방해하지 않는 것이 특징이다.

본 발명에 있어서, 전기화학발광 공반응물은 트리프로필아민 또는 2-(디부틸아미노)에탄올일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

한편, 본 발명은 상기 전기화학발광 프로브를 이용하는, 생체 내 티오페놀의 검출 방법을 제공한다.

상기 생체는 인간의 생체거나 또는 인간이 아닌 것의 생체 내일 수 있다.

또한, 본 발명은 전기화학발광 프로브를 포함하는 전기화학발광 센서를 제공한다.

상기 전기화학발광 센서를 이용하여 생체 외 검출시료의 티오페놀의 레벨의 검출에 이용할 수 있다.

본 발명에 따르면, 상기 전기화학발광 프로프를 포함하는 전기화학발광 센서는 티오페놀과의 반응에 의해 청색 이동된 영역에서 전기화학발광의 변화가 나타나는 것일 수 있다.

또한, 본 발명의 구체적인 일 실시양태로써 화학식 1의 화합물의 일 예시로 프로브 1 또는 2는 다음과 같은 반응식을 통해 제조될 수 있다.

[반응식 1]

(a) 비스(피나콜라토)디보론, KOAc, Pd(dppf)Cl₂, 1,4-디옥산, 90 ℃

(b) 1-클로로이소퀴놀린, Pd-(PPh₃) 4, NaHCO₃, THF, H₂O, 80 ℃;

(c) IrCl_3·xH₂O, 2-에톡시에탄올, H₂O, 100 ℃;

(d) BBr3, CH₂Cl₂, 0 ℃ → 실온;

(e) 아세틸아세톤, Na₂CO₃, 2-에톡시에탄올, 80 ℃;

(f) 1-클로로-2,4-디니트로벤젠, K₂CO₃, DMF, 100 ℃. Pd(dppf)Cl₂ = [1,1'-비스(디페틸포스피노)페로센]디클로로팔라듐(II), KOAc = 포타슘 아세테이트, THF = 테트라하이드로퓨란, DMF = N,N-디메틸포름아미드.

본 발명에서는 프로브 1 및 2를 상기 반응식에 나타낸 바와 같이 여섯 단계로 합성할 수 있다. 합성은 입수 가능한 4-브로모아니솔 및 5-브로모-O-아니스알데히드로 시작하여, 붕소화합물을 제조할 수 있다. 메틸에테르 보호기를 갖는 주 리간드를 통상적인 붕소화/스즈키 크로스커플링 반응으로 얻고, 상응하는 Ir(III) 착화합물 다이머는 환류중인 2-에톡시에탄올 중에서 합성할 수 있다. 아릴메틸에테르의 탈메틸화는 삼브롬화붕소(BBr₃)에 의해 수행되었고, 염기성 조건 하에서 보조 리간드로서 아세틸아세톤(acac)를 킬레이트화시켜 1-PhS^-및 2-PhS^-를 제조할 수 있다. 마지막으로, 프로브 1 및 2를 S_NAr을 통해 디니트로페닐(DNP)기를 도입하여 제조할 수 있다.

본 발명에 따른 전기화학발광 프로브는 전기화학발광 기반의 분석시스템과 단분자 화학센서를 융합시킨 것으로서, 티오페놀에 대해 높은 선택성과 민감도를 동시에 가진다. 구체적으로 본 발명의 프로브는 수용액상에서 티오페놀이 존재할 때 전기적인 트리거링(triggering)에 의해 강한 전기화학발광을 나타낸다. 본 발명에 따른 전기화학발광 프로브는 티오페놀에 대한 선택성이 매우 우수하여, 현저한 전기화학발광을 나타내므로, 티오페놀의 양을 정량적으로 용이하게 분석할 수 있다.

본 발명에 따른 전기화학발광 프로브를 이용하면, 종래기술에 비해 간단하면서도 빠르고, 정확한 방법으로 체내에 있는 티오페놀의 양을 정량할 수 있으므로, 화학물질 관련 제조업, 환경 정화 및 오염물질 처리업에서 용이하게 적용가능하며, 나아가 생명 공학 기술 분야에서 기초기반기술과 보건의료 분야에서도 응용이 가능하다.

도 1a는 프로브 1(10 μM)의 시간에 따른 인광 세기이며, 도 1b는 프로브 2(10 μM)의 시간에 따른 인광 세기이다. 도 1c는 티오페놀 존재하의 613 nm에서의 프로브 1과 589 nm에서의 프로브 2의 상대 인광 강도 변화 결과이다. 도 1d는 프로브 1 및 2의 반응 전(흑색 막대)과 CH₃CN/H₂O (1:1 v/v, pH 7.4, 10 mM HEPES)에서 25 분 동안 400 μM 티오페놀과의 반응 후(적색 막대)의 상대 인광 강도 결과이다.
도 2는 프로브 2와 티오페놀의 반응 메커니즘을 확인한 ¹H NMR 스펙트럼 결과이다.
도 3은 프로브 2와 티오페놀의 반응 전/후의 MALDI-TOF MS 스펙트럼을 겹쳐 놓은 결과이다.
도 4는 프로브 2의 광발광 특성을 평가한 결과이다.
도 5는 프로브 2의 전기화학발광 특성 평가 결과이다.
도 6은 프로브 1, 프로브 2, 1-PhS^- 및 2-PhS^-에 대한 밀도함수이론(Density functional theory; DFT) 계산 결과이다.
도 7은 1-PhS^-와 2-PhS^-의 인광 및 ECL 비교 결과이다.
도 8은 1-PhS^-와 2-PhS^-의 밀도함수이론(Density functional theory; DFT)으로 계산된 에너지 레벨 결과이다.

이하, 바람직한 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 성명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 의하여 제한되지 않는다는 것은 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다.

시약 및 기기

모든 물질은 TCI, Alfa Aesar 또는 Sigma-Aldrich에서 구매하였으며 어떤 추가적인 정제과정 없이 사용하였다. NMR을 찍기 위한 중수소화된 용매(deuterated solvent)는 Cambridge Isotopic Laboratories에서 구매하였다. 분석용 박막크로마토그래피(thin layer chromatography)는 Kieselgel 60 F254 plate를 Merck에서 구입하여 사용하였다. 컬럼 크로마토그래피(Column chromatography)는 Merck silica gel 60과 Merck aluminium oxide 60을 사용하였다. 고속 원자 충격(fast atom bombardment, FAB)을 탑재한 고해상도 질량분석 (High-resolution mass spectrometric, HRMS) 데이터는 국립 대학 연구 센터(NCIRF)에 의뢰하여 얻었다. 질량 스펙트럼은 Bruker사의 MALDI-TOF Microflex 기기를 사용하여 기록하였다. ¹H 및 ¹³C NMR 스펙트럼은 Bruker Advance DPX-300 또는 Varian/Oxford As-500 기기를 이용하여 측정하였다. 모든 화학적 이동은 중수소화된 용매의 잔류 양성자 신호를 내부 기준으로 삼아 ppm 단위로 기록되었다. 흡수 스펙트럼은 Jasco V-730 분광계로 수득하였으며, 형광 스펙트럼은 Jasco FP-6500 분광계 또는 SpectraMax M2 분광광도계로 얻었다. SpectraMax M2 분광광도계를 제외하고, 모든 여기 및 방출용 분광기의 대역폭은 5 nm로 고정하였다(감도 = 높음). 광물리학 실험을 위해, 프로브는 2 mM 스탁 용액을 제조하고, 아세토니트릴로 희석하여 사용하였다. 분석용 스탁 용액은 탈이온수로 제조하고, 10mM로 희석한 반면, 티오페놀은 아세토니트릴로 희석하였다.

전기화학 및 전기화학발광 측정

전기화학 연구는 CH Instruments 660 전기화학분석기을 이용하여 측정하였다. CH Instruments 650B는 전기화학적 특성을 조사하기 위하여 개별의 용액에 대하여 순환 전압 전류법(CV)를 적용하였다. 전기화학적 특성은 0.1 V/s의 주사율 및 시차 펄스 전압전류법 (differential pulse voltammetry, DPV)에 의한 CV에 다음 조건하에서 실시하였다: 시료 폭, 17 ms; 펄스 진폭, 50 mV; 펄스 폭, 50 mV; 펄스 주기, 200ms; 조용한 시간, 2 초. 모든 포텐셜 값은 1mM 페로센 (vs Ag/Ag⁺)의 산화 전위를 표준으로 측정하여 페로센/페로세늄 (Fc/Fc⁺) 산화 환원 커플에 상대적으로 조정되었다.

ECL 강도 프로파일은 0-1.6 V 대 Ag/AgCl 범위의 CV 프로세스 동안 저전압 광전자증배관 튜브(PMT) 모듈 (H-6780, Hamamatsu Photonics K.K., Tokyo, Japan)을 사용하여 얻었다(스캔 속도 0.1 V/s). 25 μL 부피의 ECL 셀을 실험 동안 수제 마운트 지원을 갖춘 PMT 모듈에 직접 장착하였다. ECL 스펙트럼은 일련의 광학 필터 (550, 580, 600, 620, 650, 670 및 690 nm)로 ECL 강도를 측정하여 얻었다. 모든 ECL 데이터는 용액 중에서 동시 CV로 수집하였다. ECL 용액은 모두 아세토니트릴 (CH₃CN, spectroscopy grade, Acros) 중의 서포팅 전해질로서, 100 mM TPrA (tripropylamine, Sigma-Aldrich, St.Louis, MO) 및 테트라부틸암모늄퍼클로레이트 (TBAP, TCI)를 함유하였다. 특히, TPrA를 ECL 공반응물(coreactant)로 사용하였다. ECL 측정용 전극은 0.05 μm 알루미나가 뿌려져 있는 패드 위에 폴리싱 하고, 전극을 물과 에탄올로 세척한 후 초고순도 질소를 이용하여 건조시켰다. 25 μL 사이즈의 ECL 셀을 Hamamatsu photonics의 H-6780 PMT 모듈에 직접 연결하였으며, 전기화학발광의 세기는 순환 전압-전류법 과정 중 PMT 모듈을 이용하여 측정하였다. ECL 분석 용액은 일반적으로 100 mM TPrA(트리프로필아민)를 공반응물(coreactant)로 하고 0.1 M TBAP(테트라부틸암모늄 과염소산염)를 전해질로 사용하면서 50%의 물이 포함된 수용액으로 제조하였다. 보고한 ECL 데이터들은 적어도 세 번 이상의 실험을 통해 얻어진 평균값으로 좋은 재현성을 보여주었다.

실시예 1. 프로브 1의 합성

실시예 1.1. 화합물 (3) 합성

1-브로모-4-메톡시벤젠 (1 g, 5.35 mmol), 비스(피나콜라토)디보론 (1.49 g, 5.88 mmol), [1,1'-비스(디페닐포스피노)페로센]디클로로팔라듐(II) (131 mg, 0.16 mmol) 및 KOAc (1.51 g, 16.05 mmol)을 1,4-디옥산 (50 mL)에 용해시키고 80 ℃에서 3 시간 동안 환류시켰다. 실온으로 냉각시킨 후, 용매를 감압 하에 제거하고, 디클로로메탄 (CH₂Cl₂)으로 재용해시키고, 셀라이트를 통해 여과하고, 합한 유기상을 H₂O 및 염수로 세척하고, 무수 Na₂SO₄로 건조시키고, 진공에서 농축시켰다. 잔류물을 실리카겔 컬럼크로마토그래피 (에틸아세테이트/헥산 = 1:10)로 정제하여 목적하는 화합물을 얻었다.

1.05 g, 84% 수율. 300 MHz 1H NMR (CDCl₃): δ 7.78 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 6.92 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 3.85 (s, 3H), 1.36 (s, 12 H).

실시예 1.2. 화합물 (4) 합성

화합물 3 (500 mg, 2.14 mmol), 1-클로로이소퀴놀린 (349 mg, 2.14 mmol), Pd(PPh₃)₄ (74 mg, 64 μmol) 및 NaHCO₃ (899 mg, 10.7 mmol)를 THF (21 mL) 및 H₂O (7 mL)로 희석시키고 80 ℃에서 밤새 교반하였다. 실온으로 냉각시킨 후, 반응 혼합물을 디클로로메탄 (CH₂Cl₂)으로 추출하였다. 모은 유기층을 H₂O 및 소금물로 세척하고, 무수 Na₂SO₄로 건조시키고 진공 농축시켰다. 잔류물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (에틸아세테이트/헥산 = 1:5)로 정제하여 목적하는 화합물을 수득하였다.

322 mg, 64% 수율. 300 MHz ¹H NMR (CDCl₃): δ 8.61 (d, 1 H, J = 5.7 Hz), 8.17 (d, 1H, J = 8.5 Hz), 7.90 (d, 1H, J = 8.2 Hz), 7.74-7.54 (3H, m), 7.64 (d, 1H, J = 5.7 Hz), 7.56 (t, 1H, J = 7.1 Hz), 7.10 (d, 2H, J = 8.6 Hz), 3.93 (s, 3H).

실시예 1.3. 화합물 (5) 합성

화합물 4 (176 mg, 0.75 mmol) 및 이리듐 염화물 (95 mg, 0.32 mmol)을 2-에톡시에탄올 (6 mL)과 H₂O (2 mL)의 혼합물에 용해시켰다. 반응 혼합물을 100 ℃에서 24 시간 동안 교반한 후, 실온으로 냉각 한 후, 반응 혼합물에 물을 부었다. 다음으로, 적색의 침전물을 여과하고, H2O, 헥산으로 세척하고, 진공 하에 건조시켜 조질(crude) 고리금속화된 Ir(III) 클로로로 연결된 이량체를 수득하였다.

152 mg, 68% 수율. 300 MHz ¹H NMR (DMSO-d₆): δ 9.66 (d, J = 6.5 Hz, 2H), 9.48 (d, J = 6.5 Hz, 2H), 8.83 (dd, J = 18.4, 8.5 Hz, 4H), 8.23-8.08 (m, 8H), 7.96-7.78 (m, 12H), 6.65 (dd, J = 8.7, 2.2 Hz, 2H), 6.53 (dd, J = 8.8, 2.2 Hz, 2H), 5.77 (d, J = 2.2 Hz, 2H), 5.01 (d, J = 2.1 Hz, 2H), 3.41 (s, 6H), 3.17 (s, 6H).

실시예 1.4. 화합물 (6) 합성

화합물 5 (147 mg, 0.11 mmol)를 10 mL의 무수 디클로로메탄 (CH₂Cl₂)에 용해시키고, 용액을 질소 대기하에 0 ℃로 냉각시켰다. 이어서, BBr₃ (0.63 mL, CH₂Cl₂ 중의 1.0 M 용액)을 주사기를 통해 용액에 서서히 첨가하고, 생성된 혼합물을 실온에서 18 시간 동안 교반하였다. MeOH (2 mL)를 첨가하여 반응을 중단시키고 NaHCO₃의 포화 수용액으로 중화시켰다. 그 다음, 용액을 헥산 (5 mL)으로 희석시키고, 격렬하게 교반하면서 H₂O (100 mL)를 첨가하였다. 침전물을 여과로 수집하고, H₂O 및 헥산으로 세척하고, 진공에서 밤새 건조시켰다. 화합물 6을 추가의 정제 없이 다음 단계에서 사용하였다.

화합물 6의 형성은 DMSO-d₆에서 ¹H NMR을 사용하여 메톡시 수소의 단일 피크 (δ 3.41, 3H, s / δ3.17, 3H, s)의 소실로 확인하였다.

실시예 1.5. 화합물 1-PhS^- 합성

화합물 6 (100 mg, 75 μmol), 아세틸아세톤 (38 μL, 0.37 mmol) 및 Na₂CO₃ (40 mg, 0.37 mmol)을 2-에톡시에탄올 (5 mL)에 용해시키고 80 ℃에서 2 시간 동안 교반하였다. 실온으로 냉각시킨 후, 휘발성 물질을 증발시키고 디클로로메탄 (CH₂Cl₂)으로 재용해시켰다. 용액을 H₂O 및 염수로 세척하고, 무수 Na₂SO₄로 건조시키고, 진공 농축시켰다. 잔류물을 실리카겔 컬럼크로마토그래피 (디클로로메탄/메탄올 = 50:1)로 정제하여 화합물 1-PhS^-를 수득하였다.

47 mg, 43% 수율. 300 MHz ¹H NMR (DMSO-d₆): δ 9.13 (s, 2H), 8.91 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 8.25 (d, J = 6.3 Hz, 2H), 8.09 (d, J = 8.7 Hz, 4H), 7.82 (dd, J = 9.3, 5.4 Hz, 4H), 7.65 (d, J = 6.4 Hz, 2H), 6.36 (dd, J = 8.6, 1.7 Hz, 2H), 5.63 (d, J = 1.7 Hz, 2H), 5.25 (s, 1H), 1.70 (s, 6H). 75 MHz ¹³C NMR (DMSO-d₆): δ 184.39, 168.02, 158.00, 155.37, 140.39, 137.80, 137.20, 131.47, 131.34, 128.55, 127.92, 126.61, 125.33, 120.23, 119.01, 108.65, 100.87, 28.74. HRMS (FAB+, m-NBA): m/z 측정값 732.1607 (계산값 C₃₇H₂₇N₂IrO₄ [M]+ 732.1600).

실시예 1. 프로브 1 합성

N,N'-디메틸포름아미드 (DMF) 2 mL 중의 1-PhS^- (47 mg, 64 μmol) 및 K₂CO₃ (27 mg, 0.19 mmol)의 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반하였다. 다음으로 DMF 0.5 mL에 용해된 1-클로로-2,4-디니트로벤젠 (39 mg, 0.19 mmol)을 혼합물에 서서히 첨가하였다. 반응 혼합물을 100 ℃에서 1.5 시간 동안 교반 하였다. 실온으로 냉각시킨 후, 용매를 감압 하에서 제거하고 디클로로메탄으로 추출하였다. 유기상을 H₂O 및 염수로 세척하고, 무수 Na₂SO₄로 건조시키고, 증발시켰다. 잔류물을 실리카겔 컬럼크로마토그래피 (디클로로메탄/메탄올 = 50:1)로 정제하여, 프로브 1을 수득하였다.

59 mg, 87% 수율. 500 MHz ¹H NMR (DMSO-d₆): δ 8.87 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 8.61 (d, J = 2.4 Hz, 2H), 8.30 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 8.27 (d, J = 6.4 Hz, 2H), 8.02 (d, J = 7.3 Hz, 2H), 7.82 ? 7.76 (m, 4H), 7.75 (d, J = 6.3 Hz, 2H), 7.09 (d, J = 9.2 Hz, 2H), 6.77 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 5.58 (s, 2H), 5.32 (s, 2H), 1.75 (s, 6H). 125 MHz ¹³C NMR (DMSO-d₆): δ 184.99, 167.04, 155.26, 154.77, 153.65, 143.89, 142.14, 140.50, 140.15, 137.03, 131.89, 131.87, 129.47, 129.28, 127.87, 126.24, 125.58, 121.87, 121.86, 121.32, 121.25, 111.56, 101.12, 28.65. HRMS (FAB+, m-NBA): m/z 측정값 1064.1627 (계산값 C₃₇H₂₇N₂IrO₄ [M]⁺ 1064.1629).

실시예 2. 프로브 2의 제조

실시예 2.1. 화합물 (7)의 합성

5-브로모-2-메톡시벤즈알데히드 (1.04 g, 4.83 mmol), 비스(피나콜라토)디보론 (1.35 g, 5.31 mmol), Pd(dppf)Cl₂ (157 mg, 0.19 mmol) 및 아세트산칼륨 (1.36 g, 14.49 mmol)을 1,4-디옥산 20 mL에 녹이고 3시간 동안 환류시켰다. 다음으로 상온으로 냉각한 다음 용매를 감압하에 증발시킨 후, 반응 혼합물을 DCM으로 녹여 셀라이트로 필터하였다. 필터한 여액의 용매는 다시 감압하에 증발시킨 후, 실리카겔 컬럼크로마토그래피법(에틸아세테이트/헥산=1:10)으로 정제하여 화합물 3을 수득하였다.

0.928 g, 73% 수율. 300 MHz ¹H NMR (CDCl₃): δ 10.47 (s, 1H), 8.31 (s, 1H), 8.00 (dd, J = 8.4, 1.5 Hz, 1H), 7.00 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 3.97 (s, 3H), 1.35 (s, 12H).

실시예 2.2. 화합물 (8)의 합성

THF (12 mL) 및 H₂O (4 mL) 혼합액에 화합물 7 (427 mg, 1.63 mmol), 1-클로로이소퀴놀린 (293 mg, 1.79 mmol), Pd(PPh₃)₄ (57 mg, 49 μmol) 및 탄산수소나트륨 (684 mg, 8.15 mmol)를 넣고 녹인 후 24시간 동안 환류시켰다. 다음으로 상온으로 냉각시킨 다음, 반응 혼합물을 디클로로메탄으로 추출하였다. 유기층은 물과 염수로 세척하고 무수 Na₂SO₄로 건조시킨 후, 감압하에 용매를 증발시켰다. 잔류물은 실리카겔 컬럼크로마토그래피(에틸아세테이트/헥산=1:5)로 정제하여 화합물 8를 수득하였다.

380 mg, 81% 수율. 500 MHz ¹H NMR (CDCl₃): δ 10.56 (s, 1H), 8.59 (d, J = 5.7 Hz, 1H), 8.20 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 8.07 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.98 (dd, J = 8.6, 2.3 Hz, 1H), 7.89 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.73-7.68 (m, 1H), 7.65 (d, J = 5.6 Hz, 1H), 7.56 (dd, J = 11.3, 4.1 Hz, 1H), 7.19 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 4.04 (s, 3H).

실시예 2.3. 화합물 (9)의 합성

2-에톡시에탄올 (20 ml) 및 H₂O (6 mL) 혼합액에 화합물 8 (380 mg, 1.44 mmol) 및 이리듐 염화물 (210 mg, 0.70 mmol)을 넣고 녹인 후 24시간 동안 환류시켰다. 다음으로 상온으로 냉각시킨 다음, 반응 혼합물에 과량의 물을 첨가하였다. 생성된 붉은색 침전을 여과하고 물과 헥산으로 세척하였다. 다음으로 진공에서 건조시켜 조질(crude) 금속고리화된 Ir(III) 클로로로 연결된 이량체(chloro-bridged dimer) 5를 수득하였다.

412 mg, 76% 수율. ¹H NMR (DMSO-d₆): δ 10.18 (s, 2H), 10.10 (s, 2H), 9.72 (d, J = 6.4 Hz, 2H), 9.52 (d, J = 6.5 Hz, 2H), 8.80 (dd, J = 14.5, 8.2 Hz, 4H), 8.50 (s, 2H), 8.42 (s, 2H), 8.31-8.21 (m, 4H), 8.10 (d, J = 6.4 Hz, 2H), 8.01-7.94 (m, 10H), 6.06 (s, 2H), 5.10 (s, 2H), 3.29 (s, 6H), 2.87 (s, 6H).

실시예 2.4. 2-PhS^-의 합성

질소 기체하에서 무수 디클로로메탄 10 mL에 조질 금속고리화된 Ir(III) 클로로로 연결된 이량체(chloro-bridged dimer) 9 (201 mg, 0.13 mmol)를 넣고 녹였다. 용액의 온도를 0 ℃로 냉각시킨 후, 보론 트리브로마이드(0.8 mL, 1.0 M 용액)를 주사기를 이용해 천천히 적하시키고, 용액의 온도를 상온으로 올려 18시간 동안 반응시켰다. 다음으로, 메탄올 2 mL를 참가하여 반응을 종결시키고 포화 탄산수소나트륨 용액으로 용액을 중화하였다. 혼합액은 헥산 5 mL로 묽히고 추가로 H₂O 80 mL를 첨가하였다. 생성된 침전을 여과하고 물과 헥산으로 세척하였다. 다음으로 진공에서 건조시켜 조질(crude) 금속고리화된 Ir(III) 클로로로 연결된 이량체(chloro-bridged dimer) 10을 수득하였다. 화합물 10의 생성은 ¹H NMR 상에서 메톡시의 수소 신호(δ 3.93, 3H, s/ δ 2.87, 3H, s)가 사라진 것을 통해 확인하였다. 화합물 10 (130 mg, 90 μmol), 아세틸아세톤 (46 μL, 0.45 mmol) 및 탄산나트륨 (48 mg, 0.45 mmol)을 2-에톡시에탄올 (5 mL)에 넣고 2시간 동안 환류하였다. 다음으로 상온에서 냉각시킨 후, 반응 혼합물을 디클로로메탄으로 추출하였다. 유기층은 물과 염수로 세척하고 무수 Na₂SO₄로 건조시킨 후, 감압하에 용매를 증발시켰다. 잔류물은 실리카겔 컬럼크로마토그래피(디클로로메탄/메탄올=50:1)로 정제하여 화합물 2-PhS^-를 수득하였다.

116 mg, 82% 수율. 500 MHz ¹H NMR (DMSO-d₆): δ 10.57 (s, 1H), 10.02 (s, 1H), 8.98-8.95 (m, 1H), 8.53 (s, 1H), 8.27 (d, J = 6.3 Hz, 1H), 8.18-8.15 (m, 1H), 7.91 (dd, J = 6.1, 2.9 Hz, 3H), 7.84 (d, J = 6.3 Hz, 1H), 5.81 (s, 1H), 5.29 (s, 1H), 1.72 (s, 3H). 125MHz ¹³C NMR (DMSO-d₆): δ 192.16, 185.16, 167.56, 166.21, 160.55, 140.13, 139.61, 137.30, 132.03, 130.98, 129.58, 128.38, 126.11, 125.52, 121.14, 121.04, 117.24, 101.07, 28.60. HRMS (FAB+, m-NBA): m/z 측정값 788.1496 (계산값 C₃₇H₂₇N₂IrO₄ [M]+ 788.1499).

실시예 2.5. 프로브 2의 합성

N,N-디메틸포름아미드(3 mL)에 화합물 2-PhS^- (116 mg, 0.15 mmol), 탄산칼륨 (61 mg, 0.44 mmol)을 넣고 상온에서 30분 동안 유지시킨다. 그 후, 1 mL의 N,N-디메틸포름아미드에 1-클로로-2,4-디니트로벤젠 (89 mg, 0.44 mmol)을 녹여 주사기를 이용해 천천히 혼합용액에 첨가하고, 온도를 올려 혼합 용액을 1시간 30분 동안 환류시켰다. 다음으로 상온에서 냉각시킨 후, 반응 혼합물을 디클로로메탄으로 추출하였다. 유기층은 물과 염수로 세척하고 무수 Na₂SO₄로 건조시킨 후, 감압하에 용매를 증발시켰다. 잔류물은 실리카겔 컬럼크로마토그래피(디클로로메탄/메탄올=50:1)로 정제하여 프로브 1을 수득하였다.

51 mg, 30% 수율. 500 MHz ¹H NMR (CDCl₃): δ 10.20 (s, 2H), 8.86 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 8.70 (s, 2H), 8.49 (s, 2H), 8.18 (d, J = 6.3 Hz, 2H), 8.00 (d, J = 6.4 Hz, 2H), 7.83 (t, J = 7.6 Hz, 4H), 7.78-7.74 (m, 2H), 7.47 (d, J = 6.3 Hz, 2H), 6.98 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 5.52 (s, 2H), 5.28 (s, 1H), 1.79 (s, 6H). 125MHz ¹³C NMR (DMSO-d₆): δ 188.45, 185.52, 167.46, 165.66, 155.83, 152.79, 144.34, 142.82, 140.64, 139.91, 137.11, 136.78, 132.44, 130.78, 130.01, 129.58, 127.98, 125.75, 125.59, 123.08, 122.42, 121.85, 120.96, 120.39, 28.53. HRMS (FAB+, m-NBA): m/z 측정값 1121.1611 (계산값 C₃₇H₂₇N₂IrO₄ [M]+ 1121.1606).

시험예 1. 반응속도 평가

수성매질에서 티오페놀을 측정하여 프로브 1 및 프로브 2의 시간에 따른 인광세기 변화를 통해 반응속도를 확인하였다. 측정은 pH 7.4, 4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄설폰산 (HEPES) 완충액/CH₃CN = 1:1 v/v 혼합용액에서 수행하였다.

도 1a는 프로브 1(10 μM)의 시간에 따른 인광 세기이며, 도 1b는 프로브 2(10 μM)의 시간에 따른 인광 세기이다. 도 1c는 티오페놀 존재하의 613 nm에서의 프로브 1과 589 nm에서의 프로브 2의 상대 인광 강도 변화 결과이다. 도 1d는 프로브 1 및 2의 반응 전(흑색 막대)과 CH₃CN/H₂O (1:1 v/v, pH 7.4, 10 mM HEPES)에서 25 분 동안 400 μM 티오페놀과의 반응 후(적색 막대)의 상대 인광 강도 결과이다.

프로브 1, 2 모두 충분한 시간이 지났을 때, 강한 인광 세기를 보여주었다. 프로브 1은 270분에 포화상태에 도달하였지만, 프로브 2는 25분에 포화상태에 도달하였지만, 프로브 2는 최대 세기에 도달하는데 약 25분이 채 걸리지 않았다(도 1c). 프로브들의 인광 세기 변화를 25분을 기준으로 비교하면 프로브 1은 최대 초기 인광 세기에 비해 약 4배 증가한 반면, 프로브 2는 약 31배 증가하였다(도 2d). 이는 디니트로페닐기에 인접한 포밀기가 반응성 향상에 매우 중요한 역할을 하고 있음을 시사한다. 강한 전자 흡인기인 포밀기는 마이젠하이머 (Meisenheimer)-타입 중간체에서 디니트로페닐기의 효율적인 절단에 기여하며, 공명 보조 수소결합에 의한 중간 생성물과 반응 생성물(2-Phs^-)를 모두 안정화시킬 수 있으므로 티오페놀에 의한 디니트로벤젠 기의 이탈 현상을 가속화시키는데 기여한다. 본 발명에 따른 프로브 2는 pH 5-11에서 안정된 PL 방출을 나타내는 것으로 확인되었다. 이러한 결과는 본 발명에 따른 화학식 1의 화합물이 티오페놀의 검출에 효과적이며, 특히, R₂가 포밀기인 화학식 1의 화합물은 높은 감도와 빠른 응답속도로 티오페놀을 검출할 수 있음을 보여준다.

시험예 2. 티오페놀 감지 메커니즘 규명

티오페놀에 대한 프로브의 감지 메커니즘을 규명하기 위해, 40 당량의 티오페놀 존재 하에 실시예 2 프로브의 ¹H NMR 및 MALDI-TOF MS 분석을 수행하였으며, 그 결과를 도 2에 나타내었다. 티오페놀과 프로브 2의 반응물의 ¹H NMR 피크에서 2-PhS^- 와 디니트로페닐과 티오페놀의 반응물 피크가 모두 관찰되었다.

도 3은 프로브 2와 티오페놀의 반응 전/후의 MALDI-TOF MS 스펙트럼을 겹처놓은 결과이다. 티오페놀 존재하에서 프로브 2의 m/z 신호 (1121.533)가 사라지고, 2-PhS^-의 m/z 신호 (789.118)가 나타났다. 이러한 결과는 본 발명에 다른 프로브가 티오페놀과 반응하여 디니트로페닐기가 절단되고, 디니트로페닐기와 티오페놀의 반응생성물(DN)이 형성되었음을 입증한다.

시험예 3. 프로브 2의 광발광 특성 평가

프로브 2의 민감도는 10 μM의 프로브 2의 존재하에 다양한 농도의 티오페놀을 첨가하여 시간에 따른 인광 세기 변화를 통해 측정하였다. 측정은 CH₃CN/H₂O (1:1 v/v, pH 7.4, 10 mM HEPES) (λex= 450 nm) 혼합용액에서 진행하였다. 도 4a와 같이 프로브 2의 인광 세기는 티오페놀의 농도가 점차 증가함에 따라 함께 증가하였으며, 200 μM의 티오페놀 이상의 농도에서 인광 세기가 포화되어 나타났다. 다양한 농도의 티오페놀을 첨가하였을 때의 인광 세기를 통해 결합 적정곡선을 얻을 수 있었으며, 이 곡선은 도 4b와 같다. 프로브 2의 농도를 10 μM로 유지시킨 상태에서 0-150 μM의 티오페놀 농도 범위에서 최대 인광 세기가 선형적(R2 = 0.962)으로 증가하는 것을 확인하였다. 측정된 검출 한계값은 39 nM이다.

프로브 2의 티오페놀에 대한 선택성은 다양한 음이온(CO₃ ^2-, C₂O₄ ^2-, CN-, HCO₃ ^-, N₃ ^-, NO₃ ^-, OAc^-, F^-, Cl^-, Br^-, I^-, SO₄ ^2-, HS^-)과 바이오티올(Cys, GSH, Hcy)들을 첨가한 후, 티오페놀 첨가 전/후의 인광 세기 변화를 통해 확인하였다. 도 4c에서 나타낸 바와 같이, 프로브 2는 티오페놀 외의 분석물질이 800 μM이 존재할 때는 유의적이지 않은 수준의 아주 약한 신호의 변화를 나타냈을 뿐이며, 400 μM의 티오페놀을 넣어주자 강한 인광의 세기를 나타냈다. 이를 통해 프로브 2가 다른 분석 물질들 존재 하에도 방해 없이 티오페놀을 높은 선택성으로 인식할 수 있다는 것을 확인하였다.

시험예 4. 프로브 2의 전기화학발광 특성 평가

ECL 측정은 10 μM의 프로브 2와 0.1 M TprA가 녹아 있는 CH₃CN/H₂O (1:1 v/v, pH 7.4, 0.1 M HEPES, 0.1 M TBAP) 혼합용액에서 진행하였다. 프로브 2는 0-1.6 V의 전위 범위의 순환 전압-전류법 과정 동안 거의 ECL 발광 세기에 변화가 나타나지 않았다. 하지만, 티오페놀의 농도를 증가시키고 이를 용액에 첨가함에 따라 ECL 발광 세기가 함께 증가하는 경향을 확인하였다. ECL 발광 세기는 티오페놀의 농도가 200 μM 이상의 농도에서 포화되었으며(도 5a), 티오페놀을 농도에 따른 1.4 V에서의 ECL 발광 세기를 통해 결합 적정곡선을 얻을 수 있었다(도 5b). 이 곡선에서 프로브 2는 0-200 μM의 티오페놀 농도 범위에서 1.4 V의 ECL 발광 세기가 선형적(R2 = 0.995)으로 함께 증가하는 것을 확인하였으며, 측정된 검출 한계값은 광발광 분석법으로 수행한 값보다 더 뛰어난 3.8 nM이다.

프로브 2의 티오페놀에 대한 선택성을 평가하기 위해 위와 동일한 실험 조건에서 다양한 음이온(CO₃ ^2-, C₂O₄ ^2-, CN-, HCO₃ ^-, N₃ ^-, NO₃ ^-, OAc^-, F^-, Cl^-, Br^-, I^-, SO₄ ^2-, HS^-)과 바이오티올(Cys, GSH, Hcy)들을 첨가한 후, 티오페놀 첨가 전 후의 ECL 발광 세기를 측정하였다. 도 5c에서 나타낸 바와 같이, 프로브 2는 티오페놀 외의 분석물질이 800 μM이 존재할 때는 유의적이지 않은 수준의 아주 약한 신호의 변화를 나타냈을 뿐이며, 400 μM의 티오페놀을 넣어줌에 따라 1.4 V에서 강한 ECL 발광을 나타내었다. 한편, 아이오다이드 존재 하에서 티오페놀을 첨가함에도 불구하고 ECL 발광이 나타나지 않았는데, 이는 산화에 민감한 아이오다이드가 전기화학적 과정에 영향을 미치기 때문이다.

시험예 5. 프로브 1, 2의 감지 작용 기작 평가

프로브 1, 2의 광유발 전자 전달(Photoinduced Electron Transfer, PeT)에 의한 감지 메커니즘을 설명하기 위해 프로브 1, 프로브 2, 1-PhS^- 및 2-PhS^-에 대하여 밀도함수이론(Density functional theory; DFT) 계산을 진행하였다. 도 6에서 나타낸 바와 같이, 프로브 1, 2의 HOMO 분포는 주로 이리듐과 주 리간드의 페닐기에 비편재화 되어 있으며, LUMO의 분포는 디니트로벤젠에 비편재화되어 있었다. 반면, 1-PhS^-와 2-PhS^-의 경우 프로브 1, 2와 비슷한 HOMO 분포를 가지나, LUMO의 분포는 대부분 이소퀴놀린기에 위치되어 있었다. 이러한 결과를 통해 프로브 1, 2는 티오페놀 존재하에 PeT 현상이 억제되고 신호가 나타나는 것으로 예측할 수 있다.

DFT 계산을 통한 이론적 예측과 ECL 발광 메커니즘을 확인하기 위해 CV와 DPV를 이용한 1-PhS^-와 2-PhS^-의 산화/환원 전위의 측정을 통해 HOMO/LUMO 에너지 레벨을 계산하였다. 디니트로벤젠의 LUMO 에너지 레벨(-4.36 eV)은 1-PhS^-와 2-PhS^-의 HOMO(-5.39, -5.88 eV)와 LUMO 에너지 레벨(-3.28, -3.31 eV) 사이에 존재하는 것을 확인하였다(도 6a). 이러한 결과는 프로브 1, 2가 디니트로벤젠에 의해 PeT 현상으로 빛이 소광되는 것을 간접적으로 증명하였다. 한편, 1-PhS^-와 2-PhS^-의 LUMO 에너지 레벨 (-3.28, -3.31 eV)은 공반응물인 TPrA 라디컬의 SOMO 에너지 레벨보다 충분히 낮은 위치에 존재하고 있어, ECL 발광 생성 과정이 원활히 일어나는 것을 확인할 수 있다(도 6b).

시험예 6. 1-PhS^-와 2-PhS^-의 인광 및 ECL 비교

포밀기를 가진 이리듐 복합체가 포밀기가 없는 경우보다 더 낮은 인광을 나타낸다는 것은 다른 연구진들에 의해 이전에 보고된 바 있다. 1-PhS^-와 2-PhS^-의 인광 및 ECL 비교하여 표 1에 나타내었다.

구분	상대적 인광세기	상대적 ECL 세기	상대적 ECL 효율	ECL/인광 세기비
Ru(bpy)₃ ²⁺	1	1	1	1
1-PhS^-	0.46	2.17	1.61	4.7
2-PhS^-	0.14	1.89	1.43	13.5

2-PhS^- 인광 세기의 경우, 1-PhS^-에 비해 약한 세기를 나타냈었다. 반면, 2-PhS^-의 ECL 발광 세기는 1-PhS^-와 비슷한 수준으로 관측되었으며(표 1, 도 7), 일반적으로 사용되는 ECL 발광단인 Ru(bpy)32+에 비해 두 배 강한 ECL 발광 세기를 확인하였다(표 1). 이와 같은 결과는 ECL 발광 과정에서 2-PhS^-가 원활한 촉매 과정을 유도하는 것으로 예측된다. 촉매 과정은 전극 표면에서 산화되기 어려운 TPrA를 효율적으로 TPrA 라디컬로 생성하는 과정으로 ECL 발광 세기에 영향을 미칠 수 있다. 도 8에 나타낸 바와 같이, 2-PhS^-의 HOMO 레벨은 TPrA의 HOMO 레벨보다 낮게 위치하고 있으며, 이를 통해 TPrA가 보다 효율적으로 TPrA 라디컬을 생성할 수 있다는 것을 예상할 수 있다. 반면, 1-PhS^-의 HOMO 레벨은 TPrA의 HOMO 레벨과 비슷하게 위치하고 있어 비교적 낮은 촉매 과정 효율을 나타내는 것으로 예상된다. 따라서, 2-PhS^-가 1-PhS^-에 비해 인광의 세기는 미약한 수치이나, ECL 발광 세기는 비슷한 수준으로 나타난다.

시험예 7. 수중 내 티오페놀의 정량

물 샘플에서 ECL 분석법을 활용한 프로브 2의 티오페놀 정량 실험을 수행하였다. 물 샘플은 대한민국의 한강에서 채취하였으며, 위에서 실시한 ECL 발광 측정과 같은 방식으로 진행하였다. 분석 용액은 티오페놀을 녹인 한강 물 0.8 mL를 1.0 M HEPES 버퍼 용액 (pH 7.41, 1.0 M TPrA) 0.2 mL와 0.20 M TBAP MeCN 1 mL로 묽혀서 제조하였다. 묽힌 분석용액의 농도는 도 5b의 적정곡선을 통해서 확인하였으며, 묽히기 전 실제 샘플의 농도는 묽힘 인자(2.5)를 곱해서 계산하였으며, 이를 표 2에 나타내었다. 표 2에 나타낸 것과 같이, 프로브 2는 96%에서 98% 범위의 높은 정확도로 티오페놀을 검출하였다.

티오페놀 농도 (μM)	상대적 ECL 세기 (실험값) (n =3)	상대적 ECL 세기 (계산값)	정확도 (%)
0	0.0031 ± 0.0002	-	-
50	0.1174 ± 0.0021	0.1216	95.94 ± 1.72
100	0.2152 ± 0.0053	0.2218	97.12 ± 2.40
200	0.4151 ± 0.0107	0.4222	98.20 ± 2.53

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 티오페놀 검출용 전기화학발광 프로브:
[화학식 1]

상기 화학식 1에서,
L는 비발광성 리간드이며;
A는 N 및 Z₁을 포함하는 2 내지 3환의 축합헤테로아릴이며; 상기 축합헤테로아릴은 퀴놀린, 벤조이소퀴놀린, 페난트리딘, 벤조티아졸, 벤조옥사졸 및 벤조이미다졸 중에서 선택되고; 상기 축합헤테로아릴은 비치환되거나, 또는 C_1-10알킬, C_3-8시클로알킬, C_1-10알킬옥시, 니트로 및 시아노 중에서 선택되는 1 내지 3개로 치환되며;
R₁, R₂ 및 R₃은 서로 동일하거나 또는 상이하고, 각각 독립적으로 H, 히드록시, 시아노, 포밀(formyl), C_1-10알킬, C_3-12시클로알킬, C_6-12아릴, C_1-10알킬옥시 및 C_6-12아릴옥시 중에서 선택되고; 상기 C_1-10알킬 또는 상기 C_1-10알킬옥시는 비치환되거나, C_6-12아릴로 치환되고; 상기 C_6-12아릴 또는 C_6-12아릴옥시는 비치환되거나 C_1-6알킬 또는 C_1-6알킬옥시로 치환되고;
Z₁은 O, S 및 NR_a 중에서 선택되며; R_a는 H 또는 C_1-10알킬이다.
제1항에 있어서,
상기 A는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 티오페놀 검출용 전기화학발광 프로브:

상기 화학식에서,
R₄는 수소, C_1-10알킬, C_3-8시클로알킬, C_1-10알킬옥시, 니트로 및 시아노 중에서 선택되고,
m은 0 내지 3의 정수이며,
Z₁은 O, S 및 NR_a 중에서 선택되며; R_a는 H 또는 C_1-10알킬이다.
제1항에 있어서,
비발광성 리간드 L은 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 티오페놀 검출용 전기화학발광 프로브:

상기 화학식에서,
R₆, R₇, R₈, R₉, R₁₀, R₁₁ 및 R₁₂는 서로 동일하거나 또는 상이하고, 각각 독립적으로 수소, C_1-10알킬, 할로C_1-6알킬 및 C_6-12아릴 중에서 선택된다.
제1항에 있어서,
R₂가 포밀인, 티오페놀 검출용 전기화학발광 프로브.
제1항에 있어서,
상기 화학식 1의 화합물은 티오페놀과 선택적으로 반응하여 전기화학발광 신호를 증가시키는 것을 특징으로 하는, 티오페놀 검출용 전기화학발광 프로브.
제1항에 있어서,
티오페놀과 반응하여 상기 화학식 1의 화합물의 디니트로페닐기가 분해되면서, 전기화학발광 신호를 증가시키는 것을 특징으로 하는, 티오페놀 검출용 전기화학발광 프로브.
제6항에 있어서,
화학식 1의 화합물과 티오페놀의 반응 생성물의 LUMO 에너지 레벨이 전기화학발광 공반응물의 HOMO 에너지 레벨보다 낮은, 티오페놀 검출용 전기화학발광 프로브.
제7항에 있어서,
전기화학발광 공반응물은 트리프로필아민 또는 2-(디부틸아미노)에탄올인 것을 특징으로 하는, 티오페놀 검출용 전기화학발광 프로브.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 전기화학발광 프로브를 이용하는, 생체 내 티오페놀의 검출 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 전기화학발광 프로브를 포함하는 전기화학발광 센서.
제10항에 있어서, 티오페놀과의 반응에 의해 청색 이동된 영역에서 전기화학발광의 변화가 나타나는 것인, 전기화학발광 센서.