CN118105508A - 药物连接子化合物及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及医药领域，具体涉及一种药物连接子化合物，所述药物可以包括DNA拓扑异构酶抑制剂，通过药物连接子化合物制得的偶联物，例如抗体药物偶联物具有较优的药物抗体偶联比，对肺癌、黑色素瘤、乳腺癌、胃癌、结肠癌等肿瘤具有很好的靶向杀伤效果。此外，本申请进一步提供所述抗体药物‑连接体分子的制备方法及其用途。

Description

药物连接子化合物及其制备方法和用途
技术领域
本申请涉及化合物领域，具体涉及一种药物连接子化合物，所述药物可以包括DNA拓扑异构酶抑制剂，通过药物连接子化合物制得的偶联物，例如抗体药物偶联物具有较优的药物抗体偶联比，对肺癌、黑色素瘤、乳腺癌、胃癌、结肠癌等肿瘤具有很好的靶向杀伤效果。此外，本申请进一步提供所述抗体药物-连接体分子的制备方法及其用途。
背景技术
针对肿瘤这一重大疾病领域，抗肿瘤药物研发成为全球关注的重点和难点。生物大分子药物已成为抗肿瘤药物的重要组成部分，且呈现快速增长趋势。ADC药物由单克隆抗体和强效毒性药物(toxic drug)通过生物活性连接器(linker)偶联而成，是一种定点靶向癌细胞的强效抗癌药物。
ADC药物进入体内后，抗体部分与肿瘤细胞表面的靶向抗原结合(binding)，肿瘤细胞会将ADC分子内吞。之后ADC药物会在溶酶体中分解，释放出活性的细胞毒性药物，破坏DNA或阻止肿瘤细胞分裂，起到杀死细胞的作用。ADC抗体偶联药物需要抗原、抗体、毒素分子、连接子四部分的结合，然而，其中的药物连接体部分对于ADC药物发挥良好的药效和安全性有密切关系。研发新型结构的药物连接体部分对于ADC药物研发具有重要意义。
发明内容
本申请涉及一种药物-连接子化合物及其制备方法和用途，药物-连接子化合物可用于同其他分子例如抗体形成偶联物。
在一个方面，本发明提供一种药物-连接子化合物，其具有式G-M-[L-E-D]x所示结构，其中：
G是能够与特异性氨基酸或糖基发生反应的官能团或离去基团；
M是与G相连的接头，所述的M为
其中，环A为5-6元脂杂环、或5-20元芳香族环系，所述脂杂环和芳香族环系任选地被一个或多个选自氧基(＝O)、卤素、氰基、氨基、羧基、巯基和C1-6烷基的基团取代；M1选自单键和C1-20亚烷基、C2-20亚烯基、C2-20亚炔基或胺基，所述的C1-20亚烷基、C2-20亚烯基、C2-20亚炔基或胺基任选地被一个或多个适合的取代基所取代；
L是连接接头M和E之间的连接子，L选自由下述的一个或多个组成的结构：C1-6亚烷基、-N(R’)-、羰基、-O-、天然氨基酸或非天然氨基酸及其类似物、以及氨基酸组成的短肽、
其中R’代表氢、C1-6烷基或含1-10个EO单元的聚乙二醇片段；s选自1-20的整数；
E是连接L和D的结构片段，其中E为单键、-NHCH2-或选自以下结构：
D是细胞毒性药物片段；和/或
x选自1至10。
在一些实施方式中，所述的G是能够与抗体中的特异性氨基酸或糖基发生反应的官能团或离去基团。
在一些实施方式中，所述的G选自卤素、卤代C1-6烷基、C1-6磺酰基、卤代C1-6磺酰基、卤代磺酰基、C1-6磺酸酯基、卤代C1-6磺酸酯基、C1-6亚磺酸酯基、C1-6亚砜基、硝基、叠氮基、氰基、烯基、炔基及含炔基的结构片段，所述的卤代C1-6烷基、C1-6磺酰基、卤代C1-6磺酰基、卤代磺酰基、C1-6磺酸酯基、卤代C1-6磺酸酯基、C1-6亚磺酸酯基、C1-6亚砜基、烯基、炔基及含炔基的结构片段任选地被一个或多个适合的取代基所取代。
在一些实施方式中，所述的G选自卤素、卤代C1-6烷基、C1-6磺酰基、卤代C1-6磺酰基、卤代磺酰基、C1-6磺酸酯基、卤代C1-6磺酸酯基、C1-6亚磺酸酯基、C1-6亚砜基、硝基、叠氮基、氰基、烯基、炔基及含炔基的结构片段。
在一些实施方式中，所述的M为其中环A为5元脂杂环、6元杂芳环、或由一个以上(例如2个)的6元芳杂环与苯环或6元杂芳环通过单键连接形成的多环，所述脂杂环任选地被一个或多个选自氧基(＝O)、卤素和C1-4烷基的基团取代；M1选自单键、C1-20亚烷基、C2-20亚烯基、C2-20亚炔基或胺基，所述的C1-20亚烷基、C2-20亚烯基、C2-20亚炔基或胺基任选地被一个或多个适合的取代基所取代。
在一些实施方式中，所述的M为其中环A为5元脂杂环、6元杂芳环、或由一个以上(例如2个)的6元芳杂环与苯环或6元杂芳环通过单键连接形成的多环，所述脂杂环任选地被一个或多个选自氧基(＝O)、卤素和C1-4烷基的基团取代；M1选自单键、C1-20亚烷基、C2-20亚烯基、C2-20亚炔基或胺基。
在一些实施方式中，所述的M为其中环A选自
M1选自单键和C1-6亚烷基、C2-6亚烯基、C2-6亚炔基或胺基，所述的C1-6亚烷基、C2-6亚烯基、C2-6亚炔基或胺基任选地被一个或多个适合的取代基所取代。
在一些实施方式中，所述的M选自
在一些实施方式中，所述的M选自
在一些实施方式中，所述的M选自
在一些实施方式中，所述的M选自
在一些实施方式中，所述的L选自由下述的一个或多个组成的结构：C1-6亚烷基、-N(R’)-、羰基、-O-、Ala、Arg、Asn、Asp、Cit、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、Val、Lys(COCH2CH2(OCH2CH2)rOCH3))、Ala-Ala、Ala-Lys、Ala-Lys(Ac)、Ala-Pro、Gly-Glu、Gly-Gly、Phe-Lys、Phe-Lys(Ac)、Val-Ala、Val-Lys、Val-Lys(Ac)、Val-Cit、Ala-Ala-Ala、Ala-Ala-Asn、Leu-Ala-Glu、Gly-Gly-Arg、Gly-Glu-Gly、Gly-Gly-Gly、Gly-Ser-Lys、Glu-Val-Ala、Glu-Val-Cit、Ser-Ala-Pro、Val-Leu-Lys、Val-Lys-Ala、Val-Lys-Gly、Gly-Gly-Phe-Gly、Gly-Gly-Val-Ala、Gly-Phe-Leu-Gly、Glu-Ala-Ala-Ala、Gly-Gly-Gly-Gly-Gly、
其中R’代表氢、C1-6烷基或含1-10个EO单元的聚乙二醇片段；s选自1-20的整数，例如1-15、1-10、1-9、1-8、1-7、1-6、1-5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。
在一些实施方式中，所述的L选自由下述的一个或多个组成的结构：C1-6亚烷基、羰基、-NH-、Ala-Ala、Ala-Lys、Ala-Pro、Gly-Glu、Gly-Gly、Phe-Lys、Val-Ala、Val-Lys、Val-Cit、Ala-Ala-Ala、Ala-Ala-Asn、Leu-Ala-Glu、Gly-Gly-Arg、Gly-Glu-Gly、Gly-Gly-Gly、Gly-Ser-Lys、Glu-Val-Ala、Glu-Val-Cit、Ser-Ala-Pro、Val-Leu-Lys、Val-Lys-Ala、Val-Lys-Gly、Gly-Gly-Phe-Gly、Gly-Gly-Val-Ala、Gly-Phe-Leu-Gly、Glu-Ala-Ala-Ala、Gly-Gly-Gly-Gly-Gly、 其中s选自1-20的整数。
在一些实施方式中，所述的L选自由下述的一个或多个组成的结构：
在一些实施方式中，所述的L选自以下结构：
在一些实施方式中，所述的L选自以下结构：
在一些实施方式中，所述的L选自以下结构：
在一些实施方式中，所述的L选自以下结构：
在一些实施方式中，所述的E为单键、-NHCH2-、在一些实施方式中，所述的E为单键。
在一些实施方式中，所述的E为-NHCH2-。
在一些实施方式中，所述的E为
在一些实施方式中，所述的E为
在一些实施方式中，选自以下结构：
在一些实施方式中，选自以下结构：
在一些实施方式中，所述细胞毒性药物选自微管蛋白抑制剂、DNA嵌入剂、DNA拓扑异构酶抑制剂和RNA聚合酶抑制剂。
在一些实施方式中，所述微管蛋白抑制剂为奥瑞他汀类化合物或美登素类化合物；所述DNA嵌入剂为吡咯并苯二氮卓PBD；所述DNA拓扑异构酶抑制剂为拓扑异构酶I抑制剂(例如，喜树碱、羟基喜树碱、9-氨基喜树碱、SN-38、伊立替康、拓扑替康、贝洛替康、或卢比替康)或拓扑异构酶II抑制剂(例如，阿霉素、PNU-159682、多卡米星、柔红霉素、米托蒽醌、鬼臼毒素、或依托泊苷)；所述RNA聚合酶抑制剂为α-鹅膏草碱(α-amanitin)或其药学上可接受的盐、酯或类似物。
本申请中所公开的细胞毒性药物通常含有多种官能团，例如羟基(-OH)、羧基(-COOH)、巯基(-SH)、一级氨基(-NH2)、二级胺基(-NRAH)或三级胺基(-NRBRC)，其中RA、RB、RC在此仅代表N上的非氢取代基，所述细胞毒性药物可通过这些官能团与偶联物中的连接体连接。
在一些实施方案中，所述细胞毒性药物通过其上的-OH、-SH、一级氨基、二级胺基或三级胺基与所述抗体药物偶联物中的E连接。
在一些实施方式中，所述细胞毒性药物选自式I、式II所示化合物、或式I、式II所示化合物的药学上可接受的盐、酯、立体异构体、互变异构体或前药：
其中，R1,R2各自独立地选自C1-6烷基和卤素；
R3选自H和-CO-CH2OH；
R4和R5各自独立地选自H、卤素和羟基；或者R4和R5与相连碳原子连接成5-6元含氧杂环；
R6选自氢或-C1-4亚烷基-NRaRb；
R7选自C1-6烷基和-C1-4亚烷基-NRaRb；
其中Ra、Rb在每次出现时各自独立地选自H、C1-6烷基、-SO2-C1-6烷基和-CO-C1-6烷基。
在一些实施方式中，所述细胞毒性药物选自以下化合物或所述化合物的药学上可接受的盐、酯、立体异构体、互变异构体或前药：
在一些实施方式中，所述细胞毒性药物选自以下化合物或所述化合物的药学上可接受的盐、酯、立体异构体、互变异构体或前药：
在一些实施方式中，所述细胞毒性药物选自以下化合物或所述化合物的药学上可接受的盐、酯、立体异构体、互变异构体或前药：
在一些实施方案中，所述细胞毒性药物选自以下化合物或所述化合物的药学上可接受的盐、酯、立体异构体、互变异构体或前药：
在一些实施方式中，所述细胞毒性药物与连接体连接后得到的该细胞毒性药物相应的片段即为通式中的D；优选地，D为所述细胞毒性药物上的-OH、-NH2或二级胺基失掉一个H得到的一价结构。
在一些实施方案中，D选自以下结构：
另一方面，本发明提供的药物连接子化合物，其具有式G-M-[L-E-D]x所示结构，其中：
G是能够与抗体或抗原结合片段中特异性氨基酸或糖基发生反应的官能团或离去基团；G优选自卤素、卤代C1-6烷基、C1-6磺酰基、卤代C1-6磺酰基、卤代磺酰基、C1-6磺酸酯基、卤代C1-6磺酸酯基、C1-6亚磺酸酯基、C1-6亚砜基、硝基、叠氮基、氰基、烯基、炔基及含炔基的结构片段；
M是与G相连的接头，M为
其中，环A为5-6元脂杂环、或5-20元芳香族环系，所述脂杂环和芳香族环系任选地被一个或多个选自氧基(＝O)、卤素、氰基、氨基、羧基、巯基和C1-6烷基的基团取代；M1选自单键和C1-20亚烷基、C2-20亚烯基、C2-20亚炔基或胺基；
优选地，M为其中环A为5元脂杂环、6元杂芳环、或由一个以上(例如2个)的6元芳杂环与苯环或6元杂芳环通过单键连接形成的多环，所述脂杂环任选地被一个或多个选自氧基(＝O)、卤素和C1-4烷基的基团取代；M1选自单键、C1-20亚烷基、C2-20亚烯基、C2-20亚炔基或胺基；
优选地，M为其中环A选自 M1选自单键和C1-6亚烷基、C2-6亚烯基、C2-6亚炔基或胺基；
优选地，M选自
优选地，M选自
优选地，M选自
优选地，M选自
L是连接接头M和E之间的连接子，L选自由下述的一个或多个组成的结构：C1-6亚烷基、-N(R’)-、羰基、-O-、天然氨基酸或非天然氨基酸及其类似物(比如Ala、Arg、Asn、Asp、Cit、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、Val、Lys(COCH2CH2(OCH2CH2)rOCH3))、以及氨基酸组成的短肽(比如Ala-Ala、Ala-Lys、Ala-Lys(Ac)、Ala-Pro、Gly-Glu、Gly-Gly、Phe-Lys、Phe-Lys(Ac)、Val-Ala、Val-Lys、Val-Lys(Ac)、Val-Cit、Ala-Ala-Ala、Ala-Ala-Asn、Leu-Ala-Glu、Gly-Gly-Arg、Gly-Glu-Gly、Gly-Gly-Gly、Gly-Ser-Lys、Glu-Val-Ala、Glu-Val-Cit、Ser-Ala-Pro、Val-Leu-Lys、Val-Lys-Ala、Val-Lys-Gly、Gly-Gly-Phe-Gly、Gly-Gly-Val-Ala、Gly-Phe-Leu-Gly、Glu-Ala-Ala-Ala、Gly-Gly-Gly-Gly-Gly)、
其中R’代表氢、C1-6烷基或含1-10个EO单元的聚乙二醇片段；s选自1-20的整数；
优选地，L选自由下述的一个或多个组成的结构：C1-6亚烷基、羰基、-NH-、Ala-Ala、Ala-Lys、Ala-Pro、Gly-Glu、Gly-Gly、Phe-Lys、Val-Ala、Val-Lys、Val-Cit、Ala-Ala-Ala、Ala-Ala-Asn、Leu-Ala-Glu、Gly-Gly-Arg、Gly-Glu-Gly、Gly-Gly-Gly、Gly-Ser-Lys、Glu-Val-Ala、Glu-Val-Cit、Ser-Ala-Pro、Val-Leu-Lys、Val-Lys-Ala、Val-Lys-Gly、Gly-Gly-Phe-Gly、Gly-Gly-Val-Ala、Gly-Phe-Leu-Gly、Glu-Ala-Ala-Ala、Gly-Gly-Gly-Gly-Gly、
其中s选自1-20的整数；
优选地，L选自由下述的一个或多个组成的结构：
优选地，L选自以下结构：
优选地，L选自以下结构：
优选地，L选自以下结构：
优选地，L选自以下结构：
E是连接L和D的结构片段，其中E为单键、-NHCH2-或选自以下结构：
优选地，E为单键、-NHCH2-、
优选地，E为-NHCH2-或
优选地，E为-NHCH2-；
优选地，E为单键；
优选地，E为
D是细胞毒性药物片段，所述细胞毒性药物选自微管蛋白抑制剂、DNA嵌入剂、DNA拓扑异构酶抑制剂和RNA聚合酶抑制剂；优选地，所述微管蛋白抑制剂为奥瑞他汀类化合物或美登素类化合物；优选地，所述DNA嵌入剂为吡咯并苯二氮卓(PBD)；优选地，所述DNA拓扑异构酶抑制剂为拓扑异构酶I抑制剂(例如，喜树碱、羟基喜树碱、9-氨基喜树碱、SN-38、伊立替康、拓扑替康、贝洛替康、或卢比替康)或拓扑异构酶II抑制剂(例如，阿霉素、PNU-159682、多卡米星、柔红霉素、米托蒽醌、鬼臼毒素、或依托泊苷)；优选地，所述RNA聚合酶抑制剂为α-鹅膏草碱(α-amanitin)或其药学上可接受的盐、酯或类似物；
优选地，所述细胞毒性药物选自式I、式II所示化合物、或式I、式II所示化合物的药学上可接受的盐、酯、立体异构体、互变异构体或前药：
其中，R1,R2各自独立地选自C1-6烷基和卤素；
R3选自H和-CO-CH2OH；
R4和R5各自独立地选自H、卤素和羟基；或者R4和R5与相连碳原子连接成5-6元含氧杂环；
R6选自氢或-C1-4亚烷基-NRaRb；
R7选自C1-6烷基和-C1-4亚烷基-NRaRb；
其中Ra、Rb在每次出现时各自独立地选自H、C1-6烷基、-SO2-C1-6烷基和-CO-C1-6烷基；
优选地，所述细胞毒性药物选自以下化合物或所述化合物的药学上可接受的盐、酯、立体异构体、互变异构体或前药：
所述细胞毒性药物与连接体连接后得到的该细胞毒性药物相应的片段即为通式中的D；优选地，D为所述细胞毒性药物上的-OH、-NH2或二级胺基失掉一个H得到的一价结构；
优选地，所述细胞毒性药物选自以下化合物或所述化合物的药学上可接受的盐、酯、立体异构体、互变异构体或前药：
和/或
x选自1至10；
优选地，选自以下结构：
优选地，选自以下结构：
在另一个方面，本发明提供一种药物-连接体，其具有式G-M-[L-E-D]x所示结构，x选自1至10，其中：
G-M为G为亲核取代反应的离去基团(例如，
卤素、甲磺酰基、氟代苯酚基或)，或为羟基(-OH)、巯基(-SH)或氨基(-NH2)；或者，G与环A上相邻原子形成不饱和双键；环A为5-6元脂杂环、或5-20元芳香族环系，所述脂杂环和芳香族环系任选地被一个或多个选自氧基(＝O)、卤素、氰基、氨基、羧基、巯基和C1-6烷基的基团取代；M1选自单键、C1-20亚烷基、C2-20亚烯基、C2-20亚炔基或胺基；
L、E和D结构如前述所定义。
在一些实施方式中，G-M为G为甲磺酰基，或者，G与环A上相邻原子形成碳碳双键；环A为5元脂杂环、6元杂芳环、或由一个以上的6元芳杂环与苯环或6元杂芳环通过单键连接形成的多环，所述脂杂环任选地被一个或多个选自氧基(＝O)、卤素和C1-4烷基的基团取代；M1选自单键、C1-20亚烷基、C2-20亚烯基、C2-10亚炔基或胺基。
在一些实施方式中，G-M为 选自 M1选自单键、C1-20亚烷基、C2-20亚烯基、C2-20亚炔基或胺基。
在一些实施方式中，G-M为
在一些实施方式中，G-M选自
在一些实施方式中，G-M选自
在一些实施方式中，x选自1至10。
在一些实施方式中，所述的药物连接子化合物选自下示的A-01～A-34，B-01～B-07，C-01～C-28：
A-01A-02A-03A-04A-05A-06A-07A-08A-09A-10A-11A-12A-13A-14A-15A-16A-17A-18A-19A-20A-21A-22A-23A-24A-25A-26A-27A-28A-29A-30A-31A-32A-33A-34B-01B-02B-03B-04B-05B-06B-07C-01C-02C-03C-04C-05C-06C-07C-08C-09C-10C-11C-12C-13C-14
C-15
C-16
C-17
C-18
C-19
C-20
C-21
C-22
C-23
C-24
C-25
C-26
C-27
C-28
在一些实施方式中，本发明的药物连接子化合物选自：
在一些实施方式中，前文所述的药物连接子化合物可任选地被一个或多个适合的取代基所取代。
在一些实施方式中，前文所述的药物连接子化合物具有如下结构：
R10、R11、R12独立地选自氢、C1-6烷基、C3-6环烷基、C6-10芳基、苄基、羟基取代的苄基和吲哚基-C1-6烷基；
R13和R14各自独立选自氢、C1-6烷基、C3-6环烷基和4-6元杂环基；
R15选自氢、C1-6烷基、C3-6环烷基、卤代C1-6烷基、C1-6烷基-O-C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基和3-6元杂环烷基；或者，R15与NH形成4-7元环。
在一些实施方式中，R10、R11、R12独立地选自氢、C1-4烷基、C3-6环烷基、苯基、苄基、对羟基苄基和吲哚基甲基。
在一些实施方式中，R13和R14各自独立选自氢、C1-4烷基、C3-6环烷基和4-6元杂环基。
在一些实施方式中，R13和R14各自独立选自氢、甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、环丙基、环丁基、环戊基、环己基和4-6元杂环基。
在一些实施方式中，R15选自氢、C1-4烷基、C3-6环烷基、卤代C1-4烷基、C1-4烷基-O-C1-4烷基、C2-6烯基、C2-6炔基和3-6元杂环烷基；或者，R15与NH形成4-7元杂环烷基或4-7元杂芳基。
在一些实施方式中，R15选自氢、甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、环丙基、环丁基、环戊基、环己基、卤代C1-4烷基、C1-4烷基-O-C1-4烷基、C2-6烯基、C2-6炔基和3-6元杂环烷基；或者，R15与NH形成4-7元杂环烷基或4-7元杂芳基。
在一些实施方式中，R10、R11、R12独立地选自氢、C1-4烷基、C3-6环烷基、苯基、苄基、对羟基苄基和吲哚基甲基；
R13和R14各自独立选自氢、甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、环丙基、环丁基、环戊基、环己基和4-6元杂环基；
R15选自氢、甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、环丙基、环丁基、环戊基、环己基、卤代C1-4烷基、C1-4烷基-O-C1-4烷基、C2-6烯基、C2-6炔基和3-6元杂环烷基；或者，R15与NH形成4-7元杂环烷基或4-7元杂芳基。
另一个方面，本发明提供了具有如下结构的中间体化合物：
其中，X选自苄氧羰基、叔丁氧羰基、芴甲氧羰基、烯丙氧羰基、三甲基硅乙氧羰基、甲氧羰基、乙氧羰基、邻苯二甲酰基、对甲苯磺酰基、三氟乙酰基、硝基苯磺酰基、苯甲酰基、特戊酰基、三苯甲基、4-甲氧基苯基二苯基甲基、二甲氧基三苯甲基、2,4-二甲氧基苄基、对甲氧基苄基和苄基；D如前文所定义。
在一些实施方式中，X选自芴甲氧羰基(Fmoc)。
在一些实施方式中，D选自：
其中，R1,R2各自独立地选自C1-6烷基和卤素；
R3选自H和-CO-CH2OH；
R4和R5各自独立地选自H、卤素和羟基；或者R4和R5与相连碳原子连接成5-6元含氧杂环；
R6选自氢或-C1-4亚烷基-NRaRb；
R7选自C1-6烷基和-C1-4亚烷基-NRaRb；
其中Ra、Rb在每次出现时各自独立地选自H、C1-6烷基、-SO2-C1-6烷基和-CO-C1-6烷基。
另一个方面，本发明提供抗体药物偶联物，其具有式Ab-[M-L-E-D]x所示结构，M、L、E、D、x如前文所定义，Ab是与抗原特异性结合的抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，所述抗体药物偶联物选自下示的ADC A-01～ADC A-34，ADCB-01～ADC B-07，ADC C-01～ADC C-28：下述图示中的Ab定义如前所述，其中抗体上的巯基与药物连接子化合物通过加成反应或者取代反应形成硫醚键进而得到完整的抗体药物偶联物，x代表药物载荷数量：
ADC A-01
ADC A-02
ADC A-03
ADC A-04ADCA-05ADC A-06ADC A-07ADC A-08ADC A-09ADC A-10ADC A-11ADC A-12ADC A-13ADC A-14ADC A-15ADC A-16ADC A-17ADC A-18ADC A-19ADC A-20ADC A-21ADC A-22ADC A-23ADC A-24ADC A-25ADC A-26
ADC A-27
ADC A-28
ADC A-29
ADC A-30
ADC A-31ADC A-32ADC A-33ADC A-34ADC B-01
ADC B-02
ADC B-03
ADC B-04
ADC B-05
ADC B-06
ADC B-07
ADC C-01
ADC C-02
ADC C-03
ADC C-04ADC C-05ADC C-06ADC C-07
ADC C-08
ADC C-09
ADC C-10
ADC C-11
ADC C-12
ADC C-13
ADC C-14
ADC C-15
ADC C-16
ADC C-17
ADC C-18
ADC C-19
ADC C-20
ADC C-21
ADC C-22
ADC C-23
ADC C-24
ADC C-25
ADC C-26
ADC C-27
ADC C-28
其中，表示抗体或其抗原结合片段中的巯基与连接体的具体连接方式。
组合物
在另一方面，本申请提供了组合物，所述可包含多个本文所述的ADC。所述组合物中的每个抗体分子可以与1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个本发明所述的化合物偶联。因此，所述组合物的特征在于“药物-抗体比”(DAR)在约1至约10的范围内。测定DAR的方法是技术人员熟知的，包括使用反相色谱或HPLC-MS的方法。
在一些实施方案中，所述抗体药物偶联物的DAR值(药物抗体偶联比)为1-10，例如：1～2，1～3，1～4，1～5，1～6，1～7，1～8，1～9，1～10，2～3，2～4，2～5，2～6，2～7，2～8，2～9，2～10，3～4，3～5，3～6，3～7，3～8，3～9，3～10，4～5，4～6，4～7，4～8，4～9，4～10，5～6，5～7，5～8，5～9，5～10，6～7，6～8，6～9，6～10，7～8，7～9，7～10，8～9，8～10，或9～10，优选为3～9，例如，3.0～3.5，3.0～4.0，3.0～4.5，3.0～5.0，3.0～5.5，3.0～6.0，3.5～4.0，3.5～4.5，3.5～5.0，3.5～5.5，3.5～6.0，3.5～6.5，3.5～7.0，3.5～7.5，3.5～8.0，4.0～4.5，4.0～5.0，4.0～5.5，4.0～6.0，4.0～6.5，4.0～7.0，4.0～7.5，4.0～8.0，4.5～5.0，4.5～5.5，4.5～6.0，4.5～6.5，4.5～7.0，4.5～7.5，4.5～8.0，5.0～5.5，5.0～6.0，5.0～6.5，5.0～7.0，5.0～7.5，5.0～8.0，5.5～6.0，5.5～6.5，5.5～7.0，5.5～7.5，5.5～8.0，6.0～6.5，6.0～7.0，6.0～7.5，6.0～8.5，6.5～7.0，6.5～7.5，6.5～8.5，7.0～7.5，7.0～9.0或7.5～9.0。
在一些实施方案中，所述抗体药物偶联物的DAR值为4～8。药物-连接体(药物连接子化合物)本领域技术人员应当理解，可模块化制备本申请所述抗体-药物偶联物。例如，先获得游离形式的“药物-连接体”(可理解为G-M-[L-E-D]x，其中G-M为与抗体或其抗原结合片段共价连接前的结构形式)，而后将其与抗体或其抗原结合片段共价连接得到本申请所述抗体药物偶联物。相应地，所述游离形式的“药物-连接体”中G-M通过取代反应(例如脱除其上的-SO2Me或-Br等结构)或者通过加成反应等方式与抗体或其抗原结合片段上的一个或多个巯基(-SH)、氨基(-NH2)或羧基(-COOH)连接，x选自1至10。
药物组合物
抗体药物偶联物和/或药物-连接体的药物组合物
在另一个方面，本申请提供一种药物组合物，其含有前文任一项所述的抗体药物偶联物或任选的前文任一项所述的药物-连接体，以及一种或多种药用辅料。
本文所述抗体药物偶联物通常与药学上可接受的胃肠外媒介一起以单位可注射形式配制，供胃肠外使用，例如推注、静脉注射、肿瘤内注射等。任选地，以冻干剂或溶液剂的形式将具有期望纯度的抗体药物偶联物与药学上可接受的稀释剂、载体、赋型剂或稳定剂混合(Remington’s Pharmaceutical Sciences(1980)16th edition,Osol,A.Ed.)。可以通过对于要治疗的个体适宜的任何路径施用本文所述抗体药物偶联物或含有所述抗体药物偶联物的药物组合物。
在某些实施方案中，所述药物组合物还可以包含另外的药学活性剂。
在某些实施方案中，所述另外的药学活性剂是具有抗肿瘤活性的药物。在某些实施方案中，所述另外的药学活性剂选自B7-H3抑制剂、EGFR抑制剂、HER2抑制剂、HER3抑制剂、HER4抑制剂、IGFR-1抑制剂、mTOR抑制剂、PI3激酶抑制剂、c-met或VEGF抑制剂、化疗药物或其任意组合。
应用
1、抗体药物偶联物和/或药物-连接体的治疗用途
本文所述抗体药物偶联物、药物-连接体或药物组合物可以用于治疗多种疾病或病症，例如B7-H3阳性肿瘤、Her2阳性肿瘤。
因此，本申请提供前文任一项所述的抗体药物偶联物、药物-连接体、或含有其的药物组合物在制备预防和/或治疗和/或辅助治疗阳性肿瘤的药物中的用途。
本申请提供前文任一项所述的抗体药物偶联物、药物-连接体、或含有其的药物组合物在制备预防和/或治疗和/或辅助治疗B7-H3阳性肿瘤的药物中的用途。
本申请提供前文任一项所述的抗体药物偶联物、药物-连接体、或含有其的药物组合物在制备预防和/或治疗和/或辅助治疗HER2阳性肿瘤的药物中的用途。
同时，本申请还提供一种预防和/或治疗和/或辅助治疗阳性肿瘤的方法，其包括向由此需要的受试者施用有效量的前文任一项所述的抗体药物偶联物、药物连接体、或含有其的药物组合物的步骤。
本申请还提供一种预防和/或治疗和/或辅助治疗B7-H3阳性肿瘤的方法，其包括向由此需要的受试者施用有效量的前文任一项所述的抗体药物偶联物、药物连接体、或含有其的药物组合物的步骤。
本申请还提供一种预防和/或治疗和/或辅助治疗HER2阳性肿瘤的方法，其包括向由此需要的受试者施用有效量的前文任一项所述的抗体药物偶联物、药物连接体、或含有其的药物组合物的步骤。
本申请还提供了前文任一项所述的抗体药物偶联物、药物连接体或药物组合物在抑制B7-H3阳性肿瘤细胞增殖中的用途。
本申请还提供了前文任一项所述的抗体药物偶联物、药物连接体或药物组合物在抑制Her2阳性肿瘤细胞增殖中的用途。
在某些实施方案中，所述抗体药物偶联物、药物连接体或药物组合物被施用于体外细胞或受试者体内细胞；例如应用于受试者体内，以抑制受试者体内肿瘤细胞的增殖；或者，应用于体外肿瘤细胞(例如细胞系或者来自受试者的细胞)，以抑制体外肿瘤细胞的增殖。
本申请中，B7-H3阳性肿瘤包括实体瘤或血液系统恶性肿瘤，例如结直肠癌，胃癌，乳腺癌，前列腺癌，头颈部鳞癌，黑色素瘤，神经母细胞瘤，肉瘤，肺癌(例如，小细胞肺癌，非小细胞肺癌等)、肾癌、膀胱癌、甲状腺癌、间皮瘤、胰腺癌、卵巢癌，子宫内膜癌、食管癌，肝癌、唾液腺癌、胆管癌、脑膜瘤。
本申请中，受试者优选为哺乳动物，例如牛科动物、马科动物、猪科动物、犬科动物、猫科动物、啮齿类动物、灵长类动物；例如，人。
在某些实施方案中，所述方法还包括向所述受试者施用第二疗法，所述第二疗法选自手术、化疗、放疗、免疫疗法、基因疗法、DNA疗法、RNA疗法、纳米疗法、病毒疗法、辅助疗法及其任意组合。在某些实施方案中，所述第二疗法可以与上述方法同时、分开或相继应用。
在某些实施方案中，本发明药物组合物所涉及的肿瘤选自乳腺癌，结直肠癌，头颈癌，肾透明细胞癌，肾乳头状细胞癌，肝癌，肺腺癌，肺鳞癌，前列腺癌，胃腺癌，甲状腺癌或其任意组合。
2、药物-连接体在制备偶联物中的用途
本发明前文所述的药物连接子用于制备偶联物。本发明的偶联物包含抗体药物偶联物等。
3、中间体化合物在制备药物连接子化合物中的用途
本发明前文所述的中间体化合物用于制备药物连接子化合物。
制备方法
本发明还提供了药物连接子化合物的制备方法，包含对中间体化合物进行脱保护的步骤。
方法一
在部分实施方案中，所述方法一包括制备化合物A-05a的方法，所述方法包括与式I化合物进行偶联的步骤；
A-05a：
其中，R1,R2各自独立地选自C1-6烷基和卤素；
R3选自H和-CO-CH2OH；
R4和R5各自独立地选自H、卤素和羟基；或者R4和R5与相连碳原子连接成5-6元含氧杂环；
R6选自氢或-C1-4亚烷基-NRaRb；
R7选自C1-6烷基和-C1-4亚烷基-NRaRb；
其中Ra、Rb在每次出现时各自独立地选自H、C1-6烷基、-SO2-C1-6烷基和-CO-C1-6烷基。
在一些实施方式中，R1,R2各自独立地选自C1-4烷基、F、Cl、Br和I。
在一些实施方式中，R1选自卤素、甲基、乙基、丙基和丁基，例如甲基和Cl。
在一些实施方式中，R2选自F、Cl、Br和I，例如F和Cl。
在一些实施方式中，R1选自甲基和Cl，R2选自F和Cl。
方法二
在部分实施方案中，所述方法二包括制备化合物A-14-a的方法，所述方法包括IM-5-a与式IM-6-a化合物进行脱保护的步骤；
A-14-a：IM-5-a：IM-6-a：
其中，X如前文所述中间体化合物所定义，R1和R2如方法一中所定义。
在一些实施方式中，所述脱保护的反应为：溶剂选自N,N-二甲基甲酰胺，并加入烷胺类化合物，例如二乙胺。
在一些实施方式中，所述脱保护在室温条件下进行，反应时间为1-5h，例如1-3h。
在部分实施方案中，所述方法二还进一步包括IM-6-a与IM-2进行反应的步骤。
在一些实施方式中，所述反应的溶剂选自N,N-二甲基甲酰胺和N,N-二甲基乙酰胺。
在一些实施方式中，所述反应还包括加入N,N-二异丙基乙胺的步骤。
方法三
在部分实施方案中，所述方法三包括制备化合物B-02-a的方法，所述方法包括将B-02-4a进行脱保护的步骤；
B-02-a：B-02-4a：
其中，X如前文中间体化合物中所述，R1、R2和R3如前文式一化合物中所述。
方法四
在部分实施方案中，所述方法四包括制备化合物C-07-a的方法，所述方法包括C-07-6与C-07-8a进行反应的步骤；
C-07-a：
C-07-8a：
其中，R1和R2如方法一中所定义。
在一些实施方式中，所述方法四中的C-07-8a通过C-07-7a脱保护制备得到；
C-07-7a：其中X如中间体化合物中所定义，R1和R2如方法一中所定义。
定义
除非在下文中另有定义，本文中所使用的所有技术术语和科学术语的含义意图与本领域技术人员通常所理解的相同。提及本文中使用的技术意图指在本领域中通常所理解的技术，包括那些对本领域技术人员显而易见的技术的变化或等效技术的替换。并且，本文中所用的基因组学、核酸化学、分子生物学等实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。虽然相信以下术语对于本领域技术人员很好理解，但仍然阐述以下定义以更好地解释本发明。
术语“抗体”是指，通常由两对多肽链(每对具有一条轻链(LC)和一条重链(HC))组成的免疫球蛋白分子。抗体轻链可分类为κ(kappa)和λ(lambda)轻链。重链可分类为μ、δ、γ、α或ε，并且分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过大约12或更多个氨基酸的“J”区连接，重链还包含大约3个或更多个氨基酸的“D”区。各重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区由3个结构域(CH1、CH2和CH3)组成。各轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但展现出多种效应子功能，如可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)的结合。VH和VL区还可被细分为具有高变性的区域(称为互补决定区(CDR))，其间散布有较保守的称为构架区(FR)的区域。各VH和VL由按下列顺序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4从氨基末端至羧基末端排列的3个CDR和4个FR组成。各重链/轻链对的可变区(VH和VL)分别形成抗原结合部位。氨基酸在各区域或结构域的分配可遵循本领域已知的各种编号系统。
术语“互补决定区”或“CDR”是指抗体可变区中负责抗原结合的氨基酸残基。在重链和轻链的可变区中各含有三个CDRs，命名为CDR1、CDR2和CDR3。这些CDR的精确边界可根据本领域已知的各种编号系统进行定义，例如可按照Kabat编号系统(Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1991)、Chothia编号系统(Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917；Chothia等人(1989)Nature 342:878-883)、IMGT编号系统(Lefranc et al.,Dev.Comparat.Immunol.27:55-77,2003)或AbM编号系统(MartinACR,Cheetham JC,Rees AR(1989)Modelling antibody hypervariable loops:Acombined algorithm.Proc Natl Acad Sci USA 86:9268-9272)中的定义。对于给定的抗体，本领域技术人员将容易地鉴别各编号系统所定义的CDR。并且，不同编号系统之间的对应关系是本领域技术人员熟知的(例如，可参见Lefranc et al.,Dev.Comparat.Immunol.27:55-77,2003)。
在本发明中，抗体或其抗原结合片段含有的CDR可根据本领域已知的各种编号系统确定，例如通过Kabat、Chothia、IMGT或AbM编号系统确定。在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段含有的CDR通过Chothia编号系统定义。
术语“构架区”或“FR”残基是指，抗体可变区中除了如上定义的CDR残基以外的那些氨基酸残基。
术语抗体的“抗原结合片段”是指抗体的片段的多肽，例如全长抗体的片段的多肽，其保持特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力，和/或与全长抗体竞争对抗原的特异性结合，其也被称为“抗原结合部分”。通常参见，Fundamental Immunology,Ch.7(Paul,W.,ed.,第2版，Raven Press,N.Y.(1989)，其以其全文通过引用合并入本文，用于所有目的。可通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学断裂产生抗体的抗原结合片段。抗原结合片段的非限制性实例包括Fab片段、Fab'片段、F(ab)'2片段、F(ab)'3片段、Fd、Fv、scFv、di-scFv、(scFv)2、二硫键稳定的Fv蛋白(“dsFv”)、单结构域抗体(sdAb，纳米抗体)和这样的多肽，其包含足以赋予多肽特异性抗原结合能力的抗体的至少一部分。工程改造的抗体变体综述于Holliger等,2005；Nat Biotechnol,23:1126-1136中。
术语“Fd”意指由VH和CH1结构域组成的抗体片段；术语“dAb片段”意指由VH结构域组成的抗体片段(Ward等人,Nature 341:544 546(1989))；术语“Fab片段”意指由VL、VH、CL和CH1结构域组成的抗体片段；术语“F(ab’)2片段”意指包含通过铰链区上的二硫桥连接的两个Fab片段的抗体片段；术语“Fab’片段”意指还原连接F(ab’)2片段中两个重链片段的二硫键后所获片段，由一条完整的轻链和重链的Fd片段(由VH和CH1结构域组成)组成。
术语“Fv”意指由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的抗体片段。Fv片段通常被认为是，能形成完整的抗原结合位点的最小抗体片段。一般认为，六个CDRs赋予抗体的抗原结合特异性。然而，即便是一个可变区(例如Fd片段，其仅仅含有三个对抗原特异的CDRs)也能够识别并结合抗原，尽管其亲和力可能低于完整的结合位点。
术语“Fc”意指，由抗体的第一重链的第二、第三恒定区与第二重链的第二、第三恒定区经二硫键结合而形成的抗体片段。抗体的Fc片段具有多种不同的功能，但不参与抗原的结合。
术语“scFv”是指，包含VL和VH结构域的单个多肽链，其中所述VL和VH通过接头(linker)相连(参见，例如,Bird等人,Science 242:423-426(1988)；Huston等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883(1988)；和Pluckthun，The Pharmacology ofMonoclonal Antibodies，第113卷，Roseburg和Moore编，Springer-Verlag，纽约，第269-315页(1994))。此类scFv分子可具有一般结构：NH2-VL-接头-VH-COOH或NH2-VH-接头-VL-COOH。合适的现有技术接头由重复的GGGGS氨基酸序列或其变体组成。例如，可使用具有氨基酸序列(GGGGS)4的接头，但也可使用其变体(Holliger等人(1993)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448)。可用于本发明的其他接头由Alfthan等人(1995)，Protein Eng.8:725-731，Choi等人(2001)，Eur.J.Immunol.31:94-106，Hu等人(1996)，Cancer Res.56:3055-3061，Kipriyanov等人(1999)，J.Mol.Biol.293:41-56和Roovers等人(2001)，Cancer Immunol.描述。在一些情况下，scFv的VH与VL之间还可以存在二硫键。在某些实施方案中，VH和VL结构域可以以任何合适的排列彼此相对定位。例如，包含NH2-VH-VH-COOH、NH2-VL-VL-COOH的scFv。
术语“单域抗体(single-domain antibody,sdAb)”具有本领域技术人员通常理解的含义，其是指由单个单体可变抗体结构域(例如单个重链可变区)所组成的抗体片段，其保持特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力(Holt,L.等人,生物技术趋势(Trendsin Biotechnology),21(11):484-490，2003)。单域抗体也称为纳米抗体(nanobody)。
上述各个抗体片段均保持了特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力，和/或与全长抗体竞争对抗原的特异性结合。
在本文中，除非上下文明确指出，否则当提及术语“抗体”时，其不仅包括完整抗体，而且包括抗体的抗原结合片段。
可使用本领域技术人员已知的常规技术(例如，重组DNA技术或酶促或化学断裂法)从给定的抗体(例如本发明提供的抗体)获得抗体的抗原结合片段(例如，上述抗体片段)，并且以与用于完整抗体的方式相同的方式就特异性筛选抗体的抗原结合片段。
术语“鼠源抗体”是指通过下述方法获得的抗体：融合免疫接种过的小鼠的B细胞与骨髓瘤细胞，筛选出既能无限增殖又能分泌抗体的鼠杂交融合细胞，继而进行筛选、抗体制备和抗体纯化；或者是指，由抗原侵入小鼠体内后B细胞分化增殖而形成浆细胞所分泌产生的抗体。
术语“人源化抗体”是指，经基因工程改造的非人源抗体，其氨基酸序列经修饰以提高与人源抗体的序列的同源性。通常而言，人源化抗体的全部或部分CDR区来自于非人源抗体(供体抗体)，全部或部分的非CDR区(例如，可变区FR和/或恒定区)来自于人源免疫球蛋白(受体抗体)。人源化抗体通常保留了供体抗体的预期性质，包括但不限于，抗原特异性、亲和性、反应性、提高免疫细胞活性的能力、增强免疫应答的能力等。供体抗体可以是有预期性质(例如，抗原特异性、亲和性、反应性、提高免疫细胞活性的能力和/或增强免疫应答的能力)的小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物(例如，食蟹猴)抗体。
术语“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时(例如，两个DNA分子的每一个中的某个位置都被腺嘌呤占据，或两个多肽的每一个中的某个位置都被赖氨酸占据)，那么各分子在该位置上是同一的。两个序列之间的“百分数同一性”是由这两个序列共有的匹配位置数目除以进行比较的位置数目×100的函数。例如，如果两个序列的10个位置中有6个匹配，那么这两个序列具有60％的同一性。例如，DNA序列CTGACT和CAGGTT共有50％的同一性(总共6个位置中有3个位置匹配)。通常，在将两个序列比对以产生最大同一性时进行比较。这样的比对可通过使用，例如，可通过计算机程序例如Align程序(DNAstar,Inc.)方便地进行的Needleman等人(1970)J.Mol.Biol.48：443-453的方法来实现。还可使用已整合入ALIGN程序(版本2.0)的E.Meyers和W.Miller(Comput.Appl Biosci.，4:11-17(1988))的算法，使用PAM120权重残基表(weight residue table)、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。此外，可使用已整合入GCG软件包(可在www.gcg.com上获得)的GAP程序中的Needleman和Wunsch(J MoI Biol.48:444-453(1970))算法，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵以及16、14、12、10、8、6或4的缺口权重(gap weight)和1、2、3、4、5或6的长度权重来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。
如本文中所使用的，术语“变体”，在多肽的情境中(包括多肽)也指包含已通过引入氨基酸残基置换、缺失或添加改变的氨基酸序列的多肽或肽。在某些情况下，术语“变体”还指已被修饰(即，通过将任何类型的分子共价连接至多肽或肽)的多肽或肽。例如，但非限制性地，多肽可以被修饰，例如通过糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、通过已知保护/封闭基团进行的衍生化、蛋白水解切割、连接至细胞配体或其它蛋白质等。衍生多肽或肽可使用本领域技术人员已知的技术通过化学修饰来产生，所述技术包括但不限于特异性化学切割、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等。此外，变体具有与其所源自的多肽或肽相似、相同或改善的功能。
如本文中所使用的，术语“特异性结合”是指，两分子间的非随机的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。特异性结合相互作用的强度或亲和力可以该相互作用的平衡解离常数(KD)或半最大效应浓度(EC50)表示。
两分子间的特异性结合性质可使用本领域公知的方法进行测定。一种方法涉及测量抗原结合位点/抗原复合物形成和解离的速度。“结合速率常数”(ka或kon)和“解离速率常数”(kdis或koff)两者都可通过浓度及缔合和解离的实际速率而计算得出(参见Malmqvist M,Nature,1993,361:186-187)。kdis/kon的比率等于解离常数KD(参见Davies等人,Annual Rev Biochem,1990；59:439-473)。可用任何有效的方法测量KD、kon和kdis值。在某些实施方案中，可以使用生物发光干涉测量法(例如ForteBio Octet法)来测量解离常数。除此以外还可用表面等离子共振技术(例如Biacore)或Kinexa来测量解离常数。
术语“保守置换”意指不会不利地影响或改变包含氨基酸序列的蛋白/多肽的预期性质的氨基酸置换。例如，可通过本领域内已知的标准技术例如定点诱变和PCR介导的诱变引入保守置换。保守氨基酸置换包括用具有相似侧链的氨基酸残基替代氨基酸残基的置换，例如用在物理学上或功能上与相应的氨基酸残基相似(例如具有相似大小、形状、电荷、化学性质，包括形成共价键或氢键的能力等)的残基进行的置换。已在本领域内定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，优选用来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基替代相应的氨基酸残基。鉴定氨基酸保守置换的方法在本领域内是熟知的(参见，例如，Brummell等人，Biochem.32:1180-1187(1993)；Kobayashi等人Protein Eng.12(10):879-884(1999)；和Burks等人Proc.Natl Acad.Set USA 94:412-417(1997)，其通过引用并入本文)。
本文涉及的二十个常规氨基酸的编写遵循常规用法。参见例如，Immunology-ASynthesis(2nd Edition,E.S.Golub and D.R.Gren,Eds.,Sinauer Associates,Sunderland,Mass.(1991))，其以引用的方式并入本文中。在本发明中，氨基酸通常用本领域公知的单字母和三字母缩写来表示。例如，丙氨酸可用A或Ala表示。
术语“包括”、“包含”、“具有”、“含有”或“涉及”及其在本文中的其它类似形式为包含性的(inclusive)或开放式的，且不排除其它未列举的元素或方法步骤。
术语“烷基”表示直链或支链烃基去掉1个氢原子得到的基团，例如“C1-20烷基”、“C1-10烷基”、“C1-6烷基”、“C1-4烷基”、“C1-3烷基”等，具体实例包括但不限于：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、2-甲基丁基、新戊基、1-乙基丙基、正己基、异己基、3-甲基戊基、2-甲基戊基、1-甲基戊基、3,3-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基、2-乙基丁基、1,2-二甲基丙基等。
术语“亚烷基”表示直链或支链烃基去掉2个氢原子得到的基团，例如“C1-20亚烷基”、“C1-10亚烷基”、“C3-10亚烷基”、“C5-8亚烷基”、“C1-6亚烷基”、“C1-4亚烷基”、“C1-3亚烷基”等，具体实例包括但不限于：亚甲基、亚乙基、1,3-亚丙基、1,4-亚丁基、1,5-亚戊基或1,6-亚己基等。
术语“亚烯基”是指含有至少一个碳碳双键的直链或支链的烃基失去两个氢原子得到的二价基团，包括例如“C2-20亚烯基”、“C3-10亚烯基”、“C5-8亚烯基”等。其实例包括但不限于：亚乙烯基、1-亚丙烯基、2-亚丙烯基、1-亚丁烯基、2-亚丁烯基、1,3-亚丁二烯基、1-亚戊烯基、2-亚戊烯基、3-亚戊烯基、1,3-亚戊二烯基、1,4-亚戊二烯基、1-亚己烯基、2-亚己烯基、3-亚己烯基、1,4-亚己二烯基等。
术语“亚炔基”是指含有至少一个碳碳三键的直链或支链烃基失去两个氢原子得到的二价基团。包括例如“C2-20亚炔基”、“C3-10亚炔基”、“C5-8亚炔基”等。其实例包括但不限于：亚乙炔基、1-亚丙炔基、2-亚丙炔基、1-亚丁炔基、2-亚丁炔基、1,3-亚丁二炔基、1-亚戊炔基、2-亚戊炔基、3-亚戊炔基、1,3-亚戊二炔基、1,4-亚戊二炔基、1-亚己炔基、2-亚己炔基、3-亚己炔基、1,4-亚己二炔基等。
术语“脂杂环”是指含至少一个(例如1、2或3个)选自N、O和S的环成员的饱和或部分饱和的环状结构。具体实例包括但不限于5-6元脂杂环、5-6元含氮脂杂环、5-6元含氧脂杂环等，例如四氢呋喃、吡咯烷、哌啶、四氢吡喃等。
术语“杂芳环”是指含至少一个选自N、O和S的环成员的芳香环状结构。具体实例包括但不限于5-6元芳杂环、5-6元含氮芳杂环、5-6元含氧芳杂环等，例如呋喃、噻吩、吡咯、噻唑、异噻唑、噻二唑、噁唑、异噁唑、噁二唑、咪唑、吡唑、1,2,3-三唑、1,2,4-三唑、1,2,3-噁二唑、1,2,4-噁二唑、1,2,5-噁二唑、1,3,4-噁二唑、吡啶、嘧啶、哒嗪、吡嗪、1,2,3-三嗪、1,3,5-三嗪、1,2,4,5-四嗪等。
术语“芳香族环系”是指包含至少一个芳环(例如苯环等)或杂芳环(例如5-6元芳杂环，例如5-6元含氮芳杂环，例如嘧啶环等)的单环或多环体系，两个或更多个芳环和/或杂芳环可以形成稠合环或通过单键连接(例如二嘧啶基苯基等)，所述芳香族环系可以是二价或更高价态(例如三价或四价)，例如5-20元芳香族环系。
如本文中所使用的，术语“适合的取代基”是指本领域技术人员可根据化合物取代基的需要对化合物进行的变型。“适合的取代基”包括氧基(＝O)、卤素、氰基、NR8R9、羧基、巯基、羟基、酯基(例如-C1-6烷基-C(＝O)-OC1-6烷基)、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C1-6烷基-O-C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C1-6烷氧基、C3-6环烷基、3-10元杂环基、5-10元杂芳基、C6-10芳基、苄基、羟基取代的苄基、吲哚基亚甲基和C1-6卤代烷氧基，R8、R9各自独立地选自H、C1-6烷基、C3-6环烷基、3-10元杂环基、5-10元杂芳基、C6-10芳基、C1-6烷氧基、C1-6卤代烷基、C1-6卤代烷氧基、卤素、羟基、羧基和酯基(例如-C1-6烷基-C(＝O)-OC1-6烷基)。
如本文中所使用的，术语“药学上可接受的载体和/或赋形剂”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的(参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences.Edited by Gennaro AR,19thed.Pennsylvania:Mack Publishing Company,1995)，并且包括但不限于：pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂，稀释剂，维持渗透压的试剂，延迟吸收的试剂，防腐剂。例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液。表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如Tween-80。离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。防腐剂包括但不限于各种抗细菌试剂和抗真菌试剂，例如对羟苯甲酸酯，三氯叔丁醇，苯酚，山梨酸等。维持渗透压的试剂包括但不限于糖、NaCl及其类似物。延迟吸收的试剂包括但不限于单硬脂酸盐和明胶。稀释剂包括但不限于水，水性缓冲液(如缓冲盐水)，醇和多元醇(如甘油)等。防腐剂包括但不限于各种抗细菌试剂和抗真菌试剂，例如硫柳汞，2-苯氧乙醇，对羟苯甲酸酯，三氯叔丁醇，苯酚，山梨酸等。稳定剂具有本领域技术人员通常理解的含义，其能够稳定药物中的活性成分的期望活性，包括但不限于谷氨酸钠，明胶，SPGA，糖类(如山梨醇，甘露醇，淀粉，蔗糖，乳糖，葡聚糖，或葡萄糖)，氨基酸(如谷氨酸，甘氨酸)，蛋白质(如干燥乳清，白蛋白或酪蛋白)或其降解产物(如乳白蛋白水解物)等。
如本文中所使用的，术语“预防”是指，为了阻止或延迟疾病或病症或症状(例如，肿瘤)在受试者体内的发生而实施的方法。如本文中所使用的，术语“治疗”是指，为了获得有益或所需临床结果而实施的方法。为了本发明的目的，有益或所需的临床结果包括但不限于，减轻症状、缩小疾病的范围、稳定(即，不再恶化)疾病的状态，延迟或减缓疾病的发展、改善或减轻疾病的状态、和缓解症状(无论部分或全部)，无论是可检测或是不可检测的。此外，“治疗”还可以指，与期望的存活期相比(如果未接受治疗)，延长存活期。
如本文中使用的，术语“受试者”是指哺乳动物，例如灵长类哺乳动物，例如人。在某些实施方式中，所述受试者(例如人)患有肿瘤，或者，具有患有上述疾病的风险。
如本文中所使用的，术语“有效量”是指足以获得或至少部分获得期望的效果的量。例如，预防疾病(例如，肿瘤)有效量是指，足以预防，阻止，或延迟疾病(例如，肿瘤)的发生的量；治疗疾病有效量是指，足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。测定这样的有效量完全在本领域技术人员的能力范围之内。例如，对于治疗用途有效的量将取决于待治疗的疾病的严重度、患者自己的免疫系统的总体状态、患者的一般情况例如年龄，体重和性别，药物的施用方式，以及同时施用的其他治疗等等。
术语“癌症”“肿瘤”可互换使用，其是指以体内异常细胞的不受控生长为特征的一大类疾病。不受管制的细胞分裂可能导致恶性肿瘤或侵入邻近组织的细胞的形成，并可能通过淋巴系统或血流转移到身体的远端部位。癌症包括良性和恶性癌症以及休眠肿瘤或微转移。癌症也包括血液学恶性肿瘤。
术语“血液学恶性肿瘤”包括淋巴瘤，白血病，骨髓瘤或淋巴恶性肿瘤，以及脾癌和淋巴结肿瘤。示例性淋巴瘤包括B细胞淋巴瘤和T细胞淋巴瘤。B细胞淋巴瘤，包括例如霍奇金淋巴瘤。T细胞淋巴瘤，包括例如皮肤T细胞淋巴瘤。血液学恶性肿瘤还包括白血病，例如继发性白血病或急性淋巴细胞性白血病。血液恶性肿瘤还包括骨髓瘤(例如多发性骨髓瘤)及其他血液学和/或B细胞或T细胞相关的癌症。
附图说明
图1：ADC对HCC1806细胞皮下荷瘤鼠模型的药效结果
图2：人乳腺鳞状癌细胞HCC1806 CDX模型中各组小鼠体重的变化情况
具体实施方式
以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制。本领域技术人员根据本发明的教导，可以做出各种修改或改进，而不脱离本发明的基本思想和范围。
本发明涉及的序列的信息描述于下面的表中：
本文中所使用的缩写具有以下含义：
缩写 含义
CDR 免疫球蛋白可变区中的互补决定区
FR 抗体构架区：抗体可变区中除CDR残基以外的氨基酸残基
VH 抗体重链可变区
VL 抗体轻链可变区
IgG 免疫球蛋白G
IMGT 基于由Lefranc等人发起的国际免疫遗传学信息系统(Theinternational ImMunoGeneTics information(IMGT))的编号系统，可参阅Lefranc et al.,Dev.Comparat.Immunol.27:55-77,2003。
Kabat 由Elvin A.Kabat提出的免疫球蛋白比对及编号系统(参见，例如Kabatet al.,Sequencesof Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1991)。
Chothia 由Chothia等人提出的免疫球蛋白编号系统，其是基于结构环区的位置鉴定CDR区边界的经典规则(参见，例如Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917；Chothia等人(1989)Nature 342:878-883)。
AbM CDR定义方式，来源于Martin的相关研究(Martin ACR,CheethamJC,Rees AR(1989)Modelling antibody hypervariable loops:Acombined algorithm.ProcNatl Acad Sci USA86:9268–9272)。
mAb 单克隆抗体
EC50 产生50％功效或结合的浓度
IC50 产生50％抑制的浓度
ELISA 酶联免疫吸附测定
PCR 聚合酶链式反应
HRP 辣根过氧化物酶
KD 平衡解离常数
Ka 结合速率常数
Kd 解离速率常数
ADCC 抗体依赖性细胞介导的细胞毒性
CDC 补体依赖的细胞毒性
FACS 流式细胞仪技术
CDR-H1 免疫球蛋白重链可变区中的互补决定区1
CDR-H2 免疫球蛋白重链可变区中的互补决定区2
CDR-H3 免疫球蛋白重链可变区中的互补决定区3
CDR-L1 免疫球蛋白轻链可变区中的互补决定区1
CDR-L2 免疫球蛋白轻链可变区中的互补决定区2
CDR-L3 免疫球蛋白轻链可变区中的互补决定区3
以下的实施例中记载的化合物的结构通过核磁共振(1H NMR)或质谱(MS)来确定。
核磁共振(1H NMR)的测定使用Bruker 400MHz核磁共振仪；氘代试剂为六氘代二甲基亚砜(DMSO-d6)；内标物质为四甲基硅烷(TMS)。
实施例中使用的核磁共振(NMR)图谱中的缩写示于以下。
s：单峰(singlet)、d：二重峰(doublet)、t：三重峰(triplet)、q：四重峰(quartet)、m：多重峰(multiplet)、br：宽峰(broad)、J：偶合常数、Hz：赫兹、DMSO-d6：氘化二甲基亚砜。δ值用ppm值表示。
质谱(MS)的测定使用Agilent(ESI)质谱仪，型号为Agilent 6120B。
实施例一N-((S)-10-苄基-1-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)氨基)-1,6,9,12,15-五氧代-3-氧杂-5,8,11,14-四氮杂十六烷-16-基-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1-H-吡咯-1-基)己酰胺(M-01)
将化合物IM-1(0.40g,640.59μmol，其合成参考专利CN 111936169A)、依喜替康甲磺酸盐(0.37g,704.65μmol)溶于DMF(8mL)中，加入HATU(0.32g,832.77μmol)和DIPEA(0.25g,1.92mmol)，25℃反应4小时。减压除去DIPEA并加水冷冻干燥以除去大部分DMF得到粗品，粗品用制备高效液相色谱纯化(条件如下)得M-01化合物273mg。
色谱柱：Waters XBridge Prep C18 OBD 45mm×450mm×8.0μm
流动相A：乙腈；流动相B：水(0.05％三氟乙酸)
时间[min] 流动相A[％] 流动相B[％] 流速[mL/min]
0.00 30 70 70
5.00 30 70 70
60.00 70 30 70
M-01结构表征数据如下：
ESI-MS(m/z):1034.4[M+H]+.
实施例二N-((S)-10-苄基-1-(((1S,9S)-5-氯-9-乙基-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H，12H-苯并[de]吡喃[3',4':6,7]吲哚利嗪[1,2-b]喹啉-1-基)氨基)-1,6,9,12,15-五氧代-3-氧基-5,8,11,14-四氮杂十六烷-16-基)-6-(2-(甲基磺基)嘧啶-5-基)己-5-酰胺(A-05)
氮气保护下，将2,5-二氧吡咯烷-1-基-6-(2-(甲磺酰基)嘧啶-5-基)己基-5-炔酸酯(IM-2，0.66g，1.80mmol)和(R)-16-氨基-10-苄基-6,9,12,15-四氧-3-氧-5,8,11,14-四氮杂十六酸(IM-3，0.75g,1.77mmol)加入DMF(19mL)中，升温至35℃反应16小时后向该体系中加入(1S，9S)-1-氨基-5-氯-9-乙基-9-羟基-4-甲基-1,2,3,9,12,15-六氢-10H,13H-苯并[de]吡喃[3',4':6,7]吲哚嗪[1,2-b]喹啉-10,13-二酮(1-4，1.00g，1.77mmol)，冰水降温至5～15℃，加入DMTMM(0.98g,3.53mmol)，再滴入DIPEA(1.14g,8.84mmol)，25℃反应16小时。将反应液倒入DCM(600mL)、IPA(60mL)、水(100mL)混合液中搅拌10分钟，分出DCM相，盐水(100ml)洗，浓缩得到粗品，用制备高效液相色谱纯化后冷冻干燥得A-05化合物0.98g。
A-05分离纯化方法如下：
色谱柱：Waters SunFire Prep C18 OBD(5μm*19mm*150mm)
流动相A：乙腈；流动相B：水(0.05％甲酸)
时间[min] 流动相A[％] 流动相B[％] 流速[mL/min]
0.00 30 70 24
2.00 30 70 24
18.00 80 20 24
A-05结构表征数据如下：
MS m/z(ESI):1107.3[M+H]+
1H NMR(400MHz,DMSO)δ9.10(s,2H),8.66-8.63(m,1H),8.51(d,J＝8.8Hz,1H),8.34-8.31(m,1H),8.21-8.19(m,1H),8.17-8.09(m,2H),8.08-8.04(m,1H),7.30(s,1H),7.26-7.15(m,5H),6.55(s,1H),5.56-5.55(m,1H),5.48-5.35(m,2H),5.25-5.10(m,2H),4.64(d,J＝6.4Hz,2H),4.45-4.44(m,1H),4.06-3.98(m,2H),3.77-3.52(m,6H),3.41(s,3H),3.25-3.12(m,2H),3.03-3.00(m,1H),2.83-2.72(m,1H),2.58-2.56(m,2H),2.48(s,3H),2.33-2.30(m,2H),2.21-2.13(m,2H),1.91-1.76(m,4H),0.87(t,J＝7.2Hz,3H).
实施例三N-((S)-10-苄基-1-(((1S,9S)-5-氟-9-乙基-9-羟基-4-氯-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H，12H-苯并[de]吡喃[3',4':6,7]吲哚利嗪[1,2-b]喹啉-1-基)氨基)-1,6,9,12,15-五氧代-3-氧基-5,8,11,14-四氮杂十六烷-16-基)-6-(2-(甲基磺基)嘧啶-5-基)己-5-酰胺(A-07)
氮气保护下，将2,5-二氧吡咯烷-1-基-6-(2-(甲磺酰基)嘧啶-5-基)己基-5-炔酸酯(IM-2，21.6mg，0.059mmol)和(R)-16-氨基-10-苄基-6,9,12,15-四氧-3-氧-5,8,11,14-四氮杂十六酸(IM-3，24.5mg,0.058mmol)加入DMF(1mL)中，升温至35℃反应16小时后，向该体系中加入(1S,9S)-1-氨基-5-氟-9-乙基-9-羟基-4-氯-1,2,3,9,12,15-六氢-10H,13H-苯并[de]吡喃[3',4':6,7]吲哚嗪[1,2-b]喹啉-10,13-二酮三氟乙酸盐(30.0mg，0.053mmol)，HATU(30mg,0.079mmol)和DIPEA(27.2mg,0.21mmol,)，反应体系于25℃反应16小时。反应液直接用制备高效液相色谱纯化后冷冻干燥得A-07化合物26.4mg。
A-07分离纯化方法如下：
色谱柱：SunFire Prep C18 OBD 19mm×150mm×5.0μm
流动相A：乙腈；流动相B：水(0.05％甲酸)
时间[min] 流动相A[％] 流动相B[％] 流速[mL/min]
0 30 70 28
2 30 70 28
18 90 10 28
A-07结构表征数据如下：
ESI-MS(m/z):1111.3[M+H]+.
实施例四N-((7S,10S,13S)-1-(((1S，9S)-5-氯-9-乙基-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧-2,3,9,10,13,15-六氢-1H，12H-苯并[de]吡喃[3',4':6,7]吲哚嗪[1,2-b]喹啉-1-基)氨基)-7,10-二甲基-1,6,9,12-四氧-3-氧-5,8,11-三氮十四烷-13-基)-6-(2-(甲基磺基)嘧啶-5-基)己-5-酰胺(A-14)
步骤一：
将化合物IM-4(657mg,1.22mmol)和化合物1-4(500mg,1.11mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(10mL)中，随后加入HATU(630.67mg,1.66mmol)和N,N-二异丙基乙胺(428mg,3.32mmol)，室温搅拌1小时。反应完毕后，反应液直接用制备高效液相色谱纯化后冷冻干燥得IM-5化合物700mg。
其制备方法如下：
色谱柱：Waters SunFire Prep C18 OBD(5μm*19mm*150mm)
流动相A：乙腈；流动相B：水(0.05％甲酸)
时间[min] 流动相A[％] 流动相B[％] 流速[mL/min]
0.00 30 70 28
2.00 30 70 28
18.00 90 10 28
步骤二：
将化合物IM-5(500mg,0.513mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(2mL)中，加入二乙胺(75.05mg,1.03mmol)，室温反应1小时。反应结束后，反应液直接用制备高效液相色谱纯化后冷冻干燥得IM-6化合物307mg。
其制备方法如下：
色谱柱：Waters SunFire Prep C18 OBD(5μm*19mm*150mm)
流动相A：乙腈；流动相B：水(0.05％甲酸)
时间[min] 流动相A[％] 流动相B[％] 流速[mL/min]
0.00 20 80 24
2.00 20 80 24
18.00 80 20 24
步骤三：
将IM-6(170mg,0.226mmol)和化合物IM-2(90.83mg,0.249mmol)、溶解在N,N-二甲基甲酰胺(10mL)，加入N,N-二异丙基乙胺(29.21mg,0.226mmol)。反应液在室温条件下搅拌16小时。反应液直接用制备高效液相色谱纯化后冷冻干燥得A-14化合物50.56mg。
其结构表征数据如下：
MS m/z(ESI):1002.4[M+H]+
其制备方法如下：
色谱柱：Waters SunFire Prep C18 OBD(5μm*19mm*150mm)
流动相A：乙腈；流动相B：水(0.05％甲酸)
时间[min] 流动相A[％] 流动相B[％] 流速[mL/min]
0.00 30 70 28
2.00 30 70 28
18.00 90 10 28
1H NMR(400MHz,DMSO)δ9.11(s,2H),8.68(t,J＝6.4Hz,1H),8.49(d,J＝8.8Hz,1H),8.16(s,1H),8.10(d,J＝7.2Hz,1H),8.01(d,J＝7.2Hz,1H),7.91(d,J＝6.8Hz,1H),7.31(s,1H),6.55(s,1H),5.65-5.55(m,1H),5.43(s,2H),5.21(s,2H),4.67-4.55(m,2H),4.29-4.15(m,3H),3.98(s,2H),3.41(s,3H),3.25-3.15(m,2H),2.57-2.56(m,2H),2.35-2.27(m,2H),2.22-2.12(m,2H),1.91-1.75(m,4H),1.23-1.09(m,9H),0.87(t,J＝7.2Hz,3H).
实施例五4-((S)-2-(4-氨基丁基)-35-(4-((6-(2-(甲基磺酰基)嘧啶-5-基)己-5-炔酰胺基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-4,8-二氧代-6,12,15,18,21,24,27,30,33-九氧杂-3,9-二氮杂三十五烷酰胺基)苄基((S)-4-乙基-11-(2-(N-异丙基甲基磺酰胺基)乙基)-3,14-二氧代-3,4,12,14-四氢-1H-吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-4-基)碳酸酯的合成(B-01)
步骤一：
室温下，将化合物B-01-1(413.40mg，0.251mmol,其合成参考专利CN111295389B)溶于二甲基亚砜和水(2.0mL：0.5mL)中，加入溴化亚铜(72.95mg，0.503mmol)和6-(2-(甲基磺酰基)嘧啶-5-基)-N-(丙-2-炔-1-基)-己-5-炔酰胺(95.10mg，0.302mmol)，搅拌反应1h后过滤，滤液经制备高效液相色谱纯化(条件如下)，得B-01-2化合物30.00mg。
色谱柱：SunFire Prep C18 OBD 19mm×150mm×5.0μm
流动相A：乙腈；流动相B：水
时间[min] 流动相A[％] 流动相B[％] 流速[mL/min]
0.00 40 60 28
8.00 40 60 28
50.00 90 10 28
步骤二：
将化合物B-01-2(30.00mg，0.02mmol)溶于二氯甲烷(1.0mL)反应液中加入三氟乙酸(0.2mL)，室温反应30min。反应液减压浓缩后经制备高效液相色谱纯化(条件如下)，得B-01化合物的三氟乙酸盐20.00mg。
色谱柱：SunFire Prep C18 OBD 19mm×150mm×5.0μm
流动相A：乙腈；流动相B：水(0.05％三氟乙酸)
时间[min] 流动相A[％] 流动相B[％] 流速[mL/min]
0.00 15 85 28
8.00 15 85 28
50.00 60 40 28
结构表征数据如下：ESI-MS(m/z):1631.7[M+H]+,816.0[M/2+H]+.
实施例六4-((S)-2-(4-氨基丁基)-35-(4-((6-(2-(甲磺酰基)嘧啶-5-基)己-5-炔酰胺基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-4,8-二氧基-6,12,15,18,21,24,27,30,33-九氧杂-3,9-二氮杂三十五烷酰胺基)苄基((1S,9R)-9-乙基-5-氟-1-(2-羟基乙酰胺基)-4-甲基-10,13-二氧基-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-9-基)碳酸酯(B-02)
步骤一:
25℃下,将1-1的甲磺酸盐(30.00mg,56.44μmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(1mL)中，依次加入1H-苯并三唑-1-基氧三吡咯烷基六氟磷酸盐(58.74mg,112.88μmol)、N,N-二异丙基乙胺(43.76mg,338.63μmol)和2-((叔丁基二苯基硅基)氧基)乙酸(26.62mg，84.66μmol)，保持25℃反应1小时，用液质联用色谱监测反应，反应完成后向反应液中加入水，乙酸乙酯萃取，有机相合并，经硫酸钠干燥后减压浓缩，粗品经薄层层析分离(二氯甲烷:甲醇＝15:1)得到B-02-1化合物27.00mg。
步骤二:
0℃下，将B-02-1(20mg,27.33μmol)溶于二氯甲烷(2mL)中，依次加入4-二甲氨基吡啶(26.71mg,218.61μmol)和三光气(8.11mg,27.33μmol)的二氯甲烷溶液(0.5mL)，保持0℃反应0.5小时；用氮气置换掉残余三光气后滴加入(S)-2-(32-叠氮基-5-氧代-3,9,12,15,18,21,24,27,30-九氧杂-3,9-二氮杂三十五烷酰胺基)-N-(4-(羟甲基)苯基)-6-(((4-甲氧基苯基)二苯甲基)氨基)己酰胺(43.46mg,40.99μmol)的二氯甲烷溶液(1mL)，保持0℃反应0.5小时；用液质联用色谱监测反应，反应完成后将反应液浓缩，粗品经薄层层析分离(二氯甲烷:甲醇＝15:1)纯化得到B-02-2化合物30.00mg。
步骤三:
25℃下，将B-02-2(250.00mg,137.51μmol)溶于DMSO(2mL)和水(0.4mL)混合溶剂中，加入6-(2-(甲磺酰基)嘧啶-5-基)-N-(丙-2-炔-1-基)己-5-炔酰胺(62.98mg,206.26μmol)和溴化亚铜(39.45mg,275.01μmol)，保持25℃反应1小时；用液质联用色谱监测反应；反应完成后将反应液用制备高效液相色谱纯化(条件如下)，制备液冻干得到B-02-3化合物150.00mg。
色谱柱:SunFire Prep C18 OBD 19mm×150mm×5.0μm
流动相A:乙腈；流动相B:水(0.05％甲酸)
时间[min] 流动相A[％] 流动相B[％] 流速[mL/min]
0 15 85 28
18 90 10 28
步骤四:
25℃下，将B-02-3(150mg,49.45μmol)溶于四氢呋喃(1mL)中,滴加入四丁基氟化铵(1M四氢呋喃溶液)/冰醋酸混合液(v/v＝13/1)(50uL),保持25℃反应0.5小时，用液质联用色谱监测反应；反应完成后将反应液用制备高效液相色谱纯化(条件如下)，制备液冻干得到B-02-4化合物50.00mg。
色谱柱:SunFire Prep C18 OBD 19mm×150mm×5.0μm
流动相A:乙腈；流动相B:水(0.05％甲酸)
时间[min] 流动相A[％] 流动相B[％] 流速[mL/min]
0 15 85 28
20 90 10 28
步骤五:
25℃下，将B-02-4(50mg,26.52μmol)溶于二氯甲烷(1mL)中，加入三氟乙酸(60.49mg,530.49μmol)，保持25℃反应0.5小时；用液质联用色谱监测反应；反应完成后将反应液浓缩，粗品用制备高效液相色谱纯化(条件如下)，制备液冻干得到B-02化合物23.69mg。
色谱柱:SunFire Prep C18 OBD 19mm×150mm×5.0μm
流动相A:乙腈；流动相B:水(0.05％甲酸)
时间[min] 流动相A[％] 流动相B[％] 流速[mL/min]
0 15 85 28
18 90 10 28
B-02结构表征数据如下:
ESI-MS(m/z):1613.6[M+H]+.
实施例七N-((7S,10S,13S)-1-(((1S，9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧-2,3,9,10,13,15-六氢-1H，12H-苯并[de]吡喃[3',4':6,7]吲哚嗪[1,2-b]喹啉-1-基)胺基)-7,10,13-三甲基-1,6,9,12,15-五氧-3,17,20,23-四氧-5,8,11,14-四氮五碳烷-25-基)-3,5-双(2-(甲基磺基)嘧啶-4-基)苯酰胺(C-07)
步骤一：
将原料C-07-1(4.80g,16.33mmol)、三丁基(2-甲基磺胺基嘧啶-4-基)锡(16.27g,39.19mmol)和双三苯基磷二氯化钯(2.29g,3.27mmol)溶于1，4-二氧六环(100mL)中，反应体系在氮气氛围下于110℃搅拌反应5小时，LC-MS监控反应，浓缩反应体系，经柱层析纯化(EA/PE＝0-50％)得C-07-2化合物1.36g。
步骤二：
将化合物C-07-2(510mg，1.33mol)、NaOH(212.24mg,5.31mmol)溶于THF(12.5mL)、MeOH(12.5mL)和H2O(2.5mL)中。25℃搅拌反应2小时，LC-MS监控反应，用3N HCl调节体系pH约为2，析出大量固体，过滤，收集滤饼，干燥，得到C-07-3化合物380mg。
步骤三：
将化合物C-07-3(315mg,850.32μmol)、2-[2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙氧基乙酸叔丁酯(246.31mg,935.35μmol)、HATU(484.99mg,1.28mmol)，DIPEA(329.69mg,2.55mmol)加到DMF(3mL)中，25℃反应2h。LC-MS监控反应。反应液用制备高效液相色谱纯化后冷冻干燥得C-07-3化合物40mg。
其制备方法如下：
色谱柱：Waters XBridge Prep C18OBD(5μm*19mm*150mm)
流动相A：乙腈；流动相B：水(0.05％甲酸)
时间[min] 流动相A[％] 流动相B[％] 流速[mL/min]
0.00 55 45 24
2.00 55 45 24
18.00 100 0 24
步骤四：
将化合物C-07-4(40mg,64.96μmol)溶于DCM(3mL)和TFA(1.5mL)中，25℃反应1.5小时，LC-MS监控反应，浓缩反应体系至干得C-07-5化合物36mg。
步骤五：
将化合物C-07-5(26mg,46.46μmol)、高碘酸钠(99.37mg,464.57μmol)、RuCl3·H2O(9.64mg,46.46μmol)，溶于ACN(15mL)和水(7.5mL)中，25℃反应40分钟，LC-MS监控反应，加入水和乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯层浓缩得C-07-6化合物28mg。
步骤六：
将化合物依喜替康甲磺酸盐(600mg,1.13mmol)、(5S，8S，11S)-1-(9H-芴-9-基)-5,8,11-三甲基-3,6,9,12-四氧基-2,15-二氧基-4,7,10,13-四氮杂庚烷-17-酸(IM-4，610.17mg,1.13mmol)、HATU(643.81mg,1.69mmol)，DIPEA(437.65mg,3.39mmol)加到DMF(6mL)中，25℃反应16h。LC-MS监控反应。向反应液中加入水，析出大量固体，过滤，收集固体，DCM溶解固体，浓缩得粗品，经柱层析纯化(DCM/MeOH＝0-10％)，得C-07-7化合物660mg。
步骤七：
将化合物C-07-7(660mg,688.94μmmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(6mL)中，加入二乙胺(251.94mg,3.44mmol)，室温反应1小时。反应结束后，反应液直接用制备高效液相色谱纯化后冷冻干燥得C-07-8化合物325mg。
其制备方法如下：
色谱柱：Waters SunFire Prep C18 OBD(5μm*19mm*150mm)
流动相A：乙腈；流动相B：水(0.05％甲酸)
时间[min] 流动相A[％] 流动相B[％] 流速[mL/min]
0.00 10 90 28
4.00 10 90 28
20.00 90 10 28
步骤八：
将化合物C-07-6(15.95mg,25.58μmol)、C-07-8(20mg,25.58μmol)、HATU(14.59mg,38.37μmol)，DIPEA(9.92mg,76.75μmol)加到DMF(3mL)中，25℃反应2h。LC-MS监控反应。反应液用制备高效液相色谱纯化后冷冻干燥得C-07化合物7mg。
其结构表征数据如下：
ESI-MS(m/z):1342.4[M+H]+.
其制备方法如下：
色谱柱：Waters XBridge Prep C18OBD(5μm*19mm*150mm)
流动相A：乙腈；流动相B：水(0.05％甲酸)
时间[min] 流动相A[％] 流动相B[％] 流速[mL/min]
0.00 20 80 24
2 20 80 24
18.00 90 10 24
实施例八N-((7S,10S,13S)-1-(((1S，9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧-2,3,9,10,13,15-六氢-1H，12H-苯并[de]吡喃[3',4':6,7]吲哚嗪[1,2-b]喹啉-1-基)胺基)-7,10,13-三甲基-1,6,9,12,15-五氧-3,17,20,23-四氧-5,8,11,14-四氮五碳烷-25-基)-3,5-双(2-(甲基磺基)嘧啶-5-基)苯酰胺(C-10)
步骤一：
将原料C-10-1(720mg，2.45mmol)、2-甲硫基嘧啶-5-硼酸(874mg，5.14mmol)XPhosPd G3(207mg,245μmol)、K3PO4(1.56g,7.35mmol)加到dioxane(12mL)and H2O(4mL)中，反应体系在氮气氛围下于90℃搅拌反应3小时，LC-MS监控反应，垫硅藻土过滤，往滤液中加水和乙酸乙酯，萃取，浓缩，得到粗品，经柱层析纯化(EA/PE＝0-25％)得到C-10-1化合物710mg。
步骤二：
将化合物C-10-1(650mg，1.69mol)、氢氧化锂(121mg,5.07mmol)溶于THF(2mL)、MeOH(2mL)和H2O(2mL)中。25℃搅拌反应2小时，LC-MS监控反应，用1N HCl调节体系pH约为2，析出大量固体，过滤收集滤饼，干燥得C-10-2化合物560mg。
步骤三：
将化合物C-10-2(450.80mg,1.22mmol)溶于DCM(10mL)中，将m-CPBA(2.46g,12.1mmol,纯度为85％)加到反应体系中，25℃反应12小时，LC-MS监控反应。氮气流吹干溶剂得到粗品，粗品经制备高效液相色谱纯化后冷冻干燥得C-10-3化合物153mg。
其制备方法如下：
色谱柱：Phenomenex Luna C18 200*40mm*10um。
流动相A：乙腈；流动相B：水(0.05％盐酸)
流动相：[water(HCl)-ACN]；B％:13％-43％,10min)。
时间[min] 流动相A[％] 流动相B[％] 流速[mL/min]
0.00 13 87 25
10.00 43 57 25
18.00 90 10 25
步骤四：
将化合物C-10-3(140mg,322.25μmol)、2-[2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙氧基乙酸叔丁酯(84.86mg,322.25μmol)、HATU(183.80mg,483.37μmol)，DIPEA(124.94mg,966.75μmol)加到DMF(4mL)中，25℃反应2h。LC-MS监控反应。反应液用制备高效液相色谱纯化后冷冻干燥得C-10-4化合物51mg。
其制备方法如下：
色谱柱：Waters XBridge Prep C18OBD(5μm*19mm*150mm)
流动相A：乙腈；流动相B：水(0.05％甲酸)
时间[min] 流动相A[％] 流动相B[％] 流速[mL/min]
0.00 30 70 24
2.00 30 70 24
18.00 90 10 24
步骤五：
将化合物C-10-4(50mg,73.56μmol)加到DCM(2mL)和TFA(1mL)中，25℃反应1h，LC-MS监控反应，浓缩反应体系至干得到C-10-5化合物45mg。
步骤六：
将化合物C-10-5(31.91mg,51.17μmol)、C-07-8(40mg,51.17μmol)、HATU(29.18mg,76.75μmol)，DIPEA(19.84mg,153.50μmol)加到DMF(3mL)中，25℃反应2h。LC-MS监控反应。反应液用制备高效液相色谱纯化后冷冻干燥得C-10化合物13mg。
其结构表征数据如下：
ESI-MS(m/z):1342.5[M+H]+.
其制备方法如下：
色谱柱：Waters XBridge Prep C18OBD(5μm*19mm*150mm)
流动相A：乙腈；流动相B：水(0.05％甲酸)
时间[min] 流动相A[％] 流动相B[％] 流速[mL/min]
0.00 20 80 24
2.00 20 80 24
18.00 90 10 24
实施例九N-((7S,10S,13S)-1-(((1S，9S)-9-乙基-5-氯-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧-2,3,9,10,13,15-六氢-1H，12H-苯并[de]吡喃[3',4':6,7]吲哚嗪[1,2-b]喹啉-1-基)胺基)-7,10,13-三甲基-1,6,9,12,15-五氧-3,17,20,23-四氧-5,8,11,14-四氮五碳烷-25-基)-3,5-双(2-(甲基磺基)嘧啶-5-基)苯酰胺(C-17)
步骤一：
将C-10-2(3.00g,8.10mmol)和3-[2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙氧基]-丙酸叔丁酯(2.25g,8.10mmol)加入到DMF(3mL)，依次加入HOBt(3.28g,24.3mmol),EDCI(4.66g,24.3mmol)和DIPEA(4.19g,32.4mmol,5.64mL)，升至60℃反应2小时。向反应液中加入水(50mL)，用乙酸乙酯萃取(30mL x 3)，合并有机相用无水硫酸钠干燥,过滤浓缩得C-17-1粗品(3.8g,4.75mmol)，未经纯化直接用于下一步.
步骤二：
将C-17-1(3.40g,5.40mmol)溶于二氯甲烷(30mL)中，加入三氟乙酸(10.8g,94.2mmol,7mL)。反应液25℃搅拌2小时.将反应液直接浓缩后，经制备高效液相色谱纯化后冷冻干燥得C-17-2(2.09g,3.64mmol)。
其制备方法如下：
色谱柱：Phenomenex luna C18(250mm*70mm*10μm)
流动相A：乙腈；流动相B：水(0.05％甲酸)
时间[min] 流动相A[％] 流动相B[％] 流速[mL/min]
0.00 30 70 30
22.00 60 40 30
步骤三：
将C-17-2(56mg,97.61μmol)加到乙腈(6mL)和水(3mL)中，再将高碘酸钠(208.79mg,976.15μmol)和三氯化钌水合物(8.10mg,39.05μmol)加到反应体系中，25℃搅拌反应30分钟，LC-MS监控反应，加入水和乙酸乙酯萃取，浓缩得C-17-3(60mg)。
步骤四：
将IM-6(20mg,25.06μmol)、C-17-3(16mg,25.06μmol)、HATU(19.05mg,50.11μmol)、DIPEA(16.19mg,125.28μmol)依次加入到DMF(3mL)中，反应体系于25℃反应1小时。反应液直接用制备高效液相色谱纯化后冷冻干燥得C-17(16mg)。
其结构表征数据如下：
ESI-MS(m/z):1371.4[M+H]+.
其制备方法如下：
色谱柱：Waters XBridge Prep C18OBD(5μm*19mm*150mm)
流动相A：乙腈；流动相B：水(0.05％甲酸)
时间[min] 流动相A[％] 流动相B[％] 流速[mL/min]
0.00 20 80 30
2.00 20 80 30
18.00 80 20 30
实施例十N-((7S,10S,13S)-1-(((1S,9S)-5-氯-9-乙基-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]中氮茚并[1,2-b]喹啉-1-基)氨基)-7,10,13-三甲基-1,6,9,12,15-五氧代-3,18,21,24-四氧代-5,8,11,14-四氮杂六烷-26-基)-2,6-双(2-(甲基磺酰基)嘧啶-5-基)异烟酰胺(C-19)
步骤一：
将C-19-1(5.00g,16.9mmol),(2-(甲硫基)嘧啶-5-基)硼酸(6.34g,37.3mmol),XPhos Pd G3(1.44g,1.70mmol),磷酸钾(10.80g,50.9mmol)加入到1,4-二氧六环(51.0mL)和水(17.0mL)中，反应体系经氮气置换3次后于100℃反应5小时。待反应体系冷却至室温后，向反应液中加入水(50.0mL)，过滤，滤液浓缩得粗品，用石油醚打浆后再次过滤，滤饼真空干燥后得C-19-2(5.65g)。
步骤二：
将C-19-2(5.26g,13.7mmol)溶于THF(30.0mL)、MeOH(30.0mL)和水(30.0mL)中，加入LiOH·H2O(1.72g,40.9mmol)，于25℃搅拌2小时。反应液用1N盐酸水溶液调节pH至3，有固体析出，过滤，滤饼真空干燥得C-19-3(4.20g)。
步骤三：
将C-19-3(1.50g,4.04mmol)和3-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基乙氧基乙基)丙酸叔丁酯(1.12g,4.04mmol)溶于DMF(20.0mL)中，依次加入HOBt(1.64g,12.1mmol)、EDCI(2.32g,12.1mmol)和DIPEA(2.09g,16.2mmol)，升温至60℃搅拌2小时。待反应体系冷却至室温，向反应液中加入水(10.0mL)和乙酸乙酯(20.0mL)，水相用乙酸乙酯(25.0mL*2)萃取两次，合并有机相用无水硫酸钠干燥,过滤，滤液浓缩得C-19-4粗品(2.50g)，未经纯化直接用于下一步。
步骤四：
将C-19-4(2.50g,3.96mmol)溶于二氯甲烷(3.00mL)中，加入TFA(4.61g,40.4mmol)后，反应体系于25℃搅拌12小时。将反应液直接浓缩后，经制备高效液相色谱纯化后冷冻干燥得C-19-5(1.20g)。
其制备方法如下：
色谱柱：Phenomenex luna C18(150mm*25mm*10μm)
流动相A：乙腈；流动相B：水(0.05％甲酸)
时间[min] 流动相A[％] 流动相B[％] 流速[mL/min]
0.00 36 64 30
15.00 66 34 30
步骤五：
将C-19-5(1.10g,1.91mmol)溶于乙腈(30mL)和水(15mL)的混合溶剂中,加入三氯化钌水合物(39.70mg,0.19mmol)和高碘酸钠(4.09g,19.14mmol)，反应体系于25℃反应1小时后，经水(50mL)和乙酸乙酯(80mL)萃取，有机相浓缩得到粗品，粗品经柱层析纯化(MeOH/DCM＝10～20％)，浓缩得C-19-6(130mg)。
步骤六：
将IM-6(20.0mg,0.025mmol)和C-19-6(16.0mg,0.025mmol)加入DMF(1mL)中搅拌溶解,加入HATU(19.0mg,0.050mmol)和DIPEA(12.9mg,0.100mmol)，室温反应2小时，反应液直接用制备高效液相色谱纯化后冷冻干燥得C-19(20.4mg)。
其结构表征数据如下：
ESI-MS(m/z):1372.4[M+H]+.
色谱柱：Waters XBridge Prep C18OBD(5μm*19mm*150mm)
流动相A：乙腈；流动相B：水(0.05％甲酸)
时间[min] 流动相A[％] 流动相B[％] 流速[mL/min]
0.00 30 70 30
4.00 30 70 30
24.00 90 10 30
实施例十一N-((7S,10S,13S)-1-(((1S,9S)-5-氯-9-乙基-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]中氮茚并[1,2-b]喹啉-1-基)氨基)-7,1,13-三甲基-1,6,9,12,15-五氧代-3,18,21,24,27,30,33,36,39-壬氧基-5,8,11,14-四氮杂基四烷-41-基)-3,5-双(2-(甲基磺酰基)嘧啶-5-基)苯甲酰胺(C-21)
步骤一：
将C-10-2(3.00g,8.10mmol)和1-氨基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂庚烷-27-酸叔丁酯(4.03g,8.10mmol)加入到DMF(40mL)中，依次加入HOBt(3.28g,24.3mmol),EDCI(4.66g,24.3mmol)和DIPEA(4.19g,32.4mmol,5.64mL)，反应体系于60℃搅拌2小时。向反应液中加入水(100mL)和乙酸乙酯萃取(60mL x 3)，有机相合并后用无水硫酸钠干燥,过滤，浓缩得C-21-1(4.20g,4.14mmol)，未经纯化直接用于下一步。
步骤二：
将C-21-1(3.60g,4.24mmol)溶于二氯甲烷(30mL)中，加入TFA(15.3g,134mmol,10mL)，反应体系于25℃搅拌6小时。向反应液加入水(60mL)和乙酸乙酯萃取(40mL x 3)。有机相合并后用无水硫酸钠干燥,过滤，浓缩得粗品，粗品经制备高效液相色谱纯化后冷冻干燥得C-21-2(2.93g,3.63mmol)。
其制备方法如下：
色谱柱：Phenomenex luna C18(250mm*70mm*10μm)
流动相A：乙腈；流动相B：水(0.05％甲酸)
时间[min] 流动相A[％] 流动相B[％] 流速[mL/min]
0.00 30 70 30
15.00 60 40 30
步骤三：
将C-21-2(148mg，0.186mmol)加到乙腈(15mL)和水(7.5mL)中，再将高碘酸钠(398.71mg，1.86mmol)和三氯化钌水合物(15.47mg，74.56μmol)加到反应体系中，25℃搅拌反应30分钟，反应体系经水和乙酸乙酯萃取，浓缩得C-21-3(155mg)。
步骤四：
将IM-6(27.91mg,34.97μmol)、C-21-3(30mg,34.97μmol)、HATU(26.59mg,69.93μmol)，DIPEA(22.60mg,174.84μmol)加到DMF(3mL)中，反应体系于25℃反应1小时。反应液经高效液相色谱纯化后冷冻干燥得C-21(15mg)。
其结构表征数据如下：
ESI-MS(m/z):1591.7[M+H]+.
其制备方法如下：
色谱柱：Waters XBridge Prep C18OBD(5μm*19mm*150mm)
流动相A：乙腈；流动相B：水(0.05％甲酸)
时间[min] 流动相A[％] 流动相B[％] 流速[mL/min]
0.00 20 80 30
2.00 20 80 30
18.00 90 10 30
实施例十二N-((7S,10S,13S)-1-(((1S,9S)-5-氯-9-乙基-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]中氮茚并[1,2-b]喹啉-1-基)氨基)-7,1,13-三甲基-1,6,9,12,15-五氧代-3,18,21,24,27,30,33,36,39-壬氧基-5,8,11,14-四氮杂四烷-4-基)-2,6-双(2-(甲基磺酰基)嘧啶-5-基)异烟酰胺(C-23)
步骤一：
将C-19-3(1.50g,4.04mmol)和1-氨基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂庚烷-27-酸叔丁酯(2.01g,4.04mmol)加入到DMF(20.0mL)中，依次加入HOBt(1.64g,12.1mmol)、EDCI(2.32g,12.1mmol和DIEA(2.09g,16.2mmol)，升温至60℃搅拌2小时。冷却到室温，向反应液中加入水(10.0mL)和乙酸乙酯(20.0mL)分液，水相用乙酸乙酯(25.0mL x 2)萃取两次，合并有机相用无水硫酸钠干燥,过滤浓缩得粗品C-23-1(3.00g)，直接用于下一步。
步骤二：
将C-23-1(3.00g,3.53mmol)加入到二氯甲烷(10.0mL)中，加入TFA(15.4g,134mmol)后于25℃搅拌12小时。反应液直接浓缩得粗品，粗品经制备高效液相色谱纯化后冷冻干燥得C-23-2(1.20g)。
其制备方法如下：
色谱柱：Welch Ultimate C18(150mm*25mm*5μm)
流动相A：乙腈；流动相B：水(0.05％甲酸)
时间[min] 流动相A[％] 流动相B[％] 流速[mL/min]
0.00 34 66 25
10.00 64 36 25
步骤三：
将C-23-2(500mg,0.63mmol)加到乙腈(10mL)和水(5mL)中，加入三氯化钌水合物(13.0mg,0.063mmol)和高碘酸钠(1.35g,6.29mmol)，体系于25℃反应1小时后用水(10ml)和乙酸乙酯(40ml)萃取，有机相浓缩得到粗品，粗品经柱层析纯化(MeOH/DCM＝10～20％)并浓缩得C-23-3(350mg)。
步骤四：
将IM-6(20.0mg,0.025mmol)和C-23-3(21.5mg,0.025mmol)溶于DMF(1mL)，加入HATU(19.0mg,0.050mmol)和DIPEA(12.9mg,0.100mmol)后室温反应2小时，反应液直接用制备高效液相色谱纯化后冷冻干燥得C-23(17.0mg)。
其结构表征数据如下：
ESI-MS(m/z):1592.6[M+H]+.
其制备方法如下：
色谱柱：Waters XBridge Prep C18OBD(5μm*19mm*150mm)
流动相A：乙腈；流动相B：水(0.05％甲酸)
时间[min] 流动相A[％] 流动相B[％] 流速[mL/min]
0.00 30 70 28
4.00 30 70 28
24.00 90 10 28
实施例十三4-((S)-2-(4-氨基丁基)-35-(4-((6-(2-(甲基磺酰基)嘧啶-5-基)己基-5-炔酰胺基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-4,8-二氧代-6,12,15,18,24,27,30,33-壬氧基-3,9-二氮杂五氮杂三酰氨基)苄基((1S,9R)-5-氯-9-乙基-1-(2-羟基乙酰胺基)-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[d]吡喃并[3',4':6,7]中氮茚并[1,2-b]喹啉-9-基)碳酸酯(B-03)
步骤一:2-(((1S,9S)-5-氯-9-乙基-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[d]吡喃并[3',4':6,7]中氮茚并[1,2-b]喹啉-1-基)氨基)-2-氧代乙酸乙酯(B-03-1)的制备
将(1S,9S)-1-氨基-5-氯-9-乙基-9-羟基-4-甲基-1,2,3,9,12,15-六氢-10H,13H-苯并[d]吡喃并[3',4':6,7]中氮茚并[1,2-b]喹啉-10,13-二酮(2g,3.65mmol)溶于DMF(50mL),滴入DIPEA(1.18g,9.12mmol,1.59mL),冰浴冷却搅拌下滴入乙酰氧基乙酰氯(548.12mg,4.01mmol,431.59μL)，继续搅拌反应1小时。将反应液加入0.1M稀盐酸水溶液中析出固体，过滤。将滤饼溶于二氯甲烷和甲醇中，无水硫酸钠干燥后过滤浓缩得粗品，经硅胶柱纯化(甲醇/二氯甲烷＝0％～5％)再次浓缩得标题化合物(1.7g，3.077mmol)
其结构表征数据如下：
ESI-MS(m/z):552.2[M+1]+.
步骤二:2-(((1S,9S)-9-(((4-((S)-35-叠氮基-2-(4-(4-甲氧基苯基)二苯基甲基)氨基)丁基)-4,8-二氧代-6,12,15,18,21,24,27,30,33-壬氧基-3,9-二氮杂五苯并三酰氨基)苄基)氧基)羰基)氧基-5-氯-9-乙基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲唑嗪[1,2-b]喹啉-1-基)氨基)-2-氧代乙酸乙酯(B-03-2)的制备
将2-(((1S,9S)-5-氯-9-乙基-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[d]吡喃并[3',4':6,7]中氮茚并[1,2-b]喹啉-1-基)氨基)-2-氧代乙酸乙酯(500mg,0.905mmol)和DMAP(885.33mg,7.25mmol)溶于干燥二氯甲烷(5mL)中，氮气保护下冷却至0℃，滴入三光气(268.81mg,0.905mmol)的二氯甲烷溶液(5mL)，保温搅拌反应0.5小时。缓慢滴入(S)-2-(32-叠氮基-5-氧代-3,9,12,15,18,21,24,27,30-壬氧基-6-氮杂三硝基氨基)-N-(4-(羟甲基)苯基)-6-(((4-甲氧基苯基)二苯基甲基)氨基)己酰胺(1.44g,1.36mmol)的二氯甲烷溶液，自然恢复室温反应4小时。加水淬灭反应，用二氯甲烷萃取3次(100ml x 3)后合并有机相，饱和食盐水洗涤后干燥浓缩。硅胶柱纯化(MeOH/DCM＝0％～5％)得标题化合物(498mg，0.304mmol)
其结构表征数据如下：
ESI-MS(m/z):1352.8[M+1]+.
步骤三:4-((S)-35-叠氮基-2-(4-((4-甲氧基苯基)二苯甲基)氨基)丁基)-4,8-二氧代-6,12,15,18,24,27,30,33-壬氧基-3,9-二氮杂五氮杂三酰氨基)苄基((1S,9S)-5-氯-9-乙基-1-(2-羟基乙酰胺基)-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]氮茚并[1,2-b]喹啉-9-基)碳酸酯(B-03-3)的制备
将2-(((1S,9S)-9-(((4-((S)-35-叠氮基-2-(4-(4-甲氧基苯基)二苯基甲基)氨基)丁基)-4,8-二氧代-6,12,15,18,21,24,27,30,33-壬氧基-3,9-二氮杂五苯并三酰氨基)苄基)氧基)羰基)氧基-5-氯-9-乙基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲唑嗪[1,2-b]喹啉-1-基)氨基)-2-氧代乙酸乙酯(200mg,0.122mmol)溶于THF(3mL)和MeOH(3mL)中，搅拌下滴入碳酸钠(25.88mg,0.224mmol)水溶液(1mL)，滴加完毕后继续搅拌1小时。向反应液中滴入稀盐酸中和反应，减压浓缩后直接进行下一步。
其结构表征数据如下：
ESI-MS(m/z):1596.7[M+1]+.
步骤四:4-((S)-2-(4-氨基丁基)-35-叠氮基-4,8-二氧代-6,12,15,18,21,24,27,30,33-壬氧基-3,9-二氮杂五苯并三酰氨基)苄基((1S,9S)-5-氯-9-乙基-1-(2-羟基乙酰胺基)-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]中氮茚并[1,2-b]喹啉-9-基)碳酸酯(B-03-4)的制备
将4-((S)-35-叠氮基-2-(4-((4-甲氧基苯基)二苯甲基)氨基)丁基)-4,8-二氧代-6,12,15,18,24,27,30,33-壬氧基-3,9-二氮杂五氮杂三酰氨基)苄基((1S,9S)-5-氯-9-乙基-1-(2-羟基乙酰胺基)-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]氮茚并[1,2-b]喹啉-9-基)碳酸酯(190mg,119.04μmol)溶于二氯甲烷(5mL)，加入三氟乙酸(0.5mL)后继续反应1小时。向反应液中滴入饱和碳酸氢钠水溶液中和后分液，将有机相浓缩得粗品。经反相柱色谱(乙腈/1％甲酸水溶液＝0％～50％)纯化后冷冻干燥得标题化合物(95mg,69.35μmol)。
其结构表征数据如下：
ESI-MS(m/z):1323.6[M+1]+.
步骤五:4-((S)-2-(4-氨基丁基)-35-(4-((6-(2-(甲基磺酰基)嘧啶-5-基)己基-5-炔酰胺基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-4,8-二氧代-6,12,15,18,24,27,30,33-壬氧基-3,9-二氮杂五氮杂三酰氨基)苄基((1S,9R)-5-氯-9-乙基-1-(2-羟基乙酰胺基)-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[d]吡喃并[3',4':6,7]中氮茚并[1,2-b]喹啉-9-基)碳酸酯(B-03)的制备
将4-((S)-2-(4-氨基丁基)-35-叠氮基-4,8-二氧代-6,12,15,18,21,24,27,30,33-壬氧基-3,9-二氮杂五苯并三酰氨基)苄基((1S,9S)-5-氯-9-乙基-1-(2-羟基乙酰胺基)-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]中氮茚并[1,2-b]喹啉-9-基)碳酸酯(90mg,0.066mmol)和6-(2-(甲基磺酰基)嘧啶-5-基)-N-(丙-2-炔-1-基)己-5-炔酰胺(24.07mg,0.079mmol)溶于DMSO(2mL)和水(0.2mL)中，加入溴化亚铜(9.42mg,0.066mmol)后继续搅拌2小时。将反应液直接过滤，将反应液直接过滤浓缩的粗品，经制备高效液相色谱纯化后冷冻干燥得标题化合物(42.2mg，24.69μmol)。
其结构表征数据如下：
ESI-MS(m/z):1628.7[M+1]+.
其制备高效液相色谱方法如下：
色谱柱:SunFire Prep C18 OBD 19mm×150mm×5.0μm
流动相A:乙腈；流动相B:水(0.05％甲酸)
二、抗体的制备
采用人B7-H3-4Ig-His蛋白免疫全人源小鼠，通过ELISA、细胞流式监测血清效价，根据效价结果选择最优小鼠取脾脏细胞融合、筛选并进行亚克隆，检测不同单克隆结合人\猴蛋白、细胞等活性，获得优选克隆20G11G6，并对抗体的序列进行PTM位点去除改造，PI降低改造，以及重链恒定区ADCC去除改造后，最终得到全人源抗体2#8890(重链可变区,SEQID NO:3；轻链可变区,SEQ ID NO:4)、人IgG1重链恒定区去除ADCC活性改造的序列(SEQ IDNO:31)、人κ轻链恒定区(SEQ ID NO:32)，形成完整的人源化抗体(见表1)，抗体委托南京金斯瑞生物科技有限公司进行密码子优化与基因合成，构建至pTT5质粒中，重链和轻链质粒同时转染到CHO-S细胞中，采用Protein A对上清中的表达抗体进行纯化，从而获得相应抗体蛋白2#8890。2#8890的重链氨基酸序列和轻链氨基酸序列分别如SEQ ID NO：42和SEQ IDNO：43所示。
hIgG1为抗鸡溶菌酶抗体，重链可变区融合至突变的人IgG1重链恒定区(SEQ IDNO:31)，轻链可变区融合至野生型的人kappa轻链恒定区(SEQ ID NO:32)，按上述方法表达纯化,获得抗体hIgG1。
B7-H3对照抗体DS7300来自专利CN 103687945 A中，进行密码子优化后，抗体重链可变区核苷酸序列分别合成克隆到含有突变的人IgG1重链恒定区(SEQ ID NO:31)，轻链可变区核苷酸序列合成至含有野生型kappa轻链恒定区(SEQ ID NO:32)的pTT5载体，按上述方法表达纯化,获得抗体DS7300。
表1：2#8890可变区及CDR氨基酸序列
三、包含细胞生物活性分子和连接体的化合物与抗体的偶联
以下实施例所制备得到的抗体药物偶联物中所涉及的抗体2#8890，DS7300，以及hIgG1为上述第二部分中所述的对应抗体。
1、ADC 1(DS7300-M-01，DAR 4)的制备
取38.041ml自制DS7300抗体(26.287mg/mL)，用1M Na2HPO4溶液调pH至7.4，用20mMPB将抗体稀释至3mg/mL，并于冰浴中向其中依次加入4mM ZnCl2(3.413mL)，10mM TCEP(三(2-羧乙基)膦，4.096mL，pH 7.4)溶液混匀，4℃放置过夜。再加入6倍物质的量的溶解在二甲基亚砜的M-01(4.18mL，10mM)溶液混匀，4℃反应4h，再向其中加入半胱氨酸溶液(10mM，6.826mL)，反应1.5h后将反应液移至室温，并向其中加入EDTA溶液(10mM，6.826mL)，30分钟后再加入DHAA溶液(10mM，6.826mL)，继续反应30分钟。完毕后采用NAP-5凝胶柱(Cytiva)将缓冲液置换为pH 6.0的20mM组氨酸缓冲溶液，得到抗体药物偶联物，即ADC 1(DS7300-M-01)。质谱法测定DAR值为3.8。
2、ADC 2(hIgG1-M-01,DAR 4)的制备
取1.2245ml hIgG1抗体(24.5mg/mL)，用1M Na2HPO4溶液调pH至7.3，用20mM PB将抗体稀释至3mg/mL，并于冰浴中向其中依次加入4mM ZnCl2(52.04uL)，10mM TCEP(三(2-羧乙基)膦，124.89uL，pH7.3)溶液混匀，4℃放置过夜。再加入6倍物质的量的溶解在二甲基亚砜的171(127.44uL，10mM)溶液混匀，4℃反应4h，再向其中加入半胱氨酸溶液(10mM，208.15uL)，反应1.5h后将反应液移至室温，并向其中加入EDTA溶液(10mM，208.15uL)，30分钟后再加入DHAA溶液(10mM，208.15uL)，继续反应30分钟。完毕后采用NAP-5凝胶柱(Cytiva)将缓冲液置换为pH 6.0的20mM组氨酸缓冲溶液，得到ADC 2(即hIgG1-M-01)。质谱法测定DAR值为4.46。
3、ADC 3(2#8890-M-01,DAR 4)的制备
取9.36ml 2#8890抗体(3.205mg/mL)，用1M Na2HPO4溶液调pH至7.4，用20mM PB将抗体稀释至3mg/mL，并于冰浴中向其中依次加入4mM ZnCl2(57.31uL)，10mM TCEP(三(2-羧乙基)膦，124.9uL，pH 7.4)溶液混匀，4℃放置过夜。再加入6倍物质的量的溶解在二甲基亚砜的M-01(124.9uL，10mM)溶液混匀，4℃反应4h，再向其中加入半胱氨酸溶液(10mM，208.2uL)，反应1.5h后将反应液移至室温，并向其中加入EDTA溶液(10mM，208.2uL)，30分钟后再加入DHAA溶液(10mM，208.2uL)，继续反应30分钟。完毕后采用NAP-5凝胶柱(Cytiva)将缓冲液置换为pH 6.0的20mM组氨酸缓冲溶液，得到抗体药物偶联物，即ADC 3(2#8890-M-01)。质谱法测定DAR值为3.89。
4、ADC 4(hIgG1-A-05,DAR 8)的制备
取0.943ml hIgG1抗体(11mg/mL)，用47uL 20mM PB+0.1M EDTA(pH 7.60)稀释，然后用1M Na2HPO4溶液调pH至7.60，加入10mM TCEP(三(2-羧乙基)膦，57uL，pH 7.60)溶液混匀，室温放置1.5h。再加入10倍物质的量的溶解在二甲基亚砜的A-05(103uL，10mM)溶液混匀，室温静置2h，完毕后采用NAP-5凝胶柱(Cytiva)将缓冲液置换为pH 6.0的20mM组氨酸缓冲溶液，得到抗体药物偶联物，即ADC 4(hIgG1-A-05)。质谱法测定DAR值为8.03。
5、ADC 5(2#8890-A-05,DAR 8)的制备
取3.052ml 2#8890抗体(9.83mg/mL)，用153uL 20mM PB+0.1M EDTA(pH 7.60)稀释，然后用1M Na2HPO4溶液调pH至7.60，加入10mM TCEP(三(2-羧乙基)膦，114.5uL，pH7.60)溶液混匀，室温放置1.5h。再加入10倍物质的量的溶解在二甲基亚砜的A-05(219.1uL，10mM)溶液混匀，室温静置2h，完毕后采用NAP-5凝胶柱(Cytiva)将缓冲液置换为pH 6.0的20mM组氨酸缓冲溶液，得到抗体药物偶联物，即ADC 5(2#8890-A-05)。质谱法测定DAR值为7.90。
6、ADC 6(hIgG1-A-07,DAR 8)的制备
取0.518ml hIgG1抗体(19.3mg/mL)，用25.9uL 20mM PB+0.1M EDTA(pH 7.60)稀释，然后用1M Na2HPO4溶液调pH至7.60，加入10mM TCEP(三(2-羧乙基)膦，38.1uL，pH 7.60)溶液混匀，室温放置1.5h。再加入10倍物质的量的溶解在二甲基亚砜的A-07(69.2uL，10mM)溶液混匀，室温静置2h，完毕后采用NAP-5凝胶柱(Cytiva)将缓冲液置换为pH 6.0的20mM组氨酸缓冲溶液，得到抗体药物偶联物，即ADC 6(hIgG1-A-07)。质谱法测定DAR值为8.04。
7、ADC 7(2#8890-A-07,DAR 8)的制备
取1.017ml 2#8890抗体(9.83mg/mL)，用50.85uL 20mM PB+0.1M EDTA(pH 7.60)稀释，然后用1M Na2HPO4溶液调pH至7.60，加入10mM TCEP(三(2-羧乙基)膦，38.2uL，pH7.60)溶液混匀，室温放置1.5h。再加入12倍物质的量的溶解在二甲基亚砜的A-07(87.6uL，10mM)溶液混匀，室温静置2h，完毕后采用NAP-5凝胶柱(Cytiva)将缓冲液置换为pH 6.0的20mM组氨酸缓冲溶液，得到抗体药物偶联物，即ADC 7(2#8890-A-07)。质谱法测定DAR值为7.76。
8、ADC 8(hIgG1-A-14,DAR 8)的制备
取1.9126ml hIgG1抗体(18.3mg/mL)，用95.6uL 20mM PB+0.1M EDTA(pH 7.60)稀释，然后用1M Na2HPO4溶液调pH至7.60，加入10mM TCEP(三(2-羧乙基)膦，66.86uL，pH7.60)溶液混匀，室温放置1.5h。再加入10倍物质的量的溶解在二甲基亚砜的A-14(260.53uL，10mM)溶液混匀，室温静置2h，完毕后采用NAP-5凝胶柱(Cytiva)将缓冲液置换为pH 6.0的20mM组氨酸缓冲溶液，得到抗体药物偶联物，即ADC 8(hIgG1-A-14)。质谱法测定DAR值为8.0。
9、ADC 9(2#8890-A-14,DAR 8)的制备
取3.6788ml 2#8890抗体(10.873mg/mL)，用183.94uL 20mM PB+0.1M EDTA(pH7.60)稀释，然后用1M Na2HPO4溶液调pH至7.60，加入10mM TCEP(三(2-羧乙基)膦，152uL，pH7.60)溶液混匀，室温放置1.5h。再加入10倍物质的量的溶解在二甲基亚砜的A-14(292.26uL，10mM)溶液混匀，室温静置2h，完毕后采用NAP-5凝胶柱(Cytiva)将缓冲液置换为pH 6.0的20mM组氨酸缓冲溶液，得到抗体药物偶联物，即ADC 9(2#8890-A-14)。质谱法测定DAR值为7.22。
10、ADC 10(hIgG1-B-01,DAR 8)的制备
取1.533ml hIgG1抗体(19.57mg/mL)，用76.65uL 20mM PB+0.1M EDTA(pH 7.60)稀释，然后用1M Na2HPO4溶液调pH至7.60，加入10mM TCEP(三(2-羧乙基)膦，114.5uL，pH7.60)溶液混匀，室温放置1.5h。再加入10倍物质的量的溶解在二甲基亚砜的B-01(212.4uL，10mM)溶液混匀，室温静置2h，完毕后采用NAP-5凝胶柱(Cytiva)将缓冲液置换为pH 6.0的20mM组氨酸缓冲溶液，得到抗体药物偶联物，即ADC 10(hIgG1-B-01)。质谱法测定DAR值为8.03。
11、ADC 11(2#8890-B-01,DAR 8)的制备
取3.052ml 2#8890抗体(9.83mg/mL)，用152.6uL 20mM PB+0.1M EDTA(pH 7.60)稀释，然后用1M Na2HPO4溶液调pH至7.60，加入10mM TCEP(三(2-羧乙基)膦，114.5uL，pH7.60)溶液混匀，室温放置1.5h。再加入10倍物质的量的溶解在二甲基亚砜的B-01(212.4uL，10mM)溶液混匀，室温静置2h，完毕后采用NAP-5凝胶柱(Cytiva)将缓冲液置换为pH 6.0的20mM组氨酸缓冲溶液，得到抗体药物偶联物，即ADC 11(2#8890-B-01)。质谱法测定DAR值为7.75。
对偶联后的ADC样品进行LC-MS分子量分析。
色谱测定条件：
液相色谱柱：Thermo MAbPac RP 3.0*100mm；
流动相A：0.1％ FA/H2O；流动相B：0.1％ FA/ACN；
流速：0.25ml/min；样品室温度：8℃；柱温：60℃；进样量：2μl；
时间(分钟) 2 20 22 25 26 30
流动相A(体积％) 75 20 5 5 75 75
流动相B(体积％) 25 80 95 95 25 25
质谱测定条件：
质谱型号：AB Sciex Triple TOF 5600+；
GS1 35；GS2 35；CUR 30；TEM 350；ISVF 5500；DP 200；CE 10；
Accumulation time 0.5s；
m/z 600-4000；Time bins to sum 40。
12、ADC 12(2#8890-C-07,DAR 4)的制备
取0.2274ml 2#8890抗体(10.994mg/mL)，用11.4uL 20mM PB+0.1M EDTA(pH7.60)稀释，然后用1M Na2HPO4溶液调pH至7.60，加入10mM TCEP(三(2-羧乙基)膦，9.5uL，pH7.60)溶液混匀，室温放置1.5h。再缓慢加入8倍物质的量的溶解在二甲基亚砜的C-07(14.6uL，10mM)溶液混匀，室温静置过夜，完毕后采用NAP-5凝胶柱(Cytiva)将缓冲液置换为pH 6.0的20mM组氨酸缓冲溶液，得到抗体药物偶联物，即ADC 12(2#8890-C-07)。质谱法测定DAR值为4.12。
13、ADC 13(2#8890-C-10,DAR 4)的制备
取0.2274ml 2#8890抗体(10.994mg/mL)，用11.4uL 20mM PB+0.1M EDTA(pH7.60)稀释，然后用1M Na2HPO4溶液调pH至7.60，加入10mM TCEP(三(2-羧乙基)膦，9.5uL，pH7.60)溶液混匀，室温放置1.5h。再缓慢加入8倍物质的量的溶解在二甲基亚砜的C-10(14uL，10mM)溶液混匀，室温静置过夜，完毕后采用NAP-5凝胶柱(Cytiva)将缓冲液置换为pH 6.0的20mM组氨酸缓冲溶液，得到抗体药物偶联物，即ADC 13(2#8890-C-10)。质谱法测定DAR值为4.17。
对偶联后的ADC样品进行LC-MS分子量分析。
色谱测定条件：
液相色谱柱：ACQUITY UPLC MAbPac BEH SEC；
流动相A：20mM NH4Ac；
流速：0.1ml/min；样品室温度：8℃；柱温：60℃；进样量：2μl；
时间(分钟) 2 20 22 25 26 30
流动相A(体积％) 75 20 5 5 75 75
流动相B(体积％) 25 80 95 95 25 25
质谱测定条件：
质谱型号：AB Sciex Triple TOF 5600+；
GS1 55；GS2 55；CUR 30；TEM 450；ISVF 5500；DP 75；CE 5；Accumulation time0.5s；
m/z 900-7000；Time bins to sum 40。
14、ADC 14(2#8890-C-17,DAR 4)的制备
取0.292mL 2#8890抗体(8.565mg/mL)，用14.6uL 20mM PB+0.1M EDTA(pH 7.60)稀释，然后用1M Na2HPO4溶液调pH至7.60，加入20mM TCEP(三(2-羧乙基)膦，4.77uL，pH7.60)溶液混匀，室温放置1.5h。再缓慢加入5倍物质的量的溶解在二甲基亚砜的C-17(8.76uL，10mM)溶液混匀，室温静置过夜，完毕后采用NAP-5凝胶柱(Cytiva)将缓冲液置换为pH 6.0的20mM组氨酸缓冲溶液，得到抗体药物偶联物，即ADC 14(2#8890-C-17)。质谱法测定DAR值为3.86。
15、ADC 15(2#8890-C-19,DAR 4)的制备
取0.584mL 2#8890抗体(8.565mg/mL)，用29.2uL 20mM PB+0.1M EDTA(pH 7.60)稀释，然后用1M Na2HPO4溶液调pH至7.60，加入20mM TCEP(三(2-羧乙基)膦，9.54uL，pH7.60)溶液混匀，室温放置1.5h。再缓慢加入5.5倍物质的量的溶解在二甲基亚砜的C-19(17.9uL，10mM)溶液混匀，室温静置过夜，完毕后采用NAP-5凝胶柱(Cytiva)将缓冲液置换为pH 6.0的20mM组氨酸缓冲溶液，得到抗体药物偶联物，即ADC 15(2#8890-C-19)。质谱法测定DAR值为4.05。
16、ADC 16(2#8890-C-21,DAR 4)的制备
取0.584mL 2#8890抗体(8.565mg/mL)，用29.2uL 20mM PB+0.1M EDTA(pH 7.60)稀释，然后用1M Na2HPO4溶液调pH至7.60，加入20mM TCEP(三(2-羧乙基)膦，9.54uL，pH7.60)溶液混匀，室温放置1.5h。再缓慢加入5.5倍物质的量的溶解在二甲基亚砜的C-21(17.9uL，10mM)溶液混匀，室温静置过夜，完毕后采用NAP-5凝胶柱(Cytiva)将缓冲液置换为pH 6.0的20mM组氨酸缓冲溶液，得到抗体药物偶联物，即ADC 16(2#8890-C-21)。质谱法测定DAR值为3.92。
17、ADC 17(2#8890-B-03，DAR 8)的制备
取0.867ml 2#8890抗体(34.6mg/mL)，用93.4μL 20mM PB+0.1MEDTA(pH 7.60)稀释，然后用1M Na2HPO4溶液调pH至7.60，加入10mM TCEP(三(2-羧乙基)膦，112.65μL，pH7.60)溶液混匀，室温放置1.5h。再加入11倍物质的量的溶解在二甲基亚砜的B-03(227.58uL，10mM)溶液混匀，室温静置2h，完毕后采用NAP-5凝胶柱(Cytiva)将缓冲液置换为pH 6.0的20mM组氨酸缓冲溶液，得到抗体药物偶联物，即ADC 17(2#8890-B-03，DAR 8)。质谱法测定DAR值为7.82。
18、ADC 18(2#8890-B-03，DAR 8)的制备
取0.867ml 2#8890抗体(34.6mg/mL)，用58.35μL 20mM PB+0.1MEDTA(pH 7.60)稀释，然后用1M Na2HPO4溶液调pH至7.60，加入10mM TCEP(三(2-羧乙基)膦，112.65μL，pH7.60)溶液混匀，室温放置1.5h。再加入10倍物质的量的溶解在二甲基亚砜的B-03(211.1uL，10mM)溶液混匀，室温静置2h，完毕后采用NAP-5凝胶柱(Cytiva)将缓冲液置换为pH 6.0的20mM组氨酸缓冲溶液，得到抗体药物偶联物，即ADC 18(2#8890-B-03，DAR 8)。质谱法测定DAR值为7.23。
19、ADC 19(19F6-B-02)的制备
以下实施例所涉及的抗体19F6_Hu35v1即为国际专利申请WO2022253035A1所记载的19F6_Hu35v1抗体，采用该专利实施例二所记载的方法制备。
样品的偶联制备如下：
取0.46ml 19F6_Hu35v1抗体(11.0mg/mL)，用0.1M依地酸二钠的溶液(pH 7.7)稀释，然后用1M Na2HPO4溶液调pH至7.7，加入10mM TCEP(三(2-羧乙基)膦)溶液混匀，室温放置90min。向上述溶液体系加入10倍物质的量的溶解在二甲基亚砜的B-02，混匀，室温静置2h，完毕后采用NAP-5凝胶柱(Cytiva)将缓冲液置换为pH 6.0的10mM组氨酸缓冲溶液，然后添加蔗糖和吐温20，混匀，得到抗体药物偶联物，即ADC 19(19F6-B-02)。质谱法测定DAR值为7.92。
20、ADC 20(Trastuzumab-A-05，DAR 8)
取2.469mL Trastuzumab抗体(16.2mg/mL),用123uL 20mM PB+
0.1M EDTA(pH 7.60)稀释,然后用1M Na2HPO4溶液调pH至7.60,加入10mM TCEP(三(2-羧乙基)膦,151.57uL,pH 7.60)溶液混匀,室温放置1.5h。再缓慢加入10倍物质的量的溶解在二甲基亚砜中的A-05(290.09uL,10mM)溶液混匀,室温静置2h,完毕后采用NAP-5凝胶柱(Cytiva)将缓冲液置换为pH 6.0的20mM组氨酸缓冲溶液,得到抗体药物偶联物(即Trastuzumab-A-05)。质谱法测定DAR值为8.04。
21、ADC 21(Trastuzumab-A-14，DAR 8)
取2.564mL Trastuzumab抗体(15.6mg/mL),用128.2uL 20mM PB+0.1M EDTA(pH7.60)稀释,然后用1M Na2HPO4溶液调pH至7.60,加入10mM TCEP(三(2-羧乙基)膦,151.57uL,pH 7.60)溶液混匀,室温放置1.5h。再缓慢加入10倍物质的量的溶解在二甲基亚砜中的A-14(290.1uL,10mM)溶液混匀,室温静置2h,完毕后采用NAP-5凝胶柱(Cytiva)将缓冲液置换为pH 6.0的20mM组氨酸缓冲溶液,得到抗体药物偶联物(即Trastuzumab-A-14)。质谱法测定DAR值为8.02。
22、ADC 22(Trastuzumab-A-24，DAR 8)
取0.617mL Trastuzumab抗体(16.2mg/mL),用30.86uL 20mM PB+0.1M EDTA(pH7.60)稀释,然后用1M Na2HPO4溶液调pH至7.60,加入10mM TCEP(三(2-羧乙基)膦,37.89uL,pH 7.60)溶液混匀,室温放置1.5h。再缓慢加入14倍物质的量的溶解在二甲基亚砜的A-24(98.42uL,10mM)溶液混匀,室温静置2h,完毕后采用NAP-5凝胶柱(Cytiva)将缓冲液置换为pH 6.0的20mM组氨酸缓冲溶液,得到抗体药物偶联物(即Trastuzumab-A-24)。质谱法测定DAR值为7.37。
23、ADC23(Trastuzumab-A-32，DAR 8)
取0.423mL Trastuzumab抗体(4.73mg/mL),用21.17uL 20mM PB+0.1M EDTA(pH7.60)稀释,然后用1M Na2HPO4溶液调pH至7.60,加入10mM TCEP(三(2-羧乙基)膦,7.58uL,pH 7.60)溶液混匀,室温放置1.5h。再加入10倍物质的量的溶解在二甲基亚砜的A-32(13.92uL,10mM)溶液混匀,室温静置2h,完毕后采用NAP-5凝胶柱(Cytiva)将缓冲液置换为pH6.0的20mM组氨酸缓冲溶液,得到抗体药物偶联物(即Trastuzumab-A-32)。质谱法测定DAR值为6.77。
24、ADC24(Trastuzumab-C-21，DAR 4)
取0.617mL Trastuzumab抗体(16.2mg/mL),用30.86uL 20mM PB+0.1M EDTA(pH7.60)稀释,然后用1M Na2HPO4溶液调pH至7.60,加入19.83mM TCEP(三(2-羧乙基)膦,19.1uL,pH 7.60)溶液混匀,室温放置1.5h。再依次加入5.5倍物质的量的溶解在二甲基亚砜的C-21(38.28uL,10mM)溶液混匀,室温静置18h,完毕后采用NAP-5凝胶柱(Cytiva)将缓冲液置换为pH 6.0的20mM组氨酸缓冲溶液,得到抗体药物偶联物(即Trastuzumab-C-21)。质谱法测定DAR值为4.41,其中DAR4占比60.06％。四、检测抗体药物偶联物活性
1.抗人B7-H3抗体偶联物动态亲和力检测
用ForteBio(Pall life sciences)检测抗人B7-H3抗体偶联物与人B7-H3-4Ig-his、人B7-H3-2Ig-his、大鼠B7-H3-his和猴B7-H3-his蛋白的动态亲和力。具体方法如下：用PBST(0.02％ Tween-20)将待测偶联物稀释到5μg/ml，人B7-H3-4Ig-his、人B7-H3-2Ig-his、大鼠B7-H3-his和猴B7-H3-his蛋白梯度稀释到200nM、100nM、50nM、25nM、12.50nM、6.25nM、3.125nM、0nM，随后在PBST(0.02％ Tween-20)溶液中用Protein A Sensor(Palllife sciences)分别捕获待测偶联物60s，随后分别与4个蛋白结合60s，然后解离180s，测得结果在Data Analysis 11.0软件中打开，选用1:1模式，global fitting，对结果进行分析，获得亲和力常数。结果如表2所示，结果显示2#8890偶联物与猴B7-H3结合，不与大鼠B7-H3结合。
表2：抗人B7-H3抗体偶联物动态亲和力检测结果
2.抗人B7-H3抗体偶联物的细胞亲和力检测
用流式仪(Beckman，型号Cytoflex)检测抗人B7-H3全人源抗体偶联物与人结肠癌细胞HT29(中国科学院细胞库)、人胃癌细胞NCI-N87(ATCC)、人乳腺鳞状癌细胞HCC1806(ATCC)和人非小细胞肺癌细胞HCC827(ATCC)的亲和力；检测抗人B7-H3全人源抗体偶联物与CHOS-人B7-H3-4Ig、CHOS-人B7-H3-2Ig的亲和力；检测抗人B7-H3全人源抗体偶联物的种属交叉情况：与CHOS-大鼠B7-H3和CHOS-猴B7-H3的亲和力。用Trypsin-EDTA(0.25％)(Thermo)溶液消化贴壁生长的细胞，计数并调整细胞密度至4.0×106/ml，用1％ BSA洗涤两次，重悬于1％ BSA溶液中，每孔加入50μl细胞悬液到96孔尖底板中(细胞数目为2×105个/孔)；用1％ BSA稀释抗体偶联物(终浓度10μg/ml起始，3倍梯度稀释，共稀释11个浓度点),hIgG1抗体偶联物作为对照(终浓度10ug/ml)，取50μl稀释好的抗体到含有细胞的尖底板中，4度孵育60min；1％ BSA洗涤细胞两次，每孔加入50μl稀释好的二抗，混匀，4度孵育30min；1％BSA洗涤细胞两次，将细胞重悬于200μl 1％ BSA中，流式上机检测。数据处理：导出Median PE数值，然后导入GraphPad Prism 6软件，计算EC50。
抗人B7-H3抗体偶联物的HT29、NCI-N87、HCC1806、HCC827肿瘤细胞亲和力结果分别如表3所示，抗人B7-H3全人源抗体偶联物对CHOS-人B7-H3-4Ig、CHOS-人B7-H3-2IG细胞的亲和力结果如表4所示，抗人B7-H3抗体偶联物对CHOS-大鼠B7-H3和CHOS-猴B7-H3细胞的亲和力结果如表5所示，结果显示2#8890偶联物与猴B7-H3过表达细胞结合，不与大鼠B7-H3过表达细胞结合。
表3：ADC肿瘤细胞亲和力测定结果
表4：CHOS-人B7-H3-4Ig、CHOS-人B7-H3-2Ig细胞亲和力测定结果
表5：CHOS-大鼠B7-H3和CHOS-猴B7-H3细胞亲和力测定结果
3.抗人B7-H3抗体偶联物细胞内吞活性检测
用流式仪(Thermo，型号Attune NxT)检测抗人B7-H3抗体偶联物对人胃癌细胞NCI-N87(ATCC)、人乳腺鳞状癌细胞HCC1806(ATCC)和人非小细胞肺癌细胞HCC827(ATCC)的内吞活性。用Trypsin-EDTA(0.25％)(Thermo)溶液消化贴壁生长的细胞并计数，用完全培养基调整细胞密度至1×105个/ml，每孔加入100μl细胞悬液到96孔板中(细胞数目为1×104个/孔)，将96孔板放置于37℃，CO2恒温培养箱孵育培养24h。取出96孔板，吸弃培养基，每孔加入50μl新鲜完全培养基；采用完全培养基稀释待测抗体偶联物，共计6个浓度点；完全培养基稀释300μg/ml的pHrodo试剂(Thermo，Cat#Z25612)至12μg/ml(pHrodo的终浓度为3μg/ml)；将梯度稀释的待测抗体与稀释后的pHrodo试剂1:1混合均匀(30μl:30μl)，在室温避光孵育30min；取50μl待测抗体和pHrodo试剂混合物加入96孔板中，37℃、5％CO2培养24h；取出96孔板，吸弃培养基，无菌PBS洗涤1次，每孔加入100μl的Trypsin-EDTA(0.25％)消化细胞，再加入100μl完全培养基中和；将孔里细胞吹打分散后，FACS上机检测。数据处理：导出Median YL-1H数值，然后导入GraphPad Prism 6软件，计算EC50，结果如表6所示，ADC 5和ADC 9均具有较好的细胞内吞活性。
表6：ADC细胞内吞活性测定结果
4.抗人B7-H3抗体偶联药物体外细胞杀伤检测
用Trypsin-EDTA(0.25％)(Thermo)溶液消化贴壁生长的A375、Calu6-B7-H3和U87MG-B7-H3细胞并计数，用完全培养基分别调整细胞密度至1×104、5×104、1×104个/ml，每孔加入100μl细胞悬液到96孔板中(细胞数目分别为1000、5000、1000个/孔)，将96孔板放置于37℃，CO2恒温培养箱孵育培养24h。采用完全培养基稀释待测ADC，终浓度3333.3nM起始，4倍梯度稀释，共计12个浓度点；取100μl稀释好的ADC加入96孔板中，37℃、5％CO2培养4～7天。取出96孔板，每孔加20μl CCK8试剂，37℃孵育2～3h，使用酶标仪检测OD450nm信号值，然后导入GraphPad Prism 6软件，计算IC50，结果如表7所示。
表7 ADC体外细胞杀伤结果
5.2#8890不同偶联药物HCC1806模型体内药效检测
人乳腺鳞状癌细胞HCC1806(ATCC)，培养条件为RPMI1640培养基中加10％胎牛血清，于37℃、含5％CO2空气的培养箱中培养。当细胞呈指数生长期时，取培养液进行支原体检测后，收集细胞并计数。每只小鼠右侧肩胛处皮下接种2×106个HCC1806细胞，悬浮于0.1ml PBS。待平均肿瘤体积生长至约100～200mm3时，剔除瘤体积过小或过大的小鼠，剩余小鼠根据肿瘤体积和动物体重随机分为6组，每组6只，尾静脉注射单次给药(DAR4给药组：10mg/kg，DAR8给药组：5mg/kg)。给药后每周2次测量肿瘤体积和体重，具体结果见表8。
表8 2#8890不同偶联药物对HCC1806细胞荷瘤鼠模型的疗效分析
注：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001表示与溶媒组相比有显著差异。
结果显示：给药组小鼠体重稳定，耐受性良好。等毒素剂量下，ADC 3组药效与ADC11组药效相当，弱于ADC 5组。单次给药后95天，ADC 5组小鼠肿瘤完全消退。
6.不同剂量抗体偶联药物HCC1806模型药效检测
人乳腺鳞状癌细胞HCC1806(ATCC)，培养条件为RPMI1640培养基中加10％胎牛血清，于37℃、含5％CO2空气的培养箱中培养。当细胞呈指数生长期时，取培养液进行支原体检测后，收集细胞并计数。每只小鼠右侧肩胛处皮下接种2×106个HCC1806细胞，悬浮于0.1ml PBS。待平均肿瘤体积生长至约100～200mm3时，剔除瘤体积过小或过大的小鼠，剩余小鼠根据肿瘤体积和动物体重随机分为12组，每组6只，尾静脉注射单次给药。给药后每周2次测量肿瘤体积和体重，具体结果见表9。
表9抗体偶联药物不同剂量HCC1806细胞荷瘤鼠模型的疗效分析
注：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001表示与溶媒组相比有显著差异。
结果显示：ADC 5与ADC 9组均具有较好的药效。ADC 4组死亡1只，ADC 5和ADC9组小鼠体重稳定，耐受性良好。
7.不同抗体偶联药物NCI-N87模型药效检测
人胃癌细胞NCI-N87(ATCC)，培养条件为RPMI1640培养基中加10％胎牛血清，于37℃、含5％CO2空气的培养箱中培养。当细胞呈指数生长期时，取培养液进行支原体检测后，收集细胞并计数。每只小鼠右侧肩胛处皮下接种5×106个NCI-N87细胞，悬浮于0.1ml PBS基质胶中。待平均肿瘤体积生长至约100～200mm3时，剔除瘤体积过小或过大的小鼠，剩余小鼠根据肿瘤体积和动物体重随机分为8组，每组6只，尾静脉注射给药，QW给药两次。给药后每周2次测量肿瘤体积和体重，具体结果见表10。
表10不同抗体偶联药物NCI-N87细胞荷瘤鼠模型的疗效分析
注：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001表示与溶媒组相比有显著差异。
结果显示：各给药组小鼠体重稳定，耐受性良好。
8.抗人B7-H3抗体偶联药物与Fc受体结合活性检测
用ForteBio(Pall life sciences)检测2#8890抗体偶联药物与人Fc受体蛋白CD16a、CD32a、CD32b、C1q、FcRn动态亲和力。具体方法如下：在PBST溶液中用SA Sensor(Pall life sciences)分别捕获待测生物素化蛋白，用PBST将待测抗体及偶联物稀释到起始浓度5000nM并2倍稀释7个浓度点，结合、解离并将测得结果在Data Analysis 11.0软件中打开，选用1:1模式，global fitting，对结果进行分析，获得结合速率、解离速率及亲和力常数，结果如表11所示。
表11抗体及偶联物结合Fc受体活性检测
ADC Fc受体蛋白 KD(M)
ADC 11 FcRn 1.07E-08
ADC 5 CD32a 不结合
ADC 5 FcRn 1.45E-08
ADC 9 CD32a 不结合
ADC 9 FcRn 1.5E-08
结果表明，经过突变改造的2#8890偶联物，不结合Fc受体CD16a、CD32a、CD32b、C1q蛋白，可降低Fc受体介导的非特异性杀伤，提高药物安全性，同时2#8890偶联物保留了FcRn蛋白结合活性，不影响药物的半衰期。
9.食蟹猴多次静脉注射给予抗人B7-H3抗体偶联药物后血清中总抗体(Tab)、ADC、Payload药代动力学研究
采用ELISA和LC-MS/MS方法来进行食蟹猴血清中ADC(ADC 5、ADC 9)、总抗体(TAb)、Payload的定量检测。ADC(ADC 5、ADC 9)和总抗体(TAb)方法的标准曲线定量范围均为11.72～3000.00ng/mL，Payload的方法线性范围为0.1～40ng/mL。ADC(ADC 5、ADC 9)和总抗体(TAb)方法均采用B7-H3蛋白作为捕获蛋白，包被于96孔酶标板中，随后总抗体(Tab)使用Goat Anti-Human IgG-HRP作为检测抗体；ADC(ADC 5、ADC 9)则先后分别使用Anti-Toxin mouse antibody和Goat Anti-Mouse IgG作为第二抗体和检测抗体。通过酶和底物的作用进行显色，于SpectraMax i3x(Molecular Devices)酶标仪上读取，采用4-P参数法拟合出标准曲线并计算出各样本浓度。ADC(ADC 5、ADC 9)和总抗体(TAb)浓度与颜色的深浅呈正相关。LC-MS/MS通过岛津LC 30-AD液相系统联用SCIEX QTRAP 5500+(SCIEX公司)质谱仪，采用(+)ESI离子化方式，选取多反应监测模式(MRM)分析。其中色谱柱为XbridgeC1850*4.6mm,5μm，待测物化合物1-10离子对为510.2/435.2，样品前处理使用乙腈进行蛋白沉淀。结果：食蟹猴多次静脉注射给予ADC5和ADC 9后，测试结果显示，本申请的ADC分子(例如ADC 5及ADC 9)体现出良好的药代动力学特性，于体循环中较为稳定，游离毒素释放量少。其中ADC9的食蟹猴体内的半衰期要更长，游离毒素的清除更快。
表12ADC末次静脉注射50mg/kg后血清中TAb的药代参数
表13ADC末次静脉注射50mg/kg后血清中ADC的药代参数
表14ADC末次静脉注射50mg/kg后血清中Payload的药代参数
10.重复给药毒性试验
重复给药毒性试验包括食蟹猴静脉注射ADC5和ADC 9的给药4次的重复毒性试验。
本试验共设3个组，1只/组/性别，分别静脉注射给予30mg/kg的ADC5、ADC 9以及生理盐水(体积：10mL/kg)，每周给药1次，共给药2次；之后提高剂量至50mg/kg的ADC 5、ADC 9以及生理盐水，每周给药1次，共给药2次。试验中，未见供试品相关的死亡或濒死。ADC 5给药组给药期间可见动物食欲减退、脱毛、皮肤色素沉着和体重降低。雌猴可见WBC、NEUT、LYM、MONO降低。雄猴可见RBC、HGB、HCT降低，FGB升高，恢复期有恢复趋势。ADC 9给药组给药期间可见动物食欲减退。雌猴可见WBC、NEUT、LYM、MONO降低和FBG升高。雄猴可见FBG升高、RBC、HGB、HCT降低。恢复期间，另见给药局部色素沉着和轻微脱毛，其他改变均有恢复趋势。在本实验条件下，食蟹猴每周1次，连续2周，静脉注射30mg/kg的ADC 5和ADC 9；随后提高剂量，每周1次，连续2周，静脉注射50mg/kg的ADC 5和ADC 9。所有动物均可耐受。最高无严重毒性剂量(HNSTD)为50mg/kg。
11.抗体-药物偶联物对小鼠皮下移植瘤模型上的肿瘤生长抑制作用
分别通过尾静脉注射给予皮下移植人乳腺鳞状癌细胞HCC1806小鼠CDX模型含有本发明ADC的制剂，每周2次测定肿瘤体积和动物体重变化，计算本发明ADC对荷瘤小鼠的抑瘤疗效。
实验动物：Balb/c Nude小鼠(成都药康生物科技有限公司)
细胞系：人乳腺鳞状癌细胞HCC1806(ATCC)
实验方法：
用含10％胎牛血清的RPMI 1640培养液，在37℃，5％ CO2的条件下培养HCC1806细胞。收集指数生长期的HCC1806细胞，PBS重悬至适合浓度，接种于雌性Balb/c-nude小鼠皮下建立乳腺鳞状癌模型。待肿瘤平均体积约200mm3左右时，根据肿瘤大小随机分组并分别给药，各组别及其给药剂量依次为：溶媒对照组(即阴性对照,Vehicle组)：给予0.9％ Nacl注射液；ADC 5：给药剂量为3mg/kg；ADC 9：给药剂量为3mg/kg；ADC 11：给药剂量为3.16mg/kg组；ADC 17：给药剂量为3.32mg/kg。各组均采用尾静脉注射(i.v.)，在Day 0给药,共给药1次。给药后每周2次测量小鼠体重以及用游标卡尺测量肿瘤长径和短径，并按如下计算公式计算肿瘤体积：V＝0.5a×b2，其中a和b分别表示肿瘤的长径和短径，每天观察记录动物死亡情况。
采用以下公式计算肿瘤生长抑制率TGI(％)：
VT末>VT0,TGI(％)＝[1-(VT末-VT0)/(VC末-VC0)]*100％或VT末≤VT0,TGI(％)＝[1-(VT末-VT0)/VT0]*100％。
其中VT末:治疗组实验结束时肿瘤体积均值
VT0:治疗组给药开始时肿瘤体积均值
VC末:阴性对照组实验结束时肿瘤体积均值
VC0:阴性对照组给药开始时肿瘤体积均值
采用以下公式计算肿瘤相对增殖率T/C(％)：
T/C＝(VT末/VT0)/(VC末/VC0)。
本发明ADC对HCC1806乳腺鳞状癌移植瘤模型的肿瘤生长抑制作用显著。与Vehicle组相比，本发明ADC 5，ADC 9，ADC 11和ADC 17的肿瘤生长抑制率(TGI)分别为93.51％、77.70％、46.37％、51.57％。Day 25各治疗组无动物死亡及显著地动物体重降低，未见明显的药物毒性反应，治疗期间小鼠对本发明ADC耐受性良好。具体结果见表1,图1、图2。
表15人乳腺鳞状癌细胞HCC1806 CDX模型
注:TGI为肿瘤生长抑制率，T/C为相对肿瘤增殖率。
12.抗体药物偶联物对体外细胞活性的抑制作用
(1)细胞铺板：首先采用相应的培养基培养肿瘤细胞NCI-H1975、HT-29，用胰酶消化细胞，离心后重悬细胞计数，调整细胞至合适的浓度进行铺板。肿瘤细胞来源见表16。
表16：肿瘤细胞来源
细胞名称 肿瘤类型 来源
NCI-H1975 人肺腺癌细胞 南京科佰生物
HT-29 人结肠癌细胞 中国科学院细胞库
待细胞贴壁后，移除细胞中培养基，将稀释好的抗体药物偶联物ADC 19加入到上述板孔中，孵育96小时。
体外细胞活性检测：孵育结束后，每孔加入Cell Counting-LiteTM 2.0试剂(Vazyme/诺唯赞)50μL，避光振荡混匀，反应10min后即可进行检测，酶标仪(厂家：BMG,型号：PHERAStar-FS)读数。通过加入Cell Counting-LiteTM，不含细胞的培养基孔获得背景RLU,有细胞但不含化合物的培养孔获得对照RLU。细胞抑制率＝1-(样品RLU-背景RLU)/(细胞对照RLU-背景RLU)×100％，按照四参数模型拟合曲线，计算ADC 19的半数抑制浓度(IC50)。
ADC 19对NCI-H1975细胞系的半数抑制浓度(IC50)5.00μg/mL；ADC 19对HT-29细胞系的半数抑制浓度(IC50)4.56μg/mL。
结果说明本发明的药物连接体所形成的抗体药物偶联物(例如ADC19)具有明显的肿瘤细胞杀伤活性。
13.抗人Her2抗体偶联药物在NCI-N87模型的药效检测
用含10％胎牛血清的RPMI1640培养液,在37℃,5％ CO2的条件下培养NCI-N87细胞。收集指数生长期的NCI-N87细胞,PBS重悬至适合浓度,接种于雌性Balb/c-nu小鼠皮下建立胃癌模型。待肿瘤平均体积约160mm3左右时,根据肿瘤大小随机分组,依次为:溶媒对照组(即阴性对照,Vehicle组),本发明Trastuzumab-A-05 1mg/kg组,Trastuzumab-A-141mg/kg组,Trastuzumab-A-24 1mg/kg组。各组均采用尾静脉注射(i.v.),在Day0、Day7、Day14给药,共给药3次。给药后每周2次测量小鼠体重以及用游标卡尺测量肿瘤长径和短径,并按如下计算公式计算肿瘤体积:V＝0.5a×b2,其中a和b分别表示肿瘤的长径和短径,每天观察记录动物死亡情况。
本发明ADC对NCI-N87胃癌移植瘤模型的肿瘤生长抑制作用显著。与溶媒对照组相比,本发明Trastuzumab-A-05 1mg/kg组,Trastuzumab-A-14 1mg/kg组和Trastuzumab-A-24 1mg/kg组的肿瘤生长抑制率(TGI)分别为81.62％、107.38％和61.43％。Day30各治疗组无动物死亡及显著地动物体重降低,未见明显的药物毒性反应,治疗期间小鼠对本发明ADC耐受性良好。具体结果见表17。
表17人胃癌细胞NCI-N87 CDX模型
注:TGI为肿瘤生长抑制率,T/C为相对肿瘤增殖率。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解，根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims (31)

1.一种药物连接子化合物，其具有式G-M-[L-E-D]x所示结构，其中：
G是能够与特异性氨基酸或糖基发生反应的官能团或离去基团；
M是与G相连的接头，所述的M为
其中，环A为5-6元脂杂环、或5-20元芳香族环系，所述脂杂环和芳香族环系任选地被一个或多个选自氧基(＝O)、卤素、氰基、氨基、羧基、巯基和C1-6烷基的基团取代；M1选自单键和C1-20亚烷基、C2-20亚烯基、C2-20亚炔基或胺基，所述的C1-20亚烷基、C2-20亚烯基、C2-20亚炔基或胺基任选地被一个或多个适合的取代基所取代；
L是连接接头M和E之间的连接子，L选自由下述的一个或多个组成的结构：C1-6亚烷基、-N(R’)-、羰基、-O-、天然氨基酸或非天然氨基酸及其类似物、以及氨基酸组成的短肽、
其中R’代表氢、C1-6烷基或含1-10个EO单元的聚乙二醇片段；s选自1-20的整数；
E是连接L和D的结构片段，其中E为单键、-NHCH2-或选自以下结构：
D是细胞毒性药物片段；和/或
x选自1至10。
2.权利要求1所述的药物连接子化合物，所述的G选自卤素、卤代C1-6烷基、C1-6磺酰基、卤代C1-6磺酰基、卤代磺酰基、C1-6磺酸酯基、卤代C1-6磺酸酯基、C1-6亚磺酸酯基、C1-6亚砜基、硝基、叠氮基、氰基、烯基、炔基及含炔基的结构片段，所述的卤代C1-6烷基、C1-6磺酰基、卤代C1-6磺酰基、卤代磺酰基、C1-6磺酸酯基、卤代C1-6磺酸酯基、C1-6亚磺酸酯基、C1-6亚砜基、烯基、炔基及含炔基的结构片段任选地被一个或多个适合的取代基所取代。
3.权利要求1或2所述的药物连接子化合物，所述的M为其中环A为5元脂杂环、6元杂芳环、或由一个以上(例如2个)的6元芳杂环与苯环或6元杂芳环通过单键连接形成的多环，所述脂杂环任选地被一个或多个选自氧基(＝O)、卤素和C1-4烷基的基团取代；M1选自单键、C1-20亚烷基、C2-20亚烯基、C2-20亚炔基或胺基，所述的C1-20亚烷基、C2-20亚烯基、C2-20亚炔基或胺基任选地被一个或多个适合的取代基所取代。
4.权利要求1-3任一项所述的药物连接子化合物，所述的M为其中环A选自 M1选自单键和C1-6亚烷基、C2-6亚烯基、C2-6亚炔基或胺基，所述的C1-6亚烷基、C2-6亚烯基、C2-6亚炔基或胺基任选地被一个或多个适合的取代基所取代。
5.权利要求1-4任一项所述的药物连接子化合物，所述的M选自
6.权利要求5所述的药物连接子化合物，所述的M选自
7.权利要求1-4任一项所述的药物连接子化合物，所述的M选自
8.权利要求1-4任一项所述的药物连接子化合物，所述的M选自
9.权利要求1-8任一项所述的药物连接子化合物，所述的L选自由下述的一个或多个组成的结构：C1-6亚烷基、-N(R’)-、羰基、-O-、Ala、Arg、Asn、Asp、Cit、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、Val、Lys(COCH2CH2(OCH2CH2)rOCH3))、Ala-Ala、Ala-Lys、Ala-Lys(Ac)、Ala-Pro、Gly-Glu、Gly-Gly、Phe-Lys、Phe-Lys(Ac)、Val-Ala、Val-Lys、Val-Lys(Ac)、Val-Cit、Ala-Ala-Ala、Ala-Ala-Asn、Leu-Ala-Glu、Gly-Gly-Arg、Gly-Glu-Gly、Gly-Gly-Gly、Gly-Ser-Lys、Glu-Val-Ala、Glu-Val-Cit、Ser-Ala-Pro、Val-Leu-Lys、Val-Lys-Ala、Val-Lys-Gly、Gly-Gly-Phe-Gly、Gly-Gly-Val-Ala、Gly-Phe-Leu-Gly、Glu-Ala-Ala-Ala、Gly-Gly-Gly-Gly-Gly、
其中R’代表氢、C1-6烷基或含1-10个EO单元的聚乙二醇片段；s选自1-20的整数。
10.权利要求1-9任一项所述的药物连接子化合物，所述的L选自由下述的一个或多个组成的结构：C1-6亚烷基、羰基、-NH-、Ala-Ala、Ala-Lys、Ala-Pro、Gly-Glu、Gly-Gly、Phe-Lys、Val-Ala、Val-Lys、Val-Cit、Ala-Ala-Ala、Ala-Ala-Asn、Leu-Ala-Glu、Gly-Gly-Arg、Gly-Glu-Gly、Gly-Gly-Gly、Gly-Ser-Lys、Glu-Val-Ala、Glu-Val-Cit、Ser-Ala-Pro、Val-Leu-Lys、Val-Lys-Ala、Val-Lys-Gly、Gly-Gly-Phe-Gly、Gly-Gly-Val-Ala、Gly-Phe-Leu-Gly、Glu-Ala-Ala-Ala、Gly-Gly-Gly-Gly-Gly、 其中s选自1-20的整数。
11.权利要求1-10任一项所述的药物连接子化合物，所述的L选自由下述的一个或多个组成的结构：
12.权利要求1-11任一项所述的药物连接子化合物，所述的L选自以下结构：
13.权利要求1-12任一项所述的药物连接子化合物，所述的L选自以下结构：
14.权利要求1-13任一项所述的药物连接子化合物，所述的L选自以下结构：
15.权利要求1-12任一项所述的药物连接子化合物，所述的L选自以下结构：
16.权利要求1-15任一项所述的药物连接子化合物，所述的E为单键、-NHCH2-、
17.权利要求16所述的药物连接子化合物，所述的E为-NHCH2-。
18.权利要求1-17任一项所述的药物连接子化合物，选自以下结构：
19.权利要求1-18任一项所述的药物连接子化合物，选自以下结构：
20.权利要求1-19任一项所述的药物连接子化合物，所述细胞毒性药物选自微管蛋白抑制剂、DNA嵌入剂、DNA拓扑异构酶抑制剂和RNA聚合酶抑制剂。
21.权利要求1-20任一项所述的药物连接子化合物，所述微管蛋白抑制剂为奥瑞他汀类化合物或美登素类化合物；所述DNA嵌入剂为吡咯并苯二氮卓PBD；所述DNA拓扑异构酶抑制剂为拓扑异构酶I抑制剂(例如，喜树碱、羟基喜树碱、9-氨基喜树碱、SN-38、伊立替康、拓扑替康、贝洛替康、或卢比替康)或拓扑异构酶II抑制剂(例如，阿霉素、PNU-159682、多卡米星、柔红霉素、米托蒽醌、鬼臼毒素、或依托泊苷)；所述RNA聚合酶抑制剂为α-鹅膏草碱(α-amanitin)或其药学上可接受的盐、酯或类似物。
22.权利要求1-21任一项所述的药物连接子化合物，所述细胞毒性药物选自式I、式II所示化合物、或式I、式II所示化合物的药学上可接受的盐、酯、立体异构体、互变异构体或前药：
其中，R1,R2各自独立地选自C1-6烷基和卤素；
R3选自H和-CO-CH2OH；
R4和R5各自独立地选自H、卤素和羟基；或者R4和R5与相连碳原子连接成5-6元含氧杂环；
R6选自氢或-C1-4亚烷基-NRaRb；
R7选自C1-6烷基和-C1-4亚烷基-NRaRb；
其中Ra、Rb在每次出现时各自独立地选自H、C1-6烷基、-SO2-C1-6烷基和-CO-C1-6烷基。
23.权利要求1-22任一项所述的药物连接子化合物，所述细胞毒性药物选自以下化合物或所述化合物的药学上可接受的盐、酯、立体异构体、互变异构体或前药：
24.权利要求1-23任一项所述的药物连接子化合物，所述细胞毒性药物选自以下化合物或所述化合物的药学上可接受的盐、酯、立体异构体、互变异构体或前药：
25.权利要求1-24任一项所述的药物连接子化合物，D选自以下结构：
26.权利要求1-25任一项所述的药物连接子化合物，选自下示的A-01～A-34，B-01～B-07，C-01～C-28：
27.权利要求1-26任一项所述的药物连接子化合物，所述的药物连接子化合物可任选地被一个或多个适合的取代基所取代。
28.权利要求27所述的药物连接子化合物，具有如下结构：
R10、R11、R12独立地选自氢、C1-6烷基、C3-6环烷基、C6-10芳基、苄基、羟基取代的苄基和吲哚基-C1-6烷基-；
R13和R14各自独立选自氢、C1-6烷基、C3-6环烷基和4-6元杂环基；
R15选自氢、C1-6烷基、C3-6环烷基、卤代C1-6烷基、C1-6烷基-O-C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基和3-6元杂环烷基；或者，R15与NH形成4-7元环。
29.权利要求1-28任一项所述的药物连接子化合物在制备偶联物(例如抗体药物偶联物)中的用途。
30.化合物，具有如下结构：
其中，X选自苄氧羰基、叔丁氧羰基、芴甲氧羰基、烯丙氧羰基、三甲基硅乙氧羰基、甲氧羰基、乙氧羰基、邻苯二甲酰基、对甲苯磺酰基、三氟乙酰基、硝基苯磺酰基、苯甲酰基、特戊酰基、三苯甲基、4-甲氧基苯基二苯基甲基、二甲氧基三苯甲基、2,4-二甲氧基苄基、对甲氧基苄基和苄基；所述的D如权利要求1或20-25任一项中所定义。
31.权利要求30所述的化合物在制备权利要求1-28任一项所述的药物连接子化合物中的用途。
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