WO2012083872A1 - 一类光亲和标记双功能探针分子及其制备方法和应用 - Google Patents
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- R 2 is connected to the benzene ring through the joint portion Y;
- Compound Rrd Cs alkylene-NH-C(O)-phenyl(-)-0-(( ⁇ ( ⁇ 4 alkylene-O d C ⁇ alkylene-NH-C C -C ⁇ CAalkylene-azido group can be composed of Ri-C ⁇ Cs alkylene-NH 2 and SuOOC-phenyl(-)-0-(( ⁇ 4 alkylene)
- the alkylene-NH-C(0)-Ci ⁇ C 4 alkylene-azido group is obtained by a condensation reaction.
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Abstract
本发明涉及一类光亲和标记双功能探针分子。本发明所涉及的探针分子具有GABAB受体强亲和力、高选择性的结合能力，同时可用于在活细胞水平对膜上GABAB受体的标记、示踪、分析因激活或拮抗引起的胞内相关信号蛋白的动态变化过程，以及用于新靶点的发现与蛋白质谱的研究，为与GABAB受体相关疾病的诊断和相应治疗药物的开发提供更为直接的精确的重要信息。
Description
一类光亲和标记双功能探针分子及其制备方法和应用 技术领域
本发明涉及一类光亲和标记双功能探针分子。 本发明所涉及的探针分子 具有 γ氨基丁酸 Β 型受体 (Gamma Aminobutyric Acid B Receptor, 简称 GABABR或 GABAB受体） 强亲和力、 高选择性的结合能力， 同时可用于在 活细胞水平对膜上 GABAB受体的标记、 示踪、 分析因激活或拮抗引起的胞 内相关信号蛋白的动态变化过程，以及用于新靶点的发现与蛋白质谱的研究， 为与 GABAB受体相关疾病的诊断和相应治疗药物的开发提供更为直接的精 确的重要信息。 本发明还涉及该类探针分子的结构设计及制备方法。 背景技术
药物发现过程包括许多阶段， 如： 靶点的鉴别、 先导化合物的发现、 小 分子化合物的结构优化、 临床前及临床试验等。 靶点的鉴别是药物发现与发 展过程中的关键歩骤（Curr. Opin. Chem. Biol. 2002, 6: 427-433 ) ,而目前基因 水平上的生物技术不能确定针对某种疾病的小分子药物的特异性蛋白质靶 点。 可以预见， 在基因组学基础上开展的蛋白质组学研究将推动药物开发方 面的实质性突破， 使得生命科学研究能实现其最终目标， 研制出治疗包括癌 症和艾滋病等在内的多种疾病的药物。 因此针对药物发现的技术重心已经由 基因组转向了蛋白质组。光亲和标记技术是研究蛋白质组学的主要策略之一， 它不仅对蛋白质进行鉴别， 同时也对其功能及相互作用进行研究。
光亲和标记技术是结合现代分子生物学、 细胞生物学、 有机化学等多学 科的优势， 运用合成的光亲和小分子化合物作为工具探针， 经特定波长的光 照射分解产生高活性的中间体， 与其受体活性部位形成特异性的不可逆的共 价结合。探针分子（参见图 1 )包括三个功能部位：活性基团（activity group).
光亲禾口标记基团 (photoaffmity labeling group 艮告基团 (reporter group) , 功能部位之间通过连接部位 （spacer) 连接。 活性基团的作用是将探针分子 导向受体蛋白的活性中心； 光亲和标记基团的作用是在探针分子被导向受体 蛋白的活性中心之后经特定波长的紫外光照射分解产生高活性的卡宾或氮宾 中间体， 将探针分子共价修饰在受体蛋白的活性中心； 报告基团主要是方便 以后的分离、 纯化、 检测等操作。
光亲和标记技术是在分子水平上研究配体与受体相互作用的核心工具之 一， 阐明配体与受体相互作用的机理对药物先导物的发现有着巨大的推动作 用 （Curr. Top. Med. Chem. 2002, 2: 271~288)。 它在药物的发现中主要有两个 方面的应用： 新靶点的确定及靶标蛋白与小分子配体作用模式的确定。 运用 这一技术的优势在于可在不同的层面对疾病相关的靶点进行深入的研究： 1 ) 未知作用靶点的活性化合物： 通过设计探针标记捕获的靶标蛋白， 进而确定 该活性化合物的作用靶点， 更进一歩， 对由生物大分子与探针分子形成的共 价复合物的解析可获取小分子活性化合物与其作用靶点的作用模式； 2)已知 作用靶点， 但具体作用模式未知的活性化合物， 运用这一技术可直接从微观 角度解析其与靶标蛋白的可能的作用模式。
运用光亲和标记技术， 大量的与疾病相关的靶点被发现， 多种小分子与 生物大分子作用的模式被确定， 这些信息对合理药物设计具有非常重要的意 义。 比如新的药物靶点的发现， 或者对一个已知蛋白的功能作新的阐述， 这 对于从分子水平阐明疾病的发生、 发展及治疗的意义是不言而喻的。 这些靶 点可被发展为高效、 高速的高通量筛选模型， 并在短时间内随机筛选大量的 小分子化合物， 发现一些更高活性的小分子化合物作为先导物用于进一歩的 新药开发研究。 这样， 从一个小分子探针为起点， 其母体化合物或许在类药 性、 有效性甚至代谢稳定性等方面存在问题， 但新发现的化合物则不受原有 结构的限制， 有更宽的改造空间。
γ-氨基丁酸 (GABA)是哺乳动物中枢神经系统中重要的抑制性神经递质， 在体内通过作用于离子通道型的 GABAA、 GABAC受体及代谢型的 GABAB 受体而发挥生理功能。 GABAB受体属于 G蛋白偶联受体 （ G protein-coupled receptor, GPCR) 家族的 C家族， 具有七次跨膜结构， 它存在于神经元的突 触前及突触后部位， 介导慢的抑制性效应， 在脑内参与许多重要的生理活动 和病理变化， 包括认知损害、 癫痫、 痉挛及药物成瘾等。 因此， GABAB受体 作为药物作用的重要靶点，其结构特征、作用机理以及信号转导途径的研究， 对于阐明相关神经系统疾病的发病机理以及相应治疗药物的开发具有重要意 义。
虽然 GABAB受体具有重要的生理及病理意义， 但其结构的特殊性使得 利用传统的蛋白质组学方法进行研究非常有难度； 而 ABPP技术， 尽管目前 已经广泛的用于不同酶家族的研究， 在离子型受体方面的应用也有报道， 但 是在 GPCR家族尤其是 GABAB受体方面的应用仍然很少。一般来说， GPCR 的不同构象在体内同时存在并处于平衡状态， 而 GPCR的不同的小分子配体 可以使受体在不同的构象之间转换。 这种体系的复杂性可能是制约 ABPP广 泛用于 GABAB受体研究的主要原因。 如果能克服上述困难， 成功设计合成 强亲和力、 高选择性的光亲和探针分子， 将会对 GABAB受体的生理学和结 构特征的研究起到相当大的推动作用。 此外， 利用小分子光亲和探针还可以 将 0八8八13受体固定在激活或拮抗状态，来研究活性状态下 0八8八13受体在细 胞上的定位及功能， 以及所引起胞内信号的变化。 因此， 开发 GABAB受体 的强亲和力、 高选择性的小分子配体对深入研究 GABAB受体， 以及开发新 型作用于 GABAB受体的药物具有重要意义。 发明内容
本发明的一个目的是提供一类对 GABAB受体具有强亲和力、 高选择性 的光亲和标记双功能探针分子。
本发明的另一个目的是提供上述的光亲和标记双功能探针分子的制备方 法。
本发明的另一个目的是提供上述的光亲和标记双功能探针分子的用途。 本发明所涉及的光亲和标记双功能探针分子可用于活细胞水平对膜上 GABAB受体的标记、示踪、分析因激活或拮抗引起的胞内信号蛋白的动态变 化过程以及用于新靶点的发现和蛋白质谱的研究， 为深入研究 GABAB受体 提供更有效的研究工具， 为开发新型作用于 GABAB受体的药物提供重要信 息。
根据本发明的第一个目的， 本发明提供一类结构式如通式 I所示的光亲 和标记双功能探针分子：
R-] X R2
R3
I
其中：
为活性基团， 对 GABAB受体具有高亲和力、 高选择性， 可为已知的 0 8 13受体拮抗剂经结构改造获得； 具体可以是 Rla、 Rlb或 Rle;
R2为报告基团， 可以为生物素 （biotin) , 或多肽标签： HA (序列为： N-YPYDVPDYA-C), Flag (序列为： N-DYKDDDDK-C )、 Myc (序列为： N-EQKLISEEDL-C), His (序列为： HHHHHH) , 其中： 序列两端的 N表
多肽的 N端， C表示 C端， 中间的字母为天然氨基酸的代号， 具体为： A丙 氨酸， D 天冬氨酸， E 谷氨酸， H 组氨酸， I 异亮氨酸， K赖氨酸， L亮 氨酸， P脯氨酸， Q 谷氨酰胺， S 丝氨酸， V缬氨酸， Y 酪氨酸， 或荧光 染料： 羧基荧光素（carboxyfluorescein, FAM)、异硫氰酸荧光素（Fluorescein isothiocyanate, FITC)、 四乙基罗丹明 （ Rhodamine B )、 羧基四甲基罗丹明
( carboxytetramethylrhodamine , TAMRA)、 花菁 ( cyanine )类染料 (如 Cy3、 Cy5等）以及 Alexa Fluro系列染料（如 Alexa Fluor 488、 Alexa Fluor 568等）；
Biotin Alexa Fluro 488 Alexa Fluro 568
R3 为光亲和标记基团， 可为叠氮基、 三氟甲基双吖丙啶基 ( trifluoromethyldiazirine )、 苯甲酉先基或二苯甲酮基；
X 为连接部位， 可为： -d~C8亚烷基 -NH-C(O)-苯基 -C d C^亚烷基 -0)n-d~C4亚烷基 -NH-或者 -d~C8亚烷基 -NH-C(O)-苯基 -C d C^亚烷基 -0)n-Ci~C4亚烷基 -NH-C C -C^CA亚烷基-三氮唑基 -d~C4亚烷基 -NH-; n为
0~4间的整数， 优选 n为 2;
且， R3与 X中的苯基相连。
在本发明的进一歩实施方式中， 通式 I中：
Ri为 GABAB受体拮抗剂经结构改造获得； 具体为 Rle;
R2为生物素（biotin) , 或多肽标签： HA、 Flag, Myc、 His, 或荧光染料： 幾基荧光素 （ carboxyfluorescein， FAM )、 异硫氰酸荧光素 （Fluorescein isothiocyanate, FITC)、 四乙基罗丹明 （Rhodamine B)、 羧基四甲基罗丹明 ( carboxytetramethylrhodamine , TAMRA)、 花菁 ( cyanine )类染料 (如 Cy3、 Cy5等）以及 Alexa Fluro系列染料（如 Alexa Fluor 488、 Alexa Fluor 568等）；
R3为三氟甲基双吖丙啶基、 苯甲酰基或二苯甲酮基；
X 为连接部位， 可为 -d~C8亚烷基 -NH-C(O)-苯基 -C CH^亚烷基 -0)n-d~C4亚烷基 -NH-或者 -d Cs亚烷基 -NH-C(O)-苯基 -C d C^亚烷基 -0)n-Ci~C4亚烷基 -NH-C C -C^CA亚烷基-三氮唑基 -d~C4亚烷基 -NH-; n为 0~4的整数， 优选 n为 2;
且， R3与 X中的苯基相连。
在本发明的进一歩实施方式中， 通式 I为如下的通式 II：
m为 0~7的整数； 优选地， m为 4;
R2通过连接部位 Y与苯环相连;
与苯环直接相连;
¥和 可以取代苯环的任意两个位置； 优选地， Y取代苯环的 2位， R3 取代苯环的 4位；
R2为生物素（biotin) , 或多肽标签： HA、 Flag, Myc、 His, 或荧光染料： 幾基荧光素 （ carboxyfluorescein， FAM )、 异硫氰酸荧光素 （Fluorescein isothiocyanate, FITC)、 四乙基罗丹明 （Rhodamine B)、 羧基四甲基罗丹明 ( carboxytetramethylrhodamine , TAMRA)、 花菁 ( cyanine )类染料 (如 Cy3、 Cy5等）以及 Alexa Fluro系列染料（如 Alexa Fluor 488、 Alexa Fluor 568等）；
R3为三氟甲基双吖丙啶基或苯甲酰基； 优选地， 为三氟甲基双吖丙啶 基。
Y 为 -C d C^亚烷基 -O d C^亚烷基 -NH-或者 -C d C^亚烷基 -0)n-Ci~C4亚烷基 -NH-C C -C^CA亚烷基-三氮唑基 -d~C4亚烷基 -NH-; n为 0~4的整数， 优选 n为 2。
在本发明 一个实施方式中， 通式 II为如下的通式 III：
III
其中：
n为 0~4的整数； 优选地， n为 2;
R2为生物素（biotin) , 或多肽标签： HA、 Flag, Myc、 His, 或荧光染料： 幾基荧光素 （carboxyfluorescein , FAM )、 异硫氰酸荧光素 （Fluorescein isothiocyanate, FITC)、 四乙基罗丹明 （Rhodamine B)、 羧基四甲基罗丹明 ( carboxytetramethylrhodamine , TAMRA)、 花菁 ( cyanine )类染料 (如 Cy3、 Cy5等）以及 Alexa Fluro系列染料（如 Alexa Fluor 488、 Alexa Fluor 568等）； 优选地， R2为 biotin、 HA、 Flag, Rhodamine B、 TAMRA、 Cy3、 Cy5、 Alexa
Fluro 488或 Alexa Fluor 568； 更优选地； R2为 biotin或 Alexa Fluro 488。 在本发明的另一实施方式中， 通式 II为如下的通式 IV：
R2为生物素（biotin) , 或多肽标签： HA、 Flag, Myc、 His, 或荧光染料： 幾基荧光素 （ carboxyfluorescein， FAM )、 异硫氰酸荧光素 （Fluorescein isothiocyanate, FITC)、 四乙基罗丹明 （Rhodamine B)、 羧基四甲基罗丹明 ( carboxytetramethylrhodamine , TAMRA)、 花菁 ( cyanine )类染料 (如 Cy3、 Cy5等）以及 Alexa Fluro系列染料（如 Alexa Fluor 488、 Alexa Fluor 568等）； 优选地， R2为 biotin、 HA、 Flag, Rhodamine B、 TAMRA、 Cy3、 Cy5、 Alexa Fluro 488或 Alexa Fluor 568； 更优选地； R2为 biotin, Rhodamine B或 HA。
在本发明的另一实施方式中， 结构式如通式 I所示的光亲和标记双功能 探针分子具体为：
根据通式 I中 X的定义， 通式 I可以表示为下式中的两类结构的化合物 la和 Ibo
R3
RrC广 C8亚烷基 -NH-C(O)-苯基 -C CrOt亚烷基 -0)n-C广 C4亚烷基 -NH-R2 la n为 0~4的整数
R3
R-C^Cs亚烷基 -NH-C(O)-苯基 -C C^^亚烷基 -C n-Cf^亚烷基 -NH- C -C^^亚烷基-三氮唑基 -Cf^亚烷基- ΝΗ"¾ |b n为 0~4的整数 化合物 la的制备： 化合物 Rrd Cs亚烷基 -NH-C(O)-苯基 (-R C d CA 亚烷基 -O CH^亚烷基 -NH2可由 Ri-CH^亚烷基 -NH2与 SuOOC-苯基 (-R C C^CA亚烷基 -O C^CA亚烷基 -NHBoc经缩合后再脱除 Boc保护基 得到。 Ri-C^Cs亚烷基 -NH2的合成可参考 Bioorgan. Med. Chem. 1999, 7: 2697-2704 以及专利文献 WO9709335A1 和 US5376684A, SuOOC-苯基 (-R C C^CA亚烷基 -O C^CA亚烷基 -NHBoc的合成可参考 Bioorgan. Med. Chem. 2010， 18: 3012~3019。 缩合反应在如下溶剂中进行： DMF、 CH2C12 或上述溶剂的混合溶剂； 反应加入 Et3N (三乙胺） 或 -Pr2NEt (二异丙基乙
基胺） 作碱； 通常反应温度为 0°C~60°C; 反应时间约需 1~24小时； 反应完 成后一般用 AcOEt、 Et20、 CH2C12或 CHC13等溶剂提取， 饱和食盐水洗， 经 干燥后， 低温减压除去溶剂， 浓缩物经柱层析纯化， 所得产物用 NMR等方 法来证明。 脱除 Boc保护基的反应在如下溶剂中进行： AcOEt、 C¾C12或上 述的混合溶剂，反应所需的酸通常为 HC1的 AcOEt溶液或 TFA (三氟乙酸）， 通常反应温度为 0°C~60°C; 反应时间约需 0.5~1小时； 反应完成后， 反应液 经减压浓缩， 即得目标产物， 直接用于下一歩反应。
探针分子 la可由 Rrd Cs亚烷基 -NH-C(O)-苯基 (- )-0-((^~(^4亚烷基 -O C^CA亚烷基 -NH2与 R2的活性酯经缩合反应得到。反应在如下溶剂中进 行： DMF、 CH2C12或上述溶剂的混合溶剂； 反应加入 Et3N或 -Pr2NEt作碱； 通常反应温度从 0°C~60°C; 反应时间约需 1~24 小时； 反应完成后一般用 AcOEt, Et20、 CH2C12、 CHC13等溶剂提取， 饱和食盐水洗， 经干燥后， 低温 减压除去溶剂， 浓缩物经柱层析得探针分子 la; 得到的产物用 NMR等方法 来证明。
化合物 lb的制备：化合物 Rrd Cs亚烷基 -NH-C(O)-苯基 (- )-0-((^~(^4 亚烷基 -O d C^亚烷基 -NH-C C -C^CA亚烷基 -叠氮基可由 Ri-C^Cs亚烷 基 -NH2 与 SuOOC-苯基（- )-0-((^~ 4 亚烷基
亚烷基 -NH-C(0)-Ci~C4亚烷基-叠氮基经缩合反应得到。 SuOOC-苯基 (- )-0-((^~(^4 亚烷基 -O C^CA亚烷基 -NH-C C -C^CA亚烷基-叠氮基的合成可参考 J. Med. Chem. 2008, 51: 3057-3060。 缩合反应在如下溶剂中进行： DMF、 CH2C12或 上述溶剂的混合溶剂； 反应加入 Et3N 或 -Pr2NEt 作碱； 通常反应温度为 0°C~60°C;反应时间约需 1~24小时；反应完成后一般用 AcOEt、 Et20、CH2Cl2 或 CHC13等溶剂提取， 饱和食盐水洗， 经干燥后， 低温减压除去溶剂， 浓缩 物经柱层析纯化， 所得产物用 NMR等方法来证明。
化合物炔基 - -C4亚烷基 -NH-R2可由炔基 -d-C4亚烷基 -NH2与 R2的活性
酯经缩合反应得到。缩合反应在如下溶剂中进行： DMF、 C¾C12或上述溶剂 的混合溶剂； 反应加入 Et3N或 -Pr2NEt作碱； 通常反应温度从 0°C~60°C; 反应时间约需 1~24小时； 反应完成后一般用 AcOEt、 Et20、 CH2C12或 CHC13 等溶剂提取， 饱和食盐水洗， 经干燥后， 低温减压除去溶剂， 浓缩物经柱层 析纯化， 所得产物用 NMR等方法来证明。
探针分子 lb可由 Rrd Cs亚烷基 -NH-C(O)-苯基 (- )-0-((^~(^4亚烷基 -O d C^亚烷基 -NH-C C -d C^亚烷基-叠氮基与炔基 -CrC4亚烷基 -NH-R2 经 Cu(I)催化的叠氮-炔 1, 3-偶极环加成反应得到。 Cu(I)通常在反应体系中由 VcNa还原 CuS04得到， 反应在如下溶剂中进行： MeOH、 EtOH、 ¾0或上 述溶剂的混合溶剂； 通常反应温度从 0°C~60°C; 反应时间约需 1~24小时； 反应完成后一般低温减压除去溶剂， 浓缩物经柱层析得探针分子 lb; 得到的 产物用 NMR等方法来证明。
根据本发明的第三个目的， 本发明提供了上述的结构式如通式 I所示的 光亲和标记双功能探针分子的用途。 本发明所述的探针分子可用于活细胞水 平对膜上 GABAB受体的标记、 示踪、 分析因激活或拮抗引起的胞内信号蛋 白的动态变化过程以及用于新靶点的发现和蛋白质谱的研究。
本发明的光亲和标记双功能探针分子具有以下的用途：
(1) 作为活性的 GABAB受体探针分子，可特异性标记细胞膜上的 GABAB 受体， 包括在原代神经细胞和过表达系统； 或
(2) 作为 GABAB受体特异性示踪剂； 或
(3) 作为特异性探针， 用于观察细胞膜内信号蛋白的变化情况以及用于 新靶点的发现和蛋白质谱的研究。 附图说明
图 1为光亲和标记探针分子的基本结构。
图 2为化合物 5影响细胞内磷酸肌醇产生量的定量测试结果。 图 3为化合物 5特异性标记细胞膜上 GABAB受体的 Western实验结果。 图 4为用化合物 7将 GABAB受体标记在拮抗状态， 在 GB2的激动剂
CGP7930刺激下，高特异性 Ca2+荧光指示剂 Fluo-3显示细胞内 Ca2+浓度随时 间变化的情况。
图 5为用化合物 5将 GABAB受体标记在拮抗状态， 在 GB2的激动剂 CGP7930刺激下细胞内信号蛋白 Akt和磷酸化 Akt随时间变化的情况。 具体实施方式
下列实施例说明被本发明所涵盖的探针分子及其设计、 制备、 应用， 但 这里仅仅是举例说明， 并不限制本发明。
制备实施例
制备实施例 1——化合物 5的制备
化合物 3的制备
ifiNMR (δ, ppm, CD3OD+CDCI3): 1.42-1.90 (10H, m), 1.72 (3H, ά, J = 6.3Hz), 2.89-3.01 (2H, m), 3.35-3.38 (4H, m), 3.53 ( 2H, m), 3.63 (2H, m), 3.69 (2H, m), 3.85 (2H, s), 3.89 (2H, m), 4.24 (1H, m), 4.35 (2H, m), 4.37 (1H, q, J = 6.9Hz), 6.80 (1H, s), 6.98 (1H, d, J = 8.4Hz), 7.47 (1H, t, J = 7.5Hz), 7.57 (1H, d, J = 7.2Hz), 7.99-8.08 (3H, m). HR-ESIMS: 实测值： 837.2897 [M+Na]+ (计算 值： 837.2924 [C34¾6F3N8O10P+Na]+); ESIMS: m/z = 815.0(M+H)+.
5
圆底烧瓶中加入化合物 3 ( 8mg， 9.82μιηο1) ,化合物 4 (2.8mg， 9.82μιηο1, 制备参考 Org. Lett., 2007, 11 : 2131-2134) 及甲醇 （2mL)， 搅拌溶解， 加入 CuS04溶液 （10mM， 222μΐ 体系 Ν2气置换， 换气完毕加入 VcNa水溶液 (222mM, 50μυ。 反应液室温避光搅拌 lh。 减压旋除溶剂后硅胶柱层析纯 化， CHCl3:MeOH:¾O=2: l :0.2洗脱得白色固体 8mg， 收率 74.7%。 ifiNMR (δ, ppm, CD3OD+CDCI3): 1.30-1.70 (19H, m), 2.24 (2H, t, J = 6.9Hz), 2.72 (1H, ά, J = 12.9Hz), 2.89-2.94 (3H, m), 3.20 (1H, m), 3.32 (2H, m), 3.37 (4H, m), 3.54 (2H, m), 3.64 (2H, m), 3.75 (2H, m), 3.90 (2H, s), 4.17-4.30 (4H, m), 4.40-4.50 (4H, m), 5.12 (1H, s), 6.86 (1H, s), 7.00 (1H, d, J = 9.0Hz), 7.51 (1H, m), 7.61 (1H, m), 7.90 (1H, s), 7.97 (1H, ά, J = 9.0Hz), 8.02 (1H, m). HR-ESIMS: 实 测 值 ： 1118.4067 [M+Na]+ ( 计 算 值 ： 1118.4122
[C47H65Nu012F3PS+Na] ); ESIMS: m/z
制备实施例 2—化合物 7的制备
化合物 6的制备
Rodamine B ( 500mg， 1.04mmol) 溶于干燥 DCM (25mL) , 搅拌条件下 依次加入 DCC (430mg， 2.08mmol)， HOBt (282mg, 2.08mmol)及炔丙胺 ( ΙΟΟμΙ^, 1.57mmol)。 反应液于室温搅拌 18h， 减压旋干溶剂后硅胶柱层析 纯化， PE:EA =4: 1洗脱得白色固体 311mg， 收率 61.8%。
ifiNMR (δ, ppm, CDC13): 1.15 (12H, t, J = 6.9Hz), 1.77 (IH, t, J = 2.4Hz), 3.34 (8H, q, J= 6.9Hz), 3.95 (2H, d, J= 2.4Hz), 6.28 (2H, d, J= 9.0Hz), 6.40 (2H: s), 6.48 (2H, d, J= 9.0Hz), 7.10 (IH, m), 7.43 (2H, m), 7.93 (IH, m). 13CNMR (δ, ppm, CDCI3) 12.72, 28.62, 44.54, 64.90, 70.15, 78.40, 97.91, 105.20, 108.11, 123.10, 123.90, 128.11, 129.21, 130.54, 132.75, 148.97, 153.60, 153.88, 167.48.
化合物 7的制备
ifiNMR (δ, ppm, CD30D+CDC13): 1.13 (12H, t, J = 6.9Hz) 1.40-1.80 (13H, m), 2.89 (2H, m), 3.31-3.34 (10H, m), 3.49 (2H, m), 3.54-3.60 (4H, m), 3.68 (4H, m), 3.87 (2H, s), 4.20-4.35 (3H, m), 4.35-4.50 (3H, m), 4.80 (1H, s), 6.22 (4H, m): 6.36 (2H, s), 6.78 (1H, s), 6.97 (1H, d, J = 7.5Hz), 7.09 (1H, d, J = 6.6Hz), 7.50 (3H, m), 7.65 (1H, m), 7.75 (1H, m), 7.90 (1H, m), 7.98 (1H, d, J = 7.5Hz), 8.12 (1H, m). HR-ESIMS: 实测值 1294· 5623 [M+H]+ (计算值 1294.5678 [C65H80NuO12F3P+H]+); ESIMS: w/z = 1316.4 (M+Na)+.
制备实施例 3—化合物 9的制备
化合物 8的制备
Fmoc-Tyr(tBu)-Pro-Tyr(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Pro-Asp(OtBu)-Tyr(OtBu)-Ala-OH ►
保护的 HA (200mg， 0.062mmol) 溶于干燥 DCM (3mL)， 搅拌条件下 依次加入 EDC (23.8mg, 0.125mmol) , Et3N ( 13mg， 0.138mmol) ， DMAP ( 1.5mg， 0.0125mmol) 及炔丙胺 （17.2mg， 0.312mmol)。 反应液于室温搅 拌 18h， 减压旋干溶剂后硅胶柱层析纯化， CHCl3:MeOH = 25:1洗脱得浅黄 色固体 78mg， 收率 76.2%。
ifiNMR (ό, ppm, CDC13): 0.94 (3H, ά, J = 6·6Ηζ), 0.98-1.06 (6H, m), 1.15-1.30 (27H, m), 1.33-1.48 (18H, m), 1.70-2.30 (9H, m), 2.52-3.33 (11H, m), 3.45-3.80 (5H, m), 3.85-4.70 (12H, m), 4.75-4.85 (1H, m), 5.69 (1H, t, J= 6.3Hz)
5.78 (1H, t, J = 7.2Hz), 6.76-7.00 (5H, m), 7.00-7.12 (3H, m), 7.12-7.22 (2H, m), 7.22-7.45 (5H, m), 7.45-7.67 (3H, m), 7.75 (2H, dd, J = 10.8, 8.1Hz), 7.90 (1H, dd, J= 15.6, 8.1Hz). ESIMS: m/z = 843.6 (M+2Na) 、2+
2
9的制备
o
Fmoc-Tyr(tBu)-Pro-Tyr(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Pro-Asp(OtBu)-Tyr(OtBu)-Ala
圆底烧瓶中加入化合物 3 ( 8mg， 9.8μιηο1)，化合物 8 ( 16.4mg， ΙΟ.ΟμιηοΙ) 及甲醇 （2mL)， 搅拌溶解， 加入 CuS04溶液 （10mM， 222μΐ 体系 Ν2气 置换， 换气完毕加入 VcNa水溶液 （222mM， 50 L)。 反应液室温避光搅拌 l h o减压旋除溶剂后硅胶柱层析纯化， CHCl3:MeOH:¾0=2: 1 :0.2洗脱得浅黄 色固体。 该浅黄色固体溶于 DCM ( 1.4ml) , 加入哌啶 （0.16ml)， 室温搅拌 2h， 反应液减压浓缩， CHCl3:MeOH:¾O=2: l :0.15洗脱得白色固体。 该白色 固体溶于 DCM ( 0.8ml) , 加入 TFA ( lml) 以及苯甲醚 （0.2ml)， 室温搅拌 12h， 反应液减压浓缩， CHCl3:MeOH:¾O=2: l :0.15洗脱得白色固体 5.6mg， 收率 29.9%。
ifiNMR (δ, ppm, CD3OD): 0.80-1.02 (6H, m), 1.20-1.40 (7H, m), 1.45-1.72 (7H, m), 1.72-1.92 (4H, m), 1.93-2.12 (4H, m), 2.56-2.80 (5H, m), 2.80-3.30 (12H, m), 3.44-3.55 (4H, m), 3.55-3.65 (4H, m), 3.65-3.70 (3H, m), 3.80-3.92
(4H, m), 4.10-4.60 (12H, m), 5.10 (2H, s), 6.63-6.76 (6H, m), 6.78 (1H, ά, J = 8.1Hz), 6.83 (1H, s), 6.95-7.10 (6H, m), 7.16 (1H, d, J = 8.7Hz), 7.53 (1H, t, J = 7.5Hz), 7.67 (1H, d, J = 7.5Hz), 7.88 (1H, d, J = 4.5Hz), 7.93 (1H, d, J = 8.1Hz), 8.04 (1H, ά, J = 7.2Hz), 8.14 (1H, s), 8.45 (1H, m). ESIMS: m/z = 1953.3 (M+Na)+.
制备实施例 4——化合物 13的制备
化合物 11的制备
化合物 1 ( 31mg， 0.076mmol) 溶于 2mL甲醇中， 加入化合物 10 (48mg， 0.084mmol， 制备参考 Bioorg. Med. Chem., 2010, 18: 3012-3019 ) 及 -Pr2NEt
( 55μ1， 0.33mmol)， 体系室温避光搅拌过夜， 减压旋干溶剂后， EA溶解， 有机层依次用 0.1N HCL 饱和食盐水洗涤， 无水硫酸钠干燥。 过滤， 浓缩， 硅胶柱层析纯化， CHCl3:MeOH:¾O=2: l :0-2: l :0.2梯度洗脱， 得无色油状物 38mg， 收率 60.0%。
ifiNMR (δ, ppm, CD3OD+CDCI3): 1.30-1.60 (18H, m), 1.60-1.80 (4H, m), 3.24 (3H, s), 3.51 (3H, s), 3.62 (3H, s), 3.67 (3H, s), 3.91 (3H, s), 4.27 (3H, s), 6.73 (1H, s), 6.84-6.96 (1H, m), 7.43 (1H, s), 7.50-7.88 (1H, m), 7.92-8.15 (2H, m), 8.26 (1H, s). ESIMS: m/z = 832.3(M+H)+.
化合物 13的制备
化合物 11 ( lOmg, 0.012mmol) 溶于 0.2ml TFA中， 0°C避光反应 5分 钟。 然后减压浓缩除去 TFA， 所得粗品溶于 0.3ml ¾0与 0.18ml C¾CN中， 室温搅拌下加入 8μ1 -Pr2NEt， 以及化合物 12 ( 21mg， 0.032mmol， 制备参考 专利 US006130101 ) , 室温避光搅拌过夜。 减压旋干溶剂后硅胶柱层析纯化， CH3CN:H20 = 4: 1洗脱， 含目标产物部分用 1% TFA/H20溶解后， 再经 C-18 反相硅胶纯化， MeOH:H2O=0:2-l :2梯度洗脱，所得红色固体与 0.1ml浓氨水、 5mg NaHC03和 0.5ml H20混合， 该溶液再经 Sephadex-LH20柱层析纯化， H20洗脱， 得红色固体 2.1mg， 收率 13%。
ifiNMR (δ, ppm, D20): 1.30-1.80 (13H, m), 3.10-3.30 (3H, m), 3.35-3.74 (9H, m), 3.90-4.00 (3H, m), 4.00-4.15 (3H, m), 6.60-6.90 (2H, m), 6.92-7.10 (1H, m), 7.26-7.54 (2H, m), 7.64-7.90 (2H, m). ESIMS: m/z = 1246.2(M-H)".
实验实施例
实验实施例 保持本身作为拮抗剂的活性以及特异性标记识别受体的 能力
1、 保持本身作为拮抗剂的活性
转染细胞的磷酸肌醇积累量测定是在 96孔版中进行的。 I X 107个人胚肾 细胞 HEK293转染野生型 GB 1 ( 4 μβ)和 GB2 ( 4 μβ)以及改进的 Gqi9 ( 2 μβ)
cDNA。 细胞用一定浓度的探针孵育 15min， 然后用 ΙΟμΜ 的 GABA刺激 30min。 磷酸肌醇信息数据用磷酸肌醇 /总量的比率来表示， 取三次独立实验 的平均值。抑制曲线拟合根据 Y = Bottom + (Top-Bottom) I (l+10A((LogIC50-X) X HillSlope))公式， 用 GraphPad PRISM软件进行计算分析。 Top和 Bottom 分别指实验中所测得的磷酸肌醇 /总量的比率的最大值和最小值， IC5Q是探针 抑制 GABA诱导的激活响应最大值和最小值间的中值， HillSlope是曲线的斜 率， 最大值和最小值分别在 Y轴上表现出来。
结果： 图 2为化合物 5影响细胞内磷酸肌醇产生量的定量测试结果。 在 共转染 GB1， GB2以及 Gqi9的 HEK293细胞中， 化合物 5可以抑制由 ΙΟμΜ GABA引起的 GABAB受体诱导的磷酸肌醇的生成， IC5Q为 1.03μΜ， 与拮抗 剂 CGP54626相当。
2、 特异性标记识别受体的能力
2.1单转染 GB1ASA HA、 GB1HA、 GB2Flag和共转染 GB1HA、 GB2Flag质粒的 HEK293细胞与 2 μΜ化合物 5孵育 2h， 同时用转染空质粒 PRK6的细胞作 为阴性对照。 然后 365nm紫外光照射 lh， 细胞用 HBS (pH 7.4) 洗涤两次以 除去过量的探针分子。将细胞转移至离心管中，加入冰浴冷却的细胞裂解液， 超声混匀， 然后 4 °C 在 12000rpm转速下离心 5min， 取出上清液， 将其分成 两份。 一份与 Avidin磁珠孵育， HBS (pH7.4)洗涤两次， 在磁珠上富集的蛋 白样品与另一份上清液用 SDS-PAGE分离， 然后转移至硝酸纤维素膜上， 用 5%脱脂奶粉和 0.1%吐温 20的 TBS溶液在室温下封闭 lh， 再与抗 HA或抗 Flag的抗体在 4°C孵育过夜，之后与连有辣根过氧化物酶的第二抗体孵育 2h， 免疫印迹用化学发光试剂检测， 用 X-射线胶片成像。
结果： 在单转染 GB1ASA HA、 GB1HA、 GB2Flag和共转染 GB1HA、 GB2Flag 质粒的 HEK293细胞中， 化合物 5可以特异性标记膜上的 GB1ASA HA亚基和 GBlHA+GB2Flag亚基， 经 Avidin磁珠亲和层析， 所标记的蛋白可以被抗 HA
或抗 Flag的抗体检测 （见图 3-a)。
2.2 小鼠的小脑颗粒神经元与 2 μΜ化合物 5孵育 2h， 然后 365nm紫外 光照射 lh， 细胞用 HBS (pH 7.4) 洗涤两次以除去过量的探针分子。 将细胞 转移至离心管中， 加入冰浴冷却的细胞裂解液， 超声混匀， 然后 4 °C 在 12000rpm转速下离心 5min， 取出上清液， 将其分成两份。 一份与 Avidin磁 珠孵育， HBS (pH7.4)洗涤两次， 在磁珠上富集的蛋白样品与另一份上清液用 SDS-PAGE分离，然后转移至硝酸纤维素膜上，用 5%脱脂奶粉和 0.1% 吐温 20的 TBS溶液在室温下封闭 lh， 再与抗 GB1或抗 GB2的抗体在 4°C孵育 过夜， 之后与连有辣根过氧化物酶的第二抗体孵育 2h， 免疫印迹用化学发光 试剂检测， 用 X-射线胶片成像。
结果： 在小鼠的小脑颗粒神经元中， 化合物 5可以特异性标记细胞膜上 的 GABAB受体， 经细胞裂解、 Avidin磁珠亲和层析， 所标记的 GABABB受 体的 GB1与 GB2亚基能分别被抗 GB1与抗 -GB2抗体检测 （见图 3-b)。
实验实施例 2: 标记活细胞膜表面受体实验
共转染野生型 GB1、 GB2 以及改进的 Gqi9 的 cDNA 的人胚肾细胞 HEK293与 10 μΜ 化合物 7以及 ΙμΜ高特异性 Ca2+荧光指示剂 Fluo-3AM孵 育 lh， 然后加入 10 μΜ GB2的激动剂 CGP7930, 用荧光显微镜观测不同时 间点细胞内荧光的颜色以及强度情况。
结果： 化合物 7可以特异性拮抗膜上的 GABAB受体， 该受体依旧可以 被 CGP7930激活并引起胞内 Ca2+浓度的变化 （见图 4)。
实验实施例 3 : 将 GABAB受体标记在拮抗状态下， 在激动剂刺激下研究 信号蛋白的变化情况。
小鼠的小脑颗粒神经元与 2 μΜ化合物 5孵育 2h， 然后 365nm紫外光照 射 lh， 细胞用 HBS (pH 7.4) 洗涤两次以除去过量的探针分子， 然后加入 CGP7930 (100 μΜ),在不同时间点裂解细胞，一半裂解液用 Avidin磁珠富集，
富集的蛋白与另一半裂解液用 SDS-PAGE分离，然后转移至硝酸纤维素膜上， 用 5%脱脂奶粉和 0.1% 吐温 20的 TBS溶液在室温下封闭 lh， 再与抗 Akt 或抗磷酸化 Akt的抗体在 4°C孵育过夜， 之后与连有辣根过氧化物酶的第二 抗体孵育 2h， 免疫印迹用化学发光试剂检测， 用 X-射线胶片成像。
结果：在小鼠的小脑颗粒神经元中，化合物 5与细胞预孵育使膜上的 GABAB 受体保持在拮抗状态， 再用作用于 GB2的激动剂 CGP7930刺激细胞， 激活 G蛋白并引起下游信号蛋白的变化。经温和裂解细胞、 Avidin磁珠亲和层析、 SDS-PAGE分离以及相应抗体检测， 可以发现化合物 5所标记的 GABAB受 体与其它蛋白形成的复合物中信号蛋白 Akt以及磷酸化 Akt的含量随着时间 变化 （见图 5 )。
Claims
1、 一类结构式如通式 I所示的光亲和标记双功能探针分子:
R-] X R2
οοό,ι R3
I
其中：
Ri为 Rla、 Rib或 Ric;
R2为生物素 biotin、 HA、 Flag, Myc、 His, 羧基荧光素 FAM、 异硫氰酸 荧光素 FITC、四乙基罗丹明 Rhodamine B、羧基四甲基罗丹明 TAMRA、 Cy3、 C 5、 Alexa Fluor 488或 Alexa Fluor 568
Rhodamine B TAMRA
Biotin Alexa Fluro 488 Alexa Fluro 568
R3为叠氮基、 三氟甲基双吖丙啶基、 苯甲酰基或二苯甲酮基；
X 为 -C^Cs亚烷基 -NH-C(O)-苯基 -0-((^~(^4亚烷基 -0)η-(^~(^4亚烷基 -NH-或者 -d Cs亚烷基 -NH-C(O)-苯基 -C d C^亚烷基 -0)η-(^~(^4亚烷基 -NH-C C -C^CA亚烷基-三氮唑基 -C^CA亚烷基 -ΝΗ-; n为 0~4的整数； 且， R3与 X中的苯基相连。
2、根据权利要求 1所述的结构式如通式 I所示的光亲和标记双功能探针 分子， 其中， 通式 I中：
Ri为 Ric;
R2的定义与权利要求 1相同；
为三氟甲基双吖丙啶基、 苯甲酰基或二苯甲酮基；
X的定义与权利要求 1相同。
3、根据权利要求 1或 2所述的结构式如通式 I所示的光亲和标记双功能 探针分子， 其中， 通式 I为如下的通式 II
m为 0~7的整数; Y 为 -C d C^亚烷基 -O d C^亚烷基 -NH-或者 -C d C^亚烷基 -0)n-Ci~C4亚烷基 -NH-C C -C^CA亚烷基-三氮唑基 -d~C4亚烷基 -NH-; n为 0~4的整数；
R2的定义与权利要求 2相同；
为三氟甲基双吖丙啶基或苯甲酰基。
4、根据权利要求 3所述的结构式如通式 I所示的光亲和标记双功能探针 分子， 其中， II为如下的通式 III：
III
其中：
n为 0~4的整数；
R2的定义与权利要求 3相同。
5、根据权利要求 4所述的结构式如通式 I所示的光亲和标记双功能探针 分子， 其中， 通式 III中：
n为 2;
R2为生物素或 Alexa Fluro 488。
6、根据权利要求 3所述的结构式如通式 I所示的光亲和标记双功能探针 分子， 其中， 通式 II为如下的通式 IV： 
IV n为 0~4的整数；
R2的定义与权利要求 3相同。
7、根据权利要求 6所述的结构式如通式
分子， 其中， 通式 IV中：
n为 2;
R2为生物素、 四乙基罗丹明或 HA。
8、根据权利要求 1所述的结构式如通式
分子， 该光亲和标记双功能探针分子具体为:
9、权利要求 1所述的结构式如通式 I所示的光亲和标记双功能探针分子 的用途： 所述光亲和标记双功能探针分子
(1) 作为活性的 GABAB受体探针分子， 特异性标记细胞膜上的 GABAB 受体， 包括在原代神经细胞和过表达系统； 或
(2) 作为 GABAB受体特异性示踪剂； 或
(3) 作为特异性探针， 用于观察细胞膜内信号蛋白的变化以及用于新靶 点的发现和蛋白质谱的研究。
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