CN117500527A - 抗体药物偶联物及其制备方法和用途 - Google Patents

抗体药物偶联物及其制备方法和用途 Download PDF

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Abstract

本申请提供一种抗体药物偶联物及其制备方法和用途，其具有式Ab‑[M‑L‑E‑D]x所示结构，所述药物选自抗微管蛋白剂、DNA嵌入剂、DNA拓扑异构酶抑制剂和RNA聚合酶抑制剂，制得的抗体药物偶联物具有较优的药物抗体偶联比，对结肠癌、非小细胞肺癌(例如，肺腺癌)具有很好的靶向杀伤效果。

Description

抗体药物偶联物及其制备方法和用途
本申请是以CN申请号为202110615214.X，申请日为2021年6月2日，以及CN申请号为202110941134.3，申请日为2021年8月16日的申请为基础，并主张其优先权，该CN申请的公开内容在此作为整体引入本申请中。
技术领域
本申请涉及靶向治疗领域，具体涉及一种用于治疗ROR1高表达癌症的抗体药物偶联物。具体地，本申请提供了人源化的ROR1抗体，其对ROR1阳性细胞具有优良的结合活性，可将药物高效递送至个体中ROR1高表达细胞。本申请还提供了用于偶联至所述抗体的药物-连接体分子，所述药物选自抗微管蛋白剂、DNA嵌入剂、DNA拓扑异构酶抑制剂和RNA聚合酶抑制剂。制得的抗体药物偶联物具有较优的药物抗体偶联比，对结肠癌，胃癌，乳腺癌，肺癌(例如，非小细胞肺癌，具体如肺腺癌)，和淋巴癌具有很好的靶向杀伤效果。因此，本申请进一步提供所述抗体药物偶联物的制备方法及其在治疗ROR1高表达癌症中的应用。
背景技术
癌症是由健康细胞的恶性转化引起的一类疾病，由遗传改变引起，如染色体易位，肿瘤抑制基因、生长因子受体中的突变，导致细胞恶性增殖。有缺陷的凋亡或程序性细胞死亡进一步促进了导致癌症的细胞恶性转化。
ROR1(Receptor Tyrosine kinase-like Orphan Receptor 1，受体酪氨酸激酶样孤儿受体(ROR)家族成员1)，或神经营养酪氨酸激酶受体相关1(NTRKR1)，为受体酪氨酸激酶样孤儿受体(ROR)家族的成员，也称为酪氨酸蛋白激酶跨膜受体，属于I型膜蛋白。
胞外区域包含免疫球蛋白(IgG)样结构域、CRD或卷曲蛋白结构域、Kringle结构域。胞内区从膜向胞内分别为假激酶结构域、富含丝氨酸/苏氨酸结构域1、富含脯氨酸结构域、富含丝氨酸/苏氨酸结构域2。
生理条件下，ROR1在胚胎发育过程中高表达，在调节胚胎的肌肉和骨骼发育中具有重要作用。近年来研究发现，ROR1在脂肪组织、胰腺、肺、少量B前体细胞中也有极少量表达，而在多种肿瘤组织中呈现高表达。研究表明，ROR1能够与配体分子Wnt5a(主要)或EGF结合，参与调节细胞增殖、存活与迁移。ROR1过表达与肿瘤不良预后相关，研究发现靶向ROR1能有效抑制移植瘤的生长。
目前临床在研ROR1靶点适应症涵盖了血液瘤和实体瘤。主要的治疗策略集中在单抗、CAR-T、抗体偶联药物(ADC)等几个方向。其中Anti-ROR1抗体偶联药物，目前国际在研3项，2项进入临床研究阶段(1项II期(VLS-101)，1项I/II期(NBE-002))治疗MCL、BCL、NHL、NSCLC、TNBC等，3项处于临床前/发现阶段。在研公司包括VelosBio，NBE-Therapeutics，LegoChem Biosciences，Almac等。
其中ADC药物由抗体、生物活性分子及连接体(Linker)组成。生物活性分子通过连接体共价偶联到抗体上；抗体(例如单克隆抗体)能够特异性识别肿瘤细胞表面的特异性靶点，进而能够引导ADC到达癌细胞表面，并使ADC通过细胞内吞效应进入癌细胞；然后生物活性分子在癌细胞内释放，达到杀灭癌细胞而尽量不损伤正常组织细胞的作用。
关于Anti-ROR1抗体偶联药物国际临床进展，VelosBio公司开发的VLS-101临床进展最快，采用马来酰亚胺接头(MC)，缬氨酸-瓜氨酸(Val-Cit)酶切linker，微管蛋白抑制剂MMAE为毒素，非定点偶联，DAR约为4。文献报道MC接头在生理条件下，易发生逆迈克尔反应和巯基交换，造成疗效降低，毒性增加(Nat Biotechnol.2012,30(2):184-9；Bioconjugate Chem.2015,26,145-152)。
NBE-002是由NBE-Therapeutics公司开发，采用SarA分选酶接头技术，五个甘氨酸作为酶切linker，毒素为拓扑异构酶PNU-159682。根据文献报告，该分子linker有潜在的多处酶切的位点，且PNU-159682对光照和酸性条件敏感，生理条件下有一定的心脏毒性(Bioorg.Med.Chem.Lett.30(2020)127640)。
发明内容
本申请涉及一种用于治疗ROR1高表达癌症的抗体药物偶联物，并示例性地公开了以人源化抗体19F6-Hu35V1作为靶向部分的具有通式Ab-[M-L-E-D] x所示结构的抗体药物偶联物。结果显示所述偶联物具有较优的药物抗体偶联比(例如，1.5～2.5，3.5～4.5，6.5～8.5)，并且所述偶联物对ROR1阳性细胞具有优良的结合活性，对ROR1阳性的癌症，例如结肠癌，胃癌，乳腺癌，肺癌(例如，非小细胞肺癌，具体如肺腺癌)，或淋巴癌具有很好的靶向杀伤效果。因此，本申请提供一种用于治疗ROR1高表达癌症的抗体药物偶联物，含有所述抗体药物偶联物的药物组合物，以及它们在治疗ROR1高表达癌症中的应用。
抗体药物偶联物
在一个方面，本申请提供一种抗体药物偶联物，其具有式Ab-[M-L-E-D] x所示结 构，其中：
Ab是与受体酪氨酸激酶样孤儿受体(ROR)家族成员1(ROR1)特异性结合的抗体或其抗原结合片段：
M是和所述抗体或其抗原结合片段的接头部位；
L是连接所述接头部位M和E之间的连接子；
E是连接L和D的结构片段；
D是细胞毒性药物部分；
x选自1至10。
在所述抗体药物偶联物中，所述细胞毒性药物可通过连接体(如本申请中所示“M-L-E”片段)连接至所述抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，M选自以下结构：
在一些实施方案中，M为
在一些实施方案中，L选自由下述的一个或多个组成的二价结构：C 1-6亚烷基、-N(R’)-、羰基、-O-、Val、Cit、Phe、Lys、D-Val、Leu、Gly、Ala、Asn、Val-Cit、Val-Ala、Val-Lys、Val-Lys(Ac)、Phe-Lys、Phe-Lys(Ac)、D-Val-Leu-Lys、Gly-Gly-Arg、Ala-Ala-Asn、Ala-Ala-Ala、Val-Lys-Ala、Gly-Gly-Gly、Gly-Gly-Phe-Gly、Gly-Gly-Gly-Gly-Gly、 其中R’代表氢、C 1-6烷基或含-(CH 2CH 2O)r-的烷基；r选自1-10的整数；s选自1-10的整数。
在一些实施方案中，L选自由下述的一个或多个组成的二价结构：C 1-6亚烷基、 -N(R’)-、羰基、-O-、Val、Cit、Phe、Lys、D-Val、Leu、Gly、Ala、Asn、Val-Cit、Val-Ala、Val-Lys、Val-Lys(Ac)、Phe-Lys、Phe-Lys(Ac)、D-Val-Leu-Lys、Gly-Gly-Arg、Ala-Ala-Asn、Gly-Gly-Gly、Gly-Gly-Phe-Gly、Gly-Gly-Gly-Gly-Gly、 其中R’代表氢、C 1-6烷基或含-(CH 2CH 2O)r-的烷基；r选自1-10的整数；s选自1-10的整数。
在一些实施方案中，L选自由下述的一个或多个组成的结构：
C 1-6亚烷基、-N(R’)-、羰基、-O-、Val、Cit、Phe、Lys、D-Val、Leu、Gly、Ala、Asn、Val-Cit、Val-Ala、Val-Lys、Val-Lys(Ac)、Phe-Lys、Phe-Lys(Ac)、D-Val-Leu-Lys、Gly-Gly-Arg、Ala-Ala-Asn、Ala-Ala-Ala、Val-Lys-Ala、Gly-Gly-Gly、Gly-Gly-Phe-Gly、Gly-Gly-Gly-Gly-Gly、 其中R’代表氢、C 1-6烷基或含-(CH 2CH 2O)r-的烷基；r选自1-10的整数；s选自1-20的整数；优选地，s选自1-10的整数。
在一些实施方案中，L选自由下述的一个或多个组成的结构：Val、Cit、Phe、Lys、D-Val、Leu、Gly、Ala、Asn、Val-Cit、Val-Ala、Val-Lys、Val-Lys(Ac)、Phe-Lys、Phe-Lys(Ac)、D-Val-Leu-Lys、Gly-Gly-Arg、Ala-Ala-Asn、Gly-Gly-Gly、Gly-Gly-Phe-Gly、Gly-Gly-Gly-Gly-Gly、 其中s选自1-10的整数。在一些实施方案中，L选自以下结构：
在一些实施方案中，L选自以下结构：
在一些实施方案中，L选自以下结构：
在一些实施方案中，L选自以下结构：
在一些实施方案中，L选自以下结构：
在一些实施方案中，L选自以下结构：
在一些实施方案中，L选自以下结构：
其中s选自1-20的整数。
在一些实施方案中，L选自以下结构：
其中s选自1-10的整数；优选地，s选自1、2和3。
在一些实施方案中，L选自以下结构：
在一些实施方案中，E为单键，-NH-CH 2-，或选自以下结构：
在一些实施方案中，E为单键，-NH-CH 2-或
在一些实施方案中，E为-NH-CH 2-或
在一些实施方案中，M为
L选自以下结构：
其中s选自1-10的整数；
E为-NH-CH 2-或
在一些实施方案中， 选自以下结构：
在一些实施方案中， 选自以下结构：
在一些实施方案中，所述细胞毒性药物选自抗微管蛋白剂，DNA嵌入剂，DNA拓扑异构酶抑制剂，和RNA聚合酶抑制剂。在一些实施方案中，所述微管蛋白抑制剂为奥瑞他汀类化合物或美登素类化合物。在一些实施方案中，所述DNA嵌入剂为吡咯并苯二氮卓(PBD)。在一些实施方案中，所述DNA拓扑异构酶抑制剂为拓扑异构酶I抑制剂(例如，喜树碱、羟基喜树碱、9-氨基喜树碱、SN-38、伊立替康、拓扑替康、贝洛替康、或卢比替康)或拓扑异构酶II抑制剂(例如，阿霉素、PNU-159682、多卡米星、柔红霉素、米托蒽醌、鬼臼毒素、或依托泊苷)。在一些实施方案中，所述RNA聚合酶抑制剂为α-鹅膏草碱(α-amanitin)及其药学上可接受的盐、酯和类似物。
本申请中所公开的细胞毒性药物通常含有多种官能团，例如羟基(-OH)、羧基(-COOH)，一级氨基(-NH 2)，二级胺基(-NR 1H)，三级胺基(-NR 2R 3)，其中R 1、R 2、R 3在此仅代表N上的非氢取代基，或巯基(-SH)，这些官能团可与偶联物其余部 分中合适的官能团反应以实现与药物分子的连接。
在一些实施方案中，所述细胞毒性药物通过其上的-OH，一级氨基，二级胺基或三级胺基，或-SH与所述抗体药物偶联物中的E连接。
在一些实施方案中，所述细胞毒性药物选自以下化合物：
在一些实施方案中，D选自以下结构：
本领域技术人员应当理解，可模块化制备本申请所述抗体药物偶联物。例如，先获得游离形式的“药物-连接体”(可理解为M’-L-E-D，其中M’为M与抗体或其抗原结合片段共价连接前的结构形式)，而后将“药物-连接体”与抗体或其抗原结合片段共 价连接得到本申请所述抗体药物偶联物。相应地，所述游离形式的“药物-连接体”中M’通过取代反应(例如脱除其上的-SO 2Me或-Br等结构)或者通过加成反应等方式与抗体或其抗原结合片段上的一个或多个巯基(-SH)、氨基(-NH 2)或羧基(-COOH)连接。
在一些实施方案中，所述游离形式的“药物-连接体”选自下示的A-1～A-31和B-1～B-3：
在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含:
(1)下述重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)，其中CDR按Chothia编号系统定义：
(1a)包含如下3个CDR的重链可变区(VH)：序列为SEQ ID NO:3或其变体的CDR-H1，序列为SEQ ID NO:4或其变体的CDR-H2，序列为SEQ ID NO:5或其变体的CDR-H3；和/或，包含如下3个CDR的轻链可变区(VL)：序列为SEQ ID NO:6或其变体的CDR-L1，序列为SEQ ID NO:7或其变体的CDR-L2，序列为SEQ ID NO:8或其变体的CDR-L3；或，
(1b)包含如下3个CDR的重链可变区(VH)：序列为SEQ ID NO:11或其变体的CDR-H1，序列为SEQ ID NO:12或其变体的CDR-H2，序列为SEQ ID NO:13或其变体的CDR-H3；和/或，包含如下3个CDR的轻链可变区(VL)：序列为SEQ ID NO:14或其变体的CDR-L1，序列为SEQ ID NO:15或其变体的CDR-L2，序列为SEQ ID NO:16或其变体的CDR-L3；或，
(1c)包含如下3个CDR的重链可变区(VH)：序列为SEQ ID NO:19或其变体的CDR-H1，序列为SEQ ID NO:20或其变体的CDR-H2，序列为SEQ ID NO:21或其变体的CDR-H3；和/或，包含如下3个CDR的轻链可变区(VL)：序列为SEQ ID NO:14或其变体的CDR-L1，序列为SEQ ID NO:15或其变体的CDR-L2，序列为SEQ ID NO:16或其变体的CDR-L3；
其中，(1a)、(1b)、(1c)任一项中所述的变体与其所源自的序列相比具有至少70％、至 少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，或者所述变体与其所源自的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)；优选地，所述的置换是保守置换；
或者，
(2)下述重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)，其中CDR按AbM编号系统定义：
(2a)包含如下3个CDR的重链可变区(VH)：序列为SEQ ID NO:29或其变体的CDR-H1，序列为SEQ ID NO:30或其变体的CDR-H2，序列为SEQ ID NO:5或其变体的CDR-H3；和/或，包含如下3个CDR的轻链可变区(VL)：序列为SEQ ID NO:6或其变体的CDR-L1，序列为SEQ ID NO:7或其变体的CDR-L2，序列为SEQ ID NO:8或其变体的CDR-L3；或，
(2b)包含如下3个CDR的重链可变区(VH)：序列为SEQ ID NO:36或其变体的CDR-H1，序列为SEQ ID NO:37或其变体的CDR-H2，序列为SEQ ID NO:13或其变体的CDR-H3；和/或，包含如下3个CDR的轻链可变区(VL)：序列为SEQ ID NO:14或其变体的CDR-L1，序列为SEQ ID NO:15或其变体的CDR-L2，序列为SEQ ID NO:16或其变体的CDR-L3；或，
(2c)包含如下3个CDR的重链可变区(VH)：序列为SEQ ID NO:45或其变体的CDR-H1，序列为SEQ ID NO:46或其变体的CDR-H2，序列为SEQ ID NO:21或其变体的CDR-H3；和/或，包含如下3个CDR的轻链可变区(VL)：序列为SEQ ID NO:14或其变体的CDR-L1，序列为SEQ ID NO:15或其变体的CDR-L2，序列为SEQ ID NO:16或其变体的CDR-L3；
其中，(2a)、(2b)、(2c)任一项中所述的变体与其所源自的序列相比具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，或者所述变体与其所源自的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)；优选地，所述的置换是保守置换；
或者，
(3)下述重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)，其中CDR按Kabat编号系统定义：
(3a)包含如下3个CDR的重链可变区(VH)：序列为SEQ ID NO:31或其变体的CDR-H1，序列为SEQ ID NO:32或其变体的CDR-H2，序列为SEQ ID NO:5或其变体的 CDR-H3；和/或，包含如下3个CDR的轻链可变区(VL)：序列为SEQ ID NO:6或其变体的CDR-L1，序列为SEQ ID NO:7或其变体的CDR-L2，序列为SEQ ID NO:8或其变体的CDR-L3；或，
(3b)包含如下3个CDR的重链可变区(VH)：序列为SEQ ID NO:38或其变体的CDR-H1，序列为SEQ ID NO:39或其变体的CDR-H2，序列为SEQ ID NO:13或其变体的CDR-H3；和/或，包含如下3个CDR的轻链可变区(VL)：序列为SEQ ID NO:14或其变体的CDR-L1，序列为SEQ ID NO:15或其变体的CDR-L2，序列为SEQ ID NO:16或其变体的CDR-L3；或，
(3c)包含如下3个CDR的重链可变区(VH)：序列为SEQ ID NO:47或其变体的CDR-H1，序列为SEQ ID NO:48或其变体的CDR-H2，序列为SEQ ID NO:21或其变体的CDR-H3；和/或，包含如下3个CDR的轻链可变区(VL)：序列为SEQ ID NO:14或其变体的CDR-L1，序列为SEQ ID NO:15或其变体的CDR-L2，序列为SEQ ID NO:16或其变体的CDR-L3；
其中，(3a)、(3b)、(3c)任一项中所述的变体与其所源自的序列相比具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，或者所述变体与其所源自的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)；优选地，所述的置换是保守置换；
或者，
(4)下述重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)，其中CDR按IMGT编号系统定义：
(4a)包含如下3个CDR的重链可变区(VH)：序列为SEQ ID NO:24或其变体的CDR-H1，序列为SEQ ID NO:25或其变体的CDR-H2，序列为SEQ ID NO:26或其变体的CDR-H3；和/或，包含如下3个CDR的轻链可变区(VL)：序列为SEQ ID NO:27或其变体的CDR-L1，序列为SEQ ID NO:28或其变体的CDR-L2，序列为SEQ ID NO:8或其变体的CDR-L3；或，
(4b)包含如下3个CDR的重链可变区(VH)：序列为SEQ ID NO:33或其变体的CDR-H1，序列为SEQ ID NO:34或其变体的CDR-H2，序列为SEQ ID NO:35或其变体的CDR-H3；和/或，包含如下3个CDR的轻链可变区(VL)：序列为SEQ ID NO:43或其变体的CDR-L1，序列为SEQ ID NO:44或其变体的CDR-L2，序列为SEQ ID NO:16或其变体的CDR-L3；或，
(4c)包含如下3个CDR的重链可变区(VH)：序列为SEQ ID NO:40或其变体的 CDR-H1，序列为SEQ ID NO:41或其变体的CDR-H2，序列为SEQ ID NO:42或其变体的CDR-H3；和/或，包含如下3个CDR的轻链可变区(VL)：序列为SEQ ID NO:43或其变体的CDR-L1，序列为SEQ ID NO:44或其变体的CDR-L2，序列为SEQ ID NO:16或其变体的CDR-L3；
其中，(4a)、(4b)、(4c)任一项中所述的变体与其所源自的序列相比具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，或者所述变体与其所源自的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)；优选地，所述的置换是保守置换。
在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：
(a)SEQ ID NO：1所示的VH或其变体，和/或，SEQ ID NO：2所示的VL或其变体；
(b)SEQ ID NO：9所示的VH或其变体，和/或，SEQ ID NO：10所示的VL或其变体；或
(c)SEQ ID NO：17所示的VH或其变体，和/或，SEQ ID NO：18所示的VL或其变体；
其中，所述变体与其所源自的序列相比具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，或者所述变体与其所源自的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)；优选地，所述的置换是保守置换。
在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段进一步包含：
(a)人免疫球蛋白的重链恒定区(CH)或其变体，所述变体与其所源自的野生型序列相比具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加(例如，至多20个、至多15个、至多10个、或至多5个氨基酸的置换、缺失或添加；例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)；和
(b)人免疫球蛋白的轻链恒定区(CL)或其变体，所述变体与其所源自的野生型序列相比具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加(例如，至多20个、至多15个、至多10个、或至多5个氨基酸的置换、缺失或添加；例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)。
在一些实施方案中，所述重链恒定区是IgG重链恒定区，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重链恒定区，例如人IgG1重链恒定区或人IgG4重链恒定区。在一些实施方案中， 所述抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO：22所示的重链恒定区(CH)或其变体，所述变体与SEQ ID NO：22相比具有至多20个氨基酸的保守置换(例如至多15个、至多10个、或至多5个氨基酸的保守置换；例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的保守置换)。
在一些实施方案中，所述轻链恒定区是κ轻链恒定区。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO：23所示的轻链恒定区(CL)或其变体，所述变体与SEQ ID NO：23相比具有至多20个氨基酸的保守置换(例如至多15个、至多10个、或至多5个氨基酸的保守置换；例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的保守置换)。
在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO：22所示的重链恒定区(CH)和如SEQ ID NO：23所示的轻链恒定区(CL)。
在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：
(1)包括SEQ ID NO：1所示序列的VH和SEQ ID NO：22所示的重链恒定区(CH)的重链，和，包括SEQ ID NO：2所示序列的VL和SEQ ID NO：23所示的轻链恒定区(CL)的轻链；
(2)包括SEQ ID NO：9所示序列的VH和SEQ ID NO：22所示的重链恒定区(CH)的重链，和，包括SEQ ID NO：10所示序列的VL和SEQ ID NO：23所示的轻链恒定区(CL)的轻链；或
(3)包括SEQ ID NO：17所示序列的VH和SEQ ID NO：22所示的重链恒定区(CH)的重链，和，包括SEQ ID NO：18所示序列的VL和SEQ ID NO：23所示的轻链恒定区(CL)的轻链。
在一些实施方案中，所述抗体药物偶联物选自下示的ADC A-1～ADC A-31和ADC B-1～ADC B-3：
其中，各抗体药物偶联物中的HA代表包含如SEQ ID NO:1所示的VH和如SEQ ID NO:2所示的VL的抗体或其抗原结合片段，例如19F6_Hu35v1(其包括SEQ ID NO：1所示的VH和SEQ ID NO：22所示的CH，以及SEQ ID NO：2所示的VL和SEQ ID NO：23所示的CL)；
其中， 或表示抗体或其抗原结合片段中的巯基与连接体的具体连接方式。
在一些实施方案中，所述抗体药物偶联物的DAR值(药物抗体偶联比)为1-10，例如：1～2，1～3，1～4，1～5，1～6，1～7，1～8，1～9，1～10，2～3，2～4，2～5，2～6，2～7，2～8，2～9，2～10，3～4，3～5，3～6，3～7，3～8，3～9，3～10，4～5，4～6，4～7，4～8，4～9，4～10，5～6，5～7，5～8，5～9，5～10，6～7，6～8，6～9，6～10，7～8，7～9，7～10，8～9，8～10，或9～10，优选为3～8，例如，3.0～3.5，3.0～4.0，3.0～4.5，3.0～5.0，3.0～5.5，3.0～6.0，3.5～4.0，3.5～4.5，3.5～5.0，3.5～5.5，3.5～6.0，3.5～6.5，3.5～7.0，3.5～7.5，3.5～8.0，4.0～4.5，4.0～5.0，4.0～5.5，4.0～6.0，4.0～6.5，4.0～7.0，4.0～7.5，4.0～8.0，4.5～5.0，4.5～5.5，4.5～6.0，4.5～6.5，4.5～7.0，4.5～7.5，4.5～8.0，5.0～5.5，5.0～6.0，5.0～6.5，5.0～7.0，5.0～7.5，5.0～8.0，5.5～6.0，5.5～6.5，5.5～7.0，5.5～7.5，5.5～8.0，6.0～6.5，6.0～7.0，6.0～7.5，6.0～8.0，6.5～7.0，6.5～7.5，6.5～8.0，7.0～7.5，7.0～8.0或7.5～8.0。
药物-连接体偶联物
在另一个方面，本申请提供一种药物-连接体，其可用于制备前文所述的抗体药物偶联物，所述药物-连接体具有式M’-L-E-D所示结构，其中：
M’是M接入前文所述抗体或其抗原结合片段之前的结构，M、L、E和D如前文第一方面任一项中所定义。
在一些实施方案中，M’选自以下结构：
在一些实施方案中，M’为
在一些实施方案中，L选自由下述的一个或多个组成的二价结构：C 1-6亚烷基、-N(R’)-、羰基、-O-、Val、Cit、Phe、Lys、D-Val、Leu、Gly、Ala、Asn、Val-Cit、Val-Ala、Val-Lys、Val-Lys(Ac)、Phe-Lys、Phe-Lys(Ac)、D-Val-Leu-Lys、Gly-Gly-Arg、Ala-Ala-Asn、Ala-Ala-Ala、Val-Lys-Ala、Gly-Gly-Gly、Gly-Gly-Phe-Gly、Gly-Gly-Gly-Gly-Gly、
其中R’代表氢、C 1-6烷基或含-(CH 2CH 2O)r-的烷基；r选自1-10的整数；s选自1-10的整数。
在一些实施方案中，L选自由下述的一个或多个组成的二价结构：C 1-6亚烷基、-N(R’)-、羰基、-O-、Val、Cit、Phe、Lys、D-Val、Leu、Gly、Ala、Asn、Val-Cit、Val-Ala、Val-Lys、Val-Lys(Ac)、Phe-Lys、Phe-Lys(Ac)、D-Val-Leu-Lys、Gly-Gly-Arg、Ala-Ala-Asn、Gly-Gly-Gly、Gly-Gly-Phe-Gly、Gly-Gly-Gly-Gly-Gly、 其中R’代表氢、C 1-6烷基或含-(CH 2CH 2O)r-的烷基；r选自1-10的整数；s选自1-10的整数。
在一些实施方案中，L选自由下述的一个或多个组成的结构：C 1-6亚烷基、-N(R’)-、羰基、-O-、Val、Cit、Phe、Lys、D-Val、Leu、Gly、Ala、Asn、Val-Cit、Val-Ala、Val-Lys、Val-Lys(Ac)、Phe-Lys、Phe-Lys(Ac)、D-Val-Leu-Lys、Gly-Gly-Arg、Ala-Ala-Asn、Ala-Ala-Ala、Val-Lys-Ala、Gly-Gly-Gly、Gly-Gly-Phe-Gly、Gly-Gly-Gly-Gly-Gly、 其中R’代表氢、C 1-6烷基或含-(CH 2CH 2O)r-的烷基；r选自1-10的整数；s选自1-20的整数；优选地，s选自1-10的整数。
在一些实施方案中，L选自由下述的一个或多个组成的结构：Val、Cit、Phe、Lys、D-Val、Leu、Gly、Ala、Asn、Val-Cit、Val-Ala、Val-Lys、Val-Lys(Ac)、Phe-Lys、Phe-Lys(Ac)、D-Val-Leu-Lys、Gly-Gly-Arg、Ala-Ala-Asn、Gly-Gly-Gly、Gly-Gly-Phe-Gly、Gly-Gly-Gly-Gly-Gly、 其中s选自1-10的整数。
在一些实施方案中，L选自以下结构：
在一些实施方案中，L选自以下结构：
在一些实施方案中，L选自以下结构：
在一些实施方案中，L选自以下结构：
在一些实施方案中，L选自以下结构：
在一些实施方案中，L选自以下结构：
在一些实施方案中，L选自以下结构：
其中 s选自1-20的整数。
在一些实施方案中，L选自以下结构：
其中s选自1-10的整数；优选地，s选自1、2和3。
在一些实施方案中，L选自以下结构：
在一些实施方案中，E为单键，-NH-CH 2-，或选自以下结构：
在一些实施方案中，E为单键，-NH-CH 2-或
在一些实施方案中，E为-NH-CH 2-或
在一些实施方案中，M’为
L选自以下结构：
其中s选自1-10的整数；
E为-NH-CH 2-或
在一些实施方案中， 选自以下结构：
在一些实施方案中， 选自以下结构：
在一些实施方案中，所述细胞毒性药物选自抗微管蛋白剂，DNA嵌入剂，DNA拓扑异构酶抑制剂，和RNA聚合酶抑制剂。在一些实施方案中，所述微管蛋白抑制剂为奥瑞他汀类化合物或美登素类化合物。在一些实施方案中，所述DNA嵌入剂为吡咯并苯二氮卓(PBD)。在一些实施方案中，所述DNA拓扑异构酶抑制剂为拓扑异构酶I抑制剂(例如，喜树碱、羟基喜树碱、9-氨基喜树碱、SN-38、伊立替康、拓扑替康、贝洛替康、或卢比替康)或拓扑异构酶II抑制剂(例如，阿霉素、PNU-159682、多卡米星、柔红霉素、米托蒽醌、鬼臼毒素、或依托泊苷)。在一些实施方案中，所述RNA聚合酶抑制剂为α-鹅膏草碱(α-amanitin)及其药学上可接受的盐、酯和类似物。
本申请中所公开的细胞毒性药物通常含有多种官能团，例如羟基(-OH)、羧基(-COOH)，一级氨基(-NH 2)，二级胺基(-NR 1H)，三级胺基(-NR 2R 3)，其中R 1、R 2、R 3在此仅代表N上的非氢取代基，或巯基(-SH)，这些官能团可与偶联物其余部分中合适的官能团反应以实现与药物分子的连接。
在一些实施方案中，所述细胞毒性药物通过其上的-OH，一级氨基，二级胺基或三级胺基，或-SH与所述抗体药物偶联物中的E连接。
在一些实施方案中，所述细胞毒性药物选自以下化合物：
在一些实施方案中，D选自以下结构：
在一些实施方案中，所述药物-连接体选自下示的A-1～A-31和B-1～B-3：
药物组合物
在另一个方面，本申请提供一种药物组合物，其含有前文任一项所述的抗体药物偶联物，以及一种或多种药用辅料。
本文所述抗体药物偶联物通常与药学上可接受的胃肠外媒介一起以单位可注射形式配制，供胃肠外使用，例如推注、静脉注射、肿瘤内注射等。任选地，以冻干剂或溶液剂的形式将具有期望纯度的抗体药物偶联物与药学上可接受的稀释剂、载体、赋型剂或稳定剂混合(Remington’s Pharmaceutical Sciences(1980)16 th edition,Osol,A.Ed.)。可以通过对于要治疗的个体适宜的任何路径施用本文所述抗体药物偶联物或含有所述抗体药物偶联物的药物组合物。
应用
本文所述抗体药物偶联物或其药物组合物可以用于治疗多种疾病或病症，例如ROR1 高表达癌症，包括实体瘤或血液系统恶性肿瘤，例如结肠癌，胃癌，乳腺癌，肺癌(例如，非小细胞肺癌，具体如肺腺癌)，或淋巴癌。
因此，本申请提供前文任一项所述的抗体药物偶联物或含有其的药物组合物在制备治疗ROR1高表达癌症的药物中的用途。
同时，本申请还提供一种治疗ROR1高表达癌症的方法，其包括向由此需要的受试者施用治疗有效量的前文任一项所述的抗体药物偶联物或含有其的药物组合物的步骤。
定义
除非在下文中另有定义，本文中所使用的所有技术术语和科学术语的含义意图与本领域技术人员通常所理解的相同。提及本文中使用的技术意图指在本领域中通常所理解的技术，包括那些对本领域技术人员显而易见的技术的变化或等效技术的替换。并且，本文中所用的基因组学、核酸化学、分子生物学等实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。虽然相信以下术语对于本领域技术人员很好理解，但仍然阐述以下定义以更好地解释本发明。
术语“抗体”是指，通常由两对多肽链(每对具有一条轻链(LC)和一条重链(HC))组成的免疫球蛋白分子。抗体轻链可分类为κ(kappa)和λ(lambda)轻链。重链可分类为μ、δ、γ、α或ε，并且分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过大约12或更多个氨基酸的“J”区连接，重链还包含大约3个或更多个氨基酸的“D”区。各重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区由3个结构域(CH1、CH2和CH3)组成。各轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但展现出多种效应子功能，如可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)的结合。VH和VL区还可被细分为具有高变性的区域(称为互补决定区(CDR))，其间散布有较保守的称为构架区(FR)的区域。各VH和VL由按下列顺序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4从氨基末端至羧基末端排列的3个CDR和4个FR组成。各重链/轻链对的可变区(VH和VL)分别形成抗原结合部位。氨基酸在各区域或结构域的分配可遵循本领域已知的各种编号系统。
术语“互补决定区”或“CDR”是指抗体可变区中负责抗原结合的氨基酸残基。在重链和轻链的可变区中各含有三个CDRs，命名为CDR1、CDR2和CDR3。这些CDR的精确边界可根据本领域已知的各种编号系统进行定义，例如可按照Kabat编号系统(Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1991)、Chothia编号系统(Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917；Chothia等人(1989)Nature 342:878-883)、IMGT编号系统(Lefranc et al.,Dev.Comparat.Immunol.27:55-77,2003)或AbM编号系统(Martin ACR,Cheetham JC,Rees AR(1989)Modelling antibody hypervariable loops:A combined algorithm.Proc Natl Acad Sci USA 86:9268–9272)中的定义。对于给定的抗体，本领域技术人员将容易地鉴别各编号系统所定义的CDR。并且，不同编号系统之间的对应关系是本领域技术人员熟知的(例如，可参见Lefranc et al.,Dev.Comparat.Immunol.27:55-77,2003)。
在本发明中，抗体或其抗原结合片段含有的CDR可根据本领域已知的各种编号系统确定，例如通过Kabat、Chothia、IMGT或AbM编号系统确定。在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段含有的CDR通过Chothia编号系统定义。
术语“构架区”或“FR”残基是指，抗体可变区中除了如上定义的CDR残基以外的那些氨基酸残基。
术语抗体的“抗原结合片段”是指抗体的片段的多肽，例如全长抗体的片段的多肽，其保持特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力，和/或与全长抗体竞争对抗原的特异性结合，其也被称为“抗原结合部分”。通常参见，Fundamental Immunology,Ch.7(Paul,W.,ed.,第2版，Raven Press,N.Y.(1989)，其以其全文通过引用合并入本文，用于所有目的。可通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学断裂产生抗体的抗原结合片段。抗原结合片段的非限制性实例包括Fab片段、Fab'片段、F(ab)' 2片段、F(ab)' 3片段、Fd、Fv、scFv、di-scFv、(scFv) 2、二硫键稳定的Fv蛋白(“dsFv”)、单结构域抗体(sdAb，纳米抗体)和这样的多肽，其包含足以赋予多肽特异性抗原结合能力的抗体的至少一部分。工程改造的抗体变体综述于Holliger等,2005；Nat Biotechnol,23:1126-1136中。
术语“Fd”意指由VH和CH1结构域组成的抗体片段；术语“dAb片段”意指由VH结构域组成的抗体片段(Ward等人,Nature 341:544 546(1989))；术语“Fab片段”意指由VL、VH、CL和CH1结构域组成的抗体片段；术语“F(ab’) 2片段”意指包含通过铰链区上的二硫桥连接的两个Fab片段的抗体片段；术语“Fab’片段”意指还原连接F(ab’) 2片段中两个重链片段的二硫键后所获片段，由一条完整的轻链和重链的Fd片段(由VH和CH1结构域组成)组成。
术语“Fv”意指由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的抗体片段。Fv片段通常被认为是，能形成完整的抗原结合位点的最小抗体片段。一般认为，六个CDRs赋予抗体的抗原结合特异性。然而，即便是一个可变区(例如Fd片段，其仅仅含有三个对抗原特异的CDRs)也能够识别并结合抗原，尽管其亲和力可能低于完整的结合位点。
术语“Fc”意指，由抗体的第一重链的第二、第三恒定区与第二重链的第二、第三恒定区经二硫键结合而形成的抗体片段。抗体的Fc片段具有多种不同的功能，但不参与抗原的结合。
术语“scFv”是指，包含VL和VH结构域的单个多肽链，其中所述VL和VH通过接头(linker)相连(参见，例如,Bird等人,Science 242:423-426(1988)；Huston等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883(1988)；和Pluckthun，The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Roseburg和Moore编，Springer-Verlag，纽约，第269-315页(1994))。此类scFv分子可具有一般结构：NH 2-VL-接头-VH-COOH或NH 2-VH-接头-VL-COOH。合适的现有技术接头由重复的GGGGS氨基酸序列或其变体组成。例如，可使用具有氨基酸序列(GGGGS) 4的接头，但也可使用其变体(Holliger等人(1993)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448)。可用于本发明的其他接头由Alfthan等人(1995)，Protein Eng.8:725-731，Choi等人(2001)，Eur.J.Immunol.31:94-106，Hu等人(1996)，Cancer Res.56:3055-3061，Kipriyanov等人(1999)，J.Mol.Biol.293:41-56和Roovers等人(2001)，Cancer Immunol.描述。在一些情况下，scFv的VH与VL之间还可以存在二硫键。在某些实施方案中，VH和VL结构域可以以任何合适的排列彼此相对定位。例如，包含NH 2-VH-VH-COOH、NH 2-VL-VL-COOH的scFv。
术语“单域抗体(single-domain antibody,sdAb)”具有本领域技术人员通常理解的含义，其是指由单个单体可变抗体结构域(例如单个重链可变区)所组成的抗体片段，其保持特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力(Holt,L.等人,生物技术趋势(Trends in Biotechnology),21(11):484-490，2003)。单域抗体也称为纳米抗体(nanobody)。
上述各个抗体片段均保持了特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力，和/或与全长抗体竞争对抗原的特异性结合。
在本文中，除非上下文明确指出，否则当提及术语“抗体”时，其不仅包括完整抗体，而且包括抗体的抗原结合片段。
可使用本领域技术人员已知的常规技术(例如，重组DNA技术或酶促或化学断裂法)从给定的抗体(例如本发明提供的抗体)获得抗体的抗原结合片段(例如，上述抗体片段)，并且以与用于完整抗体的方式相同的方式就特异性筛选抗体的抗原结合片段。
术语“鼠源抗体”是指通过下述方法获得的抗体：融合免疫接种过的小鼠的B细胞与骨髓瘤细胞，筛选出既能无限增殖又能分泌抗体的鼠杂交融合细胞，继而进行筛选、抗体制备和抗体纯化；或者是指，由抗原侵入小鼠体内后B细胞分化增殖而形成浆细胞所分泌产生的抗体。
术语“人源化抗体”是指，经基因工程改造的非人源抗体，其氨基酸序列经修饰以提高与人源抗体的序列的同源性。通常而言，人源化抗体的全部或部分CDR区来自于非人源抗体(供体抗体)，全部或部分的非CDR区(例如，可变区FR和/或恒定区)来自于人源免疫球蛋白(受体抗体)。人源化抗体通常保留了供体抗体的预期性质，包括但不限于，抗 原特异性、亲和性、反应性、提高免疫细胞活性的能力、增强免疫应答的能力等。供体抗体可以是有预期性质(例如，抗原特异性、亲和性、反应性、提高免疫细胞活性的能力和/或增强免疫应答的能力)的小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物(例如，食蟹猴)抗体。
术语“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时(例如，两个DNA分子的每一个中的某个位置都被腺嘌呤占据，或两个多肽的每一个中的某个位置都被赖氨酸占据)，那么各分子在该位置上是同一的。两个序列之间的“百分数同一性”是由这两个序列共有的匹配位置数目除以进行比较的位置数目×100的函数。例如，如果两个序列的10个位置中有6个匹配，那么这两个序列具有60％的同一性。例如，DNA序列CTGACT和CAGGTT共有50％的同一性(总共6个位置中有3个位置匹配)。通常，在将两个序列比对以产生最大同一性时进行比较。这样的比对可通过使用，例如，可通过计算机程序例如Align程序(DNAstar,Inc.)方便地进行的Needleman等人(1970)J.Mol.Biol.48：443-453的方法来实现。还可使用已整合入ALIGN程序(版本2.0)的E.Meyers和W.Miller(Comput.Appl Biosci.，4:11-17(1988))的算法，使用PAM120权重残基表(weight residue table)、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。此外，可使用已整合入GCG软件包(可在www.gcg.com上获得)的GAP程序中的Needleman和Wunsch(J MoI Biol.48:444-453(1970))算法，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵以及16、14、12、10、8、6或4的缺口权重(gap weight)和1、2、3、4、5或6的长度权重来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。
术语“保守置换”意指不会不利地影响或改变包含氨基酸序列的蛋白/多肽的预期性质的氨基酸置换。例如，可通过本领域内已知的标准技术例如定点诱变和PCR介导的诱变引入保守置换。保守氨基酸置换包括用具有相似侧链的氨基酸残基替代氨基酸残基的置换，例如用在物理学上或功能上与相应的氨基酸残基相似(例如具有相似大小、形状、电荷、化学性质，包括形成共价键或氢键的能力等)的残基进行的置换。已在本领域内定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，优选用来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基替代相应的氨基酸残基。鉴定氨基酸保守置换的方法在本领域内是熟知的(参见，例如，Brummell等人，Biochem.32:1180-1187(1993)；Kobayashi等人Protein Eng.12(10):879-884(1999)；和Burks等人Proc.Natl Acad.Set USA 94:412-417(1997)，其通过引用并入本文)。
术语“抗体药物偶联物”、“抗体药物缀合物”和“ADC”具有相同含义，是指由抗体、细胞毒性药物及连接抗体和细胞毒性药物的连接体形成的药物。
本文涉及的二十个常规氨基酸的编写遵循常规用法。参见例如，Immunology-A Synthesis(2nd Edition,E.S.Golub and D.R.Gren,Eds.,Sinauer Associates,Sunderland,Mass.(1991))，其以引用的方式并入本文中。在本发明中，氨基酸通常用本领域公知的单字母和三字母缩写来表示。例如，丙氨酸可用A或Ala表示。
术语“包括”、“包含”、“具有”、“含有”或“涉及”及其在本文中的其它变体形式为包含性的(inclusive)或开放式的，且不排除其它未列举的元素或方法步骤。
术语“烷基”表示直链或支链烃基去掉1个氢原子得到的基团，例如“C 1-20烷基”、“C 1-10烷基”、“C 1-6烷基”、“C 1-4烷基”、“C 1-3烷基”等，具体实例包括但不限于：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、2-甲基丁基、新戊基、1-乙基丙基、正己基、异己基、3-甲基戊基、2-甲基戊基、1-甲基戊基、3,3-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基、2-乙基丁基、1,2-二甲基丙基等。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1：过表达人ROR1的Ba/F3细胞的流式鉴定。
图2：人胃癌细胞NCI-N87 CDX模型中各组小鼠肿瘤体积的变化情况。
注：箭头代表给药，下同。
图3：人胃癌细胞NCI-N87 CDX模型中各组小鼠体重的变化情况。
图4：人肺腺癌细胞NCI-H1975 CDX模型中各组小鼠肿瘤体积的变化情况。
图5：人肺腺癌细胞NCI-H1975 CDX模型中各组小鼠体重的变化情况。
图6：人结肠癌细胞HT-29 CDX模型中各组小鼠肿瘤体积的变化情况。
图7：人结肠癌细胞HT-29 CDX模型中各组小鼠体重的变化情况。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。 以下对至少一个示例性实施例的描述实际上仅仅是说明性的，绝不作为对本发明及其应用或使用的任何限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制。本领域技术人员根据本发明的教导，可以做出各种修改或改进，而不脱离本发明的基本思想和范围。
本发明涉及的序列的信息描述于下面的表中：
本文中所使用的缩写具有以下含义：
以下的实施例中记载的化合物的结构通过核磁共振( 1H NMR)或质谱(MS)来确定。
核磁共振(1H NMR)的测定使用Bruker 400MHz核磁共振仪；氘代试剂为六氘代二甲基亚砜(DMSO-d6)；内标物质为四甲基硅烷(TMS)。
实施例中使用的核磁共振(NMR)图谱中的缩写示于以下。
s：单峰(singlet)、d：二重峰(doublet)、t：三重峰(triplet)、q：四重峰(quartet)、m：多重峰(multiplet)、br：宽峰(broad)、J：偶合常数、Hz：赫兹、DMSO-d6：氘化二甲基亚砜。δ值用ppm值表示。
质谱(MS)的测定使用Agilent(ESI)质谱仪，型号为Agilent 6120B。
实施例一4-((S)-2-(4-氨基丁基)-35-(4-((6-(2-(甲基磺酰基)嘧啶-5-基)己-5-酰胺基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-4,8-二氧代-6,12,15,18,21,24,27,30,33-九氧杂-3,9-二氮杂三十五烷酰胺基)苄基((S)-4-乙基-11-(2-(N-异丙基甲基磺酰胺基)乙基)-3,14-二氧代-3,4,12,14-四氢-1H-吡喃并[3',4':6,7]中氮茚并[1,2-b]喹啉-4-基)碳酸酯(A-1)
步骤一：6-(2-(甲基磺酰基)嘧啶-5-基)-N-(丙-2-炔-1-基)己-5-炔酰胺的合成
25℃下将丙-2-炔-1-胺(189mg,3.4mmol)和化合物IM-1(800mg,2.83mmol)溶于二氯甲烷(10mL)中，依次加入N,N-二异丙基乙胺(738mg,5.67mmol)，O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N′,N′-四甲基脲六氟磷酸酯(1.63g,4.25mmol),搅拌反应2h。反应液减压浓缩，残余物经快速硅胶柱纯化(乙酸乙酯/石油醚＝3/1)得标题化合物700mg。ESI-MS(m/z):306.1[M+H] +。
步骤二：4-((S)-35-叠氮基-2-(4-(((4-甲氧基苯基)二苯甲基)氨基)丁基)-4,8-二氧代-6,12,15,18,21,24,27,30,33-九氧杂-3,9-二氮杂三十五烷酰氨基)苄基((S)-4-乙基-11-(2-(N-异丙基甲磺酰胺基)乙基)-3,14-二氧代-3,4,12,14-四氢-2H-吡喃并[2,3-b]-1H-吡喃并[3',4'：6,7]吲嗪并[1,2-b]喹啉-4-基)碳酸酯的合成
25℃氮气保护下，将A-1-1(250mg,0.49mmol)溶于二氯甲烷(10mL)中，降温至0℃，加入4-二甲氨基吡啶(478mg,3.91mmol)的二氯甲烷(3mL)溶液，然后缓慢滴加三光气(72mg,0.24mmol)的二氯甲烷(10mL)溶液，加毕，0℃搅拌反应20min，反应液用氮气吹20min。加入(S)-2-(32-叠氮基-5-氧代-3,9,12,15,18,21,24,27,30-九氧杂-6-氮杂三联乙酰胺基)-N-(4-(羟甲基)苯基)-6(((4-甲氧基苯基)二苯甲基)氨基)乙酰胺(518mg,0.49mmol)的二 氯甲烷(7mL)溶液，加毕，0℃搅拌反应1h。反应液减压浓缩，残余物经制备高效液相色谱纯化(条件如下)得标题化合物500mg。ESI-MS(m/z):1597.5[M+H] +。
色谱柱：Daisogel C18 10μm 100x250mm
流动相A：水；流动相B：乙腈
时间[min] 流动相A[％] 流动相B[％] 流速[mL/min]
0.00 70.0 30.0 30
8.00 70.0 30.0 30
50.00 20.0 80.0 30
步骤三：(S)-4-乙基-11-(2-(N-异丙基甲磺酰胺基)乙基)-3,14-二氧代-3,4,12,14-四氢-1H-吡喃并[3',4':6,7]吲嗪并[1,2-b]喹啉-4-基(4-((S)-2-(4-(((4-甲氧基苯基)二苯基甲基)氨基)丁基)-35-(4-((6-(2-(甲基磺酰基)嘧啶-5-基)己-5-酰胺基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-4,8-二氧代-6,12,15,18,21,24,27,30,33-壬氧基-3,9-二氮杂三十五烷酰胺基)苄基)碳酸酯的合成
室温下，将化合物A-1-2(14mg，0.05mmol)溶于二甲基亚砜和水(2.0mL：0.5mL)中，加入溴化亚铜(11mg，0.08mmol)和6-(2-(甲基磺酰基)嘧啶-5-基)-N-(丙-2-炔-1-基)-己-5-炔酰胺(IM-2，18.8mg，0.06mmol)，搅拌反应1h。经制备高效液相色谱纯化(条件如下)，得标题化合物30mg。ESI-MS(m/z):815.9[(M-273)/2+H] +。
色谱柱：SunFire Prep C18 OBD 19mm×150mm×5.0μm
流动相A：乙腈；流动相B：水
时间[min] 流动相A[％] 流动相B[％] 流速[mL/min]
0.00 40 60 28
8.00 40 60 28
50.00 90 10 28
步骤四：4-((S)-2-(4-氨基丁基)-35-(4-((6-(2-(甲基磺酰基)嘧啶-5-基)己-5-酰胺基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-4,8-二氧代-6,12,15,18,21,24,27,30,33-九氧杂-3,9-二氮杂三十五烷酰胺基)苄基((S)-4-乙基-11-(2-(N-异丙基甲基磺酰胺基)乙基)-3,14-二氧代-3,4,12,14-四氢-1H-吡喃并[3',4':6,7]中氮茚并[1,2-b]喹啉-4-基)碳酸酯的合成
将化合物A-1-3(30mg，0.02mmol)溶于二氯甲烷(1.0mL)反应液中加入三氟乙酸(0.2mL)，室温反应30min。经制备高效液相色谱纯化(条件如下)，得标题化合物的三氟乙酸盐20.0mg。
色谱柱：SunFire Prep C18 OBD 19mm×150mm×5.0μm
流动相A：乙腈；流动相B：水(0.05％三氟乙酸)
时间[min] 流动相A[％] 流动相B[％] 流速[mL/min]
0.00 15 85 28
8.00 15 85 28
50.00 60 40 28
结构表征如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)δ10.18(s,1H),9.10(s,2H),8.38(t,J＝5.56Hz,1H),8.32(d,J＝8.40Hz,1H),8.22–8.20(m,2H),8.09(t,J＝5.68Hz,1H),7.91–7.87(m,2H),7.82–7.78(m,1H)，7.69(brs,3H),7.61(d,J＝8.56Hz,2H),7.32(d,J＝8.56Hz,2H),7.06(s,1H),5.56(d,J＝16.96Hz,1H),5.51(d,J＝16.96Hz,1H),5.47(d,J＝19.28Hz,1H),5.42(d,J＝19.28Hz,1H),5.14(d,J＝12.20Hz,1H),5.07(d,J＝12.16Hz,1H),4.48(t,J＝5.24Hz,2H),4.46–4.43(m,1H),4.29(d,J＝5.60Hz,2H),4.08–3.95(m,5H),3.79(t,J＝5.28Hz,2H),3.51–3.43(m,32H),3.40(s,3H),3.39–3.35(m,2H),3.30–3.26(m,2H),3.00(s,3H),2.82–2.74(m,2H),2.56(t,J＝7.08Hz,2H),2.29(t,J＝7.36Hz,2H),2.23–2.13(m,2H),1.82(p,J＝7.24Hz,2H),1.78–1.63(m,2H),1.61–1.49(m,2H),1.42–1.27(m,2H),1.15(d,J＝6.80Hz,3H),1.13(d,J＝6.76Hz,3H),0.90(t,J＝7.32Hz,3H).ESI-MS(m/z):816.0[M/2+H] +。
实施例二4-((S)-2-((S)-3-甲基-2-(4-(1-(26-(4-((6-(2-(甲基磺酰基)嘧啶-5-基)己基-5-炔酰胺基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十六烷基)哌啶-4-基)丁酰胺基)丁酰胺基)-5-脲基戊酰氨基)苄基(2-((S)-4-乙基-4-羟基-3,14-二氧代-3,4,12,14-四氢-1H-吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-11-基)乙基)(异丙基)氨基甲酸酯(A-2)
步骤一：4-(4-(((S)-1-(((S)-1-((4-(羟甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊基-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)氨基)-4-氧代丁基)哌啶-1-羧酸叔丁酯的合成
25℃下，将化合物Val-Cit-PABC(A-2-1，1g，2.64mmol)，4-(N-Boc-4-哌啶基)丁酸(929.65mg,3.43mmol)，EEDQ(977.55mg,3.95mmol)溶于甲醇(20mL)和二氯甲烷(20mL)的混合液中，加热至45℃反应2h。将反应液旋干，倒入甲基叔丁基醚(50ml)搅拌30min，有浑浊沉淀产生，经抽滤得标题化合物1.3g。
结构表征数据如下：
ESI-MS(m/z):633.2[M+H] +.
步骤二：(S)-N-(4-(羟甲基)苯基)-2-((S)-3-甲基-2-(4-(哌啶-4-基)丁酰胺基)丁酰胺基)-5- 脲基戊酰胺基的合成
25℃下，将化合物A-2-2(1.5g,2.37mmol)溶于二氯甲烷(3.00mL)中，一次性加入三氟乙酸(1.5mL)，25℃反应2h；用液质联用色谱监测原料反应完全，反应液减压蒸干溶剂，粗品用甲醇(3.00mL)溶解，加入碳酸钾(1.64g,11.85mmol)，搅拌30min，反应液经硅胶柱纯化(二氯甲烷:甲醇＝10:1)得标题化合物500mg。
结构表征数据如下：
ESI-MS(m/z):533.3[M+H] +.
步骤三：(S)-2-((S)-2-(4-(1-(26-叠氮基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十六烷基)哌啶-4-基)丁酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-N-(4-(羟甲基)苯基)-5-脲基戊酰胺的合成
25℃下，将26-叠氮基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十六烷基4-甲基苯磺酸酯(668.72mg,1.13mmol)和化合物A-2-3(1g,1.88mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(5mL)，一次性加入碳酸钾(518.89mg,3.75mmol)，升温至80℃反应2h，用液质联用色谱监测反应，反应液经硅胶柱纯化(二氯甲烷:甲醇＝10:1)得标题化合物600mg。
结构表征数据如下：
ESI-MS(m/z):954.5[M+H] +.
步骤四：4-((S)-2-((S)-2-(4-(1-(26-叠氮基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十六烷基)哌啶-4-基)丁酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基(4-硝基苯基)氨基甲酸酯的合成
25℃下，将化合物A-2-4(733mg,0.77mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(2mL)中，加入DIPEA(396.40mg,3.07mmol)，滴加二(对硝基苯)碳酸酯(701.10mg,2.30mmol)的N,N-二甲基甲酰胺(1mL)溶液，于25℃搅拌反应16h，用液质联用色谱监测反应，反应液经制备高效液相色谱纯化(条件如下)，制备液冷冻干燥得标题化合物400mg。
色谱柱：SunFire Prep C18 OBD 19mm×150mm×5.0μm
流动相A：乙腈；流动相B：水(0.05％三氟乙酸)
时间[min] 流动相A[％] 流动相B[％] 流速[mL/min]
0.00 20 80 70
7.00 20 80 70
60.00 80 20 70
结构表征数据如下：
ESI-MS(m/z):1119.5[M+H] +.
步骤五：4-((S)-2-((S)-2-(4-(1-(26-叠氮基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十六烷基)哌啶-4-基)丁酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基(2-((S)-4-乙基-4-羟基-3,14-二氧代-3,4,12,14-四氢-1H-吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-11-基)乙基)(异丙基)氨基甲酸酯 的合成
25℃下，将贝洛替康(20mg,0.046mmol)，化合物A-2-5(46.47mg,0.042mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(2mL)中，加入HOBT(9.35mg,69.20μmol)，DIPEA(11.90mg,0.092mmol)，反应体系于25℃搅拌反应1h，用液质联用色谱监测反应，反应液经制备高效液相色谱纯化(条件如下)，制备液冷冻干燥得标题化合物41mg。
色谱柱：SunFire Prep C18 ODS 19mm×150mm×5.0μm
流动相A：乙腈；流动相B：水(0.05％甲酸)
时间[min] 流动相A[％] 流动相B[％] 流[mL/min]
0.00 10 90 28
2.00 10 90 28
18.00 90 10 28
结构表征数据如下：
ESI-MS(m/z):1413.5[(M+H] +.
步骤六：4-((S)-2-((S)-3-甲基-2-(4-(1-(26-(4-((6-(2-(甲基磺酰基)嘧啶-5-基)己基-5-炔酰胺基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十六烷基)哌啶-4-基)丁酰胺基)丁酰胺基)-5-脲基戊酰氨基)苄基(2-((S)-4-乙基-4-羟基-3,14-二氧代-3,4,12,14-四氢-1H-吡喃[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-11-基)乙基)(异丙基)氨基甲酸酯的合成
25℃下,将6-(2-(甲基磺酰基)嘧啶-5-基)-N-(丙-2-炔-1-基)-己-5-炔酰胺(IM-2，12.96mg,0.042mmol)和化合物A-2-6(40mg,0.028mmol)溶于二甲基亚砜(1mL)和水(0.25mL)中，加入溴化亚铜(8.20mg,0.057mmol)后反应体系于25℃反应11，用液质联用色谱监测反应，反应液经高效液相色谱纯化(条件如下),制备液冷冻干燥得标题化合物29mg。
色谱柱：SunFire Prep C18 ODS 19mm×150mm×5.0μm
流动相A：乙腈；流动相B：水(0.05％甲酸)
时间[min] 流动相A[％] 流动相B[％] 流速[mL/min]
0.00 10 90 28
2.00 10 90 28
18.00 90 10 28
结构表征数据如下：
ESI-MS(m/z):1718.8[(M+H] +.
实施例三(S)-2-((S)-3-甲基-2-(4-(1-(26-(4-((6-(2-(甲基磺酰基)嘧啶-5-基)己基-5-炔酰胺基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十六烷基)哌啶-4-基)丁酰胺基)丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代 -2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)氨基甲酸酯(A-3)
步骤一：4-((S)-2-((S)-2-(4-(1-(26-叠氮基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十六烷基)哌啶-4-基)丁酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)氨基甲酸酯的合成
25℃下，将(1S,9S)-1-氨基-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-1,2,3,9,12,15-六氢-10H,13H-苯并吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-10,13-二酮(依喜替康，15mg，0.034mmol)和化合物A-2-5(34.70mg,0.031mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(1mL)中，加入HOBT(6.98mg,51.67μmol)和DIPEA(8.89mg,68.89μmol)，反应体系于25℃搅拌反应1h，用液质联用色谱监测反应，反应液经高效液相色谱纯化(条件如下)，制备液冷冻干燥得标题化合物30mg。
色谱柱：SunFire Prep C18 ODS 19mm×150mm×5.0μm
流动相A：乙腈；流动相B：水(0.05％甲酸)
时间[min] 流动相A[％] 流动相B[％] 流速[mL/min]
0.00 10 90 28
2.00 10 90 28
18.00 90 10 28
结构表征数据如下：
ESI-MS(m/z):1415.4[(M+H] +.
步骤二：(S)-2-((S)-3-甲基-2-(4-(1-(26-(4-((6-(2-(甲基磺酰基)嘧啶-5-基)己基-5-炔酰胺基) 甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十六烷基)哌啶-4-基)丁酰胺基)丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)氨基甲酸酯的合成(A-473，A-3)
25℃下，将6-(2-(甲基磺酰基)嘧啶-5-基)-N-(丙-2-炔-1-基)-己-5-炔酰胺(IM-2，9.71mg,0.032mmol)和化合物A-3-1(30mg,0.021mmol)溶于二甲基亚砜(0.5mL)和水(0.1mL)中，随继加入溴化亚铜(6.14mg,0.042mmol)，反应体系于25℃反应1h，用液质联用色谱监测反应，反应液经高效液相色谱纯化(条件如下),制备液冷冻干燥得标题化合物15.74mg。
色谱柱：SunFire Prep C18 ODS 19mm×150mm×5.0μm
流动相A：乙腈；流动相B：水(0.05％甲酸)
时间[min] 流动相A[％] 流动相B[％] 流速[mL/min]
0.00 10 90 28
2.00 10 90 28
18.00 90 10 28
结构表征数据如下：
ESI-MS(m/z):861.1[(M/2+H] +.
实施例四4-((R)-2-((S)-3-甲基-2-(4-(1-(26-(4-((6-(2-(甲磺酰基)嘧啶-5-基)己基-5-炔酰胺)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十六烷基)哌啶-4-基)丁酰胺基)丁酰胺基)丙酰胺)苄基((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)-1-基)氨基甲酸酯(A-4)
步骤一：4-(4-(((S)-1-(((S)-1-((4-(羟甲基)苯基)氨基)-1-氧代丙烷-2-基)基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)氨基)-4-氧代丁基)哌啶-1-羧酸叔丁酯的合成
25℃下，将化合物A-4-1(1.96g,6.67mmol)，4-(N-Boc-4-哌啶基)丁酸(2.35mg,8.67mmol)和EEDQ(2.47mg,10.0mmol)溶于甲醇(20mL)及二氯甲烷(20mL)的混合液中，反应体系加热至45℃反应2h，用液质联用色谱监测反应，反应液浓缩物经硅胶柱纯化(二氯甲烷:甲醇＝15:1)得标题化合物1.5g。
结构表征数据如下：
ESI-MS(m/z):547.1[M+H] +.
步骤二：(S)-N-((S)-1-((4-(羟甲基)苯基)氨基)-1-氧代丙烷-2-基)-3-甲基-2-(4-(哌啶-4-基)丁酰胺)丁酰胺的合成
25℃下，向A-4-2(1.25g,2.37mmol)的二氯甲烷(3.00mL)溶液中加入三氟乙酸(1.5mL)，反应体系在25℃反应2h，用液质联用色谱检测原料反应完全，反应液减压浓缩后的粗品用甲醇(3.00mL)溶解，加入碳酸钾(1.64g,11.85mmol)搅拌30min，后经液质联用色谱检测，反应液经硅胶柱纯化得标题化合物750mg。
结构表征数据如下：
ESI-MS(m/z):447.1[M+H] +.
步骤三：(S)-2-(4-(1-(26-叠氮-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十六烷基)哌啶-4-基)丁氨 基)-N-((S)-1-((4-(羟甲基)苯基)氨基)-1-氧代丙烷-2-基-3-甲基丁胺的合成
25℃下，将26-叠氮基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十六烷基4-甲基苯磺酸酯(1.4mg,2.36mmol)和A-4-3(700mg,1.57mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(5mL),一次性加入碳酸钾(433.9mg,3.14mmol)，反应体系升温至80℃反应2h，用液质联用色谱监测反应，反应液经硅胶柱纯化(石油醚:乙酸乙酯＝1:3)得标题化合物500mg。
结构表征数据如下：
ESI-MS(m/z):868.2[M+H] +.
步骤四：4-((S)-2-((S)-2-(4-(1-(26-叠氮-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十六烷基)哌啶-4-基)丁酰氨基)-3-甲基丁酰氨基)丙氨基)苄基4-对硝基苯甲酸的合成
25℃下，将A-4-4(500mg,0.58mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(2mL)中，加入DIPEA(297.77mg,2.30mmol)后滴加二(对硝基苯)碳酸酯(525.67mg,1.73mmol)的N,N-二甲基甲酰胺(1mL)溶液，反应体系于25℃搅拌反应16h，用液质联用色谱监测反应，反应液经高效液相色谱纯化(条件如下)，制备液冷冻干燥得标题化合物360mg。
色谱柱：SunFire Prep C18 OBD 19mm×150mm×5.0μm
流动相A：乙腈；流动相B：水(0.05％三氟乙酸)
时间[min] 流动相A[％] 流动相B[％] 流速[mL/min]
0.00 20 80 70
7.00 20 80 70
60.00 80 20 70
结构表征数据如下：
ESI-MS(m/z):1017.0[M+H] +.
步骤五：4-((S)-2-((S)-2-(4-(1-(26-叠氮-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十六烷基)哌啶-4-基)丁酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)丙酰胺)苄基((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)氨基甲酸酯的合成
25℃下，将(1S,9S)-1-氨基-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-1,2,3,9,12,15-六氢-10H,13H-苯并吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-10,13-二酮(依喜替康，20.0mg,0.038mmol)和化合物A-4-5(42.10mg,41.4μmol)溶于DMF(1mL)中，加入HOBT(6.1mg,45.2μmol)，DIPEA(9.7mg,75.3μmol)，加毕，反应体系于室温搅拌反应1h，用液质联用色谱监测反应，反应液经高效液相色谱纯化(条件如下)，制备液冷冻干燥得标题化合物32mg。
色谱柱：SunFire Prep C18 OBD 19mm×150mm×5.0μm
流动相A：乙腈；流动相B：水(0.05％甲酸溶液)
时间[min] 流动相A[％] 流动相B[％] 流速[mL/min]
0.00 10 90 28
2.00 10 90 28
18.00 90 10 28
结构表征数据如下：
ESI-MS(m/z):1635.1[M+H] +.
步骤六：4-((S)-2-((S)-3-甲基-2-(4-(1-(26-(4-((6-(2-(甲磺酰基)嘧啶-5-基)己基-5-炔酰胺)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十六烷基)哌啶-4-基)丁酰胺基)丁酰胺基)丙酰胺)苄基((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)-1-基)氨基甲酸酯的合成
25℃下，将化合物A-4-6(30mg,0.023mmol)溶于DMSO(0.5mL)和水(0.1ml)中，加入6-(2-(甲基磺酰基)嘧啶-5-基)-N-(丙-2-炔-1-基)-己-5-炔酰胺(IM-2，10.3mg，0.034mmol)和溴化亚铜(6.5mg,0.045mmol)，反应体系于室温反应1h，用液质联用色谱监测反应，反应液过滤后经高效液相色谱纯化(条件如下)，制备液冷冻干燥得标题化合物15.40mg。
色谱柱：SunFire Prep C18 OBD 19mm×150mm×5.0μm
流动相A：乙腈；流动相B：水(0.05％TFA)
时间[min] 流动相A[％] 流动相B[％] 流速[mL/min]
0.00 10 90 28
2.00 10 90 28
18.00 90 10 28
结构表征数据如下：
ESI-MS(m/z):1635.1[M+H] +.
实施例五：(2S,3S,4S,5R,6S)-6-(4-((((2-((S)-7-乙基-7-羟基-8,11-二氧代-8,10,11,13-四氢-7H-[1,3]二氧杂戊环并[4,5-g]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-14-基)乙基)(异丙基)氨甲酰)氧基)甲基)-2-((18-(2-(甲磺酰基)嘧啶-5-基)-13-氧代-3,6,9-三氧杂-12-氮杂十八烷基-17-炔-1-基)氨甲酰)苯氧基)-3,4,5-三羟基四氢-2H-吡喃-2-羧酸(A-5)
步骤一：叔丁基(1-(5-甲酰基-2-羟基苯基)-1-氧代-5,8,11-三氧代-2-氮杂十三烷-13-基)氨基甲酸酯的合成
将5-甲酰基-2-羟基苯甲酸(A-5-2,625.04mg,3.76mmol)溶于二氯甲烷(20mL)，滴入1滴DMF后再滴入氯化亚砜(2mL)，加热回流反应2小时。减压浓缩后溶于二氯甲烷(5mL)得到酰氯中间体溶液备用。将叔丁氧羰基三聚乙二醇胺(A-5-1,1g,3.42mmol) 溶于二氯甲烷(20mL)，冷却至0℃后，相继滴入上述酰氯溶液和二异丙基乙胺(36.47mg,0.282mmol)，反应体系缓慢升至室温后反应12h，随后减压浓缩、制备纯化(条件如下)得A-5-3(271mg)。
ESI-MS(m/z):441.2[M+1] +.
色谱柱：Waters XBridge Prep C18OBD(5μm*19mm*150mm)
流动相A：乙腈；流动相B：水(0.05％碳酸氢铵)
时间[min] 流动相A[％] 流动相B[％] 流速[mL/min]
0.00 10 90 28
2.00 10 90 28
18.00 90 10 28
步骤二：(2R,3R,4S,5S,6S)-2-(2-((2,2-二甲基-4-氧代-3,8,11,14-四氧代-5-氮杂十六烷-16-基)氨甲酰基)-4-甲酰基苯氧基)-6-(甲氧羰基)四氢-2H-吡喃-3,4,5-三乙酸酯的合成
将A-5-3(270mg，0.613mmol)和(2R,3R,5S)-2-溴-6-(甲氧羰基)四氢-2H-吡喃-3,4,5-三乙酸酯(A-5-4，267.80mg，0.674mmol)溶于乙腈(30mL)，加入氧化银(568.18mg，2.45mmol)和4A分子筛粉末(1g)，氮气保护下搅拌反应16小时。反应体系过滤后的滤液经减压浓缩得A-5-5粗品460mg，直接进行下一步反应。
ESI-MS(m/z):757.4[M+1] +.
步骤三：(2S,3R,4S,5S,6S)-2-(2-((2,2-二甲基-4-氧代-3,8,11,14-四氧代-5-氮杂十六烷-16-基)氨甲酰基)-4-(羟甲基)苯氧基)-6-(甲氧羰基)四氢-2H-吡喃-3,4,5-三乙酸酯的合成
将A-5-5(460mg,0.608mmol)溶于二氯甲烷(5mL)和异丙醇(5mL)，搅拌下加入硅胶粉(1g)和硼氢化钠(11.50mg，0.304mmol)，反应2小时，过滤，滤液经减压浓缩后制备纯化(条件如下)得A-5-6(343mg)。
ESI-MS(m/z):759.3[M+1] +.
色谱柱：Waters XBridge Prep C18OBD(8μm*45mm*450mm)
流动相A：乙腈；流动相B：水(0.05％碳酸氢铵)
时间[min] 流动相A[％] 流动相B[％] 流速[mL/min]
0.00 25 75 70
5.00 25 75 70
50.0 90 10 70
步骤四：(2S,3R,4S,5S,6S)-2-(2-((2,2-二甲基-4-氧代-3,8,11,14-四氧代-5-氮杂十六烷-16-基)氨甲酰基)-4-(((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)甲基)苯氧基)-6-(甲氧基羰基)四氢-2H-吡喃-3,4,5-三乙酸酯的合成
将A-5-6(343mg,0.452mmol)溶于干燥二氯甲烷(25mL)，加入二异丙基乙胺(175.27mg，1.36mmol)，搅拌下滴入对硝基苯基氯甲酸酯(273.35mg，1.36mmol，溶于25mL二氯甲烷)，室温反应12小时，反应体系经减压浓缩和硅胶柱纯化(洗脱剂：6％甲醇/二氯甲烷)得化合物A-5-7(342mg)。
步骤五：(2S,3R,4S,5S,6S)-2-(2-((2,2-二甲基-4-氧代-3,8,11,14-四氧代-5-氮杂十六烷-16-基)氨甲酰基)-4-(((2-((S)-7-乙基-7-羟基-8,11-二氧代-8,10,11,13-四氢-7H-[1,3]二氧杂戊环并[4,5-g]吡喃并[3',4':6,7]引哚嗪并[1,2-b]喹啉-14-基)乙基)(异丙基)氨甲酰基)氧基)甲基)苯氧基)-6-(甲氧羰基)四氢-2H-吡喃-3,4,5-三乙酸乙酯的合成
将A-5-7(53.93mg，0.058mmol)、(S)-7-乙基-7-羟基-14-(2-(异丙胺基)乙基)-10,13-二氢-11H-[1,3]二氧戊环并[4,5-g]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-8,11(7H)-二酮(A-5-8，20mg，0.039mmol)和HOBt(15.77mg，0.117mmol)溶于DMF(1mL)，滴入二异丙基乙胺(15.09mg，0.117mmol)，搅拌反应12小时，加水和乙酸乙酯搅拌，静置分液，有机相用饱和食盐水洗涤后干燥，减压浓缩得A-5-9的粗品49mg，直接进行下一部反应。
ESI-MS(m/z):1262.5[M+1] +.
步骤六：(2S,3S,4S,5R,6S)-6-(2-((2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)氨甲酰基)-4-(((2-((S)-7-乙基-7-羟基-8,11-二氧基-8,10,11,13-四氢-7H-[1,3]二氧杂戊环并[4,5-g]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-14-基)乙基)(异丙基)氨甲酰基)氧基)甲基)苯氧基)-3,4,5-三羟基四氢-2H-吡喃-2-羧酸的合成
将A-5-9(49mg，0.039mmol)溶于甲醇(2mL)，滴入氢氧化锂水溶液(13.03mg，0.311mmol，溶于0.5mL水)，搅拌反应1小时，体系减压浓缩后滴入三氟乙酸(2mL)，搅拌反应1小时，液质联用色谱监控反应至完全。反应体系减压浓缩后经制备纯化(条件如下)得化合物A-5-10(23mg)。
ESI-MS(m/z):1022.0[M+1] +.
色谱柱：Waters XBridge Prep C18OBD(5μm*19mm*150mm)
流动相A：乙腈；流动相B：水(0.05％TFA)
时间[min] 流动相A[％] 流动相B[％] 流速[mL/min]
0.00 10 90 28
2.00 10 90 28
18.00 90 10 28
步骤七：(2S,3S,4S,5R,6S)-6-(4-((((2-((S)-7-乙基-7-羟基-8,11-二氧代-8,10,11,13-四氢-7H-[1,3]二氧杂戊环并[4,5-g]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-14-基)乙基)(异丙基)氨 甲酰)氧基)甲基)-2-((18-(2-(甲磺酰基)嘧啶-5-基)-13-氧代-3,6,9-三氧杂-12-氮杂十八烷基-17-炔-1-基)氨甲酰)苯氧基)-3,4,5-三羟基四氢-2H-吡喃-2-羧酸的合成
将A-5-10(23mg，0.020mmol)和(2,5-二氧吡咯烷-1-基)-6-(2-甲基磺酰嘧啶-5-基)己酸-5-炔酯(IM-3，8.14mg，0.022mmol)溶于DMF(1mL)，滴入二异丙基乙胺(7.85mg，0.061mmol)，搅拌反应2小时，TLC监测原料基本反应完全。反应体系经制备纯化(条件如下)得化合物A-5(5.10mg)。
ESI-MS(m/z):1272.3[M+1] +.
色谱柱：SunFire Prep C18 OBD 19mm×150mm×5.0μm
流动相A：乙腈；流动相B：水(0.05％甲酸)
时间[min] 流动相A[％] 流动相B[％] 流速[mL/min]
0.00 30 70 24
2.00 30 70 24
18.00 70 30 24
实施例六(2S,3S,4S,5R,6S)-6-(4-(((2-((S)-7-乙基-7-羟基-8,11-二氧-8,10,11,13-四氢-7H-[1,3]二氧戊环并[4,5-g]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-14-基)乙基)(异丙基)氨甲酰基)氧基)甲基)-2-(2-(2-(2-(6-(2-(甲磺酰基)嘧啶-5-基)乙氧基)乙酰胺基)乙酰胺基)苯氧基)-3,4,5-三羟基四氢-2H-吡喃-2-羧酸(A-6)
步骤一：(2S,3R,4S,5S,6S)-2-(4-(羟甲基)-2-硝基苯氧基)-6-(甲氧羰基)四氢-2H-吡喃-3,4,5-三乙酸酯的合成
将化合物(2R,3R,4S,5S,6S)-2-溴-6-(甲氧羰基)四氢-2H-吡喃-3,4,5-三乙酸三酯(A-5-
4,12.32g,31.02mmol)和4-羟基-3-硝基苄醇(A-6-1,5g,29.56mmol)溶于乙腈(200mL)中，搅拌下加入氧化银(27.40g,118.25mmol)，氮气置换后避光室温反应12小时。用液质联用色谱监测反应至完全，反应体系经硅藻土抽滤，滤液减压浓缩后经硅胶柱层析纯化(石油醚:乙酸乙酯＝1:3)得标题化合物12.8g。
结构表征数据如下：
ESI-MS(m/z):503[M+18] +.
步骤二：(2S,3R,4S,5S,6S)-2-(2-氨基-4-(羟甲基)苯氧基)-6-(甲氧羰基)四氢-2H-吡喃-3,4,5-三乙酸酯的合成
将化合物A-6-2(2.2g,4.53mmol)溶于乙酸乙酯和四氢呋喃(各50.00mL)中，加入PtO 2(200mg)，然后用氢气球置换反应体系三次，并在氢气氛围下反应2小时。用液质联用色谱监测反应，反应体系经过滤，滤液减压浓缩至干得标题化合物粗品2.02g，直 接用于下一步反应。
结构表征数据如下：
ESI-MS(m/z):456.1[M+1] +.
步骤三：(2S,3R,4S,5S,6S)-2-(2-(1-(9H-芴-9-基)-3-氧代-2,7,10-三氧基-4-氮杂十二烷基)-4-(羟甲基)苯氧基)-6-(甲氧羰基)四氢-2H-吡喃-3,4,5-三乙酸酯的合成
将化合物A-6-3(456mg,1.00mmol和[2-[2-(Fmoc-氨基)乙氧基]乙氧基]乙酸(A-6-4，385.91mg,1.00mmol)溶于二氯甲烷(10mL)，搅拌下加入2-乙氧基-1-乙氧碳酰基-1,2-二氢喹啉(495.22mg,2.00mmol)，搅拌反应2小时。用液质联用色谱监测反应，反应液经减压浓缩后经硅胶柱层析纯化(甲醇:二氯甲烷＝1:20)得标题化合物507mg。
结构表征数据如下：
ESI-MS(m/z):823.3[M+1] +.
步骤四：(2S,3R,4S,5S,6S)-2-(2-(1-(9H-芴-9-基)-3-氧代-2,7,10-三氧基-4-氮杂十二酰胺)-4-(((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)甲基)苯氧基)-6-(甲氧基羰基)四氢-2H-吡喃-3,4,5-三乙酸酯的合成
向化合物A-6-5(507mg,616.18μmol)和二异丙基乙胺(238.91mg,1.85mmol)的二氯甲烷(20mL)中缓慢滴加硝基苯基氯甲酸酯(372.60mg,1.85mmol)的二氯甲烷(1mL)溶液，加毕，反应体系在室温反应15h。用液质联用色谱监测反应，反应液经减压浓缩后经硅胶柱层析纯化(甲醇:二氯甲烷＝1:20)得标题化合物496mg。
结构表征数据如下：
ESI-MS(m/z):988.5[M+1] +.
步骤五：(2S,3R,4S,5S,6S)-2-(2-(1-(9H-芴-9-基)-3-氧代-2,7,10-三氧基-4-氮杂十二酰胺)-4-((((2-((S)-7-乙基-7-羟基-8,11-二氧基-8,10,11,13-四氢-7H-[1,3]二氧戊环并[4,5-g]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-14-基)乙基)(异丙基)氨甲酰基)氧基)甲基)苯氧基)-6-(甲氧羰基)四氢-2H-吡喃-3,4,5-三乙酸酯的合成
将化合物A-6-6(165.51mg,0.168mmol)、化合物A-5-8(40mg,0.084mmol)和1-羟基苯并三唑(33.96mg,0.251mmol)溶于DMF(4mL)，滴入二异丙基乙胺(32.48mg,0.251mmol)，搅拌反应12h。用液质联用色谱监测反应，向反应体系加入适量水和乙酸乙酯，经搅拌和静止分液，有机相用饱和食盐水洗涤后干燥，后经过滤和减压浓缩得标题化合物粗品100mg，直接进行下一步反应。
结构表征数据如下：
ESI-MS(m/z):1326.2[M+1] +.
步骤六：(2S,3S,4S,5R,6S)-6-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙酰胺基)-4-(((2-((S)-7-乙基 -7-羟基-8,11-二氧基-8,10,11,13-四氢-7H-[1,3]二氧戊环并[4,5-g]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-14-基)乙基)(异丙基)氨甲酰基)氧基)甲基)苯氧基)-3,4,5-三羟基四氢-2H-吡喃-2-羧酸的合成
向化合物A-6-7(100mg,0.075mmol)的MeOH(5mL)溶液中滴加1滴二氯甲烷和氢氧化锂一水合物(15.82mg,0.377mmol)的水溶液(1mL)，搅拌反应2小时，用液质联用色谱监测反应，加入3N盐酸水溶液调节反应液pH＝4，反应体系经减压浓缩后用高效液相色谱纯化(条件如下)，制备液冷冻干燥得标题化合物27.0mg。
色谱柱：SunFire Prep C18 OBD 19mm×150mm×5.0μm
流动相A：乙腈；流动相B：水(0.05％甲酸)
时间[min] 流动相A[％] 流动相B[％] 流速[mL/min]
0.00 20 80 28
2.00 20 80 28
18.00 80 20 28
结构表征数据如下：
ESI-MS(m/z):964.2[M+1] +.
步骤七：(2S,3S,4S,5R,6S)-6-(4-(((2-((S)-7-乙基-7-羟基-8,11-二氧-8,10,11,13-四氢-7H-[1,3]二氧戊环并[4,5-g]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-14-基)乙基)(异丙基)氨甲酰基)氧基)甲基)-2-(2-(2-(2-(6-(2-(甲磺酰基)嘧啶-5-基)乙氧基)乙酰胺基)乙酰胺基)苯氧基)-3,4,5-三羟基四氢-2H-吡喃-2-羧酸的合成
将化合物A-6-8(27mg,0.028mmol)和2,5-二氧吡咯烷-1-基6-(2-(甲磺酰基)嘧啶-5-基)己-5-炔酸酯(IM-3，11.26mg,0.031mmol)溶于DMF(1mL)，搅拌下滴入二异丙基乙胺(3.62mg,0.028mmol)，室温反应4小时，用液质联用色谱监测反应，反应液用高效液相色谱纯化(条件如下)，制备液冷冻干燥得标题化合物11.7mg。
色谱柱：SunFire Prep C18 OBD 19mm×150mm×5.0μm
流动相A：乙腈；流动相B：水(0.05％甲酸)
时间[min] 流动相A[％] 流动相B[％] 流速[mL/min]
0.00 20 80 28
2.00 20 80 28
18.00 80 20 28
结构表征数据如下：
ESI-MS(m/z):1214.4[M+1] +.
实施例七(2S，3S，4S，5R，6S)-6-(4-((((((((((1S，9S)-9-乙基-5-氟-9- 羟基-4-甲基-10,13-二氧代-1,2,3,9,10,12,13,15-八羟基苯并[de]吡喃[3'，4'：6,7]吲哚嗪[1,2-b]喹啉-1-基)氨甲酰基)氧基)甲基)-2-(2-(2-(6-(2-(2-(甲磺酰基)嘧啶-5-基)己-5-炔酰胺基)乙氧基)乙酰胺基)苯氧基)-3,4,5-三羟基四氢-2H-吡喃-2-羧酸(A-7)
步骤一：(2S，3R，4S，5S，6S)-2-(2-(1-(9H-芴-9-基)-3-氧代-2,7,10-三氧-4-氮杂十二酰胺)-4-(((((((1S，9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-1,2,3,9,10,12,13,15-八氢苯并[de]吡喃并[3'，4'：6,7]吲哚嗪[1,2-b]喹啉-1-基)氨甲酰基)氧基)甲基)苯氧基)-6-(甲氧羰基)四氢-2H-吡喃-3,4,5-三乙酸乙酯的合成
将A-6-6(185.85mg，0.188mmol)，依喜替康(50mg，0.094mmol)和HOBt(38.13mg，0.282mmol)溶于DMF(4mL)，滴入二异丙基乙胺(36.47mg,0.282mmol)，搅拌反应12小时。LCMS监测原料反应完全。反应体系经水和乙酸乙酯萃取，有机相用饱和食盐水洗涤后干燥，减压浓缩得黄色油状物粗品120mg，直接进行下一步反应。
ESI-MS(m/z):1285.4[M+1] +
步骤二：(2S，3S，4S，5R，6S)-6-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙酰胺基)-4-(((((1S，9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧基-1,2,3,9,10,12,13,15-八羟基苯并[de]吡喃[3'，4'：6,7]吲哚嗪[1,2-b]喹啉-1-基)氨甲酰基)氧基)苯氧基)-3,4,5-三羟基四氢-2H-吡喃-2-羧酸的合成
将A-7-1(120mg，0.093mmol)溶于甲醇(5mL)和二氯甲烷(约50uL)，滴入氢氧化锂水溶液(31.37mg，0.747mmol，溶于1mL水)，搅拌反应2小时。LCMS监测原料反应完全。向反应体系中滴入3N盐酸水溶液调pH＝4，减压浓缩后制备纯化先后得到A-7-2白色固体32mg。
ESI-MS(m/z):922.3[M+1] +
步骤三：(2S，3S，4S，5R，6S)-6-(4-((((((((((1S，9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-1,2,3,9,10,12,13,15-八羟基苯并[de]吡喃[3'，4'：6,7]吲哚嗪 [1,2-b]喹啉-1-基)氨甲酰基)氧基)甲基)-2-(2-(2-(6-(2-(2-(甲磺酰基)嘧啶-5-基)己-5-炔酰胺基)乙氧基)乙酰胺基)苯氧基)-3,4,5-三羟基四氢-2H-吡喃-2-羧酸的合成
将A-7-2(30mg,0.033mmol)和2,5-二氧吡咯烷-1-基6-(2-(甲磺酰基)嘧啶-5-基)己-5-炔酸酯(IM-3，13.08mg,0.036mmol)溶于DMF(1mL)，搅拌下滴入二异丙基乙胺(4.21mg,0.033mmol)，室温反应4小时。LCMS监测原料反应完全。反应体系经制备纯化得到A-7白色固体18.54mg。ESI-MS(m/z):1171.8[M+1] +
色谱柱：Waters XBridge Prep C18OBD(5μm*19mm*150mm)
流动相A：乙腈；流动相B：水(0.05％甲酸)
时间[min] 流动相A[％] 流动相B[％] 流速[mL/min]
0.00 10 90 25
2.00 10 90 25
18.00 90 10 25
实施例八(9S)-1-氨基-5-氯-9-乙基-9-羟基-4-甲基-1,2,3,9,12,15-六氢-10H,13H-苯并吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-10,13-二酮(1-4)
步骤一：1-氯-3-溴-2-甲基-5-硝基苯的合成
25℃下，将化合物1-4-1(5.00g,29.14mmol)溶于正庚烷(25mL)中，加入浓硫酸(25mL)，加热至50℃，50℃下分批次加入NBS(6.22g,34.97mmol)，保持50℃反应2小时，用薄层色谱检测反应(乙酸乙酯:石油醚＝1:10)，将冷却至室温的反应液滴加入冰水中，甲苯萃取，有机相合并，经亚硫酸钠溶液、水和饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，减压浓缩，粗品用制备高效液相色谱纯化，制备液冷冻干燥得标题化合物4.88g。
色谱柱：C18 ODS 45mm×450mm×8.0μm
流动相A：乙腈；流动相B：水(0.05％甲酸)
时间[min] 流动相A[％] 流动相B[％] 流速[mL/min]
0 60 40 60
10 60 40 60
40 100 0 60
步骤二：3-氯-5-溴-4-甲基苯胺的合成
25℃下，将化合物1-4-2(4.88g,19.48mmol)溶于乙酸乙酯(100mL)中，加入铂碳(2.00g,19.48mmol,含量5％)，氢气置换后在氢气球保护下60℃反应4小时，用液质联用色谱监测反应。将反应液过滤，滤液经浓缩，得粗品标题化合物3.68g，未经进一步纯化直接用于下一步反应。
步骤三：N-(3-氯-5-溴-4-甲基苯基)乙酰胺的合成
20℃下，将化合物1-4-3(3.63g,14.82mmol)溶于乙酸乙酯(70mL)，加入三乙胺(4.50g,44.45mmol)和醋酸酐(2.27g,22.23mmol)，保持20℃反应20小时，用液质联用色谱监测反应。向反应液加入水和乙酸乙酯萃取，合并有机相，经无水硫酸钠干燥，减压浓缩得粗品，粗品经乙酸乙酯:石油醚＝1:5混合溶剂打浆得标题化合物2.86g。
步骤四：(Z)-4-(5-乙酰胺基-3-氯-2-甲基苯基)丁-3-烯酸的合成
20℃下，将化合物1-4-4(1.80g,6.86mmol)溶于THF(20mL)和水(5mL)中，加入乙烯基乙酸(708.31mg,8.23mmol)，DIPEA(1.95g,15.08mmol)，三(邻甲基苯基)磷(62.60mg,0.20mmol)，反应体系经氮气置换后加热至70℃反应5小时，用液质联用色谱监测反应。向反应液中加入1N氢氧化钠溶液调节pH＝8，加入乙酸乙酯萃取。剩余水相经1N盐酸调节pH＝3，乙酸乙酯萃取，合并有机相，经无水硫酸钠干燥，减压浓缩，得标题化合物0.82g，直接用于下一步反应。
步骤五：4-(5-乙酰胺基-3-氯-2-甲基苯基)丁酸的合成
20℃下，将化合物1-4-5(2.60g,9.71mmol)溶于THF(50mL)中，加入Pd/C(0.52g，含量10％)，体系经氢气置换后在氢气球保护下40℃反应2小时，用液质联用色谱监测反应。将反应液过滤，滤液经减压浓缩得标题化合物2.43g，未经进一步纯化直接用于下一步反应。
步骤六：N-(3-氯-4-甲基-8-氧代-5,6,7,8-四氢萘-1-基)乙酰胺的合成
将化合物1-4-6(2.43g,9.01mmol)溶于三氟乙酸(10mL)中，降温至5℃，滴加入三氟乙酸酐(3.78g,18.02mmol,2.50mL)，保持5℃反应4小时，用液质联用色谱监测反应。将反应液加入水中，用10N氢氧化钠溶于调节pH＝9，加入乙酸乙酯萃取，合并有机相，经 无水硫酸钠干燥，减压浓缩，经快速硅胶柱纯化(乙酸乙酯:石油醚＝0-20％)，得标题化合物1.53g。
步骤七:(Z)-N-(3-氯-7-(羟基亚氨基)-4-甲基-8-氧代-5,6,7,8-四氢萘-1-基)乙酰胺的合成
5℃下，将叔丁醇钾(1.50g,13.37mmol)溶于THF(16mL)和叔丁醇(4mL)中，滴加入化合物1-4-7(1.53g,6.08mmol)的THF溶液(16mL)，10分钟后滴加入亚硝酸戊酯(1.14g,9.73mmol)，保持5℃反应1小时，用液质联用色谱监测反应。用1N盐酸将反应液调节pH＝5，乙酸乙酯萃取，合并有机相经无水硫酸钠干燥，经减压浓缩，浓缩物经甲基叔丁基醚打浆得标题化合物1.20g。
步骤八：N-(7-氨基-3-氯-4-甲基-8-氧代-5,6,7,8-四氢萘-1-基)乙酰胺
20℃下，将化合物1-4-8(0.50g,1.78mmol)溶于甲醇(8mL)和2N盐酸(8mL)中，加入Pd/C(0.15g，含量10％)，体系经氢气置换后在氢气球保护下保持5℃反应2小时，用液质联用色谱监测反应。反应液过滤，滤液经减压浓缩，得标题化合物的盐酸盐0.52g，未经进一步纯化直接用于下一步反应。
步骤九：N,N’-(3-氯-4-甲基-8-氧代-5,6,7,8-四氢萘-1,7-二基)二乙酰胺的合成
20℃下，将化合物1-4-9(0.52g,1.70mmol)溶于吡啶(5mL)中，加入醋酸酐(2mL)，保持20℃反应2小时，用液质联用色谱监测反应。将反应液加入水中，乙酸乙酯萃取，有机相经水洗，合并，经无水硫酸钠干燥，减压浓缩，浓缩物经快速硅胶柱纯化(乙酸乙酯:石油醚＝0-30％)得标题化合物0.22g。
步骤十：N-(8-氨基-6-氯-5-甲基-1-氧代-1,2,3,4-四氢萘-2-基)乙酰胺的合成
20℃下，将化合物1-4-10(0.45g,1.46mmol)溶于甲醇(16mL)中，加入2N盐酸(16mL)，加热至60℃反应2小时，用液质联用色谱监测反应。向冷却后的反应液中加入饱和碳酸氢钠溶液调节pH＝8，乙酸乙酯萃取，合并有机相，经无水硫酸钠干燥，减压浓缩，得标题化合物0.23g,未经进一步纯化直接用于下一步反应。
步骤十一：N-((9S)-5-氯-9-乙基-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)乙酰胺的合成
将化合物1-4-11(0.23g,0.78mmol)溶于甲苯(10mL)中，加入(S)-4-乙基-4-羟基-7,8-二氢-1H-吡喃并[3,4-f]吲哚嗪-3,6,10(4H)-三酮(0.23g,0.87mmol)，对甲基苯磺酸(26.73mg,0.16mmol)，加热至140℃反应5小时，用液质联用色谱监测反应。将反应液浓缩，粗品经快速硅胶柱纯化(甲醇:二氯甲烷＝0-10％)，得标题化合物0.15g。
步骤十二：(9S)-1-氨基-5-氯-9-乙基-9-羟基-4-甲基-1,2,3,9,12,15-六氢-10H,13H-苯并吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-10,13-二酮的合成
将化合物1-4-12(40.00mg,0.08mmol)加入浓盐酸(1mL)中，加热至100℃反应5小时， 用液质联用色谱监测反应。将反应液过滤，滤液用制备高效液相色谱纯化，制备液经冷冻干燥得标题化合物1-4的三氟乙酸盐12.00mg。
色谱柱：SunFire Prep C18 OBD 19mm×150mm×5.0μm
流动相A：乙腈；流动相B：水(0.05％三氟乙酸)
时间[min] 流动相A[％] 流动相B[％] 流速[mL/min]
0 5 95 28
2 5 95 28
18 50 50 28
结构表征数据如下：
ESI-MS(m/z):452.1[M+H]+.
实施例九N-((1S,9S)-5-氯-9-乙基-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)-2-羟基乙酰胺和N-((1R,9S)-5-氯-9-乙基-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)-2-羟基乙酰胺(1-7-A和1-7-B)
注： ＊表示手性原子
步骤一:2-((叔丁基二苯基硅基)氧基)-N-((1S,9S)-5-氯-9-乙基-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)乙酰胺和2-((叔丁基二苯基硅基)氧基)-N-((1R,9S)-5-氯-9-乙基-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)乙酰胺的合成
25℃下，将化合物1-4的三氟乙酸盐(40.00mg,81.91μmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(1mL)中，依次加入2-((叔丁基二苯基硅基)氧基)乙酸(30.91mg,98.29μmol)，HATU(62.25mg,163.81μmol)和N,N-二异丙基乙胺(42.34mg,327.63μmol)，保持25℃反应0.5小时，用液质联用色谱监测反应。反应完成后向反应液中加入水，用二氯甲烷/甲醇(v/v＝10/1)萃取，有机相合并，经无水硫酸钠干燥后减压浓缩，粗品经制备薄层色谱纯化(二氯甲烷:甲醇＝20:1)分离得到两个异构体，依据Rf值将两个异构体命名为1-7-1-A(15.00mg，Rf值为0.3)和1-7-1-B(12.00mg，Rf值为0.35)。
步骤二:N-((1S,9S)-5-氯-9-乙基-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢 -1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)-2-羟基乙酰胺和N-((1R,9S)-5-氯-9-乙基-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)-2-羟基乙酰胺的合成
25℃下，在两个反应瓶中分别将1-7-1-A(15.00mg)和1-7-1-B(12.00mg)溶于四氢呋喃(1mL)中，分别滴加入四丁基氟化铵(1M四氢呋喃溶液)/冰醋酸混合液(v/v＝13/1)(50uL)，保持25℃反应0.5小时，用液质联用色谱监测反应。反应完成后将反应液分别用制备高效液相色谱纯化，制备液分别进行冷冻干燥得到化合物1-7-A(6.94mg)和1-7-B(4.00mg)。
色谱柱:SunFire Prep C18 OBD 19mm×150mm×5.0μm
流动相A:乙腈；流动相B:水(0.05％甲酸)
时间[min] 流动相A[％] 流动相B[％] 流速[mL/min]
0 20 80 28
3 20 80 28
18 90 10 28
1-7-A结构表征数据如下:
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.43(d,J＝8.8Hz,1H),8.16(s,1H),7.31(s,1H),6.55(s,1H),5.65-5.36(m,4H),5.21(q,J＝19.0Hz,2H),3.95(d,J＝5.7Hz,2H),3.26-3.11(m,2H),2.53(s,3H),2.30-2.08(m,2H),1.94-1.79(m,2H),0.87(t,J＝7.3Hz,3H).
ESI-MS(m/z):510.1[M+H] +.
1-7-B结构表征数据如下:
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.45(d,J＝8.9Hz,1H),8.15(s,1H),7.31(s,1H),6.54(s,1H),5.64-5.35(m,4H),5.19(q,J＝19.0Hz,2H),3.97(d,J＝5.2Hz,2H),3.27-3.10(m,2H),2.51(s,3H),2.27-2.10(m,2H),1.93-1.80(m,2H),0.88(t,J＝7.3Hz,3H).
ESI-MS(m/z):510.1[M+H] +.
实施例十：(2S,3S,4S,5R,6S)-6-(4-(((((((((1S,9S)-5-氯-9-乙基-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-1,2,3,9,10,12,13,15-八羟基苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)氨甲酰基)氧基)甲基)-2-(2-(2-(6-(2-(2-(甲磺酰基)嘧啶-5-基)己-5-乙酰胺基)乙氧基)乙酰胺基)苯氧基)-3,4,5-三羟基四氢-2H-吡喃-2-羧酸和(2S,3S,4S,5R,6S)-6-(4-(((((((((1R,9S)-5-氯-9-乙基-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-1,2,3,9,10,12,13,15-八羟基苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)氨甲酰基)氧基)甲基)-2-(2-(2-(6-(2-(2-(甲磺酰基)嘧啶-5-基)己-5-乙酰胺基)乙氧基)乙酰胺基)苯氧基)-3,4,5-三羟基四氢-2H-吡喃-2-羧酸(A-8/9-A和A-8/9-B)
注：*表示手性原子
步骤一：(2S,3S,4S,5R,6S)-2-(2-(1-(9H-芴-9-基)-3-氧代-2,7,10-三氧-4-氮杂十二酰胺)-4-((((((((9S)-5-氯-9-乙基-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-1,2,3,9,10,12,13,15-八氢苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)氨甲酰基)氧基)甲基)苯氧基)-6-(甲氧羰基)四氢-2H-吡喃-3,4,5-三乙酸乙酯的合成
将原料A-6-6(303mg，0.307mmol)、1-4(100mg，0.205mmol)和HOBt(83mg，0.614mmol)溶于DMF(5mL)，滴入二异丙基乙胺(79mg,0.614mmol)，搅拌反应12小时。加入水和乙酸乙酯搅拌，静止分液，有机相用饱和食盐水洗涤后干燥，减压浓缩得A-8/9-1的粗品260mg，直接进行下一步反应。
ESI-MS(m/z):1300.7[M+1] +.
步骤二：(2S,3S,4S,5R,6S)-6-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙酰胺基)-4-(((((9S)-5-氯-9-乙基-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-1,2,3,9,10,12,13,15-八羟基苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)氨甲酰基)氧基)苯氧基)-3,4,5-三羟基四氢-2H-吡喃-2-羧酸的合成
A-8/9-1(260mg，0.200mmol)溶于甲醇(5mL)，再滴入两滴二氯甲烷溶清，滴入氢氧化锂水溶液(67mg，1.60mmol，溶于0.5mL水)，搅拌反应2小时。LCMS监测原料反应完全。向反应体系中加入3N盐酸水溶液调至pH＝4，减压浓缩后制备纯化(条件如下)得A-8/9-2(63mg)。
ESI-MS(m/z):938.3[M+1] +.
色谱柱：Waters XBridge Prep C18OBD(5μm*19mm*150mm)
流动相A：乙腈；流动相B：水(0.05％甲酸)
时间[min] 流动相A[％] 流动相B[％] 流速[mL/min]
0.00 10 90 25
2.00 10 90 25
18.00 90 10 25
步骤三：(2S,3S,4S,5R,6S)-6-(4-(((((((((1S,9S)-5-氯-9-乙基-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-1,2,3,9,10,12,13,15-八羟基苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)氨甲酰基)氧基)甲基)-2-(2-(2-(6-(2-(2-(甲磺酰基)嘧啶-5-基)己-5-乙酰胺基)乙氧基)乙酰胺基)苯氧基)-3,4,5-三羟基四氢-2H-吡喃-2-羧酸和(2S,3S,4S,5R,6S)-6-(4-(((((((((1R,9S)-5-氯-9-乙基-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-1,2,3,9,10,12,13,15-八羟基苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)氨甲酰基)氧基)甲基)-2-(2-(2-(6-(2-(2-(甲磺酰基)嘧啶-5-基)己-5-乙酰胺基)乙氧基)乙酰胺基)苯氧基)-3,4,5-三羟基四氢-2H-吡喃-2-羧酸的合成
A-8/9-2(63mg,0.067mmol)和2,5-二氧吡咯烷-1-基6-(2-(甲磺酰基)嘧啶-5-基)己-5-炔酸酯(IM-3，27mg,0.074mmol)溶于DMF(1mL)，搅拌下滴入二异丙基乙胺(9mg,0.067mmol)，室温反应4小时。LCMS监测原料反应完全。反应液经制备分离纯化(条件如下)先后得到A-8/9-A 10.14mg和A-8/9-B 14.60mg。
色谱柱：Waters XBridge Prep C18OBD(5μm*19mm*150mm)
流动相A：乙腈；流动相B：水(0.05％甲酸)
时间[min] 流动相A[％] 流动相B[％] 流速[mL/min]
0.00 30 70 28
2.00 30 70 28
18.00 70 30 28
A-8/9-A出峰保留时间为：8.90min。ESI-MS(m/z):1188.6[M+1] +。
A-8/9-B出峰保留时间为：9.10min。ESI-MS(m/z):1188.6[M+1] +。
实施例十一N-((10S)-10-苄基-1-(((1S,9S)-5-氯-9-乙基-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4'；6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)氨 基)-1,6,9,12,15-五氧代-3-氧代-5,8,11,14-四氮杂十六烷-16-基)-6-(2-(甲磺酰基)嘧啶-5-基)十六烷酰胺和N-((10S)-10-苄基-1-(((1R,9S)-5-氯-9-乙基-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4'；6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)氨基)-1,6,9,12,15-五氧代-3-氧代-5,8,11,14-四氮杂十六烷-16-基)-6-(2-(甲磺酰基)嘧啶-5-基)十六烷酰胺(A-10/11-A和A-10/11-B)
步骤一：(S)-10-苄基-23-(2-(甲磺酸基)嘧啶-5-基)-6,9,12,15,18-五氧代-3-氧代-5,8,11,14,17-五氮杂十八烷-22-炔羧酸的合成
将化合物IM-4(30.00mg,70.00μmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(1mL)中，加入2,5-二氧吡咯烷-1-基6-(2-(甲磺酸)嘧啶-5-基)己基-5-炔酸酯(IM-3，28.00mg,77.00μmol)，室温反应1小时，用液质联用色谱监测反应。反应液直接用制备高效液相色谱纯化，制备液冷冻干燥得标题化合物IM-5(20.00mg)。
色谱柱：SunFire Prep C18 OBD 19mm×150mm×5.0μm
流动相A：乙腈；流动相B：水(0.05％甲酸)
时间[min] 流动相A[％] 流动相B[％] 流速[mL/min]
0.00 10 90 28
2.00 10 90 28
18.00 90 10 28
结构表征数据如下：
ESI-MS(m/z):691.0[M+18]+.
步骤二
25℃下，将1-4的盐酸盐(30mg,61.43μmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(1mL)中，依次加入IM-5(49.66mg,73.72μmol)、HATU(35.01mg,92.14μmol)和N,N-二异丙基乙胺(23.82mg,184.29μmol)，保持25℃反应0.5小时，用液质联用色谱监测反应，反应完成后将反应液用制备高效液相色谱纯化(条件如下)分离得到两个异构体，依据保留时间命名为A-10/11-A(11.04mg，保留时间7.5min)和A-10/11-B(19.42mg，保留时间8.0min)。
色谱柱：SunFire Prep C18 OBD 19mm×150mm×5.0μm
流动相A：乙腈；流动相B：水(0.05％甲酸)
时间[min] 流动相A[％] 流动相B[％] 流速[mL/min]
0 30 70 28
3 30 70 28
18 90 10 28
结构表征数据如下：
A-10/11-A：
ESI-MS(m/z):1107.3[M+H] +.
A-10/11-B：
ESI-MS(m/z):1107.3[M+H] +.
实施例十二(1S,9S)-1-氨基-4-氯-9-乙基-5-氟-9-羟基-1,2,3,9,12,15-六氢-10H,13H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-10,13-二酮和(1R,9S)-1-氨基-4-氯-9-乙基-5-氟-9-羟基-1,2,3,9,12,15-六氢-10H,13H-苯并[de]吡喃并[3',4'：6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-10,13-二酮(1-10-A和1-10-B)
步骤一：3-溴-4-氯-5-氟苯胺的合成
将化合物1-10-1(2.00g,10.53mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(30mL)中，然后缓慢加入N-氯代丁二酰亚胺(1.69g,12.63mmol)，加毕，室温反应16小时，用液质联用色谱检测反应。反应液经减压浓缩得粗品，粗品经快硅胶柱纯化(乙酸乙酯:石油醚＝0-25％)得标题化合物0.95g。
结构表征数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ6.77(dd,J＝2.5,1.4Hz,1H),6.51(dd,J＝11.7,2.5Hz,1H),5.84(s,2H).
步骤二：N-(3-溴-4-氯-5-氟苯基)乙酰胺的合成
将化合物1-10-2(0.95g,4.23mmol)溶于乙酸乙酯(20mL)中，氮气保护下加入乙酸酐(648.13mg,6.35mmol)，加毕，升温至50℃反应15小时，用液质联用色谱检测反应。反应液用甲醇(5mL)淬灭后，直接经减压蒸干得粗品，粗品经快速硅胶柱纯化(乙酸乙酯:石油醚＝0-40％)得标题化合物1.01g。
结构表征数据如下：
ESI-MS(m/z):265.9[M+H] +.
步骤三：(E)-4-(5-乙酰氨基-2-氯-3-氟苯基)-3-丁烯酸的合成
将化合物1-10-3和3-丁烯酸(387.65mg,4.50mmol)溶于1,4二氧六环(24mL)和水(8mL)的混合溶剂中，然后加入N,N-二异丙基乙胺(1.45g,11.26mmol)，三(邻甲基苯基)磷(114.21mg,375.24μmol)和醋酸钯(42.12mg,187.62μmol)，加毕，反应体系用氮气置换三次，并在氮气氛围下升温至100℃反应16小时，用液质联用色谱检测反应。反应液冷却至室温后，加入1N的氢氧化钠水溶液(60mL)和乙酸乙酯(50mL)振荡分层。分出下层水 相后，用4mol/L盐酸水溶液调节pH至3左右，然后用乙酸乙酯萃取，合并有机相用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液经减压蒸干，得到标题化合物的粗品1.00g。
结构表征数据如下：
ESI-MS(m/z):272.0[M+H] +.
步骤四：4-(5-乙酰氨基-2-氯-3-氟苯基)丁酸的合成
将化合物1-10-4的粗品(1.00g,3.68mmol)溶于四氢呋喃(15mL)，然后加入10％钯碳(0.10g)，加毕，然后用氢气球置换反应体系三次，并在氢气氛围下反应4小时，用液质联用色谱检测反应。将反应液过滤，滤液减压浓缩干，得标题化合物的粗品1.00g。
结构表征数据如下：
ESI-MS(m/z):274.0[M+H] +.
步骤五：N-(4-氯-3-氟-8-氧-5,6,7,8-四氢萘-1-基)乙酰胺的合成
将化合物1-10-5的粗品(1.00g,3.65mmol)溶于三氟乙酸(5mL)中，降温至5℃后，缓慢加入三氟乙酸酐(3.84g,18.27mmol,2.54mL)，加毕，保持5℃反应2小时，用液质联用色谱检测反应。反应液缓慢倒入水中，然后用乙酸乙酯萃取，合并有机相，用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥有机相，然后过滤，滤液经减压蒸干得粗品，粗品经快速硅胶柱纯化，得标题化合物0.43g。
结构表征数据如下：
ESI-MS(m/z):256.1[M+H] +.
步骤六：N-(4-氯-3-氟-7-(羟基亚氨基)-8-氧代-5,6,7,8-四氢萘-1-基)乙酰胺的合成
将四氢呋喃(16mL)和叔丁醇(4mL)加入反应液瓶中，冰浴降温至5℃后，加入叔丁醇钾(415.18mg,3.70mmol)，然后将化合物1-10-6(0.43mg,1.68mmol)溶于四氢呋喃(1mL)中，并缓慢滴加入反应液，10分钟后再加入亚硝酸异戊酯(315.24mg,2.69mmol)，加毕，保持5℃反应1小时，用液质联用色谱检测反应。反应液用饱和氯化铵水溶液淬灭后，用乙酸乙酯萃取，合并有机相，用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥有机相，然后过滤，滤液经减压浓缩，得标题化合物的粗品455.00mg。
结构表征数据如下：
ESI-MS(m/z):285.0[M+H] +.
步骤七：N-(7-氨基-4-氯-3-氟-8-氧-5,6,7,8-四氢萘-1-基)乙酰胺的合成
将化合物1-10-7的粗品(0.40g,1.41mmol)溶于甲醇(10mL)中，然后加入3mol/L的盐酸水溶液(1mL)和10％钯碳(40.00mg)，加毕，用氢气球置换反应体系三次，并在氢气氛围下室温反应1小时，用液质联用色谱检测反应。将反应液过滤，滤液经减压浓缩干，得标题化合物的盐酸盐粗品0.43g。
结构表征数据如下：
ESI-MS(m/z):271.0[M+H] +.
步骤八：(9H-芴-9-基)甲基(8-乙酰胺-5-氯-6-氟-1-氧代-1,2,3,4-四氢萘-2-基)氨基甲酸酯的合成
将化合物1-10-8的盐酸盐粗品(0.43g,1.19mmol)溶于1,4-二氧六环(15mL)中，然后加入碳酸氢钠(400.35mg,4.77mmol)、水(5mL)和9-芴甲基-N-琥珀酰亚胺基碳酸酯(481.81mg,1.43mmol)，加毕，室温下搅拌反应2小时，用液质联用色谱检测反应。将反应液倒入水中，然后用乙酸乙酯萃取，合并有机相，用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥有机相，过滤，滤液经减压浓缩得粗品。粗品经C18反相柱纯化(乙腈：0.05％甲酸水＝20％-100％)，得标题化合物301.00mg。
结构表征数据如下：
ESI-MS(m/z):493.2[M+H] +.
步骤九：(9H-芴-9-基)甲基(8-氨基-5-氯-6-氟-1-氧代-1,2,3,4-四氢萘-2-基)氨基甲酸酯的合成
将化合物1-10-9(300.00mg,608.61μmol)溶于二氧六环(5mL)中，加入12mol/L的浓盐酸(1mL)，加毕，升温至60℃反应2小时，用液质联用色谱检测反应。将反应液倒入水中，然后用乙酸乙酯萃取，合并有机相，用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥有机相，过滤，滤液经减压浓缩得粗品。粗品经快速硅胶柱纯化(乙酸乙酯:石油醚＝0-50％)，得标题化合物198.00mg。
结构表征数据如下：
ESI-MS(m/z):451.1[M+H] +.
步骤十：(9H-芴-9-基)甲基((9S)-4-氯-9-乙基-5-氟-9-羟基-10,13-二氧基-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4:6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)氨基甲酸酯的合成
将(S)-4-乙基-4-羟基-7,8-二氢-1H-吡喃并[3,4-f]吲哚嗪-3,6,10(4H)-三酮(138.72mg,526.96μmol)和化合物1-10-10(198.00mg,439.13μmol)加入甲苯(10mL)中，然后再加入对甲苯磺酸(75.53mg,439.13μmol)，加毕，升温至140℃反应4小时，反应液减压蒸干得粗品，粗品经快速硅胶柱纯化(甲醇:二氯甲烷＝0-5％)，得标题化合物256.00mg。
结构表征数据如下：
ESI-MS(m/z):678.1[M+H] +.
步骤十一：(1S,9S)-1-氨基-4-氯-9-乙基-5-氟-9-羟基-1,2,3,9,12,15-六氢-10H,13H-苯并[de]吡喃并[3',4'：6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-10,13-二酮和(1R,9S)-1-氨基-4-氯-9-乙基-5-氟-9-羟基-1,2,3,9,12,15-六氢-10H,13H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-10,13-二酮的合 成
将化合物1-10-11(201.18mg,296.67μmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(4mL)中，然后加入二乙胺(108.49mg,1.48mmol)，加毕，室温反应0.5小时，用液质联用色谱检测反应。反应液经减压蒸出二乙胺后，用1mol/L盐酸水溶液调pH至2-3，反应液直接用制备高效液相色谱纯化，得标题化合物1-10-A(44.00mg)和1-10-B(43.00mg)。
色谱柱：SunFire Prep C18 OBD 19mm×150mm×5.0μm
流动相A：乙腈；流动相B：水(0.05％甲酸)
时间[min] 流动相A[％] 流动相B[％] 流速[mL/min]
0 10 90 28
3 10 90 28
18 70 30 28
1-10-A(6min LCMS出峰靠前，保留时间：1.276min)
结构表征数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.00(d,J＝10.3Hz,1H),7.33(s,1H),6.54(s,1H),5.62(d,J＝19.3Hz,1H),5.44(s,2H),5.38(d,J＝19.3Hz,1H),4.43-4.38(m,1H),3.28-3.10(m,2H),2.22-2.12(m,1H),2.12-2.02(m,1H),1.93-1.80(m,2H),0.87(t,J＝7.3Hz,3H).
ESI-MS(m/z):456.1[M+H] +.
1-10-B(6min LCMS出峰靠后，保留时间：1.300min)结构表征数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.98(d,J＝10.3Hz,1H),7.32(s,1H),5.61(d,J＝19.4Hz,1H),5.44(s,2H),5.32(d,J＝19.4Hz,1H),4.44-4.36(m,1H),3.33-3.25(m,1H),3.22-3.11(m,1H),2.23-2.13(m,1H),2.11-2.03(m,1H),1.96-1.82(m,2H),0.89(t,J＝7.3Hz,3H).
ESI-MS(m/z):456.1[M+H] +.
6min LCMS条件：
色谱柱：Waters SunFire C18 OBD 4.6mm×50mm×5.0μm
流动相A：0.05％乙腈；流动相B：水(0.05％甲酸)
时间[min] 流动相A[％] 流动相B[％] 流速[mL/min]
0 90 10 2
4.2 10 90 2
5.7 10 90 2
5.71 90 10 2
6.70 90 10 2
实施例十三：(2S,3S,4S,5R,6S)-6-(4-(((((1S,9S)-4-氯-9-乙基-9-羟基-5-氟-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-八羟基苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)氨甲酰基)氧基)甲基)-2-(2-(2-(6-(2-(2-(甲磺酰基)嘧啶-5-基)己-5-乙酰胺基)乙氧基)乙酰胺基)苯氧基)-3,4,5-三羟基四氢-2H-吡喃-2-羧酸的合成(A-12)
步骤一：(2S,3R,4S,5S,6S)-2-(2-(1-(9H-芴-9-基)-3-氧代-2,7,10-三氧-4-氮杂十二酰胺)-4-(((((1S,9S)-4-氯-9-乙基-9-羟基-5-氟-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-八氢苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)氨甲酰基)氧基)甲基)苯氧基)-6-(甲氧羰基)四氢-2H-吡喃-3,4,5-三乙酸酯
将原料A-6-6(56.6mg，0.057mmol)、化合物1-11(30.0mg，0.048mmol)和HOBt(12.9mg，0.095mmol)溶于DMF(1mL)中，滴入二异丙基乙胺(18.5mg,0.143mmol)，25℃搅拌反应4小时，反应液经制备高效液相色谱纯化纯化(条件如下)得到标题化合物29.0mg。
ESI-MS(m/z):1304.3[M+1]+.
色谱柱：Waters XBridge Prep C18OBD(5μm*19mm*150mm)
流动相A：乙腈；流动相B：水(0.05％甲酸)
时间[min] 流动相A[％] 流动相B[％] 流速[mL/min]
0.00 40 60 30
2.00 400 60 30
18.00 90 10 30
步骤二：(2S,3S,4S,5R,6S)-6-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙酰胺基)-4-(((((1S,9S)-4-氯-9-乙基-9-羟基-5-氟-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-八羟基苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)氨甲酰基)氧基)苯氧基)-3,4,5-三羟基四氢-2H-吡喃-2-羧酸
将化合物A-12-1(29.0mg，0.022mmol)溶于甲醇(1mL)/四氢呋喃(1ml)中，滴入氢氧化锂水溶液(7.7mg，0.184mmol，溶于0.5mL水)，25℃搅拌反应2小时；向反应体系中加入水(5ml)，3N盐酸调pH＝2～3，乙酸乙酯(5mL)萃取杂质，水相冻干 得到粗品，通过制备高效液相色谱纯化(条件如下)得到标题化合物5.0mg。
ESI-MS(m/z):942.2[M+1]+.
色谱柱：Waters XBridge Prep C18OBD(5μm*19mm*150mm)
流动相A：乙腈；流动相B：水(0.05％甲酸)
时间[min] 流动相A[％] 流动相B[％] 流速[mL/min]
0.00 20 80 24
2.00 20 80 24
18.00 80 20 24
步骤三：(2S,3S,4S,5R,6S)-6-(4-(((((1S,9S)-4-氯-9-乙基-9-羟基-5-氟-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-八羟基苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)氨甲酰基)氧基)甲基)-2-(2-(2-(6-(2-(2-(甲磺酰基)嘧啶-5-基)己-5-乙酰胺基)乙氧基)乙酰胺基)苯氧基)-3,4,5-三羟基四氢-2H-吡喃-2-羧酸
将化合物A-12-2(5.0mg,0.0053mmol)和2,5-二氧吡咯烷-1-基6-(2-(甲磺酰基)嘧啶-5-基)己-5-炔酸酯(IM-3，2.3mg,0.0064mmol)溶于DMF(0.5mL)中，滴入二异丙基乙胺(2.0mg,0.016mmol)，25℃反应4小时，反应液直接通过制备高效液相色谱纯化(条件如下)得到标题化合物0.90mg。
ESI-MS(m/z):1192.0[M+1]+.
色谱柱：Waters XBridge Prep C18OBD(5μm*19mm*150mm)
流动相A：乙腈；流动相B：水(0.05％甲酸)
时间[min] 流动相A[％] 流动相B[％] 流速[mL/min]
0.00 30 70 24
2.00 30 70 24
18.00 80 20 24
实施例十四N-((S)-10-苄基-1-((1S,9S)-4-氯-9-乙基-5-氟-9-羟基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)氨基)-1,6,9,12,15-五氧代-3-氧杂-5,8,11,14-四氮杂十六烷-16-基)-6-(2-(甲基磺酰基)嘧啶-5-基)己基-5-酰胺和N-((S)-10-苄基-1-((1R,9S)-4-氯-9-乙基-5-氟-9-羟基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)氨基)-1,6,9,12,15-五氧代-3-氧杂-5,8,11,14-四氮杂十六烷-16-基)-6-(2-(甲基磺酰基)嘧啶-5-基)己基-5-酰胺的合成(A-14/15-A和A-14/15-B)
将单一构型的化合物1-10-A(36.00mg,79.70μmol)和化合物IM-5(64.43mg,95.64μmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(2mL)中，然后加入4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐(46.98mg,159.40μmol)和三乙胺(24.19mg,239.10μmol)，加毕，室温反应1小时，用液质联用色谱检测反应。反应液经高效液相色谱纯化得到单一构型的标题化合物A-14/15-A(51.00mg)。
色谱柱：SunFire Prep C18 OBD 19mm×150mm×5.0μm
流动相A：乙腈；流动相B：水(0.05％甲酸)
时间[min] 流动相A[％] 流动相B[％] 流速[mL/min]
0 30 70 28
3 30 70 28
18 90 10 28
结构表征数据如下：
ESI-MS(m/z):1111.0[M+H] +.
将单一构型的化合物1-10-B(36.00mg,79.70μmol)和化合物IM-5(64.43mg,95.64μmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(2mL)中，然后加入4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐(46.98mg,159.40μmol)和三乙胺(24.19mg,239.10μmol)，加毕，室温反应1小时，用液质联用色谱检测反应。反应液经高效液相色谱纯化得到单一构型的标题化合物A-14/15-B(52.00mg)。
色谱柱：SunFire Prep C18 OBD 19mm×150mm×5.0μm
流动相A：乙腈；流动相B：水(0.05％甲酸)
时间[min] 流动相A[％] 流动相B[％] 流速[mL/min]
0 30 70 28
3 30 70 28
18 90 10 28
结构表征数据如下：
ESI-MS(m/z):1111.0[M+H] +.
实施例十五N-((1S,9S)-4-氯-9-乙基-5-氟-9-羟基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4:6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)-2-羟基乙酰胺和N-((1R,9S)-4-氯-9-乙基-5-氟-9-羟基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4:6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)-2-羟基乙酰胺(1-13-A和1-13-B)
称取化合物A-14/15-A(40.00mg,35.99μmol)溶于二氯甲烷(2mL)和甲醇(1mL)的混合溶剂中，然后加入氯化氢乙酸乙酯溶液(4mol/L，1mL)，加毕，室温反应0.5小时，用液质联用色谱检测反应。反应液经减压浓缩得粗品，粗品经高效液相色谱纯化得单一构型的化合物1-13-A(4.75mg)。
色谱柱：SunFire Prep C18 OBD 19mm×150mm×5.0μm
流动相A：乙腈；流动相B：水(0.05％甲酸)
时间[min] 流动相A[％] 流动相B[％] 流速[mL/min]
0 15 85 28
3 15 85 28
18 90 10 28
结构表征数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.50(d,J＝8.9Hz,1H),8.05(d,J＝10.3Hz,1H),7.33(s,1H),6.55(s,1H),5.67-5.60(m,1H),5.49(t,J＝5.8Hz,1H),5.43(s,2H),5.21(s,2H),3.96(d,J＝5.8Hz,2H),3.32-3.22(m,2H),2.28-2.15(m,2H),1.93-1.80(m,2H),0.87(t,J＝7.3Hz,3H).
ESI-MS(m/z):514.0[M+H] +.
称取化合物A-14/15-B(40.00mg,35.99μmol)溶于二氯甲烷(2mL)和甲醇(1mL)的混合溶剂中，然后加入氯化氢乙酸乙酯溶液(4mol/L，1mL)，加毕，室温反应0.5小时，用液质联用色谱检测反应。反应液经减压浓缩得粗品，粗品经高效液相色谱纯化得单一构型的 化合物1-13-B(8.24mg)。
色谱柱：SunFire Prep C18 OBD 19mm×150mm×5.0μm
流动相A：乙腈；流动相B：水(0.05％甲酸)
时间[min] 流动相A[％] 流动相B[％] 流速[mL/min]
0 15 85 28
3 15 85 28
18 90 10 28
结构表征数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.52(d,J＝9.0Hz,1H),8.05(d,J＝10.3Hz,1H),7.34(s,1H),6.55(s,1H),5.68-5.58(m,1H),5.53(t,J＝5.8Hz,1H),5.43(d,J＝2.9Hz,2H),5.20(d,J＝7.3Hz,2H),3.97(d,J＝5.7Hz,2H),3.31-3.21(m,2H),2.26-2.15(m,2H),1.92-1.82(m,2H),0.87(t,J＝7.3Hz,3H).
ESI-MS(m/z):514.0[M+H] +.
实施例十六4-((S)-2-(4-氨基丁基)-35-(4-((6-(2-(甲磺酰基)嘧啶-5-基)十六烷-5-炔酰胺基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-4,8-二氧代-6,12,15,18,21,24,27,30,33-九氧杂-3,9-二氮杂三十五烷酰胺基)苄基((S)-4-乙基-11-(2-(异丙基氨基)乙基)-3,14-二氧基-3,4,12,14-四氢-1H-吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-4-基)碳酸酯(A-26)
步骤一：(S)-(2-(4-乙基-4-羟基-3,14-二氧基-3,4,12,14-四氢-1H-吡喃并[3',4':6,7]茚并[1,2-b]喹啉-11-基)乙基)(异丙基)氨基甲酸叔丁酯的合成
20℃下，将化合物2-1(500.00mg,1.15mmol)于干燥的二氯甲烷(15mL)中，加入叔丁氧羰基碳酸叔丁酯(276.90mg,1.27mmol)和DIPEA(447.21mg,3.46mmol)，反应液20℃下搅拌16h，用液质联用色谱检测反应，反应液经硅胶柱层析纯化(流动相：二氯甲烷/甲醇＝50/1)，得标题化合物400mg。
结构表征数据如下：
ESI-MS(m/z):534.0[M+H] +.
步骤二：(2-((S)-4-(((4-((S)-35-叠氮基-2-(4-((4-甲氧基苯基)二苯甲基)氨基)丁基)-4,8-二氧代-6,12,15,18,21,24,27,30,33-九氧杂-3,9-二氮杂三十五烷酰胺基)苄基)氧基)羰基)-4-乙基-3,14-二氧基-3,4,12,14-四氢-1H-吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-11-基)乙基)(异丙基)氨基甲酸叔丁酯的合成
0℃下，将化合物A-26-1(30.00mg,0.056mmol)于干燥的二氯甲烷(1mL)中，氮气保护下加DMAP(54.95mg,0.450mmol)，滴加三光气(16.68mg,0.056mmol)的二氯甲烷(1mL)溶液，反应液保持0℃反应30min，反应液经减压氮气置换，0℃下滴加(S)-2-(32-叠氮基-5-氧代-3,9,12,15,18,21,24,27,30-九氧杂-6-氮杂三十五烷酰胺基)-N-(4-(羟甲基)苯基)-6-(((4-甲氧基苯基)二苯甲基)氨基)己酰胺(117.39mg,0.111mmol)的干燥二氯甲烷(20mL)溶液，反应液20℃下搅拌60min，用液质联用色谱检测反应；反应液浓缩后直接用于下一步反应。
结构表征数据如下：
ESI-MS(m/z):1620.2[M+H] +.
步骤三：4-((S)-2-(4-氨基丁基)-35-叠氮基-4,8-二氧代-6,12,15,18,21,24,27,30,33-九氧杂-3,9-二氮杂三十五烷酰胺基)苄基((S)-4-乙基-11-(2-(异丙基氨基)乙基)-3,14-二氧基-3,4,12,14-四氢-1H-吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-4-基)碳酸盐的合成(B-194-03)
25℃下，将化合物A-26-2(80.00mg,0.049mmol)于乙腈(1.0mL)中，加入三氟乙酸(0.4mL)，反应液保持20℃反应1h；用液质联用色谱检测反应；反应液用制备高效液相色谱纯化(条件如下)，制备液冷冻干燥，得标题化合物的三氟乙酸盐41.0mg。
色谱柱：SunFire Prep C18 OBD 19mm×150mm×5.0μm
流动相A：乙腈；流动相B：水(0.05％三氟乙酸)
时间[min] 流动相A[％] 流动相B[％] 流速[mL/min]
0.00 10 90 28
2.00 10 90 28
18.00 90 10 28
结构表征数据如下：
ESI-MS(m/z):1248.2[M+H] +.
步骤四：4-((S)-2-(4-氨基丁基)-35-(4-((6-(2-(甲磺酰基)嘧啶-5-基)十六烷-5-炔酰胺基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-4,8-二氧代-6,12,15,18,21,24,27,30,33-九氧杂-3,9-二氮杂三十五烷酰胺基)苄基((S)-4-乙基-11-(2-(异丙基氨基)乙基)-3,14-二氧基-3,4,12,14-四氢-1H-吡喃并 [3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-4-基)碳酸酯的合成
25℃下，将化合物A-26-3(40.00mg,0.032mmol)和6-(2-(甲磺酰基)嘧啶-5-基)-N-(丙-2-炔-1-基)己-5-炔酰胺(IM-2，14.69mg,0.048mmol)于DMSO(0.5mL)和H 2O(0.1mL)的混合溶液中，加溴化亚铜(9.20mg,0.064mmol)，反应液氮气保护下20℃反应2h；用高效液相质谱联用色谱检测反应；反应液用制备高效液相色谱纯化(条件如下)，制备液冷冻干燥，得标题化合物的三氟乙酸盐20.0mg。
色谱柱：SunFire Prep C18 OBD 19mm×150mm×5.0μm
流动相A：乙腈；流动相B：水(0.05％三氟乙酸)
时间[min] 流动相A[％] 流动相B[％] 流速[mL/min]
0.00 25 75 28
2.00 25 75 28
18.00 90 10 28
结构表征数据如下：
ESI-MS(m/z):1552.6[M+H] +.
实施例十七4-((S)-2-(4-氨基丁基)-35-(4-((6-(2-(甲磺酰基)嘧啶-5-基)己-5-乙酰胺基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-4,8-二氧代-6,12,15,18,21,24,27,30,33-九氧杂-3,9-二氮杂三十五烷酰胺基)苄基((1S,9S)-1-(二甲氨基)-9-乙基-5-氟-4-甲基-10,13-二氧基-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪[1,2-b]喹啉-9-基)碳酸酯(A-28)
步骤一：4-((S)-35-叠氮基-2-(4-((4-甲氧基苯基)二苯甲基)氨基)丁基)-4,8-二氧代-6,12,15,18,21,24,27,30,33-九氧杂-3,9-二氮杂三十五烷酰胺基)苄基((1S,9S)-1-(二甲氨基)-9-乙基-5-氟-4-甲基-10,13-二氧基-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-9-基)碳酸酯的合成
0℃下，将化合物1-2(20.00mg,0.040mmol)于干燥的二氯甲烷(1mL)中，氮气保护下加DMAP(39.10mg,0.320mmol)，滴加三光气(11.87mg,0.040mmol)的二氯甲烷(1mL)溶液，反应液保持0℃反应30min，反应液经减压氮气置换，0℃下滴加(S)-2-(32-叠氮基-5-氧代-3,9,12,15,18,21,24,27,30-九氧杂-6-氮杂三十五烷酰胺基)-N-(4-(羟甲基)苯基)-6-(((4-甲氧基苯基)二苯甲基)氨基)己酰胺(84.66mg,0.080mmol)的干燥二氯甲烷(20mL)溶液，反应液20℃下搅拌1h，用液质联用色谱检测反应；反应液用制备高效液相色谱纯化(条件如下)，制备液冷冻干燥，得标题化合物40.0mg。
色谱柱：SunFire Prep C18 OBD 19mm×150mm×5.0μm
流动相A：乙腈；流动相B：水(0.05％甲酸)
时间[min] 流动相A[％] 流动相B[％] 流速[mL/min]
0.00 20 80 28
2.00 20 80 28
18.00 90 10 28
结构表征数据如下：
ESI-MS(m/z):1550.2[M+H] +.
步骤二：(1S,9S)-1-(二甲氨基)-9-乙基-5-氟-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-9-基(4-((S)-2-(4-((4-甲氧基苯基)二苯基甲基)氨基)丁基)-35-(4-((6-(2-(甲磺酰基)嘧啶-5-基)十六烷基-5-炔酰胺基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-4,8-二氧代-6,12,15,18,21,24,27,30,33-九氧杂-3,9-二氮杂三十五烷酰胺基)苄基)碳酸酯的合成
25℃下，将化合物A-28-1(30.00mg,0.019mmol)和6-(2-(甲磺酰基)嘧啶-5-基)-N-(丙-2-炔-1-基)己-5-炔酰胺(IM-2，8.87mg,0.029mmol)于DMSO(0.5mL)和H 2O(0.1mL)的混合溶液中，加溴化亚铜(5.55mg,0.039mmol)，反应液氮气保护下20℃反应1h；用,液质联用色谱检测反应；反应液用制备高效液相色谱纯化(条件如下)，制备液冷冻干燥，得标题化合物25.0mg。
色谱柱：SunFire Prep C18 OBD 19mm×150mm×5.0μm
流动相A：乙腈；流动相B：水(0.05％甲酸)
时间[min] 流动相A[％] 流动相B[％] 流速[mL/min]
0.00 15 85 28
2.00 15 85 28
18.00 70 30 28
结构表征数据如下：
ESI-MS(m/z):1855.2[M+H] +.
步骤三：4-((S)-2-(4-氨基丁基)-35-(4-((6-(2-(甲磺酰基)嘧啶-5-基)己-5-炔酰胺基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-4,8-二氧代-6,12,15,18,21,24,27,30,33-九氧杂-3,9-二氮杂三十五烷酰胺基)苄基((1S,9S)-1-(二甲氨基)-9-乙基-5-氟-4-甲基-10,13-二氧基-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-9-基)碳酸酯的合成
25℃下，将化合物A-28-2(15.00mg,0.017mmol)于乙腈(0.5mL)中，加入三氟乙酸(0.2mL)，反应液保持20℃反应0.5h，用液质联用色谱检测反应；反应液用制备高效液相色谱纯化(条件如下)，制备液冷冻干燥，得标题化合物的三氟乙酸盐9.0mg。
色谱柱：SunFire Prep C18 OBD 19mm×150mm×5.0μm
流动相A：乙腈；流动相B：水(0.05％三氟乙酸)
时间[min] 流动相A[％] 流动相B[％] 流速[mL/min]
0.00 15 85 28
2.00 15 85 28
18.00 80 20 28
结构表征数据如下：
ESI-MS(m/z):1583.1[M+H] +.
实施例十八4-((S)-2-(4-氨基丁基)-35-(4-((6-(2-(甲磺酰基)嘧啶-5-基)己-5-炔酰胺基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-4,8-二氧基-6,12,15,18,21,24,27,30,33-九氧杂-3,9-二氮杂三十五烷酰胺基)苄基((1S,9R)-9-乙基-5-氟-1-(2-羟基乙酰胺基)-4-甲基-10,13-二氧基-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-9-基)碳酸酯(A-29)
步骤一:2-((叔丁基二苯基硅)氧基)-N-((1S，9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)乙酰胺的合成
25℃下,将1-1的甲磺酸盐(30.00mg,56.44μmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(1mL)中，依次加入1H-苯并三唑-1-基氧三吡咯烷基六氟磷酸盐(58.74mg,112.88μmol)、N,N-二异丙基乙胺(43.76mg,338.63μmol)和2-((叔丁基二苯基硅基)氧基)乙酸(26.62mg，84.66μmol)，保持25℃反应1小时，用液质联用色谱监测反应，反应完成后向反应液中加入水，乙酸乙酯萃取，有机相合并，经硫酸钠干燥后减压浓缩，粗品经薄层层析分离(二氯甲烷:甲醇＝15:1)得到标题化合物27.00mg。
步骤二:4-((S)-35-叠氮基-2-(4-((4-甲氧基苯基)二苯甲基)氨基)丁基)-4,8-二氧基 -6,12,15,18,21,24,27,30,33-九氧杂-3,9-二氮杂三十五烷酰胺基)苄基((1S,9R)-1-(2-((叔丁基二苯基硅氧基)乙酰胺)-9-乙基-5-氟-4-甲基-10,13-二氧基-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-9-基)碳酸酯的合成
0℃下，将A-29-1(20mg,27.33μmol)溶于二氯甲烷(2mL)中，依次加入4-二甲氨基吡啶(26.71mg,218.61μmol)和三光气(8.11mg,27.33μmol)的二氯甲烷溶液(0.5mL)，保持0℃反应0.5小时；用氮气置换掉残余三光气后滴加入(S)-2-(32-叠氮基-5-氧代-3,9,12,15,18,21,24,27,30-九氧杂-3,9-二氮杂三十五烷酰胺基)-N-(4-(羟甲基)苯基)-6-(((4-甲氧基苯基)二苯甲基)氨基)己酰胺(43.46mg,40.99μmol)的二氯甲烷溶液(1mL)，保持0℃反应0.5小时；用液质联用色谱监测反应，反应完成后将反应液浓缩，粗品经薄层层析分离(二氯甲烷:甲醇＝15:1)纯化得到标题化合物30.00mg。
步骤三:(1S,9R)-1-(2-((叔丁基二苯基硅)氧基)乙酰胺)-9-乙基-5-氟-4-甲基-10,13-二氧基-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-9-基(4-((4-甲氧基苯基)二苯基甲基)氨基)丁基)-35-(4-((6-(2-(甲磺酰基)嘧啶-5-基)六氢-5-炔酰胺基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-4,8-二氧基-6,12,15,18,21,24,27,30,33-九氧杂-3,9-二氮杂三十五烷酰胺基)苄基)碳酸酯的合成
25℃下，将A-29-2(250.00mg,137.51μmol)溶于DMSO(2mL)和水(0.4mL)混合溶剂中，加入6-(2-(甲磺酰基)嘧啶-5-基)-N-(丙-2-炔-1-基)己-5-炔酰胺(IM-2,62.98mg,206.26μmol)和溴化亚铜(39.45mg,275.01μmol)，保持25℃反应1小时；用液质联用色谱监测反应；反应完成后将反应液用制备高效液相色谱纯化(条件如下)，制备液冻干得到标题化合物150.00mg。
色谱柱:SunFire Prep C18 OBD 19mm×150mm×5.0μm
流动相A:乙腈；流动相B:水(0.05％甲酸)
时间[min] 流动相A[％] 流动相B[％] 流速[mL/min]
0 15 85 28
18 90 10 28
步骤四:(1S,9R)-9-乙基-5-氟-1-(2-羟基乙酰胺)-4-甲基-10,13-二氧基-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-9-基(4-((S)-2-(4-((4-甲氧基苯基)二苯基甲基)氨基)丁基)-35-(4-((6-(2-(甲磺酰基)嘧啶-5-基)六氢-5-炔酰胺基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-4,8-二氧基-6,12,15,18,21,24,27,30,33-九氧杂-3,9-二氮杂三十五烷酰胺基)碳酸酯的合成
25℃下，将A-29-3(150mg,49.45μmol)溶于四氢呋喃(1mL)中,滴加入四丁基氟化铵(1M四氢呋喃溶液)/冰醋酸混合液(v/v＝13/1)(50uL),保持25℃反应0.5小时， 用液质联用色谱监测反应；反应完成后将反应液用制备高效液相色谱纯化(条件如下)，制备液冻干得到标题化合物50.00mg。
色谱柱:SunFire Prep C18 OBD 19mm×150mm×5.0μm
流动相A:乙腈；流动相B:水(0.05％甲酸)
时间[min] 流动相A[％] 流动相B[％] 流速[mL/min]
0 15 85 28
20 90 10 28
步骤五:4-((S)-2-(4-氨基丁基)-35-(4-((6-(2-(甲磺酰基)嘧啶-5-基)己-5-炔酰胺基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-4,8-二氧基-6,12,15,18,21,24,27,30,33-九氧杂-3,9-二氮杂三十五烷酰胺基)苄基((1S,9R)-9-乙基-5-氟-1-(2-羟基乙酰胺基)-4-甲基-10,13-二氧基-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-9-基)碳酸酯的合成
25℃下，将A-29-4(50mg,26.52μmol)溶于二氯甲烷(1mL)中，加入三氟乙酸(60.49mg,530.49μmol)，保持25℃反应0.5小时；用液质联用色谱监测反应；反应完成后将反应液浓缩，粗品用制备高效液相色谱纯化(条件如下)，制备液冻干得到标题化合物23.69mg。
色谱柱:SunFire Prep C18 OBD 19mm×150mm×5.0μm
流动相A:乙腈；流动相B:水(0.05％甲酸)
时间[min] 流动相A[％] 流动相B[％] 流速[mL/min]
0 15 85 28
18 90 10 28
A-29结构表征数据如下:
ESI-MS(m/z):1613.6[M+H] +.
实施例十九4-((S)-2-((S)-3-甲基-2-(6-(2-(甲磺酰基)嘧啶-5-基)己-5-炔酰胺基)丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基((S)-1-((S)-1-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-((1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)(甲基)氨基甲酸酯(B-1)
步骤一：4-((S)-2-((S)-2-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基((S)-1-((S)-1-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-((1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)(甲基)氨基甲酸酯的合成
25℃下，将(S)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-((1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧庚-4-基)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲胺基)丁酰胺(MMAE，10mg,0.014mmol)和化合物B-1-1(12.82mg,0.017mmol)溶于DMF(1.0mL)中，加入HOBt(2.82mg,0.021mmol)和DIPEA(3.60mg,0.028mmol)，保持25℃反应1h，用液质联用色谱检测反应，反应液不经处理直接用于下一步反应。
结构表征数据如下：
ESI-MS(m/z):1345.2[M+H] +.
步骤二：4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基((S)-1-((S)-1-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-((1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基(甲基)氨基甲酸酯的合成
25℃下，将二乙胺(0.1mL)加入化合物B-1-2的反应液中，保持25℃反应1h，用 液质联用色谱监测反应，将反应液减压浓缩除去溶剂得到粗品，粗品直接用于下一步反应。
结构表征数据如下：
ESI-MS(m/z):1123.2[M+H] +.
步骤三：4-((S)-2-((S)-3-甲基-2-(6-(2-(甲磺酰基)嘧啶-5-基)己-5-炔酰胺基)丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基((S)-1-((S)-1-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-((1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)(甲基)氨基甲酸酯的合成
25℃下，将B-1-3粗品和6-(2-(甲磺酰基)嘧啶-5-基)己-5-炔酸(IM-1，7.16mg,0.027mmol)溶于DMF(0.5mL)中，加入HATU(10.15mg,0.027mmol)和DIPEA(3.45mg,0.027mmol)，保持25℃反应1h，用液质联用色谱监测反应，反应液经制备高效液相色谱纯化(条件如下)得标题化合物5.0mg。
色谱柱：SunFire Prep C18 OBD 19mm×150mm×5.0μm
流动相A：乙腈；流动相B：水(0.05％甲酸)
时间[min] 流动相A[％] 流动相B[％] 流速[mL/min]
0.00 30 70 28
2.00 30 70 28
18.00 90 10 28
结构表征数据如下：
ESI-MS(m/z):1373.2[M+H] +.
实施例二十N-((3R,4S,7S,10S,21S)-21-苄基-4-((S)-仲丁基)-3-(2-((S)-2-((1R,2R)-3-
(((1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧丙基)吡咯烷-1-基)-2-氧乙基)-7,10-二异丙基-5,11-二甲基-6,9,12,17,20,23,26-七恶英-2,14-二恶英-5,8,11,16,19,22,25-七氮杂庚酸-27-基)-6-(2-(甲磺酰基)嘧啶-5-基)己-5-炔基(B-3)
步骤一：(9H-芴-9-基)甲基((3R,4S,7S,10S,21S)-21-苄基-4-((S)-仲丁基)-3-(2-((S)-2-
((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧丙基)吡咯烷-1-基)-2-氧乙基)-7,10-二异丙基-5,11-二甲基-6,9,12,17,20,23,26-七氧代-2,14-二氧杂-5,8,11,16,19,22,25-庚基庚二酰胺-27-基)氨基甲酸酯的合成
称取化合物IM-6(50.0mg,0.077mmol)和(S)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-
3-(((1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧丙烷)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧庚烷-4-基)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基氨基)丁酰氨基)丁酰胺(MMAE，55.60mg,0.077mmol)溶于DMF(1mL)中，然后加入HATU(32.37mg,85.18μmol)和DIPEA(20.02mg,154.88μmol)，加毕，室温反应1h，用液质联用色谱监测反应，反应液用制备高效液相色谱纯化(条件如下)得标题化合物35.0mg。
色谱柱：SunFire Prep C18 OBD 19mm×150mm×5.0μm
流动相A：乙腈；流动相B：水(0.05％甲酸)
时间[min] 流动相A[％] 流动相B[％] 流速[mL/min]
0.00 40 60 28
2.00 40 60 28
18.00 90 10 28
结构表征数据如下：
ESI-MS(m/z):1345.1[M+H] +.
步骤二：(S)-2-((2S,13S)-19-氨基-13-苄基-2-异丙基-3-甲基-4,9,12,15,18-五氧杂-6-氧杂-3,8,11,14,17-庚烷氮酮)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙烷-2- 基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧庚烷-4-基)-N,3-二甲基丁酰胺的合成
将化合物B-3-1(20.00mg,0.015mmol)溶于二氯甲烷(2mL)中，然后加入二乙胺(1mL)，加毕室温反应1h，用液质联用色谱检测反应，反应液经减压浓缩得粗品20.0mg。
结构表征数据如下：
ESI-MS(m/z):1123.1[M+H] +.
步骤三：N-((3R,4S,7S,10S,21S)-21-苄基-4-((S)-仲丁基)-3-(2-((S)-2-((1R,2R)-3-
(((1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧丙基)吡咯烷-1-基)-2-氧乙基)-7,10-二异丙基-5,11-二甲基-6,9,12,17,20,23,26-七氧代-2,14-二氧杂-5,8,11,16,19,22,25-七氮杂庚酸-27-基)-6-(2-(甲磺酰基)嘧啶-5-基)己-5-炔基的合成
将化合物B-3-2(20.00mg,0.015mmol)和6-(2-(甲磺酰基)嘧啶-5-基)己-5-炔酸(IM-1，17.00mg,0.015mmol)溶于DMF(1mL)中，然后加入HATU(6.33mg,16.65μmol)和DIPEA(3.91mg,30.27μmol)，加毕室温反应1h，用液质联用色谱检测反应，反应液用制备高效液相色谱纯化(条件如下)得标题化合物3.52mg。
色谱柱：SunFire Prep C18 OBD 19mm×150mm×5.0μm
流动相A：乙腈；流动相B：水(0.05％甲酸)
时间[min] 流动相A[％] 流动相B[％] 流速[mL/min]
0.00 10 90 28
2.00 10 90 28
18.00 90 10 28
结构表征数据如下：
ESI-MS(m/z):1374.1[M+H] +.
二、抗体的制备及结合活性测定
1、抗体的获得及纯化
前期通过免疫Balb/c，C57Bl/6，NZB和A/J小鼠，通过杂交瘤筛选获得鼠源抗体3D8、19F6和38F8，分别经人源化后获得人源化抗体序列3D8_HuC24(重链可变区,SEQ ID NO:9；轻链可变区,SEQ ID NO:10)，19F6_Hu35v1(重链可变区,SEQ ID NO:1；轻链可变区,SEQ ID NO:2)，38F8_Hu57(重链可变区,SEQ ID NO:17；轻链链可变区,SEQ ID NO:18)，上述人源化抗体的重链恒定区均为人IgG1重链恒定区(SEQ ID NO:22)，轻链恒定区均为人kappa轻链恒定区(SEQ ID NO:23)。3D8_HuC24、19F6_Hu35v1、38F8_Hu57的序列信息汇总在下面的表1中。合成上述人源化抗体的编码DNA序列并进行密码子优化后，克隆到pcDNA3.4质粒中，将每一人源化抗体重 链和轻链对应的pcDNA3.4质粒同时转染到Expi293F细胞中，采用蛋白A对上清中的表达抗体进行纯化，从而获得相应抗体。
表1：3D8_HuC24、19F6_Hu35v1、38F8_Hu57的序列信息
2、亲和力测定
通过流式方法检测19F6_Hu35V1、3D8_HuC24和38F8_Hu57与人细胞表面的ROR1亲和力。
人ROR1稳定表达细胞系构建：用包含人ROR1完整编码序列(基因编号：Q01973)的慢病毒(G&P Biosciences)感染Ba/F3细胞，通过嘌呤霉素筛选阳性转导细胞，并通过有限稀释法进行单克隆筛选获得单克隆的BA/F3-ROR1稳定细胞系。通过流式细胞术(Luminex，Guava easyCyte HT)鉴定ROR1的表达。抗人ROR1抗体D10(专利序列：美国专利9217040B2)用作检测抗体。如附图1所示，流式细胞仪结果表明Ba/F3-ROR1的阳性率很高(接近100％)，可用于后续实验。
除Ba/F3-ROR1过表达细胞外，人套细胞淋巴瘤细胞系Jeko-1(南京科佰生物)、人结肠癌细胞系HT-29(中国科学院细胞库)、人肺癌细胞系A549(中国科学院细胞库)也被用于流式分析。分别采用抗ROR1抗体UC961(抗体UC961的VH和VL分别为WO2018237335A1专利中的SEQ ID NO:5和6)和抗TNP抗体作为阳性对照和阴 性对照。将Ba/F3-ROR1、Jeko-1、HT-29和A549细胞与不同浓度梯度的纯化后人源化抗体在冰上孵育30分钟后，用流式缓冲液(PBS+2％FBS)清洗两次，再用羊抗人荧光二抗(Jackson ImmunoResearch)在冰上孵育30分钟，最后上机检测。
结果如表2-1、2-2和2-3所示，19F6_Hu35V1、3D8_HuC24和38F8_Hu57在所有4个细胞上的亲和力EC50等于或低于阳性对照抗体UC961，表明上述抗人ROR1人源化抗体对ROR1阳性细胞具有优良的结合活性。
表2-1：19F6-Hu35V1的细胞亲和力检测
表2-2：3D8-HuC24的细胞亲和力检测
表2-3：38F8-Hu57的细胞亲和力检测
19F6_Hu35V1、3D8_HuC24和38F8_Hu57和阳性对照抗体UC961采用Octet ForteBio方法测定与人ROR1ECD蛋白的动态亲和力。具体实验步骤如下：抗人IgG Fc的AHC探头(ForteBio)先与待测抗体结合至应答信号值0.8-1.2nm，通过将抗体包被的探头浸入含有不同浓度(16、8、4、2、1、0.5、0.25和0μg/mL)的人ROR1ECD蛋白的孔中来测量动态亲和力，结合2-4分钟，然后解离4-6分钟，1：1动力学结合模型用于全部拟合分析。
如表3所示，19F6_Hu35V1解离速率明显比对照抗体UC961更慢(如Kdis数值所示)，亲和力比对照抗体UC961强5.4倍(如KD值所示)。3D8_HuC24和38F8_Hu57则显示了与对照抗体UC961相当的亲和力。
表3：抗体与人ROR1的动态亲和力测定
抗体 KD(M) kon(1/Ms) kdis(1/s)
19F6-Hu35V1 1.61E-09 5.38E+05 8.63E-04
3D8-HuC24 2.61E-08 5.86E+05 1.53E-02
38F8-Hu57 1.00E-08 2.41E+05 2.42E-03
UC961 8.73E-09* 1.26E+06* 1.12E-02*
*代表该数值为三次测定的平均值。
三、包含细胞生物活性分子和连接体的化合物与抗体的偶联
以下实施例所制备得到的抗体药物偶联物中所涉及的抗体19F6即为上述第二部分中所述的19F6_Hu35v1抗体。
样品的偶联制备如下：
取0.46ml 19F6_Hu35v1抗体(抗ROR1，11.0mg/mL)，用0.1M依地酸二钠的溶液(pH 7.7)稀释，然后用1M Na 2HPO 4溶液调pH至7.7，加入10mM TCEP(三(2-羧乙基)膦)溶液混匀，室温放置90min。向上述溶液体系加入4.0--10倍物质的量的溶解在二甲基亚砜的“药物-连接体”化合物，混匀，室温静置2h，完毕后采用NAP-5凝胶柱(Cytiva)将缓冲液置换为pH 6.0的10mM组氨酸缓冲溶液，然后添加蔗糖和吐温20，混匀，得到抗体药物偶联物(即ADC化合物)，见表4。
偶联样品的药物/抗体比值(DAR值)的测定如下：
LC-MS测定ADC样品分子量，计算药物/抗体比DAR值
对偶联后的ADC样品进行LC-MS分子量分析。
色谱测定条件：
液相色谱柱：Thermo MAbPac RP 3.0*100mm；
流动相A：0.1％FA/H 2O；流动相B：0.1％FA/ACN；
流速：0.25ml/min；样品室温度：8℃；柱温：60℃；进样量：2μl；
时间(分钟) 2 20 22 25 26 30
流动相A(体积％) 75 60 5 5 75 75
流动相B(体积％) 25 40 95 95 25 25
质谱测定条件：
质谱型号：AB Sciex Triple TOF 5600+；
GS1 35；GS2 35；CUR 30；TEM 350；ISVF 5500；DP 250；CE 10；Accumulation time 0.5s；
m/z 600-4000；Time bins to sum 40。
表4 ADC编号以及DAR
药物-连接体编号 ADC编号 药物-连接体与抗体摩尔比 DAR
A-1 19F6-A-1 10：1 7.81
A-5 19F6-A-5 10：1 7.73
A-6 19F6-A-6 10：1 8.07
A-7 19F6-A-7 10：1 7.77
A-8/9-A 19F6-A-8 10：1 7.00
A-8/9-B 19F6-A-9 10：1 7.50
A-10/11-A 19F6-A-10 10：1 7.79
A-12 19F6-A-12 10：1 7.04
A-14/15-A 19F6-A-14 10：1 7.83
A-26 19F6-A-26 10：1 7.30
A-28 19F6-A-28 10：1 7.81
A-29 19F6-A-29 10：1 7.92
B-1 19F6-B-1 4.5：1 3.61
四、检测抗体药物偶联物对体外细胞活性的抑制作用
ADC化合物细胞增殖抑制作用
(1)细胞铺板：首先采用相应的培养基培养肿瘤细胞HCC827、NCI-H1975、HT-29和NCI-N87，用胰酶消化细胞，离心后重悬细胞计数，调整细胞至合适的浓度进行铺板。肿瘤细胞来源见表5。
表5：肿瘤细胞来源
细胞名称 肿瘤类型 来源
HCC827 非小细胞肺癌 ATCC
NCI-H1975 人肺腺癌细胞 南京科佰生物
HT-29 人结肠癌细胞 中国科学院细胞库
NCI-N87 人胃癌细胞 ATCC
本发明化合物和肿瘤细胞共孵育：待细胞贴壁后，移除细胞中培养基，将稀释好的抗体药物偶联物(本发明ADC化合物)加入到上述板孔中，孵育96小时。
体外细胞活性检测：孵育结束后，每孔加入Cell Counting-Lite TM 2.0试剂(Vazyme/诺唯赞)50μL，避光振荡混匀，反应10min后即可进行检测，酶标仪(厂家：BMG,型号：PHERAStar-FS)读数。通过加入Cell Counting-Lite TM，不含细胞的培养基孔 获得背景RLU,有细胞但不含化合物的培养孔获得对照RLU。细胞抑制率＝1-(样品RLU-背景RLU)/(细胞对照RLU-背景RLU)×100％，按照四参数模型拟合曲线，计算化合物的半数抑制浓度(IC 50)。
(2)数据结果：检测结果如表6-表9所示。
表6：ADC偶联物对NCI-H1975细胞系杀伤结果(96小时)
ADC编号 IC 50(μg/mL)
19F6-A-1 1.35
19F6-A-6 73.19
19F6-A-8 16.84
19F6-A-9 13.50
19F6-A-10 112.6
19F6-A-26 0.64
19F6-A-28 3.26
19F6-A-29 5.00
19F6-B-1 13.20
表7：ADC偶联物对HCC827细胞系杀伤结果(96小时)
ADC编号 IC 50(μg/mL)
19F6-A-6 45.66
19F6-A-10 39.69
19F6-B-1 0.21
表8：ADC偶联物对HT-29细胞系杀伤结果(96小时)
ADC编号 IC 50(μg/mL)
19F6-A-1 0.60
19F6-A-6 21.00
19F6-A-10 34.16
19F6-A-26 0.78
19F6-A-28 3.89
19F6-A-29 4.56
表9：ADC偶联物对NCI-N87细胞系杀伤结果(96小时)
ADC编号 IC 50(μg/mL)
19F6-A-5 25.67
19F6-A-6 54.41
19F6-A-8 18.70
19F6-A-9 15.10
19F6-A-10 42.58
测试结果表明，利用新偶联方法得到的ADC分子具有肿瘤细胞杀伤作用。
说明利用新的偶联方法形成的ADC，可对肿瘤细胞产生杀伤作用，新的偶联方法应用于ADC分子中是行之有效的。
五、评价抗体-药物偶联物对ROR1表达人源肿瘤细胞系在小鼠皮下移植瘤模型上的肿瘤生长抑制作用
将含有本发明ADC的制剂分别通过尾静脉注射给予皮下移植人胃癌细胞NCI-N87、人肺腺癌细胞H1975、人结肠癌细胞HT-29的小鼠CDX模型，每周2次测定肿瘤体积和动物体重变化，计算本发明ADC对荷瘤小鼠的抑瘤疗效。
受试药物
药物名称、来源、配制方法：取适量本发明ADC(四川科伦博泰生物医药股份有限公司)，按照10μl/g给药体积，使用生理盐水稀释母液到给药溶液。以生理盐水作为溶媒对照(Vehicle)。
实验动物及细胞系
Balb/c-nu小鼠(成都药康生物科技有限公司，生产许可证号：SCXK(川)2020-034，动物合格证编号：202112622、202109635、202106975)
人胃癌细胞NCI-N87(ATCC)
人肺腺癌细胞NCI-H1975(南京科佰)
人结肠癌细胞HT-29(中国科学院细胞库)
实验分组及评价方法
选择肿瘤平均体积在100～200mm 3的荷瘤鼠个体随机分组(根据样品数量决定分组数)。根据组别分别给予生理盐水(下文称溶媒对照、Vehicle)、本发明ADC，给药频率见具体试验方案，给药方式为尾静脉注射，给药体积为10μl/g。给药后每周2次用游标卡尺测量肿瘤直径，并按如下计算公式计算肿瘤体积：V＝0.5a×b 2，其中a和b分别表示肿瘤的长径和短径。每天观察记录动物死亡情况。
采用以下公式计算肿瘤生长抑制率TGI(％)，用于评价本发明ADC的抑瘤疗效：
或
其中 治疗组实验结束时肿瘤体积均值
V T0：治疗组给药开始时肿瘤体积均值
溶媒对照组实验结束时肿瘤体积均值
V C0：溶媒对照组给药开始时肿瘤体积均值
采用以下公式计算肿瘤相对增殖率T/C(％)，用于评价本发明ADC的抑瘤疗效：
(1)抗人ROR1抗体偶联药物在NCI-N87模型的药效检测
用含10％胎牛血清的RPMI1640培养液，在37℃，5％CO 2的条件下培养NCI-N87细胞。收集指数生长期的NCI-N87细胞，PBS重悬至适合浓度，接种于雌性Balb/c-nu小鼠皮下建立胃癌模型。待肿瘤平均体积约160mm 3左右时，根据肿瘤大小随机分组，依次为：溶媒对照组(即阴性对照，Vehicle组)，本发明19F6-A-1 10mg/kg组，19F6-A-6 10mg/kg组和19F6-A-10 10mg/kg组。各组均采用尾静脉注射(i.v.)，在Day0、Day3、Day7给药，共给药3次。给药后每周2次测量小鼠体重以及用游标卡尺测量肿瘤长径和短径，并按如下计算公式计算肿瘤体积：V＝0.5a×b 2，其中a和b分别表示肿瘤的长径和短径，每天观察记录动物死亡情况。
本发明ADC对NCI-N87胃癌移植瘤模型的肿瘤生长抑制作用显著。与Vehicle组相比，本发明ADC 19F6-A-1 10mg/kg组、19F6-A-6 10mg/kg组和19F6-A-10 10mg/kg组的肿瘤生长抑制率(TGI)分别为51.08％、131.40％和50.92％。Day28各治疗组无动物死亡及显著地动物体重降低，未见明显的药物毒性反应，治疗期间小鼠对本发明ADC耐受性良好。具体结果见表10，图2、图3。
表10：人胃癌细胞NCI-N87 CDX模型
注：TGI为肿瘤生长抑制率，T/C为相对肿瘤增殖率；P值表示治疗组与Vehicle相比，TGI的统计学差异。
(2)抗人ROR1抗体偶联药物在NCI-H1975模型的药效检测
用含10％胎牛血清的RPMI1640培养液，在37℃，5％CO 2的条件下培养NCI-H1975细胞。收集指数生长期的NCI-H1975细胞，PBS重悬至适合浓度，接种于雌性Balb/c-nu 小鼠皮下建立人肺腺癌细胞模型。待肿瘤平均体积约120mm 3左右时，根据肿瘤大小随机分组(每组6只小鼠)，分别为：溶媒对照组(Vehicle)，本发明ADC 19F6-A-6 10mg/kg组以及本发明ADC 19F6-A-10 10mg/kg组，各组均采用尾静脉注射(i.v.)，在D0、D4、D7、D10和D14给药，共给药5次。给药后每周2次测量小鼠体重以及用游标卡尺测量肿瘤长径和短径，并按如下计算公式计算肿瘤体积：V＝0.5a×b 2，其中a和b分别表示肿瘤的长径和短径，每天观察记录动物死亡情况。
与溶媒对照组相比，5次给药后，Day28数据显示，本发明ADC 19F6-A-6 10mg/kg组和19F6-A-10 10mg/kg组显著抑制NCI-H1975模型的肿瘤生长，肿瘤生长抑制率(TGI)分别为196.35％和52.52％，对NCI-H1975小细胞肺癌移植瘤模型的肿瘤生长抑制作用显著；并且本发明ADC 19F6-A-6 10mg/kg组中全部小鼠肿瘤完全消退。Day28各治疗组无动物死亡及显著动物体重降低，未见明显的药物毒性反应，治疗期间小鼠对本发明ADC耐受性良好。具体结果见表11，图4、图5。
表11人肺腺癌细胞NCI-H1975 CDX模型
注：P值表示治疗组与Vehicle相比，TGI的统计学差异。
(3)抗人ROR1抗体偶联药物在HT29模型的药效检测
用含10％胎牛血清的McCoy's 5a培养液，在37℃，5％CO 2的条件下培养人结肠癌细胞HT29。收集指数生长期的HT29细胞，加入PBS和终浓度50％的基质胶重悬至适合浓度，接种于雌性Balb/c-nu小鼠皮下建立人结肠癌移植瘤模型。待肿瘤平均体积约112mm 3左右时，根据肿瘤大小随机分组，分别为溶媒对照组(Vehicle)和本发明ADC 19F6-A-1 10mg/kg组。分组后各组采用尾静脉注射(i.v.)，在D0、D4、D7、D11、D14和D18给药，共计给药6次。给药后每周2次测量小鼠体重以及用游标卡尺测量肿瘤长径和短径，并按如下计算公式计算肿瘤体积：V＝0.5a×b 2，其中a和b分别表示肿瘤的长径和短径，每天观察记录动物死亡情况。
本发明ADC 19F6-A-1 10mg/kg对人结肠癌HT29移植瘤模型的肿瘤生长有显著抑制作用。给药后Day32数据显示，与溶媒对照组相比，19F6-A-1 10mg/kg组的TGI为59.14％。各治疗组无动物死亡及显著动物体重降低，未见明显的药物毒性反应，治疗期间小鼠对本 发明ADC耐受性良好。具体结果见表12，图6、图7。
表12.人结肠癌细胞HT29 CDX模型
注：P值表示治疗组与Vehicle相比，TGI的统计学差异。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解，根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims (22)

  1. 一种抗体药物偶联物，其具有式Ab-[M-L-E-D]x所示结构，其中：
    Ab是与受体酪氨酸激酶样孤儿受体(ROR)家族成员1(ROR1)特异性结合的抗体或其抗原结合片段：
    M是和所述抗体或其抗原结合片段的接头部位；
    L是连接所述接头部位M和E之间的连接子；
    E是连接L和D的结构片段；
    D是细胞毒性药物部分；
    x选自1至10。
  2. 权利要求1所述的抗体药物偶联物，其中，M选自以下结构：
  3. 权利要求1所述的抗体药物偶联物，其中，M选自以下结构：
  4. 权利要求1-3任一项所述的抗体药物偶联物，其中，L选自由下述的一个或多个基团组成的二价结构：
    C 1-6亚烷基、-N(R’)-、羰基、-O-、Val、Cit、Phe、Lys、D-Val、Leu、Gly、Ala、Asn、Val-Cit、Val-Ala、Val-Lys、Val-Lys(Ac)、Phe-Lys、Phe-Lys(Ac)、D-Val-Leu-Lys、Gly-Gly-Arg、Ala-Ala-Asn、Ala-Ala-Ala、Val-Lys-Ala、Gly-Gly-Gly、Gly-Gly-Phe-Gly、Gly-Gly-Gly-Gly-Gly、 其中R’代表氢、C 1-6烷基或含-(CH 2CH 2O) r-的烷基；r选自1-10的整数；s选自1-20的整数；
    优选地，L选自以下结构：
    其中s选自1-20的整数。
  5. 权利要求1-4任一项所述的抗体药物偶联物，其中，E为单键、-NH-CH 2-，或选自以下结构：
    优选地，E为单键、-NH-CH 2-，或
  6. 权利要求1-5任一项所述的抗体药物偶联物，其中， 选自以下结构：
  7. 权利要求1-6任一项所述的抗体药物偶联物，其中所述细胞毒性药物选自抗微管蛋白剂，DNA嵌入剂，DNA拓扑异构酶抑制剂和RNA聚合酶抑制剂；
    优选地，所述微管蛋白抑制剂为奥瑞他汀类化合物或美登素类化合物；优选地，所述DNA嵌入剂为吡咯并苯二氮卓(PBD)；优选地，所述DNA拓扑异构酶抑制剂为拓扑异构酶I抑制剂(例如，喜树碱、羟基喜树碱、9-氨基喜树碱、SN-38、伊立替康、拓扑替康、 贝洛替康或卢比替康等)或拓扑异构酶II抑制剂(例如，阿霉素、PNU-159682、多卡米星、柔红霉素、米托蒽醌、鬼臼毒素、或依托泊苷等)；所述RNA聚合酶抑制剂为α-鹅膏草碱(α-amanitin)及其药学上可接受的盐、酯和类似物；
    优选地，所述细胞毒性药物选自以下化合物组成的群组：
    优选地，所述细胞毒性药物通过其上的-OH，一级氨基，二级胺基或三级胺基与所述抗体药物偶联物中的E连接。
  8. 权利要求1-7任一项所述的抗体药物偶联物，其中，所述抗体或其抗原结合片段包含:
    (1)下述重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)，其中CDR按Chothia编号系统定义：
    (1a)包含如下3个CDR的重链可变区(VH)：序列为SEQ ID NO:3或其变体的CDR-H1，序列为SEQ ID NO:4或其变体的CDR-H2，序列为SEQ ID NO:5或其变体的CDR-H3；和/或，包含如下3个CDR的轻链可变区(VL)：序列为SEQ ID NO:6或其变体的CDR-L1，序列为SEQ ID NO:7或其变体的CDR-L2，序列为SEQ ID NO:8或其变体的CDR-L3；或，
    (1b)包含如下3个CDR的重链可变区(VH)：序列为SEQ ID NO:11或其变体的CDR-H1，序列为SEQ ID NO:12或其变体的CDR-H2，序列为SEQ ID NO:13或其变体的CDR-H3；和/或，包含如下3个CDR的轻链可变区(VL)：序列为SEQ ID NO:14或其变体的CDR-L1，序列为SEQ ID NO:15或其变体的CDR-L2，序列为SEQ ID NO:16或其变体的CDR-L3；或，
    (1c)包含如下3个CDR的重链可变区(VH)：序列为SEQ ID NO:19或其变体的CDR-H1，序列为SEQ ID NO:20或其变体的CDR-H2，序列为SEQ ID NO:21或其变体的CDR-H3；和/或，包含如下3个CDR的轻链可变区(VL)：序列为SEQ ID NO:14或其变体的CDR-L1，序列为SEQ ID NO:15或其变体的CDR-L2，序列为SEQ ID NO:16或其变体的CDR-L3；
    其中，(1a)、(1b)、(1c)任一项中所述的变体与其所源自的序列相比具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、 至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，或者所述变体与其所源自的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)；优选地，所述的置换是保守置换；
    或者，
    (2)下述重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)，其中CDR按AbM编号系统定义：
    (2a)包含如下3个CDR的重链可变区(VH)：序列为SEQ ID NO:29或其变体的CDR-H1，序列为SEQ ID NO:30或其变体的CDR-H2，序列为SEQ ID NO:5或其变体的CDR-H3；和/或，包含如下3个CDR的轻链可变区(VL)：序列为SEQ ID NO:6或其变体的CDR-L1，序列为SEQ ID NO:7或其变体的CDR-L2，序列为SEQ ID NO:8或其变体的CDR-L3；或，
    (2b)包含如下3个CDR的重链可变区(VH)：序列为SEQ ID NO:36或其变体的CDR-H1，序列为SEQ ID NO:37或其变体的CDR-H2，序列为SEQ ID NO:13或其变体的CDR-H3；和/或，包含如下3个CDR的轻链可变区(VL)：序列为SEQ ID NO:14或其变体的CDR-L1，序列为SEQ ID NO:15或其变体的CDR-L2，序列为SEQ ID NO:16或其变体的CDR-L3；或，
    (2c)包含如下3个CDR的重链可变区(VH)：序列为SEQ ID NO:45或其变体的CDR-H1，序列为SEQ ID NO:46或其变体的CDR-H2，序列为SEQ ID NO:21或其变体的CDR-H3；和/或，包含如下3个CDR的轻链可变区(VL)：序列为SEQ ID NO:14或其变体的CDR-L1，序列为SEQ ID NO:15或其变体的CDR-L2，序列为SEQ ID NO:16或其变体的CDR-L3；
    其中，(2a)、(2b)、(2c)任一项中所述的变体与其所源自的序列相比具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，或者所述变体与其所源自的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)；优选地，所述的置换是保守置换；
    或者，
    (3)下述重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)，其中CDR按Kabat编号系统定义：
    (3a)包含如下3个CDR的重链可变区(VH)：序列为SEQ ID NO:31或其变体的CDR-H1，序列为SEQ ID NO:32或其变体的CDR-H2，序列为SEQ ID NO:5或其变体的CDR-H3；和/或，包含如下3个CDR的轻链可变区(VL)：序列为SEQ ID NO:6或其变体的CDR-L1，序列为SEQ ID NO:7或其变体的CDR-L2，序列为SEQ ID NO:8或其变体的CDR-L3；或，
    (3b)包含如下3个CDR的重链可变区(VH)：序列为SEQ ID NO:38或其变体的CDR-H1，序列为SEQ ID NO:39或其变体的CDR-H2，序列为SEQ ID NO:13或其变体的CDR-H3；和/或，包含如下3个CDR的轻链可变区(VL)：序列为SEQ ID NO:14或其变体的CDR-L1，序列为SEQ ID NO:15或其变体的CDR-L2，序列为SEQ ID NO:16或其变体的CDR-L3；或，
    (3c)包含如下3个CDR的重链可变区(VH)：序列为SEQ ID NO:47或其变体的CDR-H1，序列为SEQ ID NO:48或其变体的CDR-H2，序列为SEQ ID NO:21或其变体的CDR-H3；和/或，包含如下3个CDR的轻链可变区(VL)：序列为SEQ ID NO:14或其变体的CDR-L1，序列为SEQ ID NO:15或其变体的CDR-L2，序列为SEQ ID NO:16或其变体的CDR-L3；
    其中，(3a)、(3b)、(3c)任一项中所述的变体与其所源自的序列相比具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，或者所述变体与其所源自的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)；优选地，所述的置换是保守置换；
    或者，
    (4)下述重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)，其中CDR按IMGT编号系统定义：
    (4a)包含如下3个CDR的重链可变区(VH)：序列为SEQ ID NO:24或其变体的CDR-H1，序列为SEQ ID NO:25或其变体的CDR-H2，序列为SEQ ID NO:26或其变体的CDR-H3；和/或，包含如下3个CDR的轻链可变区(VL)：序列为SEQ ID NO:27或其变体的CDR-L1，序列为SEQ ID NO:28或其变体的CDR-L2，序列为SEQ ID NO:8或其变体的CDR-L3；或，
    (4b)包含如下3个CDR的重链可变区(VH)：序列为SEQ ID NO:33或其变体的CDR-H1，序列为SEQ ID NO:34或其变体的CDR-H2，序列为SEQ ID NO:35或其变体的CDR-H3；和/或，包含如下3个CDR的轻链可变区(VL)：序列为SEQ ID NO:43或其变体的CDR-L1，序列为SEQ ID NO:44或其变体的CDR-L2，序列为SEQ ID NO:16或其变体的CDR-L3；或，
    (4c)包含如下3个CDR的重链可变区(VH)：序列为SEQ ID NO:40或其变体的CDR-H1，序列为SEQ ID NO:41或其变体的CDR-H2，序列为SEQ ID NO:42或 其变体的CDR-H3；和/或，包含如下3个CDR的轻链可变区(VL)：序列为SEQ ID NO:43或其变体的CDR-L1，序列为SEQ ID NO:44或其变体的CDR-L2，序列为SEQ ID NO:16或其变体的CDR-L3；
    其中，(4a)、(4b)、(4c)任一项中所述的变体与其所源自的序列相比具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，或者所述变体与其所源自的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)；优选地，所述的置换是保守置换。
  9. 权利要求1或8所述的抗体药物偶联物，其中，所述抗体或其抗原结合片段包含：
    (a)SEQ ID NO：1所示的VH或其变体，和/或，SEQ ID NO：2所示的VL或其变体；
    (b)SEQ ID NO：9所示的VH或其变体，和/或，SEQ ID NO：10所示的VL或其变体；或
    (c)SEQ ID NO：17所示的VH或其变体，和/或，SEQ ID NO：18所示的VL或其变体；
    其中，所述变体与其所源自的序列相比具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，或者所述变体与其所源自的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)；优选地，所述的置换是保守置换。
  10. 权利要求8或9所述的抗体药物偶联物，其中，所述抗体或其抗原结合片段进一步包含：
    (a)人免疫球蛋白的重链恒定区(CH)或其变体，所述变体与其所源自的野生型序列相比具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加(例如，至多20个、至多15个、至多10个、或至多5个氨基酸的置换、缺失或添加；例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)；和
    (b)人免疫球蛋白的轻链恒定区(CL)或其变体，所述变体与其所源自的野生型序列相比具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加(例如，至多20个、至多15个、至多10个、或至多5个氨基酸的置换、缺失或添加；例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)；
    优选地，所述重链恒定区是IgG重链恒定区，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 重链恒定区，例如人IgG1重链恒定区或人IgG4重链恒定区；
    优选地，所述抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO：22所示的重链恒定区(CH)或其变体，所述变体与SEQ ID NO：22相比具有至多20个氨基酸的保守置换(例如至多15个、至多10个、或至多5个氨基酸的保守置换；例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的保守置换)；
    优选地，所述轻链恒定区是κ轻链恒定区；
    优选地，所述抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO：23所示的轻链恒定区(CL)或其变体，所述变体与SEQ ID NO：23相比具有至多20个氨基酸的保守置换(例如至多15个、至多10个、或至多5个氨基酸的保守置换；例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的保守置换)；
    优选地，所述抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO：22所示的重链恒定区(CH)和如SEQ ID NO：23所示的轻链恒定区(CL)。
  11. 权利要求1、8-10任一项所述的抗体药物偶联物，其中，所述抗体或其抗原结合片段包含：
    (1)包括SEQ ID NO：1所示的VH和SEQ ID NO：22所示的重链恒定区(CH)的重链，和，包括SEQ ID NO：2所示的VL和SEQ ID NO：23所示的轻链恒定区(CL)的轻链；
    (2)包括SEQ ID NO：9所示的VH和SEQ ID NO：22所示的重链恒定区(CH)的重链，和，包括SEQ ID NO：10所示的VL和SEQ ID NO：23所示的轻链恒定区(CL)的轻链；或
    (3)包括SEQ ID NO：17所示的VH和SEQ ID NO：22所示的重链恒定区(CH)的重链，和，包括SEQ ID NO：18所示的VL和SEQ ID NO：23所示的轻链恒定区(CL)的轻链。
  12. 权利要求1-11任一项所述的抗体药物偶联物，M与Ab上的巯基(-SH)或者氨基(-NH 2)连接。
  13. 权利要求1-12任一项所述的抗体药物偶联物，其中，所述抗体或其抗原结合片段选自权利要求11所述的抗体或其抗原结合片段；-M-L-E-D选自权利要求1-7任一项所定义结构；x为1至10；优选地，x为1至8，或者x为1至4。
  14. 权利要求1-13任一项所述的抗体药物偶联物，其选自：
    其中，各抗体药物偶联物中的HA代表包含如SEQ ID NO:1所示的VH和如SEQ ID NO:2所示的VL的抗体或其抗原结合片段，例如为19F6_Hu35v1(其包含：包括SEQ ID NO：1所示的VH和SEQ ID NO：22所示的CH的重链，和，包括SEQ ID NO：2所示的VL和SEQ ID NO：23所示的CL的轻链)；
    其中， 表示抗体或其抗原结合片段中的巯基与连接体的具体连接方式。
  15. 权利要求1-14任一项所述的抗体药物偶联物，其DAR值(药物抗体偶联比)为1-10，例如：1～2，1～3，1～4，1～5，1～6，1～7，1～8，1～9，1～10，2～3，2～4，2～5，2～6，2～7，2～8，2～9，2～10，3～4，3～5，3～6，3～7，3～8，3～9，3～10，4～5，4～6，4～7，4～8，4～9，4～10，5～6，5～7，5～8，5～9，5～10，6～7，6～8，6～9，6～10，7～8，7～9，7～10，8～9，8～10，或9～10，优选为3～8，例如，3.0～3.5，3.0～4.0，3.0～4.5，3.0～5.0，6.0～6.5，6.0～7.0，6.0～7.5，6.0～8.0，6.0～8.5，6.5～7.0，6.5～7.5，6.5～8.0，6.5～8.5，7.0～7.5，7.0～8.0或7.5～8.0。
  16. 一种药物-连接体，其具有式M’-L-E-D所示结构，其中：
    M’是M接入权利要求8-11任一项所述抗体或其抗原结合片段之前的结构，M、L、E和D如权利要求1-7任一项中所定义；
    优选地，M’选自以下结构：
  17. 权利要求16所述的药物-连接体，其选自：
  18. 药物组合物，其包含权利要求1-15任一项所述的抗体药物偶联物和任选的权利要求16或17所述的药物-连接体，以及一种或多种药用辅料。
  19. 权利要求1-15任一项所述的抗体药物偶联物，权利要求16或17所述的药物-连接体，或权利要求18的药物组合物在制备治疗ROR1高表达癌症的药物中的用途。
  20. 权利要求19所述的用途，其中所述癌症疾病选自实体瘤或血液系统恶性肿瘤；例如选自结肠癌，胃癌，乳腺癌，肺癌(例如，非小细胞肺癌，具体如肺腺癌)，和淋巴癌。
  21. 一种治疗ROR1高表达癌症的方法，包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的权利要求1-15任一项所述的抗体药物偶联物，权利要求16或17所述的药物-连接体，或权利要求18的药物组合物。
  22. 权利要求1-15任一项所述的抗体药物偶联物，权利要求16或17所述的药物-连接体，或权利要求18的药物组合物，其用于治疗ROR1高表达癌症。
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