ES2754348T3 - Conjugado de (anticuerpo anti-HER2)-fármaco - Google Patents
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- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
Abstract
Un conjugado de fármaco-anticuerpo en el que un compuesto antitumoral representado por la siguiente fórmula:**Fórmula** se conjuga con un anticuerpo anti-HER2 en form de una estructura seleccionada entre el siguiente grupo: -CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-VK-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -C(=O)-cic.Hex(1,4)-CH2-(N-li-3-diminiccuS)-S-CH2CH2-C(=O)-G GFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX ), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-VC-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CMe(-H) -C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH(-Me) -C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2C(-Me)2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-NH-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-(NH -DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2C H2-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-NH-CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-N(-Me)-CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-N(-CH2CH2-OH)-CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-N(-CH2-COOH)-CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-N(-Me)-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-N(-CH2CH2-OH)-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-N(-CH2-COOH)-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-NH-CH(-CH2-OH)-C(=O)-(NHDX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-NH-CH(-CH2-COOH)-C(=O)-(NHDX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-N(-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-OH)-CH2-C(=O)- GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH(-CH2CH2-COOH)-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-GGFG-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGF-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-KGGFG-NH-CH2CH2CH2 -C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-KGGFG-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFGG-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFGGG-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2 -C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- (NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2 -O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-DGGFGNH- CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O) -(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2 -C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- (NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2 -O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-DGGFGES NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-EGGFG-NH-CH2CH2CH2 -C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DDGGFG-NH-CH2CH2CH 2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-KDGGFG-NH-CH2CH2CH 2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2C (M e)2-C(=O)-(NH-DX), -C(=O)-cic.Hex(1,4)-CH2-(N-li-3-diminiccuS)-S-CH2CH2-C(=O)-D GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2CH2 CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH(-CH2CH2-COOH)-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH 2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-[N(-CH2-COOH)]-CH2-(C=O)-GGFG-NH -CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-N[-CH2-COOH]-CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2- C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-DGGFG-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-DGGFG-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-DG-GFG- (NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-SGGFG-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DdGGFG-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-EGGFG-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-NH-[CH(-CH2-COOH)] -CH2-(C=O)-GGFG-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFS-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2 -C(=O)-GGFG-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-[N(-CH2-COOH)]-CH2-(C=O)-GGFG-(N H-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-[N(-CH2-COOH)]-CH2-(C=O)-GGFG-(NH-DX), -C(=O)-cic.Hex(1,4)-CH2-(N-li-3-diminiccuS)-S-CH2CH2-C(=O)-G GFG-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFGS-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFGGE-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFGGE-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFGGGFG-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGMeGFG-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-NH-[CH(-CH2-COOH)] -CH2-O-CH2-(C=O)-GFG-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGMeGFG-NH-CH2CH2CH 2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-NH-[CH(-CH2-COOH)]-CH2-O-CH2-(C=O)-GFG-NH-CH2CH2CH2- C(=O)-(NH-DX), - (Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2-O-CH2 -C(=O)-(NH-DX) en el que -(Succinimid-3-il-N)- tiene una estructura representada por la siguiente fórmula:**Fórmula** que está conectada al anticuerpo en la posición 3 del mismo y está conectada al grupo metileno en la estructura del enlazador que contiene esta estructura en el átomo de nitrógeno en la posición 1, -(NH-DX) es un grupo representado por la siguiente fórmula:**Fórmula** en la que el átomo de nitrógeno del grupo amino en la posición 1 es la posición de conexión.
Description
DESCRIPCIÓN
Conjugado de (anticuerpo anti-HER2)-fármaco
Campo técnico
La presente invención se refiere a un conjugado de fármaco-anticuerpo que tiene un fármaco antitumoral conjugado con un anticuerpo anti-HER2 mediante un resto de la estructura del enlazador, siendo el conjugado útil como un fármaco antitumoral.
Antecedentes de la técnica
Un conjugado de fármaco anticuerpo (ADC) que tiene un fármaco con citotoxicidad conjugado con un anticuerpo, cuyo antígeno se expresa en la superficie de las células cancerosas y que también se une a un antígeno con capacidad de internalización celular y que por lo tanto puede administrar el fármaco selectivamente a las células cancerosas, se espera por tanto que provoque la acumulación del fármaco dentro de las células cancerosas y elimine a las células cancerosas (véanse las referencias no de patente 1 a 3). Como ADC, Mylotarg (marca registrada; Gemtuzumab ozogamicina), en el que se conjuga caliqueamicina con un anticuerpo anti-CD33, está aprobado como un agente terapéutico para la leucemia mieloide aguda. Además, Adcetris (marca registrada; Brentuximab vedotina), en el que auristatina E está conjugada con un anticuerpo anti-CD30, se ha aprobado recientemente como un agente terapéutico para el linfoma de Hodgkin y la leucemia anaplásica de células grandes (véase la referencia no de patente 4). Los fármacos contenidos en los ADC que se han aprobado hasta ahora se dirigen al ADN o a la tubulina.
Con respecto a un agente antitumoral, se conocen los derivados de la camptotecina, compuestos de bajo peso molecular que inhiben a la topoisomerasa I para mostrar un efecto antitumoral. Entre estos, se conoce un compuesto antitumoral representado por la fórmula siguiente (exatecán, nombre químico: (1S,9S)-1-amino-9-etil-5-fluoro-2,3-dihidro-9-hidroxi-4-metil-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-10,13(9H,15H)-diona) (referencias de patente 1 y 2).
[ F ó r m u l a 1]
A diferencia del irinotecán, actualmente usado en escenarios clínicos, este compuesto no requiere activación por una enzima para mostrar su efecto antitumoral. Además, se observó que su actividad inhibidora en la topoisomerasa I era mayor que SN-38, que es la sustancia farmacéuticamente activa principal del irinotecán y el topotecán, también usada en escenarios clínicos, y se confirmó una mayor actividad citocida in vitro contra diversas células cancerosas. En particular, se confirmó que tiene efecto contra células cancerosas que tienen resistencia a SN-38 o similares debido a la expresión de P-glucoproteína. Además, en un modelo de tumor trasplantado por vía subcutánea en ratones, se confirmó que tiene un potente efecto antitumoral y por lo tanto, se ha sometido a estudios clínicos, pero aún no se ha comercializado (véanse las referencias no de patente 5 a 10). Sigue sin estar claro si el exatecán actúa o no eficazmente como un ADC.
DE-310 es un complejo en el que se conjuga exatecán con un polímero de carboximetildextrano polialcohol biodegradable por medio de un espaciador peptídico de GGFG (referencia de patente 3). Al convertir el exatecán en la forma de un profármaco polimérico, puede mantenerse una propiedad de alta retención en sangre y también se aumenta de manera pasiva una propiedad de alto direccionamiento a áreas tumorales utilizando la permeabilidad aumentada de los vasos sanguíneos recientemente formados en los tumores y la propiedad de retención en los tejidos tumorales. Con DE-310, mediante la escisión del espaciador peptídico por una enzima, se liberan continuamente como sustancia activa principal exatecán y exatecán con glicina conectado a un grupo amino y como resultado, se mejora la farmacocinética. Se ha observado que DE-310 tiene una mayor eficacia que exatecán administrado solo, aunque la dosis total de exatecán contenida en D310 es menor que en el caso de la administración de exatecán solo, de acuerdo con varios modelos de evaluación de tumores en estudios no clínicos. Se ha llevado a cabo un estudio clínico para
DE-310 y también se han confirmado casos eficaces, incluyendo un estudio que sugiere que la sustancia activa principal se acumula en los tumores más que en los tejidos normales. Sin embargo, también hay un estudio que indica que la acumulación de DE-310 y la sustancia activa principal en tumores no es muy diferente a la acumulación en tejidos normales en seres humanos y por lo tanto, no se observa direccionamiento pasivo en seres humanos (véanse las referencias no de patente 11 a 14). Como resultado, tampoco se ha comercializado DE-310 y sigue sin estar claro si el exatecán actúa o no de manera eficaz como un fármaco dirigido para dicho direccionamiento.
También se conoce como compuesto relacionado con DE-310 un complejo en el que la estructura de restos representada por -NH-(CH2)4-C(=O)- se inserta entre el espaciador de -GGFG- y el exatecán para formar - GGFG-NH-(CH2)4-C(=O)- usado como estructura espaciadora (referencia de patente 4). Sin embargo, se desconoce por completo el efecto antitumoral de dicho complejo.
HER2 es uno de los productos de un oncogén de tipo receptor de factor de crecimiento típico identificado como oncogén relacionado con receptor de factor de crecimiento epidérmico humano 2 y es una proteína receptora transmembrana que tiene un peso molecular de 185 kDa y que tiene un dominio de tirosina cinasa (referencia no de patente 15). La secuencia de ADN y la secuencia de aminoácidos de HER2 se han desvelado en una base de datos pública y pueden citarse, por ejemplo, con el n.° de referencia M11730 (GenBank), NP_004439.2 (NCBI) o similares.
HER2 (neu, ErbB-2) es uno de los miembros de la familia de EGFR (receptor de factor de crecimiento epidérmico) y se activa mediante autofosforilación en restos de tirosina intracelulares mediante su formación de homodímero o formación de heterodímero con otro receptor de EGFR, HER1 (EGFR, ErbB-1), HER3 (ErbB-3) o HER4 (ErbB-4) (referencias no de patente 16 a 18), desempeñando de este modo un papel importante en el crecimiento celular, la diferenciación y la supervivencia en células normales y células cancerosas (referencias no de patente 19 y 20). HER2 se sobreexpresa en diversos tipos de cáncer, tales como cáncer de mama, cáncer gástrico y cáncer de ovarios (referencias no de patente 21 a 26) y se ha comunicado que es un factor de pronóstico negativo para el cáncer de mama (referencias no de patente 27 y 28).
Trastuzumab es un anticuerpo humanizado del anticuerpo 4D5 de ratón anti-HER2 (referencia no de patente 29 y referencia de patente 5), nombrado como anticuerpo monoclonal anti-HER2 humanizado recombinante (huMAb4D5-8 , rhuMAb HER2, Herceptin(R)) (referencia de patente 6 ). Trastuzumab se une específicamente al dominio extracelular IV de HER2 e induce citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) o ejerce un efecto anticanceroso mediante la inhibición de la transducción de señales a partir de HER2 (referencias no de patente 30 y 31). Trastuzumab es altamente eficaz para tumores que sobreexpresan HER2 (referencia no de patente 32) y como tal, se lanzó en 1999 en los Estados Unidos y en 2001 en Japón como agente terapéutico para pacientes con cáncer de mama metastásico que sobreexpresa HER2.
Aunque se ha demostrado adecuadamente el efecto terapéutico de trastuzumab en el cáncer de mama (referencia no de patente 33), supuestamente aproximadamente un 15 % de los pacientes con cáncer de mama que sobreexpresa HER2 que reciben una gran variedad de terapias convencionales contra el cáncer son sensibles al trastuzumab. Aproximadamente un 85 % de los pacientes de esta población no muestran respuesta o muestran una respuesta débil al tratamiento con trastuzumab.
Por lo tanto, se ha reconocido la necesidad de un agente terapéutico que se dirija a enfermedades relacionadas con la expresión de HER2 para pacientes afectados de tumores que sobreexpresan HER2 con una respuesta nula o débil a trastuzumab o trastornos relacionados con HER2. Se han desarrollado T-DM1 (trastuzumab emtansina, Kadcyla (R); referencia no de patente 34) que tiene un fármaco antitumoral conjugado a trastuzumab a través de una estructura enlazadora y pertuzumab (Perjeta(R); referencia no de patente 35 y referencia de patente 7) diseñado para dirigirse al dominio extracelular II de HER2 y para inhibir la formación de heterodímero. Sin embargo, su sensibilidad, fuerza de actividad e indicaciones aceptadas siguen siendo insuficientes y hay necesidades médicas no satisfechas para el direccionamiento terapéutico a HER2.
La referencia de patente 8 desvela conjugados de polietilenglicol multibrazo de 7-etil-10-hidroxicamptotecina para el tratamiento de cánceres positivos a HER2 en combinación con trastuzumab (Herceptin(R)).
La referencia no de patente 36 desvela ADC en los que se unen análogos de camptotecina a anticuerpos monoclonales (anti-CD30, antiCD70, anti-LewisY) a través de enlazadores a base de dipéptido de Val-Cit o de glucurónido.
rLista de citas!
Referencias de patente!
[Referencia de patente 1] Patente japonesa abierta a inspección pública n.° 5-59061
[Referencia de patente 2] Patente japonesa abierta a inspección pública n.° 8-337584
[Referencia de patente 3] Publicación internacional n.° WO 1997/46260
[Referencia de patente 4] Publicación internacional n.° WO 2000/25825
[Referencia de patente 5] Patente de los Estados Unidos n.° 5677171
[Referencia de patente 6 ] Patente de los Estados Unidos n.° 5821337
[Referencia de patente 7] Publicación internacional n.° WO 01/00244
[Referencia de patente 8] Publicación internacional n.° WO 2011/011474
[Referencias no de patente]
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Problema técnico
Con respecto al tratamiento de tumores mediante anticuerpos, puede observarse un efecto antitumoral insuficiente incluso cuando el anticuerpo reconoce a un antígeno para unirse a células tumorales y hay casos en los que se necesita un anticuerpo antitumoral más eficaz. Además, muchos compuestos antitumorales de bajo peso molecular tienen problemas de seguridad, tales como efectos secundarios y toxicidad, incluso en caso de que los compuestos tengan un efecto antitumoral. Sigue siendo un objetivo lograr un efecto terapéutico superior mejorando adicionalmente la seguridad. Por lo tanto, un objeto de la presente invención es proporcionar un fármaco antitumoral que tenga un excelente efecto terapéutico, que sea excelente en cuanto a su efecto antitumoral y su seguridad.
Solución al problema
Los inventores han considerado que un anticuerpo anti-HER2 es un anticuerpo que es capaz de dirigirse a células tumorales, es decir, que tiene la propiedad de reconocer células tumorales, la propiedad de unirse a células tumorales, la propiedad de internalizarse en las células tumorales, actividad citotóxica contra células tumorales, actividad citocida contra células tumorales o similares; por lo tanto, cuando se convierte el compuesto antitumoral exatecán en un conjugado de anticuerpo-fármaco, a través de un resto de estructura de enlazador, mediante conjugación a este anticuerpo, el compuesto antitumoral puede administrarse de manera más segura a las células tumorales para mostrar de manera específica el efecto antitumoral del compuesto en las células tumorales y por lo tanto, puede mostrarse de manera segura el efecto antitumoral y también puede esperarse un efecto citocida potenciado del anticuerpo anti-HER2 y puede reducirse la dosis del compuesto antitumoral en comparación con el caso de administrar el compuesto solo y por lo tanto, puede aliviarse la influencia del compuesto antitumoral en las células normales, lográndose de este modo una mayor seguridad.
A este respecto, los inventores crearon un enlazador con una estructura específica y tuvieron éxito a la hora de obtener un conjugado de anticuerpo-fármaco en el que se conjugan entre sí el anticuerpo anti-HER2 y exatecán a través del enlazador y confirmaron un excelente efecto antitumoral mostrado por el conjugado, completando de este modo la presente invención.
Específicamente, la presente invención se refiere a lo siguiente.
[1] Un conjugado de anticuerpo-fármaco, en el que un compuesto antitumoral representado por la siguiente fórmula:
[ F ó r m u l a 2]
se conjuga a un anticuerpo anti-HER2 a través de un enlazador seleccionado entre el siguiente grupo:
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N) -CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-VK-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-C(=O)-cic.Hex(1,4)-CH2-(N-li-3-diminiccuS)-S-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-VC-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CMe(-H)-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N) -CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH(-Me)-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O) -GGFG-NH-CH2CH2C(-Me)2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-NH-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-NH-CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-N(-Me)-CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-N(-CH2CH2-OH)-CH2-C(=O)-(NH- DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-N(-CH2-COOH)-CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-N(-Me)-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), - (Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-N(-CH2CH2-OH)-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
- (Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-N(-CH2-COOH)-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
- (Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-NH-CH(-CH2-OH)-C(=O)-(NH-DX),
- (Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-NH-CH(-CH2-COOH)-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
- (Succinimid-3-il-N) -CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-N(-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-OH)-CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH(-CH2CH2-COOH)-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-GGFG-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGF-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-KGGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-KGGFG-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFGG-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFGGG-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
- (Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
- (Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
- (Succinimid-3-il-N) -CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
- (Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-EGGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DDGGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-KDGGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2C(Me)2-C(=O)-(NH-DX),
-C(=O)-cic.Hex(1,4)-CH2-(N-li-3-diminiccuS)-S-CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH(-CH2CH2-COOH)-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-[N(-CH2-COOH)]-CH2-(C=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), - (Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-N[-CH2-COOH]-CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-DGGFG-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N) -CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-DGGFG-(NH-DX),
- (Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-DGGFG-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-SGGFG-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N) -CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DdGGFG-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-EGGFG-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-NH-[CH(-CH2-COOH)]-CH2-(C=O)-GGFG-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFS-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-[N(-CH2-COOH)]-CH2-(C=O)-GGFG-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N) -CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-[N(-CH2-COOH)]-CH2-(C=O)-GGFG-(NH- DX), -C(=O)-cic.Hex(1,4)-CH2-(N-li-3-diminiccuS)-S-CH2CH2-C(=O)-GGFG-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFGS-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFGGE-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFGGE-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFGGGFG-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGMeGFG-(NH-DX),
-(Succimmid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-NH-[CH(-CH2-COOH)]-CH2-O-CH2-(C=O)-GFG-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGMeGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
- (Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-NH-[CH(-CH2-COOH)]-CH2-O-CH2-(C=O)-GFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)
en el que -(Succinimid-3-il-N)- tiene una estructura representada por la siguiente fórmula:
que está conectado al anticuerpo en la posición 3 del mismo y está conectado al grupo metileno en la estructura del enlazador que contiene esta estructura en el átomo de nitrógeno en la posición 1,
-(NH-DX) es un grupo representado por la siguiente fórmula:
en la que el átomo de nitrógeno del grupo amino en la posición 1 es la posición de unión.
-(N-li-3-diminiccuS)- tiene una estructura representada por la siguiente fórmula:
que está conectado en la posición 3 del mismo y está conectado al grupo metileno en la estructura del enlazador que contiene esta estructura en el átomo de nitrógeno en la posición 1, cic.Hex(1,4) representa un grupo 1,4-ciclohexileno.
La presente invención se refiere además a cada uno de los siguientes.
[2] El conjugado de anticuerpo-fármaco de acuerdo con [1], en el que el número medio de unidades del compuesto antitumoral conjugadas por molécula de anticuerpo se encuentra en el intervalo de 1 a 10.
[3] El conjugado de anticuerpo-fármaco de acuerdo con [1], en el que el número medio de unidades del compuesto antitumoral conjugadas por molécula de anticuerpo se encuentra en el intervalo de 1 a 8.
[4] El conjugado de anticuerpo-fármaco de acuerdo con [1], en el que el número medio de unidades del compuesto antitumoral conjugadas por molécula de anticuerpo se encuentra en el intervalo de 3 a 8.
[5] Una composición farmacéutica que contiene el conjugado de anticuerpo-fármaco de acuerdo con [1], una sal del mismo o un hidrato del mismo como componente activo y un componente de formulación farmacéuticamente aceptable.
[6] La composición farmacéutica de acuerdo con [5], que es para su uso contra el cáncer de pulmón, cáncer urotelial, cáncer colorrectal, cáncer de próstata, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, cáncer de mama, cáncer de vejiga, cáncer gástrico, tumor del estroma gastrointestinal, cáncer de cuello de útero, cáncer de esófago, carcinoma de células escamosas, cáncer peritoneal, cáncer de hígado, cáncer hepatocelular, cáncer de colon, cáncer rectal, cáncer colorrectal, cáncer de endometrio, cáncer de útero, cáncer de glándula salival, cáncer de riñón, cáncer vulvar, cáncer de tiroides, cáncer de pene, leucemia, linfoma maligno, plasmacitoma, mieloma o sarcoma.
[7] Un compuesto intermedio de fármaco-enlazador seleccionado entre el siguiente grupo:
(maleimid-N- l) -CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG NH-CH2CMe(-H)-C(=O)-(NH-DX),
(maleimid-N- l)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-l NH-CH2CH(-Me)-C(=O)-(NH-DX),
(maleimid-N- l) -CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG NH-CH2CH2C(-Me)2-C(=O)-(NH-DX),
(maleimid-N- l)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG- NH-CH2CH2-NH-C(=O)-(NH-DX),
(maleimid-N- l)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG- NH-CH2CH2-(NH-DX),
(maleimid-N- l) -CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG -NH-CH2CH2CH2CH2-(NH-DX),
(maleimid-N- l)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG- NH-CH2CH2-NH-CH2-C(=O)-(NH-DX),
(maleimid-N- l)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG- NH-CH2CH2-N(-Me)-CH2-C(=O)-(NH-DX),
(maleimid-N- l) -CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG -NH-CH2CH2-N(-CH2CH2-OH)-CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N- l) -CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG -NH-CH2CH2-N(-CH2-COOH)-CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N- l)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG- NH-CH2CH2-N(-Me)-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N- l)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG NH-CH2CH2-N (-CH2CH2-OH)-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(maleimid-N-il) -CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-N(-CH2-COOH)-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-NH-CH(-CH2-OH)-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-NH-CH(-CH2-COOH)-C(=O)-(NH-DX),
(maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2C(Me)2-C(=O)-(NH-DX),
(maleimid-N-il)-CH2CH2-[N(-CH2-COOH)]-CH2-(C=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-N[-CH2-COOH]-CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(maleimid-N- l)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFS-(NH-DX),
(maleimid-N- l)-CH2CH2-[N(-CH2-COOH)]-CH2-(C=O)-GGFG-(NH-DX),
(maleimid-N- l)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-[N(-CH2-COOH)]-CH2-(C=O)-GGFG-(NH-DX), (maleimid-N- l)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFGS-(NH-DX),
(maleimid-N- l)-CH2CH2-C(=O)-GGFGGE-(NH-DX),
(maleimid-N- l)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGMeGFG-(NH-DX),
(maleimid-N- l)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-NH-[CH(-CH2-COOH)]-CH2-O-CH2-(C=O)-GFG-(NH-DX), (maleimid-N- l)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGMeGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) y
(maleimid-N- l)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-NH-[CH(-CH2-COOH)]-CH2-O-CH2-(C=O)-GFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
en el que (maleimid-N-il)- es un grupo representado por la siguiente fórmula:
en la que el átomo de nitrógeno es la posición de conexión, y -(NH-DX) es un grupo obtenido a partir de un compuesto representado por la siguiente fórmula:
en la que el átomo de nitrógeno del grupo amino en la posición 1 es la posición de unión.
[8] Un compuesto seleccionado entre un grupo de
NH2-CH2CMe(-H)-C(=O)-(NH-DX),
NH2-CH2CH(-Me)-C(=O)-(NH-DX),
NH2-CH2CH2C(-Me)2-C(=O)-(NH-DX),
NH2-CH2CH2-NH-CH2-C(=O)-(NH-DX),
NH2-CH2CH2-N(-Me)-CH2-C(=O)-(NH-DX),
NH2-CH2CH2-N(-CH2CH2-OH)-CH2-C(=O)-(NH-DX),
NH2-CH2CH2-N(-CH2-COOH)-CH2-C(=O)-(NH-DX),
NH2-CH2CH2-N(-Me)-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
NH2-CH2CH2-N(-CH2CH2-OH)-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
o
NH2-CH2CH2-N(-CH2-COOH)-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
en el que -(NH-DX) es un grupo representado por la siguiente fórmula:
en la que el átomo de nitrógeno del grupo amino en la posición 1 es la posición de unión.
Efectos ventajosos de la invención
Puede lograrse un efecto antitumoral y una seguridad excelentes con un conjugado de anticuerpo anti-HER2-fármaco que tiene el compuesto antitumoral exatecán conjugado a través de un enlazador con una estructura específica. Breve descripción de los dibujos
La figura 1 muestra una secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de un anticuerpo monoclonal humanizado anti-HER2 (SEQ ID NO: 1).
La figura 2 muestra una secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de un anticuerpo monoclonal anti-HER2 (SEQ ID NO: 2).
La figura 3 es un diagrama que muestra el efecto antitumoral de un conjugado de anticuerpo-fármaco (61), (62), (76) o trastuzumab en un ratón desnudo con trasplante subcutáneo de células de la línea celular de cáncer de mama humano, KPL-4. En el dibujo, el eje de abscisas representa los días después de la inoculación del tumor y el eje de ordenadas representa el volumen tumoral.
La figura 4 es un diagrama que muestra el efecto antitumoral de un conjugado de anticuerpo-fármaco (77), (88), (143) o trastuzumab emtansina en un ratón desnudo con trasplante subcutáneo de células de la línea celular de cáncer gástrico humano, NCI-N87. En el dibujo, el eje de abscisas representa los días después de la inoculación del tumor y el eje de ordenadas representa el volumen tumoral.
La figura 5 es un diagrama que muestra el efecto antitumoral de un conjugado de anticuerpo-fármaco (77), (88), (143) trastuzumab o trastuzumab emtansina en un ratón desnudo con trasplante subcutáneo de células de la línea celular de cáncer de mama humano, JIMT-1. En el dibujo, el eje de abscisas representa los días después de la inoculación del tumor y el eje de ordenadas representa el volumen tumoral.
Descripción de las realizaciones
En lo sucesivo en el presente documento, se describen los modos preferidos para llevar a cabo la invención con referencia a los dibujos. Las realizaciones descritas a continuación se proporcionan simplemente para ilustrar un ejemplo de una realización típica de la presente invención y no pretenden limitar el ámbito de la presente invención. El conjugado de anticuerpo anti-HER2-fármaco de la presente invención es un fármaco antitumoral en el que se conjuga un anticuerpo anti-HER2 a un compuesto antitumoral mediante un resto de estructura de enlazador y se explica detalladamente más adelante en el presente documento.
[Anticuerpo]
El anticuerpo anti-HER2 usado en el conjugado de anticuerpo anti-HER2-fármaco de la presente invención puede proceder de cualquier especie y los ejemplos preferidos de la especie pueden incluir seres humanos, ratas, ratones y
conejos. En caso de que el anticuerpo proceda de una especie distinta a la humana, preferentemente, se quimieriza o humaniza usando una técnica bien conocida. El anticuerpo de la presente invención puede ser un anticuerpo policlonal o un anticuerpo monoclonal y es preferentemente un anticuerpo monoclonal.
El anticuerpo anti-HER2 es un anticuerpo que es capaz de dirigirse a células tumorales, es decir, posee la propiedad de reconocer células tumorales, la propiedad de unirse a una célula tumoral, la propiedad de internalizarse en una célula tumoral, actividad citocida contra células tumorales o similares y puede conjugarse con un fármaco que tiene actividad antitumoral a través de un enlazador para formar un conjugado de anticuerpo-fármaco.
La actividad de unión del anticuerpo contra las células tumorales puede confirmarse usando citometría de flujo. La internalización del anticuerpo en células tumorales puede confirmarse usando (1) un ensayo de visualización de un anticuerpo incorporado en células bajo un microscopio de fluorescencia usando un anticuerpo secundario (marcado fluorescentemente) que se une al anticuerpo terapéutico (Cell Death and Differentiation (2008) 15, 751-761), (2) un ensayo para medir la intensidad de la fluorescencia incorporada a las células utilizando la unión de un anticuerpo secundario (marcado fluorescentemente) al anticuerpo terapéutico (Molecular Biology of the Cell, Vol. 15, 5268-5282, diciembre de 2004) o (3) un ensayo Mab-ZAP que utiliza la unión de una inmunotoxina al anticuerpo terapéutico en el que se libera la toxina tras su incorporación en células para inhibir el crecimiento celular (Bio Techniques 28: 162-165, enero de 2000). Como inmunotoxina, puede usarse un complejo de proteína recombinante de un dominio catalítico de toxina de difteria y proteína G.
La actividad antitumoral del anticuerpo puede confirmarse in vitro determinando la actividad inhibidora contra el crecimiento celular. Por ejemplo, se cultiva una línea celular de cáncer que sobreexpresa una proteína diana para el anticuerpo y se añade el anticuerpo a diversas concentraciones en el sistema de cultivo para determinar una actividad inhibidora contra la formación de focos, la formación de colonias y el crecimiento de esferoides. La actividad antitumoral puede confirmarse in vivo, por ejemplo, administrando el anticuerpo a un ratón desnudo con una línea de células tumorales trasplantadas que expresa altamente la proteína diana y determinando el cambio en la célula cancerosa.
Debido a que el compuesto conjugado en el conjugado de anticuerpo-fármaco ejerce un efecto antitumoral, se prefiere, pero no es esencial que el propio anticuerpo tenga un efecto antitumoral. Con el objetivo de ejercer de manera específica y selectiva la actividad citotóxica del compuesto antitumoral contra células tumorales, es importante y también se prefiere que el anticuerpo tenga la propiedad de internalizarse para migrar al interior de las células tumorales.
El anticuerpo anti-HER2 puede obtenerse mediante un procedimiento conocido en la técnica. Por ejemplo, el anticuerpo de la presente invención puede obtenerse usando un procedimiento llevado a cabo habitualmente en la técnica, que implica inmunizar animales con un polipéptido antigénico y recoger y purificar los anticuerpos producidos in vivo. El origen del antígeno no está limitado a los seres humanos y se pueden inmunizar los animales con un antígeno procedente de un animal no humano, tal como un ratón, una rata y similares. En este caso, puede evaluarse la reactividad cruzada de la unión de los anticuerpos al antígeno heterólogo obtenido para seleccionar anticuerpos aplicables a una enfermedad humana.
Como alternativa, se fusionan las células productoras de anticuerpos que producen anticuerpos contra el antígeno con células de mieloma de acuerdo con un procedimiento conocido en la técnica (por ejemplo, Kohler y Milstein, Nature (1975) 256, págs. 495-497; y Kennet, R. ed., Monoclonal Antibodies, p. 365-367, Plenum Press, N.Y. (1980)) para establecer hibridomas, a partir de los cuales se pueden obtener a su vez anticuerpos monoclonales.
El antígeno puede obtenerse modificando por ingeniería genética células hospedadoras para que produzcan un gen que codifica la proteína del antígeno. Específicamente, se preparan vectores que permiten la expresión del gen del antígeno y se transfieren a células hospedadoras, de tal forma que se expresa el gen. El antígeno preparado de este modo puede purificarse. El anticuerpo también puede obtenerse mediante un procedimiento de inmunización de animales con las células que expresan el antígeno modificadas por ingeniería genética anteriormente descritas o una línea celular que expresa el antígeno.
El anticuerpo anti-HER2 puede obtenerse mediante un procedimiento conocido en la técnica.
Los anticuerpos anti-HER2 que pueden usarse en la presente invención no están particularmente limitados y preferentemente son, por ejemplo, aquellos que tienen propiedades como las que se describen a continuación.
(1) Un anticuerpo anti-HER2 que tiene las siguientes propiedades:
(a) unión específica a HER2 y
(b) tiene actividad de internalización en células que expresan HER2 mediante la unión a HER2.
(2) El anticuerpo de acuerdo con (1) anterior, en el que el anticuerpo se une al dominio extracelular de HER2. (3) El anticuerpo de acuerdo con (1) o (2) anteriores, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
(4) El anticuerpo de acuerdo con cualquiera de (1) a (3) anteriores, en el que el anticuerpo tiene actividad de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) y/o actividad de citotoxicidad dependiente de complemento (CDC).
(5) El anticuerpo de acuerdo con cualquiera de (1) a (4) anteriores, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal de ratón, un anticuerpo monoclonal quimérico o un anticuerpo monoclonal humanizado.
(6 ) El anticuerpo de acuerdo con cualquiera de (1) a (5) anteriores, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal humanizado que comprende una cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 1 y una cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 2.
(7) El anticuerpo de acuerdo con cualquiera de (1) a (6 ) anteriores, en el que el anticuerpo carece de un resto de lisina en el extremo carboxilo de la cadena pesada.
(8 ) El anticuerpo de acuerdo con (7) anterior, en el que el anticuerpo comprende una cadena pesada que consiste en una secuencia de aminoácidos que consiste en los restos de aminoácido 1 a 449 de la SEQ ID NO: 1 y una cadena ligera que consiste en una secuencia de aminoácidos que consiste en los restos de aminoácido 1 a 214 de la SEQ ID NO: 2.
(9) Un anticuerpo obtenido mediante un procedimiento para producir el anticuerpo de acuerdo con cualquiera de (1 ) a (8 ) anterior, comprendiendo el procedimiento las etapas de: cultivar una célula hospedadora transformada con un vector de expresión que contiene un polinucleótido que codifica el anticuerpo; y recoger el anticuerpo de interés de los cultivos obtenidos en la etapa anterior.
En lo sucesivo en el presente documento, se describe el anticuerpo anti-HER2 usado en la invención.
Los términos "cáncer" y "tumor" como se usan en el presente documento se utilizan con el mismo significado.
El término "gen" como se usa en el presente documento incluye no solo ADN, sino también el ARNm del mismo, ADNc del mismo y ARNc del mismo.
El término "polinucleótido" como se usa en el presente documento se utiliza con el mismo significado que un ácido nucleico e incluye también ADN, ARN, sondas, oligonucleótidos y cebadores.
Los términos "polipéptido", "proteína" y "proteína" como se usan en el presente documento se usan de manera indistinta.
El término "célula" como se usa en el presente documento incluyen también células de un individuo animal y células cultivadas.
El término "HER2" como se usa en el presente documento se usa con el mismo significado que proteína HER2.
Los ejemplos del anticuerpo anti-HER2 como se usa en el presente documento pueden incluir, pero sin limitarse particularmente, pertuzumab (Publicación Internacional de Patente n.° WO 01/00245) y trastuzumab (Patente de los Estados Unidos n.° 5821337). Se prefiere trastuzumab. Sin embargo, el anticuerpo anti-HER2 de la presente invención no se limita a este, en tanto que sea un anticuerpo anti-HER2 que se una específicamente a HER2 y más preferentemente, que tenga actividad de internalizarse en células que expresan HER2 mediante unión a HER2.
El término "trastuzumab", como se usa en el presente documento también se denomina HERCEPTIN(R), huMAb4D5-8 o rhuMAb4D5-8 y es un anticuerpo humanizado que comprende una cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos que consiste en los restos de aminoácido 1 a 449 de la SEQ ID NO: 1(figura 1) y una cadena ligera que consiste en una secuencia de aminoácidos que consiste en los restos de aminoácido 1 a 214 de la SEQ ID NO: 2 (figura 2 ).
La expresión "unión específica", como se usa en el presente documento, significa unión que no es adsorción inespecífica. Los ejemplos del criterio para determinar si la unión es específica o no pueden incluir la constante de disociación (en lo sucesivo denominada "KD"). El valor de KD del anticuerpo para la proteína HER2 es preferentemente de 1 x 10 -5 M o menor, 5 * 10 -6 M o menor, 2 x 10 -6 M o menor o 1 * 10 -6 M o menor, más preferentemente, de 5 * 10 7 M o menor, 2 * 10-7 M o menor o 1 x 10-7 M o menor, además preferentemente, de 5 * 10-8 M o menor, 2 * 10-8 M o menor o de 1 * 10-8 M o menor y lo más preferentemente, de 5 * 10-9 M o menor, 2 * 10-9 M o menor o de 1 * 10-9 M o menor. La unión entre la proteína HER2 y el anticuerpo puede medirse usando un procedimiento conocido en la técnica, tal como resonancia de plasmón superficial, ELISA o RIA.
El término "CDR", como se usa en el presente documento, se refiere a una región determinante de la complementariedad (CDR). Se sabe que cada cadena pesada y cadena ligera de una molécula de anticuerpo tiene tres regiones determinantes de la complementariedad (CDR). La CDR se denomina también el dominio hipervariable, y está presente en una región variable de cada cadena pesada y cadena ligera de un anticuerpo. Es un sitio que tiene una variabilidad inusualmente elevada en su estructura primaria y hay tres CDR separadas en la estructura primaria de cada cadena de polipéptido pesada y ligera. En la presente memoria descriptiva, como para las CDR de un anticuerpo, las CDR de la cadena pesada se representan por CDRH1, CDRH2 y CDRH3 desde el lado del extremo amino de la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada y las CDR de la cadena ligera se representan por CDRL1, CDRL2 y CDRL3 desde el lado del extremo amino de la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera. Estos sitios están próximos entre sí en la estructura terciaria y determinan la especificidad por un antígeno al cual se une el anticuerpo.
La frase "la hibridación se lleva a cabo en condiciones rigurosas" como se usa en el presente documento se refiere a un procedimiento en el que se lleva a cabo en condiciones en las cuales se puede conseguir la identificación llevando a cabo la hibridación a 68 °C en una solución de hibridación comercialmente disponible, ExpressHyb Hybridization Solution (fabricada por Clontech, Inc.) o llevando a cabo la hibridación a 68 °C en presencia de 0,7 a 1,0 M de NaCl utilizando un filtro que tiene un ADN inmovilizado en el mismo, seguido por llevar a cabo el lavado a 68 °C usando una solución de 0,1 a 2 x SSC (1 x SSC está compuesta por NaCl 150 mM y citrato de sodio 15 mM) o en condiciones equivalentes a las anteriores.
1. HER2
HER2 es uno de los productos oncogénicos de un oncogén de receptor de factor de crecimiento típico identificado como oncogén relacionado con receptor de factor de crecimiento epidérmico humano 2 y es una proteína receptora transmembrana que tiene un peso molecular de 185 kDa y que tiene un dominio de tirosina cinasa. HER2 es un miembro de la familia de EGFR que consiste en HER1 (EGFR, ErbB-1), HER2 (neu, ErbB-2), HER3 (ErbB-3) y HER4 (ErbB-4) y se sabe que se autofosforila en restos de tirosina intracelulares mediante su formación de homodímero o formación de heterodímero con otro receptor de EGFR, HER1, HER3 o HER4 y se autoactiva de este modo, desempeñando de este modo un papel importante en el crecimiento celular, la diferenciación y la supervivencia en células normales y células tumorales.
Como con la proteína HER2 que se va a usar en la presente invención, la proteína HER2 puede purificarse y usarse directamente de células que expresan HER2 de un ser humano o de un mamífero no humano (tal como una rata o un ratón) o puede prepararse y usarse una fracción de membrana celular de las células descritas anteriormente. Además, HER2 también puede obtenerse mediante síntesis in vitro de la misma o mediante producción de la misma en una célula hospedadora mediante ingeniería genética. En la ingeniería genética, específicamente, después de integrarse el ADNc para HER2 en un vector capaz de expresar el ADNc para HER2, puede obtenerse la proteína HER2 sintetizándola en una solución que contiene una enzima, un sustrato y una sustancia energética para la transcripción y la traducción o expresando HER2 en otra célula hospedadora procariota o eucariota transformada. Como alternativa, pueden usarse las células que expresan HER2 modificadas por ingeniería genética anteriormente descritas o una línea celular que expresa HER2 como la proteína HER2.
La secuencia de ADN y la secuencia de aminoácidos de HER2 se han desvelado en una base de datos pública y pueden citarse, por ejemplo, con el n.° de referencia M11730 (GenBank), NP_004439.2 (NCBI) o similares.
Además, también se incluye en HER2 una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos, en la que se sustituyen, eliminan y/o añaden uno o varios aminoácidos en cualquiera de las secuencias de aminoácidos anteriormente descritas de HER2 y también tiene una actividad equivalente a la de la proteína.
La proteína HER2 está formada por una secuencia de señal que consiste en 22 restos de aminoácidos N-terminales, un dominio extracelular que consta de 630 restos de aminoácido, un dominio transmembrana que consta de 23 restos de aminoácido y un dominio intracelular que consta de 580 restos de aminoácido.
2. Producción del anticuerpo anti-HER2
EL anticuerpo contra HER2 de la presente invención puede obtenerse de acuerdo con, por ejemplo, un procedimiento llevado a cabo normalmente en la técnica, que implica inmunizar a animales con HER2 o un polipéptido arbitrario seleccionado entre la secuencia de aminoácidos de HER2 y recoger y purificar los anticuerpos producidos in vivo. La especie biológica de HER2 para su uso como antígeno no se limita a un ser humano y puede inmunizarse a un animal con HER2 procedente de un animal distinto de un ser humano, tal como un ratón o una rata o con p185neu de rata. En este caso, mediante el examen de la reactividad cruzada entre un anticuerpo que se une a1HER2 heterólogo obtenido y HER2 humano, se puede seleccionar un anticuerpo aplicable a una enfermedad humana.
Además, se puede obtener un anticuerpo monoclonal a partir de un hibridoma establecido fusionando las células productoras de anticuerpos que producen un anticuerpo contra HER2 con células de mieloma de acuerdo con un procedimiento conocido (por ejemplo, Kohler y Milstein, Nature, (1975) 256, págs. 495-497; Kennet, R. ed., Monoclonal Antibodies, págs. 365-367, Plenum Press, N.Y. (1980)).
Puede obtenerse HER2 para su uso como antígeno expresando el gen HER2 en una célula hospedadora usando ingeniería genética.
Específicamente, se produce un vector capaz de expresar el gen HER2 y el vector resultante se transfecta en una célula hospedadora para expresar el gen, y a continuación, se purifica la HER2 expresada.
Como alternativa, pueden usarse las células que expresan HER2 modificadas por ingeniería genética anteriormente descritas o una línea celular que expresa HER2 como la proteína HER2. El anticuerpo anti-HER2 puede obtenerse mediante un procedimiento conocido en la técnica. En lo sucesivo en el presente documento, se describe específicamente un procedimiento para obtener un anticuerpo contra HER2.
(1) Preparación del antígeno
Los ejemplos del antígeno que se va a usar para producir el anticuerpo anti-HER2 incluyen HER2 o un polipéptido que consiste en una secuencia de aminoácidos parcial que comprende al menos 6 aminoácidos consecutivos de HER2 o un derivado obtenido añadiendo una secuencia de aminoácidos dada o un transportador de la misma.
HER2 puede purificarse y usarse directamente a partir de tejidos tumorales o células tumorales humanas. Además, puede obtenerse HER2 sintetizándola in vitro o produciéndola en una célula hospedadora mediante ingeniería genética.
Con respecto a la ingeniería genética, específicamente, después de integrarse el ADNc para HER2 en un vector capaz de expresar el ADNc para HER2, puede obtenerse HER2 sintetizándola en una solución que contiene una enzima, un sustrato y una sustancia energética para la transcripción y la traducción o expresando HER2 en otra célula hospedadora procariota o eucariota transformada.
Además, también puede obtenerse el antígeno como una proteína secretora expresando una proteína de fusión obtenida ligando el dominio extracelular de HER2, que es una proteína de membrana, a la región constante de un anticuerpo en un sistema de vector-hospedador adecuado.
El ADNc de HER2 puede obtenerse mediante, por ejemplo, un procedimiento denominado PCR en el que se lleva a cabo una reacción en cadena de la polimerasa usando una biblioteca de ADNc que expresa ADNc de HER2 como molde y cebadores que amplifican específicamente el ADNc de HER2 (PCR; Saiki, R. K., y col., Science, (1988) 239, págs. 487-489).
En lo referente a la síntesis in vitro del polipéptido, puede usarse a modo ilustrativo, por ejemplo, el sistema Rapid Translation System (RTS) fabricado por Roche Diagnostics, Inc., pero sin limitarse al mismo.
Los ejemplos de células hospedadoras procariotas incluyen Escherichia coli y Bacillus subtilis. Para transformar las células hospedadoras con un gen diana, las células hospedadoras se transforman mediante un vector plásmido que comprende un replicón, es decir, un origen de replicación derivado de una especie compatible con el hospedador y una secuencia reguladora. Además, el vector tiene preferentemente una secuencia capaz de imponer selectividad fenotípica sobre la célula transformada.
Los ejemplos de células hospedadoras eucariotas incluyen células de vertebrados, células de insectos y células de levaduras. En cuanto a las células de vertebrados, normalmente se usan células COS de simio (Gluzman, Y., Cell, (1981) 23, págs. 175-182, ATCC CRL-1650; ATCC: American Type Culture Collection), fibroblastos NIH3T3 murinos (ATCC n.° CRL-1658), y cepas deficientes para dihidrofolato reductasa (Urlaub, G. y Chasin, L. A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, págs. 4126-4220) de células de ovario de hámster chino (células CHO; ATCC: CCL-61); y similares, sin embargo, las células no se limitan a las anteriores.
El transformante obtenido de esta manera puede cultivarse de acuerdo con un procedimiento normalmente llevado a cabo en la técnica y mediante el cultivo del transformante, se produce un polipéptido diana intracelular o extracelularmente.
Puede seleccionarse un medio adecuado para su uso en el cultivo para diversos medios de cultivo comúnmente usados dependiendo de las células hospedadoras empleadas. Si se emplea Escherichia coli, por ejemplo, se puede usar un medio LB suplementado con un antibiótico, tal como ampicilina o IPMG según sea necesario.
Puede separarse y purificarse una proteína recombinante producida intracelular o extracelularmente por el transformante mediante dicho cultivo mediante diversos procedimientos de separación conocidos utilizando las propiedades físicas o químicas de la proteína.
Los ejemplos específicos de los procedimientos incluyen el tratamiento con un precipitante de proteína común, ultrafiltración, diversos tipos de cromatografía líquida tales como cromatografía de tamiz molecular (filtración en gel), cromatografía de adsorción, cromatografía de intercambio iónico y cromatografía de afinidad, diálisis y una combinación de los mismos.
Además, uniendo una etiqueta de seis restos de histidina a la proteína recombinante que se va a expresar, la proteína puede purificarse eficazmente con una columna de afinidad de níquel. Como alternativa, uniendo la región Fc de IgG a la proteína recombinante que se va a expresar, la proteína puede purificarse eficazmente con una columna de proteína A.
Combinando los procedimientos anteriormente descritos, se puede producir fácilmente una gran cantidad de polipéptido diana con alto rendimiento y pureza elevada.
El transformante anteriormente descrito puede usarse en sí como el antígeno. También puede usarse como antígeno una línea celular que expresa HER2. Los ejemplos de dicha línea celular pueden incluir líneas de cáncer de mama humano SK-BR-3, BT-474, KPL-4 y JIMT-1, una línea de cáncer gástrico humano NCI-N87 y una línea de cáncer de ovario humano SK-OV-3. La línea celular de la presente invención no se limita a estas líneas celulares, en tanto que exprese HER2.
(2) Producción de anticuerpo monoclonal anti-HER2
Los ejemplos del anticuerpo que se une específicamente a HER2 incluyen un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a HER2 y un procedimiento para obtener dicho anticuerpo es como se describe a continuación.
La producción de un anticuerpo monoclonal requiere generalmente las siguientes etapas operativas de:
(a) purificar un biopolímero que se va a usar como un antígeno o preparar las células que expresan el antígeno; (b) preparar las células productoras de anticuerpos inmunizando a un animal mediante la inyección del antígeno, recoger la sangre, evaluar su título de anticuerpos para determinar cuándo se extirpa el bazo;
(c) preparar células de mieloma (en lo sucesivo citadas como "mieloma");
(d) fusionar las células productoras de anticuerpos con el mieloma;
(e) explorar un grupo de hibridomas que produce un anticuerpo deseado;
(f) dividir los hibridomas en clones de células individuales (clonación);
(g) opcionalmente, cultivar el hibridoma o criar un animal al que se ha implantado el hibridoma para producir una gran cantidad de anticuerpos monoclonales;
(h) examinar la actividad biológica y la especificidad de unión del anticuerpo monoclonal producido de este modo o evaluar las propiedades del mismo como reactivo marcado; y similares.
En lo sucesivo en el presente documento, se describirá en detalle un procedimiento para producir un anticuerpo monoclonal siguiendo las etapas anteriores, sin embargo, el procedimiento no se limita a lo anterior y, por ejemplo, pueden usarse células productoras de anticuerpo distintas de células de bazo y mieloma.
(a) Purificación del antígeno
Como antígeno, puede usarse HER2 preparada mediante el procedimiento como se ha descrito anteriormente o un péptido parcial de la misma.
Además, también puede usarse como antígeno una fracción de membrana preparada a partir de células recombinantes que expresan HER2 o las células recombinantes que expresan HER2 por sí mismas y también un péptido parcial de la proteína de la invención sintetizado químicamente mediante un procedimiento conocido por los expertos en la materia.
Además, también puede usarse la línea celular que expresa HER2 como antígeno.
(b) Preparación de las células productoras de anticuerpos
El antígeno obtenido en la etapa (a) se mezcla con un adyuvante, tal como adyuvante completo o incompleto de Freund o un agente auxiliar, tal como sulfato de aluminio y potasio y la mezcla resultante se usa como inmunógeno para inmunizar a un animal experimental. Otro procedimiento implica inmunizar a un animal experimental con células que expresan antígeno como inmunógeno. Como animal experimental, puede usarse sin impedimento alguno cualquier animal usado en un procedimiento de producción de hibridoma conocido. Específicamente, por ejemplo, puede usarse un ratón, una rata, una cabra, oveja, ganado, un caballo o similares. Sin embargo, desde el punto de vista de la fácil disponibilidad de células de mieloma para su fusión con las células productoras de anticuerpo extraídas, se usa como animal para la inmunización, preferentemente, un ratón o una rata.
Además, la cepa de ratón o rata que se va a utilizar no está particularmente limitada y en el caso de un ratón, por ejemplo, pueden usarse diversas cepas, tales como A, AKR, BALB/c, BDP, BA, CE, C3H, 57BL, C57BL, C57L, d Ba , FL, HTH, HT1, LP, NZB, NZW, RF, R III, SJL, SWR, WB y 129 y similares y en el caso de una rata, por ejemplo, pueden usarse ratas Wistar, Low, Lewis, Sprague, Dawley, ACI, BN, Fischer y similares.
Estos ratones y ratas están disponibles en el mercado de criadores/distribuidores de animales experimentales, por ejemplo, CLEA Japan, Inc. y Charles River Laboratories Japan, Inc.
Como animal que se va a inmunizar, teniendo en cuenta la compatibilidad de fusión con las células de mieloma descritas anteriormente, se prefieren particularmente, en el caso de un ratón, la cepa BALB/c y en el caso de una rata, las cepas Wistar y Low.
Además, teniendo en cuenta la homología antigénica entre seres humanos y ratones, también se prefiere usar un ratón que tenga la función biológica reducida para eliminar autoanticuerpos, es decir, un ratón con una enfermedad autoinmunitaria.
La edad de dicho ratón o rata en el momento de la inmunización es preferentemente de 5 a 12 semanas de edad, más preferentemente de 6 a 8 semanas de edad.
Para inmunizar a un animal con HER2 o un recombinante de la misma, por ejemplo, puede usarse un procedimiento conocido descrito en detalle en, por ejemplo, Weir, D. M., Handbook of Experimental Immunology Vol. I. II. III., Blackwell Scientific Publications, Oxford (1987); Kabat, E. A. y Mayer, M. M., Experimental Immunochemistry, Charles C Thomas Publisher Springfield, Illinois (1964) o similares.
Entre estos procedimientos de inmunización, un procedimiento específico preferido en la presente invención es, por ejemplo, como se expone a continuación.
Es decir, en primer lugar, se administra a un animal por vía intradérmica o intraperitoneal una fracción de proteína de membrana que sirve cono antígeno o células en las que se provoca la expresión del antígeno. Sin embargo, se prefiere la combinación de ambas vías de administración para aumentar la eficacia de la inmunización y cuando se lleva a cabo administración intradérmica en la primera mitad y se lleva a cabo administración intraperitoneal en la segunda mitad o solo en la última dosis, puede aumentarse particularmente la eficacia de la inmunización.
La pauta de administración del antígeno varía dependiendo del tipo de animal que se vaya a inmunizar, de diferencias individuales o similares. Sin embargo, en general, se prefiere una pauta de administración en la que la frecuencia de administración del antígeno sea de 3 a 6 veces y el intervalo de dosificación es de 2 a 6 semanas y se prefiere aún más una pauta de administración en la que la frecuencia de administración del antígeno es de 3 a 4 veces y el intervalo de dosificación es de 2 a 4 semanas.
Además, la dosis del antígeno varía dependiendo del tipo de animal, las diferencias individuales o similares, sin embargo, la dosis se ajusta generalmente a de 0,05 a 5 mg, preferentemente de aproximadamente 0,1 a 0,5 mg.
Se lleva a cabo una inmunización de refuerzo a las 1 a 6 semanas, preferentemente a las 1 a 4 semanas, más preferentemente a las 1 a 3 semanas después de la administración del antígeno, como se ha descrito anteriormente. Cuando el inmunógeno es células, se usan de 1 * 106 a 1 * 107 células.
La dosis del antígeno en el momento de llevar a cabo la inmunización de refuerzo varía dependiendo del tipo o tamaño del animal o similares, sin embargo, en el caso de, por ejemplo, un ratón, la dosis se ajusta generalmente a de 0,05 a 5 mg, preferentemente de 0,1 a 0,5 mg, más preferentemente de aproximadamente 0,1 a 0,2 mg. Cuando el inmunógeno son células, se usan de 1 * 106 a 1 * 107 células.
Los esplenocitos o linfocitos, incluyendo las células productoras de anticuerpo, se retiran de manera aséptica del animal inmunizado después de 1 a 10 días, preferentemente de 2 a 5 días, más preferentemente de 2 a 3 días desde la inmunización de refuerzo. En ese momento, se mide el título de anticuerpo y en caso de que se use un animal que tiene un título de anticuerpo suficientemente aumentado como fuente de suministro de las células productoras de anticuerpo, puede llevarse a cabo de manera más eficaz el procedimiento posterior.
Los ejemplos del procedimiento para medir el título de anticuerpo para su uso en este caso incluyen un procedimiento de RIA y un procedimiento de ELISA, pero el procedimiento no se limita a estos. Por ejemplo, en caso de que se emplee un procedimiento ELISA, puede llevarse a cabo la medición del título de anticuerpo en la invención de acuerdo con los procedimientos como se describen más adelante.
En primer lugar, se adsorbe un antígeno purificado o parcialmente purificado a la superficie de una fase sólida, tal como una placa de 96 pocillos para ELISA y se cubre la superficie de la fase sólida que no tiene adsorbido a la misma con una proteína no relacionada con el antígeno, tal como seroalbúmina bovina (BSA). Tras lavar la superficie, se pone en contacto la superficie con una muestra diluida en serie (por ejemplo, suero de ratón) como anticuerpo primario para permitir que el anticuerpo en la muestra se una al antígeno.
Además, como anticuerpo secundario, se añade un anticuerpo marcado con una enzima contra un anticuerpo de ratón y se deja que se una al anticuerpo de ratón. Después del lavado, se añade un sustrato para la enzima y se mide el cambio en la absorbancia que se produce debido al revelado del color inducido por la degradación del sustrato o similares y el título del anticuerpo se calcula basándose en la medición.
Puede llevarse a cabo la separación de las células productoras de anticuerpo de las células de bazo o linfocitos del animal inmunizado de acuerdo con un procedimiento conocido (por ejemplo, Kohler y col., Nature (1975), 256, p. 495; Kohler y col., Eur. J. Immunol. (1977), 6 , p. 511; Millstein y col., Nature (1977), 266, p. 550; Walsh, Nature (1977), 266, p. 495). Por ejemplo, en el caso de los esplenocitos, puede emplearse un procedimiento general, en el que se separan las células productoras de anticuerpo homogeneizando el bazo para obtener las células mediante filtración con una malla de acero inoxidable y suspendiendo las células en medio esencial mínimo de EAGLE (MEM).
(c) Preparación de células de mieloma (en lo sucesivo denominadas "mieloma")
Las células de mieloma que se van a usar para la fusión celular no están particularmente limitadas y se pueden seleccionar células adecuadas de líneas celulares conocidas. Sin embargo, teniendo en cuenta la conveniencia cuando se selecciona un hibridoma de células fusionadas, se prefiere usar una cepa deficiente para HGPRT (hipoxantina-guanina fosforribosil transferasa) cuyo procedimiento de selección se ha establecido.
Más específicamente, los ejemplos de la cepa deficiente para HGPRT incluyen X63-Ag8(X63), NS1-ANS/1(NS1), P3X63-Ag8.U1(P3U1), X63-Ag8.653(X63.653), SP2/0-Ag14(SP2/0), MPC11-45.6TG1.7(45.6TG), FO, S149/5XXO y BU.1 procedentes de ratones; 210.RSY3.Ag.1.2.3(Y3) procedente de ratas; y U266a R(SKO-007), GM1500 GTG-A12(GM1500), UC729-6, LICR-LOW-HMy2(HMy2) y 8226AR/NIP4-1(NP41) procedentes de ser humano. Estas cepas deficientes para HGPRT se encuentran disponibles de, por ejemplo, la ATCC o similares.
Estas cepas de células se subcultivan en un medio adecuado, tal como un medio de 8-azaguanina [un medio obtenido añadiendo 8-azaguanina a un medio RPMI 1640 suplementado con glutamina, 2-mercaptoetanol, gentamicina y suero fetal de ternero (en lo sucesivo citado como "FCS")], medio de Dulbecco modificado por Iscove (en lo sucesivo denominado "IMDM"), o medio Eagle modificado por Dulbecco (en lo sucesivo denominado "DMEM"). En este caso, de 3 a 4 días antes de llevar a cabo la fusión celular, se subcultivan las células en un medio normal (por ejemplo, un medio ASF104 (fabricado por Ajinomoto Co., Ltd.) que contiene FCS al 10 %) para asegurar no menos de 2 * 107 células en el día de la fusión celular.
(d) Fusión celular
La fusión celular entre las células productoras de anticuerpo y las células de mieloma puede llevarse a cabo de manera adecuada de acuerdo con un procedimiento conocido (Weir, D. M. Handbook of Experimental Immunology Vol. I. II. III., Blackwell Scientific Publications, Oxford (1987); Kabat, E. A. y Mayer, M. M., Experimental Immunochemistry, Charles C Thomas Publisher, Springfield, Illinois (1964), etc.), en condiciones en las que no se reduce excesivamente la tasa de supervivencia de las células.
Como dicho procedimiento, por ejemplo, puede usarse un procedimiento químico en el que se mezclan las células productoras de anticuerpo y las células de mieloma en una solución que contiene un polímero, tal como polietilenglicol a una alta concentración, un procedimiento físico que usa estimulación eléctrica o similares. Entre estos procedimientos, un ejemplo específico del procedimiento químico es como se describe a continuación.
Es decir, en el caso cuando se usa polietilenglicol en la solución que contiene un polímero a una alta concentración, las células productoras de anticuerpos y las células de mieloma se mezclan en una solución de polietilenglicol que tiene un peso molecular de 1500 a 6000, más preferentemente de 2000 a 4000 a una temperatura de entre 30 a 40 °C, preferentemente de 35 a 38 °C durante 1 a 10 minutos, preferentemente de 5 a 8 minutos.
(e) Selección de un grupo de hibridomas
El procedimiento de selección de hibridomas obtenidos mediante la fusión celular anteriormente descrito no está limitado particularmente. Normalmente, puede usarse un procedimiento de selección de HAT (hipoxantina, aminopterina, timidina) (Kohler y col., Nature (1975), 256, p. 495; Millstein y col., Nature (1977), 266, p. 550).
Este procedimiento es eficaz cuando se obtienen hibridomas usando las células de mieloma de una cepa deficiente para HGPRT que no puede sobrevivir en presencia de aminopterina. Es decir, mediante el cultivo de células no fusionadas e hibridomas en un medio HAT, solo se permite que sobrevivan y proliferen los hibridomas resistentes a la aminopterina.
(f) División en clones de células individuales (clonación)
Como procedimientos de clonación para los hibridomas, puede usarse un procedimiento conocido, tal como un procedimiento de metilcelulosa, un procedimiento de agarosa o un procedimiento de dilución limitante (véase, por ejemplo, Barbara, B. M. y Stanley, M. S.: Selected Methods in Cellular Immunology, W. H. Freeman and Company, San Francisco (1980)). Entre estos procedimientos, particularmente, se prefiere un procedimiento de cultivo tridimensional tal como un procedimiento con metilcelulosa. Por ejemplo, se suspende el grupo de hibridomas producidos mediante fusión celular en un medio de metilcelulosa, tal como medio de selección D ClonaCell-HY (fabricado por StemCells Technologies, Inc., n.° 03804) y se cultivan. Después, se recogen las colonias de hibridomas formadas, mediante lo que pueden obtenerse hibridomas monoclonales. Se cultivan las respectivas colonias de hibridoma y se selecciona como cepa de hibridoma productora de anticuerpo monoclonal contra HER2 un hibridoma que se ha confirmado que tiene un título de anticuerpo estable en un sobrenadante de cultivo de hibridoma obtenido.
(g) Preparación de anticuerpo monoclonal mediante cultivo de hibridoma
Cultivando el hibridoma seleccionado de esta manera, se puede obtener eficazmente un anticuerpo monoclonal. Sin embargo, antes del cultivo, es preferible llevar a cabo una exploración de un hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal diana.
En dicha exploración, puede emplearse un procedimiento conocido.
La medición del título de anticuerpos en la invención se puede llevar a cabo mediante, por ejemplo, un procedimiento ELISA explicado en el punto (b) descrito anteriormente.
El hibridoma obtenido mediante el procedimiento descrito anteriormente puede almacenarse en un estado congelado en nitrógeno líquido o en un congelador a -80 °C o menos.
Tras completarse la clonación, se cambia el medio de un medio HT a un medio normal y se cultiva el hibridoma.
El cultivo a gran escala se lleva a cabo mediante cultivo rotatorio usando una botella de cultivo grande o mediante cultivo con agitador. Puede obtenerse un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a la proteína de la invención a partir del sobrenadante obtenido mediante el cultivo a gran escala mediante purificación usando un
procedimiento conocido por los expertos en la materia, tal como filtración en gel.
Además, el hibridoma se inyecta en la cavidad abdominal de un ratón de la misma cepa que el del hibridoma (por ejemplo, el ratón BALB/c anteriormente descrito) o un ratón Nu/Nu para hacer proliferar el hibridoma, mediante lo que puede obtenerse el fluido ascítico que contiene una gran cantidad del anticuerpo de la invención.
En el caso cuando se administra el hibridoma en la cavidad abdominal, si se administra un aceite mineral tal como 2,6,10,14-tetrametil pentadecano (pristano) 3 a 7 días antes en la misma, se puede obtener una gran cantidad de fluido ascítico.
Por ejemplo, se inyecta previamente un inmunosupresor en la cavidad abdominal de un ratón de la misma cepa que el hibridoma para inactivar los linfocitos T. 20 días después, se suspenden de 106 a 107 células de clones de hibridoma en un medio exento de suero (0,5 ml) y se administra la suspensión en la cavidad abdominal del ratón. En general, cuando se expande el abdomen y se llena de fluido ascítico, se recoge el fluido ascítico del ratón. Mediante este procedimiento, puede obtenerse el anticuerpo monoclonal a una concentración que es aproximadamente 100 veces o más mayor que en la solución de cultivo.
El anticuerpo monoclonal obtenido mediante el procedimiento anteriormente descrito puede purificarse mediante un procedimiento descrito en, por ejemplo, Weir, D. M.: Handbook of Experimental Immunology Vol. I, II, III, Blackwell Scientific Publications, Oxford (1978).
El anticuerpo monoclonal obtenido de este modo tiene una alta especificidad antigénica por HER2. Los ejemplos del anticuerpo monoclonal de la presente invención pueden incluir, pero sin limitarse particularmente a, un anticuerpo monoclonal de ratón 4D5 (ATCC CRL 10463).
(h) Ensayo de anticuerpo monoclonal
Puede determinarse el isotipo y la subclase del anticuerpo monoclonal obtenido de este modo del siguiente modo.
En primer lugar, los ejemplos del procedimiento de identificación incluyen el procedimiento de Ouchterlony, un procedimiento ELISA y un procedimiento RIA.
El procedimiento de Ouchterlony es sencillo, pero cuando la concentración del anticuerpo monoclonal es baja, se requiere una operación de condensación.
Por otro lado, cuando se usa un procedimiento ELISA o un procedimiento de RIA, pueden identificarse el isotipo y la subclase del anticuerpo monoclonal haciendo reaccionar directamente el sobrenadante de cultivo con antígeno adsorbido en una fase sólida y usando anticuerpos que corresponden a diversos tipos de isotipos y subclases de inmunoglobulina como anticuerpos secundarios.
Además, también puede usarse como un procedimiento más sencillo un kit de identificación disponible comercialmente (por ejemplo, el kit Mouse Typer, fabricado por Bio-Rad Laboratories, Inc.) o similares.
Además, puede llevarse a cabo la determinación cuantitativa de una proteína mediante el procedimiento de Folin Lowry y un procedimiento de cálculo basado en la absorbancia a 280 nm (1,4 (DO280) = 1 mg/ml de inmunoglobulina).
Además, incluso cuando el anticuerpo monoclonal se obtiene por separado e independientemente llevando a cabo de nuevo las etapas (a) a (h) en (2), es posible obtener un anticuerpo que tenga una actividad citotóxica equivalente a la del anticuerpo para HER2. Como ejemplo de dicho anticuerpo, puede ejemplificarse un anticuerpo que se une al mismo epítopo que el anticuerpo para HER2 obtenido en la etapa (g). En caso de que un anticuerpo monoclonal recién producido se una a un péptido parcial o una estructura terciaria parcial a la que se une el anticuerpo anti-HER2, puede determinarse que el anticuerpo monoclonal se une al mismo epítopo que el anticuerpo anti-HER2. Además, al confirmarse que el anticuerpo monoclonal compite con el anticuerpo anti-HER2 por la unión a HER2 (es decir, el anticuerpo monoclonal inhibe la unión entre el anticuerpo anti-HER2 y HER2), puede determinarse que el anticuerpo monoclonal se une al mismo epítopo que el anticuerpo anti-HER2, incluso si no se ha determinado la secuencia o la estructura específica del epítopo. Cuando se confirma que el anticuerpo monoclonal se une al mismo epítopo que el anticuerpo anti-HER2, hay una alta probabilidad de que el anticuerpo monoclonal tenga una afinidad de unión a antígeno o una actividad biológica equivalente a la del anticuerpo anti-HER2.
(3) Otros anticuerpos
El anticuerpo de la invención incluye no solo el anticuerpo monoclonal anteriormente descrito contra HER2, sino también un anticuerpo recombinante obtenido mediante modificación artificial con el objetivo de reducir la antigenicidad heteróloga en seres humanos, tal como un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado y un anticuerpo humano. Estos anticuerpos pueden producirse usando un procedimiento conocido.
Como anticuerpo quimérico, puede usarse como ejemplo un anticuerpo en el que las regiones variables y constantes del anticuerpo proceden de especies diferentes, por ejemplo, un anticuerpo quimérico en el que se conecta una región variable de anticuerpo procedente de ratón o rata a una región constante de anticuerpo procedente de un ser humano
(véase Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81,6851-6855, (1984)). Los ejemplos del anticuerpo quimérico de la presente invención pueden incluir, pero sin limitarse particularmente a, un anticuerpo quimérico 4D5 que comprende una región constante de cadena pesada de IgG1 o IgG2 humana.
Como anticuerpo humanizado, pueden usarse como ejemplo un anticuerpo obtenido mediante la integración de solo una región determinante de la complementariedad (c Dr ) en un anticuerpo de origen humano (véase Nature (1986) 321, págs. 522-525) y un anticuerpo obtenido injertando una parte de los restos de aminoácido del marco así como la secuencia de CDR en un anticuerpo humano mediante un procedimiento de injerto de CDR (documento WO 90/07861) y un anticuerpo humanizado usando estrategias de mutagénesis de conversión génica (Patente de los Estados Unidos n.° 5821337).
El término "varios", como se usa en el presente documento, se refiere a de 1 a 10, de 1 a 9, de 1 a 8, de 1 a 7, de 1 a 6, de 1 a 5, de 1 a 4, de 1 a 3 o 1 o 2.
Como sustitución de aminoácidos en la presente memoria descriptiva, se prefiere una sustitución de aminoácidos conservativa. La sustitución de aminoácidos conservativa se refiere a una sustitución que se produce en un grupo de anticuerpos con cadenas laterales de aminoácidos relacionadas. Los grupos de aminoácidos preferidos son como se expone a continuación: un grupo ácido (ácido aspártico y ácido glutámico); un grupo básico (lisina, arginina e histidina); un grupo no polar (alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina y triptófano); y una familia polar no cargada (glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina y tirosina). Los grupos de aminoácidos más preferidos son como se expone a continuación: un grupo hidroxi alifático (serina y treonina); un grupo que contiene amida (asparagina y glutamina); un grupo alifático (alanina, valina, leucina e isoleucina); y un grupo aromático (fenilalanina, triptófano y tirosina). Dicha sustitución de aminoácidos se lleva a cabo preferentemente en un grado que no deteriora las propiedades de una sustancia que tenga la secuencia de aminoácidos original.
Al combinar una secuencia que tiene una alta homología respecto de la secuencia de aminoácidos de cadena pesada anteriormente descrita con una secuencia que tiene elevada homología respecto de la secuencia de aminoácidos de cadena ligera anteriormente descrita, es posible seleccionar un anticuerpo que tenga una actividad biológica equivalente a la de cada uno de los anticuerpos descritos anteriormente. Dicha homología es generalmente una homología del 80 % o más, preferentemente, una homología del 90 % o más, más preferentemente, una homología del 95 % o más, lo más preferentemente, una homología del 99 % o más. Además, también es posible seleccionar un anticuerpo que tenga una actividad biológica equivalente a la de cada uno de los anticuerpos anteriormente descritos mediante la combinación de una secuencia de aminoácidos en la que se sustituyen, eliminan o añaden de uno a varios restos de aminoácido en la secuencia de aminoácidos de cadena pesada o cadena ligera. El término "homología", como se usa en el presente documento, se usa con el mismo significado que "identidad".
Se puede determinar la homología entre dos secuencias de aminoácidos utilizando los parámetros por defecto del algoritmo Blast, versión 2.2.2 (Altschul, Stephen F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaeffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller y David J. Lipman (1997), "Gapped BLAST y PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402). El algoritmo Blast se puede usar también a través de Internet accediendo al sitio www.ncbi.nlm.nih.gov/blast.
Además, el anticuerpo de la invención incluye un anticuerpo humano que se une a HER2. Un anticuerpo humano anti-HER2 se refiere a un anticuerpo humano que tiene únicamente una secuencia de un anticuerpo procedente de un cromosoma humano. El anticuerpo humano anti-HER2 puede obtenerse mediante un procedimiento que usa un ratón productor de anticuerpos humanos que tiene un fragmento de cromosoma que comprende genes de cadena pesada y ligera de un anticuerpo humano (véase Tomizuka, K. y col., Nature Genetics (1997) 16, págs. 133-143; Kuroiwa, Y. y col., Nucl. Acids Res. (1998) 26, págs. 3447-3448; Yoshida, H. y col., Animal Cell Technology: Basic and Applied Aspects vol. 10, págs. 69-73 (Kitagawa, Y., Matuda, T. e lijima, S. eds.), Kluwer Academic Publishers, 1999; Tomizuka, K. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000) 97, págs. 722-727, etc.).
Dicho ratón productor de anticuerpos humanos puede crearse específicamente de la siguiente forma. Se crea un animal genéticamente modificado en el que se han alterado los locus génicos endógenos de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina y en cambio, se han introducido locus génicos de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina humana mediante un vector de cromosoma artificial de levadura (YAC) o similares, produciendo un animal con supresión génica y un animal transgénico y emparejando a estos animales.
Además, de acuerdo con una técnica de ADN recombinante, se transforman células eucariotas usando ADNc que codifican cada una de dichas cadenas pesadas y cadenas ligeras de un anticuerpo humano y preferentemente un vector que comprende dichos ADNC y se cultiva una célula transformante que produce un anticuerpo monoclonal humano recombinante, mediante lo cual, también puede obtenerse el anticuerpo del sobrenadante de cultivo.
En este caso, como hospedador, por ejemplo, pueden usarse células eucariotas, preferentemente células de mamífero, tales como células CHO, linfocitos o células de mieloma.
Además, también se conoce un procedimiento para obtener un anticuerpo humano procedente de presentación en fagos seleccionado de una biblioteca de anticuerpos humanos (véase Wormstone, I. M. y col., Investigative Ophthalmology & Visual Science (2002), 43 (7), págs. 2301-2308; Carmen, S. y col., Briefings in Functional Genomics
and Proteomics (2002), 1 (2), págs. 189-203; Siriwardena, D. y col., Ophthalmology (2002), 109 (3), págs. 427-431, etc.).
Por ejemplo, puede usarse un procedimiento de presentación en fagos en el que se expresa una región variable de un anticuerpo humano sobre la superficie de un fago en forma de un anticuerpo monocatenario (scFv) y se selecciona un fago que se une a un antígeno (Nature Biotechnology (2005), 23(9), págs. 1105-1116).
Analizando el gen del fago seleccionado basándose en la unión a un antígeno, puede determinarse una secuencia de ADN que codifica la región variable de un anticuerpo humano que se une a un antígeno.
En caso de que se determine la secuencia de ADN del scFv que se une a un antígeno, puede obtenerse un anticuerpo humano preparando un vector de expresión que comprende la secuencia e introduciendo el vector en un hospedador adecuado para que lo exprese (documentos WO 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438, WO 95/15388; Annu. Rev. Immunol. (1994) 12, págs. 433-455, Nature Biotechnology (2005), 23 (9), págs. 1105-1116).
Como ejemplo de otro índice para su uso en la comparación de las propiedades de los anticuerpos, se puede ilustrar la estabilidad de los anticuerpos. La calorimetría diferencial de barrido (DSC) es un medio capaz de medir de manera rápida y precisa una temperatura intermedia de desnaturalización térmica (Tm) para su uso como un índice favorable de la estabilidad conformacional relativa de las proteínas. Midiendo los valores de la Tm utilizando DSC y comparando los valores, puede compararse una diferencia en la estabilidad térmica. Se sabe que la estabilidad en almacenamiento de los anticuerpos muestra cierta correlación con la estabilidad térmica de los anticuerpos (Lori Burton, y col., Pharmaceutical Development and Technology (2007), 12, págs. 265-273), y puede seleccionarse un anticuerpo preferido usando la estabilidad térmica como un índice. Los ejemplos de otros índices para seleccionar anticuerpos incluyen las siguientes características: el rendimiento en una célula hospedadora adecuada es elevado; y la agregabilidad en una solución acuosa es baja. Por ejemplo, un anticuerpo que muestra el rendimiento más alto no siempre muestra la estabilidad térmica más elevada y por tanto, es necesario seleccionar un anticuerpo más adecuado para su administración a seres humanos realizando una evaluación exhaustiva basándose en los índices anteriormente descritos.
En la presente invención, también se incluye una variante modificada del anticuerpo. La variante modificada se refiere a una variante obtenida sometiendo el anticuerpo de la presente invención a modificación química o biológica. Los ejemplos de la variante modificada químicamente incluyen variantes modificadas químicamente uniendo un resto químico a una cadena principal de aminoácidos, variantes modificadas químicamente con una cadena de hidrato de carbono unida a N o unida a O, etc. Los ejemplos de la variante modificada biológicamente incluyen variantes obtenidas mediante modificación postraduccional (tal como glucosilación unida a N o unida a O, procesamiento N o C-terminal, desamidación, isomerización de ácido aspártico u oxidación de metionina) y variantes en las que se ha añadido un resto de metionina a extremo N que se expresa en una célula hospedadora procariota. Además, también se incluye en el significado de la variante modificada un anticuerpo marcado de tal modo que permite la detección o el aislamiento del anticuerpo o un antígeno de la invención, por ejemplo, un anticuerpo marcado enzimáticamente, un anticuerpo marcado fluorescentemente y un anticuerpo con un marcador de afinidad. Dicha variante modificada del anticuerpo de la invención es útil para mejorar la estabilidad y la retención en sangre del anticuerpo, reducir su antigenicidad, detectar o aislar el anticuerpo o un antígeno y similares.
Además, al regular la modificación de un glucano que está unido al anticuerpo de la invención (glucosilación, defucosilación, etc.), es posible potenciar una actividad citotóxica celular dependiente del anticuerpo. Como técnica para regular la modificación de un glucano de los anticuerpos, se conocen los documentos WO 99/54342, WO 00/61739, WO 02/31140, etc. Sin embargo, la técnica no se limita a lo anterior. En el anticuerpo de la presente invención, también se incluye un anticuerpo en el que se regula la modificación de un glucano.
En el caso en el que se produce un anticuerpo aislando en primer lugar un gen de anticuerpo y posteriormente introduciendo el gen en un hospedador adecuado, puede usarse una combinación de un hospedador adecuado y un vector de expresión adecuado. Los ejemplos específicos del gen de anticuerpo incluyen una combinación de un gen que codifica una secuencia de cadena pesada de un anticuerpo descrito en la presente memoria descriptiva y un gen que codifica una secuencia de cadena ligera del mismo. Cuando se transforma una célula hospedadora, es posible insertar el gen de la secuencia de la cadena pesada y el gen de la secuencia de la cadena ligera en el mismo vector de expresión, y también en diferentes vectores de expresión por separado.
En caso de que se usen como hospedador células eucariotas, pueden usarse células animales, células vegetales y microorganismos eucariotas. Como células animales, sirven como ejemplo células de mamífero, por ejemplo, células COS de simio (Gluzman, Y., Cell, (1981) 23, págs. 175-182, ATCC CRL-1650), fibroblastos NIH3T3 murinos (ATCC n.° CRL-1658) y cepas deficientes para dihidrofolato reductasa (Urlaub, G. y Chasin, L. A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, págs. 4126-4220) de células de ovario de hámster chino (células CHO; ATCC: CCL-61).
En caso de que se usen células procariotas, por ejemplo, sirven de ejemplo Escherichia coli y Bacillus subtilis.
Puede obtenerse el anticuerpo induciendo un gen de anticuerpo deseado en estas células mediante transformación y cultivando las células transformadas de este modo in vitro. En el procedimiento de cultivo anteriormente descrito, en
ocasiones puede variar el rendimiento dependiendo de la secuencia del anticuerpo y por tanto, es posible seleccionar un anticuerpo que se produzca fácilmente como producto farmacéutico usando el rendimiento como índice entre los anticuerpos que tienen una actividad de unión equivalente. Por lo tanto, en el anticuerpo de la presente invención, también se incluye un anticuerpo obtenido mediante un procedimiento para producir un anticuerpo, caracterizado porque incluye una etapa de cultivo de la célula hospedadora transformada y una etapa de recoger un anticuerpo deseado del producto cultivado obtenido en la etapa de cultivo.
Se sabe que se elimina un resto de lisina en el extremo carboxilo de la cadena pesada de un anticuerpo producido en la célula de mamífero cultivada (Journal of Chromatography A, 705: 129-134 (1995)) y también se sabe que se eliminan dos restos de aminoácido (glicina y lisina) en el extremo carboxilo de la cadena pesada de un anticuerpo producido en una célula de mamífero cultivada y se amida un resto de prolina localizado recientemente en el extremo carboxilo (Analytical Biochemistry, 360: 75-83 (2007)). Sin embargo, dicha eliminación y modificación de la secuencia de cadena pesada no afecta a la afinidad de unión a antígeno y a la función efectora (la activación de complemento, la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo, etc.) del anticuerpo. Por lo tanto, en el anticuerpo de acuerdo con la presente invención, también se incluye un anticuerpo sometido a dicha modificación y un fragmento funcional del anticuerpo y también se incluyen una variante de eliminación en la que se han eliminado uno o dos aminoácidos en el extremo carbonilo de la cadena pesada, una variante obtenida mediante amidación de la variante de eliminación (por ejemplo, una cadena pesada en la que se ha amidado el resto de prolina carboxilo terminal) y similares. El tipo de variante de eliminación que tiene una eliminación en el extremo carboxilo de la cadena pesada del anticuerpo de acuerdo con la invención no se limita a las variantes anteriores, en tanto que se conserven la afinidad de unión a antígeno y la función efectora. Las dos cadenas pesadas que constituyen el anticuerpo de acuerdo con la invención pueden ser de un tipo seleccionado entre el grupo que consiste en una cadena pesada de longitud completa y la variante de eliminación anteriormente descrita o puede ser de dos tipos combinados seleccionados de los anteriores. La proporción de la cantidad de cada variante de eliminación puede verse afectada por el tipo de células de mamífero cultivadas que producen el anticuerpo de acuerdo con la invención y las condiciones de cultivo, sin embargo, puede usarse como ejemplo un caso en el que se ha eliminado un resto de aminoácido en el extremo carboxilo en las dos cadenas pesadas contenidas como componentes principales en el anticuerpo de acuerdo con la invención.
Como isotipo del anticuerpo de la invención, por ejemplo, pueden usarse como ejemplo IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4) y preferentemente, pueden usarse como ejemplo IgG1 o IgG2.
Como actividad biológica del anticuerpo, pueden usarse como ejemplos generalmente la actividad de unión a antígeno, la actividad de internalización en células que expresan un antígeno mediante unión al antígeno, la actividad de neutralizar la actividad de un antígeno, la actividad de potenciar la actividad de un antígeno, la actividad de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC), la actividad de citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) y la actividad de fagocitosis mediada por células dependiente de anticuerpo (ADCP). La actividad biológica del anticuerpo de la presente invención es una actividad de unión a HER2 y preferentemente, una actividad de internalización en células que expresan HER2 mediante unión a HER2. Además, el anticuerpo de la presente invención puede tener actividad ADCC, actividad CDC y/o actividad ADCP, además de actividad de internalización en células.
El anticuerpo obtenido puede purificarse hasta homogeneidad. La separación y la purificación del anticuerpo pueden llevarse a cabo empleando un procedimiento de separación y purificación de proteínas adicional. Por ejemplo, puede separarse y purificarse el anticuerpo seleccionando de manera adecuada y combinando cromatografía en columna, filtración mediante filtro, ultrafiltración, precipitación con sal, diálisis, electroforesis preparativa en gel de poliacrilamida, electroforesis de isoelectroenfoque y similares (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual, Daniel R. Marshak y col. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996); Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow y David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)), pero el procedimiento no se limita a estos.
Los ejemplos de dicha cromatografía incluyen cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía hidrófoba, cromatografía de filtración en gel, cromatografía en fase inversa y cromatografía de adsorción.
Dicha cromatografía puede llevarse a cabo empleando cromatografía líquida tal como HPLC o FPLC.
Como columna para su uso en la cromatografía de afinidad, se puede ilustrar una columna de Proteína A y una columna de Proteína G. Por ejemplo, como columna que usa una columna de Proteína A, se puede ilustrar Hyper D, POROS, Sepharose FF (Pharmacia Corporation) y similares.
Además, mediante el uso de un portador que tiene un antígeno inmovilizado sobre el mismo, también puede purificarse el anticuerpo usando las propiedades de unión del anticuerpo al antígeno.
El anticuerpo en el conjugado de anticuerpo-fármaco solo ha de ser el anticuerpo, que es capaz de dirigirse a células tumorales. Es decir, el anticuerpo puede poseer la propiedad de reconocer células tumorales, la propiedad de unirse a células tumorales, la propiedad de internalizarse en células tumorales y más preferentemente, posee incluso actividad citocida contra células tumorales. Dicho anticuerpo puede conjugarse con un fármaco antitumoral a través de la estructura enlazadora de la presente invención para obtener un excelente conjugado de anticuerpo-fármaco. Específicamente, el anticuerpo usado en el conjugado de anticuerpo-fármaco de la presente invención no se limita al
anticuerpo anti-HER2 y los ejemplos del mismo incluyen, pero sin limitación, anticuerpos anti-A33, anticuerpos anti-B7-H3, anticuerpos anti-CanAg, anticuerpos anti-CD2o, anticuerpos anti-CD22, anticuerpos anti-CD30, anticuerpos anti-CD33, anticuerpos anti-CD56, anticuerpos anti-CD70, anticuerpos anti-CD98, anticuerpos anti-CEA, anticuerpos anti-Cripto, anticuerpos anti-EphA2, anticuerpos anti-G250, anticuerpos anti-GPNMB, anticuerpos anti-HER3, anticuerpos anti-integrina, anticuerpos anti-mesotelina, anticuerpos anti-MUC1, anticuerpos anti-PSMA, anticuerpos anti-SLC44A4, anticuerpos anti-tenascina-C y anticuerpos anti-TROP2.
[Compuesto antitumoral]
A continuación se explica el compuesto antitumoral que se va a conjugar con el conjugado de anticuerpo anti-HER2-fármaco de la presente invención. El compuesto antitumoral usado en la presente invención no está particularmente limitado, a condición de que sea un compuesto que tenga un efecto antitumoral y un grupo sustituyente o una estructura parcial que permita la conexión a una estructura enlazadora. Cuando se escinde una parte o la totalidad del enlazador en las células tumorales, se libera el resto de compuesto antitumoral para que muestre el efecto antitumoral del compuesto antitumoral. A medida que se escinde el enlazador en una posición de unión al fármaco, se libera el compuesto antitumoral en una estructura no modificada para que muestre su efecto antitumoral intrínseco.
Como compuesto antitumoral usado en la presente invención, puede usarse preferentemente exatecán (((1S,9S)-1-amino-9-etil-5-fluoro-2,3-dihidro-9-hidroxi-4-metil-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolina-10,13(9H,15H)-diona; mostrado en la siguiente fórmula), uno de los derivados de la camptotecina.
[ F ó r m u l a 21]
Aunque tiene un excelente efecto antitumoral, el exatecán no se ha comercializado como fármaco antitumoral. El compuesto puede obtenerse fácilmente mediante un procedimiento conocido y puede usarse preferentemente el grupo amino en la posición 1 como la posición de unión a su estructura enlazadora. Además, aunque el exatecán también puede liberarse en las células tumorales mientras una parte del enlazador sigue unida a las mismas, es un compuesto excelente que muestra un excelente efecto antitumoral incluso en dicha estructura.
Debido a que el exatecán tiene estructura de camptotecina, se sabe que el equilibrio se desplaza a una estructura con un anillo de lactona cerrado (anillo cerrado) en un medio ácido acuoso (por ejemplo, pH 3 o similar) pero se desplaza a una estructura con un anillo de lactona abierto (anillo abierto) en un medio básico acuoso (por ejemplo, pH 10 o similar). También se espera que un conjugado de fármaco que se introduce con un resto de exatecán correspondiente a la estructura de anillo cerrado y la estructura de anillo abierta tenga el mismo efecto antitumoral y huelga decir que cualquiera de estas estructuras se encuentra dentro del ámbito de la presente invención.
Los ejemplos adicionales del compuesto antitumoral pueden incluir doxorrubicina, daunorrubicina, mitomicina C, bleomicina, ciclocitidina, vincristina, vinblastina, metotrexato, agente antitumoral a base de platino (cisplatino o sus derivados), taxol o derivados del mismo y otras camptotecinas o derivados de las mismas (agente antitumoral descrito en la patente japonesa abierta a consulta n.° 6-87746).
Con respecto al conjugado de anticuerpo-fármaco, el número de moléculas de fármaco conjugadas por molécula de anticuerpo es un factor clave que tiene influencia en la eficacia y la seguridad. La producción del conjugado de anticuerpo-fármaco se lleva a cabo definiendo las condiciones de reacción, incluyendo las cantidades de materias primas y reactivos usados para la reacción, a fin de tener un número constante de moléculas de fármaco conjugadas. Generalmente se obtiene una mezcla que contiene diferentes números de moléculas conjugadas de fármaco, a diferencia de la reacción química de un compuesto de bajo peso molecular. La cantidad de fármacos conjugados en una molécula de anticuerpo se expresa o especifica mediante el valor medio, es decir, el número medio de moléculas de fármaco conjugadas. Salvo que se describa específicamente lo contrario como un principio, el número de moléculas de fármaco conjugadas significa el valor medio, excepto en el caso en el que representa un conjugado de anticuerpofármaco que tiene un número específico de moléculas de fármaco conjugadas que se incluye en una mezcla de conjugado de anticuerpo-fármaco que tiene diferentes números de moléculas de fármaco conjugadas.
El número de moléculas de exatecán conjugadas a una molécula de anticuerpo es controlable y como número medio de moléculas de fármaco conjugadas por molécula de anticuerpo, pueden unirse aproximadamente de 1 a 10 moléculas de exatecán. Preferentemente, es de 2 a 8 y más preferentemente de 3 a 8. Entre tanto, una persona experta en la materia puede diseñar una reacción para conjugar un número necesario de moléculas de fármaco a una molécula de anticuerpo, basándose en la descripción de los ejemplos de la presente solicitud y puede obtener un conjugado de anticuerpo-fármaco conjugado con un número controlado de moléculas de exatecán.
[Estructura del enlazador]
1. Enlazador
En lo sucesivo en el presente documento, se describe el enlazador de la presente invención. El enlazador de la presente invención tiene una estructura como se define en las reivindicaciones, dentro de cualquiera de las siguientes fórmulas:
-L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-Lb-Lc- o -L1-L2-LP-.
El anticuerpo está conectado al L1 terminal, el cual es un terminal opuesto a la conexión a L2. El fármaco antitumoral está conectado al Lc terminal, el cual es un terminal opuesto a la conexión de Lb o el LP terminal, el cual es un terminal opuesto a la conexión a L2.
En cuanto al resto de la estructura representada por -NH-(CH2)n1_ en el enlazador, n1 es un número entero de 0 a 6 y es preferentemente un número entero de 1 a 5, y más preferentemente 1 a 3. El resto del grupo amino de este resto se conecta al C terminal de Lp.
2. LP
En el enlazador, LP es un péptido que consiste en 2 a 8 aminoácidos. Cada aminoácido que constituye el péptido puede ser un aminoácido tal como fenilalanina (Phe; F), leucina (Leu; L), glicina (Gly; G), alanina (Ala; A), valina (Val; V) o citrulina (Cit). El aminoácido que constituye el péptido puede ser un aminoácidofidrófilo que tiene un resto de estructura hidrófila o puede ser ácido aspártico (Asp; D), ácido glutámico (Glu; E), lisina (Lys; K), serina (Ser; S), treonina (Thr; T), glutamina (Gln; Q), asparagina (Asn; N), histidina (His; H), tirosina (Tyr; Y) o arginina (Arg; R). El aminoácido que constituye LP puede ser un L- o un D-aminoácido y es preferentemente un L-aminoácido. Puede ser p-alanina, ácido £-aminocaproico, ácido Y-aminobutírico o similares además de un a-aminoácido, y además, puede ser, por ejemplo, un aminoácido de tipo no natural, tal como un aminoácido N-metilado en su grupo a-amino. Entre estos aminoácidos, los ejemplos preferidos de los mismos pueden incluir fenilalanina, glicina, valina, lisina, citrulina, serina, ácido glutámico y ácido aspártico.
Los ejemplos de una secuencia preferida como LP pueden incluir un tripéptido de GFG y un tetrapéptido de GGFG. Entre estos, GGFG es el más preferido.
Estos péptidos, particularmente GGFG, se puede convertir a otras secuencias mediante la sustitución o adición de un aminoácido constitutivo. Un aminoácido hidrófilo puede usarse preferentemente como el aminoácido para tal sustitución o adición. Puede usarse cualquiera de los aminoácidos hidrófilos mostrados anteriormente, y los ejemplos preferidos de los mismos pueden incluir ácido aspártico, ácido glutámico, lisina y serina. Los ejemplos de una secuencia en la que se agrega el aminoácido hidrofílico pueden incluir una secuencia en la que uno o dos aminoácidos se añaden al N terminal del péptido enlazador. En el caso de añadir dos aminoácidos hidrófilos, uno de ellos es preferentemente ácido aspártico. Ejemplos de tal secuencia puede incluir DGGFG, KGGFG, EGGFG, SGGFG, DDGGFG, KDGGFG, EDGGFG y s Dg Gf G. Los péptidos obtenidos mediante la retirada de la glicina C terminal de estos también pueden usarse preferentemente. Entre ellos, se prefiere DGGF. Esto es particularmente preferido cuando el enlazador tiene una estructura representada por -L1-L2-Lp-.
Se puede añadir serina al C terminal del péptido enlazador. Ejemplos de los mismos pueden incluir GGFGS y DGGFS.
La glicina también se clasifica como un aminoácido hidrófilo y también se sabe que es hidrófila. Se puede añadir un péptido en el que dos o tres o más residuos de glicina están conectados consecutivamente. Los ejemplos preferidos de tal forma de glicina pueden incluir un di- o tripéptido de glicina. Para el péptido enlazador que contiene tal secuencia, se prefiere que esta secuencia esté presente en el C terminal. Ejemplos de los mismos pueden incluir GGFGG y GGFGGG. En el péptido que tiene tales residuos de glicina, se puede conectar un aminoácido adicional al C terminal, y los ejemplos del mismo pueden incluir GGFGGE y GGFGGGFG.
Los ejemplos del péptido enlazador mínimo pueden incluir VC y VA además de un dipéptido de VK que contiene lisina que tiene una estructura hidrófila.
Los ejemplos del péptido que contiene un D-aminoácido pueden incluir DdGGFG en el que el ácido aspártico en el péptido de DGGFG está sustituido con ácido D-aspártico (denominado Dd). Los ejemplos del N-metilaminoácido
pueden incluir DGMeGFG en el cual la glicina como el 2a aminoácido (1a glicina) contado desde el N terminal de DGGFG se convierte en N-metilglicina (sarcosina; referida como GMe) por la metilación de a-amino grupo de los mismos. La selección de dicho D-aminoácido, la selección de un aminoácido N-metilado y, además, la selección de la posición de tal aminoácido dentro del péptido no se limita a estos ejemplos.
En vista de lo anterior, ejemplos del péptido que puede usarse preferentemente como LP en la presente invención pueden incluir VK, VC, GFG, GGFG, GGFGG, GGFGS, GGFGGG, GGFGGE, GGFGGGFG, DGGF, DGGFG, DdGGFG, DGMeGFG, DGGFS, DDGGFG, KDGGFG, KGGFG, EGGFG y SGGFG. Entre estos, se prefiere GGFG, GGFGG, GGFGS, GGFGGE, GDGGF, DGGFG, DdGGFG, DGMeGFG, DGGFS, DDGGFG, KDGGFG, KGGFG, EGGFG o SGGFG. Es más preferido GGFG, GDGGF, DGGFG, DdGGFG, DGMeGFG, DGGFS, DDGGFG o KDGGFG. Además, se prefiere GGFG, DGGFG, DdGGFG, o DGMeGFG.
Cuando la estructura del enlazador es -L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-Lb-Lc-, LP es preferentemente GGFG o DGGFG, más preferentemente GGFG. Cuando la estructura del enlazador es -NH-(CH2)n1-La-Lb-Lc- sin -L1-L2-LP-, LP puede ser GGFG, GDGGF, DGGFG, DdGGFG, DGMeGFG, DGGFS, DDGGFG o KDGGFG, pero es preferentemente GGFG o contiene ácido aspártico, más preferentemente DGGFG, DdGGFG o DGMeGFG, más preferentemente GGFG o DGGFG.
3. L1
En el enlazador, L1 tiene una estructura representada por
-(Succinimid-3-il-N)-(CH2)n2-C(=O)-,
-(Succinimid-3-il-N)-CH[-(CH2)n3-COOH]-C(=O)-,
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-[N(-CH2-COOH)]-CH2-(C=O)-,
-CH2-C(=O)-NH-(CH2)n4-C(=O)-,
-C(=O)-cic.Hex(1,4 )-CH2-(N-li-3 -diminiccus)-, o
-C(=O)-(CH2)n5-C(=O)-,
En este caso, n2 es un número entero de 2 a 8 , n3 es un número entero de 1 a 8 , n4 es un número entero de 1 a 8 y n5 es un número entero de 1 a 8.
En la estructura representada por -(Succinimid-3 -il-N)-(CH2)n2-C(=O)- de L1, "-(Succinimid-3-il-N)-" es una estructura representada por la siguiente fórmula.
La posición 3 de la estructura parcial anterior es la posición de conexión con el anticuerpo. El enlace al anticuerpo en la posición 3 se caracteriza por unirse con la formación de tioéter en un sitio de enlace disulfuro en la parte de bisagra del anticuerpo. Por otro lado, el átomo de nitrógeno en la posición 1 del resto de la estructura se une al átomo de carbono del metileno que está presente en el enlazador incluyendo la estructura. De manera específica, anticuerpo-S-(Succinimid-3-il-N)-(CH2)n2-C(=O)-L2- es una estructura representada por la siguiente fórmula (en el presente documento, "anticuerpo-S-" se origina en un anticuerpo).
n2 es un número entero de 2 a 8 y es preferentemente de 2 a 5.
La estructura representada por -(Succinimid-3-il-N)-CH[-(CH2)n3-COOH]-C(=O)- de L1 es una estructura hidrófila. n3 es un número entero de 1 a 8 y es preferentemente de 2 a 4, más preferentemente 2. En -(CH2)n3-COOH de este resto de estructura hidrófila, el resto del grupo carboxi puede ser un grupo hidroxilo o un grupo amino. Cuando L1 es -(Succinimid-3-il-N)-CH[-(CH2)n3-COOH]-C(=O)-, -NH-(CH2CH2-O)n6-CH2CH2-C(=O)- se selecciona preferentemente como L2 y n6 es preferentemente de 0 a 4.
La estructura representada por -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-[N(-CH2-COOH)]-CH2-(C=O)- de L1 es también una estructura hidrófila.
En la estructura representada por -CH2-C(=O)-NH-(CH2)n4-C(=O)- de L1, n4 es un número entero de 1 a 8 y es preferentemente de 2 a 6. Esta estructura está conectada al anticuerpo a través del átomo de carbono del metileno terminal y forma la siguiente estructura al unirse con la formación de tioéter, como en lo anterior (en el presente documento, "anticuerpo-S-" se origina a partir de un anticuerpo). Anticuerpo-S-CH2-C(=O)-NH-(CH2)n4-C(=O)-L2-.
En la estructura representada por -C(=O)-cic.Hex(1,4)-CH2-(N-li-3-diminiccuS)- de L1, "-(N-li-3-diminiccuS)-" es una estructura representada por la siguiente fórmula.
[Fórmula 24]
En este resto de estructura, el átomo de nitrógeno en la posición 1 está conectado al átomo de carbono del metileno que está presente dentro del enlazador que incluye la estructura. El átomo de carbono en la posición 3 está conectado al átomo de carbono terminal de -S-(CH2)n8-C(=O)- de L2 Esta estructura -S-(CH2)n8-C(=O)- de L2 se combina solo con -C(=O)-cic.Hex(1,4)-CH2-(N-li-3-diminiccuS)- de L1 para formar una estructura del enlazador. En el presente documento, "-cic.Hex(1,4)-" contenido en el enlazador representa un grupo 1,4-ciclohexileno. El átomo de carbono del carbonilo terminal en la estructura -C(=O)-cic.Hex(1,4)-CH2-(N-li-3-diminiccuS)- forma un enlace amida con el anticuerpo para formar una estructura representada por la siguiente fórmula.
El grupo amino del anticuerpo para formar el enlace amida puede ser un grupo amino de cadena lateral de un residuo de lisina del anticuerpo o el grupo amino N terminal del anticuerpo. Esta estructura también puede conectarse al anticuerpo formando un enlace éster con el grupo hidroxilo de un aminoácido del anticuerpo, además de un enlace amida.
El resto de estructura "-cic.Hex (1,4) -" de esta estructura puede ser un grupo 1,4-ciclohexileno o cualquiera de otros grupos alquileno cíclicos saturados divalentes, es decir, un grupo hidrocarbonado cíclico saturado divalente tal como un grupo ciclobutileno, un grupo ciclopentileno, un grupo cicloheptileno o un grupo ciclooctileno. Como alternativa, puede ser un grupo hidrocarbonado aromático divalente, tal como un grupo fenileno o un grupo naftileno, o puede ser un grupo heterocíclico divalente que contiene uno o dos heteroátomos, el cual es un anillo saturado, parcialmente saturado o aromático de 5 o 6 miembros. Además, puede ser un grupo alquileno divalente que tiene de 1 a 4 átomos de carbono. Las posiciones de la unión divalente pueden ser posiciones adyacentes o pueden ser posiciones distantes.
En la estructura representada por -C(=O)-(CH2)n5-C(=O)- de L1, n5 es un número entero de 1 a 8 y es preferentemente de 2 a 6. El grupo carbonilo terminal en esta estructura también forma un enlace amida, como en la estructura anterior, con el grupo amino de un aminoácido del anticuerpo para formar una estructura representada por la siguiente fórmula (en el presente documento, "anticuerpo-NH-" se origina a partir de un anticuerpo). Anticuerpo-NH-C(=O)-(CH2)n5-C(=O)-L2-.
Los ejemplos específicos de L1 pueden incluir los que tienen las siguientes estructuras:
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-,
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2-C(=O)-,
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-,
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C (=O)-,
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-,
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-,
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-,
-(Succinimid-3-il-N)-CH(-CH2-COOH)-C(=O)-,
-(Succinimid-3-il-N)-CH(-CH2CH2-COOH)-C(=O)-,
-(Succinimid-3-il-N)-CH(-CH2CH2CH2-COOH)-C(=O)-,
-(Succinimid-3-il-N)-CH(-CH2CH2CH2CH2-COOH)-C(=O)-,
-(Succinimid-3-il-N)-CH(-CH2CH2CH2CH2CH2-COOH)-C(=O)-,
-(Succinimid-3-il-N)-CH(-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-COOH)-C(=O)-,
-(Succinimid-3-il-N)-CH(-CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-COOH)-C(=O)-,
-(Succinimid-3-il-N)-CH(-CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-COOH)-C(=O)-,
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-[N(-CH2-COOH)]-CH2-(C=O)-,
-CH2-C(=O)-NH-CH2-C(=O)-,
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-,
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-,
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-,
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-,
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-,
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-,
-C(=O)-cic.Hex(1,4)-CH2-(N-li-3-diminiccus)-,
-C(=O)-Aril (2)-CH2-(N-li-3-diminiccuS)-,
-C(=O)-cic.Het(2)-CH2-(N-li-3-diminiccuS)-,
-C(=O)-CH2-C(=O)-,
-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-,
-C(=O)-CH2CH2CH2-C(=O)-,
-C(=O)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-,
-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-,
-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-,
-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-,
-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-.
(En las anteriores fórmulas , Aril(2) representa un grupo hidrocarburo aromático divalente, y cic.Het(2) representa un grupo heterocíclico cíclico divalente.)
Entre estos, se prefieren los siguientes:
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-,
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2-C(=O)-,
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-,
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-,
-(Succinimid-3-il-N)-CH(-CH2CH2-COOH)-C(=O)-,
-(Succinimid-3-il-N)-CH(-CH2CH2CH2-COOH)-C(=O)
-(Succinimid-3-il-N)-CH(-CH2CH2CH2CH2-COOH)-C(=O)-,
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-[N(-CH2-COOH)]-CH2-(C=O)-,
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-,
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-,
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-,
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-,
-C(=O)-cic.Hex(1,4)-CH2-(N-li-3-diminiccus)-,
-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-,
-C(=O)-CH2CH2CH2-C(=O)-,
-C(=O)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-,
-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-,
-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-.
4. L2
En el enlazador, L2 tiene una estructura representada por
-NH-(CH2CH2-O)n6-CH2CH2-C(=O)-,
-N[-(CH2CH2-O)n7-CH2CH2-OH]-CH2-C(=O)-,
-NH-CH2CH2-[N(-CH2-COOH)]-CH2-(C=O)-,
-NH-[CH(-CH2-COOH)]-CH2-(C=O)-,
-NH-[CH(-CH2-COOH)]-CH2-O-CH2-(C=O)-,
o
-S-(CH2)n8-C(=O)-,
o L2 puede no estar presente, y en tal caso, L2 es un enlace sencillo. n6 es un número entero de 0 a 6, n7 es un número entero de 1 a 4, y n8 es un número entero de 1 a 6. Estas estructuras de L2 excepto para -S-(CH2)n8-C(=O)- son estructuras hidrófilas.
En la estructura representada por -NH-(CH2CH2-O)n6-CH2CH2-C(=O)- de L2, n6 es un número entero de 0 a 6 y es preferentemente de 2 a 4. También, se prefiere 0. Esta estructura está conectada a L1 a través del átomo de nitrógeno del grupo amino terminal y conectada al N terminal de LP a través del grupo carbonilo terminal en el lado opuesto. Cuando L1 es -(Succinimid-3-il-N)-CH[-(CH2)n3-COOH]-C(=O)-, solo está conectado a -NH-(CH2CH2-O)n6-CH2CH2-C(=O)- como L2, y n6 es 0.
L2 puede tener una estructura representada por -N[-(CH2CH2-O)n7-CH2CH2-OH]-CH2-(C(=O)-. En este caso, n7 es un número entero de 1 a 4 y es preferentemente de 3 o 4. Esta estructura está conectada a L1 a través del grupo amino terminal y conectada al N terminal de LP a través del grupo carbonilo terminal en el lado opuesto.
Ejemplos adicionales de L2 pueden incluir los que tienen una estructura de -NH-CH2CH2-[N(-CH2-COOH)]-CH2-(C=O)-, -NH-[CH(-CH2-COOH)]-CH2-(C=O)- o -NH-[CH(-CH2-COOH)]-CH2-O-CH2-(C=O)-. Cualquiera de estos están conectados a L1 a través del grupo amino terminal y conectada al N terminal de LP a través del grupo carbonilo terminal en el lado opuesto.
En -S-(CH2)n8-C(=O)- de L2, n8 es un número entero de 1 a 6 y es preferentemente de 2 a 4.
Los ejemplos específicos de L2 pueden incluir los que tienen las siguientes estructuras:
-NH-CH2CH2-C(=O)-,
-NH-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-,
-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-,
-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-,
-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-,
-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-,
-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-,
-N(-CH2CH2-O-CH2CH2-OH)-CH2-C(=O)-,
-N (-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-OH) -CH2-C(=O)-,
-N (-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-OH)-CH2-C(=O)-,
-N (-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-OH)-CH2-C(=O)-,
-NH-CH2CH2-[N(-CH2-COOH)]-CH2-(C=O)-,
-NH-[CH(-CH2-COOH)]-CH2-(C=O)-,
-NH-[CH(-CH2-COOH)]-CH2-O-CH2-(C=O)-.
Entre estos, se prefieren los siguientes:
-NH-CH2CH2-C(=O)-,
-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-,
-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-,
-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-,
-N(-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-OH)-CH2-C(=O)-,
-N(-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-OH)-CH2-C(=O)-,
-NH-CH2CH2-[N(-CH2-COOH)]-CH2-(C=O)-,
-NH-[CH(-CH2-COOH)]-CH2-(C=O)-,
-NH-[CH(-CH2-COOH)]-CH2-O-CH2-(C=O)-.
Cuando L2 es -S-(CH2)n8-C(=O)-, L1 para combinarse es -C(=O)-cic.Hex(1,4 )-CH2-(N-li-3-diminiccuS)-. Por lo tanto, ejemplos específicos de -L1-L2- pueden incluir los que tienen las siguientes estructuras:
-C(=O)-cic.Hex(1,4 )-CH2-(N-li-3 -diminiccuS)-S-CH2-C(=O)
-C(=O)-cic.Hex(1,4 )-CH2-(N-li-3 -diminiccuS)-S-CH2CH2-C(=O)-,
-C(=O)-cic.Hex(1,4 )-CH2-(N-li-3 -diminiccuS)-S-CH2CH2CH2-C(=O)-,
-C(=O)-cic.Hex(1,4 )-CH2-(N-li-3 -diminiccuS)-S-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-,
-C(=O)-cic.Hex(1,4 )-CH2-(N-li-3 -diminiccuS)-S-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-,
-C(=O)-cic.Hex(1,4 )-CH2-(N-li-3 -diminiccuS)-S-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-.
Entre estos, se prefieren los siguientes:
-C(=O)-cic.Hex(1,4 )-CH2-(N-li-3 -diminiccuS)-S-CH2CH2-C(=O)-,
-C(=O)-cic.Hex(1,4 )-CH2-(N-li-3 -diminiccuS)-S-CH2CH2CH2-C(=O)-,
-C(=O)-cic.Hex(1,4 )-CH2-(N-li-3 -diminiccuS)-S-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-.
5. La
La tiene cualquiera de las estructuras de -C(=O)-NH-, -NR1-(CH2)n9- y -0-, o es un enlace sencillo. n9 es un número entero de 1 a 6 , R1 es un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo que tiene de 1 a 6 átomos de carbono, -(CH2)na-COOH 0 -(CH2)nb-OH, na es un número entero de 1 a 4 y nb es un número entero de 1 a 6.
La estructura amida -C(=O)-NH- de La está conectada a Lb a través del átomo de nitrógeno. En el resto de estructura -NR1-(CH2)n9- de La, n9 es un número entero de 1 a 6 y es preferentemente de 1 a 3. El resto está conectado a Lb a través del metileno.
R1 puede ser un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo que tiene de 1 a 6 átomos de carbono. El grupo alquilo que tiene de 1 a 6 átomos de carbono puede ser lineal o ramificado. Los ejemplos del mismo pueden incluir un grupo metilo, un grupo etilo, un grupo propilo, un grupo isopropilo, un grupo butilo, un grupo isobutilo, un grupo sec-butilo, un grupo ferc-butilo, un grupo pentilo, un grupo isopentilo, un grupo 2 -metilbutilo, un grupo neopentilo, un grupo 1 -etilpropilo, un grupo hexilo, un grupo isohexilo, un grupo 4-metilpentilo, un grupo 3-metilpentilo, un grupo 2-metilpentilo, un grupo 1 -metilpentilo, un grupo 3,3-dimetilbutilo, un grupo 2,2-dimetilbutilo, un grupo 1,1-dimetilbutilo, un grupo 1,2-dimetilbutilo, un grupo 1,3-dimetilbutilo, un grupo 2,3-dimetilbutilo y un grupo 2-etilbutilo. Entre estos, se prefiere un grupo metilo o un grupo etilo.
Cuando R1 tiene una estructura representada por - (CH2) na-COOH, na es un número entero de 1 a 4 y es preferentemente 1 o 2.
Cuando R1 tiene una estructura representada por -(CH2)nb-OH, nb es un número entero de 1 a 6 y es preferentemente 1 o 2.
R1 es preferentemente un átomo de hidrógeno, un grupo metilo, un grupo etilo, -CH2-COOH, -CH2CH2-COOH o -CH2CH2-OH, más preferentemente un átomo de hidrógeno, un grupo metilo o -CH2-COOH, además preferentemente un átomo de hidrógeno.
La puede ser -0- o un enlace sencillo.
5. Lb
Lb tiene una estructura de -CR2(-R3)-, -O- o -NR4- o es un enlace sencillo. En este caso, R2 y R3 son cada uno independientemente un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo que tiene de 1 a 6 átomos de carbono, -(CH2)nc-NH2, -(CH2) nd-COOH o -(CH2)ne-OH, R4 es un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo que tiene de 1 a 6 átomos de carbono, nc es un número entero de 0 a 6 , nd es un número entero de 1 a 4, ne es un número entero de 0 a 4 y cuando nc o ne es 0, R2 y R3 no son los mismos.
Cuando cada uno de R2 y R3 es un grupo alquilo, este grupo alquilo es un grupo alquilo como se define en el grupo
alquilo para R1. Cuando cada uno de R2 y R3 tiene una estructura de -(CH2)nc-NH2, nc es un número entero de 0 a 6 y es preferentemente 0, o es de 3 a 5. Cuando nc es 0, R2 y R3 no son los mismos. Cuando cada uno de R2 y R3 tiene una estructura de -(CH2)nd-COOH, nd es un número entero de 1 a 4 y es preferentemente 1 o 2. Cuando cada uno R2 y R3 tiene una estructura de -(CH2)ne-OH, ne es un número entero de 0 a 4 y es preferentemente 1 o 2.
Cada uno de R2 y R3 es preferentemente un átomo de hidrógeno, un grupo metilo, un grupo etilo, -NH2, -CH2CH2CH2-NH2, -CH2CH2CH2CH2-NH2, -CH2CH2CH2CH2CH2CH2-NH2, -CH2-COOH, -CH2CH2-COOH, -CH2-OH o -CH2CH2-OH, más preferentemente un átomo de hidrógeno, un grupo metilo, -NH2, -CH2CH2CH2CH2-NH2, -CH2-COOH,-CH2CH2-COOH, -CH2-OH o -CH2CH2-OH, además preferentemente un átomo de hidrógeno.
Cuando R4 es un grupo alquilo que tiene de 1 a 6 átomos de carbono, este grupo alquilo es un grupo alquilo como se define en el grupo alquilo para R1. R4 es preferentemente un átomo de hidrógeno o un grupo metilo, más preferentemente un átomo de hidrógeno.
Ejemplos específicos de la estructura representada por -NH-(CH2)n1-La-Lb- pueden incluir las que tiene las siguientes estructuras:
-NH-CH2-,
-NH-CH(-Me)-,
-NH-C(-Me)2-,
-NH-CH2-CH(-Me)-,
-NH-CH(-CH2-OH)-,
-NH-CH(-CH2-COOH)-,
-NH-CH(-CH2CH2-COOH)-,
-NH-CH(-CH2CH2CH2CH2-NH2)-,
-NH-CH2CH2-,
-NH-CH2-O-CH2-,
-NH-CH2CH2-O-,
-NH-CH2CH2-O-CH2-,
-NH-CH2CH2C(-Me)2-,
-NH-CH2CH2-NH-,
-NH-CH2CH2-NH-CH2-,
-NH-CH2CH2-N(-Me)-CH2-,
-NH-CH2CH2-N(-Me)-CH2CH2-,
-NH-CH2CH2-NH-CH2CH2-,
-NH-CH2CH2-N(-Me)-CH2CH2-,
-NH-CH2CH2-N(-CH2-COOH)-CH2-,
-NH-CH2CH2-N(-CH2COOH)-CH2CH2-,
-NH-CH2CH2-N(-CH2CH2-OH)-CH2-,
-NH-CH2CH2-N(-CH2CH2-OH)-CH2CH2-,
-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-NH-CH(-CH2-OH)-,
-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-NH-CH(-CH2-COOH)-,
-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-NH-CH(-CH2CH2CH2CH2-NH2)-,
-NH-CH2CH2CH2-,
-NH-CH2CH2CH2CH2-,
-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-,
-NH-CH2CH2CH2CH2CH(-NH2)-.
Entre estos, se prefieren las siguientes estructuras:
-NH-CH2-,
-NH-CH2-CH(-Me)-,
-NH-CH(-CH2-OH)-,
-NH-CH(-CH2CH2-COOH)-,
-NH-CH2CH2-,
-NH-CH2-O-CH2-,
-NH-CH2CH2-O-,
-NH-CH2CH2-O-CH2-,
-NH-CH2CH2C(-Me)2-,
-NH-CH2CH2-NH-,
-NH-CH2CH2-NH-CH2-,
-NH-CH2CH2-N(-Me)-CH2-,
-NH-CH2CH2-N(-Me)-CH2CH2-,
-NH-CH2CH2-N(-CH2-COOH)-CH2-,
-NH-CH2CH2-N(-CH2CH2-OH)-CH2-,
-NH-CH2CH2-N(-CH2CH2-OH)-CH2CH2-,
-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-NH-CH(-CH2-OH)-, -NH-CH2CH2CH2-C(=O)-NH-CH(-CH2-COOH)-, -NH-CH2CH2CH2-,
-NH-CH2CH2CH2CH2-,
-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-.
Son más preferidas las siguientes estructuras:
-NH-CH2-,
-NH-CH2CH2-,
-NH-CH2-O-CH2-,
-NH-CH2CH2-O-,
-NH-CH2CH2-O-CH2-,
-NH-CH2CH2-NH-,
-NH-CH2CH2-NH-CH2-,
-NH-CH2CH2-N(-CH2-COOH)-CH2-,
-NH-CH2CH2-N(-CH2CH2-OH)-CH2CH2-,
-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-NH-CH (-CH2-COOH)-, -NH-CH2CH2CH2-,
-NH-CH2CH2CH2CH2-,
-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-.
Además, se prefieren las siguientes estructuras:
-NH-CH2-,
-NH-CH2CH2-,
-NH-CH2CH2CH2-,
-NH-CH2-O-CH2-,
-NH-CH2CH2-O-CH2-.
6. Lc
Lc tiene una estructura representada por -CH2- o -C(=O)-. Esta estructura está conectada al compuesto antitumoral. Lc en el enlazador es preferentemente -C(=O)-.
7. Enlazador y actividad farmacológica
Con respecto al conjugado anticuerpo-fármaco de la presente invención, cuando se transfiere al interior de las células tumorales, se ha sugerido que el resto enlazador se escinde y el derivado del fármaco tiene una estructura representada por NH2-(CH2)n1-La-Lb-Lc-(NH-DX) se libera para expresar una acción antitumoral. Los ejemplos del derivado antitumoral que exhibe un efecto antitumoral mediante la liberación del conjugado anticuerpo-fármaco de la presente invención incluyen un derivado antitumoral que tiene un resto estructural en el que un terminal de Lc que está conectado a la estructura representada por -NH-(CH2)n1-La-Lb del enlazador tiene un grupo amino, y las particularmente preferidas incluyen los siguientes:
NH2-CH2-C(=O)-(NH-DX),
NH2-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
NH2-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
NH2-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
NH2-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX).
Entre tanto, en el caso de NH2-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX), como la estructura aminal en la molécula es inestable, esta experimenta de nuevo una autodegradación para liberar el HO-CH2-C(=O)-(NH-DX) siguiente. Esos compuestos también pueden usarse preferentemente como un intermedio de producción del conjugado de fármaco con anticuerpo de la presente invención.
8. -L1-L2-LP- o -L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-Lb-Lc-En el conjugado anticuerpo-fármaco de la presente invención, el número conjugado promedio de los restos de estructura del enlazador del fármaco por molécula de anticuerpo puede ser de 1 a 10 y es preferentemente de 2 a 8, más preferentemente de 3 a 8. El resto de estructura de fármaco-enlazador es preferentemente un fármaco conectado a un resto de estructura del enlazador que tiene una estructura que se describe a continuación. La estructura del enlazador puede ser una estructura de -L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-Lb-Lc- o es una estructura de -L1-L2-LP-, LP de la cual está directamente conectada al fármaco.
Cuando el resto de estructura fármaco-enlazador se conjuga al anticuerpo a través de un enlace tioéter, una estructura representada por -(Succinimid-3-il-N)-(CH2)n2-C(=O)--(Succinimid-3-il-N)-CH[-(CH2)n3-COOH]-C(=O)-, -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-[N(-CH2-COOH)]-CH2-(C=O)- o -CH2-C(=O)-NH-(CH2)n4-C(=O)- puede usarse como L1. Cuando el resto de estructura fármaco-enlazador se conjuga al anticuerpo a través de un enlace amida, una estructura representada por -C(=O)-cic.Hex(1,4)-CH2-(N-li-3-diminiccuS)- o -C(=O)-(CH2)n5-C(=O)- puede usarse como L1. Cuando L1 es -(Succinimid-3-il-N)-(CH2)n2-C(=O)-, L2 es un enlace sencillo, o es -NH-(CH2CH2-O)n6-CH2CH2-C(=O)-, -N[-(CH2CH2-O)n7-CH2CH2-OH]-CH2-C(=O)-, -NH-[CH(-CH2-COOH)]-CH2-(C=O)-, -NH-CH2CH2-[N(-CH2-COOH)]-CH2-(C=O)- o -NH-[CH(-CH2-COOH)]-CH2-O-CH2-(C=O)-. Para tal L1 y L2, ejemplos específicos de -L1-L2-LP- pueden incluir los que tienen las siguientes estructuras:
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-LP-,
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2-C(=O)-LP-,
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-LP-,
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C (=O)-LP-,
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-LP-,
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-LP-,
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-LP-,
-L1-NH-CH2CH2-C (=O)-LP-,
-L1-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-LP-,
-L1-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C (=O)-LP-,
-L1-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-LP-,
-L1-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-LP-,
-L1-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-LP-,
-L1-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O CH2CH2-C(=O)-LP-,
-L1-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-LP-,
-L1-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2-CH2-
C(=O)-LP-,
-L1-N[-CH2CH2-O-CH2CH2-OH]-CH2-C(=O)-LP-,
-L1-N[-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-OH]-CH2-C(=O)-LP-,
- L1-N[-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-OH]-CH2-C(=O)-LP-,
-L1-N[-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-OH]-CH2-C(=O)-LP-,
-L1-NH-CH2CH2-[N(-CH2-COOH)]-CH2-(C=O)-LP-,
-L1-NH-[CH(-CH2-COOH)]-CH2-O-CH2-(C=O)-LP-.
En este caso, L1 preferentemente tiene la siguiente estructura en la cual n2 es 2 o 3:
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)- o -(Succinimid-3-il-N) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (=O)-.
Por lo tanto, -L1-L2-LP- preferentemente tiene cualquiera de las siguientes estructuras que tiene la estructura de L1 como sigue a continuación:
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-LP-,
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-LP-,
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2-CH2-C(=O)-LP-,
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-NH-CH2-CH2-C(=O)-LP-,
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2-CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-LP-,
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-LP-, -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-LP-,
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-LP-, -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-LP-, -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2-CH2-C(=O)-LP-,
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-N[-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-OH]-CH2-C(=O)-LP-,
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-N[-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-OH]-CH2-C(=O)-LP-, -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-N[-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-OH]-CH2-C(=O)-LP-, -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-N[-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-OH]-CH2-C(=O)-LP-, -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-N[-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-OH]-CH2-C(=O)-LP-,
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-N[-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-OH]-CH2-C(=O)-LP-,
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-[N(-CH2-COOH)]-CH2-(C=O)-LP-,
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-[N(-CH2-COOH)]-CH2-(C=O)-LP-,
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-[CH(-CH2-COOH)]-CH2-O-CH2-(C=O)-LP-,
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-NH-[CH(-CH2-COOH)]-CH2-O-CH2-(C=O)-LP-.
Entre estos, además, se prefieren las siguientes estructuras:
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-LP-,
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2-CH2-C(=O)-LP-,
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-NH-CH2-CH2-C(=O)-LP-,
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-LP-,
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-LP-, -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-LP-, -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2-CH2-C(=O)-LP-,
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-N[-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-OH]-CH2-C(=O)-LP-,
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-N[-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-OH]-CH2-C(=O)-LP-, -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-N[-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-OH]-CH2-C(=O)-LP-, -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-N[-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-OH]-CH2-C(=O)-LP-,
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-N[-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-OH]-CH2-C(=O)-LP-
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-N[-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-OH]-CH2-C(=O)-LP-,
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-[N(-CH2-COOH)]-CH2-(C=O)-LP-,
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-[N(-CH2-COOH)]-CH2-(C=O)-LP-,
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-[CH(-CH2-COOH)]-CH2-O-CH2-(C=O)-LP-,
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-NH-[CH(-CH2-COOH)]-CH2-O-CH2-(C=O)-LP-.
Cuando L1 es -(Succinimid-3-il-N)-CH[-(CH2)n3-COOH]-C(=O)-, L2 es un enlace sencillo o -NH-(CH2CH2-O)n6-CH2CH2-C(=O)-. Para tal L1 y L2, de manera específica, -L1-L2-LP- preferentemente tiene cualquiera de las siguientes estructuras:
-(Succinimid-3- -N)-CH(-CH2-COOH)-C(=O)-LP-,
-(Succinimid-3- -N)-CH(-CH2CH2-COOH)-C(=O)-LP-,
-(Succinimid-3- N)-CH(-CH2CH2CH2-COOH)-C(=O)-LP-,
-(Succinimid-3- -N)-CH(-CH2CH2CH2CH2-COOH)-C(=O)-LP-,
-(Succinimid-3- N)-CH(-CH2CH2CH2CH2CH2-COOH)-C(=O)-LP-,
-(Succinimid-3- -N)-CH(-CH2CH2CH2CH2cH2CH2-COOH)-C(=O)-LP-,
-(Succinimid-3- N)-CH(-CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-COOH)-C(=O)-LP-,
-(Succinimid-3- -N)-CH(-CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-COOH)-C(=O)-LP-,
-(Succinimid-3- N)-CH[-(CH2)n3-COOH]-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-LP-,
-(Succinimid-3- -N)-CH[-(CH2)n3-COOH]-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-LP-,
-(Succinimid-3- -N)-CH[-(CH2)n3-COOH]-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-LP-, -(Succinimid-3- N)-CH[-(CH2)n3-COOH]-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-LP-, -(Succinimid-3- -N)-CHKCH2)n3-COOH]-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-LP-.
Entre estos, se prefieren las siguientes estructuras en la cuales n3 es de 2 a 4:
-(Succinimid-3-il-N)-CH(-CH2CH2-COOH)-C(=O)-LP-,
-(Succinimid-3-il-N)-CH(-CH2CH2CH2-COOH)-C(=O)-LP-,
-(Succinimid-3-il-N)-CH(-CH2CH2CH2CH2-COOH)-C(=O)-LP-,
-(Succinimid-3-il-N)-CH(-CH2CH2-COOH)-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-LP-,
-(Succinimid-3-il-N)-CH(-CH2CH2-COOH)-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-LP-,
-(Succinimid-3-il-N)-CH(-CH2CH2-COOH)-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-LP-, -(Succinimid-3-il-N)-CH(-CH2CH2-COOH)-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-LP-, -(Succinimid-3-il-N)-CH(-CH2CH2-COOH)-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2-CH2-C(=O)-LP-,
-(Succinimid-3-il-N)-CH(-CH2CH2CH2-COOH)-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-LP-,
-(Succinimid-3-il-N)-CH(-CH2CH2-COOH)-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-LP-,
-(Succinimid-3-il-N)-CH(-CH2CH2CH2-COOH)-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-LP-, -(Succinimid-3-il-N)-CH(-CH2CH2CH2-COOH)-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2-CH2-C(=O)-LP-, -(Succinimid-3-il-N)-CH(-CH2CH2CH2-COOH)-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2-CH2-C(=O)-LP-,
-(Succinimid-3-il-N)-CH(-CH2CH2CH2CH2-COOH)-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-LP-,
-(Succinimid-3-il-N)-CH(-CH2CH2CH2CH2-COOH)-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-LP-,
-(Succinimid-3-il-N)-CH(-CH2CH2CH2CH2-COOH)-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-LP-, -(Succinimid-3-il-N)-CH(-CH2CH2CH2CH2-COOH)-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2-CH2-C(=O)-LP-,
-(Succinimid-3-il-N)-CH(-CH2CH2CH2CH2-COOH)-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2-CH2-C(=O)-LP-.
Entre estos, siguientes estructuras en las cuales n3 es 2:
-(Succinimid-3-il-N)-CH(-CH2CH2-COOH)-C(=O)-LP-,-(Succinimid-3-il-N)-CH(-CH2CH2-COOH)-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-LP-,
-(Succinimid-3-il-N)-CH(-CH2CH2-COOH)-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-LP-,
-(Succinimid-3-il-N)-CH(-CH2CH2-COOH)-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-LP-, -(Succinimid-3-il-N)-CH(-CH2CH2-COOH)-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-LP-, -(Succinimid-3-il-N)-CH(-CH2CH2-COOH)-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-LP-.
Una forma en la cual n6 es 0 también se prefiere, es decir, se prefiere una estructura representada por -(Succinimid-3-il-N)-CH[-(CH2)n3-COOH]-C(=O)-NH-CH2-CH2-C(=O)-LP-. De manera específica, se prefieren las siguientes estructuras:
-(Succinimid-3-il-N)-CH(-CH2CH2-COOH)-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-LP-,
-(Succinimid-3-il-N)-CH(-CH2CH2CH2-COOH)-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-LP-,
-(Succinimid-3-il-N)-CH(-CH2CH2CH2CH2-COOH)-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-LP-.
Cuando L1 es -(Succinimid-3 -il-N)-CH2CH2-[N(-CH2-COOH)]-CH2-(C=O)-, L2 puede ser un enlace sencillo. Para tal L1 y L2, de manera específica, -L1-L2-LP- tiene una estructura representada por -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-[N(-CH2-COOH)]-CH2-(C=O)-LP-.
Cuando L1 es -CH2-C(=O)-NH-(CH2)n4-C(=O)-, L2 puede ser un enlace sencillo. Para tal L1 y L2, de manera específica, L1-L2-LP-tiene cualquiera de las siguientes estructuras:
-CH2-C(=O)-NH-CH2-C(=O)-LP-,
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-LP-,
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-LP-,
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-LP-,
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-LP-,
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-LP-,
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-LP-,
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-LP-.
Cuando L1 es -C(=O)-(CH2)n5-C(=O)-, L2 se selecciona entre -NH-(CH2CH2-O)n6-CH2CH2-C(=O)- y un enlace sencillo. Para tal L1 y L2, de manera específica, L1-L2-LP- tiene cualquiera de las siguientes estructuras:
-C(=O)-CH2-C(=O)-LP-,
-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-LP-,
-C(=O)-CH2CH2CH2-C(=O)-LP-,
-C(=O)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-LP-,
-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-LP-,
-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-LP-,
-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-LP-,
-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-LP-,
-C(=O)-(CH2)n5-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-LP-,
-C(=O)-(CH2)n5-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-LP-,
-C(=O)-(CH2)n5-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-LP-,
-C(=O)-(CH2)n5-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-LP-, -C(=O)-(CH2)n5-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-LP-, -C(=O)-(CH2)n5-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-LP-,
-C(=O)-(CH2)n5-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-LP-,
-C(=O)-(CH2)n5-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-LP-,
-C(=O)-(CH2)n5-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2-H2-O-CH2-H2-O-CH2-H2-O-CH2-CH2-C(=O)-LP-.
L2 que tiene una estructura representada por -S-(CH2)n8-C(=O)- se usa junto con -C(=O)-cic.Hex(1 ,4 )-CH2-(N-li-3 -diminiccuS) - de L1. Para tal L1 y L2, de manera específica, L1-L2-LP- tiene cualquiera de las siguientes estructuras: -C(=O)-cic.Hex(1 ,4 )-CH2-(N-li-3 -diminiccuS)-S-CH2-C(=O)-LP-,
-C(=O)-cic.Hex(1 ,4 )-CH2-(N-li-3 -diminiccuS)-S-CH2CH2-C(=O)-LP-,
-C(=O)-cic.Hex(1 ,4 )-CH2-(N-li-3 -diminiccuS)-S-CH2CH2CH2-C(=O)-LP-,
-C(=O)-cic.Hex(1 ,4 )-CH2-(N-li-3 -diminiccuS)-S-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-LP-,
-C(=O)-cic.Hex(1 ,4 )-CH2-(N-li-3 -diminiccuS)-S-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-LP-,
-C(=O)-cic.Hex(1 ,4 )-CH2-(N-li-3 -diminiccuS)-S-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-LP-.
En cada una de las estructuras del enlazador anteriores, el péptido del resto LP puede seleccionarse a partir del grupo que consiste en VK, VC, GFG, GGFG, GGFGG, GGFGS, GGFGGG, GGFGGE, GGFGGGFG, DGGF, DGGFG, DdGGFG, DGMeGFG, DGGFS, DDGGFG, KDGGFG, KGGFG, EGGFG y SGGFG. Entre estos LP, se prefiere GGFG, GGFGG, GGFGS, GGFGGE, GDGGF, DGGFG, DdGGFG, DGMeGFG, DGGFS, DDGGFG, KDGGFG, KGGFG, EGGFG o SGGFG. Es más preferido GGFG, GDGGF, DGGFG, DdGGFG, DGMeGFG, DGGFS, DDGGFG o KDGGFG. Además, se prefiere GGFG, DGGFG, DdGGFG, o DGMeGFG.
Cuando el resto -NH-(CH2)n1-La-Lb-Lc- está conectado al anterior -L1-L2-LP-, el resto -NH-(CH2)n1-La-Lb-Lc- tiene preferentemente una longitud de cadena de 3 a 7 átomos. Más preferentemente tiene una longitud de cadena de 4 a 7 átomos, más preferentemente una longitud de cadena de 5 o 6 átomos. Aunque los ejemplos específicos del resto -NH-(CH2)n1-La-Lb- en el enlazador son como se han descrito anteriormente, -Nh-CH2Ch 2-C(=O)-, -NH-CH2CH2CH2-C(=O)-, -NH-CH2-O-CH2-C(=O)- o -NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)- se prefieren particularmente.
[Estructura enlazador-fármaco]
Como el ADC de la presente invención, se pueden obtener excelentes propiedades que expresan ADC conjugando el resto enlazador-fármaco que tiene cada una de las estructuras que se muestran a continuación con el anticuerpo.
a. Un resto enlazador-fármaco excelente como un resto enlazador-fármaco que tiene una estructura de -L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-Lb-Lc-(NH-DX), el cual se conjuga con el anticuerpo a través de un enlace sulfuro, en el que LP es GGFG, es como sigue a continuación:
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2-(NH-DX),
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX).
b. Un resto enlazador-fármaco excelente como un resto enlazador-fármaco que tiene una estructura de -L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-Lb-Lc-(NH-DX), el cual se conjuga con el anticuerpo a través de un enlace sulfuro, en el que LP es GGFG y -La-Lb-Lc- tiene una cadena ramificada de alquilo, es como sigue a continuación:
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CMe(-H)-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH(-Me)-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2C(-Me)2-C(=O)-(NH-DX).
c. Un resto enlazador-fármaco excelente como un resto enlazador-fármaco que tiene una estructura de -L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-Lb-Lc-(NH-DX), el cual se conjuga con el anticuerpo a través de un enlace sulfuro, en el que LP es GGFG y -La-Lb-Lc- tiene un átomo de nitrógeno, es como sigue a continuación:
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-NH-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-NH-CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-N(-Me)-CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-N(-Me)-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX).
d. Un resto enlazador-fármaco excelente como un resto enlazador-fármaco que tiene una estructura de -L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-Lb-Lc-(NH-DX), el cual se conjuga con el anticuerpo a través de un enlace sulfuro, en el que LP es GGFG y además tiene un resto de cadena ramificado que tiene un sustituyente hidrófilo, es como sigue a continuación:
-(Succinimid-3-il-N)-CH(-CH2CH2-COOH)-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH(-CH2CH2-COOH)-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-GGFG-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-[N(-CH2-COOH)]-CH2-(C=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-N[-CH2-COOH]-CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-NH-[CH(-CH2-COOH)]-CH2-O-CH2-(C=O)-GFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-N(-CH2CH2-OH)-CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-N(-CH2CH2-OH)-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-N(-CH2-COOH)-CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-N(-CH2-COOH)-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-NH-CH(-CH2-OH)-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-NH-CH(-CH2-COOH)-C(=O)-(NH-DX).
e. Un resto enlazador-fármaco excelente como un resto enlazador-fármaco que tiene una estructura de -L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-Lb-Lc-(NH-DX), el cual se conjuga con el anticuerpo a través de un enlace amida, en el que LP es GGFG, es como sigue a continuación:
-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-C(=O)-cic.Hex(1 ,4 )-CH2-(N-li-3 -diminiccuS)-S-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX).
f. Un resto enlazador-fármaco excelente como un resto enlazador-fármaco que tiene una estructura de -L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-Lb-Lc-(NH-DX), el cual se conjuga con el anticuerpo a través de un enlace sulfuro, en el que LP es GFG, es como sigue a continuación:
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-NH-[CH(-CH2-COOH)]-CH2-O-CH2-(C=O)-GFG-(NH-DX). g. Un resto enlazador-fármaco excelente como un resto enlazador-fármaco que tiene una estructura de -L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-Lb-Lc-(NH-DX), el cual se conjuga con el anticuerpo a través de un enlace sulfuro, en el que LP contiene 4 o más residuos de glicina, es como sigue a continuación:
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-NH-GGFGG-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-NH-GGFGGG-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-NH-GGFGGGFG-(NH-DX).
h. Un resto enlazador-fármaco excelente como un resto enlazador-fármaco que tiene una estructura de -L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-Lb-Lc-(NH-DX), el cual se conjuga con el anticuerpo a través de un enlace sulfuro, en el que LP tiene un aminoácido hidrófilo en el C terminal, es como sigue a continuación:
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-NH-GGFGS-(NH-DX), y
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-NH-GGFGGE-(NH-DX).
i. Un resto enlazador-fármaco excelente como un resto enlazador-fármaco que tiene una estructura de -L1-L2-LP-(NH-DX), el cual se conjuga con el anticuerpo a través de un enlace sulfuro, en el que LP es GGFG, es como sigue a continuación:
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-(NH-DX), and
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-(NH-DX).
j. Un resto enlazador-fármaco excelente como un resto enlazador-fármaco que tiene una estructura de -L1-L2-LP-(NH-DX), el cual se conjuga con el anticuerpo a través de un enlace sulfuro, en el que LP es GGFG y además tiene un resto de cadena ramificado que tiene un sustituyente hidrófilo, es como sigue a continuación:
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-[N(-CH2-COOH)]-CH2-(C=O)-GGFG-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-NH-[CH(-CH2-COOH)]-CH2-(C=O)-GGFG-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-[N(-CH2-COOH)]-CH2-(C=O)-GGFG-(NH-DX).
k. Un resto enlazador-fármaco excelente como un resto enlazador-fármaco que tiene una estructura de -L1-L2-LP-(NH-DX), el cual se conjuga con el anticuerpo a través de un enlace amida, en el que LP es GGFG, es como sigue a continuación:
-C(=O)-cic.Hex(1 ,4 )-CH2-(N-li-3 -diminiccuS)-S-CH2CH2-C(=O)-GGFG-(NH-DX).
l. Un resto enlazador-fármaco excelente como un resto enlazador-fármaco que tiene una estructura de -L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-Lb-Lc-(NH-DX), el cual se conjuga con el anticuerpo a través de un enlace sulfuro, en el que LP es un residuo de péptido que contiene ácido aspártico, lisina, ácido glutámico y/o serina, los cuales son aminoácidos hidrófilos, en particular, un residuo de péptido que tiene ácido aspártico N terminal, es como sigue a continuación:
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGF-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX).
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-DG-GFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-DG-GFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2C(Me)2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGMeGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DDGGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX).
m. Un resto enlazador-fármaco excelente como un resto enlazador-fármaco que tiene una estructura de -L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-Lb-Lc-(NH-DX), el cual se conjuga con el anticuerpo a través de un enlace sulfuro, en el que LP es un residuo de péptido que contiene ácido aspártico, lisina, ácido glutámico y/o serina, los cuales son aminoácidos hidrófilos, en particular, un residuo de péptido que tiene un aminoácido hidrófilo N terminal distinto del ácido aspártico, es como sigue a continuación:
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-KGGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-EGGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-KDGGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX).
n. Un resto enlazador-fármaco excelente como un resto enlazador-fármaco que tiene una estructura de -L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-Lb-Lc-(NH-DX), el cual se conjuga con el anticuerpo a través de un enlace amida, en el que LP es un residuo de péptido que contiene ácido aspártico, lisina, ácido glutámico y/o serina, los cuales son aminoácidos hidrófilos, en particular, un residuo de péptido que contiene ácido aspártico como un aminoácido hidrófilo, es como sigue a continuación:
-C(=O)-cic.Hex(1 ,4 )-CH2-(N-li-3 -diminiccuS)-S-CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX). o. Un resto enlazador-fármaco excelente como un resto enlazador-fármaco que tiene una estructura de -L1-L2-LP-(NH-DX), el cual se conjuga con el anticuerpo a través de un enlace sulfuro, en el que LP es un residuo de péptido que contiene ácido aspártico, lisina, ácido glutámico y/o serina, los cuales son aminoácidos hidrófilos, en particular, un residuo de péptido que tiene ácido aspártico N terminal, es como sigue a continuación:
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-DGGFG-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-DGGFG-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-DG-GFG-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2-C(=O)-NH-DGGFG-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-NH-DGGFG-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-NH-DdGGFG-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-NH-DGMeGFG-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-NH-DGGFS-(NH-DX).
p. Un resto enlazador-fármaco excelente como un resto enlazador-fármaco que tiene una estructura de -L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-(NH-DX), el cual se conjuga con el anticuerpo a través de un enlace sulfuro, en el que LP es un residuo de péptido que contiene ácido aspártico, lisina, ácido glutámico y/o serina, los cuales son aminoácidos hidrófilos, en particular, un residuo de péptido que no tiene ácido aspártico en el N terminal, es como sigue a continuación:
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-NH-KGGFG-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-NH-SGGFG-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-NH-EGGFG-(NH-DX).
q. Un resto enlazador-fármaco excelente como un resto enlazador-fármaco que tiene una estructura de -L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-(NH-DX), el cual se conjuga con el anticuerpo a través de un enlace sulfuro, en el que LP es un residuo péptido de dipéptido, es como sigue a continuación:
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-VK-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), y
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-VC-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX).
En el ADC de la presente invención, un resto enlazador-fármaco que tiene cualquiera de las estructuras mostradas a continuación se conjuga preferentemente con el anticuerpo.
A. En cuanto al resto enlazador-fármaco de la presente invención, un resto enlazador-fármaco preferido que tiene una estructura de-L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-Lb-Lc-(NH-DX) en el que LP es GGGF se muestra a continuación.
A-1. Cuando L1 es -(Succinimid-3-il-N)-(CH2)n2-C(=O)- y L2 es un enlace sencillo;
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-CH2-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2-(NH-DX).
Entre estos, los más preferidos son los siguientes:
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2-(NH-DX).
A-2. Cuando L1 es -(Succinimid-3-il-N)-(CH2)n2-C(=O)- y L2 es -NH-(CH2CH2-O)n6-CH2CH2-C(=O)-;
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-(NH-DX), -(Succinimid-3 -il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-CH2-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-CH2-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2-(NH-DX).
A-3. Cuando L1 es -(Succinimid-3-il-N)-CH[-(CH2)n3-COOH]-C(=O)- y L2 es un enlace sencillo;
-(Succinimid-3-il-N)-CH(-CH2-COOH)-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH(-CH2-COOH)-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH(-CH2-COOH)-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH(-CH2CH2-COOH)-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH(-CH2CH2-COOH)-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH(-CH2CH2-COOH)-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX).
Entre estos, los más preferidos son los siguientes:
-(Succinimid-3-il-N)-CH(-CH2CH2-COOH)-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH(-CH2CH2-COOH)-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH(-CH2CH2-COOH)-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX).
A-4. Cuando L1 es -(Succinimid-3 -il-N)-CH[-(CH2)n3-COOH]-C(=O)- y L2 es -NH-(CH2CH2-O)n6-CH2CH2-C(=O)-
-(Succinimid-3-il-N)-CH(-CH2-COOH)-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-GGFG-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH(-CH2-COOH)-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-GGFG-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH(-CH2-COOH)-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-GGFG-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH(-CH2CH2-COOH)-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-GGFG-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH(-CH2CH2-COOH)-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-GGFG-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH(-CH2CH2-COOH)-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-GGFG-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX). Entre estos, los más preferidos son los siguientes:
-(Succinimid-3-il-N)-CH(-CH2CH2-COOH)-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-GGFG-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH(-CH2CH2-COOH)-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-GGFG-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH(-CH2CH2-COOH)-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-GGFG-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX).
A-5. Cuando L1 es -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-[N(-CH2-COOH)]-CH2-(C=O)- y L2 es un enlace sencillo; -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-[N(-CH2-COOH)]-CH2-(C=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-[N(-CH2-COOH)]-CH2-(C=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-[N(-CH2-COOH)]-CH2-(C=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX).
A-6. Cuando L1 es -(Succinimid-3-il-N)-(CH2)n2-C(=O)- y L2 es -NH-(CH2-CH2-O)n6-CH2-CH2-C(=O)-;
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-CH2-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH
CH2CH2CH2-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-CH2-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-CH2-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-CH2-(NH-DX).
A-7. Cuando L1 es -(Succinimid-3-il-N)-(CH2)n2-C(=O)-, L2 es un enlace sencillo y -La-Lb-Lc- tiene una cadena ramificada de alquilo;
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CMe(-H)-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH(-Me)-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2C(-Me)2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CMe(-H)-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH(-Me)-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2C(-Me)2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CMe(-H)-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH(-Me)-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2C(-Me)2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CMe(-H)-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH(-Me)-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2C(-Me)2-C(=O)-(NH-DX).
Entre estos, se prefieren los siguientes:
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CMe(-H)-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH(-Me)-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2C(-Me)2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CMe(-H)-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH(-Me)-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2C(-Me)2-C(=O)-(NH-DX).
Además, se prefieren los siguientes:
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CMe(-H)-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH(-Me)-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2C(-Me)2-C(=O)-(NH-DX).
A-8. Cuando L1 es -(Succinimid-3-il-N)-(CH2)n2-C(=O)-, L2 es un enlace sencillo, y la cadena -La-Lb-Lc-tiene un átomo de nitrógeno;
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-NH-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-NMe-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-NH-CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-NMe-CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-NMe-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-NH-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-NMe-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-NH-CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-NMe-CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3 -il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-NMe-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX).
Entre estos, los más preferidos son los siguientes:
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-NH-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-NMe-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-NH-CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-NMe-CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-NMe-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX).
A-9. Cuando L1 es -(Succinimid-3 -il-N)-(CH2)n2-C(=O)-, L2 es un enlace sencillo, y -La-Lb-Lc- tiene un átomo de
nitrógeno y tiene un resto de cadena ramificada que tiene un grupo hidroxilo;
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-N(-CH2CH2-OH)-CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-N(-CH2CH2-OH)-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-N(-CH2CH2-OH)-CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-N(-CH2CH2-OH)-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX).
Entre estos, los más preferidos son los siguientes:
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-N(-CH2CH2-OH)-CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-N(-CH2CH2-OH)-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX).
A-10. Cuando L1 es -(Succinimid-3 -il-N)-(CH2)n2-C(=O)-, L2 es un enlace sencillo, y la cadena -La-Lb-Lc-tiene un átomo de nitrógeno y tiene un resto ramificado que tiene un grupo carboxi;
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-N(-CH2-COOH)-CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-N(-CH2-COOH)-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-N(-CH2CH2-COOH)-CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-N(-CH2CH2-COOH)-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-N(-CH2-COOH)-CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-N(-CH2-COOH)-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-N(-CH2CH2-COOH)-CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-N(-CH2CH2-COOH)-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX).
Entre estos, los más preferidos son los siguientes:
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-N(-CH2-COOH)-CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-N(-CH2-COOH)-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-N(-CH2CH2-COOH)-CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-N(-CH2CH2-COOH)-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX).
Además, se prefieren los siguientes:
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-N(-CH2-COOH)-CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-N(-CH2-COOH)-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX).
A-11. Cuando L1 es -(Succinimid-3 -il-N)-(CH2)n2-C(=O)-, L2 es un enlace sencillo, -La-Lb-Lc- tiene un resto ramificado que tiene un grupo hidroxilo o un grupo carboxi;
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-NH-CH(-CH2-OH)-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-NH-CH(-CH2CH2-OH)-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-NH-CH(-CH2-COOH)-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-NH-CH(-CH2CH2-COOH)-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-NH-CH(-CH2-OH)-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-NH-CH(-CH2CH2-OH)-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-NH-CH(-CH2-COOH)-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-NH-CH(-CH2CH2-COOH)-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-NH-CH(-CH2-OH)-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-NH-CH(-CH2CH2-OH)-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-NH-CH(-CH2-COOH)-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-NH-CH(-CH2CH2-COOH)-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-NH-CH(-CH2-OH)-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-NH-CH(-CH2CH2-OH)-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-NH-CH(-CH2-COOH)-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-NH-CH(-CH2CH2-COOH)-C(=O)-(NH-DX).
Entre estos, los más preferidos son los siguientes:
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-NH-CH(-CH2-OH)-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-NH-CH(-CH2CH2-OH)-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-NH-CH(-CH2-COOH)-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-NH-CH(-CH2CH2-COOH)-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-NH-CH(-CH2-OH)-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-NH-CH(-CH2CH2-OH)-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-NH-CH(-CH2-COOH)-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-NH-CH(-CH2CH2-COOH)-C(=O)-(NH-DX).
Además, se prefieren los siguientes:
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-NH-CH(-CH2-OH)-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-NH-CH(-CH2CH2-OH)-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-NH-CH(-CH2-COOH)-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-NH-CH(-CH2CH2-COOH)-C(=O)-(NH-DX).
Entre estos, se prefieren los siguientes:
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-NH-CH(-CH2-OH)-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-NH-CH(-CH2-COOH)-C(=O)-(NH-DX).
A-12. Cuando L1 es -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-[N(-CH2-COOH)]-CH2-(C=O)-, L2 es un enlace sencillo y -La-Lb-Lc-tiene una cadena ramificada de alquilo;
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-[N(-CH2-COOH)]-CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CMe(-H)-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-[N(-CH2-COOH)]-CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH(-Me)-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-[N(-CH2-COOH)]-CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2C(-Me)2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-[N(-CH2-COOH)]-CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CMe(-H)-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-[N(-CH2-COOH)]-CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH(-Me)-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-[N(-CH2-COOH)]-CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2C(-Me)2-C(=O)-(NH-DX).
A-13. En -L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-Lb-Lc-, cuando L1 es -CH2-C(=O)-NH-(CH2)n4-C(=O)- y L2 es un enlace sencillo;
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX).
Entre estos, los más preferidos son los siguientes:
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX).
A-14. Cuando L1 es -CH2-C(=O)-NH-(CH2)n4-C(=O)- y L2 es -NH-(CH2CH2-O)n6-CH2CH2-C(=O)-;
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX).
Entre estos, los más preferidos son los siguientes:
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2-
C(=O)-(NH-DX).
A-15. Cuando L1 es -C(=O)-(CH2)n5-C(=O)- y L2 es un enlace sencillo;
-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-C(=O)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-C(=O)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-C(=O)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-C(=O)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-C(=O)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-C(=O)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX).
Entre estos, los más preferidos son los siguientes:
-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX).
A-16. Cuando L1 es -C(=O)-cic.Hex(1 ,4 )-CH2-(N-li-3 -diminiccuS)-y L2 es -S-(CH2)n8-C(=O)-;
-C(=O)-cic.Hex(1 ,4 )-CH2-(N-li-3 -diminiccuS)-S-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -C(=O)-cic.Hex(1 ,4 )-CH2-(N-li-3 -diminiccuS)-S-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -C(=O)-cic.Hex(1 ,4 )-CH2-(N-li-3 -diminiccuS)-S-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -C(=O)-cic.Hex(1 ,4 )-CH2-(N-li-3 -diminiccuS)-S-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -C(=O)-cic.Hex(1 ,4 )-CH2-(N-li-3 -diminiccuS)-S-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-C(=O)-cic.Hex(1,4)-CH2-(N-li-3-diminiccuS)-S-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-C(=O)-cic.Hex(1,4)-CH2-(N-li-3-diminiccuS)-S-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -C(=O)-cic.Hex(1,4)-CH2-(N-li-3-diminiccuS)-S-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-C(=O)-cic.Hex(1,4)-CH2-(N-li-3-diminiccuS)-S-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX).
Entre estos, los más preferidos son los siguientes:
-C(=O)-cic.Hex(1,4)-CH2-(N-li-3-diminiccuS)-S-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -C(=O)-cic.Hex(1,4)-CH2-(N-li-3-diminiccuS)-S-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -C(=O)-cic.Hex(1,4)-CH2-(N-li-3-diminiccuS)-S-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX).
A-17. Cuando L1 es -(Succinimid-3-il-N) -CH2CH2-[N(-CH2-COOH)]-CH2-(C=O)- y L2 es -NH- CH2CH2-[N(-CH2-COOH)]-CH2-(C=O)-;
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-N(-CH2-COOH)-CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-N(-CH2-COOH)-CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-N(-CH2-COOH)-CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-N(-CH2-COOH)-CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-N(-CH2-COOH)-CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-N(-CH2-COOH)-CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX).
Entre estos, los más preferidos son los siguientes:
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-N(-CH2-COOH)-CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-N(-CH2-COOH)-CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-N(-CH2-COOH)-CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX).
A-18. Cuando L1 es -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-[N(-CH2-COOH)]-CH2-(C=O)- y L2 es -NH-[CH(-CH2-COOH)]-CH2-O-CH2-(C=O)-;
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-[CH(-CH2-COOH)]-CH2-O-CH2-(C=O)-GFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-[CH(-CH2-COOH)]-CH2-O-CH2-(C=O)-GFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-[CH(-CH2-COOH)]-CH2-O-CH2-(C=O)-GFG-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-NH-[CH(-CH2-COOH)]-CH2-O-CH2-(C=O)-GFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-NH-[CH(-CH2-COOH)]-CH2-O-CH2-(C=O)-GFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-NH-[CH(-CH2-COOH)]-CH2-O-CH2-(C=O)-GFG-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX).
Entre estos, los más preferidos son los siguientes:
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-NH-[CH(-CH2-COOH)]-CH2-O-CH2-(C=O)-GFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-NH-[CH(-CH2-COOH)]-CH2-O-CH2-(C=O)-GFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-NH-[CH(-CH2-COOH)]-CH2-O-CH2-(C=O)-GFG-NH- CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX).
A-19. Otros enlazadores preferidos análogos a los enlazadores que tienen el péptido GGFG son como se muestran a continuación.
Cuando L1 es -(Succinimid-3-il-N)-(CH2)n2-C(=O)-, L2 es un enlace sencillo y el residuo de péptido es GFG; -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-[CH(-CH2-COOH)]-CH2-O-CH2-(C=O)-GFG-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-NH-[CH(-CH2-COOH)]-CH2-O-CH2-(C=O)-GFG-(NH-DX). A-20. Cuando L1 es -(Succinimid-3-il-N)-(CH2)n2-C(=O)-, L2 es un enlace sencillo y el residuo de péptido contiene 4 o más residuos de glicina;
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-GGFGG-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-GGFGGG-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-GGFGGGFG-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-NH-GGFGG-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-NH-GGFGGG-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-NH-GGFGGGFG-(NH-DX).
Entre estos, los más preferidos son los siguientes:
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-NH-GGFGG-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-NH-GGFGGG-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-NH-GGFGGGFG-(NH-DX).
A-21. Cuando L1 es -(Succinimid-3 -il-N)-(CH2)n2-C(=O)-,L2 es un enlace sencillo, y el C terminal incluye un aminoácido hidrófilo;
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-GGFGS-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-GGFGGE-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-NH-GGFGS-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-NH-GGFGGE-(NH-DX).
Entre estos, los más preferidos son los siguientes:
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-NH-GGFGS-(NH-DX), y
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-NH-GGFGGE-(NH-DX).
B. Un resto enlazador-fármaco preferido que tiene una estructura de -L1-L2-LP-(NH-DX) en el que LP es GGGF es como se muestra a continuación.
B-0. Cuando L1 es -(Succinimid-3-il-N)-(CH2)n2-C(=O)- y L2 es un enlace sencillo;
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-(NH-DX), y -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-(NH-DX).
B-1. Cuando L1 es -(Succinimid-3-il-N)-(CH2)n2-C(=O)- y L2 es -NH-(CH2-CH2-O)n6-CH2-CH2-C(=O)-;
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-(NH-DX).
Entre estos, los más preferidos son los siguientes:
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-(NH-DX).
B-2. Cuando L1 es -(Succinimid-3-il-N)-CH[-(CH2)n3-COOH]-C(=O)- y L2 es un enlace sencillo,
se prefiere -(Succinimid-3 -il-N)-CH2CH2-[N(-CH2-COOH)]-CH2-(C=O)-GGFG-(NH-DX).
B-3. Cuando L1 es -C(=O)-cic.Hex(1 ,4 )-CH2-(N-li-3 -diminiccuS)- y L2 es -S-(CH2)n8-C(=O)-,
se prefiere -C(=O)-cic.Hex(1 ,4 )-CH2-(N-li-3-diminiccuS)-S-CH2CH2-C(=O)-GGFG-(NH-DX).
B-4. Cuando L1 es -(Succinimid-3-il-N) -CH2CH2-[N(-CH2-COOH)]-CH2-(C=O)- y L2 es -NH-[CH(-CH2-COOH)]-CH2-O-CH2-(C=O)-;
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-[CH(-CH2-COOH)]-CH2-(C=O)-GGFG-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-NH-[CH(-CH2-COOH)]-CH2-(C=O)-GGFG-(NH-DX).
Es más preferido
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-NH-[CH(-CH2-COOH)]-CH2-(C=O)-GGFG-(NH-DX).
B-5. Cuando L1 es -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-[N(-CH2-COOH)]-CH2-(C=O)- y L2 es -NH-CH2CH2-[N(-CH2-COOH)]-CH2-(C=O)-;
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-[N(-CH2-COOH)]-CH2-(C=O)-GGFG-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-[N(-CH2-COOH)]-CH2-(C=O)-GGFG-(NH-DX). Es más preferido
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-[N(-CH2-COOH)]-CH2-(C=O)-GGFG-(NH-DX).
C. Un resto enlazador-fármaco preferido que tiene una estructura de -L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-Lb-Lc-(NH-DX) en el que LP contiene ácido aspártico, lisina, ácido glutámico y/o serina, los cuales son aminoácidos hidrófilos, en particular, ácido aspártico, se muestra a continuación.
C-1. Cuando L1 es -(Succinimid-3-il-N)-(CH2)n2-C(=O)- y L2 es un enlace sencillo;
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-DGGF-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-DGGF-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-DGGF-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGF-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGF-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGF-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX).
Entre estos, los más preferidos son los siguientes:
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGF-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGF-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGF-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX).
C-2. Cuando L1 es -(Succinimid-3-il-N)-(CH2)n2-C(=O)- y L2 es un enlace sencillo;
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX).
Entre estos, se prefieren los siguientes:
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX).
C-3. Cuando L1 es -(Succinimid-3-il-N)-(CH2)n2-C(=O)- y L2 es -NH-(CH2CH2-O)n6-CH2CH2-C(=O)-;
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-DG-GFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-DG-GFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-DG-GFG-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX).
Entre estos, se prefieren los siguientes:
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH- CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3 -il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX).
C-4. Cuando L1 es -(Succinimid-3-il-N)-(CH2)n2-C(=O)-, L2 es un enlace sencillo, y -La-Lb-Lc- contiene una cadena ramificada de alquilo, se prefieren los siguientes:
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2C(-Me)2-C(=O)-(NH-DX), y -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2C(-Me)2-C(=O)-(NH-DX).
Es más preferido
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2C(-Me)2-C(=O)-(NH-DX).
C-5. Cuando L1 es -(Succinimid-3-il-N)-(CH2)n2-C(=O)-, L2 es un enlace sencillo, y el residuo de péptido contiene sarcosina;
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-DGMeGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-DGMeGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-DGMeGFG-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGMeGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGMeGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGMeGFG-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX).
Entre estos, los más preferidos son los siguientes:
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGMeGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGMeGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGMeGFG-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX).
C-6. Cuando L1 es -(Succinimid-3-il-N)-(CH2)n2-C(=O)-, L2 es un enlace sencillo y el residuo de péptido contiene lisina;
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-KGGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-KGGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-KGGFG-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-KGGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-KGGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-KGGFG-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX).
Entre estos, los más preferidos son los siguientes:
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-KGGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-KGGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-KGGFG-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX).
C-7. Cuando L1 es -(Succinimid-3-il-N)-(CH2)n2-C(=O)-, L2 es un enlace sencillo y el residuo de péptido contiene ácido glutámico;
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-EGGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-EGGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-EGGFG-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-EGGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-EGGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-EGGFG-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX).
Entre estos, los más preferidos son los siguientes:
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-EGGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-EGGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-EGGFG-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX).
C-8. Cuando L1 es -(Succinimid-3 -il-N)-(CH2)n2-C(=O)-, L2 es -NH-(CH2CH2-O) n6-CH2CH2-C(=O)- y -La-Lb-Lccontiene un átomo de oxígeno, se prefieren los siguientes:
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX), y
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX).
Es más preferido
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX).
C-9. Cuando L1 es -(Succinimid-3-il-N)-(CH2)n2-C(=O)-, L2 es un enlace sencillo, y el residuo de péptido contiene una pluralidad de aminoácidos hidrófilos, se prefieren los siguientes:
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-DDGGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-DDGGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-DDGGFG-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DDGGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DDGGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DDGGFG-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-KDGGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-KDGGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-KDGGFG-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-KDGGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-KDGGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-KDGGFG-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX).
Entre estos, los más preferidos son los siguientes:
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DDGGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DDGGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DDGGFG-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-KDGGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-KDGGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-KDGGFG-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX).
Además, se prefieren
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DDGGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), y -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-KDGGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX).
C-10. Cuando L1 es -C(=O)-cic.Hex(1 ,4 )-CH2-(N-li-3-diminiccuS)- y L2 es -S-(CH2)n8-C(=O)-, se prefieren los siguientes:
-C(=O)-cic.Hex(1 ,4 )-CH2-(N-li-3 -diminiccuS)-S-CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -C(=O)-cic.Hex(1 ,4 )-CH2-(N-li-3 -diminiccuS)-S-CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -C(=O)-cic.Hex(1 ,4 )-CH2-(N-li-3 -diminiccuS)-S-CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-C(=O)-cic.Hex(1 ,4 )-CH2-(N-li-3 -diminiccuS)-S-CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -C(=O)-cic.Hex(1 ,4 )-CH2-(N-li-3 -diminiccuS)-S-CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-C(=O)-cic.Hex(1 ,4 )-CH2-(N-li-3 -diminiccuS)-S-CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-C(=O)-cic.Hex(1 ,4 )-CH2-(N-li-3 -diminiccuS)-S-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-C(=O)-cic.Hex(1 ,4 )-CH2-(N-li-3 -diminiccuS)-S-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-C(=O)-cic.Hex(1 ,4 )-CH2-(N-li-3 -diminiccuS)-S-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX).
Entre estos, se prefieren los siguientes:
-C(=O)-cic.Hex(1 ,4 )-CH2-(N-li-3 -diminiccuS)-S-CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -C(=O)-cic.Hex(1 ,4 )-CH2-(N-li-3 -diminiccuS)-S-CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -C(=O)-cic.Hex(1 ,4 )-CH2-(N-li-3 -diminiccuS)-S-CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX).
D. Un resto enlazador-fármaco preferido que tiene una estructura de -L1-L2-LP-(NH-DX) en el que LP contiene ácido aspártico, lisina, ácido glutámico y/o serina, los cuales son aminoácidos hidrófilos, en particular, ácido aspártico, se muestra a continuación.
D-1. Cuando L1 es -(Succinimid-3-il-N)-(CH2)n2-C(=O)- y L2 es -NH-(CH2CH2-O)n6-CH2CH2-C(=O)-;
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-DGGFG-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-NH-DGGFS-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-DGGFG-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-DG-GFG-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-NH-DGGFG-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-DGGFG-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-DGGFG-(NH-DX).
Entre estos, los más preferidos son los siguientes:
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-DGGFG-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-DGGFG-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-DGGFG-(NH-DX).
D-2. Cuando L1 es -(Succinimid-3-il-N)-(CH2)n2-C(=O)- y L2 es un enlace sencillo, se prefieren los siguientes:
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-DGGFG-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2-C(=O)-NH-DGGFG-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-NH-DGGFG-(NH-DX).
D-3. Cuando L1 es -(Succinimid-3-il-N)-(CH2)n2-C(=O)- y L2 es un enlace sencillo, se prefieren los siguientes:
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-DdGGFG-(NH-DX), y
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-NH-DdGGFG-(NH-DX)
en el cual el ácido aspártico es ácido D-aspártico.
D-4. Cuando L1 es -(Succinimid-3-il-N)-(cH2)n2-C(=O)- y L2 es un enlace sencillo, se prefieren los siguientes:
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-DGMeGFG-(NH-DX), y
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-NH-DGMeGFG-(NH-DX)
en el cual la glicina está en forma de sarcosina.
D-5. Cuando L1 es -(Succinimid-3 -il-N)-(CH2)n2-C(=O)-, L2es un enlace sencillo, el residuo de péptido contiene un aminoácido hidrófilo distinto del ácido aspártico, se prefieren los siguientes:
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-KGGFG-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-SGGFG-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-EGGFG-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-DGGFS-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-NH-KGGFG-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-NH-SGGFG-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-NH-EGGFG-(NH-DX).
Entre estos, los más preferidos son los siguientes:
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-NH-KGGFG-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-NH-SGGFG-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-NH-EGGFG-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-NH-DGGFS-(NH-DX).
E. Un resto enlazador-fármaco preferido que tiene una estructura de -L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-Lb-Lc-(NH-DX) en el que L1 es -(Succinimid-3-il-N)-(CH2)n2-C(=O)-, L2 es un enlace sencillo y el residuo de péptido es un dipéptido, se muestra a continuación.
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-VK-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-VC-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-VK-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-VC-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-VK-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-VC-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-VK-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-VC-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-VK-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-VC-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-VK-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-VC-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX).
Entre estos, los más preferidos son los siguientes:
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-VK-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-VC-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-VK-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-VC-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-VK-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-VC-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX).
Además, se prefieren
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-VK-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), y
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-VC-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX).
Las excelentes propiedades del conjugado anticuerpo-fármaco anti-HER2 de la presente invención se logran ejerciendo adecuadamente las propiedades que posee el anticuerpo anti-HER2 y exatecán por el enlazador conectado al mismo. Por lo tanto, se puede obtener un conjugado anticuerpo-fármaco que tiene excelentes propiedades adoptando el enlazador que tiene la estructura de la presente invención. La estructura del enlazador de la presente invención se puede conectar fácilmente al anticuerpo formando un enlace tioéter o un enlace amida de acuerdo con un procedimiento conocido en la técnica.
Para el anticuerpo, no hay requisitos particulares para conectar el anticuerpo al enlazador de la presente invención. También, la estructura del enlazador de la presente invención también puede conectarse al fármaco antitumoral siempre que sea un compuesto que tenga un grupo funcional capaz de formar un enlace amida, un enlace éter, un
enlace éster, un enlace alquilo carbono-carbono o similar. De esta forma, un anticuerpo distinto del anticuerpo anti-HER2 puede conjugarse con un fármaco distinto de exatecán a través de la estructura del enlazador de la presente invención para obtener un excelente conjugado anticuerpo-fármaco.
[Compuesto reactivo con anticuerpo]
Para la anterior estructura enlazador-fármaco, puede usarse preferentemente como un compuesto para introducirlo en el anticuerpo,
1. un compuesto en el cual, en el caso de usar un grupo (succinimid-3-il-N) en el terminal de la estructura enlazador-fármaco, el resto es un grupo maleimidilo,
2. un compuesto en el cual, en el caso de conectar el grupo -CH2-C(=O)-NH- de la estructura enlazador-fármaco al anticuerpo a través de un enlace sulfuro, el grupo metileno es un grupo halogenometilo,
3. un compuesto en el cual, en el caso de conectar el -C(=O)-CH2CH2-C(=O) de la estructura enlazador-fármaco al anticuerpo a través de un enlace amida, el terminal se convierte a un éster activo con un grupo (pirrolidin-2 ,5 -diona-N-il)-O-, o
4. un compuesto en el cual, en el caso de conectar el -C(=O)-cic.Hex(1,4)-CH2-(N-li-3-diminiccuS)- de la estructura enlazador-fármaco al anticuerpo, tiene la estructura representada por L2 en la terminal en la cual S de este resto es HS.
Se puede usar cualquiera de estos compuestos correspondientes a cada una de las estructuras anteriores.
[Procedimiento de producción]
A continuación, se proporcionan explicaciones del procedimiento representativo para producir el conjugado de anticuerpo-fármaco de la presente invención o un intermedio de producción del mismo. Entre tanto, Los compuestos se describen en lo sucesivo en el presente documento con el número de compuesto que se muestra en cada fórmula de reacción. De manera específica, se denominan "compuesto de Fórmula (1 )", un "compuesto (1 )", o similares. Los compuestos con números diferentes de aquellos que se describen de forma similar.
1. Procedimiento de producción 1
El conjugado anticuerpo-fármaco representado por la fórmula (1 ) en el cual el anticuerpo está conectado a la estructura fármaco-enlazador a través de tioéter puede producirse mediante el siguiente procedimiento, por ejemplo.
[Fórmula 26 ]
Lr -Lz-Lp-NH-(CH2)n1-La-Lb-Lc-(NH-DX) AB AB-L1-L2-Lp-NH-{CH2)n1-La-Lb-Lc-(NH-DX)
o , 3 a o
U ’-L2-Lp-(NH-DX) AB-L1-L2-Lp-(NH-DX)
2 1
[En la fórmula, AB representa un anticuerpo que tiene un grupo sulfhidrilo, y L1' representa la estructura del enlazador L1 en la cual el terminal se convierte a un grupo maleimidilo (fórmula mostrada a continuación)
[Fórmula 27 ]
(en la fórmula, el átomo de nitrógeno es la posición de conexión) o una estructura del enlazador en la cual el terminal se convierte en halógeno. Es, por ejemplo, un grupo en el cual el resto -(Succinimid-3 -il-N)- en una estructura tal como -(Succinimid-3-il-N)-(CH2)n2-C(=O)- representada como L1 es un grupo maleimidilo, o un grupo halogen-CH2-C-(=O)-NH-(CH2)n4-C(=O)- en el cual el metileno terminal de -CH2C(=O)NH-(CH2)n4-C(=O)- representado como L1 es haloacetamida mediante halogenación. Además, el -(NH-DX) representa una estructura representada por la siguiente fórmula:
[Fórmula 28 ]
y representa un grupo que se deriva eliminando un átomo de hidrógeno del grupo amino en la posición 1 del fármaco antitumoral. Además, el compuesto de fórmula (1 ) en la anterior fórmula de reacción se describe como una estructura en la cual un resto de estructura correspondiente del fármaco al terminal enlazador se conecta a un anticuerpo. Sin embargo, solo se proporciona una descripción dada por razones de conveniencia, y existen realmente muchos casos en los que una pluralidad de restos de estructura están unidos a una molécula de anticuerpo. Lo mismo se aplica a la explicación del procedimiento de producción descrito a continuación].
Es decir, se puede producir el conjugado de anticuerpo-fármaco (1 ) haciendo reaccionar el compuesto (2 ), que es obtenible mediante el procedimiento descrito a continuación, con el anticuerpo (3 a) que tiene un grupo sulfhidrilo.
Se puede obtener el anticuerpo (3 a) que tiene un grupo sulfhidrilo mediante un procedimiento bien conocido en la técnica (Hermanson, G.T, Bioconjugate Techniques, pág. 56 -136 , pág. 456 -493 , Academic Press (1996 )). Los ejemplos incluyen: hacer reaccionar el reactivo de Traut con el grupo amino del anticuerpo; hacer reaccionar los S-acetiltioalcanoatos de N-succinimidilo con el grupo amino del anticuerpo seguido por reacción con hidroxilamina; después de reaccionar con 3 -(piridilditio)propionato de N-succinimidilo, el anticuerpo se hace reaccionar con un agente reductor; el anticuerpo se hace reaccionar con un agente reductor tal como ditiotreitol, 2 -mercaptoetanol y clorhidrato de tris(2 -carboxietil)fosfina (TCEP) para reducir el enlace disulfuro en la parte de la bisagra en el anticuerpo, pero no se limita a los mismos.
De manera específica, puede añadirse una solución de sulfóxido de dimetilo del compuesto (2 ) a una solución salina tamponada con fosfato (pH 7 ,2 ) que contiene el anticuerpo (3a) que tiene un grupo sulfhidrilo para producir el conjugado anticuerpo-fármaco (1 ). Después de eso, a reactividad del compuesto no reaccionado (2 ) se desactiva mediante la adición de N-acetil-L-cisteína (NAC) como se usa habitualmente en la reacción para formar la unión anticuerpo-fármaco. El conjugado anticuerpo-fármaco (1 ) producido, puede, después de la concentración, intercambio de tampón, purificación, la medición de la concentración de anticuerpos y el número promedio de moléculas de fármaco conjugado por molécula de anticuerpo, y el cálculo del contenido agregado de acuerdo con los procedimientos descritos a continuación, se someterán a la identificación del conjugado de anticuerpo-fármaco (1 ).
Procedimiento general A: Concentración de solución acuosa de anticuerpo o conjugado de anticuerpo-fármaco
A un recipiente Amicon Ultra (50.000 MWCO, Millipore Corporation), se le añadió una solución de anticuerpo o un conjugado de anticuerpo-fármaco y la solución del anticuerpo o el conjugado de anticuerpo-fármaco se concentró mediante centrifugación (centrífuga durante 5 a 20 minutos a 2000 a 3800 G) usando una centrífuga (Allegra X-15R, Beckman Coulter, Inc.).
Procedimiento general B: Medición de la concentración de anticuerpo
Usando un detector UV (Nanodrop 1000 , Thermo Fisher Scientific Inc.), se llevó a cabo la medición de la concentración del anticuerpo de acuerdo con el procedimiento definido por el fabricante. En ese momento, se usó un coeficiente de absorción de 280 nm diferente para cada anticuerpo (1,3 a 1 ,8/mg/ml).
Procedimiento general C-1 : Intercambio de tampón para el anticuerpo
columna NAP-25 (n.° Cat. 17-0852 -02 , GE Healthcare Japan Corporation) usando Sephadex G-25 se equilibró el transportador con tampón fosfato (10 mM, pH 6 ,0 ; se conoce como PBS6 ,0/EDTA en la memoria descriptiva) que contiene cloruro sódico (137 mM) y ácido etilendiaminotetraacético (EDTA; 5 mM) de acuerdo con el procedimiento definido por el fabricante. Se aplicó una solución acuosa del anticuerpo en una cantidad de 2 ,5 ml a una única columna
NAP-25 , y a continuación se recogió la fracción (3,5 ml) eluída con 3,5 ml de PBS6 ,0/EDTA. La fracción resultante se concentró mediante el Procedimiento general A. Tras medir la concentración del anticuerpo utilizando el Procedimiento general B, se ajustó la concentración de anticuerpo a 10 mg/ml usando PBS6 ,0/EDTA.
Procedimiento general C-2 : Intercambio de tampón para el anticuerpo
columna NAP-25 (n.° Cat. 17-0852 -02 , GE Healthcare Japan Corporation) usando Sephadex G-25 se equilibró el transportador con tampón fosfato (50 mM, pH 6 ,5 ; se denomina PBS6 ,5/EDTA en la memoria descriptiva) conteniendo cloruro sódico (50 mM) y EDTA (2 mM) de acuerdo con el procedimiento definido por el fabricante. Se aplicó una solución acuosa del anticuerpo en una cantidad de 2 ,5 ml a una única columna NAP-25 , y a continuación se recogió la fracción (3,5 ml) eluída con 3,5 ml de PBS6 ,5/EDTA. La fracción resultante se concentró mediante el Procedimiento general A. Tras medir la concentración del anticuerpo utilizando el Procedimiento general B, la concentración de anticuerpo se ajustó a 20 mg/ml usando PBS6 ,5/EDTA.
Procedimiento general D-1 : Purificación de conjugado de anticuerpo-fármaco
Se equilibró la columna NAP-25 con cualquier tampón seleccionado entre tampón fosfato comercialmente disponible (PBS7 ,4 , n.° de cat. 10010 -023 , Invitrogen), tampón fosfato sódico (10 mM, pH 6 ,0 ; se denomina PBS6 ,0 en la memoria descriptiva) que contiene cloruro de sodio (137 mM), y tampón acetato que contiene sorbitol (5 %) (10 mM, pH 5 ,5 ; se denomina ABS en la memoria descriptiva). Se aplicó una solución acuosa de la reacción del conjugado de anticuerpo-fármaco en una cantidad de aproximadamente 1,5 ml a la columna NAP-25 , y a continuación se eluyó en una cantidad definida por el fabricante para recoger la fracción de anticuerpo. Se aplicó de nuevo la fracción recogida a la columna NAP-25 y, repitiendo 2 a 3 veces en total el procedimiento de purificación mediante filtración en gel para eluir con tampón, se obtuvo el conjugado anticuerpo-fármaco, excluyendo el enlazador fármaco no conjugado y un compuesto de bajo peso molecular (clorhidrato de tris(2 -carboxietil)fosfina (TCEP), N-acetil-L-cisteína (NAC) y sulfóxido de dimetilo).
Procedimiento general D-2 : Purificación del anticuerpo derivatizado con succinimidil-4 -(N-maleimidilmetil)-ciclohexano-1-carboxilato (SMCC)
La columna NAP-25 se equilibró con PBS6 ,5/EDTA. Se aplicó una solución de reacción que contenía un anticuerpo succinimidil-4 -(N-maleimidilmetil)-ciclohexano-1-carboxilato (denominado SMCC en la memoria descriptica) en una cantidad de aproximadamente 0,5 ml a la columna NAP-25 , y después se eluyó con el tampón en una cantidad definida por el fabricante para recolectar la fracción de anticuerpos, seguido de purificación.
Procedimiento general E: Medición de la concentración de anticuerpo en el conjugado de anticuerpo-fármaco y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas por molécula de anticuerpo
La concentración de fármaco conjugado en el conjugado anticuerpo-fármaco se puede calcular midiendo la absorbancia UV de una solución acuosa del conjugado anticuerpo-fármaco en, por ejemplo, dos longitudes de onda de 280 nm y 370 nm, seguido por llevar a cabo el cálculo que se muestra a continuación.
Debido a que la absorbancia total a cualquier longitud de onda es igual a la suma de la absorbancia de cada especie química absorbente de luz que está presente en el sistema [aditividad de la absorbancia], cuando los coeficientes de absorción molar del anticuerpo y el fármaco siguen siendo los mismos antes y después de la conjugación entre el anticuerpo y el fármaco, la concentración de anticuerpo y la concentración de fármaco en el conjugado de anticuerpofármaco se expresan mediante las siguientes ecuaciones.
A280 = Ad,280 Aa,280 = £d,28oCd £a,28ciCa Ecuación (I)
A370 = Ad,370+ Aa,370 = £d,37oCd £a,37oCa Ecuación (II)
En lo anterior, A280 representa la absorbancia de una solución acuosa del conjugado de anticuerpo-fármaco a 280 nm, A370 representa la absorbancia de una solución acuosa del conjugado de anticuerpo-fármaco a 370 nm, Aa,280 representa la absorbancia de un anticuerpo a 280 nm, Aa,370 representa la absorbancia de un anticuerpo a 370 nm, Ad,280 representa la absorbancia de un precursor conjugado a 280 nm, Ad,370 representa la absorbancia de un precursor conjugado a 370 nm, £a,280 representa el coeficiente de absorción molar de un anticuerpo a 280 nm, £a,370 representa el coeficiente de absorción molar de un anticuerpo a 370 nm, £d,280 representa el coeficiente de absorción molar de un precursor conjugado a 280 nm, £d,370 representa el coeficiente de absorción molar de un precursor conjugado a 370 nm, Ca representa la concentración de anticuerpo en un conjugado de fármaco anticuerpo, y Cd representa la concentración de fármaco en un conjugado de anticuerpo-fármaco.
£a,280, £a,370, £d,280 y £d,370 en lo anterior se conocen mediante mediciones previas. Midiendo A280 y A370 de una solución acuosa del conjugado de fármaco-anticuerpo y resolviendo las ecuaciones (I) y (II) simultáneas usando los valores, se pueden obtener Ca y Cd. Además, dividiendo Cd por Ca, se puede obtener el número promedio de moléculas de fármaco conjugado por molécula de anticuerpo.
El compuesto representado por la fórmula (2 ) usado como compuesto intermedio en el procedimiento de producción
1 se describe a continuación. El compuesto es, por ejemplo, un compuesto que tiene la siguiente estructura:
[Fórmula 29]
Halogen-CH2C(=O)NH-(CH2)n3-C(=O)-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-Lb-Lc-(NH-DX)
Halogen-CH2C(=O)NH-(CH2)n3-C(=O)-NH-[(CH2CH2-O)n6-CH2CH2-OH]-LP-NH-(CH2)n1-La-Lb-Lc(NH-DX)
Halogen-CH2C(=O)NH-(CH2)n3-C(=O)-L2-LP-(NH-DX)
Halogen-CH2C(=O)NH-(CH2)n3-C(=O)-NH-[(CH2CH2-O)n6-CH2CH2-OH]-LP-(NH-DX)
En la fórmula anterior, n1, n2, n3, n4, n7, L2, LP, La, Lb y Lc son como ya se definieron, y el terminal de LP o Lc es la posición de conexión con el fármaco.
En un intermedio preferido útil en la producción de dicho conjugado anticuerpo-fármaco de la presente invención, n2
es un número entero de 2 a 5.
Cuando L1 es -(Succinimid-3-il-N)-(CH2)n2-C(=O)-, L2 es preferentemente
cualquiera de -NH-(CH2CH2-O)n6-CH2CH2-C(=O)- en el que n6 es de 2 a 4 , -N[-(CH2CH2-O)n7-CH2CH2-OH]-CH2-C(=O)- en la que n7 es 3 o 4 , -NH-CH2CH2-[N(-CH2-COOH)]-CH2-(C=O)-, -NH-[CH(-CH2-COOH)]-CH2-(C=O)- o -NH-[CH(-CH2-COOH)]-CH2-O-CH2-(C=O)- o es un enlace sencillo.
Cuando L1 es -(Succinimid-3 -il-N)-CH[-(CH2)n3-COOH]-C(=O)-, n3 es preferentemente un número entero de 1 a 4 , más preferentemente 1 o 2 , L2 es
-NH-(CH2CH2-O)n6-CH2CH2-C(=O)-, y n6 es preferentemente de 0 a 4 , más preferentemente n6 es 0 o un enlace sencillo.
Cuando L1 es -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-[N(-CH2-COOH)]-CH2-(C=O)-, L2 es preferentemente un enlace sencillo.
Cuando L1 es -CH2-C(=O)-NH-(CH2)n4-C(=O)-, n4 es preferentemente 2 y L2 es preferentemente un enlace sencillo.
LP puede ser VK, VC, GFG, GGFG, GGFGG, GGFGS, GGFGGG, GGFGGE, GGFGGGFG, DGGF, DGGFG, DdGGFG, DGMeGFG, DGGFS, DDGGFG, KDGGFG, KGGFG, EGGFG o SGGFG. Entre estos, se prefiere GGFG, GGFGG, GGFGS, GGFGGE, GDGGF, DGGFG, DdGGFG, DGMeGFG, DGGFS, DDGGFG, KDGGFG, KGGFG, EGGFG o SGGFG. Es más preferido GGFG, GDGGF, DGGFG, DdGGFG, DGMeGFG, DGGFS, DDGGFG o KDGGFG. Además, se prefiere GGFG, DGGFG, DdGGFG, o DGMeGFG.
El resto -NH- (CH2)n1-La-Lb-Lc- puede ser -NH-CH2CH2-C(=O)-, -NH-CH2CH2CH2-C(=O)-, -NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-, -NH-CH2CH(-Me)-C(=O)-, -NH-CH2C(-Me)H-C(=O)-, -NH-CH2CH2C(-Me)2-C(=O)-, -NH-CH2CH2-NH-C(=O)-, -NH-CH2CH2-NH-CH2-C(=O)-, -NH-CH2CH2-NMe-CH2-C(=O)-, -NH-CH2-O-CH2-C(=O)-, -NH-CH2CH2-N(-CH2CH2-OH)-CH2-C(=O)-, -NH-CH2CH2-N(-CH2CH2-OH)-CH2CH2-C(=O)-, -NH-CH2CH2-N(-CH2-COOH)-CH2-C(=O)-, -NH-CH2CH2CH2-C(=O)-NH-CH(-CH2-COOH)-C(=O)-, -NH-CH2CH2CH2-C(=O)-NH-CH(-CH2-OH)-C(=O)-, -NH-CH2CH2- o -NH-CH2CH2CH2CH2-. Entre estos, se prefiere una estructura parcial de -NH-CH2CH2-C(=O)-, -NH-CH2CH2CH2-C(=O)-, -NH-CH2-O-CH2-C(=O)- o -NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-.
Ejemplos específicos de estos compuestos pueden incluir los siguientes [en el presente documento, (maleimid-N-il) representa un grupo maleimidilo (grupo 2 ,5-dioxo-2 ,5-dihidro-1H-pirrol-1-ilo)].
Cuando L1 es -(Succinimid-3-il-N)-(CH2)n2-C(=O)-, L2 es -NH-(CH2CH2-O)n6-CH2CH2-C(=O)-, -N[-(CH2CH2-O)n7-CH2CH2-OH]-CH2-C(=O)-, -NH-[CH(-CH2-COOH)]-CH2-(C=O)-, -NH-CH2CH2-[N(-CH2-COOH)]-CH2-(C=O)- o un enlace sencillo. Por lo tanto, como un intermedio de producción, un compuesto que tiene una estructura preferentemente representada por la siguiente fórmula:
(maleimid-N-il)-(CH2)n2-C(=O)-LP-NH-(CH2)n1-La-Lb-Lc-(NH-DX),
(maleimid-N-il)-(CH2)n2-C(=O)-NH-(CH2CH2-O)n6-CH2CH2-C(=O)-LP-NH-(CH2)n1-La-Lb-Lc-(NH-DX) en la que n6 es de 2 a 4 ,
(maleimid-N-il)-(CH2)n2-C(=O)-N[-(CH2CH2-O)n7-CH2CH2-OH]-CH2-C(=O)-LP-NH-(CH2)n1-La-Lb-Lc-(NH-DX) en la que n7 es 3 o 4 ,
(maleimid-N-il)-(CH2)n2-C(=O)-NH-CH2CH2-[N(-CH2-COOH)]-CH2-(C=O)-LP-NH-(CH2)n1-La-Lb-Lc-(NH-DX), (maleimid-N-il)-(CH2)n2-C(=O)-NH-[CH(-CH2-COOH)]-CH2-(C=O)-LP-NH-(CH2)n1-La-Lb-Lc-(NH-DX), o (maleimid-N-il)-(CH2)n2-C(=O)-NH-[CH(-CH2-COOH)]-CH2-O-CH2-(C=O)-LP-NH-(CH2)n1-La-Lb-Lc-(NH-DX)
pueden usarse preferentemente.
En este caso, preferentemente, n2 es de 2 a 5 , y el resto -NH-(CH2)n1-La-Lb-Lc- es -NH-CH2CH2-C(=O)-, -NH-CH2CH2CH2-C(=O)-, -NH-CH2-O-CH2-C(=O)- o -NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-.
Como LP, pueden usarse preferentemente VK, GFG, GGFG, GGFGG, GGFGS, GGFGGG, GGFGGE, GGFGGGFG, DGGF, DGGFG, DdGGFG, DGMeGFG, DGGFS, DDGGFG, KDGGFG, KGGFG, EGGFG o SGGFG. Entre estos, se prefiere GGFG, GGFGG, GGFGS, GGFGGE, GDGGF, DGGFG, DdGGFG, DGMeGFG, DGGFS, DDGGFG, KDGGFG, KGGFG, EGGFG o SGGFG. Es más preferido GGFG, GDGGF, DGGFG, DdGGFG, DGMeGFG, DGGFS, DDGGFG o KDGGFG. GGFG, DGGFG, Es más preferido DdGGFG o DGMeGFG. También preferentemente, LP está directamente conectado al fármaco.
Cuando L1 es -(Succinimid-3-il-N)-CH[-(CH2)n3-COOH]-C(=O)-, L2 es -NH-(CH2CH2-O)n6-CH2CH2-C(=O)- o un enlace sencillo. Por lo tanto, como un intermedio de producción, un compuesto que tiene una estructura representada por la siguiente fórmula:
(maleimid-N-il)-CH[-(CH2)n3-COOH]-C(=O)-NH-(CH2-CH2-O)n6-CH2-CH2-C(=O)-LP-NH-(CH2)n1-La-Lb-Lc-(NH-DX) o
(maleimid-N-il)-CH[-(CH2)n3-COOH]-C(=O)-LP-NH-(CH2)n1-La-Lb-Lc-(NH-DX)
pueden usarse preferentemente. En este caso, n6 es de 0 a 6 y es de manera particular preferentemente 0. Preferentemente, n3 es de 2 a 4 , y
el resto -NH-(CH2)n1-La-Lb-Lc- es -NH-CH2CH2-C(=O)-, -NH-CH2CH2CH2-C(=O)-, -NH-CH2-O-CH2-C(=O)- o -NHCH2CH2-O-CH2-C(=O)-.
Como LP, puede usarse preferentemente VK, VC, GFG, GGFG, GGFGG, GGFGS, GGFGGG, GGFGGE, GGFGGGFG, DGGF, DGGFG, DdGGFG, DGMeGFG, DGGFS, DDGGFG, KDGGFG, KGGFG, EGGFG o SGGFG. Entre estos, se prefiere GGFG, GGFGG, GGFGS, GGFGGE, GDGGF, DGGFG, DdGGFG, DGMeGFG, DGGFS, DDGGFG, KDGGFG, KGGFG, EGGFG o SGGFG. Es más preferido GGFG, GDGGF, DGGFG, DdGGFG, DGMeGFG, DGGFS, DDGGFG o KDGGFG. Además, se prefiere GGFG, DGGFG, DdGGFG, o DGMeGFG. También preferentemente, LP está directamente conectado al fármaco. LP es preferentemente GGFG.
Cuando L1 es -CH2-C(=O)-NH-(CH2)n4-C(=O)- y L2 es un enlace sencillo, como un intermedio de producción, un compuesto que tiene un grupo halogenoacetilo y que tiene una estructura representada por la siguiente fórmula:
X-CH2-C(=O)-NH-(CH2)n4-C(=O)-LP-NH-(CH2)n1-La-Lb-Lc-(NH-DX)
pueden usarse preferentemente.
En este caso, preferentemente n4 es de 2 a 5 , y el resto -NH-(CH2)n1-La-Lb-Lc- es -NH-CH2CH2-C(=O)-, -NH-CH2CH2CH2-C(=O)-, -NH-CH2-O-CH2-C(=O)- o -NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-.
Como LP, puede usarse preferentemente VK, VC, GFG, GGFG, GGFGG, GGFGS, GGFGGG, GGFGGE, GGFGGGFG, DGGF, DGGFG, DdGGFG, DGMeGFG, DGGFS, DDGGFG, KDGGFG, KGGFG, EGGFG o SGGFG. Entre estos, se prefiere GGFG, GGFGG, GGFGS, GGFGGE, GDGGF, DGGFG, DdGGFG, DGMeGFG, DGGFS, DDGGFG, KDGGFG, KGGFG, EGGFG o SGGFG. Es más preferido GGFG, GDGGF, DGGFG, DdGGFG, DGMeGFG, DGGFS, DDGGFG o KDGGFG. Además, se prefiere GGFG, DGGFG, DdGGFG, o DGMeGFG. También preferentemente, LP está directamente conectado al fármaco. X es preferentemente bromo o yodo.
En este caso, X en la fórmula anterior representa un átomo de bromo o un átomo de yodo. Cualquiera de tales compuestos de bromo y compuestos de yodo se puede usar preferentemente como intermedio de producción.
Cuando L1 es -CH2-C(=O)-NH-(CH2)n4-C(=O)- y L2 es -N[-(CH2CH2-O)n7-CH2CH2-OH]-CH2-C(=O)-, como un intermedio de producción, un compuesto que tiene una estructura representada por la siguiente fórmula:
X-CH2-C(=O)-NH-(CH2)n4-C(=O)-N[-(CH2CH2-O)n7-CH2CH2-OH]-CH2-C(=O)-LP-NH-(CH2)n1-La-Lb-Lc-(NH-DX)
pueden usarse preferentemente.
En este caso, preferentemente, n4 es de 2 a 5 , n7 es 3 o 4 , y el resto -NH-(CH2)n1-La-Lb-Lc- es -NH-CH2CH2-C(=O)-, -NH-CH2CH2CH2-C(=O)-, -NH-CH2-O-CH2-C(=O)- o -NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-.
Como LP, puede usarse preferentemente VK, VC, GFG, GGFG, GGFGG, GGFGS, GGFGGG, GGFGGE, GGFGGGFG, DGGF, DGGFG, DdGGFG, DGMeGFG, DGGFS, DDGGFG, KDGGFG, KGGFG, EGGFG o SGGFG. Entre estos, se prefiere GGFG, GGFGG, GGFGS, GGFGGE, GDGGF, DGGFG, DdGGFG, DGMeGFG, DGGFS, DDGGFG, KDGGFG, KGGFG, EGGFG o SGGFG. Es más preferido GGFG, GDGGF, DGGFG, DdGGFG, DGMeGFG, DGGFS, DDGGFG o KDGGFG. Además, se prefiere GGFG, DGGFG, DdGGFG, o DGMeGFG. También preferentemente, LP está directamente conectado al fármaco. LP es preferentemente GGFG.
A fin de asegurar la cantidad del conjugado, se puede mezclar una pluralidad de conjugados obtenidos en condiciones de producción similares para tener un número equivalente de fármacos (por ejemplo, aproximadamente ± 1 ) para preparar nuevos lotes. En este caso, Las cantidades promedio de fármacos se encuentra entre las cantidades promedio de los fármacos en los conjugados antes de la mezcla.
2. Procedimiento de producción 2
El conjugado anticuerpo-fármaco representado por la fórmula (1) en la que el enlace al anticuerpo es un enlace amida, el enlazador es un enlazador que tiene un enlace tioéter, y -L1-L2- es una estructura de -C(=O)-cic.Hex(1 ,4 )-CH2-(N-li-3 -dimiccuS)-S-(CH2)n8-C(=O)-, o una sal farmacológicamente aceptable del mismo puede producirse mediante el siguiente procedimiento.
[Fórmula 31 ]
L2 -Lp-N H-(C H2) n1-La-Lb-Lc-(N H-DX) A B-Lr A B -L '-^ -L P -N H -ÍC H ^ n ^ -L A L ^ N H -D X )
o 3 b o
L2 -Lp-(NH-DX) A B -L 1-L2-Lp-(NH-DX)
2 a 1
En la fórmula, AB-L1' representa un compuesto que tiene una estructura en la que el anticuerpo está conectado al enlazador L1 a través de un enlace de amida y además, el terminal de L1 se convierte a un grupo N-maleimidilo. Es decir, es una estructura en la que -(N-li-3-dimiccuS)- en AB-C(=O)-cic.Hex(1 ,4 )-CH2-(N-li-3-dimiccuS)-, se convierte a un grupo maleimidilo. L2' representa un grupo representado por HS-(CH2)n8-C(=O)- que tiene un grupo mercapto terminal y AB representa un anticuerpo.
Es decir, el conjugado anticuerpo-fármaco (1) puede producirse haciendo reaccionar el compuesto (2 a), que es obtenible mediante el procedimiento descrito a continuación, con el anticuerpo (3 b) conectado al enlazador que tiene un grupo maleimidilo.
El anticuerpo (3 b) que tiene un grupo maleimidilo también puede obtenerse mediante un procedimiento bien conocido en la técnica (Hermanson, G.T, Bioconjugate Techniques, pág. 56 -136 , pág. 456 -493 , Academic Press (1996 )). Los ejemplos pueden incluir un enlazador bifuncional. tal como 4 -(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo (SMCC) capaz de unirse a un grupo amino o un grupo hidroxilo y que tiene un grupo maleimidilo que reacciona con el grupo amino del anticuerpo para introducir el grupo maleimidilo, pero no se limita a los mismos.
Por ejemplo, se puede usar preferentemente un compuesto en el que un resto reactivo para un grupo amino y un resto reactivo para un grupo tiol están conectados a través de un enlazador. En el presente documento, el resto reactivo para un grupo amino puede ser un éster activo, un éster de imida o similares, y el resto reactivo de tiol puede ser maleimidilo, haluro de acetilo, haluro de alquilo, ditiopiridilo o similares.
Ejemplos de un procedimiento para construir el conjugado anticuerpo-fármaco a través de un enlace amida en el grupo amino o grupo hidroxilo, particularmente, grupo amino, del aminoácido que constituye el anticuerpo incluye un procedimiento que usa el anticuerpo conectado al enlazador (3 b) de la presente invención que tiene un grupo maleimidilo. Un compuesto que reacciona con el anticuerpo para obtener este compuesto, un compuesto conocido en la técnica y representado por la siguiente fórmula:
Q1-L1a-Q2
[en la fórmula, Q1 representa (Pirrolidin-2 ,5-diona-N-il)-O-C(=O)-, (3 -Sulfo-pirrolidin-2 ,5 -diona-N-il)-O-C(=O)-, RQ-O-C(=N)- u O=C=N-,
L1a- representa -cic.Hex(1 ,4 )-CH2-, un grupo alquileno que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, un grupo fenileno, -(CH2)n4-C(=O)-, -(CH2)n4a-NH-C(=O)-(CH2)n4b- o -(CH2)n4a-NH-C(=O)-cic.Hex(1 ,4 )-CH2-,
Q2 representa (maleimid-N-ilo), un átomo de halógeno o -S-S-(2 -Piridilo),
RQ representa un grupo alquilo que tiene de 1 a 6 átomos de carbono,
n4 representa un número entero de 1 a 8 , n4a representa un número entero de 0 a 6 y n4b representa un número entero de 1 a 6 ] pueden usarse preferentemente.
En este caso, RQ puede ser un grupo alquilo que tiene de 1 a 6 átomos de carbono y es más preferentemente un grupo metilo o un grupo etilo.
El grupo alquileno de L1a puede tener de 1 a 10 átomos de carbono. El grupo fenileno puede ser orto-, meta- o parafenileno y es más preferentemente para- o meta-fenileno.
Ejemplos preferidos de L1a pueden incluir -cic.Hex(1 ,4 )-CH2-, -(CH2)5-NH-C(=O)-cic.Hex(1 ,4 )-CH2-, -(CH2)2-NH-C(=O)-CH2-, -(CH2)-NH-C(=O)-(CH2)2-, -CH2-, -(CH2)2-, -(CH2)3-,-(CH2)5-, -(CH2)10-, -(para-Ph)-, -(meta-Ph)-, -(para-Ph)-CH(-Me)-, -(CH2)3-(meta-Ph)- y -(meta-Ph)-NH-C(=O)-CH2-.
Q1 es preferentemente (Pirrolidin-2 ,5-diona-N-il)-O-C(=O)- y Q2 es preferentemente (maleimid-N-il). Para formar un enlace disulfuro, se puede usar -S-S-(2 -piridilo).
En este caso, (pirrolidin-2 ,5 -diona-N-il)- es un grupo representado por la siguiente fórmula:
en la que el átomo de nitrógeno está en la posición de conexión, (3 -Sulfo-pirrolidin-2 ,5 -diona-N-il)- es un grupo representado por la siguiente fórmula:
en la que el átomo de nitrógeno está en la posición de conexión y este ácido sulfónico es capaz de formar una sal de litio, una sal sódica o una sal potásica, preferentemente una sal sódica, cic.Hex(1 ,4 ) representa un grupo 1 ,4 -ciclohexileno, (maleimid-N-il) es un grupo representado por la siguiente fórmula:
en la que el átomo de nitrógeno está en la posición de conexión, (2 -piridil) representa un grupo 2 -piridilo, (para-Ph) representa un grupo para-fenileno y (meta-Ph) representa un grupo meta-fenileno.
Como tal compuesto, además del compuesto anterior, puede usarse por ejemplo 4 -(N-maleimidilmetil)ciclohexano-1-carboxilato de sulfosuccinimidilo (sulfo-SMCC), N-succinimidil-(N-maleimidilmetil)-ciclohexano-1-carboxi-(6 -amidocaproato) (LC-SMCC), N-succinimidil éster del ácido K-maleimidilundecanoico (KMUA), N-succinimidil éster del ácido Y-maleimidilbutírico (GMBS), N-hidroxisuccinimida éster del ácido £-maleimidilcaproico(EMCS), mmaleimidilbenzoil-N-hidroxisuccinimida éster (MBS), N-(a-maleimidilacetoxi)-succinimida éster (AMAS), succinimidil-6 -(p-maleimidilpropionamido)hexanoato (SMPH), 4 -(p-maleimidilfenil)-butirato de N-succinimidilo (SMPB), N-(pmaleimidilfenil)isocianato (PMPI), N-succinimidil-4 -(yodoacetil)-aminobenzoato (SIAB), yodoacetato de N-succinimidilo (SIA), bromoacetato de N-succinimidilo (SBA), 3-(bromoacetamida)propionato de N-succinimidilo (SBAP), N-succinimidil-3 -(2 -piridoditio)propionato (SPDP) y succinimidiloxicarbonil-a-metil-a-(2 -piridilditio)tolueno (SMPT).
De manera específica, por ejemplo, el anticuerpo (3 ) se puede hacer reaccionar con 2 a 6 equivalentes de SMCC en un tampón fosfato de pH 6 a 7 a temperatura ambiente durante 1 a 6 horas para que el éster activo de SMCC reaccione con el anticuerpo para obtener el anticuerpo (3 b ) que tiene un grupo maleimidilo. El anticuerpo obtenido (3 b) puede
purificarse mediante el procedimiento común D-2 a continuación y usarse para la siguiente reacción con el compuesto (2 a).
El grupo amino y el grupo hidroxilo del anticuerpo que se conectará con el resto enlazador indica, por ejemplo, el grupo amino N-terminal del anticuerpo y/o un grupo amino de un residuo de lisina del anticuerpo, y un grupo hidroxilo de un residuo de serina del anticuerpo, respectivamente, pero no están limitados al mismo.
El conjugado anticuerpo-fármaco (1) producido, puede, después de la concentración, intercambio de tampón, purificación, medición de la concentración de anticuerpos y el número promedio de moléculas de fármaco conjugado por molécula de anticuerpo, y el cálculo del contenido agregado, se someterán a la identificación del conjugado de anticuerpo-fármaco (1 ) como se menciona en el procedimiento de producción 1.
En el procedimiento de producción 2 , el compuesto representado por la fórmula (3 b) tiene la siguiente estructura (en la estructura de la siguiente fórmula, "Anticuerpo-NH-" se origina a partir de un anticuerpo).
Un compuesto que tiene la anterior estructura, la cual es un intermedio para producir el conjugado anticuerpo-fármaco de la presente invención, es como sigue a continuación (en la fórmula, n es un número entero de 1 a 10 y es preferentemente de 2 a 8 , más preferentemente de 3 a 8 ).
Un compuesto que tiene un resto enlazador-fármaco para la reacción con el intermedio anterior, en el cual L1-L2-tiene una estructura de -C(=O)-cic.Hex(1 ,4 )-CH2-(N-li-3 -dimiccuS)-S-(CH2)n8-C(=O)- y el terminal para connstruir el conjugado anticuerpo-fármaco es un grupo mercapto, un compuesto que tiene una estructura representada por la siguiente fórmula:
HS-(CH2)n8-C(=O)-LP-NH-(CH2)n1-La-Lb-Lc-(NH-DX)
pueden usarse preferentemente.
En este caso, preferentemente, n8 es de 2 a 5 , y el resto -NH-(CH2)n1-La-Lb-Lc- es -NH-CH2CH2-C(=O)-, -NH-CH2CH2CH2-C(=O)-, -NH-CH2-O-CH2-C(=O)- o -NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-.
Como LP, puede usarse preferentemente VK, VC, GFG, GGFG, GGFGG, GGFGS, GGFGGG, GGFGGE, GGFGGGFG, DGGF, DGGFG, DdGGFG, DGMeGFG, DGGFS, DDGGFG, KDGGFG, KGGFG, EGGFG o SGGFG. Entre estos, se prefiere GGFG, GGFGG, GGFGS, GGFGGE, GDGGF, DGGFG, DdGGFG, DGMeGFG, DGGFS,
DDGGFG, KDGGFG, KGGFG, EGGFG o SGGFG. Es más preferido GGFG, GDGGF, DGGFG, DdGGFG, DGMeGFG, DGGFS, DDGGFG o KDGGFG. Es más preferido GGFG, DGGFG, DdGGFG o DGMeGFG. También preferentemente, LP está directamente conectado al fármaco.
3. Procedimiento de producción 3
El conjugado anticuerpo-fármaco representado por la fórmula (1) en la que el resto enlazador del fármaco está conectado al anticuerpo a través de un enlace amida, o una sal farmacológicamente aceptable del mismo puede producirse mediante un procedimiento descrito a continuación. Cuando L1 es, por ejemplo, -C(=O)-(CH2)n5-C(=O)-, L1' en la cual además se convierte a un éster activo, por ejemplo, puede usarse preferentemente (pirrolidin-2 ,5-diona-N-il)-O-C(=O)-(CH2)n5-C(=O)-. Cuando L2 es un enlace sencillo, el conjugado anticuerpo fármaco puede producirse mediante el siguiente procedimiento, por ejemplo.
[Fórmula 37 ]
Lr -L2-Lp-NH-(CH2)n1-La-Lt>-Lc-(NH-DX) AB AB-L1-L2-Lp-NH-(CH2)n1-La-Lb-Ld-(NH-DX)
o 3 o
Lr -L2-Lp-(NPFDX) AB-L1-L2-LP-(NH-DX)
2b 1
Es decir, el conjugado anticuerpo-fármaco (1 ) puede producirse haciendo reaccionar el compuesto (2 b), que se obtiene mediante el procedimiento descrito a continuación, con el anticuerpo (3 ).
El compuesto (2 b) es capaz de unirse a un grupo amino o un grupo hidroxilo del anticuerpo. El grupo amino y el grupo hidroxilo del anticuerpo, como se describe en el procedimiento de producción 2 , indican, por ejemplo, el grupo amino N-terminal del anticuerpo y/o un grupo amino de un residuo de lisina del anticuerpo, y un grupo hidroxilo de un residuo de serina del anticuerpo, respectivamente, pero no están limitados a los mismos.
Aunque el compuesto (2 b) es un éster activo que contiene un grupo N-hidroxisuccinimidil éster, otros ésteres activos, por ejemplo, un grupo sulfosuccinimidil éster, N-hidroxiftalimidil éster, N-hidroxisulfoftalimidil éster, orto-nitrofenil éster, para-nitrofenil éster, 2 ,4 -dinitrofenil éster, 3 -sulfonil-4 -nitrofenil éster, 3-carboxi-4 -nitrofenil éster o pentafluorofenil éster pueden usarse.
Usando 2 a 20 equivalentes molares del compuesto (2 b) por el anticuerpo (3 ) en la reacción entre el compuesto (2 b) y el anticuerpo (3 ), el conjugado anticuerpo-fármaco (1 ) en el que 1 a 10 moléculas de fármaco se conjugan por molécula de anticuerpo se puede producir. De manera específica, la solución que contiene el compuesto (2 b) disuelto en el mismo puede añadirse a una solución tampón que contiene el anticuerpo (3 ) para que la reacción produzca el conjugado anticuerpo-fármaco (1). En el presente documento, los ejemplos de la solución tampón que se pueden usar incluyen solución de acetato de sodio, fosfato sódico y borato sódico. El pH para la reacción es de 5 a 9 , y más preferentemente la reacción se realiza cerca del pH 7. Los ejemplos del disolvente para disolver el compuesto (2 b) incluyen un disolvente orgánico tal como dimetil sulfóxido (DMSO), dimetilformamida (DMF), dimetilacetamida (DMA) y N-metil-2 -piridona (NMP). Es suficiente que la solución de disolvente orgánico que contiene el compuesto (2 b) disuelto en la anterior se añada a 1 a 20 % v/v a una solución tampón que contiene el anticuerpo (3 ) para la reacción. La temperatura de reacción es de 0 a 37 °C, más preferentemente de 1o a 25 °C y el tiempo de reacción es de 0,5 a 20 horas.
El conjugado anticuerpo-fármaco (1) producido, puede, después de la concentración, intercambio de tampón, purificación y la medición de la concentración de anticuerpos y el número promedio de moléculas de fármaco conjugado por molécula de anticuerpo se someterán a la identificación del conjugado de fármaco y anticuerpo (1 ) de la misma manera que el procedimiento de producción 1.
En el procedimiento de producción 3 , (pirrolidin-2 ,5 -diona-N-il)-O-C(=O)-(CH2)n5-C(=O)-tiene la siguiente estructura.
[Fórmula 38 ]
O
A
f N - 0 -C0-(CH2)n5-C(=0)
' i
o
Cuando L1 es -C(=O)-(CH2)n5-C(=O)-, ejemplos del compuesto para conectar el resto enlazador-fármaco al anticuerpo a través de un enlace amida pueden incluir un compuesto enlazador-fármaco que tiene una estructura que tiene el resto estructura anterior en el terminal.
4. Procedimiento de producción 4
Se puede producir el compuesto representado por la fórmula (2 ) o (2 b) como un intermedio usado en el procedimiento de producción anterior o una de sus sales farmacológicamente aceptables mediante el siguiente procedimiento, por ejemplo.
En la fórmula, Lc es -C(=O)- y está conectado a -(NH-DX) formando un enlace amida, L1' corresponde a L1 que tiene una estructura en la que el terminal se convierte a un grupo maleimidilo, un grupo haloacetilo o (pirrolidin-2 ,5-diona-N-il)-O-C(=O)-(CH2)n4-C(=O)- y P1, P2 y P3 cada uno representa un grupo protector.
El compuesto (6 ) puede producirse derivatizando el ácido carboxílico (5 ) en un éster activo, mezclado con anhídrido de ácido, haluro de ácido o similar y se hace reaccionar con NH2-DX [lo que indica exatecán; nombre químico: (1S,9S)-1-amino-9-etil-5-fluoro-2 ,3 -dihidro-9-hidroxi-4 -metil-1H,12H-benzo[de]pirano[3 ',4 ' :6 ,7 ]indolizino[1 ,2 -b]quinolina-10 ,13 (9 H,15H)-diona] (4 ) o una sal farmacológicamente aceptable del mismo. También, puede añadirse una base adecuada.
Se pueden emplear para la reacción reactivos de reacción y condiciones que se usan comúnmente para la síntesis de péptidos. Existen diversos tipos de ésteres activos. Por ejemplo, se pueden producir haciendo reaccionar fenoles tales como p-nitrofenol, N-hidroxibenzotriazol, N-hidroxisuccinimida o similares, con el ácido carboxílico (5 ) usando un agente de condensación, tal como clorhidrato de N,N'-diciclohexilcarbodiimida o 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida. Además, puede producirse también el éster activo mediante reacción del ácido carboxílico (5 ) con trifluoroacetato de pentafluorofenilo o similar; una reacción del ácido carboxílico (5 ) con
hexafluorofosfito de 1-benzotriazolil oxitripirrolidinofosfonio; una reacción del ácido carboxílico (5 ) con cianofosfonato de dietilo (procedimiento de salado); una reacción del ácido carboxílico (5 ) con trifenilfosfina y disulfuro de 2 ,2 '-dipiridilo (procedimiento de Mukaiyama); una reacción del ácido carboxílico (5 ) con un derivado de triazina tal como cloruro de 4 -(4 ,6 -dimetoxi-1 ,3 ,5-triazin-2 -il)-4 -metilmorfolinio (DMTMM); o similares. Además, la reacción se puede llevar a cabo mediante, por ejemplo, un procedimiento de haluro de ácido por el cual el ácido carboxílico (5 ) se trata con un haluro de ácido, tal como cloruro de tionilo y cloruro de oxalilo. Haciendo reaccionar el éster activo, mezclado con anhídrido de ácido, o haluro de ácido del ácido carboxílico (5 ) obtenido como anteriormente con el compuesto (4 ) en presencia de una base adecuada en un disolvente inerte de -78 °C a 150 °C, se puede producir el compuesto (6 ). (Mientras tanto, "disolvente inerte" indica un disolvente que no inhibe una reacción para la cual se usa el disolvente). También, puede añadirse una base adecuada.
Ejemplos específicos de la base usada para cada etapa descrita anteriormente incluyen un carbonato de un metal alcalino o un metal alcalinotérreo, un alcóxido de metal alcalino y un hidróxido o hidruro de metal alcalino, tales como carbonato de sodio, carbonato potásico, etóxido sódico, butóxido potásico, hidróxido sódico, hidróxido potásico, hidruro sódico e hidruro potásico; una base organometálica representada por un alquillitio, tal como n-butillitio o dialquilamino de litio, tal como diisopropilamida de litio; una base organometálica de bissililamina que incluye litio bis(trimetilsilil)amida; y una base orgánica, tal como piridina, 2 ,6 -lutidina, colidina, 4 -dimetilaminopiridina, trietilamina, N-metilmorfolina, diisopropiletilamina y diazabiciclo[5.4.0 ]undec-7 -eno (DBU).
Los ejemplos del disolvente inerte que se usa para la reacción de la presente invención incluyen un disolvente de hidrocarburo halogenado tal como diclorometano, cloroformo, y tetracloruro de carbono; un disolvente éter tal como tetrahidrofurano, 1 ,2 -dimetoxietano, y dioxano; un disolvente de un hidrocarburo aromático, tal como benceno y tolueno; y un disolvente amida tal como N,N-dimetilformamida, N,N-dimetilacetamida y N-metilpirrolidin-2 -ona. Además de estos, pueden usarse en algunos casos, un disolvente de sulfóxido, tales como dimetilsulfóxido y sulfolano, un disolvente de alcohol, tal como metanol y etanol; y un disolvente de cetona, tal como acetona y metil etil cetona.
En La y Lb del compuesto (6 ), como se describe a continuación, un grupo hidroxilo, un grupo carboxi, un grupo amino o similares pueden protegerse con un grupo protector que generalmente se usa para la síntesis de compuestos orgánicos. De manera específica, los ejemplos del grupo protector para un grupo hidroxilo pueden incluir un grupo alcoximetilo, tal como un grupo metoximetilo; un grupo arilmetilo, tal como un grupo bencilo, un grupo 4 -metoxibencilo y un grupo trifenilmetilo; un grupo alcanoilo, tal como un grupo acetilo; un grupo aroilo, tal como un grupo benzoílo; un grupo sililo, tal como un grupo ferc-butil difenilsililo.
Un grupo carboxi puede protegerse, por ejemplo, como un éster con un grupo alquilo tal como un grupo metilo, un grupo etilo y un grupo ferc-butilo, un grupo alilo o un grupo arilmetilo, tal como un grupo bencilo. Un grupo amino puede protegerse con un grupo protector para un grupo amino que se usa generalmente para síntesis peptídica, por ejemplo, un grupo alquiloxicarbonilo, tal como un grupo ferc-butiloxicarbonilo, un grupo metoxicarbonilo y un grupo etoxicarbonilo; un grupo arilmetilo, tal como aliloxicarbonilo, un grupo 9-fluorenilmetiloxicarbonilo, un grupo benciloxicarbonilo, un grupo parametoxi-benciloxicarbonilo y un grupo para (u orto)nitrobenciloxicarbonilo; un grupo alcanoilo, tal como un grupo acetilo; un grupo arilmetilo, tal como un grupo bencilo y un grupo trifenilmetilo; un grupo aroilo, tal como un grupo benzoílo; y un grupo arilsulfonilo, tal como un grupo 2 ,4 -dinitrobencenosulfonilo o un grupo ortonitrobencenosulfonilo. Los grupos protectores anteriores pueden introducirse y retirarse de acuerdo con procedimiento que generalmente se lleva a cabo.
Como para el grupo protector P1 para el grupo amino terminal del compuesto (6 ), un grupo protector para un grupo amino que se usa generalmente para la síntesis peptídica, por ejemplo, puede usarse un grupo ferc-butiloxicarbonilo, un grupo 9-fluorenil-metiloxicarbonilo o un grupo benciloxicarbonilo. Los ejemplos de otros grupos protectores para un grupo amino incluyen un grupo alcanoilo, tal como un grupo acetilo; un grupo alcoxicarbonilo tal como un grupo metoxicarbonilo y un grupo etoxicarbonilo; un grupo arilmetoxicarbonilo, tal como un grupo parametoxibenciloxicarbonilo y un grupo para (u orto)nitrobenciloxicarbonilo; un grupo arilmetilo, tal como un grupo bencilo y un grupo trifenilmetilo; un grupo aroilo, tal como un grupo benzoílo; y un grupo arilsulfonilo, tal como un grupo 2 ,4 -dinitrobencenosulfonilo y un grupo ortonitrobencenosulfonilo. El grupo protector P1 puede seleccionarse dependiendo de, por ejemplo, las propiedades del compuesto que tiene el grupo amino que se va a proteger.
Desprotegiendo el grupo protector P1 para el grupo del extremo amino del compuesto (6 ) obtenido, se puede producir el compuesto (7 ). Se pueden seleccionar los reactivos y condiciones dependiendo del grupo protector.
El compuesto (9 ) puede producirse derivatizando el ácido carboxílico peptídico (8 ) que tiene el extremo N protegido con P2 en un éster activo, mezclado con un anhídrido de ácido y haciendo reaccionar este con el compuesto (7 ) obtenido. Las condiciones de reacción, reactivos, bases, y disolventes inertes usados para formar un enlace peptídico entre el ácido carboxílico peptídico (8 ) y el compuesto (7 ) se pueden seleccionar de forma adecuada a partir de aquellos descritos para la síntesis del compuesto (6 ). El grupo protector P2 se puede seleccionar de forma adecuada a partir de aquellos descritos para el grupo protector del compuesto (6 ), y la selección se puede realizar basándose en, por ejemplo, las propiedades del compuesto que tiene el grupo amino que se va a proteger. Como se usa generalmente para la síntesis peptídica, repitiendo secuencialmente la reacción y la desprotección del aminoácido o péptido que constituye el ácido carboxílico peptídico (8 ) para el alargamiento, se puede producir también el compuesto (9 ).
Desprotegiendo el grupo protector P2 para el grupo amino del compuesto (9 ) obtenido, se puede producir el compuesto (10 ). Se pueden seleccionar los reactivos y condiciones dependiendo del grupo protector.
El compuesto (2 ) o (2 b) puede producirse derivatizando el ácido carboxílico (11 ) u (11b) en un éster activo, mezclado con anhídrido de ácido, haluro de ácido, o similares y haciendo reaccionar este con el compuesto (10 ) obtenido. Las condiciones de reacción, reactivos, base y el disolvente inerte usado para formar un enlace peptídico entre el ácido carboxílico (11 ) u (11b) y el compuesto (10 ) pueden seleccionarse adecuadamente de los descritos para la síntesis del compuesto (6 ).
Se puede producir también el compuesto (9 ) mediante el siguiente procedimiento, por ejemplo.
El compuesto (13 ) puede producirse derivatizando el ácido carboxílico peptídico (8 ) que tiene el extremo N protegido con P2 en un éster activo, anhídrido de ácido mezclado, o similares y haciendo reaccionar este en presencia de una base con el compuesto de amina (12 ) que tiene el grupo carboxi protegido con P3. Las condiciones de reacción, reactivos, bases, y disolventes inertes usados para formar un enlace peptídico entre el ácido carboxílico peptídico (8 ) y el compuesto (12 ) se pueden seleccionar de forma adecuada a partir de aquellos descritos para la síntesis del compuesto (6 ). El grupo protector P2 para el grupo amino del compuesto (13 ) puede seleccionarse adecuadamente de los descritos para el grupo protector del compuesto (6 ). Como para el grupo protector P3 para un grupo carboxi, un grupo protector comúnmente usado como un grupo protector para un grupo carboxi en química sintética orgánica, en particular, se puede usar la síntesis peptídica. De manera específica, puede seleccionarse adecuadamente de los descritos para el grupo protector del compuesto (6 ), por ejemplo, ésteres con un grupo alquilo, tal como un grupo metilo, un grupo etilo o un tere-butilo, alil ésteres y bencil ésteres. En este caso, es necesario que el grupo protector para un grupo amino y el grupo protector para un grupo carboxi sean los grupos protectores que pueden retirarse mediante un procedimiento diferente o condiciones diferentes. Por ejemplo, un ejemplo representativo incluye una combinación en la que P2 es un grupo tere-butiloxi carbonilo y P3 es un grupo bencilo. Los grupos protectores pueden seleccionarse a partir de los anteriormente mencionados dependiendo de, por ejemplo, las propiedades de los compuestos que tiene el grupo amino y el grupo carboxi a proteger. Para la retirada de los grupos protectores, se pueden seleccionar los reactivos y condiciones dependiendo del grupo protector.
Desprotegiendo el grupo protector P3 para el grupo carboxi del compuesto (13 ) obtenido, se puede producir el compuesto (14 ). Se pueden seleccionar los reactivos y condiciones dependiendo del grupo protector.
El compuesto (9 ) puede producirse derivatizando el compuesto (14 ) obtenido en un éster activo, mezclado con anhídrido de ácido, haluro de ácido, o similares y haciendo reaccionar este con el compuesto (4 ) en presencia de una base. Para la reacción, se pueden usar también reactivos y condiciones de reacción que se usan generalmente para la síntesis de péptidos, y se pueden seleccionar adecuadamente las condiciones de reacción, reactivos, bases y disolventes inertes usados para la reacción a partir de aquellos descritos para la síntesis del compuesto (6 ).
Se puede producir también el compuesto (2 ) o (2 b) mediante el siguiente procedimiento, por ejemplo.
Desprotegiendo el grupo protector P2 para el grupo amino del compuesto (13 ), se puede producir el compuesto (15 ). Se pueden seleccionar los reactivos y condiciones dependiendo del grupo protector.
El compuesto (16 ) o (16b) puede producirse derivatizando el derivado de ácido carboxílico (11 ) u (11b) en un éster activo, mezclado con anhídrido de ácido, haluro de ácido o similar y haciéndolo reaccionar en presencia de una base con el compuesto (15 ) obtenido. Las condiciones de reacción, reactivos, bases, y disolventes inertes utilizados para formar un enlace peptídico entre el ácido carboxílico peptídico (11 ) u (11b) y el compuesto (15 ) se pueden seleccionar de forma adecuada y utilizarse a partir de aquellos descritos para la síntesis del compuesto (6 ).
Al desproteger el grupo protector para el grupo carboxi del compuesto (16 ) o (16b) obtenido, se puede producir el compuesto (17 ) o (17b). La desprotección se puede llevar a cabo de forma similar a la desprotección en el grupo carboxi para producir el compuesto (14 ).
El compuesto (2 ) o (2 b) puede producirse derivatizando el compuesto (17 ) u (17b) en un éster activo, mezclado con anhídrido de ácido, haluro de ácido, o similares y haciendo reaccionar este con el compuesto (4 ) en presencia de una base. Para la reacción, se pueden usar también reactivos y condiciones de reacción que se usan generalmente para la síntesis de péptidos, y se pueden seleccionar adecuadamente las condiciones de reacción, reactivos, bases y disolventes inertes usados para la reacción a partir de aquellos descritos para la síntesis del compuesto (6 ).
5. Procedimiento de producción 5
Se puede producir también el compuesto representado por la fórmula (2 ) de un intermedio mediante el siguiente procedimiento.
[Fórmula 40 ]
L1 -L2-Lp-NH-(C H2)n1-La-Lb-Lc-(NH-DX)
2 0 2b
En la fórmula, Lc es -C(=O)- y está conectado a -(NH-DX) formando un enlace amida, L1' corresponde a L1 que tiene una estructura en la que el terminal se convierte a un grupo maleimidilo, un grupo haloacetilo o (pirrolidin-2 ,5-diona-N-il)-O-C(=O)-(CH2)n4-C(=O)- y P4 representa un grupo protector.
El compuesto (19 ) o (19b) puede producirse derivatizando el compuesto (11 ) u (11b) en un éster activo, mezclado con anhídrido de ácido, o similares y haciendo reaccionar este en presencia de una base con el ácido carboxílico peptídico (18 ) que tiene el extremo C protegido con P4 Las condiciones de reacción, reactivos, bases, y disolventes inertes usados para formar un enlace peptídico entre el ácido carboxílico peptídico (18 ) y el compuesto (11 ) se pueden seleccionar de forma adecuada a partir de aquellos descritos para la síntesis del compuesto (6 ). El grupo protector P4 para el grupo carboxi del compuesto (18 ) puede seleccionarse adecuadamente de los descritos para el grupo protector del compuesto (6 ).
Al desproteger el grupo protector para el grupo carboxi del compuesto (19 ) o (19b) obtenido, se puede producir el compuesto (20 ) o (20 b). La desprotección se puede conseguir de forma similar a la desprotección en el grupo carboxi para producir el compuesto (14 ).
El compuesto (2 ) puede producirse derivatizando el compuesto (20 ) o (20 b) obtenido en un éster activo, mezclado con un anhídrido de ácido y haciendo reaccionar este con el compuesto (7 ). Para la reacción, se pueden usar también reactivos y condiciones de reacción que se usan generalmente para la síntesis de péptidos, y se pueden seleccionar adecuadamente las condiciones de reacción, reactivos, bases y disolventes inertes usados para la reacción a partir de aquellos descritos para la síntesis del compuesto (6 ).
6. Procedimiento de producción 6
Un compuesto como el intermedio de producción (2 a) descrito en el procedimiento de producción 2 en el que L2' corresponde a L2 que tiene una estructura en la que el terminal se convierte a un mercaptoalcanoilo puede producirse mediante el siguiente procedimiento.
El compuesto (2 a) puede producirse derivatizando el ácido carboxílico (21 ) que tiene un grupo mercapto terminal en un éster activo, mezclado con un anhídrido de ácido y haciendo reaccionar este con el compuesto (10 ). Para la reacción, se pueden usar también reactivos y condiciones de reacción que se usan generalmente para la síntesis de péptidos, y se pueden seleccionar adecuadamente las condiciones de reacción, reactivos, bases y disolventes inertes usados para la reacción a partir de aquellos descritos para la síntesis del compuesto (4 ).
También, el compuesto (23 ) puede producirse derivatizando el compuesto (21 ) en un éster activo, mezclado con anhídrido de ácido, haluro de ácido o similares, haciéndolo reaccionar con el compuesto (15 ), y desprotegiendo el grupo protector para el grupo carboxi del compuesto (22 ) obtenido.
El compuesto (2 a) puede producirse derivatizando el compuesto (23 ) en un éster activo, mezclado con anhídrido de ácido, haluro de ácido, o similares y haciendo reaccionar este con el compuesto (4 ) en presencia de una base. Para la reacción, se pueden usar también reactivos y condiciones de reacción que se usan generalmente para la síntesis de péptidos, y se pueden seleccionar adecuadamente las condiciones de reacción, reactivos, bases y disolventes inertes usados para la reacción a partir de aquellos descritos para la síntesis del compuesto (6 ).
7. Procedimiento de producción 7
A continuación, en el presente documento, el procedimiento parta producir el compuesto (10 ') que tiene n1 = 1 , La = 0 y Lb = CR2(R3) en el intermedio de producción (10 ) descrito en el procedimiento de producción 4 se describe con detalle. El compuesto representado por la fórmula (10 '), se puede producir una sal o un solvato del mismo por el siguiente procedimiento, por ejemplo.
En la fórmula, LP, R2 y R3 son como se han definido anteriormente, L representa un grupo acetilo o un átomo de hidrógeno o similares, X e Y cada uno independientemente representan un residuo de aminoácido o un oligopéptido que consiste en 2 o 3 aminoácidos, P5 y P7 representan cada uno un grupo protector para un grupo amino y P6 representa un grupo protector para un grupo carboxi.
Se puede producir un compuesto representado por la fórmula (24 ) usando o aplicando el procedimiento descrito en la patente japonesa abierta a consulta n.° 2002 -60351 o en la referencia (J. Org. Chem., Vol. 51 , página 3196 , 1986 ), y llevando a cabo la retirada de los grupos protectores o la modificación de los grupos funcionales, si es necesario. Además, se puede obtener también tratando un aminoácido con un grupo protegido en un extremo amino o una amida ácida de un oligopéptido con un grupo amino protegido con un aldehido o una cetona.
Haciendo reaccionar (24 ) con el compuesto (25 ) que tiene un grupo hidroxilo a una temperatura que varía desde el enfriamiento a temperatura ambiente en un disolvente inerte en presencia de un ácido o una base, se puede producir el compuesto (26 ). Ejemplos del ácido usado incluyen un ácido inorgánico, tal como ácido fluorhídrico, ácido clorhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico y ácido bórico; un ácido orgánico, tal como ácido acético, ácido cítrico, ácido paratoluenosulfónico y ácido metanosulfónico; y un ácido de Lewis, tal como tetrafluoroborato, cloruro de zinc, cloruro de estaño, cloruro de aluminio y cloruro de hierro. Es particularmente preferible el ácido paratoluenosulfónico. En cuanto a la base usada, cualquiera de las bases ya mencionadas se puede seleccionar y usar adecuadamente. En particular, ejemplos preferidos de los mismos incluyen un alcóxido de metal alcalino tal como ferc-butóxido potásico, un hidróxido de metal alcalino, tal como hidróxido sódico e hidróxido potásico; un hidruro de metal alcalino, tal como hidruro sódico e hidruro potásico; una base organometálica representada por dialquilamino litio, tal como litio diisopropilamida; y una base organometálica de bissililamina que incluye litio bis(trimetilsilil)amida. Los ejemplos del disolvente que se va a usar para la reacción incluyen un disolvente de éter, tal como tetrahidrofurano y 1 ,4 -dioxano; y un disolvente de un hidrocarburo aromático, tal como benceno y tolueno. Aquellos disolventes se pueden preparar como una mezcla con agua. Además, el grupo protector para un grupo amino, como se ilustra por P5 no está particularmente limitado siempre que sea un grupo comúnmente usado para la protección de un grupo amino. Los ejemplos representativos incluyen los grupos protectores para un grupo amino que se describen en el procedimiento de producción 4. Sin embargo, En la presente reacción, pueden existir casos en los que se eliminen por escisión el grupo protector para un grupo amino, como se ilustra por P5. En tales casos, es necesario realizar una reacción con un reactivo adecuado para proteger un grupo amino según sea necesario.
Se puede producir el compuesto (27 ) eliminando el grupo protector P6 del compuesto (26 ). En el presente documento, en el procedimiento de producción 4 se describen ejemplos representativos del grupo protector para un grupo carboxi como se ejemplifica en P6, y es deseable en este caso que el grupo protector P5 para un grupo amino y el grupo protector P6 para un grupo carboxi sean los grupos protectores que se pueden retirar mediante un procedimiento de diferente o condiciones diferentes. Por ejemplo, un ejemplo representativo incluye una combinación en la que P5 es un grupo 9-fluorenilmetiloxi carbonilo y P6 es un grupo bencilo. Los grupos protectores se pueden seleccionar dependiendo de, por ejemplo, las propiedades de los compuestos que tiene el grupo amino y el grupo carboxi a proteger. Para la retirada de los grupos protectores, se pueden seleccionar los reactivos y condiciones dependiendo del grupo protector.
El compuesto (29 ) puede producirse derivatizando el ácido carboxílico (27 ) en un éster activo, mezclado con anhídrido de ácido, haluro de ácido, o similares y haciendo reaccionar este con el compuesto (4 ) o una sal farmacológicamente aceptable del mismo en presencia de una base para producir el compuesto (28 ) seguido por la retirada del grupo protector P5 del compuesto (28 ) obtenido. Para la reacción entre el compuesto (4 ) y el ácido carboxílico (27 ) y la reacción para eliminar el grupo protector P6, se pueden usar los mismos reactivos y condiciones de reacción que los descritos para el procedimiento de producción 4.
El compuesto (10 ') puede producirse haciendo reaccionar el compuesto (29 ) con un aminoácido con el grupo amino terminal protegido o el oligopéptido (30 ) con el grupo amino protegido para producir el compuesto (9 ') y retirando el grupo protector P7 del compuesto (9 ') obtenido. El grupo protector para un grupo amino, como se ilustra por P7 no está particularmente limitado siempre que de manera general se use para la protección de un grupo amino. Sus ejemplos representativos incluyen los grupos protectores para un grupo amino que se describen en el procedimiento de producción 4. Para retirar el grupo protector, se pueden seleccionar los reactivos y condiciones dependiendo del grupo protector. Para la reacción entre el compuesto (29 ) y el compuesto (30 ), se pueden emplear reactivos de reacción y condiciones que se usan comúnmente para la síntesis de péptidos. El compuesto (10 ') producido mediante el procedimiento anteriormente mencionado se puede derivatizar en el compuesto (1 ) de la presente invención de acuerdo con el procedimiento de producción descrito anteriormente.
8. Procedimiento de producción 8
A continuación, en el presente documento, el procedimiento para producir el compuesto (2 ') o (2 b') que tiene n1 = 1 , La = 0 y Lb = CR2(-R3) en el intermedio de producción (2 ) descrito en el procedimiento de producción 4 se describe con detalle. El compuesto representado mediante la fórmula (2 ') o (2 b'), se puede producir una sal o un solvato del mismo por el siguiente procedimiento, por ejemplo.
[Fórmula 43]
L1'-L2-OH
P3-Z-OPs ____________^ H-Z-OP9 11o 11b Lr -L2-Z-OP9 Lr -L2-Z-OH 31 32 *■ 33 c 33b 34 o 34b
H-X-NH-CH2-0-CR2(R3)-C(=0)-(NH-DX)
29 Lr -L2-Lp-NH-CH2-0-CR2(R3)-C(=0)-(NH-DX)
2 'o 2b'
En la fórmula, L1', L2, LP, R2 y R3 son como se han definido anteriormente, Z representa un residuo de aminoácido o un oligopéptido que consiste en 2 o 3 aminoácidos, P8 representa a grupo protector para un grupo amino, y P9 representa un grupo protector para un grupo carboxi.
El compuesto (33) o (33b) puede producirse retirando el grupo protector P8 del aminoácido u oligopéptido (31) con el grupo amino terminal protegido y el grupo carboxi para producir el compuesto (32) y haciendo reaccionar la forma de amina obtenida (32) con el compuesto (11) o (11b). El grupo protector para un grupo amino como se ejemplifica por P8 no está particularmente limitado siempre que sea un grupo comúnmente usado para la protección de un grupo amino. Los ejemplos representativos incluyen los grupos protectores para un grupo amino que se describen en el procedimiento de producción 4. Además, para retirar el grupo protector P8, se pueden seleccionar los reactivos y condiciones dependiendo del grupo protector. Para la reacción entre el compuesto (32) y el ácido carboxílico (11) o (11b), se pueden usar los mismos reactivos y condiciones de reacción que los descritos para el procedimiento de producción 4.
El producto intermedio de producción (2') o (2b') se produjo retirando el grupo protector P9 del compuesto (33) o (33b) para producir el compuesto (34) o (34b) y haciendo reaccionar el ácido carboxílico obtenido (34) con el compuesto (29). Los ejemplos representativos del grupo protector para un grupo carboxi como se ejemplifica por P9 se describen en el procedimiento de producción 4. Para la reacción de desprotección del mismo, se pueden usar los mismos reactivos y condiciones de reacción que los descritos para el procedimiento de producción 4. Para la reacción entre el compuesto (29) y el ácido carboxílico (34) o (34b), pueden emplearse los reactivos y condiciones de reacción que se usan generalmente. El compuesto (2') o (2b') producido mediante el procedimiento anteriormente mencionado se puede derivatizar en el compuesto (1) de la presente invención de acuerdo con el procedimiento de producción descrito anteriormente.
9. Procedimiento de producción 9
A continuación, en el presente documento, el procedimiento para producir el compuesto (17') o (17b') que tiene n1 = 1, La = O, y Lb = CR2(R3) en el intermedio de producción (17) descrito en procedimiento de producción 4 se describe con detalle. El compuesto representado mediante la fórmula (17') o (17b'), también se puede producir una sal o un solvato del mismo por el siguiente procedimiento, por ejemplo.
[Fórmula 44]
P 7-Y-OH
p í.X -M H -C H ,-0 -C R 2{R 3)-C (= 0 ) -0 P f H X -N H -C H ; -0 -C R 4 R 3)-€ (= O )-O P c 30 P ^ - N H - C H j - O - C R ^ X f O - O P 6
~ 26 " " 35 * " 36
L '- L '- O H
H-Lp-NH-CH2-0-CR2(R3)-C(=OJ-OH 110 11b L1,.L2-Lp.NH-CH; -0-CR2(R3).Ci=0|-0H
*■ " 17 ----------------------- * - 1 T 'o 17 b 1
En la fórmula, L1', L2, LP, R2, R3, X, Y, P5, P6 y P7 son como se han definido anteriormente.
El compuesto (36) puede producirse desprotegiendo el grupo protector P5 para el grupo amino del compuesto (26) con el grupo amino terminal protegido y el grupo carboxilo para producir el compuesto (35) y haciendo reaccionar el derivado de amina obtenido (35) con el oligopéptido (30) con el grupo amino terminal protegido o el grupo amino protegido. El grupo protector para un grupo amino como se ejemplifica por P5 no está particularmente limitado siempre que sea un grupo comúnmente usado para la protección de un grupo amino. Los ejemplos representativos incluyen los grupos protectores para un grupo amino que se describen en el procedimiento de producción 4. Además, para retirar el grupo protector P5, se pueden seleccionar los reactivos y condiciones dependiendo del grupo protector. En el presente documento, aunque los ejemplos representativos del grupo protector para un grupo carboxi representado por P6 y el grupo protector para un grupo amino representado por P7 incluyen los grupos protectores para un grupo carboxi
y un grupo amino que se describen en el procedimiento de producción 4, es deseable que el grupo protector P6 para un grupo carboxi y el grupo protector P7 para un grupo amino sean grupos protectores que puedan retirarse mediante el mismo procedimiento o las mismas condiciones. Por ejemplo, un ejemplo representativo incluye una combinación en la que P6 es un grupo éster bencílico y P7 es un grupo benciloxi carbonilo.
El compuesto (37) puede producirse retirando el grupo protector P6 para el grupo carboxi del compuesto (36) y el grupo protector P7 para el grupo amino del compuesto (36). El compuesto (37) también puede producirse eliminando secuencialmente el grupo protector P6 para el grupo carboxi y el grupo protector P7 para el grupo amino, y además, el compuesto (37) puede producirse simplemente retirando a la vez ambos grupos protectores P6 y P7 que pueden retirarse por el mismo procedimiento o las mismas condiciones.
El compuesto (17') o (17b') puede producirse haciendo reaccionar el compuesto (37) obtenido con el compuesto (11) u (11b). Para la reacción entre el compuesto (37) y el compuesto carboxílico (11) u (11b), se pueden usar los mismos reactivos y condiciones de reacción que los descritos para el procedimiento de producción 4.
10. Procedimiento de producción 10
El compuesto representado por la fórmula (2) como un intermedio usado en el procedimiento de producción previo, en el cual el enlazador tiene una estructura representada por -L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-Lb-Lc- y LP es un residuo de péptido que tiene un aminoácido hidrófilo N terminal que es un aminoácido hidrófilo distinto de glicina, o una sal farmacológicamente aceptable del mismo puede producirse mediante el siguiente procedimiento, por ejemplo.
En la fórmula, Lc representa un grupo -C(=O)-, L1' corresponde a L1 que tiene una estructura en la que el terminal se
convierte a un grupo maleimidilo o un grupo haloacetilo, LP representa una estructura que consiste en Lp1-Lp2- y P3, P10, P11, P12, P13 y P14 cada uno representa un grupo protector.
Como LP se forma conectando Lp1 y Lp2, el aminoácido hidrófilo N terminal de LP se obtiene a partir de Lp1. Por lo tanto, se puede adoptar Lp1 que tiene un aminoácido hidrófilo N terminal. Puede ser una pluralidad de aminoácidos hidrofílicos. Adoptando Lp2 que tiene un aminoácido hidrófilo, LP que incluye una pluralidad de aminoácidos hidrófilos en el N terminal de LP o en el N terminal y otras posiciones, pueden producirse de acuerdo con la posición de los mismos.
El compuesto (39) puede producirse derivatizando el péptido o aminoácido (38) que tiene el extremo N protegido con P10 en un éster activo, mezclado con un anhídrido de ácido y haciendo reaccionar este con el compuesto (7) obtenido. Las condiciones de reacción, reactivos, base, y el disolvente usado para formar un enlace amida entre el péptido o el aminoácido (38) y el compuesto (7) se puede seleccionar adecuadamente de los descritos para la síntesis del compuesto (6) a menos que se inhiba la reacción. El grupo protector P10 para un grupo amino se puede seleccionar de forma adecuada a partir de aquellos descritos para el grupo protector del compuesto (6), y la selección se puede realizar basándose en, por ejemplo, las propiedades del compuesto. Como se usa generalmente para la síntesis peptídica, repitiendo secuencialmente la reacción y la desprotección del aminoácido o péptido que constituye el aminoácido (38) para el alargamiento, se puede producir también el compuesto (39).
Desprotegiendo el grupo protector P10 para el grupo amino del compuesto (39) obtenido, se puede producir el compuesto (40). Se pueden seleccionar los reactivos y condiciones dependiendo del grupo protector.
El compuesto (42) puede producirse derivatizando el aminoácido o péptido (41) que tiene el N terminal protegido con P11 y el grupo carboxi de cadena lateral, grupo hidroxilo o grupo amino protegido con P12 en un éster activo, mezclado con un anhídrido de ácido y haciendo reaccionar este con el compuesto (40) obtenido. Las condiciones de reacción, reactivos, base, y el disolvente usado para formar un enlace peptídico entre el aminoácido o péptido (41) y el compuesto (40) puede seleccionarse adecuadamente de los descritos para la síntesis del compuesto (6). Los grupos protectores P11 y P12 pueden seleccionarse adecuadamente de los descritos para el grupo protector para el grupo amino, el grupo carboxi o el grupo hidroxilo del compuesto (6). Sin embargo, es necesario en este caso que el grupo protector P11 para un grupo amino y el grupo protector P12 para un grupo funcional de cadena lateral sean los grupos protectores que pueden eliminarse mediante un procedimiento diferente o condiciones diferentes. Por ejemplo, un ejemplo representativo incluye una combinación en la cual P11 es un grupo 9-fluorenilmetiloxicarbonilo y P12 es un grupo ferc-butilo, etc. como el grupo protector para un grupo carboxi, un grupo metoximetilo, etc. como el grupo protector para un grupo hidroxilo o un grupo ferc-butiloxi carbonilo, etc. como el grupo protector para un grupo amino. El grupo protector P12 para un grupo funcional de cadena lateral es preferentemente un grupo protector que puede desprotegerse en condiciones ácidas, pero no está limitado a los mismos, y el grupo protector puede seleccionarse de los mencionados anteriormente dependiendo de, por ejemplo, las propiedades del compuesto que tiene el grupo amino, el grupo carboxi o el grupo hidroxilo a protegerse. Para la retirada de los grupos protectores, se pueden seleccionar los reactivos y condiciones dependiendo del grupo protector. Como se usa generalmente para la síntesis peptídica, repitiendo secuencialmente la reacción y la desprotección del aminoácido o péptido que constituye el compuesto (42) para el alargamiento, se puede producir también el compuesto (42).
Desprotegiendo el grupo protector P11 para el grupo del extremo amino del compuesto (42) obtenido, se puede producir el compuesto (43). Se pueden seleccionar los reactivos y condiciones dependiendo del grupo protector.
El compuesto (44) puede producirse derivatizando el derivado de ácido carboxílico (11) en un éster activo, mezclado con anhídrido de ácido, haluro de ácido, o similares y haciendo reaccionar este con el compuesto (43) obtenido. En el presente documento, el derivado de ácido carboxílico (11) es un compuesto que tiene una estructura en la cual el enlazador terminal de L1' tiene un grupo maleimidilo o un grupo haloacetilo.
Las condiciones de reacción, reactivos, base, y el disolvente usado para formar un enlace peptídico entre el derivado de ácido carboxílico (11) y el compuesto (43) puede seleccionarse adecuadamente de los descritos para la síntesis del compuesto (6).
Al desproteger el grupo protector P12 para el grupo carboxi de la cadena lateral de aminoácidos, el grupo hidroxilo o el grupo amino del resto peptídico del compuesto (44) obtenido, se puede producir el compuesto (2). Se pueden seleccionar los reactivos y condiciones dependiendo del grupo protector.
Se puede producir también el compuesto (39) mediante el siguiente procedimiento, por ejemplo.
El compuesto (45) puede producirse derivatizando el péptido o aminoácido (38) que tiene el extremo N protegido con P10 en un éster activo, anhídrido de ácido mezclado, o similares y haciendo reaccionar este en presencia de una base con el compuesto de amina (12) que tiene el grupo carboxi terminal protegido con P3. Las condiciones de reacción, reactivos, base y el disolvente usados para formar un enlace peptídico entre el péptido o aminoácido (38) y el compuesto (12) se pueden seleccionar de forma adecuada a partir de aquellos descritos para la síntesis del compuesto (6). El grupo protector P10 para el grupo amino del compuesto (45) puede seleccionarse adecuadamente de los descritos para el grupo protector del compuesto (6). Como para el grupo protector P3 para un grupo carboxi, un grupo protector comúnmente usado como un grupo protector para un grupo carboxi en química sintética orgánica, en
particular, se puede usar la síntesis peptídica. De manera específica, puede seleccionarse adecuadamente de los descritos para el grupo protector del compuesto (6), por ejemplo, ésteres con un grupo alquilo, tal como un grupo metilo, un grupo etilo o un tere-butilo, alil ésteres y bencil ésteres. Es necesario en este caso que el grupo protector P10 para un grupo amino y el grupo protector P3 para un grupo carboxi sean los grupos protectores que pueden eliminarse mediante un procedimiento diferente o condiciones diferentes. Por ejemplo, un ejemplo representativo incluye una combinación en la que P10 es un grupo tere-butiloxi carbonilo y P3 es un grupo bencilo. Los grupos protectores pueden seleccionarse a partir de los anteriormente mencionados dependiendo de, por ejemplo, las propiedades de los compuestos que tiene el grupo amino y el grupo carboxi a proteger. Para la retirada de los grupos protectores, se pueden seleccionar los reactivos y condiciones dependiendo del grupo protector.
Desprotegiendo el grupo protector P3 para el grupo carboxi del compuesto (45) obtenido, se puede producir el compuesto (46). Se pueden seleccionar los reactivos y condiciones dependiendo del grupo protector.
El compuesto (39) puede producirse derivatizando el compuesto (46) obtenido en un éster activo, mezclado con anhídrido de ácido, haluro de ácido, o similares y haciendo reaccionar este con el compuesto (4) en presencia de una base. Para la reacción, se pueden usar también reactivos y condiciones de reacción que se usan generalmente para la síntesis de péptidos, y se pueden seleccionar adecuadamente las condiciones de reacción, reactivos, bases y disolventes usados para la reacción a partir de aquellos descritos para la síntesis del compuesto (6).
Se puede producir también el compuesto (42) mediante el siguiente procedimiento, por ejemplo.
Desprotegiendo el grupo protector P10 para el grupo amino del compuesto (45), se puede producir el compuesto (47). Se pueden seleccionar los reactivos y condiciones dependiendo del grupo protector.
El compuesto (48) puede producirse derivatizando el aminoácido o péptido (41) en un éster activo, mezclado con anhídrido de ácido, haluro de ácido o similar y haciéndolo reaccionar en presencia de una base con el compuesto (47) obtenido. Las condiciones de reacción, reactivos, base, y el disolvente usado para formar un enlace amida entre el aminoácido o péptido (41) y el compuesto (47) puede seleccionarse adecuadamente de los descritos para la síntesis del compuesto (6). En el presente documento, es necesario que los grupos protectores P11 y P12 para el aminoácido o péptido (41) y el grupo protector P3 para el compuesto (47) sean los grupos protectores que pueden eliminarse mediante un procedimiento diferente o condiciones diferentes. Por ejemplo, un ejemplo representativo incluye una combinación en la que P11 es un grupo 9-fluorenilmetiloxi carbonilo, P12es un grupo tere-butiloxi carbonilo, un grupo tere-butilo o un grupo metoximetilo, y P3 es un grupo bencilo, etc. Como se ha mencionado anteriormente, el grupo protector P12 para un grupo funcional de cadena lateral es preferentemente un grupo protector que puede desprotegerse en condiciones ácidas, pero no está limitado a los mismos, y el grupo protector puede seleccionarse de los mencionados anteriormente dependiendo de, por ejemplo, las propiedades del grupo amino, el grupo carboxi o el grupo hidroxilo a proteger. Para la retirada de los grupos protectores, se pueden seleccionar los reactivos y condiciones dependiendo del grupo protector.
Desprotegiendo el grupo protector P3 para el grupo carboxi del compuesto (48) obtenido, se puede producir el compuesto (49). Se pueden seleccionar los reactivos y condiciones dependiendo del grupo protector.
El compuesto (42) puede producirse derivatizando el compuesto (49) en un éster activo, mezclado con anhídrido de ácido, haluro de ácido, o similares y haciendo reaccionar este con el compuesto (4) en presencia de una base. Para la reacción, se pueden usar también reactivos y condiciones de reacción que se usan generalmente para la síntesis de péptidos, y se pueden seleccionar adecuadamente las condiciones de reacción, reactivos, bases y disolventes usados para la reacción a partir de aquellos descritos para la síntesis del compuesto (6).
Se puede producir también el compuesto (44) mediante el siguiente procedimiento, por ejemplo.
Desprotegiendo el grupo protector P11 para el grupo amino del compuesto (48), se puede producir el compuesto (50). Se pueden seleccionar los reactivos y condiciones dependiendo del grupo protector.
El compuesto (51) puede producirse derivatizando el derivado de ácido carboxílico (11) en un éster activo, mezclado con anhídrido de ácido, haluro de ácido o similar y haciéndolo reaccionar en presencia de una base con el compuesto (50) obtenido. Las condiciones de reacción, reactivos, base, y el disolvente usado para formar un enlace amida entre el derivado de ácido carboxílico (11) y el compuesto (50) se puede seleccionar adecuadamente de los descritos para la síntesis del compuesto (6).
Desprotegiendo el grupo protector P3 para el grupo carboxi del compuesto (51) obtenido, se puede producir el compuesto (52). Se pueden seleccionar los reactivos y condiciones dependiendo del grupo protector.
El compuesto (44) puede producirse derivatizando el compuesto (52) en un éster activo, mezclado con anhídrido de ácido, haluro de ácido, o similares y haciendo reaccionar este con el compuesto (4) en presencia de una base. Para la reacción, se pueden usar también reactivos y condiciones de reacción que se usan generalmente para la síntesis de péptidos, y se pueden seleccionar adecuadamente las condiciones de reacción, reactivos, bases y disolventes usados para la reacción a partir de aquellos descritos para la síntesis del compuesto (6).
Se puede producir también el compuesto (44) mediante el siguiente procedimiento, por ejemplo.
El compuesto (54) puede producirse derivatizando el derivado de ácido carboxílico (11) en un éster activo, mezclado con anhídrido de ácido, haluro de ácido o similar y reaccionarlo en presencia de una base con el aminoácido o péptido (53) que tiene el grupo carboxi protegido con P13 y el grupo carboxi de cadena lateral, grupo hidroxilo o grupo amino protegido con P12 Las condiciones de reacción, reactivos, base, y el disolvente usado para formar un enlace amida entre el derivado de ácido carboxílico (11) y el compuesto (53) se puede seleccionar adecuadamente de los descritos para la síntesis del compuesto (6). En el presente documento, los grupos protectores P12 y P13 para el compuesto (54) pueden seleccionarse adecuadamente de los descritos para el grupo protector para el grupo carboxi, el grupo hidroxilo o el grupo amino del compuesto (6). Sin embargo, es necesario en este caso que el grupo protector P13 para un grupo carboxi y el grupo protector P12 para un grupo funcional de cadena lateral sean los grupos protectores que pueden eliminarse mediante un procedimiento diferente o condiciones diferentes. Por ejemplo, un ejemplo representativo incluye una combinación en la cual P13 es un grupo bencilo y P12 es un grupo terc-butilo, etc. como el grupo protector para un grupo carboxi, un grupo metoximetilo, etc. como el grupo protector para un grupo hidroxilo o un grupo terc-butiloxi carbonilo, etc. como el grupo protector para un grupo amino. El grupo protector P12 para un grupo funcional de cadena lateral es preferentemente un grupo protector que puede desprotegerse en condiciones ácidas, pero no está limitado a los mismos, y el grupo protector puede seleccionarse de los mencionados anteriormente dependiendo de, por ejemplo, las propiedades del compuesto que tiene el grupo amino, el grupo carboxi o el grupo hidroxilo a protegerse. Para la retirada de los grupos protectores, se pueden seleccionar los reactivos y condiciones dependiendo del grupo protector.
Desprotegiendo el grupo protector P13 para el grupo carboxi del compuesto (54) obtenido, se puede producir el compuesto (55). Se pueden seleccionar los reactivos y condiciones dependiendo del grupo protector.
El compuesto (57) puede producirse derivatizando el compuesto (55) en un éster activo, mezclado con anhídrido de ácido, haluro de ácido o similar y reaccionarlo en presencia de una base con el aminoácido o péptido (56) que tiene el grupo carboxi protegido con P14 Para la reacción, se pueden usar también reactivos y condiciones de reacción que se usan generalmente para la síntesis de péptidos, y se pueden seleccionar adecuadamente las condiciones de reacción, reactivos, bases y disolventes usados para la reacción a partir de aquellos descritos para la síntesis del compuesto (6). En el presente documento, los grupos protectores P12 y P14 para el compuesto (57) pueden seleccionarse adecuadamente de los descritos para el grupo protector para el grupo carboxi, el grupo hidroxilo o el grupo amino del compuesto (6). Sin embargo, es necesario en este caso que el grupo protector P14 para un grupo carboxi y el grupo protector P12 para un grupo funcional de cadena lateral sean los grupos protectores que pueden eliminarse mediante un procedimiento diferente o condiciones diferentes. Por ejemplo, un ejemplo representativo incluye una combinación en la cual P14 es un grupo bencilo y P12 es un grupo terc-butilo, etc. como el grupo protector para un grupo carboxi, un grupo metoximetilo, etc. como el grupo protector para un grupo hidroxilo o un grupo terc-butiloxi carbonilo, etc. como el grupo protector para un grupo amino. El grupo protector P12 para un grupo funcional de cadena lateral es preferentemente un grupo protector que puede desprotegerse en condiciones ácidas, pero no está limitado a los mismos, y el grupo protector puede seleccionarse de los mencionados anteriormente dependiendo de, por ejemplo, las propiedades del compuesto que tiene el grupo amino, el grupo carboxi o el grupo hidroxilo a protegerse. Para la retirada de los grupos protectores, se pueden seleccionar los reactivos y condiciones dependiendo del grupo protector. Repitiendo secuencialmente la reacción y la desprotección del aminoácido o péptido que constituye el compuesto (57) para el alargamiento, se puede producir también el compuesto (57).
Desprotegiendo el grupo protector P14 para el grupo carboxi del compuesto (57) obtenido, se puede producir el compuesto (58). Se pueden seleccionar los reactivos y condiciones dependiendo del grupo protector.
El compuesto (44) puede producirse derivatizando el compuesto (58) en un éster activo, mezclado con anhídrido de ácido, haluro de ácido, o similares y haciendo reaccionar este con el compuesto (40) en presencia de una base. Para la reacción, se pueden usar también reactivos y condiciones de reacción que se usan generalmente para la síntesis de péptidos, y se pueden seleccionar adecuadamente las condiciones de reacción, reactivos, bases y disolventes usados para la reacción a partir de aquellos descritos para la síntesis del compuesto (6).
Se puede producir también el compuesto (57) mediante el siguiente procedimiento, por ejemplo.
El compuesto (59) puede producirse derivatizando el aminoácido o péptido (56) en un éster activo, mezclado con anhídrido de ácido, haluro de ácido o similar y reaccionarlo en presencia de una base con el aminoácido o péptido (41) que tiene el N terminal protegido con P11 y el grupo carboxi de cadena lateral, grupo hidroxilo o grupo amino protegido con P12. Las condiciones de reacción, reactivos, base, y el disolvente usado para formar un enlace peptídico entre el aminoácido o péptido (56) y el aminoácido o péptido (41) se pueden seleccionar adecuadamente de los descritos para la síntesis del compuesto (6). En el presente documento, es necesario que el grupo protector P14 para el grupo carboxi del aminoácido o péptido (56) y los grupos protectores P11 y P12 para el aminoácido o péptido (41) sean, como se mencionó anteriormente, los grupos protectores que pueden retirarse por un procedimiento diferente o diferentes condiciones. Por ejemplo, un ejemplo representativo incluye una combinación en la que P11 es un grupo 9-fluorenilmetiloxi carbonilo, P12 es un grupo terc-butilo, etc. como el grupo protector para un grupo carboxi, un grupo metoximetilo, etc. como el grupo protector para un grupo hidroxilo o un grupo terc-butiloxi carbonilo, etc. como el grupo protector para un grupo amino y P7 es un grupo bencilo. El grupo protector P4 para un grupo funcional de cadena
lateral es preferentemente un grupo protector que puede desprotegerse en condiciones ácidas, pero no está limitado a los mismos, y el grupo protector puede seleccionarse de los mencionados anteriormente dependiendo de, por ejemplo, las propiedades del compuesto que tiene el grupo amino, el grupo carboxi o el grupo hidroxilo a protegerse. Para la retirada de los grupos protectores, se pueden seleccionar los reactivos y condiciones dependiendo del grupo protector.
Al desproteger el grupo protector P11 para el N terminal del péptido (59) obtenido, se puede producir el péptido (60). Se pueden seleccionar los reactivos y condiciones dependiendo del grupo protector.
El compuesto (57) puede producirse derivatizando el derivado de ácido carboxílico (11) en un éster activo, mezclado con anhídrido de ácido, haluro de ácido o similar y haciéndolo reaccionar en presencia de una base con el péptido (60) obtenido. Las condiciones de reacción, reactivos, base, y el disolvente usado para formar un enlace amida entre el derivado de ácido carboxílico (11) y el péptido (60) puede seleccionarse adecuadamente de los descritos para la síntesis del compuesto (6).
Se puede producir también el compuesto (42) mediante el siguiente procedimiento, por ejemplo.
Al desproteger el grupo protector P14 para el C terminal del péptido (59) anterior, se puede producir el péptido (61). Se pueden seleccionar los reactivos y condiciones dependiendo del grupo protector.
El compuesto (42) puede producirse derivatizando el péptido (61) obtenido en un éster activo, anhídrido de ácido mixto, haluro de ácido o similares y haciéndolo reaccionar con el compuesto (7) anterior en presencia de una base. Las condiciones de reacción, reactivos, base, y el disolvente usado para formar un enlace amida entre el péptido (61) y el compuesto (7) puede seleccionarse adecuadamente de los descritos para la síntesis del compuesto (6).
11. Procedimiento de producción 11
El intermedio de producción representado por la fórmula (2) en la que el enlazador tiene una estructura representada por -L1-L2-LP-, y LP es un residuo peptídico que tiene un aminoácido hidrófilo N terminal que es un aminoácido hidrófilo distinto de la glicina también puede producirse por el siguiente procedimiento.
En la fórmula, L1' corresponde a L1 que tiene una estructura en la que el terminal se convierte a un grupo maleimidilo o un grupo haloacetilo, LP representa una estructura que consiste en Lp1-Lp2- y P10, P11, P12 y P14 cada uno representa un grupo protector.
Como LP se forma conectando Lp1 y Lp2, el aminoácido hidrófilo N terminal de LP se obtiene a partir de Lp1. Por lo tanto, se puede adoptar Lp1 que tiene un aminoácido hidrófilo N terminal. Puede ser una pluralidad de aminoácidos hidrofílicos. Adoptando Lp2 que tiene un aminoácido hidrófilo, LP que incluye una pluralidad de aminoácidos hidrófilos en el N terminal de LP o en el N terminal y otras posiciones, pueden producirse de acuerdo con la posición de los mismos.
El compuesto (62) puede producirse derivatizando el péptido o aminoácido (38) que tiene el N terminal protegido con P10 descrito en el procedimiento de producción 10 en un éster activo, anhídrido de ácido mixto o similar y haciéndolo reaccionar con el compuesto (4) o una sal del mismo. Las condiciones de reacción, reactivos, base, y el disolvente usado para formar un enlace peptídico entre el péptido o el aminoácido (38) y el compuesto (4) se puede seleccionar adecuadamente de los descritos para la síntesis del compuesto (6) a menos que se inhiba la reacción. El grupo protector P10 puede seleccionarse adecuadamente de los descritos para el grupo protector del compuesto (6), y la selección puede hacerse basándose, por ejemplo, en las propiedades del compuesto que tiene el grupo amino a proteger. Como se usa generalmente para la síntesis peptídica, repitiendo secuencialmente la reacción y la desprotección del aminoácido o péptido que constituye el aminoácido (38) para el alargamiento, se puede producir también el compuesto (62).
Desprotegiendo el grupo protector P10 para el grupo amino del compuesto (62) obtenido, se puede producir el compuesto (63). Se pueden seleccionar los reactivos y condiciones dependiendo del grupo protector.
El compuesto (64) se puede producir derivatizando el aminoácido o péptido (41) que tiene el N terminal protegido con P11 y el grupo carboxi de cadena lateral, grupo hidroxilo o grupo amino protegido con P12 descrito en el procedimiento de producción 10 en un éster activo, anhídrido de ácido mixto o similar y haciéndolo reaccionar con el compuesto (63) obtenido. Las condiciones de reacción, reactivos, base, y el disolvente usado para formar un enlace peptídico entre el aminoácido o péptido (41) y el compuesto (63) puede seleccionarse adecuadamente de los descritos para la síntesis del compuesto (6). Los grupos protectores P11 y P12 son como se describen en el procedimiento de producción 10. Como se usa generalmente para la síntesis peptídica, repitiendo secuencialmente la reacción y la desprotección del aminoácido o péptido que constituye el compuesto (64) para el alargamiento, se puede producir también el compuesto (64).
Desprotegiendo el grupo protector P11 para el grupo amino del compuesto (64) obtenido, se puede producir el compuesto (65). Se pueden seleccionar los reactivos y condiciones dependiendo del grupo protector.
El compuesto (66) puede producirse derivatizando el derivado de ácido carboxílico (11) en un éster activo, mezclado con anhídrido de ácido, haluro de ácido, o similares y haciendo reaccionar este con el compuesto (65) obtenido. Las condiciones de reacción, reactivos, base, y el disolvente usado para formar un enlace peptídico entre el derivado de ácido carboxílico (11) y el compuesto (65) puede seleccionarse adecuadamente de los descritos para la síntesis del compuesto (6).
Al desproteger el grupo protector P12 para el grupo carboxi, el grupo hidroxilo o el grupo amino del compuesto (66) obtenido, se puede producir el compuesto (2). Se pueden seleccionar los reactivos y condiciones dependiendo del grupo protector.
Se puede producir también el compuesto (64) mediante el siguiente procedimiento, por ejemplo.
El compuesto (64) puede producirse derivatizando el péptido (61) descrito en el procedimiento de producción 10 en un éster activo, anhídrido de ácido mixto, haluro de ácido o similares y haciéndolo reaccionar con el compuesto (4) o una sal del mismo. Las condiciones de reacción, reactivos, base, y el disolvente usado para formar un enlace peptídico entre el péptido (61) y el compuesto (4) puede seleccionarse adecuadamente de los descritos para la síntesis del compuesto (6).
Se puede producir también el compuesto (66) mediante el siguiente procedimiento, por ejemplo.
El compuesto (66) puede producirse derivatizando el compuesto (58) descrito en el procedimiento de producción 10 en un éster activo, anhídrido de ácido mixto o similar y haciéndolo reaccionar con el compuesto (4) en presencia de una base, o mediante la derivatización del aminoácido o péptido (55) descrito en el procedimiento de producción 10 en un éster activo, anhídrido de ácido mixto o similar y haciéndolo reaccionar con el compuesto (63) anterior en presencia de una base. Las condiciones de reacción, reactivos, base y disolvente usado para formar cada enlace peptídico se pueden seleccionar adecuadamente de los descritos para la síntesis del compuesto (6).
12. Procedimiento de producción 12
El intermedio de producción representado por la fórmula (2) en la que el enlazador tiene una estructura de -L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-Lb-Lc- o -L1-L2-LP-, y LP es un residuo de péptido que tiene un aminoácido hidrófilo N terminal que es un aminoácido hidrófilo distinto de glicina también puede producirse mediante el siguiente procedimiento, por ejemplo.
[Fórmula 47]
En la fórmula, L1' corresponde a L1 que tiene una estructura en la que el terminal se convierte a un grupo maleimidilo, un grupo haloacetilo o (Pirrolidin-2,5-diona-N-il)-O-C(=O)-(CH2)n4-C(=O)-, LP representa una estructura que consiste en Lp1-Lp2- y P11 y P15 cada uno representan un grupo protector.
El intermedio de producción representado por la fórmula (2) tiene dos formas, es decir, el enlazador tiene una estructura representada por -L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-Lb-Lc-y tiene una estructura representada por -L1-L2-LP-.
El compuesto (2) o (2b) en el que el enlazador tiene una estructura representada por -L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-Lb-Lcpuede producirse como sigue a continuación.
El compuesto (67) puede sintetizarse de la misma manera como en el compuesto (42) descrito en el procedimiento de producción 10. A diferencia del compuesto (42), para el compuesto (67), puede no ser necesario que el grupo protector P11 para un grupo amino y el grupo protector P15 para un grupo funcional de cadena lateral sean los grupos protectores que pueden retirarse mediante un procedimiento diferente o condiciones diferentes. El grupo funcional de la cadena lateral es un grupo carboxi o un grupo hidroxilo, y el grupo protector P11 para un grupo amino y el grupo protector P15 para un grupo carboxi de cadena lateral o un grupo hidroxilo pueden desprotegerse al mismo tiempo. Por ejemplo, un ejemplo representativo incluye una combinación en la que P11 es un grupo tere-butiloxicarbonilo y P15 es un grupo terebutilo o un grupo tritilo o P11 es un grupo benciloxicarbonilo y P15 es un grupo bencilo, etc. Los grupos protectores pueden seleccionarse adecuadamente de los descritos para el grupo protector del compuesto (6), dependiendo de, por ejemplo, las propiedades del compuesto que tiene el grupo amino, el grupo carboxi o el grupo hidroxilo a protegerse. Para la retirada de los grupos protectores, se pueden seleccionar los reactivos y condiciones dependiendo del grupo protector. El compuesto (67) se puede sintetizar de la misma manera que el procedimiento de producción 10 usando un aminoácido o péptido protegido que satisfaga las propiedades anteriores.
Al desproteger, secuencialmente o al mismo tiempo, los grupos protectores P11 y P15 para el compuesto (67), se puede producir el compuesto (68). Se pueden seleccionar los reactivos y condiciones dependiendo del grupo protector.
Aunque el grupo funcional de cadena lateral hidrofílica de LP no está protegido, el compuesto (2) o (2b) se puede producir haciendo reaccionar el compuesto (68) en presencia de una base con el compuesto (11) u (11b) derivatizado en un éster activo, anhídrido de ácido mixto o similar. Las condiciones de reacción, reactivos, base y disolvente usado para formar cada enlace peptídico se pueden seleccionar adecuadamente de los descritos para la síntesis del compuesto (6).
El compuesto (2) o (2b) en el que el enlazador tiene estructura representada por -L1-L2-LP- puede producirse como sigue a continuación.
El compuesto (69) también se puede sintetizar de la misma manera que en el compuesto (64) descrito en el procedimiento de producción 11. A diferencia del compuesto (64), para el compuesto (69), puede no ser necesario que el grupo protector P11 para un grupo amino y el grupo protector P15 para un grupo funcional de cadena lateral sean los grupos protectores que pueden retirarse mediante un procedimiento diferente o condiciones diferentes. El grupo funcional de la cadena lateral es un grupo carboxi o un grupo hidroxilo, y el grupo protector P11 para un grupo amino y el grupo protector P15 para un grupo carboxi de cadena lateral o un grupo hidroxilo pueden desprotegerse al mismo tiempo. Por ejemplo, un ejemplo representativo incluye una combinación en la que P11 es un grupo tere-butiloxicarbonilo y P15 es un grupo tere-butilo o un grupo tritilo o P11 es un grupo benciloxicarbonilo y P15 es un grupo
bencilo, etc. Los grupos protectores pueden seleccionarse adecuadamente de los descritos para el grupo protector del compuesto (6), dependiendo de, por ejemplo, las propiedades del compuesto que tiene el grupo amino, el grupo carboxi o el grupo hidroxilo a protegerse. Para la retirada de los grupos protectores, se pueden seleccionar los reactivos y condiciones dependiendo del grupo protector. El compuesto (69) se puede sintetizar de la misma manera que el procedimiento de producción 11 usando un aminoácido o péptido protegido que satisfaga las propiedades anteriores.
Al desproteger, secuencialmente o al mismo tiempo, los grupos protectores P11 y P15 para el compuesto (69), se puede producir el compuesto (70). Se pueden seleccionar los reactivos y condiciones dependiendo del grupo protector.
Aunque el grupo funcional de cadena lateral hidrofílica de LP no está protegido, el compuesto (2) o (2b) se puede producir haciendo reaccionar el compuesto (70) en presencia de una base con el compuesto (11) u (11b) derivatizado en un éster activo, anhídrido de ácido mixto o similar. Las condiciones de reacción, reactivos, base y disolvente usado para formar cada enlace peptídico se pueden seleccionar adecuadamente de los descritos para la síntesis del compuesto (6).
13. Procedimiento de producción 13
El compuesto (64) mostrado en el procedimiento de producción 11, en el que -LP- en el enlazador tiene una estructura que consiste en- LP1-Gly-Gly-Phe-Glycan también puede producirse mediante el siguiente procedimiento.
[Fórmula 48]
p 11_|_P1(P12)-Gly-Gly-Phe-Gly-(NH-DX)
72
En la fórmula, P11 y P12 cada uno representa un grupo protector.
El compuesto (72) puede producirse derivatizando el aminoácido o péptido (41) descrito en el procedimiento de producción 10 en un éster activo, mezclado con anhídrido de ácido, haluro de ácido o similar y haciendo reaccionar en presencia de una base con glicilglicil-L-fenilalanil-N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]glicinamida (forma libre de un compuesto farmacéutico descrito en la Publicación internacional n.° WO 97/46260) (71) o una sal del mismo. Las condiciones de reacción, reactivos, base, y el disolvente usado para formar un enlace peptídico entre el aminoácido o péptido (41) y el compuesto (71) puede seleccionarse adecuadamente de los descritos para la síntesis del compuesto (6). El grupo protector P11 para el N terminal y el grupo protector P12 para un grupo funcional de cadena lateral son como se describe anteriormente en el procedimiento de producción 10. El grupo protector P12 para un grupo funcional de cadena lateral puede estar ausente, y el compuesto (72) puede obtenerse usando el aminoácido o péptido (41) protegido solo en su N terminal en la reacción.
14. Procedimiento de producción 14
El compuesto representado por la fórmula (2) o (2b) en la que el enlazador tiene una estructura representada por -L1-L2-LP-, o una sal farmacológicamente aceptable del mismo puede producirse mediante el siguiente procedimiento, por ejemplo.
En la fórmula, L1' corresponde a L1 que tiene una estructura en la que el terminal se convierte a un grupo maleimidilo, un grupo haloacetilo terminal o (Pirrolidin-2,5-diona-N-il)-O-C(=O)-(CH2)n4-C(=O)-, LP representa una estructura que consiste en Lp1-Lp2- y P14 y P16 cada uno representan un grupo protector.
El péptido (73) se protege en su N terminal con P16 Como se usa generalmente para la síntesis peptídica, repitiendo secuencialmente la reacción de condensación y la desprotección del aminoácido o péptido que constituye el péptido (73), el péptido (73) puede sintetizarse.
El compuesto (74) puede producirse derivatizando el péptido (73) en un éster activo, anhídrido de ácido mixto o similar y haciéndolo reaccionar con el compuesto (4) o una sal del mismo. Las condiciones de reacción, reactivos, base, y el disolvente usado para formar un enlace peptídico entre el péptido (73) y el compuesto (4) puede seleccionarse adecuadamente de los descritos para la síntesis del compuesto (6). El grupo protector P16 puede seleccionarse adecuadamente de los descritos para la síntesis del compuesto (6).
El compuesto (74) también puede producirse derivatizando el aminoácido o péptido (75) que tiene el N terminal protegido con P16 en un éster activo, anhídrido de ácido mixto o similar y haciéndolo reaccionar con el compuesto (63) descrito en el procedimiento de producción 11. Las condiciones de reacción, reactivos, base, y el disolvente usado para formar un enlace peptídico entre el aminoácido o péptido (75) y el compuesto (63) puede seleccionarse adecuadamente de los descritos para la síntesis del compuesto (6). El grupo protector P16 puede seleccionarse adecuadamente de los descritos para la síntesis del compuesto (6).
Desprotegiendo el grupo protector P16 para el grupo amino del compuesto (74) obtenido, se puede producir el compuesto (76). Se pueden seleccionar los reactivos y condiciones dependiendo del grupo protector.
El compuesto (2) o (2b) puede producirse derivatizando el derivado de ácido carboxílico (11) u (11b) en un éster activo, mezclado con anhídrido de ácido, haluro de ácido, o similares y haciendo reaccionar este con el compuesto (76) obtenido. Las condiciones de reacción, reactivos, base, y el disolvente usado para formar un enlace amida entre el derivado de ácido carboxílico (11) u (11b) y el compuesto (76) se puede seleccionar adecuadamente de los descritos para la síntesis del compuesto (6).
Se puede producir también el compuesto (2) mediante el siguiente procedimiento.
El compuesto (77) puede sintetizarse de la misma manera como en el compuesto (55) descrito en el procedimiento de producción 10. El compuesto (78) puede producirse derivatizando el aminoácido o péptido (56) descrito en el procedimiento de producción 10 en un éster activo, mezclado con anhídrido de ácido, haluro de ácido o similar y haciendo reaccionar este con el compuesto (77). En el presente documento, el aminoácido o péptido (56) se protege en su C terminal con P14. Las condiciones de reacción, reactivos, base, y el disolvente usado para formar un enlace amida entre el aminoácido o péptido (56) y el compuesto (77) puede seleccionarse adecuadamente de los descritos para la síntesis del compuesto (6).
El compuesto (78) también puede producirse derivatizando el compuesto (11) en un éster activo, anhídrido de ácido mixto o similar y haciéndolo reaccionar con el péptido (79) que tiene el C terminal protegido con P14. Como se usa generalmente para la síntesis peptídica, repitiendo secuencialmente la reacción de condensación y la desprotección del aminoácido o péptido que constituye el péptido (79), el péptido (79) puede sintetizarse. Las condiciones de reacción, reactivos, base, y el disolvente usado para formar un enlace peptídico entre el péptido (79) y el compuesto
(11) puede seleccionarse adecuadamente de los descritos para la síntesis del compuesto (6). El grupo protector P14 es preferentemente un grupo protector que puede desprotegerse en condiciones ácidas, pero no está limitado al mismo, y puede seleccionarse adecuadamente de los descritos para la síntesis del compuesto (6).
Desprotegiendo el grupo protector P14 para el grupo carboxi del compuesto (78) obtenido, se puede producir el compuesto (80). Se pueden seleccionar los reactivos y condiciones dependiendo del grupo protector.
El compuesto (2) puede producirse derivatizando el compuesto (80) en un éster activo, anhídrido de ácido mixto o similar y haciéndolo reaccionar con el compuesto (4) o una sal del mismo. Las condiciones de reacción, reactivos, base y el disolvente usado para formar un enlace peptídico entre el compuesto (80) y el compuesto (4) puede seleccionarse adecuadamente de los descritos para la síntesis del compuesto (6).
Además, se puede producir también el compuesto (2) mediante el siguiente procedimiento.
El compuesto (2) puede producirse derivatizando el compuesto (63) descrito en el procedimiento de producción 11 en un éster activo, anhídrido de ácido mixto o similar y haciéndolo reaccionar con el compuesto (77) en presencia de una base. Las condiciones de reacción, reactivos, base y el disolvente usado para formar un enlace peptídico entre el compuesto (77) y el compuesto (63) puede seleccionarse adecuadamente de los descritos para la síntesis del compuesto (6).
15. Procedimiento de producción 15
El intermedio de producción representado por la fórmula (2a) descrita en el procedimiento de producción 2, en el que L2' corresponde a L2 que tiene una estructura en la que el terminal se convierte en un grupo mercaptoalcanoilo se puede producir mediante el siguiente procedimiento.
En la fórmula, LP representa una estructura que consiste en Lp1-Lp2, y P3, P12, P14 y P17 cada uno representa un grupo protector.
El intermedio de producción representado por la fórmula (2a) tiene dos formas, es decir, el enlazador tiene una estructura representada por -L1-L2-LP-NH-(CH2) n1-La-Lb-Lc-y tiene una estructura representada por -L1-L2-LP-.
El compuesto (2a) en el que el enlazador tiene una estructura representada por -L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-Lb-Lc- puede producirse como sigue a continuación.
El compuesto (82) puede producirse derivatizando el compuesto de ácido carboxílico (81) que tiene el grupo mercapto terminal protegido con P17 en un éster activo, anhídrido de ácido mixto o similar y haciéndolo reaccionar con el compuesto (43) descrito en el procedimiento de producción 10. Para la reacción, se pueden usar también reactivos y condiciones de reacción que se usan generalmente para la síntesis de péptidos, y se pueden seleccionar adecuadamente las condiciones de reacción, reactivos, bases y disolventes usados para la reacción a partir de aquellos descritos para la síntesis del compuesto (6). En cuanto al grupo protector P17 para un grupo mercapto, se puede usar un grupo protector comúnmente usado como grupo protector para un grupo mercapto en química orgánica sintética. De manera específica, pueden seleccionarse adecuadamente entre, por ejemplo, grupos sulfuro, tales como grupo sulfuro de S-metilo, un grupo sulfuro de S-etilo y un grupo sulfuro de S-2-piridilo, grupos éster, tales como un grupo acetilo, grupos aril metil éter, tales como un grupo bencilo, un grupo 9-fluorenilmetilo y un grupo tritilo, grupos éter etílico, tal como un grupo S-2-cianoetilo. En este caso, el grupo protector P12 para el grupo amino de cadena lateral, el grupo carboxi o el grupo hidroxilo de Lp1 es preferentemente un grupo protector que puede desprotegerse en condiciones ácidas, pero no está limitado a los mismos, y el grupo protector se puede seleccionar entre los mencionados anteriormente dependiendo, por ejemplo, de las propiedades del compuesto que tiene el grupo amino, el grupo carboxi o el grupo hidroxilo a proteger. Sin embargo, es necesario que el grupo protector P17 para un grupo mercapto y el grupo protector P12 para el grupo carboxi de cadena lateral, el grupo hidroxilo o el grupo amino de Lp1 sean los grupos protectores que pueden retirarse mediante un procedimiento diferente o condiciones diferentes. Por ejemplo, en el caso de un grupo carboxi, un ejemplo representativo incluye una combinación en la que el grupo protector P12 es un grupo ferc-butilo y el grupo protector P17 es un grupo sulfuro de S-metilo. El grupo protector P17 puede no estar presente, y en este caso, el grupo mercapto del compuesto (82) está presente en un estado desprotegido.
Al desproteger el grupo protector P12 para el grupo carboxi de cadena lateral, el grupo hidroxilo o el grupo amino de Lp1 del compuesto (82) obtenido, se puede producir el compuesto (83). Se pueden seleccionar los reactivos y condiciones dependiendo del grupo protector.
Al desproteger el grupo protector P17 para el grupo mercapto del compuesto (83) obtenido, se puede producir el compuesto (2a). Se pueden seleccionar los reactivos y condiciones dependiendo del grupo protector.
Se puede producir también el compuesto (82) mediante el siguiente procedimiento.
El compuesto (84) puede producirse derivatizando el compuesto de ácido carboxílico (81) anterior que tiene el grupo mercapto protegido con P14 en un éster activo, anhídrido de ácido mixto, haluro de ácido o similares y haciéndolo reaccionar con el compuesto (50) descrito en el procedimiento de producción 10. Para la reacción, se pueden usar también reactivos y condiciones de reacción que se usan generalmente para la síntesis de péptidos, y se pueden seleccionar adecuadamente las condiciones de reacción, reactivos, bases y disolventes usados para la reacción a partir de aquellos descritos para la síntesis del compuesto (6). Los grupos protectores P12 y P17 son como se han descrito anteriormente. El grupo protector P3 para un grupo carboxi puede seleccionarse adecuadamente de los descritos para el grupo protector del compuesto (6). Sin embargo, es necesario que el grupo protector P17 para un grupo mercapto y el grupo protector P12 para un grupo funcional de cadena lateral sean los grupos protectores que pueden eliminarse mediante un procedimiento diferente o condiciones diferentes de las del grupo protector P3 para un grupo carboxi. Por ejemplo, un ejemplo representativo incluye una combinación en la que P12 es un grupo ferc-butilo como el grupo protector para un grupo carboxi, P17 es un grupo sulfuro de S-metilo y P3 es un grupo alilo. P17 puede no estar presente, y en este caso, el grupo mercapto del compuesto (84) está presente en un estado desprotegido.
Desprotegiendo el grupo protector P3 para el grupo carboxi del compuesto (84) obtenido, se puede producir el compuesto (85). Se pueden seleccionar los reactivos y condiciones dependiendo del grupo protector.
El compuesto (82) puede producirse derivatizando el compuesto (85) en un éster activo, mezclado con anhídrido de ácido, haluro de ácido, o similares y haciendo reaccionar este con el compuesto (4) en presencia de una base. Para la reacción, se pueden usar también reactivos y condiciones de reacción que se usan generalmente para la síntesis de péptidos, y se pueden seleccionar adecuadamente las condiciones de reacción, reactivos, bases y disolventes usados para la reacción a partir de aquellos descritos para la síntesis del compuesto (6).
El compuesto (2a) en el que el enlazador tiene una estructura representada por -L1-L2-LP-, y LP es un residuo peptídico que tiene un aminoácido hidrófilo N terminal que es un aminoácido hidrófilo distinto de la glicina se puede producir como sigue a continuación.
El compuesto (86) puede producirse derivatizando el compuesto de ácido carboxílico (81) anterior que tiene el grupo mercapto protegido con P17 en un éster activo, anhídrido de ácido mixto, haluro de ácido o similares y haciéndolo reaccionar con el compuesto (65) descrito en el procedimiento de producción 11. Para la reacción, se pueden usar también reactivos y condiciones de reacción que se usan generalmente para la síntesis de péptidos, y se pueden
seleccionar adecuadamente las condiciones de reacción, reactivos, bases y disolventes usados para la reacción a partir de aquellos descritos para la síntesis del compuesto (6). Los grupos protectores P12 y P17 son como se han descrito anteriormente.
Se puede producir también el compuesto (86) mediante el siguiente procedimiento, por ejemplo.
El compuesto (87) puede producirse derivatizando el compuesto de ácido carboxílico (81) que tiene el grupo mercapto protegido con P17 en un éster activo, anhídrido de ácido mixto o similar y haciéndolo reaccionar con el péptido (60) descrito en el procedimiento de producción 10. Para la reacción, se pueden usar también reactivos y condiciones de reacción que se usan generalmente para la síntesis de péptidos, y se pueden seleccionar adecuadamente las condiciones de reacción, reactivos, bases y disolventes usados para la reacción a partir de aquellos descritos para la síntesis del compuesto (6). Los grupos protectores P12, P14 y P17 son como se han descrito anteriormente, y pueden seleccionarse adecuadamente a partir de los descritos para el grupo protector del compuesto (6). Sin embargo, es necesario que el grupo protector P17 para un grupo mercapto y el grupo protector P12 para un grupo funcional de cadena lateral sean los grupos protectores que pueden eliminarse mediante un procedimiento diferente o condiciones diferentes de las del grupo protector P14 para un grupo carboxi. Por ejemplo, un ejemplo representativo incluye una combinación en la que P12 es un grupo ferc-butilo como el grupo protector para un grupo carboxi, P17 es un grupo sulfuro de S-metilo y P3 es un grupo alilo. P17 puede no estar presente, y en este caso, el grupo mercapto del compuesto (87) está presente en un estado desprotegido.
Al desproteger el grupo protector P14 para el grupo péptido carboxi del compuesto (87) obtenido, se puede producir el compuesto (88). Se pueden seleccionar los reactivos y condiciones dependiendo del grupo protector.
El compuesto (86) puede producirse derivatizando el compuesto (88) obtenido en un éster activo, mezclado con anhídrido de ácido, haluro de ácido, o similares y haciendo reaccionar este con el compuesto (4) o una sal del mismo en presencia de una base. Para la reacción, se pueden usar también reactivos y condiciones de reacción que se usan generalmente para la síntesis de péptidos, y se pueden seleccionar adecuadamente las condiciones de reacción, reactivos, bases y disolventes usados para la reacción a partir de aquellos descritos para la síntesis del compuesto (6).
Al desproteger el grupo protector P4 para la cadena lateral de LP1 del compuesto (86) obtenido, se puede producir el compuesto (89). Se pueden seleccionar los reactivos y condiciones dependiendo del grupo protector.
Al desproteger el grupo protector P17 para el grupo mercapto del compuesto (89) obtenido, se puede producir el compuesto (2a). Se pueden seleccionar los reactivos y condiciones dependiendo del grupo protector.
El compuesto (2a) en el que el enlazador tiene una estructura representada por -L1-L2-LP-, y LP es un residuo peptídico que tiene un oligopéptido que consiste en 2 o 3 o más residuos de glicina en el C terminal que está conectado al fármaco, y tiene un aminoácido hidrofílico no distinto de la glicina en el N terminal, puede producirse como sigue a continuación.
El compuesto (2a) puede producirse derivatizando el compuesto de ácido carboxílico (81) en un éster activo, anhídrido de ácido mixto o similar y haciéndolo reaccionar con el compuesto (76) descrito en el procedimiento de producción 14. En este caso, el grupo mercapto puede no estar protegido con P17. Para la reacción, se pueden usar también reactivos y condiciones de reacción que se usan generalmente para la síntesis de péptidos, y se pueden seleccionar adecuadamente las condiciones de reacción, reactivos, bases y disolventes usados para la reacción a partir de aquellos descritos para la síntesis del compuesto (6).
16. Procedimiento de producción 16
El intermedio de producción representado por la fórmula (2) en la que L1' corresponde a L1 que tiene una estructura en la que el terminal se convierte en (maleimid-N-il)-CH[-(CH2)n3-COOH]-C(=O)- puede producirse mediante el siguiente procedimiento.
El intermedio de producción representado por la fórmula (2) tiene dos formas, es decir, el enlazador tiene una estructura representada por -L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-Lb-Lc-y tiene una estructura representada por -L1-L2-LP-.
El compuesto (2) en el que el enlazador tiene una estructura representada por -L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-Lb-Lc- puede producirse como sigue a continuación.
El compuesto (92) que tiene el resto (maleimid-N-il)- puede producirse haciendo reaccionar el aminoácido (90) que tiene el grupo carboxi de cadena lateral protegido con P18 con N-metoxicarbonilmaleimida (91) de -40 °C a 100 °C en presencia de una base, tal como bicarbonato sódico agua. El compuesto maleimidilo puede sintetizarse a partir de un compuesto que tiene un grupo amino mediante un procedimiento conocido en la técnica (por ejemplo, Keller, O.; Rudinger, J. Helv. Chem. Acta 1975, 58 (2), 531-541.) o un procedimiento equivalente al mismo usando N-metoxicarbonilmaleimida. Como para el grupo protector P18 para un grupo carboxi, se puede usar un grupo protector comúnmente usado como un grupo protector para un grupo carboxi en química orgánica sintética, y es preferentemente un grupo protector que se puede desproteger en condiciones ácidas, pero no se limita a los mismos.
El compuesto (94) puede producirse derivatizando el compuesto (93) que tiene el grupo amino terminal protegido con P19 en un éster activo, anhídrido de ácido mixto o similar y haciéndolo reaccionar en presencia de una base con el compuesto (68) descrito en el procedimiento de producción 12. Las condiciones de reacción, reactivos, base y el disolvente usado para formar un enlace amida entre el compuesto (93) y el compuesto (68) puede seleccionarse adecuadamente de los descritos para la síntesis del compuesto (6). El grupo protector P19 para el grupo amino del compuesto (93) puede seleccionarse adecuadamente de los descritos para el grupo protector del compuesto (6).
Desprotegiendo el grupo protector P19 para el grupo amino del compuesto (94) obtenido, se puede producir el compuesto (95). Se pueden seleccionar los reactivos y condiciones dependiendo del grupo protector.
El compuesto (96) puede producirse derivatizando el compuesto anterior (92) en un éster activo, anhídrido de ácido mixto o similar y haciéndolo reaccionar en presencia de una base con el compuesto (95) obtenido. Las condiciones de reacción, reactivos, base y el disolvente usado para formar un enlace amida entre el compuesto (92) y el compuesto (95) puede seleccionarse adecuadamente de los descritos para la síntesis del compuesto (6).
Desprotegiendo el grupo protector P18 para el grupo carboxi del compuesto (96) obtenido, se puede producir el compuesto (2). Se pueden seleccionar los reactivos y condiciones dependiendo del grupo protector.
El compuesto (2) en el que el enlazador tiene estructura representada por -L1-L2-LP- puede producirse como sigue a continuación.
De manera similar, el compuesto (97) puede producirse derivatizando el compuesto (93) que tiene el grupo amino terminal protegido con P19 en un éster activo, anhídrido de ácido mixto o similar y haciéndolo reaccionar en presencia de una base con el compuesto (70) descrito en el procedimiento de producción 12. Las condiciones de reacción, reactivos, base y el disolvente usado para formar un enlace amida entre el compuesto (93) y el compuesto (70) puede seleccionarse adecuadamente de los descritos para la síntesis del compuesto (6). El grupo protector P19 es como se ha descrito anteriormente.
Desprotegiendo el grupo protector P19 para el grupo amino del compuesto (97) obtenido, se puede producir el compuesto (98). Se pueden seleccionar los reactivos y condiciones dependiendo del grupo protector.
El compuesto (99) puede producirse derivatizando el compuesto anterior (92) en un éster activo, anhídrido de ácido mixto o similar y haciéndolo reaccionar en presencia de una base con el compuesto (98) obtenido. Las condiciones de reacción, reactivos, base y el disolvente usado para formar un enlace amida entre el compuesto (92) y el compuesto (98) puede seleccionarse adecuadamente de los descritos para la síntesis del compuesto (6).
Desprotegiendo el grupo protector P18 para el grupo carboxi del compuesto (99) obtenido, se puede producir el compuesto (2). Se pueden seleccionar los reactivos y condiciones dependiendo del grupo protector.
17. Procedimiento de producción 17
El intermedio de producción representado por la fórmula (2) en la que L1' corresponde a L1 que tiene una estructura en la que el terminal se convierte a un grupo a maleimidilo o un grupo haloacetilo, y L2 es -N[-(CH2CH2-O)n7-CH2CH2-OH]-CH2-C(=O)- puede producirse siguiendo el siguiente procedimiento.
[Fórmula 52]
NH-rC H2-COOP2D
too
E1 -(C H2CH2-0)n7~CH2C H2-OH
*
101
r
N H [-{C H, C H2-0)n 7-C H2C Hr OH]-C H2-C 00 P23
102
Lr -GH
103
L ■ - N [-(C H2 C Hj-o; n7-C H 2C Hj-OH]-C H2-C OOP20
104
En la fórmula, P20 representa un grupo protector y E1 representa un grupo saliente.
El intermedio de producción representado por la fórmula (2) tiene dos formas, es decir, el enlazador tiene una estructura representada por -L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-Lb-Lc-y tiene una estructura representada por -L1-L2-LP-.
El compuesto (2) en el que el enlazador tiene una estructura representada por -L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-Lb-Lc- puede producirse como sigue a continuación.
El compuesto (102) puede producirse haciendo reaccionar el derivado de glicina (100) que tiene el C terminal protegido con P20 con el compuesto (101) en presencia de una base. El grupo protector P20 para un grupo carboxi es
preferentemente un grupo protector que puede desprotegerse en condiciones ácidas, pero no se limita a los mismos. Ejemplos del grupo saliente E1 del compuesto (101) pueden incluir ésteres del ácido sulfónico, tales como ptoluenosulfonato, metilsulfonato y trifluorometilsulfonato así como haluros, tales como yoduro, bromuro y cloruro. Para la reacción, las condiciones de reacción que generalmente se usan para la N-alquilación también se pueden usar, y la base y el disolvente usados para la reacción se pueden seleccionar de los descritos para la síntesis del compuesto (6).
El compuesto (104) puede producirse derivatizando el derivado de ácido carboxílico (103) en un éster activo, mezclado con anhídrido de ácido, haluro de ácido, o similares y haciendo reaccionar este con el compuesto (102) obtenido. Las condiciones de reacción, reactivos, base, y el disolvente usado para formar un enlace peptídico entre el derivado de ácido carboxílico (103) y el compuesto (102) puede seleccionarse adecuadamente de los descritos para la síntesis del compuesto (6).
Desprotegiendo el grupo protector P13 para el grupo carboxi del compuesto (104) obtenido, se puede producir el compuesto (105). Se pueden seleccionar los reactivos y condiciones dependiendo del grupo protector.
El compuesto (2) puede producirse derivatizando el compuesto (105) obtenido en un éster activo, mezclado con anhídrido de ácido, haluro de ácido, o similar y haciéndolo reaccionar con el compuesto (68) descrito en el procedimiento de producción 12. Las condiciones de reacción, reactivos, base, y el disolvente usado para formar un enlace amida entre el derivado de ácido carboxílico (105) y el compuesto (68) se puede seleccionar adecuadamente de los descritos para la síntesis del compuesto (6).
El compuesto (2) en el que el enlazador tiene estructura representada por -L1-L2-LP- puede producirse como sigue a continuación.
De manera similar, el compuesto (2) puede producirse derivatizando el compuesto (105) en un éster activo, mezclado con anhídrido de ácido, haluro de ácido, o similar y haciéndolo reaccionar con el compuesto (70) descrito en el procedimiento de producción 12. Las condiciones de reacción, reactivos, base, y el disolvente usado para formar un enlace amida entre el derivado de ácido carboxílico (105) y el compuesto (70) se puede seleccionar adecuadamente de los descritos para la síntesis del compuesto (6).
18. Procedimiento de producción 18
El compuesto (10) mostrado en el procedimiento de producción 4, en el que -La-Lb-Lc-tiene una estructura que consiste en -N(-Q-H)-(CH2)n8-CO- también puede producirse siguiendo el siguiente procedimiento.
[Formula 53
En la fórmula, -Q- representa un enlace sencillo, -CH2-, -(CH2)-O- o -(CH2)-COO-, P2, P21, P22 y P23 cada uno representa un grupo protector, y E2 y E3 cada uno representa un grupo saliente.
El compuesto (108) puede producirse haciendo reaccionar la alquilendiamina (106) que tiene el grupo amino terminal en un lado protegido con P21 con el compuesto (107) en presencia de una base. El grupo protector P21 para un grupo amino es preferentemente un grupo protector que puede desprotegerse en condiciones ácidas, pero no se limita a los mismos. Como para el grupo protector P22 para un grupo carboxi, un ejemplo representativo incluye un grupo bencilo. Los grupos protectores se pueden seleccionar dependiendo de, por ejemplo, las propiedades de los compuestos a protegerse. Para la retirada de los grupos protectores, se pueden seleccionar los reactivos y condiciones dependiendo del grupo protector. Los ejemplos del grupo saliente E2 del compuesto (107) y el grupo saliente E3 del compuesto (109) o el compuesto (117) pueden incluir haluros, tales como yoduro, bromuro y cloruro, así como los ésteres de ácido sulfónico, tales como p-toluenosulfonato, metilsulfonato y trifluorometilsulfonato. Para la reacción, las condiciones de reacción que generalmente se usan para la N-alquilación también se pueden usar, y la base y el disolvente usados para la reacción se pueden seleccionar de los descritos para la síntesis del compuesto (6).
El compuesto (110) puede producirse haciendo reaccionar el compuesto (108) obtenido con el compuesto (109) en presencia de una base. Las condiciones de reacción, reactivos, base y el disolvente usado para formar un aminoalquilo entre el compuesto (108) y el compuesto (109) puede seleccionarse adecuadamente de los descritos para la síntesis del compuesto (108). Cuando el grupo protector P23 es un grupo protector para un grupo amino, es preferentemente un grupo protector que puede desprotegerse en condiciones básicas, y el grupo amino puede protegerse con un grupo protector que generalmente se usa para síntesis de compuestos orgánicos. De manera específica, puede seleccionarse entre las descritas para la síntesis del compuesto (6).
Desprotegiendo el grupo protector P22 para el grupo carboxi del compuesto (110) obtenido, se puede producir el compuesto (111). Se pueden seleccionar los reactivos y condiciones dependiendo del grupo protector.
El compuesto (112) puede producirse derivatizando el compuesto (111) obtenido en un éster activo, anhídrido de ácido mixto o similar y haciéndolo reaccionar con el compuesto (4) o una sal del mismo. Las condiciones de reacción, reactivos, base, y el disolvente usado para formar un enlace peptídico entre el ácido carboxílico (111) y el compuesto (4) puede seleccionarse adecuadamente de los descritos para la síntesis del compuesto (6) a menos que se inhiba la reacción.
Desprotegiendo el grupo protector P21 para el grupo amino del compuesto (112) obtenido, se puede producir el compuesto (113). Se pueden seleccionar los reactivos y condiciones dependiendo del grupo protector.
El compuesto (114) puede producirse derivatizando el compuesto (113) obtenido en un éster activo, anhídrido de ácido mixto o similar y haciéndolo reaccionar con el compuesto (8) descrito en el procedimiento de producción 4 o una sal del mismo. Las condiciones de reacción, reactivos, base, y el disolvente usado para formar un enlace peptídico entre el péptido o el aminoácido (8) y el compuesto (113) se puede seleccionar adecuadamente de los descritos para la síntesis del compuesto (6) a menos que se inhiba la reacción.
Al desproteger el grupo protector P23 para el compuesto (114) obtenido, se puede producir el compuesto (115). Se pueden seleccionar los reactivos y condiciones dependiendo del grupo protector.
Se puede producir también el compuesto (108) mediante el siguiente procedimiento.
El compuesto (108) puede producirse haciendo reaccionar la alquilendiamina (106) que tiene el grupo amino terminal en un lado protegido con P21 con el compuesto (116) en presencia de una base. El grupo protector P21 para un grupo amino es preferentemente un grupo protector que puede desprotegerse en condiciones ácidas, pero no se limita a los mismos. Como para el grupo protector P22 para un grupo carboxi, un ejemplo representativo incluye un grupo bencilo. Los grupos protectores se pueden seleccionar dependiendo de, por ejemplo, las propiedades de los compuestos a protegerse. Para la retirada de los grupos protectores, se pueden seleccionar los reactivos y condiciones dependiendo del grupo protector. Para la reacción, las condiciones de reacción que generalmente se usan para la síntesis orgánica también pueden usarse, y la base y el disolvente usados para la reacción se pueden seleccionar de los descritos para la síntesis del compuesto (6).
Se puede producir también el compuesto (115) mediante el siguiente procedimiento.
El compuesto (118) se puede producir haciendo reaccionar el compuesto (108) con el compuesto (117) en presencia de una base. Las condiciones de reacción, reactivos, base y el disolvente usado para formar un aminoalquilo entre el compuesto (108) y el compuesto (117) puede seleccionarse adecuadamente de los descritos para la síntesis del compuesto (108).
Desprotegiendo el grupo protector P22 para el grupo carboxi del compuesto (118) obtenido, se puede producir el compuesto (119). Se pueden seleccionar los reactivos y condiciones dependiendo del grupo protector.
El compuesto (120) puede producirse derivatizando el compuesto (119) obtenido en un éster activo, anhídrido de ácido mixto o similar y haciéndolo reaccionar con el compuesto (4) o una sal del mismo. Las condiciones de reacción, reactivos, base, y el disolvente usado para formar un enlace peptídico entre el ácido carboxílico (119) y el compuesto (4) puede seleccionarse adecuadamente de los descritos para la síntesis del compuesto (6) a menos que se inhiba la reacción.
Desprotegiendo el grupo protector P21 para el grupo amino del compuesto (120) obtenido, se puede producir el compuesto (121). Se pueden seleccionar los reactivos y condiciones dependiendo del grupo protector.
El compuesto (122) puede producirse derivatizando el compuesto (121) obtenido en un éster activo, anhídrido de ácido mixto o similar y haciéndolo reaccionar con el compuesto (8) descrito en el procedimiento de producción 4 o una sal del mismo. Las condiciones de reacción, reactivos, base, y el disolvente usado para formar un enlace peptídico entre el péptido o el aminoácido (8) y el compuesto (121) se puede seleccionar adecuadamente de los descritos para la síntesis del compuesto (6) a menos que se inhiba la reacción.
Al desproteger el grupo protector P2 para el compuesto (122) obtenido, se puede producir el compuesto (115). Se pueden seleccionar los reactivos y condiciones dependiendo del grupo protector.
Se puede producir también el compuesto (122) mediante el siguiente procedimiento.
Al desproteger los grupos protectores P21 y P23 para los grupos amino del compuesto (112), se puede producir el compuesto (123). Se pueden seleccionar los reactivos y condiciones dependiendo del grupo protector.
El compuesto (124) puede producirse derivatizando el compuesto (123) obtenido en un éster activo, anhídrido de ácido mixto o similar y haciéndolo reaccionar con el compuesto (8) descrito en el procedimiento de producción 4 o una sal del mismo. Las condiciones de reacción, reactivos, base, y el disolvente usado para formar un enlace peptídico entre el péptido o el aminoácido (8) y el compuesto (123) se puede seleccionar adecuadamente de los descritos para la síntesis del compuesto (6) a menos que se inhiba la reacción.
Al desproteger el grupo protector P2 para el compuesto (124) obtenido, se puede producir el compuesto (122). Se pueden seleccionar los reactivos y condiciones dependiendo del grupo protector.
Cualquiera de los compuestos intermedios del procedimiento de producción 1 al procedimiento de producción 18 puede estar en forma de una sal.
El conjugado anticuerpo-fármaco de la presente invención, cuando se deja en el aire o se recristaliza o purifica, puede absorber humedad o tener agua de adsorción o convertirse en un hidrato, y tales compuestos o sales que contienen agua también se incluyen en la presente invención.
Los compuestos marcados con diversos isótopos radiactivos o no radiactivos también se incluyen en la presente invención. Uno o más átomos que constituyen el conjugado de fármaco anticuerpo de la presente invención pueden contener un isótopo atómico en una relación no natural. Ejemplos de isótopos atómicos incluyen deuterio (2H), tritio (3H), yodo-125 (125I) y carbono-13 (13C). Además, el compuesto de la presente invención puede estar marcado radiactivamente con un isótopo radiactivo tal como tritio (3H), yodo-125 (125I) o carbono-14 (14C). El compuesto marcado con un isótopo radioactivo es útil como un agente terapéutico o profiláctico, un reactivo para la investigación tal como un reactivo de ensayo y un agente para el diagnóstico tal como un agente de diagnóstico por imágenes in vivo. Sin estar relacionado con la radioactividad, cualquier tipo variante de isótopo del conjugado de fármaco anticuerpo de la presente invención está comprendido en el ámbito de la presente invención.
[Fármacos]
El conjugado de anticuerpo anti-HER2-fármaco de la presente invención muestra actividad citotóxica contra células cancerosas y por tanto, puede usarse como fármaco, en particular, como agente terapéutico y/o agente profiláctico para el cáncer.
Es decir, el conjugado de anticuerpo anti-HER2-fármaco de la presente invención puede usarse de manera selectiva como fármaco para quimioterapia, que es un procedimiento principal para tratar el cáncer y como resultado, puede retrasar el desarrollo de las células cancerosas, inhibir el crecimiento de las mismas y además eliminar las células cancerosas. Esto puede permitir a los pacientes con cáncer estar libres de los síntomas producidos por el cáncer conseguir la mejora de la QOL de los pacientes con cáncer y logra un efecto terapéutico manteniendo la vida de los pacientes con cáncer. Incluso en caso de que el conjugado de anticuerpo anti-HER2-fármaco de la presente invención no logre eliminar a las células cancerosas, puede lograr una mayor QOL de los pacientes con cáncer, a la vez que logra supervivencia a largo plazo, inhibiendo o controlando el crecimiento de las células cancerosas.
En dicho tratamiento farmacológico, puede usarse como fármaco individual y además, puede usarse como fármaco en combinación con una terapia en la terapia adyuvante y puede combinarse con una intervención quirúrgica, radioterapia, tratamiento hormonal o similares. Además, también puede usarse como fármaco para terapia farmacológica en la terapia neoadyuvante.
Además del uso terapéutico como se ha descrito anteriormente, también puede esperarse el efecto de suprimir el crecimiento de células cancerosas metastásicas pequeñas y además, de eliminarlas. En particular, cuando se confirma la expresión de HER2 en las células de cáncer primarias, puede esperarse la inhibición de la metástasis del cáncer o un efecto profiláctico mediante la administración del conjugado de anticuerpo anti-HER2-fármaco de la presente invención. Por ejemplo, puede esperarse el efecto de inhibición y eliminación de las células cancerosas en un fluido
corporal durante el transcurso de la metástasis o el efecto de, por ejemplo, inhibir y eliminar células cancerosas pequeñas inmediatamente después de su implante en cualquier tejido. Por consiguiente, se puede esperar la inhibición de la metástasis del cáncer o un efecto profiláctico, particularmente, tras la eliminación quirúrgica del cáncer.
Puede esperarse que el conjugado de anticuerpo anti-HER2-fármaco de la presente invención ejerza el efecto terapéutico mediante su administración como terapia sistémica a pacientes y además, mediante la administración local a tejidos cancerosos.
Los ejemplos del tipo de cáncer al que se aplica el conjugado de anticuerpo anti-HER2-fármaco de la presente invención pueden incluir cáncer de pulmón, cáncer urotelial, cáncer colorrectal, cáncer de próstata, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, cáncer de mama, cáncer de vejiga, cáncer gástrico, tumor del estroma gastrointestinal, cáncer de cuello de útero, cáncer de esófago, carcinoma de células escamosas, cáncer peritoneal, cáncer de hígado, cáncer hepatocelular, cáncer de colon, cáncer rectal, cáncer colorrectal, cáncer de endometrio, cáncer de útero, cáncer de glándula salival, cáncer de riñón, cáncer vulvar, cáncer de tiroides o cáncer de pene. El sujeto de tratamiento del conjugado de anticuerpo anti-HER2-fármaco de la presente invención es una célula cancerosa, en una célula cancerosa como sujeto de tratamiento, que expresa proteína HER2 que puede ser reconocida por el anticuerpo en el conjugado de anticuerpo-fármaco. La expresión "cáncer que expresa proteína HER2", como se usa en la memoria descriptiva, es un cáncer que contiene células que tienen proteína HER2 en su superficie celular. La proteína HER2 se sobreexpresa en diversos tumores humanos y puede evaluarse usando un procedimiento llevado a cabo de manera general en la técnica, tal como un procedimiento de tinción inmunohistoquímica (IHC) para evaluar la sobreexpresión de la proteína HER2 o un procedimiento de hibridación de fluorescencia in situ (FISH) para evaluar la amplificación del gen de HER2.
Además, el conjugado de anticuerpo anti-HER2-fármaco de la presente invención muestra un efecto antitumoral reconociendo, a través de su anticuerpo anti-HER2, la proteína HER2 expresada en la superficie de las células cancerosas e internalizándose en las células cancerosas. Por lo tanto, el sujeto de tratamiento del conjugado de anticuerpo anti-HER2-fármaco de la presente invención no se limita al "cáncer que expresa proteína HER2" y también puede ser, por ejemplo, leucemia, linfoma maligno, plasmacitoma, mieloma o sarcoma.
El conjugado de anticuerpo anti-HER2-fármaco de la presente invención puede administrarse preferentemente a un mamífero, pero se administra más preferentemente a un ser humano.
Las sustancias usadas en una composición que contiene el conjugado de anticuerpo anti-HER2-fármaco de la presente invención pueden seleccionarse y aplicarse de manera adecuada entre aditivos de formulación y similares que se usan de manera general en la técnica, en vista de la dosis o la concentración de administración.
El conjugado de anticuerpo anti-HER2-fármaco de la presente invención puede administrarse en forma de una composición farmacéutica que contiene al menos un ingrediente farmacéuticamente adecuado. Por ejemplo, la composición farmacéutica anterior contiene normalmente al menos un transportador farmacéutico (por ejemplo, líquido esterilizado). En el presente documento, el líquido incluye, por ejemplo, agua y aceite (aceite de petróleo y aceite de origen animal, de origen vegetal o de origen sintético). El aceite puede ser, por ejemplo, aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral o aceite de sésamo. El agua es el transportador más típico cuando la composición farmacéutica anterior se administra por vía intravenosa. También puede usarse solución salina, una solución acuosa de dextrosa y una solución acuosa de glicerol como vehículo líquido, en particular, para una solución de inyección. Un vehículo farmacéutico adecuado puede seleccionarse entre los conocidos en la técnica. Si se desea, la composición anterior puede contener también una cantidad residual de un agente hidratante, un agente emulsionante o un agente tamponador del pH. Los ejemplos de transportadores farmacéuticos adecuados se desvelan en "Remington's Pharmaceutical Sciences" por E. W. Martin. Las formulaciones corresponden a un modo de administración.
Se conocen diversos sistemas de administración y se pueden usar para administrar el conjugado de anticuerpo anti-HER2-fármaco de la presente invención. Los ejemplos de vía de administración pueden incluir las vías intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa y subcutánea, pero sin limitarse a las mismas. La administración puede realizarse mediante inyección o inyección en bolo, por ejemplo. De acuerdo con una realización específica preferida, la administración del conjugado de anticuerpo-fármaco se lleva a cabo mediante inyección. La administración parenteral es una ruta de administración preferida.
De acuerdo con una realización representativa, la composición farmacéutica se prescribe como una composición farmacéutica adecuada para administración intravenosa a seres humanos, de acuerdo con los procedimientos convencionales. La composición para administración intravenosa es normalmente una solución en una solución acuosa tamponada estéril e isotónica. En caso necesario, el fármaco puede contener un agente solubilizante y anestésicos locales para aliviar el dolor en el sitio de inyección (por ejemplo, lignocaína). En general, el ingrediente anterior se proporciona individualmente como uno cualquiera de un polvo liofilizado o como un concentrado anhidro contenido en un recipiente que se obtiene precintando una ampolla o una bolsita que tiene una cantidad del principio activo o como una mezcla en una forma de dosificación unitaria. Cuando el fármaco se va a administrar mediante inyección, se puede administrar a partir de una botella de inyección que contiene agua o solución salina de calidad farmacéutica estéril. Cuando el fármaco se administra mediante inyección, se puede proporcionar una ampolla de agua estéril o solución salina para inyección de tal manera que los ingredientes anteriormente mencionados se
premezclan entre sí antes de la administración.
La composición farmacéutica de la presente invención puede ser una composición farmacéutica que contiene únicamente el conjugado de anticuerpo anti-HER2-fármaco de la presente invención o una composición farmacéutica que contiene el conjugado de anticuerpo anti-HER2-fármaco y al menos un agente para el tratamiento del cáncer distinto del conjugado. El conjugado de anticuerpo anti-HER2-fármaco de la presente invención puede administrarse con otros agentes para el tratamiento del cáncer. Consecuentemente, puede potenciarse el efecto anticanceroso. Pueden administrarse otros agentes anticancerosos para dicho fin a un individuo de manera simultánea con, por separado de o posteriormente al conjugado de anticuerpo-fármaco y puede administrarse a la vez que se varía el intervalo de administración para cada uno. Los ejemplos de agentes para tratar el cáncer incluyen 5-FU, pertuzumab, carboplatino, cisplatino, gemcitabina, capecitabina, irinotecan (CPT-11), paclitaxel, docetaxel, pemetrexed, sorafenib, vinblastina, vinorelbina, everolimus, tanespimicina, bevacizumab, oxaliplatino, lapatinib, ado-trastuzumab emtansina (T-DM1) o fármacos descritos en la Publicación Internacional n.° WO 2003/038043, análogos de LH-RH (leuprorelina, goserelina o similares), fosfato de estramustina, antagonistas del estrógeno (tamoxifeno, raloxifeno o similares) e inhibidores de aromatasa (anastrozol, letrozol, exemestano o similares), pero no están limitados, en tanto que sean fármacos que tengan actividad antitumoral.
La composición farmacéutica puede formularse en una formulación liofilizada o una formulación líquida como una formulación que tiene la composición deseada y la pureza necesaria. Cuando se formula como una formulación para liofilización, puede ser una formulación que contiene aditivos de formulación adecuados que se usan en la técnica. También para una formulación líquida, se puede formular como una formulación líquida que contiene diversos aditivos de formulación que se usan en la técnica.
La composición y concentración de la composición farmacéutica puede variar dependiendo del procedimiento de administración. Sin embargo, el conjugado de anticuerpo anti-HER2-fármaco contenido en la composición farmacéutica de la presente invención puede mostrar un efecto farmacéutico incluso a una pequeña dosis cuando el conjugado de anticuerpo-fármaco tiene una mayor afinidad por un antígeno, es decir, una mayor afinidad (= menor valor de Kd) en términos de la constante de disociación (es decir, el valor Kd) por el antígeno. Por lo tanto, para determinar la dosis del conjugado de anticuerpo-fármaco, la dosis puede determinarse en vista de la situación relativa a la afinidad entre el conjugado de anticuerpo-fármaco y el antígeno. Cuando el conjugado de anticuerpo-fármaco de la presente invención se administra a un ser humano, por ejemplo, pueden administrarse de aproximadamente 0,001 a 100 mg/kg una vez o administrarse varias veces con un intervalo de 1 a 180 días.
Ejemplos
La presente invención se describe específicamente en vista de los ejemplos mostrados a continuación. Sin embargo, la presente invención no se limita a estos. Además, no ha de interpretarse de modo alguno de una manera limitada. Además, a menos que se describa específicamente lo contrario, el reactivo, el disolvente y el material de partida descritos en la memoria descriptiva pueden obtenerse fácilmente de un proveedor comercial.
Ejemplo de referencia 1 - Preparación de trastuzumab
Se disolvieron catorce viales de 440 mg/vial de Herceptin (Genentech, Inc.) en 2 l de tampón A de cromatografía de intercambio catiónico (tampón citrato 25 mM, NaCl 30 mM, pH 5,0) y se filtró a través de un filtro de 0,2 pm (Millipore Corp.: Stericup de 0,22 pm, membrana de GVPVDF). Se aplicaron las muestras a una columna de cromatografía de intercambio catiónico (SP Sepharose HP, 240 ml, columna XK50), seguido de elución en un gradiente de concentración lineal de NaCl de 30 mM a 500 mM usando tampón B de cromatografía de intercambio catiónico (tampón citrato 25 mM, NaCl 500 mM, pH 5,0) para separar las fracciones de monómero de IgG. Se combinaron las muestras de monómero que tenían una pureza mayor del 98 % mediante análisis de cromatografía de exclusión por tamaños y se concentraron con UF30K (Millipore Corp.: filtro PELLICON XL, BIOMAX 30K, PXB030A50) y el tampón se reemplazó con tampón CBS (citrato 10 mM/NaCl 140 mM, pH 6,0). Las muestras en las que se ha reemplazado el tampón CBS se filtraron a través de un filtro de 0,2 pm (Sartorius AG: Minisart-Plus 0,2 pm, 17823K).
Ejemplo de referencia 2 - Producción de trastuzumab emtansina T-DM1
Derivatización del anticuerpo con SMCC: Usando el procedimiento común C-2 (se usó como solución de tampón PBS6.5/EDTA), el procedimiento común A y el procedimiento común B (se usó el coeficiente de absorción a 280 nm, 1,37 ml-mg'1 cm-1) descrito en el Procedimiento de producción 1, se llevó a cabo el reemplazo del tampón por PBS6.5/EDTA en el trastuzumab producido en el ejemplo de referencia 1 para preparar una solución que contenía trastuzumab (160,0 mg) disuelto en PBS6.5/EDTA (7,60 ml) en un tubo de polipropileno de 15 ml. Posteriormente, se añadió a temperatura ambiente la solución de SMCC (1,84 mg) en DMSo (0,40 ml; que corresponde a aproximadamente 5,1 equivalentes por molécula de anticuerpo). La mezcla de reacción se ajustó par atener una concentración de anticuerpo de 20 mg/ml y la reacción se llevó a cabo a temperatura ambiente usando un rotador de tubos (MTR-103, fabricado por AS ONE Corporation) durante 2 horas. Esta solución de reacción se sometió a purificación de acuerdo con el Procedimiento común D-2 (se usó como solución de tampón PBS6.5/EDTA) para dar 12 ml de una solución que contenía 154,9 mg del anticuerpo derivatizado con SMCC.
Conjugación entre el anticuerpo y enlazador de fármaco: Después de añadir PBS6.5/EDTA (2,56 ml) y N2-desacetilN2-(3-mercapto-1-oxopropil)-maitansina (4,67 mg; DM1, Journal of Medicinal Chemistry, 2006, Vol. 49, n.° 14, p. 4392) solución en DMA (dimetilacetamida) (0,93 ml; que corresponde a aproximadamente 5,8 equivalentes por molécula de anticuerpo derivatizado con SMCC) a la solución obtenida anteriormente en el tubo de polipropileno de 50 ml a temperatura ambiente, se ajustó la solución de reacción a una concentración de anticuerpo de 10 mg/ml y se llevó a cabo la reacción a temperatura ambiente usando un rotador de tubos durante 16,5 horas.
Procedimiento de purificación: La solución anterior se sometió a purificación usando el procedimiento común D-1 usando una solución de tampón de fosfato de sodio (10 mM, pH 6,5) que contenía cloruro de sodio (137 mM) para dar 35 ml de una solución que contiene el compuesto del ejemplo de referencia diana. Caracterización fisicoquímica: Mediante el uso del procedimiento común E usando la absorbancia UV a dos longitudes de onda, de 252 nm y 280 nm, se obtuvieron los siguientes valores característicos.
Concentración de anticuerpo: 4,14 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 144,9 mg (91 %) y número medio (n) de moléculas de fármaco conjugadas por molécula de anticuerpo: 3,0.
Ejemplo 1 Intermedio (1)
Procedimiento 1: (4-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-4-oxobutil)carbamato de ferc-butilo
Se disolvió ácido 4-(ferc-butoxicarbonilamino)butanoico (0,237 g, 1,13 mmol) en diclorometano (10 ml), se cargó con N-hidroxisuccinimida (0,130 g, 1,13 mmol) y clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (0,216 g, 1,13 mmol) y se agitó durante 1 hora. La solución de reacción se añadió gota a gota hasta una solución de N,N-dimetilformamida (10 ml) se cargó con la sal del ácido metanosulfónico de exatecán (0,500 g, 0,94 mmol) y trietilamina (0,157 ml, 1,13 mmol) y se agitó a temperatura ambiente durante 1 día. El disolvente se retiró a presión reducida y el residuo obtenido se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice [cloroformo - cloroformo : metanol = 8 : 2 (v/v)] para proporcionar el compuesto del título (0,595 g, cuantitativo).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 8: 0,87 (3H, t, J=7,2 Hz), 1,31 (9H, s), 1,58 (1H, t, J=7,2 Hz), 1,66 (2H, t, J=7,2 Hz), 1,82-1,89 (2H, m), 2,12-2,21 (3H, m), 2,39 (3H, s), 2,92 (2H, t, J=6,5 Hz), 3,17 (2H, s), 5,16 (1H, d, J=18,8 Hz), 5,24 (1H, d, J=18,8 Hz), 5,42 (2H, s), 5,59-5,55 (1H, m), 6,53 (1H, s), 6,78 (1H, t, J=6,3 Hz), 7,30 (1H, s), 7,79 (1H, d, J=11,0 Hz), 8,40 (1H, d, J=8,6 Hz).
EM (CLEM) m/z: 621 (M+H)+.
Procedimiento 2: 4-Amino-N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]butanamida
El compuesto (0,388 g, 0,61 mmol) obtenido en el Procedimiento 1 anterior se disolvió en diclorometano (9 ml). Después de añadir ácido trifluoroacético (9 ml), se agitó durante 4 horas. El disolvente se retiró a presión reducida y el residuo obtenido se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice [cloroformo - capa orgánica repartida de cloroformo : metanol: agua = 7 : 3 : 1 (v/v/v)] para producir sal del ácido trifluoroacético del compuesto del título (0,343 g, cuantitativo).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 8: 0,87 (3H, t, J=7,2 Hz), 1,79-1,92 (4H, m), 2,10-2,17 (2H, m), 2,27 (2H, t, J=7,0 Hz), 2,40 (3H, s), 2,80-2,86 (2H, m), 3,15-3,20 (2H, m), 5,15 (1H, d, J=18,8 Hz), 5,26 (1H, d, J=18,8 Hz), 5,42 (2H, s), 5,54 5,61 (1H, m), 6,55 (1H, s), 7,32 (1H, s), 7,72 (3H, s a), 7,82 (1H, d, J=11,0 Hz), 8,54 (1H, d, J=8,6 Hz).
EM (CLEM) m/z: 521 (M+H)+.
Ejemplo 2 Conjugado anticuerpo-fármaco (2)
N-(ferc-Butoxicarbonil)glicilglicil-L-fenilalanil-N-(4-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-4-oxobutil)glicinamida
Se disolvió N-(ferc-butoxicarbonil)glicilglicil-L-fenilalanilglicina (0,081 g, 0,19 mmol) en diclorometano (3 ml), se cargó con N-hidroxisuccinimida (0,021 g, 0,19 mmol) y clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (0,036 g, 0,19 mmol) y se agitó durante 3,5 horas. La solución de reacción se añadió gota a gota hasta una solución de N,N-dimetilformamida (1,5 ml) se cargó con el compuesto (0,080 g, 0,15 mmol) obtenido en el Procedimiento 2 del Ejemplo 1 y se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas. El disolvente se retiró a presión reducida y el residuo obtenido se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice [cloroformo - cloroformo : metanol = 8 : 2 (v/v)] para proporcionar el compuesto del título (0,106 g, 73 %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-da) 8: 0,87 (3H, t, J=7,4 Hz), 1,36 (9H, s), 1,71 (2H, m), 1,86 (2H, t, J=7,8 Hz), 2,15-2,19 (4H, m), 2,40 (3H, s), 2,77 (1H, dd, J=12,7, 8,8 Hz), 3,02 (1H, dd, J=14,1,4,7 Hz), 3,08-3,11 (2H, m), 3,16-3,19 (2H, m), 3,54 (2H, d, J=5,9 Hz), 3,57-3,77 (4H, m), 4,46-4,48 (1H, m), 5,16 (1H, d, J=19,2 Hz), 5,25 (1H, d, J=18,8 Hz), 5,42 (2H, s), 5,55-5,60 (1H, m), 6,53 (1H, s), 7,00 (1H, t, J=6,3 Hz), 7,17-7,26 (5H, m), 7,31 (1H, s), 7,71 (1H, t, J=5,7 Hz), 7,80 (1H, d, J=11,0 Hz), 7,92 (1H, t, J=5,7 Hz), 8,15 (1H, d, J=8,2 Hz), 8,27 (1H, t, J=5,5 Hz), 8,46 (1H, d, J=8,2 Hz). EM (CLEM) m/z: 939 (M+H)+.
Procedimiento 2: Glicilglicil-L-fenilalanil-N-(4-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-4-oxobutil)glicinamida
El compuesto (1,97 g, 2,10 mmol) obtenido en el Procedimiento 1 anterior se disolvió en diclorometano (7 ml). Después de añadir ácido trifluoroacético (7 ml), se agitó durante 1 hora. El disolvente se retiró a presión reducida y los residuos se cargaron con tolueno para destilación azeotrópica. Los residuos obtenidos se purificaron mediante cromatografía en columna de gel de sílice [cloroformo - capa orgánica repartida de cloroformo : metanol : agua = 7 : 3 : 1 (v/v/v)] para producir sal del ácido trifluoroacético del compuesto del título (1,97 g, 99 %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-da) 8: 0,87 (3H, t, J=7,4 Hz), 1,71-1,73 (2H, m), 1,82-1,90 (2H, m), 2,12-2,20 (4H, m), 2,40 (3H, s), 2,75 (1H, dd, J=13,7, 9,4 Hz), 3,03-3,09 (3H, m), 3,18-3,19 (2H, m), 3,58-3,60 (2H, m), 3,64 (1H, d, J=5,9 Hz), 3,69 (1H, d, J=5,9 Hz), 3,72 (1H, d, J=5,5 Hz), 3,87 (1H, dd, J=16,8, 5,9 Hz), 4,50-4,56 (1H, m), 5,16 (1H, d, J=19,2 Hz), 5,25 (1H, d, J=18,8 Hz), 5,42 (2H, s), 5,55-5,60 (1H, m), 7,17-7,27 (5H, m), 7,32 (1H, s), 7,78-7,81 (2H, m), 7,95-7,97 (3H, m), 8,33-8,35 (2H, m), 8,48-8,51 (2H, m).
EM (CLEM) m/z: 839 (M+H)+.
Procedimiento 3: N-(terc-Butoxicarbonil)-p-alanilglicilglicil-L-fenilalanil-N-(4-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-4-oxobutil)glicinamida
El compuesto (0,839 g, 1,00 mmol) obtenido en el Procedimiento 2 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 1 del Ejemplo 1 usando N-(terc-butoxicarbonil)-p-alanina en lugar de ácido 4-(tercbutoxicarbonilamino)butanoico y el producto en bruto obtenido se usó durante el siguiente procedimiento sin purificación.
Procedimiento 4: p-Alanilglicilglicil-L-fenilalanil-N-(4-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-4-oxobutil)glicinamida
El producto en bruto obtenido en el Procedimiento 3 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 3 anterior para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (0,610 g, 67 %). RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 8: 0,87 (3H, t, J=7,4 Hz), 1,67-1,77 (2H, m), 1,79-1,92 (2H, m), 2,09-2,22 (4H, m), 2,40 (3H, s), 2,46-2,55 (2H, m), 2,82-2,73 (1H, m), 2,95-3,13 (5H, m), 3,14-3,21 (2H, m), 3,55-3,80 (6H, m), 4,44 4,52 (1H, m), 5,20 (2H, dd, J=35,0, 19,0 Hz), 5,42 (2H, s), 5,53-5,60 (1H, m), 6,54 (1H, s), 7,14-7,28 (5H, m), 7,31 (1H, s), 7,67 (2H, s a), 7,72-7,78 (1H, m), 7,80 (1H, d, J=11,0 Hz), 8,10-8,17 (2H, m), 8,29 (1H, t, J=5,9 Hz), 8,42 (1H, t, J=5,7 Hz), 8,47 (1H, d, J=8,6 Hz).
Procedimiento 5: N-(Bromoacetil)-p-alanilglicilglicil-L-fenilalanil-N-(4-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-4-oxobutil)glicinamida
A una solución de diclorometano (4,5 ml) del ácido 2-bromoacético (96,3 mg, 0,693 mmol), se le añadieron N-hidroxisuccinimida (79,7 mg, 0,693 mmol) y 1,3-diisopropilcarbodiimida (0,107 ml, 0,693 mmol) y se agitaron a temperatura ambiente. La solución de reacción se añadió a una solución de N,N-dimetilformamida (4,5 ml) del compuesto (473 mg, 0,462 mmol) obtenido en el Procedimiento 4 anterior y trietilamina (0,154 ml, 1,11 mmol) a 0 °C y se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. La solución de reacción se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice [disolvente de elución: cloroformo - cloroformo : metanol = 85 : 15 (v/v)], y el sólido obtenido se lavó con un disolvente mezcla de cloroformo : metanol : éter dietílico para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (191 mg, 40 %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 8: 0,87 (3H, t, J=7,4 Hz), 1,67-1,77 (2H, m), 1,79-1,92 (2H, m), 2,08-2,22 (4H, m), 2,33 (2H, t, J=7,0 Hz), 2,40 (3H, s), 2,74-2,83 (1H, m), 2,99-3,12 (3H, m), 3,14-3,21 (2H, m), 3,24-3,30 (2H, m), 3,56-3,77 (6H, m), 3,82 (2H, s), 4,41-4,51 (1H, m), 5,20 (2H, c, J=18,9 Hz), 5,42 (2H, s), 5,54-5,60 (1H, m), 6,54 (1H, s), 7,15 7,27 (5H, m), 7,31 (1H, s), 7,69-7,74 (1H, m), 7,80 (1H, d, J=10,9 Hz), 8,06 (1H, t, J=5,7 Hz), 8,13 (1H, d, J=7,8 Hz), 8,21-8,34 (3H, m), 8,46 (1H, d, J=8,6 Hz).
EM (IEN) m/z: 1030, 1032 (M+H)+.
Procedimiento 6: Conjugado anticuerpo-fármaco (2)
Reducción del anticuerpo: El trastuzumab producido en el ejemplo de referencia 1 se preparó para tener una concentración de anticuerpo de 10 mg/ml reemplazando el medio con PBS6,0/EDTA usando el procedimiento común C-1 y el procedimiento común B (como coeficiente de absorción a 280 nm, se usaron 1,48 mlmg_1 cirr1). La solución (1,25 ml) se puso en un tubo de polipropileno de 1,5 ml y se cargó con una solución acuosa de TCEP 10 mM (0,019 ml; 2,3 equivalentes por molécula de anticuerpo) y una solución acuosa de hidrogenofosfato dipotásico 1 M (0,0625 ml). Después de confirmarse que la solución tenía un pH de 7,4 ± 0,1, el enlace disulfuro en la parte de la bisagra del anticuerpo se redujo mediante incubación a 37 °C durante 1 hora.
Conjugación entre el anticuerpo y enlazador de fármaco: Después de añadir DMSO (Sigma-Aldrich Co. LLC; 0,098 ml) y una solución de DMSO que contenía 10 mM del compuesto del Procedimiento 5 anterior (0,039 ml; 4,6 equivalentes por molécula de anticuerpo) a la solución anterior a temperatura ambiente, se agitó usando un tubo rotador para conjugar el enlazador de fármaco con el anticuerpo a temperatura ambiente durante 40 minutos. A continuación, una solución acuosa de NAC 100 mM (0,008 ml) se añadió a la misma y se agitó a temperatura ambiente para terminar la reacción del enlazador fármaco durante otros 20 minutos. Purificación: La solución anterior se sometió a purificación
usando el procedimiento común D (se usó ABS como solución tampón) para producir 6 ml de una solución que contenía el compuesto de interés.
Caracterización fisicoquímica: Usando el procedimiento común B y el procedimiento común E, se obtuvieron los siguientes valores característicos.
Concentración de anticuerpo: 1,41 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 8,5 mg (68 %), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 3,3.
Ejemplo 3 Conjugado anticuerpo-fármaco (3)
Reducción del anticuerpo: El trastuzumab producido en el ejemplo de referencia 1 se preparó para tener una concentración de anticuerpo de 10 mg/ml reemplazando el medio con PBS6,0/EDTA usando el procedimiento común C-1 y el procedimiento común B (como coeficiente de absorción a 280 nm, se usaron 1,48 mlmg-1 cm-1). La solución (1,25 ml) se puso en un tubo de polipropileno de 1,5 ml y se cargó con una solución acuosa de TCEP 10 mM (0,039 ml; 4,6 equivalentes por molécula de anticuerpo) y una solución acuosa de hidrogenofosfato dipotásico 1 M (0,0625 ml). Después de confirmarse que la solución tenía un pH de 7,4 ± 0,1, el enlace disulfuro en la parte de la bisagra del anticuerpo se redujo mediante incubación a 37 °C durante 1 hora.
Conjugación entre el anticuerpo y enlazador de fármaco: Después de añadir DMSO (0,065 ml) y una solución de DMSO que contenía 10 mM del compuesto del Procedimiento 5 del Ejemplo 2 (0,078 ml; 9,2 equivalentes por molécula de anticuerpo) a la solución anterior a temperatura ambiente, se agitó usando un tubo rotador para conjugar el enlazador de fármaco con el anticuerpo a temperatura ambiente durante 40 minutos. A continuación, una solución acuosa de NAC 100 mM (0,0155 ml) se añadió a la misma y se agitó a temperatura ambiente para terminar la reacción del enlazador fármaco durante otros 20 minutos. Purificación: La solución anterior se sometió a purificación usando el procedimiento común D (se usó ABS como solución tampón) para producir 6 ml de una solución que contenía el compuesto de interés.
Caracterización fisicoquímica: Usando el procedimiento común B y el procedimiento común E, se obtuvieron los siguientes valores característicos.
Concentración de anticuerpo: 1,55 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 9,3 mg (74 %), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 6,0.
Ejemplo 4 Intermedio (4)
Procedimiento 1: [2-(2-{[(1S,9S)-9-Etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-2-oxoetoxi)etil]carbamato de ferc-butilo
Se hizo reaccionar la sal del ácido metanosulfónico de exatecán (3,10 g, 5,47 mol) de la misma manera como en el Procedimiento 1 del Ejemplo 1 usando ácido {2-[(ferc-butoxicarbonil)amino]etoxi}acético (J. Med. Chem., 1992, Vol.
35, pág. 2928; 1,55 g, 6,01 mmol) en lugar de ácido 4-(ferc-butoxicarbonilamino)butanoico para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (2,56 g, 73 %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-da) 8: 0,87 (3H, t, J=7,3 Hz), 1,26 (9H, s), 1,81-1,91 (2H, m), 2,13-2,22 (2H, m), 2,40 (3H, s), 3,08-3,26 (4H, m), 3,43-3,53 (2H, m), 4,00 (1H, d, J=15,1 Hz), 4,05 (1H, d, J=15,1 Hz), 5,14 (1H, d, J=18,7 Hz), 5,22 (1H, d, J=18,7 Hz), 5,40 (1H, d, J=16,6 Hz), 5,44 (1H, d, J=16,6 Hz), 5,59-5,66 (1H, m), 6,53 (1H, s), 6,86 (1H, t, J=5,4 Hz), 7,31 (1H, s), 7,79 (1H, d, J=10,9 Hz), 8,49 (1H, d, J=9,1 Hz).
EM (CLEM) m/z: 637 (M+H)+.
Procedimiento 2: 2-(2-Aminoetoxi)-N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]acetamida
El compuesto (1,50 g, 2,36 mol) obtenido en el Procedimiento 1 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 2 del Ejemplo 1 para producir sal del ácido trifluoroacético del compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (1,50 g, cuantitativo).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 8: 0,87 (3H, t, J=7,5 Hz), 1,81-1,92 (2H, m), 2,15-2,23 (2H, m), 2,41 (3H, s), 3,05 (2H, t, J=5,1 Hz), 3,15-3,23 (2H, m), 3,71 (2H, t, J=5,1 Hz), 4,10 (2H, s), 5,19 (1H, d, J=18,7 Hz), 5,24 (1H, d, J=18,7 Hz), 5,43 (2H, s), 5,58-5,66 (1H, m), 6,55 (1H, s), 7,33 (1H, s), 7,73-7,84 (4H, m), 8,55 (1H, d, J=9,1 Hz). EM (CLEM) m/z: 537 (M+H)+.
Ejemplo 5 Conjugado anticuerpo-fármaco (5)
A una solución de N,N-dimetilformamida (10,0 ml) de NE-(ferc-butoxicarbonil)-Na-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-L-lisina (1,00 g, 2,14 mmol), N-hidroxisuccinimida (0,370 g, 3,20 mmol) y clorhidrato del éster ferc-butílico del ácido 4 aminobutanoico (0,830 g, 4,27 mmol), se le añadieron clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (0,610 g, 3,20 mmol) y N,N-diisopropiletilamina (0,410 ml, 2,35 mmol) y se agitaron a temperatura ambiente durante 3 días. La solución de reacción se diluyó con acetato de etilo y se lavó con una solución acuosa al 10 % de ácido cítrico, una solución acuosa saturada de hidrogenocarbonato sódico y una solución acuosa saturada de cloruro sódico y después la capa orgánica se secó sobre sulfato de magnesio anhidro. El disolvente se retiró a presión reducida para producir el compuesto del título en forma de un sólido incoloro (1,35 g, cuantitativo).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-da) 8: 1,14-1,42 (4H, m), 1,36 (9H, s), 1,37 (9H, s), 1,48-1,67 (4H, m), 2,18 (2H, t, J=7,6 Hz), 2,84-2,93 (2H, m), 2,99-3,11 (2H, m), 3,84-3,94 (1H, m), 4,18-4,30 (3H, m), 6,76 (1H, t, J=5,4 Hz), 7,33 (2H, t, J=7,3 Hz), 7,39-7,45 (3H, m), 7,73 (2H, dd, J=7,3, 2,7 Hz), 7,85-7,92 (3H, m).
Procedimiento 2: 4-{[N6-(ferc-butoxicarbonil)-L-lisil]amino}butanoato de terc-butilo
A una solución de N,N-dimetilformamida (8,00 ml) del compuesto (1,35 g, 2,22 mmol) obtenido en el Procedimiento 1 anterior, se le añadió piperidina (2,00 ml) y se agitó a temperatura ambiente durante 1,5 horas. El disolvente se retiró a presión reducida para dar un mezcla que contenía el compuesto del título. La mezcla se usó en la siguiente reacción sin purificación adicional.
Procedimiento 3: N-[(9H-Fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-L-valil-N6-(ferc-butoxicarbonil)-N-(4-ferc-butoxi-4-oxobutil)-L-lisinamida
A una solución de N,N-dimetilformamida (30,0 ml) de la mezcla (2,22 mmol) obtenido en el Procedimiento 2 anterior, se le añadieron N-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-L-valina (1,13 g, 3,32 mmol), N-hidroxisuccinimida (0,310 g, 2,66 mmol) y clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (0,550 g, 2,88 mmol) y se agitaron a temperatura ambiente durante 18 horas. La solución de reacción se diluyó con acetato de etilo y se lavó con una solución acuosa saturada de hidrogenocarbonato sódico y una solución acuosa saturada de cloruro sódico y después, la capa orgánica se secó sobre sulfato de magnesio anhidro. El disolvente se retiró a presión reducida y el residuo obtenido se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice [cloroformo - cloroformo : metanol = 9 : 1 (v/v)] para producir el compuesto del título en forma de un sólido incoloro (0,363 g, 23 %).
RMN 1H (400 MHz, DIVISOR) 6: 0,84 (6H, t, J=6,0 Hz), 1,12-1,64 (8H, m), 1,34 (9H, s), 1,38 (9H, s), 1,90-2,04 (1H, m), 2,17 (2H, t, J=7,3 Hz), 2,79-2,90 (2H, m), 2,99-3,09 (2H, m), 3,83-3,91 (1H, m), 4,08-4,44 (4H, m), 6,71 (1H, t, J=5,4 Hz), 7,32 (2H, t, J=7,3 Hz), 7,42 (3H, t, J=7,3 Hz), 7,74 (2H, t, J=7,0 Hz), 7,85-7,91 (4H, m).
EM (IEN) m/z: 709 (M+H)+.
Procedimiento 4: N-[(9H-Fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-L-valil-N-(3-carboxipropil)-L-lisinamida
Al compuesto (0,363 mg, 0,512 mmol) obtenido en el Procedimiento 3 anterior, se le añadió ácido fórmico (10,0 ml) y se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas. El disolvente se retiró a presión reducida para producir sal del ácido fórmico del compuesto del título. El compuesto se usó para la siguiente reacción sin purificación adicional.
Procedimiento 5: N-[(9H-Fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-L-valil-N6-(ferc-butoxicarbonil)-N-(3-carboxipropil)-L-lisinamida
A una suspensión de 1,4-dioxano (5,00 ml) del compuesto (0,512 mmol) obtenido en el Procedimiento 4 anterior, se le añadieron una solución acuosa saturada de hidrogenocarbonato sódico (20,0 ml) y dicarbonato de di-ferc-butilo (0,178 ml, 0,769 mmol) y se agitaron a temperatura ambiente durante 3 horas. La solución de reacción se diluyó con acetato de etilo y se lavó con una solución acuosa al 10 % de ácido cítrico y una solución acuosa saturada de cloruro sódico, y después la capa orgánica se secó sobre sulfato de magnesio anhidro. El disolvente se retiró a presión reducida para producir el compuesto del título en forma de un sólido incoloro (0,295 g, 88 %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 6: 0,84 (6H, t, J=6,7 Hz), 1,13-1,39 (4H, m), 1,35 (9H, s), 1,48-1,62 (4H, m), 1,91-2,04 (1H, m), 2,20 (2H, t, J=7,3 Hz), 2,80-2,89 (2H, m), 2,99-3,11 (2H, m), 3,87 (1H, dd, J=8,5, 6,7 Hz), 4,06-4,35 (4H, m), 6,71 (1H, t, J=6,0 Hz), 7,32 (2H, t, J=7,6 Hz), 7,39-7,46 (3H, m), 7,74 (2H, t, J=7,6 Hz), 7,83-7,94 (4H, m).
EM (IEN) m/z: 653 (M+H)+
Procedimiento 6: N-[(9H-Fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-L-valil-N6-(ferc-butoxicarbonil)-N-(4-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-4-oxobutil)-L-lisinamida
Se hizo reaccionar la sal del ácido metanosulfónico de exatecán (0,240 g, 0,452 mmol) de la misma manera como en el Procedimiento 1 del Ejemplo 1 usando el compuesto (0,295 g, 0,452 mmol) obtenido en el Procedimiento 5 anterior en lugar de ácido 4-(ferc-butoxicarbonilamino)butanoico para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color naranja pálido (0,208 g, 43 %). EM (IEN) m/z: 1071 (M+H)+.
Procedimiento 7: L-Valil-N6-(ferc-butoxicarbonil)-N-(4-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-4-oxobutil)-L-lisinamida
El compuesto (0,208 g, 0,194 mmol) obtenido en el Procedimiento 6 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 2 anterior para producir una mezcla que contenía el compuesto del título. La mezcla se usó en la siguiente reacción sin purificación adicional.
Procedimiento 8: N-[6-(2,5-Dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil]-L-valil-N6-(ferc-butoxicarbonil)-N-(4-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-4-oxobutil)-L-lisinamida
A una solución de N,N-dimetilformamida (110 ml) de la mezcla (0,194 mmol) obtenido en el Procedimiento 7 anterior, se le añadió 6-maleimidohexanoato de N-succinimidilo (84,5 mg, 0,271 mmol) y se agitó a temperatura ambiente durante 17 horas. El disolvente se retiró a presión reducida y el residuo obtenido se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice [cloroformo - cloroformo : metanol = 9 : 1 (v/v)] para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (0,133 g, 56 %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 6: 0,77 (6H, t, J=5,7 Hz), 0,87 (3H, t, J=7,3 Hz), 1,14-1,71 (10H, m), 1,35 (9H, s), 1,77 1,95 (3H, m), 2,02-2,23 (7H, m), 2,40 (3H, s), 2,84 (3H, c, J=6,4 Hz), 3,05 (2H, d, J=6,7 Hz), 3,17 (2H, s), 3,26-3,39
(3H, m), 4,01-4,16 (2H, m), 5,15 (1H, d, J=18,7 Hz), 5,24 (1H, d, J=18,7 Hz), 5,36-5,48 (2H, m), 5,51-5,60 (1H, m), 6,52 (1H, s), 6,72 (1H, t, J=6,0 Hz), 6,99 (2H, s), 7,31 (1H, s), 7,71-7,85 (5H, m), 8,41 (1H, d, J=9,1 Hz).
EM (IEN) m/z: 1041 (M+H)+.
Procedimiento 9: N-[6-(2,5-Dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil]-L-valil-N-(4-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-4-oxobutil)-L-lisinamida
A una solución de diclorometano (10,0 ml) del compuesto (0,110 mg, 0,106 mmol) obtenido en el Procedimiento 8 anterior, se le añadió ácido trifluoroacético (4,00 ml) y se agitó a temperatura ambiente durante 5 horas. El disolvente se retiró a presión reducida para producir sal del ácido trifluoroacético del compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (70,0 mg, 64 %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 8: 0,76-0,81 (6H, m), 0,87 (3H, t, J=7,3 Hz), 1,12-1,31 (4H, m), 1,39-1,56 (8H, m), 1,57 1,74 (3H, m), 1,79-1,96 (3H, m), 2,06-2,18 (7H, m), 2,40 (3H, s), 2,70-2,80 (2H, m), 3,01-3,10 (2H, m), 3,13-3,22 (2H, m), 4,04 (1H, t, J=7,6 Hz), 4,10-4,20 (1H, m), 5,15 (1H, d, J=18,7 Hz), 5,24 (1H, d, J=18,7 Hz), 5,36-5,47 (2H, m), 5,52 5,60 (1H, m), 6,53 (1H, s), 7,00 (2H, s), 7,32 (1H, s), 7,61 (3H, s a), 7,75-7,88 (4H, m), 8,43 (1H, d, J=8,5 Hz).
EM (IEN) m/z: 941 (M+H)+.
Procedimiento 10: Conjugado anticuerpo-fármaco (5)
Usando el trastuzumab producido en el ejemplo de referencia 1 y el compuesto obtenido en el Procedimiento 9 anterior, el conjugado anticuerpo-fármaco titulado se obtuvo de la misma manera que el Procedimiento 6 del Ejemplo 2. Además, la solución se concentró mediante el procedimiento común A. Después de eso, usando el procedimiento común B y el procedimiento común E, se obtuvieron los siguientes valores característicos.
Concentración de anticuerpo: 10,64 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 7,4 mg (59%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 3,3.
Ejemplo 6 Conjugado anticuerpo-fármaco (6)
Procedimiento 1: Conjugado anticuerpo-fármaco (6)
Usando el trastuzumab producido en ejemplo de referencia 1 y el compuesto obtenido en el Procedimiento 9 del Ejemplo 5, el conjugado anticuerpo-fármaco titulado se obtuvo de la misma manera que el Procedimiento 1 del Ejemplo 2. Además, la solución se concentró mediante el procedimiento común A. Después de eso, usando el procedimiento común B y el procedimiento común E, se obtuvieron los siguientes valores característicos.
Concentración de anticuerpo: 10,41 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 7,3 mg (58%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 5,9.
Ejemplo 7 Intermedio (7)
Procedimiento 1: (3-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-3-oxopropil)carbamato de ferc-butilo
Se hizo reaccionar la sal del ácido metanosulfónico de exatecán (500 mg, 0,941 mmol) de la misma manera como en el Procedimiento 1 del Ejemplo 1 usando N-(ferc-butoxicarbonil)-p-alanina en lugar de ácido 4-(fercbutoxicarbonilamino)butanoico para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo-pardo (616 mg, cuantitativo).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-da) 8: 0,87 (3H, t, J=7,2 Hz), 1,29 (9H, s), 1,86 (2H, dt, J=15,1,7,3 Hz), 2,04-2,22 (2H, m), 2,31 (2H, t, J=6,8 Hz), 2,40 (3H, s), 3,10-3,26 (4H, m), 5,15 (1H, d, J=18,8 Hz), 5,26 (1H, d, J=19,2 Hz), 5,42 (2H, dd, J=18,8, 16,4 Hz), 5,57 (1H, dt, J=8,5, 4,2 Hz), 6,53 (1H, s), 6,78 (1H, t, J=5,5 Hz), 7,30 (1H, s), 7,80 (1H, d, J=11,0 Hz), 8,46 (1H, d, J=8,6 Hz).
EM (IEN) m/z: 607 (M+H)+.
Procedimiento 2: N-[(1S,9S)-9-Etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]-p-alaninamida
El compuesto obtenido en el Procedimiento 1 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 2 del Ejemplo 1 para producir la sal del ácido trifluoroacético del compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo (499 mg, 86 %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 8: 0,87 (3H, t, J=7,2 Hz), 1,86 (2H, d quint., J=14,6, 7,2, 7,2, 7,2, 7,2 Hz), 2,06-2,27 (1H, m), 2,41 (3H, s), 2,46-2,57 (2H, m), 3,08 (2H, t, J=6,8 Hz), 3,14-3,24 (2H, m), 5,22 (1H, d, J=18,8 Hz), 5,29 (1H, d, J=18,8 Hz), 5,43 (2H, s), 5,58 (1H, dt, J=8,5, 4,5 Hz), 6,55 (1H, s), 7,32 (1H, s), 7,74 (3H, s a), 7,82 (1H, d, J=11,0 Hz), 8,67 (1H, d, J=8,6 Hz).
EM (IEN) m/z: 507 (M+H)+.
Ejemplo 8 Intermedio (8)
Procedimiento 1: (6-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-6-oxohexil)carbamato de ferc-butilo
Se hizo reaccionar la sal del ácido metanosulfónico de exatecán (0,500 g, 0,882 mmol) de la misma manera como en el Procedimiento 1 del Ejemplo 1 usando ácido 6-(ferc-butoxicarbonilamino)hexanoico en lugar de ácido 4-(fercbutoxicarbonilamino)butanoico para producir el compuesto del título (0,620 g, cuantitativo).
RMN 1H (DMSO-d6) 8: 0,83 (3H, t, J=7,8 Hz), 1,14-1,28 (2H, m), 1,31 (9H, s), 1,47-1,61 (2H, m), 1,75-1,89 (2H, m), 2,04-2,17 (4H, m), 2,35 (3H, s), 2,81-2,88 (2H, m), 3,09-3,16 (2H, m), 5,10 (1H, d, J=19,4 Hz), 5,16 (1H, d, J=19,4 Hz), 5,39 (2H, s), 5,48-5,55 (1H, m), 6,50 (1H, s), 6,73-6,78 (1H, m), 7,26 (1H, s), 7,74 (1H, d, J=10,9 Hz), 8,39 (1H, d, J=9,0 Hz).
Procedimiento 2: 6-Amino-N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]hexanamida
El compuesto (0,397 g, 0,611 mmol) obtenido en el Procedimiento 1 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 2 del Ejemplo 1 para producir sal del ácido trifluoroacético del compuesto del título (0,342 g, 84 %).
RMN 1H (DMSO-d6) 8: 0,88 (3H, t, J=7,2 Hz), 1,31-1,41 (2H, m), 1,52-1,70 (4H, m), 1,80-1,94 (2H, m), 2,05-2,18 (2H, m), 2,21 (2H, t, J=7,4 Hz), 2,40 (3H, s), 2,81 (2H, t, J=7,4 Hz), 3,10-3,25 (2H, m), 3,33 (2H, s a), 5,18 (1H, d, J=19,8 Hz), 5,22 (1H, d, J=19,8 Hz), 5,41 (2H, d, J=16,6 Hz), 5,45 (2H, d, J=16,6 Hz), 5,53-5,60 (1H, m), 6,55 (1H, s), 7,32 (1H, s), 7,80 (1H, d, J=10,9 Hz), 8,49 (1H, d, J=9,2 Hz).
Ejemplo 9 Intermedio (9)
Procedimiento 1: 2-{[(1S,9S)-9-Etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-2-oxoetilacetato
Con enfriamiento de hielo, a una suspensión de N,N-dimetilformamida (20,0 ml) de la sal del ácido metanosulfónico de exatecán (0,500 g, 0,941 mmol), se le añadieron N,N-diisopropiletilamina (0,492 ml, 2,82 mmol) y cloruro de acetoxiacetilo (0,121 ml, 1,13 mmol) y se agitaron a temperatura ambiente durante 1 hora. El disolvente se retiró a presión reducida y el residuo obtenido se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice [cloroformo -capa orgánica repartida de cloroformo : metanol : agua = 7 : 3 : 1 (v/v/v)] para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (0,505 g, cuantitativo). Rm N 1H (400 MHz, DMSO-d6) 8: 0,87 (3H, t, J=7,4 Hz), 1,81-1,92 (2H, m), 2,08 (3H, s), 2,08-2,22 (2H, m), 2,41 (3H, s), 3,14-3,21 (2H, m), 4,51 (2H, dd, J=19,4, 14,7 Hz), 5,22 (2H, dd, J=40,1, 19,0 Hz), 5,43 (2H, s), 5,56-5,61 (1H, m), 6,53 (1H, s), 7,31 (1H, s), 7,81 (1H, d, J=11,0 Hz), 8,67 (1H, d, J=8,6 Hz).
EM (IEN) m/z: 536 (M+H)+.
Procedimiento 2: N-[(1S,9S)-9-Etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]-2-hidroxiacetamida
A una suspensión de metanol (50,0 ml) del compuesto (0,504 g, 0,941 mmol) obtenido en el Procedimiento 1 anterior, se le añadieron tetrahidrofurano (20,0 ml) y una solución de hidróxido sódico 1 N (4,00 ml, 4,00 mmol) y se agitaron a temperatura ambiente durante 1 hora. La reacción se terminó mediante la adición de ácido clorhídrico 1 N (5,00 ml, 5,00 mmol) y el disolvente se retiró a presión reducida. Los residuos obtenidos se purificaron mediante cromatografía en columna de gel de sílice [cloroformo - capa orgánica repartida de cloroformo : metanol: agua = 7 : 3 : 1 (v/v/v)] para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (0,412 g, 89 %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 8: 0,87 (3H, t, J=7,3 Hz), 1,78-1,95 (2H, m), 2,09-2,28 (2H, m), 2,39 (3H, s), 3,07-3,27 (2H, m), 3,96 (2H, d, J=6,0 Hz), 5,11-5,26 (2H, m), 5,42 (2H, s), 5,46-5,54 (1H, m), 5,55-5,63 (1H, m), 6,52 (1H, s), 7,30 (1H, s), 7,78 (1H, d, J=10,9 Hz), 8,41 (1H, d, J=9,1 Hz).
EM (IEN) m/z: 494 (M+H)+.
Ejemplo 10 (procedimiento alternativo para sintetizar el compuesto del Ejemplo 9)
Procedimiento 1: N-[(1S,9S)-9-Etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]-2-hidroxiacetamida
Se disolvió ácido glicólico (0,0201 g, 0,27 mmol) en N,N-dimetilformamida (1,0 ml), se cargó con N-hidroxisuccinimida (0,0302 g, 0,27 mmol) y clorhidrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida (0,0508 g, 0,27 mmol), y se agitó durante 1 hora. La solución de reacción se añadió a una suspensión de N,N-dimetilformamida (1,0 ml) de la sal del ácido metanosulfónico de exatecán (0,1 g, 0,176 mmol) y trietilamina (0,025 ml, 0,18 mmol) y se agitó a temperatura ambiente durante 24 horas. El disolvente se retiró a presión reducida y el residuo obtenido se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice [cloroformo - cloroformo : metanol = 10 : 1 (v/v)] para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (0,080 g, 92 %). Los datos instrumentales del compuesto fueron los mismos que los del Procedimiento 2 del Ejemplo 9.
Ejemplo 11 Conjugado anticuerpo-fármaco (11)
Procedimiento 1: N-(3-Sulfanilpropanoil)glicilglicM-L-fenMalanil-N-(4-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-4-oxobutil)glicinamida
El compuesto (84,0 mg, 0,100 mmol) obtenido en el Procedimiento 2 del Ejemplo 2 se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 8 del Ejemplo 5 usando 3-mercaptopropionato de N-succinimidilo en lugar de 6-maleimidohexanoato de N-succinimidilo para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (61,2 mg, 66 %).
RMN 1H (DMSO-d6) 8: 0,87 (3H, t, J=7,4 Hz), 1,77-1,66 (2H, m), 1,79-1,92 (2H, m), 2,07-2,24 (4H, m), 2,31-2,47 (3H, m), 2,40 (3H, s), 2,59-2,69 (2H, m), 2,78 (1H, dd, J=13,7, 9,8 Hz), 2,98-3,13 (3H, m), 3,14-3,23 (2H, m), 3,54-3,79 (6H, m), 4,40-4,50 (1H, m), 5,20 (2H, dd, J=36,8, 19,2 Hz), 5,36-5,47 (2H, m), 5,52-5,63 (1H, m), 6,54 (1H, s), 7,14-7,28 (5H, m), 7,31 (1H, s), 7,68-7,74 (1H, m), 7,80 (1H, d, J=10,9 Hz), 8,03-8,09 (1H, m), 8,13 (1H, d, J=7,8 Hz), 8,19-8,29 (2H, m), 8,46 (1H, d, J=8,6 Hz).
EM (IEN) m/z: 927 (M+H)+.
Procedimiento 2: Conjugado anticuerpo-fármaco (11)
Derivatización SMCC del anticuerpo: El trastuzumab producido en el ejemplo de referencia 1 se preparó para tener una concentración del anticuerpo de 20 mg/ml reemplazando el medio con PBS6,5/EDTA usando el procedimiento común C-2 y el procedimiento común B (como coeficiente de absorción a 280 nm, se usaron 1,37 mlmg_1 cirr1). La solución (0,5 ml) se puso en un tubo de 1,5 ml, se cargó con una solución de DMSO (0,0125 ml; que corresponde a aproximadamente 5,1 equivalentes por molécula de anticuerpo) que contenía 27,6 mM de 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo (SMCC, Thermo Fisher Scientific Inc.) y DMSO (0,0125 ml) a temperatura ambiente y se hizo reaccionar a temperatura ambiente durante 2 horas. Esta solución de reacción se sometió a purificación de acuerdo con el procedimiento común D-2 para producir 1,2 ml de una solución que contenía aproximadamente 10 mg del anticuerpo derivatizado de SMCC.
Conjugación entre el anticuerpo y enlazador de fármaco: Después de añadir DMSO (0,09 ml) y una solución de DMSO que contenía 10 mM del compuesto obtenido en el Procedimiento 1 anterior (0,03 ml; que corresponde a aproximadamente 5,8 equivalentes por molécula de anticuerpo) a la solución anterior a temperatura ambiente, se agitó usando un rotador de tubo (MTR-103, fabricado por AS ONE Corporation) para conjugar el enlazador fármaco al anticuerpo a temperatura ambiente durante 16 horas.
Purificación: La solución anterior se sometió a purificación usando el procedimiento común D (se usó ABS como solución tampón) para producir 6 ml de una solución que contenía el compuesto de interés.
Caracterización fisicoquímica: Usando el procedimiento común B y el procedimiento común E, se obtuvieron los siguientes valores característicos.
Concentración de anticuerpo: 1,20 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 7,2 mg (72 %), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 3,3.
Ejemplo 12 Conjugado anticuerpo-fármaco (12)
Procedimiento 1: Conjugado anticuerpo-fármaco (12)
Derivatización SMCC del anticuerpo: El trastuzumab producido en el ejemplo de referencia 1 se preparó para tener una concentración del anticuerpo de 20 mg/ml reemplazando el medio con PBS6,5/EDTA usando el procedimiento común C-2 y el procedimiento común B (como coeficiente de absorción a 280 nm, se usaron 1,37 mlmg-1 cm-1). La solución (0,5 ml) se puso en un tubo de 1,5 ml, se cargó con una solución de DMSO (0,025 ml; que corresponde a aproximadamente 10 equivalentes por molécula de anticuerpo) que contiene 27,6 mM de 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo (SMCC, Thermo Fisher Scientific Inc.) a temperatura ambiente y se hizo reaccionar a temperatura ambiente durante 2 horas. Esta solución de reacción se sometió a purificación de acuerdo con el procedimiento común D-2 para producir 1,2 ml de una solución que contenía aproximadamente 10 mg del anticuerpo derivatizado de SMCC. Conjugación entre el anticuerpo y enlazador de fármaco: Después de añadir DMSO (0,06 ml) y una solución de DMSO que contenía 10 mM del compuesto obtenido en el Procedimiento 1 del Ejemplo 11 (0,06 ml; que corresponde a aproximadamente 11,6 equivalentes por molécula de anticuerpo) a la solución anterior a temperatura ambiente, se agitó usando un rotador de tubo (MTR-103, fabricado por AS ONE Corporation) para conjugar el enlazador fármaco al anticuerpo a temperatura ambiente durante 16 horas.
Purificación: La solución anterior se sometió a purificación usando el procedimiento común D (se usó ABS como solución tampón) para producir 6 ml de una solución que contenía el compuesto de interés. Además, la solución se concentró mediante el procedimiento común A. Después de eso, usando el procedimiento común B y el procedimiento común E, se obtuvieron los siguientes valores característicos.
Concentración de anticuerpo: 2,36 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 2,8 mg (28 %), y número promedio de moléculas
de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 4,8.
Ejemplo 13 Conjugado anticuerpo-fármaco (13)
Procedimiento 1: N-{8-[(2,5-Dioxopirrolidin-1-il)oxi]-8-oxoocatnoil}glicilgMcil-L-fenilalanil-N-(4-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metiM0,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indoNzino[1,2-b]quinoNn-1-il]amino}-4-oxobutil)glicinamida
El compuesto (84,0 mg, 0,100 mmol) obtenido en el Procedimiento 2 del Ejemplo 2 se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 8 del Ejemplo 5 usando ácido subérico di(N-succinimidil) en lugar de 6-maleimidohexanoato de N-succinimidilo para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (77,1 mg, 71 %).
RMN 1H (DMSO-da) 8: 0,87 (3H, t, J=7,2 Hz), 1,21-1,38 (4H, m), 1,43-1,50 (2H, m), 1,55-1,63 (2H, m), 1,68-1,76 (2H, m), 1,80-1,91 (2H, m), 2,07-2,22 (6H, m), 2,40 (3H, s), 2,60-2,67 (2H, m), 2,76-2,84 (5H, m), 2,97-3,22 (5H, m), 3,56 3,76 (6H, m), 4,40-4,50 (1H, m), 5,20 (2H, c, J=18,8 Hz), 5,37-5,48 (2H, m), 5,53-5,62 (1H, m), 6,54 (1H, s), 7,15-7,28 (5H, m), 7,31 (1H, s), 7,71 (1H, t, J=5,5 Hz), 7,80 (1H, d, J=10,9 Hz), 8,04 (1H, t, J=5,9 Hz), 8,09 (1H, t, J=5,9 Hz), 8,14 (1H, d, J=7,8 Hz), 8,26 (1H, t, J=5,9 Hz), 8,47 (1H, d, J=8,6 Hz).
EM (IEN) m/z: 1092 (M+H)+.
Procedimiento 2: Conjugado anticuerpo-fármaco (13)
Conjugación entre el anticuerpo y enlazador de fármaco: El trastuzumab producido en el ejemplo de referencia 1 se preparó para tener una concentración del anticuerpo de 20 mg/ml reemplazando el medio con PBS6,5/EDTA usando el procedimiento común C-2 y el procedimiento común B (como coeficiente de absorción a 280 nm, se usaron 1,37 mlmg_1 cirr1). La solución (0,33 ml) se puso en un tubo de 1,5 ml, se cargó con una solución de DMSO (0,04 ml; que corresponde a aproximadamente 9 equivalentes por molécula de anticuerpo) que contenía 10 mM del compuesto obtenido en el Procedimiento 1 anterior a temperatura ambiente y se agitó usando un rotador de tubo (MTR-103, fabricado por AS ONE Corporation) para conjugar el enlazador fármaco al anticuerpo a temperatura ambiente durante 16 horas.
Purificación: La solución anterior se sometió a purificación usando el procedimiento común D (se usó ABS como solución tampón) para producir 3,5 ml de una solución que contenía el conjugado del anticuerpo-fármaco del título. Caracterización fisicoquímica: Usando el procedimiento común B y el procedimiento común E, se obtuvieron los siguientes valores característicos.
Concentración de anticuerpo: 1,20 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 4,2 mg (63 %), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 5,6.
Ejemplo 14 Conjugado anticuerpo-fármaco (14)
Conjugación entre el anticuerpo y enlazador de fármaco: El trastuzumab producido en el ejemplo de referencia 1 se preparó para tener una concentración del anticuerpo de 20 mg/ml reemplazando el medio con PBS6,5/EDTA usando el procedimiento común C-2 y el procedimiento común B (como coeficiente de absorción a 280 nm, se usaron 1,37 mlmg-1 cm-1). La solución (0,33 ml) se puso en un tubo de 1,5 ml y después se cargó con una solución acuosa de hidrogenofosfato dipotásico 1 M (Nacalai Tesque, Inc.) para ajustar el pH a 7,2. Después de añadir una solución de DMSO que contenía 10 mM del compuesto obtenido en el Procedimiento 1 del Ejemplo 14 (0,04 ml; que corresponde a aproximadamente 9 equivalentes por molécula de anticuerpo) a la solución anterior a temperatura ambiente, se agitó usando un rotador de tubo (MTR-103, fabricado por AS ONE Corporation) para conjugar el enlazador fármaco al anticuerpo a temperatura ambiente durante 16 horas.
Purificación: La solución anterior se sometió a purificación usando el procedimiento común D (se usó ABS como solución tampón) para producir 3,5 ml de una solución que contenía el compuesto de interés.
Caracterización fisicoquímica: Usando el procedimiento común B y el procedimiento común E, se obtuvieron los siguientes valores característicos.
Concentración de anticuerpo: 1,09 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 3,8 mg (57 %), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 5,1.
Ejemplo 15 Conjugado anticuerpo-fármaco (15)
[Formula 68]
Procedimiento 1: éster ferc-butílico del ácido 4-({N5-Carbamoil-N2-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-L-omitil}amino)butanoico
A una solución de N,N-dimetilformamida (40,0 ml) de N-a-(9-fluorenilmetoxicarbonil)-L-citrulina (2,00 g, 5,03 mmol), N-hidroxisuccinimida (0,869 g, 7,55 mmol) y clorhidrato del éster ferc-butílico del ácido 4-aminobutanoico (1,48 g, 7,55 mmol), se le añadieron clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (1,45 g, 7,55 mmol) y N,N-diisopropiletilamina (0,877 ml, 5,03 mmol) y se agitaron a temperatura ambiente durante 3 días. La solución de reacción se vertió a agua y se agitó y después los insolubles depositados se recogieron por filtración para producir el compuesto del título en forma de un sólido incoloro (2,70 g, 99 %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-da) 8: 1,36 (9H, s), 1,44 (6H, tt, J=44,0, 13,2 Hz), 2,17 (2H, t, J=7,4 Hz), 2,89-3,07 (4H, m), 3,85-3,95 (1H, m), 4,15-4,26 (3H, m), 5,37 (2H, s a), 5,93 (1H, t, J=5,9 Hz), 7,31 (2H, td, J=7,4, 1,2 Hz), 7,40 (2H, t, J=7,4 Hz), 7,47 (1H, d, J=8,2 Hz), 7,72 (2H, dd, J=7,4, 2,7 Hz), 7,87-7,89 (3H, m).
Procedimiento 2: 4-[(N5-carbamoil-L-ornitil)amino]butanoato de ferc-butilo
A una solución de N,N-dimetilformamida (20,0 ml) del compuesto (1,70 g, 3,16 mmol) obtenido en el Procedimiento 1
anterior, se le añadió piperidina (1,56 ml, 15,8 mmol) y se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. El disolvente se retiró a presión reducida para producir el compuesto del título. El compuesto se usó para la siguiente reacción sin purificación adicional.
Procedimiento 3: N-[(9H-Fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-L-valil-N-(4-terc-butoxi-4-oxobutil)-N5-carbamoil-L-ornitinamida
A una solución de N,N-dimetilformamida (40,0 ml) del compuesto (3,16 mmol) obtenido en el Procedimiento 2 anterior, se le añadieron N-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-L-valina (1,07 g, 3,16 mmol), N-hidroxisuccinimida (0,363 g, 3,16 mmol) y clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (0,908 g, 4,73 mmol) y se agitaron a temperatura ambiente durante 11 días. La solución de reacción se diluyó con acetato de etilo y se lavó con una solución acuosa saturada de hidrogenocarbonato sódico y una solución acuosa saturada de cloruro sódico y después, la capa orgánica se secó sobre sulfato de magnesio anhidro. El disolvente se retiró a presión reducida y los residuos obtenidos se purificaron por cromatografía en columna sobre gel de sílice [cloroformo / (cloroformo : metanol = 9 : 1 (v/v)) = 100 / 0 - 0 / 100] para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (0,280 g, 14 %). RMN 1H (400 MHz, DIVISOR) 8: 0,82 (6H, t, J=6,6 Hz), 1,36 (9H, s), 1,25-1,64 (4H, m), 1,86-2,06 (1H, m), 2,16 (3H, t, J=7,4 Hz), 2,80-3,07 (4H, m), 3,86 (1H, dd, J=8,8, 6,8 Hz), 4,06-4,37 (5H, m), 5,35 (2H, s a), 5,90 (1H, t, J=5,5 Hz), 7,31 (2H, t, J=7,4 Hz), 7,37-7,44 (3H, m), 7,72 (2H, t, J=6,6 Hz), 7,84-7,94 (4H, m).
Procedimiento 4: N-[(9H-Fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-L-valil-N5-carbamoil-N-(3-carboxipropil)-L-ornitinamida
A una solución de diclorometano (10,0 ml) del compuesto (0,280 g, 0,439 mmol) obtenido en el Procedimiento 3 anterior, se le añadió ácido trifluoroacético (10,0 ml) y se agitó a temperatura ambiente durante 3 días. El disolvente se retiró a presión reducida para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (0,212 g, 83 %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 8: 0,82 (6H, t, J=6,8 Hz), 1,17-1,69 (4H, m), 1,87-2,01 (1H, m), 2,15-2,32 (3H, m), 2,83 3,09 (4H, m), 3,87 (1H, dd, J=8,8, 6,8 Hz), 4,08-4,37 (5H, m), 5,35 (2H, s a), 5,91 (1H, s a), 7,31 (2H, t, J=7,4 Hz), 7,36-7,44 (3H, m), 7,72 (2H, t, J=6,8 Hz), 7,85-7,94 (4H, m), 12,04 (1H, s a).
Procedimiento 5: N-[(9H-Fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-L-valil-N5-carbamoil-N-(4-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-4-oxobutil)-L-ornitinamida
A una solución de N,N-dimetilformamida (10,0 ml) del compuesto (0,212 g, 0,364 mmol) obtenido en el Procedimiento 4 anterior, se le añadieron N-hidroxisuccinimida (42,0 mg, 0,364 mmol) y sal del ácido metanosulfónico de exatecán (0,194 g, 0,364 mmol), clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (0,145 g, 0,547 mmol) y N,N-diisopropiletilamina (63,5 pl, 0,364 mmol) y se agitaron a temperatura ambiente durante 1 día. El disolvente se retiró a presión reducida y los residuos obtenidos se purificaron por cromatografía en columna sobre gel de sílice [cloroformo / (cloroformo : metanol = 9 : 1 (v/v)) = 100 / 0 - 0 / 100] para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (0,169 g, 46 %). EM (ES+APCI) m/z: 999 (M+H)+.
Procedimiento 6: L-Valil-N5-carbamoil-N-(4-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-4-oxobutil)-L-ornitinamida
El compuesto (0,169 g, 0,169 mmol) obtenido en el Procedimiento 5 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 2 anterior para producir el compuesto del título. El compuesto se usó para la siguiente reacción sin purificación adicional.
Procedimiento 7: N-[6-(2,5-Dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil]-L-valil-N5-carbamoil-N-(4-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-4-oxobutil)-L-ornitinamida
A una solución de N,N-dimetilformamida (10,0 ml) del compuesto (0,131 g, 0,169 mmol) obtenido en el Procedimiento 6 anterior, se le añadió 6-maleimidohexanoato de N-succinimidilo (78,2 mg, 0,254 mmol) y se agitó a temperatura ambiente durante 18 horas. El disolvente se retiró a presión reducida y los residuos obtenidos se purificaron por cromatografía en columna sobre gel de sílice [cloroformo / (cloroformo : metanol = 9 : 1 (v/v)) = 100 / 0 - 0 / 100] para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color naranja pálido (52,0 mg, 40 %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 8: 0,74 (6H, t, J=6,6 Hz), 0,85 (4H, t, J=7,2 Hz), 1,10-1,19 (1H, m), 1,19-1,36 (1H, m), 1,38-1,50 (4H, m), 1,50-1,62 (1H, m), 1,62-1,73 (2H, m), 1,77-1,94 (4H, m), 2,03-2,19 (6H, m), 2,38 (3H, s), 2,56 (1H, s), 2,82-2,95 (2H, m), 2,98-3,08 (2H, m), 3,09-3,21 (2H, m), 3,32 (2H, c, J=8,2 Hz), 4,02-4,16 (2H, m), 5,18 (2H, c, J=17,0 Hz), 5,34 (2H, s), 5,41 (2H, s), 5,50-5,58 (1H, m), 5,89 (1H, t, J=6,3 Hz), 6,52 (1H, s), 6,98 (2H, s), 7,29 (1H, s), 7,73-7,88 (4H, m), 8,42 (1H, d, J=8,6 Hz).
EM (ES+APCI) m/z: 970 (M+H)+.
Procedimiento 8: Conjugado anticuerpo-fármaco (15)
Usando el trastuzumab producido en el ejemplo de referencia 1 y el compuesto obtenido en el Procedimiento 7 anterior, el conjugado anticuerpo-fármaco titulado se obtuvo de la misma manera que el Procedimiento 6 del Ejemplo 2. Concentración de anticuerpo: 1,62 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 9,7 mg (78 %), y número promedio de moléculas
de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 3,1.
Ejemplo 16 Conjugado anticuerpo-fármaco (16)
Procedimiento 1: Conjugado anticuerpo-fármaco (16)
Usando el trastuzumab producido en ejemplo de referencia 1 y el compuesto obtenido en el Procedimiento 7 del Ejemplo 15, el conjugado anticuerpo-fármaco titulado se obtuvo de la misma manera que el Procedimiento 1 del Ejemplo 3. Concentración de anticuerpo: 1,47 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 8,8 mg (70 %), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 5,8.
Ejemplo 17 Intermedio (17)
Procedimiento 1: (5-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-5-oxopentil) carbamato de ferc-butilo
Se hizo reaccionar la sal del ácido metanosulfónico de exatecán (500 mg, 0,941 mmol) se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 1 del Ejemplo 1 usando ácido 5-(ferc-butoxicarbonilamino)valérico en lugar de ácido -(ferc-butoxicarbonilamino)butanoico para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillopardo (571 mg, 96 %). El compuesto se usó para la siguiente reacción sin purificación adicional.
EM (IEN) m/z: 635 (M+H)+.
Procedimiento 2: 5-Amino-N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]pentanamida
El compuesto (558 mg, 0,879 mmol) obtenido en el Procedimiento 1 anterior se hizo reaccionar de la misma manera
como en el Procedimiento 2 del Ejemplo 1 para producir la sal ácido trifluoroacético del compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo (363 mg, 64 %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-da) 8: 0,88 (3H, t, J=7,4 Hz), 1,52-1,71 (4H, m), 1,87 (2H, tt, J=14,4, 6,9 Hz), 2,07-2,18 (2H, m), 2,22 (2H, t, J=7,0 Hz), 2,40 (3H, s), 2,76-2,88 (2H, m), 3,13-3,22 (2H, m), 5,18 (1H, d, J=18,8 Hz), 5,24 (1H, d, J=18,8 Hz), 5,43 (2H, s), 5,53-5,61 (1H, m), 6,55 (1H, s), 7,33 (1H, s), 7,65 (3H, s a), 7,81 (1H, d, J=11,3 Hz), 8,49 (1H, d, J=8,6 Hz).
EM (IEN) m/z: 535 (M+H)+.
Ejemplo 18 Intermedio (18)
Procedimiento 1: [(2S)-3-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-2-metil-3-oxopropil]carbamato de ferc-butilo
Se hizo reaccionar la sal del ácido metanosulfónico de exatecán (300 mg, 0,564 mmol) de la misma manera como en el Procedimiento 1 del Ejemplo 1 usando ácido (2S)-3-[(ferc-butoxicarbonil)amino]-2-metilpropiónico en lugar de ácido 4-(ferc-butoxicarbonilamino)butanoico y 3H-1,2,3-triazolo[4,5-b]piridin-3-ol en lugar de N-hidroxisuccinimida para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color blanco pálido (376 mg, cuantitativo). El compuesto se usó para la siguiente reacción sin purificación adicional.
RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 8: 0,87 (3H, t, J=7,2 Hz), 1,01 (3H, d, J=6,6 Hz), 1,16 (9H, s), 1,84 (2H, tt, J=13,8, 7,3 Hz), 2,02-2,21 (2H, m), 2,40 (3H, s), 2,44-2,55 (1H, m), 2,84-2,94 (1H, m), 3,07-3,23 (3H, m), 5,10 (1H, d, J=18,8 Hz), 5,31 (1H, d, J=18,8 Hz), 5,39 (1H, d, J=16,4 Hz), 5,45 (1H, d, J=16,4 Hz), 5,53-5,63 (1H, m), 6,54 (1H, s), 6,70 (1H, t, J=5,5 Hz), 7,30 (1H, s), 7,81 (1H, d, J=10,9 Hz), 8,43 (1H, d, J=9,0 Hz).
Procedimiento 2: (2S)-3-Amino-N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]-2-metilpropanamida
El compuesto obtenido en el Procedimiento 1 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 2 del Ejemplo 1 para producir sal del ácido trifluoroacético del compuesto del título (339 mg, 95 %, 2 etapas).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 8: 0,87 (3H, t, J=7,2 Hz), 1,17 (3H, d, J=7,0 Hz), 1,86 (2H, tt, J=14,4, 7,3 Hz), 2,05-2,15 (1H, m), 2,15-2,24 (1H, m), 2,42 (3H, s), 2,63 (1H, c, J=6,3 Hz), 2,82-2,91 (1H, m), 3,03-3,12 (1H, m), 3,14-3,23 (2H, m), 5,27 (1H, d, J=19,2 Hz), 5,33 (1H, d, J=18,8 Hz), 5,44 (2H, s), 5,50-5,58 (1H, m), 6,57 (1H, s), 7,33 (1H, s), 7,75 (3H, s a), 7,83 (1H, d, J=10,9 Hz), 8,62 (1H, d, J=8,2 Hz).
EM (IEN) m/z: 521 (M+H)+.
Ejemplo 19 Conjugado anticuerpo-fármaco (19)
Formula 72
Procedimiento 1: N-(íerc-Butoxicarbonil)glicilglicil-L-fenilalanil-N-[(2S)-3-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10.13- dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indoNzino[1,2-b]quinoNn-1-N]amino}-2-metN-3-oxopropil]glicinamida
El compuesto (308 mg, 0,485 mmol) obtenido en el Procedimiento 2 del Ejemplo 18 se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 1 del Ejemplo 2 para producir el compuesto del título (422 mg, 93 %). El compuesto se usó para la siguiente reacción sin purificación adicional.
Procedimiento 2: Glicilglicil-L-fenilalanil-N-[(2S)-3-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7Jindolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-2-metil-3-oxopropil]glicinamida
El compuesto obtenido en el Procedimiento 1 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 2 del Ejemplo 2 para producir sal del ácido trifluoroacético del compuesto del título (419 mg, 91 %, 2 etapas).
RMN 1H (400 MHz, DIVISOR) 8: 0,86 (3H, t, J=7,4 Hz), 1,06 (3H, d, J=7,0 Hz), 1,78-1,90 (2H, m), 2,05-2,19 (2H, m), 2,40 (3H, s), 2,57 (1H, t, J=6,6 Hz), 2,73 (1H, dd, J=13,7, 10,2 Hz), 3,01 (1H, dd, J=14,5, 4,7 Hz), 3,10-3,22 (2H, m), 3,21-3,46 (2H, m), 3,57 (2H, s a), 3,61-3,75 (3H, m), 3,87 (1H, dd, J=16,8, 5,9 Hz), 4,47-4,58 (1H, m), 5,18 (1H, d, J=18,8 Hz), 5,28 (1H, d, J=19,2 Hz), 5,39 (1H, d, J=16,0 Hz), 5,45 (1H, d, J=16,0 Hz), 5,50-5,58 (1H, m), 6,55 (1H, s), 7.13- 7,28 (5H, m), 7,33 (1H, s), 7,81 (2H, d, J=10,6 Hz), 7,96 (3H, s a), 8,27-8,36 (2H, m), 8,48 (1H, t, J=5,3 Hz), 8,53 (1H, d, J=8,2 Hz). EM (IEN) m/z: 839 (M+H)+.
Procedimiento 3: N-[6-(2,5-Dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil]glicilglicil-L-fenilalanil-N-[(2S)-3-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-2-metil-3-oxopropil]glicinamida
El compuesto (100 mg, 0,105 mmol) obtenido en el Procedimiento 2 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 8 del Ejemplo 5 para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (27,0 mg, 25 %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 8: 0,86 (3H, t, J=7,2 Hz), 1,05 (3H, d, J=6,3 Hz), 1,11-1,26 (3H, m), 1,44 (4H, quint., J=7,4 Hz), 1,77-1,90 (2H, m), 2,01-2,18 (4H, m), 2,39 (3H, s), 2,76 (1H, dd, J=14,1, 8,6 Hz), 2,99 (1H, dd, J=14,3, 4,5 Hz), 3,10-3,22 (3H, m), 3,22-3,38 (3H, m), 3,39-3,82 (6H, m), 4,38-4,47 (1H, m), 5,18 (1H, d, J=18,8 Hz), 5,28 (1H, d, J=18,8 Hz), 5,41 (2H, d, J=6,6 Hz), 5,49-5,60 (1H, m), 6,53 (1H, s), 6,99 (2H, s), 7,11-7,29 (5H, m), 7,32 (1H, s), 7,73 (1H, t, J=5,5 Hz), 7,80 (1H, d, J=11,3 Hz), 7,99 (1H, t, J=5,7 Hz), 8,06 (1H, t, J=5,3 Hz), 8,13 (1H, d, J=8,6 Hz), 8,25 (1H, t, J=6,3 Hz), 8,52 (1H, d, J=8,6 Hz).
EM (IEN) m/z: 1032 (M+H)+.
Procedimiento 4: Conjugado anticuerpo-fármaco (19)
Usando el trastuzumab producido en el ejemplo de referencia 1 y el compuesto obtenido en el Procedimiento 3 anterior, el conjugado anticuerpo-fármaco titulado se obtuvo de la misma manera que el Procedimiento 6 del Ejemplo 2. Concentración de anticuerpo: 1,59 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 9,5 mg (76 %), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 3,7.
Ejemplo 20 Conjugado anticuerpo-fármaco (20)
Procedimiento 1: Conjugado anticuerpo-fármaco (20)
Usando el trastuzumab producido en ejemplo de referencia 1 y el compuesto obtenido en el Procedimiento 3 del Ejemplo 19, el conjugado anticuerpo-fármaco titulado se obtuvo de la misma manera que el Procedimiento 1 del Ejemplo 3. Concentración de anticuerpo: 1,62 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 9,7 mg (78 %), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 7,0.
Ejemplo 21 Intermedio (21)
Procedimiento 1: [(2R)-3-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-2-metil-3-oxopropil]carbamato de ferc-butilo
Se hizo reaccionar las sal del ácido metanosulfónico de exatecán (300 mg, 0,564 mmol) de la misma manera como en el Procedimiento 1 del Ejemplo 1 usando ácido (2R)-3-[(ferc-butoxicarbonil)amino]-2-metilpropiónico en lugar de ácido 4-(ferc-butoxicarbonilamino)butanoico y 3H-1,2,3-triazolo[4,5-b]piridin-3-ol en lugar de N-hidroxisuccinimida para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color blanco pálido (376 mg, cuantitativo). El compuesto se usó para la siguiente reacción sin purificación adicional. RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 8: 0,87 (3H, t, J=7,2 Hz), 1,06
(3H, d, J=6,6 Hz), 1,38 (9H, s), 1,77-1,93 (1H, m), 2,09-2,18 (2H, m), 2,40 (3H, s), 2,44-2,55 (1H, m), 2,92-3,00 (1H, m), 3,09-3,22 (3H, m), 5,12 (1H, d, J=19,2 Hz), 5,20 (1H, d, J=18,8 Hz), 5,42 (2H, s), 5,51-5,59 (1H, m), 6,54 (1H, s), 6,85 (1H, t, J=5,5 Hz), 7,30 (1H, s), 7,79 (1H, d, J=10,9 Hz), 8,44 (1H, d, J=8,6 Hz).
Procedimiento 2: (2R)-3-Amino-N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]-2-metilpropanamida
El compuesto obtenido en el Procedimiento 1 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 2 del Ejemplo 1 para producir sal del ácido trifluoroacético del compuesto del título (376 mg, 92 %, 2 etapas).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-da) 8: 0,88 (3H, t, J=7,4 Hz), 1,16 (3H, d, J=7,0 Hz), 1,86 (2H, tt, J=13,7, 6,8 Hz), 2,12-2,24 (2H, m), 2,41 (3H, s), 2,67 (1H, c, J=5,9 Hz), 2,82-2,93 (1H, m), 3,03-3,12 (1H, m), 3,13-3,22 (2H, m), 5,10 (1H, d, J=18,8 Hz), 5,24 (1H, d, J=18,8 Hz), 5,42 (2H, s), 5,58 (1H, dt, J=8,9, 4,7 Hz), 6,55 (1H, s), 7,31 (1H, s), 7,79 (3H, s a), 7,82 (1H, d, J=11,3 Hz), 8,73 (1H, d, J=8,6 Hz).
EM (IEN) m/z: 521 (M+H)+.
Ejemplo 22 Conjugado anticuerpo-fármaco (22)
[Formula 75]
Procedimiento 1: N-(terc-Butoxicarbonil)glicilglicil-L-fenilalanil-N-[(2R)-3-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-l'iidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-2-metil-3-oxopropil]glicinamida
El compuesto (296 mg, 0,466 mmol) obtenido en el Procedimiento 2 del Ejemplo 21 se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 1 del Ejemplo 2 para producir el compuesto del título (398 mg, 91 %). El compuesto se usó para la siguiente reacción sin purificación adicional.
Procedimiento 2: Glicilglicil-L-fenilalanil-N-[(2R)-3-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-2-metil-3-oxopropil]glicinamida
El compuesto obtenido en el Procedimiento 1 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 2 del Ejemplo 2 para producir sal del ácido trifluoroacético del compuesto del título (398 mg, 92 %, 2 etapas).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-da) 5: 0,87 (3H, t, J=7,2 Hz), 1,09 (3H, d, J=6,6 Hz), 1,79-1,92 (2H, m), 2,11-2,20 (2H, m), 2,40 (3H, s), 2,52-2,59 (1H, m), 2,76 (1H, dd, J=13,7, 10,2 Hz), 3,05 (1H, dd, J=13,9, 4,1 Hz), 3,12-3,19 (2H, m), 3,21 (2H, t, J=6,5 Hz), 3,58 (2H, s a), 3,64-3,79 (3H, m), 3,87 (1H, dd, J=16,6, 5,7 Hz), 4,51-4,61 (1H, m), 5,13 (1H, d, J=19,2 Hz), 5,19 (1H, d, J=18,8 Hz), 5,42 (2H, s), 5,52-5,60 (1H, m), 6,54 (1H, s), 7,15-7,29 (5H, m), 7,31 (1H, s), 7,80 (1H, d, J=11,3 Hz), 7,91 (1H, t, J=6,3 Hz), 7,96 (3H, s a), 8,31-8,38 (2H, m), 8,49 (1H, t, J=5,5 Hz), 8,56 (1H, d, J=8,6 Hz).
EM (IEN) m/z: 839 (M+H)+.
Procedimiento 3: N-[6-(2,5-Dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil]glicilglicil-L-fenilalanil-N-[(2R)-3-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-2-metil-3-oxopropil]glicinamida
El compuesto (100 mg, 0,105 mmol) obtenido en el Procedimiento 2 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 8 del Ejemplo 5 para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (27,0 mg, 25 %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 5: 0,87 (3H, t, J=7,0 Hz), 1,09 (3H, d, J=7,0 Hz), 1,13-1,26 (3H, m), 1,37-1,51 (4H, m), 1,77-1,92 (2H, m), 2,08 (2H, t, J=7,4 Hz), 2,11-2,20 (2H, m), 2,39 (3H, s), 2,79 (1H, dd, J=13,7, 9,8 Hz), 3,04 (1H, dd, J=13,7, 3,9 Hz), 3,10-3,25 (4H, m), 3,28-3,38 (2H, m), 3,50-3,80 (6H, m), 4,42-4,54 (1H, m), 5,14 (1H, d, J=19,6 Hz), 5,19 (1H, d, J=19,2 Hz), 5,42 (2H, s), 5,51-5,61 (1H, m), 6,53 (1H, s), 6,99 (2H, s), 7,13-7,28 (5H, m), 7,30 (1H, s), 7,79 (1H, d, J=10,9 Hz), 7,84 (1H, t, J=5,9 Hz), 8,01 (1H, t, J=5,7 Hz), 8,07 (1H, t, J=5,3 Hz), 8,14 (1H, d, J=7,8 Hz), 8,25 (1H, d, J=10,9 Hz), 8,54 (1H, d, J=9,0 Hz).
EM (IEN) m/z: 1032 (M+H)+.
Procedimiento 4: Conjugado anticuerpo-fármaco (22)
Usando el trastuzumab producido en el ejemplo de referencia 1 y el compuesto obtenido en el Procedimiento 3 anterior, el conjugado anticuerpo-fármaco titulado se obtuvo de la misma manera que el Procedimiento 6 del Ejemplo 2. Concentración de anticuerpo: 1,59 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 9,5 mg (76 %), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 3,8.
Ejemplo 23 Conjugado anticuerpo-fármaco (23)
Usando el trastuzumab producido en ejemplo de referencia 1 y el compuesto obtenido en el Procedimiento 3 del Ejemplo 22, el conjugado anticuerpo-fármaco titulado se obtuvo de la misma manera que el Procedimiento 1 del Ejemplo 3. Concentración de anticuerpo: 1,59 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 9,5 mg (76 %), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 6,9.
Ejemplo 24 Intermedio (24)
Procedimiento 1: (4-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-3,3-dimetil-4-oxobutil)carbamato de ferc-butilo
Se hizo reaccionar la sal del ácido metanosulfónico de exatecán (300 mg, 0,564 mmol) de la misma manera como en el Procedimiento 1 del Ejemplo 1 usando ácido 4-[(ferc-butoxicarbonil)amino]-2,2-dimetilbutanoico en lugar de ácido 4-(ferc-butoxicarbonilamino)butanoico y 3H-1,2,3-triazolo[4,5-b]piridin-3-ol en lugar de N-hidroxisuccinimida para producir el compuesto del título. El compuesto se usó para la siguiente reacción sin purificación adicional.
Procedimiento 2: 4-Amino-N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]-2,2-dimetilbutanamida, sal del ácido trifluoroacético
El compuesto obtenido en el Procedimiento 1 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 2 del Ejemplo 1 para producir el compuesto del título (358 mg, 96 %, 2 etapas).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-da) 8: 0,88 (3H, t, J=7,4 Hz), 1,21 (3H, s), 1,24 (3H, s), 1,74-1,93 (4H, m), 2,13 (2H, c, J=6,6 Hz), 2,41 (3H, d, J=1,6Hz), 2,79-2,90 (1H, m), 3,09-3,25 (2H, m), 5,10 (1H, d, J=18,4Hz), 5,19 (1H, d, J=18,4 Hz), 5,42 (2H, s), 5,55-5,63 (1H, m), 6,56 (1H, s), 7,33 (1H, s), 7,71 (3H, s a), 7,81 (1H, d, J=10,9 Hz), 8,20 (1H, d, J=8,2 Hz).
EM (IEN) m/z: 549 (M+H)+.
Ejemplo 25 Conjugado anticuerpo-fármaco (25)
[Fórmula 78]
Procedimiento 1: N-(íerc-Butoxicarbonil)gMcilglicil-L-fenilalanil-N-(4-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-3,3-dimetil-4-oxobutil)glicinamida
El compuesto (358 mg, 0,540 mmol) obtenido en el Procedimiento 2 del Ejemplo 24 se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 1 del Ejemplo 2 para producir el compuesto del título. El compuesto se usó para la siguiente reacción sin purificación adicional.
Procedimiento 2: Glicilglicil-L-fenilalanil-N-(4-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-3,3-dimetil-4-oxobutil)glicinamida, sal del ácido trifluoroacético
El compuesto obtenido en el Procedimiento 1 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 2 del Ejemplo 2 para producir el compuesto del título (576 mg, cuantitativo, 2 etapas).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-da) ó: 0,88 (3H, t, J=7,4 Hz), 1,20 (3H, s), 1,21 (3H, s), 1,64-1,71 (2H, m), 1,80-1,92 (2H, m), 2,09-2,18 (2H, m), 2,39 (3H, d, J=1,2 Hz), 2,76 (1H, dd, J=14,1, 9,8 Hz), 3,05 (2H, dd, J=14,1,4,3 Hz), 3,09-3,24 (2H, m), 3,54-3,60 (2H, m), 3,63-3,75 (3H, m), 3,82-3,91 (2H, m), 4,52-4,61 (1H, m), 5,12 (1H, d, J=18,4 Hz), 5,18 (1H, d, J=18,4 Hz), 5,42 (2H, s), 5,55-5,63 (1H, m), 6,55 (1H, s), 7,15-7,30 (5H, m), 7,32 (1H, s), 7,77-7,84 (2H, m), 7,97 (3H, d, J=7,0 Hz), 8,16 (1H, d, J=8,2 Hz), 8,29-8,37 (2H, m), 8,50 (1H, t, J=5,5 Hz).
EM (IEN) m/z: 867 (M+H)+.
Procedimiento 3: N-[6-(2,5-Dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil]glicilglicil-L-fenilalanil-N-(4-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-3,3-dimetil-4-oxobutil)glicinamida
El compuesto (100 mg, 0,102 mmol) obtenido en el Procedimiento 2 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 8 del Ejemplo 5 para producir el compuesto del título en forma de un sólido (24 mg, 22 %). RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) ó: 0,87 (3H, t, J=7,2 Hz), 1,13-1,25 (2H, m), 1,20 (3H, s), 1,21 (3H, s), 1,39-1,52 (4H, m), 1,62-1,72 (2H, m), 1,86 (2H, dt, J=14,2, 6,8 Hz), 2,09 (2H, t, J=7,4 Hz), 2,10-2,18 (2H, m), 2,39 (3H, s), 2,79 (1H,
dd, J=13,7, 9,4 Hz), 2,98-3,08 (2H, m), 3,08-3,22 (3H, m), 3,29-3,39 (2H, m), 3,53-3,79 (6H, m), 4,41-4,52 (1H, m), 5,11 (1H, d, J=18,8 Hz), 5,18 (1H, d, J=18,4 Hz), 5,42 (2H, s), 5,53-5,64 (1H, m), 6,54 (1H, s), 6,99 (2H, s), 7,14-7,29 (5H, m), 7,31 (1H, s), 7,71 (1H, t, J=5,5 Hz), 7,79 (1H, d, J=10,9 Hz), 8,03 (1H, t, J=5,9 Hz), 8,06-8,19 (3H, m), 8,24 (1H, t, J=6,1 Hz).
EM (IEN) m/z: 1060 (M+H)+.
Procedimiento 4: Conjugado anticuerpo-fármaco (25)
Usando el trastuzumab producido en el ejemplo de referencia 1 y el compuesto obtenido en el Procedimiento 3 anterior, el conjugado anticuerpo-fármaco titulado se obtuvo de la misma manera que el Procedimiento 6 del Ejemplo 2. Usando el procedimiento común B y el procedimiento común E, se obtuvieron los siguientes valores característicos.
Concentración de anticuerpo: 1,44 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 8,6 mg (69 %), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 3,3.
Ejemplo 26 Conjugado anticuerpo-fármaco (26)
Usando el trastuzumab producido en ejemplo de referencia 1 y el compuesto obtenido en el Procedimiento 3 del Ejemplo 25, el conjugado anticuerpo-fármaco titulado se obtuvo de la misma manera que el Procedimiento 1 del Ejemplo 3. Además, la solución se concentró mediante el procedimiento común A. Después de eso, usando el procedimiento común B y el procedimiento común E, se obtuvieron los siguientes valores característicos.
Concentración de anticuerpo: 1,38 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 8,3 mg (66 %), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 6,1.
Ejemplo 27 Conjugado anticuerpo-fármaco (27)
Después de enfriar una solución de tetrahidrofurano (30 ml) de N-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-p-alanina (3,1 g, 10 mmol) hasta -15 °C en una atmósfera de nitrógeno, se añadieron gota a gota N-metilmorfolina (1,2 ml, 11 mmol) y cloroformiato de etilo (1,1 ml, 11 mmol) en este orden y se agitaron a -15°C durante 10 minutos. Una solución acuosa (2 ml) de azida sódica (0,98 g, 15 mmol) se gota a gota a esta solución a -15 °C y se agitó a -15 °C durante 1 hora. La solución de reacción se cargó con una solución acuosa al 5 % de carbonato sódico y después se extrajo con cloruro de metileno. La capa orgánica se lavó con ácido cítrico al 10 % y posteriormente con agua y se secó sobre sulfato sódico anhidro y después el disolvente se retiró a presión reducida. Los residuos (sólido incoloro) obtenidos, se disolvieron en tolueno (50 ml) y se agitaron a 65 °C durante 1 hora. El disolvente se retiró a presión reducida y los residuos (sólido incoloro) obtenidos, se usaron para la siguiente reacción sin purificación.
RMN 1H (400 MHz, CDCla) 8: 3,30-3,38 (2H, m), 3,41-3,47 (2H, m), 4,21 (1H, t, J=6,6 Hz), 4,42 (2H, d, J=7,0 Hz), 5,03 (1H, s a), 7,31 (2H, t, J=7,4 Hz), 7,39 (2H, t, J=7,4 Hz), 7,57 (2H, d, J=7,4 Hz), 7,75 (2H, d, J=7,4 Hz).
Procedimiento 2: 9H-Fluoren-9-ilmetil[2-({[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]carbamoil}amino)etil]carbamato
A una solución de N,N-dimetilformamida (10 ml) del compuesto (0,36 g, 1,2mmol) obtenido en el Procedimiento 1 anterior, se le añadieron sal del ácido metanosulfónico de exatecán (0,55 g, 0,97 mmol) y N,N-diisopropiletilamina (0,33 ml, 1,9 mmol), se agitaron a 50 °C durante 1 hora, después se cargó con una solución acuosa al 10 % de bisulfato potásico y después se extrajo con acetato de etilo. La capa orgánica se lavó con agua y se secó sobre sulfato sódico anhidro, y después el disolvente se retiró a presión reducida y los residuos obtenidos se purificaron por cromatografía en columna sobre gel de sílice [cloroformo - cloroformo : metanol = 10 : 1 (v/v)] para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (0,79 g, cuantitativo).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-da) 8: 0,82 (2H, t, J=7,2 Hz), 1,73-1,86 (2H, m), 2,00-2,20 (2H, m), 2,35 (3H, s), 3,00-3,16 (5H, m), 3,17-3,27 (1H, m), 4,11-4,27 (3H, m), 5,08 (1H, d, J=19,2 Hz), 5,26-5,38 (4H, m), 5,97-6,03 (1H, m), 6,51 (1H, s), 6,67 (1H, d, J=9,0 Hz), 7,24-7,30 (2H, m), 7,32-7,39 (3H, m), 7,62 (2H, t, J=7,4 Hz), 7,72-7,82 (3H, m).
EM (CLEM) m/z: 744 (M+H)+.
Procedimiento 3: 1-(2-Aminoetil)-3-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]urea
El compuesto (0,744 g, 1,00 mmol) obtenido en el Procedimiento 2 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 2 del Ejemplo 15 para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (0,452 g, 87 %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 8: 0,65 (3H, t, J=7,2 Hz), 1,50-2,35 (3H, m), 2,23 (3H, s), 2,84-3,07 (4H, m), 3,11-3,22 (1H, m), 3,42-3,76 (3H, m), 4,40-4,46 (1H, m), 4,53-4,73 (2H, m), 4,81 (1H, d, J=19,9 Hz), 5,24-5,35 (1H, m), 6,12 (1H, s), 6,39-6,47 (1H, m), 6,56 (1H, d, J=9,8 Hz), 7,38 (1H, d, J=10,6 Hz), 7,71 (1H, s), 8,17 (1H, s).
Procedimiento 4: N-(terc-Butoxicarbonil)glicilglicil-L-fenilalanil-N-[2-({[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]carbamoil}amino)etil]glicinamida
El compuesto (0,452 g, 0,867 mmol) obtenido en el Procedimiento 3 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 1 del Ejemplo 2 para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (0,510 g, 63%).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 8: 0,87 (3H, t, J=7,2 Hz), 1,35 (9H, s), 1,77-1,94 (2H, m), 2,08-2,24 (2H, m), 2,39 (3H, s), 2,71-2,82 (1H, m), 2,98-3,80 (13H, m), 4,40-4,55 (1H, m), 5,16-5,49 (5H, m), 6,06-6,11 (1H, m), 6,53 (1H, s), 6,77 (1H, d, J=8,6 Hz), 6,96-7,03 (1H, m), 7,14-7,27 (5H, m), 7,32 (1H, s), 7,78 (1H, d, J=11,0 Hz), 7,83-7,95 (2H, m), 8,15 (1H, s), 8,29 (1H, s).
Procedimiento 5: Glicilglicil-L-fenilalanil-N-[2-({[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]carbamoil}amino)etil]glicinamida
El compuesto (0,510 g, 0,543 mmol) obtenido en el Procedimiento 4 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 2 del Ejemplo 2 para producir el compuesto del título (0,351 g, 77 %) en forma de un sólido de color amarillo pálido.
RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 8: 0,87 (3H, t, J=7,2 Hz), 1,79-1,92 (2H, m), 2,04-2,24 (2H, m), 2,39 (3H, s), 2,76 (1H, dd, J=13,7, 9,8 Hz), 3,03-3,18 (7H, m), 3,58 (2H, s a), 3,62-3,91 (4H, m), 4,50-4,58 (1H, m), 5,17-5,49 (5H, m), 6,08 6,15 (1H, m), 6,54 (1H, s), 6,79 (1H, d, J=9,0 Hz), 7,13-7,30 (5H, m), 7,32 (1H, s), 7,79 (1H, d, J=10,9 Hz), 7,91-8,03 (3H, m), 8,34 (2H, d, J=7,4 Hz), 8,49 (1H, t, J=5,7 Hz).
Procedimiento 6: N-[6-(2,5-Dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil]glicilglicil-L-fenilalanil-N-[2-({[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]carbamoil}amino)etil]glicinamida
El compuesto (84,0 mg, 0,100 mmol) obtenido en el Procedimiento 5 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 8 del Ejemplo 5 para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (75,6 mg, 73 %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 8: 0,87 (3H, t, J=7,2 Hz), 1,12-1,22 (2H, m), 1,40-1,51 (4H, m), 1,79-1,93 (2H, m), 2,03 2,22 (4H, m), 2,38 (3H, s), 2,47-3,38 (11H, m), 3,54-3,76 (6H, m), 4,42-4,52 (1H, m), 5,14-5,49 (5H, m), 6,07-6,12 (1H, m), 6,53 (1H, s), 6,77 (1H, d, J=9,0 Hz), 6,99 (1H, s), 7,19 (5H, dd, J=22,1,6,5 Hz), 7,31 (1H, s), 7,78 (1H, d, J=10,6 Hz), 7,84-7,88 (1H, m), 7,99-8,10 (2H, m), 8,14 (1H, d, J=7,8 Hz), 8,23-8,29 (1H, m).
EM (IEN) m/z: 1033 (M+H)+.
Procedimiento 7: Conjugado anticuerpo-fármaco (15)
Usando el trastuzumab producido en el ejemplo de referencia 1 y el compuesto obtenido en el Procedimiento 6 anterior, el conjugado anticuerpo-fármaco titulado se obtuvo de la misma manera que el Procedimiento 6 del Ejemplo 2. Concentración de anticuerpo: 1,65 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 9,9 mg (79 %), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 3,2.
Ejemplo 28 Conjugado anticuerpo-fármaco (28)
Usando el trastuzumab producido en ejemplo de referencia 1 y el compuesto obtenido en el Procedimiento 6 del Ejemplo 27, el conjugado anticuerpo-fármaco titulado se obtuvo de la misma manera que el Procedimiento 1 del Ejemplo 3. Concentración de anticuerpo: 1,83 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 11,0 mg (88 %), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 6,4.
Ejemplo 29 Conjugado anticuerpo-fármaco (29)
[Fórmula 82]
Procedimiento 1: (2-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}etil)carbamato de ferc-butilo
Se disolvió la sal del ácido metanosulfónico de exatecán (0,541 g, 1,00 mmol) en N,N-dimetilformamida (0,5 ml) y se cargó con cloroformo (100 ml), metanol (100 ml), N-(2-oxoetil)carbamato de ferc-butilo (0,238 g, 1,5 mmol) y ácido acético (0,086 ml, 1,5 mmol). Esta solución se cargó con triacetoxiborohidruro sódico (316 mg, 1,5 mmol) y se agitó a temperatura ambiente durante 12 horas. La solución de reacción se cargó con agua y después se extrajo con cloroformo. La capa orgánica se secó sobre sulfato sódico anhidro, y después el disolvente se retiró a presión reducida y los residuos obtenidos se purificaron por cromatografía en columna sobre gel de sílice [cloroformo - cloroformo : metanol = 10: 1 (v/v)] para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (0,20 g, 34 %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-da) ó: 0,96 (4H, t, J=7,3 Hz), 1,44 (9H, s), 1,88-2,03 (2H, m), 2,04-2,14 (1H, m), 2,23-2,37 (1H, m), 2,47 (3H, s), 2,73-2,82 (1H, m), 2,86-2,94 (1H, m), 3,08-3,17 (3H, m), 3,25-3,34 (1H, m), 4,31-4,36 (1H, m), 5,48 (2H, s), 5,52 (2H, s), 6,62 (1H, s), 6,85-6,90 (1H, m), 7,40 (1H, s), 7,84 (1H, d, J=10,7 Hz).
EM (CLEM) m/z: 579 (M+H)+.
Procedimiento 2: ((1S,9S)-1-[(2-Aminoetil)amino]-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-1,2,3,9,12,15-hexahidro-10H,13H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolina-10,13-diona
El compuesto (0,174 g, 0,300 mmol) obtenido en el Procedimiento 1 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 2 del Ejemplo 1 y el producto en bruto obtenido se usó para la siguiente reacción sin
purificación.
Procedimiento 3: N-(íerc-Butoxicarbonil)gMcilglicil-L-fenilalanil-N-(2-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}etil)glicinamida
El producto en bruto obtenido en el Procedimiento 2 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 1 del Ejemplo 2, y el producto en bruto obtenido se usó para la siguiente reacción sin purificación.
Procedimiento 4: Glicilglicil-L-fenilalanil-N-(2-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}etil)glicinamida
El producto en bruto obtenido en el Procedimiento 3 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 2 del Ejemplo 2, y el producto en bruto obtenido se usó para la siguiente reacción sin purificación.
Procedimiento 5: N-[6-(2,5-Dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil]glicilglicil-L-fenilalanil-N-(2-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}etil)glicinamida
El producto en bruto obtenido en el Procedimiento 4 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 8 del Ejemplo 5 para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (42,2 mg, 14 %, 4 etapas).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-da) 8: 0,86 (3H, t, J=7,2 Hz), 1,11-1,20 (2H, m), 1,38-1,50 (4H, m), 1,79-1,92 (2H, m), 2,02 2,25 (5H, m), 2,38 (3H, s), 2,69-3,39 (10H, m), 3,53-3,77 (6H, m), 4,21-4,31 (1H, m), 4,42-4,51 (1H, m), 5,31-5,55 (4H, m), 6,54 (1H, s), 6,99 (2H, s), 7,12-7,28 (5H, m), 7,32 (1H, s), 7,65-7,71 (1H, m), 7,75 (1H, d, J=10,9 Hz), 7,98-8,10 (2H, m), 8,16 (1H, d, J=7,4 Hz), 8,39 (1H, t, J=6,1 Hz).
EM (IEN) m/z: 990 (M+H)+.
Procedimiento 6: Conjugado anticuerpo-fármaco (29)
Usando el trastuzumab producido en el ejemplo de referencia 1 y el compuesto obtenido en el Procedimiento 5 anterior, el conjugado anticuerpo-fármaco titulado se obtuvo de la misma manera que el Procedimiento 6 del Ejemplo 2. Concentración de anticuerpo: 1,75mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 10,5 mg (84%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 3,9.
Ejemplo 30 Conjugado anticuerpo-fármaco (30)
Usando el trastuzumab producido en ejemplo de referencia 1 y el compuesto obtenido en el Procedimiento 5 del Ejemplo 29, el conjugado anticuerpo-fármaco titulado se obtuvo de la misma manera que el Procedimiento 1 del
Ejemplo 3. Concentración de anticuerpo: 1,70 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 10,2 mg (82 %), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 7,6.
Ejemplo 31 Conjugado anticuerpo-fármaco (31)
Procedimiento 1: (4-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}butil)imidodicarbonato de di-ferc-butilo
Se hizo reaccionar la sal del ácido metanosulfónico de exatecán (2,13 g, 4,00 mmol) de la misma manera como en el Procedimiento 1 del Ejemplo 29 usando (4-oxobutil)imidodicarbonato de di-ferc-butilo en lugar de N-(2-oxoetil)carbamato de ferc-butilo para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (1,73 g, 61%).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-da) 8: 0,87 (4H, t, J=7,2 Hz), 1,39 (18H, s), 1,60-1,34 (4H, m), 1,80-1,93 (2H, m), 1,96-2,05 (1H, m), 2,19-2,30 (1H, m), 2,37 (3H, s), 2,61-2,71 (1H, m), 2,73-2,83 (1H, m), 2,96-3,06 (1H, m), 3,17-3,26 (1H, m), 3,42-3,51 (2H, m), 4,19-4,25 (1H, m), 5,29-5,46 (4H, m), 6,52 (1H, s), 7,30 (1H, s), 7,74 (1H, d, J=11,3 Hz).
Procedimiento 2: (1S,9S)-1-[(4-Aminobutil)amino]-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-1,2,3,9,12,15-hexahidro-10H,13H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolina-10,13-diona
El compuesto (0,283 g, 0,400 mmol) obtenido en el Procedimiento 1 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 2 del Ejemplo 1, y el producto en bruto obtenido se usó durante el siguiente procedimiento sin purificación.
Procedimiento 3: N-(íerc-Butoxicarbonil)gMcilglicil-L-fenilalanil-N-(4-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}butil)glicinamida El producto en bruto obtenido en el Procedimiento 2 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 1 del Ejemplo 2, y el producto en bruto obtenido se usó para la siguiente reacción sin purificación. Procedimiento 4: Glicilglicil-L-fenilalanil-N-(4-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}butil)glicinamida
El producto en bruto obtenido en el Procedimiento 3 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 2 del Ejemplo 2, y el producto en bruto obtenido se usó para la siguiente reacción sin purificación. Procedimiento 5: N-[6-(2,5-Dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil]glicilglicil-L-fenilalanil-N-(4-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}butil)glicinamida
El producto en bruto obtenido en el Procedimiento 4 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 8 del Ejemplo 5 para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (53,7 g, 13 %, 4 etapas).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-da) 8: 0,87 (3H, t, J=6,6 Hz), 1,14-1,28 (2H, m), 1,40-1,56 (8H, m), 1,81-1,92 (2H, m), 1,97 2,28 (5H, m), 2,37 (3H, s), 2,46-3,42 (10H, m), 3,51-3,80 (6H, m), 4,19-4,26 (1H, m), 4,41-4,50 (1H, m), 5,29-5,48 (4H, m), 6,54 (1H, s), 6,99 (2H, s), 7,09-7,28 (5H, m), 7,31 (1H, s), 7,61-7,69 (1H, m), 7,74 (1H, d, J=11,3 Hz), 7,99-8,17 (3H, m), 8,24 (1H, s).
EM (IEN) m/z: 1018 (M+H)+.
Procedimiento 6: Conjugado anticuerpo-fármaco (31)
Usando el trastuzumab producido en el ejemplo de referencia 1 y el compuesto obtenido en el Procedimiento 5 anterior, el conjugado anticuerpo-fármaco titulado se obtuvo de la misma manera que el Procedimiento 6 del Ejemplo 2. Concentración de anticuerpo: 1,81 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 10,9 mg (87%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 3,9.
Ejemplo 32 Conjugado anticuerpo-fármaco (32)
Procedimiento 1: Conjugado anticuerpo-fármaco (32)
Usando el trastuzumab producido en ejemplo de referencia 1 y el compuesto obtenido en el Procedimiento 5 del Ejemplo 31, el conjugado anticuerpo-fármaco titulado se obtuvo de la misma manera que el Procedimiento 1 del
Ejemplo 3. Concentración de anticuerpo: 1,77 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 10,6 mg (85 %), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 7,6.
Ejemplo 33 Intermedio (33)
[Formula 86]
Procedimiento 1: N-{2-[(terc-butoxicarbonil)amino]etil}glicinato de bencilo
Se disolvió N-(2-aminoetil)carbamato de terc-butilo (3,00 g, 18,7 mmol) en acetonitrilo (10,0 ml), se cargó con carbonato potásico (2,59 g, 18,7 mmol) y 2-bromoacetato de bencilo (1,46 ml, 9,36 mmol) y se agitó a temperatura ambiente durante 1 día. La solución de reacción se filtró y el disolvente en el obtenido en el filtrado se retiró a presión reducida. Los residuos obtenidos se purificaron por cromatografía en columna sobre gel de sílice [cloroformo -cloroformo : metanol = 8 : 2 (v/v)] para producir el compuesto del título en forma de una sustancia oleosa incolora (1,71 g, 59 %).
RMN 1H (400 MHz, CDCla) 8: 1,44 (9H, s), 2,72 (2H, t, J=5,7 Hz), 3,19 (2H, c, J=5,7 Hz), 3,43 (2H, s), 4,68 (1H, s), 5,16 (2H, s), 7,34-7,36 (6H, m).
EM (CLEM) m/z: 309 (M+H)+.
Procedimiento 2: N-{2-[(terc-butoxicarbonil)amino]etil}-N-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]glicinato de bencilo
El compuesto (0,370 g, 1,19 mmol) obtenido en el Procedimiento 1 anterior se disolvió en 1,4-dioxano (5,00 ml). Después de añadir diisopropiletilamina (2,00 ml, 11,9 mmol) y cloroformiato de 9-fluorenilmetilo (1,23 g, 4,76 mmol), se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas. El disolvente se retiró a presión reducida y los residuos obtenidos se purificaron por cromatografía en columna sobre gel de sílice [hexano - hexano / acetato de etilo = 1 : 1 (v/v)] para producir el compuesto del título en forma de una sustancia oleosa incolora (0,479 g, 76 %).
RMN 1H (400 MHz, CDCla) 8: 1,40-1,43 (9H, m), 2,99-3,25 (2H, m), 3,34-3,40 (2H, m), 3,95-4,01 (2H, m), 4,08-4,24 (1H, m), 4,38 (1H, d, J=6,6 Hz), 4,52 (1H, d, J=6,3 Hz), 5,10-5,16 (2H, m), 7,24-7,41 (9H, m), 7,50 (1H, d, J=7,4 Hz), 7,56 (1H, d, J=7,4 Hz), 7,73 (1H, d, J=7,4 Hz), 7,76 (1H, d, J=7,4 Hz).
Procedimiento 3: N-{2-[(terc-Butoxicarbonil)amino]etil}-N-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]glicina
El compuesto (461 mg, 0,868 mmol) obtenido en el Procedimiento 2 anterior se disolvió en metanol (5,00 ml). Después de añadir una cantidad catalítica de un catalizador de paladio sobre carbono, se agitó en una atmósfera de hidrógeno durante 1 hora. Después de la filtración a través de una capa de celite, el disolvente en el filtrado se retiró a presión reducida. Los residuos obtenidos se purificaron mediante cromatografía en columna de gel de sílice [cloroformo - capa orgánica repartida de cloroformo : metanol : agua = 7: 3 : 1 (v/v/v)] para producir el compuesto del título en forma de una sustancia oleosa incolora (236 mg, 62 %).
RMN 1H (400 MHz, CDCh) 8: 1,36 (9H, s), 3,00-3,02 (1H, m), 3,24-3,27 (2H, m), 3,41-3,43 (1H, m), 3,67-3,69 (1H, m), 3,90-3,95 (2H, m), 4,17-4,20 (1H, m), 4,34-4,43 (2H, m), 7,29-7,33 (4H, m), 7,52-7,54 (2H, m), 7,71 (2H, d, J=7,0 Hz). EM (CLEM) m/z: 439 (M-H)'.
Procedimiento 4: 9H-Fluoren-9-ilmetil{2-[(terc-butoxicarbonil)amino]etil}(2-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-2-oxoetil)carbamato
Se hizo reaccionar la sal del ácido metanosulfónico de exatecán (230 mg, 0,435 mmol) de la misma manera como en el Procedimiento 1 del Ejemplo 1 usando el compuesto (228 mg, 0,519 mmol) obtenido en el Procedimiento 3 anterior en lugar de ácido 4-(terc-butoxicarbonilamino)butanoico para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo (336 mg, 90 %).
RMN 1H (400 MHz, CD3OD) 8: 0,89-0,97 (3H, m), 1,35-1,40 (9H, m), 1,77-1,79 (2H, m), 2,16-2,23 (2H, m), 2,29 (3H, s), 2,62 (1H, s), 3,12-3,22 (4H, m), 3,36-3,52 (1H, m), 3,88-4,17 (3H, m), 4,32-4,36 (2H, m), 4,67-4,81 (2H, m), 5,03 5,38 (2H, m), 5,59 (1H, dd, J=20,1, 15,1 Hz), 6,69 (1H, t, J=7,6 Hz), 7,03 (1H, dt, J=28,0, 7,5 Hz), 7,16-7,57 (6H, m), 7,69 (1H, d, J=7,4 Hz), 7,96 (1H, s).
EM (CLEM) m/z: 858 (M+H)+.
Procedimiento 5: (2-aminoetil)(2-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-2-oxoetil)carbamato de 9H-Fluoren-9-ilmetilo
El compuesto (347 mg, 0,404 mmol) obtenido en el Procedimiento 4 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 2 del Ejemplo 1 para producir sal del ácido trifluoroacético del compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo (307 mg, cuantitativo). RMN 1H (400 MHz, CDCla) 8: 1,05 (3H, t, J=7,4 Hz), 1,85-1,92 (2H, m), 2,29-2,32 (2H, m), 2,45 (3H, s), 2,82-2,84 (1H, m), 3,25-3,28 (2H, m), 3,58-3,65 (1H, m), 3,98-4,12 (3H, m), 4.30- 4,33 (2H, m), 4,55-4,62 (2H, m), 4,89-5,41 (4H, m), 5,60-5,72 (1H, m), 6,83 (1H, t, J=7,4 Hz), 7,12-7,19 (1H, m), 7.30- 7,65 (7H, m), 7,81 (1H, d, J=7,4 Hz). EM (CLEM) m/z: 758 (M+H)+.
Procedimiento 6: N2-(2-Aminoetil)-N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]glicinamida
El compuesto (191 mg, 0,253 mmol) obtenido en el Procedimiento 5 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 6 del Ejemplo 15 para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (97,7 mg, 72 %).
RMN 1H (DMSO-d6) 8: 0,87 (3H, t, J=7,2 Hz), 1,84-1,87 (2H, m), 2,16-2,17 (2H, m), 2,38 (3H, s), 2,76 (2H, t, J=5,5 Hz), 2,86-2,87 (2H, m), 3,00-3,02 (2H, m), 3,17-3,18 (2H, m), 3,26-3,28 (2H, m), 3,35 (2H, s a), 5,19 (2H, s), 5,42 (2H, s), 5,58-5,60 (1H, m), 7,31 (1H, s), 7,78 (1H, d, J=11,0 Hz), 8,57 (1H, d, J=9,0 Hz).
EM (CLEM) m/z: 758 (M+H)+.
Ejemplo 34 Conjugado anticuerpo-fármaco (34)
A una solución de diclorometano (50,0 ml) de N-[(9H-fluoren-9-Mmetoxi)carbonil]glicilgMcil-L-fenMalanina (Patente japonesa abierta a inspección pública n.° 2002-60351; 5,43 g, 10,8 mmol), 1-hidroxibenzotriazol (2,93 g, 21,7 mmol), clorhidrato del éster ferc-butílico de glicina (2,72 g, 16,2 mmol) y trietilamina (3,02 ml, 21,7 mmol), se le añadió clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (4,15 g, 21,7 mmol) y se agitó a temperatura ambiente durante 20 horas. Después de añadir una solución acuosa al 10 % de ácido cítrico (100 ml), se extrajo con cloroformo (100 ml) 3 veces y la capa orgánica se secó sobre sulfato sódico anhidro. Después de retirar el disolvente a presión reducida, los residuos obtenidos se purificaron por cromatografía en columna sobre gel de sílice [cloroformo -cloroformo : metanol = 8 : 2 (v/v)] para producir el compuesto del título en forma de un sólido incoloro (6,02 g, cuantitativo).
RMN 1H (DMSO-da) 8: 1,40 (9H, s), 2,76 (1H, dd, J=13,7, 10,6 Hz), 3,05 (1H, dd, J=13,7, 3,9 Hz), 3,55-3,80 (6H, m), 4,21-4,31 (3H, m), 4,52 (1H, td, J=9,3, 3,4 Hz), 7,19-7,26 (5H, m), 7,32 (2H, t, J=7,4 Hz), 7,42 (2H, t, J=7,4 Hz), 7,60 (1H, t, J=5,9 Hz), 7,71 (2H, d, J=7,0 Hz), 7,89 (2H, d, J=7,8 Hz), 8,00 (1H, t, J=5,3 Hz), 8,14 (1H, d, J=8,2 Hz), 8,39 (1H, t, J=5,7 Hz).
EM (CLEM) m/z: 615 (M+H)+.
Procedimiento 2: N-[(9H-Fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]glicilglicil-L-fenilalanilglicina
El compuesto (5,00 g, 8,13 mmol) obtenido en el Procedimiento 1 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 2 del Ejemplo 2 para producir el compuesto del título (4,47 g, 98 %). RMN 1H (DMSO-d6) 8: 2,76 (1H, dd, J=13,7, 10,2 Hz), 3,05 (1H, dd, J=13,7, 3,9 Hz), 3,55-3,79 (7H, m), 4,21-4,30 (3H, m), 4,54 (1H, td, J=9,0, 3,7 Hz), 7,16-7,25 (5H, m), 7,33 (2H, t, J=7,4 Hz), 7,42 (2H, t, J=7,4 Hz), 7,59 (1H, t, J=5,7 Hz), 7,71 (2H, d, J=7,4 Hz), 7,89 (2H, d, J=7,4 Hz), 8,00 (1H, t, J=5,3 Hz), 8,13 (1H, d, J=8,6 Hz), 8,38 (1H, t, J=5,7 Hz).
EM (CLEM) m/z: 559 (M+H)+.
Procedimiento 3: N-[(9H-Fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]glicilglicil-L-fenilalanil-N-(2-{(2-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-2-oxoetil)[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]amino}etil)glicinamida
El compuesto (200 mg, 0,264 mmol) obtenido en el Procedimiento 5 del Ejemplo 33 se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 1 del Ejemplo 2 usando el compuesto (177 mg, 0,317 mmol) obtenido en el Procedimiento 2 anterior en lugar de N-(ferc-butoxicarbonil)glicilglicil-L-fenilalanilglicina para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (297 mg, 87 %). RMN 1H (400 MHz, DMsO-d6) 8: 0,80-0,86 (3H, m), 1,75-1,82 (2H, m), 2,10-2,12 (2H, m), 2,35-2,38 (4H, m), 2,75-2,81 (2H, m), 3,00-3,17 (7H, m), 3,58-3,86 (8H, m), 4,18-4,28 (4H, m), 4,47-4,49 (1H, m), 5,14-5,23 (2H, m), 5,33-5,38 (2H, m), 5,56-5,58 (1H, m), 6,52-6,53 (1H, m), 7,17 7,43 (17H, m), 7,59-7,62 (2H, m), 7,69-7,71 (2H, m), 7,80-7,90 (4H, m), 8,01-8,03 (1H, m), 8,14-8,16 (1H, m), 8,29 8,32 (1H, m), 8,50-8,54 (1H, m).
EM (CLEM) m/z: 1298 (M+H)+.
Procedimiento 4: Glicilglicil-L-fenilalanil-N-{2-[(2-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7jindolizino[1,2-bJquinolin-1-il]amino}-2-oxoetil)amino]etil}glicinamida
El compuesto (297 mg, 0,229 mmol) obtenido en el Procedimiento 3 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 2 del Ejemplo 5 para producir el compuesto del título (95,6 mg, 49 %) en forma de un sólido de color amarillo pálido.
RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 8: 0,86 (3H, t, J=7,2 Hz), 1,82-1,89 (2H, m), 2,15-2,17 (2H, m), 2,29-2,31 (1H, m), 2,38 (3H, s), 2,60 (2H, t, J=6,1 Hz), 2,76 (1H, dd, J=15,1, 11,1 Hz), 3,00 (1H, dd, J=14,1,4,3 Hz), 3,15-3,18 (5H, m), 3,27 3,46 (3H, m), 3,55-3,80 (6H, m), 4,46 (1H, dd, J=8,2, 4,3 Hz), 5,20 (2H, s), 5,43 (2H, s), 5,58 (1H, d, J=7,8 Hz), 6,54 (1H, s), 7,19-7,24 (5H, m), 7,31 (1H, s), 7,74-7,78 (2H, m), 8,23-8,31 (3H, m), 8,51 (1H, d, J=8,6 Hz).
EM (CLEM) m/z: 854 (M+H)+.
Procedimiento 5: N-[6-(2,5-Dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil]glicilglicil-L-fenilalanil-N-{2-[(2-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-2-oxoetil)amino]etil}glicinamida
El compuesto (90,0 mg, 0,105 mmol) obtenido en el Procedimiento 4 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 6 del Ejemplo 15 para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (60,1 mg, 55 %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 8: 0,81 (3H, t, J=7,2 Hz), 1,13-1,14 (2H, m), 1,39-1,40 (4H, m), 1,78-1,82 (2H, m), 2,03 (2H, t, J=7,2 Hz), 2,09-2,12 (2H, m), 2,31 (3H, s), 2,57-2,59 (2H, m), 2,72-2,75 (1H, m), 2,92-2,96 (1H, m), 3,08-3,30 (8H, m), 3,57-3,65 (6H, m), 4,38-4,39 (1H, m), 5,12 (2H, s), 5,36 (2H, s), 5,51-5,53 (1H, m), 6,48 (1H, s), 6,93 (2H, s), 7,13-7,18 (5H, m), 7,24 (1H, s), 7,62 (1H, t, J=5,9 Hz), 7,71 (1H, d, J=10,9 Hz), 7,89 (1H, s), 7,97 (1H, t, J=5,5 Hz), 8,04 (1H, t, J=5,7 Hz), 8,08 (1H, d, J=7,8 Hz), 8,19 (1H, t, J=5,5 Hz), 8,43 (1H, d, J=9,0 Hz).
EM (CLEM) m/z: 1047 (M+H)+.
Procedimiento 6: Conjugado anticuerpo-fármaco (34)
Usando el trastuzumab producido en el ejemplo de referencia 1 y el compuesto obtenido en el Procedimiento 5 anterior, el conjugado anticuerpo-fármaco titulado se obtuvo de la misma manera que el Procedimiento 6 del Ejemplo 2. Concentración de anticuerpo: 1,51 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 9,1 mg (73 %), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 3,2.
Ejemplo 35 Conjugado anticuerpo-fármaco (35)
Usando el trastuzumab producido en el ejemplo de referencia 1 y el compuesto obtenido en el Procedimiento 5 del Ejemplo 34 anterior, el conjugado anticuerpo-fármaco titulado se obtuvo de la misma manera que el Procedimiento 1 del Ejemplo 3. Concentración de anticuerpo: 1,58 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 9,5 mg (76%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 5,9.
Ejemplo 36 Intermedio (36)
El compuesto (335 mg, 1,09 mmol) obtenido en el Procedimiento 1 del Ejemplo 33 se disolvió en diclorometano (5,00 ml). Después de añadir diisopropiletilamina (0,379 ml, 2,18 mmol) y yodometano (0,102 ml, 1,63 mmol), se agitó a temperatura ambiente durante 1 día. El disolvente se retiró a presión reducida y los residuos obtenidos se purificaron por cromatografía en columna sobre gel de sílice [cloroformo : metanol = 9 : 1 (v/v)] para producir el compuesto del título en forma de una sustancia oleosa incolora (319 mg, 91 %).
RMN 1H (400 MHz, CDCla) 8: 1,44 (9H, s), 2,37 (3H, s), 2,63 (2H, t, J=5,9 Hz), 3,19 (2H, c, J=5,3 Hz), 3,32 (2H, s), 5,15 (2H, s), 7,31-7,33 (5H, m).
EM (CLEM) m/z: 323 (M+H)+.
Procedimiento 2: N-{2-[(terc-Butoxicarbonil)amino]etil}-N-metilglicina
El compuesto (319 mg, 0,990 mmol) obtenido en el Procedimiento 1 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 3 del Ejemplo 33 para producir el compuesto del título en forma de una sustancia oleosa incolora (203 mg, 88 %).
RMN 1H (400 MHz, CDCla) 8: 1,42 (9H, s), 2,91 (3H, s a), 3,28 (2H, s a), 3,51 (2H, s a), 3,70 (2H, s a).
EM (CLEM) m/z: 233 (M+H)+.
Procedimiento 3: {2-[(2-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-2-oxoetil)(metil)amino]etil}carbamato de ferc-butilo
Se hizo reaccionar la sal del ácido metanosulfónico de exatecán (385 mg, 0,724 mmol) de la misma manera como en el Procedimiento 1 del Ejemplo 1 usando el compuesto (202 mg, 0,869 mmol) obtenido en el Procedimiento 2 anterior en lugar de ácido 4-(ferc-butoxicarbonilamino)butanoico para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo (332 mg, 71 %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-da) 8: 0,88 (3H, t, J=7,8 Hz), 1,37 (9H, s), 1,83-1,90 (2H, m), 2,11-2,14 (2H, m), 2,33 (3H, s), 2,39 (3H, s), 2,92-3,59 (8H, m), 4,26 (1H, s), 5,21 (1H, s), 5,27 (1H, s), 5,38 (2H, s), 5,55 (1H, s), 6,53 (1H, s), 7,30 (1H, s), 7,76 (1H, d, J=10,9 Hz), 8,57 (1H, d, J=9,0 Hz).
EM (CLEM) m/z: 650 (M+H)+.
Procedimiento 4: N2-(2-Aminoetil)-N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]-N2-metilglicinamida
El compuesto (340 mg, 0,523 mmol) obtenido en el Procedimiento 3 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 2 del Ejemplo 1 para producir sal del ácido trifluoroacético del compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo (289 mg, cuantitativo). RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 8: 0,87 (3H, t, J=7,4 Hz), 1,86 (2H, tt, J=21,1,7,1 Hz), 2,16-2,24 (2H, m), 2,40 (3H, s), 2,59 (2H, s a), 3,08 (3H, s a), 3,17-3,19 (2H, m), 3,70 (4H, s a), 5,21 (1H, d, J=18,8 Hz), 5,27 (1H, d, J=19,2 Hz), 5,42 (2H, s), 5,60-5,64 (1H, m), 6,57 (1H, s a), 7,32 (1H, s), 7,81 (1H, d, J=11,0 Hz), 7,95 (3H, s a), 8,88 (1H, s a).
EM (CLEM) m/z: 550 (M+H)+.
Ejemplo 37 Conjugado anticuerpo-fármaco (37)
[Fórmula 90]
Procedimiento 1: N-(ferc-Butoxicarbonil)glicilglicil-L-fenilalanil-N-{2-[(2-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-2-oxoetil)(metil)amino]etil}glicinamida
El compuesto (200 mg, 0,364 mmol) obtenido en el Procedimiento 4 del Ejemplo 36 se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 1 del Ejemplo 2 para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (140 mg, 40 %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-da) 8: 0,86 (3H, t, J=7,2 Hz), 1,36 (9H, s), 1,81-1,84 (2H, m), 2,15-2,18 (2H, m), 2,28 (3H, s), 2,37 (3H, s), 2,90-3,22 (7H, m), 3,40-3,86 (9H, m), 4,37-4,38 (1H, m), 5,20 (2H, s), 5,42 (2H, s), 5,56-5,59 (1H, m), 6,53 (1H, s), 7,01 (1H, t, J=6,1 Hz), 7,17-7,25 (5H, m), 7,30 (1H, s), 7,62 (1H, t, J=5,7 Hz), 7,78 (1H, d, J=10,9 Hz), 7,92 (1H, t, J=5,5 Hz), 8,15-8,24 (2H, m), 8,45 (1H, d, J=9,0 Hz).
EM (CLEM) m/z: 968 (M+H)+.
Procedimiento 2: Glicilglicil-L-fenilalanil-N-{2-[(2-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-2-oxoetil)(metil)amino]etil}glicinamida
El compuesto (140 mg, 0,145 mol) obtenido en el Procedimiento 1 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 2 del Ejemplo 2 para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (113 mg, 90 %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 8: 0,86 (3H, t, J=7,2 Hz), 1,85-1,88 (2H, m), 2,20-2,29 (2H, m), 2,42 (3H, s), 2,75-2,77 (2H, m), 2,89 (3H, s), 3,01-3,04 (2H, m), 3,34-3,45 (4H, m), 3,56-3,57 (4H, m), 3,64-3,72 (4H, m), 3,85 (2H, dd, J=14,3, 5,7 Hz), 4,54-4,59 (1H, m), 5,24 (1H, d, J=18,0 Hz), 5,34 (1H, d, J=20,3 Hz), 5,43 (2H, s), 5,62-5,68 (1H, m), 6,58 (1H, s), 7,19-7,27 (5H, m), 7,33 (1H, s), 7,84 (1H, d, J=10,9 Hz), 7,98 (3H, s a), 8,33 (1H, d, J=8,2 Hz), 8,41 (1H, s), 8,50 (1H, t, J=5,3 Hz).
EM (CLEM) m/z: 868 (M+H)+.
Procedimiento 3: N-[6-(2,5-Dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil]glicilglicil-L-fenilalanil-N-{2-[(2-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-2-oxoetil)(metil)amino]etil}glicinamida
El compuesto (110 mg, 0,126 mmol) obtenido en el Procedimiento 2 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 8 del Ejemplo 5 para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (41,1 mg, 31 %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 8: 0,86 (3H, s), 1,17-1,19 (2H, m), 1,44-1,47 (6H, m), 1,83-1,85 (2H, m), 2,08-2,16 (3H, m), 2,27-2,30 (2H, m), 2,38 (3H, s), 2,59 (3H, s), 2,78-2,80 (2H, m), 2,91 (2H, s), 3,17 (4H, s), 3,55 (7H, t, J=40,5 Hz), 4,37-4,40 (1H, m), 5,21 (2H, s), 5,42 (2H, s), 5,56-5,59 (1H, m), 6,52 (1H, s), 6,99 (2H, s), 7,17-7,21 (5H, m), 7,31 (1H, s), 7,61 (1H, s), 7,78 (1H, d, J=9,8 Hz), 8,01-8,08 (2H, m), 8,20 (1H, s), 8,32 (1H, s), 8,45 (1H, s).
EM (CLEM) m/z: 1061 (M+H)+.
Procedimiento 4: Conjugado anticuerpo-fármaco (37)
Usando el trastuzumab producido en el ejemplo de referencia 1 y el compuesto obtenido en el Procedimiento 3 anterior, el conjugado anticuerpo-fármaco titulado se obtuvo de la misma manera que el Procedimiento 6 del Ejemplo 2. Concentración de anticuerpo: 1,46 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 8,8 mg (60 %), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 3,1.
Ejemplo 38 Conjugado anticuerpo-fármaco (38)
Procedimiento 1: Conjugado anticuerpo-fármaco (38)
Usando el trastuzumab producido en ejemplo de referencia 1 y el compuesto obtenido en el Procedimiento 3 del Ejemplo 37, el conjugado anticuerpo-fármaco titulado se obtuvo de la misma manera que el Procedimiento 1 del Ejemplo 3. Concentración de anticuerpo: 1,44 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 8,6 mg (69 %), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 6,1.
Ejemplo 39 Intermedio (39)
El compuesto (299 mg, 0,970 mmol) obtenido en el Procedimiento 1 del Ejemplo 33 se disolvió en dimetilformamida (5,00 ml). Después de añadir carbonato potásico (268 mg, 1,94 mmol) y 2-(2-bromoetoxi)tetrahidropirano (0,232 ml,
1.45 mmol), se agitó a 60 °C durante 3 días. La solución de reacción se filtró y el disolvente en el obtenido en el filtrado se retiró a presión reducida. Los residuos obtenidos se purificaron por cromatografía en columna sobre gel de sílice [hexano : acetato de etilo = 9 : 1 (v/v) - hexano : acetato de etilo = 1 : 1 (v/v)] para producir el compuesto del título en forma de una sustancia oleosa incolora (121 mg, 29 %).
RMN 1H (400 MHz, CDCls) 8: 1,44 (9H, s), 1,47-1,81 (6H, m), 2,80-2,83 (2H, m), 2,89 (2H, t, J=5,5 Hz), 3,17 (2H, s), 3.46 (2H, dc, J=18,5, 4,4 Hz), 3,52 (2H, s), 3,76-3,86 (2H, m), 4,58 (1H, t, J=3,5 Hz), 5,14 (2H, s), 5,47 (1H, s a), 7,31 7,35 (5H, m).
EM (CLEM) m/z: 437 (M+H)+.
Procedimiento 2: N-{2-[(terc-Butoxicarbonil)amino]etil}-N-[2-(tetrahidro-2H-piran-2-iloxi)etil]glicina
El compuesto (823 mg, 1,89 mmol) obtenido en el Procedimiento 1 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 3 del Ejemplo 33 para producir el compuesto del título en forma de una sustancia oleosa incolora (616 mg, 94 %).
RMN 1H (400 MHz, CDCla) 8: 1,43 (9H, s), 1,54-1,81 (6H, m), 3,28-3,67 (8H, m), 3,74-4,00 (4H, m), 4,62 (1H, s), 6,35 (1H, s), 9,76 (1H, s).
EM (CLEM) m/z: 347 (M+H)+.
Procedimiento 3: (2-{(2-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-2-oxoetil)[2-(tetrahidro-2H-piran-2-iloxi)etil]amino}etil)carbamato de terc-butilo
Se hizo reaccionar la sal del ácido metanosulfónico de exatecán (780 mg, 1,47 mmol) de la misma manera como en el Procedimiento 1 del Ejemplo 1 usando el compuesto (610 mg, 1,76 mmol) obtenido en el Procedimiento 2 anterior en lugar de ácido 4-(terc-butoxicarbonilamino)butanoico para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo (874 mg, 78 %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 8: 0,87 (3H, s), 1,29-1,59 (15H, m), 1,84-1,87 (2H, m), 2,16-2,18 (2H, m), 2,40 (3H, s), 2,62-2,97 (6H, m), 3,48-3,81 (8H, m), 4,34-4,56 (1H, m), 5,20 (2H, s), 5,42 (2H, s), 5,60 (1H, s), 6,55 (1H, s), 6,69 (1H, s), 7,31 (1H, s), 7,80 (1H, d, J=10,6 Hz), 8,32 (1H, s).
EM (CLEM) m/z: 764 (M+H)+.
Procedimiento 4: N2-(2-Aminoetil)-N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]-N2-(2-hidroxietil)glicinamida
El compuesto (707 mg, 0,926 mmol) obtenido en el Procedimiento 3 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 2 del Ejemplo 1 para producir sal del ácido trifluoroacético del compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo (524 mg, 98 %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 8: 0,87 (3H, t, J=7,2 Hz), 1,81-1,91 (2H, m), 2,17-2,18 (2H, m), 2,39 (3H, s), 2,75-3,00 (6H, m), 3,34-4,02 (6H, m), 5,23 (2H, s), 5,42 (2H, s), 5,57-5,59 (1H, m), 6,56 (1H, s), 7,31 (1H, s), 7,70-7,84 (4H, m), 8,69-8,77 (1H, m).
EM (CLEM) m/z: 580 (M+H)+.
Ejemplo 40 Conjugado anticuerpo-fármaco (40)
[Fórmula 93]
Procedimiento 1: N-(ferc-Butoxicarbonil)glicilglicil-L-fenilalanil-N-{2-[(2-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indoNzino[1,2-b]quinoNn-1-N]amino}-2-oxoetN)(2-hidroxietil)amino]etil}glicinamida
El compuesto (200 mg, 0,345 mmol) obtenido en el Procedimiento 4 del Ejemplo 39 se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 1 del Ejemplo 2 para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo (198 mg, 57 %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-da) ó: 0,87 (3H, t, J=7,0 Hz), 1,38 (9H, s), 1,84-1,87 (2H, m), 2,12-2,14 (2H, m), 2,33-2,38 (2H, m), 2,40 (3H, s), 3,16-3,17 (8H, m), 3,54-3,60 (3H, m), 3,62-3,65 (2H, m), 3,73-3,78 (2H, m), 3,86 (2H, d, J=5,9 Hz), 4,10-4,12 (1H, m), 4,52-4,55 (2H, m), 5,22 (2H, s), 5,43 (2H, s), 5,57-5,59 (1H, m), 6,54 (1H, s), 7,01 (1H, s), 7,18-7,26 (5H, m), 7,31 (1H, s), 7,89-7,92 (2H, m), 8,17-8,19 (2H, m), 8,49-8,51 (2H, m).
EM (CLEM) m/z: 998 (M+H)+.
Procedimiento 2: Glicilglicil-L-fenilalanil-N-{2-[(2-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indoNzino[1,2-b]quinoNn-1-N]amino}-2-oxoetN)(2-hidroxietil)amino]etil}glicinamida
El compuesto (198 mg, 0,198 mmol) obtenido en el Procedimiento 1 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 2 del Ejemplo 2 para producir sal del ácido trifluoroacético del compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo (59,5 mg, 34 %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) ó: 0,87 (3H, t, J=7,2 Hz), 1,85-1,86 (2H, m), 2,16-2,33 (2H, m), 2,40 (3H, s), 2,80-2,94 (8H, m), 3,34-4,11 (10H, m), 4,53-4,56 (2H, m), 5,26-5,28 (2H, m), 5,43 (2H, s), 5,59-5,61 (1H, m), 6,57 (1H, s), 7,21 7,24 (5H, m), 7,33 (1H, s), 7,82 (1H, d, J=10,9 Hz), 7,99 (4H, s a), 8,33-8,36 (2H, m), 8,49-8,51 (2H, m).
EM (CLEM) m/z: 898 (M+H)+.
Procedimiento 3: N-[6-(2,5-Dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil]glicilglicil-L-fenilalanil-N-{2-[(2-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-2-oxoetil)(2-hidroxietil)amino]etil}glicinamida
El compuesto (100 mg, 0,111 mmol) obtenido en el Procedimiento 2 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 8 del Ejemplo 5 para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo (33,0 mg, 27 %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) ó: 0,87 (3H, t, J=7,4 Hz), 1,16-1,19 (2H, m), 1,45-1,48 (4H, m), 1,83-1,85 (2H, m), 2,09
2,17 (4H, m), 2,36 (3H, s), 2,70-2,96 (2H, m), 3,14-3,76 (20H, m), 4,39-4,41 (1H, m), 4,47-4,50 (1H, m), 5,14 (1H, d, J=19,2 Hz), 5,24 (1H, d, J=18,8 Hz), 5,42 (2H, s), 5,57-5,58 (1H, m), 6,53 (1H, s), 6,99 (2H, s), 7,19-7,23 (5H, m), 7,30 (1H, s), 7,58 (1H, s), 7,75 (1H, d, J=10,9 Hz), 8,01-8,03 (1H, m), 8,10-8,12 (2H, m), 8,21-8,23 (1H, m), 8,49 (1H, d, J=8,6 Hz).
EM (CLEM) m/z: 1091 (M+H)+.
Procedimiento 4: Conjugado anticuerpo-fármaco (40)
Usando el trastuzumab producido en el ejemplo de referencia 1 y el compuesto obtenido en el Procedimiento 3 anterior, el conjugado anticuerpo-fármaco titulado se obtuvo de la misma manera que el Procedimiento 6 del Ejemplo 2. Concentración de anticuerpo: 1,54 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 9,2 mg (74 %), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 3,8.
Ejemplo 41 Conjugado anticuerpo-fármaco (41)
Usando el trastuzumab producido en ejemplo de referencia 1 y el compuesto obtenido en el Procedimiento 3 del Ejemplo 40, el conjugado anticuerpo-fármaco titulado se obtuvo de la misma manera que el Procedimiento 1 del Ejemplo 3. Concentración de anticuerpo: 1,54 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 9,2 mg (74 %), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 6,9.
Ejemplo 42 Intermedio (42)
El compuesto (0,753 g, 2,44 mmol) obtenido en el Procedimiento 1 del Ejemplo 33 se disolvió en diclorometano (10,0 ml). Después de añadir N,N-diisopropiletilamina (0,851 ml, 4,89 mmol) y 2-bromoacetato de ferc-butilo (0,541 ml, 3,66 mmol), se agitó durante 1 día. El disolvente se retiró a presión reducida y el residuo obtenido se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice [hexano : acetato de etilo = 90 : 10 - 0 : 100 (v/v)] para producir el compuesto del título en forma de una sustancia oleosa incolora (0,614 g, 60 %).
RMN 1H (400 MHz, CDCla) 8: 1,44 (9H, s), 1,45 (9H, s), 2,84 (2H, t, J=5,7 Hz), 3,15 (2H, c, J=5,3 Hz), 3,42 (2H, s), 3,58 (2H, s), 5,13 (2H, d, J=4,7 Hz), 5,62 (1H, s), 7,30-7,38 (5H, m).
EM (CLEM) m/z: 423 (M+H)+.
Procedimiento 2: ácido [{2-[(ferc-butoxicarbonil)amino]etil}(2-ferc-butoxi-2-oxoetil)amino]acético
El compuesto (0,614 g, 1,45 mmol) obtenido en el Procedimiento 1 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 3 del Ejemplo 33 para producir el compuesto del título en forma de una sustancia oleosa incolora (0,469 g, 97 %).
RMN 1H (400 MHz, CDCla) 8: 1,44 (9H, s), 1,47 (9H, s), 2,95 (2H, s), 3,24 (2H, s), 3,57 (4H, s), 5,79 (1H, s), 10,68 (1H, s a).
EM (CLEM) m/z: 333 (M+H)+.
Procedimiento 3: [{2-[(ferc-butoxicarbonil)amino]etil}(2-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-2-oxoetil)amino]acetato de ferc-butilo
Se hizo reaccionar la sal del ácido metanosulfónico de exatecán (620 mg, 1,17 mmol) de la misma manera como en el Procedimiento 1 del Ejemplo 1 usando el compuesto (465 mg, 1,40 mmol) obtenido en el Procedimiento 2 anterior en lugar de ácido 4-(ferc-butoxicarbonilamino)butanoico para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo (666 mg, 76 %).
RMN 1H (400 MHz, CD3OD) 8: 1,01 (3H, t, J=7,0 Hz), 1,14 (9H, s), 1,37 (9H, s), 1,94 (2H, c, J=6,9 Hz), 2,24-2,26 (1H, m), 2,35 (3H, s), 2,45-2,48 (1H, m), 2,75-2,86 (2H, m), 3,16-3,21 (3H, m), 3,34-3,46 (3H, m), 3,52 (1H, d, J=17,2 Hz), 3,62 (1H, d, J=17,6 Hz), 4,66 (1H, d, J=18,8 Hz), 5,20 (1H, d, J=18,8Hz), 5,32 (1H, d, J=16,0 Hz), 5,56 (1H, d, J=16,0 Hz), 5,70-5,76 (1H, m), 6,51-6,57 (1H, m), 7,44 (1H, d, J=10,6 Hz), 7,50 (1H, s), 8,04 (2H, s a). EM (CLEM) m/z: 750 (M+H)+.
Procedimiento 4: ácido [(2-aminoetil)(2-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-2-oxoetil)amino]acético
El compuesto (587 mg, 0,783 mmol) obtenido en el Procedimiento 3 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 2 del Ejemplo 1 para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo (477 mg, cuantitativo).
RMN 1H (400 MHz, CD3OD) 8: 0,96 (3H, t, J=7,2 Hz), 1,90 (2H, c, J=7,0 Hz), 2,07-2,09 (1H, m), 2,28 (3H, s), 2,38 2,40 (1H, m), 3,02-3,23 (6H, m), 3,56-3,67 (4H, m), 4,71 (1H, d, J=18,4 Hz), 5,02 (1H, d, J=18,4 Hz), 5,28 (1H, d,
J=16,0 Hz), 5,49 (1H, d, J=16,4 Hz), 5,63-5,65 (1H, m), 7,32 (1H, d, J=10,6 Hz), 7,44 (1H, s).
EM (CLEM) m/z: 594 (M+H)+.
Ejemplo 43 Conjugado anticuerpo-fármaco (43)
Procedimiento 1: N-(ferc-Butoxicarbonil)glicilglicil-L-fenilalanil-N-{2-[(carboximetil)(2-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-2-oxoetil)amino]etil}glicinamida
El compuesto (300 mg, 0,505 mmol) obtenido en el Procedimiento 4 del Ejemplo 42 se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 1 del Ejemplo 2 para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (316 mg, 62 %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 8: 0,86 (3H, t, J=6,8 Hz), 1,36 (9H, s), 1,81-1,83 (2H, m), 2,14-2,20 (2H, m), 2,37 (3H, s), 2,86-3,46 (18H, m), 4,38-4,41 (1H, m), 5,14 (1H, d, J=19,6 Hz), 5,22 (1H, d, J=18,8 Hz), 5,41 (2H, s), 5,56-5,58 (1H, m), 6,53 (1H, s), 7,06-7,20 (5H, m), 7,75 (1H, d, J=10,6 Hz), 7,90-7,92 (2H, m), 8,09 (1H, s), 8,18 (2H, s), 8,34 8,40 (2H, m), 8,73 (1H, s).
EM (CLEM) m/z: 1012 (M+H)+.
Procedimiento 2: Glicilglicil-L-fenilalanil-N-{2-[(carboximetil)(2-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-2-oxoetil)amino]etil}glicinamida
El compuesto (316 mg, 0,312 mmol) obtenido en el Procedimiento 1 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 2 del Ejemplo 2 para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (285 mg, cuantitativo).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 8: 0,86 (3H, t, J=7,2 Hz), 1,85-1,86 (2H, m), 2,21-2,24 (2H, m), 2,40 (3H, s), 2,69-2,75 (2H, m), 3,01-3,03 (3H, m), 3,17-3,19 (3H, m), 3,28-3,30 (1H, m), 3,56-3,89 (9H, m), 3,96 (1H, s), 4,55 (1H, td, J=8,8, 4,7 Hz), 5,23 (1H, d, J=19,6 Hz), 5,30 (1H, d, J=21,5 Hz), 5,43 (2H, s), 5,58-5,63 (1H, m), 7,16-7,26 (6H, m), 7,33 (1H, s), 7,82 (1H, d, J=10,0 Hz), 7,97 (3H, s a), 8,31 (1H, d, J=7,0 Hz), 8,37 (1H, t, J=5,5 Hz), 8,49 (1H, t, J=5,7 Hz), 8,80 (1H, s).
EM (CLEM) m/z: 912 (M+H)+.
Procedimiento 3: N-[6-(2,5-Dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1 -il)hexanoil]glicilglicil-L-fenilalanil-N-{2-[(carboximetil)(2{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-2-oxoetil)amino]etil}glicinamida
El compuesto (100 mg, 0,110 mmol) obtenido en el Procedimiento 2 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 8 del Ejemplo 5 para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (79,6 mg, 66 %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-da) 6: 0,86 (3H, t, J=7,2 Hz), 1,12-1,18 (2H, m), 1,44-1,46 (4H, m), 1,81-1,83 (2H, m), 2,08 2,11 (2H, m), 2,23-2,29 (2H, m), 2,38 (3H, s), 2,65-2,74 (5H, m), 3,11-3,72 (15H, m), 4,36 (1H, td, J=8,2, 3,4 Hz), 5,14 (1H, d, J=18,8 Hz), 5,23 (1H, d, J=18,8 Hz), 5,38-5,42 (2H, m), 5,55-5,58 (1H, m), 6,50 (1H, s), 6,99 (2H, s), 7,15-7,22 (6H, m), 7,74 (1H, d, J=10,9 Hz), 8,06-8,23 (5H, m), 8,49 (1H, s a), 8,81 (1H, a).
EM (CLEM) m/z: 1105 (M+H)+.
Procedimiento 4: Conjugado anticuerpo-fármaco (43)
Usando el trastuzumab producido en el ejemplo de referencia 1 y el compuesto obtenido en el Procedimiento 3 anterior, el conjugado anticuerpo-fármaco titulado se obtuvo de la misma manera que el Procedimiento 6 del Ejemplo 2. Concentración de anticuerpo: 1,58 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 9,5 mg (76 %), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 3,8.
Ejemplo 44 Conjugado anticuerpo-fármaco (44)
Procedimiento 1: Conjugado anticuerpo-fármaco (44)
Usando el trastuzumab producido en ejemplo de referencia 1 y el compuesto obtenido en el Procedimiento 3 del Ejemplo 43, el conjugado anticuerpo-fármaco titulado se obtuvo de la misma manera que el Procedimiento 1 del Ejemplo 3. Concentración de anticuerpo: 1,68 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 10,1 mg (81 %), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 6,9.
Ejemplo 45 Intermedio (45)
[Formula 98]
Procedimiento 1: N-{2-[(ferc-butoxicarbonil)amino]etil}-p-alaninato de bencilo
Se disolvió N-(2-aminoetil)carbamato de ferc-butilo (3,00 g, 18,7 mmol) en piridina (10,0 ml), se cargó con carbonato potásico (2,59 g, 18,7 mmol) y acrilato de bencilo (1,43 ml, 9,36 mmol) y se agitó a temperatura ambiente durante 1 día. El disolvente en la solución de reacción se retiró a presión reducida. Los residuos obtenidos se purificaron por cromatografía en columna sobre gel de sílice [cloroformo - cloroformo : metanol = 8 : 2 (v/v)] para producir el compuesto del título en forma de una sustancia oleosa incolora (1,58 g, 52 %).
RMN 1H (400 MHz, CDCla) 8: 1,44 (9H, s), 2,54 (2H, t, J=6,5 Hz), 2,71 (2H, t, J=5,9 Hz), 2,89 (2H, t, J=6,5 Hz), 3,19 (2H, c, J=5,5 Hz), 5,00 (1H, s a), 5,13 (2H, s), 7,32-7,37 (6H, m).
EM (CLEM) m/z: 323 (M+H)+.
Procedimiento 2: N-{2-[(ferc-butoxicarbonil)amino]etil}-N-metil-p-alaninato de bencilo
El compuesto (490 mg, 1,52 mmol) obtenido en el Procedimiento 1 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 1 del Ejemplo 36 para producir el compuesto del título en forma de una sustancia oleosa incolora (327 mg, 64 %).
RMN 1H (400 MHz, CDCla) 8: 1,43 (9H, s), 2,20 (3H, s), 2,45 (2H, t, J=5,9 Hz), 2,50 (2H, t, J=6,8 Hz), 2,70 (2H, t, J=7,0 Hz), 3,18 (2H, c, J=5,5 Hz), 5,13 (2H, s), 7,32-7,34 (5H, m).
EM (CLEM) m/z: 337 (M+H)+.
Procedimiento 3: N-{2-[(ferc-butoxicarbonil)amino]etil}-N-metil-p-alanina
El compuesto (327 mg, 0,971 mmol) obtenido en el Procedimiento 2 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 3 del Ejemplo 33 para producir el compuesto del título en forma de una sustancia oleosa incolora (236 mg, 99 %).
RMN 1H (400 MHz, CDCh) 8: 1,43 (9H, s), 2,61-2,64 (2H, m), 2,75 (3H, s), 3,08-3,11 (2H, m), 3,20-3,23 (2H, m), 3,47 3,50 (2H, m), 6,43 (1H, s a), 11,09 (1H, s a).
EM (CLEM) m/z: 247 (M+H)+.
Procedimiento 4: {2-[(3-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-3-oxopropil)(metil)amino]etil}carbamato de ferc-butilo
Se hizo reaccionar la sal del ácido metanosulfónico de exatecán (410 mg, 0,771 mmol) de la misma manera como en el Procedimiento 1 del Ejemplo 1 usando el compuesto (228 mg, 0,926 mmol) obtenido en el Procedimiento 3 anterior en lugar de ácido 4-(ferc-butoxicarbonilamino)butanoico para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo (122 mg, 24 %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 8: 0,87 (3H, t, J=7,4 Hz), 1,31 (9H, s), 1,82-1,90 (2H, m), 2,14-2,16 (4H, m), 2,30-2,32 (2H, m), 2,41 (3H, s), 2,59 (3H, s), 2,59-2,64 (2H, m), 2,91-2,93 (2H, m), 3,16-3,17 (2H, m), 5,23 (2H, s), 5,43 (2H, s), 5,54-5,56 (1H, m), 6,42-6,63 (1H, m), 6,54 (1H, s), 7,31 (1H, s), 7,80 (1H, d, J=10,9 Hz), 8,54 (1H, d, J=7,8 Hz). EM (CLEM) m/z: 664 (M+H)+.
Procedimiento 5: N3-(2-Aminoetil)-N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]-N3-metil-p-alaninamida
El compuesto (389 mg, 0,585 mmol) obtenido en el Procedimiento 4 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 2 del Ejemplo 1 para producir sal del ácido trifluoroacético del compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo (304 mg, 92 %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 8: 0,87 (3H, s a), 1,85-1,88 (2H, m), 2,16-2,19 (2H, m), 2,40 (3H, s), 2,67 (3H, s), 2,77 2,79 (2H, m), 3,25-3,37 (8H, m), 5,24-5,29 (2H, m), 5,43 (2H, s), 5,58-5,60 (1H, m), 6,56 (1H, s), 7,32 (1H, s), 7,80 (1H, d, J=10,2 Hz), 8,17 (3H, s a), 8,81 (1H, s).
EM (CLEM) m/z: 564 (M+H)+.
Ejemplo 46 Conjugado anticuerpo-fármaco (46)
[Formula 99]
Procedimiento 1: N-(ferc-Butoxicarbonil)glicilglicil-L-fenilalanil-N-{2-[(3-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indoNzino[1,2-b]quinoNn-1-N]amino}-3-oxopropil)(metil)amino]etil}glicinamida
El compuesto (200 mg, 0,355 mmol) obtenido en el Procedimiento 5 del Ejemplo 45 se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 1 del Ejemplo 2 para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (165 mg, 47 %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-da) 8: 0,86 (3H, t, J=7,2 Hz), 1,37 (9H, s), 1,85 (2H, td, J=14,9, 7,2 Hz), 2,14-2,16 (2H, m), 2,15 (3H, s), 2,32-2,37 (4H, m), 2,39 (3H, s), 2,65-2,67 (2H, m), 2,76 (1H, dd, J=13,5, 9,6 Hz), 3,01 (1H, dd, J=13,7, 4,3 Hz), 3,10 (2H, c, J=6,4 Hz), 3,16-3,17 (2H, m), 3,53-3,77 (6H, m), 4,45-4,50 (1H, m), 5,22 (2H, s), 5,43 (2H, s), 5,53-5,57 (1H, m), 6,54 (1H, s), 7,01 (1H, t, J=5,9 Hz), 7,14-7,26 (5H, m), 7,30 (1H, s), 7,60 (1H, t, J=5,5 Hz), 7,79 (1H, d, J=10,9 Hz), 7,93 (1H, t, J=5,5 Hz), 8,16 (1H, d, J=8,2 Hz), 8,29 (1H, t, J=5,7 Hz), 8,55 (1H, d, J=8,6 Hz).
EM (CLEM) m/z: 982 (M+H)+.
Procedimiento 2: Glicilglicil-L-fenilalanil-N-{2-[(3-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-3-oxopropil)(metil)amino]etil}glicinamida
El compuesto (165 mg, 0,168 mmol) obtenido en el Procedimiento 1 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 2 del Ejemplo 2 para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (148 mg, cuantitativo).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 8: 0,87 (3H, t, J=7,2 Hz), 1,81-1,92 (2H, m), 2,13-2,19 (2H, m), 2,41 (3H, s), 2,66 (2H, dd, J=8,6, 5,1 Hz), 2,74 (1H, dd, J=13,9, 10,0 Hz), 2,82 (3H, s), 3,03 (1H, dd, J=13,9, 4,5 Hz), 3,45-3,48 (9H, m), 3,57 (2H, d, J=5,1 Hz), 3,67-3,76 (2H, m), 3,86 (1H, dd, J=16,8, 5,9 Hz), 4,57 (1H, td, J=9,1,4,0 Hz), 5,20 (1H, d, J=18,8 Hz), 5,28 (1H, d, J=19,2 Hz), 5,44 (2H, s), 5,57-5,61 (1H, m), 6,58 (1H, s), 7,11-7,25 (5H, m), 7,33 (1H, s), 7,84 (1H, d, J=10,9 Hz), 7,98 (3H, s), 8,13 (1H, s), 8,34 (1H, d, J=7,8 Hz), 8,43 (1H, t, J=5,9 Hz), 8,49 (1H, t, J=5,3 Hz), 8,79 (1H, d, J=8,6 Hz).
EM (CLEM) m/z: 882 (M+H)+.
Procedimiento 3: N-[6-(2,5-Dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1 -il)hexanoil]glicilglicil-L-fenilalanil-N-{2-[(3-{[(IS,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-3-oxopropil)(metil)amino]etil}glicinamida
El compuesto (100 mg, 0,113 mmol) obtenido en el Procedimiento 2 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 8 del Ejemplo 5 para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (43,4 mg, 36 %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-da) 8: 0,86 (3H, t, J=7,2 Hz), 1,14-1,22 (4H, m), 1,44-1,48 (4H, m), 1,80-1,91 (2H, m), 2,09 2,13 (3H, m), 2,10 (2H, t, J=7,4 Hz), 2,38-2,40 (6H, m), 2,79 (2H, dd, J=13,7, 9,8 Hz), 3,02 (1H, dd, J=13,7, 4,3 Hz), 3,09 (1H, c, J=7,3 Hz), 3,15-3,18 (4H, m), 3,35-3,77 (9H, m), 4,46 (1H, td, J=8,7, 4,2 Hz), 5,21 (2H, s), 5,42 (2H, s), 5,53-5,58 (1H, m), 6,54 (1H, s), 6,99 (2H, s), 7,14-7,25 (5H, m), 7,30 (1H, s), 7,68 (1H, s a), 7,79 (1H, d, J=10,4 Hz), 8,03 (1H, t, J=5,7 Hz), 8,09 (1H, t, J=5,7 Hz), 8,13 (1H, d, J=7,8 Hz), 8,27 (1H, t, J=5,3 Hz), 8,59 (1H, d, J=5,5 Hz). EM (CLEM) m/z: 1075 (M+H)+.
Procedimiento 4: Conjugado anticuerpo-fármaco (46)
Usando el trastuzumab producido en el ejemplo de referencia 1 y el compuesto obtenido en el Procedimiento 3 anterior, el conjugado anticuerpo-fármaco titulado se obtuvo de la misma manera que el Procedimiento 6 del Ejemplo 2. Concentración de anticuerpo: 1,57 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 9,4 mg (75 %), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 3,9.
Ejemplo 47 Conjugado anticuerpo-fármaco (47)
Procedimiento 1: Conjugado anticuerpo-fármaco (47)
Usando el trastuzumab producido en ejemplo de referencia 1 y el compuesto obtenido en el Procedimiento 3 del Ejemplo 46, el conjugado anticuerpo-fármaco titulado se obtuvo de la misma manera que el Procedimiento 1 del Ejemplo 3. Concentración de anticuerpo: 1,61 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 9,7 mg (78%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 7,2.
Ejemplo 48 Intermedio (48)
Formula 101
Procedimiento 1: N-{2-[(terc-butoxicarbonil)amino]etil}-N-[2-(tetrahidro-2H-piran-2-iloxi)etil]-p-alaninato de bencilo
El compuesto (387 mg, 1,20 mmol) obtenido en el Procedimiento 1 del Ejemplo 45 se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 1 del Ejemplo 39 para producir el compuesto del título en forma de una sustancia oleosa incolora (251 mg, 46 %).
RMN 1H (400 MHz, CDCls) 8: 1,43 (9H, s), 1,48-1,82 (6H, m), 2,51 (2H, t, J=7,0 Hz), 2,60 (2H, t, J=5,7 Hz), 2,66-2,69 (2H, m), 2,88 (2H, dd, J=10,8, 4,1 Hz), 3,17 (2H, t, J=4,5 Hz), 3,41 (1H, dt, J=11,5, 5,2 Hz), 3,50 (1H, dc, J=12,9, 2,9 Hz), 3,73-3,78 (1H, m), 3,81-3,87 (1H, m), 4,57 (1H, t, J=3,5 Hz), 5,13 (2H, s), 5,30 (1H, d, J=4,3 Hz), 7,29-7,37 (5H, m).
EM (CLEM) m/z: 451 (M+H)+.
Procedimiento 2: N-{2-[(terc-Butoxicarbonil)amino]etil}-N-[2-(tetrahidro-2H-piran-2-iloxi)etil]-p-alanina
El compuesto (436 mg, 0,968 mmol) obtenido en el Procedimiento 1 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 3 del Ejemplo 33 para producir el compuesto del título en forma de una sustancia oleosa incolora (337 mg, 97 %).
RMN 1H (400 MHz, CDCla) 8: 1,43 (9H, s), 1,57-1,77 (6H, m), 2,71-2,72 (2H, m), 3,21-3,23 (2H, m), 3,32-3,35 (4H, m), 3,50-3,53 (3H, m), 3,72-3,77 (1H, m), 3,83 (1H, dt, J=13,0, 4,5 Hz), 4,04 (1H, dt, J=11,3, 4,4 Hz), 4,62 (1H, s), 6,21 (1H, s), 9,04 (1H, s a).
EM (CLEM) m/z: 361 (M+H)+.
Procedimiento 3: (2-{(3-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-3-oxopropil)[2-(tetrahidro-2H-piran-2-iloxi)etil]amino}etil)carbamato de terc-butilo
Se hizo reaccionar la sal del ácido metanosulfónico de exatecán (410 mg, 0,771 mmol) de la misma manera como en el Procedimiento 1 del Ejemplo 1 usando el compuesto (334 mg, 0,926 mmol) obtenido en el Procedimiento 2 anterior en lugar de ácido 4-(terc-butoxicarbonilamino)butanoico para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo (366 mg, 61 %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 8: 0,87 (3H, t, J=7,0 Hz), 1,33-1,40 (6H, m), 1,33 (9H, s), 1,85-1,87 (2H, m), 2,12-2,14 (2H, m), 2,28-2,34 (2H, m), 2,40 (3H, s), 2,79-3,08 (12H, m), 3,57-3,66 (2H, m), 4,43-4,45 (1H, m), 5,18 (1H, d, J=18,2 Hz), 5,25 (1H, d, J=18,4 Hz), 5,42 (2H, s), 5,55-5,58 (1H, m), 6,49-6,52 (1H, m), 6,54 (1H, s), 7,30 (1H, s), 7,80 (1H, d, J=11,3 Hz), 8,50 (1H, d, J=8,2 Hz). EM (CLEM) m/z: 778 (M+H)+.
Procedimiento 4: N3-(2-Aminoetil)-N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]-N3-(2-hidroxietil)-p-alaninamida
El compuesto (356 mg, 0,458 mmol) obtenido en el Procedimiento 3 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 2 del Ejemplo 1 para producir sal del ácido trifluoroacético del compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo (270 mg, 99 %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 8: 0,87 (3H, t, J=7,2 Hz), 1,81-1,92 (2H, m), 2,15-2,17 (2H, m), 2,40 (3H, s), 2,58-2,61 (2H, m), 2,92-3,60 (12H, m), 5,20 (1H, d, J=18,8 Hz), 5,26 (1H, d, J=19,2 Hz), 5,43 (2H, s), 5,59-5,60 (1H, m), 6,55 (1H, s), 7,32 (1H, s), 7,79-7,82 (2H, m), 8,03 (3H, s a), 8,77-8,79 (1H, m).
EM (CLEM) m/z: 594 (M+H)+.
Ejemplo 49 Conjugado anticuerpo-fármaco (49)
Procedimiento 1: N-(ferc-Butoxicarbonil)glicilglicil-L-fenilalanil-N-{2-[(3-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indoNzino[1,2-b]quinoNn-1-N]amino}-3-oxopropN)(2-hidroxietil)amino]etil}glicinamida
El compuesto (200 mg, 0,337 mmol) obtenido en el Procedimiento 4 del Ejemplo 48 se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 1 del Ejemplo 2 para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo (270 mg, 79 %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-da) 8: 0,86 (3H, t, J=7,0 Hz), 1,36 (9H, s), 1,83-1,85 (2H, m), 2,16-2,18 (2H, m), 2,38 (3H, s), 2,59 (4H, s), 3,02-3,94 (18H, m), 4,43-4,47 (2H, m), 5,19 (1H, d, J=19,2 Hz), 5,26 (1H, d, J=19,2 Hz), 5,43 (2H, s), 5,58 (1H, s), 6,54 (1H, d, J=5,1 Hz), 7,00 (1H, s), 7,21-7,23 (5H, m), 7,31 (1H, s), 7,80 (1H, t, J=11,3 Hz), 7,92-7,95 (2H, m), 8,12-8,14 (1H, m), 8,23-8,26 (1H, m), 8,49 (1H, d, J=8,2 Hz).
Procedimiento 2: Glicilglicil-L-fenilalanil-N-{2-[(3-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indoNzino[1,2-b]quinoNn-1-N]amino}-3-oxopropN)(2-hidroxietil)amino]etil}glicinamida, sal del ácido trifluoroacético
El compuesto (270 mg, 0,267 mmol) obtenido en el Procedimiento 1 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 2 del Ejemplo 2 para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo (103 mg, 42 %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 8: 0,87 (3H, t, J=7,2 Hz), 1,85-1,88 (2H, m), 2,17-2,20 (2H, m), 2,41 (3H, s), 2,66-3,04 (8H, m), 3,31-4,11 (12H, m), 4,57-4,59 (2H, m), 5,21 (1H, d, J=18,4 Hz), 5,28 (1H, d, J=18,4 Hz), 5,43-5,45 (2H, m), 5,58-5,61 (1H, m), 6,58 (1H, s), 7,21-7,23 (5H, m), 7,34 (1H, s), 7,84 (1H, d, J=10,9 Hz), 7,96 (4H, s a), 8,31-8,33 (2H, m), 8,47-8,49 (2H, m).
EM (CLEM) m/z: 912 (M+H)+.
Procedimiento 3: N-[6-(2,5-Dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil]glicilglicil-L-fenilalanil-N-{2-[(3-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-3-oxopropil)(2-hidroxietil)amino]etil}glicinamida
El compuesto (100 mg, 0,110 mmol) obtenido en el Procedimiento 2 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 8 del Ejemplo 5 para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo (38,4 mg, 32 %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-da) 5: 0,87 (3H, t, J=7,0 Hz), 1,15-1,22 (2H, m), 1,45-1,48 (4H, m), 1,82-1,89 (2H, m), 2,09 2,11 (4H, m), 2,30-2,33 (1H, m), 2,38 (3H, s), 2,59 (1H, s), 2,77-2,79 (2H, m), 3,03-3,72 (18H, m), 4,35-4,37 (1H, m), 4 ,46 -4 ,49 (1H, m), 5,19 (2H, s), 5,42 (2H, s), 5,55-5,56 (1H, m), 6,53 (1H, s), 6,99 (2H, s), 7,16-7,25 (5H, m), 7,30 (1H, s), 7,61 (1H, s), 7,78 (1H, d, J=10,9 Hz), 8,02 (1H, t, J=5,5 Hz), 8,08-8,11 (2H, m), 8,25 (1H, t, J=5,5 Hz), 8,55 (1H, d, J=8 ,6 Hz).
EM (CLEM) m/z: 1105 (M+H)+.
Procedimiento 4: Conjugado anticuerpo-fármaco (49)
Usando el trastuzumab producido en el ejemplo de referencia 1 y el compuesto obtenido en el Procedimiento 3 anterior, el conjugado anticuerpo-fármaco titulado se obtuvo de la misma manera que el Procedimiento 6 del Ejemplo 2. Concentración de anticuerpo: 1,57 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 9,4 mg (75 %), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 3,7.
Ejemplo 50 Conjugado anticuerpo-fármaco (50)
Procedimiento 1: Conjugado anticuerpo-fármaco (50)
Usando el trastuzumab producido en ejemplo de referencia 1 y el compuesto obtenido en el Procedimiento 3 del Ejemplo 49, el conjugado anticuerpo-fármaco titulado se obtuvo de la misma manera que el Procedimiento 1 del Ejemplo 3. Concentración de anticuerpo: 1,61 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 9,7 mg (78%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 6,9.
Ejemplo 51 Intermedio (51)
Procedimiento 1: N-{2-[(ferc-butoxicarbonil)amino]etil}-N-(2-ferc-butoxi-2-oxoetil)-p-alaninato de bencilo
El compuesto (0,926 mg, 2,87 mmol) obtenido en el Procedimiento 1 del Ejemplo 45 se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 1 del Ejemplo 42 para producir el compuesto del título en forma de una sustancia oleosa incolora (1,10 g, 88 %).
RMN 1H (400 MHz, CDCla) 8: 1,43 (9H, s), 1,45 (9H, s), 2,49 (2H, t, J=6,8 Hz), 2,72 (2H, t, J=5,7 Hz), 2,98 (2H, t, J=6,8 Hz), 3,14 (2H, c, J=5,6 Hz), 3,22 (2H, s), 5,13 (2H, s), 5,30 (1H, s a), 7,30-7,34 (5H, m).
EM (CLEM) m/z: 437 (M+H)+.
Procedimiento 2: N-{2-[(ferc-Butoxicarbonil)amino]etil}-N-(2-ferc-butoxi-2-oxoetil)-p-alanina
El compuesto (1,25 g, 2,87 mmol) obtenido en el Procedimiento 1 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 3 del Ejemplo 33 para producir el compuesto del título en forma de una sustancia oleosa incolora (0,850 g, 83 %).
RMN 1H (400 MHz, CDCla) 8: 1,43 (9H, s), 1,47 (9H, s), 2,50 (2H, t, J=6,3 Hz), 2,82-2,85 (2H, m), 3,02 (2H, t, J=6,5 Hz), 3,22-3,25 (2H, m), 3,39 (2H, s), 5,62 (1H, s a), 10,36 (1H, s a).
EM (CLEM) m/z: 347 (M+H)+.
Procedimiento 3: N-{2-[(ferc-butoxicarbonil)amino]etil}-N-(3-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-3-oxopropil)glicinato de ferc-butilo
Se hizo reaccionar sal del ácido metanosulfónico de exatecán (1,00 g, 1,88 mmol) de la misma manera como en el Procedimiento 1 del Ejemplo 1 usando el compuesto (0,782 g, 2,26 mmol) obtenido en el Procedimiento 2 anterior en lugar de ácido 4-(ferc-butoxicarbonilamino)butanoico para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo (1,43 g, cuantitativo).
RMN 1H (400 MHz, CD3OD) 8: 0,95 (3H, t, J=7,4 Hz), 1,20 (9H, s), 1,33 (9H, s), 1,87 (2H, c, J=7,3 Hz), 2,24-2,28 (1H, m), 2,29 (3H, s), 2,35-2,48 (3H, m), 2,57-2,65 (2H, m), 2,89-2,92 (2H, m), 3,06-3,28 (6H, m), 3,66-3,67 (1H, m), 4,76 (1H, d, J=19,2 Hz), 5,13 (1H, d, J=18,8 Hz), 5,25 (1H, d, J=16,0 Hz), 5,49 (1H, d, J=16,0 Hz), 5,62 (1H, t, J=5,7 Hz), 7,37 (1H, d, J=10,6 Hz), 7,43 (1H, s), 7,97 (2H, s).
EM (CLEM) m/z: 764 (M+H)+.
Procedimiento 4: N-(2-Aminoetil)-N-(3-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-3-oxopropil)glicina
El compuesto (1,43 g, 1,87 mmol) obtenido en el Procedimiento 3 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 2 del Ejemplo 1 para producir sal del ácido trifluoroacético del compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo (1,06 g, 93 %).
RMN 1H (400 MHz, CD3OD) 8: 0,96 (3H, t, J=6,3 Hz), 1,90 (2H, d, J=6,3 Hz), 2,22-2,27 (1H, m), 2,29 (3H, s), 2,42 2,54 (2H, m]), 2,95-3,08 (6H, m), 3,33-3,35 (3H, m), 3,66-3,69 (2H, m), 4,04-4,07 (1H, m), 4,84 (1H, d, J=18,4 Hz), 5,10 (1H, d, J=18,4 Hz), 5,25 (1H, d, J=16,0 Hz), 5,45 (1H, d, J=16,0 Hz), 5,76-5,79 (1H, m), 7,09 (1H, d, J=10,6 Hz), 7,33 (1H, s).
EM (CLEM) m/z: 608 (M+H)+.
Ejemplo 52 Conjugado anticuerpo-fármaco (52)
[Formula 105]
Procedimiento 1: N-(íerc-Butoxicarbonil)glicilglicil-L-fenilalanil-N-{2-[(carboximetil)(3-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-3-oxopropil)amino]etil}glicinamida
La sal del ácido trifluoroacético del compuesto (300 mg, 0,494 mmol) obtenido en el Procedimiento 4 del Ejemplo 51 se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 1 del Ejemplo 2 para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (221 mg, 44 %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-da) 8: 0,86 (3H, t, J=7,2 Hz), 1,36 (9H, s), 1,83-1,85 (2H, m), 2,12-2,14 (2H, m), 2,33 (3H, s), 2,37-2,39 (1H, m), 2,43-2,45 (1H, m), 2,64-3,73 (18H, m), 4,48-4,51 (1H, m), 5,20 (2H, s), 5,42 (2H, s), 5,53-5,56 (1H, m), 6,54 (1H, s), 7,01-7,29 (5H, m), 7,79 (1H, d, J=10,6 Hz), 7,91 (1H, s), 8,09-8,14 (2H, m), 8,26-8,31 (4H, m), 8,63 (1H, s).
EM (CLEM) m/z: 1026 (M+H)+.
Procedimiento 2: Glicilglicil-L-fenilalanil-N-{2-[(carboximetil)(3-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-3-oxopropil)amino]etil}glicinamida
El compuesto (221 mg, 0,216 mmol) obtenido en el Procedimiento 1 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 2 del Ejemplo 2 para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (196 mg, 98 %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 8: 0,87 (3H, t, J=7,2 Hz), 1,85-1,87 (2H, m), 2,17-2,19 (2H, m), 2,41 (3H, s), 2,67-2,77 (2H, m), 2,99-3,05 (3H, m), 3,32-3,35 (3H, m), 3,56-3,96 (13H, m), 4,54-4,56 (1H, m), 5,21 (1H, d, J=19,0 Hz), 5,27 (1H, d, J=19,0 Hz), 5,43 (2H, s), 5,58-5,59 (1H, m), 6,57 (1H, s), 7,18-7,24 (5H, m), 7,33 (1H, s), 7,83 (1H, d, J=10,9 Hz), 7,98 (3H, s a), 8,33 (1H, d, J=8,2 Hz), 8,39 (1H, s), 8,50 (1H, s), 8,71 (1H, s).
EM (CLEM) m/z: 926 (M+H)+.
Procedimiento 3: N-[6-(2,5-Dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1 -il)hexanoil]glicilglicil-L-fenilalanil-N-{2-[(carboximetil)(3-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-3-oxopropil)amino]etil}glicinamida
El compuesto (100 mg, 0,108 mmol) obtenido en el Procedimiento 2 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 8 del Ejemplo 5 para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo
pálido (79,2 mg, 66 %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-da) 8: 0,87 (3H, t, J=7,4 Hz), 1,12-1,18 (2H, m), 1,44-1,48 (4H, m), 1,80-1,91 (2H, m), 2,09 2,15 (2H, m), 2,09 (2H, t, J=7,6 Hz), 2,33 (2H, t, J=6,8 Hz), 2,39 (3H, s), 2,65 (2H, t, J=6,8 Hz), 2,78 (2H, dd, J=13,7, 9,8 Hz), 2,91 (2H, t, J=6,6 Hz), 3,00-3,76 (14H, m), 4,47 (1H, td, J=8,8, 4,3 Hz), 5,22 (2H, s), 5,43 (2H, s), 5,54-5,58 (1H, m), 6,52 (1H, s), 6,99 (2H, s), 7,13-7,25 (6H, m), 7,30 (1H, s), 7,71 (1H, s), 7,79 (1H, d, J=10,9 Hz), 8,09-8,13 (2H, m), 8,21-8,23 (2H, m), 8,57 (1H, d, J=8,6 Hz).
EM (CLEM) m/z: 1119 (M+H)+.
Procedimiento 4: Conjugado anticuerpo-fármaco (52)
Usando el trastuzumab producido en el ejemplo de referencia 1 y el compuesto obtenido en el Procedimiento 3 anterior, el conjugado anticuerpo-fármaco titulado se obtuvo de la misma manera que el Procedimiento 6 del Ejemplo 2. Concentración de anticuerpo: 1,56 mg/ ml, rendimiento de anticuerpo: 9,4 mg (75 %), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 4,1.
Ejemplo 53 Conjugado anticuerpo-fármaco (53)
Procedimiento 1: Conjugado anticuerpo-fármaco (53)
Usando el trastuzumab producido en ejemplo de referencia 1 y el compuesto obtenido en el Procedimiento 3 del Ejemplo 52, el conjugado anticuerpo-fármaco titulado se obtuvo de la misma manera que el Procedimiento 1 del Ejemplo 3. Concentración de anticuerpo: 1,61 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 9,7 mg (78%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 7,3.
Ejemplo 54 Conjugado anticuerpo-fármaco (54)
[Fórmula 107]
Procedimiento 1: 9H-Fluoren-9-ilmetil[(2S)-3-ferc-butoxM-[[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metiM0,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-1-oxopropan-2-il]carbamato
Se hizo reaccionar la sal del ácido metanosulfónico de exatecán se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 1 del Ejemplo 1 usando O-ferc-butil-N-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-L-serina en lugar de ácido 4-(ferc-butoxicarbonilamino)butanoico para producir el compuesto del título. El compuesto se usó para la siguiente reacción sin purificación adicional. EM (ES+APCI) m/z: 801 (M+H)+.
Procedimiento 2: O-ferc-butil-N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metiM0,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]-L-serinamida
El compuesto (1,10 g, 1,37 mmol) obtenido en el Procedimiento 1 anterior se hizo reaccionar de la misma manera
como en el Procedimiento 6 del Ejemplo 15 para producir el compuesto del título. El compuesto se usó para la siguiente reacción sin purificación adicional.
Procedimiento 3: 9H-Fluoren-9-ilmetil{2-[(4-{[(2S)-3-ferc-butoxi-1-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-1-ooxopropan-2-il]amino}-4-oxobutil)amino]-2-oxoetil}carbamato
El compuesto (0,460 mmol) obtenido en el Procedimiento 2 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 1 del Ejemplo 2 usando ácido 4-({N-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]glicil}amino)butanoico en lugar de N-(ferc-butoxicarbonil)glicilglicil-L-fenilalanilglicina para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (0,106 g, 24 %, 3 etapas).
EM (ES+APCI) m/z: 943 (M+H)+.
Procedimiento 4: N-[(2S)-3-ferc-Butoxi-1-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-1-oxopropan-2-il]-4-(glicilamino)butanamida
El compuesto (0,106 g, 0,112 mmol) obtenido en el Procedimiento 3 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 6 del Ejemplo 15 para producir el compuesto del título. El compuesto se usó para la siguiente reacción sin purificación adicional.
Procedimiento 5: N-[6-(2,5-Dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil]glicilglicil-L-fenilalanil-N-(4-{[(2S)-3-ferc-butoxi-1-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-1-oxopropan-2-il]amino}-4-oxobutil)glicinamida
El compuesto (0,112 mmol) obtenido en el Procedimiento 4 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 1 del Ejemplo 2 usando N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil]glicilglicil-L-fenilalanina en lugar de N-(ferc-butoxicarbonil)glicilglicil-L-fenilalanilglicina para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color naranja (63,0 mg, 48 %). EM (ES+APCI) m/z: 1175 (M+H)+.
Procedimiento 6: N-[6-(2,5-Dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil]glicilglicil-L-fenilalanil-N-(4-{[(2S)-1-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-3-hidroxi-1-oxopropan-2-il]amino}-4-oxobutil)glicinamida
El compuesto (63,0 mg, 53,6 pmol) obtenido en el Procedimiento 5 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 8 del Ejemplo 5 para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo (20,0 mg, 33 %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 8: 0,84 (3H, t, J=7,2 Hz), 1,09-1,20 (2H, m), 1,28-1,60 (6H, m), 1,74-1,91 (2H, m), 2,01 2,20 (6H, m), 2,37 (3H, s), 2,69-2,84 (1H, m), 2,88-3,05 (3H, m), 3,07-3,18 (2H, m), 3,21-3,40 (3H, m), 3,46-3,78 (8H, m), 4,17-4,35 (1H, m), 4,36-4,48 (1H, m), 5,07-5,27 (2H, m), 5,40 (2H, s), 5,47-5,59 (1H, m), 6,50 (1H, s a), 6,96 (2H, s), 7,10-7,29 (6H, m), 7,58 (1H, t, J=4,7 Hz), 7,77 (1H, d, J=11,3 Hz), 7,87 (1H, t, J=7,4 Hz), 7,96-8,13 (3H, m), 8,21 (1H, t, J=5,9 Hz), 8,52 (1H, d, J=8,2 Hz).
EM (ES+APCI) m/z: 1119 (M+H)+.
Procedimiento 7: Conjugado anticuerpo-fármaco (54)
Usando el trastuzumab producido en el ejemplo de referencia 1 y el compuesto obtenido en el Procedimiento 6 anterior, el conjugado anticuerpo-fármaco titulado se obtuvo de la misma manera que el Procedimiento 6 del Ejemplo 2. Concentración de anticuerpo: 1,46 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 8,8 mg (88 %), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 3,4.
Ejemplo 55 Conjugado anticuerpo-fármaco (55)
Procedimiento 1: Conjugado anticuerpo-fármaco (55)
Usando el trastuzumab producido en ejemplo de referencia 1 y el compuesto obtenido en el Procedimiento 6 del Ejemplo 54, el conjugado anticuerpo-fármaco titulado se obtuvo de la misma manera que el Procedimiento 1 del Ejemplo 3. Concentración de anticuerpo: 1,35 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 7,2 mg (72 %), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 6,3.
Ejemplo 56 Conjugado anticuerpo-fármaco (56)
Se disolvió ácido 4-[(2-aminoacetil)amino]butanoico (0,500 g, 3,12 mmol) en una solución acuosa saturada de bicarbonato sódico (20,0 ml). Se añadió gota a gota N-(fluorenilmetiloxicarboniloxi)succinimida (1,58 g, 4,68 mmol) disuelta en 1,4-dioxano (10,0 ml) y se agitó durante 3 días. Después del lavado con éter dietílico, la capa acuosa se volvió ácida con ácido clorhídrico 5 N, y los precipitados depositados se recogieron por filtración por succión para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (1,19 g, 99 %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-da) 8: 1,61-1,62 (2H, m), 2,21 (2H, t, J=7,4 Hz), 3,07 (2H, c, J=6,5 Hz), 3,57 (2H, t, J=2,9 Hz), 4,21-4,29 (3H, m), 7,33 (2H, t, J=7,4 Hz), 7,42 (2H, t, J=7,4 Hz), 7,51 (1H, t, J=6,1 Hz), 7,70 (2H, t,
J=10,4 Hz), 7,86 (1H, t, J=5,5 Hz), 7,90 (3H, d, J=7,4 Hz).
Procedimiento 2: N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]-N2-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-L-a-asparaginato de terc-butilo
Se hizo reaccionar la sal del ácido metanosulfónico de exatecán (1,00 g, 1,88 mmol) de la misma manera como en el Procedimiento 1 del Ejemplo 1 usando p-t-butil éster del ácido N-a-(9-fluorenilmetoxicarbonil)-L-aspártico (0,930 mg, 2,26 mmol) en lugar de ácido 4-(terc-butoxicarbonilamino)butanoico para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (0,890 mg, 57 %). RMN 1H (400 MHz, CDCla) 8: 1,01 (3H, t), 1,35 (9H, s), 1,83 (2H, s a), 2,13-2,26 (2H, m), 2,32 (3H, s), 2,67-2,69 (1H, m), 2,92-3,02 (4H, m), 3,46 (1H, s), 4,09 (1H, s), 4,33 (2H, s), 4,57 (1H, s), 4,99-5,18 (2H, m), 5,53-5,56 (1H, m), 6,28 (1H, s), 7,16-7,67 (11H, m), 7,99 (1H, s).
EM (CLEM) m/z: 829 (M+H)+.
Procedimiento 3: N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]-N2-[4-({N-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]glicil}amino)butanoil]-L-a-asparaginato de terc-butilo
El compuesto (0,500 g, 0,604 mmol) obtenido en el Procedimiento 2 anterior se disolvió en N,N-dimetilformamida (3,00 ml), se cargó con piperidina (0,598 ml, 6,04 mmol) y se agitó durante 1 hora. El disolvente se retiró por sequedad a presión reducida y los residuos obtenidos se disolvieron en N,N-dimetilformamida (10,0 ml). Se obtuvo una solución de reacción disolviendo el compuesto (0,277 mg, 0,724 mmol) obtenido en el Procedimiento 1 anterior, clorhidrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida (0,139 mg, 0,724 mmol) y N-hidroxisuccinimida (0,0834 mg, 0,724 mmol) en diclorometano (5,00 ml) y agitándose durante 2 horas se añadió gota a gota a la solución obtenida anterior y se agitó durante 15,5 horas. Después de la adición de una solución acuosas al 10 % de ácido cítrico (20,0 ml), se extrajo con cloroformo (20,0 ml, 3 veces) y la capa orgánica se lavó con una solución acuosa saturada de cloruro sódico, después se secó sobre sulfato sódico anhidro y se filtró. El disolvente en el filtrado se retiró a presión reducida y los residuos obtenidos se purificaron por cromatografía en columna sobre gel de sílice [cloroformo - cloroformo : metanol = 8 : 2 (v/v)] para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (0,333 g, 57 %). RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 8: 0,86 (3H, s a), 1,26 (9H, s), 1,57-1,59 (2H, m), 1,84-1,87 (2H, m), 2,14-2,23 (4H, m), 2,37 (3H, s), 2,67-2,71 (1H, m), 3,04-3,40 (5H, m), 3,54-3,57 (2H, m), 4,13-4,25 (3H, m), 4,58-4,60 (1H, m), 5,08-5,24 (2H, m), 5,41-5,53 (3H, m), 6,53 (1H, s), 7,31-7,46 (6H, m), 7,70-7,89 (6H, m), 8,16-8,24 (1H, m), 8,59-8,61 (1H, m). EM (CLEM) m/z: 971 (M+H)+.
Procedimiento 4: (11S,22S)-11-bencil-22-{ [(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]carbamoil}-1-(9H-fluoren-9-il)-3,6,9,12,15,20-hexaoxo-2-oxa-4, 7, 10, 13, 16, 21-hexaazatetracosanoato de terc-butilo
El compuesto (413 mg, 0,418 mmol) obtenido en el Procedimiento 3 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 3 anterior usando ácido (2S)-2-[[2-[[2-(9H-fluoren-9-ilmetoxicarbonilamino)acetil]amino]acetil]amino]-3-fenil-propanoico en lugar de el compuesto obtenido en el Procedimiento 1 anterior para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo (122,6 mg, 32 %).
RMN 1H (400 MHz, CD3OD) 8: 0,90 (3H, t, J=6,8 Hz), 1,29 (9H, s), 1,40-1,46 (2H, m), 1,66-1,78 (2H, m), 2,20-2,28 (4H, m), 2,25 (3H, s), 2,67 (1H, t, J=8,8 Hz), 2,79-3,18 (6H, m), 3,42-3,47 (1H, m), 3,59-3,91 (6H, m), 4,03 (1H, t, J=6,7 Hz), 4,18-4,21 (1H, m), 4,34-4,41 (2H, m), 4,70 (1H, t, J=6,5 Hz), 5,17 (2H, t, J=18,2 Hz), 5,41-5,45 (3H, m), 7,15-7,25 (9H, m), 7,34-7,41 (2H, m), 7,50 (2H, d, J=7,4 Hz), 7,60-7,63 (2H, m).
EM (CLEM) m/z: 1232 (M+H)+.
Procedimiento 5: (3S,14S)-14-bencil-27-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)-3-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4' :6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]carbamoil}-5,10,13,16,19,22-hexaoxo-4,9,12,15,18,21-hexaazaheptacosanoato de terc-butilo
El compuesto (100 mg, 81,1 pmol) obtenido en el Procedimiento 4 anterior se disolvió en N,N-dimetilformamida (3,00 ml), se cargó con piperidina (9,64 pl, 97,4 pmol) y se agitó durante 1 hora. El disolvente se retiró por sequedad a presión reducida y los residuos obtenidos se disolvieron en N,N-dimetilformamida (5,00 ml). Después de la adición de 6-maleimidohexanoato de N-succinimidilo (30,0 mg, 97,4 pmol), se agitó durante 2 días. Después de la adición de una solución acuosas al 10 % de ácido cítrico (20,0 ml), se extrajo con cloroformo (20,0 ml, 3 veces) y la capa orgánica se lavó con una solución acuosa saturada de cloruro sódico, después se secó sobre sulfato sódico anhidro y se filtró. El disolvente en el filtrado se retiró a presión reducida y los residuos obtenidos se purificaron por cromatografía en columna sobre gel de sílice [cloroformo : metanol = 10 : 1 (v/v)] para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (15,5 mg, 16 %).
RMN 1H (400 MHz, CD3OD) 8: 0,98 (3H, t, J=7,3 Hz), 1,21-1,30 (2H, m), 1,33 (9H, s), 1,44-1,79 (6H, m), 1,93-1,94 (1H, m), 2,16-2,48 (6H, m), 2,40 (3H, s), 2,70-2,81 (1H, m), 2,95-3,00 (2H, m), 3,13-3,21 (3H, m), 3,39-3,51 (4H, m), 3,75-3,93 (6H, m), 4,39-4,44 (1H, m), 4,61 (2H, s), 5,07-5,16 (1H, m), 5,35 (2H, dd, J=17,3, 5,1 Hz), 5,55-5,60 (2H, m), 6,76 (2H, s), 7,20-7,26 (5H, m), 7,56-7,58 (2H, m).
EM (CLEM) m/z: 1203 (M+H)+.
Procedimiento 6: ácido (3S,14S)-14-bencil-27-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)-3-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-lH,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]carbamoil}-5,10,13,16,19,22-hexaoxo-4,9,12,15,18,21-hexaazaheptacosanoico
El compuesto (15,5 mg, 12,9 |jmol) obtenido en el Procedimiento 5 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 2 del Ejemplo 1 para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (5,50 mg, 37 %).
RMN 1H (400 MHz, CD3OD) 8: 0,99 (3H, t, J=7,4 Hz), 1,22-1,30 (2H, m), 1,49-1,79 (6H, m), 1,94 (1H, t, J=7,8 Hz), 2,20-2,22 (4H, m), 2,30-2,40 (2H, m), 2,39 (3H, s), 2,72-2,77 (2H, m), 2,87-3,26 (6H, m), 3,43-3,51 (2H, m), 3,59-3,69 (2H, m), 3,77-3,87 (4H, m), 4,38-4,45 (1H, m), 4,69 (2H, c, J=6,7 Hz), 5,15 (1H, t, J=18,0 Hz), 5,32-5,38 (2H, m), 5,51 5,60 (2H, m), 6,76 (2H, s), 7,19-7,23 (5H, m), 7,53-7,55 (2H, m).
EM (CLEM) m/z: 1147 (M+H)+.
Procedimiento 7: Conjugado anticuerpo-fármaco (56)
Usando el trastuzumab producido en el ejemplo de referencia 1 y el compuesto obtenido en el Procedimiento 6 anterior, el conjugado anticuerpo-fármaco titulado se obtuvo de la misma manera que el Procedimiento 6 del Ejemplo 2. Concentración de anticuerpo: 1,60 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 9,6 mg (77 %), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 2,8.
Ejemplo 57 Conjugado anticuerpo-fármaco (57)
Usando el trastuzumab producido en ejemplo de referencia 1 y el compuesto obtenido en el Procedimiento 6 del Ejemplo 56, el conjugado anticuerpo-fármaco titulado se obtuvo de la misma manera que el Procedimiento 1 del Ejemplo 3. Concentración de anticuerpo: 1,53 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 9,2 mg (74 %), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 5,1.
Ejemplo 58 Conjugado anticuerpo-fármaco (58)
Procedimiento 1: (3S,12S)-12-bencil-21-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-3-{[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]amino}-4,7,10,13,16,21-hexaoxo-5,8,11,14,17-pentaazaheneicosan-1-oato de ferc-butilo
Se disolvió ácido (2S)-4-ferc-butoxi-2-{[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]amino}-4-oxobutanoico (0,625 g, 1,52 mmol) en diclorometano (10,0 ml), se cargó con N-hidroxisuccinimida (0,175 g, 1,52 mol) y clorhidrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida (0,291 g, 1,52 mmol) y se agitó durante 1 hora. La solución de reacción se añadió gota a gota a una solución de N,N-dimetilformamida (10,0 ml) se cargó con el compuesto (1,00 g, 1,01 mmol) obtenido en el Procedimiento 2 del Ejemplo 2 y se agitó a temperatura ambiente durante 20 horas. El disolvente se retiró a presión reducida y el residuo obtenido se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice [cloroformo - cloroformo : metanol = 8 : 2 (v/v)] para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (0,873 g, 70 %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-da):
0,88 (3H, t, J=7,4 Hz), 1,37 (9H, s), 1,68-1,78 (2H, m), 1,81-1,93 (2H, m), 2,10-2,23 (4H, m), 2,41 (3H, s), 2,68-2,85 (3H, m), 2,99-3,22 (5H, m), 3,58-3,81 (6H, m), 4,19-4,36 (3H, m), 4,38-4,52 (2H, m), 5,17 (1H, d, J=19,2 Hz), 5,25 (1H, d, J=19,2 Hz), 5,43 (2H, s), 5,54-5,62 (1H, m), 6,55 (1H, s), 7,15-7,34 (8H, m), 7,41 (2H, t, J=7,2 Hz), 7,66-7,75 (4H, m), 7,81 (1H, d, J=11,0 Hz), 7,88 (2H, d, J=7,4 Hz), 8,01-8,06 (1H, m), 8,14 (1H, d, J=8,2 Hz), 8,17-8,22 (1H, m), 8,25 8,30 (1H, m), 8,47 (1H, d, J=8,6 Hz). EM (CLEM) m/z: 1232 (M+H)+.
Procedimiento 2: (3S,12S)-12-bencil-3-{[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil]amino}-21-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2
b]quinolin-1-il]amino}-4,7,10,13,16,21-hexaoxo-5,8,11,14,17-pentaazaheneicosan-1-oato de ferc-butilo
El compuesto (0,800 g, 0,649 mmol) obtenido en el Procedimiento 1 anterior se disolvió en N,N-dimetilformamida (3,00 ml), se cargó con piperidina (0,643 ml, 6,49 mmol) y se agitó durante 1 hora. El disolvente se retiró por sequedad a presión reducida y los residuos obtenidos se disolvieron en N,N-dimetilformamida (10 ml). Después de la adición de 6-maleimidohexanoato de N-succinimidilo (0,300 g, 0,974 mmol) se agitó durante 20 horas. El disolvente se retiró a presión reducida y los residuos obtenidos se purificaron por cromatografía en columna sobre gel de sílice [[cloroformo - cloroformo : metanol = 8 : 2 (v/v)] para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (0,224 g, 29 %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-da) 8: 0,87 (3H, t, J=7,6 Hz), 1,15-1,22 (2H, m), 1,35 (9H, s), 1,44-1,47 (4H, m), 1,71-1,73 (2H, m), 1,80-1,91 (2H, m), 2,08 (2H, t, J=7,6 Hz), 2,13-2,20 (4H, m), 2,40 (3H, s), 2,67 (1H, dt, J=11,1,4,8 Hz), 2,78 (1H, dd, J=13,6, 9,4 Hz), 2,99-3,17 (6H, m), 3,31-3,36 (2H, m), 3,57-3,76 (6H, m), 4,45-4,47 (1H, m), 4,57-4,60 (1H, m), 5,16 (1H, d, J=18,7 Hz), 5,25 (1H, d, J=18,7 Hz), 5,42 (2H, s), 5,55-5,60 (1H, m), 6,53 (1H, s), 6,99 (2H, s), 7,15 7,27 (5H, m), 7,31 (1H, s), 7,70 (1H, t, J=5,4 Hz), 7,80 (1H, d, J=10,9 Hz), 7,99 (1H, t, J=5,7 Hz), 8,09-8,12 (3H, m), 8,25 (1H, t, J=6,0 Hz), 8,45 (1H, d, J=9,1 Hz).
EM (CLEM) m/z: 1203 (M+H)+.
Procedimiento 3: N-[6-(2,5-Dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil]-L-a-aspartilglicilglicil-L-fenilalanil-N-(4-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-4-oxobutil)glicinamida
El compuesto (0,224 g, 0,186 mmol) obtenido en el Procedimiento 2 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 2 del Ejemplo 1 para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (21,2 mg, 10 %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 8: 0,87 (3H, t, J=7,2 Hz), 1,13-1,21 (2H, m), 1,42-1,45 (6H, m), 1,70-1,72 (2H, m), 1,85 1,88 (2H, m), 2,06-2,20 (6H, m), 2,39 (3H, s), 2,63-2,67 (1H, m), 2,78-2,81 (1H, m), 3,04-3,12 (6H, m), 3,63-3,70 (6H, m), 4,46-4,52 (2H, m), 5,16 (1H, d, J=19,2 Hz), 5,25 (1H, d, J=18,8 Hz), 5,42 (2H, s), 5,55-5,58 (1H, m), 6,53 (1H, s), 6,99 (2H, s), 7,18-7,23 (6H, m), 7,30 (1H, s), 7,71 (1H, t, J=5,5 Hz), 7,79 (1H, d, J=10,9 Hz), 7,99-8,02 (1H, m), 8,10 8,11 (3H, m), 8,27-8,30 (1H, m), 8,47-8,50 (1H, m).
EM (CLEM) m/z: 1147 (M+H)+.
Procedimiento 8: Conjugado anticuerpo-fármaco (58)
Reducción del anticuerpo: El trastuzumab producido en el ejemplo de referencia 1 se preparó para tener una concentración de anticuerpo de 10 mg/ml con PBS6,0/EDTA usando el procedimiento común B (como coeficiente de absorción a 280 nm, se usaron 1,37 mlmg_1 cirr1) y el procedimiento común C-1. La solución (1 ml) se puso en un tubo de 1,5 ml y se cargó con una solución acuosa de clorhidrato de tris(2-carboxietil)fosfina 10 mM (TCEP, Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,032 ml) y una solución acuosa 1 M de hidrogenofosfato dipotásico (Nacalai Tesque, Inc.; 0,100 ml) para preparar una solución de reacción en la cual la relación molar de TCEP al anticuerpo fue de 4,6. Después de confirmarse que la solución tenía un pH de 7,4 ± 0,1, el enlace disulfuro en la parte de la bisagra del anticuerpo se redujo mediante incubación a 37 °C durante 1 hora.
Conjugación entre el anticuerpo y enlazador de fármaco: Después de la adición de una solución de DMSO que contenía 10 mM del compuesto obtenido en el Procedimiento 3 anterior (0,062 ml) a la solución anterior a temperatura ambiente para preparar una solución de reacción en la cual la relación molar del enlazador de fármaco al anticuerpo fue de 9,2, se agitó usando un rotador de tubo (MTR-103, fabricado por AS ONE Corporation) para conjugar el enlazador de fármaco con el anticuerpo a temperatura ambiente durante 40 minutos. A continuación, se añadió una solución acuosa (0,0062 ml) de 100 mM de N-acetilcisteína (NAC) para preparar una solución de reacción en la cual la relación molar de NAC al anticuerpo fue de 18,4, y se agitó a temperatura ambiente para terminar la reacción del enlazador fármaco durante otros 20 minutos.
Purificación: La solución anterior se sometió a purificación usando el procedimiento común D-1 (PBS6,0 se usó como solución tampón) para producir 6 ml de una solución que contenía el compuesto de interés.
Concentración de anticuerpo: 1,22 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 7,3 mg (73 %), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 4,4.
Ejemplo 59 Conjugado anticuerpo-fármaco (59)
Reducción del anticuerpo: El trastuzumab producido en el ejemplo de referencia 1 se preparó para tener una concentración de anticuerpo de 10 mg/ml con PBS6,0/EDTA usando el procedimiento común B (como coeficiente de absorción a 280 nm, se usaron 1,37 mlmg-1 cm-1) y el procedimiento común C-1. La solución (1 ml) se puso en un tubo de 1,5 ml y se cargó con una solución acuosa de TCEP 10 mM (0,016 ml) y una solución acuosa de hidrogenofosfato dipotásico 1 M (0,050 ml) para preparar una solución de reacción en la cual la relación molar de TCEP al anticuerpo fue 2,3. Después de confirmarse que la solución tenía un pH de 7,4 ± 0,1, el enlace disulfuro en la parte de la bisagra del anticuerpo se redujo mediante incubación a 37 °C durante 1 hora.
Conjugación entre el anticuerpo y enlazador de fármaco: Después de la adición de una solución de DMSO que contenía 10 mM del compuesto obtenido en el Procedimiento 3 del Ejemplo 58 (0,031 ml) a la solución anterior a temperatura ambiente para preparar una solución de reacción en la cual la relación molar del enlazador de fármaco al anticuerpo fue de 4,6, se agitó usando un tubo rotador para conjugar el enlazador de fármaco con el anticuerpo a temperatura ambiente durante 40 minutos. A continuación, se añadió a la misma una solución acuosa (0,0062 ml) de NAC 100 mM para preparar una solución de reacción en la cual la relación molar de NAC al anticuerpo fue de 9,2 y se agitó a temperatura ambiente para terminar la reacción del enlazador fármaco durante otros 20 minutos.
Purificación: La solución anterior se sometió a purificación usando el procedimiento común D-1 (PBS6,0 se usó como solución tampón) para producir 6 ml de una solución que contenía el compuesto de interés. Dos lotes de esta muestra se prepararon para producir 12 ml en total, 8 ml de los cuales se concentraron para producir 2,5 ml de una solución que contenía el compuesto de interés. Usando el procedimiento común B, el procedimiento común E y el procedimiento común F, se obtuvieron los siguientes valores característicos. Concentración de anticuerpo: 3,82 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 9,6 mg (72 %), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 2,2.
Ejemplo 60 Conjugado anticuerpo-fármaco (60)
Procedimiento 1: Conjugado anticuerpo-fármaco (60)
Una solución que contenía el compuesto de interés se obtuvo de la misma manera como en el Procedimiento 4 del Ejemplo 58 excepto que la cantidad del anticuerpo usado como un material de partida se cambió a 80 mg (es decir, 8 ml de una solución que tenía una concentración de anticuerpo de 10 mg/ ml con PBS6,0/EDTA como medio) y el recipiente de reacción se cambió a un tubo de polipropileno de 50 ml. Usando un filtro centrífugo de ultrafiltración (Amicon Ultra-4, corte de peso molecular: 50 k), la concentración se realizó para producir 13 ml de una solución que contenía el compuesto de interés. Se obtuvieron los siguientes valores característicos.
Concentración de anticuerpo: 4,16 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 54 mg (68 %), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 4,8.
Ejemplo 61 Conjugado anticuerpo-fármaco (61)
Una solución que contenía el compuesto de interés se obtuvo de la misma manera como en el Procedimiento 1 del Ejemplo 59 excepto que la cantidad del anticuerpo usado como un material de partida se cambió a 80 mg (es decir, 8
ml de una solución que tenía una concentración de anticuerpo de 10 mg/ ml con PBS6,0/EDTA como medio) y el recipiente de reacción se cambió a un tubo de polipropileno de 50 ml. Usando un filtro centrífugo de ultrafiltración (Amicon Ultra-4, corte de peso molecular: 50 k), la concentración se realizó para producir 17 ml de una solución que contenía el compuesto de interés. Se obtuvieron los siguientes valores característicos.
Concentración de anticuerpo: 3,79 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 64 mg (80 %), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 3,1.
Ejemplo 62 Conjugado anticuerpo-fármaco (62)
Procedimiento 1: Conjugado anticuerpo-fármaco (62)
Reducción del anticuerpo: El trastuzumab producido en el ejemplo de referencia 1 se preparó para tener una concentración de anticuerpo de 10 mg/ml con PBS6,0/EDTA usando el procedimiento común B (como coeficiente de absorción a 280 nm, se usaron 1,37 mlmg-1 cm-1) y el procedimiento común C-1. La solución (5,0 ml) se recogió en un tubo de 15 ml y se cargó con una solución acuosa de TCEP 30 mM (0,0777 ml; 6,9 equivalentes por molécula de anticuerpo) y una solución acuosa de hidrogenofosfato dipotásico 1 M (0,250 ml). Después de confirmarse que la solución tenía un pH de 7,4 ± 0,1, el enlace disulfuro en la parte de la bisagra del anticuerpo se redujo mediante incubación a 37 °C durante 1 hora.
Conjugación entre el anticuerpo y enlazador de fármaco: Después de la incubación de la solución anterior durante 10 minutos a 22 °C, una solución de DMSO (0,1555 ml; 13,8 equivalentes por molécula de anticuerpo) que contenía 30 mM del compuesto obtenido en el Procedimiento 3 del Ejemplo 58 se añadió a la misma y se incubó para conjugar el enlazador fármaco al anticuerpo a 22 °C durante 40 minutos. A continuación, una solución acuosa (0,0933 ml; 27,6 equivalentes por molécula de anticuerpo) de NAC 100 mM se añadió a la misma y se incubó a 22 °C para terminar la reacción del enlazador fármaco durante otros 20 minutos. Purificación: La solución anterior se sometió a purificación usando el procedimiento común D-1 (se usó ABS como solución tampón) para producir una solución que contenía el compuesto de interés.
Caracterización fisicoquímica: Usando el procedimiento común B, el procedimiento común E y el procedimiento común F, se obtuvieron los siguientes valores característicos. Concentración de anticuerpo: 3,35 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 29,5 mg (59 %), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 7,4.
Ejemplo 63 Conjugado anticuerpo-fármaco (63)
A una solución de N,N-dimetilformamida (50,0 ml) de 2-{2-[2-(2-hidroxietoxi)etoxi]etoxi}etil4-metilbencenosulfonato (Bioorg. Med. Chem. Lett., 2011, Vol. 21, pág. 550; 1,75 g, 5,00 mmol) y clorhidrato del éster ferc-butílico de glicina (1,26 g, 7,52 mmol), se le añadió N,N-diisopropiletilamina (1,94 g, 15,0 mmol) y se agitó a 60 °C durante 10 horas. La solución de reacción se cargó con cloroformo. La capa orgánica se lavó con ácido clorhídrico 1 N y la capa orgánica obtenida se secó sobre sulfato sódico y se filtró. El disolvente se retiró a presión reducida y el residuo obtenido se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice [cloroformo - cloroformo : metanol = 8 : 1 (v/v)] para producir el compuesto del título en forma de una sustancia oleosa incolora (426 mg, 28 %).
RMN 1H (400 MHz, CDCls) 8: 1,47 (9H, s), 2,80 (2H, t, J=5,3 Hz), 3,32 (2H, s), 3,76-3,54 (17H, m).
Procedimiento 2: N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil]-N-(2-{2-[2-(2-hidroxietoxi)etoxi]etoxi}etil)glicinato de ferc-butilo
El compuesto (426 mg, 1,39 mmol) obtenido en el Procedimiento 1 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 8 del Ejemplo 5 para producir el compuesto del título en forma de una sustancia oleosa incolora (489 mg, 70 %).
RMN 1H (400 MHz, CDCls) 8: 1,28-1,36 (2H, m), 1,45 (9H, s), 1,57-1,71 (4H, m), 2,39 (2H, t, J=7,3 Hz), 3,48-3,76 (3H, m), 4,02 (2H, s), 6,68 (2H, s).
Procedimiento 3: N-[6-(2,5-Dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil]-N-(2-{2-[2-(2-hidroxietoxi)etoxi]etoxi}etil)glicina
El compuesto (489 mg, 0,977 mmol) obtenido en el Procedimiento 2 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 2 del Ejemplo 1 para producir el compuesto del título en forma de un sólido incoloro (211 mg, 49 %).
RMN 1H (400 MHz, CDCla) 8: 1,38-1,28 (2H, m), 1,73-1,55 (4H, m), 2,28 (2H, t, J=7,0 Hz), 3,50-3,79 (18H, m), 4,12 (2H, s), 6,68 (2H, s).
Procedimiento 4: N-[6-(2,5-Dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil]-N-(2-{2-[2-(2-hidroxietoxi)etoxi]etoxi}etil)glicilglicilglicil-L-fenilalanil-N-(4-[[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-4-oxobutil)glicinamida
El compuesto (48,9 mg, 0,110 mmol) obtenido en el Procedimiento 3 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 1 del Ejemplo 1 usando el compuesto (84,0 mg, 0,100 mmol) obtenido en el Procedimiento 2 del Ejemplo 2 en lugar de la sal del ácido metanosulfónico de exatecán para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (54,0 mg, 43 %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-da) 8 : 0,87 (3H, t, J=7,2 Hz), 1,14-1,26 (2H, m), 1,39-1,51 (4H, m), 1,68-1,76 (2H, m), 1,81 1,91 (2H, m), 2,08-2,23 (4H, m), 2,40 (3H, s), 2,73-2,84 (1H, m), 2,98-3,21 (5H, m), 3,25-3,79 (26H, m), 3,93 (2H, s), 4 ,43 -4 ,49 (1H, m), 4,54-4,61 (1H, m), 5,21 (2H, c, J=18,6 Hz), 5,42 (2H, s), 5,54-5,60 (1H, m), 6,53 (1H, s), 7,00 (2H, s), 7,14-7,27 (5H, m), 7,31 (1H, s), 7,68-7,74 (1H, m), 7,80 (1H, d, J=11,0 Hz), 8,02-8,32 (4H, m), 8,46 (1H, d, J=8 ,6 Hz). EM (IEN) m/z: 1265 (M+H)+.
Procedimiento 5: Conjugado anticuerpo-fármaco (63)
Reducción del anticuerpo: El trastuzumab producido en el ejemplo de referencia 1 se preparó para tener una concentración de anticuerpo de 10 mg/ml reemplazando el medio con PBS6,0/EDTA usando el procedimiento común C-1 y el procedimiento común B (como coeficiente de absorción a 280 nm, se usaron 1,37 mlmg'1 c irr1). La solución (1,25 ml) se puso en un tubo de polipropileno de 1,5 ml y se cargó con una solución acuosa de TCEP 10 mM (0,019 ml; 2,3 equivalentes por molécula de anticuerpo) y una solución acuosa de hidrogenofosfato dipotásico 1 M (0,0625 ml). Después de confirmarse que la solución tenía un pH de 7,4 ± 0,1, el enlace disulfuro en la parte de la bisagra del anticuerpo se redujo mediante incubación a 37 °C durante 1 hora.
Conjugación entre el anticuerpo y enlazador de fármaco: Después de añadir DMSO (Sigma-Aldrich Co. LLC; 0,109 ml) y una solución de DMSO que contenía 10 mM del compuesto obtenido en el Procedimiento 4 anterior (0,039 ml; 4,6 equivalentes por molécula de anticuerpo) a la solución anterior a temperatura ambiente, se agitó usando un tubo rotador para conjugar el enlazador de fármaco con el anticuerpo a temperatura ambiente durante 40 minutos. A continuación, una solución acuosa (0,008 ml) de NAC 100 mM se añadió a la misma y se agitó a temperatura ambiente para terminar la reacción del fármaco enlazador durante otros 20 minutos.
Purificación: La solución anterior se sometió a purificación usando el procedimiento común D-1 (se usó ABS como solución tampón) para producir 6 ml de una solución que contenía el compuesto de interés.
Caracterización fisicoquímica: Usando el procedimiento común B y el procedimiento común E, se obtuvieron los siguientes valores característicos.
Concentración de anticuerpo: 1,76 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 10,6 mg (84%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 2,9.
Ejemplo 64 Conjugado anticuerpo-fármaco (64)
Reducción del anticuerpo: El trastuzumab producido en el ejemplo de referencia 1 se preparó para tener una concentración de anticuerpo de 10 mg/ml reemplazando el medio con PBS6,0/EDTA usando el procedimiento común C-1 y el procedimiento común B (como coeficiente de absorción a 280 nm, se usaron 1,37 mlmg-1 cirr1). La solución (1,25 ml) se puso en un tubo de polipropileno de 1,5 ml y se cargó con una solución acuosa de TCEP 10 mM (0,039 ml; 4,6 equivalentes por molécula de anticuerpo) y una solución acuosa de hidrogenofosfato dipotásico 1 M (0,0625 ml). Después de confirmarse que la solución tenía un pH de 7,4 ± 0,1, el enlace disulfuro en la parte de la bisagra del anticuerpo se redujo mediante incubación a 37 °C durante 1 hora.
Conjugación entre el anticuerpo y enlazador de fármaco: Después de añadir DMSO (Sigma-Aldrich Co. LLC; 0,072 ml) y una solución de DMSO que contenía 10 mM del compuesto obtenido en el Procedimiento 4 del Ejemplo 63 (0,078 ml; 9,2 equivalentes por molécula de anticuerpo) a la solución anterior a temperatura ambiente, se agitó usando un tubo rotador para conjugar el enlazador de fármaco con el anticuerpo a temperatura ambiente durante 40 minutos. A continuación, una solución acuosa (0,0155 ml) de NAC 100 mM se añadió a la misma y se agitó a temperatura ambiente para terminar la reacción del fármaco enlazador durante otros 20 minutos.
Purificación: La solución anterior se sometió a purificación usando el procedimiento común D-1 (se usó ABS como solución tampón) para producir 6 ml de una solución que contenía el compuesto de ejemplo de interés. Caracterización fisicoquímica: Usando el procedimiento común B y el procedimiento común E, se obtuvieron los siguientes valores característicos.
Concentración de anticuerpo: 1,74 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 10,4 mg (83%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 5,6.
Ejemplo 65 Conjugado anticuerpo-fármaco (65)
[Formula 118]
Procedimiento 1: N-(íerc-Butoxicarbonil)-p-alanilglicilglicil-L-fenilalanil-N-(4-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,l3,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-4-oxobutil)glicinamida
El compuesto (0,839 g, 1,00 mmol) obtenido en el Procedimiento 2 del Ejemplo 2 se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 8 del Ejemplo 5 usando N-(terc-butoxicarbonN)-p-alanina en lugar de 6-maleimidohexanoato de N-succinimidilo y el producto en bruto obtenido se usó para el siguiente procedimiento sin purificación.
Procedimiento 2: p-Alanilglicilglicil-L-fenilalanil-N-(4-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,l2H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-4-oxobutil)glicinamida
El producto en bruto obtenido en el Procedimiento 1 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 2 del Ejemplo 1 para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (0,610 g, 67 %, 2 etapas).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-da) 8: 0,87 (3H, t, J=7,4 Hz), 1,67-1,77 (2H, m), 1,79-1,92 (2H, m), 2,09-2,22 (4H, m), 2,40 (3H, s), 2,46-2,55 (2H, m), 2,82-2,73 (1H, m), 2,95-3,13 (5H, m), 3,14-3,21 (2H, m), 3,55-3,80 (6H, m), 4,44-4,52 (1H, m), 5,20 (2H, dd, J=35,0, 19,0 Hz), 5,42 (2H, s), 5,53-5,60 (1H, m), 6,54 (1H, s), 7,14-7,28 (5H, m), 7,31 (1H, s), 7,67 (2H, s a), 7,72-7,78 (1H, m), 7,80 (1H, d, J=11,0 Hz), 8,10-8,17 (2H, m), 8,29 (1H, t, J=5,9 Hz), 8,42 (1H, t, J=5,7 Hz), 8,47 (1H, d, J=8,6 Hz).
Procedimiento 3: ácido (2S)-5-terc-butoxi-2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-N)-5-oxopentanoico
Se disolvió ácido L-glutámico 5-íerc-butilo (1,02 g, 5,00 mmol) en una solución acuosa saturada de hidrogenocarbonato sódico (20,0 ml), se cargó con N-metoxicarbonilmaleimida (0,775 g, 5,00 mmol) a 0 °C, se agitó a 0 °C durante 30 minutos y después se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. La solución de reacción se volvió ácida mediante la adición de ácido clorhídrico 5 N a 0 °C y después se extrajo con acetato de etilo. La capa orgánica obtenida se secó sobre sulfato sódico y se filtró. El disolvente se retiró a presión reducida para producir un producto en bruto. El producto en bruto obtenido se usó para el siguiente procedimiento sin purificación.
Procedimiento 4: N-[(2S)-5-terc-Butoxi-2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)-5-oxopentanoil]-p-alanilglicilglicil-L-fenilalanil-N-(4-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-4-oxobutil)glicinamida
El producto en bruto (85,0 mg, 0,300 mmol) obtenido en el Procedimiento 3 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 1 del Ejemplo 1 usando el compuesto (182 mg, 0,200 mmol) obtenido en el Procedimiento 2 anterior en lugar de la sal del ácido metanosulfónico de exatecán para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (102 mg, 43 %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-da) 8: 0,87 (3H, t, J=7,2 Hz), 1,35 (9H, s), 1,67-1,76 (2H, m), 1,81-1,90 (2H, m), 2,35-2,05 (10H, m), 2,40 (3H, s), 2,75-2,83 (1H, m), 2,99-3,13 (3H, m), 3,14-3,26 (4H, m), 3,55-3,76 (6H, m), 4,36-4,50 (2H, m), 5,21 (2H, c, J=18,9 Hz), 5,42 (2H, s), 5,54-5,61 (1H, m), 6,53 (1H, s), 7,03 (2H, s), 7,17-7,26 (5H, m), 7,31 (1H, s), 7,68-7,73 (1H, m), 7,80 (1H, d, J=10,6 Hz), 8,00-8,05 (2H, m), 8,12 (1H, d, J=7,8 Hz), 8,16-8,20 (1H, m), 8,23-8,28 (1H, m), 8,46 (1H, d, J=8,6 Hz).
Procedimiento 5: N-[(2S)-4-Carboxi-2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)butanoil]-p-alanilglicilglicil-L-fenilalanil-N-(4-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-4-oxobutil)glicinamida
El compuesto (102 mg, 86,8 pmol) obtenido en el Procedimiento 4 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 2 del Ejemplo 1 para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (76,0 mg, 78 %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 8: 0,87 (3H, t, J=7,4 Hz), 1,68-1,75 (2H, m), 1,84-1,91 (2H, m), 2,35-2,05 (10H, m), 2,40 (3H, s), 2,74-2,83 (1H, m), 2,99-3,12 (3H, m), 3,14-3,26 (4H, m), 3,55-3,77 (6H, m), 4,41-4,49 (2H, m), 5,21 (2H, dd, J=38,7, 18,8 Hz), 5,42 (2H, s), 5,54-5,61 (1H, m), 6,54 (1H, s), 7,03 (2H, s), 7,15-7,27 (5H, m), 7,31 (1H, s), 7,69-7,74 (1H, m), 7,80 (1H, d, J=10,9 Hz), 8,01-8,07 (2H, m), 8,12 (1H, d, J=8,2 Hz), 8,19 (1H, t, J=5,5 Hz), 8,27 (1H, t, J=6,3 Hz), 8,47 (1H, d, J=8,6 Hz), 12,12 (1H, s).
EM (IEN) m/z: 1119 (M+H)+.
Procedimiento 6: Conjugado anticuerpo-fármaco (65)
Usando el trastuzumab producido en el ejemplo de referencia 1 y el compuesto obtenido en el Procedimiento 5 anterior, el conjugado anticuerpo-fármaco titulado se obtuvo de la misma manera que el Procedimiento 6 del Ejemplo 2. Concentración de anticuerpo: 1,39 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 8,3 mg (66 %), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 3,6.
Ejemplo 66 Conjugado anticuerpo-fármaco (66)
Usando el trastuzumab producido en ejemplo de referencia 1 y el compuesto obtenido en el Procedimiento 5 del Ejemplo 65, el conjugado anticuerpo-fármaco titulado se obtuvo de la misma manera que el Procedimiento 1 del Ejemplo 3. Concentración de anticuerpo: 1,45 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 8,7 mg (70 %), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 6,5.
Ejemplo 67 Conjugado anticuerpo-fármaco (67)
[Fórmula 120]
Procedimiento 1: N-[(9H-Fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]glicilglicil-N-(4-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-4-oxobutil)-L-fenilalaninamida
El compuesto (300 mg, 0,473 mmol) obtenido en el Procedimiento 2 del Ejemplo 1 se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 1 del Ejemplo 1 usando N-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]glicilglicil-L-fenilalanina (Patente japonesa abierta a inspección pública n.° 2002-60351; 346 mg, 0,691 mmol) en lugar de ácido 4-(terc-butoxicarbonilamino)butanoico para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (230 mg, 40 %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-da) ó: 0,85 (3H, t, J=7,2 Hz), 1,67-1,68 (2H, m), 1,81-1,84 (2H, m), 2,13 (4H, t, J=6,8 Hz), 2,39 (3H, s), 2,76 (1H, t, J=11,4 Hz), 2,96-3,08 (4H, m), 3,16-3,17 (2H, m), 3,59-3,74 (4H, m), 4,22-4,28 (2H, m), 4,39 4,42 (1H, m), 5,16-5,22 (2H, m), 5,36-5,41 (2H, m), 5,56-5,59 (1H, m), 6,52 (1H, s), 7,14-7,20 (5H, m), 7,29-7,31 (3H, m), 7,38-7,41 (2H, m), 7,61 (1H, t, J=6,0 Hz), 7,69 (2H, d, J=7,4 Hz), 7,79 (1H, d, J=11,0 Hz), 7,87 (2H, d, J=7,8 Hz), 7,95 (1H, s), 8,07 (2H, t, J=4,3 Hz), 8,42 (1H, d, J=8,6 Hz).
EM (CLEM) m/z: 1004 (M+H)+.
Procedimiento 2: Glicilglicil-N-(4-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4' :6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-4-oxobutil)-L-fenilalaninamida
A una solución de N,N-dimetilformamida (1,00 ml) del compuesto (226 mg, 0,225 mmol) obtenido en el Procedimiento 1 anterior, se le añadió piperidina (0,223 ml, 2,25 mmol) y se agitó a temperatura ambiente durante 5 horas. El
disolvente se retiró a presión reducida para dar un mezcla que contenía el compuesto del título. La mezcla se usó en la siguiente reacción sin purificación adicional.
Procedimiento 3: (3S,12S)-12-bencil-18-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-3-{[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]amino}-4,7,10,13,18-pentaoxo-5,8,11,14-tetraazaoctadecan-1-oato de ferc-butilo
El compuesto (0,225 mmol) obtenido en el Procedimiento 2 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 1 del Ejemplo 1 usando ácido N-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-L-aspártico 4-ferc-butil (104 mg, 0,337 mmol) en lugar de ácido 4-(ferc-butoxicarbonilamino)butanoico para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (114 mg, 43%). RMN 1H (400 MHz, DMSO-da) 8: 0,86 (3H, t, J=7,2 Hz), 1,35 (9H, s), 1,66-1,69 (2H, m), 1,84-1,85 (2H, m), 2,11-2,13 (4H, m), 2,39 (3H, s), 2,43-2,45 (1H, m), 2,68-2,79 (2H, m), 2,94 3,16 (5H, m), 3,66 (5H, tt, J=30,5, 10,0 Hz), 4,23-4,30 (3H, m), 4,39-4,41 (1H, m), 5,15 (1H, d, J=19,2 Hz), 5,21 (1H, d, J=18,8 Hz), 5,37 (1H, d, J=17,2 Hz), 5,42 (1H, d, J=16,0 Hz), 5,53-5,57 (1H, m), 6,54 (1H, s), 7,15-7,22 (5H, m), 7,26-7,34 (3H, m), 7,38-7,40 (2H, m), 7,68-7,70 (2H, m), 7,79 (1H, d, J=10,9 Hz), 7,86-7,87 (2H, m), 7,88-7,90 (1H, m), 7,96 (1H, t, J=6,3 Hz), 8,03-8,07 (2H, m), 8,20 (1H, t, J=5,5 Hz), 8,43 (1H, d, J=8,6 Hz). EM (CLEM) m/z: 1175 (M+H)+.
Procedimiento 4: (3S,12S)-3-amino-12-bencil-18-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-4,7,10,13,18-pentaoxo-5,8,11,14-tetraazaoctadecan-1-oato de ferc-butilo
El compuesto (110 mg, 0,0936 mmol) obtenido en el Procedimiento 3 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 2 anterior para producir una mezcla que contenía el compuesto del título. La mezcla se usó en la siguiente reacción sin purificación adicional.
Procedimiento 5: (3S,12S)-12-bencil-3-{[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil]amino}-18-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]aminol-4,7,10,13,18-pentaoxo-5,8,11,14-tetraazaoctadecan-1-oato de ferc-butilo
El compuesto (0,0936 mmol) obtenido en el Procedimiento 4 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 8 del Ejemplo 5 para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (40,2 mg, 38 %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 8: 0,86 (3H, t, J=7,4 Hz), 1,17-1,19 (2H, m), 1,35 (9H, s), 1,44-1,47 (4H, m), 1,66-1,67 (2H, m), 1,81-1,88 (2H, m), 2,06-2,13 (6H, m), 2,39-2,41 (1H, m), 2,40 (3H, s), 2,67 (1H, dd, J=16,0, 5,5 Hz), 2,76 (1H, dd, J=13,3, 9,0 Hz), 2,96 (1H, dd, J=13,5, 4,9 Hz), 3,04 (2H, td, J=13,4, 6,6 Hz), 3,18 (2H, s), 3,36 (2H, d, J=7,0 Hz), 3,58 (1H, dd, J=16,8, 5,5 Hz), 3,70 (3H, dt, J=21,5, 7,2 Hz), 4,38-4,41 (1H, m), 4,57-4,59 (1H, m), 5,16 (1H, d, J=18,8 Hz), 5,24 (1H, d, J=19,2 Hz), 5,38 (1H, d, J=16,4 Hz), 5,43 (1H, d, J=16,0 Hz), 5,57-5,58 (1H, m), 6,54 (1H, s), 6,99 (2H, s), 7,13-7,25 (5H, m), 7,31 (1H, s), 7,80 (1H, d, J=10,9 Hz), 7,94-8,04 (3H, m), 8,13-8,16 (2H, m), 8,43 (1H, d, J=8,6 Hz).
EM (CLEM) m/z: 1146 (M+H)+.
Procedimiento 6: N-[6-(2,5-Dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil]-L-a-aspartilglicilglicil-N-(4-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-4-oxobutil)-L-fenilalaninamida
El compuesto (40,0 mg, 0,0349 mmol) obtenido en el Procedimiento 5 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 2 del Ejemplo 1 para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (33,6 g, 88 %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 8: 0,87 (3H, c, J=7,2 Hz), 1,14-1,20 (2H, m), 1,46 (4H, td, J=14,8, 7,3 Hz), 1,67 (2H, td, J=12,9, 6,3 Hz), 1,84 (2H, dc, J=25,5, 7,2 Hz), 2,11 (6H, dt, J=23,4, 7,3 Hz), 2,39 (3H, s), 2,45-2,47 (1H, m), 2,69 (1H, dd, J=16,5, 5,5 Hz), 2,76 (1H, dd, J=13,7, 9,3 Hz), 2,94-3,01 (1H, m), 3,05 (2H, dc, J=25,1,6,4 Hz), 3,17-3,19 (1H, m), 3,34-3,46 (4H, m), 3,59 (1H, dd, J=16,6, 5,6 Hz), 3,69 (2H, dt, J=20,1,6,8 Hz), 4,37-4,41 (1H, m), 4,55 (1H, dd, J=13,5, 7,7 Hz), 5,16 (1H, d, J=19,0 Hz), 5,22 (1H, d, J=18,6 Hz), 5,38 (1H, d, J=16,4 Hz), 5,43 (1H, d, J=16,4 Hz), 5,55-5,59 (1H, m), 6,54 (1H, s), 6,99 (2H, s), 7,19 (5H, dc, J=31,6, 7,9 Hz), 7,31 (1H, s), 7,79 (1H, d, J=11,0 Hz), 7,99 (3H, ddd, J=25,1, 14,2, 6,2 Hz), 8,11 (1H, t, J=5,5 Hz), 8,17 (1H, d, J=7,6 Hz), 8,44 (1H, d, J=8,5 Hz), 12,32 (1H, s).
EM (CLEM) m/z: 1090 (M+H)+.
Procedimiento 7: Conjugado anticuerpo-fármaco (67)
Usando el trastuzumab producido en el ejemplo de referencia 1 y el compuesto obtenido en el Procedimiento 6 anterior, el conjugado anticuerpo-fármaco titulado se obtuvo de la misma manera que el Procedimiento 6 del Ejemplo 2. Después de eso, la solución se concentró mediante el procedimiento común A. Concentración del anticuerpo: 17,6 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 8,8 mg (70 %), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 3,7.
Ejemplo 68 Conjugado anticuerpo-fármaco (68)
Procedimiento 1: Conjugado anticuerpo-fármaco (68)
Usando el trastuzumab producido en ejemplo de referencia 1 y el compuesto obtenido en el Procedimiento 6 del Ejemplo 67, el conjugado anticuerpo-fármaco titulado se obtuvo de la misma manera que el Procedimiento 1 del Ejemplo 3. Después de eso, la solución se concentró mediante el procedimiento común A.
Concentración de anticuerpo: 13,3 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 9,3 mg (74 %), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 5,0.
Ejemplo 69 Conjugado anticuerpo-fármaco (69)
Procedimiento 1: N6-(ferc-Butoxicarbonil)-N2-[(9H-fluoren-9-Mmetoxi)carbonil]-L-lisMglicMglicil-L-fenilalanil-N-(4-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metiM0,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-4-oxobutil)glicinamida
El compuesto (167 mg, 0,176 mmol) obtenido en el Procedimiento 2 del Ejemplo 2 se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 1 del Ejemplo 1 usando NE-(ferc-butoxicarbonil)-N°-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-L-lisina (103 mg, 0,22 mmol) en lugar de ácido 4-(ferc-butoxicarbonNamino)butanoico y el producto en bruto obtenido se usó para el siguiente procedimiento sin purificación.
Procedimiento 2: N6-(ferc-Butoxicarbonil)-L-lisilglicilglicil-L-fenilalanil-N-(4-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-4-oxobutil)glicinamida
A una solución de N,N-dimetilformamida (4,00 ml) del producto en bruto obtenido en el Procedimiento 1 anterior, se le añadió piperidina (0,400 ml) y se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. El disolvente se retiró a presión reducida y el residuo obtenido se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice [cloroformo - capa orgánica repartida de cloroformo : metanol : agua = 7 : 3 : 1 (v/v/v)] para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (113 mg, 60 %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-da) 8 : 0,87 (3H, t, J=7,4 Hz), 1,18-1,49 (5H, m), 1,36 (9H, s), 1,51-1,60 (1H, m), 1,67-1,76 (2H, m), 1,80-1,91 (2H, m), 2,09-2,20 (4H, m), 2,39 (3H, s), 2,76-2,89 (3H, m), 2,99-3,22 (6 H, m), 3,58-3,77 (6 H, m), 4 ,43 -4 , 49 (1H, m), 5,20 (2H, c, J=18,5 Hz), 5,42 (2H, s), 5,55-5,60 (1H, m), 6,54 (1H, s), 6,76 (1H, t, J=5,5 Hz), 7,15 7,26 (5H, m), 7,31 (1H, s), 7,69-7,74 (1H, m), 7,80 (1H, d, J=10,9 Hz), 8,08 (1H, t, J=5,7 Hz), 8,14 (1H, d, J=7,8 Hz), 8,22-8,30 (2H, m), 8,47 (1H, d, J=8 , 6 Hz).
Procedimiento 3: N6-(terc-Butoxicarbonil)-N2-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil]-L-lisilglicilglicil-L-fenilalanil-N-(4-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-4-oxobutil)glicinamida
El compuesto (113 mg, 0,106 mmol) obtenido en el Procedimiento 2 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 8 del Ejemplo 5 para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido ( 102 mg, 61 %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 8 : 0,87 (3H, t, J=7,2 Hz), 1,11-1,53 (11H, m), 1,35 (9H, s), 1,56-1,65 (1H, m), 1,68-1,76 (2H, m), 1,81-1,92 (2H, m), 2,06-2,20 (6 H, m), 2,40 (3H, s), 2,74-2,90 (3H, m), 2,96-3,39 (7H, m), 3,57-3,74 (6 H, m), 4,14-4,21 (1H, m), 4,42-4,49 (1H, m), 5,20 (2H, c, J=18,9 Hz), 5,42 (2H, s), 5,55-5,60 (1H, m), 6,54 (1H, s), 6,72-6,78 (1H, m), 7,00 (2H, s), 7,15-7,26 (5H, m), 7,31 (1H, s), 7,69-7,72 (1H, m), 7,80 (1H, d, J=10,9 Hz), 7,93 (1H, d, J=7,4 Hz), 7,99-8,04 (1H, m), 8,10-8,18 (2H, m), 8,26 (1H, t, J=6,1 Hz), 8,46 (1H, d, J=8,2 Hz).
Procedimiento 4: N2-[6-(2,5-Dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil]-L-lisilglicilglicil-L-fenilalanil-N-(4-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-4-oxobutil)glicinamida
A una solución de diclorometano (4,00 ml) del compuesto (102 mg, 80,9 pmol) obtenido en el Procedimiento 3 anterior, se le añadió ácido trifluoroacético (1,00 ml) y se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. El disolvente se retiró a presión reducida y el residuo obtenido se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice [cloroformo -capa orgánica repartida de cloroformo : metanol: agua = 7 : 3 : 1 (v/v/v)] para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (57,0 mg, 61 %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 8 : 0,87 (3H, t, J=7,2 Hz), 1,12-1,35 (4H, m), 1,41-1,55 (7H, m), 1,61-1,77 (3H, m), 1,80 1,91 (2H, m), 2,07-2,22 (6 H, m), 2,40 (3H, s), 2,84-2,71 (3H, m), 2,97-3,40 (7H, m), 3,59-3,76 (6 H, m), 4,20-4,25 (1H, m), 4,45-4,50 (1H, m), 5,20 (2H, c, J=18,5 Hz), 5,42 (2H, s), 5,54-5,60 (1H, m), 6,55 (1H, s), 7,01 (2H, s), 7,15-7,26 (5H, m), 7,31 (1H, s), 7,74 (1H, t, J=5,7 Hz), 7,81 (1H, d, J=10, 9 Hz), 7,97 (1H, d, J=7,8 Hz), 8,05 (1H, t, J=6,1 Hz), 8,13-8,18 (2H, m), 8,28 (1H, t, J=5,7 Hz), 8,47 (1H, d, J=8 , 6 Hz).
EM (IEN) m/z: 1160 (M+H)+.
Procedimiento 5: Conjugado anticuerpo-fármaco (69)
Usando el trastuzumab producido en el ejemplo de referencia 1 y el compuesto obtenido en el Procedimiento 4 anterior, el conjugado anticuerpo-fármaco del título se obtuvo de la misma manera que el Procedimiento 6 del Ejemplo 2. Después de eso, la solución se concentró mediante el procedimiento común A. Concentración del anticuerpo: 20,6 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 8,3 mg ( 66 %), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 3,6.
Ejemplo 70 Conjugado anticuerpo-fármaco (70)
Procedimiento 1: Conjugado anticuerpo-fármaco (70)
Usando el trastuzumab producido en ejemplo de referencia 1 y el compuesto obtenido en el Procedimiento 4 del Ejemplo 69, el conjugado anticuerpo-fármaco titulado se obtuvo de la misma manera que el Procedimiento 1 del Ejemplo 3. Después de eso, la solución se concentró mediante el procedimiento común A.
Concentración de anticuerpo: 23,5 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 9,4 mg (75 %), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 7,0.
Ejemplo 71 Conjugado anticuerpo-fármaco (71)
[Fórmula 124]
Procedimiento 1: N-(ferc-Butoxicarbonil)glicilglicil-L-fenilalanilglicil-N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indoNzino[1,2-b]quinoNn-1-N]-p-alaninamida
El compuesto (484 mg, 0,780 mmol) obtenido en el Procedimiento 2 del Ejemplo 7 se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 1 del Ejemplo 2 para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (626 mg, 87 %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-da) ó: 0,87 (3H, t, J=7,4 Hz), 1,27-1,42 (9H, m), 1,77-1,93 (2H, m), 2,06-2,22 (2H, m), 2,36 (2H, t, J=7,2 Hz), 2,40 (3H, d, J=1,6 Hz), 2,44-2,54 (2H, m), 2,76 (1H, dd, J=14,5, 10,2 Hz), 3,02 (1H, dd, J=13,9, 4,5 Hz), 3,12-3,22 (2H, m), 3,52 (6H, d, J=6,3 Hz), 4,42-4,54 (1H, m), 5,19 (1H, d, J=19,2 Hz), 5,26 (1H, d, J=18,4 Hz), 5,42 (1H, dd, J=18,4, 16,4 Hz), 5,57 (1H, dt, J=8,7, 4,4 Hz), 6,53 (1H, s), 6,98 (1H, t, J=5,9 Hz), 7,14-7,28 (5H, m), 7,31 (1H, s), 7,77-7,84 (1H, m), 7,91 (1H, t, J=5,5 Hz), 8,16 (1H, d, J=7,8 Hz), 8,27 (1H, t, J=5,1 Hz), 8,52 (1H, d, J=9,0 Hz).
Procedimiento 2: Sal glicilglicil-L-fenilalanilglicil-N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indoNzino[1,2-b]quinoNn-1-N]-p-alaninamida del ácido trifluoroacético
El compuesto (624 mg, 0,675 mmol) obtenido en el Procedimiento 1 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 2 del Ejemplo 2 para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo (626 mg, 92 %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-da) 5: 0,87 (3H, t, J=7,4 Hz), 1,86 (2H, tt, J=14,5, 7,2 Hz), 2,07-2,22 (2H, m), 2,36 (2H, t, J=7,2 Hz), 2,40 (3H, s), 2,44-2,54 (2H, m), 2,75 (1H, dd, J=13,7, 9,8 Hz), 3,04 (1H, dd, J=13,7, 4,3 Hz), 3,12-3,22 (2H, m), 3,58 (2H, d, J=4,7 Hz), 3,69 (3H, td, J=11,2, 5,7 Hz), 3,87 (1H, dd, J=17,0, 5,7 Hz), 4,54 (1H, m, J=17,8, 4,5 Hz), 5,19 (1H, d, J=19,2 Hz), 5,26 (1H, d, J=18,8 Hz), 5,43 (2H, s), 5,51-5,60 (1H, m), 6,55 (1H, s), 7,14-7,29 (5H, m), 7,32 (1H, s), 7,81 (1H, d, J=10,9 Hz), 7,88 (1H, t, J=5,7 Hz), 7,97 (3H, s a), 8,29-8,38 (2H, m), 8,50 (1H, t, J=5,7 Hz), 8,55 (1H, d, J=8,6 Hz).
EM (IEN) m/z: 825 (M+H)+.
Procedimiento 3: (9S,18S)-9-bencil-1-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-18-[[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]amino}-1,5,8,11,14,17-hexaoxo-4,7,10,13,16-pentaazaicosan-20-oato de ferc-butilo
El compuesto (150 mg, 0,182 mmol) obtenido en el Procedimiento 2 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 1 del Ejemplo 2 usando ácido (2S)-4-ferc-butoxi-2-{[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]amino}-4-oxobutanoico (90,0 mg, 0,219 mmol) en lugar de N-(ferc-butoxicarbonil)glicilglicil-L-fenilalanilglicina para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (84,0 mg, 38 %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 5: 0,82-0,91 (3H, m), 1,35 (9H, s), 1,85 (2H, tt, J=14,0, 7,3 Hz), 2,06-2,21 (2H, m), 2,39 (3H, s), 2,31-2,53 (5H, m), 2,64-2,73 (1H, m), 2,78 (1H, dd, J=13,7, 9,8 Hz), 3,02 (1H, dd, J=13,9, 4,5 Hz), 3,11-3,20 (2H, m), 3,55-3,80 (6H, m), 4,17-4,35 (3H, m), 4,35-4,43 (1H, m), 4,44-4,51 (1H, m), 5,18 (1H, d, J=19,2 Hz), 5,24 (1H, d, J=19,2 Hz), 5,41 (2H, dd, J=18,8, 16,4 Hz), 5,51-5,60 (1H, m), 6,53 (1H, s), 7,13-7,20 (1H, m), 7,20-7,27 (4H, m), 7,27-7,34 (3H, m), 7,39 (2H, t, J=7,2 Hz), 7,65-7,73 (3H, m), 7,79 (2H, d, J=10,6 Hz), 7,87 (2H, d, J=7,4 Hz), 8,00 (1H, t, J=6,1 Hz), 8,08-8,20 (2H, m), 8,22-8,31 (1H, m), 8,52 (1H, d, J=8,2 Hz).
EM (IEN) m/z: 1218 (M+H)+.
Procedimiento 4: (9S,18S)-9-bencil-18-{[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil]amino}-1-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-1,5,8,11,14,17-hexaoxo-4,7,10,13,16-pentaazaicosan-20-oato ferc-butilo
El compuesto (81,0 mg, 0,0665 mmol) obtenido en el Procedimiento 3 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 2 del Ejemplo 58 para producir el compuesto del título (56,0 mg, 71 %).
EM (IEN) m/z: 1189,5 (M+H)+
Procedimiento 5: N-[6-(2,5-Dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil]-L-a-aspartilglicilglicil-L-fenilalanilglicil-N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]-p-alaninamida
El compuesto (52,0 mg, 0,0437 mmol) obtenido en el Procedimiento 2 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 2 del Ejemplo 1 para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (35,0 mg, 71 %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 5: 0,87 (3H, t, J=7,4 Hz), 1,12-1,22 (2H, m), 1,39-1,51 (4H, m), 1,78-1,92 (2H, m), 2,04 2,19 (2H, m), 2,08 (2H, t, J=7,2 Hz), 2,40 (3H, s), 2,31-2,46 (6H, m), 2,61-2,72 (1H, m), 2,73-2,85 (1H, m), 3,02 (1H, dd, J=14,1, 4,7 Hz), 3,17 (2H, m, J=5,5 Hz), 3,26-3,43 (2H, m), 3,55-3,77 (6H, m), 4,42-4,50 (1H, m), 4,51-4,58 (1H, m), 5,19 (1H, d, J=18,4 Hz), 5,26 (1H, d, J=18,4 Hz), 5,42 (2H, s a), 5,52-5,60 (1H, m), 6,53 (1H, s), 6,99 (2H, s), 7,12 7,27 (5H, m), 7,31 (1H, s), 7,80 (2H, d, J=10,9 Hz), 7,93-8,02 (1H, m), 8,03-8,17 (3H, m), 8,22-8,31 (1H, m), 8,53 (1H, d, J=8,6 Hz).
EM (IEN) m/z: 1133 (M+H)+
Procedimiento 6: Conjugado anticuerpo-fármaco (71)
Usando el trastuzumab producido en el ejemplo de referencia 1 y el compuesto obtenido en el Procedimiento 3 anterior, el conjugado anticuerpo-fármaco titulado se obtuvo de la misma manera que el Procedimiento 6 del Ejemplo 2.
Concentración de anticuerpo: 1,18mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 7,08 mg (71%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 2,4.
Ejemplo 72 Conjugado anticuerpo-fármaco (72)
Usando el trastuzumab producido en ejemplo de referencia 1 y el compuesto obtenido en el Procedimiento 5 del Ejemplo 71, el conjugado anticuerpo-fármaco titulado se obtuvo de la misma manera que el Procedimiento 1 del Ejemplo 3. Concentración de anticuerpo: 1,04 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 6,24 mg (62 %), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 4,4.
Ejemplo 73 Conjugado anticuerpo-fármaco (73)
[Fórmula 126]
Procedimiento 1: (5S,14S)-5-bencil-1-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-14-[[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]amino}-1,4,7,10,13-pentaoxo-3,6,9,12-tetraazahexadecan-16-oato de ferc-butilo
Con enfriamiento de hielo, a una solución de N,N-dimetilformamida (10,0 ml) de una forma libre de glicilglicil-L-fenilalanil-N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]glicinamida (Publicación internacional n.° WO 97/46260; 0,250 g, 0,332 mmol), N-hidroxisuccinimida (57,2 mg, 0,497 mmol) y ácido N-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-L-aspártico 4-ferc-butilo (0,205 g, 0,497 mmol), se añadió N,N-diciclohexilcarbodiimida (0,123 g, 0,497 mmol) y se agitó a temperatura ambiente durante 2 días. El disolvente se retiró a presión reducida y el residuo obtenido se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice [cloroformo - cloroformo : metanol = 9 : 1 (v/v)] para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (0,278 g, 73 %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-da) ó: 0,86 (3H, t, J=7,1 Hz), 1,35 (9H, s), 1,79-1,90 (2H, m), 2,03-2,25 (2H, m), 2,40 (3H, s), 2,40-2,51 (2H, m), 2,64-2,82 (2H, m), 2,98 (1H, dd, J=13,7, 4,6 Hz), 3,16 (2H, s a), 3,55 (1H, dd, J=16,7, 5,7 Hz), 3,63-3,80 (4H, m), 4,16-4,34 (3H, m), 4,36-4,50 (2H, m), 5,23 (2H, s), 5,37 (1H, d, J=16,5 Hz), 5,43 (1H, d, J=16,5 Hz), 5,51-5,62 (1H, m), 6,52 (1H, s), 7,10-7,25 (5H, m), 7,26-7,33 (3H, m), 7,39 (2H, t, J=7,3 Hz), 7,65-7,72 (3H, m), 7,80 (1H, d, J=11,0 Hz), 7,86 (2H, d, J=7,3 Hz), 7,98 (1H, t, J=5,5 Hz), 8,07 (1H, d, J=7,8 Hz), 8,15 (1H, t, J=5,5 Hz), 8,31 (1H, t, J=5,5 Hz), 8,41 (1H, d, J=8,7 Hz).
EM (IEN) m/z: 1147 (M+H)+.
Procedimiento 2: (5S,14S)-14-amino-5-bencil-1-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-1,4,7,10,13-pentaoxo-3,6,9,12-tetraazahexadecan-16-oato de ferc-butilo
A una solución de N,N-dimetilformamida (2,00 ml) del compuesto (0,279 g, 0,242 mmol) obtenido en el Procedimiento 1 anterior, se le añadió piperidina (0,240 ml, 2,42 mmol) y se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. El disolvente se retiró a presión reducida y el residuo obtenido se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice [cloroformo - cloroformo : metanol = 2 : 1 (v/v)] para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (0,265 g, cuantitativo).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-da) 8: 0,88 (3H, t, J=7,2 Hz), 1,39 (9H, s), 1,81-1,94 (1H, m), 2,07-2,28 (2H, m), 2,37 (1H, dd, J=15,8, 8,0 Hz), 2,43 (3H, s), 2,60 (1H, dd, J=15,8, 4,9 Hz), 2,75-2,82 (1H, m), 3,00 (1H, dd, J=13,9, 4,5 Hz), 3,16 3,25 (2H, m), 3,50-3,61 (2H, m), 3,65-3,81 (5H, m), 4,40-4,51 (1H, m), 5,27 (2H, dd, J=24,1, 19,0 Hz), 5,43 (2H, dd, J=21,3, 16,2 Hz), 5,56-5,65 (1H, m), 6,55 (1H, s), 7,15-7,28 (5H, m), 7,33 (1H, s), 7,83 (1H, d, J=11,0 Hz), 8,04 (1H, t, J=5,7 Hz), 8,09 (1H, d, J=8,2 Hz), 8,26-8,39 (2H, m), 8,44 (1H, d, J=8,2 Hz).
Procedimiento 3: (5S,14S)-5-bencil-14-{[6-(2,5-dioxo-2, 5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil]amino}-1-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-1,4,7,10,13-pentaoxo-3,6,9,12-tetraazahexadecan-16-oato de ferc-butilo
A una solución de N,N-dimetilformamida (2,00 ml) del compuesto (0,100 g, 0,108 mmol) obtenido en el Procedimiento 2 anterior, se le añadió 6-maleimidohexanoato de N-succinimidilo (40,0 mg, 0,130 mmol) y se agitó a temperatura ambiente durante 2 días. El disolvente se retiró a presión reducida y el residuo obtenido se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice [cloroformo - cloroformo : metanol = 9 : 1 (v/v)] para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (80,0 mg, 66 %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 8: 0,88 (3H, t, J=7,2 Hz), 1,13-1,23 (2H, m), 1,37 (9H, s), 1,42-1,54 (4H, m), 1,80-1,96 (2H, m), 2,08-2,25 (4H, m), 2,35-3,76 (15H, m), 2,43 (3H, s), 4,39-4,49 (1H, m), 4,55-4,67 (1H, m), 5,21-5,34 (2H, m), 5,43 (2H, dd, J=21,1, 16,4 Hz), 5,56-5,64 (1H, m), 6,55 (1H, s), 7,01 (2H, d, J=0,8 Hz), 7,16-7,26 (5H, m), 7,33 (1H, s), 7,83 (1H, d, J=11,3 Hz), 8,04-8,18 (3H, m), 8,30-8,37 (1H, m), 8,43 (1H, d, J=8,6 Hz).
EM (IEN) m/z: 1118 (M+H)+.
Procedimiento 4: N-[6-(2,5-Dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil]-L-a-aspartilglicilglicil-L-fenilalanil-N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]glicinamida
Con enfriamiento de hielo, al compuesto (70,0 mg, 62,6 pmol) obtenido en el Procedimiento 3 anterior, se le añadió ácido trifluoroacético (4,00 ml) y se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. El disolvente se retiró a presión reducida para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (55,0 mg, 83 %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 8: 0,88 (3H, t, J=7,4 Hz), 1,14-1,24 (2H, m), 1,41-1,53 (4H, m), 1,79-1,95 (2H, m), 2,08 2,28 (4H, m), 2,37-2,60 (2H, m), 2,42 (3H, s), 2,63-2,82 (2H, m), 2,99 (1H, dd, J=14,1,5,1 Hz), 3,12-3,25 (2H, m), 3,29 3,44 (1H, m), 3,52-3,80 (6H, m), 4,38-4,48 (1H, m), 4,56 (1H, dd, J=13,7, 7,4 Hz), 5,27 (2H, dd, J=24,3, 18,8 Hz), 5,43 (2H, dd, J=21,5, 16,4 Hz), 5,57-5,62 (1H, m), 6,55 (1H, s), 7,01 (2H, s), 7,15-7,26 (5H, m), 7,33 (1H, s), 7,82 (1H, d, J=11,0 Hz), 7,98 (1H, s a), 8,08 (1H, d, J=6,7 Hz), 8,15 (1H, d, J=7,8 Hz), 8,34 (1H, s a), 8,44 (1H, d, J=8,6 Hz), 12,26 (1H, s a). EM (IEN) m/z: 1062 (M+H)+.
Procedimiento 5: Conjugado anticuerpo-fármaco (73)
Reducción del anticuerpo: El trastuzumab producido en el ejemplo de referencia 1 se preparó para tener una concentración de anticuerpo de 10 mg/ml con PBS6,0/EDTA usando el procedimiento común B (como coeficiente de absorción a 280 nm, se usaron 1,37 mlmg_1 cirr1) y el procedimiento común C-1. La solución (3,0 ml) se recogió en un tubo de 15 ml y se cargó con una solución acuosa de TCEP 30 mM (0,0467 ml; 6,9 equivalentes por molécula de anticuerpo) y una solución acuosa de hidrogenofosfato dipotásico 1 M (0,150 ml). Después de confirmarse que la solución tenía un pH de 7,4 ± 0,1, el enlace disulfuro en la parte de la bisagra del anticuerpo se redujo mediante incubación a 37 °C durante 1 hora.
Conjugación entre el anticuerpo y enlazador de fármaco: Después de la incubación de la solución anterior durante 10 minutos a 22 °C, una solución de DMSO (0,0933 ml; 13,8 equivalentes por molécula de anticuerpo) que contenía 30 mM del compuesto obtenido en el Procedimiento 4 anterior se añadió a la misma y se incubó para conjugar el enlazador fármaco al anticuerpo a 22 °C durante 40 minutos. A continuación, una solución acuosa (0,0560 ml; 27,6 equivalentes por molécula de anticuerpo) de NAC 100 mM se añadió a la misma y se incubó a 22 °C para terminar la reacción del enlazador fármaco durante otros 20 minutos. Purificación: La solución anterior se sometió a purificación usando el procedimiento común D-1 (se usó PBS6,0 como solución tampón) para producir una solución que contenía el compuesto del ejemplo de interés.
Caracterización fisicoquímica: Usando el procedimiento común B, el procedimiento común E y el procedimiento común F, se obtuvieron los siguientes valores característicos. Concentración de anticuerpo: 3,24 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 19,4 mg (65 %), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo:
2,6.
Ejemplo 74 Conjugado anticuerpo-fármaco (74)
Procedimiento 1: Conjugado anticuerpo-fármaco (74)
Reducción del anticuerpo: El trastuzumab producido en el ejemplo de referencia 1 se preparó para tener una concentración de anticuerpo de 10 mg/ml con PBS6,0/EDTA usando el procedimiento común B (como coeficiente de absorción a 280 nm, se usaron 1,37 mlmg-1 cm-1) y el procedimiento común C-1. La solución (8 ml) se puso en un tubo de 50 ml y se cargó con una solución acuosa de TCEP 10 mM (0,124 ml) y una solución acuosa de hidrogenofosfato dipotásico 1 M (0,400 ml) para preparar una solución de reacción en la cual la relación molar de TCEP al anticuerpo fue 4,6. Después de confirmarse que la solución tenía un pH de 7,4 ± 0,1, el enlace disulfuro en la parte de la bisagra del anticuerpo se redujo mediante incubación a 37 °C durante 1 hora.
Conjugación entre el anticuerpo y enlazador de fármaco: Después de añadir una solución de DMSO que contenía 10 mM del compuesto obtenido en el Procedimiento 4 del Ejemplo 73 (0,249 ml; 9,2 equivalentes por molécula de anticuerpo) a la solución anterior a temperatura ambiente, se agitó usando un tubo rotador para conjugar el enlazador de fármaco con el anticuerpo a temperatura ambiente durante 40 minutos. A continuación, se añadió a la misma una solución acuosa (0,050 ml) de NAC 100 mM para preparar una solución de reacción en la cual la relación molar de NAC al anticuerpo fue de 18,4 y se agitó a temperatura ambiente para terminar la reacción del enlazador fármaco durante otros 20 minutos.
Purificación: La solución anterior se sometió a purificación usando el procedimiento común D-1 (PBS6,0 se usó como solución tampón) para producir 6 ml de una solución que contenía el compuesto de interés. Usando un filtro centrífugo de ultrafiltración (Amicon Ultra-4, corte de peso molecular: 50 k), la concentración se realizó para producir 13 ml de una solución que contenía el compuesto de interés. Se obtuvieron los siguientes valores característicos.
Concentración de anticuerpo: 3,69 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 48 mg (60 %), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 6,7.
Ejemplo 75 Conjugado anticuerpo-fármaco (75)
La cantidad de la solución acuosa de TCEP 10 mM añadida, se ajustó tal que la relación molar de TCEP al anticuerpo a la reducción del anticuerpo fue de 2,3. Y la cantidad de la solución enlazador fármaco 10 mM añadida, se ajustó tal que la relación molar del enlazador fármaco al anticuerpo en la conjugación del enlazador fármaco fue de 4,6.
Después, la cantidad de la solución acuosa de NAC 100 mM añadida, se ajustó tal que la relación molar de NAC al anticuerpo en la terminación de la reacción fue de 9,2. Mediante los mismos procedimientos como en el Procedimiento 1 del Ejemplo 74, se obtuvieron 17 ml de una solución que contenía el compuesto de interés y se obtuvieron los siguientes valores característicos. Concentración de anticuerpo: 3,66 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 62 mg (78 %), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 3,3.
Ejemplo 76 Conjugado anticuerpo-fármaco (76)
Reducción del anticuerpo: El trastuzumab producido en el ejemplo de referencia 1 se preparó para tener una concentración de anticuerpo de 10 mg/ml con PBS6,0/EDTA usando el procedimiento común B (como coeficiente de absorción a 280 nm, se usaron 1,37 mlmg-1 cm-1) y el procedimiento común C-1. La solución (5,0 ml) se recogió en un tubo de 15 ml y se cargó con una solución acuosa de TCEP 30 mM (0,0777 ml; 6,9 equivalentes por molécula de anticuerpo) y una solución acuosa de hidrogenofosfato dipotásico 1 M (0,250 ml). Después de confirmarse que la solución tenía un pH de 7,4 ± 0,1, el enlace disulfuro en la parte de la bisagra del anticuerpo se redujo mediante incubación a 37 °C durante 1 hora.
Conjugación entre el anticuerpo y enlazador de fármaco: Después de la incubación de la solución anterior durante 10 minutos a 22 °C, una solución de DMSO (0,1555 ml; 13,8 equivalentes por molécula de anticuerpo) que contenía 30 mM del compuesto obtenido en el Procedimiento 4 del Ejemplo 73 se añadió a la misma y se incubó para conjugar el enlazador fármaco al anticuerpo a 22 °C durante 40 minutos. A continuación, una solución acuosa (0,0933 ml; 27,6 equivalentes por molécula de anticuerpo) de NAC 100 mM se añadió a la misma y se incubó a 22 °C para terminar la reacción del enlazador fármaco durante otros 20 minutos. Purificación: La solución anterior se sometió a purificación usando el procedimiento común D-1 (se usó ABS como solución tampón) para producir una solución que contenía el compuesto de interés.
Caracterización fisicoquímica: Usando el procedimiento común B, el procedimiento común E y el procedimiento común F, se obtuvieron los siguientes valores característicos. Concentración de anticuerpo: 3,91 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 27,4 mg (55 %), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 5,4.
Ejemplo 77 Conjugado anticuerpo-fármaco (77)
El compuesto obtenido en el Procedimiento 4 del Ejemplo 73 se usó como el enlazador fármaco. La cantidad de la solución acuosa de TCEP 10 mM añadida, se ajustó tal que la relación molar de TCEP al anticuerpo a la reducción del anticuerpo fue de 4,6. Y la cantidad de la solución enlazador fármaco 10 mM añadida, se ajustó tal que la relación molar del enlazador fármaco al anticuerpo en la conjugación del enlazador fármaco fue de 9,2. Después, la cantidad de la solución acuosa de NAC 100 mM añadida, se ajustó tal que la relación molar de NAC al anticuerpo en la terminación de la reacción fue de 18,4. Mediante los mismos procedimientos como en el Procedimiento 1 del Ejemplo 3, se obtuvieron 6 ml de una solución que contenía el compuesto de interés y se obtuvieron los siguientes valores característicos.
Concentración de anticuerpo: 1,50mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 8,55 mg (68%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 6,3.
Ejemplo 78 Conjugado anticuerpo-fármaco (78)
[Fórmula 131]
Procedimiento 1: N6-(íerc-Butoxicarbonil)-N2-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-L-lisMglicilglicil-L-fenilalanil-N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]glicinamida
Una forma libre de glicilglicil-L-fenilalanil-N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]glicinamida (Publicación internacional n.° WO 97/46260; 0,300 g, 0,397 mmol) se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 1 del Ejemplo 73 usando ácido NE-(ferc-butoxicarbonN)-Na-[(9H-fluoren-9-Nmetoxi)carbonN]-L-Nsina en lugar de N-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-L-aspártico 4-ferc-butil para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo (0,471 g, 98%).
EM (IEN) m/z: 1204 (M+H)+.
Procedimiento 2: N6-(ferc-Butoxicarbonil)-L-lisilglicilglicil-L-fenilalanil-N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]glicinamida
El compuesto (0,417 g, 0,391 mmol) obtenido en el Procedimiento 1 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 2 del Ejemplo 73 para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (0,272 g, 71 %).
EM (IEN) m/z: 1062 (M+H)+.
P r o c e d im ie n to 3: N 6-( t e r c - B u to x ic a r b o n i l ) - N 2-[ 6 -( 2 , 5 - d io x o - 2 ,5 - d ih id r o - 1 H - p i r r o l - 1 - i l ) h e x a n o i l ] - L - l is i lg l ic i lg l ic i l - L -fe n i la la n i l - N -[ ( 1 S ,9 S ) - 9 - e t i l - 5 - f lu o r o - 9 - h id r o x i - 4 - m e t i l - 10 ,13 - d io x o - 2 ,3 ,9 ,10 , 13 ,15 - h e x a h id r o - 1 H ,12 H -b e n z o [d e ]p i r a n o [ 3 ' , 4 ' : 6 , 7 ] in d o l iz in o [1 ,2 - b ]q u in o l in - 1 - i l ] g l ic in a m id a
El compuesto (0,210 g, 0,213 mmol) obtenido en el Procedimiento 2 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 3 del Ejemplo 73 para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (63,0 mg, 21 %).
EM (IEN) m/z: 1175 (M+H)+.
Procedimiento 4: N2-[6-(2,5-Dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil]-L-lisilglicilglicil-L-fenilalanil-N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]glicinamida
Con enfriamiento de hielo, al compuesto (63,0 mg, 53,6 pmol) obtenido en el Procedimiento 3 anterior, se le añadió ácido trifluoroacético (2,00 ml) y se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. El disolvente se retiró a presión reducida para producir sal del ácido trifluoroacético del compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo (50,0 mg, 78 %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 8: 0,89 (3H, t, J=7,2 Hz), 1,13-1,39 (4H, m), 1,43-1,58 (7H, m), 1,61-1,73 (1H, m), 1,80 1,94 (2H, m), 2,07-2,28 (4H, m), 2,43 (3H, s), 2,72-2,84 (4H, m), 3,00 (1H, dd, J=13,7, 3,9 Hz), 3,20 (2H, s a), 3,55 3,80 (6H, m), 4,20-4,30 (1H, m), 4,42-4,52 (1H, m), 5,27 (2H, dd, J=23,7, 19,8 Hz), 5,43 (2H, dd, J=21,9, 16,4 Hz), 5,55- 5,65 (1H, m), 6,56 (1H, s), 7,02 (2H, s), 7,15-7,27 (5H, m), 7,34 (1H, s), 7,64 (3H, s a), 7,83 (1H, d, J=10,6 Hz), 7,98-8,04 (2H, m), 8,09-8,20 (2H, m), 8,37 (1H, t, J=5,5 Hz), 8,47 (1H, d, J=8,6 Hz).
EM (IEN) m/z: 1075 (M+H)+.
Procedimiento 5: Conjugado anticuerpo-fármaco (78)
Reducción del anticuerpo: El trastuzumab producido en el ejemplo de referencia 1 se preparó para tener una concentración de anticuerpo de 10 mg/ml con PBS6,0/EDTA usando el procedimiento común B (como coeficiente de absorción a 280 nm, se usaron 1,37 mlmg'1 c irr1) y el procedimiento común C-1. La solución (1 ml) se puso en un tubo de 1,5 ml y se cargó con una solución acuosa de TCEP 10 mM (0,024 ml) y una solución acuosa de hidrogenofosfato dipotásico 1 M (0,050 ml) para preparar una solución de reacción en la cual la relación molar de TCEP al anticuerpo fue 3,5. Después de confirmarse que la solución tenía un pH de 7,4 ± 0,1, el enlace disulfuro en la parte de la bisagra del anticuerpo se redujo mediante incubación a 37 °C durante 1 hora.
Conjugación entre el anticuerpo y enlazador de fármaco: Después de añadir una solución de DMSO que contenía 10 mM del compuesto obtenido en el Procedimiento 4 anterior (0,047 ml) a la solución anterior a temperatura ambiente para preparar una solución de reacción en la cual la relación molar del compuesto obtenido en el Procedimiento 4 anterior al anticuerpo fue de 6,9, se agitó usando un tubo rotador para conjugar el enlazador de fármaco con el anticuerpo a temperatura ambiente durante 40 minutos. A continuación, se añadió a la misma una solución acuosa (0,0093 ml) de NAC 100 mM para preparar una solución de reacción en la cual la relación molar de NAC al anticuerpo fue de 13,8 y se agitó a temperatura ambiente para terminar la reacción del enlazador fármaco durante otros 20 minutos. Purificación: La solución anterior se sometió a purificación usando el procedimiento común D-1 (PBS6,0 se usó como solución tampón) para producir 6 ml de una solución que contenía el compuesto de interés.
Caracterización fisicoquímica: Usando el procedimiento común B, el procedimiento común E y el procedimiento común F, se obtuvieron los siguientes valores característicos. Concentración de anticuerpo: 1,26 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 7,6 mg (76 %), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 3,1.
Ejemplo 79 Conjugado anticuerpo-fármaco (79)
La cantidad de la solución acuosa de TCEP 10 mM añadida, se ajustó tal que la relación molar de TCEP al anticuerpo a la reducción del anticuerpo fue de 4,6. Y la cantidad de la solución enlazador fármaco 10 mM añadida, se ajustó tal que la relación molar del enlazador fármaco al anticuerpo en la conjugación del enlazador fármaco fue de 9,2. Después, la cantidad de la solución acuosa de NAC 100 mM añadida, se ajustó tal que la relación molar de NAC al anticuerpo en la terminación de la reacción fue de 18,4. Mediante los mismos procedimientos como en el Procedimiento 5 del Ejemplo 78, se obtuvieron 6 ml de una solución que contenía el compuesto de interés y se obtuvieron los siguientes valores característicos.
Concentración de anticuerpo: 1,19 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 7,1 mg (71 %), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 3,7.
Ejemplo 80 Intermedio (80)
Procedimiento 1: (2-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-2-oxoetil)carbamato de ferc-butilo
A una solución de diclorometano (3,00 ml) de N-(ferc-butoxicarbonil)-glicina (0,395 g, 2,26 mmol), se le añadieron N-hidroxisuccinimida (0,260 g, 2,26 mmol) y clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (0,433 mg, 2,26 mmol) y se agitaron a temperatura ambiente durante 1 hora. Esta solución se añadió a una solución que consiste en sal del ácido metanosulfónico de exatecán (1,00 g, 1,88 mmol), trietilamina (0,315 ml, 2,26 mmol) y N,N-dimetilformamida (3,00 ml) y se agitó a temperatura ambiente durante 16,5 horas. La solución de reacción se diluyó con cloroformo y se lavó con una solución al 10 % de ácido y después la capa orgánica se secó sobre sulfato sódico anhidro. El disolvente se retiró a presión reducida y el residuo obtenido se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice [cloroformo - cloroformo : metanol = 9 : 1 (v/v)] para producir el compuesto del título en forma de un
sólido de color amarillo (1,16 g, 99%). RMN 1H (400 MHz, DMSO-da) 5: 0,86 (3H, t, J=7,2 Hz), 1,30 (9H, s), 1,81-1,89 (2H, m), 2,09-2,21 (2H, m), 2,38 (3H, s), 3,15-3,17 (2H, m), 3,55-3,56 (2H, m), 5,15 (1H, d, J=18,8 Hz), 5,23 (1H, d, J=19,2 Hz), 5,41 (2H, s), 5,55-5,56 (1H, m), 6,53 (1H, s), 6,95 (1H, t, J=5,5 Hz), 7,28 (1H, s), 7,77 (1H, d, J=11,0 Hz), 8,39 (1H, d, J=8,6 Hz). EM (CLEM) m/z: 593 (M+H)+.
Procedimiento 2: N-[(1S,9S)-9-Etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]glicinamida
El compuesto (0,513 g, 1,01 mmol) obtenido en el Procedimiento 1 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 4 del Ejemplo 69 para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo (0,463 g, 93 %).
RMN 1H (400 MHz, CD3OD) 5: 0,96 (3H, t, J=7,0 Hz), 1,89-1,91 (2H, m), 2,14-2,16 (1H, m), 2,30 (3H, s), 2,40-2,42 (1H, m), 3,15-3,21 (2H, m), 3,79-3,86 (2H, m), 4,63-4,67 (1H, m), 5,00-5,05 (1H, m), 5,23 (1H, d, J=16,0 Hz), 5,48 (1H, d, J=16,0 Hz), 5,62-5,64 (1H, m), 7,40-7,45 (2H, m).
EM (CLEM) m/z: 493 (M+H)+.
Ejemplo 81 Conjugado anticuerpo-fármaco (81)
[Fórmula 134]
Procedimiento 1: N-(ferc-Butoxicarbonil)glicilglicil-L-fenilalanilglicil-N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]glicinamida
Se disolvió N-(ferc-butoxicarbonil)-glicilglicil-L-fenilalanilglicina (0,292 mg, 0,669 mmol) en diclorometano (5,00 ml), se cargó con N-hidroxisuccinimida (77,0 mg, 0,669 mmol) y N,N-diciclohexilcarbodiimida (128 mg, 0,669 mmol) y se agitó durante 1 hora y 20 minutos. La solución de reacción se añadió gota a gota a una solución de N,N-dimetilformamida (5,00 ml) del compuesto (0,275 g, 0,558 mmol) del Procedimiento 2 del Ejemplo 80 y se agitó a temperatura ambiente durante 1 día. Después de añadir una solución acuosa al 10 % de ácido cítrico (20,0 ml), se extrajo con cloroformo (20 ml) 3 veces. El disolvente en la capa orgánica obtenido se retiró a presión reducida y los residuos obtenidos se purificaron por cromatografía en columna sobre gel de sílice [cloroformo - cloroformo : metanol = 8 : 2 (v/v)] para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (0,430 g, 85 %).
RMN 1H (400 MHz, CD3OD) 5: 0,94 (3H, t, J=7,2 Hz), 1,43 (9H, s), 1,83-1,85 (2H, m), 2,20-2,22 (1H, m), 2,29 (3H, s), 2,36-2,39 (2H, m), 2,50-2,53 (1H, m), 2,67 (1H, s), 3,08-3,11 (1H, m), 3,18-3,21 (1H, m), 3,63-3,67 (4H, m), 3,78-3,82 (1H, m), 3,99 (2H, dd, J=23,5, 16,8 Hz), 4,16 (1H, s), 4,58 (1H, d, J=18,8 Hz), 5,15 (1H, d, J=19,2 Hz), 5,25 (1H, d, J=16,4 Hz), 5,52 (1H, d, J=16,4 Hz), 5,59-5,61 (1H, m), 6,89 (2H, d, J=6,7 Hz), 7,15-7,17 (3H, m), 7,28 (1H, d, J=10,6 Hz), 7,41 (1H, s).
EM (CLEM) m/z: 911 (M+H)+.
Procedimiento 2: Glicilglicil-L-fenilalanilglicil-N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]glicinamida
El compuesto (0,227 g, 0,249 mmol) obtenido en el Procedimiento 1 anterior se disolvió en diclorometano (1,00 ml). Después de añadir ácido trifluoroacético (3,00 ml), se agitó durante 1 hora. El disolvente se retiró a presión reducida y el residuo obtenido se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice [cloroformo - capa orgánica repartida de cloroformo : metanol : agua = 7 : 3 : 1 (v/v/v)] para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (0,200 g, 99 %).
RMN 1H (400 MHz, CD3OD) 8: 0,93 (3H, t, J=7,4 Hz), 1,85 (2H, c, J=7,3 Hz), 2,24-2,45 (5H, m), 2,32 (3H, s), 2,56 (1H, dd, J=13,7, 5,5 Hz), 3,09-3,25 (2H, m), 3,66-3,76 (6H, m), 4,18-4,24 (1H, m), 4,76 (1H, d, J=19,2 Hz), 5,18 (1H, d, J=18,8 Hz), 5,30 (1H, t, J=18,4 Hz), 5,52 (1H, d, J=16,0 Hz), 5,63 (1H, t, J=5,9 Hz), 6,93 (2H, d, J=6,6 Hz), 7,17 (3H, c, J=7,3 Hz), 7,30 (1H, d, J=10,9 Hz), 7,42 (1H, s).
EM (CLEM) m/z: 811 (M+H)+.
Procedimiento 3: N-[6-(2,5-Dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil]glicilglicil-L-fenilalanilglicil-N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]glicinamida
El compuesto (0,125 g, 0,154 mmol) obtenido en el Procedimiento 2 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 3 del Ejemplo 73 para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (0,0775 g, 50 %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 8: 0,86 (3H, t, J=7,2 Hz), 1,18-1,19 (2H, m), 1,45-1,48 (4H, m), 1,83-1,85 (2H, m), 2,12 2,17 (4H, m), 2,39 (3H, s), 2,68 (1H, dd, J=24,4, 14,7 Hz), 2,83-2,87 (1H, m), 3,17-3,78 (12H, m), 4,42-4,45 (1H, m), 5,23 (2H, s), 5,41 (2H, s), 5,58-5,60 (1H, m), 6,53 (1H, s), 6,99 (2H, s), 7,15-7,29 (6H, m), 7,76 (1H, d, J=10,9 Hz), 7,97-8,00 (1H, m), 8,09-8,12 (3H, m), 8,25-8,28 (1H, m), 8,44 (1H, d, J=8,2 Hz).
EM (CLEM) m/z: 1004 (M+H)+.
Procedimiento 4: Conjugado anticuerpo-fármaco (81)
Reducción del anticuerpo: El trastuzumab producido en el ejemplo de referencia 1 se preparó para tener una concentración de anticuerpo de 10 mg/ml reemplazando el medio con PBS6,0/EDTA usando el procedimiento común C-1 y el procedimiento común B (como coeficiente de absorción a 280 nm, se usaron 1,37 mlmg'1 cirr1). La solución (0,5 ml) se puso en un tubo de 1,5 ml y se cargó con una solución acuosa de TCEP 10 mM (0,0078 ml; 2,3 equivalentes por molécula de anticuerpo) y una solución acuosa de hidrogenofosfato dipotásico 1 M (0,025 ml). Después de confirmarse que la solución tenía un pH de 7,4 ± 0,1, el enlace disulfuro en la parte de la bisagra del anticuerpo se redujo mediante incubación a 37 °C durante 1 hora.
Conjugación entre el anticuerpo y enlazador de fármaco: Después de añadir DMSO (Sigma-Aldrich Co., LLC; 0,039 ml) y una solución de DMSO que contenía 10 mM del compuesto obtenido en el Procedimiento 3 anterior (0,0155 ml; 4,6 equivalentes por molécula de anticuerpo) a la solución anterior a temperatura ambiente, se agitó usando un tubo rotador para conjugar el enlazador de fármaco con el anticuerpo a temperatura ambiente durante 40 minutos. A continuación, una solución acuosa (0,003 ml) de NAC 100 mM se añadió a la misma y se agitó a temperatura ambiente para terminar la reacción del fármaco enlazador durante otros 20 minutos.
Purificación: La solución anterior se sometió a purificación usando el procedimiento común D-1 (se usó ABS como solución tampón) para producir 3 ml de una solución que contenía el compuesto de interés. Además, la solución se concentró mediante el procedimiento común A. Después de eso, usando el procedimiento común B y el procedimiento común E, se obtuvieron los siguientes valores característicos.
Concentración de anticuerpo: 8,31 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 3,3 mg (83 %), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 3,2.
Ejemplo 82 Conjugado anticuerpo-fármaco (82)
Reducción del anticuerpo: El trastuzumab producido en el ejemplo de referencia 1 se preparó para tener una concentración de anticuerpo de 10 mg/ml reemplazando el medio con PBS6,0/EDTA usando el procedimiento común C-1 y el procedimiento común B (como coeficiente de absorción a 280 nm, se usaron 1,37 mlmg-1 cm-1). La solución (0,5 ml) se puso en un tubo de 1,5 ml y se cargó con una solución acuosa de TCEP 10 mM (0,0155 ml; 4,6 equivalentes por molécula de anticuerpo) y una solución acuosa de hidrogenofosfato dipotásico 1 M (0,025 ml). Después de confirmarse que la solución tenía un pH de 7,4 ± 0,1, el enlace disulfuro en la parte de la bisagra del anticuerpo se redujo mediante incubación a 37 °C durante 1 hora.
Conjugación entre el anticuerpo y enlazador de fármaco: Después de añadir DMSO (Sigma-Aldrich Co., LLC; 0,029 ml) y una solución de DMSO que contenía 10 mM del compuesto obtenido en el Procedimiento 3 del Ejemplo 81 (0,031 ml; 9,2 equivalentes por molécula de anticuerpo) a la solución anterior a temperatura ambiente, se agitó usando un tubo rotador para conjugar el enlazador de fármaco con el anticuerpo a temperatura ambiente durante 40 minutos. A continuación, una solución acuosa (0,006 ml) de NAC 100 mM se añadió a la misma y se agitó a temperatura ambiente para terminar la reacción del fármaco enlazador durante otros 20 minutos.
Purificación: La solución anterior se sometió a purificación usando el procedimiento común D-1 (se usó ABS como solución tampón) para producir 3 ml de una solución que contenía el compuesto de interés. Además, la solución se concentró mediante el procedimiento común A. Después de eso, usando el procedimiento común B y el procedimiento común E, se obtuvieron los siguientes valores característicos.
Concentración de anticuerpo: 9,62 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 3,8 mg (76 %), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 6,5.
Ejemplo 83 Conjugado anticuerpo-fármaco (83)
Procedimiento 1: N-(ferc-Butoxicarbonil)glicil-N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]glicinamida
Se hizo reaccionar la sal del ácido metanosulfónico de exatecán (0,800 g, 1,51 mmol) de la misma manera como en el Procedimiento 1 del Ejemplo 1 usando N-(ferc-butoxicarbonil)-glicilglicina (0,419 g, 1,81 mmol) en lugar de ácido 4 (ferc-butoxicarbonilamino)butanoico para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo (0,965 g, 99 %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-da) 8: 0,87 (3H, t, J=7,4 Hz), 1,23 (9H, s), 1,82-1,89 (2H, m), 2,11-2,19 (2H, m), 2,40 (3H, s), 3,16-3,17 (2H, m), 3,52 (2H, ddd, J=21,3, 15,5, 4,7 Hz), 3,77 (2H, ddd, J=24,3, 16,8, 5,9 Hz), 5,23 (2H, s), 5,43 (2H, s), 5,56-5,60 (1H, m), 6,53 (1H, s), 7,04 (1H, t, J=5,9 Hz), 7,31 (1H, s), 7,80 (1H, d, J=11,0 Hz), 8,12 (1H, t, J=5,5 Hz), 8,31 (1H, d, J=8,6 Hz).
EM (CLEM) m/z: 650 (M+H)+.
Procedimiento 2: Glicil-N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]glicinamida
El compuesto (0,884 g, 1,36 mmol) obtenido en el Procedimiento 1 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 2 del Ejemplo 1 para producir la sal del ácido trifluoroacético del compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo (0,787 g, cuantitativo). RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 8: 0,87 (3H, t, J=7,2 Hz), 1,82-1,89 (2H, m), 2,11-2,18 (2H, m), 2,41 (3H, s), 3,17-3,18 (2H, m), 3,63 (2H, s), 3,88 (2H, d, J=5,5 Hz), 5,19 (1H, d, J=18,8 Hz), 5,25 (1H, d, J=19,2 Hz), 5,42 (2H, s), 5,56-5,61 (1H, m), 6,56 (1H, s), 7,32 (1H, s), 7,81 (1H, d, J=11,0 Hz), 8,01 (3H, s a), 8,65 (1H, d, J=8,6 Hz), 8,72 (1H, t, J=5,5 Hz).
EM (CLEM) m/z: 550 (M+H)+.
Ejemplo 84 Conjugado anticuerpo-fármaco (84)
[Fórmula 137]
Procedimiento 1: N-(ferc-Butoxicarbonil)glicilglicilfenilalanilglicilglicil-N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13
dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]glicinamida
Se hizo reaccionar la sal del ácido trifluoroacético del compuesto (0,400 g, 0,728 mmol) obtenido en el Procedimiento 2 del Ejemplo 83 de la misma manera como en el Procedimiento 1 del Ejemplo 1 usando N-(terc-butoxicarbonil)-glicilglicil-L-fenilalanilglicina (0,381 mg, 0,873 mmol) en lugar de ácido 4-(terc-butoxicarbonilamino)butanoico para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (0,545 g, 77 %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-da) 8: 0,87 (3H, t, J=7,2 Hz), 1,37 (9H, s), 1,80-1,90 (2H, m), 2,09-2,11 (1H, m), 2,18-2,21 (1H, m), 2,40 (3H, s), 2,72-2,77 (1H, m), 3,01 (1H, dd, J=13,7, 4,3 Hz), 3,16-3,17 (2H, m), 3,52-3,83 (10H, m), 4,48 4,51 (1H, m), 5,21 (1H, d, J=19,2 Hz), 5,26 (1H, d, J=18,8 Hz), 5,43 (2H, s), 5,55-5,59 (1H, m), 6,53 (1H, s), 6,99 (1H, t, J=5,9 Hz), 7,18-7,24 (5H, m), 7,31 (1H, s), 7,80 (1H, d, J=11,0 Hz), 7,90 (1H, t, J=5,3 Hz), 8,02 (1H, t, J=5,5 Hz), 8.15- 8,19 (2H, m), 8,30 (1H, t, J=5,5 Hz), 8,43 (1H, d, J=8,6 Hz).
EM (CLEM) m/z: 968 (M+H)+.
Procedimiento 2: Sal glicilglicilfenilalanilglicilglicil-N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2.3.9.10.13.15- hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]glicinamida del ácido trifluoroacético
El compuesto (0,429 g, 0,443 mmol) obtenido en el Procedimiento 1 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 2 del Ejemplo 1 para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo (0,385 g, cuantitativo).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 8: 0,87 (3H, t, J=7,4 Hz), 1,82-1,89 (2H, m), 2,11-2,19 (2H, m), 2,40 (3H, s), 2,74 (1H, dd, J=13,7, 9,8 Hz), 3,03 (1H, dd, J=13,7, 4,3 Hz), 3,16-3,18 (2H, m), 3,57-3,58 (2H, m), 3,67-3,76 (7H, m), 3,82-3,90 (1H, m), 4,53-4,56 (1H, m), 5,23 (2H, s), 5,43 (2H, s), 5,55-5,59 (1H, m), 6,55 (1H, s), 7,17-7,19 (1H, m), 7,22-7,29 (4H, m), 7,31 (1H, s), 7,80 (1H, d, J=10,9 Hz), 8,00 (3H, s a), 8,07 (1H, t, J=5,7 Hz), 8,22 (1H, t, J=5,7 Hz), 8,36 (2H, dd, J=10,9, 7,0 Hz), 8,47-8,52 (2H, m).
EM (CLEM) m/z: 868 (M+H)+.
Procedimiento 3: N-[6-(2,5-Dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil]glicilglicilfenilalanilglicilglicil-N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]glicinamida
El compuesto (0,278 g, 0,320 mmol) obtenido en el Procedimiento 2 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 3 del Ejemplo 73 para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (0,166 g, 49%).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 8: 0,87 (3H, t, J=7,2 Hz), 1,14-1,22 (2H, m), 1,44-1,49 (4H, m), 1,80-1,90 (2H, m), 2,06 2,13 (3H, m), 2,20 (1H, d, J=14,1 Hz), 2,40 (3H, s), 2,77 (1H, dd, J=13,3, 8,7 Hz), 3,01 (1H, dd, J=13,3, 4,3 Hz), 3,17 (2H, t, J=6,7 Hz), 3,35-3,38 (2H, m), 3,56-3,84 (10H, m), 4,48 (1H, dd, J=13,1, 9,2 Hz), 5,23 (2H, s), 5,43 (2H, s), 5,55 5,59 (1H, m), 6,53 (1H, s), 6,99 (2H, s), 7,20-7,24 (5H, m), 7,31 (1H, s), 7,80 (1H, d, J=11,0 Hz), 8,00 (2H, c, J=5,5 Hz), 8,06 (1H, t, J=5,9 Hz), 8,13 (1H, d, J=8,2 Hz), 8,18 (1H, t, J=5,7 Hz), 8,28 (1H, t, J=5,7 Hz), 8,43 (1H, d, J=8,6 Hz). EM (CLEM) m/z: 1061 (M+H)+.
Procedimiento 4: Conjugado anticuerpo-fármaco (84)
Usando el trastuzumab producido en el ejemplo de referencia 1 y el compuesto obtenido en el Procedimiento 3 anterior, el compuesto de interés se obtuvo de la misma manera como en el Procedimiento 6 del Ejemplo 2.
Concentración de anticuerpo: 1,53 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 9,2 mg (74 %), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 3,5.
Ejemplo 85 Conjugado anticuerpo-fármaco (85)
Usando el trastuzumab producido en ejemplo de referencia 1 y el compuesto obtenido en el Procedimiento 3 del Ejemplo 84, el compuesto de interés se obtuvo de la misma manera como en el Procedimiento 1 del Ejemplo 3. Concentración de anticuerpo: 1,51 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 9,1 mg (73 %), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 6,8.
Ejemplo 86 Conjugado anticuerpo-fármaco (86)
hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]glicinamida
Una forma libre de glicilglicil-L-fenilalanil-N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]glicinamida (Publicación internacional n.° WO 97/46260; 0,150 g, 0,200 mol) se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 3 del Ejemplo 73 para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (70,0 mg, 37 %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-da) 8: 0,87 (3H, t, J=7,4 Hz), 1,15-1,21 (2H, m), 1,41-1,50 (4H, m), 1,80-1,90 (2H, m), 2,07 2,12 (4H, m), 2,17-2,23 (1H, m), 2,35-2,40 (1H, m), 2,41 (3H, s), 2,73-2,81 (1H, m), 2,98 (1H, dd, J=13,7, 4,6 Hz), 3,15 3,20 (2H, m), 3,53 (1H, dd, J=16,6, 5,7 Hz), 3,62-3,77 (5H, m), 4,39-4,45 (1H, m), 5,22 (1H, d, J=18,9 Hz), 5,27 (1H, d, J=18,9 Hz), 5,39 (1H, d, J=16,0 Hz), 5,44 (1H, d, J=16,0 Hz), 5,55-5,60 (1H, m), 6,53 (1H, s), 6,98 (2H, s), 7,13-7,24 (5H, m), 7,32 (1H, s), 7,81 (1H, d, J=10,3 Hz), 7,95-8,00 (1H, m), 8,05-8,09 (2H, m), 8,28-8,31 (1H, m), 8,41 (1H, d, J=8,6 Hz).
EM (CLEM) m/z: 947 (M+H)+.
Procedimiento 2: Conjugado anticuerpo-fármaco (86)
El trastuzumab producido en el ejemplo de referencia 1 se preparó para tener una concentración de anticuerpo de 10 mg/ml con p BS6,0/EDTA usando el procedimiento común B (como coeficiente de absorción a 280 nm, se usaron 1,37 mlmg_1 cirr1 ) y el procedimiento común C-1. La solución (5,0 ml) se recogió en un tubo de 15 ml y se cargó con una solución acuosa de TCEP 10 mM (0,155 ml; 4,6 equivalentes por molécula de anticuerpo) y una solución acuosa de hidrogenofosfato dipotásico 1 M (0,250 ml). Después de confirmarse que la solución tenía un pH de 7,4 ± 0,1, el enlace disulfuro en la parte de la bisagra del anticuerpo se redujo mediante incubación a 37 °C durante 1 hora.
Conjugación entre el anticuerpo y enlazador de fármaco: Después de la incubación de la solución anterior durante 10 minutos a 22 °C, una solución de DMSO (0,311 ml; 9,2 equivalentes por molécula de anticuerpo) que contenía 10 mM del compuesto obtenido en el Procedimiento 1 anterior se añadió a la misma y se incubó para conjugar el enlazador fármaco al anticuerpo a 22 °C durante 40 minutos. A continuación, una solución acuosa (0,0622 ml; 18,4 equivalentes por molécula de anticuerpo) de NAC 100 mM se añadió a la misma y se incubó a 22 °C para terminar la reacción del enlazador fármaco durante otros 20 minutos. Purificación: La solución anterior se sometió a purificación usando el procedimiento común D-1 (se usó PBS7,4 como solución tampón) para producir una solución que contenía el compuesto del ejemplo de interés.
Caracterización fisicoquímica: Usando el procedimiento común B, el procedimiento común E y el procedimiento común F, se obtuvieron los siguientes valores característicos. Concentración de anticuerpo: 3,04 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 32,5 mg (65 %), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 3,4.
Ejemplo 87 Conjugado anticuerpo-fármaco (87)
Procedimiento 1: Conjugado anticuerpo-fármaco (87)
Reducción del anticuerpo: El trastuzumab producido en el ejemplo de referencia 1 se preparó para tener una
concentración de anticuerpo de 10 mg/ml con PBS6,0/EDTA usando el procedimiento común B (como coeficiente de absorción a 280 nm, se usaron 1,37 mlmg-1 cm-1) y el procedimiento común C-1. La solución (9,0 ml) se recogió en un tubo de 50 ml y se cargó con una solución acuosa de TCEP 10 mM (0,280 ml; 4,6 equivalentes por molécula de anticuerpo) y una solución acuosa de hidrogenofosfato dipotásico 1 M (0,450 ml). Después de confirmarse que la solución tenía un pH de 7,4 ± 0,1, el enlace disulfuro en la parte de la bisagra del anticuerpo se redujo mediante incubación a 37 °C durante 1 hora.
Conjugación entre el anticuerpo y enlazador de fármaco: Después de la incubación de la solución anterior durante 10 minutos a 22 °C, una solución de DMSO (0,559 ml; 9,2 equivalentes por molécula de anticuerpo) que contenía 10 mM del compuesto obtenido en el Procedimiento 1 del Ejemplo 31 se añadió a la misma y se incubó para conjugar el enlazador fármaco al anticuerpo a 22 °C durante 40 minutos. A continuación, una solución acuosa (0,112 ml; 18,4 equivalentes por molécula de anticuerpo) de NAC 100 mM se añadió a la misma y se incubó a 22 °C para terminar la reacción del enlazador fármaco durante otros 20 minutos. Purificación: La solución anterior se sometió a purificación usando el procedimiento común D-1 (se usó PBS7,4 como solución tampón) para producir una solución que contenía el compuesto del ejemplo de interés.
Caracterización fisicoquímica: Usando el procedimiento común B, el procedimiento común E y el procedimiento común F, se obtuvieron los siguientes valores característicos. Concentración de anticuerpo: 3,45 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 49,7 mg (55 %), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 3,4.
Ejemplo 88 Conjugado anticuerpo-fármaco (88)
Procedimiento 1: Conjugado anticuerpo-fármaco (88)
El compuesto obtenido en el Procedimiento 1 del Ejemplo 86 se usó como el enlazador fármaco. La cantidad de la solución acuosa de TCEP 10 mM añadida, se ajustó tal que la relación molar de TCEP al anticuerpo a la reducción del anticuerpo fue de 4,6. Y la cantidad de la solución enlazador fármaco 10 mM añadida, se ajustó tal que la relación molar del enlazador fármaco al anticuerpo en la conjugación del enlazador fármaco fue de 9,2. Después, la cantidad de la solución acuosa de NAC 100 mM añadida, se ajustó tal que la relación molar de NAC al anticuerpo en la terminación de la reacción fue de 18,4. Mediante los mismos procedimientos como en el Procedimiento 1 del Ejemplo 3, se obtuvieron 6 ml de una solución que contenía el compuesto de interés y se obtuvieron los siguientes valores característicos.
Concentración de anticuerpo: 1,50 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 8,55 mg (68%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 4,3.
Ejemplo 89 Conjugado anticuerpo-fármaco (89)
[Fórmula 142]
Procedimiento 1: (9S,18S)-9-bencil-18-{[3-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)propanoil]amino}-1-[[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,l3-dioxo-2,3,9,l0,l3,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-1,5,8,11,14,17-hexaoxo-4,7,10,13,16-pentaazaicosano-20-oato de ferc-butilo
El compuesto (76 mg, 0,076 mmol) obtenido en el Procedimiento 2 del Ejemplo 71 se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 2 del Ejemplo 58 usando 3-maleimidopropionato de N-succinimidilo en lugar de 6-maleimidohexanoato de N-succinimidilo para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (73 mg, 83 %).
EM (IEN) m/z: 1147 (M+H)+.
Procedimiento 2: N-[3-(2,5-Dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)propanoil]-L-a-aspartilgMcilglicil-L-fenilalanilglicM-N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]-p-alaninamida
El compuesto (69 mg, 0,060 mmol) obtenido en el Procedimiento 1 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 2 del Ejemplo 1 para producir sal del trifluoroacético del compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo (32 mg, 44 %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) ó: 0,87 (3H, t, J=7,6 Hz), 1,85 (2H, m, J=14,1 Hz), 2,06-2,20 (2H, m), 2,40 (3H, s), 2,31 2,57 (7H, m), 2,61-2,71 (1H, m), 2,73-2,83 (1H, m), 2,98-3,06 (1H, m), 3,12-3,22 (2H, m), 3,29-3,40 (2H, m), 3,54-3,79 (6H, m), 3,80-4,41 (3H, m), 4,43-4,57 (2H, m), 5,19 (1H, d, J=19,6 Hz), 5,26 (1H, d, J=19,2 Hz), 5,42 (2H, s a), 5,52 5,60 (1H, m), 6,98 (2H, s), 7,14-7,28 (5H, m), 7,31 (1H, s), 7,77-7,84 (2H, m), 7,90-7,97 (1H, m), 8,07-8,14 (2H, m), 8,23-8,30 (1H, m), 8,35 (1H, d, J=7,0 Hz), 8,53 (1H, d, J=8,6 Hz).
EM (IEN) m/z: 1091 (M+H)+.
Procedimiento 3: Conjugado anticuerpo-fármaco (89)
Usando el trastuzumab producido en el ejemplo de referencia 1 y el compuesto obtenido en el Procedimiento 2 anterior, el compuesto de interés se obtuvo de la misma manera como en el Procedimiento 6 del Ejemplo 2.
Concentración de anticuerpo: 1,67 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 10,0 mg (80%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 3,6.
Ejemplo 90 Conjugado anticuerpo-fármaco (90)
Usando el trastuzumab producido en ejemplo de referencia 1 y el compuesto obtenido en el Procedimiento 2 del Ejemplo 89, el compuesto de interés se obtuvo de la misma manera como en el Procedimiento 1 del Ejemplo 3. Concentración de anticuerpo: 1,64 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 9,8 mg (78 %), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 6,8.
Ejemplo 91 Conjugado anticuerpo-fármaco (91)
[Fórmula 144]
Procedimiento 1: (9S,18S)-9-bencil-18-{[4-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)butanoil]amino}-1-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,l0,l3,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-1,5,8,11,14,17-hexaoxo-4,7,10,13,16-pentaazaicosano-20-oato de ferc-butilo
El compuesto (75 mg, 0,075 mmol) obtenido en el Procedimiento 2 del Ejemplo 71 se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 2 del Ejemplo 58 usando 4-maleimidobutanoato de N-succinimidilo en lugar de 6-maleimidohexanoato de N-succinimidilo para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (72 mg, 82 %).
EM (IEN) m/z: 1161 (M+H)+.
Procedimiento 2: N-[4-(2,5-Dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)butanoil]-L-a-aspartilglicilglicil-L-fenilalanilglicil-N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7-]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]-p-alanilamida
El compuesto (69 mg, 0,059 mmol) obtenido en el Procedimiento 1 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 2 del Ejemplo 1 para producir sal del trifluoroacético del compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo (24 mg, 34 %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-da) ó: 0,86 (3H, t, J=7,4 Hz), 1,63-1,74 (2H, m), 1,78-1,91 (2H, m), 2,05-2,21 (4H, m), 2,30 2,56 (3H, m), 2,40 (3H, s), 2,61-2,72 (1H, m), 2,73-2,83 (1H, m), 2,97-3,07 (1H, m), 3,12-3,23 (2H, m), 3,29-3,43 (4H, m), 3,53-3,79 (6H, m), 3,80-4,58 (3H, m), 4,43-4,57 (2H, m), 5,19 (1H, d, J=19,2 Hz), 5,26 (1H, d, J=18,8 Hz), 5,42 (2H, s), 5,51-5,61 (1H, m), 7,00 (2H, s), 7,12-7,29 (5H, m), 7,31 (1H, s), 7,76-7,84 (2H, m), 7,94 (1H, t, J=5,9 Hz), 8,05 8,14 (2H, m), 8,19 (1H, d, J=7,0 Hz), 8,26 (1H, t, J=5,7 Hz), 8,52 (1H, d, J=9,0 Hz).
EM (IEN) m/z: 1105 (M+H)+.
Procedimiento 3: Conjugado anticuerpo-fármaco (91)
Usando el trastuzumab producido en el ejemplo de referencia 1 y el compuesto obtenido en el Procedimiento 2 anterior, el compuesto de interés se obtuvo de la misma manera como en el Procedimiento 6 del Ejemplo 2.
Concentración de anticuerpo: 1,51 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 9,7 mg (78 %), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 3,6.
Ejemplo 92 Conjugado anticuerpo-fármaco (92)
Procedimiento 1: Conjugado anticuerpo-fármaco (92)
Usando el trastuzumab producido en ejemplo de referencia 1 y el compuesto obtenido en el Procedimiento 2 del Ejemplo 91, el compuesto de interés se obtuvo de la misma manera como en el Procedimiento 1 del Ejemplo 3. Concentración de anticuerpo: 1,66mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 10,0 mg (80%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 6,7.
Ejemplo 93 Conjugado anticuerpo-fármaco (93)
[Fórmula 146]
Procedimiento 1: (9S,18S)-9-bencil-18-({3-[2-(2-{[3-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)propanoil]amino}etoxi)etoxi]propanoil}amino)-1-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-1,5,8,11,14,17-hexaoxo-4,7,10,13,16-pentaazaicosano-20-oato de ferc-butilo
El compuesto (80 mg, 0,080 mmol) obtenido en el Procedimiento 2 del Ejemplo 71 se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 2 del Ejemplo 58 usando 3-(2-(2-(3-maleimidopropanamida)etoxi)etoxi)propanoato de N-succinimidilo en lugar de 6-maleimidohexanoato de N-succinimidilo para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (87 mg, 83 %).
EM (IEN) m/z: 1307 (M+H)+.
Procedimiento 2: N-{3-[2-(2-{[3-(2,5-Dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)propanoil]amino}etoxi)etoxi]propanoil}-L-aaspartilglicilglicil-L-fenilalanilglicil-N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]-p-alanilamida
El compuesto (82 mg, 0,063 mmol) obtenido en el Procedimiento 1 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 2 del Ejemplo 1 para producir sal del trifluoroacético del compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo (30 mg, 35 %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-da) 8: 0,86 (3H, t, J=7,0 Hz), 1,85 (2H, dt, J=14,6, 7,4 Hz), 2,07-2,22 (2H, m), 2,40 (3H, s), 2,29- 2,58 (7H, m), 2,63-2,72 (1H, m), 2,78 (1H, dd, J=13,7, 10,6 Hz), 3,02 (1H, dd, J=13,9, 4,1 Hz), 3,09-3,21 (4H, m), 3,30-3,39 (4H, m), 3,45 (4H, s), 3,54-3,78 (10H, m), 3,78-4,53 (3H, m), 4,43-4,52 (1H, m), 4,52-4,59 (1H, m), 5,19 (1H, d, J=18,8 Hz), 5,26 (1H, d, J=19,2 Hz), 5,43 (2H, s), 5,52-5,61 (1H, m), 7,00 (2H, s), 7,13-7,28 (5H, m), 7,31 (1H, s), 7,77-7,85 (2H, m), 7,94 (1H, t, J=5,7 Hz), 8,02 (1H, t, J=6,3 Hz), 8,05-8,14 (2H, m), 8,22-8,30 (2H, m), 8,53 (1H, d, J=9,0 Hz).
EM (IEN) m/z: 1250 (M+H)+.
Procedimiento 3: Conjugado anticuerpo-fármaco (93)
Usando el trastuzumab producido en el ejemplo de referencia 1 y el compuesto obtenido en el Procedimiento 2 anterior, el compuesto de interés se obtuvo de la misma manera como en el Procedimiento 6 del Ejemplo 2.
Concentración de anticuerpo: 1,70 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 10,2 mg (82%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 3,6.
Ejemplo 94 Conjugado anticuerpo-fármaco (94)
Usando el trastuzumab producido en ejemplo de referencia 1 y el compuesto obtenido en el Procedimiento 2 del Ejemplo 93, el compuesto de interés se obtuvo de la misma manera como en el Procedimiento 1 del Ejemplo 3. Concentración de anticuerpo: 1,65 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 9,9 mg (79 %), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 6,5.
Ejemplo 95 Conjugado anticuerpo-fármaco (95)
[Fórmula 148]
Procedimiento 1: (21S)-21-{[(7S)-7-bencil-15-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-2,5,8,11,15-pentaoxo-3,6,9,12-tetraazapentadec-1-il]carbamoil}-1-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)-3,19-dioxo-7,10,13,16-tetraoxa-4,20-diazatricosan-23-oato de ferc-butilo
El compuesto (80 mg, 0,080 mmol) obtenido en el Procedimiento 2 del Ejemplo 71 se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 2 del Ejemplo 58 usando 1-maleimido-3-oxo-7,10,13,16-tetraoxa-4-azanonadecan-19-oato de N-succinimidilo en lugar de 6-maleimidohexanoato de N-succinimidilo para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (91 mg, 81 %).
EM (IEN) m/z: 1395 (M+H)+.
Procedimiento 2: N-[19-(2,5-Dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)-17-oxo-4,7,10,13-tetraoxa-16-azanonadecan-1-oil]-L-aaspartilglicilglicil-L-fenilalanilglicil-N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]-p-alanilamida
El compuesto (86 mg, 0,062 mmol) obtenido en el Procedimiento 1 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 2 del Ejemplo 1 para producir sal del trifluoroacético del compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo (30 mg, 34 %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-da) ó: 0,86 (3H, t, J=7,4 Hz), 1,85 (2H, dt, J=14,5, 7,2 Hz), 2,05-2,22 (2H, m), 2,28-2,59 (7H, m), 2,40 (3H, s), 2,64-2,72 (1H, m), 2,73-2,82 (1H, m), 3,02 (1H, dd, J=13,5, 4,5 Hz), 3,09-3,21 (4H, m), 3,35 (4H,
t, J=6,3 Hz), 3,48 (11H, d, J=8,2 Hz), 3,53-3,78 (11H, m), 3,98-4,89 (3H, m), 4,43-4,51 (1H, m), 4,52-4,59 (1H, m), 5,19 (1H, d, J=19,6 Hz), 5,26 (1H, d, J=18,8 Hz), 5,42 (2H, s), 5,52-5,61 (1H, m), 7,00 (2H, s), 7,13-7,29 (5H, m), 7,31 (1H, s), 7,77-7,85 (2H, m), 7,94 (1H, t, J=5,1 Hz), 8,02 (1H, t, J=5,7 Hz), 8,05-8,14 (2H, m), 8,22-8,31 (2H, m), 8,53 (1H, d, J=9,4 Hz). EM (IEN) m/z: 1339 (M+H)+.
Procedimiento 3: Conjugado anticuerpo-fármaco (95)
Usando el trastuzumab producido en el ejemplo de referencia 1 y el compuesto obtenido en el Procedimiento 2 anterior, el compuesto de interés se obtuvo de la misma manera como en el Procedimiento 6 del Ejemplo 2.
Concentración de anticuerpo: 1,68mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 10,1 mg (81%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 3,6.
Ejemplo 96 Conjugado anticuerpo-fármaco (96)
Usando el trastuzumab producido en ejemplo de referencia 1 y el compuesto obtenido en el Procedimiento 2 del Ejemplo 95, el compuesto de interés se obtuvo de la misma manera como en el Procedimiento 1 del Ejemplo 3. Concentración de anticuerpo: 1,67 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 10,0 mg (80%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 6,6.
Ejemplo 97 Conjugado anticuerpo-fármaco (97)
[F o rm u la 150
Procedimiento 1: (3S,12S)-12-bencil-3-{[3-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)propanoil]amino}-21-[[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-4,7,10,13,16,21-hexaoxo-5,8,11,14,17-pentaazaheneicosan-1-oato de ferc-butilo
El compuesto (90 mg, 0,089 mmol) obtenido en el Procedimiento 1 del Ejemplo 58 se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 2 del Ejemplo 58 usando 3-maleimidopropionato de N-succinimidilo en lugar de 6-maleimidohexanoato de N-succinimidilo para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (67 mg, 65 %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-da) 8: 0,87 (3H, t, J=7,4 Hz), 1,35 (9H, s), 1,66-1,77 (2H, m), 1,79-1,92 (2H, m), 2,08-2,22 (4H, m), 2,31-2,46 (3H, m), 2,40 (3H, s), 2,65 (1H, dd, J=15,8, 5,7 Hz), 2,78 (1H, dd, J=13,7, 9,8 Hz), 2,97-3,04 (1H, m), 3,05-3,12 (2H, m), 3,14-3,21 (2H, m), 3,54-3,80 (8H, m), 4,42-4,50 (1H, m), 4,54-4,62 (1H, m), 5,16 (1H, d, J=18,8 Hz), 5,25 (1H, d, J=18,8 Hz), 5,42 (2H, s), 5,54-5,62 (1H, m), 6,53 (1H, s), 6,99 (2H, s), 7,14-7,29 (5H, m), 7,31 (1H, s), 7,71 (1H, t, J=5,5 Hz), 7,80 (1H, d, J=10,9 Hz), 7,97 (1H, t, J=5,9 Hz), 8,10 (1H, d, J=8,2 Hz), 8,15 (1H, t, J=5,9 Hz), 8,26 (1H, t, J=4,7 Hz), 8,34 (1H, d, J=8,2 Hz), 8,46 (1H, d, J=8,6 Hz).
EM (IEN) m/z: 1161 (M+H)+.
Procedimiento 2: N-[3-(2,5-Dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)propanoil]-L-a-aspartilglicilglicil-L-fenilalanil-N-(4-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-4-oxobutil)glicinamida
El compuesto (67 mg, 0,058 mmol) obtenido en el Procedimiento 1 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 2 del Ejemplo 1 para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo (50 mg, 78 %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 8: 0,87 (3H, t, J=7,2 Hz), 1,71 (2H, dt, J=14,6, 7,4 Hz), 1,86 (2H, dt, J=15,0, 7,2 Hz), 2,08-2,22 (4H, m), 2,31-2,55 (3H, m), 2,39 (3H, s a), 2,67 (1H, dd, J=16,2, 6,1 Hz), 2,78 (1H, dd, J=13,9, 9,2 Hz), 3,01 (1H, dd, J=12,7, 4,5 Hz), 3,04-3,12 (2H, m), 3,13-3,21 (2H, m), 3,30-3,51 (2H, m), 3,53-3,79 (6H, m), 4,42-4,50 (1H, m), 4,54 (1H, dd, J=13,7, 7,4 Hz), 5,16 (1H, d, J=19,2 Hz), 5,25 (1H, d, J=18,8 Hz), 5,42 (2H, s), 5,53-5,61 (1H, m), 6,53 (1H, s a), 6,98 (2H, s), 7,12-7,27 (5H, m), 7,31 (1H, s), 7,71 (1H, t, J=5,5 Hz), 7,80 (1H, d, J=10,9 Hz), 7,95 (1H, t, J=5,9 Hz), 8,05-8,15 (2H, m), 8,26 (1H, t, J=6,1 Hz), 8,35 (1H, d, J=7,8 Hz), 8,46 (1H, d, J=8,6 Hz), 12,30 (1H, s a). EM (IEN) m/z: 1105 (M+H)+.
Procedimiento 3: Conjugado anticuerpo-fármaco (97)
Reducción del anticuerpo: El trastuzumab producido en el ejemplo de referencia 1 se preparó para tener una concentración de anticuerpo de 10 mg/ml con PBS6,0/EDTA usando el procedimiento común B (como coeficiente de absorción a 280 nm, se usaron 1,37 mlmg_1 cirr1) y el procedimiento común C-1. La solución (1 ml) se puso en un tubo de 1,5 ml y se cargó con una solución acuosa de TCEP 10 mM (0,016 ml) y una solución acuosa de hidrogenofosfato
dipotásico 1 M (0,050 ml) para preparar una solución de reacción en la cual la relación molar de TCEP al anticuerpo fue 2,3. Después de confirmarse que la solución tenía un pH de 7,4 ± 0,1, el enlace disulfuro en la parte de la bisagra del anticuerpo se redujo mediante incubación a 37 °C durante 1 hora.
Conjugación entre el anticuerpo y enlazador de fármaco: Después de añadir una solución de DMSO que contenía 10 mM del compuesto obtenido en el Procedimiento 2 anterior (0,031 ml) a la solución anterior a temperatura ambiente para preparar una solución de reacción en la cual la relación molar del compuesto obtenido en el Procedimiento 2 anterior al anticuerpo fue de 4,6, se agitó usando un tubo rotador para conjugar el enlazador de fármaco con el anticuerpo a temperatura ambiente durante 40 minutos. A continuación, se añadió a la misma una solución acuosa (0,0062 ml) de NAC 100 mM para preparar una solución de reacción en la cual la relación molar de NAC al anticuerpo fue de 9,2 y se agitó a temperatura ambiente para terminar la reacción del enlazador fármaco durante otros 20 minutos. Purificación: La solución anterior se sometió a purificación usando el procedimiento común D-1 (PBS6,0 se usó como solución tampón) para producir 6 ml de una solución que contenía el compuesto de interés.
Caracterización fisicoquímica: Usando el procedimiento común B, el procedimiento común E y el procedimiento común F, se obtuvieron los siguientes valores característicos. Concentración de anticuerpo: 1,37 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 8,2 mg (82 %), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 3,2.
Ejemplo 98 Conjugado anticuerpo-fármaco (98)
Procedimiento 1: Conjugado anticuerpo-fármaco (98)
La cantidad de la solución acuosa de TCEP 10 mM añadida, se ajustó tal que la relación molar de TCEP al anticuerpo a la reducción del anticuerpo fue de 4,6. Y la cantidad de la solución enlazador fármaco 10 mM añadida, se ajustó tal que la relación molar del enlazador fármaco al anticuerpo en la conjugación del enlazador fármaco fue de 9,2. Después, la cantidad de la solución acuosa de NAC 100 mM añadida, se ajustó tal que la relación molar de NAC al anticuerpo en la terminación de la reacción fue de 18,4. Mediante los mismos procedimientos como en el Procedimiento 3 del Ejemplo 97, se obtuvieron 6 ml de una solución que contenía el compuesto de interés y se obtuvieron los siguientes valores característicos.
Concentración de anticuerpo: 1,25 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 7,5 mg (75 %), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 6,2.
Ejemplo 99 Conjugado anticuerpo-fármaco (99)
[Fórmula 152]
Procedimiento 1: (3S,12S)-12-bencil-3-{[4-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)butanoil]amino}-21-[[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,l0,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-4,7,10,13,16,21-hexaoxo-5,8,11,14,17-pentaazaheneicosan-1-oato de ferc-butilo
El compuesto (90 mg, 0,089 mmol) obtenido en el Procedimiento 1 del Ejemplo 58 se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 2 del Ejemplo 58 usando 4-maleimidobutanoato de N-succinimidilo en lugar de 6-maleimidohexanoato de N-succinimidilo para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (88 mg, 84 %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-da) 8: 0,87 (3H, t, J=7,4 Hz), 1,34 (9H, s), 1,64-1,76 (4H, m), 1,86 (2H, tt, J=14,8, 7,1 Hz), 2,05-2,22 (6H, m), 2,35-2,55 (1H, m), 2,39 (3H, s), 2,67 (1H, dd, J=16,0, 5,9 Hz), 2,78 (1H, dd, J=13,9, 9,2 Hz), 3,01 (1H, dd, J=13,9, 4,5 Hz), 3,05-3,12 (2H, m), 3,14-3,21 (2H, m), 3,39 (2H, t, J=7,0 Hz), 3,53-3,79 (6H, m), 4,42-4,50 (1H, m), 4,53-4,62 (1H, m), 5,16 (1H, d, J=19,2 Hz), 5,25 (1H, d, J=18,8 Hz), 5,42 (2H, s), 5,54-5,61 (1H, m), 6,53 (1H, s), 7,00 (2H, s), 7,13-7,29 (5H, m), 7,31 (1H, s), 7,68-7,73 (1H, m), 7,80 (1H, d, J=10,9 Hz), 7,97 (1H, t, J=5,9 Hz), 8,07-8,15 (2H, m), 8,18 (1H, d, J=7,8 Hz), 8,25 (1H, t, J=6,1 Hz), 8,46 (1H, d, J=9,0 Hz).
EM (IEN) m/z: 1175 (M+H)+.
Procedimiento 2: N-[4-(2,5-Dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1 -il)butanoil]-L-a-aspartilglicilglicil-L-fenilalanil-N-(4-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-4-oxobutil)glicinamida
El compuesto (88 mg, 0,075 mmol) obtenido en el Procedimiento 1 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 2 del Ejemplo 1 para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (72 mg, 86 %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-da) 8: 0,87 (3H, t, J=7,4 Hz), 1,62-1,77 (4H, m), 1,86 (2H, dt, J=15,4, 7,5 Hz), 2,04-2,24 (6H, m), 2,39 (3H, s), 2,30-2,53 (2H, m), 2,75-2,87 (1H, m), 3,01 (1H, dd, J=13,7, 4,7 Hz), 3,04-3,12 (2H, m), 3,13-3,20 (2H, m), 3,38 (2H, t, J=7,0 Hz), 3,52-3,77 (6H, m), 4,31-4,46 (1H, m), 4,46-4,56 (1H, m), 5,16 (1H, d, J=18,8 Hz), 5,25 (1H, d, J=19,2 Hz), 5,42 (2H, s), 5,53-5,61 (1H, m), 6,53 (1H, s), 7,00 (2H, s), 7,12-7,28 (5H, m), 7,31 (1H, s), 7,79 (1H, d, J=11,3 Hz), 7,67-7,84 (1H, m), 7,95-8,22 (4H, m), 8,25-8,43 (1H, m), 8,42-8,61 (1H, m), 12,30 (1H, s a). EM (IEN) m/z: 1119 (M+H)+.
Procedimiento 3: Conjugado anticuerpo-fármaco (99)
El compuesto obtenido en el Procedimiento 2 anterior se usó como el enlazador fármaco. Mediante los mismos procedimientos como en el Procedimiento 6 del Ejemplo 2, se obtuvieron 6 ml de una solución que contenía el compuesto de interés y se obtuvieron los siguientes valores característicos.
Concentración de anticuerpo: 1,32 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 7,9 mg (79 %), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 3,3.
Ejemplo 100 Conjugado anticuerpo-fármaco (100)
La cantidad de la solución acuosa de TCEP 10 mM añadida, se ajustó tal que la relación molar de TCEP al anticuerpo a la reducción del anticuerpo fue de 4,6. El compuesto obtenido en el Procedimiento 2 del Ejemplo 99 se usó como el enlazador fármaco. Y la cantidad de la solución enlazador fármaco 10 mM añadida, se ajustó tal que la relación molar del enlazador fármaco al anticuerpo en la conjugación del enlazador fármaco fue de 9,2. Después, la cantidad de la solución acuosa de NAC 100 mM añadida, se ajustó tal que la relación molar de NAC al anticuerpo en la terminación de la reacción fue de 18,4. Mediante los mismos procedimientos como en el Procedimiento 3 del Ejemplo 99, se obtuvieron 6 ml de una solución que contenía el compuesto de interés y se obtuvieron los siguientes valores característicos.
Concentración de anticuerpo: 1,17 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 7,0 mg (70 %), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 6,2.
Ejemplo 101 Conjugado anticuerpo-fármaco (101)
[Fórmula 154]
Procedimiento 1: (3S,12S)-12-bencil-3-({3-[2-(2-{[3-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)propanoil]amino}etoxi)etoxi]propanoil}amino)-21-[[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-4,7,10,13,16,21-hexaoxo-5,8,11,14,17-pentaazaheneicosan-1-oato de ferc-butilo
El compuesto (107 mg, 0,106 mmol) obtenido en el Procedimiento 1 del Ejemplo 58 se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 2 del Ejemplo 58 usando 3-(2-(2-(3-maleimidopropanamida)etoxi)etoxi)propanoato de N-succinimidilo en lugar de 6-maleimidohexanoato de N-succinimidilo para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (107 mg, 76 %). EM (IEN) m/z: 1321 (M+H)+.
Procedimiento 2: N-{3-[2-(2-{[3-(2,5-Dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)propanoil]amino}etoxi)etoxi]propanoil}-L-aaspartilglicilglicil-L-fenilalanil-N-(4-{[(1s,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-4-oxobutil)glicinamida
El compuesto (107 mg, 0,081 mmol) obtenido en el Procedimiento 1 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 2 del Ejemplo 1 para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (91 mg, 89 %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-da) 8: 0,87 (3H, t, J=7,2 Hz), 1,71 (2H, t, J=7,0 Hz), 1,79-1,93 (2H, m), 2,07-2,22 (4H, m), 2,32 (2H, t, J=7,2 Hz), 2,35-2,41 (2H, m), 2,39 (3H, s), 2,75-2,86 (1H, m), 3,01 (1H, dd, J=13,9, 4,5 Hz), 3,05-3,21 (6H, m), 3,29-3,37 (6H, m), 3,45 (4H, s), 3,52-3,78 (8H, m), 4,38-4,47 (1H, m), 4,48-4,60 (1H, m), 5,16 (1H, d, J=18,8 Hz), 5,25 (1H, d, J=19,2 Hz), 5,42 (2H, s), 5,53-5,61 (1H, m), 6,53 (1H, s), 7,00 (2H, s), 7,12-7,27 (5H, m), 7,31 (1H, s), 7,73 (1H, t, J=5,7 Hz), 7,79 (1H, d, J=11,3 Hz), 8,03 (2H, t, J=5,7 Hz), 8,07-8,26 (3H, m), 8,26-8,42 (1H, m), 8,45-8,55 (1H, m), 12,32 (1H, s a). EM (IEN) m/z: 1264 (M+H)+.
Procedimiento 3: Conjugado anticuerpo-fármaco (101)
El compuesto obtenido en el Procedimiento 2 anterior se usó como el enlazador fármaco. Mediante los mismos procedimientos como en el Procedimiento 6 del Ejemplo 2, se obtuvieron 6 ml de una solución que contenía el compuesto de interés y se obtuvieron los siguientes valores característicos.
Concentración de anticuerpo: 1,40 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 8,4 mg (84 %), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 3,2.
Ejemplo 102 Conjugado anticuerpo-fármaco (102)
El compuesto obtenido en el Procedimiento 2 del Ejemplo 101 se usó como el enlazador fármaco. La cantidad de la solución acuosa de TCEP 10 mM añadida, se ajustó tal que la relación molar de TCEP al anticuerpo a la reducción del anticuerpo fue de 4,6. Y la cantidad de la solución enlazador fármaco 10 mM añadida, se ajustó tal que la relación molar del enlazador fármaco al anticuerpo en la conjugación del enlazador fármaco fue de 9,2. Después, la cantidad de la solución acuosa de NAC 100 mM añadida, se ajustó tal que la relación molar de NAC al anticuerpo en la terminación de la reacción fue de 18,4. Mediante los mismos procedimientos como el Procedimiento 3 del Ejemplo 101, se obtuvieron 6 ml de una solución que contenía el compuesto de interés y se obtuvieron los siguientes valores característicos. Concentración de anticuerpo: 1,22 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 7,3 mg (73%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 5,9.
Ejemplo 103 Conjugado anticuerpo-fármaco (103)
Formula 156]
Procedimiento 1: (21S)-21-{[(7S)-7-bencil-16-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-2,5,8,11,16-pentaoxo-3,6,9,12-tetraazahexadec-1-il]carbamoil}-1-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)-3,19-dioxo-7,10,13,16-tetraoxa-4,20-diazatriocsan-23-oato de ferc-butilo
El compuesto (107 mg, 0,106 mmol) obtenido en el Procedimiento 1 del Ejemplo 58 se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 2 del Ejemplo 58 usando 1-maleimido-3-oxo-7,10,13,16-tetraoxa-4-azanonadecan-19-oato de N-succinimidilo en lugar de 6-maleimidohexanoato de N-succinimidilo para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (157 mg, cuantitativo).
Procedimiento 2: N-[19-(2,5-Dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1 -il)-17-oxo-4,7,10,13-tetraoxa-16-azanonadecan-1-oil]-L-aaspartilglicilglicil-L-fenilalanil-N-(4-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-4-oxobutil)glicinamida
El compuesto (156 g, 0,111 mmol) obtenido en el Procedimiento 1 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 2 del Ejemplo 1 para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (83 mg, 55%).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-da) 8: 0,87 (3H, t, J=7,4 Hz), 1,72 (2H, t, J=7,4 Hz), 1,79-1,93 (2H, m), 2,05-2,23 (4H, m), 2,32 (2H, t, J=7,4 Hz), 2,39 (3H, s), 2,35-2,42 (2H, m), 2,76-2,87 (1H, m), 3,01 (1H, dd, J=13,5, 4,5 Hz), 3,05-3,21 (6H, m), 3,29-3,38 (4H, m), 3,48 (12H, d, J=8,2 Hz), 3,54-3,79 (10H, m), 4,38-4,47 (1H, m), 4,48-4,59 (1H, m), 5,16 (1H, d, J=18,8 Hz), 5,25 (1H, d, J=19,2 Hz), 5,42 (2H, s), 5,53-5,62 (1H, m), 6,53 (1H, s), 7,00 (2H, s), 7,13-7,29 (5H, m), 7,31 (1H, s), 7,70-7,77 (1H, m), 7,79 (1H, d, J=10,9 Hz), 8,03 (2H, t, J=5,5 Hz), 8,07-8,28 (3H, m), 8,29-8,45 (1H, m), 8,46 8,57 (1H, m), 12,33 (1H, s a). EM (IEN) m/z: 1353 (M+H)+.
Procedimiento 3: Conjugado anticuerpo-fármaco (103)
El compuesto obtenido en el Procedimiento 2 anterior se usó como el enlazador fármaco. Mediante los mismos procedimientos como en el Procedimiento 6 del Ejemplo 2, se obtuvieron 6 ml de una solución que contenía el compuesto de interés y se obtuvieron los siguientes valores característicos.
Concentración de anticuerpo: 1,27 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 7,6 mg (76 %), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 3,3.
Ejemplo 104 Conjugado anticuerpo-fármaco (104)
El compuesto obtenido en el Procedimiento 2 del Ejemplo 103 se usó como el enlazador fármaco. La cantidad de la solución acuosa de TCEP 10 mM añadida, se ajustó tal que la relación molar de TCEP al anticuerpo a la reducción del anticuerpo fue de 4,6. Y la cantidad de la solución enlazador fármaco 10 mM añadida, se ajustó tal que la relación molar del enlazador fármaco al anticuerpo en la conjugación del enlazador fármaco fue de 9,2. Después, la cantidad de la solución acuosa de NAC 100 mM añadida, se ajustó tal que la relación molar de NAC al anticuerpo en la terminación de la reacción fue de 18,4. Mediante los mismos procedimientos como en el Procedimiento 3 del Ejemplo 103, se obtuvieron 6 ml de una solución que contenía el compuesto de interés y se obtuvieron los siguientes valores característicos. Concentración de anticuerpo: 1,21 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 7,3 mg (73%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 6,0.
Ejemplo 105 Conjugado anticuerpo-fármaco (105)
F o r m u la 158 ]
Procedimiento 1: (10S,19S)-10-bencil-1-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-19-[[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]amino}-1,6,9,12,15,18-hexaoxo-5,8,11,14,l7-pentaazadocosan-22-oato de tere-butilo
El compuesto (150 mg, 0,179 mmol) obtenido en el Procedimiento 2 del Ejemplo 2 se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 1 del Ejemplo 58 usando ácido (2S)-5-tere-butoxi-2-{[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]amino}-5-oxopentanoico en lugar de ácido (2S)-4-tere-butoxi-2-{[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]amino}-4-oxobutanoico para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (176 mg, 79 %). EM (IEN) m/z: 1247 (M+H)+.
Procedimiento 2: (10S,19S)-10-bencil-19-{[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil]amino}-1-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-1,6,9,12,15,18-hexaoxo-5,8,11,14,17-pentaazadocosan-22-oato de tere-butilo
El compuesto (165 mg, 0,132 mmol) obtenido en el Procedimiento 1 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 2 del Ejemplo 58 para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color blanco (125 mg, 78 %).
EM (IEN) m/z: 1218 (M+H)+.
Procedimiento 3: N-[6-(2,5-Dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil]-L-a-glutamilglicilglicil-L-fenilalanil-N-(4-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino1,2-b]quinolin-1-il]amino}-4-oxobutil)glicinamida
El compuesto (125 mg, 0,103 mmol) obtenido en el Procedimiento 2 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 2 del Ejemplo 1 para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (102 mg, 85 %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-da) 8: 0,87 (3H, t, J=7,2 Hz), 1,16 (2H, m, J=14,5 Hz), 1,46 (4H, quint., J=7,3 Hz), 1,72 (3H, dt, J=14,2, 7,2 Hz), 1,78-1,94 (3H, m), 2,01-2,27 (8H, m), 2,39 (3H, s), 2,79 (1H, dd, J=13,7, 9,4 Hz), 3,02 (1H, dd, J=13,3, 4,7 Hz), 3,05-3,12 (2H, m), 3,17 (2H, d, J=5,1 Hz), 3,28-3,40 (2H, m), 3,50-3,83 (6H, m), 4,18-4,27 (1H, m),
4,40-4,50 (1H, m), 5,16 (1H, d, J=19,6 Hz), 5,25 (1H, d, J=19,2 Hz), 5,42 (2H, s), 5,51-5,62 (1H, m), 6,53 (1H, s), 6,99 (2H, s), 7,12-7,29 (5H, m), 7,31 (1H, s), 7,71 (1H, t, J=5,5 Hz), 7,79 (1H, d, J=10,9 Hz), 8,01 (1H, d, J=7,4 Hz), 8,05 8,21 (3H, m), 8,32 (1H, s), 8,47 (1H, d, J=8,6 Hz), 12,08 (1H, s a).
EM (IEN) m/z: 1161 (M+H)+.
Procedimiento 4: Conjugado anticuerpo-fármaco (105)
Reducción del anticuerpo: El trastuzumab producido en el ejemplo de referencia 1 se preparó para tener una concentración de anticuerpo de 10 mg/ml reemplazando el medio con PBS6,0/EDTA usando el procedimiento común C-1 y el procedimiento común B (como coeficiente de absorción a 280 nm, se usaron 1,37 mlmg'1 cirr1). La solución (1,25 ml) se puso en un tubo de polipropileno de 1,5 ml y se cargó con una solución acuosa de TCEP 10 mM (0,019 ml; 2,3 equivalentes por molécula de anticuerpo) y una solución acuosa de hidrogenofosfato dipotásico 1 M (0,0625 ml). Después de confirmarse que la solución tenía un pH de 7,4 ± 0,1, el enlace disulfuro en la parte de la bisagra del anticuerpo se redujo mediante incubación a 37 °C durante 1 hora.
Conjugación entre el anticuerpo y enlazador de fármaco: Después de añadir DMSO (Sigma-Aldrich Co. LLC; 0,109 ml) y una solución de DMSO que contenía 10 mM del compuesto obtenido en el Procedimiento 3 anterior (0,039 ml; 4,6 equivalentes por molécula de anticuerpo) a la solución anterior a temperatura ambiente, se agitó usando un tubo rotador para conjugar el enlazador de fármaco con el anticuerpo a temperatura ambiente durante 40 minutos. A continuación, una solución acuosa (0,008 ml) de NAC 100 mM se añadió a la misma y se agitó a temperatura ambiente para terminar la reacción del fármaco enlazador durante otros 20 minutos.
Purificación: La solución anterior se sometió a purificación usando el procedimiento común D-1 (se usó ABS como solución tampón) para producir 6 ml de una solución que contenía el compuesto de interés.
Caracterización fisicoquímica: Usando el procedimiento común B y el procedimiento común E, se obtuvieron los siguientes valores característicos.
Concentración de anticuerpo: 1,71 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 10,3 mg (82%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 2,7.
Ejemplo 106 Conjugado anticuerpo-fármaco (106)
Reducción del anticuerpo: El trastuzumab producido en el ejemplo de referencia 1 se preparó para tener una concentración de anticuerpo de 10 mg/ml reemplazando el medio con PBS6,0/EDTA usando el procedimiento común C-1 y el procedimiento común B (como coeficiente de absorción a 280 nm, se usaron 1,37 mlmg'1 cirr1). La solución
(1,25 ml) se puso en un tubo de polipropileno de 1,5 ml y se cargó con una solución acuosa de TCEP 10 mM (0,039 ml; 4,6 equivalentes por molécula de anticuerpo) y una solución acuosa de hidrogenofosfato dipotásico 1 M (0,0625 ml). Después de confirmarse que la solución tenía un pH de 7,4 ± 0,1, el enlace disulfuro en la parte de la bisagra del anticuerpo se redujo mediante incubación a 37 °C durante 1 hora.
Conjugación entre el anticuerpo y enlazador de fármaco: Después de añadir sulfóxido de dimetilo (0,072 ml) y una solución de DMSO que contenía 10 mM del compuesto obtenido en el Procedimiento 3 del Ejemplo 105 (0,078 ml; 9,2 equivalentes por molécula de anticuerpo) a la solución anterior a temperatura ambiente, se agitó usando un tubo rotador para conjugar el enlazador de fármaco con el anticuerpo a temperatura ambiente durante 40 minutos. A continuación, una solución acuosa (0,0155 ml) de NAC 100 mM se añadió a la misma y se agitó a temperatura ambiente para terminar la reacción del fármaco enlazador durante otros 20 minutos.
Purificación: La solución anterior se sometió a purificación usando el procedimiento común D-1 (se usó ABS como solución tampón) para producir 6 ml de una solución que contenía el compuesto de interés.
Caracterización fisicoquímica: Usando el procedimiento común B y el procedimiento común E, se obtuvieron los siguientes valores característicos.
Concentración de anticuerpo: 1,46 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 8,8 mg (70 %), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 5,1.
Ejemplo 107 Conjugado anticuerpo-fármaco (107)
[Fórmula 160]
Procedimiento 1: (3S,12S)-3-amino-12-bencil-21-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-4,7,10,13,16,21-hexaoxo-5,8,11,14,17-pentaazaheneicosan-1-oato de ferc-butilo
A una solución de N,N-dimetilformamida (2,5 ml) del compuesto (300 mg, 0,243 mmol) obtenido en el Procedimiento 1 del Ejemplo 58, se le añadió piperidina (0,245 ml, 2,43 mmol) y se agitó a temperatura ambiente durante 1,5 horas. El disolvente se retiró a presión reducida y el residuo obtenido se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice [cloroformo - capa orgánica repartida de cloroformo : metanol: agua = 7 : 3 : 1 (v/v/v)] para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (210 mg, 85 %).
RMN 1H (500 MHz, DMSO-da) ó: 0,90 (3H, t, J=6,8 Hz), 1,40 (9H, s), 1,70-1,77 (2H, m), 1,83-1,92 (2H, m), 2,12-2,23 (4H, m), 2,32-2,39 (1H, m), 2,42 (3H, s), 2,55-2,62 (1H, m), 2,78-2,85 (1H, m), 3,00-3,07 (1H, m), 3,07-3,13 (2H, m), 3,17-3,21 (2H, m), 3,50-3,80 (7H, m), 4,45-4,51 (1H, m), 5,19 (1H, d, J=17,3 Hz), 5,28 (1H, d, J=17,3 Hz), 5,43-5,47 (2H, m), 5,57-5,63 (1H, m), 6,56 (1H, s), 7,18-7,28 (5H, m), 7,34 (1H, s), 7,70-7,74 (1H, m), 7,83 (1H, d, J=10,7 Hz), 8,05-8,15 (3H, m), 8,28-8,30 (3H, m), 8,49 (1H, d, J=9,3 Hz).
Procedimiento 2: (3S,6S,15S)-15-bencil-6-(2-terc-butoxi-2-oxoetil)-24-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-3-{[(9H-fluoren
9-ilmetoxi)carbonil]amino}-4,7,10,13,16,19,24-heptaoxo-5,8,11,14,17,20-hezxaaztetracosan-1-oato de ferc-butilo
El compuesto (105 mg, 0,104 mmol) obtenido en el Procedimiento 1 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 1 del Ejemplo 58 para producir el compuesto del título (105 mg, 72 %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-da) 8: 0,86 (3H, t, J=7,4 Hz), 1,33 (9H, s), 1,36 (9H, s), 1,65-1,76 (2H, m), 1,78-1,92 (2H, m), 2,06-2,22 (4H, m), 2,39 (3H, s), 2,41-2,53 (2H, m), 2,64-2,74 (2H, m), 2,78 (1H, dd, J=13,3, 9,8 Hz), 3,01 (1H, dd, J=13,7, 4,7 Hz), 3,08 (2H, dt, J=12,2, 6,2 Hz), 3,13-3,21 (2H, m), 3,54-3,80 (6H, m), 4,16-4,33 (3H, m), 4,34-4,43 (1H, m), 4,43-4,51 (1H, m), 4,54-4,63 (1H, m), 5,15 (1H, d, J=19,2 Hz), 5,23 (1H, d, J=18,8 Hz), 5,42 (2H, s a), 5,52-5,60 (1H, m), 6,54 (1H, s), 7,13-7,19 (1H, m), 7,20-7,27 (4H, m), 7,27-7,34 (3H, m), 7,40 (2H, t, J=7,6 Hz), 7,65-7,74 (4H, m), 7,80 (1H, d, J=10,9 Hz), 7,87 (2H, d, J=7,8 Hz), 7,98 (1H, t, J=5,9 Hz), 8,05-8,09 (1H, m), 8,12 (1H, d, J=7,8 Hz), 8,23-8,31 (2H, m), 8,46 (1H, d, J=9,0 Hz).
Procedimiento 3: (3S,6S,15S)-15-bencil-6-(2-ferc-butoxi-2-oxoetil)-3-{[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil]amino}-24-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-4,7,10,13,16,19,24-heptaoxo-5,8,11,14,17,20-hezxaaztetracosan-1-oato de ferc-butilo
El compuesto (99 mg, 0,071 mmol) obtenido en el Procedimiento 2 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 2 del Ejemplo 58 para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color blancopardo claro (83 mg, 86 %).
EM (IEN) m/z: 1375 (M+H)+.
Procedimiento 4: N-[6-(2,5-Dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil]-L-a-aspartil-L-a-aspartilglicilglicil-L-fenilalanil-N-(4-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-4-oxobutil)glicinamida
El compuesto (80 mg, 0,058 mmol) obtenido en el Procedimiento 3 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 2 del Ejemplo 1 para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (30 mg, 41 %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 8: 0,87 (3H, t, J=7,2 Hz), 1,10-1,22 (2H, m), 1,45 (4H, t, J=7,0 Hz), 1,71 (2H, m, J=7,4 Hz), 1,78-1,93 (2H, m), 2,06 (2H, t, J=7,4 Hz), 2,10-2,23 (4H, m), 2,31-2,57 (2H, m), 2,40 (3H, s), 2,61-2,85 (3H, m), 3,01 (1H, dd, J=13,9, 3,7 Hz), 3,05-3,12 (2H, m), 3,17 (2H, s a), 3,28-3,41 (2H, m), 3,46-3,85 (6H, m), 4,41-4,50 (1H, m), 4,50-4,60 (2H, m), 5,16 (1H, d, J=19,6 Hz), 5,25 (1H, d, J=18,8 Hz), 5,42 (2H, s), 5,52-5,62 (1H, m), 6,54 (1H, s), 7,00 (2H, s), 7,12-7,28 (5H, m), 7,31 (1H, s), 7,72 (1H, s a), 7,80 (1H, d, J=11,3 Hz), 7,94 (1H, s a), 8,00 (1H, s a), 8,10 (1H, d, J=7,8 Hz), 8,15 (1H, d, J=7,0 Hz), 8,19 (1H, d, J=7,4 Hz), 8,28 (1H, s a), 8,46 (1H, d, J=8,2 Hz), 12,34 (2H, s a). EM (IEN) m/z: 1262 (M+H)+.
Procedimiento 5: Conjugado anticuerpo-fármaco (107)
Usando el trastuzumab producido en el ejemplo de referencia 1 y el compuesto obtenido en el Procedimiento 4 anterior, el compuesto de interés se obtuvo de la misma manera como en el Procedimiento 6 del Ejemplo 2.
Concentración de anticuerpo: 1,74mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 10,4 mg (83%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 4,3.
Ejemplo 108 Conjugado anticuerpo-fármaco (108)
Usando el trastuzumab producido en ejemplo de referencia 1 y el compuesto obtenido en el Procedimiento 4 del Ejemplo 107, el compuesto de interés se obtuvo de la misma manera como en el Procedimiento 1 del Ejemplo 3. Concentración de anticuerpo: 2,0 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 12 mg (96 %), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 8,1.
Ejemplo 109 Conjugado anticuerpo-fármaco (109)
[Fórmula 162]
Procedimiento 1: (3S,12S)-12-bencN-3-{[(2S)-6-[(ferc-butoxicarboml)airiino]-2-([(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]amino}hexanoil]amino}-2l-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-4,7,10,13,16,21-hexaoxo-5,8,11,14,17-pentaazaheneicosan-1-oato de ferc-butilo
El compuesto (105 mg, 0,104 mmol) obtenido en el Procedimiento 1 del Ejemplo 105 se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 1 del Ejemplo 58 usando N6-(terc-butoxicarbonil)-N2-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-L-lisina en lugar de ácido (2s)-4-terc-butoxi-2-{[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]amino}-4-oxobutanoico para producir el compuesto del título (105 mg, 69 %).
RMN 1H (400 MHz, DIVISOR) 6: 0,86 (3H, t, J=7,4 Hz), 1,30-1,34 (9H, m), 1,34-1,40 (9H, m), 1,44-1,54 (2H, m), 1,55 1,65 (2H, m), 1,66-1,77 (2H, m), 1,79-1,91 (2H, m), 2,06-2,22 (4H, m), 2,39 (3H, s), 2,43-2,55 (2H, m), 2,65-2,91 (5H, m), 3,01 (1H, dd, J=14,1, 4,7 Hz), 3,05-3,12 (2H, m), 3,13-3,21 (2H, m), 3,54-3,81 (6H, m), 3,89-4,01 (1H, m), 4,15 4,30 (3H, m), 4,42-4,51 (1H, m), 4,53-4,62 (1H, m), 5,17 (1H, d, J=19,9 Hz), 5,23 (1H, d, J=19,2 Hz), 5,42 (2H, s), 5,52 5,60 (1H, m), 6,54 (1H, s), 6,73-6,81 (1H, m), 7,12-7,27 (5H, m), 7,27-7,35 (3H, m), 7,36-7,44 (2H, m), 7,54 (1H, d, J=7,8 Hz), 7,66-7,75 (3H, m), 7,80 (1H, d, J=11,3 Hz), 7,87 (2H, d, J=7,8 Hz), 7,95-8,01 (1H, m), 8,01-8,06 (1H, m), 8,11 (1H, d, J=7,0 Hz), 8,21-8,31 (2H, m), 8,46 (1H, d, J=9,0 Hz).
Procedimiento 2: (3S,12S)-12-bencil-3-{[(2S)-6-[(terc-butoxicarbonil)amino]-2-{[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil]amino}hexanoil]amino}-21-{[(1S,9s)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-4,7,10,13,16,21-hexaoxo-5,8,11,14,17-pentaazaheneicosan-1-oato de terc-butilo
El compuesto (101 mg, 0,069 mmol) obtenido en el Procedimiento 1 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 2 del Ejemplo 58 para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color blancopardo claro (87 mg, 88 %).
EM (IEN) m/z: 1432 (M+H)+.
Procedimiento 3: N2-[6-(2,5-Dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil]-L-lisil-L-a-aspartilglicilglicil-L-fenilalanil-N-(4-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-4-oxobutil)glicinamida
El compuesto (84 mg, 0,059 mmol) obtenido en el Procedimiento 2 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 2 del Ejemplo 1 para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color blancopardo claro (28 mg, 37 %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 6: 0,87 (3H, t, J=7,0 Hz), 1,17 (2H, dt, J=13,7, 7,0 Hz), 1,21-1,34 (2H, m), 1,37-1,56 (6H, m), 1,57-1,77 (3H, m), 1,78-1,92 (2H, m), 1,99-2,25 (6H, m), 2,31-2,58 (3H, m), 2,40 (3H, s), 2,64-2,86 (3H, m), 3,02 (1H, dd, J=13,3, 4,3 Hz), 3,05-3,13 (2H, m), 3,13-3,22 (2H, m), 3,26-3,39 (2H, m), 3,39-3,81 (6H, m), 4,14-4,27 (1H, m), 4,40-4,58 (2H, m), 5,16 (1H, d, J=19,6 Hz), 5,25 (1H, d, J=19,9 Hz), 5,43 (2H, s), 5,51-5,63 (1H, m), 6,55 (1H, s), 7,01 (2H, s), 7,23 (5H, s), 7,31 (1H, s), 7,65 (2H, s a), 7,76 (1H, s a), 7,80 (1H, d, J=10,6 Hz), 7,94-8,09 (3H, m), 8,13 (1H, d, J=7,8 Hz), 8,23 (1H, d, J=7,4 Hz), 8,31-8,39 (1H, m), 8,49 (1H, d, J=7,8 Hz), 12,18-12,56 (1H, m). EM (IEN) m/z: 1276 (M+H)+.
Procedimiento 4: Conjugado anticuerpo-fármaco (109)
Usando el trastuzumab producido en el ejemplo de referencia 1 y el compuesto obtenido en el Procedimiento 3 anterior, el compuesto de interés se obtuvo de la misma manera como en el Procedimiento 6 del Ejemplo 2.
Concentración de anticuerpo: 1,76mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 10,6 mg (85%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 3,6.
Ejemplo 110 Conjugado anticuerpo-fármaco (110)
Procedimiento 1: Conjugado anticuerpo-fármaco (110)
Usando el trastuzumab producido en ejemplo de referencia 1 y el compuesto obtenido en el Procedimiento 3 del Ejemplo 109, el compuesto del ejemplo de interés se obtuvo de la misma manera como el Procedimiento 1 del Ejemplo 3. Concentración de anticuerpo: 1,81 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 10,8 mg (86%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 7,2.
Ejemplo 111 Conjugado anticuerpo-fármaco (111)
[Formula 164
Procedimiento 1: (3S,12S)-3-amino-12-bencil-21-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-20,20-dimetil-4,7,10,13,16,21-hexaoxo-5,8,11,14,17-pentaazaheneicosan-1-oato de ferc-butilo
A una solución mezcla de diclorometano (2,5 ml) de ácido (2S)-4-ferc-butoxi-2-{[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]amino}-4-oxobutanoico (114 mg, 0,277 mmol), se le añadieron N-hidroxisuccinimida (31,9 mg, 0,277 mmol) y clorhidrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida (66,3 mg, 0,346 mmol) y se agitaron a temperatura ambiente durante 1 hora. La solución de reacción se añadió gota a gota a una solución gota a gota de N,N-dimetilformamida (2,0 ml) del compuesto (200 mg, 0,231 mmol) obtenido en el Procedimiento 2 del Ejemplo 25, se cargó con trietilamina (0,0643 ml, 0,461 mmol) y se agitó a temperatura ambiente durante 23 horas. La mezcla de reacción se cargó con una solución acuosa al 10% de ácido cítrico y se extrajo con cloroformo. La fase orgánica obtenida se lavó con una solución acuosa saturada de cloruro sódico-agua (1 : 1) y una solución acuosa saturada de cloruro sódico en este orden y se secó sobre sulfato sódico anhidro. Después de la filtración, el disolvente se retiró a presión reducida y los residuos obtenidos se purificaron por cromatografía en columna sobre gel de sílice [diclorometano - diclorometano / metanol = 9 / 1 (v/v)]. El compuesto obtenido se disolvió en N,N-dimetilformamida (2,00 ml), se cargó con piperidina (0,140 ml, 1,42 mmol), y se agitó durante 1 hora. El disolvente se retiró a presión reducida y el residuo obtenido se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice [cloroformo - capa orgánica repartida de cloroformo : metanol: agua = 7 : 3 : 1 (v/v/v)] para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (104 mg, 49 %).
RMN 1H (500 MHz, DIVISOR) 6: 0,87 (3H, t, J=7,6 Hz), 1,20 (3H, s), 1,21 (3H, s), 1,37 (9H, s), 1,62-1,73 (2H, m), 1,81-1,91 (2H, m), 2,10-2,18 (2H, m), 2,34 (1H, dd, J=15,6, 7,8 Hz), 2,39 (3H, s), 2,57 (1H, dd, J=16,1, 4,9 Hz), 2,80 (1H, dd, J=13,9, 9,5 Hz), 2,99-3,07 (2H, m), 3,08-3,23 (3H, m), 3,27-3,37 (2H, m), 3,50 (1H, dd, J=7,3, 4,9 Hz), 3,56 3,78 (6H, m), 4,44-4,51 (1H, m), 5,12 (1H, d, J=18,6 Hz), 5,18 (1H, d, J=18,6 Hz), 5,42 (2H, s), 5,56-5,62 (1H, m), 6,52 (1H, s), 7,15-7,20 (1H, m), 7,21-7,27 (4H, m), 7,31 (1H, s), 7,70 (1H, t, J=5,6 Hz), 7,79 (1H, d, J=10,7 Hz), 8,05 (1H, t, J=5,6 Hz), 8,08 (1H, d, J=7,8 Hz), 8,14 (1H, d, J=8,8 Hz), 8,23 (1H, t, J=6,1 Hz), 8,28 (1H, s a). EM (IEN) m/z: 1038
(M+H)+.
Procedimiento 2: (3S,12S)-12-bencil-3-{[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil]amino}-21-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,l3-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-20,20-dimetil-4,7,10,13,16,21-hexaoxo-5,8,11,14,17-pentaazaheneicosan-1-oato de ferc-butilo
El compuesto (104 mg, 0,100 mmol) obtenido en el Procedimiento 1 anterior se disolvió en N,N-dimetilformamida (1,00 ml), se cargó con 6-maleimidohexanoato de N-succinimidilo (61,8 mg, 0,200 mmol) y se agitó a temperatura ambiente durante 17 horas. El disolvente se retiró a presión reducida y los residuos obtenidos se purificaron por cromatografía en columna sobre gel de sílice [diclorometano - diclorometano / metanol = 17 / 3 (v/v)] para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color blanco-pardo claro (114 mg, 92 %).
EM (IEN) m/z: 1232 (M+H)+.
Procedimiento 3: N-[6-(2,5-Dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil]-L-a-aspartilglicilglicil-L-fenilalanil-N-(4-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-3,3-dimetil-4-oxobutil)glicinamida
El compuesto (111 mg, 0,0901 mmol) obtenido en el Procedimiento 2 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 2 del Ejemplo 1 para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo (83,0 mg, 78 %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-da) 8: 0,87 (3H, t, J=7,2 Hz), 1,12-1,25 (2H, m), 1,20 (3H, s), 1,21 (3H, s), 1,39-1,52 (4H, m), 1,63-1,72 (2H, m), 1,86 (2H, m, J=7,4 Hz), 2,08 (2H, t, J=7,4 Hz), 2,11-2,19 (2H, m), 2,39 (3H, s), 2,42-2,54 (1H, m), 2,68 (1H, dd, J=16,0, 5,5 Hz), 2,79 (1H, dd, J=13,5, 9,6 Hz), 2,96-3,08 (2H, m), 3,08-3,25 (3H, m), 3,35 (2H, t, J=7,0 Hz), 3,53-3,78 (6H, m), 4,43-4,52 (1H, m), 4,52-4,60 (1H, m), 5,11 (1H, d, J=19,2 Hz), 5,18 (1H, d, J=18,8 Hz), 5,42 (2H, s), 5,54-5,64 (1H, m), 6,54 (1H, s a), 6,99 (2H, s), 7,14-7,29 (5H, m), 7,31 (1H, s), 7,72 (1H, t, J=5,3 Hz), 7,79 (1H, d, J=10,9 Hz), 7,98 (1H, t, J=5,7 Hz), 8,05-8,12 (2H, m), 8,15 (2H, d, J=7,0 Hz), 8,25 (1H, t, J=5,5 Hz), 12,29 (1H, s a). EM (IEN) m/z: 1175 (M+H)+.
Procedimiento 4: Conjugado anticuerpo-fármaco (111)
Usando el trastuzumab producido en el ejemplo de referencia 1 y el compuesto obtenido en el Procedimiento 3 anterior, el compuesto de interés se obtuvo de la misma manera como en el Procedimiento 6 del Ejemplo 2.
Concentración de anticuerpo: 1,69mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 10,1 mg (81%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 3,5.
Ejemplo 112 Conjugado anticuerpo-fármaco (112)
Usando el trastuzumab producido en ejemplo de referencia 1 y el compuesto obtenido en el Procedimiento 3 del Ejemplo 111, el compuesto de interés se obtuvo de la misma manera como en el Procedimiento 1 del Ejemplo 3. Concentración de anticuerpo: 1,84 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 11,0 mg (88%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 6,6.
Ejemplo 113 Conjugado anticuerpo-fármaco (113)
[Formula 166]
Procedimiento 1: (3S,12S)-12-bencil-21-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-3-{[3-(metildisulfanil)propanoil]amino}-4,7,10,13,16,21-hexaoxo-5,8,11,14,17-pentaazaheneicosan-1-oato de ferc-butilo
El compuesto (202 mg, 0,200 mmol) obtenido en el Procedimiento 1 del Ejemplo 107 se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 1 del Ejemplo 58 usando ácido 4-(metilditio)propanoico (36,5 mg, 0,240 mmol) en lugar de ácido (2S)-4-ferc-butoxi-2-{[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]amino}-4-oxobutanoico para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (153 mg, 67 %).
RMN 1H (400 MHz, DIVISOR) 6: 0,87 (3H, t, J=7,2 Hz), 1,36 (9H, s), 1,67-1,76 (2H, m), 1,79-1,92 (2H, m), 2,08-2,23 (4H, m), 2,36-2,57 (6H, m), 2,39 (3H, s), 2,69 (1H, dd, J=16,0, 5,5 Hz), 2,78 (1H, dd, J=13,3, 9,8 Hz), 2,88 (2H, t, J=7,2 Hz), 2,97-3,13 (3H, m), 3,14-3,21 (2H, m), 3,55-3,79 (6H, m), 4,42-4,51 (1H, m), 4,56-4,65 (1H, m), 5,20 (2H, c, J=18,5 Hz), 5,37-5,48 (2H, m), 5,52-5,62 (1H, m), 6,54 (1H, s), 7,13-7,28 (5H, m), 7,31 (1H, s), 7,68-7,74 (1H, m), 7,80 (1H, d, J=10,9 Hz), 7,95-8,01 (1H, m), 8,11 (1H, d, J=8,2 Hz), 8,14-8,20 (1H, m), 8,23-8,30 (1H, m), 8,34 (1H, d, J=8,2 Hz), 8,46 (1H, d, J=8,6 Hz).
Procedimiento 2: N-[3-(Metildisulfanil)propanoil]-L-a-aspartilglicilglicil-L-fenilalanil-N-(4-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-4-oxobutil)glicinamida
El compuesto (153 mg, 0,134 mmol) obtenido en el Procedimiento 1 anterior se hizo reaccionar de la misma manera
como en el Procedimiento 2 del Ejemplo 1 para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (103 mg, 71 %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-da) 8: 0,87 (3H, t, J=7,2 Hz), 1,67-1,77 (2H, m), 1,81-1,91 (2H, m), 2,09-2,21 (4H, m), 2,39 (3H, s), 2,58-2,35 (6H, m), 2,65-2,84 (2H, m), 2,88 (2H, t, J=7,2 Hz), 2,97-3,21 (5H, m), 3,58-3,76 (6H, m), 4,42-4,50 (1H, m), 4,53-4,62 (1H, m), 5,21 (2H, c, J=18,6 Hz), 5,42 (2H, s), 5,53-5,62 (1H, m), 6,53 (1H, s), 7,14-7,27 (5H, m), 7,31 (1H, s), 7,68-7,74 (1H, m), 7,80 (1H, d, J=11,0 Hz), 7,93-7,99 (1H, m), 8,07-8,17 (2H, m), 8,23-8,29 (1H, m), 8,35 (1H, d, J=7,8 Hz), 8,46 (1H, d, J=8,2 Hz), 12,33 (1H, s a).
Procedimiento 3: N-(3-Sulfanilpropanoil)-L-a-aspartilglicilglicil-L-fenilalanil-N-(4-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-4-oxobutil)glicinamida
El compuesto (103 mg, 0,0947 mmol) obtenido en el Procedimiento 2 anterior se disolvió en metanol (1,00 ml), acetato de etilo (0,500 ml) y un tampón de fosfato potásico 0,05 N (0,500 ml), se cargó con clorhidrato de tris(2-carboxietil)fosfina (81,4 mg, 0,284 mmol) y se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas. La solución de reacción se cargó con agua y se extrajo con cloroformo. La capa orgánica obtenida se secó sobre sulfato sódico y se filtró. El disolvente se retiró a presión reducida y el residuo obtenido se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice [cloroformo - capa orgánica repartida de cloroformo : metanol: agua = 7 : 3 : 1 (v/v/v)] para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (24,0 mg, 24 %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 8: 0,87 (3H, t, J=7,4 Hz), 1,66-1,76 (2H, m), 1,80-1,91 (2H, m), 2,08-2,22 (4H, m), 2,37 2,69 (9H, m), 2,75-2,85 (1H, m), 2,99-3,17 (5H, m), 3,53-3,78 (6H, m), 4,39-4,49 (1H, m), 4,51-4,60 (1H, m), 5,20 (2H, c, J=18,6 Hz), 5,42 (2H, s), 5,53-5,61 (1H, m), 6,53 (1H, s), 7,14-7,27 (5H, m), 7,31 (1H, s), 7,69-7,75 (1H, m), 7,80 (1H, d, J=10,9 Hz), 7,92-8,21 (4H, m), 8,23-8,38 (2H, m), 8,45-8,52 (1H, m), 12,32 (1H, s).
EM (IEN) m/z: 1042 (M+H)+.
Procedimiento 4: Conjugado anticuerpo-fármaco (113)
Derivatización SMCC del anticuerpo: El trastuzumab producido en el ejemplo de referencia 1 se preparó para tener una concentración del anticuerpo de 20 mg/ml reemplazando el medio con PBS6,5/EDTA usando el procedimiento común C-2 y el procedimiento común B (como coeficiente de absorción a 280 nm, se usaron 1,37 mlmg_1 cirr1). La solución (0,5 ml) se puso en un tubo de 1,5 ml, se cargó con una solución de sulfóxido de dimetilo (0,0125 ml; que corresponde a aproximadamente 5,1 equivalentes por molécula de anticuerpo) que contenía 27,6 mM de 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo (SMCC, Thermo Fisher Scientific Inc.) y sulfóxido de dimetilo (0,0125 ml) a temperatura ambiente y se hizo reaccionar a temperatura ambiente durante 2 horas. Esta solución de reacción se sometió a purificación de acuerdo con el procedimiento común D-2 para producir 1,2 ml de una solución que contenía aproximadamente 10 mg del anticuerpo derivatizado de SMCC. Conjugación entre el anticuerpo y enlazador de fármaco: Después de añadir sulfóxido de dimetilo (0,09 ml) y una solución que contenía sulfóxido de dimetilo 10 mM del compuesto obtenido en el Procedimiento 3 anterior (0,03 ml; que corresponde a aproximadamente 5,8 equivalentes por molécula de anticuerpo) a la solución anterior a temperatura ambiente, se agitó usando un rotador de tubo para conjugar el enlazador fármaco al anticuerpo a temperatura ambiente durante 16 horas. Purificación: La solución anterior se sometió a purificación usando el procedimiento común D-1 (se usó ABS como solución tampón) para producir 6 ml de una solución que contenía el compuesto de interés.
Caracterización fisicoquímica: Usando el procedimiento común B y el procedimiento común E, se obtuvieron los siguientes valores característicos.
Concentración de anticuerpo: 1,19 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 7,1 mg (71 %), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 3,4.
Ejemplo 114 Conjugado anticuerpo-fármaco (114)
Derivatización SMCC del anticuerpo: El trastuzumab producido en el ejemplo de referencia 1 se preparó para tener una concentración del anticuerpo de 20 mg/ml reemplazando el medio con PBS6,5/EDTA usando el procedimiento común C-2 y el procedimiento común B (como coeficiente de absorción a 280 nm, se usaron 1,37 mlmg-1 cm-1). La solución (0,5 ml) se puso en un tubo de 1,5 ml, se cargó con una solución de sulfóxido de dimetilo (0,025 ml; que corresponde a aproximadamente 10 equivalentes por molécula de anticuerpo) que contenía 27,6 mM de SMCC a temperatura ambiente y se hizo reaccionar a temperatura ambiente durante 2 horas. Esta solución de reacción se sometió a purificación de acuerdo con el procedimiento común D-2 para producir 1,2 ml de una solución que contenía aproximadamente 10 mg del anticuerpo derivatizado de SMCC.
Conjugación entre el anticuerpo y enlazador de fármaco: Después de añadir sulfóxido de dimetilo (0,06 ml) y una solución de sulfóxido de dimetilo que contenía 10 mM del compuesto obtenido en el Procedimiento 3 del Ejemplo 113 (0,06 ml; que corresponde a aproximadamente 11,6 equivalentes por molécula de anticuerpo) a la solución anterior a temperatura ambiente, se agitó usando un rotador de tubo para conjugar el enlazador fármaco al anticuerpo a temperatura ambiente durante 16 horas.
Purificación: La solución anterior se sometió a purificación usando el procedimiento común D (se usó ABS como solución tampón) para producir 6 ml de una solución que contenía el compuesto de interés. Además, la solución se concentró mediante el procedimiento común A. Después de eso, usando el procedimiento común B y el procedimiento común E, se obtuvieron los siguientes valores característicos.
Concentración de anticuerpo: 1,96 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 2,4 mg (24 %), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 5,0.
Ejemplo 115 Conjugado anticuerpo-fármaco (115)
[Fórmula 168]
Procedimiento 1: N-(íerc-Butoxicarbonil)gMcilglicil-L-fenilalanil-N-(5-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-5-oxopentil)glicinamida
El compuesto (348 mg, 0,537 mmol) obtenido en el Procedimiento 2 del Ejemplo 17 se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 1 del Ejemplo 2 para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (429 mg, 84 %). El compuesto se usó para la siguiente reacción sin purificación adicional.
Procedimiento 2: Glicilglicil-L-fenilalanil-N-(5-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-5-oxopentil)glicinamida
El compuesto (427 mg, 0,448 mmol) obtenido en el Procedimiento 1 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 2 del Ejemplo 2 para producir la sal del ácido trifluoroacético del compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo (430 mg, 99 %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-da) 8: 0,87 (3H, t, J=7,2 Hz), 1,38-1,49 (2H, m), 1,54-1,66 (2H, m), 1,86 (2H, tt, J=14,5, 7,0 Hz), 2,08-2,16 (2H, m), 2,19 (2H, t, J=7,2 Hz), 2,40 (3H, s), 2,76 (1H, dd, J=13,9, 10,0 Hz), 3,00-3,12 (3H, m), 3,14 3,21 (2H, m), 3,57 (2H, d, J=4,7 Hz), 3,60-3,75 (3H, m), 3,87 (1H, dd, J=16,8, 5,9 Hz), 4,55 (1H, td, J=9,0, 4,7 Hz), 5,16 (1H, d, J=18,8 Hz), 5,23 (1H, d, J=18,4 Hz), 5,44 (2H, s), 5,53-5,60 (1H, m), 6,55 (1H, s), 7,14-7,29 (5H, m), 7,32 (1H, s), 7,74 (1H, t, J=5,5 Hz), 7,81 (1H, d, J=10,9 Hz), 7,96 (3H, s a), 8,30-8,37 (1H, m), 8,44-8,53 (2H, m).
EM (IEN) m/z: 853 (M+H)+.
Procedimiento 3: (3S,12S)-12-bencil-22-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-3-{[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]amino}-4,7,10,13,16,22-hexaoxo-5,8,11,14,17-pentaazadocosan-1-oato de ferc-butilo
El compuesto (140 mg, 0,164 mmol) obtenido en el Procedimiento 2 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 1 del Ejemplo 58 para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (140 mg, 68 %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 8: 0,86 (3H, t, J=7,2 Hz), 1,31-1,37 (9H, m), 1,39-1,47 (2H, m), 1,53-1,64 (2H, m), 1,85 (2H, tt, J=14,2, 7,1 Hz), 2,07-2,15 (2H, m), 2,18 (2H, t, J=7,2 Hz), 2,39 (3H, s), 2,40-2,54 (1H, m), 2,70 (1H, dd, J=16,8, 5,5 Hz), 2,79 (1H, dd, J=13,9, 9,6 Hz), 2,99-3,10 (3H, m), 3,12-3,20 (2H, m), 3,56-3,79 (6H, m), 4,17-4,35 (3H, m), 4,35-4,43 (1H, m), 4,44-4,52 (1H, m), 5,15 (1H, d, J=19,2 Hz), 5,21 (1H, d, J=19,2 Hz), 5,42 (2H, s), 5,51-5,60 (1H, m), 6,54 (1H, s), 7,12-7,19 (1H, m), 7,20-7,27 (4H, m), 7,27-7,34 (3H, m), 7,40 (2H, t, J=7,4 Hz), 7,62-7,73 (4H, m), 7,80 (1H, d, J=11,3 Hz), 7,87 (2H, d, J=7,4 Hz), 8,02 (1H, t, J=5,7 Hz), 8,11 (1H, d, J=7,8 Hz), 8,17 (1H, t, J=5,3 Hz), 8,25 (1H, t, J=5,7 Hz), 8,44 (1H, d, J=9,0 Hz).
EM (IEN) m/z: 1247 (M+H)+.
Procedimiento 4: (3S,12S)-12-bencil-3-{[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil]amino}-22-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-4,7,10,13,16,22-hexaoxo-5,8,11,14,17-pentaazadocosan-1-oato de ferc-butilo
El compuesto (137 mg, 0,110 mmol) obtenido en el Procedimiento 3 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 2 del Ejemplo 58 para producir el compuesto del título (103 mg, 77 %).
EM (IEN) m/z: 1218 (M+H)+.
Procedimiento 5: N-[6-(2,5-Dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil]-L-a-aspartilglicilglicil-L-fenilalanil-N-(5-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-5-oxopentil)glicinamida
El compuesto (88 mg, 0,072 mmol) obtenido en el Procedimiento 4 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 2 del Ejemplo 1 para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (51 mg, 61 %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 8: 0,87 (3H, t, J=7,2 Hz), 1,12-1,22 (2H, m), 1,38-1,51 (6H, m), 1,54-1,64 (2H, m), 1,80 1,92 (2H, m), 2,03-2,15 (4H, m), 2,19 (2H, t, J=7,0 Hz), 2,31-2,56 (2H, m), 2,40 (3H, s), 2,60-2,71 (1H, m), 2,75-2,86 (1H, m), 2,98-3,10 (3H, m), 3,17 (2H, d, J=5,1 Hz), 3,26-3,40 (2H, m), 3,54-3,78 (6H, m), 4,39-4,49 (1H, m), 4,50-4,59 (1H, m), 5,16 (1H, d, J=19,6 Hz), 5,23 (1H, d, J=19,6 Hz), 5,43 (2H, s), 5,52-5,60 (1H, m), 6,53 (1H, s), 6,99 (2H, s), 7,14-7,28 (5H, m), 7,31 (1H, s), 7,62-7,72 (1H, m), 7,80 (1H, d, J=11,3 Hz), 7,95-8,19 (4H, m), 8,24-8,36 (1H, m), 8,45 (1H, d, J=9,0 Hz). EM (IEN) m/z: 1161 (M+H)+.
Procedimiento 4: Conjugado anticuerpo-fármaco (115)
Reducción del anticuerpo: El trastuzumab producido en el ejemplo de referencia 1 se preparó para tener una concentración de anticuerpo de 10 mg/ml con PBS6,0/EDTA usando el procedimiento común B (como coeficiente de absorción a 280 nm, se usaron 1,37 mlmg_1 cirr1) y el procedimiento común C-1. La solución (1,0 ml) se recogió en un tubo de 2 ml y se cargó con una solución acuosa de TCEP 10 mM (0,0155 ml; 2,3 equivalentes por molécula de anticuerpo) y una solución acuosa de hidrogenofosfato dipotásico 1 M (0,050 ml). Después de confirmarse que la solución tenía un pH de 7,4 ± 0,1, el enlace disulfuro en la parte de la bisagra del anticuerpo se redujo mediante incubación a 37 °C durante 1 hora.
Conjugación entre el anticuerpo y enlazador de fármaco: Después de la incubación de la solución anterior durante 10 minutos a 22 °C, una solución de DMSO (0,0311 ml; 4,6 equivalentes por molécula de anticuerpo) que contenía 10 mM del compuesto obtenido en el Procedimiento 3 anterior se añadió a la misma y se incubó para conjugar el enlazador
fármaco al anticuerpo a 22 °C durante 40 minutos. A continuación, una solución acuosa (0,00622 ml; 9,2 equivalentes por molécula de anticuerpo) de NAC 100 mM se añadió a la misma y se incubó a 22 °C para terminar la reacción del enlazador fármaco durante otros 20 minutos. Purificación: La solución anterior se sometió a purificación usando el procedimiento común D-1 (PBS6,0 se usó como solución tampón) para producir 6 ml de una solución que contenía el compuesto de interés.
Caracterización fisicoquímica: Usando el procedimiento común B, el procedimiento común E y el procedimiento común F, se obtuvieron los siguientes valores característicos. Concentración de anticuerpo: 0,99 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 5,94 mg (59 %), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 2,2.
Ejemplo 116 Conjugado anticuerpo-fármaco (116)
Procedimiento 1: Conjugado anticuerpo-fármaco (116)
Reducción del anticuerpo: El trastuzumab producido en el ejemplo de referencia 1 se preparó para tener una concentración de anticuerpo de 10 mg/ml con PBS6,0/EDTA usando el procedimiento común B (como coeficiente de absorción a 280 nm, se usaron 1,37 mlmg-1 cm-1) y el procedimiento común C-1. La solución (1,0 ml) se recogió en un tubo de 2 ml y se cargó con una solución acuosa de TCEP 10 mM (0,0311 ml; 4,6 equivalentes por molécula de anticuerpo) y una solución acuosa de hidrogenofosfato dipotásico 1 M (0,050 ml). Después de confirmarse que la solución tenía un pH de 7,4 ± 0,1, el enlace disulfuro en la parte de la bisagra del anticuerpo se redujo mediante incubación a 37 °C durante 1 hora.
Conjugación entre el anticuerpo y enlazador de fármaco: Después de la incubación de la solución anterior durante 10 minutos a 22 °C, una solución de DMSO (0,0622 ml; 9,2 equivalentes por molécula de anticuerpo) que contenía 10 mM del compuesto obtenido en el Procedimiento 3 del Ejemplo 115 se añadió a la misma y se incubó para conjugar el enlazador fármaco al anticuerpo a 22 °C durante 40 minutos. A continuación, una solución acuosa (0,0124 ml; 18,4 equivalentes por molécula de anticuerpo) de NAC 100 mM se añadió a la misma y se incubó a 22 °C para terminar la reacción del enlazador fármaco durante otros 20 minutos. Purificación: La solución anterior se sometió a purificación usando el procedimiento común D-1 (PBS6,0 se usó como solución tampón) para producir 6 ml de una solución que contenía el compuesto de interés.
Caracterización fisicoquímica: Usando el procedimiento común B, el procedimiento común E y el procedimiento común F, se obtuvieron los siguientes valores característicos. Concentración de anticuerpo: 0,95 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 5,70 mg (57 %), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 4,0.
Ejemplo 117 Conjugado anticuerpo-fármaco (117)
[Formula 170]
Procedimiento 1: ácido (2S)-5-ferc-butoxi-2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)-5-oxopentanoico
Se disolvió ácido L-glutámico 5-ferc-butilo (1,02 g, 5,00 mmol) en una solución acuosa saturada de hidrogenocarbonato sódico (20,0 ml), se cargó con N-metoxicarbonilmaleimida (0,775 g, 5,00 mmol) a 0 °C, se agitó a 0 °C durante 30 minutos y después se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. La solución de reacción se volvió ácida mediante la adición de ácido clorhídrico 5 N a 0 °C y después se extrajo con acetato de etilo. La capa orgánica obtenida se secó sobre sulfato sódico y se filtró. El disolvente se retiró a presión reducida para producir un producto en bruto. El producto en bruto obtenido se usó para la siguiente reacción sin purificación.
Procedimiento 2: N-[(2S)-5-ferc-Butoxi-2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)-5-oxopentanoil]glicilglicil-L-fenilalanil-N-(4-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-4-oxobutil)glicinamida
El compuesto (85,0 mg, 0,300 mmol) obtenido en el Procedimiento 1 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 1 del Ejemplo 1 usando el compuesto (168 mg, 0,200 mmol) obtenido en el Procedimiento 2 del Ejemplo 2 en lugar de la sal del ácido metanosulfónico de exatecán para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (113 mg, 51 %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-da) 8: 0,87 (3H, t, J=7,2 Hz), 1,35 (9H, s), 1,67-1,76 (2H, m), 1,79-1,93 (2H, m), 2,03-2,29 (8H, m), 2,40 (3H, s), 2,74-2,82 (1H, m), 2,97-3,13 (3H, m), 3,14-3,22 (2H, m), 3,50-3,80 (6H, m), 4,41-4,49 (1H, m), 4,50-4,57 (1H, m), 5,20 (2H, c, J=18,6 Hz), 5,42 (2H, s), 5,54-5,61 (1H, m), 6,53 (1H, s), 7,04 (2H, s), 7,14-7,27 (5H, m), 7,31 (1H, s), 7,66-7,72 (1H, m), 7,80 (1H, d, J=11,0 Hz), 7,98-8,03 (1H, m), 8,11 (1H, d, J=7,8 Hz), 8,22-8,27 (1H, m), 8,31-8,37 (1H, m), 8,45 (1H, d, J=8,6 Hz).
Procedimiento 3: N-[(2S)-4-Carboxi-2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)butanoil]glicilglicil-L-fenilalanil-N-(4-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-4-oxobutil)glicinamida
El compuesto (113 mg, 0,102 mmol) obtenido en el Procedimiento 2 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 2 del Ejemplo 1 para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (81,0 mg, 76 %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-da) 8: 0,87 (3H, t, J=7,2 Hz), 1,67-1,75 (2H, m), 1,80-1,91 (2H, m), 2,07-2,35 (8H, m), 2,39 (3H, s), 2,77 (1H, dd, J=13,7, 9,8 Hz), 2,96-3,13 (3H, m), 3,13-3,22 (2H, m), 3,38-3,80 (6H, m), 4,42-4,50 (1H, m), 4,53 4,60 (1H, m), 5,20 (2H, c, J=18,6 Hz), 5,42 (2H, s), 5,54-5,60 (1H, m), 6,54 (1H, s a), 7,04 (2H, s), 7,17-7,26 (5H, m), 7,31 (1H, s), 7,70 (1H, t, J=5,3 Hz), 7,80 (1H, d, J=10,9 Hz), 8,01 (1H, t, J=5,5 Hz), 8,12 (1H, d, J=8,2 Hz), 8,26 (1H, t, J=5,9 Hz), 8,32-8,38 (1H, m), 8,46 (1H, d, J=8,6 Hz).
EM (IEN) m/z: 1048 (M+H)+.
Procedimiento 4: Conjugado anticuerpo-fármaco (117)
Usando el trastuzumab producido en el ejemplo de referencia 1 y el compuesto obtenido en el Procedimiento 3 anterior, el compuesto de interés se obtuvo de la misma manera como en el Procedimiento 6 del Ejemplo 2.
Concentración de anticuerpo: 1,38 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 8,3 mg (66 %), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 3,6.
Ejemplo 118 Conjugado anticuerpo-fármaco (118)
Usando el trastuzumab producido en ejemplo de referencia 1 y el compuesto obtenido en el Procedimiento 3 del Ejemplo 117, el compuesto de interés se obtuvo de la misma manera como en el Procedimiento 1 del Ejemplo 3. Concentración de anticuerpo: 1,52 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 9,1 mg (73 %), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 6,5.
Ejemplo 119 Conjugado anticuerpo-fármaco (119)
Formula 172
Procedimiento 1: N-{2-[(ferc-Butoxicarbonil)amino]etil}-N-(2-ferc-butoxi-2-oxoetil)glicilglicil-L-fenilalanil-N-(4-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-4-oxobutil)glicinamida
El compuesto (0,250 g, 0,300 mmol) obtenido en el Procedimiento 2 del Ejemplo 40 se usó en lugar del ácido (2S)-4-ferc-butoxi-2-{[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]amino}-4-oxobutanoico y se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 1 del Ejemplo 58 para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (59,9 mg, 17 %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-da) 8: 0,87 (3H, t, J=7,2 Hz), 1,35 (9H, s), 1,40 (9H, s), 1,68-1,75 (2H, m), 1,80-1,91 (2H, m), 2,16-2,31 (4H, m), 2,40 (3H, s), 2,80 (1H, d, J=7,0 Hz), 2,95-2,98 (3H, m), 3,19-3,24 (6H, m), 3,40 (4H, s), 3,62 3,72 (6H, m), 4,44-4,48 (1H, m), 5,16 (1H, d, J=19,2 Hz), 5,25 (1H, d, J=19,2 Hz), 5,42 (2H, s), 5,56-5,59 (1H, m), 6,54 (1H, s), 6,79 (1H, t, J=6,8 Hz), 7,20-7,22 (5H, m), 7,31 (1H, s), 7,72 (1H, t, J=6,5 Hz), 7,80 (1H, d, J=10,6 Hz), 8,09 (2H, t, J=5,7 Hz), 8,15 (1H, d, J=7,8 Hz), 8,27 (1H, t, J=5,7 Hz), 8,47 (1H, d, J=7,4 Hz).
EM (CLEM) m/z: 1153 (M+H)+.
Procedimiento 2: N-(2-Aminoetil)-N-(carboximetil)glicilglicil-L-fenilalanil-N-(4-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-4-oxobutil)glicinamida
El compuesto (50,6 mg, 43,8 pmol) obtenido en el Procedimiento 1 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 2 del Ejemplo 1 para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (29,5 mg, 67 %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 8: 0,87 (3H, t, J=7,6 Hz), 1,71-1,74 (2H, m), 1,85-1,87 (2H, m), 2,10-2,20 (4H, m), 2,39 (3H, s), 2,66-2,68 (1H, m), 2,77-2,80 (7H, m), 3,15-3,18 (4H, m), 3,50 (2H, s), 3,60 (4H, s), 3,74-3,76 (2H, m), 4,37 4,39 (1H, m), 5,17 (1H, d, J=19,2 Hz), 5,25 (1H, d, J=19,2 Hz), 5,42 (2H, s), 5,57-5,59 (1H, m), 6,55 (1H, s), 7,23-7,24 (6H, m), 7,31 (1H, s), 7,76-7,80 (4H, m), 8,10-8,13 (2H, m), 8,39-8,41 (1H, m), 8,57-8,60 (2H, m). EM (CLEM) m/z: 997 (M+H)+.
Procedimiento 3: N-(Carboximetil)-N-[2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)etil]glicilglicil-L-fenilalanil-N-(4-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-4-oxobutil)glicinamida
Con enfriamiento de hielo, el compuesto (76,0 mg, 76,2 pmol) obtenido en el Procedimiento 2 anterior se disolvió en
una solución acuosa saturada de hidrogenocarbonato sódico (2,00 ml) y se agitó durante 30 minutos. Con enfriamiento de hielo, después de añadir 2,5-dioxopirroM-carboxNato de metilo (13,0 mg, 83,9 |jmol), se agitó durante 20 minutos. Se agitó adicionalmente a temperatura ambiente durante 2 horas. Después de añadir una solución acuosa al 10 % de ácido cítrico, se agitó durante una noche. La solución de reacción se extrajo con cloroformo y la capa orgánica obtenida se secó sobre sulfato sódico y se filtró. El disolvente en el filtrado se retiró a presión reducida. Los residuos obtenidos se purificaron mediante cromatografía en columna de gel de sílice [cloroformo - capa orgánica repartida de cloroformo : metanol : agua = 7 : 3 : 1 (v/v/v)] para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (18,1 mg, 22%).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-da) 8: 0,87 (3H, t, J=8,5 Hz), 1,71-1,73 (2H, m), 1,84-1,87 (2H, m), 2,12-2,19 (4H, m), 2,36 (3H, s), 2,65-2,68 (1H, m), 2,89-3,15 (9H, m), 3,48-3,66 (10H, m), 4,35-4,37 (1H, m), 5,16 (1H, d, J=18,4 Hz), 5,24 (1H, d, J=18,8 Hz), 5,42 (2H, s), 5,55-5,58 (1H, m), 6,53 (1H, s), 6,95 (2H, s), 7,19-7,21 (6H, m), 7,30 (1H, s), 7,77-7,80 (2H, m), 8,19 (1H, s), 8,32 (1H, s), 8,49 (1H, s), 8,62 (2H, s).
EM (CLEM) m/z: 1077 (M+H)+.
Procedimiento 4: Conjugado anticuerpo-fármaco (119)
Usando el trastuzumab producido en el ejemplo de referencia 1 y el compuesto obtenido en el Procedimiento 3 anterior, el compuesto de interés se obtuvo de la misma manera como en el Procedimiento 6 del Ejemplo 2. Además, la solución se concentró mediante el procedimiento común A. Después de eso, usando el procedimiento común B y el procedimiento común E, se obtuvieron los siguientes valores característicos.
Concentración de anticuerpo: 10,02 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 7,0 mg (56%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 2,6.
Ejemplo 120 Conjugado anticuerpo-fármaco (120)
Usando el trastuzumab producido en ejemplo de referencia 1 y el compuesto obtenido en el Procedimiento 3 del Ejemplo 119, el compuesto de interés se obtuvo de la misma manera como en el Procedimiento 1 del Ejemplo 3. Además, la solución se concentró mediante el procedimiento común A. Después de eso, usando el procedimiento común B y el procedimiento común E, se obtuvieron los siguientes valores característicos.
Concentración de anticuerpo: 10,36 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 7,3 mg (58%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 4,8.
Ejemplo 121 Conjugado anticuerpo-fármaco (121)
Procedimiento 1: N-(Carboximetil)-N-(2-{[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoM]amino}etil)glicilglicil-L-fenilalanil-N-(4-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-4-oxobutil)glicinamida
El compuesto (25,8 mg, 25,9 jm ol) obtenido en el Procedimiento 2 del Ejemplo 119 se disolvió en N,N-dimetilformamida (1,50 ml). Después de añadir 6-maleimidohexanoato de N-succinimidilo (12,0 mg, 38,9 |jmol), se agitó durante 1 día. El disolvente se retiró a presión reducida y el residuo obtenido se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice [cloroformo - capa orgánica repartida de cloroformo : metanol: agua = 7 : 3 : 1 (v/v/v)] para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (6,07 mg, 20 %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-da) 8: 0,87 (3H, t, J=6,7 Hz), 1,18 (4H, dd, J=25,4, 19,2 Hz), 1,41-1,43 (4H, m), 1,73 (2H, d, J=4,3 Hz), 1,82-1,90 (2H, m), 1,98 (2H, s), 2,12-2,19 (4H, m), 2,38 (3H, s), 3,08-3,15 (10H, m), 3,39-3,41 (4H, m), 3,60-3,71 (8H, m), 4,32-4,35 (1H, m), 5,16 (1H, d, J=19,2 Hz), 5,25 (1H, d, J=18,0 Hz), 5,42 (2H, s), 5,57 (1H, s), 6,53 (1H, s), 6,99 (2H, s), 7,20-7,22 (5H, m), 7,30 (1H, s), 7,72-7,81 (3H, m), 8,26-8,32 (2H, m), 8,59-8,62 (2H, m).
EM (CLEM) m/z: 1190 (M+H)+.
Procedimiento 2: Conjugado anticuerpo-fármaco (121)
Usando el trastuzumab producido en el ejemplo de referencia 1 y el compuesto obtenido en el Procedimiento 1 anterior, el compuesto de interés se obtuvo de la misma manera como en el Procedimiento 6 del Ejemplo 2.
Concentración de anticuerpo: 1,40 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 8,4 mg (67 %), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 2,0.
Ejemplo 122 Conjugado anticuerpo-fármaco (122)
Usando el trastuzumab producido en ejemplo de referencia 1 y el compuesto obtenido en el Procedimiento 1 del Ejemplo 121, el compuesto de interés se obtuvo de la misma manera como en el Procedimiento 1 del Ejemplo 3. Concentración de anticuerpo: 1,49 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 8,9 mg (71 %), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 3,4.
Ejemplo 123 Conjugado anticuerpo-fármaco (123)
[Fórmula 176]
Procedimiento 1: (5S,14S)-5-bencil-14-{[3-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)propanoil]amino}-1-[[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,l3-dioxo-2,3,9,l0,l3,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-1,4,7,10,13-pentaoxo-3,6,9,12-tetraazahexadecan-16-oato de ferc-butilo
El compuesto (0,185 g, 0,200 mmol) obtenido en el Procedimiento 2 del Ejemplo 73 se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 3 del Ejemplo 73 usando 3-maleimidopropionato de N-succinimidilo en lugar de 6-maleimidohexanoato de N-succinimidilo para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (0,152 g, 71 %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-da) ó: 0,86 (3H, t, J=7,2 Hz), 1,35 (9H, s), 1,78-1,93 (2H, m), 2,04-2,46 (5H, m), 2,41 (3H, s), 2,61-2,69 (1H, m), 2,72-2,81 (1H, m), 2,93-3,02 (1H, m), 3,13-3,22 (2H, m), 3,49-3,80 (8H, m), 4,38-4,49 (1H, m), 4,53-4,62 (1H, m), 5,25 (2H, dd, J=25,0, 19,2 Hz), 5,41 (2H, dd, J=21,1, 16,4 Hz), 5,54-5,62 (1H, m), 6,54 (1H, s), 6,98 (2H, s), 7,12-7,26 (5H, m), 7,31 (1H, s), 7,81 (1H, d, J=10,9 Hz), 7,93 (1H, t, J=5,7 Hz), 8,06 (1H, d, J=7,8 Hz), 8,13 (1H, t, J=5,9 Hz), 8,29-8,39 (2H, m), 8,42 (1H, d, J=8,2 Hz).
Procedimiento 2: N-[3-(2,5-Dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)propanoil]-L-a-aspartilglicilglicil-L-fenilalanil-N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]glicinamida
El compuesto (0,152 g, 0,141 mmol) obtenido en el Procedimiento 1 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 2 del Ejemplo 1 para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (0,112 g, 78%).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) ó: 0,86 (3H, t, J=7,2 Hz), 1,81-1,89 (2H, m), 2,56-2,03 (6H, m), 2,41 (3H, s), 2,77 (1H, dd, J=13,5, 9,6 Hz), 2,94-3,02 (1H, m), 3,12-3,24 (2H, m), 3,48-3,80 (8H, m), 4,35-4,47 (1H, m), 4,47-4,57 (1H, m), 5,25 (2H, dd, J=25,2, 19,4 Hz), 5,41 (2H, dd, J=20,5, 16,2 Hz), 5,53-5,62 (1H, m), 6,54 (1H, s), 6,99 (2H, s), 7,12-7,27 (5H, m), 7,31 (1H, s), 7,81 (1H, d, J=11,3 Hz), 7,89-8,00 (1H, m), 8,03-8,17 (2H, m), 8,27-8,54 (3H, m), 12,31 (1H, s). EM (IEN) m/z: 1020 (M+H)+.
Procedimiento 3: Conjugado anticuerpo-fármaco (123)
Usando el trastuzumab producido en el ejemplo de referencia 1 y el compuesto obtenido en el Procedimiento 2 anterior,
el compuesto de interés se obtuvo de la misma manera como en el Procedimiento 6 del Ejemplo 2. Concentración de anticuerpo: 1,83 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 11,0 mg (88%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 4,2.
Ejemplo 124 Conjugado anticuerpo-fármaco (124)
Procedimiento 1: Conjugado anticuerpo-fármaco (124)
Usando el trastuzumab producido en ejemplo de referencia 1 y el compuesto obtenido en el Procedimiento 2 del Ejemplo 123, el compuesto de interés se obtuvo de la misma manera como en el Procedimiento 1 del Ejemplo 3. Concentración de anticuerpo: 1,91 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 11,5 mg (92%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 7,4.
Ejemplo 125 Conjugado anticuerpo-fármaco (125)
[Formula 178]
Procedimiento 1: (5S,14S)-5-bencil-14-{[4-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)butanoil]amino}-1-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,l0,l3,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-1,4,7,10,13-pentaoxo-3,6,9,12-tetraazahexadecan-16-oato de ferc-butilo
El compuesto (0,185 g, 0,200 mmol) obtenido en el Procedimiento 2 del Ejemplo 73 se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 3 del Ejemplo 73 usando 4-maleimidobutanoato de N-succinimidilo en lugar de 6-maleimidohexanoato de N-succinimidilo para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (0,166 g, 76%).
RMN 1H (400 MHz, DIVISOR) 8: 0,86 (3H, t, J=7,2 Hz), 1,34 (9H, s), 1,64-1,74 (2H, m), 1,78-1,92 (2H, m), 2,03-2,45 (5H, m), 2,41 (3H, s), 2,63-2,71 (1H, m), 2,72-2,82 (1H, m), 2,93-3,02 (1H, m), 3,13-3,23 (2H, m), 3,42-3,36 (2H, m), 3,53 (1H, dd, J=16,8, 5,9 Hz), 3,61-3,77 (5H, m), 4,38-4,47 (1H, m), 4,53-4,61 (1H, m), 5,25 (2H, dd, J=25,6, 19,0 Hz), 5,41 (2H, dd, J=21,5, 16,4 Hz), 5,53-5,63 (1H, m), 6,54 (1H, s), 7,00 (2H, s), 7,12-7,27 (5H, m), 7,31 (1H, s), 7,81 (1H, d, J=10,9 Hz), 7,93 (1H, t, J=5,7 Hz), 8,06 (1H, d, J=8,2 Hz), 8,11 (1H, t, J=5,9 Hz), 8,18 (1H, d, J=8,2 Hz), 8,29-8,35 (1H, m), 8,42 (1H, d, J=8,6 Hz).
Procedimiento 2: N-[4-(2,5-Dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1 -il)butanoil]-L-a-aspartilglicilglicil-L-fenilalanil-N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]glicinamida
El compuesto (0,166 g, 0,152 mmol) obtenido en el Procedimiento 1 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 2 del Ejemplo 1 para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (0,100 g, 63%).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 8: 0,86 (3H, t, J=7,2 Hz), 1,64-1,75 (2H, m), 1,79-1,92 (2H, m), 2,04-2,51 (5H, m), 2,41 (3H, s), 2,62-2,82 (2H, m), 2,97 (1H, dd, J=13,3, 4,7 Hz), 3,13-3,22 (2H, m), 3,38 (2H, t, J=6,8 Hz), 3,51-3,74 (6H, m), 4,38-4,47 (1H, m), 4,49-4,58 (1H, m), 5,25 (2H, dd, J=25,4, 19,2 Hz), 5,41 (2H, dd, J=20,5, 16,6 Hz), 5,53-5,63 (1H, m), 6,54 (1H, s a), 7,00 (2H, s), 7,11-7,27 (5H, m), 7,31 (1H, s), 7,81 (1H, d, J=10,9 Hz), 7,92 (1H, t, J=5,7 Hz), 8,03 8,12 (2H, m), 8,20 (1H, d, J=7,4 Hz), 8,32 (1H, t, J=5,7 Hz), 8,42 (1H, d, J=8,2 Hz).
EM (IEN) m/z: 1034 (M+H)+.
Procedimiento 3: Conjugado anticuerpo-fármaco (125)
Usando el trastuzumab producido en el ejemplo de referencia 1 y el compuesto obtenido en el Procedimiento 2 anterior, el compuesto de interés se obtuvo de la misma manera como en el Procedimiento 6 del Ejemplo 2.
Concentración de anticuerpo: 1,81 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 10,9 mg (87%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 3,9.
Ejemplo 126 Conjugado anticuerpo-fármaco (126)
Usando el trastuzumab producido en ejemplo de referencia 1 y el compuesto obtenido en el Procedimiento 2 del Ejemplo 125, el compuesto de interés se obtuvo de la misma manera como en el Procedimiento 1 del Ejemplo 3. Concentración de anticuerpo: 2,11 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 12,0 mg (96%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 7,6.
Ejemplo 127 Conjugado anticuerpo-fármaco (127)
[Formula 180]
Procedimiento 1: (15S)-1-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)-15-[(2^[2-({(2S)-1-[(2-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-2-oxoetil)amino]-1-oxo-3-fenilpropan-2-il}amino)-2-oxoetil]amino}-2-oxoetil)carbamoil]-3,13-dioxo-7,10-dioxa-4,14-diazaheptadecan-17-oato de ferc-butilo
El compuesto (0,185 g, 0,200 mmol) obtenido en el Procedimiento 2 del Ejemplo 73 se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 3 del Ejemplo 73 usando 3-(2-(2-(3-maleimidopropanamida)etoxi)etoxi)propanoato de N-succinimidilo en lugar de 6-maleimidohexanoato de N-succinimidilo para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (0,157 g, 64%). RMN 1H (400 MHz, DMSO-da) 8: 0,86 (3H, t, J=7,4 Hz), 1,35 (9H, s), 1,79-1,94 (2H, m), 2,05-2,26 (2H, m), 2,28-2,47 (8H, m), 2,63-2,71 (1H, m), 2,72-2,82 (1H, m), 2,93-3,03 (1H, m), 3,08-3,24 (4H, m), 3,28-3,49 (6H, m), 3,50-3,62 (5H, m), 3,63-3,77 (5H, m), 4,39-4,48 (1H, m), 4,55-4,65 (1H, m), 5,25 (2H, dd, J=25,6, 19,0 Hz), 5,41 (2H, dd, J=21,5, 16,4 Hz), 5,54-5,63 (1H, m), 6,54 (1H, s), 7,00 (2H, s), 7,13-7,26 (5H, m), 7,31 (1H, s), 7,81 (1H, d, J=10,9Hz), 7,91-7,98 (1H, m), 7,99-8,04 (1H, m), 8,04-8,14 (2H, m), 8,24 (1H, d, J=8,2 Hz), 8,30-8,36 (1H, m), 8,42 (1H, d, J=9,0 Hz).
Procedimiento 2: N-{3-[2-(2-{[3-(2,5-Dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)propanoil]amino}etoxi)etoxi]propanoil}-L-aaspartilglicilglicil-L-fenilalanil-N-[(1s,9s)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]glicinamida
El compuesto (0,157 g, 0,127 mmol) obtenido en el Procedimiento 1 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 2 del Ejemplo 1 para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (0,120 g, 80%).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 8: 0,86 (3H, t, J=7,4 Hz), 1,79-1,92 (2H, m), 2,05-2,27 (2H, m), 2,28-2,45 (8H, m), 2,64 2,81 (2H, m), 2,92-3,02 (1H, m), 3,08-3,23 (4H, m), 3,30-3,78 (16H, m), 4,39-4,47 (1H, m), 4,52-4,61 (1H, m), 5,25 (2H, dd, J=26,4, 19,4 Hz), 5,41 (2H, dd, J=20,3, 16,4 Hz), 5,54-5,62 (1H, m), 6,55 (1H, s a), 7,00 (2H, s), 7,13-7,25 (5H, m), 7,31 (1H, s), 7,81 (1H, d, J=10,9 Hz), 7,89-7,97 (1H, m), 7,99-8,12 (3H, m), 8,26 (1H, d, J=7,8 Hz), 8,30-8,36 (1H, m), 8,43 (1H, d, J=8,6 Hz), 12,32 (1H, s a).
EM (IEN) m/z: 1179 (M+H)+.
Procedimiento 3: Conjugado anticuerpo-fármaco (127)
Usando el trastuzumab producido en el ejemplo de referencia 1 y el compuesto obtenido en el Procedimiento 2 anterior,
el compuesto de interés se obtuvo de la misma manera como en el Procedimiento 6 del Ejemplo 2. Concentración de anticuerpo: 1,77 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 10,6 mg (85%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 3,9.
Ejemplo 128 Conjugado anticuerpo-fármaco (128)
Usando el trastuzumab producido en ejemplo de referencia 1 y el compuesto obtenido en el Procedimiento 2 del Ejemplo 127, el compuesto de interés se obtuvo de la misma manera como en el Procedimiento 1 del Ejemplo 3. Concentración de anticuerpo: 1,98 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 11,9 mg (95%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 7,3.
Ejemplo 129 Conjugado anticuerpo-fármaco (129)
[Fórmula 182]
Procedimiento 1: (21S)-1-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)-21-[(2^[2-({(2S)-1-[(2-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-2-oxoetil)amino]-1-oxo-3-fenilpropan-2-il}amino)-2-oxoetil]amino}-2-oxoetil)carbamoil]-3,19-dioxo-7,10,13,16-tetraoxa-4,20-diazatricosan-23-oato de ferc-butilo
El compuesto (0,185 g, 0,200 mmol) obtenido en el Procedimiento 2 del Ejemplo 73 se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 3 del Ejemplo 73 usando 1-maleinimido-3-oxo-7,10,13,16-tetraoxa-4-aza-19-nonadecanoato de N-succinimidilo en lugar de 6-maleimidohexanoato de N-succinimidilo para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (0,161 g, 61 %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-da) ó: 0,86 (3H, t, J=7,4 Hz), 1,35 (9H, s), 1,79-1,91 (2H, m), 2,06-2,26 (2H, m), 2,28-2,46 (8H, m), 2,63-2,71 (1H, m), 2,72-2,82 (1H, m), 2,93-3,03 (1H, m), 3,10-3,22 (4H, m), 3,28-3,53 (14H, m), 3,54-3,62 (5H, m), 3,63-3,78 (5H, m), 4,39-4,47 (1H, m), 4,55-4,65 (1H, m), 5,25 (2H, dd, J=25,4, 19,2 Hz), 5,41 (2H, dd, J=21,1, 16,4 Hz), 5,55-5,62 (1H, m), 6,54 (1H, s), 7,00 (2H, s), 7,16-7,25 (5H, m), 7,31 (1H, s), 7,81 (1H, d, J=10,9 Hz), 7,91 7,98 (1H, m), 8,00-8,15 (3H, m), 8,24 (1H, d, J=7,8 Hz), 8,30-8,36 (1H, m), 8,42 (1H, d, J=8,6 Hz).
Procedimiento 2: N-[19-(2,5-Dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)-17-oxo-4,7,10,13-tetraoxa-16-azanonadecan-1-oil]-L-aaspartilglicilglicil-L-fenilalanil-N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]glicinamida
El compuesto (0,161 g, 0,122 mmol) obtenido en el Procedimiento 1 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 4 del Ejemplo 73 para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (0,133 g, 86%).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) ó: 0,86 (3H, t, J=7,4 Hz), 1,78-1,92 (2H, m), 2,03-2,25 (2H, m), 2,28-2,44 (8H, m), 2,65 2,82 (2H, m), 2,94-3,01 (1H, m), 3,10-3,22 (4H, m), 3,35 (2H, t, J=5,7 Hz), 3,42-3,80 (22H, m), 4,39-4,47 (1H, m), 4,52 4,60 (1H, m), 5,25 (2H, dd, J=26,2, 18,8 Hz), 5,41 (2H, dd, J=20,3, 16,4 Hz), 5,55-5,62 (1H, m), 6,55 (1H, s a), 7,00 (2H, s), 7,13-7,26 (5H, m), 7,31 (1H, s), 7,81 (1H, d, J=10,9 Hz), 7,90-7,96 (1H, m), 8,00-8,10 (3H, m), 8,27 (1H, d, J=7,8 Hz), 8,30-8,36 (1H, m), 8,43 (1H, d, J=9,0 Hz).
EM (IEN) m/z: 1267 (M+H)+.
Procedimiento 3: Conjugado anticuerpo-fármaco (129)
Usando el trastuzumab producido en el ejemplo de referencia 1 y el compuesto obtenido en el Procedimiento 2 anterior,
el compuesto de interés se obtuvo de la misma manera como en el Procedimiento 6 del Ejemplo 2. Concentración de anticuerpo: 1,80 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 10,8 mg (86%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 3,9.
Ejemplo 130 Conjugado anticuerpo-fármaco (130)
Procedimiento 1: Conjugado anticuerpo-fármaco (130)
Usando el trastuzumab producido en ejemplo de referencia 1 y el compuesto obtenido en el Procedimiento 2 del Ejemplo 129, el compuesto de interés se obtuvo de la misma manera como en el Procedimiento 1 del Ejemplo 3. Concentración de anticuerpo: 1,88 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 11,3 mg (90%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 7,2.
Ejemplo 131 Conjugado anticuerpo-fármaco (131)
A una solución de diclorometano (40,0 ml) de N-(ferc-butoxicarbonil)glicilglicil-L-fenilalanina (Patente japonesa abierta a inspección pública n.° 2002-60351; 5,90 g, 15,6 mmol), 1-hidroxibenzotriazol (2,62 g, 17,1 mmol), clorhidrato del éster etílico de glicina (2,62 g, 17,1 mmol) y diisopropiletilamina (5,42 ml, 31,1 mmol), se le añadió clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (3,58 g, 18,68 mmol) y se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. La solución de reacción se diluyó con diclorometano, después se lavó con ácido clorhídrico 1 N, agua y una solución acuosa saturada de cloruro sódico y se secó sobre sulfato sódico anhidro. Después de retirar el disolvente, los residuos obtenidos se purificaron por cromatografía en columna sobre gel de sílice [cloroformo - cloroformo : metanol = 9 : 1 (v/v)] para producir el compuesto del título en forma de un sólido incoloro (5,86 g, 82 %).
RMN 1H (400 MHz, DIVISOR) 8: 1,20 (3H, c, J=7,3 Hz), 1,38 (9H, s), 2,75 (1H, dd, J=13,9, 9,7 Hz), 3,05 (1H, dd, J=13,9, 4,2 Hz), 3,51-3,61 (3H, m), 3,75 (1H, dd, J=16,9, 6,0 Hz), 3,81-3,86 (2H, m), 4,10 (2H, c, J=7,3 Hz), 4,53 (1H, td, J=9,4, 4,0 Hz), 6,96-7,02 (1H, m), 7,16-7,21 (1H, m), 7,23-7,28 (4H, m), 7,88 (1H, t, J=5,4 Hz), 8,15 (1H, d, J=9,1 Hz), 8,47 (1H, t, J=5,7 Hz).
EM (IEN) m/z: 465 (M+H)+.
Procedimiento 2: glicilglicil-L-fenilalanilglicinato de etilo
A una solución de dioxano (40,0 ml) del compuesto (5,80 g, 12,5 mmol) obtenido en el Procedimiento 1 anterior, se le añadió una solución de dioxano de cloruro de hidrógeno 4 N (15,0 ml) y se dejó durante una noche a temperatura ambiente. El disolvente se retiró a presión reducida y los residuos obtenidos se cargaron con acetato de etilo. Los depósitos se recogieron por filtración para producir sal del ácido clorhídrico del compuesto del título en forma de un sólido incoloro (5,74 g, cuantitativo).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-da) 8: 1,20 (3H, t, J=7,5 Hz), 2,76 (1H, dd, J=13,9, 10,3 Hz), 3,05 (1H, dd, J=13,9, 4,2 Hz), 3,53-3,57 (2H, m), 3,63-3,72 (1H, m), 3,82-3,90 (3H, m), 4,10 (2H, c, J=7,5 Hz), 4,53-4,60 (1H, m), 7,12-7,22 (2H, m), 7,23-7,29 (5H, m), 8,06 (1H, s a), 8,36 (1H, d, J=8,8 Hz), 8,55 (2H, td, J=11,3, 5,6 Hz).
EM (IEN) m/z: 365 (M+H)+.
Procedimiento 3: N-(terc-butoxicarbonil)-L-serilglicilglicil-L-fenilalanil glicinato de etilo
A una solución de N,N-dimetilformamida (10,0 ml) del compuesto (0,940 g, 2,34 mmol) obtenido en el Procedimiento 2 anterior, se le añadieron 4-dimetilaminopiridina (0,572 g, 4,69 mmol), N-(terc-butoxicarbonil)-L-serina (0,625 g, 3,05 mmol) y clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (0,584 g, 3,05 mmol) y se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. La solución de reacción se diluyó con cloroformo, después se lavó con ácido clorhídrico 1 N y un tampón fosfato 0,1 N (pH 7,4) en este orden y se secó sobre sulfato sódico anhidro. Después de retirar el disolvente, los residuos obtenidos se purificaron por cromatografía en columna sobre gel de sílice [cloroformo -cloroformo : metanol = 9 : 1 (v/v)] para producir el compuesto del título (0,750 g, 58 %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 8: 1,16 (3H, t, J=7,1 Hz), 1,35 (9H, s), 2,74 (1H, dd, J=13,7, 10,0 Hz), 3,01 (1H, dd, J=13,7, 4,4 Hz), 3,50-3,59 (3H, m), 3,64-3,74 (3H, m), 3,81 (2H, ddd, J=22,5, 16,6, 5,4 Hz), 3,96 (1H, c, J=6,2 Hz), 4,07 (2H, c, J=7,2 Hz), 4,50 (1H, td, J=9,2, 3,7 Hz), 4,85 (1H, t, J=5,9 Hz), 6,70 (1H, d, J=7,3 Hz), 7,13-7,18 (1H, m), 7,20-7,25 (5H, m), 7,96 (1H, t, J=5,4 Hz), 8,07-8,12 (1H, m), 8,44 (1H, t, J=5,9 Hz).
EM (IEN) m/z: 552 (M+H)+.
Procedimiento 4: N-(terc-Butoxicarbonil)-L-serilglicilglicil-L-fenilalanilglicina
Con enfriamiento de hielo, a una solución de dioxano (5,00 ml) del compuesto (0,155 g, 0,280 mmol) obtenido en el Procedimiento 3 anterior, se le añadió una solución acuosa 1 N de hidróxido sódico (0,310 ml, 0,310 mmol) y se agitó durante 10 minutos. Se añadió ácido clorhídrico 1 N (0,310 ml, 0,310 mmol) para la neutralización y después el disolvente se retiró para producir el compuesto del título en forma de un sólido incoloro (0,147 g, cuantitativo).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 8: 1,35 (9H, s), 2,73 (1H, dd, J=13,7, 9,8 Hz), 3,01 (1H, dd, J=13,7, 4,1 Hz), 3,51-3,59 (4H, m), 3,67-3,71 (2H, m), 3,72-3,76 (2H, m), 3,96 (1H, dd, J=12,9, 5,6 Hz), 4,50 (1H, td, J=9,3, 3,6 Hz), 6,71 (1H, d, J=7,8 Hz), 7,13-7,18 (1H, m), 7,20-7,24 (5H, m), 7,96 (1H, t, J=5,9 Hz), 8,06-8,13 (2H, m), 8,35 (1H, t, J=5,9 Hz), 12,56 (1H, s).
Procedimiento 5: N-(terc-Butoxicarbonil)-L-serilglicilglicil-L-fenilalanil-N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]glicinamida
A una solución de N,N-dimetilformamida (1,00 ml) del compuesto (0,147 g, 0,280 mmol) obtenido en el Procedimiento 4 anterior, se le añadieron N-hidroxisuccinimida (32,4 mg, 0,280 mmol) y clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (54 mg, 0,28 mmol) y se agitaron a temperatura ambiente durante 30 minutos. Esta solución se añadió a una solución que consiste en sal del ácido metanosulfónico de exatecán (0,145 mg, 0,260 mmol), N,N-diisopropiletilamina (89,3 pl, 0,510 mmol) y N,N-dimetilformamida (0,200 ml) y se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. El disolvente en la solución de reacción se retiró a presión reducida y los residuos obtenidos se purificaron por cromatografía en columna sobre gel de sílice [cloroformo - cloroformo : metanol = 9 : 1 (v/v)] para producir el compuesto del título (197 mg, 82 %). RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 8: 0,84 (3H, t, J=7,6 Hz), 1,33 (9H, s), 1,83 (2H, dc, J=25,4, 7,2 Hz), 2,03-2,13 (1H, m), 2,14-2,21 (1H, m), 2,38 (3H, s), 2,50-2,52 (2H, m), 2,74 (1H, dd, J=13,7, 9,3 Hz), 2,95 (1H, dd, J=13,7, 4,6 Hz), 3,12-3,18 (2H, m), 3,49-3,56 (3H, m), 3,62-3,76 (5H, m), 3,93-3,99 (1H, m), 4,37-4,43 (1H, m), 4,84-4,91 (1H, m), 5,20 (1H, d, J=18,8 Hz), 5,25 (1H, d, J=18,8 Hz), 5,36 (1H, d, J=16,1 Hz), 5,41 (1H, d, J=16,1 Hz), 5,53-5,58 (1H, m), 6,51 (1H, s), 6,71 (1H, d, J=7,8 Hz), 7,11-7,23 (5H, m), 7,29 (1H, s), 7,78 (1H, d, J=10,7 Hz), 7,96 (1H, t, J=5,9 Hz), 8,05 (1H, d, J=7,3 Hz), 8,11 (1H, d, J=5,4 Hz), 8,28-8,33 (1H, m), 8,40 (1H, d, J=8,3 Hz).
EM (IEN) m/z: 941 (M+H)+.
Procedimiento 6: L-Serilglicilglicil-L-fenilalanil-N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]glicinamida
El compuesto (0,190 g, 0,200 mmol) obtenido en el Procedimiento 5 anterior se disolvió en ácido trifluoroacético y se dejó a temperatura ambiente durante 1 hora. El disolvente en la solución de reacción se retiró a presión reducida y los residuos obtenidos se cargaron con éter dietílico y se agitaron. Después, el sólido obtenido se recogió por filtración para producir sal del ácido trifluoroacético del compuesto del título (175 mg, 91 %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 8: 0,90 (3H, t, J=7,3 Hz), 1,81-1,95 (2H, m), 2,11-2,19 (1H, m), 2,19-2,26 (1H, m), 2,44 (3H, s), 2,79 (1H, dd, J=14,3, 10,0 Hz), 3,00 (1H, dd, J=14,3, 4,4 Hz), 3,18-3,24 (2H, m), 3,65 (1H, dd, J=16,6, 5,4 Hz), 3,69-3,83 (6H, m), 3,87 (1H, dd, J=16,6, 5,4 Hz), 3,90-3,95 (1H, m), 4,52 (1H, td, J=8,8, 4,2 Hz), 5,25 (1H, d, J=19,0 Hz), 5,30 (1H, d, J=19,0 Hz), 5,42 (1H, d, J=16,1 Hz), 5,47 (1H, d, J=16,1 Hz), 5,51 (1H, t, J=5,1 Hz), 5,58-5,63 (1H, m), 6,58 (1H, s), 7,17-7,29 (6H, m), 7,35 (1H, s), 7,85 (1H, d, J=10,7 Hz), 8,09-8,18 (3H, m), 8,43 (1H, t, J=5,6 Hz),
8,52 (1H, d, J=8,8 Hz), 8,70 (1H, t, J=5,6 Hz).
EM (IEN) m/z: 841 (M+H)+.
Procedimiento 7: N-[6-(2,5-Dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoM]-L-serilglicMglicil-L-fenMalanil-N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-l0,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]glicinamida
A una solución de N,N-dimetilformamida (2,00 ml) del compuesto (90,0 mg, 94,3 pmol) obtenido en el Procedimiento 6 anterior, se le añadieron 6-maleimidohexanoato de N-succinimidilo (32,0 mg, 0,100 pmol) y N,N-diisopropiletilamina (17,4 pl, 0,100 pmol) y se agitaron a temperatura ambiente durante 1 hora. El disolvente en la solución de reacción se retiró a presión reducida y los residuos obtenidos se purificaron por cromatografía en columna sobre gel de sílice [cloroformo - cloroformo : metanol = 9 : 1 (v/v)] para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (50 mg, 51 %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-da) 8: 0,87 (3H, t, J=7,3 Hz), 1,12-1,25 (2H, m), 1,41-1,51 (4H, m), 1,79-1,92 (2H, m), 2,09 2,15 (3H, m), 2,17-2,24 (1H, m), 2,41 (3H, s), 2,77 (1H, dd, J=13,9, 9,7 Hz), 2,98 (1H, dd, J=13,9, 4,5 Hz), 3,14-3,21 (2H, m), 3,35-3,38 (2H, m), 3,50-3,60 (3H, m), 3,63-3,76 (5H, m), 4,26 (1H, c, J=6,2 Hz), 4,43 (1H, td, J=8,5, 4,8 Hz), 4,94 (1H, t, J=5,4 Hz), 5,21 (1H, d, J=19,3 Hz), 5,27 (1H, d, J=19,3Hz), 5,38 (1H, d, J=16,3 Hz), 5,44 (1H, d, J=16,3 Hz), 5,54-5,60 (1H, m), 6,53 (1H, s), 6,99 (2H, s), 7,13-7,25 (5H, m), 7,31 (1H, s), 7,80 (1H, d, J=11,5 Hz), 7,89 (1H, d, J=7,9 Hz), 7,99 (1H, t, J=5,7 Hz), 8,06 (1H, d, J=7,9 Hz), 8,15 (1H, t, J=5,4 Hz), 8,29-8,34 (1H, m), 8,41 (1H, d, J=8,5 Hz).
EM (IEN) m/z: 1034 (M+H)+.
Procedimiento 8: Conjugado anticuerpo-fármaco (131)
Usando el trastuzumab producido en el ejemplo de referencia 1 y el compuesto obtenido en el Procedimiento 7 anterior, el compuesto de interés se obtuvo de la misma manera como en el Procedimiento 6 del Ejemplo 2.
Concentración de anticuerpo: 1,79 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 5,4 mg (43 %), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 3,4.
Ejemplo 132 Conjugado anticuerpo-fármaco (132)
Usando el trastuzumab producido en ejemplo de referencia 1 y el compuesto obtenido en el Procedimiento 7 del Ejemplo 131, el compuesto de interés se obtuvo de la misma manera como en el Procedimiento 1 del Ejemplo 3. Concentración de anticuerpo: 1,86 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 10,7 mg (86%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 6,6.
Ejemplo 133 Conjugado anticuerpo-fármaco (133)
[Fórmula 186]
Procedimiento 1: (5S,14R)-5-bencil-1-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-14-([(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]amino}-1,4,7,10,13-pentaoxo-3,6,9,12-tetraazahexadecan-16-oato de ferc-butilo
A una solución de N,N-dimetilformamida (1,00 ml) de N-hidroxisuccinimida (28,5 mg, 0,250 mmol) y ácido N-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-D-aspártico 4-ferc-butilo (0,101 g, 0,250 mmol), se le añadió clorhidrato de 1 -etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (47,4 mg, 0,250 mmol) y se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Esta solución se añadió a una solución que consiste en un forma libre de glicilglicil-L-fenilalanil-N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]glicinamida (Publicación internacional n.° WO 97/46260; 0,195 g, 0,225 mmol), N,N-diisopropiletilamina (78,4 pl, 0,450 mmol) y N,N-dimetilformamida (1,00 ml) y se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. La solución de reacción se diluyó con cloroformo y se lavó con una solución al 10 % de ácido cítrico y después la capa orgánica se secó sobre sulfato sódico. El disolvente se retiró a presión reducida y el residuo obtenido se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice [cloroformo - cloroformo : metanol = 9 : 1 (v/v)] para producir el compuesto del título (0,187 mg, 72%).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-da) 5: 0,86 (3H, t, J=6,7 Hz), 1,37 (9H, s), 1,77-1,92 (2H, m), 2,07-2,28 (2H, m), 2,40 (3H, s), 2,67-2,80 (2H, m), 2,98 (1H, d, J=10,3 Hz), 3,14-3,21 (2H, m), 3,50-3,60 (1H, m), 3,73-3,78 (5H, m), 4,15-4,35 (3H, m), 4,36-4,48 (2H, m), 5,24 (2H, s), 5,38 (1H, d, J=17,2 Hz), 5,43 (1H, d, J=17,2 Hz), 5,54-5,60 (1H, m), 6,53 (1H, d, J=1,8 Hz), 7,10-7,27 (5H, m), 7,30-7,37 (3H, m), 7,39 (2H, t, J=7,3 Hz), 7,69 (3H, t, J=7,3 Hz), 7,81 (1H, d, J=10. 9 Hz), 7,87 (2H, d, J=7,9 Hz), 7,97-8,02 (1H, m), 8,08-8,13 (1H, m), 8,13-8,20 (1H, m), 8,32 (1H, d, J=1,8 Hz), 8,42 (1H, d, J=8,5 Hz).
EM (IEN) m/z: 1147 (M+H)+.
Procedimiento 2: (5S,14R)-14-amino-5-bencil-1-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-1,4,7,10,13-pentaoxo-3,6,9,12-tetraazahexadecan-16-oato de ferc-butilo
El compuesto (182 mg, 0,158 mmol) obtenido en el Procedimiento 1 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 2 del Ejemplo 73 para producir el compuesto del título (132 mg, 91 %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 5: 0,87 (3H, t, J=7,0 Hz), 1,06 (1H, t, J=6,7 Hz), 1,37 (9H, s), 1,78-2,04 (4H, m), 2,04 2,26 (2H, m), 2,34 (1H, dd, J=16,3, 7,3 Hz), 2,41 (3H, s), 2,56-2,60 (1H, m), 2,77 (1H, dd, J=9,1, 13,9 Hz), 2,99 (1H, dd, J=13,9, 4,2 Hz), 3,15-3,21 (2H, m), 3,40-3,58 (3H, m), 3,64-3,76 (4H, m), 4,39-4,46 (1H, m), 5,22 (1H, d, J=19,6 Hz), 5,28 (1H, d, J=19,6 Hz), 5,38 (1H, d, J=16,6 Hz), 5,44 (1H, d, J=16,6 Hz), 5,54-5,61 (1H, m), 6,53 (1H, s), 7,13-7,26 (5H, m), 7,31 (1H, s), 7,81 (1H, d, J=10,9 Hz), 8,01 (1H, t, J=5,7 Hz), 8,08 (1H, d, J=7,9 Hz), 8,21-8,33 (2H, m), 8,41 (1H, d, J=9,1 Hz).
EM (IEN) m/z: 925 (M+H)+.
Procedimiento 3: (5S,14R)-5-bencil-14-{[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil]amino}-1-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]aminol-1,4,7,10,13-pentaoxo-3,6,9,12-tetraazahexadecan-16-oato de ferc-butilo
El compuesto (130 mg, 0,140 mmol) obtenido en el Procedimiento 2 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 3 del Ejemplo 73 para producir el compuesto del título (85,0 mg, 54 %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 5: 0,87 (3H, t, J=7,5 Hz), 1,12-1,23 (2H, m), 1,35 (9H, s), 1,40-1,50 (4H, m), 1,80-1,91 (2H, m), 2,04-2,18 (3H, m), 2,18-2,21 (1H, m), 2,41 (3H, s), 2,63-2,71 (1H, m), 2,77 (1H, dd, J=14,2, 9,7 Hz), 2,98 (1H, dd, J=14,2, 4,5 Hz), 3,15-3,20 (2H, m), 3,26-3,38 (3H, m), 3,54 (1H, dd, J=16,3, 5,4 Hz), 3,64-3,75 (4H, m), 4,39-4,46 (1H, m), 4,55-4,62 (1H, m), 5,22 (1H, d, J=19,3 Hz), 5,28 (1H, d, J=19,3 Hz), 5,38 (1H, d, J=16,0 Hz), 5,44 (1H, d, J=16,0 Hz), 5,54-5,61 (1H, m), 6,53 (1H, s), 6,99 (2H, t, J=14,8 Hz), 7,13-7,25 (5H, m), 7,31 (1H, s), 7,81 (1H, d, J=10,9 Hz), 7,95 (1H, t, J=5,7 Hz), 8,04-8,15 (3H, m), 8,27-8,33 (1H, m), 8,42 (1H, d, J=9,1 Hz).
EM (IEN) m/z: 1147 (M+H)+.
Procedimiento 4: N-[6-(2,5-Dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil]-D-a-aspartilglicilglicil-L-fenilalanil-N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]glicinamida
El compuesto (85,0 mg, 0,0760 mmol) obtenido en el Procedimiento 3 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 2 del Ejemplo 1 para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (20,0 mg, 25 %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 5: 0,87 (3H, t, J=7,3 Hz), 1,11-1,21 (2H, m), 1,39-1,50 (4H, m), 1,80-1,91 (2H, m), 2,05 2,16 (3H, m), 2,17-2,25 (1H, m), 2,40 (3H, s), 2,44-2,47 (2H, m), 2,81 (1H, dd, J=13,4, 10,4 Hz), 2,99 (1H, dd, J=13,4, 4,3 Hz), 3,15-3,20 (2H, m), 3,57-3,78 (6H, m), 4,30-4,40 (1H, m), 4,51 (1H, c, J=6,9 Hz), 5,27 (2H, s), 5,38 (1H, d, J=16,5 Hz), 5,43 (1H, d, J=16,5 Hz), 5,53-5,60 (1H, m), 6,53 (1H, s), 6,97 (2H, s), 7,13-7,27 (7H, m), 7,31 (1H, s), 7,80 (1H, d, J=11,0 Hz), 8,00-8,10 (4H, m), 8,49 (2H, d, J=7,9 Hz), 12,40 (1H, s a).
EM (IEN) m/z: 1062 (M+H)+.
Procedimiento 5: Conjugado anticuerpo-fármaco (133)
Usando el trastuzumab producido en el ejemplo de referencia 1 y el compuesto obtenido en el Procedimiento 4 anterior, el compuesto de interés se obtuvo de la misma manera como en el Procedimiento 6 del Ejemplo 2.
Concentración de anticuerpo: 1,63 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 9,8 mg (78 %), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 3,8.
Ejemplo 134 Conjugado anticuerpo-fármaco (134)
Procedimiento 1: Conjugado anticuerpo-fármaco (134)
Usando el trastuzumab producido en ejemplo de referencia 1 y el compuesto obtenido en el Procedimiento 4 del Ejemplo 133, el compuesto de interés se obtuvo de la misma manera como en el Procedimiento 1 del Ejemplo 3. Concentración de anticuerpo: 1,66 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 10 mg (80 %), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 7,0.
Ejemplo 135 Conjugado anticuerpo-fármaco (135)
[Fórmula 188]
Procedimiento 1: (5S,14S)-5-bencil-1-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-14-[[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]amino}-1,4,7,10,13-pentaoxo-3,6,9,12-tetraazaheptadecan-17-oato de ferc-butilo
A una solución de N,N-dimetilformamida (5,00 ml) de una forma libre de glicilglicil-L-fenilalanil-N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,l0,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]glicinamida (Publicación internacional n.° WO 97/46260; 0,316 g, 0,360 mmol), 1-hidroxibenzotriazol (61,4 mg, 0,400 mmol), ácido N-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-L-glutámico 5-ferc-butilo (0,175 g, 0,400 mmol) y trietilamina (0,178 ml, 1,28 mmol), se le añadió clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (76,8 mg, 0,400 mmol) y se agitó durante una noche a temperatura ambiente. El disolvente se retiró a presión reducida y el residuo obtenido se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice [cloroformo - cloroformo : metanol = 9 : 1 (v/v)] para producir el compuesto del título (0,215 g, 51 %).
RMN 1H (400 MHz, DIVISOR) ó: 0,89 (3H, t, J=7,3 Hz), 1,40 (9H, s), 1,74-2,03 (4H, m), 2,08-2,17 (1H, m), 2,19-2,30 (3H, m), 2,43 (3H, s), 2,81 (1H, dd, J=13,9, 9,5 Hz), 3,01 (1H, dd, J=13,7, 4,4 Hz), 3,17-3,22 (2H, m), 3,57 (1H, dd, J=16,6, 5,4 Hz), 3,66-3,78 (5H, m), 3,88-3,95 (1H, m), 4,21-4,34 (3H, m), 4,42-4,48 (1H, m), 5,26 (2H, s), 5,41 (1H, d, J=16,1 Hz), 5,45 (1H, d, J=16,1 Hz), 5,57-5,62 (1H, m), 6,57 (1H, s), 7,16-7,27 (5H, m), 7,32-7,36 (3H, m), 7,42 (2H, td, J=7,4, 2,8 Hz), 7,74 (3H, d, J=7,3 Hz), 7,83 (1H, d, J=11,2 Hz), 7,90 (2H, d, J=7,3 Hz), 8,05-8,12 (2H, m), 8,19 (1H,
t, J=5,6 Hz), 8,34 (1H, t, J=5,9 Hz), 8,45 (1H, d, J=8,8 Hz).
EM (IEN) m/z: 1161 (M+H)+.
Procedimiento 2: (5S,14S)-14-amino-5-bencil-1-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-1,4,7,10,13-pentaoxo-3,6,9,12-tetraazaheptadecan-17-oato de ferc-butilo
El compuesto (185 mg, 0,160 mmol) obtenido en el Procedimiento 1 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 2 del Ejemplo 73 para producir el compuesto del título (110 mg, 73 %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-da) 8: 0,87 (3H, t, J=7,0 Hz), 1,05 (1H, td, J=7,1, 1,6 Hz), 1,40 (9H, s), 1,57-1,69 (1H, m), 1,76-1,92 (3H, m), 2,06-2,15 (1H, m), 2,16-2,25 (3H, m), 2,41 (3H, s), 2,54 (3H, d, J=1,2 Hz), 2,77 (1H, dd, J=13,9, 9,7 Hz), 2,98 (1H, dd, J=13,9, 4,2 Hz), 3,23-3,28 (1H, m), 3,44 (1H, ddd, J=13,9, 6,7, 1,2 Hz), 3,53 (1H, dd, J=17,2, 5.1 Hz), 3,62-3,68 (2H, m), 3,69-3,75 (2H, m), 4,38-4,46 (1H, m), 5,21 (1H, d, J=19,3 Hz), 5,28 (1H, d, J=19,3 Hz), 5,38 (1H, d, J=16,3 Hz), 5,43 (1H, d, J=16,3 Hz), 5,54-5,60 (1H, m), 6,54 (1H, s a), 7,13-7,26 (5H, m), 7,32 (1H, s), 7,81 (1H, d, J=10,9 Hz), 8,02-8,09 (2H, m), 8,21-8,15 (3H, m), 8,29-8,34 (1H, m), 8,42 (1H, d, J=8,5 Hz).
EM (IEN) m/z: 939 (M+H)+.
Procedimiento 3: (5S,14S)-5-bencil-14-{[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil]amino}-1-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-1,4,7,10,13-pentaoxo-3,6,9,12-tetraazaheptadecan-17-oato de ferc-butilo
El compuesto (110 mg, 0,117 mmol) obtenido en el Procedimiento 2 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 3 del Ejemplo 73 para producir el compuesto del título (113 mg, 85 %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 8: 0,86 (3H, t, J=7,3 Hz), 1,13-1,24 (2H, m), 1,36 (9H, s), 1,41-1,53 (4H, m), 1,67-1,79 (1H, m), 1,79-1,95 (3H, m), 2,03-2,10 (3H, m), 2,13-2,22 (3H, m), 2,41 (3H, s), 2,45-2,48 (1H, m), 2,77 (1H, dd, J=13,9, 9.1 Hz), 2,98 (1H, dd, J=13,6, 4,5 Hz), 3,14-3,22 (2H, m), 3,34-3,38 (2H, m), 3,53 (1H, dd, J=16,6, 5,7 Hz), 3,65 (2H, d, J=5,4 Hz), 3,71 (2H, dd, J=12,4, 5,7 Hz), 4,01-4,08 (1H, m), 4,38-4,45 (1H, m), 5,22 (1H, d, J=19,0 Hz), 5,28 (1H, d, J=19,0 Hz), 5,38 (1H, d, J=16,3 Hz), 5,44 (1H, d, J=16,3 Hz), 5,54-5,60 (1H, m), 6,53 (1H, s), 6,99 (2H, s), 7,13-7,25 (5H, m), 7,31 (1H, s), 7,81 (1H, d, J=10,9 Hz), 8,00-8,09 (3H, m), 8,14 (1H, t, J=5,7 Hz), 8,28-8,33 (1H, m), 8,41 (1H, d, J=8,5 Hz). EM (IEN) m/z: 1133 (M+H)+.
Procedimiento 4: N-[6-(2,5-Dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil]-L-a-glutamilglicilglicil-L-fenilalanil-N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]glicinamida
El compuesto (113 mg, 0,0998 mmol) obtenido en el Procedimiento 3 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 2 del Ejemplo 1 para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (85,0 mg, 80 %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 8: 0,89 (3H, t, J=7,2 Hz), 1,15-1,24 (2H, m), 1,44-1,53 (4H, m), 1,70-2,02 (4H, m), 2,10 (2H, t, J=7,4 Hz), 2,21 (2H, t, J=7,8 Hz), 2,43 (3H, s), 2,79 (1H, dd, J=13,7, 9,4 Hz), 3,00 (1H, dd, J=13,7, 4,3 Hz), 3,16 3,23 (2H, m), 3,40-3,44 (1H, m), 3,55 (1H, dd, J=16,8, 5,5 Hz), 3,67 (2H, d, J=5,5 Hz), 3,73 (2H, dd, J=14,1, 5,9 Hz), 4,12-4,19 (1H, m), 4,40-4,47 (1H, m), 5,24 (1H, d, J=19,2 Hz), 5,30 (1H, d, J=19,2 Hz), 5,40 (1H, d, J=16,2 Hz), 5,46 (1H, d, J=16,2 Hz), 5,57-5,63 (1H, m), 6,52-6,58 (1H, m), 7,01 (2H, s), 7,15-7,27 (5H, m), 7,34 (1H, s), 7,83 (1H, d, J=11,0 Hz), 8,03 (1H, t, J=5,9 Hz), 8,08 (2H, d, J=7,8 Hz), 8,15 (1H, t, J=5,7 Hz), 8,32 (1H, t, J=6,1 Hz), 8,43 (1H, d, J=8,2 Hz), 12,54 (1H, s).
EM (IEN) m/z: 1076 (M+H)+.
Procedimiento 5: Conjugado anticuerpo-fármaco (135)
Usando el trastuzumab producido en el ejemplo de referencia 1 y el compuesto obtenido en el Procedimiento 4 anterior, el compuesto de interés se obtuvo de la misma manera como en el Procedimiento 6 del Ejemplo 2.
Concentración de anticuerpo: 1,61 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 9,7 mg (78 %), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 3,9.
Ejemplo 136 Conjugado anticuerpo-fármaco (136)
Usando el trastuzumab producido en ejemplo de referencia 1 y el compuesto obtenido en el Procedimiento 4 del Ejemplo 135, el compuesto de interés se obtuvo de la misma manera como en el Procedimiento 1 del Ejemplo 3. Concentración de anticuerpo: 1,60 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 9,6 mg (77 %), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 6,9.
Ejemplo 137 Conjugado anticuerpo-fármaco (137)
[Fórmula 190]
Procedimiento 1: (5S,15S)-15-amino-5-bencil-1-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]aminol-1,4,7,10,13-pentaoxo-3,6,9,12-tetraazahexadecan-16-oato de ferc-butilo
Una forma libre de glicilglicil-L-fenilalanil-N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]glicinamida (Publicación internacional n.° WO 97/46260; 150 mg, 0,199 mmol) se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 1 del Ejemplo 73 usando ácido N-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-L-aspártico 1-ferc-butilo en lugar de ácido N-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-L-aspártico 4-ferc-butilo y el producto en bruto obtenido se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 2 del Ejemplo 73 para producir el compuesto del título (72,0 mg, 39 %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-da) ó: 0,87 (3H, t, J=6,5 Hz), 1,38 (9H, s), 1,79-1,92 (2H, m), 2,06-2,15 (1H, m), 2,15-2,24 (1H, m), 2,25-2,35 (1H, m), 2,41 (3H, s a), 2,45-2,58 (2H, m), 2,71-2,82 (1H, m), 2,93-3,04 (1H, m), 3,10-3,23 (2H, m), 3,29-3,37 (2H, m), 3,41-3,79 (6H, m), 4,32-4,48 (1H, m), 5,16-5,33 (2H, m), 5,36-5,46 (2H, m), 5,53-5,63 (1H, m), 6,55 (1H, s), 7,12-7,26 (5H, m), 7,31 (1H, s), 7,81 (1H, d, J=10,6 Hz), 7,94-8,04 (1H, m), 8,24-8,39 (3H, m), 8,43 (1H, d, J=7,4 Hz).
Procedimiento 2: N-[6-(2,5-Dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil]-L-p-aspartilglicilglicil-L-fenilalanil-N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]glicinamida
El compuesto (72,0 mg, 0,0778 mol) obtenido en el Procedimiento 1 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 3 del Ejemplo 73, y el producto en bruto obtenido se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 1 del Ejemplo 2 para producir el compuesto del título en forma de un sólido (31,0 mg, 37 %). RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) ó: 0,87 (3H, t, J=7,4 Hz), 1,11-1,22 (2H, m), 1,34-1,52 (4H, m), 1,85 (2H, m, J=8,2 Hz), 1,94-2,02 (2H, m), 2,03-2,13 (1H, m), 2,15-2,25 (1H, m), 2,31-2,60 (2H, m), 2,38 (3H, s), 2,77-2,88 (1H, m), 2,99 (1H, dd, J=13,3, 3,5 Hz), 3,12-3,21 (2H, m), 3,28-3,41 (2H, m), 3,41-3,83 (6H, m), 4,05-4,33 (2H, m), 5,20 (1H, d, J=19,6 Hz), 5,26 (1H, d, J=19,2 Hz), 5,41 (2H, dd, J=19,6, 16,4 Hz), 5,51-5,59 (1H, m), 6,52 (1H, s), 7,00 (2H, s), 7,12
7,27 (5H, m), 7,30 (1H, s), 7,77 (1H, d, J=10,2 Hz), 7,83-8,06 (2H, m), 8,28-9,04 (3H, m), 8,47 (1H, d, J=8,6 Hz), 12,39 12,69 (1H, m).
EM (IEN) m/z: 1062 (M+H)+.
Procedimiento 3: Conjugado anticuerpo-fármaco (137)
Usando el trastuzumab producido en el ejemplo de referencia 1 y el compuesto obtenido en el Procedimiento 2 anterior, el compuesto de interés se obtuvo de la misma manera como en el Procedimiento 6 del Ejemplo 2.
Concentración de anticuerpo: 1,52 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 9,1 mg (73 %), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 3,7.
Ejemplo 138 Conjugado anticuerpo-fármaco (138)
Procedimiento 1: Conjugado anticuerpo-fármaco (138)
Usando el trastuzumab producido en ejemplo de referencia 1 y el compuesto obtenido en el Procedimiento 2 del Ejemplo 137, el compuesto de interés se obtuvo de la misma manera como en el Procedimiento 1 del Ejemplo 3. Concentración de anticuerpo: 1,51 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 9,1 mg (73 %), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 6,7.
Ejemplo 139 Conjugado anticuerpo-fármaco (139)
[Formula 192]
Procedimiento 1: 9H-Fluoren-9-ilmetil[(2S)-3-terc-butoxi-1-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-1-oxopropan-2-il]carbamato
Se hizo reaccionar la sal del ácido metanosulfónico de exatecán (0,750 g, 1,41 mmol) de la misma manera como en el Procedimiento 1 del Ejemplo 80 usando O-terc-butil-N-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-L-serina en lugar de N-(tercbutoxicarbonil)-glicina para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (1,10 g, 97 %).
EM (IEN) m/z: 801 (M+H)+.
Procedimiento 2: O-terc-butil-N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]-L-serinamida
El compuesto (659 mg, 0,823 mmol) obtenido en el Procedimiento 1 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 2 del Ejemplo 73 para producir el compuesto del título (395 mg, 83 %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-da) 8: 0,84 (3H, t, J=7,0 Hz), 0,90 (9H, s), 1,02-1,11 (1H, m), 1,71-1,94 (4H, m), 2,06-2,16
(1H, m), 2,17-2,27 (1H, m), 2,40 (3H, s), 3,14-3,22 (2H, m), 3,23-3,29 (1H, m), 5,22 (1H, d, J=19,2 Hz), 5,29 (1H, d, J=19,2 Hz), 5,42 (2H, s), 5,56-5,64 (1H, m), 6,54 (1H, s), 7,29 (1H, s), 7,80 (1H, d, J=10,9 Hz), 8,34-8,46 (1H, m).
Procedimiento 3: Glicilglicil-L-fenilalanil-O-ferc-butil-N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2.3.9.10.13.15- hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]-L-serinamida
El compuesto (362 mg, 0,626 mmol) obtenido en el Procedimiento 2 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 1 del Ejemplo 58 usando N-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]glicilglicil-L-fenilalanina (Patente japonesa abierta a inspección pública n.° 2002-60351) en lugar de ácido N-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-L-aspártico 4-terc-butilo y 3H-1,2,3-triazolo[4,5-b]piridin-3-ol en lugar de N-hidroxisuccinimida, y el producto en bruto obtenido se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 2 del Ejemplo 73 para producir el compuesto del título (257 mg, 49 %).
EM (IEN) m/z: 840 (M+H)+.
Procedimiento 4: (5S,8S,17S)-8-bencil-5-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]carbamoil}-17-{[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]amino}-2,2-dimetil-7,10,13,16-tetraoxo-3-oxa-6,9,12,15-tetraazanonadecan-19-oato de terc-butilo
El compuesto (249 mg, 0,297 mmol) obtenido en el Procedimiento 3 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 1 del Ejemplo 73 para producir el compuesto del título (259 mg, 71 %).
EM (IEN) m/z: 1234 (M+H)+.
Procedimiento 5: (5S,8S,17S)-17-amino-8-bencil-5-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2.3.9.10.13.15- hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]carbamoil}-2,2-dimetil-7,10,13,16-tetraoxo-3-oxa-6,9,12,15-tetraazanonadecan-19-oato de terc-butilo
El compuesto (259 mg, 0,210 mmol) obtenido en el Procedimiento 4 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 2 del Ejemplo 73 para producir el compuesto del título (99,0 mg, 47 %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 6: 0,76-0,92 (3H, m), 0,85 (9H, s a), 1,00-1,12 (2H, m), 1,37 (9H, s a), 1,73-1,92 (1H, m), 2,03-2,17 (1H, m), 2,19-2,29 (1H, m), 2,30-2,60 (2H, m), 2,41 (3H, s a), 2,65-2,77 (1H, m), 2,81-2,92 (1H, m), 3,15 3,25 (2H, m), 3,27-3,36 (2H, m), 3,37-3,42 (1H, m), 3,45-3,57 (2H, m), 3,62-3,77 (3H, m), 4,27-4,39 (1H, m), 4,46-4,56 (1H, m), 5,17 (1H, d, J=19,9 Hz), 5,28-5,45 (3H, m), 5,54-5,64 (1H, m), 6,54 (1H, s a), 7,08-7,24 (5H, m), 7,28 (1H, s a) , 7,81 (1H, d, J=9,4 Hz), 7,93-8,10 (3H, m), 8,20-8,31 (1H, m), 8,44-8,54 (1H, m).
EM (IEN) m/z: 1011 (M+H)+.
Procedimiento 6: N-[6-(2,5-Dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil]-L-a-aspartilglicilglicil-L-fenilalanil-N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b] quinolin-1-il]-L-serinamida
El compuesto (94,0 mg, 0,0930 mol) obtenido en el Procedimiento 5 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 3 del Ejemplo 73, y el producto en bruto obtenido se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 2 del Ejemplo 1 para producir el compuesto del título en forma de un sólido (51,0 mg, 50 %). RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 6: 0,85 (3H, t, J=7,4 Hz), 1,17 (2H, quint., J=7,7 Hz), 1,38-1,52 (4H, m), 1,76-1,91 (2H, m), 2,08 (3H, t, J=7,2 Hz), 2,18-2,36 (1H, m), 2,37-2,53 (1H, m), 2,41 (3H, s), 2,60-2,75 (2H, m), 2,85 (1H, dd, J=13,7, 3,9 Hz), 3,14-3,22 (2H, m), 3,29-3,39 (2H, m), 3,47-3,72 (6H, m), 4,28 (1H, dd, J=12,9, 5,5 Hz), 4,43-4,61 (2H, m), 4,88-5,01 (1H, m), 5,19 (1H, d, J=18,4 Hz), 5,29 (1H, d, J=18,8 Hz), 5,40 (2H, dd, J=21,9, 16,8 Hz), 5,51-5,60 (1H, m), 6,52 (1H, s), 6,94-7,03 (2H, m), 7,10-7,24 (5H, m), 7,29 (1H, s), 7,80 (1H, d, J=10,6 Hz), 7,92-7,99 (1H, m), 7,99-8,08 (2H, m), 8,09-8,16 (2H, m), 8,41 (1H, d, J=9,4 Hz), 12,29 (1H, s a).
EM (IEN) m/z: 1092 (M+H)+.
Procedimiento 7: Conjugado anticuerpo-fármaco (139)
Usando el trastuzumab producido en el ejemplo de referencia 1 y el compuesto obtenido en el Procedimiento 6 anterior, el compuesto de interés se obtuvo de la misma manera como en el Procedimiento 6 del Ejemplo 2.
Concentración de anticuerpo: 1,61 mg/ml, 9,7 mg (78 %), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 3,9.
Ejemplo 140 Conjugado anticuerpo-fármaco (140)
Usando el trastuzumab producido en ejemplo de referencia 1 y el compuesto obtenido en el Procedimiento 6 del Ejemplo 139, el compuesto de interés se obtuvo de la misma manera como en el Procedimiento 1 del Ejemplo 3. Concentración de anticuerpo: 1,52 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 9,1 mg (73 %), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 6,9.
Ejemplo 141 Conjugado anticuerpo-fármaco (141)
Procedimiento 1: N-{3-[2-(2-{[3-(2,5-Dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)propanoil]amino}etoxi)etoxi]propanoil}-glicilglicil-L-fenilalanil-N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]glicinamida
Se usó 3-(2-(2-(3-maleimidopropanamida)etoxi)etoxi)propanoato de N-succinimidilo en lugar de 6
maleimidohexanoato de N-succinimidilo y se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 1 del Ejemplo 86 para producir el compuesto del título en forma de un sólido (39 mg, 55 %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-da) 8: 0,87 (3H, t, J=7,3 Hz), 1,79-1,91 (2H, m), 2,06-2,15 (1H, m), 2,16-2,24 (1H, m), 2,29 2,34 (2H, m), 2,37-2,43 (2H, m), 2,41 (3H, s), 2,54-2,58 (2H, m), 2,77 (1H, dd, J=14,2, 9,6 Hz), 2,98 (1H, dd, J=14,2, 4,6 Hz), 3,10-3,15 (2H, m), 3,15-3,20 (2H, m), 3,44-3,47 (4H, m), 3,55-3,61 (6H, m), 3,62-3,69 (2H, m), 3,70-3,75 (2H, m), 4,39-4,46 (1H, m), 5,22 (1H, d, J=18,8Hz), 5,28 (1H, d, J=18,8Hz), 5,39 (1H, d, J=16,5 Hz), 5,44 (2H, d, J=16,5 Hz), 5,54-5,61 (1H, m), 6,53 (1H, s), 6,99 (2H, s), 7,14-7,25 (5H, m), 7,32 (1H, s), 7,81 (1H, d, J=11,0 Hz), 7,97 8,03 (2H, m), 8,08 (1H, d, J=7,8 Hz), 8,17 (1H, t, J=5,7 Hz), 8,31 (1H, t, J=6,0 Hz), 8,42 (1H, d, J=8,7 Hz).
EM (CLEM) m/z: 1064 (M+H)+.
Procedimiento 2: Conjugado anticuerpo-fármaco (141)
El compuesto obtenido en el Procedimiento 1 anterior se usó como el enlazador fármaco. La cantidad de la solución acuosa de TCEP 10 mM añadida, se ajustó tal que la relación molar de TCEP al anticuerpo a la reducción del anticuerpo fue de 2,3. Y la cantidad de la solución enlazador fármaco 10 mM añadida, se ajustó tal que la relación molar del enlazador fármaco al anticuerpo en la conjugación del enlazador fármaco fue de 4,6. Después, la cantidad de la solución acuosa de NAC 100 mM añadida, se ajustó tal que la relación molar de NAC al anticuerpo en la terminación de la reacción fue de 9,2. Mediante los mismos procedimientos como en el Procedimiento 6 del Ejemplo 2, se obtuvieron 6 ml de una solución que contenía el compuesto de interés y se obtuvieron los siguientes valores característicos.
Concentración de anticuerpo: 1,28mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 7,68 mg (77%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 2,6.
Ejemplo 142 Conjugado anticuerpo-fármaco (142)
El compuesto obtenido en el Procedimiento 1 del Ejemplo 141 se usó como el enlazador fármaco. La cantidad de la solución acuosa de TCEP 10 mM añadida, se ajustó tal que la relación molar de TCEP al anticuerpo a la reducción del anticuerpo fue de 4,6. Y la cantidad de la solución enlazador fármaco 10 mM añadida, se ajustó tal que la relación molar del enlazador fármaco al anticuerpo en la conjugación del enlazador fármaco fue de 9,2. Después, la cantidad de la solución acuosa de NAC 100 mM añadida, se ajustó tal que la relación molar de NAC al anticuerpo en la terminación de la reacción fue de 18,4. Mediante los mismos procedimientos como en el Procedimiento 1 del Ejemplo 3, se obtuvieron 6 ml de una solución que contenía el compuesto de interés y se obtuvieron los siguientes valores característicos.
Concentración de anticuerpo: 1,14mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 6,84 mg (68%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 4,8.
Ejemplo 143 Conjugado anticuerpo-fármaco (143)
El compuesto obtenido en el Procedimiento 1 del Ejemplo 141 se usó como el enlazador fármaco. La cantidad de la solución acuosa de TCEP 10 mM añadida, se ajustó tal que la relación molar de TCEP al anticuerpo a la reducción del anticuerpo fue de 4,6. Y la cantidad de la solución enlazador fármaco 10 mM añadida, se ajustó tal que la relación molar del enlazador fármaco al anticuerpo en la conjugación del enlazador fármaco fue de 9,2. Después, la cantidad de la solución acuosa de NAC 100 mM añadida, se ajustó tal que la relación molar de NAC al anticuerpo en la terminación de la reacción fue de 18,4. Mediante los mismos procedimientos como en el Procedimiento 1 del Ejemplo 3, se obtuvieron 6 ml de una solución que contenía el compuesto de interés y se obtuvieron los siguientes valores característicos.
Concentración de anticuerpo: 1,60mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 9,12 mg (73%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 5,8.
Ejemplo 144 Conjugado anticuerpo-fármaco (144)
[Fórmula 197]
Procedimiento 1: N-{2-[(ferc-Butoxicarbonil)amino]etil}-N-(2-ferc-butoxi-2-oxoetil)glicilglicilglicil-L-fenilalanil-N-[(1S,9S)-9-etN-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]glicinamida
El compuesto (0,198 g, 0,597 mmol) obtenido en el Procedimiento 2 del Ejemplo 51 se usó en lugar de ácido (2S)-4-ferc-butoxi-2-{[(9H-fluoren-9-Nmetoxi)carbonN]amino}-4-oxobutanoico y se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 1 del Ejemplo 58 para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (0,380 g, 89 %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-da) ó: 0,87 (3H, t, J=7,2 Hz), 1,35 (9H, s), 1,39 (9H, s), 1,84-1,86 (2H, m), 2,09-2,11 (1H, m), 2,18-2,21 (1H, m), 2,41 (3H, s), 2,97-2,99 (5H, m), 3,18-3,23 (4H, m), 3,38-3,40 (3H, m), 3,55-3,73 (6H, m), 4,43 (1H, s), 5,22 (1H, d, J=19,2 Hz), 5,28 (1H, d, J=19,2 Hz), 5,39 (1H, d, J=16,4 Hz), 5,44 (1H, d, J=16,4 Hz), 5,59 (1H, s), 6,54 (1H, s), 6,59 (1H, s), 6,78 (1H, s), 7,15-7,23 (5H, m), 7,32 (1H, s), 7,81 (1H, d, J=10,9 Hz), 8,05-8,09 (2H, m), 8,32 (1H, s), 8,42 (1H, d, J=8,6 Hz).
EM (CLEM) m/z: 1068 (M+H)+.
Procedimiento 2: N-(2-Aminoetil)-N-(carboximetil)glicilglicilglicil-L-fenilalanil-N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]glicinamida
El compuesto (0,366 g, 0,338 mmol) obtenido en el Procedimiento 1 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 2 del Ejemplo 1 para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (0,180 g, 58%).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) ó: 0,87 (3H, t, J=7,0 Hz), 1,82-1,89 (2H, m), 2,11-2,13 (1H, m), 2,18-2,20 (1H, m), 2,41 (3H, s), 2,77-2,81 (5H, m), 2,98-3,00 (1H, m), 3,16-3,18 (3H, m), 3,39-3,43 (3H, m), 3,58 (1H, dd, J=16,8, 5,5 Hz), 3,71 3,73 (5H, m), 4,45-4,46 (1H, m), 5,22 (1H, d, J=18,0 Hz), 5,28 (1H, d, J=18,0 Hz), 5,39 (1H, d, J=17,6 Hz), 5,44 (1H, d, J=15,6 Hz), 5,58-5,59 (1H, m), 6,55 (1H, s), 7,18-7,23 (6H, m), 7,32 (1H, s), 7,80 (2H, s a), 7,82 (1H, d, J=10,9 Hz), 8,10 (1H, d, J=5,5 Hz), 8,19 (1H, d, J=7,8 Hz), 8,36 (1H, s), 8,43 (1H, s), 8,49 (1H, d, J=8,6 Hz).
EM (CLEM) m/z: 912 (M+H)+.
Procedimiento 3: N-(Carboximetil)-N-[2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1 -il)etil]glicilglicilglicil-L-fenilalanil-N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]glicinamida
Con enfriamiento de hielo, el compuesto (81,0 mg, 88,8 pmol) obtenido en el Procedimiento 2 anterior se disolvió en
una solución acuosa saturada de hidrogenocarbonato sódico (1,00 ml) y 1,4-dioxano (4,00 ml) y se agitó durante 10 minutos. Con enfriamiento de hielo, después de añadir 2,5-dioxopirroM-carboxilato de metilo (13,8 mg, 88,8 |jmol), se agitó durante 20 minutos. Se agitó adicionalmente a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después de añadir una solución acuosa al 10% de ácido cítrico, se agitó durante una noche. La solución de reacción se extrajo con cloroformo y la capa orgánica obtenida se secó sobre sulfato sódico y se filtró. El disolvente en el filtrado se retiró a presión reducida. Los residuos obtenidos se purificaron mediante cromatografía en columna de gel de sílice [cloroformo - capa orgánica repartida de cloroformo : metanol : agua = 7 : 3 : 1 (v/v/v)] para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (14,9 mg, 17 %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-da) 8: 0,87 (3H, t, J=7,2 Hz), 1,80-1,91 (2H, m), 2,09-2,11 (1H, m), 2,17-2,20 (1H, m), 2,38 (3H, s), 2,63-2,68 (2H, m), 2,84-3,00 (2H, m), 3,12-3,16 (3H, m), 3,40-3,45 (6H, m), 3,63-3,76 (5H, m), 4,33-4,35 (1H, m), 5,24 (2H, s), 5,38 (1H, d, J=16,8 Hz), 5,43 (1H, d, J=16,4 Hz), 5,56-5,57 (1H, m), 6,52 (1H, s), 6,95 (2H, s), 7,14 7,21 (6H, m), 7,31 (1H, s), 7,78 (1H, d, J=11,0 Hz), 8,10 (1H, s), 8,54 (1H, d, J=7,8 Hz), 8,72 (3H, s a).
EM (CLEM) m/z: 992 (M+H)+.
Procedimiento 4: Conjugado anticuerpo-fármaco (144)
Usando el trastuzumab producido en el ejemplo de referencia 1 y el compuesto obtenido en el Procedimiento 3 anterior, el compuesto de interés se obtuvo de la misma manera como en el Procedimiento 6 del Ejemplo 2.
Concentración de anticuerpo: 10,55 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 7,4 mg (59%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 3,4.
Ejemplo 145 Conjugado anticuerpo-fármaco (145)
Usando el trastuzumab producido en ejemplo de referencia 1 y el compuesto obtenido en el Procedimiento 3 del Ejemplo 144, el compuesto del ejemplo de interés se obtuvo de la misma manera como el Procedimiento 1 del Ejemplo 3. Concentración de anticuerpo: 9,91 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 6,9 mg (55 %), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 6,3.
Ejemplo 146 Conjugado anticuerpo-fármaco (146)
Procedimiento 1: N-(Carboximetil)-N-(2-{[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1 -il)hexanoil]amino}etil)glicilglicilgMcil-L-fenilalanil-N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]glicinamida
El compuesto (49,0 mg, 53,7 pmol) obtenido en el Procedimiento 2 del Ejemplo 144 se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 1 del Ejemplo 121 para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (14,9 g, 25 %).
RMN 1H (400 MHz, DIVISOR) 8: 0,87 (3H, t, J=7,2 Hz), 1,07-1,16 (2H, m), 1,41-1,43 (4H, m), 1,85-1,87 (2H, m), 1,96 1,98 (2H, m), 2,09-2,12 (1H, m), 2,17-2,19 (1H, m), 2,37-2,42 (3H, m), 2,38 (3H, s), 2,48-2,60 (4H, m), 2,87-3,48 (8H, m), 3,63-3,82 (5H, m), 4,30 (1H, s), 5,22 (1H, d, J=20,3 Hz), 5,29 (1H, d, J=19,2 Hz), 5,41 (2H, s), 5,56-5,58 (1H, m), 6.53 (1H, s), 6,99 (2H, s), 7,20 (6H, d, J=10,6 Hz), 7,32 (1H, s), 7,78-7,80 (3H, m), 8,14-8,16 (2H, m), 8,32 (1H, s), 8.53 (1H, d, J=8,2 Hz).
EM (CLEM) m/z: 1105 (M+H)+.
Procedimiento 2: Conjugado anticuerpo-fármaco (146)
Usando el trastuzumab producido en el ejemplo de referencia 1 y el compuesto obtenido en el Procedimiento 1 anterior, el compuesto de interés se obtuvo de la misma manera como en el Procedimiento 6 del Ejemplo 2.
Concentración de anticuerpo: 1,48 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 8,9 mg (71 %), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 3,1.
Ejemplo 147 Conjugado anticuerpo-fármaco (147)
Procedimiento 1: Conjugado anticuerpo-fármaco (147)
Usando el trastuzumab producido en ejemplo de referencia 1 y el compuesto obtenido en el Procedimiento 1 del Ejemplo 146, el compuesto de interés se obtuvo de la misma manera como en el Procedimiento 1 del Ejemplo 3. Concentración de anticuerpo: 1,49 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 8,9 mg (71 %), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 6,0.
Ejemplo 148 Conjugado anticuerpo-fármaco (148)
Procedimiento 1: N-(3-Sulfonilpropanoil)glicilglicil-L-fenilalanil-N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]glicinamida
Una forma libre de glicilglicil-L-fenilalanil-N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]glicinamida (Publicación internacional n.° WO 97/46260; 0,200 g, 0,27 mmol) se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 1 del Ejemplo 73 usando ácido 3-mercaptopropiónico (62,0 mg, 0,58 mmol) en lugar de ácido N-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-L-aspártico 4-ferc-butilo para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (55,0 mg, 25 %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-da) 8: 0,88 (3H, t, J=7,4 Hz), 1,82-1,93 (2H, m), 2,03-2,29 (2H, m), 2,35-2,57 (3H, m), 2,43 (3H, s), 2,66 (2H, c, J=7,0 Hz), 2,79 (1H, dd, J=13,7, 9,4 Hz), 3,00 (1H, dd, J=13,5, 4,5 Hz), 3,12-3,25 (2H, m), 3,56 (1H, dd, J=16,8, 5,5 Hz), 3,63-3,79 (5H, m), 4,42-4,48 (1H, m), 5,27 (2H, dd, J=23,9, 19,2 Hz), 5,43 (2H, dd, J=20,9, 16,2 Hz), 5,54-5,64 (1H, m), 6,55 (1H, s), 7,13-7,28 (5H, m), 7,33 (1H, s), 7,83 (1H, d, J=11,0Hz), 8,03 (1H, t, J=5,9 Hz), 8,10 (1H, d, J=8,2 Hz), 8,24 (1H, t, J=5,5 Hz), 8,34 (1H, t, J=5,7 Hz), 8,45 (1H, d, J=8,6 Hz).
EM (IEN) m/z: 842 (M+H)+.
Procedimiento 2: Conjugado anticuerpo-fármaco (148)
Derivatización SMCC del anticuerpo: El trastuzumab producido en el ejemplo de referencia 1 se preparó para tener una concentración del anticuerpo de 20 mg/ml reemplazando el medio con PBS6,5/EDTA usando el procedimiento común C-2 y el procedimiento común B (como coeficiente de absorción a 280 nm, se usaron 1,37 mlmg'1 cirr1). La solución (0,5 ml) se puso en un tubo de 1,5 ml, se cargó con una solución de sulfóxido de dimetilo (0,0125 ml; que corresponde a aproximadamente 5,1 equivalentes por molécula de anticuerpo) que contenía 27,6 mM de SMCC y sulfóxido de dimetilo (0,0125 ml) a temperatura ambiente y se hizo reaccionar a temperatura ambiente durante 2 horas. Esta solución de reacción se sometió a purificación de acuerdo con el procedimiento común D-2 para producir 1,2 ml de una solución que contenía aproximadamente 10 mg del anticuerpo derivatizado de SMCC. Conjugación entre el anticuerpo y enlazador de fármaco: Después de añadir una suloción de dimetilacetamida que contenía 10 mM del compuesto obtenido en el Procedimiento 1 anterior (0,03 ml; que corresponde a 5,8 equivalentes por molécula de anticuerpo) a la solución anterior a temperatura ambiente, se agitó usando un rotador de tubo para conjugar el enlazador fármaco al anticuerpo a temperatura ambiente durante 16 horas. Purificación: La solución anterior se sometió a purificación usando el procedimiento común D-1 (se usó ABS como solución tampón) para producir 6 ml de una solución que contenía el compuesto de interés.
Caracterización fisicoquímica: Usando el procedimiento común B y el procedimiento común E, se obtuvieron los siguientes valores característicos.
Concentración de anticuerpo: 1,22 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 7,3 mg (73 %), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 2,7.
Ejemplo 149 Conjugado anticuerpo-fármaco (149)
La cantidad de la solución de DMSO de SMCC 27,6 mM añadida, se ajustó tal que la cantidad de SMCC añadida por molécula de anticuerpo fue de 10,2 equivalentes. Y la cantidad de la solución de dimetilacetamida de enlazador fármaco 10 mM añadido, se ajustó tal que la cantidad del compuesto obtenido en el Procedimiento 1 del Ejemplo 148 añadido por molécula de anticuerpo fue de 11,6 equivalentes. Mediante los mismos procedimientos como en el Procedimiento 2 del Ejemplo 148, se obtuvieron 6 ml de una solución que contenía el compuesto de interés y se obtuvieron los siguientes valores característicos.
Concentración de anticuerpo: 1,10 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 6,6 mg (66 %), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 4,2.
Ejemplo 150 Conjugado anticuerpo-fármaco (150)
[Formula 203]
Procedimiento 1: N-[(9H-Fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]glicilglicil-L-fenilalanMglicil-O-íerc-butil-N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metiM0,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indoNzino[1,2-b]quinoNn-1-il]-L-serinamida
El compuesto (0,27 g, 0,46 mmol) obtenido en el Procedimiento 2 del Ejemplo 139 se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 1 del Ejemplo 1 usando el compuesto (0,39 g, 0,69 mmol) obtenido en el Procedimiento 2 del Ejemplo 34 en lugar de ácido 4-(ferc-butoxicarbonNamino)butanoico para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (0,313 g, 72 %).
EM (IEN) m/z: 1119 (M+H)+.
Procedimiento 2: GNcNgNcN-L-fenNalanNgNcN-O-ferc-butN-N-[(1S,9S)-9-etN-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]-L-serinamida
El compuesto (0,31 g, 0,28 mol) obtenido en el Procedimiento 1 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 2 del Ejemplo 73. Después de la concentración del disolvente, los residuos se usaron para la siguiente reacción sin purificación.
Procedimiento 3: N-[6-(2,5-Dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1 -il)hexanoil]glicilglicil-L-fenilalanilglicil-O-ferc-butil-N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]-L-serinamida
El compuesto (0,28 mol) obtenido en el Procedimiento 2 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 3 del Ejemplo 73 para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color naranja (0,306 g,
cuantitativo, 2 etapas).
EM (IEN) m/z: 1090 (M+H)+.
Procedimiento 4: N-[6-(2,5-Dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1 -il)hexanoil]glicilglicil-L-fenMalanilgMcil-N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3’,4’:6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]-L-serinamida
El compuesto (0,31 g, 0,28 mol) obtenido en el Procedimiento 3 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 2 del Ejemplo 1 para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (0,12 g, 41 %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-da) 6: 0,86 (3H, t, J=7,4 Hz), 1,13-1,23 (2H, m), 1,39-1,52 (6H, m), 1,74-1,90 (2H, m), 2,03 2,14 (4H, m), 2,39 (3H, s), 2,60-2,95 (2H, m), 3,49-3,81 (10H, m), 4,15-4,59 (3H, m), 5,15-5,31 (2H, m), 5,40 (2H, s), 5,53-5,61 (1H, m), 6,52 (1H, s a), 6,99 (2H, s), 7,12-7,29 (6H, m), 7,76 (1H, d, J=11,0 Hz), 7,94-8,16 (4H, m), 8,25 (1H, t, J=5,5 Hz), 8,50 (1H, d, J=8,6 Hz).
EM (IEN) m/z: 1034 (M+H)+.
Procedimiento 5: Conjugado anticuerpo-fármaco (150)
Usando el trastuzumab producido en el ejemplo de referencia 1 y el compuesto obtenido en el Procedimiento 4 anterior, el compuesto de interés se obtuvo de la misma manera como en el Procedimiento 6 del Ejemplo 2.
Concentración de anticuerpo: 1,57 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 9,4 mg (75 %), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 3,4.
Ejemplo 151 Conjugado anticuerpo-fármaco (151)
Usando el trastuzumab producido en ejemplo de referencia 1 y el compuesto obtenido en el Procedimiento 4 del Ejemplo 150, el compuesto de interés se obtuvo de la misma manera como en el Procedimiento 1 del Ejemplo 3. Concentración de anticuerpo: 1,76 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 10,6 mg (85%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 6,9.
Ejemplo 152 Conjugado anticuerpo-fármaco (152)
[Formula 205]
Procedimiento 1: N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3’,4’:6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]-N2-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-L-a-glutaminato de terc-butilo
Se hizo reaccionar la sal del ácido metanosulfónico de exatecán (532 mg, 1,00 mmol) de la misma manera como en el Procedimiento 1 del Ejemplo 80 usando ácido N-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-L-glutámico 5-ferc-butilo (511 mg, 1,20 mmol) en lugar de N-(ferc-butoxicarbonil)-glicina y el producto en bruto obtenido se usó para la siguiente reacción sin purificación.
Procedimiento 2: N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]-L-a-glutaminato de ferc-butilo
El producto en bruto obtenido en el Procedimiento 1 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 2 del Ejemplo 73 para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (411 mg, 66 %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-da) 8: 0,87 (3H, t, J=7,4 Hz), 1,32 (9H, s), 1,51-2,35 (8H, m), 2,41 (3H, s), 3,13-3,22 (3H, m), 5,21 (2H, dd, J=57,7, 19,0 Hz), 5,42 (2H, dd, J=18,4, 16,4 Hz), 5,51-5,59 (1H, m), 6,54 (1H, s), 7,30 (1H, s), 7,81 (1H, d, J=10,9 Hz), 8,34-8,42 (1H, m).
Procedimiento 3: N-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]glicil-N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2.3.9.10.13.15- hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]-L-a-glutaminato de terc-butilo
El compuesto (411 mg, 0,662 mmol) obtenido en el Procedimiento 2 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 1 del Ejemplo 80 usando N-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]glicina (236 mg, 0,795 mmol) en lugar de N-(ferc-butoxicarbonil)-glicina y el producto en bruto obtenido se usó para la siguiente reacción sin purificación.
Procedimiento 4: glicil-N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]-L-a-glutaminato de ferc-butilo
El producto en bruto obtenido en el Procedimiento 3 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 2 del Ejemplo 73 para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (219 mg, 49 %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 8: 0,87 (3H, t, J=7,4 Hz), 1,27 (9H, s), 1,66-2,45 (8H, m), 2,41 (3H, s), 3,11-3,45 (4H, m), 4,30-4,37 (1H, m), 5,19 (2H, dd, J=109,1, 18,8 Hz), 5,41 (2H, dd, J=16,4, 19,9 Hz), 5,50-5,58 (1H, m), 6,55 (1H, s), 7,31 (1H, s), 7,81 (1H, d, J=10,9 Hz), 8,14 (1H, s), 8,65 (1H, d, J=8,2 Hz).
Procedimiento 5: N-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]glicilglicil-L-fenilalanilglicilglicil-N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]-L-aglutaminato de ferc-butilo
El compuesto (219 mg, 0,323 mmol) obtenido en el Procedimiento 4 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 1 del Ejemplo 80 usando N-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]glicilglicil-L-fenilalanilglicina (217 mg, 0,388 mmol) en lugar de N-(ferc-butoxicarbonil)-glicina y el producto en bruto obtenido se usó para la siguiente reacción sin purificación.
Procedimiento 6: glicilglicil-L-fenilalanilglicilglicil-N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2.3.9.10.13.15- hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]-L-a-glutaminato de ferc-butilo
El producto en bruto obtenido en el Procedimiento 5 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 2 del Ejemplo 73 para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (131 mg, 41 %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 8: 0,87 (3H, t, J=7,2 Hz), 1,28 (9H, s), 1,66-2,29 (8H, m), 2,40 (3H, s), 2,72-2,80 (1H, m), 3,00-3,08 (1H, m), 3,37-3,10 (4H, m), 3,55-3,84 (6H, m), 4,23-4,31 (1H, m), 4,49-4,55 (1H, m), 5,19 (2H, dd, J=104,4, 18,8 Hz), 5,42 (2H, dd, J=19,9, 16,4 Hz), 5,50-5,58 (1H, m), 6,55 (1H, s), 7,16-7,28 (5H, m), 7,31 (1H, s), 7,81 (1H, d, J=10,9 Hz), 7,96-8,01 (1H, m), 8,09 (1H, d, J=7,4 Hz), 8,12-8,19 (1H, m), 8,24 (1H, d, J=8,2 Hz), 8,34-8,40 (1H, m), 8,52 (1H, d, J=8,6 Hz).
Procedimiento 7: N-[3-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)propanoil]glicilglicil-L-fenilalanilglicilglicil-N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]-L-a-glutaminato de ferc-butilo
El compuesto (131 mg, 0,132 mol) obtenido en el Procedimiento 6 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 3 del Ejemplo 73 usando 3-maleimidopropionato de N-succinimidilo en lugar de 6-maleimidohexanoato de N-succinimidilo para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (102 mg, 68 %). RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 8: 0,87 (3H, t, J=7,4 Hz), 1,28 (9H, s), 2,87-2,86 (10H, m), 2,40 (3H, s), 2,73-2,82 (1H, m), 2,99-3,07 (1H, m), 3,11-3,20 (2H, m), 3,54-3,80 (10H, m), 4,23-4,31 (1H, m), 4,45-4,52 (1H, m), 5,19 (2H, dd, J=104,1, 18,8 Hz), 5,41 (2H, dd, J=16,4, 20,0 Hz), 5,50-5,58 (1H, m), 6,54 (1H, s), 6,99 (2H, s), 7,14 7,26 (5H, m), 7,31 (1H, s), 7,81 (1H, d, J=11,0 Hz), 7,92-7,97 (1H, m), 8,00-8,05 (1H, m), 8,06-8,13 (2H, m), 8,26-8,32 (2H, m), 8,50 (1H, d, J=8,6 Hz).
Procedimiento 8: N-[3-(2,5-Dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1 -il)propanoM]glicilgMcil-L-fenMalanilglicilgMcil-N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3’,4’:6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]-L-a-glutamina
El compuesto (102 mg, 0,0889 mol) obtenido en el Procedimiento 7 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 2 del Ejemplo 1 para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (74,0 mg, 76 %).
RMN 1H (400 MHz, DIVISOR) 6:0,88 (3H, t, J=7,4 Hz), 2,56-1,74 (10H, m), 2,40 (3H, s), 2,74-2,83 (1H, m), 2,99-3,08 (1H, m), 3,12-3,19 (2H, m), 3,55-3,78 (10H, m), 4,22-4,33 (1H, m), 4,44-4,53 (1H, m), 5,19 (2H, dd, J=83,1, 19,0 Hz), 5,43 (2H, s), 5,49-5,56 (1H, m), 6,53 (1H, s), 6,99 (2H, s), 7,15-7,29 (5H, m), 7,31 (1H, s), 7,80 (1H, d, J=11,3 Hz), 7,93-8,19 (4H, m), 8,24-8,36 (2H, m), 8,44-8,53 (1H, m), 12,08 (1H, s).
EM (CLEM) m/z: 1091 (M+H)+.
Procedimiento 9: Conjugado anticuerpo-fármaco (152)
Usando el trastuzumab producido en el ejemplo de referencia 1 y el compuesto obtenido en el Procedimiento 8 anterior, el compuesto de interés se obtuvo de la misma manera como en el Procedimiento 6 del Ejemplo 2.
Concentración de anticuerpo: 1,58 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 9,5 mg (76 %), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 3,9.
Ejemplo 153 Conjugado anticuerpo-fármaco (153)
Usando el trastuzumab producido en ejemplo de referencia 1 y el compuesto obtenido en el Procedimiento 8 del Ejemplo 152, el compuesto del ejemplo de interés se obtuvo de la misma manera como el Procedimiento 1 del Ejemplo 3. Concentración de anticuerpo: 1,45 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 8,7 mg (70%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 7,2.
Ejemplo 154 Conjugado anticuerpo-fármaco (154)
[Formula 2071
Procedimiento 1: N-(ferc-Butoxicarbonil)glicilglicil-L-fenilalanilglicilglicilglicilfenilalanil-N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]glicinamida
Se hizo reaccionar glicilglicil-L-fenilalanil-N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]glicinamida (0,550 g, 0,730 mmol) de la misma manera como en el Procedimiento 1 del Ejemplo 73 usando N-(íerc-butoxicarbonil)-glicilglicil-L-fenilalanilglicina (0,382 g, 0,876 mmol) en lugar de ácido N-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-L-aspártico 4-ferc-butilo para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (0,566 g, 66 %). RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 8: 0,86 (3H, t, J=7,2 Hz), 1,37 (9H, s), 1,79-1,90 (2H, m), 2,10-2,13 (1H, m), 2,18-2,21 (1H, m), 2,41 (3H, s), 2,77-2,80 (2H, m), 2,98 (1H, dd, J=13,9, 4,5 Hz), 3,04 (1H, dd, J=13,7, 3,9 Hz), 3,17-3,19 (2H, m), 3,54-3,61 (4H, m), 3,70-3,74
(8H, m), 4,44 (1H, td, J=8,4, 4,7 Hz), 4,52 (1H, td, J=8,8, 4,0 Hz), 5,22 (1H, d, J=19,6 Hz), 5,28 (1H, d, J=19,6 Hz), 5,38 (1H, d, J=16,4 Hz), 5,44 (1H, d, J=16,4 Hz), 5,56-5,60 (1H, m), 6,53 (1H, s), 6,99 (1H, t, J=5,7 Hz), 7,17-7,23 (10H, m), 7,31 (1H, s), 7,81 (1H, d, J=11,0 Hz), 7,89 (1H, t, J=6,1 Hz), 8,03-8,05 (2H, m), 8,10 (1H, d, J=7,8 Hz), 8,15 (1H, d, J=8,2 Hz), 8,32-8,33 (2H, m), 8,44 (1H, d, J=8,2 Hz). EM (CLEM) m/z: 1172 (M+H)+.
Procedimiento 2: Glicilglicil-L-fenilalanilglicilglicilglicilfenilalanil-N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]glicinamida
El compuesto (0,440 g, 0,376 mmol) obtenido en el Procedimiento 1 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 2 del Ejemplo 1 para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo (0,264 g, 66 %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 8: 0,86 (3H, t, J=7,2 Hz), 1,79-1,90 (2H, m), 2,14-2,20 (2H, m), 2,41 (3H, s), 2,73-2,80 (2H, m), 2,98 (1H, dd, J=13,7, 4,3 Hz), 3,05 (1H, dd, J=13,9, 4,5 Hz), 3,17-3,18 (2H, m), 3,55-3,88 (12H, m), 4,45 (1H, dd, J=13,1, 8,8 Hz), 4,56 (1H, td, J=8,9, 4,3 Hz), 5,22 (1H, d, J=19,9Hz), 5,27 (1H, t, J=10,9Hz), 5,38 (1H, d, J=16,0 Hz), 5,44 (1H, d, J=16,4 Hz), 5,58 (1H, t, J=4,1 Hz), 6,55 (1H, s), 7,16-7,32 (10H, m), 7,32 (1H, s), 7,81 (1H, d, J=10,9 Hz), 7,99 (3H, s a), 8,07-8,12 (2H, m), 8,34-8,38 (3H, m), 8,47-8,51 (2H, m).
EM (CLEM) m/z: 1072 (M+H)+.
Procedimiento 3: N-[6-(2,5-Dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil]glicilglicil-L-fenilalanilglicilglicilglicilfenilalanil-N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]glicinamida
El compuesto (0,229 g, 0,213 mmol) obtenido en el Procedimiento 2 anterior se hizo reaccionar de la misma manera como en el Procedimiento 8 del Ejemplo 5 para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (0,0282 g, 11 %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 8: 0,87 (3H, t, J=7,2 Hz), 1,17-1,63 (8H, m), 2,08-2,10 (3H, m), 2,31-2,35 (1H, m), 2,40 (3H, s), 2,76 (1H, dd, J=10,6, 3,1 Hz), 2,95-3,11 (2H, m), 3,13-3,24 (3H, m), 3,36-3,41 (2H, m), 3,59-3,79 (12H, m), 4,50-4,52 (2H, m), 5,23-5,25 (2H, m), 5,40-5,41 (2H, m), 5,57-5,58 (1H, m), 6,53 (1H, s), 6,99 (2H, s), 7,14-7,26 (10H, m), 7,32 (1H, s), 7,81 (1H, d, J=11,0 Hz), 7,97-8,13 (6H, m), 8,28-8,32 (2H, m), 8,42-8,47 (1H, m). EM (CLEM) m/z: 1265 (M+H)+.
Procedimiento 4: Conjugado anticuerpo-fármaco (154)
El compuesto obtenido en el Procedimiento 3 anterior se usó como el enlazador fármaco. La cantidad de la solución acuosa de TCEP 10 mM añadida, se ajustó tal que la relación molar de TCEP al anticuerpo a la reducción del anticuerpo fue de 2,3. Y la cantidad de la solución enlazador fármaco 10 mM añadida, se ajustó tal que la relación molar del enlazador fármaco al anticuerpo en la conjugación del enlazador fármaco fue de 4,6. Después, la cantidad de la solución acuosa de NAC 100 mM añadida, se ajustó tal que la relación molar de NAC al anticuerpo en la terminación de la reacción fue de 9,2. Mediante los mismos procedimientos como el Procedimiento 5 del Ejemplo 78, se obtuvieron 6 ml de una solución que contenía el compuesto del ejemplo de interés y se obtuvieron los siguientes valores característicos.
Concentración de anticuerpo: 1,16 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 7,0 mg (70 %), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 2,2.
Ejemplo 155 Conjugado anticuerpo-fármaco (155)
El compuesto obtenido en el Procedimiento 3 del Ejemplo 154 se usó como el enlazador fármaco. La cantidad de la solución acuosa de TCEP 10 mM añadida, se ajustó tal que la relación molar de TCEP al anticuerpo a la reducción del anticuerpo fue de 4,6. Y la cantidad de la solución enlazador fármaco 10 mM añadida, se ajustó tal que la relación molar del enlazador fármaco al anticuerpo en la conjugación del enlazador fármaco fue de 9,2. Después, la cantidad de la solución acuosa de NAC 100 mM añadida, se ajustó tal que la relación molar de NAC al anticuerpo en la terminación de la reacción fue de 18,4. Mediante los mismos procedimientos como en el Procedimiento 5 del Ejemplo 78, se obtuvieron 6 ml de una solución que contenía el compuesto de interés y se obtuvieron los siguientes valores característicos.
Concentración de anticuerpo: 1,36 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 8,2 mg (82 %), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 4,9.
Ejemplo 156 Conjugado anticuerpo-fármaco (156)
[Formula 209]
Procedimiento 1: (3S)-4-{[2-(bencNoxi)-2-oxoetil](metil)amino}-3-{[(9H-fluoren-9-Nmetoxi)carboml]amino}-4-oxobutanato de tere-butilo
Se disolvió ácido (2S)-4-terc-butoxi-2-{[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]amino}-4-oxobutanoico (9,00 g, 21,9 mmol) en N,N-dimetilformamida (30,0 ml), se cargó con 1-hidroxibenzotriazol (2,96 g, 21,9 mmol) y clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (8,39 g, 43,8 mmol) y se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de añadir 4-metilbencenosulfonato de N-metilglicinato de bencilo (7,69 g, 21,9 mmol) y trietilamina (3,05 ml, 21,88 mmol), se agitó a temperatura ambiente durante 21 horas. Después de añadir agua (200 ml), se extrajo con 150 ml de acetato de etilo 3 veces y la capa orgánica se secó sobre sulfato sódico anhidro. El disolvente se retiró a presión reducida para producir una mezcla de unb sólido incoloro que contenía el compuesto del título (11,9 g). La mezcla se usó en la siguiente reacción sin purificación adicional.
Procedimiento 2: ácido {[(2S)-4-terc-butoxi-2-{[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]amino}-4-oxobutanoil](metil)amino}acético
La mezcla (11,9 g) obtenido en el Procedimiento 2 anterior se disolvió en metanol (200 ml). Después de añadir un catalizador de paladio sobre carbono (500 mg), se agitó en una atmósfera de hidrógeno a temperatura ambiente durante 7 horas. Los insolubles se retiraron por filtración a través de celite y el disolvente se retiró a presión reducida para producir una mezcla de un sólido incoloro que contenía el compuesto del título (9,21 g). La mezcla se usó en la siguiente reacción sin purificación adicional.
Procedimiento 3: N-(terc-butoxicarbonil)glicil-L-fenilalanato de bencilo
Se disolvió N-(terc-butoxicarbonil)glicina (5,00 g, 28,5 mmol) en N,N-dimetilformamida (30 ml), se cargó con 1-hidroxibenzotriazol (3,86 g, 28,5 mmol) y clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (10,9 g, 57,1 mmol) y se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de añadir 4-metilbencenosulfonato de L-fenilalanato de bencilo (12,2 g, 28,5 mmol) y trietilamina (3,98 ml, 28,5 mmol), se agitó a temperatura ambiente durante 17 horas. La solución de reacción se vertió en agua y se agitó, y después los insolubles depositados se recogieron por filtración. El sólido se lavó con agua para producir el compuesto del título en forma de un sólido incoloro (11,7 g, 99 %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-da) 8: 1,38 (9H, s), 2,96 (1H, dd, J=13,7, 8,5 Hz), 3,03 (1H, dd, J=13,8, 6,0 Hz), 3,52 (1H, dd, J=17,0, 6,2 Hz), 3,58 (1H, dd, J=16,8, 6,3 Hz), 4,54 (1H, dd, J=14,2, 7,6 Hz), 5,06 (1H, d, J=12,4 Hz), 5,10 (1H, d, J=12,4 Hz), 6,93 (1H, t, J=6,0 Hz), 7,17-7,37 (10H, m), 8,27 (1H, d, J=7,8 Hz).
EM (IEN) m/z: 413 (M+H)+.
Procedimiento 4: glicil-L-fenilalanato de bencilo
El compuesto (11,7 g, 28,2 mmol) obtenido en el Procedimiento 3 anterior se disolvió en a una solución 4 N de dioxano de cloruro de hidrógeno (100 ml) y se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. El disolvente se retiró a presión reducida para producir la sal del ácido clorhídrico del compuesto del título en forma de un sólido incoloro (9,98 g, cuantitativo).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 8: 2,96 (1H, dd, J=13,8, 8,7 Hz), 3,08 (1H, dd, J=13,9, 5,9 Hz), 3,51-3,57 (2H, m), 4,62 (1H, c, J=7,2 Hz), 5,07 (1H, d, J=12,4 Hz), 5,13 (1H, d, J=12,7 Hz), 7,21-7,38 (10H, m), 8,10 (3H, s), 9,00 (1H, s). EM (IEN) m/z: 313 (M+H)+.
Procedimiento 5: (5S,14S)-14-bencil-5-(2-terc-butoxi-2-oxoetil)-1-(9H-fluoren-9-il)-7-metil-3,6,9,12-tetraoxo-2-oxa-4.7.10.13- tetraazapantadecan-15-oato de bencilo
La mezcla (2,8 g) obtenido en el Procedimiento 2 se disolvió en N,N-dimetilformamida (20 ml), se cargó con 1-hidroxibenzotriazol (780 mg, 5,80 mmol), clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (10,9 g, 11,6 mmol), el compuesto (2,02 g, 5,80 mmol) obtenido en el Procedimiento 4 y trietilamina (590 pl, 5,80 mmol) y se agitó a temperatura ambiente durante 13 horas. La solución de reacción se vertió en agua y se agitó, y después los insolubles depositados se recogieron por filtración. El sólido se lavó con agua para producir el compuesto del título en forma de un sólido incoloro (4,51 g, 87 %, 3 etapas).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 8: 1,36 (9H, s), 2,43-2,48 (1H, m), 2,60-2,66 (1H, m), 2,79-2,81 (1H, m), 2,93-2,97 (1H, m), 3,03 (3H, s), 3,63-4,07 (4H, m), 4,17-4,35 (3H, m), 4,51-4,57 (1H, m), 4,69-4,80 (1H, m), 5,05-5,09 (2H, m), 7,18 7,46 (14H, m), 7,58-7,83 (2H, m), 7,82-8,03 (4H, m), 8,26-8,44 (1H, m).
EM (IEN) m/z: 777 (M+H)+.
Procedimiento 6: (5S,14S)-14-Bencil-5-(2-terc-butoxi-2-oxoetil)-1-(9H-fluoren-9-il)-7-metil-3,6,9,12-tetraoxo-2-oxa-4.7.10.13- tetraazapantadecan-15-ácido
El compuesto (4,49 g, 5,78 mmol) obtenido en el Procedimiento 5 anterior se disolvió en metanol (50,0 ml). Después de añadir una cantidad catalítica de un catalizador de paladio sobre carbono, se agitó en una atmósfera de hidrógeno a temperatura ambiente durante 1,5 horas. Los insolubles se retiraron por filtración a través de celite y el disolvente se retiró a presión reducida para producir el compuesto del título en forma de un sólido incoloro (3,99 g, cuantitativo). RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 8: 1,35 (9H, s), 2,42-2,45 (1H, m), 2,62-2,67 (1H, m), 2,77 (1H, s), 2,85-2,90 (1H, m), 3,00 (3H, s), 3,03-3,06 (1H, m), 3,61-4,06 (3H, m), 4,25-4,29 (3H, m), 4,40-4,42 (1H, m), 4,79-4,80 (1H, m), 7,19-7,43 (9H, m), 7,64-7,70 (2H, m), 7,81-7,89 (3H, m), 7,99 (1H, t, J=5,7 Hz), 8,12 (1H, d, J=8,1 Hz), 8,21 (1H, d, J=7,3 Hz). EM (IEN) m/z: 687 (M+H)+.
Procedimiento 7: (5S,14S)-5-bencil-1-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro
1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-14-[[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]amino}-12-metil-1,4,7,10,l3-pentaoxo-3,6,9,12-tetraazapantadecan-16-oato de ferc-butilo
Se disolvió la sal del ácido metanosulfónico del compuesto (400 mg, 0,659 mmol) del Procedimiento 2 del Ejemplo 80 en N,N-dimetilformamida (10 ml), se cargó con 1-hidroxibenzotriazol (90,0 mg, 0,659 mmol), clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (250 mg, 1,32 mmol), el compuesto (450 mg, 0,659 mmol) obtenido en el Procedimiento 6 anterior y trietilamina (90,0 pl, 0,0659 mmol) y se agitó a temperatura ambiente durante 19 horas. El disolvente se retiró a presión reducida y el residuo obtenido se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice [cloroformo - cloroformo : metanol = 4 : 1 (v/v)] para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (595 mg, 78 %).
RMN 1H (400 MHz, DIVISOR) 8: 0,86 (3H, t, J=7,3 Hz), 1,35 (9H, s), 1,80-1,89 (2H, m), 2,10-2,11 (1H, m), 2,17-2,19 (1H, m), 2,39 (3H, s), 2,40-2,45 (1H, m), 2,58-2,82 (3H, m), 2,99 (3H, s), 3,17 (2H, s), 3,53-4,01 (5H, m), 4,25-4,40 (5H, m), 4,65-4,79 (1H, m), 5,22 (2H, s), 5,37 (1H, d, J=16,4 Hz), 5,42 (1H, d, J=16,4 Hz), 5,56-5,58 (1H, m), 6,52 (1H, s), 7,14-7,40 (9H, m), 7,66-7,68 (2H, m), 7,79-7,84 (4H, m), 7,96-8,22 (2H, m), 8,34-8,43 (3H, m).
EM (IEN) m/z: 1161 (M+H)+.
Procedimiento 8: (5S,14S)-14-amino-5-bencil-1-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-12-metil-1,4,7,10,13-pentaoxo-3,6,9,12-tetraazapantadecan-16-oato de ferc-butilo
El compuesto (520 mg, 0,448 mmol) obtenido en el Procedimiento 7 anterior se disolvió en N,N-dimetilformamida (8,00 ml), se cargó con piperidina (2,00 ml) y se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. El disolvente se retiró a presión reducida y el residuo obtenido se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice [cloroformo -capa orgánica repartida de cloroformo : metanol : agua = 7 : 3 : 1 (v/v/v)] para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (350 mg, 83 %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 8: 0,86 (3H, t, J=7,1 Hz), 1,36 (9H, s), 1,82-1,88 (3H, m), 2,12-2,22 (3H, m), 2,40 (3H, s), 2,54 (1H, s), 2,76-2,81 (1H, m), 2,98-3,03 (1H, m), 3,04 (3H, s), 3,16-3,17 (2H, m), 3,33 (2H, s), 3,50-4,16 (6H, m), 4,47 (1H, t, J=17,1 Hz), 5,24 (2H, s), 5,39 (1H, d, J=16,6 Hz), 5,43 (1H, d, J=16,4 Hz), 5,57-5,59 (1H, m), 6,53 (1H, s), 7,17-7,22 (5H, m), 7,31 (1H, s), 7,79-7,81 (1H, m), 7,89-8,01 (1H, m), 8,18-8,46 (3H, m).
EM (IEN) m/z: 939 (M+H)+.
Procedimiento 9: (5S,14S)-5-bencil-14-{[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil]amino}-1-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-12-metil-1,4,7,10,13-pentaoxo-3,6,9,12-tetraazapantadecan-16-oato de ferc-butilo
El compuesto (351 mg, 0,374 mmol) obtenido en el Procedimiento 8 anterior se disolvió en N,N-dimetilformamida (6,00 ml). Después de añadiro 6-maleimidohexanoato de N-succinimidilo (115 mg, 0,374 mmol), se agitó a temperatura ambiente durante 16,5 horas. El disolvente se retiró a presión reducida y el residuo obtenido se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice [cloroformo - cloroformo : metanol = 4 : 1 (v/v)] para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (403 mg, 95 %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 8: 0,86 (3H, t, J=7,3 Hz), 1,15-1,18 (2H, m), 1,35 (9H, s), 1,41-1,44 (4H, m), 1,83-1,88 (2H, m), 1,99-2,00 (1H, m), 2,03-2,06 (1H, m), 2,10-2,12 (1H, m), 2,19-2,21 (1H, m), 2,33 (1H, dd, J=15,9, 6,8 Hz), 2,40 (3H, s), 2,61 (1H, dc, J=26,1,6,5 Hz), 2,78 (1H, dd, J=13,8, 9,6 Hz), 2,97-2,99 (1H, m), 2,98 (3H, s), 3,17-3,19 (2H, m), 3,35-3,37 (2H, m), 3,67-3,83 (6H, m), 4,41-4,49 (1H, m), 4,90-5,02 (1H, m), 5,24 (2H, s), 5,39 (1H, d, J=16,1 Hz), 5,43 (1H, d, J=16,4 Hz), 5,57 (1H, dd, J=8,4, 4,3 Hz), 6,53 (1H, s), 6,99 (2H, s), 7,19 (5H, dc, J=26,7, 6,8 Hz), 7,32 (1H, d, J=7,6 Hz), 7,80 (1H, d, J=10,7 Hz), 7,92 (1H, dd, J=21,0, 15,4 Hz), 8,09 (1H, dt, J=20,1,5,9 Hz), 8,22 (1H, dd, J=14,5, 8,4 Hz), 8,32-8,45 (2H, m).
EM (IEN) m/z: 1132 (M+H)+.
Procedimiento 10: N-[6-(2,5-Dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil]-L-a-aspartil-N-metilglicilglicil-L-fenilalanil-N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]glicinamida
El compuesto (343 mg, 0,302 mmol) obtenido en el Procedimiento 9 anterior se disolvió en ácido trifluoroacético (6,00 ml) y se agitó a temperatura ambiente durante 22 horas. El disolvente se retiró a presión reducida y el residuo obtenido se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice [cloroformo - cloroformo : metanol = 4 : 1 (v/v)] para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (42,2 mg, 13 %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 8: 0,87 (3H, t, J=7,2 Hz), 1,16-1,17 (2H, m), 1,45-1,48 (4H, m), 1,81-1,91 (2H, m), 2,00 2,02 (2H, m), 2,11-2,17 (2H, m), 2,38 (3H, s), 2,71-3,17 (8H, m), 3,11 (3H, s), 3,37-3,38 (3H, m), 3,63-3,80 (3H, m), 4,24-4,32 (1H, m), 4,86-4,90 (1H, m), 5,26 (2H, s), 5,39 (1H, d, J=16,6 Hz), 5,44 (1H, d, J=16,4 Hz), 5,57-5,58 (1H, m), 6,51 (1H, s), 7,00 (2H, s), 7,16-7,25 (5H, m), 7,31 (1H, d, J=3,2 Hz), 7,76-7,78 (2H, m), 8,05-8,14 (3H, m), 8,54 (1H, d, J=7,6 Hz), 8,73 (1H, s).
EM (IEN) m/z: 1077 (M+H)+.
Procedimiento 11: Conjugado anticuerpo-fármaco (156)
Usando el trastuzumab producido en el ejemplo de referencia 1 y el compuesto obtenido en el Procedimiento 10
anterior, el conjugado anticuerpo-fármaco titulado se obtuvo de la misma manera que el Procedimiento 1 del Ejemplo 3.
Concentración de anticuerpo: 1,82 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 15,5 mg (78%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 5,2.
Ejemplo 157 Conjugado anticuerpo-fármaco (157)
A una solución de tetrahidrofurano (50,0 ml) del a-(N-hidroxisuccinimidil)p-t-butil éster del ácido N-a-benciloxicarbonil-L-aspártico (10,0 g, 5,29 mmol) y glicolato de bencilo (1,16 g, 7,93 mmol), se le añadió una solución acuosa (10,0 ml) de borohidruro sódico (1,47 g, 35,7 mmol) a 0 °C y se agitó a la misma temperatura como anteriormente durante 1 hora. La solución de reacción se diluyó con acetato de etilo y se lavó con agua, y después la capa orgánica se secó sobre sulfato sódico. El disolvente se retiró a presión reducida y el residuo obtenido se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice [hexano : acetato de etilo = 4 : 1 (v/v) - acetato de etilo] para producir el compuesto del título en forma de una sustancia oleosa incolora transparente (7,91 g, cuantitativo).
RMN 1H (400 MHz, CDCla) 8: 1,44 (9H, s), 2,41 (1H, s a), 2,48-2,62 (2H, m), 3,72 (2H, t, J=5,4 Hz), 3,99-4,08 (1H, m),
5,11 (2H, s), 5,42-5,53 (1H, m), 7,28-7,40 (5H, m). EM (API) m/z: 310 (M+H)+.
Procedimiento 2: (3S)-3-{[(benciloxi)carbonil]amino}-4-(prop-2-en-1-iloxi)butanoato de ferc-butilo
A una solución de tetrahidrofurano (50,0 ml) del compuesto (3,75 g, 12,1 mmol) obtenido en el procedimiento anterior y alil metil carbonato (2,05 ml, 18,1 mmol), se le añadió tetraquis(trifenilfosfina)paladio (0,700 g, 0,600 mmol) y se calentó y se agitó a 60 °C durante 13 horas. El disolvente se retiró a presión reducida y los residuos obtenidos se purificaron por cromatografía en columna sobre gel de sílice [hexano - hexano : acetato de etilo = 2 : 1 (v/v)] para producir el compuesto del título en forma de una sustancia oleosa de color amarillo (2,08 g, 49 %).
RMN 1H (400 MHz, CDCla) 8: 1,43 (9H, s), 2,54 (2H, d, J=6,0 Hz), 3,43-3,57 (2H, m), 3,97 (2H, d, J=5,4 Hz), 4,10-4,22 (1H, m), 5,10 (2H, s), 5,17 (1H, dd, J=10,3, 1,2 Hz), 5,24 (1H, dd, J=17,2, 1,2 Hz), 5,32-5,43 (1H, m), 5,80-5,91 (1H, m), 7,30-7,36 (5H, m).
EM (API) m/z: 350 (M+H)+.
Procedimiento 3: ácido {[(2S)-2-{[(benciloxi)carbonil]amino}-4-ferc-butoxi-4-oxobutil]oxi}acético
A una solución acuosa (15,0 ml) de peryodato sódico (3,06 g, 14,3 mmol), se le añadió una solución de acetato de etilo (10,0 ml) de acetonitrilo (10,0 ml), hidrato de cloruro de rutenio (15,0 mg), y el compuesto (0,500 g, 1,43 mmol) obtenido en el procedimiento anterior y se agitó a temperatura ambiente durante 1,5 horas. La solución de reacción se cargó con agua y se extrajo con acetato de etilo y la capa orgánica obtained se secó sobre sulfato sódico. El disolvente se retiró a presión reducida y el residuo obtenido se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice [cloroformo - capa orgánica repartida de cloroformo : metanol : agua = 7 : 3 : 1 (v/v/v)] para producir el compuesto del título en forma de una sustancia oleosa incolora (0,187 g, 36 %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 8: 1,36 (9H, s), 2,29 (1H, dd, J=15,4, 8,8 Hz), 2,43-2,54 (1H, m), 3,36 (1H, dd, J=9,7, 6.0 Hz), 3,43 (1H, dd, J=9,7, 6,0 Hz), 3,93-4,03 (1H, m), 4,00 (2H, s), 4,98 (1H, d, J=12,7 Hz), 5,03 (1H, d, J=12,7 Hz), 7,25-7,39 (6H, m), 12,63 (1H, s a).
EM (API) m/z: 368 (M+H)+.
Procedimiento 4: N-({[(2S)-2-{[(benciloxi)carbonil]amino}-4-ferc-butoxi-4-oxobutil]oxi}acetil)glicil-L-fenilalanato de bencilo
A una solución de N,N-dimetilformamida (10,0 ml) del compuesto (0,266 g, 0,760 mmol) obtenido en el Procedimiento 4 del Ejemplo 156, N-hidroxisuccinimida (89,4 mg, 0,660 mmol) y el compuesto (0,187 g, 0,510 mmol) obtenido en el procedimiento anterior, se le añadieron N,N-diisopropiletilamina (0,124 ml, 0,710 mmol) y clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (0,127 g, 0,660 mmol) y se agitaron a temperatura ambiente durante 22 horas. La solución de reacción se diluyó con cloroformo : metanol = 9 : 1 (v/v) y se lavó con una solución acuosa al 10 % de ácido cítrico, una solución acuosa saturada de hidrogenocarbonato sódico y una solución acuosa saturada de cloruro sódico y después la capa orgánica se secó sobre sulfato sódico. El disolvente se retiró a presión reducida y el residuo obtenido se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice [cloroformo - cloroformo : metanol = 9 : 1 (v/v)] para producir el compuesto del título en forma de una sustancia oleosa de color naranja pálido (0,373 g, cuantitativo). RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 8: 1,35 (9H, s), 2,33 (1H, dd, J=15,1,9,1 Hz), 2,47-2,53 (1H, m), 2,93 (1H, dd, J=13,9, 8,5 Hz), 3,03 (1H, dd, J=13,9, 6,0 Hz), 3,37 (1H, dd, J=9,1,5,4 Hz), 3,44 (1H, dd, J=9,7, 4,8 Hz), 3,69 (1H, dd, J=16,3, 6.0 Hz), 3,79 (1H, dd, J=16,3, 6,0 Hz), 3,87 (2H, s), 3,99-4,09 (1H, m), 4,53 (1H, dd, J=14,2, 8,2 Hz), 4,94-5,12 (4H, m), 7,16-7,40 (15H, m), 7,92-7,99 (2H, m), 8,41 (1H, d, J=7,9 Hz).
EM (API) m/z: 662 (M+H)+.
Procedimiento 5: N-({[(2S)-2-Amino-4-ferc-butoxi-4-oxobutil]oxo}acetil)glicil-L-fenilalanina
El compuesto (0,373 g, 0,560 mmol) obtenido en el procedimiento anterior se disolvió en N,N-dimetilformamida (30,0 ml). Después de añadir un catalizador de paladio sobre carbono (0,400 g), se agitó en una atmósfera de hidrógeno a temperatura ambiente durante 4 días. Los insolubles se retiraron por filtración a través de celite y el disolvente se retiró a presión reducida para producir el compuesto del título. El compuesto se usó para la siguiente reacción sin purificación adicional. EM (API) m/z: 438 (M+H)+.
Procedimiento 6: N-({[(2S)-4-ferc-Butoxi-2-{[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil]amino}-4-oxobutil]oxi}acetil)glicil-L-fenilalanina
A una solución de N,N-dimetilformamida (10,0 ml) de la mezcla (0,560 mmol) obtenida en el procedimiento anterior, se le añadieron 6-maleimidohexanoato de N-succinimidilo (0,261 g, 0,850 mmol) y N,N-diisopropiletilamina (98,2 pl, 0,560 mmol) y se agitó a temperatura ambiente durante 2 días. El disolvente se retiró a presión reducida y los residuos obtenidos se diluyeron con acetato de etilo y se lavaron con una solución acuosa al 10 % de ácido cítrico y una solución acuosa saturada de cloruro sódico. Después, la capa orgánica se secó sobre sulfato sódico. El disolvente se retiró a presión reducida y el residuo obtenido se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice [cloroformo -cloroformo : metanol = 9 : 1 (v/v)] para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (0,246 g, 69 %).
RMN 1H (400 MHz, CDCla) 8: 1,23-1,34 (2H, m), 1,44 (9H, s), 1,53-1,67 (4H, m), 2,16 (2H, t, J=7,6 Hz), 2,43-2,55 (2H, m), 3,03-3,28 (2H, m), 3,46-3,59 (4H, m), 3,81-4,06 (4H, m), 4,38-4,49 (1H, m), 4,69-4,78 (1H, m), 6,61-6,73 (1H, m), 6,67 (2H, s), 6,99 (1H, s a), 7,11-7,33 (5H, m), 7,51 (1H, s a).
EM (API) m/z: 631 (M+H)+.
Procedimiento 7: N-({[(2S)-4-terc-Butoxi-2-{[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil]amino}-4-oxobutil]oxi}acetil)glicil-L-fenilalanil-N-[(1s,9s)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]glicinamida
A una solución de N,N-dimetilformamida (10,0 ml) de sal del ácido metanosulfónico compuesto (0,101 g, 0,170 mmol) del Procedimiento 2 del Ejemplo 80, 1-hidroxibenzotriazol (25,7 mg, 0,190 mmol) y el compuesto (0,100 g, 0,160 mmol) obtenido en el procedimiento anterior, se le añadieron N,N-diisopropiletilamina (29,0 pl, 0,170 mmol) y clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (39,5 mg, 0,210 mmol) y se agitaron a temperatura ambiente durante 18 horas. El disolvente se retiró a presión reducida y el residuo obtenido se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice [cloroformo - cloroformo : metanol = 9 : 1 (v/v)] para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (90,0 mg, 51 %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-da) 8: 0,87 (3H, t, J=7,3 Hz), 1,11-1,19 (2H, m), 1,35 (9H, s), 1,41-1,48 (4H, m), 1,82-1,89 (2H, m), 2,00 (2H, t, J=7,3 Hz), 2,06-2,35 (3H, m), 2,41 (3H, s), 2,76 (1H, dd, J=13,9, 9,7 Hz), 2,98 (1H, dd, J=13,6, 4,5 Hz), 3,14-3,22 (2H, m), 3,24-3,49 (5H, m), 3,58 (1H, dd, J=16,9, 5,4 Hz), 3,73-3,80 (3H, m), 3,82 (2H, s), 4,16-4,28 (1H, m), 4,41-4,51 (1H, m), 5,25 (2H, s), 5,35-5,47 (2H, m), 5,54-5,62 (1H, m), 6,52 (1H, s), 6,99 (2H, s), 7,12-7,26 (5H, m), 7,31 (1H, s), 7,74-7,84 (3H, m), 8,17 (1H, d, J=8,5 Hz), 8,36 (1H, t, J=5,4 Hz), 8,42 (1H, d, J=8,5 Hz).
EM (API) m/z: 1106 (M+H)+.
Procedimiento 8: N-{[(2S)-3-Carboxi-2-{[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil]amino}propoxi]acetil}glicil-L-fenilalanil-N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]glicinamida
Con enfriamiento de hielo, al compuesto (85,0 mg, 80,0 pmol) obtenido en el procedimiento anterior, se le añadió ácido trifluoroacético (6,00 ml) y se agitó a temperatura ambiente durante 1,5 horas. El disolvente se retiró a presión reducida para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (60,0 mg, 74 %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 8: 0,87 (3H, t, J=7,6 Hz), 1,12-1,20 (2H, m), 1,41-1,48 (4H, m), 1,80-1,91 (2H, m), 2,00 (2H, t, J=7,3 Hz), 2,05-2,26 (2H, m), 2,34 (1H, dd, J=15,7, 7,9 Hz), 2,41 (3H, s), 2,76 (1H, dd, J=13,6, 9,4 Hz), 2,98 (1H, dd, J=13,6, 4,5 Hz), 3,13-3,22 (2H, m), 3,29-3,47 (5H, m), 3,59 (1H, dd, J=16,9, 5,4 Hz), 3,71-3,81 (3H, m), 3,83 (2H, s), 4,15-4,25 (1H, m), 4,41-4,51 (1H, m), 5,25 (2H, s), 5,35-5,47 (2H, m), 5,54-5,62 (1H, m), 6,52 (1H, s a), 6,99 (2H, s), 7,12-7,26 (5H, m), 7,31 (1H, s), 7,75-7,84 (3H, m), 8,17 (1H, d, J=7,9 Hz), 8,36 (1H, t, J=5,7 Hz), 8,42 (1H, d, J=9,1 Hz), 12,17 (1H, s a). HRMS (FAB) m/z: (M+H)+. Calc. para C53H58FN8O14: 1049,40564; Encontrado: 1049,40646.
Procedimiento 9: Conjugado anticuerpo-fármaco (157)
Usando el trastuzumab producido en el ejemplo de referencia 1 y el compuesto obtenido en el Procedimiento 8 anterior, el conjugado anticuerpo-fármaco titulado se obtuvo de la misma manera que el Procedimiento 1 del Ejemplo 3. Concentración de anticuerpo: 1,90mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 16,2 mg (81%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 5,8.
Ejemplo 158 Conjugado anticuerpo-fármaco (158)
Procedimiento 1: {2-[(4-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-4-oxobutil)amino]-2-oxoetil}carbamato de ferc-butilo
El compuesto (1,70 g, 2,68 mmol) de Procedimiento 1 del Ejemplo 1 se disolvió en N,N-dimetilformamida (10,0 ml), se cargó con 1-hidroxibenzotriazol (362 mg, 2,68 mmol) y clorhidrao de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (1,03 g, 5,36 mmol) y se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después de añadir N-(fercbutoxicarbonil)glicina (469 mg, 2,68 mmol) y trietilamina (373 pl, 2,68 mmol), se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas. El disolvente se retiró a presión reducida y el residuo obtenido se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice [cloroformo - cloroformo : metanol = 4 : 1 (v/v)] para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (1,82 g, 91 %).
RMN 1 H (400 MHz, CD3OD) 8 : 0,94 (3H, t, J=6 ,6 Hz), 1,37 (9H, s), 1,88-1,90 (4H, m), 2,07-2,08 (1H, m), 2,23 (3H, s), 2,33-2,36 (3H, m), 3,16-3,30 (4H, m), 3,66-3,73 (2H, m), 4,54 (1H, d, J=18,8Hz), 4,95-4,98 (1H, m), 5,25 (1H, d, J=16,0 Hz), 5,47 (1H, d, J=16,0 Hz), 5,54-5,57 (1H, m), 7,29 (1H, d, J=10,6 Hz), 7,38 (1H, s).
EM (CLEM) m/z: 678 (M+H)+.
Procedimiento 2: N-[(1S,9S)-9-Etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]-4-(glicilamino)butanamida
El compuesto (1,66 g, 2,45 mmol) obtenido en el Procedimiento 1 anterior se disolvió en diclorometano (6,00 ml), se cargó con ácido trifluoroacético (6,00 ml) y se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos. El disolvente se retiró a presión reducida y los residuos obtenidos se purificaron por cromatografía en columna sobre gel de sílice [[cloroformo - capa orgánica repartida de cloroformo : metanol: agua = 7 : 3 : 1 (v/v/v)] para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo (1,69 g, 93 %).
RMN 1 H (400 MHz, CD3OD) 8 : 0,97 (3H, t, J=6 ,8 Hz), 1,95-2,04 (5H, m), 2,31 (3H, s), 2,35-2,43 (3H, m), 3,07 (1H, s), 3,22 (1H, d, J=17,2 Hz), 3,35-3,37 (2H, m), 3,78 (2H, s), 4,74-5,01 (1H, m), 5,10 (1H, d, J=18,8 Hz), 5,30 (1H, d, J=16,4 Hz), 5,51 (1H, d, J=16,0 Hz), 5,61-5,63 (1H, m), 7,43 (1H, d, J=10,6 Hz), 7,47 (1H, s).
EM (CLEM) m/z: 578 (M+H)+.
Procedimiento 3: (3S,12S)-12-bencil-21-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-3-{[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]amino}-5-metil-4,7,10,13,16,21-hexaoxo-5,8,11,14,17-pentaazaheneicosan-1-oato de tere-butilo
El compuesto (1,56 g, 2,27 mmol) obtenido en el Procedimiento 6 del Ejemplo 156 se disolvió en N,N-dimetilformamida (20 ml), se cargó con 1-hidroxibenzotriazol (307 mg, 2,27 mmol) y clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (870 mg, 4,54 mmol) y se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora y 30 minutos. Después de añadir el compuesto (1,57 g, 2,27 mmol) obtenido en el Procedimiento 2 anterior y trietilamina (316 pl, 2,27 mmol), se agitó a temperatura ambiente durante 17 horas. El disolvente se retiró a presión reducida y el residuo obtenido se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice [cloroformo - cloroformo : metanol = 4 : 1 (v/v)] para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (2,65 g, 94 %).
RMN 1 H (400 MHz, DMSO-d6) 8 : 0,86 (3H, t, J=7,0 Hz), 1,35 (9H, s), 1,71-1,73 (2H, m), 1,80-1,91 (2H, m), 2,09-2,12 (2H, m), 2,18 (2H, t, J=7,2 Hz), 2,37 (3H, s), 2,40-2,48 (1H, m), 2,64-2,77 (2H, m), 3,01 (3H, s), 3,02-3,13 (5H, m), 3,59-3,68 (3H, m), 3,75-3,80 (2H, m), 3,98-4,07 (1H, m), 4,17-4,30 (3H, m), 4,47-4,48 (1H, m), 4,65-4,83 (1H, m), 5,14 (1H, d, J=19,2 Hz), 5,20 (1H, d, J=18,8 Hz), 5,39 (1H, d, J=17,2 Hz), 5,44 (1H, d, J=17,2 Hz), 5,53-5,56 (1H, m), 6,53 (1H, s), 7,18-7,24 (9H, m), 7,39-7,41 (2H, m), 7,65-7,87 (5H, m), 7,98-8,00 (1H, m), 8,13-8,14 (1H, m), 8,23-8,30 (2H, m), 8,45 (1H, d, J=7,8 Hz).
EM (IEN) m/z: 1247 (M+H)+.
Procedimiento 4: (3S,12S)-3-amino-12-bencil-21-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-5-metil-4,7,10,13,16,21-hexaoxo-5,8,11,14,17-pentaazaheneicosan-1 -oato de tere-butilo
El compuesto (1,85 g, 1,48 mmol) obtenido en el Procedimiento 3 anterior se disolvió en N,N-dimetilformamida (16,0 ml), se cargó con piperidina (4,00 ml) y se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. El disolvente se retiró a presión reducida y el residuo obtenido se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice [cloroformo -capa orgánica repartida de cloroformo : metanol: agua = 7 : 3 : 1 (v/v/v)] para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo (1,15 g, 76 %).
RMN 1 H (400 MHz, DMSO-d6) 8 : 0,87 (3H, t, J=7,2 Hz), 1,37 (9H, s), 1,72-1,73 (2H, m), 1,80-1,92 (2H, m), 2,17-2,22 (5H, m), 2,37 (3H, s), 2,53-2,56 (1H, m), 2,73-2,82 (1H, m), 2,99-3,15 (7H, m), 3,30-3,32 (2H, m), 3,57-4,00 (6 H, m), 4,39-4,45 (1H, m), 5,14 (1H, d, J=19,0 Hz), 5,20 (1H, d, J=19,0 Hz), 5,40 (1H, d, J=19,3 Hz), 5,43 (1H, d, J=16,4 Hz), 5,55-5,56 (1H, m), 6,53 (1H, s), 7,16-7,21 (7H, m), 7,30 (1H, s), 7,69-7,72 (1H, m), 7,77 (1H, d, J=11,0 Hz), 8,02-8,09 (1H, m), 8,25-8,31 (2H, m), 8,47 (1H, d, J=8,5 Hz).
EM (IEN) m/z: 1025 (M+H)+.
Procedimiento 5: (3S,12S)-12-bencil-3-{[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil]amino}-21-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-5-metil-4,7,10,13,16,21-hexaoxo-5,8,11,14,17-pentaazaheneicosan-1-oato de tere-butilo
El compuesto (1,09 g, 1,06 mmol) obtenido en el Procedimiento 4 anterior se disolvió en N,N-dimetilformamida (6,00 ml). Después de añadiro 6 -maleimidohexanoato de N-succinimidilo (328 mg, 1,06 mmol), se agitó a temperatura ambiente durante 17,5 horas. El disolvente se retiró a presión reducida y el residuo obtenido se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice [cloroformo - cloroformo : metanol = 4 : 1 (v/v)] para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (730 mg, 56 %).
RMN 1 H (400 MHz, DMSO-d6) 8 : 0,87 (3H, t, J=7,0 Hz), 1,14-1,16 (2H, m), 1,34 (9H, s), 1,44 (4H, d, J=7,0 Hz), 1,71 1,73 (2H, m), 1,83-1,86 (2H, m), 1,98-2,18 (6 H, m), 2,31-2,35 (1H, m), 2,38 (3H, s), 2,56-2,66 (1H, m), 2,74-2,78 (1H, m), 3,00 (3H, s), 3,03-3,09 (3H, m), 3,16-3,18 (4H, m), 3,58-4,22 (6 H, m), 4,45-4,48 (1H, m), 4,89-5,07 (1H, m), 5,15 (1H, d, J=18,8 Hz), 5,23 (1H, d, J=19,2 Hz), 5,42 (2H, s), 5,55-5,58 (1H, m), 6,53 (1H, s), 6,99 (2H, s), 7,18-7,23 (5H, m), 7,30 (1H, s), 7,70-7,73 (1H, m), 7,78 (1H, d, J=11,0 Hz), 7,97-7,99 (1H, m), 8,10-8,14 (1H, m), 8,21-8,27 (2H, m), 8,45 (1H, d, J=8,2 Hz).
EM (IEN) m/z: 1218 (M+H)+.
Procedimiento 6 : N-[6-(2,5-Dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil]-L-a-aspartil-N-metilglicilglicil-L-fenilalanil-N-(4-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-4-oxobutil)glicinamida
El compuesto (690 mg, 0,567 mmol) obtenido en el Procedimiento 5 anterior se disolvió en diclorometano (3,00 ml),
se cargó con ácido trifluoroacético (6,00 ml) y se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. El disolvente se retiró a presión reducida y el residuo obtenido se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice [cloroformo -cloroformo : metanol = 4 : 1 (v/v)] para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (346 mg, 53 %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-da) 8 : 0,87 (3H, t, J=7,2 Hz), 1,14-1,16 (2H, m), 1,44-1,45 (4H, m), 1,71-1,73 (2H, m), 1,81 1,89 (2H, m), 1,99-2,03 (2H, m), 2,12-2,14 (2H, m), 2,17-2,19 (2H, m), 2,34-2,39 (1H, m), 2,39 (3H, s), 2,69-2,76 (2H, m), 3,01 (3H, s), 3,09-3,13 (2H, m), 3,16-3,18 (2H, m), 3,35-3,36 (2H, m), 3,58-3,89 (7H, m), 4,45-4,47 (1H, m), 4,91 4,99 (1H, m), 5,16 (1H, d, J=19,0 Hz), 5,23 (1H, d, J=19,0 Hz), 5,42 (2H, s), 5,56-5,58 (1H, m), 6,52 (1H, s), 6,99 (2H, s), 7,17-7,25 (5H, m), 7,31 (1H, s), 7,70-7,72 (1H, m), 7,79 (2H, d, J=11,0 Hz), 7,94-7,96 (1H, m), 8,10-8,12 (1H, m), 8,19-8,28 (2H, m), 8,47 (1H, d, J=7,1 Hz).
EM (IEN) m/z: 1162 (M+H)+.
Procedimiento 7: Conjugado anticuerpo-fármaco (158)
Usando el trastuzumab producido en el ejemplo de referencia 1 y el compuesto obtenido en el Procedimiento 6 anterior, el conjugado anticuerpo-fármaco titulado se obtuvo de la misma manera que el Procedimiento 6 del Ejemplo 2. Concentración de anticuerpo: 1,76mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 15,0 mg (75%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 2 ,8.
Ejemplo 159 Conjugado anticuerpo-fármaco (159)
Procedimiento 1: Conjugado anticuerpo-fármaco (159)
Usando el trastuzumab producido en ejemplo de referencia 1 y el compuesto obtenido en el Procedimiento 6 del Ejemplo 158, el conjugado anticuerpo-fármaco titulado se obtuvo de la misma manera que el Procedimiento 1 del Ejemplo 3. Concentración de anticuerpo: 1,75 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 15,0 mg (75 %), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 4,9.
Ejemplo 160 Conjugado anticuerpo-fármaco (160)
Procedimiento 1: N-({[(2S)-4-terc-Butoxi-2-{[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil]amino}-4-oxobutil]oxi}acetil)glicil-L-fenilalanil-N-(4-{[(1s,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-4-oxobutil)glicinamida
El compuesto (21,8 mg, 34,6 |jmol) de Procedimiento 6 del Ejemplo 157 se disolvió en N,N-dimetilformamida (3,00 ml) y se cargó con 1-hidroxibenzotriazol (4,68 mg, 34,6 jm ol) y clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (9,96 mg, 51,9 jmol). Después de añadir adicionalmente el compuesto (20,0 mg, 34,6 jm ol) de Procedimiento 2 del Ejemplo 158, se agitó a temperatura ambiente durante 21 horas. El disolvente se retiró a presión reducida y el residuo obtenido se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice [cloroformo - cloroformo : metanol = 4 : 1 (v/v)] para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (15,1 mg, 37 %).
RMN 1H (400 MHz, DIVISOR) 8 : 0,87 (3H, t, J=7,2 Hz), 1,11-1,19 (2H, m), 1,35 (9H, s), 1,40-1,48 (4H, m), 1,67-1,75 (2H, m), 1,80-1,91 (2H, m), 1,99 (2H, t, J=7,4 Hz), 2,15-2,18 (4H, m), 2,27-2,32 (2H, m), 2,40 (3H, s), 2,67 (1H, s), 2,77 (1H, dd, J=13,7, 9,8 Hz), 3,01 (1H, dd, J=13,9, 4,5 Hz), 3,06-3,11 (2H, m), 3,17 (2H, t, J=2,5 Hz), 3,36-3,47 (3H, m), 3,58-3,67 (3H, m), 3,80 (1H, t, J=8,2 Hz), 3,85 (2H, s), 4,20-4,24 (1H, m), 4,45-4,50 (1H, m), 5,16 (1H, d, J=18,8 Hz), 5,25 (1H, d, J=18,8 Hz), 5,42 (2H, s), 5,55-5,59 (1H, m), 6,53 (1H, s), 6,99 (2H, s), 7,17-7,23 (5H, m), 7,31 (1H, s), 7,71 (1H, d, J=5,9 Hz), 7,78 (1H, s), 7,81 (1H, d, J=3,5 Hz), 7,86 (1H, t, J=5,7 Hz), 8,21 (1H, d, J=7,8 Hz), 8,30 (1H, t, J=5,9 Hz), 8,45 (1H, d, J=8 ,6 Hz).
EM (IEN) m/z: 1190 (M+H)+.
Procedimiento 2: N-{[(2S)-3-Carboxi-2-{[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil]amino}propxy]acetil}glicil-L-fenilalanil-N-(4-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-4-oxobutil)glicinamida
El compuesto (14,3 mg, 0,120 jm ol) obtenido en el Procedimiento 1 anterior se disolvió en diclorometano (1,00 ml), se cargó con ácido trifluoroacético (1,00 ml) y se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. El disolvente se retiró a presión reducida, y los residuos insolubles depositados con etanol y éter dietílico se recogieron por filtración para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (11,8 mg, 87 %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 8 : 0,87 (3H, t, J=7,2 Hz), 1,15 (2H, t, J=7,2 Hz), 1,40-1,48 (4H, m), 1,68-1,75 (2H, m), 1,80-1,91 (2H, m), 2,00 (2H, t, J=7,4 Hz), 2,12-2,19 (4H, m), 2,34 (2H, dd, J=16,0, 7,8 Hz), 2,40 (3H, s), 2,77 (1H, dd, J=13,5, 9,6 Hz), 3,01 (1H, dd, J=13,7, 4,7 Hz), 3,05-3,11 (2H, m), 3,16-3,18 (2H, m), 3,33-3,35 (3H, m), 3,44-3,47 (2H, m), 3,61-3,68 (2H, m), 3,80 (1H, dd, J=16,6, 6,1 Hz), 3,85 (1H, s), 4,22-4,25 (1H, m), 4,47-4,50 (1H, m), 5,16 (1H, d, J=18,8 Hz), 5,25 (1H, d, J=19,2 Hz), 5,42 (2H, s), 5,57 (1H, s), 6,99 (2H, s), 7,15-7,26 (6 H, m), 7,31 (1H, s), 7,71 (1H, t, J=5,5 Hz), 7,78-7,81 (2H, m), 7,84 (1H, t, J=5,7 Hz), 8,21 (1H, d, J=7,8 Hz), 8,30 (1H, t, J=6 ,8 Hz), 8,45 (1H, d, J=8 ,6 Hz).
EM (IEN) m/z: 1134 (M+H)+.
Procedimiento 1: Conjugado anticuerpo-fármaco (160)
Usando el trastuzumab producido en el ejemplo de referencia 1 y el compuesto obtenido en el Procedimiento 2 anterior, el conjugado anticuerpo-fármaco titulado se obtuvo de la misma manera que el Procedimiento 1 del Ejemplo 3. Concentración de anticuerpo: 1,75 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 14,7 mg (74%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticuerpo: 5,0.
Ejemplo 161 Conjugado anticuerpo-fármaco (161)
A una mezcla que consiste en N-9-fluorenilmetoxicarbonilglicilglicina (4,33 g, 12,2 mmol), tetrahidrofurano (120 ml) y tolueno (40,0 ml), se le añadieron piridina (1,16 ml, 14,7 mmol) y tetraacetato de plomo (6,84 g, 14,7 mmol) sy se calentaron a reflujo durante 5 horas. Después de enfriar la mezcla de reacción a temperatura ambiente, los insolubles se retiraron por filtración a través de celite y se concentraron a presión reducida. Los residuos obtenidos se disolvieron en acetato de etilo y se lavaron con agua y una solución acuosa saturada de cloruro sódico y después la capa orgánica se secó sobre sulfato de magnesio anhidro. Después de retirar el disolvente a presión reducida, los residuos obtenidos se purificaron por cromatografía en columna sobre gel de sílice [hexano : acetato de etilo = 9 : 1 (v/v) - acetato de etilo] para proporcionar el compuesto del título en forma de un sólido incoloro (3,00 g, 67 %).
RMN 1 H (400 MHz, CDCla) 8 : 2,07 (3H, s), 3,90 (2H, d, J=5,1 Hz), 4,23 (1H, t, J=7,0 Hz), 4,46 (2H, d, J=6 ,6 Hz), 5,26 (2H, d, J=7,0 Hz), 5,32 (1H, s a), 6,96 (1H, s a), 7,32 (2H, t, J=7,3 Hz), 7,41 (2H, t, J=7,3 Hz), 7,59 (2H, d, J=7,3 Hz), 7.77 (2H, d, J=7,3 Hz).
Procedimiento 2: [({N-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]glicil}amino)metoxi]acetato de bencilo
A una solución de tetrahidrofurano (200 ml) del compuesto (7,37 g, 20,0 mmol) obtenido en el Procedimiento 1 anterior, Se le añadieron glicolato de beniclo (6,65 g, 40,0 mmol) y monohidrato de ácido p-toluenosulfónico (0,381 g, 2,00 mmol) a 0 °C y se agitaron a temperatura ambiente durante 2 horas y 30 minutos. La solución de reacción se cargó con una solución acuosa saturada de hidrogenocarbonato sódico y se extrajo con acetato de etilo y la capa orgánica obtenida se secó sobre sulfato sódico y se filtró. El disolvente se retiró a presión reducida y el residuo obtenido se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice [hexano : acetato de etilo = 100 : 0 (v/v) - 0 : 100 ] para producir el compuesto del título en forma de un sólido incoloro (6,75 g, 71 %).
RMN 1 H (400 MHz, CDCla) 8 : 3,84 (2H, d, J=5,5 Hz), 4,24 (3H, t, J=6,5 Hz), 4,49 (2H, d, J=6,7 Hz), 4,88 (2H, d, J=6,7 Hz), 5,15-5,27 (1H, m), 5,19 (2H, s), 6,74 (1H, s a), 7,31-7,39 (7H, m), 7,43 (2H, t, J=7,4 Hz), 7,61 (2H, d, J=7,4 Hz), 7,79 (2H, d, J=7,4 Hz).
Procedimiento 3: N-[(Benciloxi)carbonil]glicilglicil-L-fenilalanina-N-{[(2-(benciloxi)-2-oxoetoxi]metil}glicinamida
A una solución de N,N-dimetilformamida (140 ml) del compuesto (6,60 g, 13,9 mmol) obtenido en el Procedimiento 2 anterior, 1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno (2,22 g, 14,6 mmol) se añadió a 0 °C y se agitó a temperatura ambiente durante 15 minutos. La solución de reacción se cargó con una solución de N,N-dimetilformamida (140 ml) de N-[(benciloxi)carbonil]glicilglicil-L-fenilalanina (6,33 g, 15,3 mmol), N-hidroxisuccinimida (1,92 g, 16,7 mmol) y clorhidrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida (3,20 g, 16,7 mmol) agitada previamente a temperatura ambiente durante 1 hora y se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas. La solución de reacción se cargó con ácido clorhídrico 0,1 N y se extrajo con cloroformo y la capa orgánica obtenida se secó sobre sulfato sódico y se filtró. El disolvente se retiró a presión reducida y el residuo obtenido se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice [cloroformo - cloroformo : metanol = 8 : 2 (v/v)] para producir el compuesto del título en forma de un sólido incoloro (7,10 g, 79 %). RMN 1 H (DMSO-D6) 8 :
2.78 (1 H, dd, J=13,9, 9,6 Hz), 3,05 (1 H, dd, J=13,9, 4,5Hz), 3,56-3,80 (6 H, m), 4,15 (2 H, s), 4,47-4,55 (1 H, m), 4,63 (2 H, d, J=6 ,6 Hz), 5,03 (2 H, s), 5,15 (2 H, s), 7,16-7,38 (15 H, m), 7,52 (1 H, t, J=5,9 Hz), 8,03 (1 H, t, J=5,5Hz), 8,17 (1 H, d, J=8,2 Hz), 8,36 (1 H, t, J=5,7 Hz), 8,61 (1 H, t, J=6 ,6 Hz).
Procedimiento 4: Glicilglicil-L-fenilalanil-N-[(carboximatoxi)metil]glicinamida
A una solución de N,N-dimetilformamida (216 ml) del compuesto (7,00 g, 10,8 mmol) obtenido en el Procedimiento 3 anterior, se le añadió un catalizador de paladio sobre carbono (7,00 g) y se agitó en una atmósfera de hidrógeno a temperatura ambiente durante 24 horas. Los insolubles se retiraron por filtración a través de celite y el disolvente se retiró a presión reducida. Los residuos obtenidos se disolvieron en agua, los insolubles se retiraron por filtración a través de celite y el disolvente se retiró a presión reducida. Este procedimiento se repitió dos veces para producir el compuesto del título en forma de un sólido incoloro (3,77 g, 82 %).
RMN 1 H (DMSO-d6) 8 : 2,84 (1H, dd, J=13,7, 9,8 Hz), 3,08 (1H, dd, J=13,7, 4,7 Hz), 3,50-3,72 (4H, m), 3,77-3,86 (2H, m), 3,87 (2H, s), 4,52-4,43 (1H, m), 4,61 (2H, d, J=6 ,6 Hz), 7,12-7,30 (5H, m), 8,43 (1H, t, J=5,9 Hz), 8,54 (1H, d, J=7,8 Hz), 8,70 (1H, t, J=6,3 Hz), 8,79 (1H, t, J=5,5 Hz).
Procedimiento 5: (5S,14S)-14-Bencil-5-[2-(benciloxi)-2-oxoetil]-3,6,9,12,15,18-hexaoxo-1-fenil-2,21-dioxa-4,7,10,13,16,19-hexaazatricosan-23-ácido
Se disolvió ácido (2S)-4-(benciloxi)-2-{[(benciloxi)carbonil]amino}-4-oxobutanoico (123 mg, 0,344 mmol) en N,N-dimetilformamida, se cargó con N-hidroxisuccinimida (39,5 mg, 0,344 mmol) y clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (65,9 mg, 0,344 mmol) y se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después de añadir el compuesto (121 mg, 0,286 mmol) del Procedimiento 4 anterior y trietilamina (39,6 pl, 0,286 mmol), se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas. El disolvente se retiró a presión reducida y el residuo obtenido se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice [cloroformo - capa orgánica repartida de cloroformo : metanol : agua = 7 : 3 : 1 (v/v/v)] para producir el compuesto del título en forma de un sólido incoloro (66,2 mg, 30 %).
RMN 1 H (400 MHz, DMSO-d6) 8 : 2,55 (1H, s), 2,62 (1H, dd, J=16,4, 7,4 Hz), 2,80 (1H, dd, J=13,9, 10,0 Hz), 2,86 (1H, dd, J=16,2, 4,9 Hz), 2,99 (1H, dd, J=14,3, 7,2 Hz), 3,63-3,73 (6 H, m), 3,96 (2H, s), 4,46-4,52 (2H, m), 4,61 (2H, d,
J=6,7 Hz), 5,00 (1H, d, J=12,5 Hz), 5,05 (1H, d, J=15,3 Hz), 5,07 (2H, s), 7,24-7,26 (5H, m), 7,31-7,35 (10H, m), 7,76 (1H, d, J=8,2 Hz), 8,07 (1H, t, J=5,1 Hz), 8,18 (1H, d, J=8,2 Hz), 8,30 (1H, t, J=5,3 Hz), 8,34 (1H, t, J=5,5 Hz), 8,60 (1H, t, J=6,7 Hz). EM (IEN) m/z: 761 (M-H)-.
Procedimiento 6 : L-a-Aspartilglicilglicil-L-fenilalanil-N-[(2-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-2-oxoetoxi)metil]glicinamida
El compuesto (85,6 mg, 0,112 mmol) obtenido en el Procedimiento 5 anterior y exatecán (63,7 mg, 0,112 mmol) se disolvieron en un disolvente mezcla de N,N-dimetilformamida (1,50 ml) y metanol (0,500 ml), se cargó con trietilamina (15,6 pl, 0,112 mmol) e hidrato de cloruro de 4-(4,6-dimetoxi-1,3,5-triazin-2-il)-4-metilmorfolinio (49,6 mg, 0,168 mmol) y se agitó a temperatura ambiente durante 17,5 horas. El disolvente se retiró a presión reducida y el residuo obtenido se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice [cloroformo - cloroformo : metanol = 4 : 1 (v/v)] para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (59,8 mg, 45 %).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 8 : 0,86 (3H, t, J=7,2 Hz), 1,80-1,90 (2H, m), 2,16-2,20 (2H, m), 2,38 (3H, s), 2,63 (1H, dd, J=16,4, 9,0 Hz), 2,76 (1H, dd, J=13,7, 9,8 Hz), 2,85 (1H, dd, J=16,2, 4,9 Hz), 3,01 (1H, dd, J=13,5, 4,5 Hz), 3,11 3,23 (2H, m), 3,58-3,76 (6 H, m), 4,02 (2H, s), 4,45-4,50 (2H, m), 4,63 (2H, d, J=6,3 Hz), 4,98-5,01 (2H, m), 5,06 (2H, s), 5,20 (2H, s), 5,41 (2H, s), 5,58-5,61 (1H, m), 6,53 (1H, s), 7,16-7,22 (5H, m), 7,29-7,34 (11H, m), 7,70 (1H, d, J=8,2 Hz), 7,79 (1H, d, J=11,0 Hz), 7,99 (1H, t, J=5,7 Hz), 8,12 (1H, d, J=7,8 Hz), 8,23 (1H, d, J=5,5 Hz), 8,32 (1H, t, J=5,7 Hz), 8,52 (1H, d, J=9,0 Hz), 8,64 (1H, t, J=6,7 Hz).
EM (IEN) m/z: 1180 (M+H)+.
Procedimiento 7: (10S,19S)-10-bencil-19-{[(benciloxi)carbonil]amino}-1-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-1,6,9,12,15,18-hexaoxo-3-oxa-5,8,11,14,17-pentaazahenicosano-21-oato de bencilo
El compuesto (57,3 mg, 48,6 pmol) obtenido en el Procedimiento 6 anterior se disolvió en N,N-dimetilformamida (6,00 ml). Después de añadir un catalizador de paladio sobre carbono (10,0 mg), se agitó en una atmósfera de hidrógeno a temperatura ambiente durante 6 días. Los insolubles se retiraron por filtración a través de celite y el disolvente se retiró a presión reducida para producir una mezcla de un sólido de color amarillo pálido que contenía el compuesto del título (46,8 mg). La mezcla se usó en la siguiente reacción sin purificación adicional.
Procedimiento 8 : N-[6-(2,5-Dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil]-L-a-aspartilglicilglicil-L-fenilalanil-N-[(2-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1 -il]amino}-2 -oxoetoxi)metil]glicinamida
La mezcla (43,6 mg, 1,06 mmol) obtenido en el Procedimiento 7 anterior se disolvió en N,N-dimetilformamida (0,500 ml). Después de añadir 6 -maleimidohexanoato de N-succinimidilo (28,1 mg, 91,2 pmol), se agitó a temperatura ambiente durante 23 horas. Los residuos obtenidos se purificaron mediante cromatografía en columna de gel de sílice [cloroformo - capa orgánica repartida de cloroformo : metanol: agua = 7 : 3 : 1 (v/v/v)] para producir el compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido (4,23 mg, 8,1 %). RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 8 : 0,86 (3H, t, J=7,2 Hz), 1,16 (2H, dt, J=18,9, 6,0 Hz), 1,45-1,50 (4H, m), 1,79-1,91 (2H, m), 2,09-2,14 (4H, m), 2,32 (2H, dd, J=5,3, 3,7 Hz), 2,36 (3H, s), 2,67-3,19 (4H, m), 3,43-3,48 (2H, m), 3,56-3,76 (6 H, m), 4,01 (2H, s), 4,21-4,22 (1H, m), 4,35 4,37 (1H, m), 4,62-4,63 (2H, m), 5,21 (2H, s), 5,41 (2H, s), 5,56-5,59 (1H, m), 6,51 (1H, s), 6,99 (2H, s), 7,10-7,30 (9H, m), 7,75-7,78 (2H, m), 8,32-8,36 (1H, m), 8,55-8,70 (2H, m), 9,02-9,04 (1H, m). EM (IEN) m/z: 1149 (M+H)+.
Procedimiento 9: Conjugado de anticuerpo-fármaco (161)
Mediante el uso del trastuzumab producido en el ejemplo de referencia 1 y el compuesto obtenido en el procedimiento 8 anterior, se obtuvo el conjugado de anticuerpo-fármaco del título del mismo modo que el procedimiento 1 del ejemplo 3.
Concentración de anticuerpo: 1,89 mg/ml, rendimiento de anticuerpo: 15,9 mg (79 %) y número medio (n) de moléculas de fármaco conjugadas por molécula de anticuerpo: 3,4.
Ejemplo de evaluación 1 - Efecto inhibidor del crecimiento celular del conjugado de anticuerpo-fármaco
Se cultivó la línea celular de cáncer de mama humano KPL-4 de células positivas al antígeno HER2 (Dr. Junichi Kurebayashi, Kawasaki Medical School, British Journal of Cancer, (1999) 79 (5/6). 707-717) o la línea celular de cáncer de mama humano MCF7 de células negativas al antígeno HER2 (ECACC; European Collection of Cell Cultures) en RPMI1640 (GIBCO) que contenía suero fetal de ternero al 10 % (MOREGATE) (en lo sucesivo citado como medio). Las KPL-4 o MCF7 se prepararon para tener una concentración de 2,5 * 104 células/ml usando medio, añadido a una concentración de 100 pl/pocillo a una placa de microtitulación de 96 pocillos para cultivo celular y se cultivaron durante una noche. Al día siguiente, se añadió trastuzumab o el conjugado de anticuerpo-fármaco diluido a 1000 nM, 200 nM, 40 nM, 8 nM, 1,6 nM, 0,32 nM y 0,064 nM usando medio a una concentración de 10 pl/pocillo a la microplaca. Se añadió medio a una concentración de 10 pl/pocillo a los pocillos no complementados con anticuerpo. Las células se cultivaron en condiciones de 5 % de CO2 a 37 °C durante de 5 a 7 días. Después del cultivo, se extrajo la microplaca de la incubadora y se dejó reposar a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se cambió la solución de cultivo con una cantidad equivalente de ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiter-Glo (Promega) y se agitó. Después de
dejar reposar la microplaca a temperatura durante 10 minutos, se midió la intensidad de luminiscencia de cada pocilio usando un lector de placas (PerkinElmer). Se calculó el valor de CI50 de acuerdo con la siguiente ecuación:
CI50 (nM) = antilogaritmo ((50 - d) * (LOG10 (b) - LOG10 (a) ) / (d - c) LOG10 (b))
a: Concentración de muestra a
b: Concentración de muestra b
c: Viabilidad celular de la muestra a
d: Viabilidad celular de la muestra b
Se calculó la viabilidad celular a cada concentración de acuerdo con la siguiente ecuación:
Viabilidad celular (%) = a / b * 100
a: Intensidad de luminiscencia media de los pocillos de muestra (n = 2)
b: Intensidad de luminiscencia media de los pocillos no complementados con anticuerpo (n = 10)
Los resultados se muestran en la "tabla 1". El trastuzumab no mostró un efecto inhibidor del crecimiento celular contra las células KPL-4 o MCF7 (> 100 (nM)).
Claims (8)
1. Un conjugado de fármaco-anticuerpo en el que un compuesto antitumoral representado por la siguiente fórmula:
se conjuga con un anticuerpo anti-HER2 en form de una estructura seleccionada entre el siguiente grupo:
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-VK-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-C(=O)-cic.Hex(1 ,4 )-CH2-(N-li-3 -diminiccuS)-S-CH2CH2-C(=O)-G GFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX ),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-VC-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3 -il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CMe(-H) -C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3 -il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH(-Me) -C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3 -il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2C(-Me)2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3 -il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-NH-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-(NH -DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2C H2-(NH-DX),
-(Succinimid-3 -il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-NH-CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3 -il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-N(-Me)-CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-N(-CH2CH2-OH)-CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3 -il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-N(-CH2-COOH)-CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-N(-Me)-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-N(-CH2CH2-OH)-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-N(-CH2-COOH)-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3 -il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-NH-CH(-CH2-OH)-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3 -il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-NH-CH(-CH2-COOH)-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-N(-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-OH)-CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3 -il-N)-CH(-CH2CH2-COOH)-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-GGFG-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGF-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-KGGFG-NH-CH2CH2CH2 -C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3 -il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3 -il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-(NH-DX),
-(Succinimid-3 -il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-KGGFG-(NH-DX),
-(Succinimid-3 -il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFGG-(NH-DX),
-(Succinimid-3 -il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFGGG-(NH-DX),
-(Succinimid-3 -il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-(NH-DX),
-(Succinimid-3 -il-N)-CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3 -il-N)-CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2 -C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2 -O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3 -il-N)-CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3 -il-N)-CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O) -(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2 -C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2 -O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-DGGFGNH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-EGGFG-NH-CH2CH2CH2 -C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DDGGFG-NH-CH2CH2CH 2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-KDGGFG-NH-CH2CH2CH 2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3 -il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2C (M e)2-C(=O)-(NH-DX),
-C(=O)-cic.Hex(1 ,4 )-CH2-(N-li-3 -diminiccuS)-S-CH2CH2-C(=O)-D GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3 -il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2CH2 CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3 -il-N)-CH(-CH2CH2-COOH)-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH 2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3 -il-N)-CH2CH2-[N(-CH2-COOH)]-CH2-(C=O)-GGFG-NH -CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), -(Succinimid-3 -il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-N[-CH2-COOH]-CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3 -il-N)-CH2CH2-C(=O)-DGGFG-(NH-DX),
-(Succinimid-3 -il-N)-CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-(NH-DX),
-(Succinimid-3 -il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-DGGFG-(NH-DX), -(Succinimid-3 -il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-DG-GFG-(NH-DX),
-(Succinimid-3 -il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-SGGFG-(NH-DX),
-(Succinimid-3 -il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DdGGFG-(NH-DX),
-(Succinimid-3 -il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-EGGFG-(NH-DX),
-(Succinimid-3 -il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-NH-[CH(-CH2-COOH)] -CH2-(C=O)-GGFG-(NH-DX), -(Succinimid-3 -il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFS-(NH-DX),
-(Succinimid-3 -il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2 -C(=O)-GGFG-(NH-DX), -(Succinimid-3 -il-N)-CH2CH2-[N(-CH2-COOH)]-CH2-(C=O)-GGFG-(N H-DX),
-(Succinimid-3 -il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-[N(-CH2-COOH)]-CH2-(C=O)-GGFG-(NH-DX), -C(=O)-cic.Hex(1 ,4 )-CH2-(N-li-3 -diminiccuS)-S-CH2CH2-C(=O)-G GFG-(NH-DX),
-(Succinimid-3 -il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFGS-(NH-DX),
-(Succinimid-3 -il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFGGE-(NH-DX),
-(Succinimid-3 -il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFGGE-(NH-DX),
-(Succinimid-3 -il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFGGGFG-(NH-DX),
-(Succinimid-3 -il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGMeGFG-(NH-DX),
-(Succinimid-3 -il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-NH-[CH(-CH2-COOH)] -CH2-O-CH2-(C=O)-GFG-(NH-DX), -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGMeGFG-NH-CH2CH2CH 2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3 -il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-NH-[CH(-CH2-COOH)]-CH2-O-CH2-(C=O)-GFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(Succinimid-3 -il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2-O-CH2 -C(=O)-(NH-DX)
en el que -(Succinimid-3-il-N)- tiene una estructura representada por la siguiente fórmula:
que está conectada al anticuerpo en la posición 3 del mismo y está conectada al grupo metileno en la estructura del enlazador que contiene esta estructura en el átomo de nitrógeno en la posición 1, -(NH-DX) es un grupo representado por la siguiente fórmula:
en la que el átomo de nitrógeno del grupo amino en la posición 1 es la posición de conexión.
2. El conjugado de fármaco anticuerpo de acuerdo con reivindicación 1, en el que el número promedio de unidades del compuesto antitumoral conjugado por molécula de anticuerpo está en el intervalo de 1 a 10.
3. El conjugado de fármaco anticuerpo de acuerdo con reivindicación 1, en el que el número promedio de unidades del compuesto antitumoral conjugado por molécula de anticuerpo está en el intervalo de 1 a 8.
4. El conjugado de fármaco anticuerpo de acuerdo con reivindicación 1, en el que el número promedio de unidades del compuesto antitumoral conjugado por molécula de anticuerpo está en el intervalo de 3 a 8.
5. Una composición farmacéutica que contiene el conjugado anticuerpo-fármaco de acuerdo con la reivindicación 1, una sal del mismo o un hidrato del mismo como un componente activo, y un componente de formulación farmacéuticamente aceptable.
6. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 5, la cual es para su uso contra el cáncer de pulmón, cáncer urotelial, cáncer de intestino grueso, cáncer de próstata, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, cáncer de mama, cáncer de vejiga, cáncer gástrico, tumor del estroma gastrointestinal, cáncer de cuello de útero, cáncer de esófago, carcinoma de células escamosas, cáncer peritoneal, cáncer de hígado, cáncer hepatocelular, cáncer de colon, cáncer rectal, cáncer colorrectal, cáncer endometrial, cáncer de útero, cáncer de glándula salival, cáncer de riñón, cáncer vulvar, cáncer de pene, leucemia, linfoma maligno, plasmacitoma, mieloma o sarcoma.
7. Un compuesto intermedio enlazador fármaco seleccionado entre el siguiente grupo:
(maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CMe(-H)-C(=O)-(NH-DX),
(maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH(-Me)-C(=O)-(NH-DX),
(maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2C(-Me)2-C (=O)-(NH-DX),
(maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-NH-C(=O) -(NH-DX),
(maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-(NH-DX),
(maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2-(NH-DX),
(maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-NH-CH2-C (=O)-(NH-DX),
(maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-N(-Me)-CH2-C(=O)-(NH-DX),
(maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-N(-CH2CH2 -OH)-CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-N(-CH2-C OOH)-CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-N(-Me)-C H2CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-N(-CH2CH2 -OH) -CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-N(-CH2-COOH)-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-NH-CH(-CH2-OH)-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-NH-CH(-CH2-COOH)-C(=O)-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFG-NH-CH2CH2C(Me)2-C (=O)-(NH-DX),
(maleimid-N-il)-CH2CH2-[N(-CH2-COOH)]-CH2-(C=O)-GGFG-NH-CH2C H2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-N[-CH2-COOH]-CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGGFS-(NH-DX),
(maleimid-N-il)-CH2CH2-[N(-CH2-COOH)]-CH2-(C=O)-GGFG-(NH-DX),
(maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-[N(-CH2-COOH) ]-CH2-(C=O)-GGFG-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFGS-(NH-DX),
(maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-GGFGGE-(NH-DX),
(maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGMeGFG-(NH-DX),
(maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-NH-[CH(-CH2-COOH)]-CH2-O-CH2-(C=O)-GFG-(NH-DX), (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-DGMeGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) y
(maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-NH-[CH(-CH2-COOH)]-CH2-O-CH2-(C=O)-GFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
en las que (maleimid-N-il)- es un grupo representado por la siguiente fórmula:
en la que el átomo de nitrógeno es la posición de conexión, y
-(NH-DX) es un grupo obtenido a partir de un compuesto representado mediante la siguiente fórmula:
en la que el átomo de nitrógeno del grupo amino en la posición 1 es la posición de conexión.
8. Un compuesto seleccionado entre el grupo de
NH2-CH2CMe(-H)-C(=O)-(NH-DX),
NH2-CH2CH(-Me)-C(=O)-(NH-DX),
NH2-CH2CH2C(-Me)2-C(=O)-(NH-DX),
NH2-CH2CH2-NH-CH2-C(=O)-(NH-DX),
NH2-CH2CH2-N(-Me)-CH2-C(=O)-(NH-DX),
NH2-CH2CH2-N(-CH2CH2-OH)-CH2-C(=O)-(NH-DX),
NH2-CH2CH2-N(-CH2-COOH)-CH2-C(=O)-(NH-DX),
NH2-CH2CH2-N(-Me)-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
NH2-CH2CH2-N(-CH2CH2-OH)-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
o
NH2-CH2CH2-N(-CH2-COOH)-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
en las que -(NH-DX) es un grupo representado por la siguiente fórmula:
en la que el átomo de nitrógeno del grupo amino en la posición 1 es la posición de conexión.
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