JP2005509008A - Ptp1bの阻害剤およびリガンド - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、国立衛生研究所助成金番号GMS5242のもとで米国政府の支援によりなされた。米国政府は本発明に所定の権利を有する。
[(1)発明の分野]
本発明は、酵素のリガンドおよび阻害剤に関する。さらに特には、本発明は、酵素のリガンドおよび阻害剤を発見し評価する方法、および上記方法を用いて見い出されたタンパク質チロシンホスファターゼ1Bの特異的阻害剤に関する。さらに、本発明は、肥満およびII型糖尿病に対する治療のための、これらの阻害剤の使用方法に関する。
膨大な数の酵素について、酵素の阻害剤が知られている。それらは、研究目的に関してと同様に、治療応用に関しても有用である(例えば、引用文献42〜44を参照のこと)。改善された酵素の阻害剤が有用であろう酵素の重要なグループは、タンパク質チロシンホスファターゼである。
本発明は、酵素のリガンドおよび阻害剤の発見に有用な方法、ならびにタンパク質チロシンホスファターゼ1B(PTP1B)のリガンドおよび阻害剤を発見するためのコンビナトリアルライブラリを含むそれらの方法から結果として生じる組成物を指向する。種々の新規なPTP1Bのリガンドおよび阻害剤も、開示される。
略語:Ahx、6−アミノヘキサン酸;Boc、第3級ブトキシルカルボニル;BOP、ベンゾトリアゾール−1−イル−オキシ−トリス−(ジメチルアミノ)−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート;DAST、(ジエチルアミノ)サルファートリフルオリド;DIC、1,3−ジイソプロピルカルボジイミド;DIPEA、N,N−ジイソプロピルエチルアミン;DMA、N,N−ジメチルアセトアミド;DMAP、4−(ジメチルアミノ)ピリジン;DMF、N,N−ジメチルホルムアミド;DMSO、ジメチルスルホキシド;DTT、ジチオスレイトール;EDT、1,2−エタンジチオール;ELISA、酵素結合免疫吸着測定法;ESI−MS、電子スプレーイオン化−質量分光光度計;Fmoc、9−フルオレニルメトキシカルボニル;Fmoc−Osu、N−(9−フルオレニルメトキシカルボニルオキシ)スクシンイミド;HBTU、2−(1H−ベンゾトリアゾール−1−イル)−1,1,3,3−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート;HMPA、ヘキサメチルホスホルアミド;HPLC、高速液体クロマトグラフィ;HOBt、N−ヒドロキシベンゾトリアゾール;LHMDS、リチウムビス(トリメチルシリル)アミド;MOLDI−TOF、マトリクス支援レーザ脱離イオン化法−飛行時間型;MS、質量分光光度計;NMM、N−メチルモルホリン;NMR、核磁気共鳴;PTPアーゼ、タンパク質チロシンホスファターゼ;PTP1B、タンパク質チロシンホスファターゼ1B;pTyr、O−ホスホ−L−チロシン;PyBOP、ベンゾトリアゾール−1−イル−オキシ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート;TFA、トリフルオロ酢酸;TFFH、テトラメチルフルオロホルムアミジニウムヘキサフルオロホスフェート;THF、テトラヒドロフラン;TIS、トリイソプロピルシラン;TMSBr、ブロモトリメチルシラン;TMSI、ヨードトリメチルシラン;Tris、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン;TSTU、O−(N−スクシンイミジル)−1,1,3,3−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート。
(a)酵素の既知の活性部位のリガンドを、該化合物および該酵素の突然変異体と組み合わせる工程であって、ここで該突然変異体は該酵素の基質に結合することはできるが、該基質の化学変換を触媒することはできない工程、および
(b)該酵素の突然変異体への既知のリガンドの結合に対して該化合物が競合することが可能であるかどうかを決定する工程であって、ここで結合に対して競合する該化合物の能力によって、該化合物が該酵素のリガンドであることを示す工程を含む。
pTyr−含有ペプチドによるPTPアーゼの速度論的研究は、高親和性の結合にはpTyr(例えば、図1における化合物3の活性部位を標的とする成分)だけでは十分ではなく、pTyrを取り囲む残基が効率的な基質認識に寄与することを、以前に示した(12、13)。このことは、阻害剤の親和性および選択性を高めるために標的とすることができる活性部位に境を接してサブポケットがあることを示唆している。更に、PTPアーゼにおけるpTyr結合部位は、タンパク質キナーゼ類におけるATP部位より明らかに小さい。したがって、PTPアーゼ阻害剤の設計については、有効性および選択性を得るために、該活性部位の他に、隣接する周辺部位を考慮することが重要である。この実施例は、PTP1Bにおいて該活性部位および隣接する周辺部位の双方を標的とするように設計された新規のコンビナトリアルライブラリの構築を記載する。また、強力なPTP1Bのリガンドをスクリーニングするのに用いたELISAを基にした親和性選抜法の開発を記載する。PTPアーゼのパネルに対して数桁PTP1Bを優先する程の選択性を示す、極めて強力なPTP1Bの阻害剤が同定される(2.4nMのKi値を持つ)。以下の結果は、PTPアーゼの阻害についての有効性および選択性を達成することが実行可能であることを実証している。
[一般的な手順]
湿気に敏感な反応はすべて、乾燥したN2またはArの加圧のもと、オーブンで乾燥したガラス容器中で行った。湿気に敏感な反応のためのDMA、DMF、DMSO、LHMDS、CH2Cl2およびTHFは、シュア/シール(Sure/Seal(商標))瓶入りでアルドリッチ(Aldrich)から購入した。反応はすべて、その後にE.メルクのシリカゲル60F−254を用いたTLCを伴った。J.T.ベーカーのシリカゲル(230〜400メッシュ)を用いて、フラッシュカラムクロマトグラフィを行った。ペプチド合成用のBOP、DIC、HBTU、HOBt、ピペリジン、PyBOP、TFFHおよびTSTUは、アドバンストケムテック(Advanced ChemTech)から購入した。他に指示がない限り、299Kにて1H−NMR(300MHz)、13C−NMR(75.5MHz)、19F−NMR(282MHz)および31P−NMR(121MHz)によって、ならびにESI−MS解析によって、新しい化合物の構造を特徴付けた。
Fmoc保護したアミノ酸誘導体(アドバンストケムテックまたはノババイオケム(Novabiochem))のHBTU/HOBt/NMM活性化に関する標準のプロトコールを用いて、リンク(Rink)のアミド樹脂(アドバンストケムテック)上で、ペプチド(ビオチン化−カプロン酸−DADEpYL−アミドおよび7−ヒドロキシクマリン−カプロン酸−DADEpYL−アミド)を合成した。DMF中の1.5当量のTSTUおよび4当量のDIPEAにより、7−ヒドロキシクマリン−4−酢酸およびビオチン(アルドリッチ)を活性化した。第3級ブチルとして、AspおよびGluの側鎖を保護し、モノ−ベンジルエステルとして、pTyrのホスフェート基を保護した。樹脂に結合したアミンに対して3倍過剰の酸を用いて、1.5時間、DMF中でこのカップリング反応を行った。DMF中20%のピペリジンによって、Fmocの除去を行った。水中95%のTFAおよび2.5%のTISによって2時間、最終的な開裂および側鎖の脱保護を達成した。ろ過により該樹脂を除き、残った溶液を濃縮した。乾燥(dry:無水)ジエチルエーテルを添加し、沈殿したペプチドを遠心により回収した。該ペプチドを再懸濁させ、エーテルで2回洗浄し、水に溶解して、半調製用の逆相HPLCで精製した。MALDI−TOF MSおよび分析用HPLCで分析すると、ペプチドはすべて高い純度(>95%)で得られた。
Fmoc化学反応を用いて、シスタミン修飾したテンタゲルS NH2樹脂1上で、該ライブラリを合成した(14)(図4)。樹脂に結合したシスタミンのアミノ末端に、pTyrを結合させた(8g)。DMF中30%のピペリジンで5分間2回処理することによりFmocを除いた後、該樹脂をDMF、CH2Cl2、イソプロパノールおよびエーテルで洗浄し、次いで残りの溶媒を減圧して除いた。次の成分とのカップリングのために、20mLのポリプロピレンのろ過チューブ(スペルコ(Supelco))に、220mgの量で該樹脂を分配した。Fmocで保護した形態のライブラリにリンカーの多様性要素4〜25(図3)を組み込んだが(リンカーがない多様性要素26を除く)、これらは、市販されていたか、または市販のアミノ酸を1:1のTHF/10%Na2CO3中にてFmoc−Osuで処理することにより調製された。4mLのDMF中の6当量のアミノ酸、6当量のPyBOP、6当量のHOBtおよび12当量のNMMによる2時間の処理1回と15時間の処理1回とによって、カップリングを達成した。該ライブラリ合成に用いたpTyrのホスフェート基はモノ−ベンジルエステルとして保護し、AspおよびGluの酸性側鎖はt−ブチルエステルとして保護した。DMF中30%のピペリジンで5分間の処理を2回行うことで、N末端のFmoc基を脱保護した。次いで、該樹脂をDMF、CH2Cl2、イソプロパノールおよびエーテルで洗浄し、残りの溶媒を減圧して除いた。前記末端の多様性要素のカップリングまでの該ライブラリ合成の経過の間、無保護のアミンの置換レベルまたはFmocの放出を調べることにより、カップリング工程および脱保護工程をモニターした。次いで、各ろ過チューブからの樹脂を、5.0mgの量で、96穴合成ブロックの一列中の8ウエル中に分配した。500mLのDMF中、6当量の前記酸、6当量のTFFH、および12当量のDIPEAを用いた2時間のカップリング1回および15時間のカップリング1回によって、前記末端の多様性要素A〜H(図2)を該ライブラリに組み込んだ。フェニルホスフェート基を含有するそれらの酸は、ピリジン中での塩化ホスホリルによる処理を介した対応するフェノールのカルボキシルメチルエステルから調製され(15)、その後の塩基性の加水分解を行った。2,2’−ビピリジン−4,4’−二酸は、25%H2SO4中でのKMnO4による処理によって、4,4’−ジメチル−2,2’−ビピリジン(GFSケミカル(Chemicals))から調製された(16)。固相による組み立てが完了する際に、水中の90%TFAおよび5%フェノールによる1時間の処理を2回行うことによって、側鎖の脱保護を達成した。次いで、この得られた樹脂3(図1)をCH2Cl2、DMF、MeOHおよびH2Oで更に十分に洗浄し、その後500mLの50mMトリス緩衝液(pH8.0)中の10mMのDTTで3時間処理した。最後に、液相を96穴のレシーブプレートにろ過し、濃度0.1mM(各メンバーが完全に変換されたと仮定して)で空間的に分離されたライブラリメンバー3を得た。HPLCおよびMOLDI−TOF MS分析で評価して、高収率および高純度(約90%)にて、同じ手順を用いて、より大規模に幾つかのライブラリメンバーを再合成した。これらのライブラリメンバーには、サブユニットAと17(MOLDI−TOF MS、計算値[M]653、観測値[M−H]−652.8)とに由来する構造3、およびサブユニットCと6(MOLDI−TOF MS、計算値[M]633、観測値[M+H]+634.2)とに由来する構造3が包含される。
最初のELISAによるスクリーニングの結果に基づいて、該ライブラリの幾つかの高親和性のメンバーを選択し、上記のペプチド合成法に従って、リンクの樹脂上にて、チオールの尾部を持たないそれらの類似体を合成した。これらの化合物を再びこのELISA評価に付し、要素21とBとを有する最も高い親和性の化合物を、大規模に合成した。
1H−NMR(D2O):d7.4〜7.2(m,8H)、4.76(dd,J=6.0Hz,7.5Hz,1H)、4.68(dd,J=5.7Hz,9.0Hz,1H)、3.66(s,2H)、3.27(dd,J=5.7Hz,14Hz,1H)、3.04(dd,J=9.0Hz,14Hz,1H)、2.9(dd,J=6.0Hz,17Hz,1H)、2.7(dd,J=7.5Hz,17Hz,1H);13C−NMR(D2O):d175.8、174.9、174.3、172、151.2(d)、150.9(d)、132、130.8、130.74、130.72、121.06(d)、121.86(d)、54、50、41、36、35;31P−NMR(D2O):d−3.01、−3.03;MOLDI−TOF MS計算値[M]589、観測値[M+H]+590。
4−(ブロモメチル)フェニル酢酸27(1.5g、6.55ミリモル)のCH2Cl2溶液30mLに、ベンジルアルコール(10当量、6.8mL)およびDMAP(0.05当量、40mg)を添加した。次いで、この溶液を0℃に冷却し、DIC(520mL、0.5当量)を一滴ずつ添加した。室温にて6時間、この混合物を撹拌し、次いでロータリー・エバポレーターで容積を減らした。フラッシュカラムクロマトグラフィにより、白色の固形物28(1.0g、96%)を得た。1H−NMR(CDCl3):d7.4〜7.3(m,7H)、7.28(d,J=7.9Hz,2H)、5.1(s,2H)、4.5(s,2H)、3.7(s,2H);13C−NMR(CDCl3):d171、137、135、134、130、129、128.7、128.5、128.3、67、41、33。
テトラフルオロホウ酸銀(17)(2.3g、11.8ミリモル)を、乾燥DMSO(10mL)に溶解し、ベンジル4−(ブロモメチル)フェニルアセテート28(3.0g、9.4ミリモル)の乾燥DMSO溶液(10mL)をゆっくり添加した。この混合物を室温にて12時間撹拌し、次いでトリエチルアミン(2mL)を添加した。この混合物をさらに15分間保ち、次いでCH2Cl2/水による抽出に付した。ロータリー・エバポレーターにより有機相を濃縮し、フラッシュカラムクロマトグラフィにより精製して、白色の固形物29(1.96g、82%)を得た。1H−NMR(CDCl3):d10.0(s,1H)、7.8(d,J=8.3Hz,2H)、7.5(d,J=8.3Hz,2H)、7.3(m,5H)、5.1(s,2H)、3.8(s,2H);13C−NMR(CDCl3):d192、170、140、135.7、135.6、130.2、130.1、128.8、128.6、128.4、67.41。
−20℃にて、10mLのTHF中の水素化ナトリウム(77mg、3.2ミリモル)に、亜リン酸ジエチル(430mL、3.3ミリモル)を一滴ずつ添加した。この溶液を20分間撹拌した後、ベンジル4−ホルミルフェニルアセテート29(750mg、3.0ミリモル)のTHF溶液8mLを添加した。この溶液をさらに30分間撹拌し、10mLの5%NH4Cl溶液でこの反応を停止した。15mLの酢酸エチルで3回、この混合物を抽出し、有機相を飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、ろ過し、ロータリー・エバポレーターで濃縮した。続いてフラッシュカラムクロマトグラフィを行い、無色の油状物30(820mg、収率71%)を得た。1H−NMR(CDCl3):d7.4(dd,J=1.5Hz,7.9Hz,2H)、7.3〜7.2(m,7H)、5.1(s,2H)、5.0(d,J=11Hz,1H)、4.8(s,br、1H)、4.0(m,4H)、3.6(s,2H)、1.23(t,J=7.2Hz,3H)、1.19(t,J=7.2Hz,3H);13C−NMR(CDCl3):d171(d)、136.9(d)、135.8、133.6(d)、129(d)、128.6、128.2、128.1、127(d)、70(d)、67、63(m)、41、16(d);31P−NMR(CDCl3):d22.6。
ベンジル4−[(ジエチルホスホノ)ヒドロキシメチル]フェニルアセテート30(100mg、0.26ミリモル)の乾燥CH2Cl2(5mL)溶液に、260mgの活性化させたMnO2(85%、2.5ミリモル)を一度に添加した。この混合物を24時間撹拌し、次いで酸で洗浄したシリカゲルを通してろ過した。得られたろ液をロータリー・エバポレーターで留去し、真空下で乾燥して、無色の油状物としてケトホスホネート中間体を得た。さらに精製することなく、該油状物を0℃に冷却し、1mLのDAST(7.5ミリモル)を一滴ずつ添加した。室温にて、この溶液を6時間撹拌し、10mLのCH2Cl2で希釈した。0℃にて、15mLの飽和したNa2CO3溶液に、得られた溶液をゆっくり添加した。10mLのCH2Cl2で3回、この混合物を抽出し、有機層を合わせて、飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、ろ過し、ロータリー・エバポレーターで濃縮し、フラッシュカラムクロマトグラフィで精製して、31(45mg、43%)を得た。1H−NMR(CDCl3):d7.5(d,J=7.9Hz,2H)、7.4〜7.2(m,7H)、5.1(s,2H)、4.2(m,4H)、3.7(s,2H)、1.3(t,J=7.2Hz,6H);13C−NMR(CDCl3):d170、137、136、132(m)、129、128.8、128.7、128.5、128.4、128.3、128.2、126(m)、115(m)、67、65(d)、41、16(d);31P−NMR(CDCl3):d7.5(t,J=116Hz)。
氷水浴槽により、ベンジル4−[(ジエチルホスホノ)ジフルオロメチル]フェニルアセテート31(123mg、0.3ミリモル)を0℃に冷却し、この反応溶液に1mLのTMSI(7.0ミリモル)を添加し、その後、室温にて一晩撹拌した。ロータリー・エバポレーターにより、この溶液を油状残渣に濃縮し、1mLのアセトニトリル、1mLの水および0.5mLのTFAの混合溶液にそれを溶解し、2時間撹拌した。次いでこの溶液を乾燥するまでロータリー・エバポレーターで留去し、水に溶解してエーテルで洗浄した。この水溶液にHPLC精製を施して、所望の生成物32(28mg、35%)を得た。1H−NMR(D2O):d7.6(d,J=7.9Hz,2H)、7.4(d,J=7.9Hz,2H)、3.8(s,2H);13C−NMR(D2O):d176、136(d)、133(dt)、129、126(dt)、120(dt)、40;31P−NMR(D2O):d5.4(t,J=105Hz)。
−78℃にて、ヨードベンジルブロミド33(149mg、0.50ミリモル)とラクトン34(213mg、0.55ミリモル)とHMPA(1.5mL)とのTHF(15ml)溶液に、THF(550mL、0.55ミリモル)中1MのLHMDSを一滴ずつ添加した(18)。−78℃にて2時間撹拌した後、この混合物をEtOAcで希釈し、水および飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、ろ過し、ロータリー・エバポレーターにより溶媒を除いた。フラッシュカラムクロマトグラフィにより、所望のアリールヨウ化物33(242mg、80%)を得た。299Kにて、1:2の比率で2つの配座異性体が観測された;1H−NMR(CDCl3):d[主要な配座異性体]7.71(d,J=7.9Hz,2H)、7.43〜7.03(m,11H、重複している)、6.83(m,2H、重複している)、6.68〜6.62(m,2H、重複している)、6.53(d,J=7.5Hz,2H)、5.35〜5.25(m,2H、重複している)、5.20〜5.03(m,2H、重複している)、4.91(d,J=3.0Hz,1H)、4.51(d,J=3.0Hz,1H)、3.63(dd,J=6.8Hz,14Hz,1H)、3.47〜3.31(m,1H、重複している)、[副次的な配座異性体]7.63(d,J=7.9Hz,2H)、7.43〜7.03(m,11H、重複している)、6.83(m,2H、重複している)、6.72(d,J=7.5Hz,2H)、6.68〜6.62(m,2H、重複している)、5.35〜5.25(m,1H、重複している)、5.23(dd,J=3.4Hz,6.8Hz,1H)、5.20〜5.03(m,3H、重複している)、4.71(d,J=3.0Hz,1H)、3.47〜3.31(m,2H、重複している);ESI−MS計算値[M]603、観測値[M+H]+604。
ジエチルブロモジフルオロホスホネート(1.42mL、8ミリモル)のDMA(4mL)溶液で処理するのに先立って、DMA(4mL)中の亜鉛粉末(520mg、8ミリモル)を1時間超音波処理した(19)。超音波処理をさらに3時間継続し、次いで臭化第一銅(1.15g、8ミリモル)を一度に添加した。30分後、アリールヨウ化物35(2.40g、4ミリモル)のDMA溶液(4mL)を一滴ずつ添加し、得られた混合物を24時間撹拌し、EtOAcで希釈し、水および飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、ろ過し、ロータリー・エバポレーターによって溶媒を除去した。フラッシュカラムクロマトグラフィにより、所望のアルキル化ラクトン36(1.38g、52%)を得た。299Kにて、3:7の比率で2つの配座異性体が観測された。1H−NMR(CDCl3、299K):d[主要な配座異性体]7.82(d,J=7.9Hz,2H)、7.61〜7.23(m,11H、重複している)、7.01(d,J=7.9Hz,2H)、6.83(d,J=7.9Hz,2H)、6.68(d,J=7.9Hz,2H)、5.55〜5.43(m,1H、重複している)、5.33〜5.17(m,2H、重複している)、5.08(d,J=3.0Hz,1H)、4.61(d,J=3.0Hz,1H)、4.43〜4.19(m,4H、重複している)、3.93(dd,J=6.8Hz,14Hz,1H)、3.75〜3.55(m,1H、重複している)、1.44(m,6H、重複している)、[副次的な配座異性体]7.75(d,J=7.9Hz,2H)、7.61〜7.23(m,13H、重複している)、6.88(d,J=7.9Hz,2H)、6.78(d,J=7.9Hz,2H)、5.55〜5.43(m,1H、重複している)、5.43(dd,J=3.4Hz,6.8Hz,1H)、5.33〜5.17(m,2H、重複している)、4.85(d,J=3.0Hz,1H)、4.43〜4.19(m,4H、重複している)、3.75〜3.55(m,2H、重複している)、1.44(m,6H、重複している);19F−NMR(CDCl3、299K):d[主要な配座異性体]−108.58(d,J=115Hz)、−108.78(d,J=115Hz)、[副次的な配座異性体]−108.67(d,J=115Hz)、−108.83(d,J=115Hz);31P−NMR(CDCl3、299K):d7.2(t,J=115Hz);373Kでは配座異性体は観測されず;1H−NMR(DMSO、373K):d7.5(d,J=7.9Hz,2H)、7.4(d,J=7.9Hz,2H)、7.3〜7.0(m,11H)、6.9(d,J=7.2Hz,2H)、6.6(d,J=7.5Hz,2H)、5.8(s,1H)、5.2(d,J=3.0Hz,1H)、5.1(dd,J=4.9Hz,8.3Hz,1H)、5.0(s,2H)、4.1(m,4H)、3.58(dd,J=8.3Hz,14Hz,1H)、3.49(dd,J=4.9Hz,14Hz,1H)、1.256(t,J=7.2Hz,3H)、1.250(t,J=7.2Hz,3H);13C−NMR(DMSO、373K)d167、153、138、135.6、135.4、134、129、127.6、127.5、127.1、126.9、126.8、125.8、125.5(m)、115(m)、78、67、62(d)、60、58、15(d);19F−NMR(DMSO、373K):d−105.9(d,J=114Hz)、−106.2(d,J=114Hz);31P−NMR(DMSO、373K):d6.8(t,J=114Hz);ESI−MS計算値[M]663、観測値[M+H]+664。
10%Pd/C(200mg)のEtOH(4mL)とTHF(2mL)との懸濁液に、少量のMeOH中のアルキル化ラクトン36(20)(478mg、0.72ミリモル)を加えた。H2の雰囲気下で24時間、この混合物を撹拌し、次いでセライトを通してろ過した。乾燥するまで、ろ液をロータリー・エバポレーターで留去し、エーテルで3回粉砕し、次いで残渣を真空下に置き、所望のアミノ酸37(252mg、100%)を得た。1H−NMR(CD3OD):d7.6(d,J=7.9Hz,2H)、7.4(d,J=7.9Hz,2H)、4.2(m,5H)、3.3(dd,J=4.3Hz,14Hz,1H)、3.2(dd,J=8.7Hz,14Hz,1H)、1.326(t,J=7.2Hz,3H)、1.321(t,J=7.2Hz,3H);13C−NMR(CD3OD):d171、139、133(m)、131、128、117(m)、66(d)、55、37、16(d);31P−NMR(CD3OD):d7.1(t,J=118Hz)。
氷浴槽にて、アミノ酸37(535mg、1.5ミリモル)とNaHCO3(128mg、1.5ミリモル)との水(5mL)およびジオキサン(5mL)溶液を冷却し、次いで少量のジオキサン中のFmoc−OSu(720mg、2.1ミリモル)で処理した(20)。室温にて3時間撹拌した後、NaHCO3(30mL)でこの混合物を希釈し、次いでエーテルで洗浄した。水相を6NのHClでpH2に酸性化し、EtOAcで抽出した。この抽出物を硫酸ナトリウム上で乾燥し、ろ過し、溶媒を除いて、白色固形物(870mg、100%)としてFmocアミノ酸38を得た。比旋光度[a]D 24=44°(クロロホルム中でc=0.1)は、以前報告された値(20,21)と一致している。1H−NMR(DMSO):d7.9(d,J=7.2Hz,2H)、7.7〜7.3(m,10H)、4.2〜4.0(m,8H)、3.1(dd,J=4.5Hz,14Hz,1H)、2.9(dd,J=11Hz,14Hz,1H)、1.18(t,J=7.2Hz,3H)、1.17(t,J=7.2Hz,3H);13C−NMR(CDCl3):d173、156、144、142、139、131(m)、130、128、127、126、125、120、115(m)、67、65(d)、54、47、38、16(d);19F−NMR(CDCl3):d−109(d,J=118Hz);31P−NMR(CDCl3):d7.1(t,J=118Hz)。
酸のHBTU/HOBt/NMM活性化のための標準プロトコールを用いて、リンクのアミド樹脂上にて合成を行った。樹脂に結合したアミンに比べて3倍過剰の酸を用いて、DMF中にて1.5時間、このカップリング反応を行った。このリンクのアミド樹脂に、完全に保護されたFmocアミノ酸38と、Fmocで保護したAsp(側鎖は第3級ブチルで保護されている)と、無保護の酸32とを順にカップリングさせた。各カップリングの後、DMF中の20%ピペリジンでFmocの除去を達成した。5%EDTおよび1%m−クレゾールを伴ったTFA中1MのTMSBr−チオアニソールによる、0℃での5時間および次いで室温での16時間の処理によって、最終の開裂および側鎖の脱保護を達成した。ろ過により該樹脂を除き、残りの溶液を濃縮した。残渣をエーテルで粉砕し、水に溶解し、半調製用の逆相HPLCにより精製して、所望の化合物40を得た。1H−NMR(D2O):d7.6(m,4H)、7.4(m,4H)、4.7(m,2H)、3.7(s,2H)、3.3(dd,J=5.7Hz,14Hz,1H)、3.1(dd,J=9.4Hz,14Hz,1H)、2.9(dd,J=6.0Hz,17Hz,1H)、2.7(dd,J=7.9Hz,17Hz,1H);13C−NMR(D2O):d175、174.5、174.4、172、139、137、133(m)、129.69、129.63、126(m)、115(m)、54、50、42、37、35;19F−NMR(D2O):d−108.58(d,J=105Hz)、−108.66(d,J=105Hz);31P−NMR(D2O):d5.36(t,J=105Hz)、5.35(t,J=105Hz);ESI−MS計算値[M]657、観測値[M−H]−656、[M+H]+658。
ヒトの胎児の脳のcDNAライブラリ(ストラタジーン(Stratagene))のPCRを用いて、ヒトPTP1B(アミノ酸1〜321)の触媒ドメインをコードするcDNAを得た。用いたPCRのプライマーは、5’−AGCTGGATCCATATGGAGATGGAAAAGGAGTT(BamHI部位およびNdeI部位の双方をコードする)および3’−ACGCGAATTCTTAATTGTGTGGCTCCAGGATTCG(EcoRI部位をコードする)であった。このPCR産物を、BamHIとEcoRIとで消化し、pUC118ベクター中へとサブクローニングした。Cys215をSerに変換するのに用いたオリゴヌクレオチドプライマーは、5’−TGGTGCACTCCAGTGCAGG−3’であり、ここで下線を施された塩基が、天然のヌクレオチドからの塩基の変化を示した。PTP1B/C215S突然変異体のコード領域を、NdeIとEcoRIとによってpUC118−PTP1B/C215Sから切り出し、プラスミドpT7−7(22)の相当する部位に連結した。制限酵素NdeIにより、pT7−7/PTP1B/C215SからPTP1B/C215Sのコード領域を開裂させ、それに続いてDNAポリメラーゼIのクレノウ断片で処理して、平滑末端を持つ分子を生成させた。この線状化したDNAを、制限酵素EcoRIで再び消化した。制限酵素SmaI(平滑末端)およびEcoRI(付着末端)によって、ベクターpGEX−KGを開裂させた。PTP1B/C215Sの遺伝子を含有するpT7−7/PTP1B/C215SのNdeI(平滑)〜EcoRIのDNA断片、およびアンピシリン耐性をコードするpGEX−KGのSmaI(平滑)〜EcoRIの断片を単離し、一緒に連結した。
pGEX−KG/PTP1B(またはPTP1B/C215S)を用いて、常法によって大腸菌BL21(DE3)を形質転換させた。単一のコロニーを選択し、100mg/mLのアンピシリンを含有する10mLの2xYT培地で、37℃にて振盪しながら一晩増殖させた。10mLの一晩培養を、100mg/mLのアンピシリンを含有する1リットルの2xYT培地に移し、600nmでの吸収が0.6〜0.8になるまで、37℃にて振盪した。最終濃度0.2mMまでイソプロピル−1−チオ−b−D−ガラクトピラノシドを添加したのに続いて、37℃にてさらに4時間、振盪しながら該培養をインキュベートした。5,000rpmにて5分間遠心することによって細胞を回収し、1mMのジチオスレイトールと1%トリトンX−100を含む30mLのPBS緩衝液(140mMのNaCl、2.7mMのKCl、10mMのNa2HPO4、1.8mMのKH2PO4、pH7.4)中に、バクテリア細胞のペレットを再懸濁させた。1200p.s.i.にて2回、フレンチ圧力細胞プレス(French pressure cell press)を通すことによって該細胞を溶解した。15,000rpmにて30分間の遠心によって細胞の残骸を除き、上清を50mLの円錐型試験管に移し、PBS緩衝液で平衡化した2mLのグルタチオン−セファロース4B(アマシャムファルマシアバイオテック(Amersham Pharmacia Biotech))の50%スラリーをそこに添加した。緩やかに撹拌しながら4℃にて1時間インキュベートした後、マトリクスをカラムに移し、1mMのジチオスレイトールと0.1%トリトンX−100とを含む総容積の10倍のPBS緩衝液、および総容積の5倍の50mMのトリス(pH7.5)と1mMのジチオスレイトールとで洗浄した。室温にて該カラムを10分間静置した後、50mMトリス(pH8.0)中の総容積と同量の10mMの還元グルタチオンを添加することにより、この融合タンパク質を溶出させた。この溶出工程と回収工程とを5回繰り返した。この溶出液をプールし、セントリプレップ−30ろ過ユニット(アミコン(Amicon))により濃縮し、50mMの3’,3’−ジメチルグルタレート、1mMのEDTA、1mMのジチオスレイトールおよびI=0.15Mを含有するpH7.0の緩衝液に変更した。この精製したタンパク質を、30%グリセロールにして−20℃にて保存した。
前に記載したように、PTP1B(残基1〜321)(22)、イェルシニアPTPアーゼ(23)、Stp1(24)、VHR(25)およびMKP3(26)を大腸菌中で発現させ、精製した。ヒトT細胞のPTPアーゼ(TCPTP)の触媒ドメイン(アミノ酸残基1〜288)のコード配列は、ハリー・シャルボノー博士(Dr. Harry Charbonneau)によって供与され、記載されたようにTCPTPを発現させ、精製した(27)。組換えHePTPならびにSHP1およびSHP2の触媒ドメインを(His)6融合タンパク質として発現させ、精製した。組換えグルタチオンS−トランスフェラーゼ(GST)融合タンパク質として、PTPa、LARおよびCD45の触媒ドメインを発現させ、精製した(28)。PTPアーゼドメインを両方含有するPTPa、LARおよびCD45の細胞内断片を、トロンビンを用いて、記載された融合タンパク質から開裂された。
ニュートルアビジンをコーティングした96穴マイクロタイタープレートの各ウエルに、50mMの3,3−ジメチルグルタレート、pH7.0、I=0.15M(DMG緩衝液)中の10nMのビオチン化カプロン酸−DADEpYL−アミドを100μL添加した。4℃にて一晩インキュベートした後、該DMG緩衝液(各200μL)で3回、該プレートをすすいだ。2%のBSAと0.2%のTween20とを含有するDMG緩衝液溶液100μLで各ウエルをブロックし、室温にて2時間振盪した。次いで、0.2%のBSAと0.1%Tween20とを含有するDMG緩衝液(pH7.0)(BSA−T−DMG)溶液200μLで、これらのウエルを4回すすいだ。別個のコーティングしていない96穴プレートの各ウエルにて、60μLのライブラリ成分溶液(BSA−T−DMG中で500nM)および60μLのGST−PTP1B/C215S融合タンパク質溶液(BSA−T−DMG中で0.4nM)を混合し、室温で1時間インキュベートした。次いで、この混合物100μLを、ブロックした、ビオチン化カプロン酸−DADEpYL−アミド処理した96穴プレートの各ウエルに添加し、室温にて2時間、該プレートを振盪した。200μLのBSA−T−DMGで、これらのウエルを4回すすいだ。次いで、ポリクローナルのウサギ抗GST抗体(100μL、BSA−T−DMG中で100ng/mL)を各ウエルに加え、室温で1時間振盪した(または、4℃にて一晩インキュベートした)。200μLのBSA−T−DMG溶液で4回、これらのウエルを洗浄した。これらのウエルに残されたGST−PTP1B/C215Sの量を検出するために、西洋ワサビのペルオキシダーゼを結合したマウス抗ウサギ抗体(100μL、BSA−T−DMG中で200ng/mL)を各ウエルに加え、室温で1時間振盪した。200μLのBSA−T−DMGで4回、これらのウエルをすすぎ、次いで300mLのDMG緩衝液で2回すすいだ。100μLのペルオキシダーゼ基質(IステップターボTMB−ELISA、トリメチルベンジジン)を各ウエルに加え、5〜30分間インキュベートした。このペルオキシダーゼの反応を停止するために、100μLの1M硫酸溶液を各ウエルに添加し、スペクトラマックス(SpectraMax)340プレートリーダーにより450nmにてその吸収を測定した。
クマリン標識されたpTyrを含有するペプチド7−ヒドロキシクマリン−カプロン酸−DADEpYL−アミドは、高度に蛍光を発し、PTP1B結合に際して蛍光において有意な変化を示さない。したがって、前述したように(14)、平衡透析を介して7−ヒドロキシクマリン−カプロン酸−DADEpYL−アミドペプチドのPTP1B/C215Sへの結合に関するKd値を決定した。測定はすべて、50mMの3,3−ジメチルグルタレート(pH7.0、I=0.15M)緩衝液中で4℃にて行った。簡単に言えば、100nMのGST−PTP1B/C215Sおよび100nMの7−ヒドロキシクマリン−カプロン酸−DADEpYL−アミドを含有するスライドAライザー透析スライドカセット(ピアース、分子量10kDaで切断、許容量0.1〜0.5mL)を用いた。同一緩衝液中の100nMの7−ヒドロキシクマリン−カプロン酸−DADEpYL−アミド100mLを含有するビーカー中にこれらのカセット(最終容量400μL)を置いた。結果として、この透析実験を行っている間に亘って(16時間)、PTP1Bに結合していないペプチドの濃度は、この透析スライドカセット内で一定に保たれた。このスライドカセット内の溶液と該ビーカー内の溶液との間の蛍光の差異を決定した。このクマリンペプチドの励起波長は325nmであり、460nmにてその放射をモニターした。Kd値は方程式1から算出された:
Kp=([E]−[E・P])[P]/[E・P] (方程式1)
式中、Kp=PTP1B/C215Sに対する7−ヒドロキシクマリン−カプロン酸−DADEpYL−アミドのKd、[E]=PTP1B/C215Sの総濃度、[P]=7−ヒドロキシクマリン−カプロン酸−DADEpYL−アミドの総濃度、および[E・P]=PTP1B/C215Sに結合した7−ヒドロキシクマリン−カプロン酸−DADEpYL−アミドの濃度。
KL=Kp[L][E・P]/[P]/{[E]−Kp([E・P]/[P])−[E・P]} (方程式2)
式中、KL=PTP1B/C215Sに対する21BのKd、Kp=PTP1B/C215Sに対する7−ヒドロキシクマリン−カプロン酸−DADEpYL−アミドのKd、[E]=PTP1B/C215Sの総濃度、[P]=7−ヒドロキシクマリン−カプロン酸−DADEpYL−アミドの総濃度、[L]=21Bの総濃度、および[E・P]=PTP1B/C215Sに結合した7−ヒドロキシクマリン−カプロン酸−DADEpYL−アミドの濃度。
NaClの添加によりイオン強度を0.15Mに調整した、1mMのEDTAを含有する50mMの3,3−ジメチルグルタレート緩衝液(pH7.0)中、25℃にてp−ニトロフェニルホスフェート(pNPP)を基質として用いて、PTPアーゼの活性をアッセイした。種々の濃度のpNPPを含有する反応混合物(0.2mL)にこの酵素を添加することにより該反応を開始し、2、3分後、5NのNaOH0.05mLを添加することにより停止させた。用いた基質濃度の範囲は0.2〜5Kmであった。酵素を添加せずに対照を測定することにより、該基質の非酵素的加水分解を補正した。反応停止後、18,000M−1cm−1のモル励起係数を用いたスペクトラMAX340マイクロプレート用分光光度計(モレキュラーデバイス(Molecular Devices))により検出された405nmでの吸収から、生成物であるp−ニトロフェノールの量を決定した。非線形回帰プログラムKinetAsyst(ペンシルベニア州、州立大学、Intellikinetics)を用いて、ミカエリス・メンテン式に、基質濃度のデータに対する速度を直接当てはめることから、ミカエリス・メンテンの動態パラメータを決定した。以下の方式で、PTP1BおよびTCPTPに対するPTPアーゼ阻害剤の阻害定数を決定した。8つの異なった基質濃度(0.2Km〜5Km)での初速を、3つの異なって固定した阻害剤濃度にて測定した(15)。曲線の直接当てはめのプログラム、KINETASYST(ペンシルベニア州、州立大学、Intellikinetics)を用いて阻害定数を得て、阻害パターンを評価した。2mMのpNPP濃度にて、種々のホスファターゼに対するIC50値を決定した。
序論で述べたように、生化学的検討および遺伝子的検討により、PTP1Bはインスリン感受性および燃料代謝の主要な調節因子であることが示唆されている。したがって、PTP1Bは、II型糖尿病および肥満の治療について潜在的な治療上の標的を代表している。その結果、PTP1Bを阻害するように設計された小分子は、医薬剤として期待できるだけでなく、正常な細胞プロセスに関与する特異的な細胞内経路においてPTP1Bの役割を解明するためのプローブとして機能する可能性もあるであろう。しかしながら、大きな懸念の1つは、活性部位(すなわち、pTyr結合部位)が多数のPTPアーゼの間で高度に保存されているので、1つのPTPアーゼを選択的に標的とする阻害剤を得る可能性が極めて低いと思われることである。にもかかわらず、PTPアーゼ阻害剤の設計に対する最も有効なアプローチは、該活性部位を標的としている。
一方がpTyrを結合する触媒部位を標的とし、他方がPTP1Bにおいて隣接する固有の非触媒部位を標的とする、2つの連結したモチーフを含有するように、我々の第一世代のライブラリを設計した。加水分解可能ではないホスホネート類似体(下記参照)の調製に関連する合成上の必要事項が要求されるので、我々は、合成的に入手しやすいホスフェート系誘導体のライブラリを調製することが賢明であると感じた。後者からの高親和性の手がかり(リード)がいったん同定されると、次いでこのホスフェート部分をジフルオロホスホネート基で置換することにより、それを阻害剤に変換することができる。pTyrはPTPアーゼの活性部位に対する規範的なリガンドなので、ライブラリメンバーを該活性部位に向けるために我々は、pTyrで該ライブラリを構造的に偏向させることに決めた。該活性部位から移した結合相互作用に近づくために、構造的に異なるアリール酸(A〜H)(図2)の小さな一団を選択し、pTyrに連結した。これらのアリール酸には、3つのフェニルホスフェート含有種(A〜C)、3つのフェノール含有種(D〜F)、および2つの追加の芳香族種(G〜H)が包含される。この一団のアリール酸のメンバーは、別々に、直接(26)、または22の異なったアミノ酸(4〜25)(図3)を介してpTyrに連結されるが、9つの直鎖脂肪族種(4〜10、15、23)、11の環を含有する種(11〜14、16〜20、24〜25)、および2つの天然の酸性アミノ酸(21〜22)が包含される。リンカーとしての疎水性アミノ酸および荷電アミノ酸の包含が、追加の相互作用を潜在的に提供して、PTP1Bの結合を高める。確立されたアプローチ(材料および方法、ならびにその中の引用文献を参照のこと)を用いて、これらの構造物を用いて、固相並行合成(図4、スキームI)により、我々は、184種のメンバー[(pTyr)1×(リンカー)23×(多様性要素)8]の合成ライブラリを構築した。
この合成ライブラリのメンバーはアリールホスフェートなので、潜在的にPTPアーゼの基質として役目を果たす可能性がある。ホスファターゼ活性に基づいたアッセイにより、有効なPTPアーゼ基質を同定することができる(13、31)。しかしながら、最も高いkcat/Km値を特徴とする最も有効な基質は、必ずしもこの酵素に対する最も高い親和性を有するわけではない。我々の目標は、PTP1B阻害剤としての加水分解可能ではない類似体に引き続き変換することができる高親和性のPTP1B結合リガンドを同定することであった。したがって、我々は、化合物の適当なサイズのライブラリの高処理能力スクリーニングに採用しやすい親和性に基づいたアッセイを必要としていた。この目的で、我々は、PTP1Bによるライブラリメンバーのホスフェートの加水分解を回避する高親和性のPTP1Bの基質をスクリーニングするために、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)を開発した。このアッセイは、野生型の結合親和性を保持する、触媒的に不全な突然変異体のPTP1Bの使用を必要とする。我々は以前、活性部位Cys〜SerのPTPアーゼ突然変異体が測定可能なホスファターゼ活性を有さず(32)、PTP1B/C215S突然変異体が野生型酵素と同様の、基質に対する親和性を示すこと(33)を示している。我々はまた、六量体のpTyrを含有するペプチドDADEpYL−アミドが、高親和性のPTP1Bの基質であることも示している(30、33)。我々は、ビオチン化−カプロン酸−DADEpYL−NH2ペプチドを調製したが、それは、野生型PTP1Bと共にDADEpYL−NH2ペプチドについて報告されている動態パラメータと同様の動態パラメータを示す(データは示さず)ことを見出した。したがって、このアッセイでは、PTP1B/C215Sへの結合に対してビオチン化ホスホペプチドと競合するそれらの能力によって、これらのライブラリメンバーの結合親和性を評価した。
このELISA系スクリーニングのプロトコールは、250nMの濃度で固定したライブラリメンバーを使用し、二連一組で行った。この親和性に基づいたスクリーニングによって、我々は、ビオチン化DADEpYL−NH2ペプチドからGST−PTP1B/C215Sを効果的に置き換える幾つかのリード化合物を同定することができた。図7にグラフで描かれた結果から、幾つかの要点が明らかである。第1に、天然のアミノ酸11、13、21、22および24は、最も効果的なリンカーとして役目を果たす。例えば、Aspを含有するライブラリメンバー(図7Cにおける21A〜21H)は、すべて有意な阻害有効性を示している。興味深いことに、これらのリードリンカーは、疎水性残基(11、13、24)と負に荷電した残基(13、21、22)の混合物である。このリンカーの位置は、活性部位に向いたPTPアーゼペプチド/タンパク質基質におけるP−1位(すなわち、pTyrのアミノ側)と等しい。我々は以前、PTP1Bが、疎水性残基または負に荷電した残基を該P−1部位に収容できるような、異なった構造変化を受けることを明らかにした(9)。第2に、最も効果的なPTP1Bリガンドの内の2つ(21Bおよび24B)は、同一のN−末端要素、リン酸化されたフェニル酢酸部分Bを含有する。最後に、単一のメチレン基だけが異なる密接に関係した要素(AおよびC)がリードBより効果が低いという事実を考えると、PTP1Bは、該N−末端要素の構造的性質に明らかに非常に敏感である。
7−ヒドロキシクマリン−カプロン酸−DADEpYL−NH2ペプチドにおけるN末端に付加されたクマリン部分に関係する固有の蛍光は、GST−PTP1B/C215Sの存在下で有意に変化しなかった。この特性によって、我々は、スライド−A−ライザーカセット(材料および方法を参照のこと)を用い、平衡透析を介してこのクマリン誘導体に関する解離定数を決定することができた。PTP1B/C215Sへの7−ヒドロキシクマリン−カプロン酸−DADEpYL−NH2の結合に関するKd値は、pH7.0および4℃にて420±20nMである。これは、pH7.0および25℃にて等温滴定熱量測定により決定されたPTP1B/C215Sに対するAc−DADEpYL−NH2の結合に関するKd値(800±100nM)に似ている。同じ手順を用いて、この透析実験において、7−ヒドロキシクマリン−カプロン酸−DADEpYL−NH2ペプチドを置き換えるその能力から、リード化合物21Bに関するKd値を決定することができる。平衡透析により得られた化合物21Bに関するKd値は32±5nMであり、それは該ELISAアッセイにより決定された親和性(表1、〜30nM)に一致している。
上記のように、我々は、184メンバーの空間的に分離したライブラリから、最も強力なPTP1B結合リガンドとして、要素21Bを有する化合物を同定した。次に、我々は、21Bの加水分解できない類似体が、強力でかつ選択的なPTP1B阻害剤として役立つことができるかどうかを評価した。Burkeおよびその共同研究者らは、PTPアーゼの基質においてアリールホスフェート基を加水分解に耐性のジフルオロホスホネート部分で置き換え、有効なPTPアーゼ阻害剤を生産することができることを示した(34、35)。例えば、ヘキサペプチドDADEpYL−NH2において、ホスホノジフルオロメチルフェニルアラニン(F2Pmp)がpTyrに取って代わると、F2Pmp(PTP1Bに対して200nM)を持つ得られたペプチドに関するKiは、ホスホノメチルフェニルアラニン(Pmp)を含有する同じペプチドよりも1000倍以上強力である(33、34、36)。これは、これらのフッ素原子とPTP1Bの活性部位の残基との間での直接的な相互作用によるものと考えられてきた(36)。したがって、我々は、21Bにおけるエステル酸素をこのジフルオロメチレン基で置き換えることを決定した。
25℃にて、1mMのEDTAを含有し、イオン強度が0.15MであるpH7.0の50mMの3,3−ジメチルグルタレート緩衝液中で(詳細は材料および方法を参照のこと)、PTP1Bが触媒するpNPPの加水分解反応における、加水分解に耐性の化合物40の効果を調べた。化合物40は、PTP1Bの反応を可逆的に阻害し、この阻害の様式は、その基質に関して競合的である(データは示さず)。40によるPTP1Bの阻害に関するKi値は、2.4±0.2nMである。低いnMの範囲にKiまたはIC50値を持つPTP1B阻害剤は、以前から報告されていた(37、38)。しかしながら、それらの測定は、低い、したがって生理的でないイオン強度で行われた。該阻害剤とPTP1Bの活性部位との間の相互作用の静電気的性質によって、低いイオン強度での測定は、これらの化合物の結合親和性を過大評価することがあることが起こりうる。これを支援して、我々は、酵素阻害および等温滴定熱量測定によって、我々の生理的に関連した条件(0.15Mのイオン強度)下にて測定したPTP1Bに関するヘキサペプチドDADE(F2Pmp)L−NH2のKi値およびKd値がそれぞれ、250nMおよび240nMであることを言及する(33)。それに対して、以前報告された低いイオン強度の条件(50mMのHepes(ヘペス)、5mMのDTTおよび10mg/mLのBSA緩衝液中にてpH7.3)で得られた、同一ペプチドに関するKi値は26nMである(37)。さらに、類似の低いイオン強度条件下(50mMビス−トリス、2mM EDTA、および5mM DTT緩衝液中にてpH6.3)での同一ペプチドのIC50値は30nMである(38)。双方の場合におけるイオン強度は0.15Mよりもはるかに低いので、該ヘキサペプチドの報告されたPTP1Bとの親和性において何故矛盾が存在するのかは理解可能である。この見かけの結合親和性における塩濃度の重要性をさらに実証するために、我々は、その他のグループが用いたのと同一の低い塩条件下でも、化合物40のKi値を測定した。我々は、PTP1Bに関する40のKiが、50mMヘペス、5mM DTTおよび10mg/mL BSA緩衝液中にてpH7.3にて測定した場合、0.14±0.01nMであることを見い出した。同様に、50mMビス−トリス、2mM EDTA、および5mM DTT緩衝液中でpH6.3にて測定した場合、PTP1Bに関する40のKiは0.63±0.09nMである。これらの結果は、PTPアーゼのリガンドの阻害特性の意味のある比較を確実に行うには、アッセイのイオン強度を制御することが重要であることを強調している。まとめると、我々の結果は、化合物40が現在までに同定されている最も強力なPTP1B阻害剤であることを示している。
要約すると、我々は、PTPアーゼの活性部位および隣接する保存されていない周辺部位の双方を同時に占有するように設計されたアリールホスフェート類のライブラリの並行合成を記載してきた。触媒的に不活性のPTP1B/C215S突然変異体を用いた、親和性に基づいたELISAスクリーニング法によって、PTP1Bに結合する強力なリガンド、化合物21Bを同定するに至った。21Bの加水分解できないジフルオロホスホネート類似体40への変換によって、現在までに報告されている最も強力でかつ選択的なPTP1B阻害剤を生産した。この結果は、それが強力で、なお高度に選択的なPTPアーゼ阻害剤を獲得することの実行可能性を実証しているので、PTPアーゼ阻害剤の開発において概念実証として役立つ。40のようなPTPアーゼ阻害剤は、シグナル伝達経路において特定のPTPアーゼが演じる正確な役割を分析するのに有用であることが分かるだけでなく、治療上有用な物質の基となるであろう分子上の基礎を提供するはずである。
[PTP1B阻害剤の生物学的効果]
実施例1は、高度に強力なPTP1B阻害剤、化合物40を記載している。化合物40は、PTP1Bに関して2.4nMのKi値を示し、PTP類のパネルに対して数桁PTP1Bを優先させる程の選択性を示す。生体内での化合物40の効果を評価するために、我々は、40の膜透過性を高めるために、化合物40の類似体40A、40B、および40Cを調製した(図9)。化合物40Aおよび40Bには、脂肪酸への化合物40の共役が関与し、一方、化合物40Cには、ポリArgペプチドへの化合物40の結合が関与する。我々は、このステアリン酸部分またはこのポリArgペプチドが化合物40の有効性および選択性に影響を与えないことを見い出した。さらに、化合物40Bおよび40Cは、例えば、細胞の中において、それらの化合物の視覚化を可能にするために共有結合したローダミン分子を包含する。
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Claims (49)
- 活性部位を標的とする成分と、リンカー成分と、周辺部位を標的とする成分とを含む化合物であって、前記リンカー成分は前記活性部位を標的とする成分に共有結合し、前記周辺部位を標的とする成分は前記リンカー成分に共有結合し、ここで前記活性部位を標的とする成分は図1の化合物3の場合のような式を有し、およびここで前記リンカー成分および前記周辺部位を標的とする成分は各々、500ダルトン未満の任意の有機分子である化合物。
- 図1の化合物3を含み、ここでXおよびYが独立して500ダルトン未満の任意の有機分子であり、およびここで該化合物は少なくとも1つのホスフェート基(H2PO4)をさらに含む、請求項1に記載の化合物。
- 前記リンカー成分は炭素、酸素、窒素および/または水素から成り、前記周辺部位を標的とする成分は芳香環を有して炭素、酸素、窒素、リンおよび/または水素から成る、請求項1または2に記載の化合物。
- 前記化合物はタンパク質チロシンホスファターゼ1B(PTP1B)のリガンドである、請求項1ないし3のいずれか1項に記載の化合物。
- 前記リンカー成分が図3の要素4〜26より成る群から選択される、請求項1ないし4のいずれか1項に記載の化合物。
- 前記リンカー成分は、図3の要素11、13、21、22および24より成る群から選択される、請求項5に記載の化合物。
- 前記周辺部位を標的とする成分は、図2の要素A〜Hより成る群から選択される、請求項1ないし6のいずれか1項に記載の化合物。
- 前記周辺部位を標的とする成分は、図2の要素A、B、C、FおよびHより成る群から選択される、請求項7に記載の化合物。
- 前記化合物はさらに脂肪酸部分を含む、請求項1ないし8のいずれか1項に記載の化合物。
- 前記脂肪酸部分は少なくとも6炭素を含む、請求項9に記載の化合物。
- 前記脂肪酸部分は少なくとも10炭素を含む、請求項9に記載の化合物。
- 前記脂肪酸部分は15炭素を含む、請求項9に記載の化合物。
- 前記化合物はさらにポリアルギニン部分を含む、請求項1ないし8のいずれか1項に記載の化合物。
- 前記ポリアルギニン部分は少なくとも4つのアルギニンを含む、請求項13に記載の化合物。
- 前記ポリアルギニン部分は8つのアルギニンを含む、請求項13に記載の化合物。
- 前記化合物は検出可能な部分をさらに含む、請求項1ないし15のいずれか1項に記載の化合物。
- 前記検出可能な部分は蛍光部分である、請求項16に記載の化合物。
- 前記検出可能な部分はローダミンである、請求項16に記載の化合物。
- 活性部位を標的とする成分と、リンカー成分と、周辺部位を標的とする成分とを有する、タンパク質チロシンホスファターゼ1B(PTP1B)のリガンドであって、該リガンドは図1の化合物3の式を含み、前記リンカー成分および前記周辺部位を標的とする成分はそれぞれ、図3および図2の以下の要素:4A、4B、4C、4E、4F、5A、5B、5C、5F、6A、6B、6E、6F、6H、7A、7B、7C、7E、7F、7H、8A、8B、8C、8F、8H、9A、9B、9C、9F、9H、10A、10B、10C、10F、10H、11A、11B、11C、11D、11E、11F、11G、11H、12A、12B、12C、12F、12G、12H、13A、13B、13C、13D、13E、13F、13G、13H、14A、14B、14C、15A、15B、15C、15E、15F、15H、16A、16B、16C、16F、16H、17A、17B、17C、17E、17F、17H、18A、18B、18C、18E、18F、18G、18H、19A、19B、19C、19F、20A、20B、20C、20E、10F、20G、20H、21A、21B、21C、21D、21E、21F、21G、21H、22A、22B、22C、22D、22E、22F、22G、23H、24A、24B、24C、24D、24E、24F、24G、24H、25F、26A、26B、26C、26E、26F、26Gおよび26Hより成る群から選択され、該リガンドは少なくとも1つのホスフェート基を含むリガンド。
- 前記リンカー成分は図3の要素21および24より成る群から選択され、前記周辺部位を標的とする成分は図2のBである、請求項19に記載のリガンド。
- 前記リンカー成分は図3の要素21であり、前記周辺部位を標的とする成分は図2のBである、請求項19に記載のリガンド。
- さらに脂肪酸部分を含む、請求項19ないし21のいずれか1項に記載のリガンド。
- さらにポリアルギニン部分を含む、請求項19ないし21のいずれか1項に記載のリガンド。
- 検出可能な部分をさらに含む、請求項19ないし21のいずれか1項に記載のリガンド。
- 活性部位を標的とする成分と、リンカー成分と、周辺部位を標的とする成分とを有するタンパク質チロシンホスファターゼ1B(PTP1B)の阻害剤であって、該阻害剤は請求項19ないし24のいずれか1項のリガンドを含み、前記少なくとも1つのホスフェート基はジフルオロホスホネート基で置換される阻害剤。
- 図9の40、40A、40Bおよび40Cより成る群から選択される化合物より成る、請求項25に記載の阻害剤。
- 薬学上許容可能な賦形剤中に、請求項25または26のPTP1B阻害剤を含む組成物。
- 患者における肥満を治療する方法であって、請求項27の組成物を該患者に投与することを含む方法。
- 患者における肥満を予防する方法であって、請求項27の組成物を該患者に投与することを含む方法。
- 患者におけるII型糖尿病を治療する方法であって、請求項27の組成物を該患者に投与することを含む方法。
- 患者におけるII型糖尿病を予防する方法であって、請求項27の組成物を該患者に投与することを含む方法。
- 前記賦形剤はリポソームを含む、請求項28ないし31のいずれか1項に記載の方法。
- PTP1Bの活性を阻害する方法であって、PTP1Bを請求項25または26の阻害剤に接触させることを含む方法。
- 前記PTP1Bは生存細胞の中にある、請求項33に記載の方法。
- 前記細胞は生存脊椎動物の中にある、請求項34に記載の方法。
- 前記脊椎動物は哺乳類である、請求項35に記載の方法。
- 前記哺乳類はヒトである、請求項36に記載の方法。
- 化合物が酵素のリガンドであるかどうかを評価する方法であって、
(a)該酵素の既知の活性部位のリガンドを、該化合物および該酵素の突然変異体と組み合わせ、ここで該突然変異体は該酵素の基質に結合できるが、該基質の化学変換を触媒することはできない工程、および
(b)該酵素の該突然変異体への既知のリガンドの結合に対して、該化合物が競合することができるかどうかを決定し、ここで結合に対して競合する該化合物の能力が、該化合物が該酵素のリガンドであることを示す工程を含む方法。 - 前記工程(a)は、
(i)固体表面に前記既知のリガンドを結合する工程、および
(ii)前記化合物および前記突然変異体を該固体表面に結合した該既知のリガンドと組み合わせる工程を含む、請求項38に記載の方法。 - 前記固体表面は、化合物がリガンドであるかどうかを評価するための1つより多くの領域を含む、請求項39に記載の方法。
- 前記固体表面はマイクロタイタープレートのウエルである、請求項40に記載の方法。
- 前記基質に対する前記突然変異体の結合量を定量することによって、結合に対して競合する前記化合物の能力を決定し、ここで該突然変異体が標識されている、請求項38に記載の方法。
- 前記標識は抗原、放射活性のある原子、または蛍光分子より成る群から選択される、請求項42に記載の方法。
- 前記標識は抗原であり、ここで該抗原は該抗原に特異的な抗体を用いて定量される、請求項43に記載の方法。
- 前記酵素はタンパク質チロシンホスファターゼである、請求項38ないし44のいずれか1項に記載の方法。
- 前記酵素はタンパク質チロシンホスファターゼ1B(PTP1B)である、請求項45に記載の方法。
- 前記酵素はヒトPTP1Bである、請求項46に記載の方法。
- タンパク質チロシンホスファターゼのリガンドを発見するためのコンビナトリアルライブラリであって、1つより多くの形態の図1の化合物3を含み、ここでXおよびYは各々独立して500ダルトン未満の任意の有機分子である、コンビナトリアルライブラリ。
- Xは炭素、酸素、窒素および/または水素から成り、Yは芳香環を有して炭素、酸素、窒素、リンおよび/または水素から成る、請求項48に記載のコンビナトリアルライブラリ。
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