EA014870B1 - Антитела к белку steap-1 и их применение - Google Patents

Антитела к белку steap-1 и их применение Download PDF

Info

Publication number
EA014870B1
EA014870B1 EA200601946A EA200601946A EA014870B1 EA 014870 B1 EA014870 B1 EA 014870B1 EA 200601946 A EA200601946 A EA 200601946A EA 200601946 A EA200601946 A EA 200601946A EA 014870 B1 EA014870 B1 EA 014870B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
antibody
8teap
fragment
protein
cells
Prior art date
Application number
EA200601946A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200601946A3 (ru
EA200601946A2 (ru
Inventor
Айя Якобовиц
Соудабех Этессами
Пиа М. Чаллита-Эйд
Хуан Х. Перес-Вильяр
Карен Дж. Моррисон
Сяо-Чи Цзя
Мэри Фейрис
Джин Гьюдас
Артур Б. Райтано
Original Assignee
Эдженсис, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Эдженсис, Инк. filed Critical Эдженсис, Инк.
Publication of EA200601946A2 publication Critical patent/EA200601946A2/ru
Publication of EA200601946A3 publication Critical patent/EA200601946A3/ru
Publication of EA014870B1 publication Critical patent/EA014870B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6861—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from kidney or bladder cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/10—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody
    • A61K51/1045—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody against animal or human tumor cells or tumor cell determinants
    • A61K51/106—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody against animal or human tumor cells or tumor cell determinants the tumor cell being from kidney or bladder
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/10—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody
    • A61K51/1075—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody the antibody being against an enzyme
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3069—Reproductive system, e.g. ovaria, uterus, testes, prostate
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6887—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids from muscle, cartilage or connective tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Pregnancy & Childbirth (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)

Abstract

В настоящем изобретении приведено описание антител и полученных из них молекул, которые связываются с новым белком STEAP-1 и его вариантами, где STEAP-1 обладает тканеспецифической экспрессией в нормальных взрослых тканях и аберрантно экспрессируется в раковых тканях, перечисленных в табл. I. Следовательно, STEAP-1 представляет собой диагностическую, прогностическую, профилактическую и/или терапевтическую мишень для противораковой терапии. Ген STEAP-1, или его фрагмент, или кодируемый им белок, или его варианты, или его фрагменты можно использовать для индуцирования гуморального или клеточного иммунного ответа; антитела или Т-клетки, способные взаимодействовать со STEAP-1, можно использовать для активной или пассивной иммунизации.

Description

Права на изобретения, сделанные в результате исследований, финансируемых федеральным правительством
В данном случае неприменимы.
Область изобретения
Описанное в данном документе изобретение относится к антителам, а также к их связывающим фрагментам и молекулам, полученным из них методом генной инженерии, которые связываются с белками, называемыми 8ТЕАР-1. Данное изобретение также относится к диагностическим, прогностическим, профилактическим и терапевтическим способам, а также к композициям, которые можно использовать для лечения злокачественных заболеваний, сопровождающихся экспрессией 8ТЕАР-1.
Предпосылки создания изобретения
Рак является второй из основных причин смертности среди людей после ишемической болезни сердца. Во всем мире каждый год от рака умирают миллионы людей. Только в Соединенных Штатах, по данным Американского общества по борьбе с раком, рак является причиной смерти более полумиллиона людей ежегодно, причем каждый год диагностируется более 1,2 миллионов новых случаев. В то время как смертность от сердечных заболеваний значительно снизилась, смертность от рака в целом возрастает. Ожидается, что в начале следующего столетия рак станет главной причиной смертности.
Во всем мире выделяют несколько типов рака, как наиболее опасных для жизни. В частности, карциномы легких, простаты, молочной железы, толстой кишки, поджелудочной железы, яичников и мочевого пузыря являются основными причинами смерти от злокачественных заболеваний. Указанные и практически все другие карциномы имеют общий летальный характер. За немногими исключениями, метастатическая карцинома приводит к смертельному исходу. Кроме того, опыт показывает, что, даже если пациенты выживают после первичного злокачественного заболевания, их жизнь сильно изменяется. Многие раковые пациенты испытывают сильное беспокойство, сознавая возможность рецидива или того, что лечение может быть неудачным. После лечения многие раковые пациенты испытывают сильную слабость. Кроме того, у многих раковых пациентов наблюдаются рецидивы.
Во всем мире рак простаты является четвертым по распространенности среди злокачественных заболеваний у мужчин. В Северной Америке и в Северной Европе он, несомненно, является наиболее распространенным злокачественным заболеванием у мужчин и второй из основных причин смертности среди мужчин. Только в Соединенных Штатах от данного заболевания ежегодно умирает значительно более 30000 мужчин - второе место по смертности после рака легких. Несмотря на величину данных цифр, пока еще не существует эффективного лечения метастазирующего рака простаты. Основными способами лечения продолжают оставаться хирургическая простатэктомия, лучевая терапия, антигормональная терапия, хирургическая кастрация и химиотерапия. К сожалению, данные способы лечения во многих случаях являются неэффективными и зачастую связаны с нежелательными последствиями.
С точки зрения диагностики отсутствие маркера опухоли простаты, который позволяет осуществлять точную диагностику локализованных опухолей на ранней стадии, остается существенным препятствием для диагностики и лечения данного заболевания. Хотя анализ сывороточного специфического антигена простаты (Р8А) является очень полезным инструментом, общепризнано, что в некоторых важных аспектах он обладает недостаточной специфичностью и недостаточной общей функциональностью.
Прогресс в идентификации других маркеров, специфичных для рака простаты, был достигнут в результате применения ксенотрансплантатов рака простаты, которые позволяют воспроизводить разные стадии данного заболевания у мышей. Ксенотрансплантаты ЬАРС (Ьок Лпдс1с5 Ргок1а1е Сапсег) представляют собой ксенотрансплантаты рака простаты, которые перенесли пересадку мышам с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (8СШ) и которые способны имитировать переход от зависимости от андрогенов к независимости от андрогенов (К1ет е! а1., 1997, ΝαΙ. Меб. 3: 402). Идентифицированные позже маркеры рака простаты включают в себя РСТА-1 (8и е! а1., 1996, Ргос. №111. Асаб. 8с1. И8А, 93: 7252), простата-специфичный мембранный (Р8М) антиген (Ρίηΐο е! а1., С11п. Сапсег Век. 2 8ер., 1996 (9): 1445-51), 8ТЕАР (НиЬей, е! а1., Ргос. №И. Асаб. 8сь И8А. 7 Оес., 1999; 96(25): 14523-8) и антиген стволовых клеток, дифференцирующихся в клетки простаты (Р8СА) (Кейет е! а1., 1998, Ргос. №И. Асаб. 8сь И8А, 95: 1735).
Хотя ранее идентифицированные маркеры, такие как Р8А, Р8М, РСТА и Р8СА, помогают диагностировать и лечить рак простаты, еще существует потребность в идентификации других маркеров и терапевтических мишеней, специфичных для рака простаты и родственных заболеваний, которые позволили бы усовершенствовать способы диагностики и лечения.
Почечно-клеточная карцинома (КСС) составляет приблизительно 3% от злокачественных заболеваний взрослых. Если диаметр аденомы достигает 2-3 см, существует возможность злокачественного перерождения. У взрослых двумя основными злокачественными опухолями почек являются почечноклеточная аденокарцинома и переходно-клеточная карцинома почечной лоханки или мочеточника. В США зарегистрировано более 29000 случаев почечно-клеточной аденокарциномы, причем в 1998 г. от данного заболевания умерло более 11600 пациентов. Переходно-клеточная карцинома встречается реже, в Соединенных Штатах диагностируется приблизительно 500 случаев в год.
- 1 014870
В течение многих десятилетий хирургия была основным способом лечения почечно-клеточной аденокарциномы. До последнего времени метастазирующие заболевания не поддавались никакому системному лечению. Последние разработки в области системной терапии, в особенности иммунотерапии, позволили найти кардинальный подход к лечению метастазирующей почечно-клеточной карциномы у соответствующих пациентов, который обеспечивает вероятность устойчивых ответов. Тем не менее, остается потребность в эффективных способах лечения данных пациентов.
Среди новых случаев рака, зарегистрированных в Соединенных Штатах, рак мочевого пузыря составляет приблизительно 5% у мужчин (пятое место среди наиболее распространенных новообразований) и 3% у женщин (восьмое место среди наиболее распространенных новообразований). Заболеваемость медленно возрастает с увеличением возраста популяции. В 1998 г. было зарегистрировано 54500 случаев, в том числе 39500 у мужчин и 15000 у женщин. Связанная с возрастом заболеваемость в Соединенных Штатах составляет 32 на 100000 у мужчин и 8 на 100000 у женщин. Исторически сложившееся соотношение заболеваемости у мужчин/женщин 3:1 может уменьшаться вследствие увеличения курящих женщин. В 1998 г. зарегистрировано 11000 смертей от рака мочевого пузыря (7800 у мужчин и 3900 у женщин). Заболеваемость раком мочевого пузыря и смертность от данного заболевания сильно увеличиваются с возрастом и представляют собой проблему, возрастающую по мере увеличения возраста популяции.
Большинство злокачественных заболеваний мочевого пузыря рецидивируют в мочевом пузыре. Рак мочевого пузыря лечат сочетанием трансуретральной резекции мочевого пузыря (ТИК.) и внутрипузырной химиотерапии или иммунотерапии. Многоочаговый и рецидивирующий характер рака мочевого пузыря ограничивает применение ТЫК. Большинство проникающих в мышцы раковых опухолей нельзя вылечить с помощью одной ТЫК. Радикальная цистэктомия с отводом мочи является наиболее эффективным средством устранения раковой опухоли, но сопровождается нежелательным воздействием на мочевыводящие и половые функции. Соответственно, остается настоятельная потребность в способах лечения, благоприятно воздействующих на пациентов с раком мочевого пузыря.
В 2000 г. в Соединенных Штатах зарегистрировано 130200 случаев колоректального рака, в том числе 93800 случаев рака толстой кишки и 36400 случаев рака прямой кишки. Колоректальный рак занимает третье место среди наиболее распространенных злокачественных заболеваний у мужчин и женщин. В период 1992-1996 гг. коэффициент заболеваемости значительно снизился (-2,1% в год). Исследования показывают, что данное снижение обусловлено увеличением скрининга населения и удалением полипов, позволяющим предотвратить их развитие до инвазивных злокачественных заболеваний. В 2000 г. зарегистрировано 56300 смертей (47700 от рака толстой кишки и 8600 от рака прямой кишки), что составляет приблизительно 11% от всех смертельных исходов злокачественных заболеваний в США.
В настоящее время хирургия является наиболее распространенным способом лечения колоректального рака и при отсутствии метастазирования часто дает положительный результат. Химиотерапию, или химиотерапию в сочетании с лучевой терапией, назначают до или после хирургической операции большинству пациентов, у которых раковая опухоль глубоко проникает в стенки кишечника или метастазирует в лимфатические узлы. При раке толстой кишки и при раке прямой кишки иногда требуется постоянная колостомия (открытие брюшной полости для удаления экскрементов). Следовательно, существует потребность в эффективных способах диагностики и лечения колоректального рака.
В 2000 г. зарегистрировано 164100 новых случаев рака легких и бронхов, что составляет 14% от всех раковых диагнозов в США. Коэффициент заболеваемости раком легких и бронхов значительно снизился: от 86,5 на 100000 человек в 1984 г. до 70,0 в 1996 г. В 1990-х гг. скорость увеличения заболеваемости среди женщин начала снижаться. В 1996 г. коэффициент заболеваемости у женщин составлял 42,3 на 100000 человек.
В 2000 г. было зарегистрировано 156900 смертей от рака легких и бронхов, что составляет 28% от общей смертности от злокачественных заболеваний. В период 1992-1996 гг. смертность от рака легких среди мужчин значительно снизилась (-1,7% в год), тогда как смертность среди женщин еще заметно росла (0,9% в год). С 1987 г. от рака легких каждый год умирало больше женщин, чем от рака молочной железы, который в течение 40 лет был основной причиной смертей от злокачественных заболеваний среди женщин. Снижение заболеваемости раком легких и смертности от данного заболевания, скорее всего, является следствием уменьшения курения в течение предыдущих 30 лет; однако по уменьшению курения женщины отстают от мужчин. Интересно, что в то время как снижение употребления табака у взрослых замедляется, у подростков употребление табака снова увеличивается.
Способы лечения рака легких и бронхов зависят от типа и стадии рака и включают в себя хирургическое лечение, лучевую терапию и химиотерапию. Для лечения многих локализованных раковых опухолей обычно выбирают хирургию. Поскольку данное заболевание обычно распространяется со времени его обнаружения, наряду с хирургическим лечением обычно требуется лучевая терапия и химиотерапия. При мелкоклеточном раке легких обычно выбирают химиотерапию, отдельно или в сочетании с лучевой терапией; при таком режиме лечения у пациентов часто наступает ремиссия, которая в некоторых случаях может быть длительной. Однако продолжает существовать потребность в эффективных способах лечения и диагностики рака легких и бронхов.
- 2 014870
В течение 2000 г. в США было зарегистрировано 182800 новых случаев инвазивного рака молочной железы. Кроме того, в 2000 г. было диагностировано приблизительно 1400 новых случаев рака молочной железы у мужчин. После увеличения приблизительно до 4% в год в 1980 г. коэффициент заболеваемости раком молочной железы у женщин снизился в 1990 г. приблизительно до 110,6 случаев на 100000 человек.
В 2000 г. только в США было зарегистрировано 41200 смертей (40800 женщин, 400 мужчин) от рака молочной железы. Смертность от рака молочной железы занимает второе место среди смертности от злокачественных заболеваний у женщин. В соответствии с последними данными коэффициент смертности значительно снизился в период 1992-1996 гг., причем сильнее всего он снизился у молодых женщин как с белой кожей, так и с черной. Возможно, данное снижение является результатом более ранней диагностики и усовершенствования лечения.
С учетом медицинских обстоятельств и предпочтений пациента лечение рака молочной железы может включать в себя лампэктомию (локальное удаление опухоли) и удаление лимфатических узлов под мышкой; мастэктомию (хирургическое удаление молочной железы) и удаление лимфатических узлов под мышкой; лучевую терапию; химиотерапию; или гормональную терапию. Часто используют сочетание двух или более способов. Многочисленные исследования показали, что в случае ранней стадии заболевания продолжительность жизни после лампэктомии в сочетании с лучевой терапией подобна продолжительность жизни после модифицированной радикальной мастэктомии. Значительные достижения в восстановительной технологии предоставляют некоторые возможности для воссоздания молочной железы после мастэктомии. Недавно такое воссоздание было осуществлено одновременно с мастэктомией.
Локальное удаление протоковой карциномы ίη Ли (ΌΟδ) вместе с соответствующими количествами окружающей нормальной ткани молочной железы может предотвратить местный рецидив ΩΟΙ8. Облучение молочной железы и/или обработка тамоксифеном могут уменьшить вероятность возникновения ΩΟΙ8 в оставшейся ткани молочной железы. Это важно, поскольку ЭС18. при отсутствии лечения, может развиться в инвазивный рак молочной железы. Тем не менее, указанные способы лечения имеют серьезные побочные эффекты или последствия. Следовательно, существует потребность в эффективных способах лечения рака молочной железы.
В 2000 г. в Соединенных Штатах зарегистрировано 23100 новых случаев рака яичников. Данное заболевание составляет 4% от всех злокачественных заболеваний у женщин и занимает второе место среди гинекологических злокачественных заболеваний. В период 1992-1996 гг. коэффициент заболеваемости раком яичников значительно снизился. В 2000 г. зарегистрировано 14000 смертей от рака яичников. Рак яичников вызывает больше смертей, чем любое другое злокачественное заболевание женской репродуктивной системы.
Для лечения рака яичников используют хирургию, лучевую терапию и химиотерапию. Хирургия обычно включает в себя удаление одного или обоих яичников, фаллопиевых труб (удаление придатков матки) и матки (гистерэктомия). В случае некоторых опухолей на ранней стадии удаляют только пораженный яичник, особенно если пациентом является молодая женщина, желающая иметь детей. В случае запущенного заболевания, чтобы увеличить эффект химиотерапии, делают попытку удалить все внутрибрюшинные пораженные органы. Таким образом, остается потребность в эффективных способах лечения рака яичников.
В 2000 г. в Соединенных Штатах зарегистрировано 28300 новых случаев рака поджелудочной железы. В течение последних 20 лет заболеваемость раком поджелудочной железы у мужчин уменьшилась. Заболеваемость среди женщин остается приблизительно постоянной, но есть тенденция к уменьшению. В 2000 г. в Соединенных Штатах зарегистрировано 28200 смертей от рака поджелудочной железы. Смертность среди мужчин за последние 20 лет немного, но значимо уменьшилась (приблизительно -0,9% в год), в то время как смертность среди женщин несколько увеличилась.
Для лечения рака поджелудочной железы используют хирургию, лучевую терапию и химиотерапию. Указанные способы лечения могут увеличивать выживаемость и/или облегчать симптомы у многих пациентов, но в большинстве случаев они не приводят к излечению. Существует настоятельная потребность в дополнительных способах лечения и диагностики злокачественных заболеваний. Указанные способы лечения включают в себя применение антител, вакцин и маленьких молекул. Кроме того, существует потребность в применении данных способов в качестве инструментов исследования для диагностики, детектирования, мониторинга и развития уровня техники во всех областях лечения и исследования злокачественных заболеваний.
- 3 014870
Краткое описание изобретения
В данном изобретении предложены антитела, а также их связывающие фрагменты и молекулы, полученные из них методом генной инженерии, которые связываются с белками 8ТЕАР-1 и полипептидными фрагментами белков 8ТЕАР-1. В данном описании термин 8ТЕАР-1 является синонимом 8Ρ1Ό4. Данное изобретение включает в себя поликлональные и моноклональные антитела, антитела мышей и других млекопитающих, химерные антитела, гуманизированные и полноразмерные человеческие антитела, а также антитела, меченные детектируемым маркером или терапевтическим средством. В некоторых воплощениях существует условие, что полная нуклеотидная последовательность (фиг. 2) не кодируется и/или полная аминокислотная последовательность (фиг. 2) не синтезируется. В других воплощениях полная нуклеотидная последовательность (фиг. 2) кодируется и/или полная аминокислотная последовательность (фиг. 2) синтезируется, каждая из которых входит в состав стандартных лекарственных форм для применения человеком.
В данном изобретении также предложены способы детектирования присутствия и статуса полинуклеотидов и белков 8ТЕАР-1 в разных биологических образцах, а также способы идентификации клеток, экспрессирующих 8ТЕАР-1. В одном воплощении согласно изобретению предложены способы детектирования генных продуктов 8ТЕАР-1 в ткани или гематологическом образце, в котором имеет место, или предположительно имеет место, нарушение регуляции роста, например, в образце раковой ткани.
В данном изобретении также предложены разные иммуногенные или терапевтические композиции и стратегии для лечения злокачественных заболеваний, при которых происходит экспрессия 8ТЕАР-1. таких как злокачественные заболевания тканей, перечисленные в табл. I, в том числе способы лечения, обспечивающие ингибирование транскрипции, трансляции, процессинга или функционирования 8ТЕАР-1. а также противораковые вакцины. В одном аспекте согласно изобретению предложены композиции и способы с применением данных композиций для лечения рака, при котором происходит экспрессия 8ТЕАР-1, у человека, где композиция содержит носитель, подходящий для человека, и человеческую разовую дозу одного или нескольких средств, ингибирующих продукцию или функционирование 8ТЕАР-1. Предпочтительно носитель представляет собой однозначно человеческий носитель. В другом аспекте согласно изобретению средство представляет собой молекулу, обладающую иммунореактивностью по отношению к белку 8ТЕАР-1. Неограничивающие примеры таких молекул включают в себя, без ограничения, антитела (такие как одноцепочечные, моноклональные, поликлональные, гуманизированные, химерные или человеческие антитела), их функциональные эквиваленты (либо природные, либо синтетические) и их сочетания. Антитела можно конъюгировать с диагностическим или терапевтическим фрагментом. В другом аспекте средство представляет собой маленькую молекулу, как указано в данном описании.
В другом воплощении средство включает в себя один или несколько пептидов, содержащих эпитоп цитотоксического Т-лимфоцита (СТЬ), который связывается с молекулой НЬА класса I в организме человека и вызывает ответ СТЬ на 8ТЕАР-1, и/или один или несколько пептидов, содержащих эпитоп хелперного Т-лимфоцита (НТЬ), который связывается с молекулой НЬА класса II в организме человека и вызывает ответ НТЬ. Пептиды согласно изобретению могут находиться на одной и той же или на одной или нескольких разных полипептидных молекулах. В другом аспекте согласно изобретению средство включает в себя одну или несколько молекул нуклеиновых кислот, экспрессирующих один или несколько пептидов, стимулирующих ответ СТЬ или НТЬ, как описано выше. В следующем аспекте согласно изобретению одна или несколько молекул нуклеиновых кислот могут экспрессировать фрагмент, обладающий иммунологической реактивностью в отношении 8ТЕАР-1, как описано выше. Одна или несколько молекул нуклеиновых кислот могут представлять собой молекулы, которые ингибируют продукцию 8ТЕАР-1, или они могут кодировать такие молекулы. Неограничивающие примеры таких молекул включают в себя, без ограничения, молекулы, комплементарные нуклеотидной последовательности, необходимой для продукции 8ТЕАР-1 (например, антисмысловые последовательности молекул, которые образуют тройную спираль с нуклеотидной двойной спиралью, необходимой для продукции 8ТЕАР-1), или рибозим, способный лизировать мРНК 8ТЕАР-1.
Другое воплощение согласно изобретению относится к эпитопам антител, включающим в себя пептидные участки, или олигонуклеотидам, кодирующим пептидные участки, которые имеют один, два, три, четыре или пять из нижеследующих признаков:
ί) пептидный участок, состоящий по меньшей мере из 5 аминокислот конкретного пептида, приведенного на фиг. 3, с любым целочисленным приращением вплоть до полного размера белка, изображенного на фиг. 3, который содержит аминокислотное положение, имеющее значение по профилю гидрофильности, приведенному на фиг. 5, равное или превышающее 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 или равное 1,0;
ίί) пептидный участок, состоящий по меньшей мере из 5 аминокислот конкретного пептида, приведенного на фиг. 3, с любым целочисленным приращением вплоть до полного размера белка, изображенного на фиг. 3, который содержит аминокислотное положение, имеющее значение по профилю гидропатичности, приведенному на фиг. 6, равное или превышающее 0,5, 0,4, 0,3, 0,2, 0,1 или равное 0,0;
- 4 014870 ίίί) пептидный участок, состоящий по меньшей мере из 5 аминокислот конкретного пептида, приведенного на фиг. 3, с любым целочисленным приращением вплоть до полного размера белка, изображенного на фиг. 3, который содержит аминокислотное положение, имеющее значение по профилю процента доступных остатков, приведенному на фиг. 7, равное или превышающее 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 или равное 1,0;
ίν) пептидный участок, состоящий по меньшей мере из 5 аминокислот конкретного пептида, приведенного на фиг. 3, с любым целочисленным приращением вплоть до полного размера белка, изображенного на фиг. 3, который содержит аминокислотное положение, имеющее значение по профилю средней жесткости, приведенному на фиг. 8, равное или превышающее 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 или равное 1,0; или
ν) пептидный участок, состоящий по меньшей мере из 5 аминокислот конкретного пептида, приведенного на фиг. 3, с любым целочисленным приращением вплоть до полного размера белка, изображенного на фиг. 3, который содержит аминокислотное положение, имеющее значение по профилю бета-складки, приведенному на фиг. 9, равное или превышающее 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 или равное 1,0.
Настоящее изобретение также относится к гену, обозначаемому 8ТЕАР-1, сверхэкспрессия которого наблюдается при злокачественных заболеваниях, перечисленных в табл. I. Анализ экспрессии гена 8ТЕАР-1 методом нозерн-блоттинга в нормальных тканях показывает ограниченный характер экспрессии во взрослых тканях. Приведены нуклеотидная (фиг. 2) и аминокислотная (фиг. 2 и 3) последовательности 8ТЕАР-1. Тканевый профиль 8ТЕАР-1 для нормальных взрослых тканей, наряду со сверхэкспрессией, наблюдающейся в тканях, перечисленных в табл. I, показывает, что, по меньшей мере, в некоторых раковых опухолях наблюдается аберрантная сверхэкспрессия 8ТЕАР-1, следовательно, 8ТЕАР-1 может служить мишенью в способах диагностики, профилактики, прогноза и/или лечения злокачественных заболеваний тканей, таких как перечисленные в табл. I.
Данное изобретение предлагает полинуклеотиды, соответствующие или комплементарные полноразмерным или частичным генам, мРНК и/или кодирующим последовательностям 8ТЕАР-1, предпочтительно выделенные, в том числе полинуклеотиды, кодирующие белки, родственные 8ТЕАР-1, и фрагменты, содержащие 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или более 25 последовательных аминокислот; по меньшей мере 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 80, 85, 90, 95, 100 или более 100 последовательных аминокислот белка, родственного 8ТЕАР-1, а также сами пептиды/белки; ДНК, РНК, ДНК/РНК гибриды и родственные молекулы, полинуклеотиды или олигонуклеотиды, комплементарные или по меньшей мере на 90% гомологичные последовательностям генов или мРНК 8ТЕАР-1 или их частям, и полинуклеотиды или олигонуклеотиды, которые гибридизуются с генами и мРНК 8ТЕАР-1 или с полинуклеотидами, кодирующими 8ТЕАР-1. Также предлагаются способы выделения кДНК и генов, кодирующих 8ТЕАР-1. Кроме того, предлагаются рекомбинантные молекулы ДНК, содержащие полинуклеотиды 8ТЕАР-1, клетки, трансформированные или преобразованные такими молекулами, и системы хозяин-вектор для экспрессии генных продуктов 8ТЕАР-1.
Краткое описание чертежей
В данном описании термин 8ТЕАР-1 включает в себя все варианты, в том числе приведенные на фиг. 10, 11 и/или 12, если контекст однозначно не указывает иначе.
Фиг. 1. 88Н последовательность 8ТЕАР-1, содержащая 436 нуклеотидов.
Фиг. 2А. кДНК и аминокислотная последовательность 1 варианта 8ТЕАР-1 (также называемого 8ТЕАР-1 ν. 1 или 1 вариант 8ТЕАР-1). Стартовый метионин подчеркнут. В открытую рамку считывания входят нуклеотиды 66-1085, в том числе стоп-кодон.
Фиг. 2В. кДНК и аминокислотная последовательность 2 варианта 8ТЕАР-1 (также называемого 8ТЕАР-1 ν. 2). Кодон, кодирующий стартовый метионин, подчеркнут. В открытую рамку считывания входят нуклеотиды 96-872, в том числе стоп-кодон.
Фиг. 2С. кДНК и аминокислотная последовательность 3 варианта 8ТЕАР-1 (также называемого 8ТЕАР-1 ν. 3). Кодон, кодирующий стартовый метионин, подчеркнут. В открытую рамку считывания входят нуклеотиды 96-944, в том числе стоп-кодон.
Фиг. 2Ό. кДНК и аминокислотная последовательность 4 варианта 8ТЕАР-1 (также называемого 8ТЕАР-1 ν. 4). Кодон, кодирующий стартовый метионин, подчеркнут. В открытую рамку считывания входят нуклеотиды 96-872, в том числе стоп-кодон.
Фиг. 2Е. кДНК и аминокислотная последовательность 5 варианта 8ТЕАР-1 (также называемого 8ТЕАР-1 ν. 5). Кодон, кодирующий стартовый метионин, подчеркнут. В открытую рамку считывания входят нуклеотиды 96-872, в том числе стоп-кодон.
Фиг. 2Е. кДНК и аминокислотная последовательность 6 варианта 8ТЕАР-1 (также называемого 8ТЕАР-1 ν. 6). Кодон, кодирующий стартовый метионин, подчеркнут. В открытую рамку считывания входят нуклеотиды 96-872, в том числе стоп-кодон.
Фиг. 2С. кДНК и аминокислотная последовательность 7 варианта 8ТЕАР-1 (также называемого 8ТЕАР-1 ν. 7). Кодон, кодирующий стартовый метионин, подчеркнут. В открытую рамку считывания входят нуклеотиды 96-872, в том числе стоп-кодон.
- 5 014870
Фиг. 2Н. кДНК и аминокислотная последовательность 8 варианта 8ТЕАР-1 (также называемого 8ТЕАР-1 ν. 8). Кодон, кодирующий стартовый метионин, подчеркнут. В открытую рамку считывания входят нуклеотиды 96-872, в том числе стоп-кодон.
Фиг. 21. кДНК и аминокислотная последовательность 9 варианта 8ТЕАР-1 (также называемого 8ТЕАР-1 ν. 9). Кодон, кодирующий стартовый метионин, подчеркнут. В открытую рамку считывания входят нуклеотиды 96-872, в том числе стоп-кодон.
Фиг. 21. кДНК и аминокислотная последовательность 10 варианта 8ТЕАР-1 (также называемого 8ТЕАР-1 ν. 10). Кодон, кодирующий стартовый метионин, подчеркнут. В открытую рамку считывания входят нуклеотиды 96-872, в том числе стоп-кодон.
Фиг. 2К. кДНК и аминокислотная последовательность 11 варианта 8ТЕАР-1 (также называемого 8ТЕАР-1 ν. 11). Кодон, кодирующий стартовый метионин, подчеркнут. В открытую рамку считывания входят нуклеотиды 96-872, в том числе стоп-кодон.
Фиг. 2Ь. кДНК и аминокислотная последовательность 12 варианта 8ТЕАР-1 (также называемого 8ТЕАР-1 ν. 12). Кодон, кодирующий стартовый метионин, подчеркнут. В открытую рамку считывания входят нуклеотиды 96-872, в том числе стоп-кодон.
Фиг. 2М. кДНК и аминокислотная последовательность 13 варианта 8ТЕАР-1 (также называемого 8ТЕАР-1 ν. 13). Кодон, кодирующий стартовый метионин, подчеркнут. В открытую рамку считывания входят нуклеотиды 96-872, в том числе стоп-кодон.
Фиг. 2Ν. кДНК и аминокислотная последовательность 14 варианта 8ТЕАР-1 (также называемого 8ТЕАР-1 ν. 14). Кодон, кодирующий стартовый метионин, подчеркнут. В открытую рамку считывания входят нуклеотиды 96-872, в том числе стоп-кодон.
Фиг. 20. кДНК и аминокислотная последовательность 15 варианта 8ТЕАР-1 (также называемого 8ТЕАР-1 ν. 15). Кодон, кодирующий стартовый метионин, подчеркнут. В открытую рамку считывания входят нуклеотиды 96-872, в том числе стоп-кодон.
Фиг. 2Р. кДНК и аминокислотная последовательность 16 варианта 8ТЕАР-1 (также называемого 8ТЕАР-1 ν. 16). Кодон, кодирующий стартовый метионин, подчеркнут. В открытую рамку считывания входят нуклеотиды 96-872, в том числе стоп-кодон.
Фиг. 2р. кДНК и аминокислотная последовательность 17 варианта 8ТЕАР-1 (также называемого 8ТЕАР-1 ν. 17). Кодон, кодирующий стартовый метионин, подчеркнут. В открытую рамку считывания входят нуклеотиды 96-872, в том числе стоп-кодон.
В данном описании термин 8ТЕАР-1 включает в себя все варианты, в том числе приведенные на фиг. 10, 11 и/или 12, если контекст однозначно не указывает иначе.
Фиг. 3А. Аминокислотная последовательность 8ТЕАР-1 ν. 1, содержащая 339 аминокислот.
Фиг. 3В. Аминокислотная последовательность 8ТЕАР-1 ν. 2, содержащая 258 аминокислот.
Фиг. 3С. Аминокислотная последовательность. 8ТЕАР-1 ν. 3, содержащая 282 аминокислоты.
Фиг. 3Ό. Аминокислотная последовательность 8ТЕАР-1 ν. 4, содержащая 258 аминокислот.
Фиг. 4А. Сравнительный анализ первичной структуры аминокислотной последовательности 8ТЕАР-1 ν. 1 и мышиного ЮТос-индуцированного белка жировой ткани (§1/16905133).
Фиг. 4В. Сравнительный анализ первичной структуры аминокислотной последовательности 8ТЕАР-1 ν. 1 и крысиного белка рНубе (§1/21717655/).
Фиг. 4С. Показывает гомологию 8ТЕАР-1 и мышиного эпителиального антигена простаты, содержащего шесть трансмембранных доменов (§ί|20820492|).
Фиг. 5А. Гидрофильность аминокислотного профиля 1 варианта 8ТЕАР-1.
Фиг. 5В. Гидрофильность аминокислотного профиля 3 варианта 8ТЕАР-1.
Гидрофильность определена путем компьютерного анализа последовательности по способу Норр апб ХУообБ (Норр Т.Р., ХУообБ К.В., 1981. Ргос. Ναΐΐ. Асаб. 8οί. И.8.А. 78: 3824-3828), который можно найти на \уеЬ-сайте Рго18са1е, расположенном в глобальной сети ИВЬ сй/с§1-Ыи/рго15са1е.р1), через сервер молекулярной биологии ЕхРаБу.
Фиг. 6А. Гидропатичность аминокислотного профиля 1 варианта 8ТЕАР-1.
Фиг. 6В. Гидропатичность аминокислотного профиля 3 варианта 8ТЕАР-1, определенная путем компьютерного анализа последовательности по способу Ку1е апб ЭоойШе (Ку1е 1., ЭооИШе В.Е., 1982. 1. Мо1. Вю1. 157:105-132), который можно найти на \\'еЬ-сайте Рго18са1е, расположенном в глобальной сети ИВЬ ехра5у.сй/с§1-Ыи/рго15са1е.р1) через сервер молекулярной биологии ЕхРаБу.
Фиг. 7А. Профиль процента доступных аминокислотных остатков 1 варианта 8ТЕАР-1.
Фиг. 7В. Профиль процента доступных аминокислотных остатков 3 варианта 8ТЕАР-1, определенный путем компьютерного анализа последовательности по способу 1аши (1аши 1., 1979 №1Шге. 277: 491-492), который можно найти на \\'еЬ-сайте Рго18са1е, расположенном в глобальной сети ИВЬ ехра5у.сй/с§1-Ыи/рго15са1е.р1) через сервер молекулярной биологии ЕхРаБу.
Фиг. 8А. Аминокислотный профиль средней жесткости 1 варианта 8ТЕАР-1.
Фиг. 8В. Аминокислотный профиль средней жесткости 3 варианта 8ТЕАР-1, определенный путем компьютерного анализа последовательности по способу ВйаБкагап апб РоппиБ^ашу (ВйаБкагап В., апб РоипиБ^ашу Р.К., 1988. Ιηΐ. 1. Рер1. Рго1еш ВеБ. 32: 242-255), который можно найти на \\'еЬ-сайте
- 6 014870
Рго!8са1е, расположенном в глобальной сети ИКЬ ехраку.сй/сд1-Ыи/рго!кса1е.р1) через сервер молекулярной биологии ЕхРаку.
Фиг. 9А. Аминокислотный профиль бета-складки 1 варианта 8ТЕАР-1.
Фиг. 9В. Аминокислотный профиль бета-складки 3 варианта 8ТЕАР-1, определенный путем компьютерного анализа последовательности по способу Эе1еаде апб Ноих (Ое1еаде. 6., Ноих В. 1987 Рго!еш Епдшеегщд, 1: 289-294), который можно найти на тееЬ-сайте Рго18са1е. расположенном в глобальной сети иРЬ ехраку.сй/сд1-Ыи/рго!кса1е.р1) через сервер молекулярной биологии ЕхРаку.
Фиг. 10. Схематический сравнительный анализ вариантов 8ЫР 8ТЕАР-1.
Варианты 8ТЕАР-1 ν. 4-ν. 17 представляют собой варианты с единичными нуклеотидными различиями по сравнению со 8ТЕАР-1 ν. 2. Хотя указанные варианты 8ИР показаны отдельно, они могут встречаться в любых сочетаниях и в любых транскрипционных вариантах, которые содержат пары оснований, например 8ТЕАР-1 ν. 1 и ν. 3. Нумерация соответствует нумерации 8ТЕАР-1 ν. 2. Черные прямоугольники обозначают последовательности, совпадающие с последовательностями 8ТЕАР-1 ν. 2. 8ЫР указаны над прямоугольниками.
Фиг. 11. Состав экзонов транскрипционных вариантов 8ТЕАР-1.
На данной фигуре показана структура транскрипционных вариантов без хвоста поли А. Варианты 8ТЕАР-1 ν. 1, ν. 2 и ν. 3 представляют собой транскрипционные варианты, содержащие одинаковые экзоны 2 и 3. Первый экзон 8ТЕАР-1 ν. 1 на 30 оснований короче по 5'-концу, чем первые экзоны двух других транскрипционных вариантов. Четвертый экзон 8ТЕАР-1 ν. 2 аналогичен объединенным экзону 4, интрону 4 и экзону 5 8ТЕАР-1 ν. 1. По сравнению со 8ТЕАР-1 ν. 1 вариант 8ТЕАР-1 ν. 3 имеет другой экзон, полученный в результате сплайсинга интрона 4 8ТЕАР-1 ν. 1. Интроны и экзоны имеют неодинаковую длину.
Фиг. 12. Схематический сравнительный анализ первичных структур белковых вариантов 8ТЕАР-1.
Белковые варианты соответствуют нуклеотидным вариантам. Нуклеотидные варианты 8ТЕАР-1 ν. 5 - ν. 17, приведенные на фиг. 10, кодируют белок, аналогичный 8ТЕАР-1 ν. 2. Белки, транслируемые из транскрипционных вариантов 8ТЕАР-1 ν. 1 и ν. 3, показанных на фиг. 11, в положении 169 могут содержать аминокислоту Е (Рйе) или Ь (Ьеи). Единичные аминокислотные различия указаны над рамками. Черными прямоугольниками отмечены последовательности, аналогичные последовательности 8ТЕАР-1 ν. 1. Прямоугольники, заштрихованные разными способами, обозначают разные последовательности. Номера под прямоугольниками соответствуют 8ТЕАР-1 ν. 1.
Фиг. 13А-13С. Прогнозирование вторичной структуры и трансмембранных доменов для белковых вариантов 8ТЕАР-1. Вторичную структуру белковых вариантов 1 8ТЕАР-1 (8ЕЦ ГО N0: 46), 2 (8ЕЦ ГО N0: 47) и 3 (8ЕЦ ГО N0: 48) (фиг. 13А-13С соответственно) прогнозируют по способу ΗΝΝ - Н1егагсЫса1 №ига1 №1\хогк (Сиегшеиг, 1997, 1Шр://рЫ1.|Ьср.Гг/сщЬш/прка_аи!ота!.рГ?раде=прка_пп.Ыт1), который можно найти через сервер молекулярной биологии ЕхРаку, расположенному в глобальной сети, на сайте (.ехраку.сйЛоок/). Данный способ позволяет прогнозировать присутствие и расположение альфа-спиралей, развернутых цепей и статистических клубков на основе первичной последовательности белка. Также приводится процент белковых молекул, имеющих данную вторичную структуру.
Фиг. 13Ό-13Η. Схематически показана вероятность существования трансмембранных участков и ориентация вариантов 1-3 8ТЕАР-1 соответственно, полученные с помощью алгоритма ТМргеб, НоГтапп апб 8!о1Ге1, в котором используется ТМВА8Е (К. НоГтапп, ^. 81оПс1. ТМВА8Е - А ба!аЬаке оГ тетЬгапе крапшпд рго!еш кедтепй Вю1. С1ет. Норре-8еу1ег 374: 166, 1993).
Фиг. 13Е-131. Схематически показана вероятность существования трансмембранных участков, а также внеклеточная и внутриклеточная ориентация вариантов 1-3 8ТЕАР-1 соответственно, полученные с помощью алгоритма ТМНММ, 8опп1аттег, νоп Нерпе, апб Кгодй (Епк Ь.Ь. 8оппйаттег, Сиппаг νоп Нерпе, апб Апбегк Кгодй: А Ыббеп Магкох тобе1 Гог ргебюОпд йапктетЬгапе йеБсек ш рго!ет керпепсек. 1п Ргос. оГ 8ί.\11ι 1п1. СопГ. оп 1п1еШдеп1 8ук!етк Гог Мо1еси1аг В1о1оду, р. 175-182, Еб. 1. С1акдоте, Т. Ей11е_)ойп, Е. Ма)ог, Н. ЬаШгор, Ό. 8апкоГГ, апб С. 8епкеп Меп1о Рагк, СА: ААА1 Ргекк, 1998). Алгоритмы ТМргеб и ТМНММ можно найти через сервер молекулярной биологии ЕхРаку в глобальной сети на сайте (.ехраку.сйЛоок/).
Фиг. 14А. Экспрессия 8ТЕАР-1 в образце пациента с раком желудка.
РНК экстрагируют из нормального желудка (Ν) и из образцов от 10 разных пациентов с раком желудка (Т). Наличие последовательности 8ТЕАР-1 определяют методом нозерн-блоттинга, используя 10 мкг общей РНК на полосу. Результаты показывают, что в тканях опухоли желудка происходит интенсивная экспрессия 8ТЕАР-1 размером приблизительно 1,6 т.о. На нижней панели представлено окрашивание блоттинга бромидом этидия, демонстрирующее качество образцов РНК.
Фиг. 14В. Экспрессия 8ТЕАР-1 в тканях пациента с раком прямой кишки.
РНК экстрагируют из нормальной прямой кишки (Ν), из опухолевых тканей пациентов с раком прямой кишки (Т) и из метастаз рака прямой кишки (М). Наличие последовательности 8ТЕАР-1 определяют методом нозерн-блоттинга, используя 10 мкг общей РНК на полосу. Результаты показывают, что в тканях пациентов с раком прямой кишки происходит интенсивная экспрессия 8ТЕАР-1. На нижней па
- 7 014870 нели представлено окрашивание блоттинга бромидом этидия, демонстрирующее качество образцов РНК. Фиг. 14С. Экспрессия 8ТЕАР-1 в эндотелиальных клетках пупочной вены человека (НИУЕС). Одноцепочечную кДНК получают из клеток НИУЕС, ксенотрансплантатов рака простаты ЕАРС-4АО и ЕАРС-9АО, а также из тканей мозга человека. Нормализацию проводят методом ПЦР, используя праймеры для актина и САРИН. Полуколичественную ПЦР с праймерами для 8ТЕАР-1, проводят, используя 27 и 30 циклов амплификации (А). В качестве контроля проводят ПЦР с использованием праймеров для актина (В). Результаты показывают, что в клетках НИУЕС происходит интенсивная экспрессия 8ТЕАР-1, как и в тканях ксенотрансплантатов рака простаты. Экспрессия 8ТЕАР-1 в клетках НИУЕС показывает, что 8ТЕАР-1 можно использовать в качестве маркера эндотелиальных клеток при реваскуляризации опухолей.
Фиг. 14Ό и 14Е. Экспрессия 8ТЕАР-1 в нормальных и раковых тканях.
Одноцепочечную кДНК получают из нормальных тканей (мочевого пузыря, мозга, сердца, почек, печени, легких, простаты, селезенки, скелетной мускулатуры, яичек, поджелудочной железы, толстой кишки и желудка) и из пулов раковых тканей пациентов (из пула рака простаты, пула рака мочевого пузыря, пула рака почек, пула рака прямой кишки, пула рака легких, пула рака яичников, пула рака молочной железы, пула раковых метастаз, пула рака поджелудочной железы, пула ксенотрансплантатов рака простаты и пула метастаз рака простаты в лимфоузлах). Нормализацию проводят методом ПЦР с использованием праймеров для актина. Полуколичественную ПЦР с праймерами для 8ТЕАР-1 проводят, используя 26 и 30 циклов амплификации.
Фиг. 14Ό. Изображение агарозного геля с продуктами ОТ-ПЦР.
Фиг. 14Е. Результаты количественного определения продуктов ПЦР с помощью программного обеспечения А1рйа1тадет.
Результаты показывают, что среди всех анализируемых нормальных тканей интенсивная экспрессия наблюдается в простате. Повышающая регуляция экспрессии 8ТЕАР-1 обнаружена в пуле рака простаты, пуле рака мочевого пузыря, пуле рака почек, пуле рака прямой кишки, пуле рака легких, пуле рака яичников, пуле рака молочной железы и пуле рака поджелудочной железы. Интенсивная экспрессия 8ТЕАР-1 обнаружена в пуле раковых метастаз, пуле ксенотрансплантатов рака простаты и в пуле метастаз рака простаты в лимфоузлах.
Фиг. 14Е. Экспрессия 8ТЕАР-1 в лимфомных образцах пациентов.
Нормализацию проводят методом ПЦР с использованием праймеров для актина. Полуколичественную ПЦР с праймерами для 8ТЕАР-1 проводят, используя 26 и 30 циклов амплификации. Образцы анализируют на агарозном геле и с помощью программного обеспечения А1рйа1тадет определяют количество продуктов ПЦР. Экспрессию считают сильной или средней, если сигнал детектируется после 26 или 30 циклов амплификации соответственно, и считают, что экспрессия отсутствует, если сигнал не детектирутся даже после 30 циклов амплификации. Результаты показывают, что экспрессия 8ТЕАР-1 наблюдается в 8 из 11 анализируемых опухолевых образцов (72,7%).
Фиг. 15. Специфическое окрашивание 8ТЕАР-1 на поверхности клеток с помощью МаЬ М2/92.30.
Левые секторы: анализ методом ЕАС8 рекомбинантных клеток 3Т3 и РАТ1. стабильно экспрессирующих либо 8ТЕАР-1 (темные линии), либо контрольный ген устойчивости к неомицину (светлые линии), где окрашивание проводят с помощью МаЬ М2/92.30 против 8ТЕАР (10 мкг/мл), а связанные с клеточной поверхностью МаЬ детектируют, используя в качестве вторичного реагента конъюгат козлиных антител против мышиных 1дС с РЕ. Затем окрашенные клетки анализируют методом ЕАС8. Сдвиг флуоресценции в клетках КА.Т1-8ТЕАР-1 и 3Т3-8ТЕАР-1 по сравнению с контрольными клетками показывает, что МаЬ М2/92.30 специфически связываются со 8ТЕАР-1 на клеточной поверхности.
Правый сектор: флуоресцентная микроскопия клеток 3Т3-8ТЕАР-1, окрашенных МаЬ М2/92.30, демонстрирует интенсивную флуоресценцию клеточной поверхности.
Фиг. 16. 8ТЕАР-1 М2/92.30 МаЬ распознает 8ТЕАР-1 на поверхности клеток ксенотрансплантатов рака простаты.
Клетки рака простаты ЬАРС9 окрашивают, используя 10 мкг/мл либо МаЬ М2/92.30, либо контрольные МаЬ против КЬН. Связанные с поверхностью МаЬ детектируют, используя в качестве вторичных АЬ конъюгат козлиных антител против мышиных 1дС с РЕ. Затем окрашенные клетки анализируют методом ЕАС8. Полученные результаты показывают, что МаЬ М2/120.545 против 8ТЕАР-1 специфически связывается с эндогенным 8ТЕАР-1, экспрессирующимся на поверхности клеток ксенотрансплантатов рака простаты.
Фиг. 17. 8ТЕАР-1 М2/92.30 МаЬ распознает мышиный 8ТЕАР-1.
Клетки 293Т транзиторно трансфицируют либо рСИИА3.1, кодирующим кДНК мышиного 8ТЕАР-1, либо пустым вектором. Через 2 дня клетки собирают и окрашивают МаЬ М2/92.30 против 8ТЕАР-1 (10 мкг/мл), после чего связанные с клеточной поверхностью МаЬ детектируют, используя в качестве вторичного реагента конъюгат козлиных антител против мышиных 1дС с РЕ. Затем клетки анализируют методом ЕАС8. Сдвиг флуоресценции на клетках 293Т, трансфицированных мышиным 8ТЕАР-1, по сравнению с клетками, трансфицированными пустым вектором, показывает, что МаЬ М2/92.30 специфически связываются с мышиным белком 8ТЕАР-1.
- 8 014870
Фиг. 18. 8ТЕАР-1/120.545 Мак распознает 8ТЕАР-1 на клеточной поверхности.
Сектор А и сектор В. Клетки ЗТЗ-пео (А, закрашенная гистограмма) и 3Т3-8ТЕАР-1 (А, незакрашенная гистограмма) и клетки КАТ1-пео (В, закрашенная гистограмма) и КА.Т1-8ТЕАР (В, незакрашенная гистограмма) окрашивают Мак М2/120.545 (10 мкг/мл) и связанные с поверхностью Мак детектируют, используя в качестве вторичных Ак конъюгат козлиных антител против мышиных 1дС с РЕ. Затем клетки анализируют методом ЕАС8. Сдвиг флуоресценции на клетках 3Т3-8ТЕАР-1 и РАТ1-8ТЕЛР-1 по сравнению с соответствующими пео-контролями показывает, что Мак М2/120.545 специфически связываются с 8ТЕАР-1 на клеточной поверхности.
Сектор С. Клетки ЬЫСаР окрашивают либо Мак М2/120.545, либо контрольными Мак против КЕН и анализируют методом ЕАС8, как описано выше.
Сектор Ό. Флуоресцентная микроскопия клеток ЬЫСаР, окрашенных М2/120.545, демонстрирует интенсивную флуоресценцию клеточной поверхности. Полученные результаты показывают, что Мак М2/120.545 специфически связывается с эндогенным 8ТЕАР-1 на поверхности клеток ЕЫСаР.
Фиг. 19А. кДНК (8ЕО ГО N0: 49) и аминокислотная последовательность (8Е0 ГО N0: 50) М2/Х92.30 УН, клон #2.
Фиг. 19В кДНК (8Е0 ГО N0: 51) и аминокислотная последовательность (8Е0 ГО N0: 52) М2/Х92.30 Уъ, клон #2.
Фиг. 19С. кДНК (8Е0 ГО N0: 53) и аминокислотная последовательность (8Е0 ГО N0: 54) М2/Х92.30 Уъ, клон #6.
Фиг. 19Ό. кДНК (8Е0 ГО N0: 55) и аминокислотная последовательность (8Е0 ГО N0: 56) М2/Х120.545 Уъ, клон #8.
Фиг. 20А. Аминокислотная последовательность (8Е0 ГО N0: 57) М2/Х92.30 УН, клон #2.
Фиг. 20В. Аминокислотная последовательность (8Е0 ГО N0: 58) М2/Х92.30 Уь, клон #2.
Фиг. 20С. кДНК (8Е0 ГО N0: 59) и аминокислотная последовательность (8Е0 ГО N0: 60) М2/Х92.30 Уъ, клон #6.
Фиг. 20Ό. Сравнительный анализ амнокислотной последовательности М2/Х92.30 Уь, клон #2 (8ЕС ГО N0: 61), и М2/М92.30 Уъ, клон #6 (8ЕС ГО N0: 62).
Фиг. 20Е. Аминокислотная последовательность (8Е0 ГО N0: 63) М2/Х120.545 Уь, клон #8. Последовательность сигнального пептида подчеркнута.
Фиг. 21. 8ТЕАР-1 М2/92.30 Мак распознает 8ТЕАР-1 на поверхности клеток ксенотрансплантатов рака простаты и мочевого пузыря человека.
Клетки мочевого пузыря ИСВ1 (левый сектор) и клетки рака простаты ЬАРС9 (правый сектор) окрашивают, используя 10 мкг/мл либо Мак М2/92.30, либо контрольных Мак против КЬН. Связанные с поверхностью Мак детектируют, используя в качестве вторичных Ак конъюгат козлиных антител против мышиных 1дС с РЕ. Затем окрашенные клетки анализируют методом ЕАС8. Полученные результаты показывают, что Мак М2/92.30 против 8ТЕАР-1 специфически связывается с эндогенным 8ТЕАР-1, экспрессирующимся на поверхности клеток ксенотрансплантатов рака мочевого пузыря и простаты.
Фиг. 22. Интернализация 8ТЕАР-1 под действием 8ТЕАР-1/92.30 Мак.
Клетки 3Т3-8ТЕАР-1 окрашивают при 4°С с помощью М2/92.30 Мак (10 мкг/мл), промывают и инкубируют с конъюгатом козлиные антитела против мышиных 1дС-РЕ в качестве вторичных Ак при 4°С. Половину клеток инкубируют при 37°С в течение 30 мин, а вторую половину оставляют при 4°С. Затем клетки из каждой партии анализируют методом флуоресцентной микроскопии. На поверхности клеток, оставленных инкубироваться при 4°С, наблюдается яркая кольцеобразная флуоресценция. На поверхности клеток, инкубировавшихся при 37°С, кольцеобразная флуоресценция отсутствует, а появление точечной и агрегированной флуоресценции указывает на кэпирование и интернализацию.
Фиг. 23. Интернализация 8ТЕАР-1 под действием 8ТЕАР-1 М2/120.545 Мак.
Клетки РС3-8ТЕАР-1 окрашивают при 4°С с помощью М2/120.545 Мак (10 мкг/мл), промывают и инкубируют с конъюгатом козлиные антитела против мышиных 1дС-РЕ в качестве вторичных Ак. Половину клеток инкубируют при 37°С в течение 30 мин, а вторую половину оставляют при 4°С. Затем клетки из каждой партии анализируют методом флуоресцентной микроскопии. На поверхности клеток, оставленных инкубироваться при 4°С, наблюдается яркая кольцеобразная флуоресценция. На поверхности клеток, инкубировавшихся при 37°С, кольцеобразная флуоресценция отсутствует, а появление точечной и агрегированной флуоресценции указывает на кэпирование и интернализацию.
Фиг. 24. Интернализация 8ТЕАР-1.
Для того чтобы продемонстрировать, что мышиный 8ТЕАР-1 М2/120.545 проникает в клеткимишени благодаря экспрессии 8ТЕАР-1 на поверхности клеток БХСаР. используют конъюгаты антител против мышиных 1дС с сапорином (Абуапееб Тагдебпд 8у81еш8, 8ап П1едо, СА). Анализ проводят следующим образом. Клетки БХСаР помещают в количестве 5000 клеток/90 мкл/лунку в 96-луночный планшет и инкубируют в течение ночи. Получают растворы конъюгатов вторичных антител с иммунотоксином (антитела против мышиных 1дС-сапорин и антитела против козлиных 1дС-сапорин) или антител против мышиных 1дС в среде для культивирования клеток с конечной концентрацией 100 нг/мл. Добавляют первичное антитело в концентрации, варьирующей от 1 до 1000 нг/мл. Планшеты инкубируют в
- 9 014870 течение 72 ч, после чего методом МТТ определяют жизнеспособность. Результаты показывают, что клетки ЕЫСаР погибают в присутствии М2/120.545 и конъюгата антитело против мышиных 1дО-сапорин. При использовании только вторичных антител (против мышиных 1дО) или конъюгатов неспецифичных вторичных антител (антител против козлиных 1дО с сапорином) эффект не детектируется. При использовании только первичного антитела (М2/120.545) вплоть до концентрации 1 мкг/мл токсичность не наблюдается.
Фиг. 25. Иммунопреципитация §ТЕАР-1 под действием Май против 8ТЕАР-1 М2/92.30 и М2/120.545.
Клетки 3Т3-8ТЕАР-1 и ЗТЗ-пео лизируют в буфере В1РА (25 мМ Тп5-С1 рН 7,4; 150 мМ ЫаС1, 0,5 мМ ЕЭТА. 1% тритон Х-100, 0,5% дезоксихолевая кислота, 0,1% δΌδ и смесь ингибиторов протеаз). Клеточные лизаты предварительно осветляют с помощью гранул сефарозы, содержащих белок С, и затем инкубируют с 5 мкг Май либо М2/92.30, либо М2/120.545 в течение 2 ч при комнатной температуре. Добавляют гранулы, содержащие белок С, и смесь инкубируют еще 1 ч. Иммунные комплексы промывают и солюбилизируют в буфере для δΌδ-РАОЕ. Затем солюбилизированные образцы анализируют методами δΌδ-РАОЕ и вестерн-блоттинга, используя кроличьи рАй против 8ТЕАР. В качестве положительного контроля используют лизаты целых клеток 293Т, трансфицированных 8ТЕАР-1. Иммунореактивная полоса, соответствующая ~37 кДа, наблюдается только в образцах, полученных из клеток 3Т3-8ТЕАР-1, и указывает на специфичную иммунопреципитацию 8ТЕАР-1 под действием как Май М2/92.30, так и Май М2/120.545.
Фиг. 26. Влияние 8ТЕАР-1 Май на рост ксенотрансплантатов рака простаты человека ЬАРС9 у мышей.
8ТЕАР-1 М2/92.30 и М2/120.545 тестируют в двух разных дозах, 100 и 500 мкг. В качестве контролей используют РВ8 и Май против КЬН. В исследовании участвуют 6 групп по 10 мышей в каждой. Май вводят в. б. два раза в неделю, всего 12 раз, начиная со дня инъекции опухолевых клеток. Размер опухоли измеряют штангенциркулем два раза в неделю. Объем опухоли рассчитывают по формуле ^2хЬ/2, где Ь - самый длинный размер; - перпендикулярный ему размер. Концентрацию Р8А в сыворотке измеряют на 40 день после начала обработки с помощью коммерческого набора ЕЬ18А. Чтобы учесть различия в росте опухоли и уровне Р8А между группами, используют тест Крускала-Валлиса и И-тест Манна-Уитни. Все тесты являются двусторонними с α=0,05. Полученные результаты показывают, что 8ТЕАР-1 М2/92.30 и М2/120.545 значительно замедляют рост ксенотрансплантата опухоли простаты человека в зависимости от используемой дозы.
Фиг. 27. Влияние 8ТЕАР-1 Май на рост ксенотрансплантатов рака простаты человека ЬАРС9 у мышей.
8ТЕАР-1 М2/92.30 и М2/120.545 тестируют в двух разных дозах, 100 и 500 мкг. В качестве контролей используют РВ8 и Май против КЬН. В исследовании участвуют 6 групп по 10 мышей в каждой. Май вводят в. б. два раза в неделю, всего 12 раз, начиная со дня инъекции опухолевых клеток. Размер опухоли измеряют штангенциркулем два раза в неделю. Измеряют самый длинный размер Ь и перпендикулярный ему размер ^, после чего объем опухоли определяют по формуле \У:хй/2. Концентрацию Р8А в сыворотке измеряют на 40 день после начала обработки с помощью коммерческого набора ЕЙ18А. Чтобы учесть различия в росте опухоли и уровне Р8А между группами, используют тест Крускала-Валлиса и И-тест Манна-Уитни. Все тесты являются двусторонними с α=0,05. Полученные результаты показывают, что 8ТЕАР-1 М2/92.30 и М2/120.545 значительно замедляют рост ксенотрансплантата опухоли простаты человека в дозозависимой манере.
Фиг. 28. 8ТЕАР-1-индуцированное фосфорилирование ЕВК-1 и ЕВК-2.
Левые секторы: клетки РС3 трансфицируют геном устойчивости к неомицину отдельно или вместе с геном 8ТЕАР-1 в векторе ρδΚα. Клетки выращивают в течение ночи в 0,5% РВ8, затем стимулируют 10% РВ8 в течение 5 мин в присутствии или в отсутствие 10 мкг/мл ингибитора МЕК РЭ98058. Клеточные лизаты анализируют методами 12,5% δΌδ-РАОЕ и вестерн-блоттинга с использованием антител против фосфо-ЕВК (Се11 δφηηΐίηβ) и антител против ЕВК Щуше!).
Правые секторы: клетки Ы1Н-3Т3 трансфицируют только геном устойчивости к неомицину или δТЕАР-1 в векторе ρδΒα. Клетки обрабатывают, как описано выше, но в отсутствие ингибитора МЕК. Кроме того, клетки Ы1Н-3Т3-пео обрабатывают 10 мг/мл салицилата №1. Экспрессия δТЕАР-1 индуцирует фосфорилирование ЕВК-1 и ЕВК-2 в сыворотке, которое ингибируется вышестоящим ингибитором киназы МЕК РЭ98058.
Фиг. 29. δТЕАР-1 опосредует межклеточное взаимодействие.
Клетки РС3 трансфицируют геном устойчивости к неомицину отдельно или вместе с геном δТЕАР-1, или котрольным геном в векторе ρδΚα. Реципиентные клетки метят конъюгатом декстрантехасовый красный в концентрации 1 мг/мл, а донорные клетки метят кальцеином АМ в концентрации 2,5 мкг/мл. Донорные (зеленые) и реципиентные (красные) клетки совместно культивируют при 37°С в течение 18-24 ч, после чего с помощью микроскопии анализируют расположение флуоресцентных красителей.
- 10 014870
Левый сектор: в качестве доноров и реципиентов используют клетки РСЗ-пео. Центральный сектор: в качестве доноров и реципиентов используют клетки РС3-8ТЕАР-1. Правый сектор: в качестве доноров и реципиентов используют РСЗ-контрольные клетки. 8ТЕАР-1 индуцирует перенос кальцеина в клетки, содержащие конъюгат декстран-техасовый красный, данный результат указывает на то, что 8ТЕАР-1 облегчает межклеточные взаимодействия.
Фиг. 30. Для межклеточного взаимодействия требуется экспрессия 8ТЕАР-1 на донорных и реципиентных клетках.
Клетки РСЗ трансфицируют геном устойчивости к неомицину отдельно или вместе с геном 8ТЕАР-1 в векторе ρ8Κα. Реципиентные клетки метят конъюгатом декстран-техасовый красный в концентрации 1 мг/мл, а донорные клетки метят кальцеином АМ в концентрации 2,5 мкг/мл. Донорные (зеленые) и реципиентные (красные) клетки совместно культивируют при 37°С в течение 18-24 ч, после чего с помощью микроскопии анализируют расположение флуоресцентных красителей. Верхние секторы: оптическая микроскопия; нижние секторы: УФ-флуоресценция. Левые секторы: в качестве доноров и реципиентов используют клетки РСЗ-пео. Центральные секторы: в качестве донорных клеток используют РСЗ-пео, а в качестве реципиентных клеток используют РС3-8ТЕАР-1. Правые панели: в качестве доноров и реципиентов используют клетки РС3-8ТЕАР-1. Межклеточные взаимодействия детектируют только в том случае, если 8ТЕАР-1 экспрессируется и на донорных, и на реципиентных клетках.
Фиг. 31. Влияние МаЬ 8ТЕАР-1/120.545 на щелевой контакт.
Клетки РСЗ трансфицируют геном устойчивости к неомицину отдельно или вместе с геном 8ТЕАР-1 в векторе ρδΒα. Реципиентные клетки метят конъюгатом декстран-техасовый красный в концентрации 1 мг/мл, а донорные клетки метят кальцеином АМ в концентрации 2,5 мкг/мл. Донорные (зеленые) и реципиентные (красные) клетки совместно культивируют при 37°С в течение 18-24 ч, после чего с помощью микроскопии анализируют расположение флуоресцентных красителей. Во всех экспериментах в качестве доноров и реципиентов используют одинаковые клетки. Клетки инкубируют с указанными количествами МаЬ 8ТЕАР-1/120.545 в течение 10 мин перед внесением в планшеты, затем МаЬ оставляют в культуре на 24 ч до анализа. 8ТЕАР-1/120.545 уменьшает щелевой контакт, опосредованный 8ТЕАР-1, в зависимости от используемой дозы.
Фиг. 32. Ингибирование фосфорилирования ЕВК-1 и ЕВК-2 под действием 8ТЕАР-1 МаЬ и РНКи.
Клетки РС3 трансфицируют геном устойчивости к неомицину отдельно или вместе с геном 8ТЕАР-1 и МаЬ в векторе ρδΒα. Для удаления РНКи клетки РС3-8ТЕАР-1 стабильно трансфицируют вектором рРИВ-иб-27-8ТЕАР-1, содержащим киРНК (короткие интерферирующие РНК) 8ТЕАР-1. Клетки держат в условиях недостаточного количества питательных веществ в 0,1% ΕΒδ в течение 18 ч при 37°С, затем помещают на лед, где держат в течение 10 мин в присутствии или в отсутствие 10 мкг/мл МаЬ М2/92.30, после чего в течение 3 мин нагревают до КТ и стимулируют 10% ΕΒδ в течение 5 мин. Клетки лизируют в буфере В1РА, лизаты целых клеток анализируют методом 12,5% δΩδ-РАСЕ. а белки детектируют методом вестерн-блоттинга. Фосфо-ЕВК детектируют с помощью кроличьей антисыворотки (Се11 δί^ηηΐίη^), а ЕВК детектируют с помощью кроличьих антител против ЕВК (2ушеб). δТЕАР-1 детектируют с помощью овечьих антител против δТЕАР-1, а актин детектируют с помощью МаЬ против актина (δηηΐη Стих). Фосфорилирование ЕВК-1 и ЕВК-2, индуцированное 10% сывороткой, ингибируется под действием МаЬ М2/92.30 и киРНК δТЕАР-1.
Фиг. 33. Влияние РНКи δТЕАР-1 на межклеточное взаимодействие.
Клетки РС3 трансфицируют геном устойчивости к неомицину отдельно или вместе с геном δТЕАР-1 в векторе ρδΒα. Для удаления РНКи клетки РС3^ТЕАР-1 стабильно трансфицируют вектором рРиВ-иб-27^ТЕАР-1, содержащим киРНК δТЕАР-1, или пустым вектором. Реципиентные клетки метят конъюгатом декстран-техасовый красный в концентрации 1 мг/мл, а донорные клетки метят кальцеином АМ в концентрации 2,5 мкг/мл. Донорные (зеленые) и реципиентные (красные) клетки совместно культивируют при 37°С в течение 18-24 ч, после чего с помощью микроскопии анализируют расположение флуоресцентных красителей. Во всех экспериментах в качестве доноров и реципиентов используют одинаковые клетки. Специфичная РНКи δТЕАР-1, стабильно экспрессирующаяся в клетках РС3^ТЕАР-1, уменьшает межклеточное взаимодействие, индуцированное δТЕАР-1.
- 11 014870
Подробное описание изобретения
Оглавление разделов.
I. Определения.
II. Полинуклеотиды 8ТЕАР-1.
II. А. Применение полинуклеотидов 8ТЕАР-1.
ΙΙ.Α.1. Выявление генетических нарушений.
П.А.2. Антисмысловые воплощения.
Π.Α.3. Праймеры и пары праймеров.
П.А.4. Выделение молекул нуклеиновых кислот, кодирующих 8ТЕАР-1.
П.А.5. Молекулы рекомбинантных нуклеиновых кислот и системы векторов-хозяев.
III. Белки, родственные 8ТЕАР-1.
III. А. Воплощения белков, несущих мотив.
Ш.В. Экспрессия белков, родственных 8ТЕАР-1.
III. С. Модификации белков, родственных 8ТЕАР-1.
Ш.Э. Применение белков, родственных 8ТЕАР-1.
IV. Антитела против 8ТЕАР-1.
V. Клеточные иммунные ответы на 8ТЕАР-1.
VI. Трансгенные животные, несущие 8ТЕАР-1.
VII. Способы детектирования 8ТЕАР-1.
VIII. Способы определения статуса генов, родственных 8ТЕАР-1, и их продуктов.
IX. Идентификация молекул, взаимодействующих со 8ТЕАР-1.
X. Терапевтические способы и композиции.
Х.А. Противораковые вакцины.
Х.В. 8ТЕАР-1 как мишень для терапии антителами.
Х.С. 8ТЕАР-1 как мишень для клеточных иммунных ответов.
Х.С.1. Вакцины на основе мини-генов.
Х.С.2. Сочетания пептидов СТЬ с хелперными пептидами.
Х.С.3. Сочетания пептидов СТЬ с факторами, сенсибилизирующими Т-клетки.
Х.С.4. Вакцинные композиции, содержащие ЭС. сенсибилизированные пептидами СТЬ и/или НТЬ. Χ.Ό. Адоптивная иммунотерапия.
X. Е. Введение вакцин с целью лечения или профилактики.
XI. Диагностические и прогностические воплощения 8ТЕАР-1.
XII. Ингибирование белковой функции 8ТЕАР-1.
XII.А. Ингибирование 8ТЕАР-1 внутриклеточными антителами.
XII.В. Ингибирование 8ТЕАР-1 рекомбинантными белками.
XII.С. Ингибирование транскрипции или трансляции 8ТЕАР-1.
XII. ^. Общие положения стратегий лечения.
XIII. Идентификация, характеристика и применение модуляторов 8ТЕАР-1.
XIV. РНКи и терапевтическое применение маленьких интерферирующих РНК (8ЖЫА).
XV. Наборы/готовые изделия.
I. Определения.
Если не указано иначе, подразумевается, что все используемые в данном описании научные термины, номенклатура или терминология имеют значения, общепринятые в области, к которой относится данное изобретение. В некоторых случаях для ясности и/или в качестве справочного материала в данном описании приводятся определения терминов, имеющих общепринятые значения, но не следует считать, что включение таких определений в данное описание означает, что они существенно отличаются от общепринятых в данной области. Многие методы и процедуры, описанные в данном документе, являются хорошо известными и широко применяются специалистами в данной области в рамках традиционной методологии, такой, например, как широко используемые методы молекулярного клонирования, описанные в 8атЬгоок с1 а1., Мо1еси1аг С1ошид: А ЬаЬога!огу Мапиа1, 2'1 ебйюи (1989), Со1б 8ргшд НагЬог ЬаЬога!огу Рге§8, Со1б 8ргтд НагЬог, N. Υ. Если не указано иначе, процедуры, включающие в себя применение коммерческих наборов и реагентов, обычно проводят в соответствии с инструкциями и/или параметрами производителя.
Термины распространенный рак простаты, местно распространенный рак простаты, распространенное заболевание и местно распространенное заболевание относятся к заболеваниям простаты, распространившимся из капсулы простаты, и включают в себя заболевания стадии С по системе американской урологической ассоциации (АИА), заболевания стадий С1-С2 по системе Уитмора- Джеветта (АЫ1тоге-1е^ей) и заболевания стадий Т3-Т4 и Ν+ по системе ΡΝΜ (опухоль, узел, метастазы).
Как правило, не рекомендуется применять хирургическое лечение для пациентов с местно распространенным заболеванием, такие пациенты имеют гораздо менее благоприятный исход, чем пациенты с клинически локализованным (ограниченным органом) раком простаты. Местно распространенное заболевание идентифицируют при обнаружении путем пальпации уплотнения за боковой границей простаты,
- 12 014870 или асимметрии, или уплотнения выше основания простаты. Местно распространенный рак простаты в настоящее время диагностируют патологически после радикальной простатэктомии, если опухоль внедряется или проникает в простатическую капсулу, простирается за границы оперируемой области или проникает в семенные пузырьки.
Термин изменение природного характера гликозилирования в данном описании означает делецию одного или нескольких углеводных фрагментов, присутствующих в нативной последовательности 8ТЕАР-1 (либо в результате удаления нижестоящего участка гликозилирования, либо в результате делеции гликозилирования химическими или ферментативными способами), и/или добавление одного или нескольких участков гликозилирования, не присутствующих в нативной последовательности 8ТЕАР-1. Кроме того, данная фраза включает в себя количественные изменения в гликозилировании нативных белков, включающие в себя изменения природы и соотношения разных присутствующих углеводных фрагментов.
Термин аналог относится к молекуле, которая имеет структуру, подобную структуре другой молекулы, или признаки, подобные или аналогичные признакам другой молекулы (например, белка, родственного 8ТЕАР-1). Например, аналог белка 8ТЕЛР-1 может специфически связываться с антителом или Т-клеткой, которые специфически связываются со 8ТЕЛР-1.
Если однозначно не указано иначе, термин антитело используется в самом широком смысле. Следовательно, антитело может быть природным или искусственным, таким как моноклональные антитела, полученные с помощью традиционной гибридомной технологии. Антитела против 8ТЕАР-1 включают в себя моноклональные и поликлональные антитела, а также фрагменты, содержащие антигенсвязывающий домен и/или один или несколько гипервариабельных участков данных антител. В данном описании термин антитело относится к антителам любого вида или к их фрагментам, которые специфически связываются со 8ТЕАР-1 и/или обладают желательной биологической активностью, и, в частности, включает в себя моноклональные антитела (в том числе полноразмерные моноклональные антитела), поликлональные антитела, поливалентные антитела (например, биспецифические антитела) и фрагменты антител, которые специфически связываются со 8ТЕАР-1 и/или обладают желательной биологической активностью. В способах и композициях, описанных в данном документе, можно использовать любое специфическое антитело. Так, в одном воплощении термин антитело включает в себя молекулу, содержащую по меньшей мере один вариабельный участок легкой цепи молекулы иммуноглобулина и по меньшей мере один вариабельный участок тяжелой цепи, которые вместе образуют участок специфического связывания антигена-мишени. В одном воплощении антитело представляет собой антитело 1дС. Например, антитело может представлять собой ΙβΟ|. 1дС2, 1дС3 или 1дС4. Антитела, используемые в способах и композициях согласно изобретению, могут быть получены в клеточной культуре, в фагах или в разных животных, включающих в себя, без ограничения, коров, кроликов, коз, мышей, крыс, хомяков, морских свинок, овец, собак, кошек, мартышек, шимпанзе, человекообразных обезьян. Таким образом, в одном воплощении антитело согласно изобретению представляет собой антитело млекопитающего. Для выделения исходного антитела или получения вариантов с измененными характеристиками специфичности или авидности можно использовать фаговые технологии. Такие технологии являются стандартными и хорошо известны в данной области. Например, рекомбинантное антитело можно получить путем трансфекции клетки-хозяина вектором, содержащим последовательность ДНК, кодирующую антитело. Для трансфекции последовательности ДНК, экспрессирующей по меньшей мере один Уь- и один Ун-участок в клетке-хозяине, можно использовать один или несколько векторов. Примеры рекомбинантных способов получения и продукции антител описаны в ИеКек, АИТШОПУ РКОПиСТЮЫ: Е88ЕЫТ1АЬ ТЕС11ХЮВ'Е5 (Айеу, 1997); 8йерйагй, е! а1., МОХОСВОХАВ ЛХТ1ВОП1Е5 (О.хГогс! В'штегаВ Ргекк, 2000); 6οάίη§, МОХЮСЕОХАЬ АХТ1ВОП1Е5: РВ1ХС1РВЕ5 АХВ РКАСТ1СЕ (Асайет1с Ргекк, 1993); СИККЕХГГ РКОТОСОЬ8 ИХ 1ММЕХОВОСУ (,ΙοΙιιι А11еу & δοηκ, ток! гесеп! еййюп). Антитело согласно изобретению можно модифицировать рекомбинантными способами с увеличением эффективности антитела при опосредовании целевой функции. Таким образом, в объем согласно изобретению входят модификации антител путем замен с использованием рекомбинантных методов. Как правило, замены являются консервативными. Например, по меньшей мере одна аминокислота в константном участке антитела может быть заменена на другой остаток. См., например, патент США № 5624821, патент США № 6194551, заявка АО 9958572 и Апда1, е! а1., Мо1. 1ттипо1. 30: 105-08 (1993). Модификации аминокислотного состава включают в себя делеции, добавления, замены аминокислот. В некоторых случаях такие изменения делают, чтобы уменьшить нежелательную активность, например комплементзависимую цитотоксичность. Зачастую антитела метят путем присоединения либо ковалентного, либо нековалентного, вещества, генерирующего детектируемый сигнал. Известен широкий ряд меток и методов присоединения, которые широко описаны в научной и патентной литературе. Данные антитела можно анализировать на связывание с нормальным или дефектным 8ТЕАР-1. См., например, АХТ1ВООУ ЕХСШЕЕШХС: А РКАСТ1САЬ АРРК.ОАСН (ОхГогй Ишуегкйу Ргекк, 1996). Подходящие антитела с желательной биологической активностью можно идентифицировать с помощью ίη νί!το анализов, включающих в себя, без ограничения, пролиферацию, миграцию, адгезию, выращивание в мягком агаре, ангиогенез, межклеточные взаимодействия, апоптоз, транспорт, передачу сигнала, а также с помощью ίη
- 13 014870 νίνο анализов, таких как ингибирование опухолевого роста. Антитела, предлагающиеся в данном описании, также можно использовать для диагностических целей. Улавливающие или не-нейтрализующие антитела можно анализировать на способность связываться со специфическим антигеном, при этом не ингибируя связывание с рецептором или биологическую активность антигена.
Нейтрализующие антитела можно использовать в конкурентном анализе связывания. Их также можно использовать для количественного определения 8ТЕАР-1 или его рецептора.
Фрагмент антитела определяют по меньшей мере как часть вариабельного участка молекулы иммуноглобулина, которая связывается с мишенью антитела, т.е. как антигенсвязывающий участок. В одном воплощении данный термин, в частности, охватывает отдельные антитела против 8ТЕАР-1 и их клоны (в том числе агонистические, антагонистические и нейтрализующие антитела), а также композиции антител против 8ТЕАР-1 с полиэпитопной специфичностью. В способах и композициях согласно изобретению можно использовать моноклональные или поликлональные антитела. Антитело может находиться в виде антигенсвязывающего фрагмента антитела, включающего в себя фрагмент РаЬ, фрагмент Р(аЬ')2, одноцепочечный вариабельный участок и т.п. Фрагменты интактных молекул можно получить с помощью способов, хорошо известных в данной области и включающих в себя ферментативное расщепление и рекомбинантные способы.
В данном описании для получения антитела, специфичного к 8ТЕАР-1, можно использовать любую форму антигена. Так, антиген, вызывающий образование антител, может представлять собой один эпитоп, несколько эпитопов или целый белок и может использоваться один или в сочетании с одним или несколькими известными в данной области средствами, повышающими иммуногенность. Антиген, вызывающий образование антител, может представлять собой выделенный полноразмерный белок, белок клеточной поверхности (например, при иммунизации клетками, трансфицированными по меньшей мере частью антигена) или растворимый белок (например, при иммунизации только фрагментом внеклеточного домена белка). Антиген может продуцироваться в генетически модифицированных клетках. ДНК, кодирующая антиген, может быть геномной или негеномной (например, кДНК) и может кодировать по меньшей мере часть внеклеточного домена. В данном описании термин фрагмент относится к минимальному числу аминокислот или нуклеиновых кислот, по обстоятельствам, образующих иммуногенный эпитоп рассматриваемого антигена. Для трансформации клеток можно использовать любые подходящие генетические векторы, включающие в себя, без ограничения, аденовирусные векторы, плазмиды и невирусные векторы, такие как катионные липиды. В одном воплощении антитело, используемое в способах и композициях согласно изобретению, специфически связывается по меньшей мере с частью внеклеточного домена рассматриваемого 8ТЕАР-1.
Описываемые в данном документе антитела или их антигенсвязывающие фрагменты можно конъюгировать с биоактивным средством. В данном описании термин биоактивное средство относится к любому синтетическому или природному соединению, которое связывается с антигеном и/или усиливает или опосредует желательный биологический эффект, связанный с увеличением уровня цитотоксичных веществ.
В одном воплощении связывающие фрагменты, используемые в настоящем изобретении, представляют собой биологически активные фрагменты. В данном описании термин биологически активный относится к антителу или фрагменту антитела, способному связываться с целевым антигенным эпитопом и непосредственно или косвенно оказывать биологический эффект. Непосредственные эффекты включают в себя, без ограничения, модуляцию, стимуляцию и/или ингибирование сигнала роста; модуляцию, стимуляцию и/или ингибирование антиапоптотического сигнала; модуляцию, стимуляцию и/или ингибирование апоптотического или некротического сигнала; модуляцию, стимуляцию и/или ингибирование каскада АЭСС и модуляцию, стимуляцию и/или ингибирование каскада СЭС.
В способах и композициях согласно изобретению также используются биспецифические антитела. В данном описании термин биспецифическое антитело относится к антителу, как правило, моноклональному, способному специфично связываться по меньшей мере с двумя антигенными эпитопами. В одном воплощении эпитопы относятся к одному антигену. В другом воплощении эпитопы относятся к двум разным антигенам. Способы получения биспецифических антител известны в данной области. Например, биспецифические антитела можно получить рекомбинантными способами путем совместной экспрессии пар тяжелых и легких цепей двух иммуноглобулинов. См., например, Μίΐδίοίη е! а1., №щ.1гс. 305: 537-39 (1983). Альтернативно, биспецифические антитела можно получить путем химического присоединения. См., например, Вгеппап, е! а1., 8с1епсе, 229: 81 (1985). Биспецифические антитела включают в себя фрагменты биспецифических антител. См., например, НоШпдет, е! а1., Ргос. Νη11. Асаб. 8с1. И8А. 90: 6444-48 (1993), ОгиЬег, е! а1., 1. 1ттипо1. 152: 5368 (1994).
- 14 014870
Описанные в данном документе моноклональные антитела, в частности, включают в себя химерные антитела, в которых фрагмент тяжелой и/или легкой цепи идентичен или гомологичен соответствующим последовательностям антител, полученных из конкретных видов или принадлежащих к конкретному классу или подклассу антител, тогда как другая цепь (цепи) идентична или гомологична соответствующим последовательностям антител, полученных из других видов или принадлежащих к другому классу или подклассу антител, а также фрагменты таких антител, пока они специфически связываются с целевым антигеном и/или обладают желательной биологической активностью (патент США № 4816567 и Моглкоп е! а1., Ргос. ЫаЙ. Асай. 8ск И8А, 81: 6851-6855 (1984)).
Термин кодон-оптимизированные последовательности относится к нуклеотидным последовательностям, оптимизированным для конкретных видов путем замены любых кодонов с периодичностью использования менее чем приблизительно 20%. Нуклеотидные последовательности, оптимизированные для экспрессии в определенных видах хозяев путем устранения мнимых последовательностей полиаденилирования, устранения сигналов сплайсинга экзонов/интронов, устранения транспозон-подобных повторов и/или оптимизации содержания ОС в добавление к оптимизации кодонов, в данном описании называют последовательностями с повышенной экспрессией.
Комбинаторная библиотека представляет собой набор разных химических соединений, полученных путем химического или биологического синтеза в результате объединения ряда химических структурных элементов, таких как реагенты. Например, линейную комбинаторную химическую библиотеку, такую как библиотеку полипептидов (например, мутеина), получают путем соединения ряда химических структурных элементов, называемых аминокислотами, с получением молекулы заданной длины (т. е. полипептидного соединения, содержащего определенное число аминокислот). Многие химические соединения синтезируют путем такого комбинаторного смешивания химических структурных элементов (Оа11ор е! а1., 1. Мей. Скет. 37(9): 1233-1251 (1994)).
Способы получения и скрининга комбинаторных библиотек хорошо известны специалистам в данной области. Такие комбинаторные химические библиотеки включают в себя, без ограничения, библиотеки пептидов (см., например, патент США № 5010175, Еигка, Рер!. Рго!. Век. 37: 487-493 (1991), Ноидк!оп е! а1., ЫаШге, 354: 84-88 (1991)), пептоиды (публикация РСТ № XVО 91/19735), кодированные пептиды (публикация РСТ № νθ 93/20242), статистические биоолигомеры (публикация РСТ № νθ 92/00091), бензодиазепины (патент США № 5288514), диверсомеры, такие как гидантоины, бензодиазепины и дипептиды (НоЬЬк е! а1., Ргос. №11. Асай. 8с1. И8А, 90: 6909-6913 (1993)), винилогические полипептиды (Над1кага е! а1., 1 Атег. Скет. 8ос. 114: 6568 (1992)), непептидные пептидомиметики с бета-Э-глюкозным скелетом (Нпксктаии е! а1., 1 Атег. Скет. 8ос. 114: 9217-9218 (1992)), библиотеки маленьких соединений, полученные путем аналогового органического синтеза (Скеп е! а1., 1 Атег. Скет. 8ос. 116: 2661 (1994)), олигокарбаматы (Ско, е! а1., 8аепсе, 261: 1303 (1993)) и/или пептидилфосфонаты (СатрЬе11 е! а1., 1. Огд. Скет. 59: 658 (1994)). См., в общем, Согйоп е! а1., 1. Мей. Скет. 37: 1385 (1994), библиотеки нуклеиновых кислот (см., например, 8!га!адепе, Согр.), библиотеки пептидов и нуклеиновых кислот (см., например, патент США № 5539083), библиотеки антител (см., например, Уаидки е! а1., Ыа!иге Вю!ескпо1оду, 14 (3), (1996) и РСТ/и896/10287), библиотеки углеводов (см., например, Ыапд е! а1., 8с1епсе, 274: 1520-1522 (1996) и патент США № 5593853) и библиотеки маленьких органических молекул, таких как бензодиазепины (Вайт, С&Е№ 1аи 18, р. 33 (1993)); изопреноиды (патент США № 5569588); тиазолидиноны и метатиазаноны (патент США № 5549974); пирролидины (патенты США № 5525735 и 5519134); морфолиновые соединения (патент США № 5506337); бензодиазепины (патент США № 5288514) и т.п.
Устройства для получения комбинаторных библиотек имеются в продаже (см., например, 357 ΝΙΓ8, 390 ΝΙΓ8. Айуапсей Скет Теск. ЬошкуШе ΚΥ; 8утркопу, Ватт, ’№оЬит, МА; 433А, Аррйей Вюкук!етк, Еок!ег Ску, СА; 9050, Р1ик, Мййроге, ВейЕогй, ΝΙΛ). Для решений фазовой химии также разработан ряд роботизированных систем. Данные системы включают в себя автоматизированные рабочие станции, такие как автоматизированные аппараты синтеза, разработанные Такейа Скетюа1 1пйикй1ек, ЬТО. (Окака, 1арап), а также многие системы, в которых используются роботизированные руки (2ута!е Н., 2утагк Согрогайоп, Норкт!оп, Макк.; Огса, Нете1е!!-Раскагй, Ра1о А1!о, СайЕ), имитирующие синтетические операции, проводимые химиками. Любое из вышеуказанных устройств можно использовать в настоящем изобретении. Специалисты в данной области могут осуществлять модификации данных устройств (если таковые имеют место) в пределах их работоспособности в соответствии с настоящим изобретением. Кроме того, ряд комбинаторных библиотек является коммерчески доступным (см., например, СотОепех, Рппсе!оп, N1; Актех, Моксоте, ВИ; Тпрок, 1пс., 8!. Ьошк, МО; Скет8!аг, Ь!й., Моксоте, ВИ; 3Ό Ркагтасеийса1к, Ех!оп, РА; Майек Вюктепсек, Со1итЫа, МО; е!с.).
В данном описании термин консервативная замена относится к заменам аминокислот, известным специалистам в данной области, которые, как правило, могут быть осуществлены без изменения биологической активности полученной молекулы. Специалистам в данной области известно, что единичные аминокислотные замены в неэссенциальных участках, как правило, не приводят к существенному изменению биологической активности (см., например, -№а!коп, е! а1., МОЕЕСиЬАВ ВIО^ОСΥ ОЕ ТНЕ ΟΕΝΕ, Тке Веп)ат1п/Ситттдк РиЬ. Со., р. 224 (4|к Еййюп, 1987)).
- 15 014870
Предпочтительные примеры таких замен описаны в табл. ΙΙΙ(Α), ΙΙΙ(Β). Например, такие замены включают в себя замещение любого из изолейцина (Ι), валина (V) и лейцина (Ь) на любую другую из указанных гидрофобных аминокислот: аспарагиновой кислоты (Ό) на глутаминовую кислоту (Е), и наоборот; глутамина (0) на аспарагин (Ν), и наоборот; и серина (8) на треонин (Т), и наоборот. Другие замены также могут считаться консервативными, если это позволяет их окружение и роль в трехмерной структуре белка. Например, глицин (С) и аланин (А) часто являются взаимозаменяемыми, как и аланин (А) и валин (V). Метионин (М), который является относительно гидрофобным, как правило, можно заменить на лейцин и изолейцин, а иногда на валин. Лизин (К) и аргинин (В) часто являются взаимозаменяемыми по положениям, для которых имеет значение заряд аминокислотного остатка, но не рК. Консервативными можно считать и другие замены, в частности, в окружающей области (см., например, табл. ΙΙΙ(Α), приведенную в данном описании; р. 13-15 Вюсйетщйу, 2'1 еб. ЬиЬей 8!гуег еб. (8!ап£отб Ишуегайу); Нешко££ е! а1., ΡΝΑ8, 1992. νοί. 89, 10915-10919; Ье1 е! а1., 1. Βίο. Скет. 19 Мау, 1995; 270(20): 11882-6). Другие допустимые замены можно идентифицировать эмпирически или по аналогии с известными консервативными заменами.
Термин цитотоксическое средство относится к веществу, которое ингибирует или предотвращает экспрессионную активность клеток, функционирование клеток и/или вызывает деструкцию клеток. Подразумевается, что данный термин включает в себя радиоактивные изотопы, химиотерапевтические средства и токсины, такие как токсины с маленькими молекулами или ферментативно активные токсины бактериального, грибкового, растительного или животного происхождения, в том числе их фрагменты и/или варианты. Примеры цитотоксических средств включают в себя, без ограничения, ауристатины, ауристатин е, ауромицины, маутанзиноиды, иттрий, висмут, рицин, А-цепь рицина, комбрестатин, дуокармицины, долостатины, доксорубицин, даунорубицин, таксол, цисплатин, сс1065, бромид этидия, митомицин, этопозид, тенопозид, винкристин, винбластин, колхицин, дигидроксиантрациндион, актиномицин, дифтерийный токсин, экзотоксин Ркеиботопак (РЕ) А, РЕ40, абрин, А-цепь абрина, А-цепь модексина, альфа-сарцин, гелонин, митогеллин, ретстриктоцин, феномицин, эномицин, курицин, кротин, каличемицин, ингибитор 8араопаг1а оШстаБк, глюкокортикоиды и другие химиотерапевтические средства, а также радиоактивные изотопы, такие как 211Αΐ, 131Ι, 125Ι, 90Υ, 186Ве, 188Ве, 1538т, 212 или 213Βί, 32р и радиоактивные изотопы Ьи, в том числе 177Ьи. К антителам также можно присоединить фермент, активирующий пролекарственную форму противоракого средства, который способен превращать пролекарство в активную форму.
В данном описании термин диантитела относится к маленьким фрагментам антител с двумя антигенсвязывающими участками, данные фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи (νΗ), соединенный с вариабельным доменом легкой цепи (νθ в одной полипептидной цепи (νΗ-νθ. Путем применения линкера, который является слишком коротким, чтобы позволить спариваться двум доменам на одной цепи, домены вынуждают спариваться с комплементарными доменами другой цепи с образованием двух антигенсвязывающих участков. Более подробно диантитела описаны, например, в ЕР 404097; АО 93/11161 и НоШпдет е! а1., Ргос. Ναίί. Αсаб. 8с1. υ8Α, 90: 6444-48 (1993).
Термин генный продукт в данном описании обозначает пептид/белок или мРНК. Например, термин генный продукт согласно изобретению в данном описании иногда относится к раковой аминокислотной последовательности, раковому белку, белку злокачественного заболевания, приведенного в табл. Ι, раковой мРНК, мРНК злокачественного заболевания, приведенного в табл. Ι и др. В одном воплощении раковый белок кодируется нуклеиновой кислотой, приведенной на фиг. 2. Раковый белок может представлять собой фрагмент или, альтернативно, полноразмерный белок, кодируемый нуклеиновыми кислотами фиг. 2. В одном воплощении раковую аминокислотную последовательность используют для определения идентичности или подобия последовательностей. В другом воплощении последовательности представляют собой природные аллельные варианты белка, кодируемого нуклеиновой кислотой, приведенной на фиг. 2. В следующем воплощении последовательности представляют собой варианты последовательностей, как описано в данном документе ниже.
В способах и композициях согласно изобретению можно использовать гетероконъюгатные антитела. В данном описании термин гетероконъюгатное антитело относится к двум ковалентно связанным антителам. Такие антитела можно получить с помощью известных способов белкового синтеза, в том числе путем использования сшивающих агентов. См., например, патент США № 4676980.
Способы проведения высокопроизводительного скрининга с целью определения присутствия, отсутствия количества или других характеристик конкретных нуклеиновых кислот или белковых продуктов хорошо известны специалистам в данной области. Подобным образом, хорошо извстны способы проведения анализов связывания и анализов репортерных генов. Так, например, патент США № 5559410 раскрывает способы проведения высокопроизводительного скрининга белков; патент США № 5585639 раскрывает способы проведения высокопроизводительного скрининга связывания нуклеиновых кислот (т.е. в массивах); а патенты США № 5576220 и 5541061 раскрывают способы проведения высокопроизводительного скрининга на связывание лиганд/антитело.
- 16 014870
Кроме того, существуют коммерческие системы высокопроизводительного скрининга (см., например, Атегайат Вю8е1еиее8, Р18еа1атау, N1; 2утатк Согр., Норкш!ои, МА; Αίτ Тее11шеа1 1п6и51г1С5. Меи!ог, ОН; Веектаи 1и8!гитеи!8, 1ие. РиНейои, СА; Ргееыоп 8у8!ет8, 1ие., №йек, МА; е!е.). Как правило, в данных системах автоматизированы все процедуры, в том числе отмеривание пипетками всех образцов и реагентов, распределение жидкостей, инкубации в течение заданного времени и конечное считывание микропланшета в детекторе, используемом в данном анализе. Данные настраиваемые системы обеспечивают высокую пропускную способность, быстрый запуск и высокую степень приспособляемости и удовлетворения требований потребителя. Производители таких систем предоставляют подробные инструкции для разных систем с высокой пропускной способностью. Так, например, Ζ\τη;πΊ< Согр. предлагает технические бюллетени, описывающие системы скрининга с детекцией модуляции транскрипции генов, связывания лиганда и т.п.
Термин гомолог относится к молекуле, которая гомологична другой молекуле, т.е. такие молекулы имеют последовательности химических остатков, совпадающие или подобные по соответствующим положениям.
В одном воплощении антитело, предлагаемое в данном описании, представляет собой человеческое антитело. В данном описании термин человеческое антитело относится к антителу, в котором практически все последовательности легких и тяжелых цепей, включая гипервариабельные участки (СЭКя), кодируются человеческими генами. В одном воплощении для получения человеческих моноклональных антител используют триомы, человеческие В-клетки (см., например, КохЬог, е! а1., 1ттиио1. Тобау, 4: 72 (1983)), трансформацию ЕВУ (см., например, Со1е е! а1. МОNОС^ОNΑ^ ΑNТIВО^IΕ8 ΑN^ ΤΆΝΤΈΡ ТНЕКАРУ, 77-96 (1985)) или фаговые дисплеи (см., например, Магк8 е! а1., 1. Мо1. Вю1. 222: 581 (1991)). В отдельном воплощении человеческое антитело получают в трансгенной мыши. Можно использовать любые известные в данной области способы получения таких частично или полностью человеческих антител. В соответствии с особо предпочтительным воплощением последовательности полностью человеческого антитела получают в трансгенной мыши, несущей гены тяжелой и легкой цепей человеческого антитела. Примеры способов получения трансгенных мышей и их потомства, продуцирующих человеческие антитела, можно найти в заявке № XVО 02/43478 и патенте США № 6657103 (АЬдешх). В-клетки трансгенных мышей, продуцирующие целевое антитело, затем можно гибридизовать с получением гибридомных клеточных линий, непрерывно продуцирующих антитело (см., например, патенты США № 5569825; 5625126; 5633425; 5661016 и 5545806; 1акоЬоуЙ8, А6у. Όιυ§ Ое1. Неу. 31: 3342 (1998); Стееи, е! а1., 1. Ехр. Меб. 188: 483-95 (1998)).
Человеческий лейкоцитарный антиген, или НЬА представляет собой человеческий белок главного комплекса гистосовместимости (МНС) класса I или класса II (см., например, 8!йе8, е! а1., 1ММШОЬО6У, 84Ь ΕΌ., Ьаи§е РиЫМшщ Ьо8 А1!о8, СА (1994)).
В данном описании термин гуманизированное антитело относится к формам антител, которые содержат последовательности не человеческих (например, мышиных) и человеческих антител. Такие антитела представляют собой химерные антитела, которые содержат минимальную последовательность не человеческого иммуноглобулина. В большинстве случаев гуманизированное антитело содержит, по существу, полностью по меньшей мере один, как правило, два вариабельных доменов, в которых все или почти все гипервариабельные петли относятся к не человеческому иммуноглобулину, а все или почти все участки ЕН представляют собой последовательности человеческого иммуноглобулина. Гуманизированное антитело также необязательно содержит по меньшей мере часть константного участка (Ее) иммуноглобулина, обычно человеческого иммуноглобулина. См., например, СаЬШу патент США № 4816567; Оиееп е! а1. (1989), Ргое. Νο!'1 Аеаб. 8е1. И8А 86: 10029-10033 и АКПВООУ ΕΝ6ΙΝΕΕΚ1Ν6: А РВАСТ1САБ АРРНОАСН (ОхЕотб Сш\ег8П\ Рге88, 1996).
Подразумевается, что термины гибридизовать, гибридизация, гибридизуется и т.п., используемые в применении к полинуклеотидам, относятся к традиционным условиям гибридизации, предпочтительно таким, как гибридизация в 50% формамиде/6х 88С/0,1% 8Ό8/100 мкг/мл 88-ДНК, где температура гибридизации выше 37°С, а температура промывания в 0,1 х 88С/0,1% 8Ό8 выше 55°С.
Фразы выделенный или биологически чистый относятся к веществу, которое по существу или практически не содержит компонентов, которые обычно окружают вещество в природном состоянии. Таким образом, выделенные пептиды в соответствии с данным изобретением предпочтительно не содержат веществ, обычно присутствующих в окружении пептидов 1и 8Йи. Например, полинуклеотид считают выделенным, если он практически не содержит примеси полинуклеотидов, соответствующих или комплементарных генам, отличным от генов 8ТЕАР-1, или кодирующих полипептиды, отличные от генного продукта 8ТЕАР-1 или его фрагментов. Опытный специалист может легко использовать способы выделения нуклеиновых кислот для получения выделенного полинуклеотида 8ТЕАР-1. Белок считают выделенным, если, например, с помощью физических, механических или химических методов белок 8ТЕАР-1 отделяют от компонентов клеток, обычно связанных с белком. Опытный специалист может легко использовать стандартные методы очистки для получения выделенного белка 8ТЕАР-1. Альтернативно, выделенный белок можно получить химическими методами.
- 17 014870
Подходящие метки включают в себя радионуклиды, ферменты, субстраты, кофакторы, ингибиторы, флуоресцентные фрагменты, хемилюминесцентные фрагменты, магнитные частицы и т. п. Патенты, описывающие применение таких меток, включают в себя патенты США № 3817837; 3850752; 3939350; 3996345; 4277437; 4275149 и 4366241. Кроме того, антитела, предлагаемые в настоящем описании, можно использовать в качестве антигенсвязывающего компонента флуоресцентных антител. См., например, 2еу1ии е! а1., Να! Бю1ееЬпо1. 21: 1473-79 (2003).
Термин млекопитающее относится к любому организму класса млекопитающих и включает в себя мышей, крыс, кроликов, собак, кошек, коров, лошадей и людей. В одном воплощении согласно изобретению млекопитающее представляет собой мышь. В другом воплощении согласно изобретению млекопитающее представляет собой человека.
Термины метастазирующий рак простаты и метастазирующее заболевание относятся к раку простаты, распространившемуся в региональные лимфатические узлы или в отдаленные участки организма, и включает в себя заболевание стадии Ό по системе АИА и заболевание стадии Ψ/Ν/Μ+ по системе ΊΝΜ. Как и в случае с местно распространенным раком простаты, для пациентов с метастазирующим заболеванием хирургическая операция не рекомендуется, а предпочтительным способом лечения является гормональная (антиандрогенная) терапия. У пациентов с метастазирующим раком простаты с течением времени, через 12-18 месяцев после начала лечения, развивается андроген-устойчивое состояние. Приблизительно половина таких андроген-устойчивых пациентов умирает в течение 6 месяцев после развития данного состояния. Чаще всего рак простаты метастазирует в кости. Костные метастазы рака простаты чаще являются остеобластными, чем остеолитическими (т. е. приводят к образованию костей с сетчатой структурой). Костные метастазы чаще всего можно обнаружить в позвоночнике, затем в бедренной кости, тазовых костях, грудной клетке, черепе и плечевой кости. Другие распространенные участки метастазирования включают в себя лимфатические узлы, легкие, печень и мозг. Метастазирующий рак простаты обычно диагностируют путем открытия или лапароскопического иссечения тазовых лимфатичских узлов, радионуклидного анализа целой крови, радиографического исследования скелета и/или биопсии патологического изменения кости.
Термины модулятор, или тестируемое соединение, или лекарственное средство-кандидат, или используемые в данном описании грамматические эквиваленты относятся к любой молекуле, например белку, олигопептиду, маленькой органической молекуле, полисахариду, полинуклеотиду и т.п., тестируемым на способность непосредственно или косвенно изменять раковый фенотип, или экспрессию раковых последовательностей, например последовательностей нуклеиновых кислот или белков, или эффекты раковых последовательностей (например, сигнальные эффекты, экспрессию генов, взаимодействие белков и др.). В одном аспекте модулятор нейтрализует эффект ракового белка согласно изобретению. Нейтрализация означает ингибирование или блокировку активности белка, наряду с последующим эффектом на клетку. В другом аспекте модулятор нейтрализует эффект гена и соответствующего ему белка согласно изобретению путем нормализации уровней указанного белка. В предпочтительных воплощениях модуляторы изменяют профили экспрессии или профиль экспрессии нуклеиновых кислот или белков, предлагаемых в данном описании, или пути, лежащие ниже эффектора. В одном воплощении модулятор подавляет раковый фенотип, например, до нормальных характеристик ткани. В другом воплощении модулятор индуцирует раковый фенотип. Обычно несколько аналитических смесей анализируют в параллелях с разными концентрациями средства с получением разных ответов на разные концентрации. Как правило, одна из данных концентраций служит отрицательным контролем, т.е. нулевой концентрацией или концентрацией, вызывающей эффект ниже уровня детектирования.
Модуляторы, лекарственные средства-кандидаты или тестируемые соединения охватывают разные классы химических соединений, однако обычно они представляют собой органические молекулы, предпочтительно маленькие органические соединения, имеющие молекулярную массу более 100 и менее чем приблизительно 2500 Да. Предпочтительные маленькие молекулы имеют молекулярную массу меньше 2000, меньше 1500 или меньше 1000 или 500 Да. Средства-кондидаты содержат функциональные группы, необходимые для структурного взаимодействия с белками, в особенности способные образовывать водородные связи, и обычно включают в себя, по меньшей мере, аминовую, карбонильную, гидроксильную или карбоксильную группу, предпочтительно, они содержат две функциональные химические группы. Средства-кандидаты часто содержат циклический атом углерода или гетероциклические структуры и/или ароматические или полиароматические структуры, замещенные одной или несколькими из вышеуказанных функциональных групп. Модуляторы также включают в себя такие биомолекулы, как пептиды, сахариды, жирные кислоты, стероиды, пурины, пиримидины, их производные, структурные аналоги или сочетания. Особенно предпочтительными молекулами являются пептиды. Одним классом модуляторов являются пептиды, например, содержащие приблизительно от 5 до 35 аминокислот, предпочтительно приблизительно от 5 до 20 аминокислот, особенно предпочтительно приблизительно от 7 до 15 аминокислот. Предпочтительно раковый модуляторный белок является растворимым, содержит участок, отличный от трансмембранного, и/или содержит Ν-концевой Сук, повышающий растворимость. В одном воплощении С-конец фрагмента держат в виде свободной кислоты, а Ν-конец - в виде свободного амина, чтобы обеспечить конденсацию, например, с цистеином. В одном воплощении раковый белок согласно
- 18 014870 изобретению конъюгируют с иммуногенным агентом, как описано в данном документе. В одном воплощении раковый белок конъюгируют с БСА. Пептиды согласно изобретению, например, имеющие предпочтительную длину, можно соединить друг с другом или с другой аминокислотой с получением более длинного пептида/белка. Модуляторные пептиды могут представлять собой продукты расщепления природных белков, как указано выше, рандомизированные пептиды или пептиды, рандомизированные с отклонением. В предпочтительном воплощении пептидные/белковые модуляторы представляют собой антитела и их фрагменты, определенные в данном описании.
Модуляторами злокачественного заболевания также могут быть нуклеиновые кислоты. Нуклеиновые модулирующие средства могут представлять собой природные нуклеиновые кислоты, рандомизированные нуклеиновые кислоты или нуклеиновые кислоты, рандомизированные с отклонением. Например, в подходе, аналогичном описанному выше для белков, можно использовать продукты расщепления прокариотических или эукариотических геномов.
В данном описании термин моноклональное антитело относится к антителу, полученному из популяции, по существу, гомогенных антител, т. е. отдельные антитела, составляющие популяцию, являются идентичными, за исключением возможных природных мутаций, которые могут присутствовать в минорных количествах. Моноклональные антитела являются высокоспецифичными по отношению к одному антигенному эпитопу. Наоборот, препараты традиционных (поликлональных) антител, как правило, включают в себя множество антител, направленных против разных эпитопов (или специфичных по отношению к разным эпитопам). В одном воплощении поликлональные антитела включают в себя совокупность моноклональных антител, обладающих специфичностью, аффинностью или авидностью по отношению к разным эпитопам в одном антигене, который содержит несколько антигенных эпитопов. Определение моноклональный указывает на характер антитела, полученного из практически гомогенной популяции антител, и не подразумевает получение антитела каким-либо конкретным способом. Например, моноклональные антитела, используемые в соответствии с настоящим изобретением, могут быть получены гибридомным методом, впервые описанным КоЫет е! а1., №1игс. 256: 495 (1975), или методами рекомбинантных ДНК (см., например, патент США № 4816567). Моноклональные антитела также могут быть выделены из фаговых библиотек антител с помощью методов, описанных, например, в Оаекхоп е! а1., Ма!иге, 352: 624-628 (1991) и Маткк е! а1., 1. Мо1. Бю1. 222: 581-597 (1991). К,| связывания указанных моноклональных антител составляет по меньшей мере приблизительно 1 мкМ, чаще по меньшей мере приблизительно 300 нМ, как правило, по меньшей мере приблизительно 30 нМ, предпочтительно по меньшей мере приблизительно 10 нМ, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 3 нМ или менее и обычно определяется методом ЕЫ8А.
Термин мотив, например биологический мотив белка, родственного 8ТЕАР-1, относится к любой образованной аминокислотами части первичной последовательности белка, которая связана с конкретной функцией (например, белок-белковым взаимодействием, взаимодействием белок-ДНК и др.), или модификацией (например, фосфорилированная, гликозилированная или амидированная часть), или локализацией (например, секреторная последовательность, последовательность ядерной локализации и др.), или к последовательности, связанной с иммунными функциями, либо гуморальными, либо клеточными. Мотив может быть либо смежным с некоторыми положениями, коррелирующими с определенной функцией или определенным свойством, либо совпадать с такими положениями. В контексте мотивов НЬА данный термин относится к совокупности остатков в пептиде определенной длины, как правило, содержащем приблизительно от 8 до 13 аминокислот в случае мотива НЬА класса I и приблизительно от 6 до 25 аминокислот в случае мотива НЬА класса II, которая распознается конкретной молекулой НЬА. Пептидные мотивы для связывания НЬА обычно различаются в белках, кодируемых разными аллелями человеческого НЬА, и различаются по совокупности первичных и вторичных анкорных остатков.
Термин фармацевтический наполнитель включает в себя такие вещества, как вспомогательные средства, носитель, средства, регулирующие рН, и забуферивающие средства, средства, регулирующие тоничность, увлажняющие средства, консерванты и т.п.
Термин фармацевтически приемлемый относится к нетоксичной и/или инертной композиции, физиологически совместимой с людьми или другими млекопитающими.
Термин полинуклеотид относится к полимерной форме нуклеотидов длиной по меньшей мере в 10 оснований или пар оснований, либо рибонуклеотидов, либо дезоксинуклеотидов, либо модифицированных нуклеотидов любого типа, подразумевается, что данный термин включает в себя одно- или двухцепочечные формы ДНК и/или РНК. В данной области указанный термин часто используется как взаимозаменяемый с термином олигонуклеотид. Полинуклеотид может содержать нуклеотидную последовательность, раскрытую в данном описании, где тимидин (Т), как показано, например, на фиг. 2, может быть заменен на урацил (И); данное определение связано с различиями в химических структурах ДНК и РНК, в особенности относится к тому, что одним из четырех доминирующих оснований в РНК является урацил (И), вместо которого в ДНК присутствует тимидин (Т).
- 19 014870
Термин полипептид относится к полимеру, содержащему по меньшей мере приблизительно 4, 5, 6, 7 или 8 аминокислот. В данном описании для обозначения аминокислот используют стандартные трехбуквенные или однобуквенные символы. В данной области указанный термин часто используется как взаимозаменяемый с терминами пептид или белок.
Первичный анкорный остаток НЬА представляет собой аминокислоту в конкретном положении пептидной последовательности, которая, как полагают, участвует в образовании точки контакта между иммуногенным пептидом и молекулой НЬА. От одного до трех, как правило два, первичных анкорных остатковв пептиде определенной длины обычно образуют мотив иммуногенного пептида. Полагают, что данные остатки находятся в тесном контакте с пептидсвязывающей бороздкой молекулы НЬА, причем их боковые цепи погружены в специфические карманы связывающей бороздки. В одном воплощении, например, первичные анкорные остатки молекулы НЬА класса I расположены в положении 2 (с аминоконца), а с карбоксильной стороны - в положениях 8, 9, 10, 11 или 12 пептидного эпитопа в соответствии с данным изобретением. Альтернативно, в другом воплощении первичные анкорные отатки пептида, связывающие молекулу НЬА класса II, отдалены в пространстве друг от друга в большей степени, чем от концов пептида, где длина пептида обычно составляет по меньшей мере 9 аминокислот. Первичные анкорные положения для каждого мотива и супермотива приведены в табл. 1У(А). Например, аналоговые пептиды можно создать путем изменения присутствия или отсутствия конкретных остатков в первичных и/или вторичных анкорных положениях, приведенных в табл. IV. Такие аналоги используют для модуляции связывающего сродства и/или установления популяционного распределения пептида, содержащего конкретный мотив или супермотив НЬА.
Радиоактивные изотопы включают в себя, без ограничения, нижеследующие неограничивающие примеры применения, которые приведены в табл. ЩЦ).
Под термином рандомизированный или его грамматическими эквивалентами в данном описании понимают нуклеиновые кислоты и белки, состоящие, по существу, из случайных нуклеотидов и аминокислот соответственно. Данные рандомизированные пептиды (или нуклеиновые кислоты, описанные в данном документе) в каждом положении могут содержать любой нуклеотид или любую аминокислоту. Можно разработать способ синтеза рандомизированных белков или нуклеиновых кислот, содержащих все или почти все возможные сочетания по всей длине последовательности, с получением библиотеки рандомизированных биологически активных белковых средств-кандидатов.
В одном воплощении библиотека является полностью рандомизированной и не имеет последовательностей отнесения или постоянных элементов в каком-либо положении. В другом воплощении библиотека представляет собой библиотеку, рандомизированную с отклонением. То есть некоторые положения в последовательности либо оставляют постоянными, либо выбирают из ограниченного числа вариантов. Например, нуклеотидные или аминокислотные остатки рандомизируют в пределах определенного класса, например гидрофобных аминокислот, гидрофильных остатков, стерически отклоняющихся (либо маленьких, либо больших) остатков, для создания доменов, связывающих нуклеиновые кислоты, для введения остатков цистеина, для образования поперечных связей, для введения остатков пролина в домены 8Н-3, остатков серина, треонина, тирозина или гистидина в участки фосфорилирования и др., или в пределах класса пуринов и др.
Рекомбинантная молекула ДНК или РНК представляет собой молекулу ДНК или РНК, полученную в результате молекулярных манипуляций ίη νίΙΐΌ.
В данном описании термин одноцепочечный Εν или ксЕу, или одноцепочечное антитело относится к фрагментам антитела, содержащим домены антитела ν4 и ν^ где указанные домены находятся на одной полипептидной цепи. Обычно полипептид Εν содержит также полипептидный линкер между доменами V и который позволяет 5ску образовывать структуру, необходимую для связывания антигена. Обзор по ксБу см. в Р1искШип, ТНЕ РНАКМАСОЕОСУ ΟΕ МΟNΟС^ΟNЛ^ АКПВОПШЗ, то1. 113, ВокепЬитд апб Мооге ебк. 8рппдег^ег1ад, №\ν Уотк, р. 269-315 (1994).
Неограничивающие примеры маленьких молекул включают в себя соединения, которые связывают 8ТЕАР-1 или взаимодействуют с ним, лиганды, в том числе гормоны, нейропептиды, хемокины, отдушки, фосфолипиды и их функциональные эквиваленты, которые связывают и предпочтительно ингибируют белковую функцию 8ТЕАР-1. Такие маленькие молекулы, без ограничения, предпочтительно имеют молекулярную массу менее чем приблизительно 10 кДа, более предпочтительно менее чем приблизительно 9, приблизительно 8, приблизительно 7, приблизительно 6, приблизительно 5 или приблизительно 4 кДа. В некоторых воплощениях маленькие молекулы физически связаны с белком 8ТЕАР-1 или связывают данный белок; не обнаружены в природных метаболических путях и/или лучше растворяются в водных, чем в неводных растворах.
В данном описании термин специфический относится к селективному связыванию антитела с целевым антигенным эпитопом. Специфичность связывания антител можно анализировать путем сравнения связывания с целевым антигеном со связыванием с другим антигеном или смесью антигенов в заданной комбинации условий. Если антитело связывается с целевым антигеном по меньшей мере в 2, 5, 7 и предпочтительно в 10 раз лучше, чем с другим антигеном или смесью антигенов, то оно считается специфическим. В одном воплощении специфическое антитело представляет собой антитело, которое свя
- 20 014870 зывает только антиген 8ТЕАР-1, но не связывает другие антигены. В другом воплощении специфическое антитело представляет собой антитело, которое связывает человеческий антиген 8ТЕАР-1, но не связывает антиген 8ТЕАР-1, отличный от человеческого и обладающий 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более аминокислотной гомологией с антигеном 8ТЕАР-1. В другом воплощении специфическое антитело представляет собой антитело, которое связывает человеческий антиген 8ТЕАР-1 и связывает мышиный антиген 8ТЕАР-1, но в большей степени оно связывает человеческий антиген. В другом воплощении специфическое антитело представляет собой антитело, которое связывает человеческий антиген 8ТЕАР-1 и антиген 8ТЕАР-1 приматов, но в большей степени оно связывает человеческий антиген. В следующем воплощении специфическое антитело связывает человеческий антиген 8ТЕАР-1 и любой отличный от человеческого антиген 8ТЕАР-1 или любое их сочетание, но в большей степени оно связывает человеческий антиген.
Жесткость гибридизации легко определяется рядовым специалистом в данной области и, как правило, эмпирически рассчитывается в зависимости от длины зонда, температуры промывания и концентрации соли. Как правило, для соответствующего отжига более длинных зондов требуется более высокая температура, тогда как более короткие зонды требуют более низких температур. Как правило, гибридизация зависит от способности денатурированных последовательностей нуклеиновых кислот к повторному отжигу, если комплементарные цепи присутствуют в среде при температуре ниже точки плавления. Чем выше степень желаемой гомологии между зондом и гибридизующейся с ним последовательностью, тем выше относительная температура, которую можно использовать. Следовательно, более высокая относительная температура может делать условия реакции более жесткими, а более низкая температура менее жесткими. Дополнительные подробности и разъяснения, касающиеся жесткости реакций гибридизации, можно найти в Аи8иЬе1 е! а1., Сиггеи! Рго!осок ίη Мо1еси1аг Вю1оду, ^йеу 1и!ег8С1еисе РиЬ118Йег8, (1995).
Условия жесткости или условия высокой жесткости, как описано в данном документе, включают в себя, без ограничения, следующие:
(1) применение низкой ионной силы и высокой температуры для промывания, например, 0,015 М хлорид натрия/0,0015 М цитрат натрия/0,1% додецилсульфат натрия при 50°С;
(2) применение в процессе гибридизации денатурирующего средства, такого как формамид, например 50% (об./об.) формамид и 0,1% бычий сывороточный альбумин/0,1% фиколл/0,1% поливинилпирролидон/50 мМ натрий-фосфатный буфер, рН 6,5, содержащий 750 мМ хлорид натрия, 75 мМ цитрат натрия, при 42°С или (3) применение 50% формамида, 5х 88С (0,75 М ЫаС1, 0,075 М цитрат натрия), 50 мМ фосфата натрия (рН 6,8), 0,1% пирофосфата натрия, 5х раствора Денхардта, ДНК спермы лосося, обработанной ультразвуком (50 мкг/мл), 0,1% 8И8 и 10% сульфата декстрана при 42°С с промыванием при 42°С в 0,2х 88С (хлорид натрия/цитрат натрия) и 50% формамиде при 55°С и затем с промыванием в условиях высокой жесткости, включающих в себя применение 0,1х 88С, содержащей ЕИТА, при 55°С. Условия средней жесткости описаны, например, в 8атЬгоок е! а1., Мо1еси1аг С1ошид: А ЬаЬога!огу Маииа1, Νονν Уогк: Со1б 8рпид НагЬог Рге§8, 1989 и включают в себя применение раствора для промывания и условий гибридизации (например, температуры, ионной силы и % 8Ό8), менее жестких, чем описанные выше. Примером условий средней жесткости является инкубация в течение ночи при 65°С в растворе, содержащем 1% бычий сывороточный альбумин, 0,5 М фосфат натрия, рН 7,5, 1,25 мМ ЕИТА и 7% 8Ό8 5х 88С (150 мМ ЫаС1, 15 мМ трицитрат натрия), с последующим промыванием фильтров в 2х 88С/1% 8Ό8 при 50°С и 0,2х 88С/0,1% 8Ό8 при 50°С. Специалисту в данной области известно, как выбрать температуру, ионную силу и др. в зависимости от таких факторов, как длина зонда и т. п.
Супермотив НЬА представляет собой пептидсвязывающий специфичный участок, общий для молекул НЬА, кодируемых двумя или более аллелями НЬА. Общая частота фенотипической встречаемости НЬА в разных этнических популяциях приведена в табл. 1У(Р). Разные супертипы включают в себя, без ограничения, следующие разновидности:
А2: А*0201, А*0202, А*0203, А*0204, А*0205, А*0206,
А*6802, А*6901, А*0207
АЗ: АЗ, АН, А31, А*3301, А*6801, А*0301, А*1101, А*3101
В7: В7, Β+3Β01-03, В*51, В*5301, В*5401, В*5501, В*5502,
В*5601, В*6701, В*7801, В*0702, В*5101, В*5бО2
В44: В*3701, В*4402, В*4403, В*50(В*4001), В61 (В*4006)
А1: А*0102, А*2604, А*3601, А*43О1, А*8001
А24: А*24, А*30, А*2403, А*2404, А*3002, А*3003
В27: В*1401-02, В*1503, В*1509, В*1510, В*1518, В*3801-02,
В*3901, В*3902, В*3903-04, В*4801-02, В*73О1, В*2701~08
В58 ·. В*151б, В*1517, В*5701, В*5702, В58
В62: В*4601, В52, В*1501 (В62), В*1502 (В75), В*1513 (В77)
- 21 014870
Рассчитанное популяционное распределение разных сочетаний супертипов НЬА приведено в табл. 1У(6).
В данном описании термины лечить или терапевтический, а также грамматически родственные им термины относятся к какому-либо улучшению любого последствия заболевания, такому как повышение выживаемости, уменьшение процента смертности и/или уменьшение побочных эффектов, свойственных альтернативным терапевтическим средствам; специалистам в данной области известно, что полное излечение заболевания является предпочтительным, но не обязательным требованием для акта лечения.
Трансгенное животное (например, мышь или крыса) представляет собой животное, несущее клетки, содержащие трансген, который вводят животному или его предку в пренатальном периоде, например на эмбриональной стадии. Трансген представляет собой ДНК, интегрированную в геном клетки, из которой развивается трансгенное животное.
В данном описании НЬА или вакцина клеточного иммунного ответа представляет собой композицию, которая содержит или кодирует один или несколько пептидов согласно изобретению. Существует несколько воплощений таких вакцин, например смесь одного или нескольких отдельных пептидов; один или несколько пептидов согласно изобретению, содержащих полиэпитопный пептид; или нуклеиновые кислоты, которые кодируют такие отдельные пептиды или полипептиды, например мини-ген, который кодирует полиэпитопный пептид. Термин один или несколько пептидов может включать в себя любое целое число от 1 до 150 или больше, например по меньшей мере 2, 3, 4, 5, б, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 1б, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 2б, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, Зб, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 4б, 47, 48, 49, 50, 55, б0, б5, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145 или 150, пептидов согласно изобретению. Пептиды или полипептиды, необязательно, можно модифицировать, например, путем липидизации, добавления меток или других последовательностей. Пептиды НЬА класса I согласно изобретению можно смешать или связать с пептидами НЬА класса II, чтобы обеспечить активацию как цитотоксических, так и хелперных Т-лимфоцитов. НЬА вакцины также могут содержать сенсибилизированные пептидом клетки, экспонирующие антиген, например дендритные клетки.
Термин вариант относится к молекуле, которая отличается от описываемого или нормального типа, такой как белок, который содержит один или несколько других аминокислотных остатков в соответствующем положении (соответствующих положениях) конкретно описываемого белка (например, белка δТЕАР-1, приведенного на фиг. 2 или 3). Аналог является примером вариантного белка. Другими примерами вариантов являются изоформы, образующиеся в результате сплайсинга и полиморфизма отдельных нуклеотидов (δΝΈ).
'ЪТЕАР-1-родственные белки согласно изобретению включают в себя белки, конкретно описанные в данном документе, а также их аллельные варианты, варианты, содержащие консервативные замены, аналоги и гомологи, которые могут быть выделены/получены и охарактеризованы без проведения излишних экспериментов с помощью способов, описанных в данном документе или хорошо известных в данной области. В объем изобретения также входят гибридные белки, в которых объединены части разных белков или их фрагментов, а также гибридные белки, состоящие из белка δТЕАР-1 и гетерологичного полипептида. Такие белки δТЕАР-1 в совокупности называют белками, родственными δТЕАР-1, белками согласно изобретению или δТЕАР-1.
Термин белок, родственный δТЕАР-1, относится к полипептидному фрагменту или белковой последовательности δТЕАР-1, содержащей 4, 5, б, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 1б, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или более аминокислот или по меньшей мере 30, 35, 40, 45, 50, 55, б0, б5, 70, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 1б0, 1б5, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 330, 335, 339 или более аминокислот.
II) Полинуклеотиды δТЕАР-1.
В одном аспекте данное изобретение предлагает полинуклеотиды, соответствующие или комплементарные полноразмерным гену, мРНК и/или кодирующей последовательности δТЕАР-1 или их части, предпочтительно в выделенном виде, в том числе полинуклеотиды, кодирующие белок, родственный δТЕАР-1, и его фрагменты, ДНК, РНК, гибрид ДНК/РНК и родственные молекулы, полинуклеотиды или олигонуклеотиды, комплементарные гену δТЕАР-1 или последовательности мРНК или ее части, и полинуклеотиды или олигонуклеотиды, гибридизующиеся с геном δТЕАР-1, мРНК или с полинуклеотидом, кодирующим δТЕАР-1 (вместе их называют полинуклеотиды δТЕАР-1). Во всех случаях упоминаемый в данном разделе Т может быть заменен на и на фиг. 2.
- 22 014870
Воплощения полинуклеотида 8ТЕАР-1 включают в себя полинуклеотид 8ТЕАР-1, имеющий последовательность, изображенную на фиг. 2, причем в нуклеотидной последовательности 8ТЕАР-1, изображенной на фиг. 2, Т может обозначать И; по меньшей мере 10 смежных нуклеотидов полинуклеотида, имеющего последовательность, изображенную на фиг. 2; или по меньшей мере 10 смежных нуклеотидов полинуклеотида, имеющего последовательность, изображенную на фиг. 2, где Т может обозначать и. Например, воплощения нуклеотидов 8ТЕАР-1 включают в себя, без ограничения:
(Ι) полинуклеотид, по существу содержащий или содержащий последовательность, изображенную на фиг. 2, где Т также может обозначать И;
(ΙΙ) полинуклеотид, по существу содержащий или содержащий последовательность, изображенную на фиг. 2А, от нуклеотидного остатка номер 66 до нуклеотидного остатка номер 1085, включая стопкодон, где Т также может обозначать И;
(ΙΙΙ) полинуклеотид, по существу содержащий или содержащий последовательность, изображенную на фиг. 2В, от нуклеотидного остатка номер 96 до нуклеотидного остатка номер 872, включая стопкодон, где Т также может обозначать И;
(IV) полинуклеотид, по существу содержащий или содержащий последовательность, изображенную на фиг. 2С, от нуклеотидного остатка номер 96 до нуклеотидного остатка номер 944, включая стопкодон, где Т также может обозначать И;
(V) полинуклеотид, по существу содержащий или содержащий последовательность, изображенную на фиг. 2Ό, от нуклеотидного остатка номер 96 до нуклеотидного остатка номер 872, включая стопкодон, где Т также может обозначать И;
(VI) полинуклеотид, по существу содержащий или содержащий последовательность, изображенную на фиг. 2Е, от нуклеотидного остатка номер 96 до нуклеотидного остатка номер 872, включая стопкодон, где Т также может обозначать И;
(VII) полинуклеотид, по существу содержащий или содержащий последовательность, изображенную на фиг. 2Е, от нуклеотидного остатка номер 96 до нуклеотидного остатка номер 872, включая стопкодон, где Т также может обозначать И;
(VIII) полинуклеотид, по существу содержащий или содержащий последовательность, изображенную на фиг. 2С. от нуклеотидного остатка номер 96 до нуклеотидного остатка номер 872, включая стопкодон, где Т также может обозначать И;
(IX) полинуклеотид, по существу содержащий или содержащий последовательность, изображенную на фиг. 2Н, от нуклеотидного остатка номер 96 до нуклеотидного остатка номер 872, включая стопкодон, где Т также может обозначать И;
(X) полинуклеотид, по существу содержащий или содержащий последовательность, изображенную на фиг. 2ф от нуклеотидного остатка номер 96 до нуклеотидного остатка номер 872, включая стоп-кодон, где Т также может обозначать И;
(XI) полинуклеотид, по существу содержащий или содержащий последовательность, изображенную на фиг. 21, от нуклеотидного остатка номер 96 до нуклеотидного остатка номер 872, включая стоп-кодон, где Т также может обозначать И;
(XII) полинуклеотид, по существу содержащий или содержащий последовательность, изображенную на фиг. 2К, от нуклеотидного остатка номер 96 до нуклеотидного остатка номер 872, включая стопкодон, где Т также может обозначать И;
(XIII) полинуклеотид, по существу содержащий или содержащий последовательность, изображенную на фиг. 2Ь, от нуклеотидного остатка номер 96 до нуклеотидного остатка номер 872, включая стопкодон, где Т также может обозначать И;
(XIV) полинуклеотид, по существу содержащий или содержащий последовательность, изображенную на фиг. 2М, от нуклеотидного остатка номер 96 до нуклеотидного остатка номер 872, включая стопкодон, где Т также может обозначать И;
(XV) полинуклеотид, по существу содержащий или содержащий последовательность, изображенную на фиг. 2Ν, от нуклеотидного остатка номер 96 до нуклеотидного остатка номер 872, включая стопкодон, где Т также может обозначать И;
(XVI) полинуклеотид, по существу содержащий или содержащий последовательность, изображенную на фиг. 20, от нуклеотидного остатка номер 96 до нуклеотидного остатка номер 872, включая стопкодон, где Т также может обозначать И;
(XVII) полинуклеотид, по существу содержащий или содержащий последовательность, изображенную на фиг. 2Р, от нуклеотидного остатка номер 96 до нуклеотидного остатка номер 872, включая стопкодон, где Т также может обозначать И;
(XVIII) полинуклеотид, по существу содержащий или содержащий последовательность, изображенную на фиг. 2р, от нуклеотидного остатка номер 96 до нуклеотидного остатка номер 872, включая стоп-кодон, где Т также может обозначать И;
(XIX) полинуклеотид, кодирующий белок, родственный 8ТЕАР-1, который по меньшей мере на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% гомологичен полноразмерной аминокислотной последовательности, изображенной на фиг. 2А-2О;
- 23 014870 (XX) полинуклеотид, кодирующий белок, родственный 8ТЕАР-1, который по меньшей мере на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичен полноразмерной аминокислотной последовательности, изображенной на фиг. 2А-2О;
(XXI) полинуклеотид, кодирующий по меньшей мере один из пептидов, приведенных в табл. ^КУШ и XXII-^I. как описано в патентной заявке США 10/236878, поданной 6 сентября 2002 г., конкретное содержание которой полностью включено в данное описание в качестве ссылки;
(XXII) полинуклеотид, кодирующий пептидный участок, состоящий по меньшей мере из 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 аминокислот пептида фиг. 3А с любым целочисленным приращением вплоть до 339, который содержит по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 аминокислотных положений со значением больше 0,5 по профилю гидрофильности, приведенному на фиг. 5;
(XXIII) полинуклеотид, кодирующий пептидный участок, состоящий по меньшей мере из 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 аминокислот пептида фиг. 3А с любым целочисленным приращением вплоть до 339, который содержит 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 аминокислотных положений со значением меньше 0,5 по профилю гидрофобности, приведенному на фиг. 6;
(XXIV) полинуклеотид, кодирующий пептидный участок, состоящий по меньшей мере из 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 аминокислот пептида фиг. 3А с любым целочисленным приращением вплоть до 339, который содержит 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 аминокислотных положений со значением больше 0,5 по профилю процента доступных остатков, приведенному на фиг. 7;
(XXV) полинуклеотид, кодирующий пептидный участок, состоящий по меньшей мере из 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 аминокислот пептида фиг. 3А с любым целочисленным приращением вплоть до 399, который содержит 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 аминокислотных положений со значением больше 0,5 по профилю средней жесткости, приведенному на фиг. 8;
(XXVI) полинуклеотид, кодирующий пептидный участок, состоящий по меньшей мере из 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 аминокислот пептида фиг. 3А с любым целочисленным приращением вплоть до 339, который содержит 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 аминокислотных положений со значением больше 0,5 по профилю бета-складки, приведенному на фиг. 9;
(XXVII) полинуклеотид, кодирующий пептидный участок, состоящий по меньшей мере из 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 аминокислот пептида фиг. 3В и 3Ό с любым целочисленным приращением вплоть до 258, который содержит 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 аминокислотных положений со значением больше 0,5 по профилю гидрофильности, приведенному на фиг. 5;
(XXVIII) полинуклеотид, кодирующий пептидный участок, состоящий по меньшей мере из 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 аминокислот пептида фиг. 3В и 3Ό с любым целочисленным приращением вплоть до 258, который содержит 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 аминокислотных положений со значением меньше 0,5 по профилю гидрофобности, приведенному на фиг. 6;
(XXIX) полинуклеотид, кодирующий пептидный участок, состоящий по меньшей мере из 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 аминокислот пептида фиг. 3В и 3Ό с любым целочисленным приращением вплоть до 258, который содержит 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 аминокислотных положений со значением больше 0,5 по профилю процента доступных остатков, приведенному на фиг. 7;
(XXX) полинуклеотид, кодирующий пептидный участок, состоящий по меньшей мере из 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 аминокислот пептида фиг. 3В и 3Ό с любым целочисленным приращением вплоть до 258, который содержит 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 аминокислотных положений со значением больше 0,5 по профилю средней жесткости, приведенному на фиг. 8;
- 24 014870 (XXXI) полинуклеотид, кодирующий пептидный участок, состоящий по меньшей мере из 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 аминокислот пептида фиг. 3В и 3Ό с любым целочисленным приращением вплоть до 258, который содержит 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 аминокислотных положений со значением больше 0,5 по профилю бета-складки, приведенному на фиг. 9;
(XXXII) полинуклеотид, кодирующий пептидный участок, состоящий по меньшей мере из 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 аминокислот пептида фиг. 3С с любым целочисленным приращением вплоть до 282, который содержит 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 аминокислотных положений со значением больше 0,5 по профилю гидрофильности, приведенному на фиг. 5;
(XXXIII) полинуклеотид, кодирующий пептидный участок, состоящий по меньшей мере из 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 аминокислот пептида фиг. 3С с любым целочисленным приращением вплоть до 282, который содержит 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 аминокислотных положений со значением меньше 0,5 по профилю гидрофобности, приведенному на фиг. 6;
(XXXIV) полинуклеотид, кодирующий пептидный участок, состоящий по меньшей мере из 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 аминокислот пептида фиг. 3С с любым целочисленным приращением вплоть до 282, который содержит 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 аминокислотных положений со значением больше 0,5 по профилю процента доступных остатков, приведенному на фиг. 7;
(XXXV) полинуклеотид, кодирующий пептидный участок, состоящий по меньшей мере из 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 аминокислот пептида фиг. 3С с любым целочисленным приращением вплоть до 282, который содержит 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 аминокислотных положений со значением больше 0,5 по профилю средней жесткости, приведенному на фиг. 8;
(XXXVI) полинуклеотид, кодирующий пептидный участок, состоящий по меньшей мере из 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 аминокислот пептида фиг. 3С с любым целочисленным приращением вплоть до 282, который содержит 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 аминокислотных положений со значением больше 0,5 по профилю бета-складки, приведенному на фиг. 9;
(XXXVII) полинуклеотид, полностью комплементарный полинуклеотиду по любому из пп.(I)-(XXXVI);
(XXXVIII) полинуклеотид, полностью комплементарный полинуклеотиду по любому из пп.(I)-(XXXVII);
(XXXIX) пептид, который кодируется полинуклеотидом по любому из пп.(I)-(XXXVШ); и композиция, содержащая полинуклеотид по любому из пп.(I)-(XXXVШ) или пептид по п.(XXXIX) вместе с фармацевтическим наполнителем и/или в составе человеческой стандартной лекарственной формы;
(X^I) способ применения полинуклеотида по любому из пп.(I)-(XXXVШ), или пептида по п.(XXXIX), или композиции по п.(X^) для модуляции экспрессии 8ТЕАР-1 в клетке;
(X^II) способ применения полинуклеотида по любому из пп.(I)-(XXXVШ), или пептида по п.(XXXIX), или композиции по п.(X^) для диагностики, профилактики, прогнозирования или лечения субъекта, несущего клетку, экспрессирующую 8ТЕАР-1;
(X^III) способ применения полинуклеотида по любому из пп.(I)-(XXXVШ), или пептида по п.(XXXIX), или композиции по п.(X^) для диагностики, профилактики, прогнозирования или лечения субъекта, несущего клетку, экспрессирующую 8ТЕАР-1, где указанная клетка относится к раковой ткани, приведенной в табл. I;
(X^IV) способ применения полинуклеотида по любому из пп.(I)-(XXXVШ), или пептида по п.(XXXIX), или композиции по п.(X^) для диагностики, профилактики, прогнозирования или лечения рака;
(X^V) способ применения полинуклеотида по любому из пп.(I)-(XXXVШ), или пептида по п.(XXXIX), или композиции по п.(X^) для диагностики, профилактики, прогнозирования или лечения рака ткани, приведенной в табл. I; и (X^VI) способ применения полинуклеотида по любому из пп.(I)-(XXXVШ), или пептида по п.(XXXIX), или композиции по п.(X^) для идентификации или характеристики модулятора экспрессии 8ТЕАР-1 в клетке.
- 25 014870
В данном описании подразумевается, что интервал конкретно включает в себя все находящиеся внутри него целочисленные значения.
Типичные воплощения согласно изобретению, раскрытые в данном описании, включают в себя полинуклеотиды 8ТЕАР-1, которые кодируют конкретные фрагменты последовательностей мРНК δТЕАР-1 (а также полинуклеотиды, комплементарные таким последовательностям), такие как полинуклеотиды, кодирующие, например, нижеследующие белки и/или их фрагменты: 4, 5, б, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 1б, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, б0, б5, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 1б0, 1б5, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 330, 335, 339 или больше смежных аминокислот δТЕАР-1, вариант 1; другие варианты имеют следующую максимальную длину: вариант 2 - 258 аминокислот; вариант 3 - 282 аминокислот и вариант 4 - 258 аминокислот.
Например, типичные воплощения согласно изобретению, раскрытые в данном описании, включают в себя полинуклеотиды и кодируемые ими пептиды, полинуклеотиды, кодирующие фрагменты приблизительно от аминокислоты 1 до аминокислоты 10 белка δТЕАР-1, изображенного на фиг. 2 или 3; полинуклеотиды, кодирующие фрагменты приблизительно от аминокислоты 10 до аминокислоты 20 белка δТЕАР-1, изображенного на фиг. 2 или 3; полинуклеотиды, кодирующие фрагменты приблизительно от аминокислоты 20 до аминокислоты 30 белка δТЕАР-1, изображенного на фиг. 2 или 3, полинуклеотиды, кодирующие фрагменты приблизительно от аминокислоты 30 до аминокислоты 40 белка δТЕАР-1, изображенного на фиг. 2 или 3; полинуклеотиды, кодирующие фрагменты приблизительно от аминокислоты 40 до аминокислоты 50 белка δТЕАР-1, изображенного на фиг. 2 или 3; полинуклеотиды, кодирующие фрагменты приблизительно от аминокислоты 50 до аминокислоты б0 белка δТЕАР-1, изображенного на фиг. 2 или 3; полинуклеотиды, кодирующие фрагменты приблизительно от аминокислоты б0 до аминокислоты 70 белка δТЕАР-1, изображенного на фиг. 2 или 3; полинуклеотиды, кодирующие фрагменты приблизительно от аминокислоты 70 до аминокислоты 80 белка δТЕАР-1, изображенного на фиг. 2 или 3; полинуклеотиды, кодирующие фрагменты приблизительно от аминокислоты 80 до аминокислоты 90 белка δТЕАР-1, изображенного на фиг. 2 или 3; полинуклеотиды, кодирующие фрагменты приблизительно от аминокислоты 90 до аминокислоты 100 белка δТЕАР-1, изображенного на фиг. 2 или 3, с приращением приблизительно 10 аминокислот, заканчивая аминокислотой карбоксильного конца, изображенной на фиг. 2 или 3. Соответственно полинуклеотиды, кодирующие фрагменты аминокислотной последовательности (приблизительно из 10 аминокислот), включающие в себя аминокислоты белка δТЕАР-1 от 100 до С-концевой аминокислоты, являются воплощениями согласно изобретению, где подразумевается, что каждое конкретное аминокислотное положение включает в себя указанное положение плюс или минус пять аминокислотных остатков.
Полинуклеотиды, кодирующие относительно длинные фрагменты белка δТЕАР-1, также входят в объем согласно изобретению. Например, полинуклеотиды, кодирующие фрагмент приблизительно от аминокислоты 1 (или 20, или 30, или 40 и т.д.) до аминокислоты 20 (или 30, или 40, или 50 и т.д.) белка или варианта δТЕАР-1, изображенного на фиг. 2 или 3, можно получить с помощью ряда методов, хорошо известных в данной области. Данные полинуклеотидные фрагменты могут содержать любой фрагмент последовательности δТЕАР-1, изображенной на фиг. 2.
Другие иллюстративные воплощения согласно изобретению, раскрытые в данном описании, включают в себя фрагменты полинуклеотида δТЕАР-1, кодирующие один или несколько биологических мотивов, входящих в состав последовательности белка или варианта δТЕАР-1, включающей в себя одну или несколько из мотив-несущих субпоследовательностей белка или варианта δТЕАР-1, приведенных в табл. У-ХУШ и ХХП-Ы. В другом воплощении типичные полинуклеотидные фрагменты согласно изобретению кодируют один или несколько участков белка или варианта δТЕАР-1, гомологичных известной молекуле. В другом воплощении согласно изобретению типичные полинуклеотидные фрагменты могут кодировать один или несколько участков Ν-гликозилирования белка или варианта δТЕАР-1, участков фосфорилирования под действием цАМФ- и цГМФ-зависимой протеинкиназы, участков фосфорилирования под действием казеинкиназы II или участков Ν-миристоилирования и амидирования.
Чтобы определить исходное положение любого пептида, приведенного в табл. У-ХУШ и ХХП-Ы (собирательные таблицы пептидов НЬА), относительно родительского белка, например варианта 1, варианта 2 и др., следует учитывать три фактора: конкретный вариант, длину пептида, приведенную в таблице пептидов НЬА, и поисковые пептиды, приведенные в табл. ЬП. Как правило, поисковые пептиды используют для получения пептидов НЬА конкретного варианта. Положение каждого поискового пептида относительно соответствующей родительской молекулы приведено в табл. ЬП. Соответственно, если поисковый пептид начинается в положении Х, нужно добавить значение Х минус 1 к каждому положению в табл. У-ХУШ и ХХП-Ы, чтобы определить действительное положение пептидов НЬА в родительской молекуле. Например, если конкретный поисковый пептид начинается в положении 150 родительской молекулы, нужно добавить 150-1, т.е. 149, к каждому аминокислотному положению пептида НЬА, чтобы рассчитать положение аминокислоты в родительской молекуле.
- 2б 014870
II. А. Применение полинуклеотидов 8ТЕАР-1.
11.А.1. Выявление генетических нарушений.
Полинуклеотиды, описанные в предыдущих разделах, имеют ряд конкретных применений. Хромосомное расположение человеческого гена 8ТЕАР-1 описано в примере, озаглавленном Хромосомное картирование 8ТЕАР-1. Например, поскольку ген 8ТЕАР-1 находится в определенной хромосоме, полинуклеотиды, кодирующие разные участки белков 8ТЕАР-1, используют для характеристики цитогенетических нарушений в данном хромосомном регионе, например нарушений, которые, как установлено, связаны с различными раковыми заболеваниями. Было обнаружено, что ряд хромосомных нарушений в некоторых генах, включающих в себя реаранжировки, представляют собой цитогенетические нарушения, часто наблюдающиеся при разных злокачественных заболеваниях (см., например, Кгафпоую е! а1., Ми!а1. Кек. 382(3-4): 81-83 (1998); йокапккоп е! а1., В1ооб, 86(10): 3905-3914 (1995) и Ртдег е! а1., Р.КА.Б. 85(23): 9158-9162 (1988)). Так, полинуклеотиды, кодирующие конкретные участки белков 8ТЕАР-1, можно использовать для более точного, чем это было возможно ранее, выявления цитогенетических нарушений в хромосомном участке, кодирующем 8ТЕАР-1, которые могут вносить вклад в формирование злокачественного фенотипа. В данном контексте указанные полинуклеотиды удовлетворяют существующую в данной области потребность в увеличении чувствительности скрининга хромосом, которая позволила бы идентифицировать более трудноуловимые и менее распространенные хромосомные нарушения (см., например, Еуаик е! а1., Ат. I. 0кк!е!. Супесо1. 171(4): 1055-1057 (1994)).
Далее, поскольку было обнаружено, что 8ТЕАР-1 интенсивно экспрессируется при раке простаты и других злокачественных заболеваниях, полинуклеотиды 8ТЕАР-1 можно использовать для определения статуса генных продуктов 8ТЕАР-1 в нормальной ткани по сравнению с раковой. Как правило, полинуклеотиды, кодирующие конкретные участки белков 8ТЕАР-1, используют для оценки изменений (таких как делеции, вставки, точечные мутации или изменения, приводящие к утрате антигена, и др.) в конкретных участках гена 8ТЕАР-1, таких как участки, содержащие один или несколько мотивов. Примеры анализов включают в себя анализы ОТ-ПЦР и анализы полиморфизма одноцепочечной конформации (88СР) (см., например, Маггод1 е! а1., I. Си!ап. Ра!ко1. 26(8): 369-378 (1999)), в которых используются полинуклеотиды, кодирующие конкретные участки белка, для идентификации данных участков в белке.
11.А.2. Антисмысловые воплощения.
Другие конкретные воплощения нуклеиновых кислот согласно изобретению, раскрытые в данном описании, представляют собой геномные ДНК, кДНК, рибозимы и антисмысловые молекулы, а также молекулы нуклеиновых кислот с альтернативным скелетом или содержащие альтернативные основания либо полученные из природных источников, либо синтезированные и включают в себя молекулы, способные ингибировать экспрессию РНК или белка 8ТЕАР-1. Например, антисмысловые молекулы могут представлять собой РНК или другие молекулы, в том числе пептидные нуклеиновые кислоты (РNЛ5) или молекулы, отличные от нуклеиновых кислот, такие как фосфотиоатные производные, которые специфически связываются с ДНК или РНК по принципу комплементарности оснований. Специалист в данной области может легко получить указанные классы молекул нуклеиновых кислот с использованием полинуклеотидов 8ТЕАР-1 и полинуклеотидных последовательностей, описанных в данном документе.
Антисмысловая технология включает в себя введение экзогенных олигонуклеотидов, которые связываются с целевым полинуклеотидом, расположенным в клетках. Термин антисмысловой относится к олигонуклеотидам, комплементарным их внутриклеточным мишеням, например 8ТЕАР-1. См., например, 1аск Сокеп, 0кдобеохупис1ео11бе5, Апккепке 1пк1кког5 ой Сепе Ехргеккюп, СКС Ргекк, 1989 и 8уп!кек15, 1: 1-5 (1988). Антисмысловые олигонуклеотиды 8ТЕАР-1 согласно изобретению включают в себя такие производные, как 8-олигонуклеотиды (фосфоротиоатные производные или 8-олиги, см., йаск Сокеп, приведено выше), которые ингибируют рост раковых клеток с повышенной эффективностью. 8-олигонуклеотиды (нуклеозидфосфоротиоаты) являются изоэлектронными аналогами олигонуклеотидов (О-олигонуклеотид), в которых не мостиковый атом кислорода фосфатной группы заменен на атом серы. 8-олигонуклеотиды согласно изобретению можно получить путем обработки соответствующих О-олигонуклеотидов 3Н-1,2-бензодитиол-3-он-1,1-диоксидом, который представляет собой реагент, переносящий серу. См., например, 1уег, К.Р. е! а1., й. 0гд. Скет. 55: 4693-4698 (1990) и 1уег, К.Р. е! а1., I. Ат. Скет. Бос. 112: 1253-1254 (1990). Другие антисмысловые олигонуклеотиды 8ТЕАР-1 согласно изобретению включают в себя известные в данной области антисмысловые морфолиноолигонуклеотиды (см., например, РаПгЩде е! а1., 1996, Апйкепке & ШсШс Ас1б Эгид Оеуе1ортеп!, 6: 169-175).
Антисмысловые олигонуклеотиды 8ТЕАР-1 согласно изобретению, как правило, представляют собой РНК или ДНК, комплементарные первым 100 5'-кодонам, или последним 100 3'-кодонам геномной последовательности 8ТЕАР-1, или соответствующей мРНК, или стабильно гибридизующиеся с ними. Абсолютная комплементарность не требуется, хотя высокая степень комплементарности является предпочтительной. Применение олигонуклеотида, комплементарного к данному участку, обеспечивает селективную гибридизацию с мРНК 8ТЕАР-1, но не с мРНК, кодирующей другие регуляторные субъединицы протеинкиназы. В одном воплощении антисмысловые олигонуклеотиды 8ТЕАР-1 согласно изобретению представляют собой фрагменты антисмысловой молекулы ДНК, содержащие от 15 до 30 мономеров, которые имеют последовательности, гибридизующиеся с мРНК 8ТЕАР-1.
- 27 014870
Необязательно, антисмысловой олигонуклеотид δТЕАР-1 содержит 30 мономеров и является комплементарным участку, включающему в себя первые 10 5'-кодонов или последние 10 3'-кодонов δТЕАР-1. Альтернативно, антисмысловые молекулы модифицируют, чтобы использовать рибозимы для ингибирования экспрессии δТЕАР-1, см., например, Ь.А. СоиШге & Э.Т. δΐίηοΐιοοιηό; Тгеп!§ Сепе1. 12: 510-515 (1996).
11.А.3. Праймеры и пары праймеров.
Другие конкретные воплощения нуклеотидов согласно изобретению включают в себя праймеры и пары праймеров, обеспечивающие специфическую амплификацию полинуклеотидов согласно изобретению или любых конкретных фрагментов указанных полинуклеотидов, а также зонды, которые селективно или специфично гибридизуются с молекулами нуклеиновых кислот согласно изобретению или с любыми их фрагментами. Зонды можно пометить детектируемым маркером, таким как, например, радиоактивный изотоп, флуоресцентное соединение, биолюминесцентное соединение, хемилюминесцентное соединение, соединение, способное образовывать комплексы с металлами, или фермент. Такие зонды и праймеры используют для детектирования присутствия полинуклеотида δТЕАР-1 в образце и в качестве средств, позволяющих детектировать клетки, экспрессирующие белок δТЕАР-1.
Примеры таких зондов включают в себя полинуклеотиды, содержащие полноразмерную последовательность кДНК человеческого δТЕАР-1, изображенную на фиг. 2, или ее часть. Примеры пар праймеров, способных обеспечить специфическую амплификацию мРНК δТЕАР-1, также описаны в примерах. Для опытного специалиста очевидно, что на основе последовательностей, описанных в данном документе, можно получить большое количество разных праймеров и зондов, которые можно эффективно использовать для амплификации и/или детектирования мРНК δТЕАР-1.
Полинуклеотиды δТЕАР-1 согласно изобретению используют для разных целей, включающих в себя, без ограничения, применение в качестве зондов и праймеров для амплификации и/или детектирования гена (генов) δТЕАР-1, мРНК или его (их) фрагментов; применение в качестве реагентов для диагноза и/или прогнозирования рака простаты и других злокачественных заболеваний; применение в качестве кодирующих последовательностей, способных управлять экспрессией полипептидов δТЕАР-1; применение в качестве средств, модулирующих или ингибирующих экспрессию гена (генов) δТЕАР-1 и/или трансляцию транскрипта (транскриптов) δТЕАР-1; применение в качестве терапевтических средств.
Настоящее изобретение включает в себя применение любого описанного в данном документе зонда для идентификации и выделения нуклеотидной последовательности δТЕАР-1 или нуклеотидной последовательности, родственной δТЕАР-1, из природного источника, такого как человек или другие млекопитающие, а также самой выделенной нуклеотидной последовательности, которая содержит полноразмерную последовательность, присутствующую в используемом зонде, или ее большую часть.
11.А.4. Выделение молекул нуклеиновых кислот, кодирующих δТЕАР-1.
Последовательности кДНК δТЕАР-1, описанные в данном документе, можно использовать для выделения других полинуклеотидов, кодирующих генные продукты δТЕАР-1, а также для выделения полинуклеотидов, кодирующих гомологи генных продуктов δТЕАР-1, изоформ, образующихся в результате альтернативного сплайсинга, аллельных вариантов и мутантных форм генного продукта δТЕАР-1, а также полинуклеотидов, кодирующих аналоги белков, родственных δТЕАР-1. Для выделения полноразмерных кДНК, кодирующих ген δТЕАР-1, можно использовать хорошо известные методы молекулярного клонирования (см., например, δатй^οοк, 1. е1 а1., Мо1еси1аг С1ошпд: А Ьайога1огу Мапиа1, 2п! е!йюп, Со1! δρππβ Нагйог Рге§5, №\ν Уогк, 1989; Сиггеп! Рго1осок т Мо1еси1аг Вю1оду. Аи5ийе1 е1 а1., Е!§., ^11еу ап! δοη8, 1995). Например, можно использовать методы клонирования на основе лямбда-фага с помощью коммерчески доступных систем клонирования (например, Ьашй!а 2АР Ехргекк, δΙπ-Ηη^ικ). Фаговые клоны, содержащие кДНК генов δТЕАР-1, можно идентифицировать путем зондирования меченой кДНК δТЕАР-1 или ее фрагментом. Например, в одном воплощении кДНК δТЕАР-1 (например, показанная на фиг. 2), или ее фрагмент, можно синтезировать и использовать в качестве зонда для идентификации перекрывающихся и полноразмерных кДНК, соответствующих гену δТЕАР-1. Сам ген δТЕАР-1 можно выделить путем скрининга библиотек геномных ДНК, библиотек бактериальных искусственных хромосом (ВАС), библиотек дрожжевых искусственных хромосом (УАС) и т.п. с использованием зондов или праймеров на основе ДНК δТЕАР-1.
11.А.5. Рекомбинантные молекулы нуклеиновых кислот и системы векторов-хозяев.
Данное изобретение также предлагает рекомбинантные молекулы ДНК или РНК, содержащие полинуклеотид δТЕАР-1, его фрагмент, аналог или гомолог, включающие в себя, без ограничения, фаги, плазмиды, фагмиды, космиды, УАС, ВАС, разные вирусные и невирусные векторы, хорошо известные в данной области, а также клетки, трансформированные или трансфицированные такими рекомбинантными молекулами ДНК или РНК. Способы получения таких молекул хорошо известны в данной области (см., например, δатй^οοк е1 а1., 1989, приведено выше).
- 28 014870
Данное изобретение также предлагает систему вектора-хозяина, включающую в себя рекомбинантную молекулу ДНК, содержащую полинуклеотид 8ТЕАР-1, его фрагмент, аналог или гомолог в подходящей прокариотической или эукариотической клетке-хозяине. Примеры подходящих эукариотических клеток-хозяев включают в себя дрожжевую клетку, растительную клетку или животную клетку, такую как клетка млекопитающего или клетка насекомого (например, клетку, которую можно инфицировать бакуловирусом, такую как клетка 8Г9 или клетка Н|д№уе). Примеры подходящих клеток млекопитающих включают в себя различные клеточные линии рака простаты, такие как Όυ145 и ТкиРг1, другие клеточные линии рака простаты, которые можно трансфицировать или трансдуцировать, первичные клетки (РгЕС), а также ряд клеток млекопитающих, обычно используемых для экспрессии рекомбинантных белков (таких как клетки С08, СН0, 293, 293Т). Более конкретно, полинуклеотид, включающий в себя кодирующую последовательность 8ТЕАР-1 или ее фрагмент, аналог или гомолог, можно использовать для получения белков 8ТЕАР-1 или их фрагментов с использованием любого числа традиционно используемых и широко известных в данной области систем векторов-хозяев.
Широкий ряд систем векторов-хозяев, подходящих для экспрессии белков 8ТЕАР-1 или их фрагментов, является доступным (см., например, 8атЬгоок е! а1., 1989, приведено выше; Сиггеп! Рго!осо1к ίπ Мо1еси1аг Вю1оду, 1995, приведено выше). Векторы, предпочтительные для экспрессии в клетках млекопитающих, включают в себя, без ограничения, ркДНК 3.1 тус-Н1к-!ад (1пуйгодеп) и ретровирусный вектор р8На!кпео (Ми11ег е! а1., 1991, МСВ, 11: 1785). С помощью указанных векторов экспрессии 8ТЕАР-1 можно экспрессировать в некоторых клеточных линиях рака простаты и клеточных линиях, не связанных с простатой, включающих в себя, например, 293, 293Т, НАТ1, МН 3Т3 и ТкиРг1. Системы векторовхозяев согласно изобретению можно использовать для получения белка 8ТЕАР-1 или его фрагмента. Такие системы векторов-хозяев можно также использовать для изучения функциональных свойств 8ТЕАР-1 и мутантов или аналогов 8ТЕАР-1.
Рекомбинантный человеческий белок 8ТЕАР-1 или его аналог, гомолог или фрагмент также можно получить с использованием клеток млекопитающих, трансфицированных конструкцией, кодирующей нуклеотид, родственный 8ТЕАР-1. Например, клетки 293Т можно трансфицировать экспрессионной плазмидой, кодирующей 8ТЕАР-1 или его фрагмент, аналог или гомолог, с последующими экспрессией белка, родственного 8ТЕАР-1, в клетках 293Т и выделением рекомбинантного белка 8ТЕАР-1 с помощью стандартных методов очистки (таких как аффинная очистка с использованием антител против 8ТЕАР-1). В другом воплощении последовательность, кодирующую 8ТЕАР-1, субклонируют в ретровирусном векторе р8НаМ8У!кпео и используют для инфицирования различных клеточных линий млекопитающих, таких как МН 3Т3, ТкиРг1, 293 и НАТ1, с последующей экспрессией 8ТЕАР-1 в клеточных линиях. Можно использовать и другие системы экспрессии, хорошо известные в данной области. Для получения секретируемой формы рекомбинантного белка 8ТЕАР-1 можно использовать экспрессионные конструкции, включающие в себя последовательность, кодирующую лидерный пептид, и объединенную с ней в рамке считывания последовательность, кодирующую 8ТЕАР-1.
Как указано в данном описании, избыточность генетического кода приводит к возникновению вариаций в генных последовательностях 8ТЕАР-1. В частности, как известно в данной области, конкретные виды-хозяева часто имеют характерные кодоновые предпочтения, и, следовательно, раскрываемую последовательность можно адаптировать для определенного хозяина. Например, в предпочтительных аналоговых кодоновых последовательностях редкие кодоны (т. е. кодоны, периодичность встречаемости которых в известных последовательностях конкретного хозяина составляет менее чем приблизительно 20%) обычно заменяют на кодоны с более высокой встречаемостью. Кодоновые предпочтения для конкретных видов рассчитывают, например, с помощью таблиц использования кодонов, которые можно найти в Интернете, например, на сайте иКЬ бπа.аПГ^с.до.^р/-πакати^а/собоπ.йΐт1.
Известны другие модификации последовательности с целью увеличения экспрессии белка в клеткехозяине. Данные модификации включают в себя удаление последовательностей, кодирующих мнимые сигналы полиаденилирования, сигналы сплайсинга экзонов/интронов, транспозон-подобные повторы и/или другие подобные хорошо охарактеризованные последовательности, которые оказывают неблагоприятное влияние на экспрессию генов. Содержание СС в последовательности доводят до среднего уровня, характерного для конкретной клетки-хозяина, который рассчитывают по известным генам, экспрессирующимся в данном хозяине. По возможности последовательность модифицируют так, чтобы избежать прогнозированного образования шпилек во вторичной структуре мРНК. Другие полезные модификации включают в себя добавление консенсусной последовательности инициации трансляции в начало открытой рамки считывания, как описано Кохак, Мо1. Се11 Вю1., 9: 5073-5080 (1989). Опытные специалисты понимают, что общее правило, согласно которому эукариотические рибосомы инициируют трансляцию исключительно по 5'-проксимальному кодону АиС, нарушается только в редких случаях (см., например, Кохак. Р^8. 92(7): 2662-2666 (1995) и Кохак. тН. 15(20): 8125-8148 (1987)).
- 29 014870
III. Белки, родственные 8ТЕАР-1.
В другом аспекте настоящее изобретение предлагает белки, родственные 8ТЕАР-1. Конкретные воплощения белков 8ТЕАР-1 включают в себя полипептид, содержащий полноразмерную аминокислотную последовательность человеческого 8ТЕАР-1, изображенную на фиг. 2 или 3, предпочтительно на фиг. 2 А, или ее фрагмент. Альтернативно, воплощения белков 8ТЕАР-1 включают в себя вариантные, гомологичные или аналоговые полипептиды, которые содержат изменения в аминокислотной последовательности 8ТЕАР-1, изображенной на фиг. 2 или 3.
Воплощения полипептида 8ТЕАР-1 включают в себя полипептид 8ТЕАР-1, имеющий последовательность, изображенную на фиг. 2, пептидную последовательность 8ТЕАР-1, изображенную на фиг. 2, где Т может обозначать И; по меньшей мере 10 смежных нуклеотидов полипептида, имеющего последовательность, изображенную на фиг. 2; или по меньшей мере 10 смежных пептидов полипептида, имеющего последовательность, изображенную на фиг. 2, где Т может обозначать и. Например, воплощения пептидов 8ТЕАР-1 включают в себя, без ограничения:
(I) белок, по существу содержащий или содержащий аминокислотную последовательность, изображенную на фиг. 2А-2О или 3А-3О;
(II) белок, родственный 8ТЕАР-1, который по меньшей мере на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% гомологичен полноразмерной аминокислотной последовательности, изображенной на фиг. 2А-2О или 3А-3О;
(III) белок, родственный 8ТЕАР-1, который по меньшей мере на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичен полноразмерной аминокислотной последовательности, изображенной на фиг. 2А-2О или 3А-3О;
(IV) белок, содержащий по меньшей мере один пептид из перечисленных в табл. У-Ы, как описано в патентной заявке США 10/236878, поданной 6 сентября 2002 г., конкретное содержание которой полностью включено в данное описание в качестве ссылки, необязательно при условии, что данный белок не является полноразмерным, изображенным на фиг. 2;
(V) белок, содержащий по меньшей мере один пептид из перечисленных в общей сложности в табл. У-ХУШ, данные пептиды также приведены в общей сложности в табл. ХХП-Ы, необязательно при условии, что данный белок не является полноразмерным, изображенным на фиг. 2;
(VI) белок, содержащий по меньшей мере два пептида, выбранных из пептидов, приведенных в табл. У-Ы, необязательно при условии, что данный белок не является полноразмерным, изображенным на фиг. 2;
(VII) белок, содержащий по меньшей мере два пептида, выбранных из пептидов, приведенных в общей сложности в табл. при условии, что данный белок не является смежной последовательностью по отношению к аминокислотной последовательности фиг. 2;
(VIII) белок, содержащий по меньшей мере один пептид, выбранный из пептидов, приведенных в табл. V-XVШ; и по меньшей мере один пептид, выбранный из пептидов, приведенных в табл. ХХП-Ы, при условии, что данный белок не является смежной последовательностью по отношению к аминокислотной последовательности фиг. 2;
(ЕХ) полипептид, содержащий по меньшей мере 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 аминокислот белка, изображенного на фиг. 3А, с любым целочисленным приращением вплоть до 339 соответственно, который содержит по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 аминокислотных положений со значением больше 0,5 по профилю гидрофильности, приведенному на фиг. 5;
(Х) полипептид, содержащий по меньшей мере 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 аминокислот белка, изображенного на фиг. 3А, с любым целочисленным приращением вплоть до 339 соответственно, который содержит по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 аминокислотных положений со значением меньше 0,5 по профилю гидрофобности, приведенному на фиг. 6;
(ХГ) полипептид, содержащий по меньшей мере 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 аминокислот белка, изображенного на фиг. 3А, с любым целочисленным приращением вплоть до 339 соответственно, который содержит по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 аминокислотных положений со значением больше 0,5 по профилю процента доступных остатков, приведенному на фиг. 7;
(ХП) полипептид, содержащий по меньшей мере 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 аминокислот белка, изображенного на фиг. 3А, с любым целочисленным приращением вплоть до 339 соответственно, который содержит по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 аминокислотных положений со значением больше 0,5 по профилю средней жесткости, приведенному на фиг. 8;
- 30 014870 (XIII) полипептид, содержащий по меньшей мере 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 аминокислот белка, изображенного на фиг. 3А, с любым целочисленным приращением вплоть до 339 соответственно, который содержит по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 аминокислотных положений со значением больше 0,5 по профилю бета-складки, приведенному на фиг. 9;
(XIV) полипептид, содержащий по меньшей мере 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 аминокислот белка, изображенного на фиг. 3В или 3Ό, с любым целочисленным приращением вплоть до 258 соответственно, который содержит по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 аминокислотных положений со значением больше 0,5 по профилю гидрофильности, приведенному на фиг. 5;
(XV) полипептид, содержащий по меньшей мере 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 аминокислот белка, изображенного на фиг. 3В или 3Ό, с любым целочисленным приращением вплоть до 258 соответственно, который содержит по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 аминокислотных положений со значением меньше 0,5 по профилю гидрофобности, приведенному на фиг. 6;
(XVI) полипептид, содержащий по меньшей мере 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 аминокислот белка, изображенного на фиг. 3В или 3Ό, с любым целочисленным приращением вплоть до 258 соответственно, который содержит по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 аминокислотных положений со значением больше 0,5 по профилю процента доступных остатков, приведенному на фиг. 7;
(XVII) полипептид, содержащий по меньшей мере 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 аминокислот белка, изображенного на фиг. 3В или 3Ό, с любым целочисленным приращением вплоть до 258 соответственно, который содержит по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29,
30, 31, 32, 33, 34, 35 аминокислотных положений со значением больше 0,5 по профилю средней жесткости, приведенному на фиг. 8;
(XVIII) полипептид, содержащий по меньшей мере 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19,
20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 аминокислот белка, изображенного на фиг. 3В или 3Ό, с любым целочисленным приращением вплоть до 258 соответственно, который содержит по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30,
31, 32, 33, 34, 35 аминокислотных положений со значением больше 0,5 по профилю бета-складки, приведенному на фиг. 9;
(XIX) полипептид, содержащий по меньшей мере 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20,
21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 аминокислот белка, изображенного на фиг. 3С, с любым целочисленным приращением вплоть до 282 соответственно, который содержит по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 аминокислотных положений со значением больше 0,5 по профилю гидрофильности, приведенному на фиг. 5;
(XX) полипептид, содержащий по меньшей мере 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 аминокислот белка, изображенного на фиг. 3С, с любым целочисленным приращением вплоть до 282 соответственно, который содержит по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 аминокислотных положений со значением меньше 0,5 по профилю гидрофобности, приведенному на фиг. 6;
(XXI) полипептид, содержащий по меньшей мере 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 аминокислот белка, изображенного на фиг. 3С, с любым целочисленным приращением вплоть до 282 соответственно, который содержит по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 аминокислотных положений со значением больше 0,5 по профилю процента доступных остатков, приведенному на фиг. 7;
(XXII) полипептид, содержащий по меньшей мере 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 аминокислот белка, изображенного на фиг. 3С, с любым целочисленным приращением вплоть до 282 соответственно, который содержит по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 аминокислотных положений со значением больше 0,5 по профилю средней жесткости, приведенному на фиг. 8;
- 31 014870 (XXIII) полипептид, содержащий по меньшей мере 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 аминокислот белка, изображенного на фиг. 3С, с любым целочисленным приращением вплоть до 282 соответственно, который содержит по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 аминокислотных положений со значением больше 0,5 по профилю бета-складки, приведенному на фиг. 9;
(XXIV) пептид, который встречается в общей сложности по меньшей мере два раза в табл. V-XVΊII и XXII-^I;
(XXV) пептид, который встречается в общей сложности по меньшей мере три раза в табл. ν^νω и XXII-^I;
(XXVI) пептид, который встречается в общей сложности по меньшей мере четыре раза в табл. V-XXVIII и XXII-^I;
(XXVII) пептид, который встречается в общей сложности по меньшей мере пять раз в табл. V-XVIII и XXII-^I;
(XXVIII) пептид, который встречается по меньшей мере один раз в табл. МХМП и по меньшей мере один раз в табл. XXII-^I;
(XXIX) пептид, который встречается по меньшей мере один раз в табл. МХМП и по меньшей мере два раза в табл. ΥνΗ-ΕΙ;
(XXX) пептид, который встречается по меньшей мере два раза в табл. МХМП и по меньшей мере один раз в табл. ΥνΗ-Μ;
(XXXI) пептид, который встречается по меньшей мере два раза в табл. V-XVIII и по меньшей мере два раза в табл. ΥνΗ-Μ;
(XXXII) пептид, который имеет один, два, три, четыре или пять из нижеследующих характерных признаков, или олигонуклеотид, кодирующий такой пептид:
ί) участок, состоящий по меньшей мере из 5 аминокислот конкретного пептида, приведенного на фиг. 3, с любым целочисленным приращением вплоть до полного размера белка, изображенного на фиг. 3, который содержит аминокислотное положение, имеющее значение по профилю гидрофильности, приведенному на фиг. 5, равное или превышающее 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 или равное 1,0;
ίί) участок, состоящий по меньшей мере из 5 аминокислот конкретного пептида, приведенного на фиг. 3, с любым целочисленным приращением вплоть до полного размера белка, изображенного на фиг. 3, который содержит аминокислотное положение, имеющее значение по профилю гидропатичности, приведенному на фиг. 6, равное или превышающее 0,5, 0,4, 0,3, 0,2, 0,1 или равное 0,0;
ίίί) участок, состоящий по меньшей мере из 5 аминокислот конкретного пептида, приведенного на фиг. 3, с любым целочисленным приращением вплоть до полного размера белка, изображенного на фиг. 3, который содержит аминокислотное положение, имеющее значение по профилю процента доступных остатков, приведенному на фиг. 7, равное или превышающее 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 или равное 1,0;
ίν) участок, состоящий по меньшей мере из 5 аминокислот конкретного пептида, приведенного на фиг. 3, с любым целочисленным приращением вплоть до полного размера белка, изображенного на фиг. 3, который содержит аминокислотное положение, имеющее значение по профилю средней жесткости, приведенному на фиг. 8, равное или превышающее 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 или равное 1,0; или
ν) участок, состоящий по меньшей мере из 5 аминокислот конкретного пептида, приведенного на фиг. 3, с любым целочисленным приращением вплоть до полного размера белка, изображенного на фиг. 3, который содержит аминокислотное положение, имеющее значение по профилю бета-складки, приведенному на фиг. 9, равное или превышающее 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 или равное 1,0$ (XXXIII) композиция, содержащая пептид по любому из пп.I-XXXII или антитело или его связывающий фрагмент, вместе с фармацевтическим наполнителем и/или в составе человеческой стандартной лекарственной формы;
(XXXIV) способ применения пептида по любому из пп.I-XXXII или антитела или его связывающего фрагмента либо композиции по п.XXXIII для модуляции экспрессии 8ТЕАР-1 в клетке;
(XXXV) способ применения пептида по любому из пп.I-XXXII или антитела или его связывающего фрагмента либо композиции по п.XXXIII для диагностики, профилактики, прогнозирования или лечения субъекта, несущего клетку, экспрессирующую 8ТЕАР-1;
(XXXVI) способ применения пептида по любому из пп.I-XXXII или антитела или его связывающего фрагмента либо композиции по п.XXXIII для диагностики, профилактики, прогнозирования или лечения субъекта, несущего клетку, экспрессирующую 8ТЕАР-1, где указанная клетка относится к раковой ткани, приведенной в табл. I;
(XXXVII) способ применения пептида по любому из пп.I-XXXII или антитела или его связывающего фрагмента либо композиции по п.XXXIII для диагностики, профилактики, прогнозирования или лечения рака;
(XXXVIII) способ применения пептида по любому из пп.I-XXXII или антитела или его связывающего фрагмента либо композиции по п.XXXIII для диагностики, профилактики, прогнозирования или лечения рака ткани, приведенной в табл. I; и
- 32 014870 (XXXIX) способ применения пептида по любому из ппТ-ХХХП или антитела или его связывающего фрагмента либо композиции по п.XXXIII для идентификации или характеристики модулятора экспрессии 8ТЕАР-1 в клетке.
В данном описании подразумевается, что интервал конкретно включает в себя все находящиеся внутри него целочисленные значения.
Типичные воплощения согласно изобретению, раскрытые в данном описании, включают в себя полинуклеотиды 8ТЕАР-1, которые кодируют конкретные положения последовательностей мРНК 8ТЕАР-1 (а также комплементарные таким последовательностям), такие как полинуклеотиды, кодирующие, например, следующие белки и/или их фрагменты: 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 330, 335, 339 или более смежных аминокислот 8ТЕАР-1, вариант 1; максимальная длина других вариантов составляет: вариант 2 - 258 аминокислот; вариант 3 - 282 аминокислоты, вариант 4 - 258 аминокислот.
Как правило, природные аллельные варианты человеческого 8ТЕАР-1 обладают высокой степенью структурной идентичности и гомологии (например, гомология составляет 90% или более). Обычно аллельные варианты белка 8ТЕАР-1 содержат консервативные аминокислотные замены в последовательностях 8ТЕАР-1, описанных в данном документе, или содержат аминокислотную замену в соответствующем положении гомолога 8ТЕАР-1. Один класс аллельных вариантов 8ТЕАР-1 включает в себя белки, которые являются в высокой степени гомологичными, по меньшей мере, маленькому участку конкретной аминокислотной последовательности 8ТЕАР-1, но также содержат существенное отличие от структуры последовательности, такое как неконсервативная замена, усечение, вставка или сдвиг рамки считывания. В области генетики считается, что термины подобие, идентичность и гомология, относящиеся к сравнению белковых последовательностей, имеют разные значения. Более того, большое значение для описания взаимоотношений между членами конкретного семейства белков в одном организме и членами такого же семейства в других организмах могут иметь ортология и паралогия.
Сокращенные наименования аминокислот приведены в табл. II. Консервативные аминокислотные замены в белке зачастую могут быть осуществлены без изменения конформации или функции белка. Белки согласно изобретению могут содержать 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 консервативных замен.
Воплощения согласно изобретению, раскрытые в данном описании, включают в себя широкий ряд принятых в данной области вариантов или аналогов белков 8ТЕАР-1, таких как полипептиды, содержащие вставки, делеции и замены аминокислот. Варианты 8ТЕАР-1 можно получить с помощью известных в данной области методов, таких как сайт-направленный мутагенез, сканирование по аланину и мутагенез методом ПЦР. Сайт-направленный мутагенез (Сайег е! а1., Νϋθ1. Ас1бк Век., 13: 4331 (1986); 2о11ег е! а1., №с1. Ас1бк Век., 10: 6487 (1987)), кассетный мутагенез (\Уе11к е! а1., Сепе, 34: 315 (1985)), рестрикционный селекционный мутагенез (\Уе11к е! а1., РЫ1ок. Тгапк. В. 8ос. Ьопбоп 8егА, 317: 415 (1986)) или другие известные методы можно проводить на клонированной ДНК с получением варианта ДНК 8ТЕАР-1.
Анализ с аминокислотным сканированием также можно использовать для идентификации одной или нескольких аминокислот по всей длине непрерывной последовательности, участвующей в конкретной биологической активности, такой как белок-белковое взаимодействие. К предпочтительным аминокислотам для сканирования относятся сравнительно маленькие нейтральные аминокислоты. Такие аминокислоты включают в себя аланин, глицин, серин и цистеин. Как правило, аланин является предпочтительной сканирующей кислотой в данной группе, поскольку он не содержит боковых цепей за бетаатомом углерода и с меньшей вероятностью изменяет конформацию основной цепи варианта. Аланин также часто предпочитают из-за того, что он является наиболее распространенной аминокислотой. Кроме того, он зачастую присутствует как в заглубленных, так и в экспонированных положениях (Сге1дй!оп, Т11е Рго!етк (\У.Н. Егеетап & Со., Ν.Υ.); Сйо!Ыа, I. Мо1. Вю1., 150: 1 (1976)). Если аланиновая замена не дает адекватных количеств варианта, можно использовать изостерическую аминокислоту.
Как указано в данном описании, отличительным признаком вариантов, аналогов или гомологов 8ТЕАР-1 является то, что они содержат по меньшей мере один эпитоп, способный перекрестно взаимодействовать с белком 8ТЕАР-1, имеющим аминокислотную последовательность, приведенную на фиг. 3. Использованный термин перекрестное взаимодействие означает, что антитело или Т-клетка, которая специфически связывается с вариантом 8ТЕАР-1, также может специфически связываться с белком 8ТЕАР-1, имеющим аминокислотную последовательность, приведенную на фиг. 3. Полипептид перестает быть вариантом белка, изображенного на фиг. 3, если он больше не содержит эпитопа, который может распознаваться антителом или Т-клеткой, специфически связывающимися с исходным белком 8ТЕАР-1. Специалистам в данной области известно, что антитела, распознающие белки, связываются с эпитопами разного размера, причем минимальным эпитопом, как правило, считается эпитоп, который содержит совокупность приблизительно из четырех или пяти аминокислот, смежных или нет. См., например, №1й е! а1., I. Iттиηο1. 2000, 165(12): 6949-6955; НеЬЬек е! а1., Мо1. Iттиηο1. (1989), 26(9): 865-73; 8с11\\'аг1х е! а1., I. Тттипо1. (1985), 135(4): 2598-608.
- 33 014870
Другие классы вариантов белков, родственных 8ΤΕΑΡ-1, имеют 70, 75, 80, 85 или 90% или более процентов подобия с аминокислотной последовательностью, приведенной на фиг. 3, или с ее фрагментом. Другие конкретные классы вариантов или аналогов 8ΤΕΑΡ-1 включают в себя один или несколько биологических мотивов 8ΤΕΑΡ-1, описанных в данном документе или известных в настоящее время в данной области. Таким образом, настоящее изобретение охватывает аналоги фрагментов 8ΤΕΑΡ-1 (нуклеотидных или аминокислотных), которые имеют измененные функциональные (например, иммуногенные) свойства по сравнению с исходным фрагментом. Следует понимать, что мотивы, описанные в данном документе или известные из предыдущего уровня техники, относятся к нуклеотидным или аминокислотным последовательностям, приведенным на фиг. 2 или 3.
Как указано в данном документе, воплощения заявляемого изобретения включают в себя полипептиды, содержащие последовательность меньше полноразмерной аминокислотной последовательности белка 8ΤΕΑΡ-1, изображенного на фиг. 2 или 3. Например, типичные воплощения согласно изобретению включают в себя пептиды/белки, содержащие 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или больше смежных аминокислот белка 8ΤΕΑΡ-1, изображенного на фиг. 2 или 3.
Кроме того, типичные воплощения согласно изобретению, раскрытые в данном описании, включают в себя полипептиды, содержащие последовательность приблизительно от аминокислоты 1 до аминокислоты 10 белка 8ΤΕΑΡ-1, изображенного на фиг. 2 или 3; полипептиды, содержащие последовательность приблизительно от аминокислоты 10 до аминокислоты 20 белка 8ΤΕΑΡ-1, изображенного на фиг. 2 или 3; полипептиды, содержащие последовательность приблизительно от аминокислоты 20 до аминокислоты 30 белка 8ΤΕΑΡ-1, изображенного на фиг. 2 или 3; полипептиды, содержащие последовательность приблизительно от аминокислоты 30 до аминокислоты 40 белка 8ΤΕΑΡ-1, изображенного на фиг. 2 или 3; полипептиды, содержащие последовательность приблизительно от аминокислоты 40 до аминокислоты 50 белка 8ΤΕΑΡ-1, изображенного на фиг. 2 или 3; полипептиды, содержащие последовательность приблизительно от аминокислоты 50 до аминокислоты 60 белка 8ΤΕΑΡ-1, изображенного на фиг. 2 или 3; полипептиды, содержащие последовательность приблизительно от аминокислоты 60 до аминокислоты 70 белка 8ΤΕΑΡ-1, изображенного на фиг. 2 или 3; полипептиды, содержащие последовательность приблизительно от аминокислоты 70 до аминокислоты 80 белка 8ΤΕΑΡ-1, изображенного на фиг. 2 или 3; полипептиды, содержащие последовательность приблизительно от аминокислоты 80 до аминокислоты 90 белка 8ΤΕΑΡ-1, изображенного на фиг. 2 или 3; полипептиды, содержащие последовательность приблизительно от аминокислоты 90 до аминокислоты 100 белка 8ΤΕΑΡ-1, изображенного на фиг. 2 или 3, и т.д. на протяжении всей аминокислотной последовательности 8ΤΕΑΡ-1.
Более того, полипептиды, содержащие последовательность приблизительно от аминокислоты 1 (или 20, или 30, или 40 и т.д.) до аминокислоты 20 (или 130, или 140, или 150 и т.д.) белка 8ΤΕΑΡ-1, изображенного на фиг. 2 или 3, являются воплощениями согласно изобретению. Следует понимать, что начальные и конечные положения, указанные в данном разделе, относятся к конкретному положению, а также к положению в интервале плюс или минус 5 остатков.
Белки, родственные 8ΤΕΑΡ-1, получают с помощью стандартных методов пептидного синтеза или с помощью методов химического расщепления, хорошо известных в данной области. Альтернативно, для получения нуклеиновых кислот, кодирующих белок, родственный 8ΤΕΑΡ-1, можно использовать рекомбинантные методы. В одном воплощении молекулы нуклеиновых кислот являются средством для получения определенных фрагментов белка 8ΤΕΑΡ-1 (или его вариантов, гомологов или аналогов).
Ш.А. Мотив-несущие воплощения белков.
Другие иллюстративные воплощения согласно изобретению, раскрытые в данном описании, включают в себя полипептиды 8ΤΕΑΡ-1, содержащие аминокислотные остатки одного или нескольких биологических мотивов, входящих в состав полипептидной последовательности 8ΤΕΑΡ-1, приведенной на фиг. 2 или 3. Многие мотивы известны в данной области и присутствие таких мотивов в белке можно определить с помощью ряда широко доступных сайтов Интернета (см., например, адреса ЦКЕ: рГатлуцЛ.еби/; 8еагсЫаипсйег.Ьст.!тс.еби/8ед-8еагсй/8!гис-ргеб1с!.Ыт1; р5ой.1т5.и-1окуо.ас.|р/;
сЛ.бШ.бк/; еЬ1.ас.ик/1п!егрго/8сап.й!т1; ехра8у.сй/!оок/8спр81!1.Ыт1; Нр1та1г1х™ апб Εр^те^™, Вго\\'п ип1уег8Йу, Ь^ο^η.еби/Ве8еа^сй/ΤΒ-ΗIV_^аЬ/ер^та!^^x/ер^таΐ^^x.й!т1 и ΒΙΜΑ8, Ытаз.бсп.шй.доу/).
Мотив-несущие субпоследовательности всех белковых вариантов 8ΤΕΑΡ-1 приведены и идентифицированы в табл. ν-ΧνΙΙΙ и ΧΧΙΙ-Ы.
В табл. Ιν(Η) приведено несколько часто ввстречающихся мотивов, обнаруженных в результате поиска рГат (см. адрес иВЬ рГатлуцЛ.еби/). В колонках таблицы Ιν(Η) приведены (1) сокращенные наименования мотивов; (2) процент идентичности для разных членов семейства мотивов; (3) наименование или описание мотива и (4) наиболее общая функция; информация о расположении указывается, если мотив связан с определенным положением.
Полипептиды, содержащие один или несколько описанных выше мотивов 8ΤΕΑΡ-1, можно использовать для объяснения характерных признаков злокачественного фенотипа, поскольку существуют данные, что описанные выше мотивы 8ΤΕΑΡ-1 связаны с нарушением регуляции роста и что при некоторых злокачественных заболеваниях происходит сверхэкспрессия 8ΤΕΑΡ-1 (см., например, табл. Ι). Известно, что такие ферменты, как, например, казеинкиназа ΙΙ, цАМФ- и сатр-зависимая протеинкиназа и проте
- 34 014870 инкиназа С, связаны с развитием злокачественного фенотипа (см., например, СНеп е! а1., ЬаЬ [пуекЬ 78(2): 165-174 (1998); ΒηκΙάοιι е! а1., ЕпаосгтоФду, 136(10): 4331-4338 (1995); На11 е! а1., ХГис1ек Аайк Кекеагсй, 24(6): 1119-1126 (1996); Ре!егае1 е! а1., Опсодепе, 18(46): 6322-6329 (1999) и О'Вг1ап, Опсо1. Кер. 5(2): 305-309 (1998)). Кроме того, с раковыми заболеваниями и их развитием также связаны модификации белков, такие как гликозилирование и миристоилирование (см., например, Эепшк е! а1., ВюсНет. Вюрйук. Ас!а 1473(1):21-34 (1999); Кащ е! а1., Ехр. Се11 Кек. 235(1): 145-154 (1997)). Амидирование представляет собой другую модификацию белка, тоже связанную с раковыми заболеваниями и их развитием (см., например, Тгек!оп е! а1., 1. Ыа!1. Сапсег 1пк!. Моподг. (13): 169-175 (1992)).
В другом воплощении белки согласно изобретению содержат один или несколько иммунореактивных эпитопов, идентифицированных в соответствии с принятыми в данной области методами, таких как пептиды, приведенные в табл. У-ХУШ и ΧΧΙΙ-Ы. Эпитопы СТЬ можно определить с помощью специальных алгоритмов, используемых для идентификации пептидов в белке ЗТЕАР-Ц способных связываться с определенными аллелями НЬА с оптимальной эффективностью (например, табл. IV; Ер1та1г1х™ апй Ертег™, Вго\уп υη^νе^к^ΐу, ИКЬ Ь^ο^η.еάи/Кекеа^ск/ТВ-НIV_^аЬ/ер^ша!^^χ/ер^ша!^^χ.йίш1 и В1МА8, ИКЬ Ытак.асг1.ш11.до\7). Кроме того, способы идентификации пептидов, которые обладают достаточным сродством к молекулам НЬА и по имеющимся данным могут являться иммуногенными эпитопами, хорошо известны в данной области и не требуют проведения излишних экспериментов. Способы идентификации пептидов, которые являются иммуногенными эпитопами, также хорошо известны в данной области и могут проводиться без излишнего экспериментирования либо ίη νί!Γ0, либо ίη νίνο.
В данной области также известны принципы создания аналогов таких эпитопов с целью модулирования иммуногенности. Например, в качестве исходного можно использовать эпитоп, который несет мотив СТЬ или НТЬ (см., например, мотивы/супермотивы НЬА класса I и НЬА класса II в табл. IV). Аналог эпитопа получают путем замены аминокислоты в одном определенном положении на другую аминокислоту, специфичную для данного положения. Например, на основе остатков, приведенных в табл. IV, неблагоприятный остаток можно заменить на любой другой остаток, такой как предпочтительный остаток; менее предпочтительный остаток можно заменить на предпочтительный остаток или заменить изначально присутствующий предпочтительный остаток на другой предпочтительный остаток. Замены можно осуществлять по первичным анкорным положениям или по другим положениям пептида; см., например, табл. IV.
Ряд ссылок отражает состояние уровня техники, связанного с идентификацией и получением эпитопов белка, представляющего интерес, а также его аналогов. См., например, АО 97/33602, СНекни! е! а1.; Зе!!е, Iшшиηοдеηе!^ск, 1999 50(3-4): 201-212; 8ейе е! а1., 1. Iттиηο1. 2001, 166(2): 1389-1397; 5>1Йпеу е! а1., Нит. Iттиηο1. 1997, 58(1): 12-20; Κοηάο е! а1., Iттиηοдеηеί^ск, 1997, 45(4): 249-258; ЗЮнеу е! а1., 1. типо1. 1996, 157(8): 3480-90 и Ра1к е! а1., ХТа!иге, 351: 290-6 (1991); Ниш! е! а1., 8с1епсе, 255: 1261-3 (1992); Рагкег е! а1., 1. Iтшиηο1. 149: 3580-7 (1992); Рагкег е! а1., 1. Iтшиηο1. 152: 163-75 (1994)); Как! е! а1., 1994 152(8): 3904-12; Воггак-Сиек!а е! а1., Ниш. ^шипок 2000 61(3): 266-278; А1ехапйег е! а1., 1. Iтшиηο1. 2000, 164(3): 1625-1633; А1ехапйег е! а1., РМГО: 7895164, VI: 95202582; О'8и11тт е! а1., 1. ^типок 1991, 147(8): 2663-2669; А1ехапйег е! а1., Iтшиη^ίу, 1994, 1(9): 751-761 и А1ехапйег е! а1., ^типок Кек. 1998, 18(2): 79-92.
Родственные воплощения согласно изобретению включают в себя полипептиды, содержащие сочетания разных мотивов, приведенных в табл. ^^)-^(0) и Ш^Н), и/или один или несколько предсказанных эпитопов СТЬ, приведенных в табл. V-ΧVШ и ХХП-Ы, и/или один или несколько предсказанных эпитопов НТЬ, приведенных в табл. ΧΤΥΠ^Μ, и/или один или несколько известных в данной области мотивов, связывающих Т-клетки. Предпочтительные воплощения не содержат вставок, делеций или замен внутри мотивов или внутри последовательностей, встроенных в полипептиды. Кроме того, желательными могут быть воплощения, которые включают в себя ряд любых Ы-концевых и/или С-концевых аминокислотных остатков на любой стороне данных мотивов (например, которые включают в себя более крупный фрагмент полипептидной структуры, содержащий мотив). Как правило, число Х-концевых и/или С-концевых аминокислотных остатков на любой стороне мотива находится в интервале приблизительно от 1 до 100 аминокислотных остатков, предпочтительно приблизительно от 5 до 50 аминокислотных остатков.
Белки, родственные 8ТЕАР-1, могут воплощаться в разных формах, предпочтительно в форме выделенного белка. Очищенная молекула белка 8ТЕАР-1 практически не содержит других белков или молекул, ухудшающих связывание 8ТЕАР-1 с антителом, Т-клеткой или другим лигандом. Природа и степень выделения и очистки зависят от предполагаемого применения. Воплощения белков, родственных 8ТЕАР-1, включают в себя очищенные 8ТЕАР-1-родственные белки и функциональные растворимые 8ТЕАР-1-родственные белки. В одном воплощении функциональный растворимый белок ЗТЕАР-]. или его фрагмент сохраняет способность связывать антитело, Т-клетку или другой лиганд.
- 35 014870
Данное изобретение также предлагает белки ЗТЕАР-1, содержащие биологически активные фрагменты аминокислотной последовательности ЗТЕАР-1, изображенной на фиг. 2 или 3. Такие белки обладают свойствами исходного белка ЗТЕАР-1, такими, как способность вызывать образование антител, специфически связывающихся с эпитопом, ассоциированным с исходным белком 8ТЕАР-1; способность связываться с такими антителами; способность вызывать активацию НТБ или СТБ и/или способность к распознаванию НТЬ или СТЬ, которые специфически связываются с исходным белком.
8ТЕАР-1-родственные полипептиды, которые содержат особенно важные структуры, можно прогнозировать и/или идентифицировать с помощью разных аналитических методов, хорошо известных в данной области, включающих в себя, например, методы Чоу-Фасмана, Гарньер-Робсона, Кит-Дулитла, Эйсенберга, Карплус-Шультца или Джеймсон-Вульфа, или на основе иммуногенности. Фрагменты, содержащие такие структуры, особенно пригодны для получения субъединица-специфичных антител против 8ТЕАР-1 или Т-клеток либо для идентификации клеточных факторов, связывающих 8ТЕАР-1. Например, для получения профилей гидрофильности и идентификации иммуногенных пептидных фрагментов можно использовать метод, описанный в Норр, Т.Р. апб ^ообБ, К.В., 1981, Ргос. №111. Асаб. Зсг и.З.А. 78: 3824-3828. Для получения профилей гидропатичности и идентификации иммуногенных пептидных фрагментов можно использовать метод, описанный в Ку!е, 1. апб Иоо1й11е, В.Е., 1982, 1. Мо1. Вю1. 157: 105-132. Для получения профилей процента (%) доступных остатков и идентификации иммуногенных пептидных фрагментов можно использовать метод, описанный в 1ашп 1., 1979, №!иге, 277: 491-492. Для получения профилей средней жесткости и идентификации иммуногенных пептидных фрагментов можно использовать метод, описанный в ВйаБкагап В., РоппиБ\\'ату Р.К., 1988, Ш!. 1. Рер!. Рго!еш ВеБ. 32: 242-255. Для получения профилей бета-складки и идентификации иммуногенных пептидных фрагментов можно использовать метод, описанный в Ие1еа§е, 6., Воих В., 1987, Рго1е1п Епдтеегтд, 1: 289-294.
Эпитопы СТЬ можно определить с помощью специальных алгоритмов, используемых для идентификации пептидов в белке 8ТЕАР-1, способных связываться с определенными аллелями НБА с оптимальной эффективностью (например, с помощью алгоритмов, которые можно найти на сайте ЗУЕРЕПН в глобальной сети Интернет ИВЬ Бу£рейЫ.Ьт1-йе1бе1Ьег§.сот/; перечисленных в табл. Г^А)-^^); Ер1та!пх™ апб Ер1тег™, Вго\\'п ипВегБЙу, ИВБ (Ьго\уп. еби/ВеБеа^сй/ТВ-НIУ_^аЬ/ер^та!^^x/ер^таΐπx. й!т1) и В^АЗ, ИВБ ЫтаБ.бсП.шй.дох/). В качестве иллюстрации были предсказаны пептидные эпитопы из ЗТЕАР-1 применительно к человеческим молекулам МНС класса I, например НБА-А1, А2, А3, А11, А24, В7 и В35 (см., например, табл. XXII-^I). А именно, полную аминокислотную последовательность белка ЗТЕАР-1 и соответствующие фрагменты других вариантов, т.е. в случае НБА класса I прогнозы 9 фланкирующих участков с каждой стороны точечной мутации или сочленения экзона и в случае НБА класса II прогнозы 14 фланкирующих участков с каждой стороны точечной мутации или сочленения экзона, соответствующие данному варианту, вводят в алгоритм поиска пептидного мотива НБА, который можно найти на указанном выше \\'еЬ-сайте Раздела Биоинформатики и молекулярного анализа (В^АЗ); а также на сайте ЗУБРЕПН! ИВБ Бу£рейЫ.Ьт1-йе1бе1Ьег§.сот/.
Алгоритм поиска пептидного мотива НБА разработан Иг. Кеп Рагкег на основе связывания специфических пептидных последовательностей в бороздках молекул НБА класса I, в частности НБА-А2 (см., например, Еа1к е! а1., №!иге, 351: 290-6 (1991); Нип! е! а1., Заепсе 255: 1261-3 (1992); Рагкег е! а1., 1. ^типоР 149: 3580-7 (1992); Рагкег е! а1., 1. Iттипо1. 152: 163-75 (1994)). С помощью данного алгоритма можно определить местоположение и ранжировать пептиды, состоящие из 8, 9 и 10 мономеров, в полной последовательности белка с целью прогнозирования связывания с НБА-А2, а также с рядом других молекул НБА класса I. Многие пептиды, связывающие НБА класса I, состоят из 8, 9, 10 или 11 мономеров. Например, в случае НБА-А2 класса I эпитопы предпочтительно содержат лейцин (Б) или метионин (М) в положении 2 и валин (V) или лейцин (Б) на С-конце (см., например, Рагкег е! а1., 1. Iттиηо1. 149: 3580-7 (1992)). Отдельные результаты прогнозирования ЗТЕАР-1-связывающих пептидов приведены в табл. У-ЯУШ и данного описания. В табл. У-ЯУШ и XXII-X^VШ приведены некоторые кандидаты семейства, каждый член которого содержит 9 и 10 мономеров, а также их расположение, аминокислотная последовательность каждого пептида и теоретический показатель связывания. В табл. КБУМ^! приведены некоторые кандидаты семейства, каждый член которого содержит 15 мономеров, а также их расположение, аминокислотная последовательность каждого пептида и теоретический показатель связывания. Показатель связывания соответствует теоретическому полупериоду диссоциации комплексов, содержащих пептид, при 37°С и рН 6,5. Предположительно пептиды с наивысшим показателем связывания наиболее прочно связываются с НБА класса I на поверхности клетки в течение наибольшего периода времени и, следовательно, представляют собой наилучшие иммуногенные мишени для распознавания Т-клетками.
Реальное связывание пептидов с аллелью НБА можно определить путем стабилизации экспрессии НБА в антигенпроцессирующей дефектной клеточной линии Т2 (см., например, Xие е! а1., РгоБ!а!е, 30: 73-8 (1997) и РеБЙга е! а1., РгоБ!а!е, 36: 129-38 (1998)). Иммуногенность конкретных пептидов можно определить ш νίΙΐΌ путем стимуляции СИ8+ цитотоксических Т-лимфоцитов (СТБ) в присутствии антигенпрезентирующих клеток, таких как дендритные клетки.
- 36 014870
Следует понимать, что каждый эпитоп, предсказанный с помощью сайта ВГМА8, сайтов Ер1тег™ апб ЕрпшЦпх™ или определенный с помощью мотивов НЬА класса I или класса II, доступных в данной области или которые стали частью данной области, таких как перечисленные в табл. IV (или определенные с помощью сайта глобальной сети ИРЬ 8у£рейЫ.Ьт1-йе1бе1Ьегд.сот/ или В^АЗ, Ь^та8.άсй.η^й.дον/), применяется к белку 8ТЕАР-1 в соответствии с данным изобретением. Специалисту в соответствующей области должно быть понятно, что в данном контексте термин применяется означает, что белок 8ТЕАР-1 анализируют, например, визуально или с помощью компьютерных программ поиска. В объем согласно изобретению входит каждая субпоследовательность белка 8ТЕАР-1, состоящая из 8, 9, 10 или 11 аминокислотных остатков, которая несет мотив НЬА класса I, или субпоследовательность, состоящая из 9 или более аминокислотных остатков, которые несут мотив НЬА класса II.
Ш.В. Экспрессия белков, родственных 8ТЕАР-1.
В воплощении, описанном в нижеследующих примерах, 8ТЕАР-1 можно с помощью традиционных способов экспрессировать в клетках (таких как клетки 293Т), трансфицированных коммерчески доступным вектором экспрессии, таким как СМV-зависимый вектор экспрессии, кодирующий 8ТЕАР-1 с С-концевым 6х Н15 и МУС-маркером (ркДНК3.1/тусН18, ^йтодепот !ад-5, СепНиШег Со грога! ίο η, ΝηδΙινΠ^ ΊΝ). Вектор !ад-5 обеспечивает секреторный сигнал ^СК, который можно использовать для облегчения продукции секретируемого белка 8ТЕАР-1 в трансфицированных клетках. Секретированный в культуральную среду НЕ-меченый 8ТЕАР-1 можно очистить, например, стандартными методами с использованием никелевой колонки.
Ш.С. Модификации белков, родственных 8ТЕАР-1.
В объем согласно изобретению входят модификации белков, родственных 8ТЕАР-1, таких как ковалентные модификации. Один тип ковалентной модификации включает в себя взаимодействие меченых аминокислотных остатков полипептида 8ТЕАР-1 с органическим дериватизирующим средством, которое способно взаимодействовать с отдельными боковыми цепями Ν- или С-концевых остатков белка 8ТЕАР-1. Другой тип ковалентной модификации полипептида 8ТЕАР-1, входящий в объем согласно изобретению, включает в себя изменение природного характера гликозилирования белка согласно изобретению. Следующий тип ковалентной модификации 8ТЕАР-1 включает в себя присоединение полипептида 8ТЕАР-1 к одному из ряда небелковых полимеров, таких как полиэтиленгликоль (РЕС), полипропиленгликоль или полиоксиалкилены, с помощью способов, описанных в патентах США № 4640835;4496689;4301144;4670417; 4791192 или 4179337.
8ТЕАР-1-родственные белки согласно изобретению также можно модифицировать с получением химерной молекулы, в которой 8ТЕАР-1 гибридизован с другой, гетерологичной полипептидной или аминокислотной последовательностью. Такую химерную молекулу можно получить химическими или рекомбинантными способами. Химерная молекула может содержать белок согласно изобретению, гибридизованный с другим опухолевым специфическим антигеном или его фрагментом. Альтернативно, белок в соответствии с данным изобретением может включать в себя гибрид фрагментов последовательности 8ТЕАР-1 (аминокислотной или нуклеотидной) так, что полученная молекула, несмотря на ее длину, не является непосредственно гомологичной аминокислотным или нуклеотидным последовательностям, изображенным на фиг. 2 или 3. Такая химерная молекула может содержать несколько одинаковых субпоследовательностей 8ТЕАР-1. Химерная молекула может включать в себя гибрид 8ТЕАР-1-родственного белка, содержащего в качестве маркера полигистидиновый эпитоп, который может селективно связывать иммобилизованный никель, с цитокинами или факторами роста. Эпитопный маркер обычно помещают на амино- или карбоксильные концы белка 8ТЕАР-1. В альтернативном воплощении химерная молекула может включать в себя гибрид белка, родственного 8ТЕАР-1, с иммуноглобулином или отдельным фрагментом иммуноглобулина. В случае бивалентной формы химерной молекулы (также называемой иммуноадгезин) такой гибрид можно получить с использованием Ес-участка молекулы ^С. Гибриды [д предпочтительно содержат растворимую форму полипептида 8ТЕАР-1 (трансмембранный домен удален или инактивирован) вместо по меньшей мере одного вариабельного участка молекулы ^. В предпочтительном воплощении иммуноглобулиновый гибрид содержит шарнирные участки СН2 и СН3 или шарнирные участки СН1, СН2 и СН3 молекулы ^Сь Получение иммуноглобулиновых гибридов описано, например, в патенте США № 5428130, поданном 27 июня 1995 г.
Ш.Э. Применение 8ТЕАР-1-родственных белков.
Белки согласно изобретению имеют несколько разных применений. Поскольку при раке простаты и при других злокачественных заболеваниях происходит интенсивная экспрессия 8ТЕАР-1, белки, родственные 8ТЕАР-1, используют для определения статуса генных продуктов 8ТЕАР-1 в нормальных тканях по сравнению с раковыми и выявления злокачественного фенотипа на основе полученных результатов. Обычно полипептиды из конкретных участков белка 8ТЕАР-1 используют для анализа изменений (таких как делеции, инсерции, точечные мутации и др.) в данных участках (таких как участки, содержащие один или несколько мотивов). В типичных анализах используют антитела или Т-клетки, специфичные по отношению к 8ТЕАР-1-родственным белкам, которые содержат аминокислотные остатки одного или нескольких биологических мотивов, входящих в состав полипептидной последовательности 8ТЕАР-1, что
- 37 014870 бы сравнить характерные особенности данного участка в нормальной и раковой тканях или чтобы вызвать иммунный ответ на данный эпитоп. Альтернативно, δТЕАР-1-родственные белки, которые содержат аминокислотные остатки одного или нескольких биологических мотивов белка δТЕАР-1, используют для скрининга факторов, взаимодействующих с данным участком δТЕАР-1.
Фрагменты/субпоследовательности белка δТЕАР-1 в особенности подходят для получения и характеристики домен-специфичных антител (например, антител, распознающих внеклеточный или внутриклеточный эпитоп белка δТЕАР-1), для идентификации агентов или клеточных факторов, связывающихся со δТЕАР-1 или его отдельным структурным доменом, а также для применения в разных терапевтических и диагностических контекстах, включающих в себя, без ограничения, диагностические анализы, противораковые вакцины и способы получения таких вакцин.
Белки, кодируемые генами δТЕАР-1 или их аналогами, гомологами или фрагментами, имеют разные применения, включающие в себя, без ограничения, получение антител, а также способы идентификации лигандов и других агентов и клеточных компонентов, которые связываются с генным продуктом δТЕАР-1. Антитела, полученные против белка δТЕАР-1 или его фрагмента, можно использовать в диагностических и прогностических анализах, а также в методах визуализации, использующихся при лечении злокачественных заболеваний человека, характеризующихся экспрессией белка δТЕАР-1, таких как перечисленные в табл. I. Такие антитела, экспрессирующиеся внутри клетки, можно использовать в способах лечения пациентов с такими раковыми заболеваниями. Родственные δТЕАР-1 нуклеиновые кислоты или белки также используются для получения НТЬ- или СТЬ-ответов.
Для детектирования белков δТЕАР-1 можно использовать разные биологические анализы, включающие в себя, без ограничения, разные типы радиоиммунологических анализов: твердофазный иммуноферментный анализ (ЕЬЫА), флуоресцентный иммуноферментный анализ (ЕЫЕА), иммунохимические анализы и т. п. Антитела можно метить и использовать в качестве визуализирующих реагентов, позволяющих детектировать δ ТЕ АР-1 -экспрессирующие клетки (например, в радиосцинтиграфических методах визуализации). Белки δТЕАР-1 в особенности подходят для получения противораковых вакцин, как описано ниже в данном документе.
IV. Антитела δТЕАР-1.
В другом аспекте данное изобретение предлагает антитела, которые связывают δТЕАР-1-родственные белки. Предпочтительные антитела в физиологических условиях специфично связываются с белком, родственным δТЕАР-1, и не связываются (или слабо связываются) с пептидами или белками, отличными от белков, родственных δТЕАР-1. В данном контексте примеры физиологических условий включают в себя 1) забуференный фосфатом физиологический раствор; 2) забуференный Тгй физиологический раствор, содержащий 25 мМ Тгй и 150 мМ №С1; или обычный физиологический раствор (0,9% №101); 4) животную сыворотку, например человеческую сыворотку; или 5) сочетание любых условий 1)-4); указанные реакции предпочтительно проводят при рН 7,5, альтернативно, в интервале рН от 7,0 до 8,0 или, альтернативно, в интервале рН от б,5 до 8,5 и при температуре от 4 до 37°С. Например, антитела, которые связывают δТЕАР-1, могут связывать δТЕАР-1-родственные белки, например, их гомологи или аналоги.
Антитела δТЕАР-1 согласно изобретению в особенности подходят для применения в диагностике и прогнозировании злокачественных заболеваний (см., например, табл. I), а также в визуализирующих методах. Подобным образом, такие антитела можно использовать для лечения, диагностики и/или прогнозирования рака простаты и других злокачественных заболеваний, которые сопровождаются экспрессией или сверхэкспрессией δТЕАР-1. Более того, антитела, экспрессирующиеся внутри клеток (например, одноцепочечные антитела), можно использовать для лечения злокачественных заболеваний, которые сопровождаются экспрессией δТЕАР-1, таких как запущенный или метастазирующий рак простаты или другие запущенные или метастазирующие злокачественные заболевания.
Данное изобретение также предлагает различные иммунологические методы для детектирования и количественного определения δТЕАР-1 и мутантных δТЕАР-1-родственных белков. Такие анализы могут включать в себя применение одного или нескольких антител δТЕАР-1, способных распознавать и связывать белок, родственный δТЕАР-1, в зависимости от обстоятельств. Данные анализы проводят в формате разных иммунологических анализов, хорошо известных в данной области, включающих в себя, без ограничения, разные типы радиоиммунологических анализов: твердофазный иммуноферментный анализ (ЕЬКА), флуоресцентный иммуноферментный анализ (ЕЫЕА) и т.п.
Иммунологические анализы согласно изобретению, в которых не используются антитела, включают в себя анализ иммуногенности Т-клеток (ингибиторный или стимуляторный), а также анализ связывания главного комплекса гистосовместимости (МНС).
Данное изобретение также предлагает способы иммунологической визуализации, позволяющие диагностировать рак простаты и другие злокачественные заболевания, сопровождающиеся экспрессией δТЕАР-1, данные способы включают в себя, без ограничения, радиосцинтиграфические методы визуализации с использованием меченых антител δТЕАР-1. Такие анализы можно использовать в клинике для диагностирования, мониторинга и прогнозирования злокачественных заболеваний, сопровождающихся экспрессией δТЕАР-1, таких как рак простаты.
- 38 014870
Антитела 8ТЕАР-1 также используют в способах очистки белков, родственных 8ТЕАР-1, а также в способах выделения гомологов 8ТЕАР-1 и родственных молекул. Например, способ очистки белка, родственного 8ТЕАР-1, включает в себя инкубацию антитела 8ТЕАР-1, иммобилизованного на твердом носителе, с лизатом или другим раствором, содержащим белок, родственный 8ТЕАР-1, в условиях, которые позволяют антителу 8ТЕАР-1 связываться с белком, родственным 8ТЕАР-1; промывание твердого носителя для удаления примесей и элюирование белка, родственного 8ТЕАР-1, с иммобилизованного антитела. Другие применения антител 8ТЕАР-1 в соответствии с данным изобретением включают в себя получение антиидиотипических антител, которые имитируют белок 8ТЕАР-1.
В данной области известно много способов получения антител. Например, антитела можно получить путем иммунизации подходящего млекопитающего-хозяина 8ТЕАР-1-родственным белком, пептидом или фрагментом в выделенной или иммуноконъюгированной форме (АибЬоб1е8: А ЬаЬога!огу Маииа1, С8Н Рге88, Еб8., Наг1оте, аиб Ьаие (1988); Наботе, АибЬоб1е8, Со1б 8рпп§ НагЬог Рге88, ΝΥ (1989)). Также можно использовать гибридные белки 8ТЕАР-1, такие как гибридный белок 8ТЕАР-1-С8Т. В отдельном воплощении получают гибридный белок С8Т, содержащий полноразмерную аминокислотную последовательность, приведенную на фиг. 2 или 3, или ее большую часть, и используют его в качестве иммуногена для получения соответствующих антител. В другом воплощении синтезируют белок, родственный 8ТЕАР-1, и используют его в качестве иммуногена.
Кроме того, используют известные в данной области методы иммунизации оголенной ДНК (в присутствии или в отсутствие белка, родственного 8ТЕАР-1, или клеток, экспрессирующих 8ТЕАР-1), чтобы получить иммунный ответ на кодируемый антиген (обзор можно найти в Ооииебу е! а1., 1997, Аии. Неу. 1ттиио1. 15: 617-648).
Аминокислотную последовательность белка 8ТЕАР-1, изображенную на фиг. 2 или 3, можно проанализировать, чтобы выбрать конкретные участки белка 8ТЕАР-1 для получения антител. Например, для идентификации гидрофильных участков в структуре 8ТЕАР-1 проводят анализы гидрофобности и гидрофильности аминокислотной последовательности 8ТЕАР-1. Участки белка 8ТЕАР-1, обладающие иммуногенной структурой, а также другие участки и домены можно легко идентифицировать с помощью других методов, известных в данной области, таких как анализы Чоу-Фасмана, Гарньер-Робсона, КитДулитла, Эйсенберга, Карплус-Шультца или Джеймсон-Вульфа. Профили гидрофильности можно получить с помощью метода, описанного в Норр, Т.Р. аиб Vооб8, К.Н., 1981, Ргое. №111. Аеаб. 8е1. И.8.А. 78: 3824-3828. Профили гидропатичности можно получить с помощью метода, описанного Ку!е, I. аиб Ооо11Н1е, Н.Е., 1982, I. Мо1. Вю1. 157: 105-132. Профили процента (%) доступных остатков можно получить с помощью метода, описанного 1аши I., 1979, №!ите, 277: 491-492. Профили средней жесткости можно получить с помощью метода, описанного Вйа8катаи Н., Роиии8теату Р.К., 1988, 1и!. I. Рер!. Рто!еш Не8. 32: 242-255. Профили бета-складки можно получить с помощью метода, описанного Ое1еаде, С., Ноих В., 1987, Рто!еш Еидшеебид, 1: 289-294. Таким образом, все участки, идентифицированные с помощью любых указанных программ или методов, входят в объем согласно изобретению. Предпочтительные способы получения антител 8ТЕАР-1 дополнительно иллюстрируются с помощью примеров, описанных в данном документе. Способы получения белка или полипептида для применения в качестве иммуногена хорошо известны в данной области. В данной области также хорошо известны способы получения иммуногенных конъюгатов белка с носителем, таким как БСА, КЬН или другой белок-носитель. В некоторых случаях проводят непосредственную конъюгацию с использованием, например, карбодиимидных реагентов; в других случаях эффективными являются конденсирующие реагенты, например, поставляемые Р1егее С11ет1еа1 Со., НоекГогб, 1Ь. Введение иммуногена 8ТЕАР-1 часто осуществляют путем введения в течение подходящего периода времени и с использованием подходящего адъюванта, как известно специалистам в данной области. Степень образования антител в процессе схемы иммунизации оценивают путем определения титра антител.
Моноклональные антитела 8ТЕАР-1 можно получить с помощью известных в данной области способов. Например, широко известно, что иммортализованные клеточные линии, которые секретируют целевое моноклональное антитело, получают с помощью стандартного гибридомного метода Келера и Милштейна (КоЫет аиб МЙ8!еш) или с помощью модификаций, приводящих к иммортализации антитело-продуцирующих В-клеток. Иммортализованные клеточные линии, которые секретируют целевые антитела, подвергают скринингу с помощью иммунологического анализа, в котором антиген представляет собой белок, родственный 8ТЕАР-1. После идентификации подходящей иммортализованной клеточной культуры клеткам дают расти и продуцировать антитела либо в культурах 1и У1бо, либо в асцитной жидкости.
Антитела или фрагменты согласно изобретению также можно получить рекомбинантными способами. Участки, которые специфически связываются с целевыми участками белка 8ТЕАР-1, можно получить в составе антител с привитыми химерными или гипервариабельными (СОК) участками, относящимися к другим видам. Также можно получить гуманизированные или человеческие антитела, которые являются предпочтительными при применении в терапии. Способы гуманизации мышиных и других, отличных от человеческих антител путем замещения одного или нескольких СОН из нечеловеческих антител на соответствующие последовательности человеческих антител хорошо известны (см., напри
- 39 014870 мер, 1опек е! а1., 1986, №!иге, 321: 522-525; В1есйтапп е! а1., 1988, №!иге, 332: 323-327; Хегкоеуеп е! а1., 1988, 8с1епсе, 239: 1534-1536, а также Сайег е! а1., 1993, Ргос. Νη11. Асай. 8с1. И8А, 89: 4285 и 81тк е! а1., 1993, I. Iттипо1. 151: 2296).
Способы получения полностью человеческих антител включают в себя методы фаговых дисплеев и трансгенные методы (обзор см. в Хаидкап е! а1., 1998, №1иге Вю!ескпо1оду, 16: 535-539). Полностью человеческие моноклональные антитела 8ТЕАР-1 можно получить с помощью методов клонирования с использованием больших комбинаторных библиотек генов человеческих (т.е. фаговых дисплеев) (СпПЕикк апй НоодепЬоот, Виййтд ап т уйго 1ттипе кук!ет: китап апйЬой1ек Егот рйаде й1кр1ау НЬгапек. Ш: Рго!еш Епдтеейпд оГ АпйЬойу Мо1еси1ек Гог Ргорйу1асйс апй Тйегареийс Аррйсайопк ш Мап, С1агк, М. (Ей.), ШШпдкат Асайетк, р. 45-64 (1993); Вийоп апй ВаГЬак, Нитап АпйЬой1ек Егот сотЬша!опа1 НЬгапек. И., р. 65-82). Полностью человеческие моноклональные антитела 8ТЕАР-1 также можно получить с помощью трансгенных мышей, содержащих локус гена человеческого иммуноглобулина, как описано в патентной заявке РСТ VО 98/24893, Кисйег1арай апй 1акоЬоуйк е! а1., опубликованной 3 декабря 1997 г. (см. также 1акоЬоуйк, 1998, Ехр. Орт. Шуек!. Эгидк, 7(4): 607-614; патенты США 6162963, выданный 19 декабря 2000 г.; 6150584, выданный 12 ноября 2000 г.; и 6114598, выданный сентября 2000 г.). Данный метод позволяет эффективно получать аутентичные человеческие антитела с высоким сродством, избегая манипуляций ш уйго, необходимых в методе фаговых дисплеев.
Реакционноспособность антител 8ТЕАР-1 по отношению к белку, родственному 8ТЕАР-1, можно определить с помощью ряда хорошо известных способов, включающих в себя вестерн-блоттинг, иммунопреципитацию, анализы ЕЫ8А и РАС8, с использованием в зависимости от обстоятельств 8ТЕАР-1-родственные белки, 8ТЕАР-1-экспрессирующие клетки или их экстракты. Антитело 8ТЕАР-1 или его фрагмент можно пометить детектируемым маркером или конъюгировать с другой молекулой. Подходящие детектируемые маркеры включают в себя, без ограничения, радиоактивные изотопы, флуоресцентные соединения, хемилюминесцентные соединения, соединения, образующие комплексы с металлами или ферменты. Далее, биспецифические антитела, специфичные по отношению к двум или более эпитопам 8ТЕАР-1, получают с помощью методов, широко известных в данной области. Гомодимерные антитела можно получить с помощью известных в данной области методов поперечной сшивки (например, ’№о1ЕП е! а1., Сапсег Век. 53: 2560-2565).
В одном воплощении данное изобретение предлагает моноклональные антитела, идентифицированные как мышиная гибридома Х92.1.30.1.1 (1) и мышиная гибридома Х120.545.1.1, помещенные на хранение в Американскую коллекцию типовых культур, 10801 Ишуегкйу В1уй. Мапаккак, VА 20110-2209, февраля 2004 г., с присвоением номеров доступа в АТСС РТА-5802 и РТА-5803 соответственно.
V. Клеточные иммунные ответы 8ТЕАР-1.
Механизм, посредством которого Т-клетки распознают антигены, известен. Эффективные вакцинные композиции согласно изобретению, содержащие пептидные эпитопы, индуцируют терапевтические или профилактические иммунные ответы в очень широких слоях населения во всем мире. Ниже приводится краткий обзор связанной с иммунологией технологии, позволяющий лучше понять значение и эффективность композиций согласно изобретению, индуцирующих клеточные иммунные ответы.
Комплекс молекулы НЬА и пептидного антигена действует как лиганд, распознаваемый НЬА-ограниченными Т-клетками (Виик, 8. е! а1., Се11, 47: 1071, 1986; ВаЬЬй!, В.Р. е! а1., №!иге, 317: 359, 1985; Тотепкепй, А. апй Войтег, Н., Аппи. Веу. ^типоЕ 7: 601, 1989; Оегтат, В.К, Аппи. Веу. ^типок 11: 403, 1993). В результате анализа аналогов антигена с единичной аминокислотной заменой и секвенирования эндогенно связанных, естественно процессированных пептидов были идентифицированы критические остатки, относящиеся к мотивам, необходимым для специфического связывания с молекулами антигена НЬА, указанные критические остатки приведены в табл. IV (см. также, например, 8ои!ктеоой, е! а1., I. Iттиηо1. 160: 3363, 1998; Ваттепкее, е! а1., ^ти^де^^ск, 41: 178, 1995; Ваттепкее е! а1., 8ΥРРΕIТНI, доступный в Интернете на сайте ИВЬ (134.2.96.221/кспр!к.Ыакегуег.й11/йоте.й!т); 8ейе, А. апй 81йпеу, I. Сигг. Орт. Iттиηо1. 10: 478, 1998; ЕпдеШагй, V.Н., Сигг. Орт. Iттипо1. 6: 13, 1994; 8е!!е, А. апй Сгеу, Н.М., Сигг. Орт. Iттипо1. 4: 79, 1992; 81тдад11а, Р. апй Наттег, I. Сигг. Вю1. 6: 52, 1994; Виррей е! а1., Се11. 74: 929-937, 1993; Копйо е! а1., I. Iттипо1. 155: 4307-4312, 1995; 81йпеу е! а1., I. ^типок 157: 3480-3490, 1996; 81йпеу е! а1., Нитап ^типок 45: 79-93, 1996; 8ейе, А. апй 81йпеу, I. Iттиподепейск, 1999, Ш.; 50 (3-4): 201-12, Веу1ете).
Кроме того, с помощью рентгеноструктурного анализа комплексов НЬА-пептид были обнаружены карманы в пептидсвязывающей щели/бороздке молекул НЬА, которые принимают в аллельспецифичном режиме остатки пептидных лигандов; данные остатки, в свою очередь, определяют НЬА-связывающую способность пептидов, в которых они находятся (см., например, Маййеп, Э.В. Аппи. Веу. Iттиηо1. 13: 587, 1995; 8тйк, е! а1., Iттишίу, 4: 203, 1996; Ргетоп! е! а1., Iттишίу, 8: 305, 1998; 8!ет е! а1., 8йис!иге, 2: 245, 1994; 1опек, Е^ Сигг. Орт. ^типоЕ 9: 75, 1997; Вготеп, ЕН. е! а1., №!иге, 364: 33, 1993; Ойо, Н.С. е! а1., Ргос. №!1. Асай. 8сЕ И8А, 90: 8053, 1993; Ойо, Н.С. е! а1., №!иге, 360: 364, 1992; 8йуег, М.Ь. е! а1., №!иге, 360: 367, 1992; Ма!китига, М. е! а1., 8с1епсе, 257: 927, 1992; Маййеп е! а1., Се11, 70: 1035, 1992; Ргетоп!, Э.Н. е! а1., 8с1епсе, 257: 919, 1992; 8арег, М.А., Вргктап, Р.1. апй νί^ν, Э.С., I. Мо1. Вю1. 219: 277, 1991).
- 40 014870
Соответственно определение аллель-специфичных НЬА-связывающих мотивов класса I и класса II или супермотивов класса I и класса II позволяет идентифицировать участки белка, отвечающие за связывание с конкретным антигеном (антигенами) НЬА.
Таким образом, в результате идентификации мотива НЬА были идентифицированы вакциныкандидаты на основе эпитопов; такие кандидаты можно также оценивать с помощью анализов связывания НЬА-пептид, чтобы определить сродство связывания и/или период существования комплекса эпитопа с соответствующей молекулой НЬА. Чтобы выбрать среди вакцин-кандидатов эпитопы с предпочтительными характеристиками, касающимися популяционного распределения и/или иммуногенности, нужно провести другие отборочные анализы.
Для определения иммуногенности клеток можно использовать разные стратегии, в том числе:
1) анализ первичных Т-клеточных культур от нормальных субъектов (см., например, Аеп1\уог111. Р.А. е! а1., Мо1. Iттиио1. 32: 603, 1995; СеШ, Е. е! а1., Ргос. №Й. Асаб. 8с1. И8А, 91: 2105, 1994; Ткац V. е! а1., I. ^тииоЕ 158: 1796, 1997; Ка^акЫта, I. е! а1., Нитаи ^тииок 59: 1, 1998). Данная процедура включает в себя стимуляцию лимфоцитов периферической крови (РВЬ) от нормальных субъектов тестируемым пептидом в присутствии антигенпрезентирующих клеток ίη νίΙΐΌ в течение нескольких недель. Специфичные к пептиду Т-клетки активируются в течение указанного времени и их детектируют, например, с помощью анализа высвобождения лимфокинов или 51Сг из клеток-мишеней, сенсибилизированных пептидом;
2) иммунизация трансгенных НЬА-мышей (см., например, АеШ^оПН, Р.А. е! а1., Е Iттиио1. 26: 97, 1996; АеШ^оПН, Р.А. е! а1., Ш!. Iттиио1. 8: 651, 1996; А1ехапбег, I. е! а1., I. ^тииок 159: 4753, 1997). Например, в таких способах пептиды вводят подкожно трансгенным НЬА-мышам в неполном адъюванте Фрейнда. Через несколько недель после иммунизации спленоциты выделяют и культивируют 1и ν 11го в присутствии тестируемого пептида в течение приблизительно одной недели. Пептидспецифичные Т-клетки детектируют, например, с помощью анализа высвобождения 51Сг, в котором участвуют клеткимишени, сенсибилизированные пептидом, и клетки-мишени, экспрессирующие эндогенный антиген;
3) демонстрация повторных Т-клеточных ответов у иммунных субъектов, которые были эффективно вакцинированы и/или являются хронически больными пациентами (см., например, ЯеΗе^таππ. В. е! а1., I. Ехр. Меб. 181: 1047, 1995; Ооо1аи, О.Ь. е! а1., [ттииНу 7: 97, 1997; Вейош, В. е! а1., I. С1т. ЕтсеН. 100: 503, 1997; Тйге1ке1б, 8.С. е! а1., I. Iттиηо1. 159: 1648, 1997; П1еро1бег, Н.М. е! а1., I. У1го1. 71: 6011, 1997). Соответственно повторные ответы детектируют путем культивирования РВЬ, полученных от субъектов, испытывающих воздействие антигена в результате заболевания, и, следовательно, генерирующих естественный иммунный ответ, или от пациентов, которые были вакцинированы против данного антигена. Полученные от субъектов РВЬ культивируют 1и νί!ΐΌ в течение 1-2 недель в присутствии тестируемого пептида и антигенпрезентирующих клеток (АРС), чтобы обеспечить активацию Т-клеток памяти по сравнению с наивными Т-клетками. В конце периода культивирования активность Т-клеток детектируют с помощью анализов, включающих в себя высвобождение 51Сг из сенсибилизированных пептидом мишеней, пролиферацию Т-клеток и высвобождение лимфокинов.
VI. 8ТЕАР-1-трансгенные животные.
Нуклеиновые кислоты, кодирующие белок, родственный 8ТЕАР-1, также можно использовать для получения либо трансгенных животных, либо животных с нокаутным геном, которые, в свою очередь, можно использовать для разработки и скрининга терапевтических средств. В соответствии с общепринятыми методами, кДНК, кодирующую 8ТЕАР-1, можно использовать для клонирования геномной ДНК, кодирующей 8ТЕАР-1. Затем клонированные геномные последовательности можно использовать для получения трансгенных животных, содержащих клетки, которые экспрессируют ДНК, кодирующую 8ТЕАР-1. Способы получения трансгенных животных, в частности, таких как мыши или крысы, широко используются в данной области и описаны, например, в патентах США № 4736866, выданном 12 апреля 1988 г., и 4870009, выданном 26 сентября 1989 г. Как правило, для внедрения трансгена 8ТЕАР-1 вместе с тканеспецифичным энхансером используют особые клетки.
Трансгенных животных, которые содержат копию трансгена, кодирующего 8ТЕАР-1, можно использовать для детектирования повышенной экспрессии ДНК, кодирующей 8ТЕАР-1. Таких животных можно использовать для тестирования реагентов, предположительно эффективных, например, против патологических состояний, связанных с повышенной экспрессией указанной ДНК. В соответствии с данным аспектом согласно изобретению уменьшение числа случаев патологического состояния у животных, получающих реагент, по сравнению с необработанными животными, несущими трансген, указывает на возможное терапевтическое воздействие на данное патологическое состояние.
- 41 014870
Альтернативно, нечеловеческие гомологи 8ТЕАР-1 можно использовать для конструирования животного с нокаутным геном 8ТЕАР-1, у которого ген, кодирующий 8ТЕАР-1, становится дефективным или изменяется в результате гомологичной рекомбинации между эндогенным геном, кодирующим 8ТЕАР-1, и измененной геномной ДНК, кодирующей 8ТЕАР-1, введенной в эмбриональную клетку животного. Например, кДНК, кодирующую 8ТЕАР-1, можно использовать для клонирования ДНК, кодирующей 8ТЕАР-1, в соответствии с широко используемыми в данной области методами. Фрагмент геномной ДНК, кодирующей 8ТЕАР-1, можно удалить или заменить на другой ген, такой как ген, кодирующий селектируемый маркер, используемый для отслеживания интеграции.
Обычно в состав вектора включают несколько тысяч оснований неизмененной фланкирующей ДНК (как с 5'-, так и с 3'-конца) (описание гомологичных рекомбинантных векторов можно найти, например, в Т1юша5 апб СарессЫ, Се11, 51: 503 (1987)). Вектор вводят в линию эмбриональных стволовых клеток (например, методом электропорации), после чего отбирают клетки, в которых произошла гомологичная рекомбинация введенной ДНК и эндогенной ДНК (см., например, Ы е! а1., Се11, 69: 915 (1992)). Затем отобранные клетки вводят в бластоцисту животного (например, мыши или крысы) с получением агрегационных химер (см., например, Вгаб1еу, ш ТегаФсагсшотак апб ЕтЬгуоп1с 81ет Се1к: А Ргасйса1 Арргоасй, Е.1. ВоЬегйоп, еб. (ШЬ, ОхФгб, 1987), р. 113-152). Полученный химерный эмбрион имплантируют подходящей псевдобеременной самке животного для вынашивания, после чего эмбрион считается эмбрионом животного с нокаутным геном. Потомство, в гаметах которого содержится ДНК с гомологичной рекомбинацией, можно идентифицировать стандартными методами и использовать для выведения животных, у которых все клетки содержат ДНК с гомологичной рекомбинацией. Животные с нокаутным геном могут характеризоваться, например, способностью сопротивляться некоторым патологическим состояниям или развитием патологических состояний, являющихся следствием отсутствия полипептида 8ТЕАР-1.
VII. Способы детектирования 8ТЕАР-1.
Другой аспект согласно изобретению относится к способам детектирования полинуклеотидов 8ТЕАР-1 и белков, родственных 8ТЕАР-1, а также к способам идентификации клеток, экспрессирующих 8ТЕАР-1. Профиль экспрессии 8ТЕАР-1 позволяет использовать его в качестве маркера для диагностики метастазирующего заболевания. Соответственно, на основе статуса генных продуктов 8ТЕАР-1 можно прогнозировать ряд факторов, в том числе возможность развития поздней стадии заболевания, скорость развития и/или агрессивность опухоли. Как описано в данном документе, статус генных продуктов 8ТЕАР-1 в образцах пациента можно анализировать с помощью ряда методов, хорошо известных в данной области и включающих в себя иммуногистохимический анализ, ряд методов нозерн-блоттинга, в том числе с использованием гибридизации ίη Цф, анализ ОТ-ПЦР (например, на микроиссеченных образцах с лазерным улавливанием), вестерн-блоттинг и анализ тканей с использованием чипов.
Более конкретно, данное изобретение предлагает анализы для детектирования полинуклеотидов 8ТЕАР-1 в биологическом образце, таком как сыворотка, кость, простата и другие ткани, моча, семенная жидкость, препараты клеток и т.п. Детектируемые полинуклеотиды 8ТЕАР-1 включают в себя, например, ген 8ТЕАР-1 или его фрагмент, мРНК 8ТЕАР-1, альтернативные сплайсинговые варианты мРНК 8ТЕАР-1 и рекомбинантные молекулы ДНК или РНК, которые содержат полинуклеотид 8ТЕАР-1. При осуществлении данного аспекта согласно изобретению можно использовать ряд способов амплификации и/или детектирования присутствия полинуклеотидов 8ТЕАР-1, хорошо известных в данной области.
В одном воплощении способ детектирования мРНК 8ТЕАР-1 в биологическом образце включает в себя получение кДНК из образца путем обратной транскрипции с использованием по меньшей мере одного праймера; амплификацию полученной кДНК с использованием полинуклеотидов 8ТЕАР-1 в качестве смыслового и антисмыслового праймеров и детектирование присутствия амплифицированной кДНК 8ТЕАР-1. Необязательно можно определить последовательность амплифицированной кДНК 8ТЕАР-1.
В другом воплощении способ детектирования гена 8ТЕАР-1 в биологическом образце включает в себя выделение геномной ДНК из образца; амплификацию выделенной геномной ДНК с использованием полинуклеотидов 8ТЕАР-1 в качестве смысловых и антисмысловых праймеров и детектирование присутствия амплифицированного гена 8ТЕАР-1. Из нуклеотидной последовательности 8ТЕАР-1 можно получить любое число подходящих сочетаний смысловых и антисмысловых зондов, подходящих для применения в вышеуказанном анализе (см., например, фиг. 2).
Данное изобретение также предлагает анализы для детектирования присутствия белка 8ТЕАР-1 в ткани или другом биологическом образце, таком как сыворотка, семенная жидкость, кость, простата, моча, препараты клеток и т.п. Способы детектирования белка, родственного 8ТЕАР-1, также хорошо известны и включают в себя, например, иммунопреципитацию, иммуногистохимический анализ, вестернблоттинг, анализ молекулярного связывания, ЕЫЗА, ЕЫРА и т.п. Например, способ детектирования присутствия белка, родственного 8ТЕАР-1, в биологическом образце включает в себя приведение образца в контакт с антителом 8ТЕАР-1, его реакционноспособным по отношению к 8ТЕАР-1 фрагментом или рекомбинантным белком, содержащим антигенсвязывающий участок антитела 8ТЕАР-1; и затем детектирование связывания белка, родственного 8ТЕАР-1, в образце.
- 42 014870
Способы идентификации клеток, экспрессирующих 8ТЕАР-1, также входят в объем согласно изобретению. В одном воплощении способ идентификации клетки, экспрессирующей ген 8ТЕАР-1, включает в себя детектирование присутствия мРНК 8ТЕАР-1 в клетке. Способы детектирования конкретных мРНК в клетках хорошо известны и включают в себя, например, гибридизационные анализы с использованием в качестве зондов комплементарных ДНК (такие как гибридизация 1п кйи с использованием меченых рибозондов 8ТЕАР-1, нозерн-блоттинг и родственные методы) и различные анализы с использованием амплификации нуклеиновых кислот (такие как ОТ-ПЦР с использованием комплементарных праймеров, специфичных для 8ТЕАР-1, а также другие способы детектирования на основе амплификации, такие как, например, метод многоцепьевых ДНК, 818ВА, ТМА и т.п.). Альтернативно, способ идентификации клеток, экспрессирующих ген 8ТЕАР-1, включает в себя детектирование присутствия 8ТЕАР-1-родственного белка в клетке или его секреции клеткой. В данной области известно много способов детектирования белков, которые можно использовать для детектирования 8ТЕАР-1-родственных белков и клеток, экспрессирующих 8ТЕАР-1-родственные белки.
Анализ экспрессии 8ТЕАР-1 также используется для идентификации и характеристики средств, модулирующих экспрессию гена 8ТЕАР-1. Например, при раке простаты и злокачественных заболеваниях тканей, перечисленных в табл. I, происходит значительное увеличение экспрессии 8ТЕАР-1. Идентификация молекул или биологических средств, ингибирующих экспрессию или сверхэкспрессию 8ТЕАР-1, в раковых клетках имеет терапевтическое значение. Например, такое средство можно идентифицировать с помощью скрининга, в котором проводят количественное определение экспрессии 8ТЕАР-1 с использованием ОТ-ПЦР, гибридизации нуклеиновых кислот или связывания антител.
VIII. Способы мониторинга статуса 8ТЕАР-1-родственных генов и их продуктов.
Онкогенез представляет собой многостадийный процесс, характеризующийся нарастающим нарушением клеточного роста и развитием клеток из нормального физиологического состояния до предракового и затем ракового состояния (см., например, А1егк е! а1., ЬаЬ [пуек!. 77(5): (1997) и Нааск е! а1., Сапсег 8игу. 23: 19-32 (1995)). В данном контексте анализ биологического образца на признаки нарушения клеточного роста (такие как аберрантная экспрессия 8ТЕАР-1 в раковых тканях) позволяет осуществить раннюю диагностику такого аберрантного физиологического состояния до того, как патологическое состояние, такое как рак, разовьется до стадии, при которой терапевтические средства имеют ограниченный эффект и/или которой соответствует плохой прогноз. В таких анализах статус 8ТЕАР-1 в исследуемом биологическом образце можно сравнить, например, со статусом 8ТЕАР-1 в соответствующей нормальной ткани (например, в образце, который не имеет патологических изменений и получен от того же субъекта или, альтернативно, от другого субъекта). Изменение статуса 8ТЕАР-1 в биологическом образце (по сравнению с нормальной тканью) свидетельствует о нарушении регуляции клеточного роста. Помимо применения в качестве нормального образца биологического образца, не имеющего патологических изменений, для сравнения статуса 8ТЕАР-1 в образце также можно использовать предварительно определенное нормативное значение, такое как предварительно определенный нормальный уровень экспрессии мРНК (см., например, Сгегег е! а1., I. Сотр. №иго1. 1996, Эес 9; 376(2) и патент США № 5837501).
Термин статус в данном контексте используют в соответствии с принятым в данной области значением и относят к состоянию или положению гена и его продуктов. Как правило, чтобы охарактеризовать состояние или положение гена и его продуктов, опытные специалисты используют ряд параметров. Данные параметры включают в себя, без ограничения, местоположение продуктов экспрессируемого гена (в том числе местоположение клеток, экспрессирующих 8ТЕАР-1), а также уровень и биологическую активность экспрессируемых генных продуктов (таких как мРНК, полинуклеотиды и полипептиды 8ТЕАР-1). Как правило, изменение статуса 8ТЕАР-1 включает в себя изменение местоположения 8ТЕАР-1 и/или 8ТЕАР-1 -экспрессирующих клеток и/или увеличение экспрессии мРНК и/или белка 8ТЕАР-1.
Статус 8ТЕАР-1 в образце можно определить с помощью ряда способов, хорошо известных в данной области и включающих в себя, без ограничения, иммуногистохимический анализ, гибридизацию ш кйи, анализ ОТ-ПЦР на микроиссеченных образцах с лазерным улавливанием, вестерн-блоттинг и анализ тканей с использованием чипов. Типичные способы определения статуса гена и генных продуктов 8ТЕАР-1 можно найти, например, в АикиЬе1 е! а1. ебк., 1995, Сштеп! Рго!осо1к Ш Мо1еси1аг Вю1оду, ипйк 2 (№г111егп В1ойтд), 4 (8ои!йегп В1ойтд), 15 (^типоМой/пё) апб 18 (РСН Апа1ук1к). Так, статус 8ТЕАР-1 в биологическом образце можно определить с помощью разных методов, используемых специалистами в данной области, которые включают в себя, без ограничения, саузерн-анализ генома (для определения, например, изменений в гене 8ТЕАР-1), нозерн-анализ и/или ПЦР-анализ мРНК 8ТЕАР-1 (для определения, например, изменений в полинуклеотидных последовательностях или уровнях экспрессии мРНК 8ТЕАР-1) и вестерн-блоттинг и/или иммуногистохимический анализ (для определения, например, изменений в полипептидных последовательностях, в местоположении полипептида в образце, в уровнях экспрессии белков 8ТЕАР-1 и/или комплексов белков 8ТЕАР-1 с полипептидсвязывающими партнерами). Детектируемые полинуклеотиды 8ТЕАР-1 включают в себя, например, ген 8ТЕАР-1 или его фрагмент, мРНК 8ТЕАР-1, варианты, образованные в результате альтернативного сплайсинга, мРНК
- 43 014870
8ТЕАР-1 и рекомбинантные молекулы ДНК или РНК, содержащие полинуклеотид 8ТЕАР-1.
Профиль экспрессии 8ТЕАР-1 позволяет использовать его в качестве диагностического маркера для локального и/или метастазирующего заболевания и предоставляет информацию о росте или онкогенном потенциале биологического образца. В частности, на основе статуса генных продуктов 8ТЕАР-1 можно прогнозировать ряд факторов, в том числе возможность развития конкретных стадий заболевания, скорость развития и/или агрессивность опухоли. Данное изобретение предлагает способы и анализы для определения статуса 8ТЕАР-1 и диагностики злокачественных заболеваний, таких как злокачественные заболевания тканей, перечисленных в табл. I. Например, поскольку мРНК 8ТЕАР-1 интенсивно экспрессируется в раковых тканях простаты, а также в других раковых тканях по сравнению с нормальной тканью простаты, анализы, позволяющие определить уровни транскриптов мРНК или белков 8ТЕАР-1 в биологическом образце, можно использовать для диагностики заболевания, связанного с нарушением регуляции 8ТЕАР-1, и получения информации, позволяющей выбрать подходящие способы лечения.
Статус экспрессии 8ТЕАР-1 предоставляет информацию о присутствии, стадии и местоположении диспластических, предраковых и раковых клеток и позволяет прогнозировать возможность развития разных стадий заболевания и/или оценивать агрессивность опухоли. Более того, профиль экспрессии позволяет использовать 8ТЕАР-1 для визуализации метастазирующего заболевания. Следовательно, один аспект согласно изобретению направлен на разные методы молекулярного прогнозирования и молекулярной диагностики, позволяющие определить статус 8ТЕАР-1 в биологических образцах, таких как образцы, полученные от субъектов, которые имеют, или предположительно имеют патологию, характеризующуюся нарушением регуляции клеточного роста, такую как рак.
Как описано выше, статус 8ТЕАР-1 в биологическом образце можно определить с помощью ряда хорошо известных в данной области методов. Например, статус 8ТЕАР-1 в биологическом образце, взятом из конкретной области организма, можно определить путем анализа образца на присутствие или отсутствие клеток, экспрессирующих 8 ТЕ АР-1 (например, клеток, экспрессирующих мРНК или белки 8ТЕАР-1). Результаты данного анализа могут свидетельствовать о нарушении регуляции клеточного роста, например, если 8ТЕАР-1-экспрессирующие клетки обнаружены в образце, который в нормальном состоянии не содержит таких клеток (таком как лимфатический узел), поскольку такие изменения статуса 8ТЕАР-1 в биологическом образце часто связаны с нарушением регуляции клеточного роста. А именно, показателем нарушения регуляции клеточного роста является метастазирование раковых клеток из органа, несущего первичную опухоль (такого как простата), в другую область организма (например, в лимфатический узел). В данном контексте нарушение регуляции клеточного роста является важной информацией, поскольку оно позволяет диагностировать скрытые метастазы в лимфатических узлах у значительной части пациентов с раком простаты, а такие метастазы связаны с известными прогнозами развития заболевания (см., например, МигрБу е! а1., Рго§!а!е, 42(4): (2000); 8и е! а1., 8етш. 8игд. Оисо1. 18(1): 17-28 (2000) и Бгеетаи е! а1., 1. Иго1. 1995 Аид. 154 (2 Р!. 1): 474-8).
В одном аспекте данное изобретение предлагает способы мониторинга генных продуктов 8ТЕАР-1, экспрессируемых клетками, полученными от субъекта, предположительно имеющего заболевание, связанное с нарушением регуляции клеточного роста (такое как гиперплазия или рак), с последующим сравнением статуса, определенного с помощью данных способов, со статусом генных продуктов 8ТЕАР-1 в соответствующем нормальном образце. Присутствие аберрантных генных продуктов 8ТЕАР-1 в тестируемом образце по сравнению с нормальным образцом свидетельствует о нарушении клеточного роста в клетках субъекта.
В другом аспекте изобретение предлагает анализы, использующиеся для диагностирования рака у субъекта, включающие в себя детектирование значительного повышения экспрессии мРНК или белка 8ТЕАР-1 в тестируемой клетке или в образце ткани по сравнению с уровнями экспрессии в соответствующей нормальной клетке или ткани. Присутствие мРНК 8ТЕАР-1, например, можно определить в тканях, включающих в себя, без ограничения, перечисленные в табл. I. Присутствие значительной экспрессии 8ТЕАР-1 в любой из данных тканей может указывать на возникновение, присутствие и/или тяжесть рака, поскольку соответствующие нормальные ткани не экспрессируют мРНК 8ТЕАР-1 или экспрессируют на низком уровне.
В родственном воплощении статус 8ТЕАР-1 определяют чаще на уровне белка, чем на уровне нуклеиновой кислоты. Например, такой способ включает в себя определение уровня белка 8ТЕАР-1, экспрессируемого клетками в тестируемом образце ткани, и сравнение полученного уровня с уровнем 8ТЕАР-1, экспрессируемого в соответствующем нормальном образце. В одном воплощении присутствие белка 8ТЕАР-1 определяют, например, иммуногистохимическими методами. Антитела или связывающие партнеры 8ТЕАР-1, позволяющие детектировать экспрессию белка 8ТЕАР-1, применяют в ряде аналитических форматов, широко использующихся в данной области для указанной цели.
В следующем воплощении предлагается способ определения статуса нуклеотидных и аминокислотных последовательностей 8ТЕАР-1 в биологическом образце с целью идентификации изменений в структуре данных молекул. Указанные изменения могут включать в себя вставки, делеции, замены и т. п. Такие анализы имеют большое значение, поскольку изменения в нуклеотидных и аминокислотных последовательностях наблюдаются в большом числе белков, связанных с фенотипом, сопутствующим на
- 44 014870 рушению клеточного роста (см., например, Маггощ е! а1., 1999, I. Си!ап. Ра11ю1. 26(8): 369-378). Например, мутация в последовательности 8ТЕАР-1 может указывать на присутствие фактора, стимулирующего развитие опухоли. Следовательно, такие анализы имеют диагностическое и прогностическое значение, если мутация в 8ТЕАР-1 указывает на возможную утрату функции или повышение опухолевого роста.
В данной области известен широкий ряд анализов, позволяющих детектировать изменения в нуклеотидных и аминокислотных последовательностях. Например, размер и структуру нуклеотидных или аминокислотных последовательностей генных продуктов 8ТЕАР-1 можно определить с помощью нозерн-, саузерн-, вестерн-блоттингов, методов ПЦР и секвенирования ДНК, описанных в данном документе. Кроме того, в данной области хорошо известны другие методы, позволяющие определять изменения в нуклеотидных и аминокислотных последовательностях, такие как анализ полиморфизма одноцепочечной конформации (см., например, патенты США № 5382510, выданный 7 сентября 1999 г., и 5952170, выданный 17 января 1995 г.).
Кроме того, можно определить статус метилирования гена 8ТЕАР-1 в биологическом образце. Аберрантные деметилирование и/или гиперметилирование островков СрС в 5'-регуляторных участках гена часто встречаются в иммортализованных и трансформированных клетках и могут приводить к изменению экспрессии разных генов. Например, гиперметилирование промотора глутатион-8-трансферазы ρί-класса (белка, экспрессирующегося в ткани нормальной простаты, но не экспрессирующегося в >90% тканей карциномы простаты) приводит к постоянно молчащей транскрипции данного гена и является наиболее часто детектируемым геномным изменением при карциноме простаты (Эе Магхо е! а1., Ат. I. Ра11ю1. 155(6): 1985-1992 (1999)). Данное изменение также присутствует по меньшей мере в 70% случаев простатической внутриэпителиальной неоплазии (РЕЦ) с высокой степенью злокачественности (Вгоокк е! а1., Сапсег Ер1бетю1. Вютагкегк Ргеу.. 1998, 7: 531-536). В другом примере экспрессия опухолеспецифичного гена ЬАСЕЛ (который не экспрессируется в нормальной простате, но экспрессируется в 25-50% случаев рака простаты) индуцируется дезоксиазацитидином в лимфобластоидных клетках, это позволяет предположить, что опухолевая экспрессия является следствием деметилирования (Ье!йе е! а1., Ш!. I. Сапсег, 76(6): 903-908 (1998)). В данной области широко известен ряд анализов для определения статуса метилирования. Например, статус метилирования островков СрС можно определить методом саузернгибридизации с использованием рестриктаз, чувствительных к метилированию, которые не могут расщеплять последовательности, содержащие метилированные участки СрС. Кроме того, с помощью М8Р (ПЦР, специфичная для метилирования) можно быстро определить статус метилирования всех участков СрС, присутствующих в островке СрС конкретного гена. Данный метод включает в себя модификацию ДНК бисульфитом натрия (который превращает все неметилированные остатки цитозина в остатки урацила) с последующей модификацией с использованием праймеров, специфичных для метилированной, но не для неметилированной ДНК. Методы, включающие в себя воздействие метилированием, можно найти, например, в Сиггеп! Рго!осо1к Ш Мо1еси1аг Вю1оду, Иш! 12, Егебепск М. АикиЬе1 е! а1., ебк., 1995.
Амплификация гена является другим способом определения статуса 8ТЕАР-1. Амплификацию гена измеряют непосредственно в образце, например, с помощью традиционного саузерн-блоттинга или нозерн-блоттинга путем количественного определения транскрипции мРНК (Тйотак, 1980, Ргос. Ыа!1. Асаб. 8с1. И8А, 77: 5201-5205), дот-блоттинга (анализ ДНК) или гибридизации т кйи с использованием соответственно меченого зонда на основе описанных здесь последовательностей. Альтернативно можно использовать антитела, которые распознают конкретные двойные спирали, в том числе двойные спирали ДНК, двойные спирали РНК и двойные спирали гибридов ДНК-РНК или двойные спирали комплексов ДНК-белок. Данный анализ проводят с использованием меченых антител и при условии, что двойная спираль связана с поверхностью так, чтобы при образовании двойной спирали на поверхности можно было детектировать антитело, связанное с двойной спиралью.
Образцы ткани или периферической крови можно анализировать на присутствие раковых клеток путем детектирования экспрессии 8ТЕАР-1 с помощью традиционных методов, таких как нозернблоттинг, дот-блоттинг или анализ ОТ-ПЦР. Присутствие амплифицируемой методом ОТ-ПЦР мРНК 8ТЕАР-1 свидетельствует о наличии злокачественного заболевания. Анализы ОТ-ПЦР хорошо известны в данной области. В настоящее время изучается возможность применения детекционных анализов опухолевых клеток в периферической крови с использованием ОТ-ПЦР для диагностики и контролирования ряда солидных опухолей человека. В области рака предстательной железы они включают в себя анализы ОТ-ПЦР для детектирования клеток, экспрессирующих Р8А и Р8М ^егкаП< е! а1., 1997, Иго1. Век. 25: 373-384; Сйоккет е! а1., 1995, I. С1т. Опсо1. 13:1195-2000; Нек!оп е! а1., 1995, С1т. С1ет. 41: 1687-1688).
Следующий аспект согласно изобретению заключается в определении предрасположенности субъекта к развитию злокачественного заболевания. В одном воплощении способ прогнозирования предрасположенности к злокачественному заболеванию включает в себя детектирование мРНК 8ТЕАР-1 или белка 8ТЕАР-1 в образце ткакни, их присутствие указывает на предрасположенность к злокачественному заболеванию, а степень экспрессии мРНК 8ТЕАР-1 коррелирует со степенью предрасположенности. В конкретном воплощении определяют присутствие 8ТЕАР-1 в простате или в другой ткани, причем присутствие 8ТЕАР-1 в образце свидетельствует о наличии предрасположенности к раку простаты (либо о возникновении или существовании опухоли простаты). Подобным образом можно определить правиль
- 45 014870 ность нуклеотидных и аминокислотных последовательностей 8ТЕАР-1 в биологическом образце с целью идентификации изменений в структуре данных молекул, таких как вставки, делеции, замены и т. п. Присутствие одного или нескольких изменений в генных продуктах 8ТЕАР-1 образца свидетельствует о предрасположенности к злокачественному заболеванию (либо о возникновении или существовании опухоли простаты).
Данное изобретение также включает в себя способы оценки агрессивности опухоли. В одном воплощении способ оценки агрессивности опухоли включает в себя определение уровня мРНК 8ТЕАР-1 или белка 8ТЕАР-1, экспрессируемых опухолевыми клетками, сравнение полученного уровня с уровнем мРНК 8ТЕАР-1 или белка 8ТЕАР-1, экспрессируемых в соответствующей нормальной ткани, взятой у того же субъекта, или в нормальной ткани эталонного образца, где степень экспрессии мРНК 8ТЕАР-1 или белка 8ТЕАР-1 в опухолевом образце по сравнению с нормальным образцом соответствует степени агрессивности. В конкретном воплощении агрессивность опухоли оценивают путем определения степени экспрессии 8ТЕАР-1 в опухолевых клетках, причем более высокие уровни экспрессии соответствуют более агрессивным опухолям. Другое воплощение относится к оценке правильности нуклеотидных и аминокислотных последовательностей 8ТЕАР-1 в биологическом образце с целью идентификации изменений в структуре данных молекул, таких как вставки, делеции, замены и т. п. Присутствие одного или нескольких изменений свидетельствует о наличии более агрессивной опухоли.
Другое воплощение согласно изобретению направлено на способы наблюдения за развитием злокачественного заболевания у субъекта с течением времени. В одном воплощении способы наблюдения за развитием злокачественного заболевания у субъекта с течением времени включают в себя определение уровня мРНК 8ТЕАР-1 или белка 8ТЕАР-1, экспрессируемых опухолевыми клетками, сравнение полученного уровня с уровнем мРНК 8ТЕАР-1 или белка 8ТЕАР-1, экспрессируемых в образце равнозначной ткани, взятой у того же субъекта в другое время, где изменение степени экспрессии мРНК 8ТЕАР-1 или белка 8ТЕАР-1 в опухолевом образце с течением времени предоставляет информацию о развитии злокачественного заболевания. В отдельном воплощении развитие злокачественного заболевания оценивают путем определения степени экспрессии 8ТЕАР-1 в опухолевых клетках в разное время, причем более высокие уровни экспрессии свидетельствуют о развитии злокачественного заболевания. Кроме того, можно оцененить правильность нуклеотидных и аминокислотных последовательностей 8ТЕАР-1 в биологическом образце с целью идентификации изменений в структуре данных молекул, таких как вставки, делеции, замены и т. п., где присутствие одного или нескольких изменений свидетельствует о развитии злокачественного заболевания.
Описанные выше диагностические способы можно объединить с любым из широкого ряда прогностических и диагностических методов, известных в данной области. Например, другое воплощение согласно изобретению направлено на способы наблюдения за соответствием между экспрессией гена 8ТЕАР-1 и генных продуктов 8ТЕАР-1 (или изменений в гене 8ТЕАР-1 и генных продуктах 8ТЕАР-1) и фактором, связанным со злокачественным заболеванием, как на средства диагностики и прогнозирования статуса образца ткани. Можно использовать широкий ряд факторов, связанных со злокачественным заболеванием, таких как экспрессия генов, ассоциированных со злокачественным заболеванием (например, экспрессия Р8А, Р8СА и Р8М при раке простаты и др.), а также обширные цитологические наблюдения (см., например, Восктд е! а1., 1984, Апа1. Оиап1. Су!о1. 6(2): 74-88; Ерк!ет, 1995, Нит. Ра!йо1. 26(2): 2239; Тйогкоп е! а1., 1998, Моб. Ра!йо1. 11(6): 543-51; Вакбеп е! а1., 1999, Ат. I. 8игд. Ра!йо1. 23(8): 918-24). Способы наблюдения за соответствием между экспрессией гена 8ТЕАР-1 и генных продуктов 8ТЕАР-1 (или изменений в гене 8ТЕАР-1 и генных продуктах 8ТЕАР-1) и фактором, связанным со злокачественным заболеванием, являются полезными, например, поскольку присутствие ряда факторов, сопутствующих заболеванию, предоставляет важную информацию для диагностики и прогнозирования статуса образца ткани.
В одном воплощении способы наблюдения за соответствием между экспрессией гена 8ТЕАР-1 и генных продуктов 8ТЕАР-1 (или изменений в гене 8ТЕАР-1 и генных продуктах 8ТЕАР-1) и фактором, связанным со злокачественным заболеванием, включают в себя детектирование сверхэкспрессии мРНК или белка 8ТЕАР-1 в образце ткани, детектирование сверхэкспрессии мРНК или белка Р8А в образце ткани (или экспрессии Р8СА или Р8М) и наблюдение за соответствием сверхэкспрессии мРНК или белка 8ТЕАР-1 либо мРНК или белка Р8А (или экспрессии Р8СА или Р8М). В отдельном воплощении определяют экспрессию мРНК 8ТЕАР-1 и Р8А в ткани простаты, где соответствие сверхэкспрессии мРНК 8ТЕАР-1 и Р8А в образце указывает на существование рака простаты, на предрасположенность к раку простаты и на появление или на статус опухоли простаты.
Способы детектирования и количественного определения экспрессии мРНК или белка 8ТЕАР-1 мРНК описаны в данном документе, а стандартные методы детектирования и количественного определения нуклеиновых кислот и белков хорошо известны в данной области. Стандартные методы детектирования и количественного определения мРНК 8ТЕАР-1 включают в себя гибридизацию ш к1!и с использованием меченых рибозондов 8ТЕАР-1, нозерн-блоттинг и родственные методы с использованием в качестве зондов полинуклеотидов 8ТЕАР-1, анализ ОТ-ПЦР с использованием праймеров, специфичных для 8ТЕАР-1, а также другие методы детектирования на основе амплификации, такие как, например, метод
- 46 014870 многоцепьевых ДНК, δIδΒА, ТМА и т.п. В отдельном воплощении для детектирования и количественного определения экспрессии мРНК δТЕАР-1 используют полуколичественный метод ОТ-ПЦР. В данном методе можно использовать любое число праймеров, способных обеспечивать амплификацию δТЕАР-1, которые включают в себя, без ограничения, разные наборы праймеров, конкретно описанные в данном документе. В другом воплощении в иммуногистохимическом анализе образца ткани для биопсии можно использовать поликлональные или моноклональные антитела, специфически взаимодействующие с белком δТЕАР-1 дикого типа.
ЕХ. Идентификация молекул, взаимодействующих со δТЕАР-1.
С помощью белковых и нуклеотидных последовательностей δТЕАР-1, раскрытых в данном документе, специалист в данной области может идентифицировать белки, маленькие молекулы и другие реагенты, взаимодействующие со δТЕАР-1, а также пути, активируемые δТЕАР-1, с помощью любого из используемых в данной области методов. Например, можно использовать одну из так называемых систем улавливания взаимодействия (также называемых двухгибридный анализ). В таких системах молекулы подвергают взаимодействию с фактором транскрипции, который управляет экспрессией репортерного гена, с преобразованием фактора транскрипции, после чего анализируют экспрессию репортерного гена. Другие системы позволяют идентифицировать белок-белковые взаимодействия ίη νίνο посредством преобразования эукариотного активатора транскрипции (см., например, патенты США № 5955280, выданный 21 сентября 1999 г., 5925523, выданный 20 июля 1999 г., 584б722, выданный 8 декабря 1998 г., и б00474б, выданный 21 декабря 1999 г.). Алгоритмы прогнозирования белковой функции на основе структуры генома также доступны в данной области (см., например, Магсойе, е1 а1., №1иге, 402: 4, NονетЬе^, 1999, 83-8б).
Альтернативно, молекулы, взаимодействующие с белковыми последовательностями δТЕАР-1, можно идентифицировать путем скрининга пептдных библиотек. В таких способах пептиды, которые связываются со δТЕАР-1, идентифицируют путем скрининга библиотек, кодирующих статистическое или упорядоченное расположение аминокислот. Пептиды, кодируемые библиотеками, экспрессируют в виде гибридов с белками оболочки бактериофагов, после чего бактериофаговые частицы подвергают скринингу против белка (белков) δТЕАР-1.
Соответственно, пептиды, имеющие широкий ряд применений, таких как применения в качестве терапевтических, прогностических или диагностических средств, идентифицируют таким образом без какой-либо предварительной информации о структуре предполагаемого лиганда или рецепторной молекулы. Типичные пептидные библиотеки и способы скрининга, которые можно использовать для идентификации молекул, взаимодействующих с белковыми последовательностями δТЕАР-1, раскрыты, например, в патентах США № 572328б, выданном 3 марта 1998 г., и 5733731, выданном 31 марта 1998 г.
Альтернативно, для идентификации белок-белковых взаимодействий, опосредованных δТЕАР-1, можно использовать клеточные линии, экспрессирующие δТЕАР-1. Такие взаимодействия можно исследовать с помощью методов иммунопреципитации (см., например, НатШоп Β.Ί., е1 а1. Вюсйет. Вюрйук. Век. Соттип. 1999, 2б1: б4б-51). Белок δТЕАР-1 из клеточных линий, экспрессирующих δТЕАР-1, может участвовать в реакциях иммунопреципитации с антителами против δТЕАР-1. Альтернативно, при применении клеточной линии, созданной для экспрессии гибридов δТЕАР-1 и Н1к-маркера (векторы указаны выше), можно использовать антитела против Н1к-маркера. Ассоциацию белков в преципитированном иммунокомплексе можно анализировать с помощью таких методов, как вестерн-блоттинг, мечение белков 3^-метионином, микросеквенирование белков, окрашивание серебром и двухмерный гельэлектрофорез.
Маленькие молекулы и лиганды, взаимодействующие со δТЕАР-1, можно идентифицировать с помощью родственных воплощений таких скрининговых анализов. Например, можно идентифицировать маленькие молекулы, которые препятствуют выполнению белковой функции, в том числе молекулы, которые препятствуют способности δТЕАР-1 опосредовать фосфорилирование и дефосфорилирование, взаимодействовать с молекулами ДНК или РНК, что может служить показателем регуляции клеточного цикла, участвовать в передаче сигнала, опосредованной вторичными мессенджерами, или в онкогенезе. Подобным образом, маленькие молекулы, модулирующие δТЕАР-1-родственный ионный канал, белковый насос или функции клеточной коммуникации, идентифицируют и используют для лечения пациентов с злокачественным заболеванием, сопровождающимся экспрессией δТЕАР-1 (см., например, Н111е, В., йшс Сйаппек о£ ЕхсйаЫе МетЬгапек, 2'1 Е6., δΐΜ^Γ Аккос., δиηάе^1аηά, МА, 1992). Кроме того, лиганды, регулирующие функцию δТЕАР-1, можно идентифицировать по их способности связывать δТЕАР-1 и активировать репортерную конструкцию. Типичные способы описаны, например, в патенте США № 59288б8, выданном 27 июля 1999 г., и включают в себя способы получения гибридных лигандов, в которых по меньшей мере один лиганд является маленькой молекулой. В иллюстративном воплощении клетки, созданные для экспрессии гибридного белка δТЕАР-1 и ДНК-связывающего белка, используют для совместной экспрессии гибридного белка гибридный лиганд/маленькая молекула и белка, активирующего транскрипцию библиотеки кДНК. Данные клетки также содержат репортерный ген, экспрессия которого ограничена степенью приближения первого и второго гибридных белков друг к другу и происходит только в том случае, если гибридный лиганд связывается с участками-мишенями на обоих
- 47 014870 гибридных белках. Клетки, экспрессирующие репортерный ген, отбирают и идентифицируют неизвестную маленькую молекулу или неизвестный лиганд. Данный способ позволяет идентифицировать модуляторы, которые активируют или ингибируют 8ТЕАР-1.
Воплощение согласно изобретению включает в себя способ скрининга с целью выявления молекулы, взаимодействующей с аминокислотной последовательностью δТЕАР-1, изображенной на фиг. 2 или 3, включающий в себя следующие стадии: приведение в контакт популяции тестируемых молекул с аминокислотной последовательностью δТЕАР-1; взаимодействие популяции молекул с аминокислотной последовательностью δТЕАР-1 в условиях, способствующих взаимодействию; определение присутствия молекулы, взаимодействующей с аминокислотной последовательностью δТЕАР-1, и затем разделение молекул, которые не взаимодействуют с аминокислотной последовательностью δТЕАР-1, от молекул, взаимодействующих с данной последовательностью. В отдельном воплощении данный способ дополнительно включает в себя очистку, характеризацию и идентификацию молекулы, которая взаимодействует с аминокислотной последовательностью δТЕАР-1. Идентифицированную молекулу можно использовать для модуляции функции, выполняемой δТЕАР-1. В предпочтительном воплощении аминокислотную последовательность δТЕАР-1 приводят в контакт с библиотекой пептидов.
X. Терапевтические способы и композиции.
Идентификация δТЕАР-1 как белка, который в норме экспрессируется в ограниченном диапазоне тканей, но который также экспрессируется в раковых тканях, таких как перечисленные в табл. I, открывает ряд терапевтических подходов к лечению указанных злокачественных заболеваний.
Следует отметить, что направленную на определенную мишень противоопухолевую терапию можно использовать, даже если белок-мишень экспрессируется в нормальных тканях, в том числе и в нормальных тканях жизненно важных органов. Жизненно важным органом считается орган, необходимый для поддержания жизни, такой как сердце или прямая кишка. Органом, не имеющим жизненно важных функций, считается орган, после удаления которого субъект продолжает жить. Примерами органов, не имеющих жизненно важных функций, являются яичники, молочная железа и простата.
Например, НегсерДп® представляет собой фармацевтическое средство, утвержденное Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (РОА) США, которое содержит антитело, иммунореактивное по отношению к белку, известному под разными наименованиями, а именно НЕВ2, НЕВ2/пеи и егй-й-2. Он поставляется Сепеп1есй и является коммерчески успешным противоопухолевым средством. Доход от продажи НегсерДп® в 2002 г. составил почти 400 миллионов долларов. НегсерДп® представляет собой лекарственное средство для лечения НЕВ2-положительного метастазирующего рака простаты. Однако экспрессия НЕВ2 не ограничивается такими опухолями. Данный белок экспрессируется в ряде нормальных тканей. В частности, НЕВ2/пеи обнаружен в нормальных тканях почек и сердца, которые присутствуют у всех людей, принимающих НегсерДп. Присутствие НЕВ2/пеи в нормальных почках также подтверждают ЬаДБ, Ζ., е1 а1., В.1.И. 1п1етаДопа1 (2002), 89: 5-9. Как показано в данной статье (в которой исследуется, действительно ли почечно-клеточная карцинома является предпочтительным показанием для применения антител против НЕВ2, таких как НегсерДп), в доброкачественных тканях почек продуцируются и белок, и мРНК. Примечательно, что в доброкачественной ткани почек обнаружена интенсивная сверхэкспрессия белка НЕВ2/пеи. Несмотря на то что НЕВ2/пеи экспрессируется в таких жизненно важных тканях, как ткани сердца и почек, НегсерДп является очень полезным, утвержденным РОА и коммерчески успешным лекарственным средством. Влияние НегсерДп на ткани сердца, т.е. кардиотоксичность, является просто побочным эффектом лечения. Если пациенты принимают только НегсерДп, существенная кардиотоксичность наблюдается лишь у очень небольшой части пациентов. Для минимизации кардиотоксичности ужесточают требования, касающиеся лечения с использованием НЕВ2/пеи. Перед лечением оценивают такие факторы, как предрасположенность к заболеваниям сердца.
Следует особо отметить, что, несмотря на то что в тканях почек наблюдается нормальная экспрессия, возможно, даже более высокая, чем в тканях сердца, никакие побочные эффекты со стороны НегсерДп в почках не обнаружены. Более того, существует очень маленькая вероятность какого-либо побочного эффекта в других нормальных тканях, экспрессирующих НЕВ2. Вообще, все обнаруженные побочные эффекты относятся только к тканям сердца. Такая ткань, как ткань почек, где экспрессия НЕВ2/пеи является особенно значительной, не является платформой для возникновения какого-либо побочного эффекта.
Далее, благоприятные терапевтические эффекты наблюдаются при использовании противоопухолевой терапии, направленной на рецептор эпидермального фактора роста (ЕСРВ), ЕгйДих (1тС1опе). ЕСРВ также экспрессируется в ряде нормальных тканей. При применении терапевтических средств, направленных против ЕСРВ, существуют очень ограниченные побочные эффекты в нормальных тканях. Общим побочным эффектом лечения, направленного против ЕСРВ, является сильная кожная сыпь, наблюдающаяся у 100% пациентов, подвергающихся лечению.
- 48 014870
Таким образом, экспрессия целевого белка в нормальной ткани, даже в жизненно важной нормальной ткани, не является причиной для отказа от применения средства, направленного против данного белка, при лечении некоторых опухолей, в которых также происходит сверхэкспрессия указанного белка. Например, экспрессия в жизненно важных органах сама по себе не является вредной. Кроме того, органы, не являющиеся жизненно необходимыми, такие как простата и яичники, можно удалить, не создавая угрозы для жизни. Наконец, экспрессия в некоторых жизненно важных нормальных органах не вносит вклад в эффект препарата по причине иммунологической привилегии данных органов. Иммунопривилегированными органами являются органы, которые защищены от некоторых переносимых кровью веществ гематоорганным барьером и, следовательно, не доступны для иммунотерапии. Примерами иммунопривилегированных органов являются мозг и яички.
Соответственно, терапевтические способы, направленные на ингибирование активности белка 8ТЕАР-1, можно использовать для лечения пациентов, страдающих от рака, сопровождающегося экспрессией 8ТЕАР-1. Данные терапевтические способы обычно делят на три класса. Первый класс включает в себя модулирование функции 8ТЕАР-1, связанной с опухолевым клеточным ростом, которое приводит к подавлению или замедлению опухолевого клеточного роста или вызывает его прекращение. Второй класс включает в себя разные способы ингибирования связывания или ассоциации белка 8ТЕАР-1 с его партнером по связыванию или с другими белками. Третий класс включает в себя ряд способов ингибирования транскрипции гена 8ТЕАР-1 или трансляции мРНК 8ТЕАР-1.
Х. А. Противораковые вакцины.
Данное изобретение предлагает противораковые вакцины, содержащие белок, родственный 8ТЕАР-1, или нуклеиновую кислоту, родственную 8ТЕАР-1. С точки зрения экспрессии 8ТЕАР-1, с помощью противораковых вакцин можно предотвращать и/или лечить злокачественные заболевания, сопровождающиеся экспрессией 8ТЕАР-1, при этом эффект, оказываемый данными вакцинами на другие органы, является минимальным или отсутствует. Применение в качестве противораковой терапии вакцины, содержащей опухолевый антиген, который вызывает клеточный или гуморальный иммунные ответы, хорошо известно в данной области и используется для лечения рака простаты с применением в качестве иммуногенов человеческого Р8МА и РАР грызунов (Нобде е! а1., 1995, 1п!. й. Сапсег, 63: 231-237; Еопд е! а1., 1997, й. 1ттипо1. 159: 3113-3117).
Такие способы можно легко осуществить с использованием белка, родственного 8ТЕАР-1, молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей 8ТЕАР-1, и рекомбинантных векторов, обеспечивающих экспрессию и презентирование иммуногена 8ТЕАР-1 (который обычно содержит ряд Т-клеточных эпитопов или антитело). В данной области известен широкий ряд вакцинных систем для доставки иммунореактивных эпитопов (см., например, Негу1п е! а1., Апп Меб. 1999 Еек. 31(1): 66-78; Магиуата е! а1., Сапсег 1ттипо1. 1ттипо1кег, 2000 Йип. 49(3): 123-32). Коротко говоря, такие способы индуцирования иммунного ответа (например, клеточного и/или гуморального) у млекопитающего включают в себя стадии воздействия на иммунную систему млекопитающего иммунореактивного эпитопа (например, эпитопа, присутствующего в белке 8ТЕАР-1, изображенном на фиг. 3, или в его аналоге или гомологе) с индуцированием у млекопитающего иммунного ответа, специфичного для данного эпитопа (например, с образованием антител, которые специфично распознают данный эпитоп). В предпочтительном способе иммуноген 8ТЕАР-1 содержит биологический мотив, см., например, табл. У-ХУ111 и ХХ11-Ь1, или пептид, размер которого варьирует в соответствии со 8ТЕАР-1, изображенным на фиг. 5-9.
Полноразмерный белок 8ТЕАР-1, его иммуногенные участки или эпитопы можно объединять и доставлять разными способами. Такие вакцинные композиции могут включать в себя, например, липопептиды (например, У1бе11о, А. е! а1., й. С1т. 1пуек!. 95: 341, 1995), пептидные композиции, заключенные в полусферах из полиЩЬ-лактид-со-гликолида) (см., например, Е1бпбде, е! а1., Мо1ес. 1ттипо1. 28: 287294, 1991; А1опко е! а1., Уассте, 12: 299-306, 1994; Йопек е! а1., Уассте, 13: 675-681, 1995), пептидные композиции в составе иммуностимулирующих комплексов (18С0М8) (см., например, ТакакакЫ е! а1., №1иге 344: 873-875, 1990; Ни е! а1., С1т. Ехр. 1ттипо1. 113: 235-243, 1998), совокупные антигенпептидные системы (МАР) (см., например, Тат, Й.Р., Ргос. №!1. Асаб. 8с1. и.8.А. 85: 5409-5413, 1988; Тат, Й.Р., й. 1ттипо1. Ме!кобк? 196: 17-32, 1996), композиции, содержащие поливалентные пептиды; пептиды для применения в баллистических системах доставки, обычные кристаллические пептиды, вирусные векторы для доставки (Регкик, М.Е. е! а1. 1п: Сопсер!к ш уассте беуе1ортеп!, Каийтапп, 8.Н.Е., еб., р. 379, 1996; Скакгакагб, 8. е! а1. №!иге, 320: 535, 1986; Ни, 8.Ь. е! а1. №!иге, 320: 537, 1986; К1епу, М.-Р. е! а1. А1О8 Вю/Тескпо1оду, 4: 790, 1986; Тор, Е.Н. е! а1. й. 1пйес!. Э1к. 124: 148, 1971; Скапба, Р.К. е! а1. У1го1оду, 175: 535, 1990), частицы вирусного или синтетического происхождения (например, Коййег, N. е! а1., й. 1ттипо1. Ме!кобк, 192: 25, 1996; Е1бпбде, Й.Н. е! а1., 8ет. Нета!о1. 30: 16, 1993; Еа1о, ЬГО., йг. е! а1., №11иге Меб. 7: 649, 1995), адъюванты (^аггеп, Н.8., Уоде1, Е.К., апб Скеб1б, ЬА Аппи. Кеу. 1ттипо1. 4: 369, 1986; Сир!а, К.К. е! а1., Уассте, 11: 293, 1993), липосомы (Кеббу, К. е! а1., й. 1ттипо1. 148: 1585, 1992; Коск, К.Ь., 1ттипо1. Тобау, 17: 131, 1996) либо оголенную или адсорбированную на частицах кДНК (И1тег, Й.В. е! а1., 8с1епсе, 259: 1745, 1993; КоЫпкоп, Н.Ь., Нип!, ЬА., апб АеЬк1ег, К.С., Уассте, 11: 957, 1993; 8Ыуег, Й.\У. е! а1., 1п: Сопсер!к т уассте беуе1ортеп!, Каийтапп, 8.Н.Е., еб., р. 423, 1996; Сеаке, К.В., апб Вегхойкку, Й.А., Аппи. Кеу. 1ттипо1. 12: 923, 1994 и Е1бпбде, Й.Н. е! а1., 8ет. Нета!о1. 30:
- 49 014870
16, 1993). Также можно использовать токсин-направленные методы доставки, также известные как рецептор-опосредованные направленные методы, такие как поставляемые Ανаη! Iттиηο!йе^ареиΐ^ск, Лс. (Nеебкат. Маккаскике!!к).
В случае пациентов со 8ΤΕΑΡ-1-ассоциированным раком вакцинные композиции согласно изобретению также можно использовать в сочетании с другими противораковыми способами лечения, такими как хирургия, химиотерапия, медикаментозная терапия, лучевая терапия и др., включая применение в сочетании с иммунными вспомогательными средствами, такими как ΙΕ-2, ΙΕ-12, СМ-С8Е и т.п.
Клеточные вакцины.
Эпитопы ΟΙΕ можно анализировать с помощью определенных алгоритмов с целью идентификации в белке 8ΤΕΑΡ-1 пептидов, которые связывают соответствующие аллели ΗΕΑ (см., например, табл. Ιν; Нр1тег™ и Εр^та!^^x™, ΒΐΌ\νπ итуегкйу (иВЬ Ь^ονη.еби/Векеа^сй/ΤΒ-ΗIV_^аЬ/ер^та!^^x/ер^таΐπx.йίт1) и ΒΙΜΑ8, (иВЬ Ытак.бсй.шй.доу/; 8ΥΕΡΕΙΤΗΙ на сайте иВЬ куГрейЫ.Ьт1-йе1бе1Ьегд.сот/). В предпочтительном воплощении иммуноген 8ΤΕΑΡ-1 содержит одну или несколько аминокислотных последовательностей, идентифицированных с помощью хорошо известных в данной области способов, таких как последовательности, приведенные в табл. ν-ΧνΙΙΙ и ΧΧΙΙ-ΕΙ, или пептид из 8, 9, 10 или 11 аминокислот, определенный как мотив/супермотив ΗΕΑ класса Ι (например, табл. Ш(А), Ιν(Ό) или Ш(Е)), и/или пептид, состоящий по меньшей мере из 9 аминокислот, который содержит мотив/супермотив ΗΕΑ класса ΙΙ (например, табл. Ш(В) или Ш(С)). Как известно в данной области, бороздка ΗΕΑ класса Ι имеет, по существу, закрытые концы, поэтому только пептиды определенного размера могут плотно прилегать к бороздке и связываться с ней, как правило, эпитопы ΗΕΑ класса Ι имеют длину 8, 9, 10 или 11 аминокислот. Наоборот, связывающая бороздка ΗΕΑ класса ΙΙ имеет, по существу, открытые концы; следовательно, с молекулой ΗΕΑ класса ΙΙ может связываться пептид, состоящий из 9 или более аминокислот. Вследствие различия в связывающих бороздках ΗΕΑ классов Ι и ΙΙ мотивы ΗΕΑ класса Ι специфичны к длине, т. е. второе положение в мотиве класса Ι соответствует второй аминокислоте в направлении от аминоконца к карбоксильному концу пептида. Аминокислотные положения в мотиве класса ΙΙ соответствуют только друг другу, но не всему пептиду, т.е. к амино- и/или карбоксильному концу мотив-несущей последовательности могут быть присоединены другие аминокислоты. Длина эпитопов ΗΕΑ класса ΙΙ может составлять 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 аминокислот или более.
В данной области известен широкий ряд способов получения иммунного ответа у млекопитающего (например, первая стадия при получении гибридом). Способы получения иммунного ответа у млекопитающего включают в себя воздействие иммуногенного эпитопа, содержащегося в белке (например, в белке 8ΤΕΑΡ-1), на иммунную систему млекопитающего так, что генерируется иммунный ответ. Типичное воплощение включает в себя способ индуцирования у хозяина иммунного ответа на 8ΤΕΑΡ-1 путем приведения в контакт хозяина с достаточным количеством, по меньшей мере одного, эпитопа 8ΤΕΑΡ-1 или его аналога, специфичного для В-клеток или цитотоксичных Т-клеток; и по меньшей мере один периодический интервал после повторного приведения в контакт хозяина с эпитопом 8ΤΕΑΡ-1 или его аналога, специфичным для В-клеток или цитотоксичных Т-клеток. Конкретное воплощение относится к способу индуцирования иммунного ответа против белка, родственного 8ΤΕΑΡ-1, или искусственного полиэпитопного пептида, который включает в себя введение человеку или другому млекопитающему иммуногена 8ΤΕΑΡ-1 (например, белка 8ΤΕΑΡ-1 или его пептидного фрагмента, гибридного белка 8ΤΕΑΡ-1, его аналога и др.) в составе вакцинного препарата. Обычно такие вакцинные препараты дополнительно содержат подходящий адъювант (см., например, патент США № 6146635) или универсальный хелперный эпитоп, такой как пептид ΡΑΌΒΕ™ (Εр^ттиηе Лс., 8ап П1едо, СΑ; см., например, Л1ехапбег е! а1., 1. Iттиηο1. 2000; 164(3): 1625-1633; Α1еxаηбе^ е! а1., Iттишίу, 1994, 1(9): 751-761 и Α1еxаηбе^ е! а1., ^типок Век. 1998, 18(2): 79-92). Альтернативный способ включает в себя индуцирование у субъекта иммунного ответа против иммуногена 8ΤΕΑΡ-1 путем введения ш у1уо в мышцу или кожу организма субъекта молекулы ДНК, которая содержит последовательность ДНК, кодирующую иммуноген 8ΤΕΑΡ1, последовательность ДНК, функционально связанную с регуляторной последовательностью, которая контролирует экспрессию последовательности ДНК, где молекула ДНК поглощается клетками, затем последовательность ДНК экспрессируется в клетках и индуцируется иммунный ответ против иммуногена (см., например, патент США № 5962428). Также можно ввести средство, способствующее действию генетической вакцины, такое как анионные липиды; сапорины; лектины; эстрогенные соединения; гидроксилированные низшие алкилы; диметилсульфоксид; и мочевину. Кроме того, чтобы индуцировать ответ на целевой антиген, можно ввести антиидиотипическое антитело, которое имитирует 8ΤΕΑΡ-1.
- 50 014870
Вакцины на основе нуклеиновых кислот.
Вакцинные композиции согласно изобретению включают в себя композиции на основе нуклеиновых кислот. Пациенту можно вводить ДНК или РНК, которые кодируют белок (белки) согласно изобретению. Методы генетической иммунизации можно использовать для индуцирования гуморального и клеточного иммунных ответов против раковых клеток, экспрессирующих ЗТЕАР-1, с профилактической или терапевтической целью. Конструкции, которые содержат ДНК, кодирующую ЗТЕАР-1-родственный белок/иммуноген, а также подходящие регуляторные последовательности, можно вводить непосредственно в мышцу или кожу субъекта так, чтобы клетки мышцы или кожи поглощали конструкцию и экспрессировали кодируемый ею белок ЗТЕАР-1/иммуноген. Альтернативно, вакцина содержит белок, родственный ЗТЕАР-1. Экспрессия иммуногенного ЗТЕАР-1-родственного белка приводит к индуцированию профилактических или терапевтических гуморального и клеточного ответов против клеток, несущих белок ЗТЕАР-1. Можно использовать разные, известные в данной области методы профилактической и терапевтической генетической иммунизации (информацию и ссылки, позволяющие сделать обзор по данной теме, можно найти на Интернет-сайте денет еЬ. сот). Доставка с использованием нуклеиновых кислот описана, например, в \Уо1ГГ е!. а1., Зс1епсе, 247: 1465 (1990), а также в патентах США № 5580859; 5589466; 5804566; 5739118; 5736524; 5679647; \У0 98/04720. Примеры способов доставки с использованием ДНК включают в себя метод оголенной ДНК, облегченную (опосредованную бупивикаином, полимерами, пептидами) доставку, метод с применением катионных липидных комплексов и метод с применением частиц (метод генной пушки) или доставку под давлением (см., например, патент США № 5922687).
С целью терапевтической или профилактической иммунизации белки согласно изобретению можно экспрессировать с помощью вирусных или бактериальных векторов. Вирусные системы доставки генов, которые можно использовать при осуществлении согласно изобретению, включают в себя, без ограничения, вирус коровьей оспы, вирус птичьей оспы, вирус канареечной оспы, аденовирус, вирус гриппа, полиовирус, адено-ассоциированный вирус, лентивирус и вирус Б1пбЬ1Б (см., например, ВеБЙГо, 1996, Сигг. 0рш. Iттиηо1. 8: 658-663; ТБапд е! а1. 1. №11. Сапсег Шб!. 87: 982-990 (1995)). Для индуцирования противоопухолевого ответа также можно использовать невирусные системы доставки путем введения пациенту оголенной ДНК, кодирующей белок, родственный ЗТЕАР-1 (например, внутримышечно или внутрикожно).
Вирус коровьей оспы используют, например, для экспрессии нуклеотидных последовательностей, кодирующих пептиды согласно изобретению. После введения хозяину рекомбинантный вирус коровьей оспы обеспечивает экспрессию иммуногенного пептида белка и посредством этого индуцирует у хозяина иммунный ответ. Векторы на основе вируса коровьей оспы и способы их применения в методах иммунизации описаны, например, в патенте США № 4722848. В качестве вектора также можно использовать ВСС (ВасШе Са1те!!е Сиепп). Векторы на основе ВСС описаны в З1оуег е! а1., №!иге, 351: 456-460 (1991). Из настоящего описания специалистам в данной области будет очевидно, что для введения с терапевтическими целями или для иммунизации против пептидов согласно изобретению можно использовать широкий ряд других векторов, таких как векторы на основе адено- и адено-ассоциированных вирусов, ретровирусные векторы, векторы на основе обезвреженного вируса сибирской язвы и т.п.
Таким образом, для доставки молекулы нуклеиновой кислоты, родственной ЗТЕАР-1, используют системы генной доставки. В одном воплощении используют полноразмерную кДНК человеческого ЗТЕАР-1. В другом воплощении используют молекулы нуклеиновых кислот ЗТЕАР-1, кодирующие эпитопы, специфичные для цитотоксичных Т-лимфоцитов (СТЬ) и/или антител.
Ех νί\Ό вакцины.
Для индуцирования иммунного ответа можно использовать различные ех νί\Ό стратегии. Один из подходов включает в себя применение антигенпрезентирующих клеток (АРС), таких как дендритные клетки (ИС), для предоставления антигена ЗТЕАР-1 иммунной системе пациента. Дендритные клетки экспрессируют молекулы МНС классов I и II, костимулятор В7 и №-12 и, следовательно, являются высокоспециализированными антигенпрезентирующими клетками. При раке простаты аутологичные дендритные клетки, сенсибилизированные пептидами простат-специфического мембранного антигена (РЗМА), используют в фазе I клинических испытний для стимуляции иммунной системы пациентов с раком простаты (Т)оа е! а1., 1996, РгоБ!а!е, 28: 65-69; Мигрйу е! а1., 1996, РгоБ!а!е, 29: 371-380). Таким образом, дендритные клетки можно использовать для презентирования пептидов ЗТЕАР-1 Т-клеткам в контексте молекул МНС классов I или II. В одном воплощении аутологичные дендритные клетки сенсибилизируют пептидами ЗТЕАР-1, способными связываться с молекулами МНС класса I и/или класса II. В другом воплощении дендритные клетки сенсибилизируют полноразмерным белком ЗТЕАР-1. Следующее воплощение включает в себя достижение с помощью методов генной инженерии сверхэкспрессии гена ЗТЕАР-1 в дендритных клетках с использованием векторов, известных в данной области, таких как векторы на основе аденовируса (АгНшг е! а1., 1997, Сапсег Сепе Тйег. 4: 17-25), ретровируса (НепбегБоп е! а1., 1996, Сапсег ВеБ. 56: 3763-3770), лентивируса, адено-ассоциированного вируса, а также путем трансфекции ДНК (В1ЬаБ е! а1., 1997, Сапсег ВеБ. 57: 2865-2869), или трансфекции опухолевой РНК (АБЙ1еу е! а1., 1997, 1. Ехр. Меб. 186: 1177-1182). Клетки, экспрессирующие ЗТЕАР-1, также можно изменить мето
- 51 014870 дами генной инженерии, чтобы они экспрессировали иммунные модуляторы, такие как СМ-С8Е, и использовать их в качестве иммунизирующих средств.
Х.В. 8ТЕАР-1 в качестве мишени для терапии антителами.
8ТЕАР-1 является привлекательной мишенью для терапевтических стратегий с применением антител. В данной области известен ряд стратегий с применением антител, направленных как на внеклеточные, так и на внутриклеточные молекулы (см., например, комплемент- и АОСС-опосредованное уничтожение, а также применение интрател). Поскольку 8ТЕАР-1 экспрессируется раковыми клетками различного происхождения, но не соответствующими нормальными клетками, системное введение 8ТЕАР-1иммунореактивных композиций обеспечивает превосходную чувствительность, не вызывая токсических, неспецифичных или связанных с другими органами эффектов, обусловленных связыванием иммунореактивной композиции органами и тканями, не являющимися мишенями. Антитела, специфически взаимодействующие с доменами 8ТЕАР-1, можно использовать для системного лечения злокачественных заболеваний, сопровождающихся экспрессией 8ТЕАР-1, либо в виде конъюгатов с токсином или терапевтическим средством, либо в виде отдельных антител, способных ингибировать клеточную пролиферацию или функцию.
Пациенту можно вводить антитела 8ТЕАР-1 с тем, чтобы они связывались со 8ТЕАР-1 и модулировали его функции, такие как взаимодействие с партнером по связыванию, и, как следствие, опосредовали деструкцию опухолевых клеток и/или ингибировали рост опухолевых клеток. Механизмы, посредством которых антитела оказывают терапевтический эффект, могут включать в себя комплементопосредованный цитолиз, антитело-зависимую клеточную цитотоксичность, модуляцию физиологической функции 8ТЕАР-1, ингибирование связывания лиганда или путей передачи сигнала, модуляцию дифференциации опухолевых клеток, изменение профилей факторов опухолевого ангиогенеза и/или апоптоз. Примеры препаратов на основе антител включают в себя РЕихап® для неходжкинской лимфомы, НегсерЕп® для метастазирующего рака молочной железы и ЕгЬЕих® для рака ободочной и прямой кишки.
Специалистам в данной области следует понимать, что можно использовать антитела, специфичные к иммуногенным молекулам и связывающиеся с такими молекулами, например с иммуногенным участком последовательности 8ТЕАР-1, изображенной на фиг. 2 или 3. Кроме того, специалистам в данной области известно, что получение конъюгатов антител с цитотоксичными средствами является рутинной практикой (см., например, 81етегк е! а1. В1ооб, 93: 11, 3678-3684 (1ипе 1, 1999)). Если цитотоксичное и/или терапевтическое средство доставляется непосредственно к клеткам, например, путем использования конъюгатов такого средства с антителами, специфичными к молекуле, экспрессирующейся данными клетками (например, 8ТЕАР-1), то цитотоксичное средство оказывает свой известный биологический эффект (т.е. цитотоксичный) непосредственно на указанные клетки.
В данной области известен широкий ряд композиций и способов, связанных с использованием конъюгатов антитело-цитотоксичное средство для уничтожения клеток. В случае злокачественных заболеваний типичные способы включают в себя введение животному, несущему опухоль, биологически эффективного количества конъюгата, содержащего выбранное цитотоксичное и/или терапевтическое средство, связанное с направляющим агентом (например, с антителом против 8ТЕАР-1), который связывается с экспрессируемым маркером (например, 8ТЕАР-1), доступным для связывания или локализованным на поверхности клеток. Типичное воплощение относится к способу доставки цитотоксичного и/или терапевтического средства к клетке, экспрессирующей 8ТЕАР-1, который включает в себя получение конъюгата цитотоксичного средства с антителом, которое иммуноспецифично связывается с эпитопом 8ТЕАР-1, и обеспечение воздействия полученного конъюгата антитело-средство на клетку. Другое иллюстративное воплощение относится к способу лечения субъекта, предположительно страдающего от метастазирующего злокачественного заболевания, который включает в себя стадию парентерального введения указанному субъекту фармацевтической композиции, содержащей терапевтически эффективное количество антитела, конъюгированного с цитотоксическим и/или терапевтическим средством.
Противораковую иммунотерапию с использованием антител против 8ТЕАР-1 можно проводить разными способами, успешно применяющимися для лечения других типов рака, включающих в себя, без ограничения, рак толстой кишки (Аг1еп е! а1., 1998, Сгй. Рет. Iттиηο1. 18: 133-138), множественную миелому (Охак| е! а1., 1997, В1ооб. 90: 3179-3186, Ткипепап е! а1., 1997, В1ооб 90: 2437-2444), рак желудка (Какргхук е! а1., 1992, Сапсег Рек. 52: 2771-2776), В-клеточную лимфому (ЕипакокЫ е! а1., 1996, I. ^типоЛет. ЕтрЕак1к Титог Тттипок 19: 93-101), лейкоз (2Еопд е! а1., 1996, Ьеик. Рек. 20: 581-589), рак толстой и прямой кишки (Моип е! а1., 1994, Сапсег Рек. 54: 6160-6166; Уе1бегк е! а1., 1995, Сапсег Рек. 55: 4398-4403) и рак молочной железы (8Еерагб е! а1., 1991, I. СЕп. Iттиηο1. 11: 117-127). Некоторые терапевтические способы включают в себя получение конъюгатов свободного антитела с токсином или радиоизотопом, например получение конъюгатов Υ91 или I131 с антителами против СЭ20 (например, Ζеνа1^η™, ЮЕС РЕагтасеиЕса1к Согр. или Веххаг™, Сои1!ег РЕагтасеи!юа1к) соответственно, тогда как другие способы включают в себя совместное введение антител и других терапевтических средств, таких как НегсерЕп™ (!гак!и7иМаЬ), с паклитакселом (Сепеп!есЕ, Ечс.). Антитела можно конъюгировать с тера
- 52 014870 певтическим средством. При лечении рака простаты, например, антитела 8ТЕАР-1 можно вводить в сочетании с лучевой терапией, химиотерапией или антигормональной терапией. Кроме того, антитела можно конъюгировать с токсином, таким как каличемицин (например, Му1о!агд™, Ауе!й-Ауетк!, Маб1кои, N1, каппа-цепь рекомбинантного гуманизированного антитела ^0,1, конъюгированная с противоопухолевым антибиотиком каличемицином), майтанзиноид (например, активируемое опухолью пролекарство на основе таксана, ТАР, р1а1Гогт, Iттиηо6еη, СатЬпбде, МА, также см., например, патент США № 5416064) или ауристатин Е (8еай1е Сеиейск).
Хотя терапию антителами против 8ТЕАР-1 можно проводить на всех стадиях рака, она в особенности подходит для лечения запущенных или метастазирующих злокачественных заболеваний. Терапия с применением антител согласно изобретению показана для пациентов, перенесших один или несколько циклов химиотерапии. Альтернативно, для пациентов, которые не получали химиотерапии, лечение антителами согласно изобретению можно объединить с химиотерапией или лучевой терапией. Кроме того, терапия антителами позволяет уменьшить дозы химиотерапевтических средств, что особенно важно для пациентов, которые плохо переносят токсичность химиотерапевтических средств. В Раи е! а1. (Саисег Век. 53: 4637-4642, 1993), Рге^ей е! а1. I. оГ Оисо. 9: 217-224, 1996) и Наисоск е! а1. (Саисег
Век. 51: 4575-4580, 1991) описано применение разных антител вместе с химиотерапевтическими средствами.
Хотя терапию антителами против 8ТЕАР-1 можно проводить на всех стадиях рака, она в особенности подходит для лечения запущенных или метастазирующих злокачественных заболеваний. Терапия с применением антител согласно изобретению показана для пациентов, перенесших один или несколько циклов химиотерапии. Альтернативно, для пациентов, которые не получали химиотерапии, лечение антителами согласно изобретению можно объединить с химиотерапией или лучевой терапией. Кроме того, терапия антителами позволяет уменьшить дозы химиотерапевтических средств, что особенно важно для пациентов, которые плохо переносят токсичность химиотерапевтических средств.
У раковых пациентов можно определить наличие и уровень экспрессии 8ТЕАР-1 предпочтительно с помощью иммуногистохимических анализов опухолевой ткани, количественной визуализации 8ТЕАР-1, или других методов, позволяющих надежно определить наличие и степень экспрессии 8ТЕАР-1. Для данной цели предпочтительно использовать иммуногистохимический анализ биопсийных образцов опухолевой ткани или образцов, полученных при хирургической операции. Методы иммуногистохимических анализов опухолевых тканей хорошо известны в данной области.
Моноклональные антитела против 8ТЕАР-1, используемые для лечения рака простаты и других злокачественных заболеваний, включают в себя антитела, которые инициируют мощный иммунный ответ против опухоли, а также антитела, которые сами по себе обладают цитотоксичной активностью. При этом моноклональные антитела против 8ТЕАР-1 (МаЬ) могут вызывать лизис опухолевых клеток по механизму либо комплемент-опосредованной, либо антитело-зависимой клеточной цитотоксичности (АЭСС), причем для реализации обоих указанных механизмов требуется присутствие в молекуле иммуноглобулина интактного Рс-фрагмента, обеспечивающего взаимодействие с Рс-рецепторными участками эффекторных клеток в присутствии белков комплемента. Кроме того, МаЬ против 8ТЕАР-1, которые оказывают непосредственное биологическое действие на рост опухоли, можно использовать для лечения злокачественных заболеваний, сопровождающихся экспрессией 8ТЕАР-1. Механизмы непосредственного цитотоксического действия МаЬ включают в себя ингибирование клеточного роста, модуляцию дифференциации клеток, модуляцию профилей факторов опухолевого ангиогенеза и индукцию апоптоза. Механизм(ы) противоопухолевого действия конкретного МаЬ против 8ТЕАР-1 определяют с помощью ряда широко известных в данной области анализов 1и ν 11го, позволяющих оценить гибель клеток, таких как АЭСС, АЭММС, комплемент-опосредованный лизис клеток и др.
У некоторых пациентов применение мышиных или других нечеловеческих моноклональных антител, или человеческих/мышиных химерных МаЬ, может индуцировать иммунные ответы против нечеловеческих антител с интенсивностью от средней до высокой. Такие иммунные ответы могут приводить к выведению антитела из кровотока и к уменьшению эффективности антитела. В большинсте тяжелых случаев при таком иммунном ответе может происходить обширное образование иммунных комплексов, которое может вызвать почечную недостаточность. Соответственно, в терапевтических способах согласно изобретению предпочтительно используют либо полностью человеческие, либо гуманизированные моноклональные антитела, которые специфически связываются с целевым антигеном 8ТЕАР-1 с высоким сродством, но не вызывают антигенных реакций у пациента или вызывают их в незначительной степени.
- 53 014870
Терапевтические способы согласно изобретению включают в себя введение отдельных МаЬ против 8ТЕАР-1, а также сочетаний и смесей разных МаЬ. Такие смеси МаЬ могут иметь некоторые преимущества, поскольку они могут содержать МаЬ против разных эпитопов, действующие через разные механизмы, или смесь МаЬ, обладающих непосредственной токсичностью, и МаЬ, являющихся иммунными эффекторами. Такие МаЬ в сочетании могут оказывать синергические терапевтические эффекты. Кроме того, МаЬ против 8ТЕАР-1 можно вводить наряду с применением других терапевтических средств, включающих в себя, без ограничения, разные химиотерапевтические средства, андрогенные блокаторы, иммунные модуляторы (например, 1Ь-2, СМ-С8Е), хирургическое лечение или лучевую терапию. МаЬ против 8ТЕАР-1 вводят либо в свободной, или неконъюгированной, форме, либо в виде конъюгата с терапевтическим средством (средствами).
Композиции антител против 8ТЕАР-1 вводят с помощью способов, позволяющих доставлять антитела к опухолевым клеткам. Способы введения включают в себя, без ограничения, внутривенный, внутрибрюшинный, внутримышечный, внутриопухолевый, внутрикожный и т.п. Лечение обычно включает в себя повторяющееся введение препаратов антител против 8ТЕАР-1 с использованием подходящего способа введения, такого как внутривенное введение (в.в.), при котором вводимая доза обычно составляет 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 или 25 мг/кг массы тела. Как правило, дозы в интервале 10-1000 мг МаЬ в неделю являются эффективными и хорошо переносятся.
Клинические эксперименты с использованием МаЬ Негеерби™ для лечения метастазирующего рака молочной железы показали, что подходящий режим дозирования включает в себя в.в. введение начальной ударной дозы, составляющей приблизительно 4 мг препарата МаЬ против 8ТЕАР-1/кг массы тела пациента, и затем еженедельное в. в. введение дозы, составляющей приблизительно 2 мг/кг. Предпочтительно начальную ударную дозу вводят в течение 90-минутной или более продолжительной инфузии. Периодическую поддерживающую дозу вводят в течение 30-минутной или более продолжительной инфузии при условии, что пациент хорошо перенес начальную дозу. Специалистам в данной области известно, что выбор идеального для каждого конкретного случая режима дозирования зависит от разных факторов. Такие факторы включают в себя, например, сродство связывания и период полужизни используемых АЬ или МаЬ, степень экспрессии 8ТЕАР-1 у пациента, уровень сбрасываемого антигена 8ТЕАР-1 в крови, желательный уровень стационарной концентрации антитела, частота введения препарата, влияние химиотерапевтических или других средств, используемых в сочетании со способом лечения согласно изобретению, а также состояние здоровья конкретного пациента.
Чтобы облегчить выбор наиболее эффективного режима дозирования и др., у пациента необязательно определяют уровень 8ТЕАР-1 в конкретном образце (например, уровни антигена 8ТЕАР-1 и/или 8ТЕАР-1-экспрессирующих клеток в кровотоке). Такие анализы также проводят с целью мониторинга на протяжении всего лечения и используют для оценки эффективности лечения в сочетании со значениями других параметров (например, с результатами цитологического анализа мочи и/или уровня 1ттииоСу! при лечении рака мочевого пузыря или по аналогии - уровня Р8А в сыворотке при лечении рака простаты).
Антиидиотипические антитела против 8ТЕАР-1 также можно использовать в противораковой терапии в качестве вакцины для индуцирования иммунного ответа на клетки, экспрессирующие белок, родственный 8ТЕАР-1. В частности, в данной области хорошо известны способы получения антиидиотипических антител; данную методологию можно легко адаптировать для получения антиидиотипических антител против 8ТЕАР-1, которые имитируют эпитоп, находящийся в белке, родственном 8ТЕАР-1 (см., например, ’№адиег е! а1., 1997, НуЬпбота, 16: 33-40; Еоои е! а1., 1995, I. С1т. 1иуе8!. 96: 334-342; Нег1уи е! а1., 1996, Саиеег 1ттиио1. 1ттиио!йег. 43: 65-76). Такие антиидиотипические антитела могут быть использованы в вакцинных стратегиях противораковой терапии.
Х.С. 8ТЕАР-1 как мишень для клеточных иммунных ответов.
Следующими воплощениями согласно изобретению являются вакцины и способы получения вакцин, содержащих иммунологически эффективное количество одного или нескольких НЬА-связывающих пептидов, описанных в данном документе. Вакцины в соответствии с данным изобретением охватывают композиции, содержащие один или несколько из заявляемых пептидов. Пептид может присутствовать в вакцине один. Альтернативно, пептид может существовать в виде гомополимера, содержащего несколько копий одного и того же пептида, или в виде гетерополимера, состоящего из разных пептидов. Полимеры имеют преимущество, заключающееся в повышенной иммунологической реакционноспособности, и, если для получения полимера используют разные пептиды, иммунный ответ дополняется способностью полимера индуцировать образование антител и/или СТЬ, которые взаимодействуют с другими антигенными детерминантами патогенного организма или связанного с опухолью пептида. Композиция может представлять собой природное окружение антигена или она может быть получена, например, рекомбинантными или синтетическими методами.
- 54 014870
Вакцины согласно изобретению могут содержать хорошо известные в данной области носители, которые включают в себя, например, тироглобулин, альбумины, такие как человеческий сывороточный альбумин, столбнячный токсин, полиаминокислоты, такие как поли-Ь-лизин, поли-Ь-глутаминовая кислота, вирус гриппа, капсидный белок вируса гепатита В и т. п. Вакцины могут содержать физиологически допустимый (т. е. приемлемый) разбавитель, такой как вода, или физиологический раствор, предпочтительно забуференный фосфатом физиологический раствор. Кроме того, вакцины обычно содержат адъювант. Адъюванты, такие как неполный адъювант Фрейнда, фосфат алюминия, гидроксид алюминия или квасцы, представляют собой вещества, хорошо известные в данной области. Кроме того, как описано в данном документе, СТЬ-ответы можно инициировать с помощью конъюгатов пептидов согласно изобретению с липидами, такими как трипальмитоил-3-глицерилцистеинилсерилсерин (Р3С88). Было также обнаружено, что адъюванты, такие как синтетические олигонуклеотиды, содержащие цитозинфосфоротиолированный-гуанин (Срб), усиливают СТЬ-ответы в 10-100 раз (см., например, Эауба апб Се118, I. ]ттипо1. 165: 539-547 (2000)).
После иммунизации пептидной композицией согласно изобретению путем инъекции, аэрозольного введения, перорального введения, чрескожного введения, введения через слизистую оболочку, внутриплеврального введения, интратекального введения или других способов введения иммунная система хозяина отвечает на вакцину, продуцируя большие количества СТЬ и/или НТЬ, специфичных к целевому антигену. В результате хозяин становится, по меньшей мере, частично иммунным по отношению к клеткам с более поздним развитием, в которых происходит экспрессия или сверхэкспрессия антигена 8ТЕАР-1, или испытывает, по меньшей мере, некоторое улучшение, если антиген является ассоциированным с опухолью.
В некоторых воплощениях может быть желательно объединить пептидные компоненты класса I с компонентами, которые индуцируют или облегчают нейтрализацию антител и/или ответы хелперных Т-клеток, направленные на целевой антиген. Предпочтительное воплощение такой композиции содержит эпитопы класса I и класса II в соответствии с данным изобретением. Альтернативное воплощение такой композиции включает в себя эпитоп класса I и/или класса II в соответствии с данным изобретением, наряду с перекрестно взаимодействующим эпитопом НТЬ, таким как молекула РАОКЕ™ (Ер1ттипе, 8ап П1едо, СА) (описанная, например, в патенте США № 5736142).
Вакцина согласно изобретению также может содержать антигенпрезентирующие клетки (АРС), такие как дендритные клетки (ОС), в качестве носителя, презентирующего пептиды согласно изобретению. Вакцинные композиции могут быть получены ш νίΐΐΌ, после мобилизации и сбора дендритных клеток, при этом загрузка дендритных клеток происходит ш νίΙΐΌ. Например, дендритные клетки трансфицируют мини-геном согласно изобретению или сенсибилизируют пептидами. Затем дендритные клетки вводят пациенту, чтобы вызвать иммунный ответ ш νί\Ό. Вакцинные композиции на основе либо ДНК, либо пептида также можно вводить т νί\Ό в сочетании с мобилизацией дендритных клеток, при этом загрузка дендритных клеток происходит ш νί\Ό.
При выборе совокупности эпитопов, подходящих для включения в состав полиэпитопной композиции, входящей в состав вакцины, или при выборе отдельных эпитопов, подходящих для включения в состав вакцины, и/или кодируемых нуклеиновыми кислотами, такими как мини-ген, желательно использовать нижеследующие принципы. Желательно также при осуществлении выбора сопоставлять нижеследующие принципы друг с другом. Несколько эпитопов, предназначенных для включения в определенную вакцинную композицию, необязательно могут быть смежными в последовательности нативного антигена, из которого они получены.
1) Выбирают эпитопы, которые при введении имитируют иммунные ответы, которые по результатам наблюдения коррелируют с уничтожением опухоли. В случае НЬА класса I такие эпитопы включают в себя 3-4 эпитопа, относящихся по меньшей мере к одному опухолеспецифическому антигену (ТАА). Это справедливо также для НЬА класса II; снова выбирают 3-4 эпитопа, относящихся по меньшей мере к одному ТАА (см., например, КокепЬегд е! а1., 8с1епсе, 278: 1447-1450). Эпитопы из одного ТАА можно использовать в сочетании с эпитопами из одного или нескольких других ТАА с получением вакцины, направленной на опухоли с разным характером экспрессии часто экспрессируемых ТАА.
2) Выбирают эпитопы, имеющие желательное сродство связывания, которое, как установлено, коррелирует с иммуногенностью: для НЬА класса I Κ'50 составляет 500 нМ или меньше, часто 200 нМ или меньше; а для НЬА класса II Κ'50 составляет 1000 нМ или меньше.
3) Выбирают пептиды, несущие супермотивы, или совокупность пептидов, несущих аллельспецифические мотивы, которые имеют достаточно широкий популяционный охват. Например, предпочтительно они имеют по меньшей мере 80% популяционный охват. Для оценки широты или величины популяционного охвата можно использовать анализ Монте-Карло, известный в данной области метод статистических испытаний.
4) При выборе эпитопов из связанных с раком антигенов зачастую полезно выбирать аналоги, поскольку у пациента может развиться толерантность к нативному эпитопу.
- 55 014870
5) Особое значение имеют эпитопы, называемые эпитопами футлярного типа. Футлярные эпитопы встречаются там, где по меньшей мере два эпитопа перекрываются в некоторой пептидной последовательности. Футлярная пептидная последовательность может включать в себя эпитопы В-клеток, НЬА класса I и/или НЬА класса II. При выборе футлярных эпитопов основной целью является выбор наибольшего числа эпитопов на последовательность. Следует избегать выбора пептида, который имеет несколько большую длину, чем аминоконец аминоконцевого эпитопа и карбоксильный конец карбоксильного концевого эпитопа в пептиде. При выборе полиэпитопной последовательности, такой как последовательность, содержащая футлярные эпитопы, желательно провести скрининг данной последовательности, чтобы удостовериться, что она не имеет патологических или других вредных биологических свойств.
6) При создании полиэпитопного белка или при создании мини-гена желательно получить наименьший пептид, охватывающий представляющие интерес эпитопы. Данный принцип подобен, если не идентичен, принципу, используемому при выборе пептида, содержащего футлярные эпитопы. Однако в случае искусственного полиэпитопного пептида минимизацию размера следует соотносить с необходимостью внедрения каких-либо спейсерных последовательностей между эпитопами в полиэпитопном белке. Спейсерные аминокислотные остатки, например, можно ввести, чтобы избежать соединенных эпитопов (эпитопов, распознаваемых иммунной системой, не присутствующих в целевом антигене, а образованных в результате созданного человеком непосредственного соседства эпитопов), или для облегчения расхождения эпитопов и, как результат, увеличения презентации эпитопа. Образования соединенных эпитопов обычно избегают, потому что реципиент может генерировать иммунный ответ на такие неприродные эпитопы. Особое значение имеет соединенный эпитоп, являющийся доминантным эпитопом. Доминантный эпитоп может вызывать такой интенсивный ответ, при котором иммунные ответы на другие эпитопы уменьшаются или подавляются.
7) Если присутствуют последовательности нескольких вариантов одного целевого белка, потенциальные пептидные эпитопы можно выбирать на основе их консервативности. Например, показатель консервативности может указывать, что полноразмерная последовательность связывающего пептида НЬА класса I или все 9-мономерное ядро связывающего пептида класса II обладают указанным процентом консервативности последовательностей, определенным для конкретного белкового антигена.
Х.С.1. Вакцины на основе мини-генов.
Известен ряд способов, обеспечивающих одновременную доставку нескольких эпитопов. Нуклеиновые кислоты, кодирующие пептиды согласно изобретению, являются особенно важным воплощением согласно изобретению. Эпитопы для включения в мини-ген выбирают в соответствии с принципами, описанными в предыдущем разделе. В предпочтительных способах введения нуклеиновых кислот согласно изобретению используют конструкции мини-генов, кодирующие пептиды, содержащие один или несколько эпитопов согласно изобретению.
Применение полиэпитопных мини-генов описано ниже и в Инока е! а1., к Iтшиηο1. 162: 3915-3925, 1999; Апп, Ь. аЫ АЫйоп, кЬ., 1. ΉγοΙ 71: 2292, 1997; ТНоткоп, З.А. е! а1., 1. Стишок 157: 822, 1996; АЫ!!оп, кЬ. е! а1., 1. ^гок 67: 348, 1993; Напке, К. е! а1., Vасс^ηе, 16: 426, 1998.
Например, с помощью методов генной инженерии можно получить полиэпитопную ДНК-плазмиду, кодирующую эпитопы 8ТЕАР-1, несущие супермотив и/или мотив, универсальный эпитоп хелперных Т-клеток РАЭКЕ™ или несколько эпитопов НТЬ из §ТΒАР-1 (см., например, табл. Μ-ΧΥΜ и ХХП-Ы), и последовательность транслокационного сигнала эндоплазматического ретикулума. Вакцина также может содержать эпитопы из других ТАА.
Иммуногенность полиэпитопного мини-гена у трансгенных мышей можно подтвердить, определив величину ответов против тестируемых эпитопов, связанных с индукцией СТЬ. Кроме того, иммуногенность ДНК-кодируемых эпитопов ίη νίνο может коррелировать с ответами специфических линий СТЬ ίη νί!το против клеток-мишеней, трансфицированных ДНК-плазмидой. Таким образом, данные эксперименты демонстрируют, что присутствие мини-гена может приводить к 1) генерации ответа СТЬ и 2) экспрессии кодируемых им эпитопов клетками, распознаваемыми индуцированными СТЬ.
Например, чтобы создать последовательность ДНК, кодирующую выбранные эпитопы (мини-ген) и пригодную для экспрессии в человеческих клетках, аминокислотные последовательности эпитопов можно подвергнуть обратной трансляции. При выборе кодона для каждой аминокислоты можно руководствоваться таблицей используемости человеческих кодонов. Данные последовательности ДНК, кодирующие эпитопы, могут непосредственно примыкать друг к другу, тогда при трансляции образуется непрерывная полипептидная последовательность. Чтобы оптимизировать экспрессию и/или иммуногенность, в мини-ген можно включить дополнительные элементы. Примеры аминокислотных последовательностей, которые можно подвергнуть обратной трансляции и ввести в последовательность мини-гена, включают в себя: эпитопы НЬА класса I, эпитопы НЬА класса II, эпитопы антител, последовательность сигнала убиквитинирования и/или сигнала, направленного на эндоплазматический ретикулум. Кроме того, презентацию НЬА СТЬ и эпитопов НТЬ можно улучшить путем включения в состав мини-гена синтетических (например, полиаланин) или природных фланкирующих последовательностей так, чтобы они примыкали к эпитопам СТЬ или НТЬ; эпитопы, входящие в состав этих более крупных пептидов, также
- 56 014870 включены в объем согласно изобретению.
Последовательность мини-гена можно превратить в последовательность ДНК путем сборки олигонуклеотидов, кодирующих плюс- и минус-цепи мини-гена. Можно синтезировать перекрывающиеся олигонуклеотиды (30-100 оснований в длину), которые затем можно фосфорилировать, очистить и подвергнуть отжигу в подходящих условиях с помощью хорошо известных методов. Концы олигонуклеотидов можно соединять, например, с помощью ДНК-лигазы Т4. Затем полученный синтетический мини-ген, кодирующий эпитопный полипептид, можно клонировать в подходящем векторе экспрессии.
Чтобы обеспечить экспрессию в клетках-мишенях, в состав вектора предпочтительно включают стандартные регуляторные последовательности, хорошо известные специалистам в данной области. Желательно, чтобы в векторе присутствовали следующие элементы: промотор с участком клонирования для вставки мини-гена, расположенным ниже по ходу считывания; сигнал полиаденилирования для эффективной терминации транскрипции; репликатор Е.сой; и селектируемый маркер Е.сой (например, ген устойчивости к ампициллину или канамицину). Для данной цели можно использовать ряд промоторов, например промотор человеческого цитомегаловируса (БСМУ). Другие подходящие последовательности промоторов можно найти, например, в патентах США № 5580859 и 5589466.
Для оптимизации экспрессии и иммуногенности мини-гена можно использовать другие модификации вектора. В некоторых случаях, если для эффективной экспрессии гена требуются интроны, в транскрибируемый участок мини-гена можно включить один или несколько синтетических или природных интронов. Последовательности, стабилизирующие мРНК, и последовательности, обеспечивающие репликацию в клетках млекопитающих, также могут вносить вклад в увеличение экспрессии мини-гена.
После выбора вектора экспрессии мини-ген клонируют в полилинкерном участке, расположенном ниже промотора. Данную плазмиду трансформируют в подходящем штамме Е.сой и получают ДНК с помощью стандартных методов. Ориентацию и последовательность ДНК мини-гена, а также присутствие в векторе других элементов подтверждают с помощью рестрикционной карты и анализа последовательности ДНК. Бактериальные клетки, несущие правильную плазмиду, хранят в виде банка базовых клеток и банка рабочих клеток.
Кроме того, в иммуногенность ДНК-вакцин вносят вклад иммуностимуляторные последовательности (188к или СрС§). Если нужно повысить иммуногенность, данные последовательности вводят в состав вектора вне кодирующей последовательности мини-гена.
В некоторых воплощениях можно использовать бицистронный вектор экспрессии, который обеспечивает продукцию как кодируемых мини-геном эпитопов, так и второго белка (используемого для увеличеня или уменьшения иммуногенности). Примеры белков или полипептидов, которые при совместной экспрессии могут существенно усилить иммунный ответ, включают в себя цитокины (например, 1Ь-2, 1Ь-12, СМ-С8Е), индуцируемые цитокинами молекулы (например, ЬеГЕ), костимуляторные молекулы или в случае НТЬ-ответов связывающие белки раи-ИК (РАЙКЕ™, Ер1ттиие, 8аи И1едо, СА). Эпитопы хелперных лимфоцитов (НТЬ) можно соединить с внутриклеточными направляющими сигналами и экспрессировать отдельно от эпитопов СТЬ; это позволяет направить эпитопы НТЬ и СТЬ в разные компартменты клетки. При необходимости это может обеспечить более эффективный вход эпитопов НТЬ в путь, опосредованный НЬА класса II, и посредством этого повысить индукцию НТЬ. В противоположность индукции НТЬ или СТЬ при некоторых заболеваниях благоприятный эффект может иметь специфическое уменьшение иммунного ответа под влиянием совместной экспрессии иммуносупрессивных молекул (например, ТСЕ-β).
Плазмидную ДНК в терапевтических количествах можно получить, например, путем ферментации в Е.сой с последующей очисткой. Аликвоты из банка рабочих клеток вносят в питательную среду и выращивают до насыщения в колбах для шейкера или в биореакторе, используя известные в данной области методы. Плазмидную ДНК можно очистить с помощью стандартных методов биоразделения, таких как твердофазное разделение на анионообменных смолах, поставляемых ОМСЕН йю. (Уа1еис1а, СаШогша). При необходимости сверхспиральные ДНК можно выделить из открытых циклических и линейных форм с помощью гель-электрофореза или других методов.
Очищенную плазмидную ДНК для инъекций можно получить с использованием ряда композиций. Самая простая из них представляет собой раствор лиофилизованной ДНК в стерильном физиологическом растворе, забуференном фосфатом (РВ8). Данный препарат, известный как оголенная ДНК, в настоящее время используется в клинических испытаниях для внутримышечного введения (в.м.). Для максимизации иммунотерапевтических эффектов вакцин на основе ДНК мини-генов может быть желательным использование альтернативного способа получения очищенной плазмиды ДНК. Ряд способов уже описан и могут стать доступными новые способы. В композиции также можно использовать катионные липиды, гликолипиды и сливающиеся липосомы (см., например, XVО 93/24640; Маиито & Сои1б-Еодеп!е, ВюТесйшдиек, 6(7): 682 (1988); патент США № 5279833; νθ 91/06309 и Ее1диег, е! а1., Ргос. №111. Асаб. 8сй И8А, 84: 7413 (1987). Кроме того, можно получить комплексы очищенной плазмидной ДНК с пептидами и соединениями, называемыми в совокупности защитными, интерактивными, неконденсирующими соединениями (РЕЙС), которые позволяют модифицировать такие характеристики,
- 57 014870 как стабильность, внутримышечная дисперсия или способность достигать конкретные органы или типы клеток.
Сенсибилизацию целевых клеток можно использовать в качестве функционального анализа экспрессии кодируемых мини-геном эпиопов СТЬ и их презентации НЬА класса I. Например, плазмидную ДНК вводят в линию клеток млекопитающих, подходящую для использования в качестве мишени в стандартном анализе высвобождения хрома из СТЬ. Выбор метода трансфекции зависит от конечной композиции. Для введения оголенной ДНК можно использовать электропорацию, где катионные липиды позволяют осуществлять непосредственную трансфекцию ш νίΙΐΌ. Можно одновременно трансфицировать плазмиду, экспрессирующую зеленый флуоресцентный белок (СРР), позволяющий осуществить селекцию трансфицированных клеток с помощью сортинга клеток с активацией флуоресценции (РАСЗ). Затем данные клетки метят хромом-51 (51Сг) и используют в качестве клеток-мишеней для эпитопспецифичных линий СТЬ; цитолиз, детектируемый по высвобождению 51Сг, указывает как на продукцию кодируемых мини-геном эпитопов СТЬ, так и на их презентацию НЬА. Экспрессию эпитопов НТЬ можно оценить аналоговым способом с использованием результатов анализов активности НТЬ.
Иммуногенность ш νί\Ό является вторым способом функционального тестирования композиций, содержащих ДНК мини-генов. Трансгенных мышей, экспрессирующих соответствующие человеческие белки НЬА, иммунизируют продуктом ДНК. Доза и способ введения зависят от состава композиции (например, в.м. введение используют для ДНК в РВЗ, а внутрибрюшинное (в.б.) введение используют для комплексов ДНК с липидами). Через 21 день после иммунизации спленоциты собирают и повторно стимулируют в течение одной недели в присутствии пептидов, кодирующих каждый тестируемый эпитоп. Затем в случае эффекторных клеток СТЬ анализируют цитолиз нагруженных пептидом 51Сг-меченных клеток-мишеней с помощью стандартных методов. Лизис клеток-мишеней, сенсибилизированных НЬА, содержащим пептидные эпитопы, соответствующие эпитопам, кодируемым мини-геном, демонстрирует влияние ДНК-вакцины на индукцию СТЬ ш νί\Ό. Иммуногенность эпитопов НТЬ у трансгенных мышей подтверждают аналогичным способом.
Альтернативно, нуклеиновые кислоты можно вводить с помощью баллистической системы доставки, как описано, например, в патенте США № 5204253. Данный метод включает в себя введение частиц, содержащих только ДНК. В следующем альтернативном воплощении вводят ДНК, прилипшую к частицам, таким как частицы золота.
Мини-гены также можно доставлять с помощью других бактериальных или вирусных систем доставки, хорошо известных в данной области, например экспрессионная конструкция, кодирующая эпитопы согласно изобретению, может входить в состав вирусного вектора, такого как вектор на основе вируса коровьей оспы.
Х.С.2. Сочетание пептидов СТЬ с хелперными пептидами.
Вакцинные композиции, содержащие пептиды СТЬ согласно изобретению, можно модифицировать, например, с получением аналогов, обладающих желательными свойствами, такими как увеличенный период полужизни в сыворотке, расширенный популяционный охват или повышенная иммуногенность.
Например, способность пептида индуцировать активность СТЬ, можно повысить путем присоединения пептида к последовательности, которая содержит по меньшей мере один эпитоп, способный индуцировать ответ, опосредованный хелперными Т-клетками. Хотя пептид СТЬ можно непосредственно присоединить к пептиду Т-хелпера, зачастую они соединены в конъюгатах эпитоп СТЬ/эпитоп НТЬ через спейсерную молекулу. Спейсер обычно представляет собой относительно маленькие нейтральные молекулы, такие как аминокислоты или имитаторы аминокислот, которые в физиологических условиях являются практически незаряженными. Спейсеры обычно выбирают, например, из А1а, С1у или других неполярных аминокислот или нейтральных полярных аминокислот. Следует понимать, что необязательно присутствующий спейсер может состоять из одинаковых или разных остатков и, следовательно, может представлять собой гетеро- или гомоолигомер. В случае присутствия спейсер обычно содержит по меньшей мере один или два остатка, чаще от трех до шести остатков, иногда 10 или более остатков. Пептидный эпитоп СТЬ может быть связан с пептидным эпитопом Т-хелпера либо непосредственно или через спейсер, либо по амино- или карбоксиконцу пептида СТЬ. Аминоконец иммуногенного пептида или Т-хелперного пептида может быть ацилирован.
В некоторых воплощениях Т-хелперный пептид представляет собой пептид, который распознается Т-хелперными клетками, присутствующими у большей части генетически различающихся популяций. Выбирают пептиды, которые связываются со многими, большинством или со всеми молекулами НЬА класса II. Примеры аминокислотных последовательностей, связывающихся со многими молекулами НЬА класса II, включают в себя последовательности из таких антигенов, как столбнячный токсин, положения 830-843 ^ΥIКАNЗКΡIСIТЕ (ЗЕО ГО N0: 64), околоспорозоидный белок (СЗ) Р1аБтобшт ГаШрагит, положения 378-398 ^IЕККIАКМЕКАЗЗVΡNVУNЗ (ЗЕО ГО N0: 65) и белок З!гер!ососсиБ размером 18 кДа, положения 116-131 САV^ЗI^ССУАТΥСАА (ЗЕО ГО N0: 66). Другие примеры включают в себя петиды, несущие супермотив ΌΡ 1-4-7 или любой из мотивов ΌΡ3.
- 58 014870
Альтернативно, можно получить синтетические пептиды, способные стимулировать Т-хелперные лимфоциты, в форме, несколько ограниченной НЬА, с использованием аминокислотных последовательностей, не обнаруженных в природе (см., например, публикацию РСТ \УО 95/07707). Указанные синтетические соединения, называемые Рап-ЛВ-связывающие эпитопы (например, РАЛВЕ™, Ер1ттипе, Шс., 8ап Л1едо, СА), наиболее предпочтительно конструируют так, чтобы они связывали большинство молекул НЬА-ЛВ (человеческие НЬА класса II). Например, было обнаружено, что рап-ЛВ-связывающий эпитопный пептид, имеющий формулу XI<XVЛЛ\VТ^КЛЛX (8ЕО Ю NΟ: 67), где X обозначает любой остаток из циклогексилаланина, фенилаланина или тирозина; А обозначает либо Л-аланин, либо Ь-аланин, связывается с большинством аллелей НЬА-ЛВ и стимулирует ответ Т-хелперных лимфоцитов у большинства субъектов, независимо от типа НЬА. В альтернативном рап-ЛВ-связывающем эпитопе все аминокислоты представляют собой природные Ь-аминокислоты и могут быть представлены в виде нуклеиновых кислот, кодирующих эпитоп.
Пептидные эпитопы НТЬ также можно модифицировать с целью изменения их биологических свойств. Например, в их состав можно ввести Л-аминокислоты для увеличения устойчивости к протеазам и, следовательно, увеличения периода полужизни в сыворотке или их можно конъюгировать с другими молекулами, такими как липиды, белки, углеводы и т.п., для увеличения их биологической активности. Например, Т-хелперный пептид можно конъюгировать с одной или несколькими цепями пальмитиновой кислоты по аминоконцу или по карбоксильному концу.
X.С.3. Сочетания пептидов СТЬ с агентами, сенсибилизирующими Т-клетки.
В некоторых воплощениях желательно включать в состав фармацевтических композиций согласно изобретению по меньшей мере один компонент, который сенсибилизирует В- или Т-лимфоциты. Известно, что липиды способны сенсибилизировать СТЬ ш νί\Ό. Например, остатки пальмитиновой кислоты можно присоединить к ε- и α-аминогруппам остатка лизина и полученное производное можно присоединить, например, с использованием одного или нескольких связующих остатков, таких как С1у, С1у-С1у, 8ет, 8ет-8ет и т.п., к иммуногенному пептиду. Затем липидированный пептид можно вводить, либо непосредственно в мицелле или частице, заключенной в липосому, либо в виде эмульсии в адъюванте, например в неполном адъюванте Фрейнда. В предпочтительном воплощении особенно эффективная иммуногенная композиция содержит пальмитиновую кислоту, присоединенную к ε-и α-аминогруппам Ьук, который через мостик, например 8ет-8ет, соединен с аминоконцом иммуногенного пептида.
В качестве другого примера липида, инициирующего ответы, опосредованные СТЬ, для сенсибилизации вирус-специфических СТЬ можно использовать липобелки Е.со11, такие как трипальмитоил-8-глицерилцистеинилсерилсерин (Р3С88), ковалентно связанные с соответствующим пептидом (см., например, Петек, е! а1., №!ите, 342: 561, 1989). Пептиды согласно изобретению можно присоединить к Р3С88, например, и полученный липопептид можно ввести субъекту для индуцирования специфического иммунного ответа на целевой антиген. Более того, поскольку эпитопы, конъюгированные с Р3С88, также могут инициировать образование нейтрализующих антител, для более эффективной индукции как гуморального, так и клеточного ответов, две указанные композиции можно объединить.
X.С.4. Вакцинные композиции, содержащие ПС, сенсибилизированные пептидами СТЬ и/или НТЬ.
Воплощение вакцинной композиции в соответствии с данным изобретением включает в себя введение ех νί\Ό смеси эпитоп-несущих пептидов в РВМС или в выделенные из них ПС, полученные из крови пациента. Можно использовать фармацевтическое средство, облегчающее сбор ПС, такое как Ртодешро1ейп™ (Рйаттас1а-Мопкап!о, 8!. Ьошк, МО) или СМ-С8Е/[Б-4. После сенсибилизации пептидами и перед повторным вливанием пациентам ПС промывают, чтобы удалить несвязанные пептиды. В данном воплощении вакцина содержит сенсибилизированные пептидами ПС, которые презентируют на поверхности, продуцированные в результате сенсибилизации пептидные эпитопы, в комплексе с молекулами НЬА.
ПС можно сенсибилизировать ех νί\Ό смесью пептидов, некоторые из которых стимулируют ответы СТЬ на 8ТЕАР-1. Для усиления ответа СТЬ в состав композиции необязательно вводят пептид хелперной Т-клетки (НТЬ), такой как природный или искусственный пептид, несколько ограниченный НЬА класса II. Таким образом, вакцину согласно изобретению используют для лечения рака, сопровождающегося экспрессией или сверхэкспрессией 8ТЕАР-1.
ΥΌ. Адоптивная иммунотерапия.
Антигенные 8ТЕАР-1-родственные пептиды используют для индуцирования как СТЬ-, так и НТЬ-ответов νί\Ό. Полученные СТЬ или НТЬ клетки можно использовать для лечения опухолей у пациентов, которые не отвечают на другие традиционные формы терапии или не отвечают на терапевтический вакцинный пептид или вакцинную нуклеиновую кислоту согласно изобретению. СТЬ- или НТЬ-ответы ех νί\Ό на конкретный антиген индуцируют путем инкубации культуры ткани пациента или генетически совместимых клеток-предшественников СТЬ или НТЬ вместе с источником антигенпрезентирующих клеток (АРС), таких как дендритные клетки, и соответствующим иммуногенным пептидом. По прошествии подходящего времени инкубации (обычно приблизительно 7-28 дней), в течение которого клетки-предшественники активируются и развиваются в эффекторные клетки, клетки вводят обратно
- 59 014870 пациенту, где они разрушают (СТЬ) свои специфические клетки-мишени (например, опухолевые клетки) или облегчают их разрушение (НТЬ). В качестве антигенпрезентирующих клеток также можно использовать трансфицированные дендритные клетки.
Х.Е. Введение вакцин с терапевтической или профилактической целью.
Фармацевтические и вакцинные композиции согласно изобретению обычно используют для лечения и/или профилактики злокачественного заболевания, сопровождающегося экспрессией или сверхэкспрессией δТЕАР-1. При терапевтическом применении композиции, содержащие пептиды и/или нуклеиновые кислоты, вводят пациенту в количестве, достаточном для индуцирования эффективного В-клеточного, СТЬ- и/или НТЬ-ответа на антиген, а также для лечения или, по меньшей мере, частичного устранения или замедления симптомов и/или осложнений. Количество, достаточное для осуществления данной цели, называют терапевтически эффективной дозой. Количество, эффективное для данного применения, зависит, например, от вида вводимой композиции, способа введения, стадии и тяжести заболевания, подлежащего лечению, массы тела и общего состояния здоровья пациента, а также от оценки врача, назначающего лечение.
Что касается фармацевтических композиций, иммуногенные пептиды согласно изобретению или кодирующие их молекулы ДНК, как правило, вводят субъекту, уже несущему опухоль, которая сопровождается экспрессией δТЕАР-1. Пептиды или кодирующие их ДНК можно вводить индивидуально или в виде гибридов одной или нескольких пептидных последовательностей. Пациентов можно лечить иммуногенными пептидами отдельно или, по обстоятельствам, в сочетании с другими способами лечения, такими как хирургия.
Что касается терапевтического применения, введение, как правило, следует начинать при первом диагнозе δТЕАР-1-ассоциированного злокачественного заболевания. Затем вводят поддерживающие дозы до тех пор, пока, по меньшей мере, не начнут ослабевать симптомы, и в течение некоторого времени после этого.
Воплощение вакцинной композиции (т. е. включающее в себя, без ограничения, такие воплощения, как смеси пептидов, полиэпитопные полипептиды, мини-гены или ТАА-специфичные СТЬ или сенсибилизированные дендритные клетки), доставляемое пациенту, может варьировать в зависимости от стадии заболевания или состояния здоровья пациента. Например, в случае пациента с опухолью, сопровождающейся экспрессией δТЕАР-1, вакцина, содержащая δТЕАР-1-специфичные СТЬ, может быть более эффективной в отношении уничтожения опухолевых клеток пациента с запущенным заболеванием, чем альтернативные воплощения.
Как правило, важно выбрать количество пептидного эпитопа, доставляемого с помощью определенного способа введения, достаточное для эффективной стимуляции Т-клеточного ответа; в соответствии с данным воплощением согласно изобретению также можно вводить композиции, которые стимулируют ответы хелперных Т-клеток.
Разовая доза при начальной терапевтической иммунизации обычно находится в интервале, где низшее значение составляет приблизительно 1, 5, 50, 500 или 1000 мкг, а высшее значение составляет приблизительно 10000, 20000, 30000 или 50000 мкг. Значения дозы для человека массой 70 кг, как правило, варьируют приблизительно от 500 до 50000 мкг. Поддерживающие дозы в интервале приблизительно от 1,0 до 50000 мкг пептида, которые вводят в течение нескольких недель или месяцев, можно назначать в зависимости от ответа и состояния пациента, определяемых путем измерения специфической активности СТЬ и НТЬ, полученных из крови пациента. Введение следует продолжать до тех пор, пока, по меньшей мере, клинические симптомы или лабораторные анализы не укажут, что неоплазия устранена или уменьшена и в течение некоторого периода после этого. Дозы, способы введения и дозировочные режимы подбирают в соответствии с известными в данной области методами.
В некоторых воплощениях пептиды и композиции согласно изобретению используются для лечения тяжелых болезненных состояний, т.е. в ситуациях, когда существует или может существовать угроза для жизни. В таких случаях, поскольку используются минимальные количества чужеродных веществ, а пептиды, входящие в состав предпочтительных композиций согласно изобретению, являются относительно нетоксичными, данные пептидные композиции можно вводить в количествах, значительно превышающих указанные дозы, что зачастую желательно с точки зрения лечащего врача.
Вакцинные композиции согласно изобретению также можно использовать только в качестве профилактических средств. Как правило, при начальной профилактической иммунизации разовая доза находится в интервале, где низшее значение составляет приблизительно 1, 5, 50, 500 или 1000 мкг, а высшее значение составляет приблизительно 10000, 20000, 30000 или 50000 мкг. Значения дозы для человека массой 70 кг, как правило, варьируют приблизительно от 500 до 50000 мкг. Поддерживающие дозы в интервале приблизительно от 1,0 до 50000 мкг пептида вводят через определенные интервалы времени, приблизительно от четырех недель до шести месяцев, после первоначального введения вакцины. Иммуногенность вакцины можно определить путем измерения специфической активности СТЬ и НТЬ, полученных из образца крови пациента.
- б0 014870
Для терапевтического лечения можно использовать фармацевтические композиции для парентерального, локального, перорального, назального, интратекального или местного (например, в виде крема или мази для местного применения) введения. Предпочтительно фармацевтические композиции вводят парентерально, например внутривенно, подкожно, внутрикожно или внутримышечно. Следовательно, данное изобретение предлагает композиции для парентерального введения, которые содержат раствор или суспензию иммуногенных пептидов в подходящем носителе, предпочтительно в водном носителе.
Можно использовать ряд водных носителей, например воду, забуференную воду, 0,8% физиологический раствор, 0,3% раствор глицина, гиаулуроновой кислоты и т.п. Данные композиции можно стерилизовать традиционными, хорошо известными методами, в том числе фильтрованием. Полученные водные растворы можно фасовать как есть или в виде лиофилизованных препаратов, которые перед введением объединяют со стерильным раствором.
Композиции могут содержать фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, необходимые для приближения композиции к физиологическим условиям, такие как средства, используемые для доведения рН, и забуферивающие средства, средства, обеспечивающие нужную тоничность, увлажняющие средства, консерванты и т.п., например ацетат натрия, лактат натрия, хлорид натрия, хлорид калия, хлорид кальция, монолаурат сорбитана, олеат триэтаноламина и др.
Концентрация пептидов согласно изобретению в фармацевтических композициях может широко варьировать, например от менее чем приблизительно 0,1 мас.%, обычно по меньшей мере приблизительно 2 мас.%, до 20-50 мас.% или более, ее выбор, в первую очередь, зависит от объема жидкости, вязкости и т. п. в соответствии с выбранным способом введения.
Человеческая стандартная лекарственная форма композиции обычно включена в фармацевтическую композицию, которая содержит разовую дозу приемлемого для человека носителя, в одном воплощении водного носителя, ее вводят в объеме/количестве, обычно используемом специалистами в данной области для введения таких композиций людям (см., например, Неттд!оп'к РЬагтасеибса1 8аепсек, 1711' ЕбШоп, А. Сеппаго, Ебйог, Маск РиЬбкЫпд Со., Еак!оп, Реппкукаша, 1985). Например, для пациента массой 70 кг доза пептида при начальной иммунизации может составлять приблизительно от 1 до 50000 мкг, как правило, 100-5000 мкг. Например, в случае нуклеиновых кислот начальную иммунизацию можно проводить путем в.м. (или п.к., или в.к.) введения вектора экспрессии в виде оголенной нуклеиновой кислоты в количестве 0,5-5 мг в разные участки. Нуклеиновую кислоту (от 0,1 до 1000 мкг) также можно вводить методом генной пушки. По истечении 3-4-недельного инкубационного периода вводят поддерживающую дозу. В качестве поддерживающего препарата можно вводить рекомбинантный вирус птичьей оспы в дозе от 5х107 до 5х109 бое (бляшкообразующих единиц).
В случае антител лечение обычно включает в себя повторяющееся введение препарата антител против 8ТЕАР-1 посредством приемлемого способа введения, такого как внутривенное введение (в.в.), в дозе, варьирующей приблизительно от 0,1 до 10 мг/кг массы тела. Как правило, дозы в интервале 10-500 мг МаЬ в неделю являются эффективными и хорошо переносятся. Приемлемый дозировочный режим включает в себя в.в. введение начальной ударной дозы препарата МаЬ против 8ТЕАР-1, составляющей приблизительно 4 мг/кг массы тела пациента, и последующее еженедельное в. в. введение дозы, составляющей приблизительно 2 мг/кг. Специалистам в данной области известно, что выбор идеальной дозы для каждого конкретного случая зависит от разных факторов. Такие факторы включают в себя, например, период полужизни композиции, сродство связывания АЬ, иммуногенность вещества, степень экспрессии 8ТЕАР-1 у пациента, степень сбрасывания антигена 8ТЕАР-1 в кровоток, желательный уровень равновесной концентрации, частота введения, влияние химиотерапевтических или других средств, используемых в сочетании со способом лечения согласно изобретению, а также состояние здоровья конкретного пациента. Неограничивающие предпочтительные человеческие разовые дозы составляют, например, 500 мкг-1 мг, 1-50 мг, 50-100 мг, 100-200 мг, 200-300 мг, 400-500 мг, 500-600 мг, 600-700 мг, 700-800 мг, 800-900 мг, 900 мг-1 г или 1-700 мг. В некоторых воплощениях доза составляет 2-5 мг/кг массы тела, например, с последующим еженедельным введением дозы 1-3 мг/кг; 0,5 мг, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 мг/кг массы тела, например, с последующим еженедельным введением дозы в течение двух, трех или четырех недель; 0,5-10 мг/кг массы тела, например, с еженедельным введением дозы в течение двух, трех или четырех недель; 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400 мг/м2 площади тела еженедельно; 1-600 мг/м2 площади тела еженедельно; 225-400 мг/м2 площади тела еженедельно; указанные дозы могут сопровождаться еженедельным введением доз в течение 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или более недель.
В одном воплощении стандартные лекарственные формы для применения человеком содержат полинуклеотиды в подходящем интервале доз или в эффективном количестве, обеспечивающем какой-либо терапевтический эффект. Рядовому специалисту в данной области известно, что терапевтический эффект зависит от ряда факторов, включающих в себя последовательность полинуклеотида, молекулярную массу полинуклеотида и способ введения. Дозы обычно выбирает врач или другой специалист здравоохранения в соответствии с рядом параметров, известных в данной области, таких как тяжесть симптомов, история болезни пациента и т.п. Как правило, дозировочный интервал для полинуклеотида размером приблизительно 20 оснований может иметь нижнюю границу, независимо выбранную, например, из таких значений, как приблизительно 0,1, 0,25, 0,5, 1, 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400
- 61 014870 или 500 мг/кг, и верхнюю границу, независимо выбранную, например, из таких значений, как приблизительно 60, 80, 100, 200, 300, 400, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000 или 10000 мг/кг, при условии, что верхняя граница превышает нижнюю. Например, доза может находиться в любом из следующих приблизительных интервалов: 0,1-100, 0,1-50, 0,1-25, 0,1-10, 1-500, 100-400, 200-300, 1-100, 100-200, 300-400, 400-500, 500-1000, 500-5000 или 500-10000 мг/кг. Как правило, при парентеральных способах введения требуются более высокие дозы полинуклеотида, чем при более направленном введении непосредственно в больную ткань, как в случае более длинных полинуклеотидов.
В одном воплощении стандартные лекарственные формы для применения человеком содержат Т-клетки в подходящем интервале доз или в эффективном количестве, обеспечивающем какой-либо терапевтический эффект. Рядовому специалисту в данной области известно, что терапевтический эффект зависит от ряда факторов. Дозы обычно выбирает врач или другой специалист здравоохранения в соответствии с рядом параметров, известных в данной области, таких как тяжесть симптомов, история болезни пациента и т.п. Доза может составлять приблизительно от 104 до 106 клеток, приблизительно от 106 до 108 клеток, приблизительно от 108 до 1011 клеток или приблизительно от 108 до 5х1010 клеток. Доза также может составлять приблизительно от 106 до 1010 клеток/м2 или приблизительно от 106 до 108 клеток/м2.
Белок (белки) согласно изобретению и/или нуклеиновые кислоты, кодирующие данный белок (белки), также можно вводить с использованием липосом, которые могут служить для 1) направления белка (белков) к конкретной ткани, такой как лимфоидная ткань; 2) избирательного направления к больным клеткам или 3) увеличения периода полужизни пептидной композиции. Препараты липосом включают в себя эмульсии, пенки, мицеллы, нерастворимые монослои, жидкие кристаллы, дисперсии фосфолипидов, ламеллярные слои и т. п. В данных препаратах доставляемый пептид включен в липосому, один или в сочетании с молекулой, которая связывается с рецептором, распространенным среди лимфоидных клеток, такой как моноклональные антитела, связывающиеся с антигеном ί.Ό45, или в сочетании с другими терапевтическими или иммуногенными композициями. Так, липосомы, либо содержащие внутри, либо экспонирующие целевой пептид согласно изобретению, можно направить к лимфоидным клеткам, куда липосомы доставляют пептидные композиции. Липосомы для применения в соответствии с данным изобретением получают из стандартных везикулообразующих липидов, которые обычно включают в себя нейтральные и отрицательно заряженные фосфолипиды и стерин, такой как холестерин. Как правило, выбор липидов зависит от таких факторов, как, например, размер липосом, устойчивость к воздействию кислот и стабильность липосом в кровотоке. Для получения липосом можно использовать разные способы, например, описанные в δ/ока, е1 а1., Апп. Вег. Вюрйук. Вюепд. 9: 467 (1980) и в патентах США № 4235871,4501728, 4837028 и 5019369.
Чтобы направить липосомы к клеткам иммунной системы, в их состав можно ввести лиганд, включающий в себя, например, антитела или их фрагменты, специфичные к поверхностным детерминантам целевых клеток иммунной системы. Суспензию липосом, содержащую пептид, можно вводить внутривенно, локально, местно и т.п. в дозе, которая варьирует в зависимости от способа введения, типа доставляемого пептида, стадии заболевания, подлежащего лечению, и т.п.
Для получения твердых композиций можно использовать традиционные нетоксичные твердые носители, которые включают в себя такие носители фармацевтической категории, как, например, маннит, лактоза, крахмал, стеарат магния, сахарин натрия, тальк, целлюлоза, глюкоза, сахароза, карбонат магния и т.п. Фармацевтически приемлемую нетоксичную композицию для перорального введения получают с использованием любых традиционно использующихся наполнителей, таких как перечисленные ранее носители, такая композиция обычно содержит 10-95% активного ингредиента, включающего в себя один или несколько пептидов согласно изобретению, более предпочтительно 25-75%.
Иммуногенные пептиды для аэрозольного введения предпочтительно предоставляют в мелкоизмельченном виде вместе с поверхностно-активным веществом и пропеллентом. При этом доля пептидов обычно составляет приблизительно 0,01-20 мас.%, предпочтительно приблизительно 1-10 мас.%. Разумеется, поверхностно-активное вещество должно быть нетоксичным и предпочтительно растворимым в пропелленте. Типичными примерами таких веществ являются сложные эфиры или частичные сложные эфиры жирных кислот, содержащих приблизительно от 6 до 22 атомов углерода, таких как капроновая, октановая, лауриновая, пальмитиновая, стеариновая, линолевая, линоленовая, олестериновая и олеиновая кислоты, и алифатического многоатомного спирта или его циклического ангидрида. Можно использовать смешанные сложные эфиры, такие как смешанные или природные глицериды. Масса поверхностноактивного вещества может составлять приблизительно 0,1-20% по отношению к массе композиции, предпочтительно приблизительно 0,25-5%. Остальную часть композиции обычно составляет пропеллент. При желании в состав композиции для интраназальной доставки также может быть включен носитель, такой как, например, лецитин.
- 62 014870
ХЕ Диагностические и прогностические воплощения 8ТЕАР-1.
Как указано в данном описании, полинуклеотиды 8ТЕАР-1, полипептиды, реакционноспособные цитотоксичные Т-клетки (СТЬ), реакционноспособные хелперные Т-клетки (НТЬ) и антитела против полипептидов используют в хорошо известных диагностических, прогностических и терапевтических анализах, позволяющих диагностировать состояния, связанные с нарушением регуляции клеточного роста, такие как рак, в частности злокачественные заболевания, перечисленные в табл. I (см., например, специфический характер тканевой экспрессии, а также сверхэкспрессию при некоторых злокачественных заболеваниях, как описано, например, в примере, озаглавленном Анализ экспрессии 8ТЕАР-1 в нормальных тканях и в образцах, полученных от пациентов).
8ТЕАР-1 можно сравнить с антигеном, ассоциированным с простатой Р8А, исконным маркером, используемым врачами-терапевтами в течение многих лет для идентификации и мониторинга рака простаты (см., например, МеггШ е! а1., I. Иго1. 163(2): 503-5120 (2000); Ро1акс1к е! а1., I. Иго1. Аид; 162(2): 293306 (1999) и Еогйег е! а1., I. ΝηΙ. Сапсег Шк!. 91(19): 1635-1640 (1999)). Для данной цели также используют ряд других диагностических маркеров, в том числе р53 и К-гак (см., например, Ти1сЫпкку е! а1., Ш!. I. Мо1. Мей. 1999 1и1., 4(1): 99-102 и М1што!о е! а1., Сапсег Эе1ес1 Ргеу. 2000, 24(1): 1-12). Следовательно, данное описание полинуклеотидов 8ТЕАР-1 и полипептидов (а также полинуклеотидных зондов 8ТЕАР-1 и антител против 8ТЕАР-1, используемых для идентификации присутствия данных молекул), а также их свойств позволит опытным специалистам использовать данные молекулы в способах, аналогичных используемым, например, в ряде диагностических анализов, направленных на диагностику состояний, связанных с раком.
Типичные воплощения диагностических способов, в которых используются полинуклеотиды 8ТЕАР-1, полипептиды 8ТЕАР-1, специфичные к 8ТЕАР-1 Т-клетки и антитела против 8ТЕАР-1, аналогичны традиционным способам диагностических анализов, в которых используются, например, полинуклеотиды Р8А, полипептиды Р8А, специфичные к Р8А Т-клетки и антитела против Р8А. Например, так же, как и полинуклеотиды Р8А, которые используются в качестве зондов (например, в анализе методом нозерн-блоттинга, см., например, 8капеП е! а1., Вюскет. Мо1. Вю1. Ш!. 33(3): 567-74 (1994)) и праймеров (например, в анализе ПЦР, см., например, Окедатеа е! а1., I. Иго1. 163(4): 1189-1190 (2000)) при определении присутствия и/или уровня мРНК Р8А в методах мониторинга сверхэкспрессии Р8А или метастаз рака простаты, описанные в данном документе полинуклеотиды 8ТЕАР-1 можно использовать аналогично для детектирования сверхэкспрессии 8ТЕАР-1 или метастаз рака простаты и других злокачественных заболеваний, сопровождающихся экспрессией данного гена. Альтернативно, так же, как и полипептиды Р8А, которые используются для стимуляции образования антител, специфичных к Р8А, которые затем можно использовать для определения присутствия и/или уровня белков Р8А в методах мониторинга сверхэкспрессии белка Р8А (см., например, 8!ерйап е! а1., Иго1оду, 55(4): 560-3 (2000)) или метастаз клеток опухоли простаты (см., например, А1апеп е! а1., Ра!ко1. Век. Ргас!. 192(3): 233-7 (1996)), описанные в данном документе полипептиды 8ТЕАР-1 можно использовать для стимуляции образования антител, применяющихся для детектирования сверхэкспрессии 8ТЕАР-1 или метастаз клеток опухоли простаты, а также клеток других раковых опухолей, экспрессирующих данный ген.
А именно, поскольку метастазирование включает в себя перемещение раковых клеток из органа первоначальной опухоли (такого как легкое, предстательная железа и др.) в другие области организма (такие как лимфатические узлы), анализы биологического образца на присутствие клеток, экспрессирующих полинуклеотиды и/или полипептиды 8ТЕАР-1, можно использовать для обнаружения метастаз. Так, присутствие 8ТЕАР-1-экспрессирующих клеток в биологическом образце, который обычно их не содержит (лимфатический узел), например обнаружение экспрессии 8ТЕАР-1 в ЕАРС4 и Е-АРС*/ ксенотрансплантатах, выделенных из лимфатического узла и костных метастазов соответственно, указывает на наличие метастаз.
Альтернативно, полинуклеотиды и/или полипептиды 8ТЕАР-1 можно использовать для диагностики рака, например, если обнаруживается, что клетки в биологическом образце, которые обычно не экспрессируют 8ТЕАР-1 или экспрессируют его на другом уровне, экспрессируют 8ТЕАР-1 или экспрессируют его на повышенном уровне (см., например, уровни экспрессии 8ТЕАР-1 при злокачественных заболеваниях, перечисленных в табл. I, а также в образцах пациентов и др., приведенные на прилагающихся чертежах). С помощью таких анализов специалисты могут получить дополнительные доказательства метастазирования путем тестирования биологического образца на присутствие другого тканеспецифического маркера (в дополнение к 8ТЕАР-1), такого как Р8А, Р8СА и др. (см., например, А1апеп е! а1., Ра!ко1. Век. Ргас!. 192(3): 237 (1996)).
Детектирование присутствия полипептида 8ТЕАР-1 в срезе ткани с помощью иммуногистохимического анализа может указывать на изменение состояния некоторых клеток в данной ткани. В данной области хорошо известно, что способность антитела локализовывать полипептид, экспрессирующийся в раковых клетках, используется для диагностики заболевания, стадии заболевания, развития и/или агрессивности опухоли. С помощью такого антитела также можно детектировать изменение распределения полипептида в раковых клетках по сравнению с соответствующей немалигнизированной тканью.
- 63 014870
Полипептид 8ТЕАР-1 и иммуногенные композиции также используются для детектирования изменения внутриклеточной локализации при болезненных состояниях. Изменение состояния клеток из нормального на болезненное сопровождается изменениями в клеточной морфологии и зачастую связано с изменениями во внутриклеточной локализации/внутриклеточном распределении белка. Например, клеточные мембранные белки, которые в нормальных клетках экспрессируются в поляризованном виде, при возникновении болезненного состояния могут измениться, что приводит к распределению белка в неполяризованном виде на всей поверхности клетки.
Изменение внутриклеточной локализации белка в болезненном состоянии было продемонстрировано для белков МИС1 и НЕН2 с помощью иммуногистохимического анализа. Нормальные эпителиальные клетки имеют обычное поверхностное распределение МИС1 при небольшой локализации гликопротеина на поверхности ядра, тогда как злокачественные клетки часто демонстрируют аполярный характер окрашивания (Όίηζ е! а1., ТНе Вгеа8! 1оигиа1, 7: 40-45 (2001); Ζΐκ-πΐβ е! а1., С11шеа1 Саиеег Не8еагей, 4: 2669-2676 (1998): Сао, е! а1., ТНе 1оигиа1 оГ Н18!оеНет181гу аиб Су!оейет18бу, 45: 1547-1557 (1997)). Кроме того, клетки нормального эпителия молочной железы либо являются отрицательными по белку НЕН2, либо имеют базолатеральное распределение данного белка, тогда как в злокачественных клетках экспрессирующийся белок распределяется по всей клеточной поверхности (Эе Ро!!ег, е! а1., 1и!егиа!юиа1 1оигиа1 оГ Саиеег, 44: 969-974 (1989); МеСогт1ек, е! а1., 117: 935-943 (2002)). Альтернативно, в больном состоянии распределение белка может измениться с исключительно поверхностной локализации на диффузную цитоплазматическую экспрессию. Примером такого белка может служить МИС1 (Όίηζ, е! а1., ТНе Вгеа8! 1оигиа1, 7: 40-45 (2001)).
Изменение локализации/распределения белка в клетке, определяемое гистохимическими методами, также может предоставить информацию, имеющую значение для выбора способов лечения. Последнее применение иллюстрируется случаем, где белок в нормальной ткани находится внутри клетки, а в малигнизированной ткани - на поверхности клетки; локализация белка на поверхности клеток делает клетки доступными для антител, применяющихся в диагностических и терапевтических способах. Если такое изменение локализации белка происходит в случае 8ТЕАР-1, белок 8ТЕАР-1 и связанные с ним иммунные ответы также можно использовать в указанных способах. Соответственно, очень важно определить, действительно ли изменение внутриклеточной локализации белка, наблюдающееся для 24Р4С12, делает белок 8ТЕАР-1 и связанные с ним иммунные ответы очень полезными. Применение композиций 8ТЕАР-1 позволяет специалистам в данной области решать важные диагностические и терапевтические проблемы.
Иммуногистохимические реагенты, специфичные к 8ТЕАР-1, также можно использовать для детектирования метастаз опухолей, экспрессирующих 8ТЕАР-1, в том случае, если полипептид 8ТЕАР-1 обнаруживается в тканях, в которых он обычно не продуцируется.
Таким образом, полипептиды 8ТЕАР-1 и антитела, полученные путем индуцирования иммунных ответов на указанные полипептиды, можно использовать для достижения разных целей, включающих в себя диагностические, прогностические, профилактические и/или терапевтические задачи, известные специалистам в данной области.
Полинуклеотидные фрагменты и варианты 8ТЕАР-1 применяются аналогично полинуклеотидным фрагментам и полинуклеотидным вариантам Р8А, используемым специалистами в данной области в способах мониторинга Р8А. В частности, полинуклеотиды Р8А обычно используются в способах мониторинга Р8А в виде зондов или праймеров, которые состоят из фрагментов последовательности кДНК Р8А. Например, праймеры, используемые в полимеразной цепной реакции для амплификации полинуклеотида Р8А, должны содержать фрагмент, размер которого меньше полной последовательности Р8А. Для проведения ПЦР опытные специалисты обычно получают ряд полинуклеотидных фрагментов, которые можно использовать в качестве праймеров для амплификации разных фрагментов представляющего интерес полинуклеотида или для оптимизации реакций амплификации (см., например, Сае!аио-Аио11е8, С. Вю!еейтдие8, 25(3): 472-476, 478-480 (1998); НоЬегйои е! а1., Ме!1об8 Мо1. Вю1. 98: 121-154 (1998)). Применение таких фрагментов дополнительно иллюстрируется в примере, озаглавленном Анализ экспрессии 8ТЕАР-1 в нормальных тканях и в образцах, полученных от пациентов, где полинуклеотидный фрагмент 8ТЕАР-1 используют в качестве зонда при определении экспрессии молекул РНК 8ТЕАР-1 в раковых клетках. Кроме того, в качестве праймеров и зондов для соответствующих мРНК в методах ПЦР и нозерн-блоттинга используют вариантные нуклеотидные последовательности (см., например, 8атеа1 е! а1., Ее!а1 П1ади. ТНег. 1996. Шу.-Эее. 11(6): 407-13 и Сиггеи! Рго!оео18 1и Мо1ееи1аг Вю1о§у. Уо1. 2. Иш! 2. Егебепек М. Аи8иЬе1 е! а1. еб8., 1995). Для данной цели используют полинуклеотидные фрагменты и варианты, способные связываться с целевой полинуклеотидной последовательностью (например, с полинуклеотидом 8ТЕАР-1, изображенным на фиг. 2, или с его вариантом) в условиях высокой жесткости.
- 64 014870
Далее, полипептиды Р8А, содержащие эпитоп, который может распознаваться антителом или Т-клеткой, специфически связывающейся с данным эпитопом, используют в способах мониторинга Р8А. Фрагменты и аналоги полипептидов 8ТЕАР-1 можно использовать аналогичным способом. В данной области для получения антител (например, антител или Т-клеток, специфичных к Р8А) практикующие специалисты обычно используют фрагменты или варианты полипептидов с использованием разных систем, таких как гибридные белки (см., например, Сштеп! Рго!осо1к Ш Мо1еси1аг Вю1оду. ^1. 2. Ипй 16. Егебепск М. АикиЬе1 е! а1. ебк., 1995). В данном контексте каждый эпитоп (эпитопы) должен иметь конфигурацию, обеспечивающую взаимодействие с антителом или Т-клеткой. Обычно специалисты в данной области получают разные полипептидные фрагменты, которые можно использовать для инициации иммунных ответов, специфичных для разных участков представляющего интерес полипептида (см., например, патенты США № 5840501 и 5939533). Например, иногда предпочтительно использовать полипептид, содержащий один из описанных в данном документе мотивов 8ТЕАР-1 или мотив-несущую субпоследовательность, которые специалист в данной области может легко идентифицировать, используя известные мотивы. В данном контексте используют полипептидные фрагменты, варианты или аналоги, которые еще содержат эпитоп, способный индуцировать образование антител или Т-клеток, специфичных к целевой полипептидной последовательности (например, к полипептиду 8ТЕАР-1, изображенному на фиг. 3).
Как указано в данном описании, полинуклеотиды и полипептиды 8ТЕАР-1 (а также полинуклеотидные зонды 8ТЕАР-1 и антитела против 8ТЕАР-1 или Т-клетки, специфичные к 8ТЕАР-1, используемые для детектирования присутствия данных молекул) обладают специфическими свойствами, которые позволяют использовать их для диагностики злокачественных заболеваний, таких как приведенные в табл. I. Диагностические анализы, которые позволяют определять присутствие генных продуктов 8ТЕАР-1 и посредством этого диагностировать наличие или появление болезненного состояния, описанного в данном документе, такого как рак простаты, используют для выявления пациентов, нуждающихся в профилактических мерах, или для их последующего мониторинга, как и диагностические анализы Р8А, которые успешно применяются в настоящее время. Более того, указанные вещества удовлетворяют существующей в данной области потребности в молекулах, имеющих подобные или комплементарые Р8А характеристики, в тех случаях, когда, например, окончательный диагноз метастаз простатического происхождения не может быть поставлен на основе анализа одного Р8А (см., например, А1апеп е! а1., Ра!1о1. Век. Ргас!. 192(3): 233-237 (1996)), следовательно, такие вещества, как полинуклеотиды и полипептиды 8ТЕАР-1 (а также полинуклеотидные зонды 8ТЕАР-1 и антитела против 8ТЕАР-1, используемые для детектирования присутствия данных молекул), необходимы для подтверждения метастаз простатического происхождения.
Наконец, помимо применения в диагностических анализах, полинуклеотиды 8ТЕАР-1, раскрытые в данном описании, имеют ряд других применений, например, для идентификации связанных с онкогенезом хромосомных нарушений в участке хромосомы, к которому относят 8ТЕАР-1 (см. приведенный ниже пример под заголовком Хромосомное картирование 8ТЕАР-1). Кроме того, помимо применения в диагностических анализах, 8ТЕАР-1-родственные белки и полинуклеотиды, раскрытые в данном описании, имеют ряд других применений, например, в судебно-медицинских анализах тканей неизвестного происхождения (см., например, Такайата К. Еогепкю 8ск Ш!. 1996, Вт. 28; 80(1-2): 63-9).
Кроме того, 8ТЕАР-1-родственные белки или полинуклеотиды согласно изобретению можно использовать для лечения патологического состояния, характеризующегося сверхэкспрессией 8ТЕАР-1. Например, аминокислотную или нуклеотидную последовательность, приведенную на фиг. 2 или 3, или их фрагменты, можно использовать для индуцирования иммунного ответа на антиген 8ТЕАР-1. Антитела или другие молекулы, которые взаимодействуют со 8ТЕАР-1, можно использовать для модуляции функции данной молекулы и получения терапевтического эффекта, опосредованного данной функцией.
XII. Ингибирование белковой функции 8ТЕАР-1.
Данное изобретение включает в себя различные способы и композиции, направленные на ингибирование связывания 8ТЕАР-1 с его партнером по связыванию или его ассоциации с другим белком (белками), а также способы ингибирования функции 8ТЕАР-1.
XII.А. Ингибирование 8ТЕАР-1 внутриклеточными антителами.
В одном способе рекомбинантный вектор, кодирующий одноцепочечные антитела, которые специфически связываются со 8ТЕАР-1, вводят в 8ТЕАР-1-экспрессирующие клетки с помощью методов, использующихся для переноса генов. Соответственно, кодируемое вектором одноцепочечное антитело против 8ТЕАР-1 экспрессируется внутри клетки, связывается с белком 8ТЕАР-1 и посредством этого ингибирует его функцию. Генно-инженерные методы получения таких внутриклеточных одноцепочечных антител хорошо известны. Такие внутриклеточные антитела, также известные как интратела, направляются к конкретному компартменту клетки, обеспечивая контроль над областью фокусирования ингибиторной активности лекарственного средства. Указанная технология успешно применяется в данной области (обзор можно найти в Вюйагбкоп апб Магаксо, 1995, ТШТЕСН, νо1. 13). Показано, что интратела действительно нивелируют экспрессию клеточных поверхностных рецепторов, которые обычно присутствуют в большом количестве (см., например, Вюйагбкоп е! а1., 1995, Ргос. Ыа!1. Асаб. 8ск И8А 92:
- 65 014870
3137-3141; Βее^1^ е! а1., 1994, I. ΒΛΕ Скет. 289: 23931-23936; Пеките е! а1., 1994, Сепе ΤΑγ. 1: 332-337).
Одноцепочечные антитела включают в себя вариабельные домены тяжелой и легкой цепей, соединенные гибким линкерным полипептидом, экспрессирующиеся в одном полипептиде. Необязательно, одноцепочечные антитела экспрессируются в виде одноцепочечного фрагмента вариабельного участка, соединенного с константным участком легкой цепи. Чтобы точно направить интратело к целевому внутриклеточному компартменту, в состав рекомбинантных полинуклеотидных векторов, кодирующих такие одноцепочечные антитела, вводят с помощью методов генной инженерии хорошо известные сигналы внутриклеточного переноса. Например, в состав антител, направляемых к эндоплазматическому ретикулуму (ΕΒ), включают лидерный пептид и, необязательно, С-концевой сигнал удерживания ΕΒ, такой как аминокислотный мотив ΚΌΕΕ. В состав интрател, активность которых реализуется в клеточных ядрах, вводят сигнал ядерной локализации. Чтобы привязать интратело к цитозольной стороне клеточной мембраны, в его состав вводят липидные фрагменты. Функция интрател также может реализовываться в цитозоле. Например, цитозольные интратела используют для изоляции факторов, находящихся в цитозоле, и предотвращения посредством этого их транспортировки к месту назначения.
В одном воплощении интратела используют для улавливания 8ΤΕΑΡ-1 в ядрах, препятствуя таким образом проявлению его активности в данном компартменте клетки. Чтобы достичь нужной направленности, в такие интратела 8ΤΕΑΡ-1 с помощью методов генной инженерии вводят сигналы направления в ядро. Полученные указанными способами интратела 8ΤΕΑΡ-1 специфически связываются с конкретным доменом 8ΤΕΑΡ-1. В другом воплощении с помощью цитозольных интрател, которые специфически связываются с белком 8ΤΕΑΡ-1, предотвращают проникновение 8ΤΕΑΡ-1 в ядра и, посредством этого, реализацию биологической активности 8ΤΕΑΡ-1 в ядрах (например, предотвращают образование транскрипционных комплексов 8ΤΕΑΡ-1 с другими факторами).
Чтобы осуществить экспрессию таких интрател в конкретных клетках, для регуляции транскрипции используют подходящий опухолеспецифический промотор и/или энхансер. Например, чтобы осуществить экспрессию интратела именно в простате, можно использовать промотор и/или промотор/энхансер Ρ8Α (см., например, патент США № 5919652, выданный 6 июля 1999 г.).
ΧΙΙ.β. Ингибирование 8ΤΕΑΡ-1 рекомбинантными белками.
В другом способе рекомбинантные молекулы связываются со 8ΤΕΑΡ-1 и посредством этого ингибируют функцию 8ΤΕΑΡ-1. Например, указанные рекомбинантные молекулы предотвращают доступ 8ΤΕΑΡ-1 к партнеру (партнерам) по связыванию, или ингибируют связывание 8ΤΕΑΡ-1 с партнером (партнерами) по связыванию, или предотвращают или ингибируют образование ассоциации 8ΤΕΑΡ-1 с другим белком (белками). Такие рекомбинантные молекулы могут содержать, например, реакционноспособную часть (части) 8ΤΕΑΡ-1-специфичной молекулы антитела. В конкретном воплощении 8ΤΕΑΡ-1связывающий домен партнера 8ΤΕΑΡ-1 по связыванию входит в состав полученного рекомбинантными методами димерного гибридного белка, в результате чего гибридный белок содержит два домена, связывающих лиганд 8ΤΕΑΡ-1, соединенных с фрагментом Ес человеческого ΙβΟ, такого как человеческий ΙβΟι. Такой фрагмент Ι§6 может содержать, например, домены СН2 и СН3 и шарнирный участок, но не домен СН1. Такие димерные гибридные белки вводят в растворимой форме пациентам, страдающим от рака, связанного с экспрессией 8ΤΕΑΡ-1, после чего данные белки специфически связываются со 8ΤΕΑΡ-1 и блокируют взаимодействие 8ΤΕΑΡ-1 с партнером по связыванию. Димерные гибридные белки можно также объединить в мультимерные белки с помощью известных методов соединения антител.
ΧΙΙ.Ο Ингибирование транскрипции или трансляции 8ΤΕΑΡ-1.
Настоящее изобретение также включает в себя разные способы и композиции, направленные на ингибирование транскрипции гена 8ΤΕΑΡ-1. Аналогично, данное изобретение предлагает способы и композиции, направленные на ингибирование трансляции мРНК 8ΤΕΑΡ-1 с образованием белка.
Один способ ингибирования транскрипции гена 8ΤΕΑΡ-1 включает в себя приведение в контакт гена 8ΤΕΑΡ-1 с антисмысловым полинуклеотидом 8ΤΕΑΡ-1. Другой способ ингибирования трансляции мРНК 8ΤΕΑΡ-1 включает в себя приведение в контакт мРНК 8ΤΕΑΡ-1 с антисмысловым полинуклеотидом. В следующем способе используют 8ΤΕΛΡ-1-специфичный рибозим, который отщепляет транскрипт 8ΤΕΑΡ-1 и в результате этого ингибирует трансляцию. Такие способы с использованием антисмысловых последовательностей и рибозимов также могут быть направлены на регуляторные участки гена 8ΤΕΑΡ-1, такие как промоторные и/или энхансерные элементы 8ΤΕΑΡ-1. Подобным образом, для ингибирования транскрипции мРНК 8ΤΕΑΡ-1 можно использовать белки, способные ингибировать фактор транскрипции гена 8ΤΕΑΡ-1. Различные полинуклеотиды и композиции, используемые в приведенных выше сособах, описаны выше. Применение антисмысловых молекул и рибозимов для ингибирования транскрипции и трансляции широко известно в данной области.
Другие факторы, ингибирующие транскрипцию 8ΤΕΑΡ-1 путем нарушения активации транскрипции 8ΤΕΑΡ-1, также можно использовать для лечения злокачественных заболеваний, сопровождающихся экспрессией 8ΤΕΑΡ-1. Подобным образом, для лечения злокачественных заболеваний, сопровождающихся экспрессией 8ΤΕΑΡ-1, можно использовать факторы, препятствующие процессингу 8ΤΕΑΡ-1. Способы лечения рака, в которых используются такие факторы, также входят в объем согласно изобретению.
- 66 014870
XII.^. Общие принципы терапевтических стратегий.
Способы переноса гена и генной терапии можно использовать для доставки терапевтических полинуклеотидных молекул к опухолевым клеткам, синтезирующим 8ТЕАР-1 (т.е. антисмысловых молекул, рибозимов, полинуклеотидов, кодирующих интратела, и других молекул, ингибирующих 8ТЕАР-1). В данной области известны разные способы генной терапии. Рекомбинантные векторы, кодирующие антисмысловые полинуклеотиды 8ТЕАР-1, рибозимы, факторы, препятствующие транскрипции 8ТЕАР-1, и т.д., можно доставить к целевым опухолевым клеткам с помощью таких способов генной терапии.
Вышеуказанные терапевтические способы можно объединить с любым из широкого ряда хирургических, химиотерапевтических и традиционных способов лечения. Терапевтические способы согласно изобретению позволяют использовать пониженные дозы химиотерапевтических средств (или других лекарственных препаратов) и/или уменьшить частоту введения, это является преимуществом для всех пациентов, но особенно для тех, которые плохо переносят токсичность химиотерапевтических средств.
Противоопухолевую активность конкретной композиции (например, содержащей антисмысловую молекулу, рибозим или интратело) или сочетания таких композиций можно оценить с помощью разных аналитических систем 1и νίΙΐΌ и 1и νί\Ό. Анализы 1и νίΐΐΌ, используемые для определения терапевтической активности, включают в себя анализы клеточного роста, анализы с применением мягкого агара и другие анализы, позволяющие определить опухоль-стимулирующую активность, анализы связывания, позволяющие определить степень ингибирования связывания 8ТЕАР-1 с партнером по связыванию под действием терапевтической композиции, и др.
Эффект терапевтической композиции 8ТЕАР-1 1и νί\Ό можно оценить на подходящей животной модели. Например, можно использовать модели ксеногенного рака простаты, где эксплантаты рака простаты человека или пересаженную ткань ксенотрансплантата вводят иммунокомпромиссным животным, таким как голые мыши или мыши 8СГО (К1еш е! а1., 1997, №!иге Мебкте, 3: 402-408). Например, в патентной заявке РСТ АО 98/16628 и патенте США № 6107540 описаны разные модели ксенотрансплантатов человеческого рака простаты, способные воспроизводить развитие первичных опухолей, микрометастаз и образование остеобластических метастаз, характерных для поздней стадии заболевания. Эффективность препаратов можно прогнозировать с помощью анализов ингибирования образования опухоли, регрессии опухоли или метастаз и т.п.
Для тестирования терапевтических композиций можно использовать анализы 1и νίνΌ, которые позволяют оценить индукцию апоптоза. В одном воплощении ксенотрансплантаты из мышей, несущих опухоль, обработанных терапевтической композицией, можно анализировать на присутствие апоптотических очагов по сравнению с необработанными контрольными мышами, несущими ксенотрансплантат. Относительное количество апоптотических очагов, обнаруженных в опухолях обработанных мышей, соответствует терапевтической эффективности композиции.
Терапевтические композиции, используемые при осуществлении вышеописанных способов, могут быть получены в виде фармацевтических композиций, содержащих носитель, подходящий для желательного способа доставки. Подходящие носители включают в себя любое вещество, которое при объединении с терапевтической композицией сохраняет противоопухолевую функцию терапевтической композиции и, как правило, не вызывает у пациента иммунного ответа. Примеры таких носителей включают в себя, без ограничения, любые стандартные фармацевтические носители, такие как забуференный фосфатом стерильный физиологический раствор, бактериостатическая вода и т. п. (общее описание можно найти в Вет1ид1ои'к Рйагтасеийса1 8аеисек, 16'1' Ебйюи, А. Ока1., Еб., 1980).
Терапевтические композиции можно солюбилизировать и вводить любыми способами, обеспечивающими доставку терапевтической композиции к участку опухоли. Потенциально эффективные способы введения включают в себя, без ограничения, внутривенное, парентеральное, внутрибрюшинное, внутримышечное, внутриопухолевое, внутрикожное, внутриорганное, ортотопическое и т.п. введение. Предпочтительная композиция для внутривенного введения включает в себя раствор терапевтической композиции в обработанной консервантами бактериостатической воде, стерильной не обработанной консервантами воде и/или может находиться в поливинилхлоридных или полиэтиленовых пакетах в виде раствора в 0,9% стерильном растворе хлорида натрия для инъекций, И8Р. Терапевтические белковые препараты можно лиофилизировать и хранить в виде стерильных порошков, предпочтительно в вакууме, которые перед введением растворяют в бактериостатической воде (содержащей, например, бензиловый спирт в качестве консерванта) или в стерильной воде.
Дозы и режимы введения лекарственных средств для лечения злокачественных заболеваний с использованием вышеописанных способов зависят от выбранного способа лечения, от конкретного типа рака, а также от ряда других факторов, известных в данной области.
- 67 014870
XIII. Идентификация. Характеристика и применение модуляторов ЗТЕАР-1.
Способы идентификации и применения модуляторов.
В одном воплощении проводят скрининг для идентификации модуляторов, которые индуцируют или подавляют конкретный профиль экспрессии, подавляют или индуцируют специфические метаболические пути и предпочтительно генерируют связанный с их активностью фенотип. В другом воплощении, идентифицировав конкретные гены с дифференциальной экспрессией в зависимости от состояния, проводят скрининг для идентификации модуляторов, которые изменяют, либо увеличивая, либо уменьшая, экспрессию отдельных генов. В следующем воплощении проводят скрининг для идентификации модуляторов, которые изменяют биологическую функцию продукта гена с особым характером экспрессии. Опять же, идентифицировав значение гена для конкретного состояния, проводят скрининг для идентификации средств, которые связываются с продуктом гена и/или модулируют его биологическую активность.
Кроме того, проводят скрининги генов, индуцируемых в ответ на средство-кандидат. После идентификации модулятора (либо модулятора, который снижает экспрессию в раковой ткани до нормального уровня, либо модулятора ракового гена, который обеспечивает экспрессию гена на уровне, наблюдающемся в нормальной ткани) проводят скрининг для идентификации генов, которые специфично модулируются в ответ на данное средство. При сравнении профилей экспрессии в нормальной ткани и в раковой ткани, обработанной лекарственным средством, обнаружены гены, которые не экспрессируются в нормальной ткани или в раковой ткани, но экспрессируются в ткани, обработанной лекарственным средством, и наоборот. Специфичные к данному средству последовательности идентифицируют и используют в способах, описанных в данном документе для раковых генов или белков. В частности, указанные последовательности и кодируемые ими белки используют для получения или идентификации клеток, обработанных лекарственным средством. Кроме того, получают антитела против белков, индуцируемых данным средством, и используют их для направления новых терапевтических средств к раковой ткани, подлежащей лечению.
Идентификация модуляторов и скрининговые анализы.
Анализы, связанные с экспрессией генов.
Белки, нуклеиновые кислоты и антитела согласно изобретению используют в скрининговых анализах. Связанные с раком белки, антитела, нуклеиновые кислоты, модифицированные белки и клетки, содержащие данные последовательности, используют в таких скрининговых анализах, как анализ влияния лекарственных средств-кандидатов на профиль экспрессии генов, профиль экспрессии полипептидов или на биологическую функцию. В одном воплощении анализы профилей экспрессии проводят предпочтительно в сочетании с методами скрининга высокой пропускной способности, позволяющими осуществлять мониторинг профилей экспрессии генов после лечения средством-кандидатом (например, ^аν^Б, С.Р., е! а1., 1. Вю1. Зсгееп, 7: 69 (2002); 21окагшк, е! а1., Зс1епсе, 279: 84-8 (1998); Не1б, Сепоте ВеБ, 6: 986-94, 1996).
В скрининговых анализах используют раковые белки, антитела, нуклеиновые кислоты, модифицированные белки и клетки, содержащие нативные или модифицированные раковые белки или гены. То есть настоящее изобретение включает в себя способы скрининга композиций, которые модулируют раковый фенотип или физиологическую функцию ракового белка согласно изобретению. Скрининг проводят непосредственно по гену или путем оценки влияния средств-кандидатов на профиль экспрессии гена или на биологическую функцию. В одном воплощении анализ на профили экспрессии предпочтительно используют в сочетании с методами скрининга высокой пропускной способности, позволяющими осуществлять мониторинг после лечения средством-кандидатом, см. 21окат1к, приведено выше.
Проводят ряд анализов, направленных на гены и белки согласно изобретению. При проведении анализов используют определенный уровень нуклеиновой кислоты или белка. То есть проводят скрининг тестируемых соединений на способность модулировать экспрессию гена, который был идентифицирован как ген, участвующий в повышающей регуляции злокачественного заболевания, или на способность связывать раковый белок согласно изобретению. Термин модуляция в данном контексте включает в себя повышение или снижение экспрессии гена. Предпочтительная степень модуляции зависит от исходного изменения экспрессии гена в опухолевой ткани по сравнению с нормальной и составляет по меньшей мере 10%, предпочтительно 50%, более предпочтительно 100-300% и в некоторых воплощениях 300-1000% или выше. Так, если экспрессия гена в ракой ткани в 4 раза выше, чем в нормальной, желательно достичь приблизительно 4-кратного уменьшения экспрессии; аналогично, при 10-кратном уменьшении экспрессии в ракой ткани по сравнению с нормальной желательно, чтобы тестируемое соединение уменьшило экспрессию в 10 раз. Модуляторы, которые усиливают экспрессию гена при злокачественном заболевании, тоже могут быть полезными, например, для модели повышающей регуляции в дальнейших анализах.
Величину экспрессии гена определяют с помощью нуклеотидных зондов и количественного определения уровня экспрессии гена или, альтернативно, регистрируют генный продукт, например, посредством применения антител против ракового белка и стандартных иммунологических анализов. Для количественной оценки экспрессии также используют протеомики и методы разделения.
- 68 014870
Мониторинг экспрессии для идентификации соединений, которые модифицируют экспрессию гена.
В одном воплощении мониторинг экспрессии гена, т.е. получение профиля экспрессии, проводят одновременно для ряда образцов. Такие профили обычно получают для одного или нескольких генов, приведенных на фиг. 2. В таком воплощении, например, зонды, полученные из раковых нуклеиновых кислот, присоединяют к биочипам, чтобы детектировать раковые последовательности в конкретной клетке и определять их количество. Альтернативно, можно использовать ПЦР. Например, в соответствующие лунки титрационного микропланшета помещают праймеры. Затем каждую лунку анализируют методом ПЦР.
Для идентификации соединений, которые модифицируют экспрессию одной или нескольких последовательностей, ассоциированных с раком, например полинуклеотидной последовательности, приведенной на фиг. 2, проводят мониторинг экспрессии. Как правило, тестируемый модулятор добавляют к клеткам до анализа. Кроме того, скрининг также проводят для идентификации средств, которые модулируют злокачественное заболевание, модулируют раковые белки согласно изобретению, связываются с раковым белком согласно изобретению или препятствуют связыванию ракового белка согласно изобретению с антителом или другим партнером по связыванию.
В одном воплощении способы скрининга с высокой пропускной способностью включают в себя использование библиотек, содержащих большое количество потенциальных терапевтических соединений (соединений-кандидатов). Затем такие комбинаторные химические библиотеки подвергают скринингу с помощью одного или нескольких анализов, чтобы идентифицировать компоненты библиотеки (отдельные химические соединения или подклассы соединений), которые обладают желательной специфической активностью. Идентифицированные таким образом соединения можно использовать в качестве традиционных ведущих соединений для скрининга или в качестве терапевтических средств.
В некоторых воплощениях комбинаторные библиотеки потенциальных модуляторов подвергают скринингу на способность связывать раковый полипептид или модулировать его активность. Как правило, новые химические соединения с нужными свойствами получают путем идентификации химического соединения (называемого ведущее соединение), обладающего желательным свойством или активностью, например ингибирующей активностью, создания вариантов ведущего соединения и анализа свойств и активности данных вариантов. Зачастую для таких анализов используют способы скрининга с высокой пропускной способностью.
Как указано выше, для тестирования модуляторов-кандидатов (например, белков, нуклеиновых кислот маленьких молекул) обычно используют мониторинг экспрессии генов. После добавления средствакандидата клетки оставляют инкубироваться в течение некоторого периода времени, затем образец, содержащий целевую анализируемую последовательность, добавляют, например, к биочипу.
При необходимости целевую последовательность получают с помощью известных методов. Например, образец обрабатывают известными буферами для лизиса, чтобы лизировать клетки, подвергают электропорации и др., используя, в зависимости от обстоятельств, очистку и/или амплификацию, например, методом ПЦР. Например, проводят транскрипцию ш νίΐΐΌ, используя метки, ковалентно присоединенные к нуклеотидам. Обычно нуклеиновые кислоты метят биотин-ИТС или РЕ, или суЗ, или су 5.
Чтобы обеспечить детектирование специфического связывания целевой последовательности с зондом, целевую последовательность можно пометить, например, флуоресцентным, хемилюминесцентным, химическим или радиоактивным сигналом. В качестве метки также можно использовать фермент, такой как щелочная фосфатаза или пероксидаза хрена, который в присутствии субстрата продуцирует детектируемый продукт. Альтернативно, в качестве метки можно использовать меченое соединение или маленькую молекулу, такую как ингибитор фермента, которая связывается с ферментом, но не вступает в реакции, катализируемые ферментом, или не изменяется под действием фермента. Метка также может представлять собой фрагмент молекулы или целое соединение, например эпитопный фрагмент или биотин, который специфически связывается со стретавидином. В случае использования биотина стрептавидин метят, как описано выше, с целью получения детектируемого сигнала от связанной целевой последовательности. Несвязанный меченый стрептавидин обычно удаляют перед анализом.
Специалистам в данной области известно, что к указанным выше анализам относятся анализы с применением прямой гибридизации или сэндвич-анализы, включающие в себя использование нескольких зондов, общее описание таких анализов можно найти в патентах США № 5б81702; 5597909; 5545730; 5594117; 5591584; 5571б70; 5580731; 5571б70; 5591584; 5б24802; 5б35352; 5594118; 5359100; 512424б и 5б81б97. В данном воплощении, как правило, целевую нуклеиновую кислоту получают по описанному выше способу и добавляют к биочипу, содержащему множество нуклеотидных зондов, в условиях, которые обеспечивают образование комплекса из гибридизованных молекул.
В настоящем изобретении используют ряд условий гибридизации, включающих в себя указанные выше условия высокой, средней и низкой жесткости. Анализы проводят в условиях такой жесткости, которая обеспечивает образование гибридизационного комплекса меченого зонда только в присутствии целевой последовательности. Жесткость можно регулировать путем изменения шагового параметра, который представляет собой термодинамическую переменную и включает в себя, без ограничения, температуру, концентрацию формамида, концентрацию соли, концентрацию хаотропной соли, рН, концентра
- б9 014870 цию органического растворителя и др. Данные параметры также можно использовать для регуляции неспецифического связывания, как описано в патенте США № 5681697. Так, чтобы уменьшить неспецифическое связывание, желательно проводить некоторые стадии в условиях более высокой жесткости.
Описанные в данном документе реакции можно проводить разными способами. Компоненты, участвующие в реакции, можно добавлять одновременно или последовательно в разном порядке, предпочтительные воплощения данных способов описаны ниже. Кроме того, реакционная смесь может содержать ряд других реагентов. Данные реагенты включают в себя соли, буферы, нейтральные белки, например альбумин, детергенты и др., которые используют для обеспечения оптимальной гибридизации и детектирования и/или уменьшения неспецифических или фоновых взаимодействий. По обстоятельствам, в зависимости от способа получения образца и чистоты целевой последовательности можно использовать реагенты, которые иным образом улучшают эффективность анализа, такие как ингибиторы протеаз, ингибиторы нуклеаз, противомикробные средства и др. Путем анализа полученных результатов определяют уровни экспрессии отдельных генов и изменение экспрессии при изменении состояния клеток с получением профиля экспрессии генов.
Анализы биологической активности.
Данное изобретение предлагает способы идентификации или скрининга соединения, которое модулирует активность связанного с раком гена или белка согласно изобретению. Указанные способы включают в себя добавление тестируемого соединения, как указано выше, к клетке, содержащей раковый белок согласно изобретению. Данные клетки содержат рекомбинантную нуклеиновую кислоту, кодирующую раковый белок согласно изобретению. В другом воплощении библиотеку средств-кандидатов анализируют на нескольких клетках.
В одном аспекте анализы проводят в присутствии или в отсутствие либо при предварительном или последующем добавлении физиологических сигналов, например гормонов, антител, пептидов, антигенов, цитокинов, факторов роста, потенциалов действия, фармакологических средств, включающих в себя химиотерапевтические средства, радиоактивные средства, канцерогенные средства или другие клетки (т.е. межклеточные контакты). В другом примере анализ проводят на разных стадиях клеточного цикла. В данном способе идентифицируют соединения, которые модулируют гены или белки согласно изобретению. Соединения, обладающие фармакологической активностью, могут повышать активность ракового белка согласно изобретению или препятствовать реализации такой активности. После идентификации оценивают подобные структуры, чтобы выявить важные структурные признаки соединения.
В одном воплощении предлагается способ модулирования (например, ингибирования) деления раковых клеток; данный способ включает в себя введение модулятора злокачественного заболевания. В другом воплощении предлагается способ модулирования (например, ингибирования) злокачественного заболевания; данный способ включает в себя введение модулятора злокачественного заболевания. В следующем воплощении предлагаются способы лечения раковых клеток или субъектов, страдающих от рака; данный способ включает в себя введение модулятора злокачественного заболевания.
В одном воплощении предлагается способ модулирования статуса клетки, которая экспрессирует ген согласно изобретению. Используемый в данном описании термин статус включает в себя такие принятые в данной области параметры, как рост, пролиферация, жизнеспособность, функционирование, апоптоз, старение, локализация, ферментативная активность клетки, передача сигнала и др. В одном воплощении раковый ингибитор представляет собой антитело, как указано выше. В другом воплощении раковый ингибитор представляет собой антисмысловую молекулу. Как указано в настоящем описании, специалистам в данной области известен ряд анализов клеточного роста, пролиферации и метастазирования.
Скрининг с высокой пропускной способностью для идентификации модуляторов.
При проведении скрининга с высокой пропускной способностью можно применять анализы, используемые для идентификации подходящих модуляторов. Так, предпочтительные анализы позволяют детектировать повышение или ингибирование транскрипции ракового гена, ингибирование или увеличение экспрессии полипептида и ингибирование или увеличение активности полипептида.
В одном воплощении модуляторы, участвующие в скрининге с высокой пропускной способностью, представляют собой белки, обычно природные белки или фрагменты природных белов. Так, например, можно использовать клеточные экстракты, содержащие белки, или белковые клеточные экстракты, подвергнутые случайному или направленному расщеплению ферментами. В данном способе для скрининга, используемого в способах согласно изобретению, получают библиотеки белков. В данном воплощении можно использовать библиотеки бактериальных, грибковых, вирусных белков и белков млекопитающих, причем последние являются предпочтительными, а человеческие белки являются особенно предпочтительными. Особенно полезные тестируемые соединения имеют функцию, связанную с классом белков, к которому принадлежит мишень, например, они представляют собой субстраты ферментов или лиганды рецепторов.
- 70 014870
Применение методов выращивания на мягком агаре и образования колоний для идентификации и характеристики модуляторов.
Нормальные клетки растут после присоединения к твердому субстрату. Если клетки трансформируются, они утрачивают данное свойство фенотипа и растут неприсоединенными к субстрату. Например, трансформированные клетки могут расти в перемешиваемой суспензионной культуре или при суспендировании в полутвердой среде, такой как полутвердый или мягкий агар. После трансфицирования геномсупрессором опухоли трансформированные клетки могут восстановить нормальный фенотип и потребность в твердом субстрате для присоединения и роста. Анализы роста на мягком агаре или образования колоний используют для идентификации модуляторов раковых последовательностей, которые после экспрессии в клетках-хозяевах ингибируют аномальную пролиферацию и трансформацию клеток. Модулятор уменьшает или устраняет способность клеток расти суспендированными в твердой или полутвердой среде, такой как агар.
Способы проведения анализов роста на мягком агаре или образования колоний в суспензии описаны в ЕгекЬпеу, Си1!иге о£ Ашта1 Се11к а Мапиа1 о£ Вакю ТесЬтцие (3гб еб., 1994). Описание таких способов также можно найти в методическом разделе Сагка\'1ке\' е! а1. (1996), приведено выше.
Идентификация и характеристика модуляторов с помощью анализа контактного ингибирования и ограничения роста плотностью клеток.
Рост нормальных клеток обычно имеет плоский и организованный характер, пока клетки не начнут контактировать друг с другом. Когда клетки начинают соприкасаться друг с другом, вступает в силу контактное ингибирование и рост прекращается. Однако у трансформированных клеток контактное ингибирование отсутствует, они продолжают расти и достигают высокой плотности в очаге дезорганизованного роста. Таким образом, трансформированные клетки достигают более высокой плотности насыщения, чем нормальные клетки. Морфологически это проявляется в образовании дезориентированного монослоя клеток или очага клеток. Альтернативно, степень мечения (3Н)-тимидином при плотности насыщения, используемая для измерения ограничения роста плотностью, подобно МТТ или анализу с использованием аламара синего (А1атаг Ь1ие), позволяет оценить способность клеток к пролиферации, а также способность модуляторов оказывать влияние на пролиферацию. См. ЕгекЬпеу (1994), приведено выше. После трансфицирования генами-супрессорами опухоли трансформированные клетки могут восстановить нормальный фенотип, способность к контактному ингибированию и начинают расти до более низкой плотности.
Анализ степени мечения (3Н)-тимидином при плотности насыщения является предпочтительным способом измерения ограничения роста плотностью. Трансформированные клетки-хозяева трансфицируют ассоциированной с раком последовательностью и выращивают в течение 24 ч при плотности насыщения в условиях неограничивающей среды. Процент клеток, меченных (3Н) -тимидином, определяют по включенной радиоактивности, измеряемой в срт (число импульсов в минуту).
Независимый от контакта рост используют для идентификации модуляторов раковых последовательностей, вызывающих аномальную пролиферацию и трансформацию клеток. Модулятор уменьшает или устраняет независимый от контакта рост и возвращает клеткам нормальный фенотип.
Идентификация и характеристика модуляторов путем анализа зависимости от факторов роста или сыворотки.
Трансформированные клетки имеют более низкую зависимость от сыворотки, чем их нормальные аналоги (см., например, Тетш, I. №!1. Сапсег Шк1. 37: 167-175 (1966); Еад1е е! а1., I. Ехр. Меб. 131: 836879 (1970)); ЕгекЬпеу, приведено выше. Отчасти это является следствием высвобождения разных факторов роста трансформированными клетками. Можно сравнить степень зависимости от факторов роста или от сыворотки у трансформированных клеток-хозяев и у контрольных клеток. Например, степень зависимости клетки от факторов роста или от сыворотки определяют в способах, используемых для идентификации и характеристики соединений, модулирующих ассоциированные с раком последовательности согласно изобретению.
Идентификация и характеристика модуляторов путем измерения уровней опухолеспецифических маркеров.
Опухолевые клетки высвобождают более высокие количества некоторых факторов (далее называемых опухолеспецифические маркеры), чем их нормальные аналоги. Например, активатор плазминогена (РА) высвобождается из человеческой глиомы на более высоком уровне, чем из нормальных клеток мозга (см., например, СиШпо, Апдюдепеык, Тито г Уиксий-ш/абот апб Ро!еп!1а1 Iη!е^£е^еηсе \νί11ι Тито г Сго^!Ь, ш Вю1од1са1 Рекропкек ш Сапсег, р. 178-184 (М1ШсЬ (еб.), 1985)). Подобным образом, фактор опухолевого ангиогенеза (ТАЕ) высвобождается из опухолевых клеток на более высоком уровне, чем из их нормальных аналогов. См., например, Ео1ктап, Апдюдепеык апб Сапсег, 8ет Сапсег Вю1. (1992)), а также высвобождение ЬЕСЕ из опухолей эндотелиальной ткани (ЕпкоЬ, В. е! а1.).
Разные методы, позволяющие измерять высвобождение данных факторов, описаны в ЕгекЬпеу (1994), приведено выше. Описание таких методов также можно найти в ИпИекк е! а1., I. Вю1. СЬет. 249: 4295-4305 (1974); §!пск1апб & Веегк, I. Вю1. СЬет. 251: 5694-5702 (1976); \\Ίιιιγ е! а1., Вг. I. Сапсег. 42: 305-312 (1980); СиШпо, Апдюдепеык, Титог Vакси1а^^ζа!^οη, апб Ро!еп!1а1 Iη!е^£е^сηсе \\'ЬЬ Титог СгоМЬ,
- 71 014870
1п В1о1од1са1 Кекропкек ш Сапсег, р. 178-184 (М1Ыск (еб.), 1985); Егеккпеу, Апйсапсег Кек. 5: 111-130 (1985). Например, уровни опухолеспецифических маркеров определяют в способах, используемых для идентификации и характеристики соединений, модулирующих ассоциированные с раком последовательности согласно изобретению.
Идентификация и характеристика модуляторов путем измерения способности клеток внедряться в матригель
Степень внедрения в матригель или в компонент клеточного матрикса можно использовать для идентификации и характеристики соединений, модулирующих ассоциированные с раком последовательности. Существует положительная корреляция между степенью злокачественности опухолевых клеток и степенью их проникновения в матригель или какой-нибудь другой компонент клеточного матрикса. В данном анализе онкогенные клетки используют в качестве клеток-хозяев. Экспрессия гена-супрессора опухоли в данных клетках-хояевах уменьшает инвазивность клеток-хозяев. Можно использовать методы, описанные в Сапсег Кек. 1999; 59: 6010; Егеккпеу (1994), приведено выше. Коротко говоря, уровень проникновения клеток-хозяев определяют путем использования фильтров, покрытых матригелем или какимнибудь другим компонентом клеточного матрикса. Инвазивность определяют как проникновение в гель или через удаленную сторону фильтра и рассчитывают гистологически путем определения числа клеток и пройденной дистанции или путем предварительного мечения клеток 1251 и подсчетом радиоактивности на удаленной стороне фильтра или на дне чашки. См., например, Егеккпеу (1994), приведено выше.
Идентификация и характеристика модуляторов путем измерения опухолевого роста ш у1уо
Влияние ассоциированных с раком последовательностей на рост клеток анализируют на трансгенных организмах или организмах с подавленным иммунитетом. Трансгенные организмы получают с помощью ряда известных в данной области способов. Например, можно получить нокаутные трансгенные организмы, например млекопитающих, таких как мыши, у которых раковый ген выключают или вставляют. Нокаутных трансгенных мышей получают путем вставки маркерного гена или другого гетерологичного гена в участок эндогенного ракового гена мышиного генома посредством гомологичной рекомбинации. Таких мышей можно получить путем замены эндогенного ракового гена на мутировавшую версию ракового гена или путем мутации эндогенного ракового гена, например, под воздействием канцерогенов.
Чтобы получить трансгенных химерных животных, например мышей, конструкцию ДНК вводят в ядра эмбриональных стволовых клеток. Клетки, содержащие повреждения генома, полученные рекомбинантными методами, вводят мышиному эмбриону-хозяину, который снова имплантируют самкереципиенту. Некоторые из данных эмбрионов развиваются у химерных мышей, у которых некоторые гаметы образуются из мутантной клеточной линии.
Следовательно, путем селекции можно получить новую линию химерных мышей, содержащих искусственное повреждение гена (см., например, СарессЫ е! а1., 8с1епсе, 244: 1288 (1989)). Химерных мышей можно получить по способу, описанному в патенте США № 6365797, выданном 2 апреля 2002 г.; в патенте США № 6107540, выданном 22 августа 2000 г.; Нодап е! а1., Машри1а!шд !ке Мойке Еткгуо: А 1акога!огу Мапиа1, Со1б 8рппд Нагког Ьакога!огу (1988) и Тега!осагсшотак апб Еткгуошс 8!ет Се11к: А Ргасйса1 Арргоаск, Кокейкоп, еб., 1КЬ Ргекк, ^акЫпд!оп, Э.С. (1987).
Альтернативно, можно использовать разных животных с подавленной или дефектной иммунной системой. Например, в качестве хозяина можно использовать генетически бестимусную голую мышь (см., например, Сюуапе11а е! а1., й. ИаЙ. Сапсег 1пк!. 52: 921 (1974)), мышь 8СГО, мышь с удаленной вилочковой железой или облученную мышь (см., например, Вгаб1еу е! а1., Вг. й. Сапсег, 38: 263 (1978); 8е1ку е! а1., Вг. й. Сапсег, 41: 52 (1980)). Опухолевые клетки (обычно около 106 клеток), пересаженные изогенным хозяевам, продуцируют инвазивные опухоли с высокой частотой, тогда как нормальные клетки такого же происхождения не продуцируют опухоль. Хозяевам с развившимися инвазивными опухолями подкожно или в ортотопическую область вводят клетки, экспрессирующие ассоциированные с раком последовательности. Затем мышей разделяют на группы, включающие в себя контрольные группы, и вводят им (экспериментальным группам) тестируемое средство (например, модулятор). Через определенный промежуток времени, предпочтительно через 4-8 недель, измеряют рост опухоли (например, по объему, или по двум наибольшим размерам, или по массе) и сравнивают его с контролем. Говорят, что рост опухоли ингибируется, если происходит статистически значимое уменьшение объема опухоли (определяемое, например, с использованием Т-теста Стьюдента).
Идентификация и характеристика модуляторов с помощью анализов ш уйго.
Идентифицировать соединения, обладающие моделирующей активностью, можно с помощью анализов 1п У1!го. Например, в начале раковый полипептид приводят в контакт с потенциальным модулятором и затем инкубируют его в течение подходящего периода времени, например от 0,5 до 48 ч. В одном воплощении, уровни ракового полипептида определяют ш У1!го путем измерения уровня белка или мРНК. Уровень белка измеряют с помощью иммунологических анализов, таких как вестерн-блоттинг, ЕЕ18А и т.п., с использованием антитела, которое селективно связывается с раковым полипептидом или его фрагментом. Количество мРНК предпочтительно определяют методом амплификации, например с использованием ПЦР, ЬСК, или гибридизации, например нозерн-гибридизации, защиты РНКазы, дот
- 72 014870 блоттинга. Как указано в данном документе, для определения уровня белка или мРНК используют непосредственно или косвенно меченые агенты, например флуоресцентно или радиоактивно меченые нуклеиновые кислоты, радиоактивно или ферментативно меченые антитела и т.п.
Альтернативно, можно использовать систему репортерного гена, содержащую промотор ракового белка, функционально связанный с репортерным геном, таким как ген люциферазы, зеленого флуоресцентного белка, САТ или Р-да1. Репортерную конструкцию' обычно трансфицируют в клетку. После обработки потенциальным модулятором измеряют величину транскрипции, трансляции или активности репортерного гена с помощью стандартных методов, известных специалистам в данной области (Όηνίκ С.Е., приведено выше; Соп/акх, I. & №дц1екси, Р. Сигг. 0рш. Вю!есЬпо1. 1998, 9: 624).
Как указано выше, скрининги ш νίΙΐΌ проводят по отдельным генам и генным продуктам. То есть после идентификации конкретного гена с дифференциальной экспрессией в зависимости от состояния проводят скрининг модуляторов экспрессии гена или генного продукта.
В одном воплощении проводят скрининг модуляторов экспрессии конкретного гена (генов). Как правило, определяют экспрессию только одного или нескольких генов. В другом воплощении при проведении скринингов вначале выявляют соединения, которые связываются с белками, экспрессия которых меняется в зависимосит от состояния клетки. Затем определяют способность данных соединений модулировать активность, связанную с изменяющейся экспрессией. Кроме того, после идентификации исходных соединений-кандидатов можно подвергнуть скринингу их варианты, чтобы более полно осветить взаимоотношения структура-активность.
Идентификация и характеристика модуляторов путем анализа связывания.
В анализах связывания в соответствии с данным изобретением обычно используют очищенный или выделенный генный продукт. Например, получают антитела против белка согласно изобретению и с помощью иммунологических анализов определяют количество и/или локализацию белка. Альтернативно, в таких анализах используют клетки, содержащие раковые белки.
Таким образом, данные способы включают в себя объединение ракового белка согласно изобретению с соединением-кандидатом, таким как лиганд, и определение связывания соединения с раковым белком согласно изобретению. В предпочтительных воплощениях используют человеческий раковый белок; также можно разработать и использовать животные модели человеческого злокачественного заболевания. Кроме того, специалистам в данной области известно, что можно использовать другие аналогичные белки млекопитающих. Более того, в некоторых воплощениях используют варианты или производные раковых белков.
Как правило, раковый белок согласно изобретению, или лиганд, связан с нерастворимой подложкой и не способен диффундировать. Подложкой, например, может быть поверхность, принимающая выделенный образец (планшет для микротитрования, чип и др.). Нерастворимые носители могут быть изготовлены из любого вещества, с которым могут связываться композиции, которое легко отделяется от растворимой фракции и в других аспектах совместимо со способом скрининга в целом. Поверхность таких носителей может быть сплошной или пористой и может иметь любую подходящую форму.
Примеры подходящих нерастворимых подложек включают в себя планшеты для микротитрования, чипы, мембраны и шарики. Обычно их изготавливают из стекла, пластика (например, полистирола), полисахарида, нейлона, нитроцеллюлозы, ТеГ1оп™ и др. Особенно подходящими являются планшеты для микротитрования и чипы, поскольку они позволяют одновременно проводить большое число анализов с использованием маленьких количеств реагентов и образцов. Конкретный характер связывания композиции с носителем не имеет большого значения при условии, что он совместим с реагентами и способами согласно изобретению в целом, позволяет сохранять активность композиции и не сопровождается диффузией. Предпочтительные способы связывания включают в себя применение антител, которые при присоединении белка к подложке не вызывают стерической блокады ни центра связывания лиганда, ни последовательности активации, непосредственное присоединение к липким или ионным подложкам, химическую сшивку, синтез белка или агента на поверхности и др. После присоединения белка или лиганда/связывающего агента к носителю избыток несвязанного вещества удаляют промыванием. Затем поверхности, принимающие образец, можно блокировать путем инкубации с бычьим сывороточным альбумином (БСА), казеином или другим нетоксичным белком или фрагментом.
После присоединения ракового белка к подложке к аналитической смеси добавляют тестируемое соединение. Альтернативно, к подложке присоединяют вещество, связывающее соединение-кандидат и затем добавляют белок согласно изобретению. Связывающие вещества включают в себя специфические антитела, неприродные связывающие средства, идентифицированные при скрининге химических библиотек, пептидных аналогов и др.
Особый интерес представляют анализы, использующиеся для идентификации средств, обладающих низкой токсичностью для клеток человека. Для данной цели можно использовать широкий ряд анализов, включающих в себя анализы пролиферации, анализы цАМФ, анализы связывания меченых 1п ν 11го белков с другими белками, анализы сдвига злектрофоретической подвижности, иммунологические анализы связывания белков, функциональные анализы (анализы фосфорилирования и др.) и т.п.
- 73 014870
Определение связывания тестируемого соединения (лиганда, связывающего агента, модулятора и др.) с раковым белком согласно изобретению можно осуществить разными способами. Тестируемое соединение можно пометить и непосредственно определить связывание, например, путем присоединения всего ракового белка согласно изобретению или его фрагмента к твердой подложке с последующим добавлением меченого соединения-кандидата (например, содержащего флуоресцентную метку), отмыванием избытка реагента и определением присутствия метки на твердой подложке. В зависимости от обстоятельств можно использовать разные стадии блокирования и промывания.
В некоторых воплощениях метят только один из компонентов, например, белок согласно изобретению или лиганды. Альтернативно, можно метить несколько компонентов разными метками, например белки - а соединение - флуорофором. Также можно использовать реагенты, обеспечивающие близкие взаимодействия, например гашение или перенос энергии.
Идентификация и характеристика модуляторов путем анализа конкурентного связывания.
В одном воплощении связывание тестируемого соединения определяют путем анализа конкурентного связывания с соединением-конкурентом. Соединение-конкурент представляет собой связывающий фрагмент, который связывается с целевой молекулой (например, раковым белком согласно изобретению). Соединения-конкуренты включают в себя такие соединения, как антитела, пептиды, партнеры по связыванию, лиганды и др. В определенных условиях связывания соединение-конкурент вытесняет тестируемое соединение. В одном воплощении тестируемое соединение метят. Либо тестируемое соединение, либо соединение-конкурент, либо оба соединения инкубируют с белком в течение периода времени, достаточного для того, чтобы произошло связывание. Инкубации проводят при температуре, которая обеспечивает оптимальную активность, как правило, от 4 до 40°С. Периоды инкубации обычно оптимизируют, например, чтобы обеспечить быстрый скрининг с высокой пропускной способностью; как правило, достаточным является период от 0 до 1 ч. Избыток реагента обычно удаляют или отмывают. Затем добавляют второй компонент и, чтобы определить связывание, детектируют присутствие или отсутствие меченого компонента.
В одном воплощении вначале добавляют соединение-конкурент, затем тестируемое соединение. Замещение соединения-конкурента указывает на то, что тестируемое соединение способно связываться с раковым белком и, возможно, модулировать его активность. В данном воплощении любой компонент может быть меченым. Так, например, если пометить соединение-конкурент, присутствие метки в растворе после отмывания тестируемого соединения указывает на то, что тестируемое соединение замещает соединение-конкурент. Альтернативно, если пометить тестируемое соединение, присутствие метки на подложке будет указывать на замещение.
В альтернативном воплощении вначале добавляют тестируемое соединение, затем после инкубации и промывания добавляют соединение-конкурент. Отсутствие связывания с конкурентом указывает на то, что тестируемое соединение связывается с раковым белком с более высоким сродством, чем соединениеконкурент. Таким образом, если меченым является тестируемое соединение, присутствие метки на подложке указывает на отсутствие связывания соединения-конкурента, а также на то, что тестируемое соединение связывается с раковым белком согласно изобретению и, следовательно, возможно, модулирует его активность.
Соответственно, методы конкурентного связывания включают в себя дифференциальный скрининг для идентификации средств, способных модулировать активность раковых белков согласно изобретению. В данном воплощении способы включают в себя объединение ракового белка и соединенияконкурента в первом образце. Второй образец содержит тестируемое соединение, раковый белок и соединение-конкурент. Связывание конкурента определяют для обоих образцов, и изменение связывания в одном образце по сравнению с другим или разница в связывании в двух образцах указывает на присутствие средства, способного связываться с раковым белком и, возможно, модулировать его активность. То есть если связывание конкурента в первом образце отличается от связывания конкурента во втором образце, значит, средство способно связываться с раковым белком.
Альтернативно, дифференциальный скрининг используют для идентификации лекарственных средств-кандидатов, которые связываются с нативным раковым белком, но не способны связываться с модифицированными раковыми белками. Например, модель структуры ракового белка используют в рациональном дизайне лекарственного средства для синтеза соединений, которые взаимодействуют с конкретным участком, соединений, которые обычно не связываются с белками, у которых этот участок модифицирован. Более того, скрининг лекарственных средств на способность повышать или понижать активность раковых белков позволяет идентифицировать лекарственные средства-кандидаты, которые влияют на активность нативного ракового белка.
- 74 014870
В данных анализах можно использовать положительные и отрицательные контроли. Чтобы получить статистически значимые результаты, контрольные и тестируемые образцы предпочтительно используют по меньшей мере с тройными повторами. Инкубацию всех образцов проводят в течение периода времени, достаточного для того, чтобы произошло связывание соединения с белком. После инкубации образцы отмывают от неспецифически связанных веществ и определяют количество связанного, обычно меченого, соединения. Например, при использовании радиоактивной метки количество связанного соединения можно определить путем измерения количества радиоактивности на сцинтилляционном счетчике.
В скрининговых анализах можно использовать ряд других реагентов. Такие реагенты включают в себя такие соединения, как соли, нейтральные белки, например альбумин, детергенты и др., которые используют для обеспечения оптимального белок-белкового связывания и/или уменьшения неспецифических или фоновых взаимодействий. Кроме того, можно использовать реагенты, которые иным образом улучшают эффективность анализа, такие как ингибиторы протеаз, ингибиторы нуклеаз, противомикробные средства и др. Компоненты смеси добавляют в таком порядке, который обеспечивает необходимое связывание.
Применение полинуклеотидов для понижающей регуляции или ингибирования белка согласно изобретению.
Полинуклеотидные модуляторы рака можно вводить в клетку, содержащую целевую нуклеотидную последовательность, путем образования конъюгата с лигандсвязывающей молекулой, как описано в \У0 91/04753. Подходящие лигандсвязывающие молекулы включают в себя, без ограничения, клеточные поверхностные рецепторы, факторы роста, другие цитокины или другие лиганды, которые связываются с клеточными поверхностными рецепторами. Предпочтительно конъюгирование лигандсвязывающей молекулы, по существу, не препятствует способности данной молекулы связываться с соответствующей молекулой или рецептором или блокировать вход смыслового или антисмыслового олигонуклеотида или его конъюгированной версии в клетку. Альтернативно, полинуклеотидный модулятор рака можно ввести в клетку, содержащую целевую нуклеотидную последовательность, например, путем образования комплекса полинуклеотид-липид, как описано в XV0 90/10448. Понятно, что антисмысловые молекулы или модели с нокаутным и выключенным геном помимо способов лечения также можно использовать в описанных выше скрининговых анализах.
Ингибиторные и антисмысловые нуклеотиды.
В некоторых воплощениях активность ассоциированного с раком белка подвергается понижающей регуляции или полностью ингибируется путем применения антисмыслового полинуклеотида или ингибиторных маленьких ядерных РНК (БпРНК), т. е. нуклеиновых кислот, комплементарных и предпочтительно специфически гибридизующихся с нуклеотидной последовательностью, кодирующей, например, раковый белок согласно изобретению, мРНК или ее субпоследовательность. Связывание антисмыслового полинуклеотида с мРНК уменьшает трансляцию и/или стабильность мРНК.
В контексте согласно изобретению антисмысловые полинуклеотиды могут содержать природные нуклеотиды или синтетические, полученные из природных нуклеотидов или их близких гомологов. Антисмысловые полинуклеотиды также могут содержать измененные углеводные фрагменты или измененные связи между остатками сахаров. Примерами таких измененных нуклеотидов являются фосфоротиоат и другие серосодержащие виды, известные в данной области. Аналоги входят в объем согласно изобретению при условии, что они гибридизуются с нуклеотидами согласно изобретению. См., например, Пб Рйагтасеийсак, СагкЬаб, СА; Зедийог, Шс., №йск, МА.
Такие антисмысловые полинуклеотиды можно легко получить рекомбинантными методами или путем синтеза ш νίΙΐΌ. Оборудование для такого синтеза продается несколькими поставщиками, в том числе АррИеб ВюБуБ!етБ. Способы получения других олигонуклеотидов, таких как фосфоротиоаты и алкилированные производные, хорошо известны специалистам в данной области.
В данном описании термин антисмысловые молекулы включает в себя антисмысловые или смысловые олигонуклеотиды. Смысловые олигонуклеотиды, например, можно использовать для блокирования транскрипции путем связывания с антисмысловой цепью. Антисмысловые и смысловые олигонуклеотиды включают в себя последовательность одноцепочечной нуклеиновой кислоты (либо РНК, либо ДНК), способной связываться с целевыми последовательностями мРНК (смысловой) или ДНК (антисмысловой), кодирующими раковые молекулы. В соответствии с настоящим изобретением антисмысловые или смысловые олигонуклеотиды включают в себя фрагмент, содержащий, как правило, по меньшей мере приблизительно 12 нуклеотидов, предпочтительно приблизительно от 12 до 30 нуклеотидов. Способы получения антисмысловых или смысловых олигонуклеотидов на основе последовательности кДНК, кодирующей целевой белок, описаны, например, в З!ет & Сойеп (Сапсег ВеБ. 48: 2659 (1988) и νап бег Кго1 е! а1. (ВюТесйтдиеБ, 6: 958 (1988)).
- 75 014870
Рибозимы.
Помимо антисмысловых полинуклеотидов для ингибирования ассоциированных с раком нуклеотидных последовательностей, можно использовать рибозимы. Рибозим представляет собой молекулу РНК, которая каталитически расщепляет другие молекулы РНК. Описаны разные виды рибозимов, в том числе рибозимы группы I, молотоголовые (йаттегйеаб) рибозимы, шпилечные (йапрт) рибозимы, РНКаза Р и рибозимы с урезанной головой (ахБеаб) (общий обзор свойств разных рибозимов можно найти, например, в Сак!аио!!о е! а1., Абу. 1и Рйагтасо1оду, 25: 289-317 (1994)).
Общие свойства шпилечных рибозимов описаны, например, в Натре1 е! а1., Ыис1. Аабк Кек. 18: 299304 (1990); в Европейской патентной заявке № 0360257 и в патенте США № 5254678. Способы получения рибозимов хорошо известны специалистам в данной области (см., например, νθ 94/26877; Ощаид е! а1., Ргос. №11. Асаб. 8сг И8А, 90: 6340-6344 (1993); Уатаба е! а1., Нитаи Сеие Тйегару, 1: 39-45 (1994); Ьеауй! е! а1., Ргос. №11. Асаб. 8сг И8А, 92: 699-703 (1995); Ьеауй! е! а1., Нитаи Сеие Тйегару, 5: 1151-120 (1994) и Уатаба е! а1., Уйо1о§у, 205: 121-126 (1994)).
Применение модуляторов в фенотипическом скрининге.
В одном воплощении тестируемое соединение вводят в популяцию раковых клеток, которые имеют связанный с раком профиль экспрессии. Под введением или приведением в контакт в данном описании подразумевают добавление модулятора к клеткам таким способом, который обеспечивает действие модулятора на клетку, либо внутриклеточное действие после поглощения, либо действие на клеточную поверхность. В некоторых воплощениях нуклеиновую кислоту, кодирующую белковый агент (т.е. пептид), помещают в вирусную конструкцию, например в аденовирусную или ретровирусную, и добавляют к клетке так, чтобы обеспечить экспрессию пептидного агента, см., например, РСТ И897/01019. Также можно использовать регуляторные системы для генной терапии. После введения модулятора клетки при необходимости промывают и оставляют инкубироваться предпочтительно в физиологических условиях в течение определенного периода времени. Затем клетки собирают и определяют профиль экспрессии генов. Так, например, для скрининга средств, которые модулируют, например, индуцируют или подавляют раковый фенотип, используют раковую ткань. Изменение экспрессии по меньшей мере одного гена, предпочтительно нескольких, в общем профиле экспрессии указывает на то, что тестируемое средство влияет на раковую активность. Подобным образом, изменение биологической функции или сигнального пути указывает на наличие модулирующей активности. После определения такого влияния на раковый фенотип предпринимают скрининг новых лекарственных средств, которые изменяют фенотип. В данном подходе лекарственное средство может быть неизвестным и может не присутствовать в исходном скрининге экспрессии гена/белка, уровень транскрипта целевого белка также может не меняться. Ингибирующая функция модулятора служит суррогатным маркером.
Как указано выше, скрининги проводят по генам или генным продуктам. То есть после идентификации конкретного гена с дифференциальной экспрессией, в зависимости от состояния, проводят скрининг модуляторов по экспрессии либо гена, либо генного продукта.
Применение модуляторов для воздействия на пептиды согласно изобретению.
Определение активности ракового полипептида или ракового фенотипа проводят с помощью ряда анализов. Например, влияние модуляторов на функцию ракового полипептида (полипептидов) измеряют путем определения описанных выше параметров. Для оценки влияния тестируемого соединения на полипептиды согласно изобретению используют физиологическое изменение, вызываемое изменением активности полипептида. Если функциональные анализы проводят на интактных клетках или животных, можно оценивать разные эффекты, например, в случае рака, связанного с солидными опухолями, это - рост опухоли, метастазирование опухоли, реваскуляризация, высвобождение гормонов, изменение транскрипции как известных, так и ^охарактеризованных генных маркеров (например, определяемое методом нозерн-блоттинга), изменение клеточного метаболизма, например рост клеток или изменение рН, а также изменение уровня внутриклеточных вторичных мессенджеров, таких как сСИТР.
Способы идентификации и характеристики ассоциированных с раком последовательностей.
Экспрессия разных генных последовательностей коррелирует с наличием злокачественного заболевания. Соответственно, определяют нарушения, связанные с мутантными или вариантными раковыми генами. В одном воплощении данное изобретение предлагает способы идентификации клеток, содержащих варианты раковых генов, например определение присутствия всей или части последовательности по меньшей мере одного ракового гена в клетке. Такое определение можно проводить с помощью разных методов секвенирования. Данное изобретение включает в себя способы идентификации ракового генотипа у субъекта, например определение присутствия у субъекта всей или части последовательности по меньшей мере одного гена согласно изобретению. Данный анализ проводят с использованием по меньшей мере одной ткани субъекта, например ткани, приведенной в табл. I, но можно использовать несколько тканей или несколько разных образцов одной ткани. Данный способ может включать в себя сравнение последовательности секвенированного гена с последовательностью известного ракового гена, т.е. гена дикого типа, для отнесения к определенному семейству, а также для выявления гомологии, мутаций или вариантов. Затем последовательность всего или части гена можно сравнить с последовательностью известного ракового гена, чтобы определить, существуют ли какие-нибудь различия. Такое сравнение
- 76 014870 можно осуществить с помощью ряда известных программ для определения гомологии, таких как βΕ-ΆδΗ ВеЧГЛ и др. Как указано в данном описании, различие в последовательностях ракового гена пациента и известного ракового гена коррелирует с болезненным состоянием или с предрасположенностью к болезненному состоянию.
В предпочтительном воплощении раковые гены используют в качестве зондов для определения числа копий ракового гена в геноме. Раковые гены также используют в качестве зондов для определения хромосомной локализации раковых генов. Информацию о хромосомной локализации можно использовать для диагностики и прогнозирования, особенно если в локусе ракового гена обнаружены хромосомные нарушения, такие как транслокации и т.п.
XIV. иРНК и терапевтическое применение коротких интерферирующих РНК (киРНК).
Настоящее изобретение также направлено на олигонуклеотиды киРНК, в частности на двухцепочечные РНК, содержащие, по меньшей мере, фрагмент участка, кодирующего δТЕΆР-1, или 5-участки ИТВ, а также на олигонуклеотиды, комплементарные последовательности δΙΈνΕ^, или на антисмысловые олигонуклеотиды, специфичные для последовательности 8ТЕАР-1. В одном воплощении такие олигонуклеотиды используют для освещения функции δТЕΆР-1 или для скрининга с целью выявления модуляторов функции или экспрессии δТЕΆР-1. В другом воплощении экспрессию гена δТЕΆР-1 уменьшают путем трансфекции киРНК, что приводит к значительному снижению пролиферативной способности трансформированных раковых клеток, которые эндогенно экспрессируют антиген; у клеток, обработанных специфическими киРНК 8ТЕАР-1, наблюдается пониженная выживаемость, определяемая, например, по метаболическому считыванию клеточной жизнеспособности, которая коррелирует с пониженной способностью к пролиферации. Таким образом, композиции на основе киРНК δТЕΆР-1 содержат киРНК (двухцепочечная РНК), которая соответствует последовательности ОВР нуклеиновой кислоты, кодирующей белок δТЕΆР-1 или его субпоследовательности; как правило, указанные субпоследовательности состоят из 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 или более непрерывных нуклеотидов РНК в длину и содержат последовательности, которые являются комплементарными и некомплементарными по меньшей мере части последовательности, кодирующей мРНК. В предпочтительном воплощении субпоследовательности содержат 19-25 нуклеотидов в длину, наиболее предпочтительно 21-23 нуклеотидов в длину.
Подавление с использованием РНК является новым подходом к получению молчащих генов ш νίΙΐΌ и ш у1уо, следовательно, короткие двухцепочечные РНК (киРНК) являются ценными терапевтическими средствами. Способность киРНК приводить к молчанию конкретных генов в настоящее время используется у животных моделей заболевания, а также у людей. Например, доказано, что введение мыши путем гидродинамической инфузии раствора киРНК против конкретной мишени имеет терапевтический эффект.
В новаторской работе, проведенной δοηд Е. е1 а1., показано, что один тип природных нуклеиновых кислот, а именно, короткие интерферирующие РНК (киРНК), можно использовать в качестве терапевтических средств без какой-либо дополнительной химической модификации ^опд, Е., е1 а1. КНА. т!егГегепсе ЮгдеЕпд Рак рго!ес!к писе Ггот Ги1ттап1 йераДДк. №И. Ме!. 9(3): 347-51 (2003)). В данной работе впервые доказывается ш у1уо, что инфузия киРНК животному может облегчать симптомы заболевания. В данном случае авторы делают мышам инъекции киРНК, направленной против белка РАδ (рецептор клеточной гибели, который при воспалительном ответе приходит в гиперактивное состояние и вызывает гибель гепатоцитов и других клеток). На следующий день животным дают антитело, специфичное к Рак. Контрольные мыши умирают от острой печеночной недостаточности в течение нескольких дней, тогда как более 80% мышей, получивших киРНК, выживают без симптомов серьезного заболевания. Приблизительно от 80 до 90% клеток печени таких мышей содержат оголенные олигонуклеотиды киРНК. Кроме того, молекулы РНК, уже функционирующие в течение 10 дней, теряют активность через 3 недели.
Для лечения людей киРНК доставляют с помощью эффективных систем, обеспечивающих длительную активность иРНК. Основным требованием при клиническом применении является доставка киРНК к нужным клеткам. По-видимому, гепатоциты являются наиболее восприимчивыми к экзогенной РНК. В настоящее время мишени, находящиеся в печени, привлекают внимание исследователей, поскольку печень является органом, который могут легко достигать молекулы нуклеиновых кислот и вирусные векторы. Однако мишенями также могут служить другие ткани и органы.
В терапии для улучшения введения киРНК используют композиции, содержащие киРНК вместе с соединениями, которые обеспечивают прохождение через клеточные мембраны. Другое воплощение относится к химически модифицированным синтетическим киРНК, которые являются устойчивыми к нуклеазам и стабильными в сыворотке и соответственно имеют повышенную продолжительность действия.
Таким образом, технология с использованием киРНК представляет собой способ лечения злокачественных заболеваний человека путем доставки молекул киРНК, направленных против 8ТЕАР-1, субъектам, страдающим от злокачественных заболеваний, таких как перечисленные в табл. I. Такое введение киРНК приводит к снижению роста раковых клеток, экспрессирующих δТЕАР-1, и обеспечивает противоопухолевую терапию, уменьшая заболеваемость и/или смертность, связанные со злокачественными заболеваниями.
- 77 014870
Анализы 1п νίΙΐΌ или ш νί\Ό показали высокую эффективность данного способа устранения генного продукта. Эффективность ш ν 11го можно легко продемонстрировать путем введения киРНК в культуру клеток (как описано выше) или в биопсийные образцы раковых пациентов, если анализы ш νίΙΐΌ используют для детектирования пониженной экспрессии белка 8ТЕАР-1.
XV. Наборы/готовые изделия.
Наборы для описанных в данном документе лабораторных, прогностических, диагностических и терапевтических применений входят в объем согласно изобретению. Такие наборы могут содержать носитель, упаковку или контейнер, разделенный на отсеки, которые могут вмещать один или несколько таких контейнеров, как флаконы, пробирки и т.п., причем каждый отдельный элемент контейнера предназначен для использования в описанном способе, а также этикетку или вкладыш с инструкциями по применению, такому как применение, описанное в данном документе. Например, контейнер (контейнеры) содержит зонд, который может быть помечен детектируемой меткой. Такой зонд может представлять собой антитело или полинуклеотид, специфичный для белка, или гена, или транскрипта согласно изобретению соответственно. Если набор предназначен для детектирования целевой нуклеиновой кислоты методом гибридизации, в его состав могут входить контейнеры, содержащие нуклеотид(ы) для амплификации последовательности целевой нуклеиновой кислоты. Наборы могут включать в себя контейнер, содержащий репортерное соединение, такое как биотинилированный белок, например авидин или стрептавидин, связанный с репортерной молекулой, такой как ферментная, флуоресцентная или радиоактивная метка; такое репортерное соединение можно использовать, например, вместе с нуклеиновой кислотой или антителом. Набор может содержать полноразмерные или частичные аминокислотные последовательности, приведенные на фиг. 2 или 3, или их аналоги, или молекулы нуклеиновых кислот, кодирующих такие аминокислотные последовательности.
Набор согласно изобретению обычно содержит описанный выше контейнер и один или несколько связанных с ним других контейнеров, которые содержат средства, необходимые с коммерческой и пользовательской точки зрения, и включающие в себя буферы, разбавители, фильтры, иглы, шприцы; этикетки для носителя, упаковки, контейнера, флакона и/или пробирки с описанием содержимого и/или инструкциями по применению, а также вкладыши в упаковку с инструкциями по применению.
На контейнере или вместе с ним может присутствовать этикетка, указывающая, что композиция предназначена для специфического терапевтического или нетерапевтического применения, такого как прогностическое, профилактическое, диагностическое или лабораторное применение, этикетка также может указывать для ш νί\Ό или ш νί!ΐΌ применения, такого как описанное в данном документе, предназначена данная композиция. Входящие в состав набора вкладыш(и) или этикетка(и) могут содержать инструкции или другую информацию. Этикетка может находиться на контейнере или она может быть связана с ним. Этикетка находится на контейнере, если буквы, числа или другие символы, образующие этикетку, отформованы или выгравированы на самом контейнере; этикетка может быть связана с контейнером, если она присутствует в таре или носителе, который также содержит контейнер, например в виде вкладыша в упаковку. Этикетка может указывать, что композиция предназначена для диагностики, лечения, профилактики или прогнозирования такого состояния, как неоплазия ткани, приведенной в табл. I.
Термины набор и готовое изделие можно использовать как синонимы.
В другом воплощении согласно изобретению предлагается готовое изделие (готовые изделия), которое включает в себя композиции, содержащие аминокислотную последовательность (аминокислотные последовательности), маленькую молекулу (маленькие молекулы), нуклеотидную последовательность (нуклеотидные последовательности) и/или антитело (антитела), т. е. вещества, используемые для диагностики, прогнозирования, профилактики и/или лечения неоплазии тканей, приведенных в табл. I. Готовое изделие обычно содержит по меньшей мере один контейнер и по меньшей мере одну этикетку. Подходящие контейнеры включают в себя, например, бутылки, флаконы, шприцы и пробирки. Контейнеры могут быть изготовлены из разных материалов, таких как стекло, металл или пластик. Контейнер может содержать аминокислотную последовательность (аминокислотные последовательности), маленькую молекулу (маленькие молекулы), нуклеотидную последовательность (нуклеотидные последовательности), популяцию (популяции) клеток и/или антитело (антитела). В одном воплощении контейнер содержит полинуклеотид для применения в анализе профиля экспрессии мРНК в клетке вместе с реагентами, используемыми для данной цели. В другом воплощении контейнер содержит антитело, его связывающий фрагмент или специфический связывающий белок для применения в анализе экспрессии белка 8ТЕАР-1 в клетках и тканях или для соответственных лабораторных, прогностических, диагностических, профилактических и терапевтических применений; указания и/или инструкции по таким применениям могут присутствовать на контейнере или вместе с ним как реагенты и другие композиции или средства, используемые для данных целей. В другом воплощении контейнер содержит вещества, вызывающие клеточный или гуморальный иммунный ответ, вместе с прилагающимися указаниями и/или инструкциями. В другом воплощении контейнер содержит вещества для адоптивной иммунотерапии, такие как цитотоксичные Т-клетки (СТЬ) или хелперные Т-клетки (НТЬ), вместе с прилагающимися указаниями и/или инструкциями; контейнер также может содержать реагенты и другие композиции или средства, используемые для данных целей.
- 78 014870
Альтернативно, контейнер может содержать композицию, эффективную для лечения, диагностики, прогнозирования или профилактики состояния, а также стерильное входное отверстие (например, контейнер может представлять собой пакет, содержащий раствор для внутривенного вливания, или флакон, имеющий пробку, которую можно проколоть иглой для подкожных инъекций). Активный ингредиент композиции может представлять собой антитело, способное специфически связывать 8ТЕАР-1 и модулировать функцию 8ТЕАР-1.
Готовое изделие может дополнительно включать в себя второй контейнер, содержащий фармацевтически приемлемый буфер, такой как забуференный фосфатом физиологический раствор, раствор Рингера и/или раствор декстрозы. Он может также содержать другие средства, необходимые с точки зрения производителя и потребителя, которые включают в себя другие буферы, разбавители, фильтры, мешалки, иглы, шприцы и/или вкладыши в упаковку с указаниями и/или инструкциями по применению.
Примеры
Различные аспекты согласно изобретению далее описываются и иллюстрируются с помощью нескольких приведенных ниже примеров, ни один из которых не предназначен для ограничения объема согласно изобретению.
Пример 1. Выделение фрагмента кДНК гена 8ТЕАР-1 методом 88Н.
Материалы и методы.
Ксенотрансплантаты ЬАРС.
Ксенотрансплантаты ЬАРС получают от Όγ. СЬаг1ек 8а^уегк (ИСЬА) и используют по описанному способу (К1еш е! а1., 1997, №1Шге Меб. 3: 402-408; Сгай е! а1., 1999, Сапсег Век. 59: 5030-5036). Андрогензависимые и андрогеннезависимые ксенотрансплантаты ЬАРС-4 (ЬАРС-4 АО и АI соответственно) и ксенотрансплантаты ЬАРС-9 (ЬАРС-9 АО и АI соответственно) выращивают у интактных самцов мышей 8СГО или у кастрированных самцов соответственно и пересаживают в виде маленьких кусочков ткани самцам-реципиентам. Ксенотрансплантаты ЬАРС-4 АI получают из опухолей ЬАРС-4 АО, а ксенотрансплантаты ЬАРС-9 АI получают из опухолей ЬАРС-9 АО. Чтобы получить ксенотрансплантаты ΆΣ, самцов мышей, несущих опухоли ЬАРС АО, кастрируют и выдерживают в течение 2-3 месяцев. После того как опухоли ЬАРС снова вырастают, их выделяют и пересаживают кастрированным самцам или самкам мышей 8СГО.
Ксенотрансплантаты ЬАРС-4 АО выращивают внутри голени следующим образом. Выращенную подкожно опухолевую ткань ксенотрансплантата ЬАРС-4 АО измельчают с получением кусочков размером 1-2 мм3 в среде К Iксоνек, затем измельченную ткань центрифугируют при 1,3 тыс. об/мин в течение 4 мин, супернатант ресуспендируют в 10 мл охлажденной на льду среде К Iксоνек и центрифугируют при 1,3 тыс. об/мин в течение 4 мин. Затем осадок ресуспендируют в среде Iксоνек, содержащей 1% проназы Е, и инкубируют 20 мин при комнатной температуре при умеренном встряхивании, после чего инкубируют на льду в течение 2-4 мин. Фильтрат центрифугируют при 1,3 тыс. об/мин в течение 4 мин, супернатант удаляют отсасыванием, а осадок снова суспендируют в 10 мл среды Iксоνек и центрифугируют, чтобы удалить проназу. Затем скопления клеток помещают в среду РгЕСМ и выращивают в течение ночи. После этого клетки собирают, фильтруют, промывают 2х ВΡМ[ и считают. Приблизительно 50000 клеток смешивают на льду с равным объемом охлажденного на льду матригеля и хирургическим путем вводят в проксимальный метафиз большеберцовой кости мышей 8СГО с помощью иглы 27 калибра. Через 10-12 недель извлекают опухоли ЬАРС-4, растущие в костном мозге.
Клеточные линии и ткани.
Человеческие клеточные линии (например, НеЬа) получают от АТСС и держат в среде ОМЕМ, содержащей 5% фетальной телячьей сыворотки. Человеческие ткани для анализов РНК и белка получают из Центра хранения человеческих тканей (НТВС - Нитап Т1ккие Векоигсе Сеп!ег) ИСЬА (Ьок Апде1ек, СА) и от ОнаНек, кчс. (8ап!а ВагЬага, СА).
Выделение РНК.
Чтобы выделить общую РНК, опухолевую ткань и клеточные линии гомогенизируют в реагенте Тпхо1 (Ь1£е ТесЬпо1од1ек, 61Ьсо ВРЬ), используемом в количестве 10 мл/г ткани или 10 мл/108 клеток. Из общей РНК выделяют поли-А с помощью мини- и миди-наборов для выделения РНК О|адеп'к О11до!ех. Общую РНК и мРНК количественно определяют с помощью спектрофотометрического анализа (Ο.Ό. 260/280 нм) и анализируют методом гель-электрофореза.
- 79 014870
Олигонуклеотиды.
Используют нижеследующие нуклеотиды, очищенные методом ВЭЖХ. □ΓΝΕΟΝ (праймер для синтеза кДНК):
5'ТТТТСАТСААССТТзоЗ 1 (5Е0 Ιϋ N0: 68)
Адаптор 1:
5'СТААТАСОАСТСАСТАТАОСССТСОАОССОССОСССОООСАОЗ’ (2Е0 ΙΕ N0:69) 'ОССССОТССТАСБ ’ (ЗЕ<2 ТО МО: 70)
Адаптор 2:
51 (ЗТААТАСОАСТСАСТАТАСаОСАОССТааТСОСООСССАОЗ' ίΟΞΟ ΙΌ N0:71) 3'СОССТССТАО5' (ЗЕО Ιϋ ΝΟ: 72)
Праймер 1 для ПЦР:
Футлярный праймер (ΝΈ) 1:
Футлярный праймер (ΝΈ) 2:
’АССО'Г'ЗОТСОСОаСССАООАЗ 1 (5Ες> Ιϋ ΝΟ: 75)
Супрессивная вычитательная гибридизация.
Супрессивную вычитательную гибридизацию (δδΜ) используют для идентификации кДНК, соответствующих генам, которые подвергаются повышающей регуляции при андрогензависимом раке простаты по сравнению с доброкачественной гиперплазией простаты (ВРН).
Двухцепочечные кДНК, соответствующие ксенотрансплантату ЬАРС-4 АО (тестер (1ек1ег)) и ткани ВРН (драйвер (бпгег)) синтезируют из 2 мкг смеси поли(А)+РНК, выделенной из ксенотрансплантата и ткани ВРН, как описано выше, с помощью набора для вычитательной селекции кДНК СЬОХТЕСН, с использованием 1 нг олигонуклеотида ΒδАС^N в качестве праймера. Одно- и двухцепочечный синтез проводят по способу, описанному в инструкции по применению данного набора (СЬОХТЕСН Рго1осо1 Ыо. РТ1117-1, Са)а1од Ыо. К1804-1). Полученную кДНК расщепляют Вка I в течение 3 ч при 37°С. Расщепленную кДНК экстрагируют смесью фенол/хлороформ (1:1) и осаждают этанолом.
Драйверную кДНК (ВРН) получают путем объединения в соотношении 4:1 Вка [-расщепленной кДНК из ВРН с расщепленной кДНК из мышиной печени, чтобы подтвердить, что мышиные гены вычитаются из тестерной кДНК (ЬАРС-4 АО).
Тестерную кДНК (ЬАРС-4 АО) получают путем разбавления 1 мкл Вка Ьрасщепленной кДНК ЬАРС-4 АО (400 нг) в 5 мкл воды. Затем разбавленную кДНК (2 мкл, 1б0 нг) лигируют с 2 мкл адаптера 1 и адаптера 2 (10 мкМ) в отдельных реакциях лигирования в общем объеме 10 мкл при 1б°С в течение ночи с использованием 400 ед. ДНК-лигазы Т4 (СЬОХТЕСН). Лигирование останавливают путем добавления 1 мкл 0,2 М ЕОТА и нагревания при 72°С в течение 5 мин.
Первую гибридизацию проводят путем добавления 1,5 мкл (б00 нг) драйверной кДНК к каждой из двух пробирок, содержащих 1,5 мкл (20 нг) тестерной кДНК, лигированной с адаптором 1 и адаптором 2. На образцы, имеющие конечный объем 4 мкл, наносят слой минерального масла, после чего содержащуюся в образцах ДНК подвергают денатурации в термоблоке для проведения реакций М1 Векеагсй при 98°С в течение 1,5 мин и затем оставляют гибридизоваться в течение 8 ч при б8°С. Затем две гибридизационные смеси смешивают вместе с 1 мкл свежеденатурированной драйверной кДНК и оставляют гибридизоваться в течение ночи при б8°С. После второй гибридизации смесь разбавляют в 200 мкл 20 мМ Нерек, рН 8,3, 50 мМ №1С1 0,2 мМ ЕОТА, нагревают при 70°С в течение 7 мин и хранят при -20°С.
Амплификация методом ПЦР, клонирование и секвенирование генных фрагментов, полученных с помощью δδ№
Чтобы амплифицировать генные фрагменты, полученные с помощью реакций δδ№ проводят две реакции ПЦР1. В первой реакции ПЦР1 мкл разбавленной конечной гибридизационной смеси добавляют к 1 мкл праймера ПЦР1 (10 мкМ), 0,5 мкл смеси ПИТР (10 мкМ), 2,5 мкл 10х реакционного буфера (СЬОХТЕСН) и 0,5 мкл 50х предпочтительной смеси кДНК-полимераз (СЬОХТЕСН) в конечном объеме 25 мкл. ПЦР1 проводят с использованием следующих условий: 75°С в течение 5 мин, 94°С в течение 25 с, затем 27 циклов, включающих в себя 94°С в течение 10 с, бб°С в течение 30 с, 72°С в течение 1,5 мин. В каждом эксперименте проводят пять отдельных реакций ПЦР. Продукты объединяют и разбавляют водой в соотношении 1:10. Для проведения второй реакции ПЦР1 мкл объединенной и разбавленной реакционной смеси после первой ПЦР добавляют к реакционной смеси, аналогичной используемой для ПЦР1, за исключение того, что вместо праймера ПЦР1 используют праймеры №1 и №2 (10 мкМ). ПЦР2 проводят, используя 10-12 циклов по 94°С в течение 10 с, б8°С в течение 30 с, 72°С в течение 1,5 мин. Продукты ПЦР анализируют методом электрофореза в 2% агарозном геле.
- 80 014870
Продукты ПЦР вставляют в вектор рСВ2.1, используя набор для клонирования векторов Т/А (ЧпуЦгодеп). Трансформированные Е.со11 подвергают селекции по синему/белому окрашиванию и по устойчивости к ампициллину. Белые колонии отбирают, помещают в 96-луночные планшеты и выращивают в жидкой культуре в течение ночи. Чтобы идентифицировать вставки, проводят ПЦР-амплификацию в 1 мл бактериальной культуры с использованием условий ПЦР1 и ΝΓ1 и ΝΈ2 в качестве праймеров. Продукты ПЦР анализируют методом электрофореза в 2% агарозном геле.
Бактериальные клоны хранят в 20% глицерине в 96-луночном формате. Плазмидную ДНК выделяют, секвенируют и анализируют на гомологию с использованием баз данных СепВапк, бЬЕЗТ и ^ГОСАР.
Анализ экспрессии методом ОТ-ПЦР.
Одноцепочечные кДНК получают с помощью системы ЗирегБспр! Ргеатр1Шса!юп, С1Ьсо-ВВЬ с использованием 1 мкг мРНК в качестве матрицы и олигонуклеотидов (бТ) 12-18 в качестве праймеров. Согласно инструкции производителя реакцию проводят путем инкубации с обратной транскриптазой в течение 50 мин при 42°С с последующей обработкой РНКазой Н при 37°С в течение 20 мин. После завершения реакции и перед нормализацией объем увеличивают путем добавления 200 мкл воды. Одноцепочечные кДНК из 16 разных нормальных тканей человека получают от СЬ0№ТЕСН.
Нормализацию одноцепочечных кДНК из нескольких тканей проводят с использованием праймеров 5'а!а!сдссдсдс!сд!сд!сдасаа3' (ЗЕО ГО N0: 76) и 5'адссасасдсадс!сайд!адаадд3' (ЗЕО ГО N0: 77) по амплификации β-актина. Одноцепочечную кДНК (5 мкл) амплифицируют в общем объеме 50 мкл, содержащем 0,4 мкМ праймеров, 0,2 мкМ каждого из бЭТР, 1х буфера для ПЦР (СЬ0ЭТЕСН, 10 мМ ТИ8-НС1, 1,5 мМ МдС12, 50 мМ КС1, рН 8,3) и 1х ДНК-полимеразы Кленова (СЬ0№ТЕСН). После 18, 20 и 22 циклов отбирают 5 мкл реакционной смеси ПЦР и анализируют методом электрофореза в агарозном геле. ПЦР проводят с использованием термоблока для проведения реакций М1 ВеБеагсй в следующих условиях: начальную денатурацию проводят при 94°С в течение 15 с, затем проводят 18, 20 и 22 циклов, включающих в себя 94°С в течение 15 с, 65°С в течение 2 мин, 72°С в течение 5 с. Конечное удлинение при 12°С проводят в течение 2 мин. После электрофореза в агарозном геле визульно сравнивают интенсивность окрашивания полос β-актина, соответствующих 283 п.о., из разных тканей. Рассчитывают коэффициент разбавления одноцепочечных кДНК, получая равную интенсивность полос β-актина для всех тканей после 22 циклов ПЦР. Для достижения равной интенсивности полос во всех тканях после 22 циклов ПЦР требуется три цикла нормализации.
Чтобы определить уровень экспрессии гена ЗТЕАР-1, 5 мкл нормализованной одноцепочечной кДНК анализируют методом ПЦР, используя 25, 30 и 35 циклов амплификации и следующие пары праймеров:
5' АСТ ТТ(3 ТТ(3 АТС АСС АСС АТТ ССА 3' (8Е0 Ιϋ ΝΟ: 73)
5’ САС ААС ТТС АСС АСА САС АСС ААС 3' (вЕ£ Ιϋ ΝΟ: 79)
Полуколичественный анализ экспрессии проводят путем сравнения продуктов ПЦР после такого числа циклов, которое дает слабую интенсивность окрашивания полос.
Результаты.
Проводят несколько экспериментов ЗЗН по способу, описанному в приведенном выше разделе Материалы и методы, и выделяют ряд клонов-кандидатов генных фрагментов. Все клоны-кандидаты секвенируют и подвергают анализу на гомологию со всеми последовательностями из основной общедоступной базы данных генов и базы данных ЕЗТ, позволяющему получить информацию по идентичности соответствующего гена и выбрать конкретный ген для анализа на дифференциальную экспрессию. Как правило, анализу на дифференциальную экспрессию методом ОТ-ПЦР и/или нозерн-блоттинга подвергают фрагменты генов, которые не имеют гомологии ни с одной известной последовательностью, присутствующей в используемых базах данных, и, следовательно, считаются новыми генами, а также фрагменты генов, обладающие гомологией с ранее секвенированными экспрессирующимися маркерными последовательностями (ЕЗТ).
Один из клонов кДНК, обозначаемый ЗТЕАР-1, имеет 436 п.о. в длину и обладает гомологией с последовательностью ЕЗТ из базы данных опухолевых генов NСI-ССАР. Используя данную кДНК, выделяют полноразмерную кДНК, кодирующую ген ЗТЕАР-1, которую также называют ЗТЕАР-1. Нуклеотидная последовательность кДНК ЗТЕАР-1 соответствует нуклеотидным остаткам 150-585 в последовательности кДНК ЗТЕАР-1, приведенной на фиг. 1. Другой клон, обозначаемый 28Р3Е1, имеет 561 п.о. в длину и обладает гомологией с рядом последовательностей ЕЗТ из базы данных опухолевых генов NСIССАР или из других баз данных. Часть последовательности 28Р3Е1 (356 п.о.) идентична ЕЗТ, полученной из человеческой фетальной ткани. После получения и секвенирования полноразмерной кДНК ЗТЕАР-1 выясняется, что данный клон также соответствует ЗТЕАР-1 (более конкретно, остаткам от 622 до 3'-конца нуклеотидной последовательности ЗТЕАР-1, приведенной на фиг. 1).
- 81 014870
Пример 2. Выделение полноразмерной кДНК, кодирующей 8ΤΕΑΡ-1.
Фрагмент гена 8ΤΕΑΡ-1 размером 436 п.о. (см. пример, озаглавленный Выделение фрагмента кДНК гена 8ΤΕΑΡ-1 методом 88Η) используют для выделения других кДНК, кодирующих ген 8Ρ1Ό4/8ΤΕΑΡ-1. Коротко говоря, библиотеку кДНК нормальной простаты человека (^ΟΝΙΈ^Η) подвергают скринингу с использованием меченого зонда, полученного из кДНК 8ΤΕΑΡ-1 размером 436 п.о. Один из положительных клонов, клон 10, содержит 1195 п.о. в длину и кодирует белок из 339 аминокислот, причем данная нуклеотидная и кодируемая ею аминокислотная последовательности не обладают гомологией ни с одним известным человеческим геном или белком (гомология с крысиным белком, ассоциированным с нарушением функции почек, описана в международной заявке АО 98/53071). Кодируемый белок содержит по меньшей мере 6 предсказанных трансмембранных мотивов, предполагающих экспонирование на поверхности клетки. Данные структурные признаки обусловливают аббревиатуру 8ΤΕΑΡ, которая расшифровывается как шесть трансмембранных эпителиальных антигенов простаты 8ίχ ^а^тетЛа^ Εр^ίке1^а1 Αη!^деη оГ !ке Ριγ^Ε-ιΟ.
После идентификации других белков 8ΤΕΑΡ продукт гена 8ΤΕΑΡ-1 обозначают как 8ΤΕΑΡ-1. кДНК 8ΤΕΑΡ-1 и кодируемые ею аминокислотные последовательности приведены на фиг. 2Α-2Ο. Клон 10 кДНК 8ΤΕΑΡ-1 помещен на хранение в Американскую коллекцию типовых культур (АТСС) (10801 итуегкйу Β^., Мапаккак, νΑ 20110-2209 υ8Α) как плазмидный клон 8ΤΕΑΡ-1 10.1 26 августа 1998 г. и имеет номер доступа АТСС 98849. Клон кДНК 8ΤΕΑΡ-1 можно выделить из плазмиды путем двойного расщепления Ε^ΕΙ/ΧΕηΙ (БсоК! по 5'-концу, XЬаI по 3'-концу).
Пример 3. Хромосомное картирование 8ΤΕΑΡ-1.
Хромосомная локализация гена может быть связана с его участием в патогенезе. Известно несколько способов хромосомного картирования, в том числе гибридизация ш кйи с использованием флуоресцентной метки (ΕΙ8Η), картирование с применением панелей человеческих/хомячковых гибридов с использованием радиоактивной метки (ΒΗ) (Аа1!ег е! а1., 1994; №11иге Сепейск. 7: 22; Векеагск Сепекск, Η^^νί^ Α1), картирование с применением панелей гибридов соматических клеток человека и грызунов, например, доступных от института Сопе11 (Сатбеп, №\ν 1егкеу), а также исследование генома и установление гомологии с помощью ΒΕΑ8Τ с секвенированными и картированными геномными клонами (^ΒΙ, Βеΐкекба, Магу1апб).
Определение положения 8ΤΕΑΡ-1 на хромосоме 7с.|21 с использованием последовательности 8ΤΕΑΡ-1 и программного обеспечения NСΒI ΒΕΑ8Τ (которое можно найти в глобальной сети на сайте (.ηсЬ^.η1т.η^к.дον/деηοте/ке^/раде.сд^?Е=ΗкΒ1ак!.к!т1&&ΟВС=Ηк)).
Пример 4. Анализ экспрессии 8ΤΕΑΡ-1.
Экспрессия 8ΤΕΑΡ-1 в образцах пациентов с раком желудка приведена на фиг. 14Α-14Ε. На фиг. 14Α изображены результаты анализа РНК, экстрагированной из нормального желудка (Ν) и из 10 разных образцов пациентов с раком желудка (Т). При проведении нозерн-блоттинга на полосу наносят 10 мкг общей РНК, используя в качестве зонда последовательность 8ΤΕΑΡ-1. Результаты показывают, что в тканях опухоли желудка происходит интенсивная экспрессия 8ΤΕΑΡ-1 размером приблизительно 1,6 т.о. В нижнем секторе представлено окрашивание блоттинга бромидом этидия, демонстрирующее качество образцов РНК.
На фиг. 14Β показано, что 8ΤΕΑΡ-1 экспрессируется в тканях пациентов с раком прямой кишки. РНК экстрагируют из нормальной прямой кишки (Ν), из опухолей пациентов с раком прямой кишки (Т) и из метастаз рака прямой кишки (М). При проведении нозерн-блоттинга на полосу наносят 10 мкг общей РНК, используя в качестве зонда последовательность 8ΤΕΑΡ-1. Результаты показывают, что в тканях пациентов с раком прямой кишки происходит интенсивная экспрессия 8ΤΕΑΡ-1. В нижнем секторе представлено окрашивание блоттинга бромидом этидия, демонстрирующее качество образцов РНК.
Анализ экспрессии 8ΤΕΑΡ-1 методом ОТ-ПЦР показывает, что 8ΤΕΑΡ-1 интенсивно экспрессируется в эндотелиальных клетках пупочной вены человека (ΗυνΕΟ) (фиг. 14С). Одноцепочечную кДНК получают из клеток ΗυνΕ^ ксенотрансплантатов рака простаты ΕΑΡΟΗ ΑΌ и ΕΑΡΟΑ ΑΌ, а также из тканей мозга человека. Нормализацию проводят методом ПЦР с использованием праймеров для актина и ΟΑΡΩΗ. При проведении полуколичественной ПЦР используют праймеры для 8ΤΕΑΡ-1 и 27 и 30 циклов амплификации. В качестве контроля проводят ПЦР с использованием праймеров для актина. Результаты показывают, что в клетках ΗυVΕС происходит интенсивная экспрессия 8ΤΕΑΡ-1, подобная экспрессии, детектируемой в тканях ксенотрансплантатов рака простаты. Экспрессия 8ΤΕΑΡ-1 в клетках ΗυVΕС показывает, что использование 8ΤΕΑΡ-1 в качестве мишени может также сделать мишенью эндотелиальные клетки новообразованных сосудов опухоли.
На фиг. 14Ό приведены результаты электрофореза продуктов ОТ-ПЦР в агарозном геле.
На фиг. 14Ε приведены результаты количественного анализа продуктов ПЦР с помощью программного обеспечения Α1рка1таде^. Результаты показывают, что среди всех тестируемых нормальных тканей интенсивная экспрессия 8ΤΕΑΡ-1 наблюдается в нормальной простате. Повышающая регуляция экспрессии 8ΤΕΑΡ-1 обнаружена в пулах рака простаты, рака мочевого пузыря, рака почки, рака прямой кишки, рака легкого, рака яичника и рака молочной железы. Интенсивная экспрессия 8ΤΕΑΡ-1 обнаружена в пулах раковых метастаз, ксенотрансплантатов рака простаты и метастаз рака простаты в лимфа
- 82 014870 тическом узле.
Экспрессия 8ТЕАР-1 в образцах пациентов с лимфомой показана на фиг. 14Е.
Одноцепочечную кДНК получают из ряда образцов пациентов, страдающих от лимфомы. Нормализацию проводят методом ПЦР с использованием праймеров для актина. Полуколичественную ПЦР с праймерами для 8ТЕАР-1 проводят, используя 26 и 30 циклов амплификации. Образцы анализируют на агарозном геле и с помощью программного обеспечения А1рйа1тадег определяют количество продуктов ПЦР. Экспрессию считают сильной или средней, если сигнал детектируется после 26 или 30 циклов амплификации соответственно, и считают, что экспрессия отсутствует, если сигнал не детектирутся даже после 30 циклов амплификации. Результаты показывают, что экспрессия 8ТЕАР-1 наблюдается в 8 из 11 анализируемых опухолевых образцов (72,7%).
Пример 5. Сплайсинг-варианты 8ТЕАР-1.
Транскрипционные варианты представляют собой варианты зрелой мРНК, кодируемые одним геном, которые образуются в результате альтернативной транскрипции или альтернативного сплайсинга. Альтернативными транскриптами являются транскрипты, образующиеся в результате транскрипции одного гена, но начинающейся в разных точках. Сплайсинг-варианты представляют собой варианты мРНК, образующиеся в результате альтернативного сплайсинга одного транскрипта. У эукариотов исходная РНК, образующаяся при транскрипции полиэкзонного гена из геномной ДНК, подвергается сплайсингу с получением функциональной мРНК, которая содержит только экзоны и используется для трансляции в аминокислотную последовательность. Соответственно, один ген может иметь от нуля до нескольких альтернативных транскриптов и каждый транскрипт может иметь от нуля до нескольких сплайсингвариантов. Каждый транскрипционный вариант имеет уникальный экзонный состав и может содержать кодирующие и/или некодирующие (5'- или 3'-концевые) фрагменты, отличные от содержащихся в исходном транскрипте. Транскрипционные варианты могут кодировать одинаковые или разные белки с одинаковыми или подобными функциями или белки с разными функциями, причем данные варианты могут экспрессироваться в одной ткани в одно и то же время, или в разных тканях в одно и то же время, или в одной ткани в разное время, или в разных тканях в разное время. Белки, кодируемые транскрипционными вариантами, могут иметь одинаковую или разную клеточную или внеклеточную локализацию, например они могут секретироваться или находиться внутри клетки.
Транскрипционные варианты идентифицируют с помощью ряда известных в данной области методов. Например, альтернативные транскрипты и сплайсинг-варианты идентифицируют путем экспериментов с полноразмерным клонированием или путем применения полноразмерного транскрипта и последовательностей Е8Т. Вначале все человеческие Е8Т группируют в кластеры, все члены которых прямо или косвенно идентичны друг другу. Затем Е8Т в одном кластере дополнительно подразделяют на подкластеры и собирают в консенсусную последовательность.
Последовательность исходного гена сравнивают с консенсусной последовательностью (последовательностями) других полноразмерных последовательностей. Каждая консенсусная последовательность представляет собой потенциальный сплайсинг-вариант данного гена (см., например, Каи, Ζ., е! а1., Сеие 81гие1иге ргеб1е!юи аиб а1!егиайуе 8рйетд аиа1у818 и81ид деиот1еа11у айдиеб Е8Т8, Сеиоте Не8еагей, 2001 Мау, 11(5): 889-900). Даже если идентифицирован вариант, который не является полноразмерным клоном, данный фрагмент варианта можно использовать для получения антитела и для дальнейшего клонирования полноразмерного сплайсинг-варианта с помощью известных в данной области методов.
Более того, в данной области известны компьютерные программы, которые позволяют идентифицировать транскрипционные варианты на основе геномных последовательностей. Программы для идентификации транскрипционных вариантов на основе геномных последовательностей включают в себя Едеие8Н (А. 8а1атоу аиб V. 8о1оууеу, АЬ шйю деие Гтбшд т Эгс^орйПа деиот1е ^NΑ. Сеиоте Не8еагей. 2000 Арп1; 10(4): 516-22); СгаЛ (ИНЬ еотрЬю.оги1.доу/СгаП-Ь1и/Етр1уСга11Еогт) и Сеи8еаи (ИНЬ деие8.тй.еби/СЕ№САКй1т1). Общее описание способов идентификации сплайсинг-вариантов можно найти, например, в 8ои!йаи, С. А деиоине регареейуе ои йитаи рго!еа8е8, ЕЕВ8 Лей. 2001, йт. 8; 498(2-3): 214-8; бе 8о^а, 83., е! а1., 1беи!1йеайои оГ йитаи ейгото8оте 22 йащепйеб 8ецнеиее8 тейй ОНЕ ехрге88еб 8ецнеиее !ад8, Ргое. №11. Аеаб. 8е1. И8А. 2000, №у. 7; 97(23): 12690-3.
Параметры транскрипционного варианта можно подтвердить с помощью ряда известных в данной области методов, таких как полноразмерное клонирование, протеомный анализ, анализ на основе ПЦР, анализ 5' РАСЕ и др. (см., например, протеомный анализ: Вгеииаи, 8.О., е! а1., А1Ьитш Ьаик8 реши8и1а: а иете !егтша!юи уапаи! ейа^ае!е^^ζеб Ьу е1ее!го8ргау та88 8рее!готе!гу, Вюейет Вюрйу8 Ае!а. 1999, Аид. 17; 1433(1-2): 321-6; Ееггаий Р., е! а1., П1ГГегеийа1 8рйешд оГ ргете88еидег КNΑ ргобиее8 ти1йр1е Гогт8 оГ та!иге еарппе а1рйа (81)-еа8ет, Еиг. I. Вюейет. 1997, Ое!. 1; 249(1): 1-7. Анализ на основе ПЦР: Vе11таии 8., е! а1., 8рееШе геуегае !гаи8ег1рйои-РСН диаийЛеайои оГ уа8еи1аг еибо1йейа1 дготе!й Гае!ог (УЕСЕ) 8рйее уапаи!8 Ьу Ыдй! Суе1ег !еейио1оду, С1ш Сйет. 2001 Арг.; 47(4): 654-60; Ла, Н.Р., е! а1., 0|8еоуегу оГ иете йитаи Ье!а-беГеи8Ш8 и81ид а деиот1е8-Ьа8еб арргоаей, Сеие. 2001, 1аи. 24; 263(1-2): 2118. Анализ на основе ПЦР и 5' РАСЕ: Впд1е, К.Е., е! а1., О^даи^ζайои оГ !йе типие гебиееб Го1а!е еатег деие аиб 1беийЛеайои оГ уапаи! 8рйее Гогт8, Вюейет Вюрйу8 Ае!а. 1997, Аид. 7; 1353(2): 191-8).
- 83 014870
В данной области известно, что при злокачественных заболеваниях происходят изменения геномных участков. Если при конкретном злокачественном заболевании происходит изменение геномного участка, к которому относят ген, также изменяются альтернативные транскрипты или сплайсингварианты данного гена. В данном описании указано, что 8ТЕАР-1 имеет особый профиль экспрессии, связанный с злокачественным заболеванием. Альтернативные транскрипты и сплайсинг-варианты 8ТЕАР-1 также могут участвовать в развитии злокачественного заболевания одной или разных тканей и, следовательно, служить опухолеспецифическими маркерами/антигенами.
Экзонный состав исходного транскрипта, обозначаемого 8ТЕАР-1 ν. 1, приведен в табл. ЬШ. С использованием полноразмерного гена и последовательностей Е8Т идентифицируют два транскрипционных варианта, которые обозначают 8ТЕАР-1 ν. 2 и ν. 3. По сравнению со 8ТЕАР-1 ν. 1, при сплайсинге транскрипционного варианта 8ТЕАР-1 ν. 2 не происходит отщепления интрона 4, присутствующего в 8ТЕАР-1 ν. 1, а при сплайсинге варианта 8ТЕАР-1 ν. 3 происходит отщепление одного дополнительного экзона из интрона 4 8ТЕАР-1 ν. 1, как изображено на фиг. 11. Теоретически, каждое другое сочетание экзонов в пространстве, например экзонов 2 и 3, представляет собой потенциальный сплайсинг-вариант. На фиг. 11 показано схематическое сравнение первичных последовательностей экзонов транскрипционных вариантов.
Пример 6. Однонуклеотидный полиморфизм 8ТЕАР-1.
Однонуклеотидный полиморфизм (8Ν6) представляет собой изменение одной пары оснований в конкретном положении нуклеотидной последовательности. Для любой определенной точки генома существует четыре возможных варианта пар нуклеотидных оснований: А/Т, С/С, С/С и Т/А. Генотип относится к специфической последовательности пар оснований в одном или нескольких положениях генома субъекта. Гаплотип относится к последовательности пар оснований более чем одного положения на одной молекуле ДНК (или на одной хромосоме у высших организмов), зачастую в рамках одного гена или в рамках нескольких тесно связанных генов. 8Ν6, который относится к кДНК, называют с8ЫР. Указанные с8ЫР могут изменять аминокислоты белка, кодируемого геном, и посредством этого влиять на функцию белка. Некоторые 8ЫР вызывают наследственные заболевания; другие вносят вклад в количественные вариации фенотипа субъектов и реакции субъектов на факторы окружающей среды, такие как диета и лекарственные средства. Следовательно, 8ЫР и/или сочетания аллелей (называемые гаплотипами) могут иметь разные применения, включающие в себя диагностику наследственных заболеваний, определение реакции на лекарственные средства и их дозировки, идентификацию генов, ответственных за болезни, и анализ генетических взаимоотношений субъектов (Р. Иоуо!пу, РМ. Куоп апб А.М. Соа!е, 8Ν6 апа1ук1к !о б1ккес! йитап !гайк, Сшт. Орт. ЫеигоЬю1. 2001 Ос!.; 11(5): 637-641; М. Ритойатеб апб В.К. Рагк, Сепебс киксербЬббу !о абуегке бгид геасбопк, Тгепбк Рйагтасо1. δα. 2001 Вт.; 22(6): 298-305; РН. В11еу, С.1. А11ап, Е. Ьа1 апб А. Вокек, Тйе ике о£ к1пд1е пис1еоббе ро1утогрЫктк ш !йе 1ко1абоп о£ соттоп б1кеаке депек, Рбагтасодепотюк, 2000 ЕеЬ.; 1(1): 39-47; В. Шбкоп, РС. 8!ерйепк апб А. ^тбетиШ, Тйе ргебюбуе ро\уег о£ йар1о!урек т сбшса1 гекропке, Рбагтасодепотюк, 2000 ЕеЬ.; 1(1): 15-26).
8Ν6 идентифицируют с помощью ряда известных в данной области методов (Р. Веап, Тйе ргошшпд νоуаде о£ 8ЫР 1агде! б1ксоуегу, Ат. С1т. ЬаЬ. 2001 ОсХ-Ыоу.; 20(9): 18-20; К.М. ^е1кк, 'Тп кеагсй о£ йитап уапабоп, Сепоте Век. 1998 1и1.; 8(7): 691-697; М.М. 8йе, ЕпаЬйпд 1агде-кса1е рйагтасодепейс к!иб1ек Ьу Ыдй-!йгоидйри! ти!а!юп бе!есйоп апб депо!уртд !есйпо1од1ек, Сйп. Сйет. 2001 ЕеЬ.; 47(2): 164-172). Например, 8Ν6 идентифицируют путем секвенирования фрагментов ДНК, которые обладают полиморфизмом по данным анализов, проводимых с применением геля, таких как анализ полиморфизма длины фрагментов рестрикции (ВЕЙР) и денатурирующий электрофорез в градиентном геле (ЭССЕ). Они могут быть обнаружены путем непосредственного секвенирования образцов ДНК, взятых от разных субъектов, или путем сравнения последовательностей разных образцов ДНК. В связи с быстрым накоплением сведений о последовательностях в общедоступных и закрытых базах данных 8Ν6 можно обнаружить путем сравнения последовательностей с помощью компьютерных программ (Ζ. Си, Ь. Нййег апб Р.У. Куок, 8тд1е пис1еоббе ро1утогрй1кт йипбпд т суЬегкрасе, Нит. Ми!а!. 1998; 12(4): 221-225). Для подтверждения 8Ν6 и определения генотипа или гаплотипа субъекта можно использовать ряд методов, включающих в себя непосредственное секвенирование и анализ с применением микрочипов высокой пропускной способности (Р.У. Куок, Ме!йобк £ог депо!уртд ктд1е пис1еойбе ро1утогрЫктк, Аппи. Веу. Сепотюк Нит. Сепе!. 2001; 2: 235-258; М. Кокопк, К. Όίχ, К. Моушйап, I. Ма!й1к, В. Егут, Р. Сгакк, В. Нтек апб А. Пиек!егйоей, ШдйЭйгоидйри! 8Ν6 депо!уртд убй !йе Макксобе кук!ет, Мо1. Э1адп. 2000 Эес.; 5(4): 329-340).
С помощью указанных выше способов было идентифицировано 14 8Ν6 в транскрипте из клона СТН9, обозначаемого 8ТЕАР-1 ν. 2, в положениях 602 (С/С), 386 (С/Т), 1087 (Т/С), 1447 (Т/С), 1621 (А/Т), 1625 (С/Т), 1716 (С/А), 2358 (С/Т), 2646 (Т/С), 2859 (Т/С), 2908 (А/Т), 3006 (С/С), 3107 (С/Т) и 3180 (А/Т). Транскрипты или белки с альтернативными аллелями обозначают как варианты 8ТЕАР-1 ν. 4, ν. 5, ν. 6, ν. 7, ν. 8, ν. 9, ν. 10, ν. 11, ν. 12, ν. 13, ν. 14, ν. 15, ν. 16 и ν. 17 соответственно. На фиг. 10 показано схематичное сравнение первичных последовательностей вариантов 8Ν6. На фиг. 12 показано схематичное сравнение первичных последовательностей белковых вариантов, соответствую
- 84 014870 щих нуклеотидным вариантам. Указанные аллели 8ΝΓ, хотя показаны здесь отдельно, могут встречаться в разных сочетаниях (гаплотипах) и в любом из транскрипционных вариантов (таких как 8ТЕАР-1 ν. 1 и ν. 3), последовательность которых содержит 8ΝΓ. Например, первые два 8ΝΓ также обнаружены в 8ТЕАР-1 ν. 3 в таких же положениях, а в 8ТЕАР-1 ν. 1 в положениях 572 и 356 соответственно.
Пример 7. Получение рекомбинантного 8ТЕАР-1 в прокариотических системах.
Чтобы экспрессировать рекомбинантный 8ТЕАР-1 и варианты 8ТЕАР-1 в прокариотических клетках, полноразмерные или частичные последовательности кДНК 8ТЕАР-1 и варианта 8ТЕАР-1 клонируют в любом из ряда векторов, известных в данной области. Можно использовать полноразмерную кДНК или любой ее фрагмент, кодирующий 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 или более смежных аминокислот белка 8ТЕАР-1, его вариантов или аналогов.
A. Конструкции для транскрипции и трансляции 1и νίΙΐΌ.
рСВП. Чтобы получить смысловые и антисмысловые РНК-зонды 8ТЕАР-1 для анализов РНК 1и кйи, создают конструкции рСВП (^йю^еи, Саг1кЬаб СА), кодирующие полноразмерные кДНК 8ТЕАР-1 или их фрагменты. Вектор рСВП содержит промоторы 8р6 и Т7, фланкирующие вставку и управляющие транскрипцией РНК 8ТЕАР-1 для применения в качестве зондов в анализах РНК методом гибридизации 1и кйи. Данные зонды используются для анализа экспрессии 8ТЕАР-1 на уровне РНК в клетках и тканях. Чтобы синтезировать белок 8ТЕАР-1, транскрибируемую РНК 8ТЕАР-1, представляющую участок кДНК гена 8ТЕАР-1, кодирующий аминокислотную последовательность, используют в системах трансляции 1и У11го, таких как ТиТ™ Соир1еб Ве!юи1о1ука!е 8ук!ет (Рготеда, Согр., Маб1кои, XVI).
B. Бактериальные конструкции.
Конструкции рСЕX. Чтобы получить в бактериальных клетках рекомбинантные белки 8ТЕАР-1, гибридизованные с белком глутатион-8-трансферазой (68Т), полноразмерные кДНК или варианты 8ТЕАР-1 или их фрагменты клонируют в 68Т-гибридном векторе семейства р6ЕX (Атегкйат Рйагтас1а Вю!есй, Р1кса!а^ау, N1). Полученные конструкции позволяют контролировать экспрессию последовательностей рекомбинантного белка 8ТЕАР-1, гибридизованного с С8Т по аминоконцу и с эпитопом из шести остатков гистидина (6хН1к) по карбоксильному концу. Маркеры С8Т и 6хН1к позволяют проводить выделение рекомбинантного гибридного белка из индуцированных бактерий с использованием носителя, обладающего подходящей аффинностью, и обеспечивают распознавание гибридного белка антителами против С8Т и Н1к. Маркер 6хН1к получают путем добавления 6 гистидиновых кодонов к праймеру клонирования по 3'-концу, например открытой рамки считывания (ОВР). Можно также добавить участок протеолитического расщепления, такой как участок распознавания Рге8с1ккюи™ в рСЕX-6Р-1. позволяющий отщепить С8Т от белка, родственного 8ТЕАР-1. Ген устойчивости к ампициллину и участок начала репликации рВВ322 позволяют осуществлять селекцию и поддержание плазмид рСЕX в Е.соН.
Конструкции рМАЬ. Чтобы получить в бактериальных клетках рекомбинантные белки 8ТЕАР-1, гибридизованные с белком, связывающим мальтозу (МВР), полноразмерные или частичные кДНК 8ТЕАР-1, кодирующие белковые последовательности, гибридизуют с геном МВР путем клонирования в векторах рМΑ^-с2X и рМΑ^-р2X (Νο\ν Еид1аиб Вю1аЬк, Веуег1у, МА). Полученные конструкции позволяют контролировать экспрессию последовательностей рекомбинантного белка 8ТЕАР-1, гибридизованного с МВР по аминоконцу и с эпитопом 6хН1к по карбоксильному концу. Маркеры МВР и 6хН1к позволяют проводить выделение рекомбинантного гибридного белка из индуцированных бактерий с использованием носителя, обладающего подходящей аффинностью, и обеспечивают распознавание гибридного белка антителами против МВР и Н1к.
Маркерный эпитоп 6хН1к получают путем добавления 6 гистидиновых кодонов к 3'-концу праймера клонирования. Участок распознавания фактора Ха позволяет отщеплять маркер рМАЬ от 8ТЕАР-1. Векторы рМΑ^-с2X и рМΑ^-р2X оптимизируют, чтобы обеспечить экспрессию рекомбинантного белка в цитоплазме или периплазме соответственно. При экспрессии в периплазме увеличивается укладка белков посредством дисульфидных связей.
Конструкции рЕТ. Чтобы экспрессировать 8ТЕАР-1 в бактериальных клетках, полноразмерные или частичные кДНК 8ТЕАР-1, кодирующие белковые последовательности, клонируют в векторах семейства рЕТ (Штадеи, Маб1кои, XVI). Данные векторы позволяют строго контролировать экспрессию рекомбинантного белка 8ТЕАР-1 в бактериях, который необязательно может быть гибридизован с белками, повышающими растворимость, такими как М.1кА и тиоредоксин (Тгх), и маркерными эпитопами, такими как 6хН1к и 8-Тад™, которые позволяют проводить выделение и детектирование рекомбинантного белка. Например, с использованием гибридной системы рЕТ №1кА 43.1 получают конструкции, обеспечивающие экспрессию участков белка 8ТЕАР-1 в виде аминоконцевых гибридов с М.1кА.
- 85 014870
С. Дрожжевые конструкции.
Конструкции рЕ8С. Чтобы экспрессировать 8ТЕАР-1 в дрожжах вида 8асскаготусек сегеуыае с целью получения рекомбинантного белка и проведения функциональных исследований, полноразмерные или частичные кДНК 8ТЕАР-1, кодирующие белковые последовательности, клонируют в векторах семейства рЕ8С, каждый из которых содержит 1 из 4 селектируемых маркеров, Н1к3, ТВР1, ЬЕИ2 и ИВА3 (8йа1адепе, Ьа 1о11а, СА). Данные векторы позволяют контролировать экспрессию одного или двух разных генов из одной плазмиды или клонировать последовательности, содержащие либо маркерный эпитоп Е1ад™, либо маркерный эпитоп Мус, в одной дрожжевой клетке. Данную систему можно использовать для подтверждения белок-белковых взаимодействий 8ТЕАР-1. Кроме того, экспрессия в дрожжевых клетках сопровождается посттрансляционными модификациями, такими как гликозилирование и фосфорилирование, подобными наблюдающимся при экспрессии в эукариотических клетках.
Конструкции рЕ8Р. Чтобы экспрессировать 8ТЕАР-1 в дрожжах вида 8асскаготусек ротЬе, полноразмерные или частичные кДНК 8ТЕАР-1, кодирующие белковые последовательности, клонируют в векторах семейства рЕ8Р. Данные векторы позволяют контролировать на высоком уровне экспрессию последовательности белка 8ТЕАР-1, гибридизованному либо по аминоконцу, либо по карбоксиконцу с О8Т, который помогает проводить выделение рекомбинантного белка. Маркерный эпитоп Р1ад™ позволяет детектировать рекомбинантный белок с помощью антитела против Р1ад™.
Пример 8. Получение рекомбинантного 8ТЕАР-1 в системах высших эукариотов.
А. Конструкции млекопитающих.
Чтобы экспрессировать рекомбинантный 8ТЕАР-1 в эукариотических клетках, полноразмерные или частичные последовательности кДНК 8ТЕАР-1 клонируют в любом из ряда векторов экспрессии, известных в данной области. С использованием данных конструкций можно экспрессировать один или несколько из участков 8ТЕАР-1, включающих в себя участок 8ТЕАР-1 ν. 1, ν. 4, содержащий аминокислоты 1-339, участок ν. 2, содержащий аминокислоты 1-258, участок ν.3, содержащий аминокислоты 1-282, или любые 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 или больше смежных аминокислот из 8ТЕАР-1, его вариантов или аналогов. В некоторых воплощениях экспрессируется участок конкретного варианта 8ТЕАР-1, кодирующий в определенном положении аминокислоту, отличающуюся от присутствующих в данном положении аминокислот любых других вариантов. В других воплощениях экспрессируется участок варианта 8ТЕАР-1, который полностью или частично относится к последовательности, уникальной для данного варианта.
Указанные конструкции можно трансфицировать в любые клетки млекопитающих, например в клетки 293Т. Лизаты трансфицированных клеток 293Т можно анализировать с помощью описанной выше поликлональной сыворотки против 8ТЕАР-1.
Конструкции рс^NА4/Н^кМаx. Чтобы экспрессировать 8ТЕАР-1 в клетках млекопитающих, ОВЕ 8ТЕАР-1 или ее фрагменты клонируют в векторе рс^NА4/Н^кМаx, версия А (^йгодеп, Саг1кЬай, СА). Экспрессия белка находится под контролем промотора цитомегаловируса (СМ^) и энхансера трансляции 8Р16. Рекомбинантный белок содержит эпитоп Хргекк™ и эпитоп из шести гистидиновых остатков (6хН1к), присоединенные к аминоконцу. Вектор рс^NА4/Н^кМаx также содержит сигнал полиаденилирования бычьего гормона роста (ВОН) и последовательность терминации транскрипции для повышения стабильности мРНК наряду с точкой начала эписомной репликации 8V40 и участком, обеспечивающим спасение вектора в клеточных линиях, экспрессирующих супер-Т-антиген. Ген устойчивости к зеоцину позволяет осуществлять селекцию клеток млекопитающих, экспрессирующих белок, а ген устойчивости к ампициллину и точка начала репликации Со1Е1 позволяют осуществлять селекцию и поддержание плазмиды в Е.сой.
Конструкции рс^NА3.1/МусН^к.
Чтобы экспрессировать 8ТЕАР-1 в клетках млекопитающих, ОВЕ 8ТЕАР-1 или ее фрагменты вместе с консенсусным участком инициации трансляции Козака клонируют в векторе рс^NА3.1/МусН^к, версия А (^йгодеп Саг1кЬай, СА). Экспрессия белка находится под контролем промотора цитомегаловируса (СМ^). Рекомбинантные белки содержат эпитоп тус и эпитоп 6хН1к, присоединенные к карбоксиконцу. Вектор рс^NА3.1/МусН^к также содержит сигнал полиаденилирования бычьего гормона роста (ВОН) и последовательность терминации транскрипции для повышения стабильности мРНК, наряду с точкой начала эписомной репликации 8V40 и участком, обеспечивающим спасение вектора в клеточных линиях, экспрессирующих супер-Т-антиген. Используют ген устойчивости к неомицину, который позволяет осуществлять селекцию клеток млекопитающих, экспрессирующих белок, а также ген устойчивости к ампициллину и точку начала репликации Со1Е1, позволяющие осуществлять селекцию и поддержание плазмиды в Е.сой.
- 86 014870
Конструкция рсОХА3.1/СТ-СРР-ТОРО.
Чтобы экспрессировать ЗТЕАР-1 в клетках млекопитающих и обеспечить детектирование рекомбинантных белков с помощью флуоресцентного анализа, ОКР 8ТΒЛР-1 или ее фрагменты вместе с консенсусным участком инициации трансляции Козака клонируют в векторе рсОХА3.1/СТ-СРР-ТОРО (^йгодеп, С А). Экспрессия белка находится под контролем промотора цитомегаловируса (СМ^. Рекомбинантные белки содержат зеленый флуоресцентный белок (СРР), присоединенный к карбоксильному концу, который позволяет проводить неинвазивное детектирование ίη νίνο и исследования в области клеточной биологии. Вектор рсОХА3.1СТ-СРР-ТОРО также содержит сигнал полиаденилирования бычьего гормона роста (ВОН) и последовательность терминации транскрипции для повышения стабильности мРНК, наряду с точкой начала эписомной репликации ^40 и участком, обеспечивающим спасение вектора в клеточных линиях, экспрессирующих супер-Т-антиген. Ген устойчивости к неомицину позволяет осуществлять селекцию клеток млекопитающих, экспрессирующих белок, а ген устойчивости к ампициллину и точка начала репликации Со1Е1 позволяют осуществлять селекцию и поддержание плазмиды в Е.сой. Другие конструкции, содержащие гибрид с СРР по аминоконцу, получают на основе вектора рсПХА3.1/ХТ-СРР-ТОРО, кодирующего полноразмерный белок 8ТΒЛР-1.
рАР!ад. ОКР ОТВАРИ или ее фрагменты, клонируют в векторе рАР!ад-5 (СепНцп!ег Согр. ХакНуШе, ТХ). Данная конструкция кодирует гибрид, в котором к карбоксиконцу белка 8ТЕЛР-1 присоединена щелочная фосфатаза, а к аминоконцу - сигнальная последовательность ^СК. Также получают конструкции, кодирующие гибриды, в которых щелочная фосфатаза вместе с аминоконцевой сигнальной последовательностью ^СК присоединена к аминоконцу белка 8ТΒЛР-1. Полученные рекомбинантные белки 8ТЕЛР-1 можно оптимизировать для секреции в среду трансфицированных клеток млекопитающих и использовать для идентификации белков, таких как лиганды или рецепторы, которые взаимодействуют с белками 8ТЕЛР-1. Экспрессия белка находится под контролем промотора СМV, и, кроме того, рекомбинантные белки содержат эпитопы тус и 6хН1к, присоединенные к карбоксильному концу, которые облегчают детектирование и очистку. Присутствующий в векторе ген устойчивости к зеоцину позволяет осуществлять селекцию клеток млекопитающих, экспрессирующих рекомбинантный белок, а ген устойчивости к ампициллину позволяет осуществлять селекцию плазмиды в Е.сой.
р!ад-5. ОКР 8ТЕЛР-1 или ее фрагменты также клонируют в векторе р!ад-5. Данный вектор подобен вектору рАИад, но не кодирует гибрид щелочной фосфатазы. Данная конструкция кодирует белок 8ТЕЛР-1, содержащий на аминоконце сигнальную последовательность [дСК, а на карбоксильном конце - маркерные эпитопы тус и 6хН1к, облегчающие детектирование и аффинную очистку. Полученный рекомбинантный белок 8ТΒЛР-1 можно оптимизировать для секреции в среду трансфицированных клеток млекопитающих и использовать в качестве иммуногена или лиганда для идентификации белков, таких как лиганды или рецепторы, которые взаимодействуют с белками 8ТЕЛР-1. Экспрессия белка находится под контролем промотора СМV. Присутствующий в векторе ген устойчивости к зеоцину позволяет осуществлять селекцию клеток млекопитающих, экспрессирующих белок, а ген устойчивости к ампициллину позволяет осуществлять селекцию плазмиды в Е.сой.
ркесРс: ОКР 8ТΒЛР-1 или ее фрагменты также клонируют в векторе ркесРс. Вектор ркесРс получают путем клонирования участка Рс (шарнирный участок, участки СН2, СН3) человеческого иммуноглобулина С1 ЩС) в векторе ркес!ад-2 (Iην^!^οдеη, Са1йогша). Данная конструкция кодирует гибрид, содержащий белок 8ТΒЛР-1, присоединенный к нему по карбоксильному концу Рс-участок и сигнальную последовательность ^СК, присоединенную по И-концу. Также используют гибриды 8ТЕЛР-1 с участком Рс мышиного ^Сд Полученные рекомбинантные белки 8ТΒЛР-1 можно оптимизировать для секреции в среду трансфицированных клеток млекопитающих и использовать в качестве иммуногенов или для идентификации белков, таких как лиганды или рецепторы, которые взаимодействуют с белком ЗТЕАР-Р Экспрессия белка находится под контролем промотора СМV. Присутствующий в векторе ген устойчивости к гидромицину позволяет осуществлять селекцию клеток млекопитающих, экспрессирующих рекомбинантный белок, а ген устойчивости к ампициллину позволяет осуществлять селекцию плазмиды в Е.сой.
Конструкции рЗКа. Чтобы получить линии клеток млекопитающих, которые конститутивно экспрессируют 8ТΒЛР-1, ОКР 8ТΒЛР-1 или ее фрагменты клонируют в конструкциях рЗКа. Амфотропные и экотропные ретровирусы получают путем трансфекции конструкций рЗКа в линию клеток с дефектом упаковки 293Т-10А1 или путем совместной трансфекции рЗКа и хелперной плазмиды (в которой удалена последовательность с дефектом упаковки) в клетки 293 соответственно. Ретровирус используют для инфицирования ряда клеточных линий млекопитающих с интеграцией клонируемого гена, 8ТЕЛР-1, в линии клеток-хозяев. Экспрессия белка находится под контролем длинного концевого повтора (ЬТК). Присутствующий в векторе ген устойчивости к неомицину позволяет осуществлять селекцию клеток млекопитающих, экспрессирующих белок, а ген устойчивости к ампициллину и точка начала репликации Со1Е1 позволяют осуществлять селекцию и поддержание плазмиды в Е.сой. Затем ретровирусные векторы используют для инфицирования и получения разных клеточных линий с применением, например, клеток РС3, ХН 3Т3, ТкиРг1, 293 или КАТ1.
- 87 014870
Можно получить другие конструкции р8Ва, кодирующие белки, в которых к карбоксильному концу последовательностей 8ТЕАР-1 присоединяют маркерный эпитоп, такой как маркер Е1ад™, чтобы обеспечить детектирование с помощью антител против Е1ад. Например, последовательность Е1ад™ 5'-да! !ас аад да! дас дас да! аад-3' (8ЕО ГО NΟ: 80) добавляют к праймеру клонирования по 3'-концу ОВЕ. Другие конструкции р8Ва кодируют гибридные белки, содержащие полноразмерные белки 8ТЕАР-1 и присоединенные к ним по амино- и карбоксильным концам СЕР и тус/6хН1к.
Другие вирусные векторы. Для вирус-опосредованной доставки и экспрессии 8ТЕАР-1 получают другие конструкции. Высокий титр вируса, приводящий к высокому уровню экспрессии 8ТЕАР-1, достигается при использовании таких вирусных систем доставки, как аденовирусные векторы и векторы на основе ампликона герпеса. Кодирующие последовательности 8ТЕАР-1 или их фрагменты амплифицируют методом ПЦР и субклонируют в челночном векторе АбЕаку (8!га!адепе). Рекомбинацию и упаковку вируса проводят в соответствии с инструкциями производителя по получению аденовирусных векторов. Альтернативно, чтобы получить векторы на основе вируса герпеса, кодирующие последовательности 8ТЕАР-1 или их фрагменты клонируют в векторе Н8У-1 Дтдепех). Затем вирусные векторы используют для инфицирования разных клеточных линий, таких как клетки РС3, МН 3Т3, 293 или ВАТ1.
Регулируемые системы экспрессии. Чтобы осуществить контролируемую экспрессию 8ТЕАР-1 в клетках млекопитающих, последовательности, кодирующие 8ТЕАР-1 или их фрагменты клонируют в регулируемых системах экспрессии млекопитающих, таких как система Т-Вех Д^^одец), система Сепе8\\йс11 (^Шоден) и строго регулируемая система Есбукопе (8га!адепе). Данные системы позволяют исследовать зависимость эффектов рекомбинантного 8ТЕАР-1 от времени и концентрации. Затем указанные векторы используют для регуляции экспрессии 8ТЕАР-1 в разных клеточных линиях, таких как клетки РС3, МН 3Т3, 293 или ВАТ1.
В. Бакуловирусные системы экспрессии.
Чтобы получить рекомбинантные белки 8ТЕАР-1 с использованием бакуловирусной системы экспрессии, ОВЕ 8ТЕАР-1 или ее фрагменты клонируют в бакуловирусном векторе переноса рВ1иеВас 4.5 О^йгодеп), который кодирует белок, содержащий Н1к-маркер на Ν-конце. А именно, чтобы получить рекомбинантный бакуловирус, рВШеВас^ТЕАРЧ трансфицируют вместе с хелперной плазмидой рВас-МВ1ие (^Шодей) в клетки насекомых 8Е9 (8робор!ега Егид1регба) (подробное описание данного способа можно найти в инструкции по эксплуатации Iην^!^οдеη). Затем бакуловирус собирают из клеточного супернатанта и очищают методом бляшкообразования.
Затем рекомбинантный белок 8ТЕАР-1 получают путем инфицирования клеток насекомых Н|д11Е|уе очищенным бакуловирусом (Iηνй^οдеη). Рекомбинантный белок 8ТЕАР-1 можно детектировать с помощью антител против 8ТЕАР-1, антител против Н1к-маркера. Белок 8ТЕАР-1 можно выделить и использовать в различных клеточных анализах или в качестве иммуногена для получения поликлональных и моноклональных антител, специфичных для 8ТЕАР-1.
Пример 9. Профили антигенности и вторичная структура.
На фиг. 5А-9А и 5В-9В графически изображены пять аминокислотных профилей вариантов 8ТЕАР-1 1 и 3 соответственно, анализ которых осуществлен с помощью теЬ-сайта Рго!8са1е, расположенного в глобальной сети на сервере молекулярной биологии ЕхРаку по адресу (иВЬ.ехраку.сй/сд1Ь1п/рго!кса1е.р1).
Данные профили включают в себя следующие характеристики:
фиг. 5А и 5В, гидрофильность (Норр Т.Р., ХУообк К.В., 1981. Ргос. Май. Асаб. 8с1. И.8.А. 78: 38243828);
фиг. 6А и 6В, гидропатичность, (Ку!е I., ОооШИе В.Е., 1982. I. Мо1. Вю1. 157: 105-132);
фиг. 7А и 7В, процент доступных остатков (1ашп I., 1979, Ма!иге, 277: 491-492);
фиг. 8А и 8В, средняя жесткость (Вйаккагап В., апб Роппик^ату Р.К., 1988. Ш!. I. Рер!. Рго!ет Век. 32: 242-255);
фиг. 9А и 9В, бета-складка (Ое1еаде, С., Воих В. 1987, Рго!еш Епдтееппд, 1: 289-294); а для идентификации антигенных участков белка 8ТЕАР-1 также можно использовать другие характеристики, известные в данной области, например, доступные на \геЬ-сайте Рго!8са1е.
Каждый из вышеуказанных аминокислотных профилей 8ТЕАР-1 получают с использованием нижеследующих аналитических параметров Рго!8са1е:
1) размер составляет окна 9;
2) масса границ окна составляет 100% по сравнению с центром окна и
3) значения аминокислотного профиля нормализуют так, чтобы они находились в интервале от 0 до 1.
Профили гидрофильности (фиг. 5А и 5В), гидропатичности (фиг. 6А и 6В) и процента доступных остатков (фиг. 7А и 7В) используют для определения участков гидрофильных аминокислот (т.е. имеющих значение выше 0,5 по профилям гидрофильности и процента доступных остатков и меньше 0,5 по профилю гидропатичности). Такие участки, скорее всего, экспонируются в водную среду, присутствуют на поверхности белка и, следовательно, доступны для иммунного распознавания, например, антителами.
- 88 014870
С помощью профилей средней жесткости (фиг. 8А и 8В) и бета-складки (фиг. 9А и 9В) определяют участки аминокислот (т.е. имеющие значение выше 0,5 по профилю бета-складки и по профилю средней жесткости), подвижность которых не ограничена вторичными структурами, такими как бета-слои и альфа-спирали. Такие участки, скорее всего, экспонируются на поверхности белка и, следовательно, доступны для иммунного распознавания, например, антителами.
Антигенные последовательности белка 8ТЕАР-1 и вариантных белков, определенные, например, по профилям, приведенным на фиг. 5А и 5В, 6А и 6В, 7А и 7В, 8А и 8В и/или 9А и 9В, используют для получения иммуногенов, либо пептидов, либо кодирующих их нуклеиновых кислот, которые, в свою очередь, используют для получения терапевтических и диагностических антител против 8ТЕАР-1. Иммуноген может представлять собой последовательность, состоящую из любых 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50 или более смежных аминокислот белковых вариантов 8ТЕАР-1, приведенных на фиг. 2 и 3, или он может представлять собой нуклеиновую кислоту, кодирующую такую аминокислотную последовательность. В частности, пептидные иммуногены согласно изобретению могут включать в себя пептидный участок, содержащий по меньшей мере 5 аминокислот последовательности, приведенной на фиг. 2 или 3, с любым целочисленным приращением, который содержит аминокислотное положение, имеющее значение больше 0,5 по профилю гидрофильности, приведенному на фиг. 5А и 5В; пептидный участок, содержащий по меньшей мере 5 аминокислот последовательности, приведенной на фиг. 2 или 3, с любым целочисленным приращением, который содержит аминокислотное положение, имеющее значение меньше 0,5 по профилю гидрофобности, приведенному на фиг. 6А и 6В; пептидный участок, содержащий по меньшей мере 5 аминокислот последовательности, приведенной на фиг. 2 или 3, с любым целочисленным приращением, который содержит аминокислотное положение, имеющее значение больше 0,5 по профилю процента доступных остатков, приведенному на фиг. 7А и 7В; пептидный участок, содержащий по меньшей мере 5 аминокислот последовательности, приведенной на фиг. 2 или 3, с любым целочисленным приращением, который содержит аминокислотное положение, имеющее значение больше 0,5 по профилю средней жесткости, приведенному на фиг. 8А и 8В; и пептидный участок, содержащий по меньшей мере 5 аминокислот последовательности, приведенной на фиг. 2 или 3, с любым целочисленным приращением, который содержит аминокислотное положение, имеющее значение больше 0,5 по профилю бета-складки, приведенному на фиг. 9А и 9В. Иммуногены согласно изобретению также могут включать в себя нуклеиновые кислоты, кодирующие указанные выше пептиды.
Все иммуногены согласно изобретению, как пептиды, так и нуклеиновые кислоты, могут быть представлены в виде человеческой стандартной лекарственной формы или они могут входить в состав композиции, которая содержит фармацевтический наполнитель, совместимый с физиологией человека.
Вторичные структуры варианта 1 и варианта 3 8ТЕАР-1, а именно наличие и местоположение альфа-спиралей, развернутых цепей и статистических клубков, предсказывают на основе первичных аминокислотных последовательностей с использованием метода ΗNN - иерархических нейронных сетей (Сиегтеиг, 1997, ййр://рЫ1.1Ьср.Гг/сд1Ып/прка_аи!ота!.р1?раде=прка_пп.Ыт1), который можно найти на сервере молекулярной биологии ЕхРаку, расположенном в глобальной сети по адресу (.ехраку.сйЛоо1к/). Результаты данного анализа показывают, что вариант 1 8ТЕАР-1 на 64,60% состоит из альфа-спиралей, на 4,72% - из развернутых цепей и на 30,68% - из статистических клубков (фиг. 13А). Вариант 2 8ТЕАР-1 на 62,79% состоит из альфа-спиралей, на 3,10% - из развернутых цепей и на 34,11% - из статистических клубков (фиг. 13В). Вариант 3 8ТЕАР-1 на 58,87% состоит из альфа-спиралей, на 5,32% - из развернутых цепей и на 35,82% - из статистических клубков (фиг. 13С).
Анализ возможного присутствия трансмембранных доменов в вариантах 8ТЕАР-1 проводят с использованием ряда алгоритмов прогнозирования трансмембранных доменов, которые можно найти на сервере молекулярной биологии ЕхРаку, расположенном в глобальной сети по адресу (.ехраку.сйЛоо1к/). На графическом изображении результатов анализа варианта 1 отражено присутствие и расположение 6 трансмембранных доменов, предсказанных с помощью программы ТМргеб (фиг. 13Ό) и программы ТМНММ (фиг. 13Е). Также показаны результаты анализа варианта 2, отражающие присутствие и расположение 4 трансмембранных доменов, предсказанных с помощью программы ТМргеб (фиг. 13Е), и 3 трансмембранных доменов, предсказанных с помощью программы ТМНММ (фиг. 13С). Анализ варианта 3 позволяет предсказать присутствие 4 трансмембранных доменов с помощью программы ТМргеб (фиг. 13Н) и 3 трансмембранных доменов с помощью программы ТМНММ (фиг. 13Ц Результаты применения каждой программы, а именно аминокислоты, составляющие трансмембранные домены, приведены в табл. XX.
- 89 014870
Пример 10. Получение поликлональных антител ЗТЕАР-1.
Образование поликлональных антител можно индуцировать у млекопитающего, например, путем одной или нескольких инъекций иммунизирующего средства, при необходимости, вместе с адъювантом. Как правило, иммунизирующее средство и/или адъювант вводят млекопитающему путем нескольких подкожных или внутрибрюшинных инъекций. Помимо вариантов полноразмерного белка ЗТЕАР-1, для иммунизации используют иммуногены, созданные с помощью компьютерных алгоритмов, которые по результатам анализа аминокислотной последовательности обладают антигенными свойствами и доступны для распознавания иммунной системой иммунизированного хозяина (см. пример, озаглавленный Профили антигенности и вторичная структура). Предположительно такие участки должны быть гидрофильными, гибкими, иметь бета-складчатую конформацию и экспонироваться на поверхности белка (аминокислотные профили, указывающие на такие участки вариантов 1 и 3 белка ЗТЕАР-1, приведены, например, на фиг. 5А и 5В, 6А и 6В, 7А и 7В, 8А и 8В и/или 9А и 9В).
Например, для получения поликлональных антител от новозеландских белых кроликов или моноклональных антител по способу, описанному в примере, озаглавленном Получение моноклональных антител (МаЬБ) ЗТЕАР-1, в качестве антигенов используют рекомбинантные бактериальные гибридные белки или пептиды, содержащие гидрофильные, гибкие, бета-складчатые участки белковых вариантов ЗТЕАР-1. Например, такие участки включают в себя, без ограничения, аминокислоты 1-40, аминокислоты 143-165, аминокислоты 180-220 вариантов 1, 2 и 3 ЗТЕАР-1, аминокислоты 312-339 варианта 1 ЗТЕАР-1 и аминокислоты 250-282 варианта 3 ЗТЕАР-1. Предпочтительно использовать конъюгат иммунизирующего средства с белком, являющимся иммуногенным для иммунизируемого млекопитающего. Примеры таких иммуногенных белков включают в себя, без ограничения, гемоцианин лимфы улитки (КЬН), сывороточный альбумин, бычий тироглобулин и соевый ингибитор трипсина. В одном воплощении пептид, содержащий аминокислоты 250-282 варианта 3 ЗТЕАР-1, конъюгируют с КЬН. Затем полученный конъюгат используют в качестве иммуногена. Альтернативно, иммунизирующее средство может содержать полноразмерные или частичные вариантные белки ЗТЕАР-1, их аналоги или гибриды. Например, аминокислотную последовательность варианта 1 ЗТЕАР-1 можно гибридизовать, используя методы рекомбинантных ДНК, с одним из ряда белков-партнеров по гибридизации, хорошо известных в данной области, таких как глутатион-З-трансфераза (СЗТ) и Н1Б-меченые гибридные белки. В другом воплощении аминокислоты 250-282 варианта 1 ЗТЕАР-1 гибридизуют с СЗТ, используя рекомбинантные методы и вектор экспрессии рСЕX, экспрессируют, очищают и используют для иммунизации кролика. Такие гибридные белки выделяют из индуцированных бактерий с помощью носителя, обладающего подходящей аффинностью.
Также можно использовать другие рекомбинантные бактериальные гибридные белки, которые включают в себя белок, связывающий мальтозу, Ьас2, тиоредоксин, №бА или константный участок иммуноглобулина (см. раздел, озаглавленный Получение ЗТЕАР-1 в прокариотических системах и Сиггеп! Рго!осо1б Ш Мо1еси1аг Вю1оду, Уо1ите 2, Иш! 16, Егебепск М. АиБиЬи1 е! а1. ебБ., 1995; ЬтБ1еу, Р.З., Вгабу, V., ИтеБ, М., СгоБтайе, Ь., Оат1е, К, апб ЬебЬейег, Ь. (1991), 1. Ехр. Меб. 174, 561566).
Помимо бактериальных гибридных белков также используют белковые антигены, экспрессирующиеся в клетках млекопитающих. Данные антигены экспрессируют из векторов экспрессии млекопитающих, таких как !ад-5 и Рс-гибридные векторы (см. раздел, озаглавленный Продукция рекомбинантного ЗТЕАР-1 в зукариотических системах), и сохраняют посттрансляционные модификации, такие как гликозилирование, присутствующие в нативном белке. В одном воплощении аминокислоты 185-218 варианта 1 ЗТЕАР-1 клонируют в векторе секреции млекопитающих !ад-5 и экспрессируют в клетках 293Т. Рекомбинантный белок выделяют из супернатантов тканевой культуры клеток 293Т, экспрессирующих рекомбинантный вектор, методом металлохелатной хроматографии. Затем очищенный белок 1ад-5-вариант 1 ЗТЕАР-1 используют в качестве иммуногена.
При осуществлении схемы иммунизации полезно смешивать антиген с адъювантами, которые усиливают иммунный ответ животного-хозяина, или эмульгировать антиген в таких адъювантах. Примеры адъювантов включают в себя, без ограничения, полный адъювант Фрейнда (СРА) и адъювант МРЬ-ТОМ (монофосфорил липида А, синтетический дикориномиколат трегалозы).
В типичном способе иммунизации кроликам вначале вводят подкожно не более 200 мкг, обычно 100-200 мкг гибридного белка или пептида, конъюгированного с КЬН и смешанного с полным адъювантом Фрейнда (СРА). Затем кроликам вводят подкожно каждые две недели не более 200 мкг, обычно 100-200 мкг иммуногена в неполном адъюванте Фрейнда ДР А). Приблизительно через 7-10 дней после каждой иммунизации берут контрольные пробы крови и определяют титр антисыворотки методом ЕЫЗА.
Чтобы проанализировать реакционноспособность и специфичность иммунной сыворотки, такой как кроличья сыворотка, полученная путем иммунизации гибридным белком СЗТ-вариант 1 ЗТЕАР-1, полноразмерную кДНК варианта 1 ЗТЕАР-1 клонируют в векторе экспрессии рс^NА3.1 шус-1иБ Цпуйгодеп, см. пример, озаглавленный Продукция рекомбинантного ЗТЕАР-1 в эукариотических системах). После трансфекции конструкций в клетки 293Т клеточные лизаты анализируют на способность специфически
- 90 014870 взаимодействовать с денатурированным белком 8ТЕАР-1 методом вестерн-блоттинга с использованием антисыворотки против 8ТЕАР-1 и антител против НЕ (8аи!а Сгих В^о!есЬηо1од^еκ, 8аи!а Сгих, СА). Кроме того, иммунную сыворотку анализируют на способность специфически распознавать нативный белок с помощью методов флуоресцентной микроскопии, проточной цитометрии и иммунопреципитации против клеток 293Т и других клеток, экспрессирующих рекомбинантный 8ТЕАР-1. Методы вестерн-блоттинга, иммунопреципитации, флуоресцентной микроскопии и проточной цитометрии с использованием клеток, эндогенно экспрессирующих 8ТЕАР-1, также проводят для определения реакционноспособности и специфичности.
Антисыворотку, полученную от кроликов, иммунизированных гибридами вариантных белков 8ТЕАР-1, такими как С8Т- и МВР-гибриды, очищают путем удаления антител, способных взаимодействовать с последовательностью партнера по гибридизации, пропуская сыворотку через аффинную колонку, содержащую партнер по гибридизации, либо в отдельности, либо в составе другого гибридного белка. Например, антисыворотку, полученную против гибридного белка С8Т-вариант 1 8ТЕАР-1 вначале очищают путем пропускания через колонку, содержащую белок С8Т, ковалентно связанный с носителем Ай1Се1 (ВюКаб, Негси1ек, СайЕ). Затем антисыворотку очищают, пропуская через колонку, заполненную носителем А£йСе1, ковалентно связанным с гибридным белком МВР-8ТЕАР-1. Затем, чтобы выделить фракцию ^С, сыворотку очищают аффинной хроматографией с использованием белка С. Сыворотку, полученную от кроликов, иммунизированных другими НЕ-мечеными антигенами и пептидами, а также сыворотку, истощенную по партнеру по гибридизации, подвергают аффинной очистке, пропуская через носитель для колонки, содержащий исходный белковый иммуноген или свободный пептид.
Пример 11. Получение моноклональных антител (МаЬ) 8ТЕАР-1.
В одном воплощении терапевтические МаЬ против вариантов 8ТЕАР-1 включают в себя МаЬ, которые взаимодействуют с эпитопами, характерными для каждого белкового варианта, или для последовательностей, общих для разных вариантов, и которые связывают, способствуют интернализации, нарушают или модулируют биологическую функцию вариантов 8ТЕАР-1, например нарушают взаимодействие с лигандами и партнерами по связыванию. Иммуногены, используемые для получения таких МаЬ, включают в себя иммуногены, кодирующие или содержащие внеклеточный домен или всю последовательность белкового варианта 8ТЕАР-1, участки, которые, как предсказано с помощью компьютерного анализа аминокислотной последовательности, содержат функциональные мотивы, и участки белковых вариантов 8ТЕАР-1, которые, как предсказано, являются антигенными (см., например, фиг. 5А-9А, 5В-9В и пример, озаглавленный Профили антигенности и вторичная структура). Иммуногены включают в себя пептиды, рекомбинантные бактериальные белки, !ад-5-белки, экспрессируемые клетками млекопитающих, а также человеческие и мышиные ^С Ес-гибридные белки. Кроме того, для иммунизации мышей используют белок р!ад-5, векторы ДНК, кодирующие р!ад-5, клетки, экспрессирующие высокие уровни соответствующего варианта 8ТЕАР-1, такого как вариант 1 293Т-8ТЕАР-1 или 3Т3, КАТ или 300.198ТЕАР-1 вариант 1 мышиные пре-В клетки.
Чтобы получить МаЬ против вариантов 8ТЕАР-1, мышей вначале иммунизируют путем введения внутрибрюшинно (в.б.) или в подошву ступни, как правило, 10-50 мкг белкового иммуногена или 107 8ТЕАР-1-экспрессирующих клеток, смешанных с полным адъювантом Фрейнда. В качестве адъювантов также можно использовать ТЕегтах (8щта) и [ттипеаку (фхадеи). Затем мышей иммунизируют путем в.б. введения каждые 2-4 недели, как правило, 10-50 мкг белкового иммуногена или 107 клеток, смешанных с неполным адъювантом Фрейнда. Альтернативно, для иммунизации можно использовать адъювант МРЬ-ТИМ. Помимо стратегий иммунизации с использованием вышеуказанных белков и клеток, используют схему иммунизации с применением ДНК, в которой вектор экспрессии млекопитающих, кодирующий последовательность варианта, вводят иммунизируемой мыши путем непосредственной инъекции плазмидной ДНК. Например, участок, кодирующий аминокислоты 185-218 варианта 1 8ТЕАР-1, клонируют в векторе секреции млекопитающих !ад-5 и рекомбинантный вектор используют в качестве иммуногена. В другом примере участок, кодирующий такие же аминокислоты, клонируют в векторе секреции Ес-гибрида, в котором последовательность варианта 1 8ТЕАР-1 присоединена к аминоконцу лидерной последовательности ^К и к карбоксильному концу последовательности, кодирующей Ес-участок человеческого или мышиного ^С. Данный рекомбинантный вектор используют в качестве иммуногена. Схему иммунизации плазмидой используют в сочетании с очищенными белками, экспрессируемыми тем же вектором, и с клетками, экспрессирующими соответствующий вариант 8ТЕАР-1. В другом примере получают моноклональное антитело против варианта 3 8ТЕАР-1, используя пептид, кодирующий аминокислоты 250-282. Получают конъюгат данного пептида с КЬН и используют в качестве иммуногена. Иммунореактивные клоны идентифицируют методом ЕЫ8А с использованием свободного пептида. Реакционноспособность и специфичность моноклональных антител по отношению к варианту 1 полноразмерного белка 8ТЕАР-1 определяют методами Вестерн-блоттинга, иммунопреципитации и проточной цитометрии с использованием клеток, экспрессирующих как рекомбинантный, так и эндогенный вариант 1 8ТЕАР-1.
- 91 014870
При осуществлении схемы иммунизации через 7-10 дней после инъекции берут контрольные пробы крови, чтобы определить титр и специфичность иммунного ответа. После достижения подходящих реакционноспособности и специфичности, определяемых методами ЕЕ18А, вестерн-блоттинга, иммунопреципитации, флуоресцентной микроскопии и проточной цитометрии, получают гибрид и гибридому с помощью общепринятых методов, хорошо известных в данной области (см., например, Наг1оте апб Бане, 1988).
Сродство связывания специфических моноклональных антител против варианта 1 8ТЕАР-1 определяют с помощью стандартных методов. Измерение сродства позволяет количественно определить силу связывания антитела с эпитопом и помогает идентифицировать моноклональные антитела против варианта 8ТЕАР-1, являющиеся предпочтительными для диагностического или терапевтического применения, что оценивают специалисты в данной области. Система В1Асоге (Иррка1а, 8тебеп) является предпочтительным методом определения сродства связывания. В системе В1Асоге для регистрации биомолекулярных взаимодействий в режиме реального времени используют метод поверхностного плазмонного резонанса (8РК, \Уе1йогб К. 1991, 0р!. Оиап1. Е1ес!. 23: 1; Мойоп апб Мукхка, 1998, Мебюбк ш Епхуто1оду 295: 268). Как правило, анализ В1Асоге позволяет определять константы скорости ассоциации, константы скорости диссоциации, равновесные константы диссоциации и константы сродства.
Чтобы получить моноклональные антитела, специфичные к другим вариантам 8ТЕАР-1, создают иммуногены, кодирующие аминокислотные последовательности, уникальные для данных вариантов. В одном воплощении синтезируют пептид, несущий аминокислоты, уникальные для вариантов 8ТЕАР-1, присоединяют его к КЕН и полученный конъюгат используют в качестве иммуногена. В другом воплощении получают пептиды или бактериальные гибридные белки, которые содержат уникальную последовательность, образующуюся в результате альтернативного сплайсинга вариантов. Затем отбирают гибридомы, которые распознают антиген, характерный для соответствующего варианта, и, кроме того, распознают полноразмерный вариантный белок, экспрессирующийся в клетках. Такой отбор проводят с помощью описанных выше иммунологических анализов, таких как вестерн-блоттинг, иммунопреципитация и проточная цитометрия.
В одном воплощении данное изобретение предлагает моноклональные антитела, обозначаемые Х92.1.30.1.1 (1) (а.к.а. М2/92.30) и Х120.545.1.1 (а.к.а. М2.120.545); М2/92.30 и М2/120.545 идентифицируют и демонстрируют, что они взаимодействуют и связываются с клеточным поверхностным 8ТЕАР-1 (см. фиг. 15 и 18). На фиг. 16 показано, что Мак М2/92.30 против 8ТЕАР-1 связывается с эндогенным клеточным поверхностным 8ТЕАР-1, экспрессирующимся в клетках мочевого пузыря и ксенотрансплантатов рака простаты. Кроме того, М2/92.30 взаимодействует и связывается с мышиным 8ТЕАР-1, как изображено на фиг. 17.
Антитела, обозначенные Х92.1.30.1.1 (1) (а.к.а. М2/92.30) и Х120.545.1.1 (а.к.а. М2.120.545), отправлены (с помощью службы Федерал-Экспресс) в Американскую коллекцию типовых культур (АТСС), Р. О. Вох 1549, Мапаккак, У А 20108, 6 февраля 2004 г., где им присвоены номера доступа РТА-5802 и РТА-5803 соответственно.
Для клонирования антител М2/Х92.30 и М2/Х120.545 используют следующие способы. Клетки гибридомы лизируют реагентом Тпхо1 (БЕе Тескпо1од1ек, С1ксо ВКБ). Общую РНК очищают и количественно определяют. Одноцепочечные кДНК получают из общей РНК с использованием олиго(бТ) 12-18 в качестве праймеров и системы С1ксо-ВКЕ 8ирегкспр! Ргеатр1Шса!юп. Продукты ПЦР клонируют в векторе рСК8спр! (8!га!адепе, Ба Йо11а). Некоторые клоны секвенируют и определяют вариабельные участки тяжелой (Ун) и легкой (Уь) цепей. Нуклеотидная и аминокислотная последовательности вариабельных участков тяжелой и легкой цепей М2/Х92.30 и М2/Х120.545 приведены на фиг. 19А-19О и 20А-20Е.
Пример 12. Характеристика антител 8ТЕАР-1.
А. Клеточное поверхностное связывание.
Способность антител 8ТЕАР-1 взамодействовать с белком, родственным 8ТЕАР-1, можно определить с помощью ряда хорошо известных методов, включающих в себя вестерн-блоттинг, иммунопреципитацию, ЕБЕА и ЕАС8, проводимые, в зависимости от обстоятельств, с использованием 8ТЕАР-1-родственных белков, 8ТЕАР-1-экспрессирующих клеток или их экстрактов. На фиг. 15 показаны результаты анализа ЕАС8 рекомбинантных клеток 3Т3 и КАТ1, стабильно экспрессирующих либо 8ТЕАР-1, либо контрольный ген, окрашенных Мак М2/92.30 против 8ТЕАР (10 мкг/мл), где связанные с клеточной поверхностью Мак детектируют, используя в качестве вторичного реагента конъюгат козлиных антител против мышиных 1дС с РЕ. Окрашенные клетки анализируют методом ЕАС8. Сдвиг флуоресценции в клетках КЛТ1-8ТЕАР-1 и 3Т3-8ТЕАР-1 по сравнению с контрольными клетками показывает, что Мак М2/92.30 специфически связываются со 8ТЕАР-1 на клеточной поверхности.
- 92 014870
Кроме того, проводят окрашивание клеток мочевого пузыря ИСВ1 и клеток рака простаты ЬАРС-9 с использованием 10 мкг/мл либо МаЬ М2/92.30, либо контрольных МаЬ против КЬН. Связанные с поверхностью МаЬ М2/92.30 детектируют, используя в качестве вторичных АЬ конъюгат козлиных антител против мышиных ЦС с РЕ. Окрашенные клетки анализируют методом РАС8. Полученные результаты показывают, что МаЬ М2/92.30 против 8ТЕАР-1 специфически связывается с эндогенным 8ТЕАР-1, экспрессирующимся на поверхности клеток ксенотрансплантатов рака мочевого пузыря и простаты (фиг. 21).
Показано также, что М2/92.30 против 8ТЕАР-1 связывается с мышиным белком 8ТЕАР-1 (см. фиг. 17). В данном эксперименте клетки 293Т транзиторно трансфицируют либо рСПИА3.1, кодирующим кДНК мышиного 8ТЕАР-1, либо пустым вектором. Через 48 ч клетки собирают и окрашивают МаЬ М2/92.30 против 8ТЕАР-1 (10 мкг/мл), после чего связанные с клеточной поверхностью МаЬ детектируют, используя в качестве вторичного реагента конъюгат козлиных антител против мышиных ЦС с РЕ. Затем клетки анализируют методом РАС8. Результаты показывают, что МаЬ М2/92.30 против 8ТЕАР-1 специфически связывается с клетками 293Т, экспрессирующими 8ТЕАР-1.
Показано также, что М2/120.545 против 8ТЕАР-1 специфически связывается со 8ТЕАР-1 (см. фиг. 18). Клетки 3Т3-пео (сектор А, закрашенная гистограмма) и 3Т3-8ТЕАР-1 (сектор А, незакрашенная гистограмма), а также клетки ВАТ1-пео (сектор В, закрашенная гистограмма) и ВАТ1-8ТЕАР (сектор В, незакрашенная гистограмма) окрашивают МаЬ М2/120.545 (10 мкг/мл) и связанные с поверхностью МаЬ детектируют, используя в качестве вторичных АЬ конъюгат козлиных антител против мышиных ЦС с РЕ. Затем клетки анализируют методом РАС8. Сдвиг флуоресценции в клетках 3Т3-8ТЕАР-1 и ВАТ1-8ТЕАР-1 по сравнению с соответствующими пео-контролями показывает, что МаЬ М2/120.545 специфически связывается со 8ТЕАР-1 на клеточной поверхности. В секторе С показаны результаты анализа РАС8, как описано выше, клеток ЬИСаР, окрашенных либо МаЬ М2/120.545, либо контрольными МаЬ против КЬН. В секторе Ό показаны результаты флуоресцентной микроскопии клеток ЬИСаР, окрашенных М2/120.545, демонстрирующие интенсивную флуоресценцию на клеточной поверхности.
Реакционноспособность и специфичность М2/92.30 и М2/120.545 также определяют методом иммунопреципитации. На фиг. 25 приведены результаты эксперимента, в котором клетки 3Т3-8ТЕАР-1 и 3Т3-пео лизируют в буфере ШРА (25 мМ Тпк-С1 рН 7,4; 150 мМ ИаС1, 0,5 мМ ЕОТА, 1% тритон Х-100, 0,5% дезоксихолевая кислота, 0,1% δΌδ и смесь ингибиторов протеаз). Клеточные лизаты предварительно осветляют с помощью гранул сефарозы, содержащих белок С, и затем инкубируют с 5 мкг МаЬ, либо М2/92.30, либо М2/120.545, в течение 2 ч при комнатной температуре. Добавляют гранулы, содержащие белок С, и смесь инкубируют еще 1 ч. Иммунные комплексы промывают и солюбилизируют в буфере для δΌδ-РАСЕ. Затем солюбилизированные образцы анализируют методами δΌδ-РАСЕ и вестернблоттинга, используя кроличьи рАЬ против δТЕАΡ. В качестве положительного контроля используют лизаты целых клеток 293Т, трансфицированных δТЕАΡ-1. Иммунореактивная полоса, соответствующая ~37 кДа, наблюдается только в образцах, полученных из клеток 3Т3^ТЕАР-1, и указывает на специфичную иммунопреципитацию δТЕАΡ-1 под действием как МаЬ М2/92.30, так и МаЬ М2/120.545.
В. Интернализация антитела против δТЕАΡ-1.
Иммунотерапия, основанная на доставке токсинов к конкретным клеткам-мишеням с помощью моноклональных антител, относится к способам лечения злокачественных заболеваний. Общим принципом данных способов является доставка токсинов или противоопухолевых средств к раковым клеткам с помощью молекул, которые связываются с антигенами или рецепторами, экспрессирующимися только в клетках-мишенях или обладающими повышенным уровнем экспрессии в клетках-мишенях по сравнению с нормальными тканями.
Иммунотоксины состоят из клеточно-селективных лигандов (как правило, моноклональных антител или цитокинов), ковалентно связанных с токсинами. Взаимодействие антитела или лиганда с рецепторами клеточной поверхности инициирует интернализацию. В определенных внутриклеточных полостяхкомпартментах токсиновый фрагмент отделяется и попадает в цитозоль, где он каталитически изменяет ключевые клеточные функции и приводит к гибели клетки. См., Ргапке1 А.Е., Фсша^ δорЬ^кΐ^саΐ^оη о£ ^типо^х^, Сйшса1 сапсег гекеагсЬ, 8: 942-944 (2002) и А11еп Т.М., Ь1дапб-Тагде!еб ТЬегареийск ш Апй-сапсег ТЬегару. ИаФге Βον®\νκ. 2: 750-760 (2002).
Сапорин представляет собой белок, инактивирующий рибосомы (КЬР), который катализирует ш νίϋΌ депуринизацию конкретного аденинового остатка в больших рибосомальных РНК. Епбо Υ., е!. а1., МесЬашкт о£ Асйоп о£ !Ье Тохш Ьес!ш В ют оп Ецкагуойс Се11к; ТЬе δ Не апб СЬагасФпкйск о£ !Ье МобШсайоп т 28δ ВИА Саикеб Ьу !Ье Тохш, 1. Вю1. СЬет. 262, 5908-5912 (1987). Как правило, он способен проникать в клетки только в составе комплекса с подходящей молекулой-носителем. Путем ковалентной конъюгации сапорина с моноклональными антителами, распознающими опухолевые антигены, получают иммунотоксины, которые обладают селективностью по отношению к раковым клеткам и способны к интернализации. См., Р^е11, Ό.Ι, δаро^η Iттиηо!оx^ηк, Сигг. Тор. МФгоЬю1. Iттиηо1. 234: 51-61 (1998) и Ыауе11 Ό.Ρ, е!. а1., ТЬегару о£ Нитап Т-се11 Аси!е ЬутрНоЫакОс Ьеикет1а νίΐΗ а СотЬта!юп о£ Ап11-СЬ7 апб Апй-СО38^арогт ^ти^Фх^ 1к δ^дшίϊсаηί1у Вейег Фап ТЬегару νίΐΗ ЕасЬ Iηб^ν^биа1 ^ти^Фх^. Вг. 1 Сапсег, 84: 571-578 (2001). Данные молекулы недавно поступили в I фазу клиниче
- 93 014870 ских испытаний по лечению лейкоза и множественной миеломы. Еооп К.А. Мопос1опа1 АпЕЬобу ТЬегар1ек Гог ЬутоЬотак. Сапсег I. 6: 273-278 (2000).
Интернализация 8ТЕАР-1 с помощью М2/92.30 показана на фиг. 22. В данном эксперименте клетки РС3-8ТЕАР-1 окрашивают при 4°С с помощью МаЬ М2/120.545 (10 мкг/мл), промывают и инкубируют с конъюгатом козлиные антитела против мышиных ^С-РЕ в качестве вторичных АЬ. Половину клеток инкубируют при 37°С в течение 30 мин, а вторую половину оставляют при 4°С. Затем клетки из каждой партии анализируют методом флуоресцентной микроскопии. На поверхности клеток, оставленных инкубироваться при 4°С, наблюдается яркая кольцеобразная флуоресценция. На поверхности клеток, инкубировавшихся при 37°С, кольцеобразная флуоресценция отсутствует, а появление точечной и агрегированной флуоресценции указывает на кэпирование и интернализацию.
Интернализация 8ТЕАР-1 с помощью МаЬ М2/120.545 против 8ТЕАР-1 показана на фиг. 23. Клетки РС3-8ТЕАР-1 окрашивают при 4°С с помощью МаЬ М2/120.545 (10 мкг/мл), промывают и инкубируют с конъюгатом козлиные антитела против мышиных ^С-РЕ в качестве вторичных АЬ. Половину клеток инкубируют при 37°С в течение 30 мин, а вторую половину оставляют при 4°С. Затем клетки из каждой партии анализируют методом флуоресцентной микроскопии. На поверхности клеток, оставленных инкубироваться при 4°С, наблюдается яркая кольцеобразная флуоресценция. На поверхности клеток, инкубировавшихся при 37°С, кольцеобразная флуоресценция отсутствует, а появление точечной и агрегированной флуоресценции указывает на кэпирование и интернализацию.
В одном способе антитела-кандидаты, подходящие для доставки иммунотоксинов, выбирают путем уничтожения клеток с помощью вторичных антител, конъгированных с лекарственным средством или молекулой токсина. Вторичное конъюгированное антитело, переносимое на первичном антителе, позволяет детектировать интернализацию и перемещение первичного антитела в соответствующие внутриклеточные компартменты. После интернализации конъюгата сапорин отщепляется от направляющего средства и инактивирует рибосомы, приводя к гибели клеток-мишеней. КоЬ1к М.Э. апб Ьарр1 ЭЛ. МаЬ-2АР: А Тоо1 Гог Еνа1иаΐ^ηд АпЕЬобу ЕГПсасу Гог Ике ш ап Iттиηο!οx^η. Вю Тес11пк.|иек. 28(1): 162-165 (2000).
Чтобы выбрать подходящее антитело-кандидат с помощью вышеуказанного способа, в качестве иммунотоксина используют конъюгат антитела против мышиного ^С с сапорином (Абνаηсеб ТагдеЕпд 8ук!ешк, 8ап П1едо, СА), позволяющий продемонстрировать, что мышиный 8ТЕАР-1 М2/120.545 проникает в клетки-мишени благодаря экспрессии 8ТЕАР-1 на поверхности клеток ЕЖ'аР. Анализ проводят следующим образом. Клетки ЕЖ'аР помещают в количестве 5000 клеток/90 мкл/лунку в 96-луночный планшет и инкубируют в течение ночи. Получают растворы конъюгатов вторичных антител с иммунотоксином (антитела против мышиных ^С-саторин и антитела против козлиных ^С-сапорин) и антител против мышиных ^С в среде для культивирования клеток с конечной концентрацией 100 нг/мл. В каждую лунку добавляют 10 мкл полученных растворов. Добавляют первичное антитело в концентрации, варьирующей от 1 до 1000 нг/мл. Планшеты инкубируют в течение 72 ч, после чего методом МТТ определяют жизнеспособность клеток. Результаты, приведенные на фиг. 24, показывают, что клетки ЕЖ'аР погибают в присутствии конъюгата антитело против мышиных ^С-саторин. При использовании только вторичных антител (против мышиных ^С) или конъюгатов неспецифичных вторичных антител (антител против козлиных ^С с сапорином) эффект не детектируется. При использовании только первичного антитела (М2/120.545) вплоть до концентрации 1 мкг/мл токсичность не наблюдается.
Пример 13. Анализы связывания НЬА класса I и класа II.
Анализы связывания НЬА класса I и класса II с использованием очищенных молекул НЬА проводят в соответствии с раскрытыми способами (например, в публикациях РСТ XVО 94/20127 и XVО 94/03205; 81бпеу е! а1., Сиггеп! Рго!осо1к ш Iттиηο1οду, 18.3.1 (1998); 81бпеу, е! а1., I. Iттиηο1. 154: 247 (1995); 8е!!е, е! а1., Мо1. Iттиηο1. 31: 813 (1994)). Коротко говоря, очищенные молекулы МНС (от 5 до 500 нМ) инкубируют в присутствии различных немеченых пептидных ингибиторов и 1-10 нМ меченных радиоактивным изотопом 125Σ пептидных зондов по описанному способу. После инкубации комплексы МНСпептид отделяют от несвязанного пептида путем гель-фильтрации и определяют фракции связанного пептида. Как правило, перед проведением эксперимента каждый препарат МНС титруют в присутствии фиксированного количества меченных радиоактивным изотопом пептидов, чтобы определить концентрацию молекул НЬА, необходимую для связывания 10-20% общего количества радиоактивности. Все последующие анализы ингибирования и непосредственного связывания проводят, используя данные концентрации НЬА.
Поскольку в данных условиях [1аЬе1]<[НЬА], а Κ.'50 >[НЬА], измеренные значения Κ''50 являются приемлемыми приближениями фактических значений Кс. Пептидные ингибиторы обычно используют в концентрациях, варьирующих от 120 мкг/мл до 1,2 нг/мл, и анализируют в двух-четырех независимых экспериментах. Чтобы сравнить результаты, полученные в разных экспериментах, для каждого пептида получают график относительного связывания путем деления Κ'.'50 положительного контроля ингибирования на Κ.'50 каждого анализируемого пептида (как правило, немеченного пептида по сравнению с меченным радиоактивным изотопом пептидным зондом). Для формирования базы данных и сравнения результатов разных экспериментов, компилируют значения относительного связывания. Затем данные значения снова превращают в значения ТС50, нМ, путем деления ТС50, нМ, положительных контролей ингибирова
- 94 014870 ния на относительное связывание анализируемого пептида. Указанный способ компиляции данных является точным и позволяет получать согласующиеся результаты для сравнения пептидов, тестируемых в разные дни или с использованием разных партий очищенных МНС.
Описанные выше анализы связывания можно использовать для тестирования пептидов, несущих супермотив НЬА и/или мотив НЬА (см. табл. IV).
Пример 14. Конструирование полиэпитопных ДНК-плазмид, несущих мини-ген.
В данном примере описывается конструирование плазмиды экспрессии, несущей мини-ген. Разумеется, плазмиды, несущие мини-гены, могут содержать разные конфигурации эпитопов или аналогов эпитопов В-клеток, СТЬ и/или НТЬ, описанных в данном документе.
Плазмида экспрессии, несущая мини-ген, как правило, содержит несколько пептидных эпитопов СТЬ и НТЬ. В настоящем примере пептидные эпитопы, несущие супермотивы НЬА-А2, -А3, -В7, и пептидные эпитопы, несущие мотивы НЬА-А1 и -А24, используют в сочетании с эпитопами, несущими супермотив ЭВ и/или с эпитопами ПВ3. Супермотив НЬА класса I или мотив-несущие пептидные эпитопы δТЕΆР-1 выбирают так, чтобы было представлено несколько супермотивов/мотивов, обеспечивающих широкий популяционный охват. Подобным образом, эпитопы НЬА класса II выбирают из последовательности δТЕΆР-1 так, чтобы обеспечить широкий популяционный охват, т.е. в состав конструкции, несущей мини-ген, включают и эпитопы, несущие супермотив НЬА ПВ-1-4-7, и эпитопы, несущие мотив НЬА ΩΒ-3. Затем выбранные эпитопы СТЬ и НТЬ вводят в состав мини-гена для экспрессии в векторе экспрессии.
Такая конструкция может дополнительно включать в себя последовательности, направляющие эпитопы НТЬ в эндоплазматический ретикулум. Например, белок 11 может быть присоединен к одному или нескольким эпитопам НТЬ, как описано в данной области, где последовательность СЫР белка 11 удаляют и заменяют на последовательность эпитопа НЬА класса II для того, чтобы направить эпитоп НЬА класса II в эндоплазматический ретикулум, где данный эпитоп связывается с молекулами НЬА класса II.
В данном примере иллюстрируются способы, используемые для конструирования плазмиды экспрессии, несущей мини-ген. Для композиции мини-гена можно использовать и другие векторы экспрессии, известные специалистам в данной области.
ДНК-плазмида данного примера, несущая мини-ген, содержит консенсусную последовательность Козака и консенсусную сигнальную последовательность легкой цепи каппа мышиного Ц, затем эпитопы СТЬ и/или НТЬ, выбранные в соответствии с описанными в данном документе принципами. Данная последовательность кодирует открытую рамку считывания, гибридизованную с маркерным эпитопом антитела против Мус и Н15, кодируемую вектором рсПНА3.1Мус-Н1к.
Синтезируют перекрывающиеся олигонуклеотиды, которые могут содержать в длину в среднем приблизительно 70 нуклеотидов, из которых 15 нуклеотидов перекрываются, и очищают их методом ВЭЖХ. Олигонуклеотиды кодируют выбранные пептидные эпитопы, а также содержат подходящие линкерные нуклеотиды, последовательность Козака и сигнальную последовательность. Конечный полиэпитопный мини-ген собирают путем удлинения перекрывающихся олигонуклеотидов в трех циклах реакций ПЦР. Используют машину для проведения ПЦР Регкш/Е1тег 9600 и всего 30 циклов реакции с применением следующих условий: 95°С в течение 15 с, температура отжига (на 5° ниже самой низкой рассчитанной Тт для каждой пары праймеров) в течение 30 с и 12°С в течение 1 мин.
Например, мини-ген получают следующим образом. В первой реакции ПЦР 5 мкг каждого из двух олигонуклеотидов подвергают отжигу и удлинению: в примере с использованием восьми олигонуклеотидов, т.е. четырех пар праймеров, олигонуклеотиды 1+2, 3+4, 5+6 и 7+8 объединяют в 100 мкл реакционных смесей, содержащих буфер для полимеразы РГи (1х=10 мМ КС1, 10 мМ (ΝΉ4)2δΟ4, 20 мМ Тпкхлорид, рН 8,75, 2 мМ МдδΟ4, 0,1% тритон Х-100, 100 мкг/мл БСА), 0,25 мМ каждого !ЭТР и 2,5 ед. полимеразы РГи. Полноразмерные димерные продукты очищают в геле, две реакционные смеси, содержащие продукты 1+2 и 3+4, а также продукты 5+6 и 7+8, смешивают, подвергают отжигу и удлинению в течение 10 циклов. Затем смешивают половину двух реакционных смесей и проводят 5 циклов отжига и удлинения, после чего добавляют фланкирующие праймеры и амплифицируют полноразмерный продукт. Полноразмерный продукт очищают в геле, клонируют в векторе рСВ-й1ип! Цпуйгодеп) и проводят скрининг отдельных клонов путем секвенирования.
Пример 15. Плазмидная конструкция и степень ее иммуногенности.
Степень иммуногенности плазмидной конструкции, например плазмидной конструкции, полученной по способу предыдущего примера, подтверждают ш ν Иго путем определения презентации эпитопа АРС после трансдукции или трансфекции АРС конструкцией нуклеиновой кислоты, экспрессирующей эпитоп. Такое исследование позволяет определять антигенность с применением человеческих АРС. Данный анализ позволяет оценить способность АРС презентировать эпитоп, распознаваемый Т-клетками, путем количественного определения плотности комплексов эпитоп-НЬА класса I на поверхности клеток. Количественное определение можно проводить путем непосредственного измерения количества пептида, элюируемого из АРС (см., например, δί)15 е! а1., 1. Iттиηο1. 156: 683-692, 1996; Пето!/ е! а1., На!иге, 342: 682-684, 1989); или количество комплексов пептид-НЬА класса I можно определить путем количественного определения лизиса или высвобождения лимфокинов из больных или трансфици
- 95 014870 рованных клеток с последующим определением концентрации пептида, необходимой для получения эквивалентных уровней лизиса или высвобождения лимфокинов (см., например, Кадеуата е! а1., I. Iттиηо1. 154: 567-576, 1995).
Альтернативно, иммуногенность подтверждают путем ш νί\Ό введения мышам с последующей оценкой активности СТЬ и НТЬ ш νί!ΐΌ с помощью анализов цитотоксичности и пролиферации соответственно, подробно описанных, например, в А1ехапйег е! а1., ^типПу, 1: 751-761, 1994.
Например, чтобы подтвердить способность ДНК-конструкции, несущей мини-ген и кодирующей по меньшей мере один пептидный супермотив НЬА-А2, индуцировать СТЬ ш у1уо, трансгенных мышей НЬА-А2.1/КЬ, например, иммунизируют внутримышечно 100 мкг оголенной кДНК. Для сравнения уровня СТЬ, индуцированных в результате иммунизации кДНК, контрольную группу животных иммунизируют истинной пептидной композицией, которая содержит несколько эпитопов, синтезированных в виде одного полипептида, которые могли бы кодироваться анализируемым мини-геном.
Спленоциты иммунизированных животных стимулируют дважды каждой из соответствующих композиций (пептидными эпитопами, кодируемыми мини-геном или полиэпитопным пептидом), затем анализируют на пептид-специфическую цитотоксичную активность по высвобождению 51Сг. Результаты позволяют определить величину СТЬ-ответа, направленного против А2-ограниченного эпитопа, и оценить иммуногенность вакцины, несущей мини-ген, и полиэпитопной вакцины ш νί\Ό.
В результате обнаружено, что мини-ген вызывает иммунные ответы, направленные против пептидных эпитопов супермотива НЬА-А2, как и полиэпитопная пептидная вакцина. Чтобы оценить индукцию СТЬ под действием эпитопов мотива или супермотива НЬА-А3 и НЬА-В7, проводят подобный анализ с использованием других трансгенных мышиных моделей НЬА-А3 и НЬА-В7, в результате которого обнаруживают, что мини-ген вызывает соответствующие иммунные ответы, направленные против предоставленных эпитопов.
Чтобы подтвердить способность мини-гена, кодирующего эпитоп класса II, индуцировать НТЬ ш νίνΌ, трансгенных мышей ЭВ или в случае эпитопов, которые перекрестно взаимодействуют с соответствующей молекулой мышиного МНС, 1-АЬ-ограниченных мышей, например, иммунизируют внутримышечно 100 мкг плазмидной ДНК. Для сравнения уровня НТЬ, индуцированных в результате иммунизации ДНК, контрольную группу животных иммунизируют истинной пептидной композицией, эмульгированной в полном адъюванте Фрейнда. Т-клетки СЭ4+, т.е. НТЬ, выделяют из спленоцитов иммунизированных животных и стимулируют каждой из соответствующих композиций (пептиды, кодируемые минигеном). Ответ НТЬ измеряют с использованием анализа пролиферации по включению 3Н-тимидина (см., например, А1ехапйег е! а1. Iттишίу, 1: 751-761, 1994). Результаты позволяют определить величину ответа НТЬ, соответствующую иммуногенности мини-гена ш νί\Ό.
ДНК-мини-гены, полученные по способу, описанному в предыдущем примере, также можно использовать в качестве вакцины в сочетании с иммунизирующим средством по схеме примированиеповторная иммунизация. Иммунизирующее средсто может включать в себя рекомбинантный белок (например, Вагпей е! а1., А1йк Век. апй Нитап ВеП'огйикек 14, 8ирр1етеп!, 3: 8299-8309, 1998) или рекомбинантную вакцину, например, экспрессирующую мини-ген или ДНК, кодирующую полноразмерный белок, представляющий интерес (см., например, Напке е! а1., Хассте, 16: 439-445, 1998; 8ейедак е! а1., Ргос. Νη11. Асай. 8с1. И8А, 95: 7648-53, 1998; Напке апй МсМюйае1, Iттипо1. Ьейегк, 66: 177-181, 1999 и ВоЬткоп е! а1., ΝιΙιιιό Мей. 5: 526-34, 1999).
Например, эффективность ДНК-мини-гена при иммунизации по схеме примирование-повторная иммунизация вначале оценивают у трансгенных мышей. В данном примере трансгенных мышей А2.1/КЬ иммунизируют в. м. 100 мкг ДНК-мини-гена, кодирующего иммуногенные пептиды, включающие в себя по меньшей мере один пептид, несущий супермотив НЬА-А2. После инкубационного периода (варьирующего от 3 до 9 недель) мышей иммунизируют в. б. 107 бое/мышь рекомбинантного вируса коровьей оспы, экспрессирующего последовательность, идентичную последовательности, кодируемой ДНК-минигеном. Контрольных мышей иммунизируют 100 мкг ДНК или рекомбинантного вируса коровьей оспы, не содержащих последовательности мини-гена, или ДНК, содержащей мини-ген, но не содержащей иммуноген коровьей оспы. После другого инкубационного периода, составляющего 2 недели, спленоциты мышей сразу анализируют на пептидспецифическую активность методом ЕЫ8РОТ. Кроме того, спленоциты стимулируют 1п ν 1!го А2-ограниченными пептидными эпитопами, кодируемыми мини-геном и рекомбинантным вирусом коровьей оспы, затем анализируют на пептидспецифичную активность методом альфа, бета и/или гамма ΒΝ ЕЫ8А.
Обнаружено, что мини-ген при иммунизации по схеме примирование-повторная иммунизация вызывает более сильный иммунный ответ против пептидов супермотива НЬА-А2, чем одна ДНК. Чтобы оценить индукцию СТЬ под действием эпитопов мотива или супермотива НЬА-А3 и НЬА-В7, проводят подобный анализ с использованием трансгенных мышиных моделей НЙА-А11 и НЬА-В7. Применение схемы примирование-повторная иммунизация у людей описано ниже в примере, озаглавленном Индукция ответов СТЬ с использованием схемы примирование-повторная иммунизация.
- 96 014870
Пример 16. Полиэпитопные вакцинные композиции, содержащие несколько антигенов.
Чтобы создать вакцинную композицию для профилактики или лечения рака, сопровождающегося экспрессией ЗТЕАР-1 и других подобных антигенов, пептидные эпитопы ЗТЕАР-1 согласно изобретению используют в сочетании с эпитопами других опухолеспецифических антигенов-мишеней. Например, вакцинную композицию можно получить в виде одного полипептида, который содержит несколько эпитопов из ЗТЕАР-1, а также из опухолеспецифических антигенов, которые часто экспрессируются при злокачественном заболевании, связанном с экспрессией ЗТЕАР-1, или вакцинную композицию можно получить в виде смеси одного или нескольких отдельных эпитопов. Альтернативно, вакцину можно вводить в виде конструкции мини-гена или в виде дендритных клеток, нагруженных пептидными эпитопами 1п уйго.
Пример 17. Применение пептидов для оценки иммунного ответа.
Пептиды согласно изобретению можно использовать для анализа иммунного ответа по присутствию специфических антител, СТЬ или НТЬ, направленных на ЗТЕАР-1. Такой анализ можно проводить по способу, описанному 0дд е! а1., Заепсе, 279: 2103-2106, 1998. В данном примере пептиды согласно изобретению используют в качестве реагента для диагностических или прогностических целей, но не в качестве иммуногена.
В данном примере высокочувствительные тетрамерные комплексы (тетрамеры) человеческого лейкоцитарного антигена используют для перекрестного анализа, например частоты встречаемости ЗТЕАР-1 НЬА-А*0201-специфических СТЬ у НЬА А*0201-положительных субъектов на разных стадиях заболевания или после иммунизации пептидом ЗТЕАР-1, содержащим мотив А*0201. Тетрамерные комплексы синтезируют по описанному в литературе способу (МиБеу е! а1., N. Епд1. 1. Меб. 337: 1267, 1997). Коротко говоря, очищенную тяжелую цепь НЬА (А*0201 в данном примере) и в2-микроглобулин синтезируют с использованием прокариотической системы экспрессии. Тяжелую цепь модифицируют путем делеции трансмембранно-цитозольного хвоста и добавления по СООН-концу последовательности, содержащей участок ферментативного биотинилирования В1гА. Рефолдинг тяжелой цепи, в2-микроглобулина и пептида достигают путем разбавления. Продукт размером 45 кДа после рефолдинга выделяют методом жидкостной экспресс-хроматографии белков и затем биотинилируют под действием В1гА в присутствии биотина (З1дта, З!. Ьошб, М1ббоиг1), аденозин-5'-трифосфата и магния. Добавляют конъюгат стрептавидин-фикоэритрин в молярном соотношении 1:4 и концентрируют тетрамерный продукт до концентрации 1 мг/мл. Полученный продукт называют тетрамер-фикоэритрин.
Чтобы проанализировать образцы крови пациента, приблизительно 1 миллион РВМС центрифугируют при 300д в течение 5 мин и ресуспендируют в 50 мкл холодного забуференного фосфатом физиологического раствора. Трехцветный анализ проводят с использованием тетрамер-фикоэритрина и трехцветного красителя против СЭ8 и СЭ38. РВМС инкубируют с тетрамером и антителами на льду в течение 30-60 мин, затем дважды промывают и фиксируют формальдегидом. Устанавливают границы измерения, включающие в себя значения >99,98% от контрольных образцов. Контроли по тетрамеру включают в себя как А*0201-отрицательных субъектов, так и А*0201-положительных здоровых доноров. Затем методом проточной цитометрии определяют процент клеток, окрашенных тетрамером. Результаты позволяют определить в образце РВМС число клеток, содержащих эпитоп-ограниченные СТЬ, посредством этого величину иммунного ответа на эпитоп ЗТЕАР-1 и, следовательно, статус экспонирования ЗТЕАР-1 или экспонирования для вакцины, которая индуцирует защитный или терапевтический ответ.
Пример 18. Индуцирование иммунных ответов с использованием схемы примирование-повторная иммунизация.
Схему примирование-повторная иммунизация, подобную по своей основе схеме, используемой для подтверждения эффективности ДНК-вакцины у трансгенных мышей, такой как описанная выше в примере, озаглавленном Плазмидная конструкция и степень ее иммуногенности, также можно использовать для введения вакцины людям. Такой режим вакцинирования может включать в себя первичное введение, например, оголенной ДНК, сопровождающееся повторной иммунизацией путем введения в адъюванте рекомбинантного вируса, кодирующего вакцину, или рекомбинантного белка/полипептида, или пептидной смеси.
Например, для первичной иммунизации можно использовать вектор экспрессии, такой как полученный в примере, озаглавленном Конструирование полиэпитопных ДНК-плазмид, несущих миниген, в виде оголенной нуклеиновой кислоты, который вводят в.м. (или п.к., или в.к.) в количестве 0,5-5 мг в несколько участков. Нуклеиновую кислоту (от 0,1 до 1000 мкг) также можно вводить методом генной пушки. После периода инкубации, составляющего 3-4 недели, вводят повторную дозу антигена. При повторной иммунизации можно вводить рекомбинантный вирус птичьей оспы в дозе от 5х107 до 5х109 бое. Для повторной иммунизации также можно использовать альтернативный рекомбинантный вирус, такой как МУ А, вирус канареечной оспы, аденовирус или адено-ассоциированный вирус либо полиэпитопный белок или смесь пептидов. Для оценки эффективности вакцины образцы крови пациента берут до иммунизации, а также через определенные интервалы после введения первичной вакцины и повторной дозы вакцины. Мононуклеарные клетки периферической крови выделяют из свежей гепари
- 97 014870 низированной крови путем центрифугирования в градиенте плотности фикол-гипак, аликвоты помещают в среду для замораживания и хранят в замороженном состоянии. Образцы анализируют на активность СТЬ и ΗΊΈ.
Анализ полученных результатов показывает, что величина индуцируемого ответа достаточна для формирования терапевтического или защитного иммунитета против 8ΤΕΑΡ-1.
Пример 19. Комплементарные полинуклеотиды.
Последовательности, комплементарные 8ΤΕΑΡ-1-кодирующим последовательностям или их частям, используют для детектирования, уменьшения или ингибирования экспрессии природного 8ΤΕΑΡ-1. Описано применение олигонуклеотидов, содержащих приблизительно от 15 до 30 пар оснований, однако практически такой же способ можно использовать в применении к более мальньким или более крупным фрагментам последовательности. Подходящие олигонуклеотиды получают, например, с использованием программного обеспечения ОЬЮО 4.06 (№Шопа1 Β^οкс^еηсек) и кодирующей последовательности 8ΤΕΑΡ-1. Чтобы ингибировать транскрипцию, получают олигонуклеотид, комплементарный наиболее уникальной 5'-последовательности, и используют его для предотвращения связывания промотора с кодирующей последовательностью. Чтобы ингибировать трансляцию, получают комплементарный олигонуклеотид, предотвращающий связывание рибосом с транскриптом, кодирующим 8ΤΕΑΡ-1.
Пример 20. Очистка природного или рекомбинантного 8ΤΕΑΡ-1 с помощью 8ΤΕΑΡ-1специфических антител.
Природный или рекомбинантный 8ΤΕΑΡ-1, по существу, очищают методом иммуноаффинной хроматографии с использованием антител, специфичных для 8ΤΕΑΡ-1. Иммуноаффинную колонку получают путем ковалентного присоединения антитела против 8ΤΕΑΡ-1 к активированной хроматографической смоле, такой как С^г-активированная сефароза (АтеШи-ип Ρйа^тас^а Β^ΟΛ). После присоединения смолу блокируют и промывают в соответствии с инструкциями производителя.
Среду, содержащую 8ΤΕΑΡ-1, пропускают через иммуноаффинную колонку, после чего колонку промывают в условиях, обеспечивающих предпочтительную абсорбцию 8ΤΕΑΡ-1 (например, буферами с высокой ионной силой в присутствии детергента). Колонку элюируют в условиях, разрушающих связывание антитела со 8ΤΕΑΡ-1 (например, с использованием буфера, имеющего рН от 2 до 3, или содержащего высокую концентрацию агента, вызывающего диссоциацию комплексов, такого как мочевина или ион тиоцианата) и собирают ССВР.
Пример 21. Идентификация молекул, взаимодействующих со 8ΤΕΑΡ-1.
8ΤΕΑΡ-1 или его биологически активные фрагменты метят 121Ι с использованием реактива БолтонаХантера (см., например, Βο1!οη е! а1. (1973), Β^οскет. I. 133: 529). Молекулы-кандидаты, предварительно размещенные в лунки многолуночного планшета, инкубируют с меченнм 8ΤΕΑΡ-1, промывают и определяют лунки, содержащие меченый комплекс 8ΤΕΑΡ-1. Результаты, полученные для разных концентраций 8ΤΕΑΡ-1, используют для расчета количества комплексов 8ΤΕΑΡ-1, сродства 8ΤΕΑΡ-1 к молекуламкандидатам и степени ассоциации 8ΤΕΑΡ-1 с молекулами-кандидатами.
Пример 22, Анализ инициации опухолевого роста под действием 8ΤΕΑΡ-1 ш νί\Ό.
Влияние белка 8ΤΕΑΡ-1 на рост опухолевых клеток определяют ш νί\Ό путем оценки развития опухоли и роста клеток, экспрессирующих или не экспрессирующих 8ΤΕΑΡ-1. Например, мышам 8СШ подкожно вводят с каждой стороны 1х105 клеток либо 3Т3, либо линии рака простаты (например, клеток РС3), содержащих пустой вектор !кпео или 8ΤΕΑΡ-1. Можно использовать по меньшей мере две стратегии:
(1) стратегия, в которой обеспечивают конститутивную экспрессию 8ΤΕΑΡ-1 под регуляцией такого промотора, как конститутивный промотор, полученный из геномов вирусов, таких как вирус полиомы, вирус птичьей оспы (ЦК 2211504, опубликованный 5 июля 1989 г.), аденовирус (такой как аденовирус 2), вирус бычьей папилломы, вирус саркомы птиц, цитомегаловирус, ретровирус, вирус гепатита В и обезьяний вирус 40 (8ν40), или из гетерологичных промоторов млекопитающих, таких как промотор актина или промотор иммуноглобулина, при условии, что такие промоторы совместимы с системами клеткихозяина; и (2) стратегия, в которой обеспечивают регулируемую экспрессию, находящуюся под контролем индуцируемой векторной системы, такой как экдизон, тетрациклин и др., при условии, что такие промоторы совместимы с системами клетки-хозяина. Затем с помощью штангенциркуля измеряют объем опухоли в участке пальпируемой опухоли и через некоторое время определяют, не обладают ли 8ΤΕΑΡ-1-экспрессирующие клетки более высокой скоростью роста и не обладают ли опухоли, образованные 8ΤΕΑΡ-1-экспрессирующими клетками, признаками, характерными для изменения агрессивности (такими как повышенное метастазирование, васкуляризация, пониженная чувствительность к химиотерапевтическим средствам).
- 98 014870
Кроме того, мышам можно имплантировать 1х 105 таких же клеток в гомологичную область, чтобы определить, влияет ли ЗТЕАР-1 на локальный рост в простате и влияет ли ЗТЕАР-1 на способность опухолей к метастазированию, особенно в лимфатические узлы и кости (М1к1 Т. е! а1., Оисо1 Век. 2001; 12: 209; Ей X. е! а1., ЬЕ. I. Саисег. 1991, 49: 938). Влияние ЗТЕАР на образование и рост опухоли в кости можно оценить путем инъекции клеток опухоли простаты в большеберцовую кость.
С помощью данного анализа также можно определить способность терапевтических композицийкандидатов, таких как, например, интратела ЗТЕАР-1, антисмысловые молекулы 8ТЕАР-1 и рибозимы, оказывать ингибиторное действие на 8ТЕАР-1.
Пример 23. Ингибирование роста опухолей 1и у|уо, опосредованное моноклональными антителами ЗТЕАР-1.
Значительный уровень экспрессии 8ТЕАР-1 в раковых тканях и поверхностная локализация 8ТЕАР-1, наряду с ограниченной экспрессией в нормальных тканях, делают 8ТЕАР-1 хорошей мишенью для терапии антителами. Аналогично, 8ТЕАР-1 может служить мишенью для иммунотерапии на основе Т-клеток. Терапевтическую эффективность МаЬ против 8ТЕАР-1 у мышиных моделей, несущих ксенотрансплантаты рака простаты человека, оценивают с использованием рекомбинантных клеточных линий, таких как РС3-8ТЕАР-1 и 3Т3-8ТЕАР-1 (см., например, 1<а1д1щ М.Е., е! а1., Игрек! Иго1., 1979, 17(1): 16-23), а также моделей, несущих ксенотрансплантаты простаты человека, таких как ЬАРС 9АЭ (ЗаЕГгаи е! а1. Р^8, 1999, 10: 1073-1078).
Влияние антитела на рост опухоли и образование метастаз исследуют, например, на мышиных моделях, несущих ортотопические ксенотрансплантаты рака простаты. Антитела могут быть неконъюгированными, как описано в данном примере, или они могут быть конъюгированными с терапевтическим средством, такие конъюгаты известны в данной области. МаЬ против ЗТЕАР-1 ингибируют формирование ксенотрансплантатов легких и простаты. МаЬ против ЗТЕАР-1 также замедляют рост развитых ортотопических опухолей и увеличивают продолжительность жизни мышей, несущих опухоль. Полученные результаты указывают на возможность применения МаЬ против ЗТЕАР-1 для лечения рака простаты на стадиях локального и запущенного заболевания (см., например, ЗаЕГгаи, Ό., е! а1., РNΑ8, 10: 1073-1078 или сайт в глобальной сети ИВЬ риак.огд/сд1/бо1/10.1073/риак.051624698).
Введение МаЬ против ЗТЕАР-1 приводит к замедлению роста развившейся ортотопической опухоли и к ингибированию метастаз в отдаленных участках, значительно увеличивая таким образом продолжительность жизни мышей, несущих опухоль. Полученные результаты показывают, что ЗТЕАР-1 является приемлемой мишенью для иммунотерапии и демонстрирует терапевтический потенциал МаЬ против ЗТЕАР-1 для лечения локального и метастазирующего рака простаты. В данном примере показано, что неконъюгированные моноклональные антитела ЗТЕАР-1 эффективно ингибируют рост ксенотрансплантатов опухоли простаты человека у мышей 8СГО; соответственно, сочетание таких эффективных моноклональных антител также является эффективным.
Ингибирование опухоли с использованием нескольких неконъюгированных МаЬ ЗТЕАР-1.
Материалы и методы.
Моноклональные антитела ЗТЕАР-1.
Моноклональные антитела против ЗТЕАР-1 получают по способу, описанному в примере, озаглавленном Получение моноклональных антител (МаЬ) ЗТЕАР-1. Способность антител связываться со ЗТЕАР-1 определяют методами ЕЫЗА, вестерн-блоттинга, ЕАСЗ и иммунопреципитации. Результаты эпитопного картирования МаЬ против ЗТЕАР-1, полученные с помощью методов ЕЫ8А и вестернблоттинга, свидетельствуют о том, что данные МаЬ распознают эпитопы на белке ЗТЕАР-1. Проводят иммуногистохимический анализ тканей и клеток рака простаты с использованием данных антител.
Моноклональные антитела выделяют из асцитов или из супернатантов гибридомных тканевых культур путем хроматографии на сефарозе, содержащей С-белок, диализуют против РВЗ, стерилизуют фильтрацией и хранят при -20°С. Определение белков проводят по методу Брэдфорда (Вю-Ваб, Негси1ек, СА). Получают терапевтическое моноклональное антитело или смесь, содержащую отдельные моноклональные антитела, и используют для лечения мышей, получающих подкожные или ортотопические инъекции ксенотрансплантатов опухолей иМ-ИС3 и СаЬи1.
Клеточные линии и ксенотрансплантаты.
Линии клеток рака простаты, РС3 и И-ЖиР, а также линию фибробластов МН 3Т3 (Американская коллекция типовых культур) поддерживают в ВРМI и ЬМЕМ соответственно, дополненных Ь-глутамином и 10% ЕВЗ.
Популяции клеток РС3-ЗТЕАР-1 и 3Т3-ЗТЕАР-1 получают путем переноса ретровирусного гена, как описано в НиЬегЕ, В.З., е! а1., Ргос. №!1. Асаб. 8сЕ И8А, 1999, 96(25): 14523.
Ксенотрансплантат ЬАРС-9, который экспрессирует рецептор андрогенов дикого типа и продуцирует специфический антиген простаты (РЗА), пересаживают самцам мышей ГСВ с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (8СГО) (Тасошс Еагтк) возрастом 6-8 недель путем п.к. имплантации с помощью трокара (СгаЕ!, Ν., е! а1., №11. Меб. 1999, 5: 280). Суспензионные культуры опухолевых клеток ЬАРС-9 получают по способу, описанному СгаЕ!, е! а1.
- 99 014870
Мышиные модели, несущие ксенотрансплантаты.
Подкожные (п.к.) опухоли получают путем инъекции 1х10б раковых клеток, смешанных в соотношении 1:1 с матригелем (Со11аЬога!гуе ВекеагсЬ), в правый бок самцов мышей ЗСГО. Чтобы определить влияние антитела на формирование опухоли, инъекции антитела начинают в тот же день, что и инъекции раковых клеток. Контрольным мышам вводят либо очищенный мышиный (ТСХ), либо РΒδ, либо очищенное моноклональное антитело, которое распознает другой антиген, не экспрессирующийся в клетках человека. В предварительных исследованиях не было обнаружено различия в воздействии мышиного или РΒδ на рост опухоли. С помощью штангенциркуля определяют размеры опухолей и рассчитывают объем опухолей по формуле длинах ширинах высота. Мышей, у которых размер опухоли превышает в диаметре 1,5 см, умерщвляют.
Ортотопические инъекции проводят под анестезией кетамином/ксилазином. При ортотопических исследованиях делают разрез стенки живота, открывая простату, и опухолевые клетки ЬАРС или РСЗ (5х105), смешанные с матригелем, вводят в капсулу простаты в объеме 10 мкл. Рост опухолей отслеживают путем еженедельных пальпаций мышей и анализов крови на уровень РδА. Мышей разделяют на группы, которым в.б. вводят МаЬ против 8ТЕАР-1 или контрольные МаЬ.
МаЬ против δТЕАР-1 ингибируют рост ксенотрансплантатов раковых опухолей, экспрессирующих 8ТЕАР-1.
Влияние МаЬ против δТЕАР-1 на формирование опухоли анализируют путем применения ортотопических моделей ЬНСаР и ЬАРС-9. По сравнению с п.к. моделью опухоли ортотопическая модель, для получения которой опухолевые клетки вводят непосредственно в мышиную простату соответственно, приводит к локальному росту опухоли, развитию метастаз в удаленных участках, ухудшению здоровья мыши и последующей смерти (8айгап О., е! а1., РNАδ, приведено выше). Благодаря данным признакам ортотопическая модель лучше отражает развитие человеческого заболевания и позволяет отслеживать терапевтический эффект МаЬ на клинически релевантных конечных событиях.
Соответственно, опухолевые клетки вводят в мышиную простату и через 2 дня мышей разделяют на две группы, которые обрабатывают либо а) 200-500 мкг АЬ против ЗТЕАР-1, либо Ь) РВЗ три раза в неделю в течение 2-5 недель.
Основным преимуществом ортотопических раковых моделей является то, что они позволяют исследовать развитие метастаз. Образование метастаз у мышей, несущих развившиеся ортотопические опухоли, исследуют с помощью анализа ГНС на срезах легкого с использованием антитела против опухолеспецифического клеточного поверхностного белка, такого как антитело против СК20 в случае рака простаты (Ьш δ. е! а1., Сапсег Ое!ес! Ргеу. 2001, 25: 202).
Другим преимуществом моделей раковых ксенотрансплантатов является то, что они позволяют исследовать реваскуляризацию и ангиогенез. Опухолевый рост отчасти зависит от развития новых кровеносных сосудов. Хотя капиллярная система и развивающаяся кровеносная сеть по происхождению относятся к хозяину, инициация и архитектура реваскуляризации регулируются опухолью ксенотрансплантата (Оау1боГТ А.М. е! а1., С1ш. Сапсег Век. 2001, 7: 2870; 8о1евдк О. е! а1., Еиг. Е Сапсег С1т. Опсо1. 1984, 20: 1295). Влияние антител и маленьких молекул исследуют с помощью известных в данной области методов, таких как анализ опухолевых тканей и их микроокружения методом ШС.
Мышам, несущим развившиеся ортотопические опухоли, вводят 1000 мкг либо МаЬ против ЗТЕАР-1, либо РВЗ в течение 4-недельного периода. Мышей из обеих групп оставляют для развития большой массы опухоли, чтобы обеспечить высокую вероятность образования метастаз в легких мышей. Затем мышей умерщвляют и анализируют их мочевые пузыри, печени, кости и легкие на присутствие опухолевых клеток методом ШС. Данные исследования демонстрируют широкую противоопухолевую эффективность антител против ЗТЕАР-1 при инициации и развитии рака простаты у мышиных моделей, несущих ксенотрансплантат. Антитела против ЗТЕАР-1 ингибируют образование опухолей, а также замедляют рост уже развившихся опухолей и увеличивают продолжительность жизни обработанных мышей. Более того, МаЬ против ЗТЕАР-1 сильно ингибируют распространение локальной опухоли простаты в отдаленные участки даже в случае большой массы опухоли. Таким образом, МаЬ против ЗТЕАР-1 оказывают эффективное влияние на большую часть клинически релевантных конечных событий (опухолевый рост), продолжительность жизни, состояние здоровья.
Влияние МаЬ против ЗТЕАР-1 на рост ксенотрансплантатов рака простаты человека у мышей.
Используют самцов мышей ГСВ-ЗСГО возрастом 5-б недель (Сйаг1ек Вгуег ЬаЬога!огу, ^11ттд!оп МА). Мышей держат в контролируемых условиях в соответствии с инструкциями, приведенными в руководстве ШН по уходу за лабораторными животными и их применению. Для получения моделей, несущих ксенотрансплантат, используют андрогензависимую раковую опухоль простаты человека ЬАРС-9 АО. Исходные опухоли, обычно поддерживаемые в мышах ЗСГО, вырезают в стерильных условиях, измельчают и обрабатывают проназой (Са1ЬюсЬет, Ззп О1едо, СА). Полученные клеточные суспензии инкубируют в течение ночи при 37°С, чтобы получить гомогенные суспензии отдельных клеток.
- 100 014870
М2/92.30 и М2/120.545 против 8ТЕАР-1 анализируют в двух разных дозах, 100 и 500 мкг. В качестве контролей используют РВ8 и МаЬ против КЬН. В исследовании участвует 6 групп по 10 мышей в каждой. МаЬ вводят в.б. 2 раза в неделю, всего 12 раз, начиная со дня инъекции опухолевых клеток.
Размер опухоли измеряют штангенциркулем 2 раза в неделю. Объем опухоли рассчитывают по формуле ^2хЬ/2, где Ь - самый длинный размер; - перпендикулярный ему размер. Концентрацию Р8А в сыворотке каждого животного измеряют на 40-й день после начала обработки с помощью коммерческого набора ЕЫ8А. Чтобы учесть различия в росте опухоли и уровне Р8А между группами, используют тест Крускала-Валлиса и υ-тест Манна-Уитни. Все тесты являются двусторонними с α=0,05.
Результаты эксперимента, приведенные на фиг. 26 и 27, показывают, что М2/92.30 и М2/120.545 против 8ТЕАР-1 значительно замедляют рост ксенотрансплантата опухоли простаты человека в зависимости от используемой дозы.
Пример 24. Терапевтическое и диагностическое применение антител против 8ТЕАР-1 у людей.
Моноклональные антитела против 8ТЕАР-1 можно безопасно и эффективно использовать в применении у людей для диагностических, профилактических, прогностических и/или терапевтических целей. При проведении вестерн-блоттинга и иммуногистохимического анализа раковых тканей и раковых ксенотрансплантатов с использованием МаЬ против 8ТЕАР-1 наблюдается сильное экстенсивное окрашивание в тканях карциномы при значительно более низком уровне или отсутствии окрашивания в нормальных тканях. Детектирование 8ТЕАР-1 при карциноме и при метастазирующем заболевании демонстрирует, что МаЬ можно использовать в качестве диагностического и/или прогностического маркера. Следовательно, антитела против 8ТЕАР-1 можно использовать в диагностических применениях, таких как иммуногистохимия биопсийных образцов почек для выявления злокачественного заболевания у предполагаемых пациентов.
С помощью метода проточной цитометрии определяют, что МаЬ против 8ТЕАР-1 специфически связываются с клетками карциномы. Таким образом, антитела против 8ТЕАР-1 можно использовать для диагностики всего организма с помощью методов визуализации, таких как радиоиммуносцинтиграфия и радиоиммунотерапия (например, методы детектирования локализованных и метастазирующих злокачественных заболеваний, сопровождающихся экспрессией 8ТЕАР-1, описаны в Ро!ат1апок 8., е!. а1. Апбсапсег Нек, 20(2А): 925-948 (2000)). Сбрасывание или высвобождение внеклеточного домена 8ТЕАР-1 в межклеточную среду, например, как в случае щелочной фосфодиэстеразы В10 (Меегкоп, Н., Нера!о1оду, 27: 563-568 (1998)), позволяет осуществлять диагностическое детектирование 8ТЕАР-1 с помощью антител против 8ТЕАР-1 в сыворотке и/или образцах мочи предполагаемых пациентов.
Антитела против 8ТЕАР-1, специфически связывающиеся со 8ТЕАР-1, используются в терапевтических применениях для лечения злокачественных заболеваний, сопровождающихся экспрессией 8ТЕАР-1. Антитела против 8ТЕАР-1 можно использовать в виде неконъюгированных молекул или в составе конъюгатов, которые содержат антитела, присоединенные к одному из разных терапевтических или визуализирующих средств, хорошо известных в данной области, таких как пролекарства, ферменты или радиоактивные изотопы. В предклинических исследованиях неконъюгированные и конъюгированные антитела против 8ТЕАР-1 анализируют на эффективность предотвращения образования и ингибирования роста опухоли у мышиных моделей 8СГО, несущих раковые ксенотрансплантаты, например модели рака почек АС8-К3 и АС8-К6 (см. пример, озаглавленный Ингибирование опухолей мочевого пузыря и легких 1п хйо, опосредованное моноклональными антителами против 8ТЕАР-1). Конъюгированные и неконъюгированные антитела против 8ТЕАР-1 используют в качестве терапевтических средств в клинических испытаниях в применении к человеку либо отдельно, либо в сочетании с другими способами лечения, как описано в нижеследующих примерах.
Пример 25. Клинические испытания человеческих антител против 8ТЕАР-1 ш νί\Ό для лечения и диагностики карциномы человека.
Антитела согласно изобретению, распознающие эпитоп 8ТЕАР-1, можно использовать для лечения некоторых опухолей, таких как перечисленные в табл. I. На основе ряда факторов, включающих в себя уровень экспрессии 8ТЕАР-1, такие опухоли, как перечисленные в табл. I, в настоящее время являются предпочтительными показаниями для применения указанных антител. В сучае каждого из данных показаний успешно применяются три клинических подхода.
I) Дополнительная терапия.
При дополнительной терапии пациентов лечат антителами против 8ТЕАР-1 в сочетании с химиотерапевтическим или противоопухолевым средством и/или лучевой терапией. Первичные раковые мишени, такие как перечисленные в табл. I, лечат по стандартным схемам путем добавления антител к стандартным первой и второй линиям терапии. Схемы лечения составляют так, чтобы достичь эффективности, оцениваемой по уменьшению массы опухоли, а также возможности уменьшить обычные дозы стандартной химиотерапии. Уменьшение доз позволяет проводить дополнительную и/или пролонгированную терапию в результате уменьшения связанной с дозой токсичностью химиотерапевтического средства. Антитела против 8ТЕАР-1 участвуют в клинических испытаниях нескольких дополнительных способов лечения в сочетании с химиотерапевтическими или противоопухолевыми средствами адриамицином
- 101 014870 (при запущенном раке простаты), цисплатином (при запущенном раке головы, шеи и легкого), таксолом (при раке молочной железы) и доксорубицином (при предклиническом состоянии).
II) Монотерапия.
При применении антител против 8ТЕАР-1 в монотерапии опухолей антитела вводят пациентам без химиотерапевтического или противоопухолевого средства. В одном воплощении монотерапию проводят в клинике в применении к пациентам, страдающим от экстенсивного метастазирующего заболевания на последней стадии. У пациентов наблюдается некоторая стабилизация заболевания. Испытания показывают, что данная терапия имеет эффект у пациентов с раковыми опухолями, не поддающимися лечению.
III) Визуализирующее средство.
После присоединения радионуклида (например, йода или иттрия (131Σ, 90Υ) к антителам против 8ТЕАР-1 меченные радиоактивными изотопами антитела используют в качестве диагностического и/или визуализирующего средства. Меченые антитела, выполняющие такую роль, локализуются как на солидных опухолях, так и в участках метастазирующего поражения, содержащих клетки, экспрессирующие 8ТЕАР-1. При применении антител против 8ТЕАР-1 в качестве визуализирующих агентов данные антитела используют как вспомогательное средство при хирургическом лечении солидных опухолей как при дооперационном скрининге, так и при послеоперационном наблюдении с целью выявления оставшейся и/или рецидивирующей опухоли. В одном воплощении меченое (11%) антитело против 8ТЕАР-1 используют в качестве визуализирующего средства в фазе I человеческих клинических испытаний у пациентов, страдающих от карциномы, сопровождающейся экспрессией 8ТЕАР-1 (по аналогии см., например, Οίν§ί е! а1. I. №111. Сапсег Шк!. 83: 97-104 (1991)). Пациентов наблюдают с помощью стандартной предшествующей и последующей гамма-камеры. Полученные результаты позволяют обнаружить первичные и метастазирующие поражения.
Доза и способ введения.
Как известно рядовому специалисту в данной области, дозировочный режим можно установить путем сравнения с аналогичными продуктами, применяющимися в клинике. Так, антитела против 8ТЕАР-1 можно вводить в дозах, варьирующих от 5 до 400 мг/м2, причем более низкие дозы используются, например, по соображениям безопасности. Сродство антитела против 8ТЕАР-1 по сравнению со сродством известного антитела к его мишени является параметром, используемым специалистами в данной области для определения аналогичных дозировочных режимов. Кроме того, полностью человеческие антитела против 8ТЕАР-1 выводятся более медленно, чем химерные антитела; соответственно, вводимая пациентам доза таких полностью человеческих антител против 8ТЕАР-1 может быть ниже, возможно, в интервале от 50 до 300 мг/м2, оставаясь при этом эффективной. Измерение дозы в мг/м2, в противоположность традиционному измерению дозы в мг/кг, основано на площади поверхности и является удобной мерой дозирования, которая разработана для учета пациентов всех размеров от детей до взрослых.
Для доставки антител против 8ТЕАР-1 используют три разных способа доставки. Традиционная внутривенная доставка является стандартным способом доставки при многих опухолях. Однако в случае опухолей брюшной полости, таких как опухоли яичников, желчных протоков, других протоков и т. п., внутрибрюшинное введение может иметь преимущество, поскольку оно позволяет достичь высокой дозы антитела в районе опухоли, а также минимизировать выведение антитела. Подобным образом, некоторые солидные опухоли имеют сосудистую сеть, позволяющую осуществлять регионарную перфузию. Регионарная перфузия обеспечивает высокую концентрацию антитела в участке опухоли и минимизирует краткосрочное выведение антитела.
План клинических испытаний (СИР).
Общее представление. СИР помогает осуществить и разработать применение антител против 8ТЕАР-1 во всомогательной терапии, монотерапии и в качестве визуализирующего средства. Вначале проводят испытания, демонстрирующие безопасность, затем испытания, подтверждающие эффективность при многократном введении дозы. Для сравнения стандартной химиотерапии с сочетанием стандартной терапии и антител против 8ТЕАР-1 используют открытые исследования. Очевидно, что в качестве критерия, используемого при наборе пациентов, можно использовать уровни экспрессии 8ТЕАР-1 в опухолях пациентов, определяемые с помощью биопсии.
При проведении терапии, основанной на инфузии любого белка или антитела, факторы опасности в первую очередь связаны с (1) синдромом высвобождения цитокинов, т.е. с гипертонией, лихорадкой, дрожью, ознобом; (ίί) развитием иммунного ответа на вещество (т.е. образование у пациента человеческих антител против терапевтических антител, или ответ НАНА) и (ш) токсичностью для нормальных клеток, экспрессирующих 8ТЕАР-1. Для отслеживания каждого из указанных факторов опасности используют стандартные анализы и наблюдения. Обнаружено, что антитела против 8ТЕАР-1 являются безопасными для людей.
- 102 014870
Пример 26. Клинические испытания в применении к людям. Монотерапия человеческими антителами против §ТЕЛР-1.
Вышеописанное испытание, связанное с дополнительной терапией, показывает, что антитела против §ТΒЛР-1 являются безопасными, а во II фазе клинических испытаний подтвержают эффективность монотерапии и устанавливают оптимальный дозировочный режим. Такое испытание проводят, используя такие же факторы опасности и итоговые анализы, как и в испытании, связанном с дополнительной терапией, за исключением того, что пациенты не получают химиотерапевтического средства одновременно с антителами против §ТЕЛР-1.
Пример 27. Клинические испытания в применении к людям. Диагностическая визуализация антитела против §ТЕЛР-1.
Опять же, поскольку в пределах описанных выше факторов опасности дополнительная терапия является безопасной, проводят клинические испытания, касающиеся применения антител против §ТЕЛР-1 в качестве диагностического визуализирующего средства. Для проведения испытания используют схемы, подобные описанным в данной области, например в Όίν^ί е! а1. 1 №111. Сапсег йк!. 83: 97-104 (1991). Обнаружено, что антитела можно безопасно и эффективно использовать в диагностических целях.
Пример 28. Клинические испытания в применении к людям. Дополнительная терапия человеческими антителами против §ТЕЛР-1 в сочетании с химиотерапией, лучевой терапией и/или антигормональной терапией.
Фазу I клинических испытаний предпринимают для определения безопасности шести внутривенных доз человеческого антитела против §ТΒАР-1, используемого для лечения солидной опухоли, например рака тканей, перечисленных в табл. I. В данном исследовании оценивают безопасность однократных доз антител против §ТΒЛР-1, используемых в дополнение к введению противоопухолевого, или химиотерапевтического, или антигормонального средства, описанного в данном документе, включающего в себя, без ограничения, цисплатин, топотекан, доксорубицин, адриамицин, таксол, лупрон, 2о1абех, ЕШехт, Сакобех, Апапбгоп и т.п. Данное испытание включает в себя доставку шести однократных доз антитела против 8ТЕАР-1 с увеличением дозы антитела приблизительно от 25 до 275 мг/м2 в течение курса лечения, проводимого по следующей схеме:
День День День День День День
0 7 14 21 28 35
Доза МаЬ 25 75 125 175 225 275
мг/м2 мг/м2 мг/м2 мг/м2 мг/м2 мг/м2
Химиотерапевтическое + + + + + +
средство (стандартная доза)
Пациентов тщательно наблюдают в течение недели после каждого введения антитела и химиотерапии. В частности, у пациентов оценивают указанные выше факторы опасности:
(ί) синдром высвобождения цитокинов, т.е. гипертония, лихорадка, дрожь, озноб;
(ίί) развитие иммунного ответа на вещество (т.е. образование у пациента человеческих антител против терапевтических антител, или ответ НАНА) и (ΐϊϊ) токсичность для нормальных клеток, экспрессирующих §ТΒЛР-1. Для отслеживания каждого из указанных факторов опасности используют стандартные анализы и наблюдения. У пациентов также оценивают клинический результат, в особенности уменьшение массы опухоли, определяемое с помощью МК1 или другого метода визуализации.
Антитела против §ТΒЛР-1, которые по данным предыдущих испытаний являются безопасными и эффективными, используют во II фазе испытаний, где подтверждают их эффективность и устанавливают оптимальный дозировочный режим.
Пример 29. Идентификация и подтверждение потенциальных путей передачи сигнала.
Описано, что многие белки млекопитающих взаимодействуют с сигнальными молекулами и участвуют в регуляции сигнальных путей (1. ХеигосНет. 2001, 76: 217-223). В частности, фибронектин связан с сигнальным каскадом МАРК, регулирующим клеточный митогенез (Лапд Р., Ла Υ., СоНеп I. Β1οοά. 2002, 99:3579). В добавление к вышесказанному, белок §ТЕЛР-1 содержит несколько сайтов фосфорилирования (см. табл. ХХЦ указывающих на его связь с определенными сигнальными каскадами. С помощью методов иммунопреципитации и вестерн-блоттинга идентифицируют белки, связанные со 8ТЕАР-1 и опосредующие события передачи сигнала. §ТЕЛР-1 может регулировать несколько путей, которые, как известно, участвуют в биологии злокачественного заболевания и включают в себя фосфолипидные пути, такие как Р13К, АКТ и др., пути адгезии и миграции, в том числе РАК, КНо, Кас-1, катенин и др., а также каскады, связанные с митогенезом/выживанием, такие как ЕКК, р38 и др. (Се11 Сго\\1Н Э1ГГег. 2000, 11: 279; 1 Вю1 СНет. 1999, 274: 801; Опсодепе. 2000, 19: 3003; 1. Се11 Βίο1. 1997, 138: 913). Чтобы определить, является ли экспрессия ЗТЕАР-1 достаточной для регуляции конкретных сигнальных путей, но не для проявления другой активности, в покоящихся клетках РС3, исследуют влияние данных генов на активацию каскада р38 МАРК в клеточной линии рака простаты РС3. Активация киназы р38 зависит от ее фосфорилирования по остаткам тирозина и серина. Фосфорилированное состояние р38 можно отличить от
- 103 014870 нефосфорилированного с помощью МаЬ против фосфо-р38. Данные фосфо-специфические АЬ используют для исследования состояния фосфорилирования р38 в рекомбинантных клеточных линиях РС3.
Клетки РСЗ трансфицируют геном устойчивости к неомицину отдельно или в сочетании с геном ЗТЕАР-1 в векторе рЗВа. Клетки выращивают в течение ночи в 0,5% РВЗ, затем стимулируют 10% РВЗ в течение 5 мин в присутствии или в отсутствие 10 мкг/мг ингибитора МЕК РИ98058. Клеточные лизаты анализируют методами 12,5% ЗИЗ-РАСЕ и вестерн-блоттинга с использованием антител против фосфоЕВК (Се11 З1дпа1шд) и антител против ЕВК (2утеб). Клетки №Н-3Т3 трансфицируют геном устойчивости к неомицину отдельно или в сочетании с геном ЗТЕАР-1 в векторе рЗВа. Клетки обрабатывают по описанному выше способу, но не добавляют ингибитор МЕК. Кроме того, клетки №Н-3Т3-пео обрабатывают 10 мг/мл салицилата №а Экспрессия ЗТЕАР-1 индуцирует фосфорилирование ЕВК-1 и ЕВК-2 в сыворотке и ингибируется вышестоящим ингибитором киназы МЕК РИ98058.
В другой серии экспериментов исследуют достаточность экспрессии ЗТЕАР-1 в клеточной линии рака простаты РС3 для активации митогенного пути МАРК, а именно каскада ЕВК. Активация ЕВК зависит от фосфорилирования тирозиновых и сериновых остатков. Фосфорилированное состояние ЕВК можно отличить от нефосфорилированного с помощью МаЬ против фосфо-ЕВК. Данные фосфоспецифические АЬ используют для исследования состояния фосфорилирования ЕВК в рекомбинантных клеточных линиях РС3. Клетки РС3, экспрессирующие активированную форму ВаБ, используют в качестве положительного контроля.
Полученные результаты показывают, что в то время как экспрессия контрольного гена пео не оказывает влияния на фосфорилирование ЕВК, экспрессия ЗТЕАР-1 в клетках РС3 является достаточной для индуцирования увеличения фосфорилирования ЕВК (фиг. 28). Данные результаты подтверждают методом вестерн-блоттинга с использованием антител против ЕВК и по активации пути ЕВК под действием ЗТЕАР-1.
Поскольку РВЗ содержит несколько компонентов, которые могут вносить вклад в опосредованную рецептором активацию ЕВК, авторы исследуют влияние ЗТЕАР-1 в условиях низкого и оптимального уровней РВЗ. Клетки РС3, экспрессирующие пео или ЗТЕАР-1, выращивают в течение ночи в 0,1% или 10% РВЗ. Клетки анализируют методом вестерн-блоттинга с использованием антител против фосфоЕВК. Данный эксперимент показывает, что ЗТЕАР-1 индуцирует фосфорилирование ЕВК в 0,1% РВЗ и подтверждает, что экспрессия ЗТЕАР-1 является достаточной для индуцирования активации сигнального каскада ЕВК в отсутствие других стимулов.
Чтобы подтвердить, что ЗТЕАР-1 непосредственно или косвенно активирует известные пути передачи сигнала в клетках, проводят анализы транскрипционного репортера на основе люциферазы (1ис) в клетках, экспрессирующих отдельные гены. Данные транскрипционные репортеры содержат консенсусные участки связывания известных факторов транскрипции, которые лежат ниже хорошо охарактеризованных путей передачи сигнала. Репортеры и примеры ассоциированных факторов транскрипции, путей передачи сигнала и активирующих стимулов приведены ниже.
1. №кВ-1ис, №кВ/Ве1; П<-к1паБе/ЗАР1<; рост/апоптоз/стресс.
2. ЗВЕ-1ис, ЗВР/ТСР/ЕЬК1; МАРК/ЗАРК; рост/дифференциация.
3. АР-1-1ис, Р0З/ГОХ МАРК/ЗАРК/РКС; рост/апоптоз/стресс.
4. АВЕ-1ис, рецептор андрогенов; стероиды/МАРК; рост/дифференциация/апоптоз.
5. р53-1ис, р53; ЗАРК; рост/дифференциация/апоптоз.
6. СВЕ-1ис, СВЕВ/АТР2; РКА/р38; рост/апоптоз/стресс.
7. ТСР-1ис, ТСР/ЬеГ; катенин, адгезия/инвазия.
Опосредованные геном эффекты можно анализировать на клетках, экспрессирующих мРНК. Плазмиды, содержащие люциферазный репортер, можно вводить путем липид-опосредованной трансфекции (ТРX-50, Рготеда). Активность люциферазы как показатель относительной транскрипционной активности определяют путем инкубации клеточных экстрактов с субстратом люциферина и измерения люминесценции реакционной смеси с помощью люминометра.
Сигнальные пути, активируемые ЗТЕАР-1, картируют и используют для идентификации и оценки терапевтических мишеней. Поскольку ЗТЕАР-1 участвует в передаче клеточного сигнала, его можно использовать в качестве мишени для диагностических, прогностических, профилактических и/или терапевтических целей.
Пример 30. Участие ЗТЕАР-1 в транспорте маленьких молекул и межклеточных взаимодействиях.
При образовании и развитии опухоли происходит нарушение регуляции межклеточных взаимодействий, которые нужны для поддержания целостности органа и гомеостаза. Межклеточные взаимодействия можно анализировать с помощью двух типов методов (1. Вю1. С1ет. 2000, 275: 25207). В первом анализе клетки, нагруженные флуоресцентным красителем, инкубируют в присутствии немеченых клеток-реципиентов, после чего клеточные популяции анализируют методом флуоресцентной микроскопии. Данный качественный анализ позволяет определить изменение распределения красителя между соседними клетками. Во второй аналитической системе донорные и реципиентные клеточные популяции обрабатывают, как описано выше, после чего проводят количественное измерение популяций реципиент
- 104 014870 ных клеток методом ЕАС8. С помощью двух указанных аналитических систем клетки, экспрессирующие 8ТЕАР-1, сравнивают с контрольными клетками, которые не экспрессируют 8ТЕАР-1, и в результате обнаруживают, что 8ТЕАР-1 усиливает межклеточные взаимодействия.
На фиг. 29 показано, что 8ТЕАР-1 опосредует перенос маленьких молекул между соседними клетками и таким образом регулирует межклеточные взаимодействия в клетках рака простаты. В данном эксперименте реципиентные клетки РС3 метят конъюгатом декстран-техасовый красный в концентрации 1 мг/мл, а донорные клетки РС3 метят кальцеином АМ (зеленый). Донорные (зеленые) и реципиентные (красные) клетки совместно культивируют при 37°С, после чего с помощью микроскопии анализируют расположение техасового красного и кальцеина. Полученные результаты показывают, что, в то время как в контрольных клетках РС3 (экспрессия белка 8ТЕАР-1 не обнаруживается) перенос кальциина происходит на низком уровне, экспрессия 8ТЕАР-1 обеспечивает перенос маленьких молекул между клетками, и в результате совместной локализации красных и зеленых молекул изначально красные реципиентные клетки приобретают коричневатый цвет. Маленькие молекулы и/или антитела, которые модулируют межклеточные взаимодействия, опосредуемые 8ТЕАР-1, можно использовать для лечения злокачественных заболеваний, сопровождающихся экспрессией 8ТЕАР-1.
На фиг. 30 показано, что для переноса маленьких молекул требуется, чтобы экспресссия 8ТЕАР-1 происходила как в донорных, так и в реципиентных популяциях. В данном эксперименте клетки РС3 трансфицируют геном устойчивости к неомицину отдельно или вместе с геном 8ТЕАР-1 в векторе р8На. Реципиентные клетки метят конъюгатом декстран-техасовый красный в концентрации 1 мг/мл, а донорные клетки метят кальцеином АМ в концентрации 2,5 мкг/мл. Донорные (зеленые) и реципиентные (красные) клетки совместно культивируют при 37°С в течение 18-24 ч, после чего с помощью микроскопии анализируют расположение флуоресцентных красителей. Верхние секторы: оптическая микроскопия. Нижние секторы: УФ-флуоресценция. Левые секторы: в качестве доноров и реципиентов используют клетки РС3-иео. Центральные секторы: в качестве донорных клеток используют РС3-иео, а в качестве реципиентных клеток используют РС3-8ТЕАР-1. Правые панели: в качестве доноров и реципиентов используют клетки РС3-8ТЕАР-1. Межклеточные взаимодействия детектируют только в том случае, если 8ТЕАР-1 экспрессируется и на донорных, и на реципиентных клетках.
Полученные результаты показывают, что при совместном культивировании контрольных клеток РС3 и клеток РС3 перенос кальцеина не наблюдается. Подобным образом, при совместной инкубации контрольных клеток РС3 и клеток РС3-8ТЕАР-1 перенос кальцеина не наблюдается. Однако при совместном культивировании донорных клеток РС3-8ТЕАР-1 и реципиентных клеток РС3-8ТЕАР-1 происходит перенос маленьких молекул, определяемый по совместной локализации зеленого и красного красителей в одних и тех же клетках. Взятые вместе результаты, приведенные на фиг. 29 и 30, демонстрируют, что 8ТЕАР-1 опосредует перенос маленьких молекул и регулирует межклеточные взаимодействия путем образования каналов межклеточного взаимодействия, которые функционально подобны щелевидным контактам.
Кроме того, подтверждают влияние М2/120.545 8ТЕАР-1 на щелевой контакт (см. фиг. 31). В данном эксперименте клетки РС3 трансфицируют геном устойчивости к неомицину отдельно или вместе с геном 8ТЕАР-1 в векторе р8На. Реципиентные клетки метят конъюгатом декстран-техасовый красный в концентрации 1 мг/мл, а донорные клетки метят кальцеином АМ в концентрации 2,5 мкг/мл. Донорные (зеленые) и реципиентные (красные) клетки совместно культивируют при 37°С в течение 18-24 ч, после чего с помощью микроскопии анализируют расположение флуоресцентных красителей. Во всех экспериментах в качестве доноров и реципиентов используют одинаковые клетки. Клетки инкубируют с указанными количествами МаЬ 8ТЕАР-1/120.545 в течение 10 мин перед внесением в планшеты, затем МаЬ оставляют в культуре на 24 ч до анализа. 8ТЕАР-1/120.545 уменьшает щелевой контакт, опосредованный 8ТЕАР-1, в зависимости от используемой дозы. Полученные результаты показывают, что 8ТЕАР-1/120.545 уменьшает щелевой контакт, опосредованный 8ТЕАР-1, в зависимости от используемой дозы.
Таким образом, поскольку 8ТЕАР-1 участвует в межклеточных взаимодействиях и транспорте маленьких молекул, его можно использовать в качестве мишени для диагностических, прогностических, профилактических и/или терапевтических целей.
Пример 31. Интерференция РНК (РНКи).
Технологию интерференции РНК (РНКи) используют в ряде клеточных анализов, применяющихся в онкологии. РНКи представляет собой посттранскрипционный механизм молчания гена, активируемый двухцепочечными РНК (дцРНК). РНКи индуцирует деградацию специфической мРНК, приводящую к изменению экспрессии белка и, следовательно, функции гена. В клетках млекопитающих указанные дцРНК, называемые короткие интерферирующие РНК (киРНК), имеют правильный состав для активации пути РНКи, направленного на деградацию, особенно некоторых мРНК (см., Е1Ьа8Ыг 8.М., е!. а1., Энр1ехе8 оГ 21-иие1еойбе КNΑ8 Меб1а!е КNΑ т!ег£егеиее т Си1!игеб МаттаНаи Се118, №!иге, 411(6836): 494-8 (2001)). Таким образом, технология РНКи успешно используется в клетках млекопитающих для выключения целевых генов.
- 105 014870
Утрата контроля за пролиферацией является отличительным признаком раковых клеток; следовательно, целесообразно определить значение 8ТЕАР-1 в процессах выживания/пролиферации клеток. Соответственно, для исследования функции антигена 8ТЕАР-1 используют РНКи. Чтобы получить киРНК для 8ТЕАР-1, используют алгоритмы, позволяющие предсказать структуру олигонуклеотидов, которые обладают критическими молекулярными параметрами (содержание С:С, температура плавления и др.) и обладают способностью значительно уменьшать уровни экспрессии белка 8ТЕАР-1 при введении в клетки. Соответственно, одной из целевых последовательностей киРНК 8ТЕАР-1 является: 5'-ААССТСАТТСТАСССССАААТ-3' (8Еф ГО N0: 81). В соответствии с данным примером используют композиции киРНК 8ТЕАР-1, которые содержат киРНК (двухцепочечную короткую интерферирующую РНК), соответствующую нуклеотидной последовательности ОКЕ белка 8ТЕАР-1 или ее субпоследовательностям. Так, используемые в данном способе киРНК, как правило, содержат 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 или более смежных нуклеотидов РНК в длину. Данные последовательности киРНК являются комплементарными и некомплементарными по меньшей мере части кодирующей последовательности мРНК. В предпочтительном воплощении субпоследовательности содержат 19-25 нуклеотидов в длину, наиболее предпочтительно 21-23 нуклеотидов в длину. В предпочтительных воплощениях указанные киРНК вызывают снижение уровня антигена 8ТЕАР-1 в клетках, экспрессирующих данный белок, и имеют функциональные эффекты, как описано ниже.
Выбранные киРНК (олиго 8ТЕАР-1.Ь) анализируют на жизнеспособность/пролиферацию ряда клеточных линий методом МТ8 (позволяющим измерять метаболическую активность клеток). Колориметрические анализы с применением тетразолия (т.е. МТ8) позволяют точно детектировать жизнеспособные клетки, поскольку живые клетки являются метаболически активными и, следовательно, в отличие от мертвых клеток могут восстанавливать соли тетразолия до окрашенных соединений формазана. Более того, указанный олиго 8ТЕАР-1.Ь вызывает снижение уровня антигена 8ТЕАР-1 в клетках, экспрессирующих данный белок, и имеет функциональные эффекты, как описано ниже с использованием нижеследующих способов.
Трансфекция киРНК млекопитающих.
За 1 день до трансфекции киРНК разные клеточные линии помещают в среду (КΡМI 1640, содержащая 10% ЕВ8 в отсутствие антибиотиков) в количестве 2х103 клеток/лунку в объеме 80 мкл (в формате 96-луночного планшета), чтобы провести анализ жизнеспособности/МТ8. В каждом эксперименте параллельно со специфическими олиго-киРНК 8ТЕАР-1 используют следующие контроли:
a) клетки Моск, трансфицированные липофектамином 2000 (Iиν^ΐ^одеи, СагЕЬаб, СА) и буфером для отжига (не содержащим киРНК);
b) киРНК, специфичные для люциферазы-4 (целевая последовательность:
5'-ААСССАССААСАССААСАСииСТТ-3') (8Еф ГО 82); и
c) Ед5-специфические киРНК (целевая последовательность: 5'-ААСТСААСАССТСААСАСААТАА-3') (8ЕО ГО NО: 83). Конечная концентрация киРНК составляет 10 нМ, а липофектамина 2000 - 1 мкг/мл.
Анализ проводят следующим способом. Вначале киРНК разбавляют ОРТГМЕМ (не содержащая сыворотки среда для трансфекции, Iиν^ΐ^одеи) до концентрации 0,1 мкМ (в 10 раз выше, чем концентрация в реакционной смеси) и инкубируют 5-10 мин при комнатной температуре (к.т.). Липофектамин 2000 разбавляют до концентрации 10 мкг/мл (в 10 раз выше, чем концентрация в реакционной смеси) для общего числа трансфекции и инкубируют 5-10 мин при к.т. Подходящее количество разбавленного раствора Липофектамин 2000 с 10-кратным превышением концентрации смешивают в соотношении 1:1 с разбавленным раствором киРНК с 10-кратным превышением концентрации и инкубируют при к.т. в течение 20-30 (раствор для трансфекции с 5-кратным превышением концентрации). Перед анализом 20 мкл раствора для трансфекции с 5-кратным превышением концентрации добавляют к соответствующим образцам и инкубируют при 37°С в течение 96 ч.
Анализ МТ8.
Анализ МТ8 представляет собой колориметрический метод определения числа жизнеспособных клеток в анализах пролиферации, цитотоксичности или чувствительности к химиотерапевтическим препаратам с применением соединения тетразолия [внутренняя соль 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-5-(3карбоксиметоксифенил)-2-(4-сульфофенил)-2Н-тетразолия; МТ8 (Ь)] и электрон-присоединяющего реагента (этосульфат феназина, РЕ8). Анализы проводят путем добавления небольшого количества раствора реагента непосредственно в культуральные лунки, инкубации в течение 1-4 ч и регистрации поглощения при 490 нм с помощью планшет-ридера для 96-луночных планшет. Количество окрашенного формазанового продукта, определяемое по величине поглощения при 490 нм, прямо пропорционально митохондриальной активности и/или числу живых клеток в культуре.
- 106 014870
Чтобы выяснить функцию 8ТЕАР-1 в клетках, 8ТЕАР-1 выключают путем трансфекции клеточных линий, эндогенно экспрессирующих 8ТЕАР-1. Как изображено на фиг. 32, фосфорилирование и ЕКК-1, и ЕКК-2 индуцируется 10% сывороткой и ингибируется Мак М2/92.30 и киРНК 8ТЕАР-1. В данном эксперименте клетки РС3 трансфицируют геном устойчивости к неомицину отдельно или вместе с геном 8ТЕАР-1 и Мак в векторе р8Ка. Для удаления РНКи клетки РС3-8ТЕАР-1 стабильно трансфицируют вектором рРиК-и6-27-8ТЕАР-1, содержащим киРНК 8ТЕАР-1. Клетки держат в условиях недостаточного количества питательных веществ в 0,1% ЕВ8 в течение 18 ч при 37°С, затем помещают на лед, где держат в течение 10 мин в присутствии или в отсутствие 10 мкг/мл Мак М2/92.30, после чего в течение 3 мин нагревают до к.т. и стимулируют 10% ЕВ8 в течение 5 мин. Клетки лизируют в буфере К1РА, лизаты целых клеток анализируют методом 12,5% 8^8-РЛСЕ. а белки детектируют методом вестернблоттинга. Фосфо-ЕКК детектируют с помощью кроличьей антисыворотки (Се11 81дпа1шд), а ЕКК детектируют с помощью кроличьих антител против ЕКК (2утеб). 8ТЕАР-1 детектируют с помощью овечьих антител против 8ТЕАР-1, а актин детектируют с помощью Мак против актина (8ап!а Сгих).
Кроме того, как изображенно на фиг. 33, специфические РНКи 8ТЕАР-1, стабильно экспрессирующиеся в клетках РС3-8ТЕАР-1, уменьшают индуцированные 8ТЕАР-1 межклеточные взаимодействия. В данном эксперименте клетки РС3 трансфицируют геном устойчивости к неомицину отдельно или вместе с геном 8ТЕАР-1 в векторе р8Ка.
Для удаления РНКи клетки РС3-8ТЕАР-1 стабильно трансфицируют вектором рРиК-И6-27-8ТЕАР1, содержащим киРНК 8ТЕАР-1, или пустым вектором. Реципиентные клетки метят конъюгатом декстран-техасовый красный в концентрации 1 мг/мл, а донорные клетки метят кальцеином АМ в концентрации 2,5 мкг/мл. Донорные (зеленые) и реципиентные (красные) клетки совместно культивируют при 37°С в течение 18-24 ч, после чего с помощью микроскопии анализируют расположение флуоресцентных красителей. Во всех экспериментах в качестве доноров и реципиентов используют одинаковые клетки.
Другое воплощение согласно изобретению относится к методу анализа пролиферации клеток, экспрессирующих 8ТЕАР-1, путем измерения синтеза ДНК как маркера пролиферации. Используют меченные (например, 3Н-тимидином) предшественники ДНК и количественно определяют их включение в ДНК. Включение меченого предшественника в ДНК прямо пропорционально числу клеточных делений в культуре. Другим способом измерения клеточной пролиферации являются клоногенные анализы. В данных анализах определенное число клеток помещают на подходящую подложку и считают число колоний, образовавшихся через определенный период инкубации после обработки киРНК.
При оценке раковой мишени 8ТЕАР-1 в дополнение к анализу жизнеспособности/пролиферации клеток используют анализы, связанные с апоптозом и клеточным циклом. Отличительным биохимическим признаком апоптотического процесса является фрагментация геномной ДНК, необратимое событие, приводящее к гибели клетки. Фрагментированную ДНК в клетках можно обнаружить путем иммунологического детектирования комплексов гистона с фрагментами ДНК с помощью иммунологического анализа (например, ЕЫ8А для детектирования клеточной гибели), который позволяет определять обогащение цитоплазмы апоптотических клеток комплексами гистона с фрагментами ДНК (моно- и олигонуклеосомами). Данный анализ не требует предварительного мечения клеток и позволяет детектировать деградацию ДНК в клетках, которые не пролиферируют ш νίΙΐΌ (например, свежевыделенные опухолевые клетки).
Наиболее важную роль в запуске апоптотической гибели клеток играют эффекторные молекулы, называемые каспазами. Каспазы представляют собой протеазы, которые при активации расщепляют многочисленные субстраты по аспартатному остатку карбоксиконцевого участка, опосредуя наиболее ранние стадии апоптоза. Все каспазы синтезируются в виде проферментов, активация которых включает в себя расщепление по аспартатным участкам. В частности, по-видимому, каспаза 3 играет ключевую роль в инициации клеточных событий апоптоза. Анализы активации каспазы 3 позволяют детектировать ранние события апоптоза. После обработки РНКи детектирование методом вестерн-блоттинга активной каспазы 3 или продуктов протеолитического расщепления (например, РАКР) в апоптотических клетках дополнительно подтверждает индукцию апоптоза. Поскольку клеточные механизмы, приводящие к апоптозу, являются сложными, каждый из них имеет свои преимущества и ограничения. Другие критерии/ключевые моменты, такие как клеточная морфология, конденсация хроматина, протекание мембраны, апоптотические тельца, помогают дополнительно подтвердить клеточную гибель как апоптотическую. Поскольку не все генные мишени, которые регулируют клеточный рост, являются антиапоптотическими, получают профиль содержания ДНК или профиль клеточного цикла путем измерения содержания ДНК в клетках с нарушенной проницаемостью мембраны. Ядра апоптотических клеток содержат меньше ДНК вследствие ее утечки в цитоплазму (популяция суб-С1). Кроме того, окрашивание ДНК (например, йодидом пропидия) также позволяет различить разные фазы клеточного цикла в популяции клеток, поскольку в фазах С0/С1, 8 и С2/М присутствует разное количество ДНК. С помощью данных анализов можно количественно определить субпопуляции.
- 107 014870
Что касается гена 8ТЕАР-1, исследования РНКи облегчают понимание вклада генного продукта в раковые пути. Такие активные молекулы РНКи можно использовать в скрининге Май для идентификации соединений, обладающих противоопухолевой активностью. Кроме того, киРНК можно вводить раковым пациентам в качестве терапевтических средств, уменьшающих злокачественный рост при разных типах рака, включающих в себя перечисленные в табл. I. Поскольку δТЕΆР-1 участвует в таких процессах, как выживание, клеточная пролиферация, онкогенез или апоптоз, его можно использовать в качестве мишени для диагностических, прогностических, профилактических и/или терапевтических целей.
Пример 32. Модулирование функции δТЕΆР-1.
Транспорт ионов играет важную роль в регуляции клеточного роста, внутриклеточной проницаемости, транспортировке молекул и передаче сигналов (Мшке В. Се11 Мо1. №игойю1. 2001, 21: 629; Со1оута е! а1., Ат. 1. Рйукю1 Неаг! С1гс Рйукю1. 2001, 280: Н746), данные функции особенно характерны для неопластического состояния. Межклеточные взаимодействия регулируют гомеостаз, клеточную пролиферацию и гибель клеток (Еуапк ^.Н., Магйп Р.Е. Мо1. Метйг. Вю1. 2002, 19: 121; Саггийа С, е! а1., Апп, ΝΥ, Аса!. δα. 2002, 963: 156), данные функции также особенно характерны для неопластического состояния.
Ингибиторы функции δТЕΆР-1 идентифицируют, используя контрольные клеточные линии и клеточные линии, экспрессирующие 8ТЕАР-1. Например, клетки РС3 и РС3^ТЕАР-1 инкубируют в присутствии и в отсутствие Май или маленьких ингибиторных молекул. Эффект данных Май или маленьких ингибиторных молекул исследуют с использованием описанных выше анализов ионных потоков, межклеточных взаимодействий, пролиферации и сигнальных путей.
Передачу сигнала и биологический результат, опосредованный переносчиками, можно модулировать посредством разных механизмов, включающих в себя ингибирование связывания рецептора и лиганда, применение ионных антагонистов, белковые взаимодействия, регуляцию транспорта ионов и маленьких молекул и др. (Тапд ^. е! а1., Ргоп! Вюксц 2002, 7: 1583). Модуляторы (ингибиторы или усилители) функции δТЕΆР-1 идентифицируют, используя контрольные клеточные линии и клеточные линии, экспрессирующие 8ТЕАР-1. Например, клетки РС3 и РС3^ТЕАР-1 инкубируют в присутствии и отсутствие Май или маленьких модуляторных молекул. В качестве модуляторов функций 8ТЕАР-1, раскрытых в данном документе, в контексте согласно изобретению можно использовать блокаторы ионных каналов, которые включают в себя такие соединения, как амлодипин, азулен, лигидропиридины, тианины, нифедин, верапамил и их производные (Тапака Υ., δЫдеηοйи К. Саг!юуакс Эгид Веу. 2001, 19: 297; Ц]ипс Ό., М1!гоу1с V., 1акоу1)еу1с V. Аг/те1тЦ1е1Гогкс11ипд. 2002, 52: 365; Коште II., \Уоо! Н.В. Ргод. ВюрЬук. Мо1. Вю1. 2000; 73: 91); и ингибиторы межклеточных взаимодействий, которые включают в себя такие соединения, как бета-глицирретиновая кислота, ретиноиды, ТРА (Кги!оукк1кй V.А. е! а1., Опсодепе. 2002, 21: 1989; Ви!кш е! а1., I. 8игд. Век. 2002, 103: 183; Висй I. е! а1., I. Се11 Вюсйет. 2001, 83: 163). Соответственно, эффект(ы) Май или маленьких ингибиторных молекул исследуют с использованием анализов ионных потоков, межклеточных взаимодействий, пролиферации и сигнальных путей, описанных в приведенных выше примерах.
Если Май и маленькие молекулы модулируют, например ингибируют транспорт и онкогенную функцию 8ТЕАР-1, их используют для профилактических, прогностических, диагностических и/или терапевтических целей.
В данном изобретении приводятся ссылки на данные, содержащиеся на разных тей-сайтах, а также на разные публикации, патентные заявки и патенты (\УеЬ-сайты указываются по унифицированному указателю ресурса, или ИВЬ, адресам глобальной сети). Раскрытие каждой из указанных ссылок настоящим включается в данное описание в качестве ссылки во всей полноте.
Объем согласно изобретению не следует ограничивать раскрытыми в данном описании воплощениями, которые предлагаются только для иллюстрации отдельных аспектов согласно изобретению, причем все фунционально эквивалентные воплощения входят в объем согласно изобретению. Различные модификации моделей и методов согласно изобретению, в добавление к описанным в данном документе, которые станут очевидными для специалистов в данной области из вышеприведенных описания и разъяснений, также входят в объем согласно изобретению. Такие модификации или другие воплощения могут быть осуществлены без отступления от объема и сущности согласно изобретению.
- 108 014870
Таблицы
Таблица 1 Ткани, экспрессирующие 8ТЕАР-1 при малигнизации
Таблица II
Сокращенные названия аминокислот
Однобуквенное обозначение Трехбуквенное обозначение Полное название
Р РЬе фенилаланин
Е Ьеи лейцин
3 Зег серин
Υ Туг тирозин
с Суз цистеин
N Тгр триптофан
Р Рго пролин
н Ηίθ гистидин
с 61п глутамин
ц Агд аргинин
I Не изолейцин
м МеЬ метионин
т ТНг треонин
N Азп аспарагин
К. Ьуз лизин
V Уа1 валин
А А1а аланин
Ц Азр аспарагиновая кислота
Е <51 и глутаминовая кислота
с е1у глицин
- 109 014870
Таблица Ш(А) Матрица аминокислотных замен
Матрица аминокислотных замен адаптирована с помощью программного обеспечения ССС 9.0 ВЬО8ИМ62 (матрица с заменой блоков). Чем выше значение, тем больше вероятность обнаружения замены в родственных, природных белках (см. \\'еЬ-сайт ИВЬ 1кр.ишЬе.сй/тапиа1/Ь1окит62.Ыт1)
Ά С ϋ Е г С И I К ь м N 2 Н 8 т V И Υ .
4 0 “2 -2 0 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1 -1 -1 1 0 0 -3 -2 А
9 “3 -4 -2 -3 -3 -1 -3 -1 -1 -3 -3 -3 -3 -1 -1 -1 -2 -2 С
6 2 -3 -1 -1 -3 -1 -4 -3 1 -1 0 -2 0 -3 -4 -3 О
5 -3 -2 0 -3 1 -3 -2 0 -1 2 0 0 -1 -2 -3 -2 Ξ
6 -3 -1 0 -3 0 0 -3 -4 -3 -3 -2 -2 -1 1 3 Н1
6 -2 -4 -2 -4 -3 0 -2 -2 -2 0 -2 -3 ~2 “3 6
9 -3 -1 “3 -2 1 -2 0 0 -1 -2 -3 -2 2 н
4 -3 2 1 -3 -3 -3 -3 -2 -1 3 -3 -1 I
5 -2 -1 0 -1 1 2 0 -1 -2 -3 -2 к
4 2 -3 -3 -2 -2 2 -1 1 ~2 -1 ь
Б -2 -2 0 -1 -1 -1 1 -1 -1 м
6 -2 0 0 1 0 -3 -4 -2 N
7 -1 -2 -1 -1 -2 -4 -3 Р
5 1 0 -1 -2 -2 -1 0
-1 -1 -3 -3 -2 а
1-2-3-23
0 -2 -2 Т
-3 -1 V
2 И
У
Таблица Ш(В)
Исходный остаток Консервативная замена
А1а (А) С1у; Зег; Уа1
Агд (К) Буз
Азп (Ν) С1п; Н13
Азр (Ώ) С1и
Суз (С) Зег
<31п (0) Азп, Ηίε
С1и (Е) Азр
С1У (О А1а,- Рго
ΗΪ3 (Н) Азп; <31п
Не (1) Беи,- Уа1
Беи (Б) Не; Ча1
Буз (К) Агд,- С1п; С1и
Мер (М) Беи; Туг; Не; Уа1
Рйе (Е) Мер; Беи; Туг
Зег (3) ТУ1Г
Т11Г (Т) Зег
Тгр (И) Туг
Туг (Υ) Тгр; РЬе
Уа1 (V) Не; Беи; А1а
- 110 014870
Таблица ГУ(А)
Супермотивы/мотивы НЬА класса I
СУПЕРМОТИВ ПОЛОЖЕНИЕ ПОЛОЖЕНИЕ ПОЛОЖЕНИЕ
2 (Первичный якорный фрагмент) 3 (Первичный якорный фрагмент) С-конеи (Первичный якорный фрагмент)
А1 Л1УМЗ ШУ
А2 ПУМА ТО ΝΜΑ.Π
АЗ У8МА71/ кк
А24 УРЕИШМТ НУИШ
В7 Р УНЕМИ/УД
В27 кнк РПЕШУА
В44 ЕР ИАЫМУА
858 АТЗ рулъша
В62 оишр ’ΡΝΥΜΙ'ΛΑ
МОТИВЫ
А1 Т8М Υ
А1 РЕА5 Υ
А2.1 и/мзит чимлт
АЗ 1МУ15АТРС6Р ΚϊΚΗΡΑ
А11 утмизлбысор ΚΡΥΗ
А24 γρνίΜ Είΐνν
А*3101 МУТАЛЗ κκ
А*3301 МУАЬР/ЗГ κκ
А*63С1 А¥шзи ' κκ
ΒΌ702 Р ίΜΡΜΎΑΨ
В*3501 Р гмгамУА
В51 Р НУРИУАМ
В*5301 Р иигагуму
В*5401 Р АТШОУ
Жирным шрифтом выделены предочтительные остатки, курсивом выделены менее предочтительные остатки. Считается, что пептид несет мотив, если он содержит первичные якорные фрагменты в каждом якорном положении мотива или супермотива.
Таблица £У(В)
Супермотив НЬА класса II
1 6 9
Η, Ρ, Υ, V, I, ь А, V, I, Ь, Ρ, С, £, Τ А, V, I, Ь, С, 8, Τ, Μ, Υ
Таблица £У(С)
Мотивы НЬА класса II
Рякорь 1 2 3 4 5 1° якорь 6 7 8 9
βΚ4 предпочтительный вредный ΡΜΥί/УИ/ М т νν I УЗТСРАШ мн Е МН ТОЕ
№1 предпочтительный вредный МШИФУ С СН РАМО Ρβ СТО УМАТЗШС м 6ϋΕ β АУМ
0Н7 предпочтительный вредный МР1МФУ м с νν А Θ К'МЗАСТЯ м ΘΕΌ N IV Θ
2ВЗ мотивы Предпочтительный мотив а Предпочтительный мотив Ь )· якорь 1 нумгу ίΐνΜΗΑΥ 2 3 1е якорь 4 β βΝΟΕ3Τ 5 1° якорь 6 ккн
Сулермотив Ой. МР!АШ УМЗТАСРЭ
Курсивом выделены менее предпочтительные или допустимые остатки.
- 111 014870
Таблица Ιν(Ό)
СУПЕРМОТИВЫ ПОЛОЖЕНИЕ: Супермотивы ΗΕΑ класса Ι 8 С-конец
1 2 3 4 5 6 7
Α1 Ίβ Якорь 1° Якорь
Т11Ш5 гЖ
А2 “Якорь 1* Якорь
нумато ШИАТ
АЗ предпочтительный Ί °Якорь γρνν γρνν γρνν Р 1° Якорь
У5МАШ (4/5) (3/5) (4/5) (4/5) РК
вредный ϋΕ(3/5); 0Е
Р (5/5) .(4/5)
А24 1 “ Якорь Ί “Якорь
УЕИЖМТ ΡΙΥΙ4ΐΛί
В7 предпочтительный ΡΤνΎ 1 ° Якорь ρννγ ЕЖ 1 “Якорь
□УМ (3/5) Р (4/5) (3/5) νίΙΡΜΚΥΑ
вредный ДЕ (3/5); РЕ 6 ΟΝ ϋΕ
Р(5/5); (3/5) (4/5) (4/5) (4/5)
6(4/5);
А(3/5); ΟΝ(3/5)
В27 10 Якорь кнк 1Якорь РгШМКД
В44 1“ Якорь 1° Якорь
ЕО РЖЫМУА
В58 1 Якорь 1° Якорь
АТ5 РУМ1М!А
В62 1 “Якорь 1 ’ Якорь
ООИМР
Курсивом выделены менее предпочтительные или допустимые остатки.
- 112 014870
Таблица ΑίΈ) Мотивы НЬА класса I
ПОЛОЖЕНИЕ: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 С-конец
или С-конец
А1 Предпоч- егм 1 “Якорь βΕΑ ΎΕνν Р ΒΕΟΝ ΥΡ1Λ1 Ί “Якорь
9-тег эта Υ
вредный ОЕ кнкнумр а С А
А1 Предпоч- СЯНК азтсиум 1 “Якорь СЗТС АЗТС υνΜ βΕ Ί “Якорь
^»|γΐθρ тательньтй βΕΑ 8 Υ
вредный А ρηκοερυριλ/ ΒΕ ΡΟΝ РНК РС СР
Предпоч- УРИ 10 Якорь С-ЕАОМ А ΥΡΛΌΝ ΡΑδΤΟ СОЕ ₽ Ί “Якорь
10- тигельный зтм Υ
тег
вредный 6Р кнксиум се КИК ΟΝΑ ΡΗΚΥΡΛ'ΚΗΚ А
Д1 Предпоч- γρνν ЭТСИУМ Ί “Якорь А γρνν РС Θ γρνν Ί “Якорь
•|0_ тигельный βΕΑ5 Υ
тег
вредный ЯНК ННКОЕРУРУ/ Р С ΡΡΗΚ ΟΝ
А2.1 Предпоч- ΥΠΑ1 “Якорь γτνν 5ТС γρνν А Ρ Ί “Якорь
θ-тег ίΛΙ/νΟΑΓ 'ΛΙΜΑΤ
вредный βΕΡ ОЕВКН ккн ΒΕΚΚΗ
ПОЛОЖЕНИЕ:! 1 3 4 5 6 7 8 9
С-конец
А2.1 Предпоч- ДУГИ 1 “Якорь ΙΛ'ΙΜ С 6 ΡΥΜ 1 “Якорь
|θ, тигельный 1.1ЖСДГ νΐΜ УШАТ
тег
вредный ВЕР βΕ ККНА Р ΡΚΗ ΒΕΚΚΗΚΚΗ
АЗ Предпоч- кнк 1 “Якорь ΥΗΝ ΡΚΗΚΥΡ А ΥΓΜ Ρ Ί “Якорь
тигельный илмбатрссо Щ ΚΥΡ,ΗΡΑ
вредный βΕΡ ΒΕ
А11 Предпоч- А 1 “Якорь γρνν γρνν А γρνν γρνν Ρ 1 “Якорь
тм тельный νΤίΜίεΑΘΝΟΟ №УЯ
вредный ВЕР А 6
А24 Предпоч- ΥΕΥΙΗΗΚ 1“Якорь $тс γρνν γρνν 1 “Якорь
9-тег гагельнъ,и ΥΡΜΜ Ρίΐνν
вредный βΕΟ ΒΕ с ΟΝΡ ВЕКНКС ΑΟΝ
А24 Предпоч- 1 “Якорь Р УЕИР Р 1 “Якорь
-|д_ тигельный ΥΡΜΜ ριινν
тег
вредный СОЕ ом РНК ΒΕ А ΟΝ ΒΕΑ
А3101 Предпоч- РНК 1 “Якорь ΥΡΙΛί Р γρνν γρνν ΑΡ 1 “Якорь
тигельный МУГАШ ΕΚ
вредный ОЕР ΒΕ АВЕ ϋΕ βΕ ΟΕ
ДЗЗО1 Предпоч- “Якорь γρνν ΑΥΡνν 1 “Якорь
тигельный МУАЕНет ΡΚ
вредный СР ΒΕ
А6801 Предпоч- ΥΡΤί/δΤΟ ^“Якорь γρννυν γρνν Ρ “Якорь
тигельный АУТШ/ Μ ΗΚ
вредный СР βΕΘ РНК А
В0702 Предпоч- ΚΗΚΕνΥΥ 1’Якорь ΒΗΚ кнк ΚΗΚ ЙНК ΡΑ 1 “Якорь
тигельный Р ШРИГ/Л/ 1/
вредный ΟΕΟΝΡ □ΕΡ ВЕ ОЕ 6ΒΕ ΟΝ ΟΕ
- 113 014870
ПОЛОЖЕНЫ!: 2 3 4 5 6 7 8 С-конец
или
С-конец
ΑΪ Предяоч- βργνν ^’Якорь ОЕА ут Ρ ΟΕΟΝ ΥΕΥ/ 1еЯкорь
9-гпбг етм У
вредный ПРШУМР А θ А
А1 Предаст- ВЯНК аэтсиум Г Якорь 63ТС А5ТС пум ϋΕ 1 ’Якорь
&*гпег тительны^ □ЕА5 Υ
ВВОДНЫЙ д ΚΗΚΟΕΡΥΕΜ ΟΕ ΡΟΝ РНК Рб ΘΡ
В3501 Предаст- РЖИУМ 1“Якорь РЖ ΓΑποίιοτ
тителыгый Р ШРЖ1У
вредный ДОР <3 б
В51 Предаст- 1_|\/МЕЖ 1“Якорь РЖ зтс РЖ б РЖ 1°Якорь
тигельный Р ΙΐνΡΙΨΥΑ
М
вредный ΑΘΡΟΕΕ ΟΕ 6 ОЕОН 6ϋΕ
НК5ТС
В5301 Првдпоч. |_|УМЕЖ 1 “Якорь ЕЖ зтс РЖ ЫУМРЖРЖ 1е,Якорь
тигельный Р 1МРЛШ
вредный ДЗРОЫ 6 ΚΗΚΟΝ ОЕ
В5401 Прадпоч- ρ,νγ 1°Якорь РЖИУМ ЫУМ АЫУМ РЖА 1 “Якорь
•пгтельный Р Р АТ1УШР
Ж
вредный 3ΡΟΝΟΕ 6ϋΕ8Τ0 НИКОЕ ϋΕ 0Ν06Ε ϋΕ
Таблица ^Е) Краткий обзор супертипов НЬА
Общая фенотипическая встречаемость супертипов НЬА у разных этнических популяций
Специфичность Фенотипическая встречаемость
Супертип Положение 2 С-конец Кавказцы Севере·американ ские негры Японцы Китайцы Испанцы Среднее
В7 Р ΑΙΕΜνΡΝΥ 43,2 55,1 57,1 43,0 49,3 49,5
АЗ А1ЬМУ5Т εκ 37,5 42,1 45,8 52,7 43,1 44,2
А2 А1ЬМУТ А1ЫГ7Т 45,8 39,0 42,4 45,9 43,0 42,2
А24 ΥΡ(ΡΠνΐΜΓ) РКУИЪМ) 23,9 33,9 58,6 40,1 38,3 40,0
В44 Ε(ϋ) ЕКУЫМУА 43,0 21,2 42,9 39,1 39,0 37, 0
А1 ТЦЬУМЗ) ΡΗΥ 47Γ1 16,1 21,8 14,7 26,3 25,2
В27 Р.НК ΡΪΒ(ΗΜΙ) 28,4 26,1 13,3 13,9 35,3 23,4
В62 <ЭЬ(17МР) ΡΗΥ(Μΐν) 12,6 4,8 36,5 25,4 11,1 18,1
В58 АТ.5 ΡΡΪΥΙΣίν) 10,0 25,1 1,6 9,0 5,9 10,3
Таблица Ш(О)
Рассчитанный популяционный охват для разных сочетаний супертипов НЬА
Супертипы НЬА Фенотипическая встречаемость
А2, АЗ и В7 А2, АЗ, В7 , А24, В44 и Α1 А2, АЗ, В7, А24, В44, А1, В27, В62 и В58 Кавказцы Североамериканские не гры Японцы Китайцы Испанцы Среднее
83,0 86,1 87,5 88,4 86,3 86,2
99,5 98,1 100,0 99, 5 99,4 99,3
99, 9 99,6 100,0 99,8 99,9 99, 8
Мотивы указывают остатки, определяющие особенности супертипов. Мотивы содержат остатки, которые, как определено на основании опубликованных данных, распознаются несколькими аллелями в супертипе. Остатки, заключенные в скобки, представляют собой дополнительные остатки, которые по прогнозам являются допустимыми для нескольких аллелей в супертипе.
- 114 014870
Таблица Ш(Н)
Частота встречаемости мотивов
Название средний % идентичности Описание Потенциальная функция
г£-С2Н2 34% Цинкосодержащая пальцеобразная область Белок, связывающий нуклеиновые кислоты, функционирует как фактор транскрипции, возможна ядерная локализация
Цитохром Ь N 68% Цитохром Ь (ίί- конец) /Ьб/реРВ Мембраносвязанная оксидаза, генерирует супероксид
19% Имму н о гл о булиновый домен Домены содержат сто аминокислот в длину и консервативную внутрияомеиную дисульфидную связь
ТО40 18% ТО домен, С-бета повтор Тандемные повторы приблизительно из 40 остатков, каждый из которых содержит мотив Тгр-Азр. Участвует в передаче сигнала и белковых взаимодействиях
Ρϋζ 23% ΡΏ2 домен Может направлять сигнальные молекулы к околомембранным участкам
- 115 014870
ьяк 28% Обогащенный лейцином повтор Мотивы с короткой последовательностью участвуют в белок-белковых взаимодействиях
Р-киназа 23% Протеинкиназный домен Консервативное каталитическое ядро, общее для серин/треониновой и тирозиновой протеинкиназ, содержит участок связывания АТФ и каталитический центр
РН 1β% РН домен Плекстриновая гомология, участвует во внутриклеточной передаче сигнала или используется как составная часть цитоскелета
ΕΘΓ 34% ΕΘΡ-подобный домен Содержит 30-40 аминокислот в длину, обнаружен во внеклеточном домене мембраносвязанных белков или в секретируемых белках
?.νθ 49% Обратная транскриптаза (РНК“зависимая ДНК- полимераза)
Алк 25% Повтор Алк Цитоплазматический белок, связывает интегральные мембранные белки с цитоскелетом
Оксидоредук- таза 32% ΝΑ6Ηубиквинон/пластоквинон (комплекс I), разные цепи Связан с мембраной. Участвует в переносе протонов через мембрану
ЕЕЬапд 24% Плечо ЕР Кальций-связывающий домен, содержит петлю из 12 остатков, которую с обеих сторон фланкирует альфаспиральный домен. из 12 остатков
Κνρ 79% Ретровирусная аспартилпротеаза Аспартил- или кислотные протеазы с центром на каталитическом остатке аспартила
Коллаген 42% Повтор тройной спирали коллагена Внеклеточные структурные белки, участвующие в образовании соединительной ткани. Последовательность содержит С-Χ-Υ и полипептидные цепи, образующие тройную спираль
ГпЗ 20% Домен фибронектина типа III Расположен во внеклеточном лиганд-связывающем участке рецепторов, содержит приблизительно 200 аминокислотных остатков в длину, в том числе две пары остатков цистеина, участвующих в образовании дисульфидных связей
7ϋτη_1 19% 7 трансмембранный рецептор (семейство родопсина) Семь гидрофобных трансмембранных участков, причем Ν-конец имеет внеклеточную локализацию, а С-конец цитоплазматическую. Сигнал передается через «3-белки
- 116 014870
Таблица ТУф
Примеры медицинских изотопов
Изотоп Описание применения
Актиний-225 (АС-225) См. Торий-229 (Т11-229)
Актиний-227 (АС-227) Родительский изотоп радия-223 (Ка-223), который является альфа-излучателем и используется для лечения раковых метастаз (например, рака молочной железы и простаты) в скелете, и в радиоиммунотерапии злокачественных заболеваний
Висмут-212 (В1-212) См. Торий-228 (ТП-228)
Висмут-213 (Βί-213) См. Торий-229 (И1-229)
Кадмий-109 (С<1-109) Диагностика злокачественных заболеваний
Кобальт-50 (Со-60) Источник радиации, используемый для лучевой терапии рака, облучения пищевых продуктов и стерилизации медицинских принадлежностей
Медь-64 (Си-64> Позитронный излучатель, используется для лечения рака и визуализации методом 5РЕСТ
Медь-67 (Си-67) Бета/гамма-излучатель, используемый в радиоиммунотерапии злокачественных заболеваний и диагностических исследованиях (например, рака молочной железы и толстой кишки и лимфомы)
Диспрозий- 166 (Оу-166) Радиоиммунотерапии злокачественных заболеваний
Эрбий-169 (Ег-169) Лечение ревматоидного артрита, особенно маленьких суставов пальцев рук и ног
Европий-152 (Еи-152) Источник радиации, используется для облучения пищевых продуктов и стерилизации медицинских принадлежностей
Европий-154 (Еи-154) Источник радиации, используется для облучения пищевых продуктов и стерилизации медицинских принадлежностей
Гадолиний- 153 (ад-153) Применяется в диагностике остеопороза и в ядерных устройствах медицинского назначения
Золото-198 (Ли-198) Имплантационная и внутриполостная терапия рака яичников, простаты и мозга
- 117 014870
|Гольмий-166 (Но-166) Лечение множественной миеломы в направленной скелетной терапии, радиоиммунотерапия злокачественных заболеваний, аблация костного мозга и лечение ревматоидного артрита
ЙОД-125 (1-125) Используется для диагностики остеопороза, диагностической визуализации, получения радиоактивных лекарственных средств, лечения рака мозга, получения радиоактивных меток, визуализации опухолей, картирования рецепторов мозга, интерстициальной лучевой терапии, брахитерапии для лечения рака простаты, определения скорости клубочковой фильтрации (ОТК.) , определения объема плазмы, диагностики глубокого тромбоза вен ног
ИОД-131 (Т-131) Используется для оценки функции щитовидной железы, диагностики заболеваний щитовидной железы, лечения рака щитовидной железы, а также других доброкачественных заболеваний щитовидной железы (например, болезни Грейвса, струмы и гипертиреоза), лечения лейкоза, лимфомы и других видов рака (наприер, рака молочной железы) с применением радиоиммунотерапии
Иридий-192 (1Г-192) Применяется в брахитерапии, для лечения опухолей головного и спинного мозга, закупоренных артерий (например, атеросклероза и рестеноза) , а также для имплантантов опухолей молочной железы и простаты
Лютеций-177 (ΙΛ1-177) Применяется в радиоиммунотерапии злокачественных заболеваний и для лечения закупоренных артерий (например, атеросклероза и рестеноза)
Молибден-99 (Мо-99) Родительский изотоп технеция-99т (Тс-99т), который используется для визуализации головного мозга, печени, легких, сердца и других органов» В настоящее время Тс-99т является наиболее широко используемым радиоактивным изотопом, который применяется для диагностической визуализации раковых и других заболеваний разных органов, включающих в себя головной мозг, сердце, печень, легкие; кроме того, он используется для диагностики глубокого тромбоза вен ног
Осмий-194 (08-194) Радиоиммунотерапия злокачественных заболеваний
Палладий- 103 Лечение рака простаты
Платина - 195т (Рб-195т) Применяется для исследования биораспределения и метаболизма цисплатина, химиотерапевтического лекарственного средства
- 118 014870
Фосфор“32 (Р-32) Применяется для лечения стойкой красной полицитемии (заболевание кровяных клеток) и лейкоза, диагностики/лечения рака костей; лечения рака толстой кишки, поджелудочной железы и печени: получения меченных радиоактивными изотопами нуклеиновых кислот, используемых в исследованиях ίη νϋζΓο; диагностики поверхностных опухолей, лечения закупоренных артерий (например, атеросклероза и рестеноза) и внутриполостной терапии
Фосфор-33 (Р-33) Применяется для лечения лейкоза, диагностики/лечения костных заболеваний, радиоактивного мечения и лечения закупоренных артерий (например, атеросклероза и рестеноза)
Радий-223 (Ка-223) См. актиний-227 (Ас-227)
Рений-186 (Ке-ΐδδ) Применяется для облегчения болей при раке костей, для лечения ревматоидного артрита, а также для диагностики и лечения лимфомы и злокачественных заболеваний костей, молочной железы, толстой кишки и печени с использованием радиоиммунотерапии
Рений-188 (Ее-188) Применяется для диагностики и лечения злокачественных заболеваний с использованием радиоиммунотерапии, для облегчения болей при раке костей, а также для лечения ревматоидного артрита и рака простаты
Родий-105 (КИ-105) Радиоиммунотерапия злокачественных заболеваний
Самарий-145 (ЗШ-145) Лечение злокачественных заболеваний глаз
Самарий-153 (Зт-153) Применяется в радиоиммунотерапии злокачественных заболеваний и для облегчения болей при раке костей
Скандий-47 (ЗС-47) Применяется в радиоиммунотерапии злокачественных заболеваний и для облегчения болей при раке костей
Селен-75 (Зе-75) Применяется как радиоактивный индикатор в исследованиях головного мозга, визуализации коры надпочечников методом гамма-сцинтиграфии, латеральной локализации стероид-секретирующих опухолей, сканирования поджелудочной железы, диагностики гиперактивных паращитовидных желез, измерение скорости исчезновения желчных кислот их эндогенного пула
Стронций-85 (Зг-85) Диагностика рака костей и сканирование головного мозга
Стронций-89 (Зг-89) Применяется для облегчения болей при раке костей, лечения множественной миеломы и остеобластной терапии
Технеций- 9 9т (тс-ээт) См. молибден-99 (Мо-99)
- 119 014870
Торий-228 (ТЬ-228) Родительский изотоп висмута-212 (Βί-212), который является альфа-излучателем и используется в радиоиммунотерапии злокачественных заболеваний
Торий-229 (Т11-229) Родительский изотоп актиния-225 (Ас-225) и прародительский изотоп висмута-213 (Βί-213), которые являются альфа-излучателями и используются в радиоиммунотерапии злокачественных заболеваний
Тулий-170 (Тт-170) Применяется в качестве гамма-источника для облучателей крови и источника энергии для имплантируемых медицинских устройств
0лово-117т (Зп-117т) Применяется для радиоиммунотерапии злокачественных заболеваний и облегчения болей при раке костей
Вольфрам- 188 (И-188) Родительский изотоп рения-188 (Не-188), который применяется для диагностики/лечения злокачественных заболеваний, облегчения болей при раке костей, лечения ревматоидного артрита и закупоренных артерий (например, атеросклероза и рестеноза)
Ксенон-127 (Хе-127) Применяется для нейровизуализациии заболеваний головного мозга, исследований 8РЕСТ высокого разрешения, тестирования легочной функции и исследований кровотока в головном мозге
Иттербий- 175 (УЬ-175) Применяется для радиоиммунотерапии злокачественных заболеваний
Иттрий-90 (Υ-90) Микрокапсулы, полученные при облучении иттрием89 (¥-89}г используются для лечения рака печени
Иттрий-91 (Υ-91) Гамма-излучающая метка для иттрия-90 (Υ-90), которая применяется для радиоиммунотерапии злокачественных заболеваний (например, лимфомы, рака молочной железы, толстой кишки, почек, легких, яичников, простаты, поджелудочной железы и неоперабельного рака печени)
Таблицы V-XVIII приведены в патентной заявке США № 10/236878; поданной 6 сентября 2002 г., конкретное содержание которой полностью включено в данное описание в качестве ссылки.
- 120 014870
Таблица XIX
Частота встречаемости мотивов
Название Средний % идентичности Описание Потенциальная функция
з£-С2Н2 34% Цинкосодержащая пальцеобразная область Белок, связывающий нуклеиновые кислоты, функционирует как фактор транскрипции, возможна ядерная локализация
Цитохром Ь N 68% Цитохром Ь(Ν- конец)/Ьб/реРВ Мембраносвязанная оксидаза, генерирует супероксид
19% Иммуноглобулиновый домен Домены содержат сто аминокислот в длину и консервативную внутридоменную дисульфидную связь
7ГО40 18% ИС домен, С-бета повтор Тандемные повторы приблизительно из 40 остатков, каждый из которых содержит мотив Тгр-Авр. Участвует в передаче сигнала и белковых взаимодействиях
ΡΌΖ 23% ΡΏΖ домен Может направлять сигнальные молекулы к околомембранным участкам
ЬЕК 28% Обогащенный лейцином повтор Мотивы с короткой последовательностью участвуют в белок-белковых взаимодействиях
Р-киназа 23% Протеинкиназный домен Консервативное каталитическое ядро, общее для серин/треониновой и тиро зино вой пр от еинкина з, содержит участок связывания АТФ и каталитический центр
₽ы 16% РН домен Плёкстриновая гомология, участвует во внутриклеточной передаче сигнала или используется как составная часть цитоскелета
ЕСЕ 34% ЕСтР-подобный домен Содержит 30-40 аминокислот в длину, обнаружен во внеклеточном домене мембраносвязанных белков или в секретируемых белках
ΗνΡ 49% Обратная транскриптаза (РНК-зависимая ДНКполимераза)
Апк 25% Повтор Апк Цитоплазматический белок, связывает интегральные мембранные белки с цитоскелетом
Оксидоредук- таза С[1 32% ΝΆΏΗубиквинон/пластоквинон (комплекс I), разные цепи Связан с мембраной. Участвует в переносе протонов через мембрану
ЕЕЬапЗ 24% Плечо ЕЕ Кальций-связывающий домен, содержит петлю из 12 остатков, которую с обеих сторон фланкирует альфаспиральный домен из 12 остатков
Κνρ 79% Ретровирусная аспартилпротеаза Аспартил- или кислотные протеазы с центром на каталитическом остатке аспартила
- 121 014870
Коллаген 42% Повтор тройной спирали коллагена Внеклеточные структурные белки, участвующие в образовании соединительной ткани. Последовательность содержит Θ-Χ-Υ и полипептидные цепи, образующие тройную спираль
?пЗ 20% Домен фибронектина типа III Расположен во внеклеточном лиганд-связывающем участке рецепторов, содержит приблизительно 2ОС аминокислотных остатков в длину, в том числе две пары остатков цистеина, участвующих в образовании, дисульфидных связей
7Ът_1 19% 7 трансмембранный рецептор (семейство родопсина) Семь гидрофобных трансмембранных участков, причем Ν-конец имеет внеклеточную локализацию, а С-конец цитоплазматическую. Сигнал передается через С-белки
Таблица ХХ
Мотивы и посттрансляционные модификации §ТЕΛР-1
Участок
N-гликозилирования
143-146
ΝΟΤΚ (ЗЕО ТО N0:
84)
331-334
ΝΚΤΕ (ЗЕО ΙΌ МО:
Участок фосфорилирования протеинкиназой С
3-5 ЗгК
160-162
ТгК
187-189
ЗуН
246-248
Τν/Η
Участок фосфорилирования казеинкиназой II
3-6 ЗгкП (ЗЕО Ιϋ N0: 86)
8-11 ТпдЕ (ЗЕО ТО
240-243
Ιϋ N0:
88)
246-249
Τν/гЕ (ЗЕО
N0:
89)
Участок фосфорилирования тирозинкиназой
19-27 ΚΚΝΙ,ΕΕϋΟΥ (ЗЕО ГО N0: 90)
Участок
Ν-миристоилирования
133-138
ΟνίΆΑΙ (ЗЕО ГО N0:
91)
265-270
СТТНАЬ (ЗЕО ГО N0:
92)
Состоящая из двух частей последовательность направления в ядро
4-20 ΗΚϋΙΤΝΟΕΕΙΚΚΜΚΡΚΚ(ЗЕО ГО N0: 93)
- 122 014870
Таблица XXI
Белковые характеристики 8ТЕАР-1
Бнллнформацнои нал программа ЦВ.Е (расположение в глобальной сети) Результат
ОВР Длина белка ОКР йпйег 1193 о н. 339 а.к.
Трансмембранный участок ТМРгес! (сЬ.ЕппЬпеХогд/) 6ТМ ах 73-91,120-141, 163-181,218-236,253-274, 286-304
НММТор (.θηζίίη.ίιυι'ίιπυηίορ/) 6ТМ ах 73-90,117-139, 164-182,220-238,257-274, 291-309
Зози1 (.двпоте.аЛ)р/ЁОЗи1/) 6ТМ ах 70-92,114-136, 163-184,219-241,255-273, 292-313
тмнмм {.сЬзЛи.Зк/ваг^себЛМНММ) 6ТМ а.к 73¼ 117-139, 164-182,218-240, 252-274, 289-311
Сигнальный пептид Згдпа! р (, сЬз.сКи.Шег/1се5/&дпа1Р/) потенциальное растепление меадаа 136 и 137
р| р|/мт<х>1 (.ехразу.сЬЛооЭД 9,2 р! 39,8 кДа
Молекулярная масса ρΙ/ΜννίοοΙ (.ехра5у.сМ<ю1б/)
Локализация Р50ЙТ 11йр://рзог(,п1ЬЬ.ас.|р/ 60% плазматическая мембрана, 40% до1®1, 30% эндоплазматический ретикулум
РЗОРГГН ййр://реог11п|ЬЬ.ас.|р/ 66% эндоплазматический ретикулум, ] 1% митохондрии, 1 ]%
плазматическая мембрана
Мотивы Р1ат Ρτίηΐε (.8апдег.ас.иУРГат/) (.Ыосйет.ий-ас.ик/) сгсутсвует Характерные признаки трансформирующего белка Р21 газ,
В1оскэ (,Ыос1<5.#1сг<;.огд/) характерные признаки повтора фибронектина типа III
Повтор На1Г-А-ТРВ, :<арактериые признаки мембранного белка мышьякового насоса, повтор белка
Таблицы XXII-^I приведены в патентной заявке США № 10/236878; поданной 6 сентября 2002 г., конкретное содержание которой полностью включено в данное описание в качестве ссылки.
- 123 014870
Таблица ЬП
Поисковые пептиды
Вариант 1 ΞΤΕΑΡ-1·:
нонамеры, декамеры и 15-меры: а.к. 1-339 (ЗЕО ΙΌ N0: 94)
МЕЗЮТДТВД ЕЕ1ИКИКРНК НЪЕЕЗОУЬНК 0Т5ЕТЗМ1.КК РУЬЬНЪНОТА НАЕЕЕЕСРЕЕ60 ес;гЛ)еы?ро таьеткгдА! ϊλει,τϊι,υτα ьнеутнрьат 3ηο(2Υεύκιρ ιινικκνίΡΜ12 о узиъъаьуу т.Рс-νΞΑί,τνο ьнжзткукке рниьокимьт ккцрсььзгг еауънагубх,ιβο
ЗУРМЕКЗУВУ КЪЪЫИАУдОУ 001ЯКЕПАИ1Е Ηθν»ΚΜΕΙΥν ЗЬС1У61А1Ъ АЫАУТ81₽3240 узозътиеег ΗϊΐΟΒκι,σιν зыютхнаь ιεά»νκηιοι коетиутррт гм1аугьр1у зор ’/ЫЗКЗИГЬ РС1ЕККИК1 ВНСИЕОУТК! яктеюзоь ззэ
Вариант 2;
9- меры а.к. 247-258 (ЗЕ<2 Ю N0: 95)
ΗΚΕΡΗΥΙΟνΝΝΙ ю-меры а.к. 246-258 (ЗЕО Ιϋ ΝΟ: 96)
ΤΝΚΕΡΗΥΙΟνΝΝΙ
15-меры а.к. 241-258 (ЗЕО ГО N0: 97)
УЗБЗЬТИКЕРНУЮУШ!
Вариант 3:
э-меры а. к. 247- (ЗЕО Ιϋ N0: 98)
ИКЕРНУЮИНККЗиУРЕЗЬИОРСЬТКРКСЬЫЫОЗ
10- меры а.к. 246- (ЗЕО Ю N0: 99)
ТОКЕРНУ10ИНККЗБУРЕЗЬИОРСЪТКРКОЬЫЫ08
15-меры а.К. 241- (ΞΕ<2 ΙΌ N0: 100)
УЗПЗЬТИКЕРНУЮИНККЗОУРЕЗЬИПРСЬТЕРКСШЫОЗ
Вариант 4:
9-меры а.к. 160-176 (ЗЕО Ю N0: 101)
ККОГОЬЬЗЬГРАУЬНА!
ю-меры а.к. 159-177 (ЗЕО Ιϋ ΝΟ: 102)
ТР.К01Ю1Ь£ЬР?А','ЬНАГ/
15-меры а.к. 154-182 (ЗЕО ΙΒ ΝΟ: 103)
ОКИМЪТККОРОЬЬЗЬГГА¥ЪНА1УЗЬЗУР
Таблица ЬШ
Состав экзона варианта 1 δТЕАΡ-1 (8Р1Э4)
- 124 014870
Список последовательностей <110> Адепеуй, 1пс.
ЛкоЬс^зЛз г Ауа
Е^еззат!, ЗоидаЪек
СИа11±Ъа-Е10г Рха М.
Регег-УШазг, Диан
Меуггск Моггхзоп, Кагеп Дапе
Ла, Х1ао-Ск1
Гаг15, Магу (ЗиЛаз, Деап КаИзапо, Аг£лиг В.
<12 0> Антитела, связывающиеся с белками БТЕАР-1 и их производные <130> 51156-20016.61 <140> РСТ/и504/12625 <141> 2004-04-22 <150> 09/323,873 <151> 1999-06-01 <150> 10/010,667 <151> 2001-12-06 <150> 10/011,095 <151> 2001-12-06 <150> 10/236,378 <151> 2002-09-06 <150> 10/165,044 <151> 2002-06-06 .
<150> 09/455,486 <1Б1> 1999-12-06 <150> 60/091,183 <1Б1> 1998-06-30 <1Б0> 60/317,840 <151> 2001-09-06 <150> 60/370,387 <151> 2002-04-05 <150> 60/296,656 <151> 2001-06-06 <150> 60/087,520 <151> 1993-06-01 <160> 103 <170> РазЬЗЕО £ог Μίηάονίδ Уегзхоп 4.0 <210> 1 <211> 436 <212> ДНК <213> Нотпф зар1епз <40О> 1
- 125 014870 деасадсааа ааадааасЬд адаадсссаа асСдсееесе едееаасаес ассааедедд ааасеесееа Ьасееддеес саееаЬдаад ееддасааее сасседдсад деааассаае дссаададад едаСддааас саееддсаад Ьдассаддас еддааееееа саааааеане деедаЬддда адЪЪдсеааа сеесссесад аададедНаа адаааадеса дадаНдсеае ааеадсадсе дсаадЬдсса СНдеддааад адеНсседНд Ьдедседаад еесЬдааддд саесадсаЪд ддсНаеесдд НдсаааЬдса ааадсасадд есееееНадс сесссдСдес сНЬаНд сасееаЬсса 60 дсНдсНаеса 120 асЬеедееда 130 ЗЗЭедаасеа 240 аСЪССааеед 300 садНсаааее 360 аСдседдесе 420 436 <210> 2 <211> 1193 <212> ДНК <213> Ното зараепз <220>
<221> СОЗ <222> (66}...(1085) <400> 2 ссдадасеса сддЬсаадсе ааддсдаада дсдддсддсе даадссаСас еаееееаеад 60 ааееа аед даа аде ада ааа дас аес аса аас саа даа даа сее Рдд ааа 110
Мее С1и Зег Агд Ъуз Αερ Не Ткг Αεη С1п <31и С1и Ьеи Тхр Ьуз 15 10 15
аед аад сер адд ада Рго Агд Агд 20 аае Αεη Ъеа даа даа дас Азр 25 дае Αερ еае Туг Ъбд· Ьеи сае Ηίε аад Ъуз 30 дас Азр 158
Мее Ьуз Ъеи С1и 61и
асд дда дад асе аде аед сНа ааа ада ссН сее еед саЪ еед сас 206
ТНг 61у О1и ТНг Бег Мее Ъеи Ьуз Агд Рго Уа1 Ъеи Ьеи Ηίε Ьеи Ηίε
35 40 45
саа аса дес сае дсН даН даа еее дас Ъдс ссе Ъса даа сее сад сас 254
(31п ТЬг А1а Н13 А1а Αερ О1и РЬе Азр Суз Рго Зег С1и Ьеи Б1п Ηίε
50 55 60
аса сад даа сес нее сса сад ьдд сас еед сса аее ааа аНа дсе дсе 302
ТНг <31п О1и Ьеи РНе Рго 61η Тгр Ηίε Ъеи Рго Не Ъуз 11е а. 1а А1а
65 70 75
аее аНа дса Ъсе сед асН еее сее Нас асН сее сед адд даа дЪа аее 350
Не Не А1а Зег Ьеи ТЬг РНе Ъеи Туг ТЬг Ъеи Ьеи Агд С1и Уа1 Не
80 85 90 95
сас ССР Сба дса асе Нее сае саа саа Пае нее еае ааа аее сса аес 398
Н13 Рго Ьеи А1а ТНг Зег Ηίε О1п 01п Туг РЬе Туг Ъуз Не Рго Не
100 105 110
сед дес аес аас ааа дЪс еед сса аЪд дее есс аЪс асе сес еед дса 446
Ьеи Уа1 Не Αεη Ьуз Уа1 Ъеи Рго Мее Уа1 Зег Не ТЬг Ьеи Ьеи А1а
115 12 0 125
еед дне Нас сед сса дде дед аеа дса дса аЪН дес саа сее саН аае 4 94
Ьеи Уа1 Туг Ьеи Рго С1у Уа1 11е А1а А1а Не Уа1 С1п Ъеи Ηίε Азп
130 135 14 0
дда асе аад еае аад аад еее сса саб Ндд еед даН аад едд аед ееа 542
01у ТНг Ьуз Туг Ьуз Ьуз РНе Рго Ηίε Тгр Ъеи Азр Ъуз Тгр МеН Ьеи
145 150 155
аса ада аад сад еее ддд сее сес аде еее нее еее дсС деа сед сае 590
ТЬг Агд Ьуз О1П РНе С1у ъеи Ъеи Зег РНе РНе РЬе А1а Уа1 Ьеи Ηίε
160 165 170 175
- 126 014870
дса А1а акк как адъ £ег сБд Беи 180 ксъ Йег Бас сса аБд адд еда Агд есс зег Ьас ада Бас Туг 190 аад Ьуе 633
Не Туг Туг Рго Мее Агд 185 Туг Агд
ьид сБа аас кдд дса саб саа сад дес саа оаа аае ааа даа да Б дсс 685
Беи Беи Азп Тгр А1а Туг 31п 61п Уа1 (31п <31п Азп Буз (31и Азр А1а
195 200 205
сдд аББ зад сак даЪ дкк Гдд ада аед дад акк БаБ БсБ сБд дда 734
Тгр Не С1и Н1В Айр Уа1 Тгр Агд Мее <31и Не Туг Уа1 Зег Беи З1у
210 215 220
ар Б дид дда «9 дса аба сед дсБ сед еед дсъ дБд аса БсБ аББ сса 732
Не Уа1 31у Беи А1а 11е Беи А1а Беи Беи А1а Уа1 тНг Бег Не Рго
225 230 235
БсБ дЪд адЬ дас БсБ ^Ьд аса Ьдд ада даа ккъ сас еае аББ сад аде 830
Бег Уа1 Бет Азр 5ег Беи ТЬг Тгр Агд Й1и РЬе Н1е Туг Не С1п Йег
240 245 250 255
аад сБа дда аЪЬ дББ Дсс сбб сна сед ддс аса аБа сас дса ББд аЪк 878
Буз Беи 31у Не Л7а1 Зег Беи Беи Беи (31у ТЬг Не ΗΪ3 А1а Беи Не
260 265 270
иг дсс Ддд ааР аад ндд аБа даБ аБа ааа саа еее дБа Ьдд БаБ аса 926
РНе А1а Тгр Азп Буз Тгр Не Азр Не Вуз 31п вне Уа1 Тгр Туг ТЬг
275 280 285
ссБ сса асБ ЬЬЬ аБд аБа дсБ дее еес сбб сса аББ дББ дкс сед ака 974
Рго Рго ТНг РЬе Мее Не А1а ν&1 РИе Беи Рго Не 7а1 7а1 Беи Не
290 295 300
БББ ааа аде ака сБа ББс сед сса Ьдс ъед адд аад аад ака сБд аад 1022
РНе Бу В Зег Не Беи РНе Беи Рго Суз Беи Агд Буз Буз Не Беи Ьув
305 310 315
аББ ада саБ ддь £дд даа дас дес асе ааа аЬЪ аас ааа асе дад аЪа 1070
Не Агд ΉΪ3 О1у Тгр О1и Азр Уа1 ТЬг Буз Не Азп Буз ТЬг С1и Не
320 325 330 335
БдБ Бес сад ББд Бад ааББасБдББ БасасасаББ БББдББсааБ аББдаБаБаБ 1125 Суэ Зег 01п Беи *
БББаБсасса асаЬББсаад БББдБаЬББд ББааБааааБ даНЪасаадд ааааааааяа 1185 аааааааа 1193 <210> 3 <211> 339 <212> РКТ <213> Ното зар1епз <400> 3
МеБ (31и Зег Агд Буз Азр Не ТНг Азп <31п <31и С1и Беи Тгр Ьуз МеБ
1 5 10 15
Буз Рго Агд Агд АЗП Беи С1и О1и АЗР Азр Туг Ьеи ΗΪ3 Ьуз Азр ТЬг
20 25 30
С1у С1и ТЬг Зег МеБ Беи Буз Агд Рго Уа1 Беи Ьеи Н1з Ьеи Ηίβ С1п
35 40 45
ТЬг А1а Ηί£ А1а Азр £1и РЬе Авр Сув Рго Зег О1и Беи О1п ΗΪ3 ТЬг
50 55 60
<31п <31и Беи РЬе Рго О1п Тгр Н1е Ьеи Рго 11е Ьув Не А1а А1а Г1е
65 70 75 80
Не А1а Зег Ьеи ТНг РИе Беи Туг ТЬг Беи Беи Агд 61и Уа1 Не ΗΪ3
- 127 014870
85 90 95
Рго Беи А1а ТЬг Зег Н13 01п С1п Туг РЬе Туг Був Не Рго Не Беи
100 105 110
Уа1 Не АЗП Буз Уа1 Беи РГО Мее Уа1 Зег 11е ТЬг Беи Беи А1а Беи
115 120 125
ν«1 Туг Беи Рго <31у Уа1 11е А1а А1а 11е Уа1 С1п Беи ΗΪ5 Азп 61у
130 135 140
ТЬг Буе Туг Був Буз РЬе РГО Ηί3 Тгр Беи Азр Буз Тгр МеЬ Беи ТЬг
14 5 150 155 160
Агд Був С1п РЬе С1у Беи Беи Зег РЬе РЬе РЬе А1а Уа1 Беи ΗΪ3 А1а
165 170 175
Не Туг Зег Беи зег Туг Рго Мее Агд Агд Зег Туг Агд Туг Буз Беи
180 185 190
Беи Азп Тгр А1а Туг αΐη (31п Уа1 С1п Θΐη Ав η Буз О1и Азр А1а Тгр
195 200 205
11е (31и Н1з Азр Уа1 Тгр Агд Мее <31и Не Туг Уа1 Зег Беи (Пу Не
210 215 220
Уа1 <31у Беи А1а Не Беи А1а Беи Беи А1а Уа1 Ткг Зег Не Рго Зег
225 230 235 240
Уа1 Зег Азр Зег Беи ТЬг Тгр Агд С1и РЬе ΗΪ3 туг 11е Н1п Зег Буз
245 250 255
Деи (Пу Не Уа1 Зег Беи Беи Беи (Пу ТЬг Не Н1з А1а Беи Не РЬе
260 265 270
А1а Тгр Азп Буз Тгр Не Азр Не Буз С1п РЬе Уа1 Тгр Туг ТЬг Рго
275 280 285
Рго ТЬг РЬе Мер 11е А1а Уа1 РЬе Беи Рго Не Уа1 νβΐ Беи Не РЬе
290 295 300
Ъуз Зег Не Беи РЬе Беи Рго Суз Беи Агд Буз Буз Не Беи Був Не
305 310 315 320
Агд Н1з <31у Тгр С1и Азр Уа1 ТЬг Буз Не АЗП Був ТЬг О1и Не Суз
325 330 335
Зег С1п Беи
<210> 4 <211> 3627 <212> ДНК <213> Ното зар±епз <220>
<221> СБЗ <222> (96)...(872) <400> 4 ддддсссдса ссеседддса дсадсддсад ссдадасеса сддесаадсе ааддсдаада 60 дедддеддсе даадссаеас еаееееаеад ааееа аЬд даа аде ада ааа дао 113
Мер О1и Зег Агд Буз Азр
5
аес Не аса ТЬг аас Азп саа <31п 10 даа С1и даа <31и сее Беи едд Тгр ааа Буз 15 аЬд мец аад Буз ссе Рго адд Агд ада Агд 20 аае Азп ееа Беи 161
даа даа да с дае еае ЬСд сае а ад дас асд дда дад асе аде аед сеа 209
С1и О1и Авр Азр Туг Ьеи Н1з Буз Азр ТЪг (Пу (Ни ТЬг Зег МеЬ Беи
25 30 35
ааа ада ссЬ дед сее ЬЬд сае еед сас саа аса дес сае дсе дае даа 257
Був Агд Рго νβΐ Беи Ьеи Н±3 Беи Н1в 31п ТЬг А1а Н1в А1а Азр (31и
40 45 50
еее дас Сдс сое Сса даа сее сад сае аса сад даа сес еее сса сад 305
РЬе Азр Суз Рго Зег О1и Беи αΐη Н1з ткг <31п (31и Беи РЬе Рго 61п
- 128 014870
55 60 65 70
Ьдд сас ЕЕд сса аЕЕ ааа аЕа дсЕ дес аЕЕ аЕа дса СсС сСд асС ЕЕЕ 353
Тгр ΗΪ3 Ьеи Рго Не Ьуз Не А1а А1а Не Не А1а Бег Ьеи ТЬг РЬе
75 80 85
сСС Сас асЕ сСЪ сЕд адд даа дЕа асе сас ссс СЬа дса асЪ Ссс саЕ 401
Ьеи Туг ТЬг Ьеи Ьеи Агд С1и Уа1 Не ΗΪ3 Рго Ьеи А1а ТЬг Бег ΗΪ3
90 95 100
саа саа ЕаЕ ссс ЕаЕ ааа аЕЕ сса аЬс сЕд дЕс аСс аас ааа дСс ЕЕд 449
О1п 61п Туг Рке Туг Ьуз Не Рго 11е Ьеи Уа1 Не Азп Ьуз ν^ι Ьеи
105 110 115
сса аЕд дЕЕ Ссс аЕс асе СЕС ьгд дса ЕЕд дЕЕ Сас ерд сса ддЕ д^д 497
Рго МеЕ Уа1 Бег Не ткг Ьеи Ьеи А1а Ьеи Уа1 Туг Ьеи Рго 61у 7а1
120 12 5 13 0
аЬа дса дса аСС дЕс саа сЕЕ саЕ ааС дда асе аад СаС аад аад ссс 545
Не А1а А1а Не Уа1 С1п Ьеи Н±В Азп <31у ТЬг Ьуз Туг Ьуз Ьуз РЬе
135 140 145 150
сса саЕ Едд ЬЪд даЕ аад Едд аЕд СЬа аса ада аад сад ссс ддд сЕЕ 593
Рго Н13 Тгр Ьеи Аар Ьуз Тгр МеЕ Ъеи ТЬг Агд Ьуз 01п РЬе <31у Ъеи
155 160 165
сСс адЕ ЕЕс ССС ЕЕЕ дсС дЕа сЕд сае дса аЕЕ Рас адС сСд ЕсЕ Еас 641
Ьеи Вег РЬе РЬе РЬе А1а Уа1 Ьеи Н1э А1а Не Туг Бег Ьеи Еег Туг
170 175 180
сса аЕд адд еда Есс Сас ада Еас аад ЕЕд сЕа аас ъдд дса ЕаЕ саа 689
Рго МеЕ Агд Агд Зег Туг Агд Туг Ьуз Ьеи Ьеи Азп Тгр А1а Туг <31п
185 190 195
сад дЕс саа саа ааЕ ааа даа даЕ дсс ьдд аЕЕ д^д саС даь дЕЕ Едд 737
С1п Уа1 С1п С1п Азп Ьуз С1и Азр А1а тгр Не 61и ΗΪ3 Азр Уа1 Тгр
200 205 210
ада аЕд дад аьъ ЕаЕ дед ЕСЕ сЕд дда аСС дЕд дда ССд дса аЕа сЕд 785
Агд МеЕ С1и Не Туг Уа1 Зег Ьеи С1у Не Уа1 С1у Ьеи А1а Не Ьеи
21Б 220 225 230
дес сЕд ЕЕд дес дьд аса ЕСЕ аЕЕ сса СсС дЕд адС да с СсС ЕЕд аса 833
А1а Ьеи Ьеи А1а Уа1 ТЬг Зег Не Рго Зег Уа1 Бег Азр Бег Ьеи ТЬг
235 240 245
Ьдд ада даа С.СС сас СаГ аЕЕ сад дса ааС ааЕ аСа Саа ааЕаасссЕа 882
Тгр Агд <31и РЬе Ηίβ Туг Не 61п Уа1 Азп Азп Не *
250 255
ададдЕаааЕ сЕЕсЕЕЕЕЕд ЕдЕЕЕаЕдаЕ аЕадааЕаЕд ЕЕдасЕЕЕас сссаЕааааа 942 аЕаасаааЕд ЬЕЕЫсааса дсааадаЕсЕ ЕаЕасЕЕдЕЕ ссааЕЕааЕа аЕдЕдсЕсЕс 1002 сЕдЕЕдЕЕЕЕ сссЕаЕЕдсЕ ЕсЕааЕЕадд асаадЕдЕЕЕ ссЕадасаЕа ааЕааааддс 1062 аЕЕааааЕаЕ ЕсЬЕЕдЕЕЕЕ ЕЕЕЕЕЕЕЕЕд ЕЕЕдЕЕЕдЕЕ ЕЕЕЕдЕЕЕдЕ ЕЕдЕЕЕдЕЕЕ 1122 ЕЕЕЕдадаЕд аадЕсЕсдсЕ сЕдЕЕдссса ЕдсЕддадЕа садЕддсасд аЕсЕсддсЕс 1182 асЕдсаассЕ дсдссЕссЕд ддЕЕсаддсд аЕЕсЕсЕЕдс сЕсадссЕсс ЕдадЕадсЕд 1242 ддаЕЕасадд сасссаЕсас саЕдЕссадс ЕааЕЕЕЕЕдЕ аЕЕЕЕЕадЕа дадасадддЕ 1302 ЕЕЕсссаЕдЕ ЕддссаддсЕ ддЕсЕсдаЕс ЕссЕдассЕс аааЕдаЕссд сссассЕсдд 1362 ссЕсссааад ЕдсЕдддаЕд асадЕЕдЕда дссассасас ЕсадссЕдсЕ сЕЕЕсЕааЕа 1422 ЕЕЕдааасЕЕ дЕЕадасааЕ ЕЕдсЕассса ЕсЕааЕдЕда ЕаЕЕЕЕадда аЕссааЕаЕд 1482 саЕддЕЕЕаЕ ЕаЕЕЕсЕЕаа ааааааЕаЕЕ сЕЕЕЕассЕд ЕсассЕдааЕ ЕЕадЕааЕдс 1542 сЕЕЕЕаЕдЕЕ асасаасЕЕа дсасЕЕЕсса дааасааааа сЕсЕсЕссЕЕ даааЕааЕад 1602 адЕЕЕЕЕаЕс ЕассааадаЕ аЕдсЕадЕдЕ сЕсаЕЕЕсаа аддсЕдсЕЕЕ ЕЕссадсЕЕа 1662 саЕЕЕЕаЕаЕ асЕЕасЕсас ЕЕдаадЕЕЕс ЕаааЕаЕЕсЕ ЕдЕааЕЕЕЕа ааасЕаЕсЕс 1722
- 129 014870 адаоОСасСд аддЬЫаЬсЬ ьсЬддБддеа даЬБаЬссаЬ аадаададЬд аЬдЬдссада 1732 аЬсасЬсЬдд даЬссЬЬдЬс ЪдасаадаСЬ саааддасЬа ааЬЬЬааИБс адЪсаЬдаас 1842 асБдссааЫ ассдЬЬЬаЬд ддЬадасаЬс ЬЫддаааЫ Ьссасаадд'Ь садасаЫсд 1902 саасЬаЬссс ссссаеасдс ссасасдЪа!: асЬссаасас ЬЫаЫаддс аЬсСдаЬСад 1962 ЬЪЬддааадЬ аЬдссЬссаЬ сьдааыадс ссадЬдЬддс ЬЬададЬЬдд ЬасаасаЬЬс 2022 ЬсасадааЫ СссЬааЬЬЫ дьаддььсад ссСдаЪаасс асСддадььс РЬЪддБасЬс 2082 аЬЬаааЬадс ЫЫсгса саЪСдсЪсЬд ссЬдЬЬасас аЬаЬдаЬдаа сасЬдсЫСЕ 2142 ьадасЬБсаЬ ЬаддааЬЬЬа ддасЬдсаЬс ЬЬдасаасЬд адссЬаЬЬсЬ асЪаЬакдЬа 2202 сааБассЬад сссаСааЬад дЬаЬасааЬа сасаЬЬЬддЬ аааасЬааЬЬ ЫсаассааС 2262 дасаЪдЬаЪС ЬЫсаасСад ЬаассЬадаа аСдЬЬЬсасЬ ЬааааЬсЬда даасСддЬЬа 232 2 сасьасаадь ЬассЫддад аЬЬсаСаЬа^ даааасдсаа асССадсЪа-С ЬЬдаСЬдЬаС 2382 ЬсасЕдддас ОСаадааЬдс дссЬдааЬаа ЫдБдадССс даЫ:ОдЫс1 ддсаддсЬаа 2442 ЁдассаЬЪЪс садЬааадЬд ааЬададдЪс адаадЬсдЬа саааададдЪ дЬЬдЬсадаа 2502 сассдЬЬдад аЬЬасаЬадд ЪдаасаасЬа ЫЫСаадса асЫЬаЬЫд ЬдкадЬдаса 2562 аадсаЪссса аЬдсаддсЬд аааЬдЬЫса ЬсасаЬсЬсЬ ддаЬсЬсЬсЬ аЬЪЬЬдЬдса 2622 дасаЬСдааа аааЬБдЬЬса ЬаЫаЫЬсс аЬдЪЬаосад ааЬаЫСдаЬ ЬЬЬЬЬааааа 2682 саСаддссаа дЬЬсаЬЬсас ЬЬсаЬЪаССс аЬЬЬаЪсааа аСсададСда аЬсасаЬЬад 2742 СсдссЬСсас аасЬдаЬааа даЬсасЬдаа дЬсаааССда ЬЫ:ЕЬдсЧас ааСсЬЬсааС 2802 сЬассЬаСаС ЫааЬЬдада ассСааааСд ЕасаааЬсас сдСдЬСдаЬЬ сЬдсадЬдаЕ 2862 сссдсЬаЬаа дсаадаоЬса дЬсссЕдаЫ сЬаддЬаЬсс ЬдЬдаааадс адааГСаада 2922 саааСасаса ададасааад сасааааааС аааЪаСсаЬа аддддаЬдаа сааааС.ддСд 2982 дадааададС адасааадЬЬ СЬСдаЬсасс СдссССсааа даааддеЬдс даассьсдсс 3042 сасСЬадаса дсЬЬддадас аадаааЫас ссаааадсаа ддсдаддадд аЪаддсаааа 3102 ададсадааа даСд^дааЪд дасаЬЬдССд адаааСдСда Ъаддааааса аЪсаЬадаЬа 3162 ааддаЬСЬсс аадсаасада дсаСаСосад асдаддьадд аЬдддаЬааа сСсЫаСОда 3222 ассааЬсЬЬс ассааььььд ЫСЫсССЫ дсададсаад сСаддааССд СсСсесСссС 3282 асЬдддсаса аБасасдсаЬ СдаСССССдс оСддааСаад ЬддаЬадаСа ЬаааасааСЬ 3342 СдСаСддСаЬ асассЪссаа сССССаСдаС адсЬдСЬСЬс сЬЬссааЬСд ссдчсссдас 3402 аЬССаааадс аСасСаСЬсс СдссаЬдсСС даддаадаад аЬасЬдаада ПадасаСдд 3462 Ыдддаадас дЮассаааа СЬаасаааас СдадаСаСдС ЬсссадСЬдС адааЬ Сосед 3522 счсасаеаса СС-СССдЬСса аСаСЬдаСаЬ аСсСсаСсас саасаСССса адсссдсасс 3582 СдЬСааЬааа аСдаЫаЫс ааддаааааа аааааааааа ааааа 3627 <210> 5 <211> 258 <212> РЕТ <213> Ното зар!епз <400> 5
МеС С1и Зег Агд Буз Азр Не ТЬг Азп С1п <31и С1и Беи Тгр Буз МеС
1 5 10 15
БуЗ Рго Агд Агд Азп Беи С1и С1и Азр Азр Туг Беи Н13 Буз Азр ТЬг
20 25 30
61у 61и ТЬг Зег МеЬ Беи Буз Агд Рго Уа1 Беи Беи ΗΪ3 Беи ΗΪ3 С1п
35 40 45
ТЬг А1а Ηίβ А1а Азр <31и РЬе Азр Суз Рго Зег в1и Беи <31п Н13 ТЬг
50 55 60
<Э1п С1и Беи РЬе Рго ΰΐη Тгр ΗΪ3 Беи Рго Не Буз Не А1а А1а Не
65 70 75 80
Не А1а Зег Беи ТЬг РЬе Беи Туг ТЬг Беи Беи Агд С1и Уа1 Не ΗΪ8
85 90 95
Рго Беи А1а ТЬг Зег Низ О1п <31П Туг РЬе Туг Буз Не Рго Не Беи
100 105 110
ν»ι Не Азп Буз Уа1 Беи Рго МеС Уа1 Зег Не ТЫ Беи Беи А1а Беи
115 120 12 5
Уа1 Туг Беи Рго С1у νβΐ Не А1а А1а Не Уа1 С1п Беи Нхз Авп С1у
130 135 14 0
ТЬг Буе Туг Буз Буз ₽Ье Рго Н13 Тгр Беи Азр Буз Тгр МеЬ Беи ТЬг
145 150 155 160
Агд ьуз С1п РЬе С1у Беи Беи Зег РЬе РЬе РЬе А1а Уа1 Беи Н1з А1а
165 170 175
Не Туг Зег Беи Зег Туг Рго МеС Агд Агд Зег Туг Агд Туг Буз Беи
180 185 190
Беи Азп Тгр А1а Туг <31п С1п Уа1 С1П 61п Азп Буз С1и Азр А1а Тгр
- 130 014870
195 200 205
Не е1и Ηίε Азр Уа1 Тгр Агд Мес С1и 11е Туг Уа1 Зег Деи С1у 11е
210 215 220
Уа1 <31у Деи А1а Не Деи А1а Деи Деи А1а Уа1 ТЬг Зег Не Рго Зег
225 230 235 240
Уа1 Зег Азр Зег Деи ТЬг Тгр Агд <31и РНе Ηίε Туг Не С51П Уа1 Азп
245 250 255
Авп Не <210? б <211? 1365 <212> ДНК <213> Ното зартепз <220?
<221? СОЗ <222? (36)...(944) <400? 5 ддддсссдса ссьсСдддса дсадсддсад ссдадасСса сддСсаадсС ааддсдаада 60 дСдддСддсС даадссаСас СаССССаСад ааСЬа аСд даа аде ада ааа дас 113
Мер С1и Зег Агд Дуз Авр
5
асе Не аса. аас саа <Э1п 10 даа даа С1и сСС Деи ьдд Тгр ааа Ъу& 15 аСд МеС аад ссС адд Агд ада Агд 20 ааС Авп ССа Деи 161
ТЬг Аз П Дуз Рго
даа даа дас да С СаС ССд сас аад дас асд дда дад асе аде аСд сСа 209
<31и <31и Азр Авр Туг Деи Н1з Дуз Азр ТЬг <31у С1и ТЬг Зег МеС Деи
25 30 35
ааа ада ссС дСд сСС ССд сас ССд сас саа аса дсс саС дсС даС даа 257
Дув Агд Рго Уа1 Деи Деи Н1в Деи Ηϊβ С1п ТЬг А1а Ηίε А1а Азр <Э1и
40 45 50
ССС дас Сдс ссС Сса даа есс сад сас аса сад даа сес ССС сса сад 305
РЬе Азр Сув Рго Зег (31и Деи С1п Н1з ТЬг С1п С1и Деи РЬе Рго С1п
55 60 65 70
ьдд сас ССд сса аСС ааа аСа дсС дсС аСС аса дса СсС сСд асС ССС 353
Тгр Ηίε Деи Рго Не Дуз Не А1а А1а Не 11е А1а Зег Деи ТЬг РЬе
75 80 85
сер Рас асС сСС сСд адд даа дСа аСС сас ссе ССа дса асе ссс саС 401
Деи Туг ТЬг Деи Деи Агд <31и Уа1 Не Ηίε Рго Деи А1а ТЬг Зег НДз
90 95 100
саа саа СаС ССС СаС ааа аСС сса аСс сСд дСс аСс аас ааа дсе ССд 449
С1п б1п Туг РЬе Туг Дув Не РГО Не Деи Уа1 Не Авп Дуз Уа1 Деи
105 110 115
сса аСд дсе Ссс асе асе сСс ССд дса ССд дСС сас сСд сса ддС дед 497
Рго Мее Уа1 Зег Не ТЬг Деи Деи А1а Деи Уа1 Туг Деи Рго <31у Уа1
12 0 125 130
аСа дса дса аЪЪ дСс саа сСС саС ааС дда асе аад СаС аад аад еее 54 5
Не А1а А1а 11е Уа1 <31п Деи Ηίβ Авп С1у ТЬг Дуз Туг Дуз Дуз РЬе
135 140 145 150
сса саС £дд ССд дас аад сдд аСд ССа аса ада аад сад ССС ддд сСС 593
Рго Ηίε Тгр Деи Азр Дуз Тгр мес Деи ТЬг Агд Дув <31п РЬе (31у Деи
- 131 014870
155 160 165
скс адк Скс ккк ккк дек дСа скд саС дса аСк Сак адк скд кек Нас 641
Ьеи Зег РНе РНе РНе А1а ν»1 Ьеи Нез А1а Не Туг Зег Ьеи Зег Туг
170 17 5 180
сса акд адд еда кос сас ада Нас аад ССд ска аас едд дса Сак саа 689
Рго Мек Агд Агд Зег Туг Агд Туг Ьуз ьеи Ьеи Азп Тгр А1а Туг 61п
185 190 1Э5
сад дкс саа саа аак ааа даа да С дсс едд акк дад сак дан дкк ьдд 737
Θΐη Уа1 31п С1п АЗП ьуз С1и Азр А1а Тгр Не С1и Ηίθ Азр Уа1 Тгр
200 205 210
ада акд дад акк Сак дед СсС сСд дда акк дкд дда ккд дса ака Скд 785
Агд Мек С1и Не Туг Уа1 Зег Ьеи 61у Не Уа1 е1у Ьеи А1а Не Ьеи
215 220 225 230
дек. с кд ккд дек дкд аса Сек акк сса кек дкд адк дас Сек ккд аса 833
А1а Ьеи Ьеи А1а Уа1 ТНг Зег Не Рго Зег Уа1 Зег Азр Зег Ьеи ТНг
235 240 245
Ьдд ада даа ккк сас СаС аСС сад акс акс сак аад аад адк да к дед 881
Тгр Агд <31и РНе ΗΪ3 туг Не С1п Не Не Н1в Ьуз Ьуз Зег Азр Уа1
250 255 260
сса даа кса скс Сдд даС сск кдк сСд аса ада Скс ааа дда ска аак 929
Рго 61и Зег Ьеи Тгр Азр Рго Суз Ьеи ТНг Агд РНе Ьуз С31у Ьеи Азп
265 270 275
Ска акк сад Сса кда асаскдссаа ССассдкССа кдддкадаса СсСкСддааа 934 Ьеи Не <31п Зег *
280 кккссасаад адсаадскад дааккдкккс ссккскаскд ддсасаакас асдсаккдак 1044 ккккдсскдд аакаадкдда кадакакааа асаакксдка кддкакасас скссаасккк 1104 какдакадск дккккссккс саакСдккдк ссСдакаккк аааадсаСас какксскдсс 1164 акдсккдадд аадаадакас кдаадаккад асакддккдд даадасдкса ссааааккаа 1224 сааааскдад акакдккссс адккдкадаа ккаскдккка сасасакккк СдСксааСаС 1284 кдакакаккк каксассаас акСксаадкк СдкакССдкк аакаааакда ССаССсаадд 1344 аааааааааа аааааааааа а 1365 <210? 7 <211> 282 <212? РКТ <213> Ното вар!епв <400? 7
Мек <31и Зег Агд Ьуз Азр Не ТНг Азп С1п С1и С1и Ьеи Тгр Ьуз Мек
1 5 10 15
Ьуз Рго Агд Агд Азп Ьеи <31и С1и Азр АЗР Туг Ьеи Н13 ьуз Азр ТНг
20 25 30
О1у С1и ТНг Зег Мек Ьеи Ьуз Агд Рго Уа1 Ьеи Ьеи Н1з Ьеи Н1в С1п
35 40 45
ТНг А1а ΗΪ3 А1а Азр <Э1и РНе Азр Суз Рго Зег С1и Ьеи С1п Н1 в ТНг
50 55 60
αΐη С1и Ьеи РНе Рго С1п Тгр Н1з Ьеи Рго Не Ьуз Не А1а А1а Не
65 70 75 80
Не А1а Зег Ьеи ТНг РНе Ьеи Туг ТНг Ьеи Ьеи Агд <31и Уа1 Не ΗίΒ
85 90 95
Рго Ьеи А1а ТНг Зег Ηίε С1п <31п Туг РНе Туг Ьуз Не Рго Не Ьеи
100 105 НО
Уа1 Не Азп Ьуз Уа1 Ьеи Рго мес Уа1 Зег Не ТНг ьеи Ьеи А1а Ьеи
115 120 125
- 132 014870
Уа1 туг Ьеи 13С Рго 61у Уа1 Не А1а А1а 135 Не Уа1 Й1п 140 Ьеи ΗΪ8 Азп 31у
ТНг Ьуз Туг Ьуз Ьуз РИе Рго Н1з Тгр Ьеи Азр Ьуз Тгр мее Ьеи ТНг
145 150 155 160
Агд ьуз С1п РНе С1у Ьеи ьеи Зег РНе РНе РНе А1а Уа1 Ьеи Н13 А1а
165 170 175
Не Туг Зег Ьеи Зег Туг Рго МеН Агд Агд Зег Туг Агд Туг Ьуз Ьеи
180 185 190
Ней Азп Тгр А1а Туг (31п <Э1п Уа1 01п С1п Азп Ьуз С1и Азр А1а Тгр
195 200 205
Не 31и Η1Ξ Азр Уа1 Тгр Агд мее С1и Не Туг Уа1 зег Ьеи (31у 11е
210 215 220
Уа1 <31у Ьеи А1а Не Ьеи А1а Ьеи Ьеи А1а Уа1 ТНг Зег Не Рго Зег
225 230 235 240
Уа1 Зег Азр Зег Ьеи Ткг Тгр Агд Е1и РНе Н13 Туг Не С1п Не Т1е
245 250 255
Н1з Ьуз Ьуз Зег Азр Уа1 Рго О1и Зег Ьеи Тгр Азр Рго Суз Ьеи ТНг
260 265 270
Агд РНе Ьуз С1у Ьеи Азп Ьеи Не Е1п Зег
275 280
<210> 8 <211> 3627 <212> ДНК <213> Ното еаргепз <220>
<221> СОЗ ¢222:. (96) . . . (872) <400> 8 ддддсссдса ссеседддса дсадсддсад ссдадасеса сддесаадсе ааддсдаада 60 дедддСддсе даадссаеас еасеееаеад ааееа аед даа аде ада ааа дас 113
Меб С1и Зег Агд Ьуз Азр
5
аес Не аса ТНг аас Азп саа 01п 10 даа 31и даа 31и сее ьеи едд Тгр ааа ьуз 15 аед мее аад Ьуз ссе Рго адд Агд ада Агд 20 ааН Азп ееа Ьеи 161
даа даа дас дае еае еед сае аад дас асд дда дад асе аде аед сеа 209
С1и (31и Азр Азр Туг Ьеи Н1з Ьуз Азр ТНг <31у <31и ТНг Зег Мее Ьеи
25 30 35
ааа ада ссе дкд сее еед сае еед сас саа аса дсс сае дсе дае даа 257
ьуз Агд Рго νβΐ Ьеи ьеи НЬз Ьеи Н1з 01п ТНг А1а Нхз А1а Азр Е1и
40 45 50
еее дас еде ссе еса даа сее сад сас аса сад даа сес еее сса сад 305
Рке Авр Суз Рго Зег С1и Ьеи 61п Н18 ТНг 61п 61и Ьеи РНе Рго 01п
55 60 65 70
едд сас еед сса аее ааа аеа дсе дсе аее аеа дса есе сед асе еее 353
Тгр ΗΪ3 Ьеи Рго 11е Ьуз 11е А1а А1а Не Не А1а Зег Ьеи ТНг РНе
75 80 85
сее еае асе сее сед адд даа де а аее сас ссс ееа дса асе есс сае 401
Ьеи туг Ткг Ьеи Ьеи Агд С1и Уа1 Не Шз Рго Ьеи А1а ТНг Зег Н1з
90 95 100
саа саа еае еее еае ааа аее сса аес сед дес аес аас ааа дес еед 449
е1п 01п Туг Рке Туг Ьуз Не Рго Не Ьеи Уа1 Не Азп Ьуз Уа1 Ьеи
105 110 115
- 133 014870
сса аБд дрр Бсс Зег аБс Не асБ ТНг ере Беи 125 РРд Беи дса РРд А1а Беи дББ Рас сРд Беи сса Рго ддр СБу дрд УаБ 497
Рго Мер Уа1 УаБ Туг 130
120
аБа дса дса арр дрс саа сББ саР ааР дда асе аад БаБ аад аад БРР 545
Не А1а А1а Не УаБ σΐη Беи Н1з Азп СБу ТНг Буе Туг Буз Буз РНе
135 140 14 5 150
сса саР рдд РРд дар аад рдд аБд ББа аса ада аад сад БРР ддд сББ 593
Рго н!з Тгр Беи Азр Буз Тгр МеР Беи ТНг Агд Буз С1п РНе СБу Беи
155 160 165
сБс адр РРд БРР БРР дер дРа егд саР дса аРР БаБ адр сБд БсР Бас 641
Беи Зег Беи РНе РНе АБа УаБ Беи НБз А1а Не Туг Зег Беи Зег Туг
170 175 180
сса аБд адд еда Бес Бас ада Бас аад РЬд сБа аас ьдд дса БаЬ саа 689
Рго Мер Агд Агд Зег Туг Агд Туг Буз Беи Беи Азп Тгр А1а Туг С1п
185 190 195
сад дрс саа саа ааБ ааа даа дар дес рдд аРБ дад саР даР дес £дд 737
С1п Уа1 С1п 61п Азп Буз СБи Азр А1а Тгр Не СБи Н1з Азр УаБ Тгр
200 205 210
ада аЬд дад арр Ба Б дБд БсБ сРд дда аРЬ дЬд дда РРд дса аБа орд 785
Агд Мер <31и Не Туг УаБ Зег Беи. СБу Не УаБ СБу Беи А1а Не Беи
215 220 225 230
дес сРд РРд дсР дрд аса РСР аБР сса РСР дБд адБ дас РсБ РРд аса 833
А1а Беи Беи АБа УаБ ТНг Зег Не Рго Зег УаБ Зег Азр Зег Беи ТНг
235 240 245
Бдд ада даа БРР сас Бар аББ сад дБ а аар аар аБа Раа ааБаасссБа 882
Тгр Агд С1и РНе Η1Ξ Туг Не (ЗБп УаБ Азп Азп Не 4с
250 255
ададдБаэ.аБ аБаасаааБд сРдРБдББББ аРБааааРаБ ББББдадаБд асБдсаассБ ддаББасадд ЬББсссаБдБ ссБсссааад БББдааасББ саБддБЬБаБ срББраБдББ адЬББББаБс саББББаРаБ адаРББасБд аРсасБсБдд асБдссааБР саасБаБссс БББддааадР БсасадааББ аРБаааБадс БадасББсаБ сааЬассрад дасаЬдЬаЬЬ сасЕасаадБ РсасРдддас сРРсРРРРРд РБРББсааса сссРаРРдсР рсрррдрррр аадРсРсдсР дсдссРссРд сасссаБсас РддссаддсР рдсРдддаРд дррадасаар РаРЬРсРРаа асасаасБРа БассааадаР асБРасРсас аддБЕБаРсБ даРссРРдРс ассдРРРаРд ББсЕасаЕдс аБдссЕссаь РссРааРРРР БББсББсаса РаддааРРРа сссаРаабад БББсаасБад РассРРддад РРаадааРдс
РдРРРаРдаР дсааадарср РсРааРРадд рррррррррд сРдРРдссса ддРРсаддсд саРдРссадс ддРсРсдаРс асадРРдРда РРдсРассса ааааааРаББ дсасБББсса аРдсБадБдР РРдаадРРРс РсРддЬддРа РдасаадаРР ддРадасаРс ссасасдБаБ сРдааРРадР дРаддРРсад саРБдсБсБд ддасБдсаБс дРаРасааБа РаассБадаа аБЬсаРаРаР дссРдааРаа аРадааРаРд Сабасррдрр асаадРдРРР рррдрррдрр БдсРддадРа аРЬсРсРРдс рааРРБРРдБ РссРдассРс дссассасас БсБааРдБда сББББассСд дааасааааа сбсаЬРРсаа РаааРаРРсР даЬРаРссаР саааддасБа БРРддаааСР асрссаасас ссадрдрддс ссРдаРаасс ссрдЬЬасас ББдасаасРд сасаРБРддБ аРдРРЪсасР даааасдсаа РБдРдадРРс
РРдасРРРас ссааРРааРа ссРадасаРа БРББдББЬдБ садрддсасд сРсадссРсс аРрРБРадБа аааРдаБссд РсадсаРдсР БаБРРРадда БсассРдааР сБсБсБссББ аддсрдсБЬР РдРааРРРРа аадаададрд ааРРРааРРс РссасааддР БББаББаддс РРададРРдд асРддадРРс арардардаа адссРаРРсР аааасБааББ ЬааааРсЬда асРРадсРаР даРБРдБРсР сссаРааааа ардрдсрсрс ааРааааддс ББдБРБдБББ аРсБсддсБс БдадРадсБд дадасадддб сссассРсдд сБРСсРааРа асссааБаРд БрадРаардс даааБааБад ББссадсБРа ааасБаСсРс аБдРдссада адБсаРдаас садасаББсд аРсБдаБРад БасаасаРЕс РРбддБссРс сасЕдсББББ асБаРаРдРа БРсаассааР даасБддББа ррдаррдрар ддсаддсраа
942
1002
1052
1122
1132
1242
1302
1362
1422
1482
1542
1602
1662
1722
1782
1842
1902
1962
2022
2082
2142
2202
2262
2322
2382
2442
- 134 014870
ОдассаСООс сассдООдад аадсаЪссса дасаоодааа саОаддссаа ОсдссООсас сОассОаОаО ссОдсОаОаа саааЪасаса дадааададр сасооадаса ададсадааа ааддаООЪсс ассаарсОСс асЪдддсаса ОдОаЪддОаО аООСаааадс ООдддаадас ООСасасаса ОдООаарааа садСааадОд аООасаОадд аОдсаддсОд аааООдкОса дРОсаОксас ааскдаСааа ОкааРОдада дкаадаскса ададасааад адасааадкк дсккддадас даОдкдааОд аадсаасада ассааооокд акасасдсаО асассОссаа аСасОакОсс дксассаааа кОкккдккса ардаккаккс аакададдкс кдаасааска ааакдкккса каккаккксс кксаООаккс даксаскдаа аксОаааакд дкссскдакк сасаааааак кккдаксасс аадаааккас дасаккдккд дсаОакссад кккккскккк кдакОЬккдс сккккакдак кдссакдскк ккаасаааас акаккдакак ааддаааааа адаадксдка кккккаадса ксасакскск акдккаксад акккаксааа дксаааккда касаааксак ккаддкаксс аааОаОсака Одсскксааа ссаааадкаа адааакдкда акдаддОадд дсададсаад скддаакаад адскдккккс даддаадаад Одадакакдк аккккаксас аааааааааа каааададдк аскккакккд ддакскскск аакакккдак аксададкда кккккдскак ОдкдкОдакк кдкдаааадс аддддакдаа даааддскдк ддкдаддадд каддааааса акдддакааа скаддааккд кддакадака сккссааккд акаскдаада Осссадккдк саасакккса ааааа дккдксадаа кдкадкдаса аорккдкдса кккккааааа аксасаккад аакскксаак содсадкдак адааккаада саааакддкд дааОкккдкО акаддсаааа аксакадака сксккаккда Скксссккск каааасаакк ккдксскдак Ькадасакдд адааккаскд адкккдОакк
2502 2562 2622 2652 2742 2802 2862 2922 2982 3042 3102 3162 3222 3282 3342 3402 3462 3522 3582 3627 <210> 9 <211> 258 <212=· РНТ <213> Ното зархепз <400> 9
Мек <31и Бег Агд Буз Азр Не ТЬг Авп С1п С1и С1и Беи Тгр Буе МеС
1 5 10 15
Буе Рго Агд Агд Ава Беи <31и 01и Авр Авр Туг Беи Н13 Буз Азр ТЬг
20 25 30
С1у <31и ТЬг Зег Мер Беи Буз Агд Рго 7а1 Беи Беи Н1з Беи Ηί3 С1п
35 40 45
ТЬг А1а Нгз А1а Аер 01и РЬе Азр Суз Рго Зег 01и Беи 31п Н13 ТЬг
50 55 60
С1п 01и Беи РЬе Рго С1п Тгр Н13 Беи Рго Не Буз 11е А1а А1а Не
65 70 75 80
Не А1а Зег Беи ТЬг РЬе Беи Туг ТЬг Беи Беи Агд 01и Уа1 Не Н1з
85 90 95
Рго Беи А1а ТЬг Зег Н1з <31п 01п Туг РЬе Туг Буз Не Рго Не Беи
100 105 110
Уа1 Не Азп Буе Уа1 Беи Рго Мер Уа1 Зег Не ТЬг Беи Беи А1а Беи
115 120 12 5
Уа1 Туг Беи Рго 01у Уа1 11е А1а А1а Не Уа1 С1п Беи Н13 Азп С1у
130 135 140
ТЬг Буе Туг Буз Буз РЬе Рго Н1з Тгр Беи Авр Бу в Тгр мео Беи ТЬг
14 5 150 155 160
Агд Буз С1п РЬе <31у Беи Беи Зег Беи РЬе РЬе А1а Уа1 Беи Н1з А1а
165 170 175
Не Туг Зег Беи зег Туг Рго Мео Агд Агд Зег Туг Агд Туг Буз Беи
180 185 190
Беи Авп Тгр А1а Туг С1п αΐη Уа1 С1п С1п Азп Буз С1и Азр А1а Тгр
195 200 205
Не С1и ΗΪ8 Азр Уа1 Тгр Агд мео 51и Не Туг Уа1 Зег Беи 61у Не
210 215 220
νβΐ 01у Беи А1а 11е Беи А1а Беи Беи А1а Уа1 ТЬг Зег Не Рго Зег
225 230 235 240
νβΐ Зег Азр Зег Беи ТЬг Тгр Агд О1и РЬе Ηίε Туг Не 01п Уа1 Азп
245 250 255
Азп Не
<210> 10
- 135 014870 <211> 3627 <212> ДНК <213> Ното зар!епз <220>
<221> СОЗ <222> (96)...(872) <400> 10 ддддсссдса сскскдддса дсадсддсад ссдадаскса сддксаадск ааддсдаада 60 дЬдддкддск даадссакас какеккакад аакка акд даа аде ада ааа дао 113
Мек С1и Зег Агд Ьуз Азр
5
акс Не аса Ткг аас Азп саа <31п 10 даа С1и даа 61и сее Ьеи едд Тгр ааа Ьуз 15 акд МеС аад Ьуз ссе Рго адд ада аак Азп кПа Ьеи 161
Агд Агд 20
даа даа дас даС СаС еед сае аад дас асд 9*9 асе аде акд ска 209
С1и С1и Авр Азр Туг Ьеи Н1з Ьуз Азр Ткг С1у Я1и Ткг Зег Мек Ьеи
25 30 35
ааа ада ссе дед сее еед сак еед сас саа аса дсс сак дек дак даа 257
Ьуз Агд Рго Уа1 Ьеи Ьеи Н1з Ьеи Н1з <31п Ткг А1а Н1з А1а Авр <31и
40 45 50
ккк дас Идс ссе Пса даа сее сад сас аса сад даа сСс ккк сса сад 305
Рке Азр Суз Рго Зег <31и Ьеи <31п Н1з Ткг <Э1п 31и Ьеи Рке Рго σΐη
55 60 65 70
Ьдд сас И Ид сса аее ааа ака дсе дсС аее ака дса есе скд аск ккк 353
Тгр ΗΪ8 Ьеи. Рго Не Ьуз Не А1а А1а Не Не А1а Зег Ьеи Ткг Рке
75 80 85
СПИ Пас асе асе сед адд даа дПа аее сас ссе ееа дса аск ксс сак 401
Ьеи Туг Ткг Ьеи Ьеи Агд С1и Уа1 Не ΗΪ3 Рго Ьеи А1а Ткг Зег Н1з
90 95 100
саа саа Сае ссе НаС ааа аее сса акс сед дес акс аас ааа дке ккд 449
(31п (31п Туг рке туг ьуз 11е Рго Не Ьеи Уа1 Не Азп Ьуз Уа1 Ьеи
105 110 115
сса акд дне есс аСс асе сес еед дса еед дне Нас сед сса дде дед 497
Рго Мек Уа1 зег 11е Ткг Ьеи Ьеи А1а Ьеи ча1 Туг Ьеи Рго С1у Уа1
120 125 130
ака дса дса аее дСс саа сее сак аае дда асе аад как аад аад ккк 545
Не А1а А1а 11е ν&1 <Э1п Ьеи ΗΪ3 Азп 61у Ткг Ьуз Туг Ьуз Ьуз Рке
135 140 145 150
сса сак ьдд ССд даС аад Ьдд акд ССа аса ада аад сад ккк ддд екк 593
Рго ΗΪΒ Тгр Ьеи Авр Ьуз Тгр МеС Ьеи Ткг Агд Ьуз <Э1п Рке 31у Ьеи
155 160 165
скс адк еес еее еее дсе дПа сед сае дса аее Пае адк скд кек кас 641
Ьеи Зег Рке Рке РЬе А1а Уа1 Ьеи ΗΪ8 А1а Не Туг Зег Ьеи Зег Туг
170 175 130
сса акд адд еда есс Пас ада Пас аад ъед ска аас кдд дса как саа 689
Рго Мек Агд Агд Зег Туг Агд Туг Ьуз Ьеи Ьеи Азп Тгр А1а Туг <31п
185 190 195
сад дПс саа саа ааС ааа даа даН дсс ьдд аее д*д сак дак дке едд 737
Θΐη Уа1 Θΐη 01п Аеп Ьуз 61и Авр А1а Тгр не О1и ΗΪ3 Азр Уа1 Тгр
- 136
200 205210 ада аСд дад аСС СаС дСд СсС сед дда асе дСд дда ссд дса аса ссд785
Агд Мес 01и 11е Туг Уа1 Зег Беи (31у Не ¥а1 01у Беи А1а 11еБеи
215 220 225230
дсС А1а сСд ССд дсС А1а дьд νβΐ 235 аса Таг СсС Зег асе Не сса Рго Ссс дСд адС Зег дас Азр СсС Зег ссд аса 833
Беи Беи Зег 240 Уа1 Беи 245 ТИг
Сдд ада даа ссс сас СаС аЬС сад дса ааЕ аас аса Саа ааСаасссСа 882
Тгр Агд С1и Р11С Н1з Туг Не 01п Уа1 Азп Аз η 11е ★
250 255 ададдСаааС сССсСССССд СдСССаСдаС аСадааСаСд ССдасСССас сссаСааааа942 аСаасааард СССССсааса дсааадаСсС СаСасССдСС ссааССааСа аСдБдсСсСс1002 сСдССдСССС сссСаССдсС СсСааССадд асаадСдССС ссСадасаСа ааСааааддс1062 аЪСааааСаС СсСССдСССС СССССССССд СССдСССдСС СССЬдСССдЬ ССдСССдССС1122
ССССдадаСд аадСсСсдсС сСдССдссса СдсСддадСа садСддсасд аСсСсддсСс1182 асСдсаассС дсдссСОсСд ддССсаддсд аССсСсССдс сСсадссСсс СдадСадсСд1242 ддаССасадд сасссаСсас саСдСссадс саасссссдс аСССЬЬадса дадасадддс1302
СССсссаСдС СддссаддсЬ ддСсСсдаСс СссСдассСс аааСдаСссд сссассСсдд1362 ссссссааад сдссдддасд асадссдрда дссассасас СсадссСдсС сссссСааСа1422
СССдааасСС дССадасааС ССдсСассса СсСааСдСда СаЬСССадда аСссааСаСд1482 саСддСССаС СаСССсССаа ааааааСаСС сСЬССассСд СсассСдааЬ ССадСааСдс1542 сССССаСдСС асасаасССа дсасСССсса дааасааааа сСсСсСссСС даааСааСад1602 адСССССаСе СассааадаС аСдсСадрдС сСсаСССсаа аддсСдсССС ССссадсССа1662 саССССаСаС асССасСсас ССдаадСССс СаааСаССсЬ сдСааССССа ааасСаСсСс1722 адаЬССасСд аддСССаСсС СсСддСддСа даССаСссаС аадаададСд аСдЬдссада1782 аСсасСсСдд даСссССдСс СдасаадаСС саааддасСа ааСССааССс адСсаСдаас1842 асСдссааСС ассдСССаСд ддСадасаСс СССддаааСС СссасааддС садасаССсд1902 саасСаСссс ССсСасаСдС ссасасдСаС асСссаасас СССаССаддс аСсСдаССад1Э62
СССддааадЪ аСдссСссаС сСдааССадС ссадСдСддс ССададССдд СасаасаССс202Ξ
СсасадааСС ссссааСССС дсаддсссад сссдасаасс асСддадССс сссддСссСс2082 аССаааСадс ССЬсССсаса саССдсСсСд ссСдСЬасас аСаСдаСдаа сасСдсСССС2142
СадасССсаС СаддааСССа ддасСдсаСс ССдасаасСд адссСаССсС асСаСаСдСа2202 сааСассСад сссаСааСад дСаеасааСа сасаСССддС аааасСааСС ССсаассааС2262 дасасдсасс ССЬсаасСад СаассСадаа аСдСССсасС СааааСсСда даасСддССа2322 сасЬасаадС СассЬСддад аССсаСаСаС даааасдсаа асССадсСаС ССдаССдСаС2382 ссассдддас ССаадааСдс дссСдаасаа ССдСдадССс даСССдССсС ддсаддсСаа2442
СдассаСССс садСааадСд ааЬададдСс адаадСсдСа СаааададдС дССдЬсадаа2502 сассдССдад аССасаСадд СдаасаасСа СССССаадса асСССаСССд сдсадсдаса2562 аадсаСссса аСдсаддсСд аааСдСССса СсасаСсСсС ддаСсСсСсС аССССдСдса2622 дасаССдааа аааССдБСса СаСЬаСССсс аСдССаСсад ааСаСССдаС СССССааааа2682 саСаддссаа дССсаССсас ССсаССаССс аСССаСсааа аСсададСда аСсасаССад2742
СсдссССсас аасСдаСааа даСсасСдаа дСсаааССда СССССдсСаС ааСсССсааС2802 сСассЪаЪас ЪСаасСдада аСсСааааСд СасаааСсаС СдСдССдаСС сСдсадСдаС2862 ссСдсСаСаа дСаадасЪса дСссоСдаСС ССаддСаСсс СдСдаааадс адааССаада2922 саааСасаса ададасааад сасааааааС аааСаСсаСа аддддаСдаа сааааСддСд2982 дадааададе адасааадСС ССЬдаСсасс СдссСЬсааа даааддсСдб дааСЬССдСС3042 сасЬСадаса дсССддадас аадаааСЬас ссаааадСаа ддСдаддадд аСаддсаааа3102 ададсадааа даСдСдааСд дасаССдССд адааасдсда Саддааааса аСсаСадаСа3162 ааддаСССсс аадсаасада дсаСаСссад аСдаддСадд аЪдддаСааа сСсССаССда3222 ассааСсССс ассааССССд СССССсСССС дсададсаад сСаддааССд СССсссССсС3282 асСдддсаса аСасасдсаС СдаСССССдс сСддааСаад СддаСадаСа СаааасааСС3342
Бдсасддсас асассСссаа сссссасдас адссдсСЪЪс сССссааССд ссдСесСдаЪ340Ξ аСССаааадс аСасСаССсс СдссаСдсСС даддаадаад аСасСдаада ССадасаСдд3462
ССдддаадас дСсассаааа сСаасаааас СдадаСаСдС СсссадССдС адааСбасСд3522
СССасасаса СССССдССса аСаССдаСаС аССССаСсас саасаССЬса адСССдСаСС3582
СдССааСааа аСдаССаССс ааддаааааа аааааааааа ааааа3627 <210> 11 <211> 258 <212> РЕТ
- 137 014870 <213> Ното заргепз <400> 11
мег <31и Зег Агд Ьуз Азр 11е Ткг Азп О1п С1и С1и Ьеи Тгр Ьуз Мек
1 5 10 15
ьув Рго Агд Агд Азп ьеи (31 и 01и Азр Азр Туг Ьеи ΗίΒ Ьуз Авр Ткг
20 25 30
С1у <Э1и ТЬг Зег Мек Ьеи Ьуз Агд Рго Уа1 Ьеи Ьеи ΗΪ3 Ьеи ΗΪ3 01п
35 40 45
Ткг А1а Н1з А1а Азр С1и Рке Азр Суз Рго Бег <31и Ьеи <31п Н1в Ткг
50 55 60
е1п С1и Ьеи Рке Рго <Э1п Тгр Нгз Ьеи Рго Не Ьуз Не А1а А1а 11е
65 70 75 30
Не А1а Зег Ьеи Ткг Рке Ьеи Туг Ткг Ьеи Ьеи Агд С1и Уа1 Не ΗΪ3
85 90 95
Рго Ьеи А1а Ткг Зег Н1з С1п С1п Туг Рке Туг Ьуз Не Рго Не Ьеи
100 105 но
17а1 Не Азп Ьуз Уа1 Ьеи Рго Мек 7а1 Зег Не Ткг Ьеи Ьеи А1а Ьеи
115 120 125
Уа1 Туг Ьеи Рго <31у Уа1 11е А1а А1а Не Уа1 <31п Ьеи Н1в Азп 01у
130 135 140
Ткг Ьуе Туг Ьуз Ьуз Рке Рго Н1з Тгр Ьеи Азр Ьуз Тгр Мек Ьеи ткг
145 150 155 160
Агд Ьуз 01П Р?_е 61у Ьеи Ьеи Зег РЪе Рке Рке А1а Уа1 Ьеи Нгз А1а
165 170 175
Не Туг Зег Ьеи Зег Туг Рго мео Агд Агд Зег Туг Агд Туг Ьуз Ьеи
180 1ΘΞ 190
Ьеи Азп Тгр А1а Туг С1п (31п Уа1 О1в О1п Азп Ьуз (31и Азр А1а тгр
195 200 205
Не 01и Н15 Азр Уа1 Тгр Агд Мек С1и 11е Туг Уа1 Зег Ьеи О1у Не
210 215 220
Уа1 61у Ьеи А1а Не Ьеи А1а Ьеи Ьеи А1а Уа1 Ткг Зег Не Рго Зег
225 230 235 240
Уа1 Зег Азр Зег Ьеи Ткг Тгр Агд С1и Рке Н13 Туг Не С1п ν&1 Азп
245 250 255
Азп Не <210> 12 <211> 3627 <212> ДНК <213> Ното еар!епв <22 0>
<221> СПЗ <222> [96}...[872) <400> 12 ддддсссдса сскскдддса дсадсддсад ссдадаскса сддксаадск ааддсдаада 60 дкдддкддск даадссакас Ьаккккакад аакка акд даа аде ада ааа дао 113
Мер 01и Зег Агд Ьуз Азр
1 5
а£с аса аас саа даа даа екк £дд ааа акд аад сск адд ада аак кка 161
Не ТИг Азп 01п С1и 01и Ьеи тгр Ьуз Мек Ьуз Рго Агд Агд Азп Ьеи
10 15 20
даа даа дас да к как ккд сак аад дас асд дда дад асе аде акд ска 209
С1и С1и Азр Азр Туг Ьеи Н1з Ьуз Азр Ткг С1у 01и Ткг Зег Мек Ьеи
25 30 35
ааа ада сск дкд екк ккд сак ккд сас саа аса дсс сак дек дак даа 257
ьуз Агд Рго Уа1 Ьеи Ьеи Ηίβ Ьеи ΗΪ3 О1п Ткг А1а ΗΪ3 А1а Авр (31и
- 138 014870
40 45 50
ЕЕЕ дас Еде ССЕ Еса даа С ЕЕ сад сас аса сад даа сЕс ЕЕЕ сса сад 305
РЬе Азр Суз Рго Зег С1и Ьеи Й1п Нхз ТЬг С1п С1и Ьеи РЬе Рго С1п
55 60 65 70
бдд сас ЕЕд сса аЕЕ ааа аЕа дсЕ дсЕ аЕЕ аЕа дса ЕсЕ сЕд асЕ ЕЕЕ 353
Тгр Ηίε Ьеи Рго Не ьуз Не А1а А1а Не Не А1а Зег Ьеи ТЬг РНе
75 80 85
СЕЕ бас асЕ сЕЕ сЕд адд даа дЕа аЕЕ сас ССС ЕЕа дса асЕ Есс саЕ 401
Ьеи туг Тки ьеи Ьеи Агд <31и Уа1 11е Ηίβ Рго Ьеи А1а ТЬг Зег ΗΪ3
90 95 100
саа саа Гас ЕЕЕ ЕаЕ ааа аЕЕ сса аЕс сЕд дЕс аЕс аас ааа дке ЕЕд 449
Θΐη С1п Туг РЬе Туг Ьуз Не Рго 11е Ьеи Уа1 11е Азп Ьуз Уа1 Ьеи
105 110 115
сса аЕд дЕЕ Есс аЕс асЕ сЕс ЕЕд дса ЕЕд 9ЕЕ Еас сЕд сса ддЕ дЕд 497
Рго МеЕ Уа1 Зег 11е ТЬг Ьеи Ьеи А1а ьеи Уа1 Туг Ьеи Рго <31у ν»1
12 0 125 130
аЕа дса дса аЕЕ дЕс саа сЕЕ саЕ ааЕ дда асе аад ЕаЕ аад аад ЕЕЕ 545
Не А1а А1а Не Уа1 <31п Ьеи Ηίε Азп С1у ТЬг Ьуз Туг Ьуз Ьуз РНе
135 140 145 150
сса саЕ Едд ЕЕд даЕ аад Едд аЕд ЕЕа аса ада аад сад ЕЕЕ ддд СЕЕ 593
Рго ΗΪΞ Тгр Ьеи Азр Ьуз Тгр МеЕ Ьеи ТЬг Агд Ьуз С1п РЬе (31у Ьеи
155 160 165
сЕс адЕ ЕЕс ЕЕЕ ЕЕЕ дсЕ дЕа сЕд саЕ дса аЕЕ ЕаЕ адЕ сЕд ЕСЕ Еас 641
Ьеи Зег Рке Рке РЬе А1а Уа1 Ьеи Шз А1а Не Туг Зег Ьеи Зег Туг
17 0 17 5 180
сса аЕд адд еда Есс Еас ада Еас аад ЕЕд СЕа аас Едд дса ЕаЕ саа 689
Рго МеЕ Агд Агд Зег туг Агд туг Ьуз Ьеи Ьеи Азп Тгр А1а Туг С1п
185 190 195
сад дЕс саа саа ааЕ ааа даа даЕ дсс Едд аЕЕ дад саЕ даЕ дЕЕ ьдд 737
С1п Уа1 С1п С1п Азп Ьуз О1и Азр А1а Тгр Не 61и Нхз кар Уа1 Тгр
200 205 210
ада аЕд дад аЕЕ ЕаЕ дЬд ЕсЕ сЕд дда аЕЕ дЕд дда ЕЕд дса аЕа сЕд 785
Агд мег С1и 11е Туг Уа1 Зег Ьеи <31у Не Уа1 С1у Ьеи А1а Не Ьеи
215 220 225 230
дсЕ сЕд ЕЕд дсЕ дЕд аса ЕсЕ аЕЕ сса ЕСЕ дЕд адЕ дас ЕсЕ ЕЕд аса 833
А1а Ьеи Ьеи А1а Уа1 ТЬг Зег Не Рго Зег Уа1 Зег Азр Зег Ьеи ТЬг
235 240 245
Едд ада даа ЕЕЕ сас ЕаЕ аЕЕ сад дЕа ааЕ ааЕ аЕа Еаа ааЕаасссЕа 882
Тгр Агд <Э1и Рке Нхз Туг 11е С1п Уа1 Азп Азп Не *
250 255
ададдЕаааЕ аЕаасаааЕд сЕдЕЕдЕЕЕЕ аЕЕааааЕаЕ ЕЕЕЕдадаъд асЕдсаассЕ ддаЕЕасадд ЕЕЕсссаЕдС ссЕсссааад ЕЕЕдааасЕЕ сЕЕсЕЕЕЕЕд ЕЕЕЕЕсааса сссЕаЕЕдсЕ ЕсЕЕЕдЕЕЕЕ аадЕсЕсдсЕ дсдссЕссЕд сасссаЕсас ЬддссаддсЕ ЕдсЕдддаЬд дЕЕадасааЕ
ЕдЕЕЕаЕдаЕ дсааадаЕсЕ ЕсЕааЕЕадд ЕЕЕЕдЕЕЕЕд сЕдЕЕдссса ддЕЕсаддсд саЕдЕссадс ддЕсЕсдаЕс асадЕЕдЕда ЬЕдсЕассса аЕадааЕаЕд ЕаЕасЕЕдЕЕ асаадЕдЕЕЕ ЕЕЕдЕЕЕдЕЕ ЕдсЕддадЕа аЕЕсксЕЕдс СааЕ.ССГ.ЬдХ. ЕссЕдассЕс дссассасас ЕсЕааЕдЕда
ЕЕдасЕЕЕас ссааЕЕааЕа ссЕадасаЕа ЕЕЕЕдЕЕЕдъ садЕддсасд сЕсадссЕсс аЕЕЕЕЕадЕа аааЕдаЕссд ЕсадссЕдсЕ ЕаЕЕЕЕадда сссаЬааааа акдЕдсЕсЕс ааЕааааддс ЕЕдЕЕЕдЕЕЕ аЕсЕсддсЕс ЕдадЕадсЕд дадасадддЕ сссассЕсдд сЕЕЕскааЕа аЕссааЕаЕд
942
1002
1062
1122
1182
1242
1302
1362
1422
1482
- 139 014870 саеддеееае сеееьаедее адееьееаес саееееаеае адаеееасед аесасеседд аседссааее саасеаЬссс еееддаааде есасадааее асеаааЬадс еадасеесае сааеассеад дасаедеаее сасеасааде есаседддас едассаеьес сассдеедад аадсаСссса дасаЬЬдааа саеаддссаа есдссеесас сЬассЬаеае сседсеаеаа саааеасаса дадааададе сасееадаса ададсадааа ааддаееесс ассааесеес аседддсаса едеаЬддеае аеееаааадс еедддаэдас еееасасаса едееааеааа еаееесееаа асасаасееа еассааадае асееасесас аддеееаЬсе даессеедСс ассдеееакд еесЬасаСдС аЬдссЬссае ессЬааЪеее ееьсеесаса еаддааЪееа сссаеааеад ееесаасеад еассЬеддад ееаадааедс садеааадЬд аееасаеадд аСдсаддсед аааеедееса деесаеесас ааседаеааа ееааеедада деаадасеса ададасааад адасааадее дсССддадас даЬдедааЬд аадсаасада ассааеееед аеасасдсае асассессаа аСасеаеесс десассаааа есееедССса аСдаееаеес ааааааеаЬС сееееасссд есасседаае ееадеааедс 1542 дсасееесса дааасааааа сЬсесессее даааеааеад 1602 аедсЬадеде сесаееесаа аддседсеее сессадсЬЬа 1662 еедаадеесс еаааеаеесе сдЬааееееа ааасеаесес 1722 СседдЬддеа даеСаессаС аадаададед аедЬдссада 1782 едасаадаее саааддасСа ааеееааеес адесаедаас 1842 ддеадасаес еседдаааее ессасааддЬ садасаеесд 1902 ссасасдеае асЬссаасас еееаееаддс аеседаееад 1962 седааееаде ссадедеддс ссададеедд еасаасаеес 2022 дЪаддеесад сседабаасс аседдадеес еееддессес 2082 саеедсесед сседееасас аСаедаСдаа саседсееее 2142 ддаседсаЬс СЬдасаасед адссеаеесе асеаеаедеа 2202 деаеасааЬа сасаееъдде аааасЬааее еесаассаае 2262 ЬаассЬадаа аСдееесасС еааааеседа даасЬддееа 2322 аеесаеаеае даааасдсаа асееадсЬае еедаЪЬдеае 2382 дсседааеаа еьдедадеес даееедеесе ддсаддсеаа 2442 ааеададдЬс адаадбсдеа ЬаааададдЬ деедСсадаа 2502 едаасаасеа еееееаадса асееьаееед едЬадедаса 2562 аааедеееса есасаесесе ддаесеаЬсе аеееедедса 2622 еаееаееесс аедееаЬсад ааеаееьдае еееееааааа 2682 ЬЬсаееаеес аеееаЬсааа аЬсададЬда аесасаееад 2 742 даЬсаседаа десаааееда ееееЬдсеае ааЬсеесаае 2802 аесеааааЬд ЬасаааесаЬ едЬдЬЬдаее сЬдсадЬдае 2862 дЬссседаее ееаддеаесс едЬдаааадс адааееаада 2922 сасааааааС аааеаесаЬа аддддаедаа сааааСддед 2982 ееедаЬсасс едссеесааа даааддседе дааьееедее 3042 аадаааееас ссаааадеаа ддСдаддадд аеаддсаааа 3102 дасаСЬдеед адаааедеда Ъаддааааса аесаеадаЬа 3162 дсаеаессад аедаддеадд аедддаСааа сЬсСеаССда 3222 еьееьсееее дсададсаад сЬаддааеед ееесссеесе 3282 Сдаееееедс сЬддааеаад еддаеадаеа еаааасааее 3342 сееееаЬдае адседеееес сеессааеед еедесседае 3402 сдссаедсее даддаадаад аеасСдаада еСадасаСдд 3462 ееаасаааас едадаеаеде есссадееде адааееасЬд 3522 аеаССдаЬае аееееаесас саасаеееса адеседеаее 3582 ааддаааааа аааааааааа ааааа 3627 <210> 13 <211> 258 <212> РКТ <213> Ното зар!епз <400> 13
Мее <3111 8ег Агд ьуз Азр Не ТЬг Азп <31п <31и С1и Ьеи Тгр Ьуз Мее
1 5 10 15
Ьуз Рго Агд Агд Азп Ьеи Й1и О1и Азр Азр Туг Ьеи Н1з Ьуз Азр ТЬг
20 25 30
01у (31и ТЬг Зег Мее Ьеи Ьуз Агд Рго 17а 1 Ьеи Ьеи Н1з Ьеи Н13 <31п
35 40 45
ТЬг А1а Н1з А1а Азр <3111 РЬе Азр Суз Рго Зег С1и Ьеи С1п Н13 ТЬг
50 55 60
<31п (31и Ьеи РЬе Рго <31п Тгр Н1з Ьеи Рго Не ьуз Не А1а А1а Не
65 70 75 80
Не А1а Зег Ьеи ТЬг РЬе Ьеи Туг ТЬг Ьеи Ьеи Агд С1и Уа1 11е ΗΪ3
85 90 95
Рго Ьеи А1а ТЬг Зег Η13 <31п <31п Туг РЬе Туг Ьуз Не Рго Не Ьеи
юо 105 110
Уа1 Не Азп Ьуз Уа1 Ьеи Рго Мее Уа1 Зег Не ТЬг Ьеи Ьеи А1а Ьеи
115 12 0 125
Уа1 Туг Ьеи Рго 01у Уа1 Не А1а А1а Не Уа1 <31п Ьеи Н1з Азп (31у
130 135 140
ТЬг Ьуз Туг Ьуз Ьуз РЬе Рго Н1з Тгр Ьеи Азр Ьуз Тгр Мее Ьеи ТЬг
145 150 155 160
Агд Ьув (Ли РЬе <31у Ьеи Ьеи Зег РЬе РЬе РЬе А1а Уа1 Ьеи Н1з А1а
- 140 014870
165 170 175
11е Туг Зег ьеи Зег Туг Рго Мес Агд Агд Зег Туг Агд Туг Ьув Ьеи
180 185 190
Ьеи Азп Тгр А1а Туг <31п С1п Уа1 С1п 31п Азп Ьуз 61и Азр А1а Тгр
195 200 205
Не <31и ΗΪΒ Авр Уа1 Тгр Агд Мее С1и Не Туг Уа1 Зег Ьеи <31у Не
210 215 220
Уа1 б1у Ьеи А1а 11е Ьеи А1а Ьеи Ьеи А1а Уа1 ТЬг Зег 11е Рго Зег
225 230 235 240
Уа1 Зег Авр Зег Ьеи ТЬг Тгр Агд С1и РЬе ΗΪ3 Туг 11е Θ1Π Уа1 Азп
245 250 255
Азп Не <210> 14 <211> 3627 <212> ДНК <213> Ното Варгепз <220>
<221> СЕЕ <222> (96)...(872) <400> 14 ддддсссдса ссСседддса дсадсддсад ссдадасеса сддесаадсе ааддсдаада 60 дедддеддсе даадссаеас еаееееаеад ааееа аед даа аде ада ааа дас 113
Мее С31и Зег Агд Ьув Авр
5
аес Не аса ТЬг аас Азп саа е1п 10 даа 31и даа <31и сее Ьеи ^дд Тгр ааа Ьуз 15 асд Мес аад Ьуз ссе Рго адд Агд ада Агд 20 ааС Азп ееа Ьеи 161
даа даа дас дае СаС ^д сае аад дас асд дда дад асе аде аСд сСа 209
С1и С1и Азр Азр Туг Ьеи Н13 Ьуз Азр ТЬг <31у д1и ТЬг Зег МеС Ьеи
25 30 35
ааа ада ссе дед сее сед сае сед сас саа аса дсс сае дсе дас даа 257
Ьуз Агд Рго Уа1 Ьеи Ьеи Ηίβ Ьеи Ηί3 31п ТЬг А1а Н13 А1а Авр <31и
40 45 50
еее дас еде ссе Ьса даа сее сад сас аса сад даа ссс есс сса сад 305
РЬе Азр Суз Рго Зег О1и ьеи О1П Н13 ТЬг 01п 31и Ьеи РЬе Рго <31п
55 60 65 70
едд сас ЬСд сса аее ааа аСа дсС дсС аСС аСа дса СсС сСд ас С сее 353
Тгр Нгз Ьеи Рго Не Ьуз 11е А1а А1а 11е 11е А1а Зег Ьеи ТЬг РЬе
75 80 85
сее Сас асе сее сед адд даа дСа аСС сас ссс ееа дса асЬ Ссс саС 401
Ьеи Туг ТЬг Ьеи Ьеи Агд 31и Уа1 11е Н1Б Рго Ьеи А1а ТЬг Зег ΗΪ3
90 95 100
саа саа ЬаС еее Сае ааа аее сса аСс сСд дСс аес аас ааа дес ССд 449
С1п 51п Туг РЬе Туг Ьуз Не Рго 11е Ьеи Уа1 Не Азп Ьуз Уа1 Ьеи
105 НО 115
сса аед дес есс аСс асе сес сед дса сед дее еас сед сса ддс дед 497
Рго Мес Уа1 Зег Не ТЬг Ьеи Ьеи А1а Ьеи Уа1 Туг Ьеи Рго С1у Уа1
120 125 130
аса дса дса аее дес саа сее сае аас дда асе аад еас аад аад еее 545
Не А1а А1а 11е Уа1 С1п Ьеи ΗΪΒ Азп С1у ТЬг ьуз Туг Ьуз Ьуз РЬе
- 141 014870
135
140
145
150
сса Рго сак Н13 Ъдд Тгр ббд даб аад Ьуа едд абд сеа Ьеи аса ТЬг 160 ада Агд аад Ьуа сад (31п ббб ддд сбб Ьеи 593
Ьеи Азр 155 Тгр МеЪ РЬе О1у 165
сбс адб еес ббб ббб дсб дба сед саб дса абб баб аде сед есе бас 641
Ьеи Зег РЬе РЬе РЬе А1а Уа1 Ьеи ΗΪ3 А1а Не Туг Зег Ьеи Зег Туг
170 175 180
сса абд адд еда есс бас ада еас аад еед сеа аас ^дд дса бае саа 689
Рго Меб Агд Агд Зег Туг Агд Туг Ьуе Ьеи Ьеи Азп Тгр А1а туг О1п
185 190 195
сад дбс саа саа ааб ааа даа даб дсс бдд абб дад саб даб дее £дд 737
01 η 57а 1 <31п <31п Азп Ьуе С1и Азр А1а Тгр Не 01и ΗΪ3 Азр \7а1 Тгр
200 205 210
ада абд дад аее баб дьд бсб сед дда абб дед дда ббд дса аба ебд 785
Агд Мее 51и Не Туг \7а1 £ег Ьеи <31у Не ν&ι С1у Ьеи А1а Не Ьеи
215 220 225 230
дсб А1а ебд Ьеи ббд Ьеи дсб А1а д^д Уа1 235 аса ТЬг бсб Зег абб Не сса Рго бсб Зег 240 д^д Уа1 аде зег дас Азр бее Зег ббд Ьеи 245 аса ТИг 833
бдд ада даа ббб сас баб абб сад дба ааб ааб аба баа аабаасссба 882
Тгр Агд <31и РЬе ΗΪ3 туг Не (31П V»! Азп Азп 11е *
250 255
ададдбааае абаасааабд сбдббдбббб аббааааеас ббббдадабд асбдсаассб ддаббасадд еббсссабдб ссесссааад бббдааасее саеддбОбаС еббббабдес адбеоебаСс саббббабаб адаСббасбд аесасбсбдд асбдссаабб саасбабссс бббддааадб бсасадаабб аббааабадс бадасббсаб саабассбад дасабдбабб сасбасаадб бсасбдддас бдассаСбСс сассдббдад аадсабссса дасаббдааа сабаддссаа бсдссббсас сбассбабаб сббсбббббд ееееесааса сссбаебдсб бсеебдСббе аадбсбсдсб дсдссбссбд сасссабсас бддссаддсб бдсбдддабд дббадасааб баееесееаа асасаасбба Сассааадаб асббасбсас аддеббабсб дабссббдбс ассдбббабд ббсбасабдб абдссбссаб бссбаабббб Оббсебсаса СаддааСбба сссабаабад бебсаасбад бассоеддад ббаадаабдс садбааадбд аббасабадд абдсаддсбд аааббдббса дебсаббсас аасбдабааа ОбааОбдада едбебабдаб дсааадабсб бсбааббадд ееееееееед сбдббдссса ддббсаддсд сабдбссадс ддбсбсдабс асадббдбда ббдссассса аааааабабб дсасбббсса абдсбадбдб еедаадееес бсбддбддба бдасаадабб ддбадасабс ссасасдбаб сбдааббадб дбаддббсад саебдсбсбд ддасбдсабс дбабасааба баассбадаа аббсабабаб дссбдаабаа аабададдбс бдаасаасба аааедбббса баббаббесс ебсаебаббс дабсасбдаа абсбаааабд абадаабаед бабасбедбе асаадбдббб еебдбеедее бдсбддадба аббсбсбедс еааеееееде бссбдассбс дссассасас бсбаабдбда сбеббассбд дааасааааа сбсабббсаа еааабаеесб даббабссаб саааддасба еееддааабб асбссаасас ссадбдбддс ссбдабаасс сседббасас ббдасаасбд сасаеееддб аедбебсасб даааасдсаа ббдбдадеес адаадбсдба ббеббаадса бсасабсбсб аедбеабсад абьеабсааа дбсаааббда басааабсаб еедасбббас ссааббааба ссбадасаба ееебдеебдб садбддсасд сбсадссбсс аеееееадба ааабдабссд бсадссбдсб бабеббадда бсассбдааб сбсбсбссбб аддсбдсббб едеаабебба аадаададбд аабббааббс бссасааддб бббаббаддс ееададббдд асбддадббс абабдабдаа адссбаббсб аааасбаабб баааабсбда асббадсбаб дабббдббсе баааададдб асбббабббд ддабсбсбсб аабабббдаб абсададбда бббббдсбаб едбдббдаеб сссабааааа абдбдсбсбс аабааааддс ббдбббдббб абсбсддсбс бдадбадсбд дадасадддб сссассбсдд сбОбсбааба абссаабабд ббадбаабдс дааабаабад ббссадсбба ааасбабсбс абдбдссада адбсабдаас садасаббсд абсбдаббад басаасаббс бббддбссбс сасбдсбббб асбабабдба ббсаассааб даасбддбба ебдаббдбае ддсаддсбаа дббдбсадаа бдбадбдаса аббббдбдса бббббааааа абсасаббад аабсббсааб сбдсадбдаб
942 1002 1062 1122 1182 1242 1302 1362 1422 1482 1542 1602 1662 1722 1782 1842 1902 1962 2022 2082 2142 2202 2262 2322 2382 2442 2502 2552 2622 2682 2742 2802 2852
- 142 014870 ссЬдсЬаЬаа саааЬасаса дадааададь сасЬЪадаса ададсадааа ааддаЬЬЬсс ассааьсНЬс асЬдддсаса ьдьаьддьаь аЬЬЬаааадс ЬЬдддаадас ЬЬЬасасаса ЬдЬЬааЬааа дЬаадасЬса ададасааад адасааадьь дсЬЬддадас даьдьдааьд аадсаасада ассааЬЬЬЬд аЬасасдсаЬ асассЬссаа аЬасЬаЬЬсс дСсассаааа ьъьььдььса аЬдаЬЬаЬЬс дЬсссЬдаЬЬ сасааааааЬ ьььдаьсасс аадаааЬЬас дасаЬЬдЬЬд дсаЬаЬссад ьььььснььь ьдаььсььдс сььььаьдаь ЬдссаЬдсСЬ ЬЬаасаааас аЬаЬЬдаЬаЬ ааддаааааа
ЬЬаддЬаЬсс ЬдЬдаааадс адааЬЬаада 2322 аааЬаЬсаЬа аддддаЬдаа сааааЬддЬд 2982 ЬдссЬЬсааа даааддсЬдЬ дааЬЬЬЬдЬЬ 3042 ссаааадЬаа ддЬдаддадд аЬаддсаааа 3102 адаааЬдЬда Ьаддааааса аЬсаЬадаЬа 3162 аЬдаддЬадд аЬдддаЬааа сЬсЪЬаЬЬда 3222 дсададсаад сЬаддааЬЬд ЬЬЬсссЬЬсЬ 3282 сЬддааЬаад ЬддаЬадаЬа ЬаааасааЬЬ 3342 адсЬдЬЬЬЬс сЬЬссааЬЬд ЬЬдЬссЬдаЬ 3402 даддаадаад аьасьдаада ььадасаЬдд 3462 ЬдадаЬаЬдЬ ЬсссадЬЬдЬ адааЬЬасЬд 3522 аЬЬЬЬаЬсас саасаЬЬЬса адЬЬЬдЬаЬЬ 3582 аааааааааа ааааа 3627 <210> 15 <211> 258 <212> РКТ <213> Ното зараепв <400> 15
мее 01и Зег Агд Ьуз Авр Не ТЬг Азп 31п 01и 01и Ьеи Тгр Ьуз МеЬ
1 5 10 15
Ьув Рго Агд Агд Азп Ьеи <31и 01и Азр Азр Туг Ьеи Ηίε Ьуз АЗр ТЬг
20 25 30
01у 01и ТЬг Зег МеЬ Ьеи Ьуз Агд Рго νβΐ Ьеи Ьеи Н13 Ьеи Н1в 01п
35 40 45
ТНг А1а Ηίε А1а Азр С1и РЬе Азр Суз Рго Зег 01и Ьеи 01п Ηίε ТЬг
50 55 60
01п 01и Ьеи РЬе Рго С1п Тгр Паз Ьеи Рго Не Ьуз Не А1а А1а Не
65 70 75 30
Не А1а Зег Ьеи ТЬг РЬе Ьеи Туг ТЬг Ьеи Ьеи Агд 61 и Уа1 Не Н1з
85 90 95
Рго Ьеи А1а ТЬг Зег Н±з 01п 01п Туг РЬе Туг Ьуз Не Рго Не Ьеи
100 105 110
Vа1 11е Азп Ьуз Уа1 Ьеи Рго МеЬ Уа1 Зег Не ТЬг ьеи Ьеи А1а Ьеи
115 120 125
Уа1 Туг Ьеи Рго С1у Уа1 Не А1а А1а Не Уа1 01п Ьеи Ηίε Азп 01у
130 135 140
ТЬг Ьуз Туг Ьуз Ьуз РЬе Рго Н13 Тгр Ьеи Азр Ьуз Тгр МеЬ Ьеи ТЬг
14 5 150 155 160
Агд Ьуз <31п РЬе 61у Ьеи Ьеи Зег РЬе РЬе РЬе А1а Уа1 Ьеи Ηίε А1а
165 170 175
Не Туг Зег Ьеи Зег Туг Рго МеЬ Агд Агд Зег Туг Агд Туг Ьуз Ьеи
180 185 190
Ьеи Азп Тгр А1а Туг С1п С1п Уа1 С1п С1п Азп Ьув 61и Азр А1а Тгр
1Э5 200 205
Не <31и Н13 Азр Уа1 Тгр Агд Мее С1и Не Туг Уа1 Зег Ьеи С1у Не
210 215 220
νβΐ С1у Ьеи А1а Не Ьеи А1а Ьеи Ьеи А1а νβΐ ТЬг Зег Не Рго Зег
225 230 235 240
Уа1 Зег Азр Зег Ьеи ТЬг тгр Агд С1и РЬе Ηίε Туг Не 01п Уа1 Азп
245 250 255
Азп Не
<2101 16
<211> 3627
<212> ДНК
<213> Ното еархепе
<220>
<221> СЬЗ
<222> (96) ...(672)
- 143 014870 <400? 16 ддддсссдса сскскдддса дсадсддсад ссдадаскса сддксаадск ааддсдаада 60 дкдддкддск даадссакас каккккакад аакка акд даа аде ада ааа дас 113
Мек Н1и Зег Агд Ьуз Азр
5
акс 11® аса аас ТЪг А5П саа С1п 10 даа О1и даа С1и екк Ьеи кдд Тгр ааа акд аад Ьуз сск Рго адд Агд ада Агд 20 аак Азп кка Ьеи 161
Ьуз 15 Мек
даа даа дас дак как Скд сак аад дас асд дда дад асе аде акд ска 209
С1и С1и Азр Азр Туг ьеи Н1з Ьуз Азр ТНг О1у С1и ТНг Зег Мек Ьеи
25 зо‘ 35
ааа ада сек дкд екк ккд сак ккд сас саа аса дсс сак дек дак даа 257
Ьуз Агд Рго Уа1 Ьеи Ьеи Нхз Ьеи Н1э 01п ТНг А1а Н1з А1а Азр С1и
40 45 50
ккк дас кде сек кса даа екк сад сас аса сад даа скс ккк сса сад 305
РНе Аер Суз Рго Зег 01и Ьеи <31П ΗΪ3 ТНг 01п 01и Ьеи РНе Рго 01п
55 60 65 70
кдд сас ккд сса акк ааа ака дек дек акк ака дса Иск скд аск НИИ 353
Тгр Н1з Ьеи Рго Не Ьуз Не А1а А1а Не Не А1а Зег Ьеи ТНг РНе
75 80 85
екк Ъас ас к екк скд адд даа дка акк сас ссс кка дса аск ксс сак 401
ьеи Туг ТНг Ьеи Ьеи Агд О1и Уа1 Не Н1з Рго ьеи А1а ТНг Зег Н13
90 95 100
саа саа как ккк как. ааа акк сса акс скд дкс акс аас ааа дкс Скд 449
О1п <31п РНе ТЧ гъ- Не п.-ч Не ν=1 Не Ъ С Vя! Тл!Х ν&1
11Д- Ьуз 2 -
105 110 115
сса акд дкк ксс акс аск скс ккд дса ккд дкк Нас скд сса ддк дкд 497
Рго Мек ν»ι Зег 11е ТНг Ьеи Ьеи А1а Ьеи Уа1 Туг Ьеи Рго 01у νβΐ
120 125 130
ака дса дса акк дкс саа енн сак аак дда асе аад как аад аад ккк 545
Не А1а А1а Не Уа1 αΐη Ьеи Н1з Азп 01у ТНг Ьуз Туг Ьуз Ьуз РНе
135 140 145 150
сса сак кдд ккд дак аад кдд акд кка аса ада аад сад ккк ддд екк 593
Рго Ηίε Тгр Ьеи Азр Ьуз Тгр Мек Ьеи ТНг Агд Ьуз С1п РНе 01у Ьеи
155 160 165
скс адк икс ккк ккк дек дка скд сак дса акк как адк скд кек кас 641
Ьеи Зег РНе РНе РНе А1а Уа1 Ьеи ΗΪΒ А1а Не Туг Зет Ьеи зег Туг
170 175 180
сса акд адд еда ксс Нас ада Нас аад ккд ска аас кдд дса как саа 689
Рго Мек Агд Агд Зег Туг Агд Туг Ьуз Ьеи Ьеи Азп Тгр А1а Туг 01п
185 190 195
сад дкс саа саа аак ааа даа дак дсс кдд акк дад сак дак дкк кдд 737
С1п Уа1 01п Е1п Азп Ьуз С1и Азр А1а Тгр Не 01и нйз Азр Уа1 тгр
200 205 210
ада акд дад акк как дьд кек скд дда акк дкд дда ккд дса ака скд 785
Агд Мек 01и Не Туг Уа1 Зег Ьеи С1у Не Уа1 С1у Ьеи А1а 11е Ьеи
215 220 225 230
дек скд ккд дек дкд аса кек акк сса кек дкд адк дас кек ккд аса 833
- 144 014870
А1а Ьеи Ьеи А1а Уа1 ТЪг Зег Не Рго Зег ν&1 240 Зег Авр Зег ьеи ткг 245
235
ада даа еее сас ГаЬ аСС сад деа аае аае аеа Саа ааеаасссеа
Тгр Агд <31и Рке ΗΪ3 Туг 11е С1п Уа1 Авп Азп 11е ★
250 255
ададдеааае сеесееееед едеесаедае аСадааеаСд еедасеееас сссаеааааа942 аеаасаааед ееееесааса дсааадаесЬ еаеасеедее ссааееааеа аедедсесес1002 седеедееее сссеаеедсе есеааееадд асаадедеее ссеадасаеа ааеааааддс1062 аееааааеае есееедееее ееееееееед ееедееедее еееедеееде еедееедеее1122 еееедадаед аадЪсесдсЬ сЪдЪедесса едседдадеа садЬддсасд аесесддсес1182 аседсаассе дсдссессед ддеесаддсд аеесесеедс сесадссесс едадеадсед1242 ддаееасадд сасссаЬсас саедСссадс еааеееееде аесеееадеа дадасадддк1302 сеесссаСде еддссаддсе ддесесдаес ессСдассес аааедаессд сссассесдд1362 ссесссааад ЪдседддаЬд асадеедеда дссассасас есадсседсе сееескааеа1422 ееедааасее дееадасаае еедсбассса есбааедеда еаесееадда аессаасаед1482 саеддеееае еаееесееаа ааааааеаее сееееассед Ъсасседаае ееадкааедс1542 сееесаедее асасаасееа дсасееесса дааасааааа сесесессее даааеааеад1602 адеееееаес еассааадее аедсеадеде сесаееесаа аддседсеее еессадсееа1662 саееееаеае асееасесас еедаадееес еаааеаеесе едеааееееа ааасеаесес1722 адаеееасед аддеееаесе еседдеддеа даееаессае аадаададед аедедссада1782 аесасеседд даессеедес едасаадаее саааддасеа ааеееааеес адесаСдаас1842 аседссааее ассдеееаед ддеадасаес еееддаааее ессасаадде садасаеесд1902 саасеаессс еесеасаеде ссасасдеае асессаасас еееаееаддс аеседаееад1962 еееддаааде аедссессаС седааееаде ссадедеддс ееададеедд еасаасаеес2022 есасадааее Сссеааееее дкаддеесад сседаеаасс аседдадеес еееддесскс2082 аееаааеадс ееесеесаса саеедсесед сседееасас аЪаЪдаедаа саседсееее2142 еадасЬЪсаЬ еаддааеееа ддаседсаео еедасаасЪд адссеаеесе асеаеаедеа2202 сааеасскад сссаеааеад дСаеасааеа сасаееедде аааасеааее еесаассаае2262 дасаедеаее ееесаасеад еаассеадаа аедееесаск кааааеседа дааседдкка2322 сасеасаадк еассееддад аеесаеакае даааасдсаа асееадсеае еедаеедкае2382 ксаседддас ееаадаакдс дсседаакаа еедедадкес дакеедеесе ддсаддсеаа2442 едассаееес садеааадед ааеададдкс адаадксдеа еаааададде дкедесадаа2502 сассдеедад асеасакадд кдаасааска кСкекаадеа асеккакеед едкадедаса2562 аадсакссса акдсаддскд ааакдеееса есасаксксе ддаесксксе аккекдедса2622 дасаккдааа аааеедекса каккакеесс акдекаксад аакаккедак еекккааааа2682 саеаддссаа деесакксас ексаккакес аеееаксааа аксададкда аксасаккад2742 ксдссексас ааскдакааа даксаскдаа дксаааееда кеееедскак аакскксаак2802 скасскакае ккааекдада акскааааед касаааксае кдедкедакк скдсадкдае2862 сседскакаа дкаадаскса дессскдакк ккаддеаксс кдкдаааадс адааккаада2922 сааакасаса ададасааад сасаааааак ааакаксаеа аддддакдаа саааакддкд2982 дадааададк адасааадке некдаксаос кдссеесааа даааддскдк дааеееедке3042 еасккадаса дсккддадас аадаааккас ссаааадкаа ддкдаддадд акаддсаааа3102 ададсадааа дакдкдаакд дасакедкед адааакдкда каддааааса аксакадака3162 ааддаккксс аадсаасада дсакакссад акдаддкадд акдддакааа сксккаекда3222 ассааксккс ассааккекд еееексееек дсададсаад скаддааеед екесссеесе3282 аседддсаса аеасасдсае кдаеек-еде сСддааеаад еддаеадаеа еаааасааее3342 едеакддеае асассессаа скеекакдае адседеееес сеессааеед еедесседае3402 аееСаааадс аеасеаеесс едссаедеее даддаадаад акаокдаада ееадасаедд3462 еедддаадас десассаааа ееаасаааас едадаеаеде есссадееде адааккасед3522 еееасасаса ееееедееса аеаеедаеае аееееаесас саасаеееса адееедкакк3582 едееааеааа аедаееаеес ааддаааааа аааааааааа ааааа3627 <210> 17 <211> 258 <212 > РЕТ <213> Ното заркепз <400> 17
Мее С1и Зег Агд Ьуз Азр Не ТМг Азп О1п С1и С1и Ьеи Тгр ьуз МеС
1 5 10 15
Ьуз Рго Агд Агд Азп Ьеи 31и 31и Азр Азр Туг Ьеи ΗΪ3 Ьув Азр ТЫ
20 25 30
- 145 014870
С1у <31и Т11г Зег Меи Ьеи Ьуй Агд 40 Рго Уа1 Ъеи Ьеи Н1з 45 Ьеи Н±з С1п
35
ТЬг А1а Н1з А1а Азр Й1и РЬе Азр Суз Рго Зег С1и Ьеи βΐη Н1е ТЬг
50 55 60
С1п <31и Ьеи РЬе Рго αΐη Тгр Н1з Ьеи Рго Не Ьуз Не А1а А1а Не
65 70 75 80
Не А1а Зег Ьеи ТЬг РЬе Ьеи Туг ТЬг Ьеи Ьеи Агд <31и Уа1 Не ΗΪ3
85 90 95
Рго Ьеи А1а ТЬг Зег Н13 С1п 31П Туг РЬе Туг Ьуз Не Рго Не Ьеи
100 105 110
Уа1 Не Азп Ьуз Уа1 Ьеи Рго МеЕ Уа1 Зег Не ТЬг Ьеи Ьеи А1а Ьеи
115 120 125
Уа1 Туг Ьеи Рго 01у Уа1 Не А1а А1а Не Уа1 С1п Ьеи ΗΪ3 Азп 01у
130 135 140
ТЬг Ьуз Туг Ьуз Ьуз РЬе Рго Н13 Тгр Ьеи Азр Ьуз Тгр МеЬ ьеи ТЬг
145 150 155 160
Агд Ьуз (31п РЬе С1у Ьеи Ьеи Зег РЬе РЬе РЬе А1а Уа1 Ьеи Н1з А1а
165 170 175
Не туг Зег Ьеи Зег Туг Рго МеЕ Агд Агд Зег Туг Агд Туг Ьуз Ьеи
180 185 190
Ьеи Азп Тгр А1а Туг Й1п <31п Уа1 С1п С1п Азп Ьуз 61и Азр А1а Тгр
195 200 205
Не <Э1и Нхз Азр Уа1 Тгр Агд МеЕ О1и Не Туг Уа1 Зег Ьеи <Э1у Не
210 215 220
Уа1 <31у Ьеи А1а Не Ьеи А1а Ьеи Ьеи А1а Уа1 ТЬг Зег 11е Рго Зег
225 230 235 240
Уа1 Зег Азр Зег Ьеи ТЬг Тгр Агд Э1и РЬе Н1в Туг Не С1п Уа1 Азп
245 250 255
Азп Не <210> 18 <211> 3627 <212> ДНК <213> Ното зар1епв <220>
<221> СРЗ <222> (96)...(872) <400> 18 ддддсссдса ссЕсЕдддса дсадсддсад ссдадасЕса сддЕсаадсЕ ааддсдаада 60 дЬдддЬддсЬ даадссаСас ЬаССЬСаЬад ааСЕа аЕд даа аде ада ааа дас 113
Мер С1и Зег Агд Ьуз Азр
5
аЕс Не аса ТНг аас АЗП саа <Э1п 10 даа даа сЕЕ Едд ааа ьуз 15 аЕд МеС аад Ьуз ссЕ адд ада Агд 20 ааЕ Азп ЬСа Ьеи 161
(31и О1и Ьеи Тгр Рго Агд
даа даа дас даЕ ЕаЕ ЕЕд саЕ аад дас асд дда дад асе аде аЕд сЬа 209
С1и С1и Азр Азр Туг Ьеи ΗΪ3 Ьуз Азр ТЬг (Э1у С1и ТЬг Зег МеЕ Ьеи
25 30 35
ааа ьуе ада Агд 40 ССЕ Рго дЕд Уа1 СЕЕ Ьеи ЕЕд Ьеи саЕ Н13 45 ^Ед Ьеи сас Н1в саа О1п аса ТЬг дес А1а 50 сар Нхз дсС А1а дай Азр даа О1и 257
еьь дас Ьдс ссЪ Еса даа СЕЕ сад сас аса сад даа сЕс ЕЕЕ сса сад 305
РЬе Азр Суз Рго Зег Й1и Ьеи 61п ΗΪ3 ТНг С1п 01и Ьеи РЬе Рго С1п
55 60 65 70
- 146 014870
сдд сас ССд Беи сса асС ааа аСа Не дсС А1а дсС А1а аСС Не 80 аЬа Не дса А1а ЬсЬ Зег сед Беи асС ТИу 85 ССС РЬе 353
Тгр ΗΪ3 Рго Не Буз 75
ССС Сас асе ссс сСд адд даа дСа аСС сас ссс ССа дса асе Ссс саЬ 401
Беи Туг ТЬг Беи Беи Агд <31и Уа1 Не Н13 Рго Беи А1а ТЬг Зег Н1з
90 95 100
саа саа СаС ССС СаС ааа асе сса асе сед дЬс аЬс аае ааа дес СЬд 449
С1п <31п Туг РНе Туг Буз Не Рго Не Беи Уа1 11е Азп Буз Уа1 Беи
105 но 115
сса асд ди Ссс асе асе ССС СЬд дса СЬд дЬЬ Сас сСд сса ддС дед 497
Рго МеС Уа1 Зег Не ТЬг Беи Беи А1а Беи Уа1 Туг Беи Рго С1у Уа1
120 125 130
аса дса дса аСС дСс саа сСС сас аае дда асе аад сас аад аад ссе 54 5
Не А1а А1а Не Уа1 01п Беи Н1з Азп С1у ТНг Буз Туг Буз Буз РЬе
135 140 145 150
сса саС Сдд ССд дас аад едд асд ССа аса ада аад сад ссс ддд сее 593
Рго Ηίε Тгр Беи Азр Буз Тгр мес Беи ТЬг Агд Буз <31п РЬе (31у Беи
155 160 165
сСс ад С ССс ССС ССС дсС дса сед сас дса асе СаЬ аде ссд ссе Сас 641
Беи Зег РЬе РНе РНе А1а Уа1 Беи Н1з А1а Не Туг Зег Беи Зег Туг
17 0 17 5 100
сса аСд адд еда Ссс Сас ада Сас аад ЬСд сСа аае Сдд дса СаС саа 689
Рго МеС Агд Агд Зег Тус Агд Туг Буз Беи Беи Азп Тгр А1а Туг С1п
185 190 195
сад дСс саа саа ааС ааа даа даС дес Сдд аСС дад саЬ даь дЬЬ сдд 737
С1п Уа1 С1п 61п Азп БУЗ 61и Азр А1а Тгр Не <31и Н1з Азр Уа1 Тгр
200 205 210
ада асд дад аес СаС дед СсС сед дда асе дед дда сед дса аса сед 785
Агд Мес С1и Не Туг Уа1 Зег Беи С1у Не Уа1 (31у Беи А1а Не Беи
215 220 225 230
дсС сСд ССд дсС дед аса ссе асе сса ьсе дед аде дас ЬсЬ ссд аса 833
А1а Беи Беи А1а Уа1 ТЬг Зег Не Рго Зег Уа1 Зег АЗр Зег Беи ТЬг
235 240 245
сдд ада даа ССС сас СаС аСС сад дса аае ааС аса Саа ааЬаасссЬа 882
Тгр Агд С1и Рпе Н13 Туг Не С1п Уа1 Азп Азп 11е *
250 255
ададдСаааС аСаасаааСд сСдЬСдееСС аССааааеае СЬССдадаСд асСдсаассЬ ддаССасадд СССсссаСдС ссЬсссааад СССдааасСС саСддСССаС сССССаСдСС адСССССаСс саССССаСаС адаСССасСд аСсасСсСдд сССсСССССд СССССсааса сссСаССдсе сесссдсссс аадСсЬсдсЬ дсдссСссСд сасссаСсас СддссаддсС СдсСдддаСд дЬСадасааС СаСССсЬСаа асасаасССа СассааадаС асССасСсас аддСССаСсС даСссССдСс
СдСССаСдаС дсааадаСсС СсСааССадд СССССССССд сСдСЬдссса ддССсаддсд саСдСссадс ддссСсдаСс асадССдСда ССдсСассса ааааааЬаСС дсасСССсса аССсСадСдС ССдаадСССс СсСддСддСа СдасаадаСС аСадааСаСд СаСасССдСС асаадСдССС СССдСССдСС ЬдсСддадСа аССсСсССдс СааСССССдС СссСдассСс дссассасас СсСааСдСда СССССассСд дааасааааа сСсаСССсаа СаааСаССсС даССаСссаС саааддасСа
ССдасСССас ссааССааСа ссСадасаСа ссссдсссдс садСддсасд сСсадссСсс аСЬСССадСа аааСдаСссд СсадссСдсС еаесееадда СсассСдааС сСсСсСссСС аддседсССС ЬдСааССЬСа аадаададСд ааСССааСЬс сссаСааааа аСдСдсСсСс ааСааааддс ССдСССдССС аСсСсддсСс СдадСадсСд дадасадддС сссассСсдд сСССсСааСа аСссааСаСд ССадСааСдс даааСааСад ссссадссса ааасСаСсСс асдсдссада адСсаСдаас
942 1002 1062 1122 1182 1242 1302 1362 1422 1482 1542 1602 1662 1722 1782 1842
- 147 014870 аскдссаакк сааскакссс кккддааадк ксасадаакк аккааакадс кадаскксак саакасскад дасакдкакк саскасаадк ксазкдддас кдассакккс сассдккдад аадсакссса дасаккдааа сакаддссаа ксдсскксас скасскакак сскдскакаа сааакасаса дадааададк сасккадаса ададсадааа ааддаккксс ассааксккс аскдддсаса кдкакддкак акккаааадс ккдддаадас кккасасаса кдккаакааа ассдкккакд ккскасакдк акдсскссак ксскаакккк кккскксаса каддааккка сссакаакад ккксааскад кассккддад ккаадаакдс садкааадкд аккасакадд акдсаддскд аааккдккса дкксакксас ааскдакааа ккааккдада дкаадаскса ададасааад адасааадкк дсккддадас дакдкдаакд аадсаасада ассааккккд акасасдсак асасскссаа акаскакксс дксассаааа кккккдккса акдаккаккс ддкадасакс ссасасдкак скдааккадк дкаддкксад саккдскскд ддаскдсакс дкакасаака каасскадаа акксакакак дсскдаакаа аакададдкс кдаасааска ааакдкккса каккаккксс кксаккаккс даксаскдаа акскаааакд дкссскдакк сасаааааак кккдаксасс аадаааккас дасаккдккд дсакакссад кккккскккк кдакккккдс сккккакдак кдссакдскк ккаасаааас акаккдакак ааддаааааа кккддааакк аскссаасас ссадкдкддс сскдакаасс сскдккасас ккдасааскд сасакккддк акдккксаск даааасдсаа ккдкдадккс адаадксдка кккккаадса ксасакскск акдккаксад акккаксааа дксаааккда касаааксак ккаддкаксс ааакаксака кдсскксааа ссаааадкаа адааакдкда акдаддкадд дсададсаад скддаакаад адскдккккс даддаадаад кдадакакдк аккккаксас аааааааааа кссасааддк кккаккаддс Скададккдд аскддадккс акакдакдаа адсскаккск ааааскаакк каааакскда асккадскак дакккдккск каааададдк аскккакккд ддакскскск аакакккдак аксададкда Ьккккдскак кдкдккдакк кдкдаааадс аддддакдаа даааддскдк ддкдаддадд каддааааса акдддакааа скаддааккд кддакадака сккссааккд акаскдаада ксссадккдк саасакккса ааааа садасакксд 1902 акскдаккад 1962 касаасаккс 2022 кккддксскс 2032 саскдскккк 2142 аскакакдка 2202 кксаассаак 2262 дааскддкка 2322 ккдаккдкак 2332 ддсаддскаа 2442 дккдксадаа 2502 кдкадкдаса 2562 аккккдкдса 2622 кккккааааа 2682 аксасаккад 2742 аакскксаак 2302 скдсадкдак 2062 адааккаада 2922 саааакддкд 2932 дааккккдкк 3042 акаддсаааа 3102 аксакадака 3162 сксккаккда 3222 ккксссккск 3282 каааасаакк 3342 ккдксскдак 3402 ккадасакдд 3462 адааккаскд 3522 адкккдкакк 3582 3627 <210> 19 <211> 258 <212> РЕТ <213> Ното заркепз <400> 19
Мек 61и Зег Агд Ьуз Азр Не Ткг Азп С1п 61и 61и Ьеи Тгр Ьуз Мек
1 5 10 15
Ьуз Рго Агд Агд Азп Ьеи 61и 61и Азр Азр Туг Ьеи Н1з Ьуз Азр Ткг
20 25 30
61у 61и Ткг Зег Мек Ьеи Ьуз Агд Рго Уа1 Ьеи Ьеи ΗΪ3 Ьеи ΗΪ5 61п
35 40 45
Ткг А1а Н13 А1а Азр 61и Рке Азр Суз Рго Зег 61и Ьеи С1п Ηί3 Ткг
50 55 60
61 η 61и Ьеи Рке Рго С1п Тгр ΗΪ3 Ьеи Рго 11е Ьуз 11е А1а А1а Не
65 70 75 80
Не А1а Зег Ьеи Ткг Рке Ьеи Туг Ткг Ьеи Ьеи Агд <Э1и ча1 Не Н1з
85 90 95
Рго Ьеи А1а ткг Зег Наз 61п 61п Туг Рке Туг Ьуз Не Рго Не Ьеи
100 105 но
Уа1 Не Азп Ьуз νβΐ Ьеи Рго Мек Уа1 Зег Не Ткг Ьеи Ьеи А1а Ьеи
115 12 0 125
νβΐ Туг Ьеи Рго 61у Уа1 Не А1а А1а 11е Уа1 С1п Ьеи Н1з АЗП 61у
13 0 135 140
Ткг Ьуз Туг Ьуз Ьуз Рке Рго Н1з Тхр Ьеи Азр Ьуз Тгр Мек Ьеи Ткг
145 150 155 160
Агд Ьуз С1п Рке <31у Ьеи Ьеи Зег Рке Рке Рке А1а Уа1 Ьеи Н1з А1а
165 170 175
11е Туг Зег Ьеи Зег Туг Рго Мек Агд Агд Зег Туг Агд Туг Ьуз Ьеи
180 185 190
Ьеи АЗП Тгр А1а Туг 61п 61п Уа1 61п 61п Азп Ьуз 61и Азр А1а Тгр
195 200 205
Не 61и ΗΪ3 Азр Уа1 Тгр Агд Мек 51и 11е Туг Уа1 Зег Ьеи 61у Не
- 148 014870
210 215 220
ν*1 <31у Беи А1а Не Беи А1а Беи Беи А1а Уа! ТЬг Зег Не Рго Зег
225 230 235 240
7а1 Зег Азр Зег Беи ТЬг Тгр Агд 01и РЬе Наз Туг Не <31п 7а1 Азп
245 250 255
Азп 11е <210> 20 <211> 3627 <212> ДНК <213> Ното зар1епз <220>
<221> СОЗ <222=· (96) . . . (372) <400> 20 ддддсссдса ссСсСдддса дсадсддсад ссдадасСса сддСсаадсС ааддсдаада 60 дСдддСддсС даадссаСас СаССССаСад ааССа аСд даа аде ада ааа дас 113
Мес е1и Зег Агд Буз Азр
5
асе Не аса аас саа (31п 10 даа даа □1и О1и сСС Беи Сдд ааа аСд аад Буз ссС Рго адд Агд ада ааС ССа Беи 161
ТЬг Азп Тгр Буе 15 МеС Агд 20 Аеп
даа даа дас дас СаС ссд саС аад дас асд дда дад асе аде аСд сСа 209
61и С1и Азр Азр Туг Беи ΗΪΞ Буз Азр ТЬг С51у С1и ТЬг Зег МеС Беи
25 30 35
ааа ада ССС 0Ьд сСС ССд саС ССд сас саа аса дес сас дсС даС даа 257
Буз Агд Рго Уа1 Беи Беи ΗΪ8 Беи ΗΪ8 <31п ТЬг А1а Низ А1а Азр С1и
40 45 50
ссс дас Сдс ссС Сса даа сСС сад сас аса сад даа сСс ССС сса сад 305
РЬе Азр Суз Рго Зег <31и Беи 01п Ηίβ ТЬг (31п 01и Беи РЬе Рго Й1п
55 60 65 70
Сдд сас ССд сса аСС ааа аСа дсС дсС аСС аСа дса СсС сСд асС ССС 353
Тгр ΗΪ5 Беи Рго Не Буз Не А1а А1а Не Не А1а Зег Беи ТЬг РЬе
75 80 85
есс Сае асС сСС сСд адд даа дса аСС сас ССС сса дса асС Ссс сас 401
Беи Туг ТЬг Беи Беи Агд О1и Уа1 Не Низ Рго Беи А1а ТЬг Зег Низ
90 95 100
саа саа СаС ССС СаС ааа аСС сса аСс сСд дес аСс аас ааа дСс ССд 449
О1п С1п Туг РЬе Туг Буз Не Рго Не Беи Уа1 Не Азп Був Уа1 Беи
105 110 115
сса аСд дСС Ссс аСс асС сСс ССд дса ССд дес Сас сСд сса ддь дьд 497
Рго Ме- Уа1 Зег Не ТЬг Беи Беи А1а Беи Уа1 Туг Беи Рго <31у Уа1
НО 125 130
аСа дса дса аСС дСс саа сСС саС ааС дда асе аад сас аад аад ССС 545
Не А1а А1а 11е Уа1 О1п Беи Η1Ξ Азп С1у ТЬг Буз Туг Буз Буз РЬе
135 140 14 5 150
сса саС ьдд ССд дас аад Сдд аСд ССа аса ада аад сад ССС ддд сСС 593
Рго ΗΪ3 Тгр Беи Азр Буз Тгр МеС Беи ТЬг Агд Буз О1п РЬе Й1у Беи
155 160 165
- 149 014870
СРС адъ със БРР БРР дсБ дБа срд саР дса еас адр сБд БсБ Бас 641
Ьеи РИе РНе ₽ке А1а Уа1 Ьеи Н1з А1а Не Туг Зег Ьеи Зег Туг
170 175 180
сса Рго аБд адд еда Агд Рсс Зег Рас ада Бас Туг 190 аад Ьуз РРд сБа аас Ьеи Ьеи Азп едд Тгр 195 дса А1а Рас Туг саа С1п 689
мер Агд 185 Туг Агд
сад дБс саа саа аар ааа даа дар дсс Бдд аРБ дад саР даБ дББ ^дд 737
<31п Уа1 <31п <31п Азп Ьуз С1и Азр А1а Тгр 11е 31и Н1з Азр Уа1 Тгр
200 205 210
ада асд дад аРБ РаР дрд БсБ срд ада аРБ дЬд дда РРд дса аБа сБд 785
Агд Мер 61и 11е Туг Уа1 Зег Ьеи С1у 11е Уа1 <Э1у Ьеи А1а 11е Ьеи
215 220 225 230
дер срд РРд дсБ ?6д аса БсБ аББ сса БсБ дрд адр дас БсБ РРд аса 833
А1а Ьеи Ьеи А1а Уа1 ТЬг Зег 11е Рго Зег Уа1 Зег Азр Зег Ьеи ТЬг
235 240 245
Бдд ада даа БРР сас РаР арр сад дБа ааБ ааБ аРа Баз ааРаасссБа 882
Тгр Агд С1и РЬе Η1Ξ Туг 11е С1п Уа1 Азп Азп 11е ★
250 255
ададдБаааБ аРаасаааБд СРдРБдБРББ аББааааРар ББЕРдадаРд асБдсаассБ ддаББасадд ББРсссаРдБ ссБсссааад БББдааасББ саРддБРБаБ СББББаБдББ адБББББаБс саББББаБаБ адаЬББасБд аРсасБсРдд асРдссааББ саасБаБссс БББддааадБ БсасадааББ аББаааБадс ЕадасБЬсаЕ сааБассБад дасаБдБаББ сасБасаадБ БсасЕдддас БдассаБББс сассдЕБдад аадсаБссса дасаББдааа саБаддссаа БсдссББсас сБассБаРаР ссБдсБаРаа саааБасаса дадааададр сасББадаса ададсадааа ааддаБББсс
СРБсБББББд ББРББсааса сссБаББдсР БсБББдББББ аадБсБсдсБ дсдссБссБд сасссаБсас БддссаддсР БдсБдддаБд дРБадасааБ ЬаБББсрБаа асасаасББа БассааадаБ асББасБсас аддРББаБсБ даРссББдБс ассдБББаРд ББсРасаРдБ аРдссБссаБ БссБааББББ БББсББсаса БаддааББРа сссаБааБад БББсаасБад БассББддад ББаадааБдс садБааадРд аББасаРадд аБдсаддсРд аааРБдББса дРБсаББсас аасБдаБааа ББааББдада дБаадасБса ададасааад адасааадРР дсББддадас дардБдааБд аадсаасада
БдРББаБдаБ дсааадаБсБ БсБааББадд БББББББББд сБдББдссса ддББсаддсд саБдБссадс ддРсБсдаБс асадррдрда ББдсБассса ааааааРаББ дсасБББсса аРдсБадрдр ББдаадБББс Бсрддрддра БдасаадаББ ддБадасаБс ссасасдБаБ сБдааРБадБ дРаддББсад саББдсБсБд ддасБдсаБс дРаБасааБа РаассБадаа аРБсаБаБаБ дссБдааБаа ааБададдБс БдаасаасБа аааБдРББса БаББаБББсс РБсаРРаББс даБсасБдаа аБсБааааБд дБсссБдаББ сасааааааБ БРРдаБсасс аадаааББас дасаРБдББд дсаБаБссад аБадааБаБд РБдасБББас сссаБааааа 942 БаРасББдББ ссааББааРа аРдБдсБсБс 1002 асаадБдРББ ссБадасаБа ааБааааддс 1062 РББдБРБдРБ ББББдББРдБ ББдБББдБББ 1122 БдсБддадРа садБддсасд аРсБсддсРс 1182 аРБсБсББдс сБсадссБсс БдадРадсБд 1242 БааРББББдБ аБББББадРа дадасадддБ 1302 БссрдассБс ааардаБссд сссассРсдд 1362 дссассасас БсадссБдсБ сБББсБааРа 1422 БсБааБдРда БаББББадда аБссааБард 1482 сББББассБд БсассБдааБ БРадБааРдс 1542 дааасааааа сБсБсБссББ даааРааБад 1602 сБсаБББсаа аддсБдсБББ ББссадсББа 1662 БаааРаББсБ БдБааББРБа ааааРаБеРс 1722 даРРаРссаБ аадаададрд аБдБдссада 1782 саааддасРа ааРББааРБс адБсаБдаас 1842 БББддаааББ БссасааддБ садасаББсд 1Э02 асБссаасас БББаРБаддс аРсБдаРБад 1962 ссадБдБддс БРададББдд БасаасаББс 2022 ссБдаБаасс асБддадЬЬс БББддЬссРс 2082 ссБдББасас аРаРдаБдаа сасБдсББРБ 2142 ББдасаасБд адссБаББсБ асБаБаБдБа 2202 сасаРББддР аааасБааББ ББсаассааС 2262 аРдБББсасБ БааааБсрда даасБддрБа 2322 даааасдсаа асББадсБаБ ББдаЬБдБаБ 2382 ББдБдадББс даРББдББсБ ддсаддсраа 2442 адаадРсдБа БаааададдБ дррдрсадаа 2502 БББББаадса асБББаБББд БдБадБдаса 2562 БсасаБсБсБ ддаРсБсБсБ аРБББдБдса 2622 аРдРБаБсад ааБаББРдаБ БББББааааа 2682 аБББаРсааа аБсададБда аЬсасаББад 2742 дБсаааББда БББББдсБаБ ааБсББсааР 2802 БасаааБсаБ ЕдБдРЕдаББ сБдсадРдаБ 2862 БРаддРаБсс БдБдаааадс адаарБаада 2922 аааРаБсаБа аддддаБдаа сааааБддБд 2982 БдссББсааа даааддсБдБ дааББББдРБ 3042 ссаааадБаа ддБдаддадд аБаддсаааа 3102 адаааБдБда Баддааааса аБсаРадаБа 3162 аБдаддБадд аБдддаБааа сБсрраББда 3222
- 150 014870 ассааРсРСс асСдддсаса СдСарддСаС аССРаааадс ССдддаадас ЬССасасаса ЬдссааЬааа ассааССССд асасасдсаР асассрссаа аСасСаССсс дСсассаааа СЬССЬдССса асдассассс ссссесьссс ЬдаЬСЬССдс сССССаСдаС СдссаСдсСС РСаасаааас аСаССдаСаС ааддаааааа дсададсаад срддаараад адсСдССРСс даддаадаад РдадаРаРдР аССССаСсас аааааааааа сСаддааССд СддаСадаСа сРРссааРРд аРасРдаада РсссадРРдР саасаСССса ааааа
РССсссССсС Саааасаарр СРдРссРдаР РРадасаСдд адааССасСд адРРРдСаРР
3282
3342
3402
3462
3522
3582
3627 <210? 21 <211? 258 <212? РЕТ <213? Ното зартепз <400? 21
Мер С1и Зег Агд Дув Авр Не ТЬг Азп С1п С1и С1и Деи Тгр Дуэ Мес
1 5 10 15
Дуэ Рго Агд Агд Авп Деи С1и С1и Авр Азр Туг Деи Н1в Дув Авр ТЬг
20 25 30
<31у 01и ТЬг Зег Мер Деи Дув Агд Рго Уа1 Деи Деи Н1з Деи ΗΪ3 С1п
35 40 45
ТЬг А1а Ηί3 А1а Азр С1и РЬе Азр Суз Рго Зег □1и Деи 61п Н13 ТЬг
50 55 60
С1п <31и Деи РЬе Рго С1п Тгр Н±В Деи Рго Не Дуз Не А1а А1а Не
65 70 75 80
11е А1а Зег Деи ТЬг РЬе Деи Туг ТЬг Деи Деи Агд <31и Уа1 Не Низ
85 90 95
РГО Деи А1а ТЬг Зег ΗΪ3 С1п С1п Туг РЬе Туг Дуз Не Рго Не Деи
100 105 110
Уа1 Не Азп Дув Уа1 Деи РГО МеС Уа1 Зег Не ТЬг Деи Деи А1а Деи
115 12 0 125
Уа1 Туг Деи Рго С1у Уа1 Не А1а А1а Не Уа1 01П Деи Ηίε Авп <31у
130 135 14 0
ТЬг Дув Туг Дув Дув РЬе Рго ΗΪΒ Тгр Деи Азр Дуз Тгр МеС Деи ТЬг
145 150 155 160
Агд Дуз С1п РЬе С1у Деи Деи Зег РЬе РЬе РЬе А1а Уа1 Деи Н1з А1а
165 170 175
Не Туг Зег Деи Зег Туг Рго Мер Агд Агд Зег Туг Агд Туг Дуз Деи
180 185 190
Деи Авп Тгр А1а Туг С1п С1п Уа1 С1п <31п Азп Дуз <31и Азр А1а Тгр
195 200 205
11е <31и Н1з Авр Уа1 Тгр Агд Мер <31и Не Туг Уа1 Зег Деи С1у Не
210 215 220
Уа1 С1у Деи А1а 11е Деи А1а Деи Деи А1а Уа1 ТЬг Зег Не Рго Зег
225 230 235 240
Уа1 Зег Азр Зег Деи ТЬг Тгр Агд <31и РЬе Н13 Туг Не <31п νβΐ Азп
245 250 255
Авп Не
<210? 22 <211? 3627 <212> ДНК <213? Ното зархепз <220?
<221? СПЗ <222? (96)...(872) <400? 22 ддддсссдса ссРсРдддса дсадсддсад ссдадасРса сддСсаадсС ааддсдаада 60 дсдддСддсС даадссаСас СаССССаСад ааССа аСд даа аде ада ааа дас 113 Мес С1и Зег Агд Дуз Азр
5
- 151 014870
акс аса аас АЗП саа даа даа екк кдд ааа акд Мек аад сск адд ада аак Азп кка Ьеи 161
11е ТНг 61п 10 61и 61и Ьеи Тгр Ьуз 15 Ьуз Рго Агд Агд 20
даа даа дас дак как ккд сак аад дас асд дда дад асе аде акд ска 209
С1и 61и Азр Азр Туг Ьеи ΗΪ3 Ьуз Азр ТНг 61у 61 и ТНг Зег Мек Ьеи
25 30 35
ааа ада сск д^д екк ЬЬд сак сед сас саа аса дсс сак дек дак даа 257
Ьуз Агд Рго Уа1 Ьеи Ьеи Н1з Ьеи Н1з <31п ТНг А1а Ηίβ А1а Азр 61и
40 45 50
ккк дас кдс сск кса даа екк сад сас аса сад даа скс ккк сса сад 305
Рке Азр Суз Рго Зег 61и Ьеи 61п ΗΪ3 ТНг 61п С1и Ьеи РНе Рго 61п
55 60 65 70
кдд сас ккд сса акк ааа ака дек дек акк ака дса кек скд аск ккк 353
Тгр НЬз Ьеи Рго Не Ьуз Не А1а А1а Не Не А1а Зег Ьеи ТНг РНе
75 80 85
екк кас аск екк скд адд даа дка акк сас ссс кка дса аск ксс сак 401
Ьеи Туг ТНг Ьеи Ьеи Агд С1и 7а1 Не НЬз Рго Ьеи А1а ТНг Зег Н13
90 95 100
саа саа как ккк как ааа акк сса акс скд дкс акс аас ааа дкс ккд 449
6111 С1п Туг Рке Туг Ьув 11е Рго Не Ьеи Уа1 Не Азп Ьув Уа1 Ьеи
105 110 115
сса акд дкк ксс акс аск скс ккд дса ккд дкк кас скд сса ддк дкд 497
Рго Мек Уа1 Зег Не ТНг Ьеи Ьеи А1а Ьеи Уа1 Туг Ьеи Рго 61у Уа1
120 125 130
ака дса дса акк дкс саа екк сак аак дда асе аад как аад аад ккк 545
11е А1а А1а Не Уа1 61η Ьеи Н13 Азп <31у Ткг ьуз Туг Ьуз Ьуз РНе
135 14 0 145 150
сса сак кдд ккд дак аад кдд акд кка аса ада аад сад ккк ддд екк 593
Рго Н15 Тгр Ьеи Азр Ьуз Тгр Мек Ьеи ТНг Агд Ьуз 61п РНе 61у Ьеи
155 160 165
скс адк Икс ккк ккк дек дка скд сак дса акк как адк скд кек кас 641
Ьеи Зег Рке Рке Рке А1а 7а 1 Ьеи НА в А1а Не Туг Зег Ьеи Зег Туг
170 175 180
сса акд адд еда ксс кас ада кас аад ккд ска аас ндз дса как саа 689
Рго Мек Агд Агд Зег Туг Агд Туг Ьуз Ьеи Ьеи Азп Тгр А1а Туг 61п
185 190 195
сад дкс саа саа аак ааа даа дак дес ^дд акк дад сак дак дкк сдд 737
61п Уа1 61п 61П Азп Ьуз 61и Азр А1а Тгр 11е 61и Н1з Азр Уа1 Тгр
200 205 210
ада акд дад акк как дкд кек скд дда акк дкд дда ккд дса ака скд 785
Агд Мек 61и Не Туг Уа1 Зег Ьеи 61у 11е Уа1 б1у Ьеи А1а Не Ьеи
215 220 225 230
дек скд ккд дек дкд аса кек акк сса кек дкд адк дас кек ккд аса 833
А1а Ьеи Ьеи А1а Уа1 Ткг Зег Не Рго Зег Уа1 Зег Азр Зег Ьеи тНг
235 240 245
кдд ада даа ккк сас как акк сад дка ааЬ аак ака каа аакаассска 8Θ2
Тгр Агд 61и Рке Наз Туг 11е 61п Уа1 Азп Азп 11е
250 255
- 152 014870 ададдЕаааЕ сЕЕсЕЕЕЕЕд ЕдЕЕЕаЕдаЕ аЕадааЕаЕд ЕЕдасЕЕЕас сссаЕааааа Э42 аЕаасаааЕд ЕЕЕЕЕсааса дсааадаЕсЕ ЕаЕасЕЕдЕЕ ссааЕЕааЕа аЕдЕдсЕсЕс 1002 сЕдЕЕдЕЕЕЕ сссЕаЕЕдсЕ ЕсЕааЕЕадд асаадЕдЕЕЕ ссЕадасаЕа ааЕааааддс 1062 аЕЕааааЕаЕ ЕсЕЕЕдЕЕЕЕ ЕЕЕЕЕЕЕЕЕд ЕЕЕдЕЕЕдЕЕ ЕЕЕЕдЕЕЕдЕ ЕЕдЕЕЕдЕЕЕ 1122 ЕЕЕЕдадаЕд аадЕсЕсдсЕ сЕдЕЕдссса ЕдсЕддадЕа садЕддсасд аЕсЕсддсЕс 1182 асЕдсаассЕ дсдссЕссЕд ддЕЕсаддсд аЕЕсЕсЕЕдс сЕсадссЕсс ЕдадЕадсЕд 1242 ддаЕЕасадд сасссаЕсас саЕдЕссадс ЕааЕЕЕЕЕдЕ аЕЕЕЕЕадЕа дадасадддЕ 1302 ЕЕЕсссаЕдЕ ЕддссаддсЕ ддЕсЕсдаЕс ЕссЕдассЕс аааЕдаЕссд сссассЕсдд 1362 ссЕсссааад ЕдсЕдддаЕд асадЕЕдЕда дссассасас ЕсадссЕдсЕ сЕЕЕсЕааЕа 1422 ЕЕЕдааасЕЕ дЕЕадасааЕ ЕЕдсЕассса ЕсЕааЕдЕда ЕаЕЕЕЕадда аЕссааЕаЕд 1482 саЕддЕЕЕаЕ ЕаЕЕЕсЕЕаа ааааааЕаЕЕ сЕЕЕЕассЕд ЕсассЕдааЕ ЕЕадЕааЕдс 1542 СЕЕЕЕаЕдЕЕ асасаасЕЕа дсасЕЕЕсса дааасааааа сЕсЕсЕссЕЕ даааЕааЕад 1602 адЕЕЕЕЕаЕс ЕассааадаЕ аЕдсЕадЕдЕ сЕсаЕЕЕсаа аддсЕдсЕЕЕ ЕЕссадсЕЕа 1662 саЕЕЕЕаЕаЕ асЕЕасЕсас ЕЕдаадЕЕЕс ЕаааЕаЕЕсЕ ЕдЕааЕЕЕЕа ааасЕаЕсЕс 1722 адаЕЕЕасЕд аддЕЕЕаЕсЕ ЕсЕддЕддЕа даЕЕаЕссаЕ аадаададЕд аЕдЕдссада 1782 аЕсасЕсЕдд даЕссЕЕдЕс ЕдасаадаЕЕ саааддасЕа ааЕЕЕааЕЕс адЕсаЕдаас 1842 асЕдссааЕЕ ассдЕЕЕаЕд ддЕадасаЕс ЕЕЕддаааЕЕ ЕссасааддЕ садасаЕЕсд 1902 саасЕаЕссс ЕЕсЕасаЕдЕ ссасасдЕаЕ асЕссаасас ЕЕЕаЕЕаддс аЕсЕдаЕЕад 1962 ЕЕЕддааадЕ аЕдссЕссаЕ сЕдааЕЕадЕ ссадЕдЕддс ЕЕададЕЕдд ЕасаасаЕЕс 2022 ЕсасадааЕЕ ЕссЕааЕЕЕЕ дЕаддЕЕсад ссЕдаЕаасс асЕддадЕЕс ЕЕЕддЕссЕс 2082 аЕЕаааЕадс ЕЕЕсЕЕсаса саЕЕдсЕсЕд ссЕдЕЕасас аЕаЕдаЕдаа сасЕдсЕЕЕЕ 2142 ЕадасЕЕсаЕ ЕаддааЕЕЕа ддасЕдсаЕс ЕЕдасаасЕд адссЕаЕЕсЕ асЕаЕаЕдЕа 2202 сааЕассЕад сссаЕааЕад дЬаЬасааЕа сасаЕЕЕддЕ аааасЕааЕЕ ЕЕсаассааЕ 2262 дасаЕдЕаЕЕ ЕЕЕсаасЕад ЕаассЕадаа аЕдЕЕЕсасЕ ЕааааЕсЕда даасЕддЕЕа 2322 сасЕасаадЕ ЕассЕЕддад аЕЕсаЕаЕаЕ дааааЕдсаа асЕЕадсЕаЕ ЕЕдаЕЕдЕаЕ 2382 ЕсасЕдддас ЕЕаадааЕдс дссЕдааЕаа ЕЕдЕдадЕЕс даЕЕЕдЕЕсЕ ддсаддсЕаа 2442 ЕдассаЕЕЕс садЕааадЕд ааЕададдЕс адаадЕсдЕа ЕаааададдЕ дЕЕдЕсадаа 2502 сассдЕЕдад аЕЕасаЕадд ЕдаасаасЕа ЕЕЕЕЕаадса асЕЕЕаЕЕЕд ЕдЕадЕдаса 2562 аадсаЕссса аЕдсаддсЕд аааЕдЕЕЕса ЕсасаЕсЕсЕ ддаЕсЕсЕсЕ аЕЕЕЕдЕдса 2622 дасаЕЕдааа аааЕЕдЕЕса ЕаЕЕаЕЕЕсс аЕдЕЕаЕсад ааЕаЕЕЕдаЕ ЕЕЕЕЕааааа 2682 саЕаддссаа дЕЕсаЕЕсас ЕЕсаЕЕаЕЕС аЕЕЕаЕсааа аЕсададЕда аЕсасаЕЕад 2742 ЕсдссЕЕсас аасЕдаЕааа даЕсасЕдаа дЕсаааЕЕда ЕЕЕЕЕдсЕаЕ ааЕсЕЕсааЕ 2802 сЕассЕаЕаЕ ЕЕааЕЕдада аЕсЕааааЕд ЕасаааЕсаЕ ЕдЕдЕЕдаЕЕ сЕдсадЕдаЕ 2862 ссЕдсЕайаа дЕаадасЕса дЕсссЕдаЕЕ ЕЕаддЕаЕсс ЕдЕдаааадс адааЕЕаада 2922 саааЕасаса ададасааад сасааааааЕ аааЕаЕсаЕа аддддаЕдаа сааааЕддЕд 2982 дадааададЕ адасааадЕЕ ЕЕЕдаЕсасс ЕдссЕЕсааа даааддсЕдЕ дааЕЕЕЕдЕЕ 3042 сасЕЕадаса дсЕЕддадас аадаааЕЕас ссаааадЕаа ддЕдаддадд аЕаддсаааа 3102 ададсадааа даЕдЕдааЕд дасаЕЕдЕЕд адаааЕдЕда Еаддааааса аЕсаЕадаЕа 3162 ааддаЕЕЕсс аадсаасада дсаЕаЕссад аЕдаддЕадд аЕдддаЕааа сЕсЕЕаЕЕда 3222 аССааЕсЕЕс ассааЕЕЕЕд ЕЕЕЕЕсЕЕЕЕ дсададсаад сЕаддааЕЕд ЕЕЕсссЕЕсЕ 3282 асЕдддсаса аЕасасдсаЕ ЕдаЕЕЕЕЕдс сЕддааЕаад ЕддаЕадаЕа ЕаааасааЕЕ 3342 ЕдЕаЕддЕаЕ асассЕссаа сЕЕЕЕаЕдаЕ адсЕдЕЕЕЕс сЕЕссааЕЕд ЕЕдЕссЕдаЕ 3402 аЕЕЕаааадс аЕасЕаЕЕсс ЕдссаЕдсЕЕ даддаадаад аЕасЕдаада ЕЕадасаЕдд 3462 ЕЕдддаадас дЕсассаааа ЕЕаасаааас ЕдадаЕаЕдЕ ЕсссадЕЕдЕ адааЕЕасЕд 3522 ЕЕЕасасаса ЕЕЕЕЕдЕЕса аЕаЕЕдаЕаЕ аЕЕЕЕаЕсас саасаЕЕЕса адЕЕЕдЕаЕЕ 3582 ЕдЕЕааЕааа аЕдаЕЕаЕЕс ааддаааааа аааааааааа ааааа 3627 е210> 23 <211> 258 <212> РКТ <213> Ното зархепз <400> 23
МеЕ 01и 5ег Агд Ьуз Азр 11е ТЬг Азп 01п С1и 01и Ьеи Тгр Ьуз МеЕ
1 5 10 15
Ьуз РГО Агд Агд Азп Ьеи 01и 31и Азр Азр Туг Ьеи Н1з Ьуз Азр ТЬг
20 25 30
С1у 61ц ТЬг Зег МеЕ Ьеи Ьуз Агд Рго Уа1 Ьеи Ьеи Нхз Ьеи ΗΪ8 01п
35 40 45
ТЬг А1а Н1з А1а Азр 01и РЬе Азр Суз Рго Зег 01и Ьеи С1п ΗΪΒ ТЬг
50 55 60
αΐη О1и Ьеи РЬе Рго 01п Тгр ΗΪ3 Ьеи Рго 11е Ьуз Не А1а А1а 11е
65 70 75 30
- 153 014870
Не А1а Зег Беи ТЬг 85 РЬе Беи Туг ТЬг Беи 90 Беи Агд С1и Уа1 Не 95 Н13
Рго Беи А1а ТЬг Зег н±з О1п С1п Туг РЬе Туг Буз Не Рго 11е Беи
100 105 110
Уа1 Не Азп Буз Уа1 Беи Рго Мек Уа1 Зег Не ТЬг Беи Беи А1а Беи
115 120 12 5
Уа1 Туг Беи Рго <31у Уа1 11е А1а А1а Не Уа1 <Э1п Беи Н13 Азп 31у
130 135 140
ТЬг Буз Туг Ьуз Буз РЬе Рго Ηίε Тгр Беи Азр Ьуз Τζρ Мек Беи ТЬг
145 150 155 160
Агд Буз 31п РЬе <31у Беи Беи Зег РЬе РЬе РЬе А1а Уа1 Беи ΗΪ3 А1а
165 170 175
11е Туг Зег Беи Зег Туг РГО Мек Агд Агд Зег Туг Агд Туг Буз Беи
1В0 185 190
Беи Азп Тгр А1а Туг С1п С1п Уа1 (31п С1п Азп Ьуз 61и Азр А1а Тгр
195 200 205
11е С1и Н1з Азр Уа1 Тгр Агд Мек 01и Не Туг ν»1 Зег Беи 31у Не
210 215 220
Уа1 С1у Беи А1а Не Беи А1а Беи Беи А1а Уа1 ТЬг Зег Не Рго Зег
225 230 235 240
Уа1 Зег Азр Зег Беи ТЬг Тгр Агд С1и РЬе Н13 Туг Не (31п Уа1 Азп
245 250 255
Азп 11е <210> 24 <211> 3627 <212> ДНК <213> Нопто вар1епз <220>
<221> СБЗ <222> (96)...(872) <400> 24 ддддсссдса сскскдддса дсадсддсад ссдадаскса сддксаадск ааддсдаада 60 дкдддкддск даадссакас каккккакад аакка акд даа аде ада ааа дас 113
Мек С1и Зег Агд Ьуз Азр
5
акс Не аса ТЬг аас Азп саа С1П 10 даа 31и даа <31и екк Беи ьдд Тгр ааа Ьуз 15 акд Мек аад Ьуз сск Рго адд Агд ада Агд 20 аак Азп кка Беи 161
даа даа дас да к как ^д сак аад дас асд дда дад асе аде акд ска 209
О1и б1и Азр Азр туг Беи Н13 Буз Азр ТЬг <31у <31и ТЬг Зег Мек Беи
25 30 35
ааа ада сск дкд екк ккд сак ккд сас саа аса дсс сак дек дак даа 257
Буз Агд Рго Уа1 Беи Беи Нае Беи Н1з (Э1п ТЬг А1а Н±з А1а Азр С1и
40 45 50
ккк дас кде сск кса даа екк сад сас аса сад даа скс ккк сса сад 305
РЬе Азр Суз Рго Зег С1и Беи С1п НЁе тЬг С1п С1и Беи РЬе Рго С1п
55 60 65 70
кдд сас ккд сса акк ааа ака дек дс£ акк ака дса кек скд аск ккк 353
Тгр Н1з Беи Рго Не Ьуз Не А1а А1а Не Не А1а Зег Беи ТЬг РЬе
75 80 85
екк Бас аск екк скд адд даа дка ацц сас ссс кка дса аск ксс сак 401
Беи Туг ТЬг Беи Беи Агд С1и Уа1 Не Н13 Рго Беи А1а ТЬг Зег Н1з
90 95 100
- 154 014870
саа саа еае С1п (31п Туг есс РЬе СаС Туг ааа Ьуз аСС Не сса Рго но аес Не сСд Ьеи дес Уа1 аес Не аас Азп 115 ааа Ьув дес Уа1 СЬд Ьеи 449
105
сса асд дсс Ссс аСс асе сСс сед дса еед дсе еас сед сса дде дСд 497
Рго Мес Уа1 Зег Не ТЬг Ьеи Ьеи А1а Ьеи ν*1 Туг Ьеи Рго 01у Уа1
120 125 130
аса дса дса аСС дес саа сее сае ааС дда асе аад СаС аад аад еее 545
Не А1а А1а 11е Уа1 <31п Ьеи Н1в Азп С1у ТЬг Ьув Туг Ьуз Ьуз РЬе
135 140 145 150
сса саС Ьдд £сд дас аад едд аед ееа аса ада аад сад еее ддд сее 5 93
Рго Ηΐε Тгр Ьеи АВр Ьуз Тгр МеС Ьеи ТЬг Агд Ьуз 51П РЬе Е1у Ьеи
155 160 165
сСс адС ССс ссс еее дсе дСа сед сае дса асе еае аде сед есе Сас 641
Ьеи Зег РЬе РЬе РЬе А1а Уа1 Ьеи Н1з А1а 11е Туг Зег Ьеи Зег Туг
170 175 180
сса аСд адд еда Ссс Сас ада Сас аад ЬСд сСа аас Сдд дса еае саа 689
Рго МеС Агд Агд Зег Туг Агд Туг Ьув Ьеи Ьеи Азп Тгр А1а Туг 31п
185 190 195
сад дсс саа саа аас ааа даа дае дсс едд асе дад сае дае дее Сдд 737
С1П Уа1 С1п <31п Азп Ьуз О1и Азр А1а Тгр 11е Е1и Н1з Азр Уа1 Тгр
200 205 210
ада аСд дад аСС СаС дСд ссе сед дда аее дСд дда еед дса аСа сед 735
Агд Мес <31и Не Туг Уа1 Зег Ьеи С1у Не Уа1 Е1у Ьеи А1а Не Ьеи
215 220 225 Ξ30
дсС сСд ССд дсС дед аса есе асе сса есе дед аде дас есе еед аса 833
А1а Ьеи Ьеи А1а Уа1 ТЬг Зег Не Рго Зег Уа1 Зег Азр Зег Ьеи Ткг
235 240 245
сдд ада даа ССС сас Ъаб асе сад дса ааС аац аСа Саа ааСаасссеа 882
Тгр Агд Е1и РЬе Н13 туг 11е 61п Уа1 Азп Азп Не *
250 255
ададдСаааС аеаасаааСд седеедееес аССааааСае еееедадаед аседсаассе ддаЬСасадд еессссаеде ссСсссааад еесдааасее саеддеееае сееееаедее адеееееасс сасеесаСае адаеееасед аСсасСседд асСдссааее саасСаСссс еееддааадС ЬсасадааЬе аееаааЬадс еадасеесаС сааСассСад сессееееед ееееесааса сссеаеедсе ессссдесее аадСсесдсе дсдссессед сасссаесас Сддссаддсе СдседддаСд дССадасаае еаееессеаа асасаасСЬа Сассааадае асееасСсас аддСееаСсе даСссССдес ассдееСаСд еесСасаСде аСдссСссае ессеааееес сеесеесаса еаддааСССа сссаСааСад
СдСССаСдае дсааадаСсС СсЬаасеадд ссееееесед седеедссса ддеесаддсд саСдессадс ддесесдаес асадССдСда еедсСассса ааааааСаее дсасСеесса аСдсСадедС ССдаадеесс еседдбддеа СдасаадаСЬ ддСадасаес ссасасдСаС сСдааееаде дСаддСЬсад саСедсесед ддасСдсаСс дСаСасааеа аСадааеаСд еаеасеедее асаадСдССС ееедееедее СдсСддадеа аССсесеедс еааеееседе СсседассСс дссассасас СсСааедСда сееееассед дааасааааа сСсаееесаа СаааСаеесе даЬеаессаС саааддасеа сееддаааее асессаасас ссадСдСддс ссСдаСаасс сседЬСасас ССдасаасСд сасасССдде
ССдасСеСас ссааееааеа ссСадасаСа ссеедеееде садеддсасд сбсадссСсс аееессадеа аааедаСссд СсадссСдсе СаСеееадда Ссасседаае сСсесСссее аддсСдсССС СдСааСССеа аадаададед ааеееаасес ессасааддС СССаСеаддс ССададССдд аседдадССс аСаедаСдаа адссСаССсС аааасСааее сссаеааааа аЬдедсесСс ааСааааддс еедееедеее аСсесддсес СдадеадсСд дадасаддде сссассесдд сСеесСааСа аессааСаСд ееадСааедс даааеааСад ССссадсССа ааасСассСс аедЬдссада адесаедаас садасаеесд аСседаеСад Сасаасаеес еееддСссСс саседсесее асСаСаедСа ССсаассааС
942 1002 1062 1122
11В2 1242
02 1362 1422 1482 1542 1602 1662 1722 1782 1842 1902 1962 2022 2032 2142 2202 2262
- 155 014870 дасаедеаее сасеасааде есаседддас едассаееес сассдеедад аадсаЬссса дасаъедааа саеаддссаа есдссеесас сеассеаеае сседсеаеаа саааеасаса дадааададе сасееадаса ададсадааа ааддаееесс ассааесеес аседддсаса едеаеддеае аеееаааадс еедддаадас еееасасаса едееааЪааа ееесаасеад еассееддад ееаадааЬдс садеааадед аееасаеадд аедсаддсед аааеедееса деесаЪСсас аасСдаеааа ееааеедада деаадасЬса ададасааад адасааадее дсееддадас даедедааед аадсаасада ассааеееед аеасасдсае асассЬссаа аеасеаеесс десассаааа ееееедееса аедаеЪаеес еаассеадаа аеесаеаЬае дсседааСаа ааеададдес едаасаасеа аааедеееса еаедаъеесс еесаееаеес даесаседаа аесСааааед дессседаее сасаааааае ееедаесасс аадаааееас дасаеедеед дсаеаессад ееееесееее едаееееедс сееееаедае едссаедсее ееаасаааас аеаеСдаеаС ааддаааааа аедееесасе даааасдсаа еедедадсес адаадесдеа еееееаадса есасаесесе аЬдееаЪсад аеееаСсааа десаааееда еасаааесае ееаддеаесс аааеаесаеа едссеесааа ссаааадеаа адаааедеда аедаддеадд дсададсаад седдааеаад адседеееес даддаадаад едадаеаеде аееееаесас аааааааааа еааааеседа асееадсеае даееедеесе еаааададде асеееаееед ддаесесесе ааЬаееедае абсададеда ееееедсеае едедеедаее едедаааадс аддддаедаа даааддсЪде ддедаддадд еаддааааса аедддаЬааа сеаддааеед еддаеадаеа сеессааеед аеасЬдаада есссадееде саасаеееса ааааа дааседдееа еедаеедеае ддсаддсеаа деедесадаа едеадедаса аеееедедса еееееааааа абсасаееад ааесеесаае сСдсадедае адааЬЬаада сааааЬ-ддед дааеееедее аЬаддсаааа аесаеадаеа сесееаееда ееесссеесе еаааасааее еедесседае ееадасаедд адааееасед адееедеасе
2322
2382
2442
2502
2552
2622
2682
2742
2302
2862
2922
2982
3042
3102
3162
3222
3282
3342
3402
3462
3522
3582
3627 <210> 25 <211> 258 <212> РЕТ <213 > Ното аараепз <400> 25
Мее 1 СГи Зег Агд Ьуз 5 Азр Не ТЬг Азп С1п 10 С1и С1и Ьеи Тгр Ьув 15 МеЬ
Ьуз Рго Агд Агд Азп Ьеи <31и С1и Авр Азр Туг Ьеи Н1в Ьув Аар ТЬг
20 25 30
С1у С1и ТЬг Зег мее Ьеи Ьув Агд Рго Уа1 Ьеи Ьеи Н13 Ьеи Η1Ξ С1п
35 40 45
ТЬг А1а ΗΪ3 А1& Аар С1и РЬе Азр Суз Рго Зег С1и Ьеи <31п Н1з ТЬг
50 55 60
С1п С1и Ьеи РЬе Рго С1п ТГр Н1в ьеи РГО Не Ьув Не А1а А1а 11е
65 70 75 80
11е А1а Зег Ьеи ТЬг РЬе Ьеи Туг ТЬг Ьеи Ьеи Агд □1и Уа1 11е ΗΪ3
85 90 95
Рго Ьеи А1а ТЬг Зег ΗΪ8 О1п С1п Туг РЬе Туг ьув Не Рго 11е Ьеи
100 105 но
Уа1 11е Азп Ьув 17а 1 Ьеи Рго Мее Уа1 Зег Не ТЬг Ьеи ьеи А1а Ьеи
115 120 125
Уа1 Туг Ьеи РГО <31у ναΐ Не А1а А1а Не Уа1 С1п Ьеи Н1з Азп С1у
130 135 140
ТЬг Ьуз Туг Ьув Ьув РЬе Рго Ηίθ Тгр Ьеи Азр ьув Тгр МеЬ Ьеи ТЬг
145 150 155 160
Агд Ьуз С1п РЬе С1у Ьеи Ьеи Зег РЬе РЬе РЬе А1а Уа1 Ьеи Н1з А1а
165 170 175
11е Туг Зег Ьеи Зёг Туг Рго Мее Агд Агд Зег Туг Агд Туг Ьуз Ьеи
180 185 190
ьеи Азп Тгр А1а Туг С1п С1п Уа1 С1п С1п Азп Ьув «1и Азр А1а Тгр
195 200 205
11е С1и Н13 Аар Уа1 Тгр Агд Мее С1и Не Туг Уа1 Зег Ьеи С1у Не
210 215 220
Уа1 С1у Ьеи А1а Не Ьеи А1а Ьеи Ьеи А1а Уа1 ТЬг Зег Не Рго Зег
225 230 235 240
Уа1 Зег Азр Зег Ьеи ТЬг Тгр Агд С1и РЬе Η1Ξ Туг Не С1П Уа1 Азп
245 250 255
Азп Не
- 156 014870 <210> 26 <211> 3627 <212> ДНК <213> Ното зархепз <220>
<221> СОЗ <222> (96)...(872) <400> 26 ддддсссдса ссЬсЬдддса дсадсддсад ссдадасЬса сддЬсаадсЬ ааддсдаада 60 дЬдддЬддсЬ даадссаЬас ЬаЬЬЬЬаЬад ааЬЬа аьд даа аде ада ааа дас 113
МеЬ 61и Зег Агд Ьуз Авр
5
аЬс Не аса аае саа Θΐη 10 даа <ЭЬи даа сЬЬ <31и Ьеи ьдд Тгр ааа Ьуз 15 аЬд МеЬ аад Ьуз ссЬ Рго адд Агд ада Агд 20 ааЬ Азп ЬЬа Ьеи 161
ТЬг АЗП
даа даа дас даЬ ЬаЬ ЬЬд саЬ аад дас асд дда дад асе аде аЬд сЬа 209
С1и 61и Азр Азр Туг Ьеи Η13 Ьуз Азр ТЬг С1у 01и ТЬг Зег МеЬ Ьеи
25 30 35
ааа ада ССЬ дЬд СЬЬ ььд саЬ ЬЬд сас саа аса дсс саь дсЬ даЬ даа 257
Ьуз Агд Рго УаЬ Ьеи Ьеи ΗΪ3 Ьеи Ηίε 61п ТЬг А1а Ηίε А1а Азр 01и
40 45 50
ЬЬЬ дас Ьдс ссЬ Ьса даа сЬЬ сад сас аса сад даа сЬс ЬЬЬ сса сад 305
РЬе Азр Суз Рго Зет 31и Ьеи <31п ΗΪ3 ТЬг С1п 61и Ьеи РЬе Рго <Э1п
55 60 65 70
сдд сас ььд сса аЬЬ ааа аЬа дсь дсь аЬЬ аЬа дса ЬсЬ сЬд асЬ ЬЬЬ 353
Тгр Ηίε Ьеи Рго Не Ьуз Не А1а А1а Не Не А1а Зег Ьеи ТЬг РЬе
75 80 35
сЬЬ Ьас ась СЬЬ сЬд адд даа дЬа аьь сас ссс ЬЬа дса асЬ Ьсс саь 401
Ьеи Туг ТЬг Ьеи Ьеи Агд С1и Уа1 Не Ηίε Рго Ьеи А1а ТЬг Зег Ηίε
90 95 100
саа саа ЬаЬ ЬЬЬ ЬаЬ ааа аьь сса аЬс сЬд дЬс аЬс аае ааа дЬс ЬЬд 449
(31п 61п Туг РЬе Туг Ьуз Не Рго Не Ьеи Уа1 Не Азп Ьув Уа1 Ьеи
105 110 115
сса аьд дЬЬ Ьсс аЬс асЬ сЬс ЬЬд дса ььд дьь Ьас сЬд сса ддь дЬд 497
Рго МеЬ УаЬ Зег Не ТЬг Ьеи Ьеи А1а Ьеи Уа1 Туг Ьеи Рго <31у Уа1
120 125 130
аЬа дса дса аЬЬ дЬс саа сЬЬ саЬ ааЬ дда асе аад ьаь аад аад ЬЬЬ 54 5
Не АЬа АЬа Не ЦаЬ <31П Ьеи Н1з Азп С1у ТЬг Ьуз Туг Ьуз Ьуз РЬе
135 14 0 145 150
сса саЬ ьдд ЬЬд даь аад ьдд аЬд ЬЬа аса ада аад сад ЬЬЬ ддд сЬЬ 593
Рго ΗΪΞ Тгр Ьеи Азр Ьуз Тгр МеЬ Ьеи ТЬг Агд Ьуз αΐη РЬе <31у Ьеи
155 160 165
сЬс адк ЬЬс ЬЬЬ ЬЬЬ дсь дЬа сЬд саЬ дса аьь ЬаЬ адЬ сЬд ЬсЬ Ьас 641
Ьеи Зег РЬе РЬе РЬе А1а νδΐ Ьеи Ηίε А1а Не Туг Зег Ьеи Зег Туг
170 17 5 180
сса аьд адд еда Ьсс Ьас ада Ьас аад ЬЬд сЬа аае Ьдд дса ЬаЬ саа 689
Рго МеЬ Агд Агд Зег Туг Агд Туг Ьуз ьеи Ьеи Азп Тгр А1а Туг 01п
185 190 195
- 157 014870
сад дкс 01п Уа1 саа саа С1п <31п аак ааа даа дак дес А1а ьдд Тгр акк Не дад 01и 210 сак Ηίθ дак Азр дкк Уа1 сдд Тгр 737
Αθ η Ьуз О1и 205 Авр
200
ада акд дад акк как дбд кек скд дда акк дкд дда ккд дса ака скд 785
Агд Мек 01и 11е Туг Уа1 Зег Ьеи С1у Не Уа1 31у Ьеи А1а Не Ьеи
215 220 225 230
дек скд ккд дек дкд аса кек акк сса кек дкд адк дас кек ккд аса 833
А1а Ьеи Ьеи А1а Уа1 ТНг Зег 11е Рго Зег Ца1 Зег Азр Зег Ьеи ТЬг
235 240 245
кдд ада даа ккк сас как акк сад дка аак аак ака каа аакаассска 882
Тгр Агд С1и РНе ΗΪ3 Туг 11е 5111 Уа1 Азп АЗП Не ♦
250 255
ададдкааак акаасааакд скдккдкккк аккаааакак ккккдадакд аскдсаасск ддаккасадд ккксссакдк ссксссааад кккдаааскк сакддкккак ск.кккакдкк адкккккакс сакНккакак адакккаскд аксасЬскдд аскдссаакк сааскакссс кккддааадк ксасадаакк аккааакадс кадаскксак саакасскад дасакдкакк саскасаадк ксаскдддас кдассакккс сассдккдад аадсакссса дасаккдааа сакаддссаа ксдсскксас скасскакак сскдскакаа сааакасаса дадааададк сасккадаса ададсадааа ааддаккксс ассааксккс аскдддсаса Ъдкакддкак акккаааадс ккдддаадас Нккасасаса кдккаакааа сккскккккд ккккксааса ссскаккдск ЬскЫдккЪк аадксксдск дсдссксскд сасссаксас кддссаддск кдскдддакд дккадасаак каккксккаа асасааскка кассааадак асккасксас аддкккакск дакссккдкс ассдкккакд ккскасакдк акдескссак ксскаакккк кккскксаса каддааккка сссакаакад ккксааскад кассккддад ккаадаакдс садкааадкд аккасакадд акдсаддскд аааккдккса дкксакксас ааскдакааа ккааккдада дкаадаскса ададасааад адасааадкк дсккддадас дакдкдаакд аадсаасада ассааккккд акасасдсак асасскссаа акаскакксс дксассаааа кккккдккса акдаккаккс кдкккакдак дсааадакск кскааккадд кккккккккд скдккдссса ддкксаддсд сакдкссадс ддксксдакс асадккдкда ккдскассса аааааакакк дсасккксса акдскадкдк ккдаадкккс кскддкддка кдасаадакк ддкадасакс ссасасдкак скдааккадк дкаддкксад саккдскскд ддаскдсакс дкакасаака каасскадаа акксакакак дсскдаакаа аакададдкс кдаасааска ааакдкккса каЪЬаНкксс кксаккаккс даксаскдаа акскаааакд дкссскдакк сасаааааак кккдаксасс аадаааккас дасаккдккд дсакакссад кккккскккк кдаккЫкдс сккккакдак кдссакдскк ккаасаааас акаккдакак ааддаааааа акадаакакд ккдаскккас сссакааааа 942 какасккдкк ссааккаака акдкдскскс 1002 асаадкдккк сскадасака аакааааддс 1062 кккдкккдкк ккккдкккдк ккдкккдккк 1122 кдскддадка садкддсасд аксксддскс 1182 акксксккдс сксадссксс кдадкадскд 1242 каакккккдк акккккадка дадасадддк 1302 ксскдасскс ааакдакссд сссассксдд 1362 дссассасас ксадсскдск скккскаака 1422 кскаакдкда каккккадда акссаакакд 1482 сккккасскд ксасскдаак ккадкаакдс 1542 дааасааааа сксксксскк дааакаакад 1602 сксаккксаа аддскдсккк ккссадскка 1662 кааакаккск кдкаакккка аааскакскс 1722 даккаЬссак аадаададкд акдкдссада 1782 саааддаска аакккааккс адксакдаас 1842 кккддааакк кссасааддк садасакксд 1902 аскссаасас кккаккаддс акскдаккад 1962 ссадкдкддс ккададккдд касаасаккс 2022 сскдакаасс аскддадккс Ыкддксскс 2082 сскдккасас акакдакдаа саскдскккк 2142 ккдасааскд адсскаккск аскакакдка 2202 сасакккддк ааааскаакк кксаассаак 2262 акдккксаск каааакскда дааскддкка 2322 даааасдсаа асккадскак ккдаккдкак 2382 ккдкдадккс дакккдккск ддсаддскаа 2442 адаадксдка каааададдк дккдксадаа 2502 кккккаадса аскккакккд кдкадкдаса 2562 ксасакскск ддакскскск аккккдкдса 2622 акдккаксад аакакккдак кккккааааа 2682 акккаксааа аксададкда аксасаккад 2742 дксаааккда кккккдскак ааксккеаак 2802 касаааксак кдкдккдакк скдсадддак 2862 ккаддкаксс кдкдаааадс адааккаада 2922 ааакаксака аддддакдаа саааакддкд 2982 кдсскксааа даааддскдк дааккккдкк 3042 ссаааадкаа ддкдаддадд акаддсаааа 3102 адааакдкда каддааааса аксакадака 3162 акдаддкадд акдддакааа сксккаккда 3222 дсададсаад скаддааккд ккксссккск 3282 скддаакаад кддакадака каааасаакк 3342 адскдккккс сккссааккд ккдксскдак 3402 даддаадаад акаскдаада ккадасакдд 3462 кдадакакдк ксссадккдк адааккаскд 3522 аккккаксас саасакккса адкккдкакк 3582 аааааааааа ааааа 3627
- 158 014870 <210> 27 <211> 258 <212> РНТ <213? Ното зархепз <400> 27
Мек С1и Зег Агд ьуз Азр Не Ткг Азп О1п С1и С1и Ьеи Тгр Ьуз Мек
1 5 10 15
Ьуз Рго Агд Агд Азп Ьеи 01и <31и Азр Азр Туг Ьеи Н18 Ьуз Азр Ткг
20 25 30
<31у С1и ТНг Зег мек Ьеи Ьуз Агд Рго Уа1 Ьеи Ьеи Н13 Ьеи Н1з С1п
35 40 45
Ткг А1а Н1з А1а Азр <31и Рке Азр Суз Рго Зег С1и Ьеи 01п Н1з Ткг
50 55 60
С1п 61и ьеи РНе РГО е1п Тгр ΗΪ3 Ьеи Рго Не Ьуз Не А1а А1а 11е
65 70 75 80
Не А1а Зег ьеи ткг Рке Ьеи Туг Ткг Ьеи Ьеи Агд С1и Уа1 Не Н13
85 90 95
Рго Ьеи. А1а Ткг Зег Η1ξ αΐη С1п Туг Рке Туг Ьуз Не Рго 11е Ьеи
100 105 110
Уа1 11е Азп Ьуз Уа1 Ьеи Рио Мек Уа1 Зег Не Ткг Ьеи Ьеи А1а Ьеи
115 120 125
Уа1 Туг Ьеи Рго С1у Уа1 11е А1а А1а Не Уа1 И1п Ьеи Н13 Азп С1у
13 0 135 140
Ткг Ьуз туг ьуз Ьуз Рке Рго ΗΪ3 Тгр Ьеи Азр Ьуз Тгр Мек Ьеи ТНг
145 150 155 160
Агд Ьуз О1п Рке 31у Ьеи Ьеи Зег Рке Рке Рке А1а Уа1 Ьеи ΗΪ3 А1а
165 170 175
Не Туг Зег Ьеи Зег Туг Рго Мек Агд Агд Зег Туг Агд Туг Ьуз Ьеи
180 185 190
Ьеи Азп Тгр А1а Туг С1п <31п Уа1 С1п С1п Азп Ьуз <31и. Азр А1а Тгр
195 200 205
11е 01и ΗΪΒ Азр Уа1 Тгр Агд мек С1и Не Туг Уа1 Зег Ьеи О1у Не
210 215 220
Уа1 01у Ьеи А1а Не Ьеи А1а Ьеи Ьеи А1а Уа1 Ткг Зег Не Рго Зег
225 230 235 240
Уа1 Зег Азр Зег Ьеи Ткг Тгр Агд С1и Рке ΗΪ3 Туг Не С1п Уа1 Азп
245 250 255
Азп Не <210> 28 <211> 3627 <212> ДНК <213> Ното зархепз <220>
<221> СЕ'5 <222? (Э6)...(872) <400> 28 ддддсссдса сскскдддса дсадсддсад ссдадаскса сддксаадск ааддсдаада 60 дкдддкддск даадссакас каккккакад аакка акд даа аде ада ааа дас 113
Мек С1и Зег Агд Ьуз Азр
5
акс аса 11е ТНг аас Азп саа даа даа οϋϋ Ьеи. кдд ааа акд аад иск адд Агд ада Агд 20 аак Азп кка Ьеи 161
<31п 10 <31и Тгр Ьуз 15 МеС Ьуз Рго
даа даа дас дак как ЪЬд са£ аад дас асд дда дад асе аде акд ска 209
С1и О1и Азр Азр Туг Ьеи ΗΪ5 Ьуз Азр тИг <31у С1и ткг Зег Мек Ьеи
25 30 35
- 159 014870
ааа Ьуз ада Агд 40 ссЕ Рго дЕд сЕЕ ЕЕд саЕ ЕЕд сас ьеи Н1з саа С1п аса ТЬг дсс А1а 50 саЕ дсЕ даЕ Азр даа <31и 257
Уа1 Ьеи ьеи ΗΪ3 45 Нхз А1а
ЕЕЕ дас Еде ссЕ Еса даа СЕЕ сад сас аса сад даа СЕс ЕЕЕ сса сад 305
РЬе Азр Суе Рго Зег С1и Ьеи С1п ТЬг С1п 01и Ьеи РЬе Рго θΐη
55 60 65 70
Едд сас ЕЕд ьеи сса Рго аЕЕ ааа аса дсЕ дсЕ А1а А1а аЕЕ Не 80 аЕа Не дса СсЕ сЕд Ьеи асЕ ТЬг 85 ЕЕЕ РЬе 353
Тгр Шз Не 75 Ьуз 11е А1а Зег
СЕЕ Еас асЕ СЕЕ сЕд адд даа дЕа аЕЕ сас ссс ЕЕа дса асЕ Ссс саЕ 401
Ьеи Туг ТЬг Ьеи Ьеи Агд 61и Уа1 11е Н1з Рго Ьеи А1а ТЬг Зег ΗΪ3
90 95 100
саа саа ЕаЕ ЕЕЕ ЕаЕ ааа асе сса аЕс сЕд дЕс аЕс аас ааа дЕс ЕЕд 449
01п <31п Туг РЬе Туг Ьуз Не Рго Не Ьеи Уа1 Не Азп Ьуз Уа1 Ьеи
105 но 115
сса аЕд дЕЕ Есс аЕс асЕ сЕс £Сд дса ЕЕд дЕЕ Еас сЕд сса ддс дед 497
Рго МеЕ Уа1 Бег Не ТЬг Ьеи Ьеи А1а Ьеи Уа1 Туг Ьеи Рго <31у Уа1
12 0 125 130
аЕа дса дса аЕЕ дЕс саа сЕЕ саЕ ааЕ дда асе аад ЕаЕ аад аад ЕЕЕ 545
11е А1а А1а Не Уа1 61п Ьеи Ηίε Азп (31у ТЬг Ьуз Туг Ьуз Ьуз РЬе
135 140 145 150
сса саЕ Едд ЕЕд дас аад Едд аЕд ЕЕа аса ада аад сад ЕЕЕ ддд сЕЕ 593
Рго ΗΪΞ Тгр Ьеи Азр Ьуз Тгр МеЕ ьеи ТЬг Агд Ьуз С1п РЬе С1у Ьеи
155 160 165
сЕс адЕ ЕЕс ЕСЕ ССЕ дес дЕа сЕд саЕ дса аЕЕ СаЕ аде сЕд СсЕ Еас 641
Ьеи Бег РЬе РЬе РЬе А 1а Уа1 Ьеи ΗΪ5 А1а Не Туг Зег Ьеи Бег Туг
170 175 180
сса аЕд адд еда Есс Сас ада Еас аад СЕд сСа аас едд дса ЕаЕ саа 689
Рго МеЕ Агд Агд Зег Туг Агд Туг Ьуз Ьеи Ьеи Азп Тгр А1а Туг С1п
185 190 195
сад дЕс саа саа ааЕ ааа даа даЕ дсс Едд аЕЕ дад саЕ даЕ дЕЕ Едд 737
θΐη Уа1 01п С1п Азп Ьуз О1и Азр А1а Тгр Не С1и Н1з Азр Уа1 Тгр
200 205 210
ада аЕд дад аЕЕ ЕаЕ дСд ЕсЕ СЕд дда аЕЕ дед дда ЕЕд дса аЕа сЕд 785
Агд МеЕ С1и 11е Туг Уа1 Зег Ьеи С1у Не Уа1 С1у Ьеи А1а 11е Ьеи
215 220 225 230
дсЕ сЕд ^Ед дсЕ дед аса ЕСЕ аЕЕ сса СсЕ дед аде дас ЕсЕ СЕд аса 833
А1а Ьеи Ьеи А1а νβΐ ТЬг Бег 11е Рго Зег νβΐ Зег Азр Зег Ьеи ТЬг
235 240 245
Едд ада даа ЕЕЕ сас ЕаЕ аЕЕ сад дЕа ааЕ ааЕ аЕа Еаа ааЕаасссЕа 882
Тгр Агд 61и РЬе Н1з Туг Не (31п Уа1 Азп Азп Не +
250 255
ададдЬаааЕ аЕаасаааЕд сЕдЕЕдСЕЕЕ аЕЕааааЕаЕ ЕЕЕЕдадаЕд асЕдсаассЕ
СЕЕсЕЕЕЕЕд ЕЕЕЕЕсааса СссЕаЕЕдсЕ ЕсЕЕЕдЕЕЕЕ аадЕсСсдсЕ дсдссСссЕд
ЕдЕЕЕаЕдаЕ дсааадаЕсЕ ЕсСааЕЕадд ЕЕЕЕЕЕЕЕЕд сЕдЕЕдссса ддЕЕсаддсд аЕадааЕаЕд ЕаЕасЕЕдЕЕ асаадЕдЕЕЕ ЕЕЕдЕЕЕдЕЕ ЕдсЕддадЕа аЕЕсЕсЕЕдс
ЕЕдасЕЕЕас ссааЕЕааЕа ссЕадасаЕа ЕЕЕЕдЕЕЕдЕ садЕддсасд сЕсадссЕсс сссаЕааааа аЕдЕдсЕсЕс ааЕааааддс ЕЕдЕЕЕдЕЕЕ аЕсЕсддсЕс ЕдадЕадсЕд
942
1002
1062
1122
1182
1242
- 160 014870 ддаЕЕасадд ЕЕЕсссаЕдЕ ссЕсссааад ЕЕЕдааасЕЕ саЕддЕЕЕаЕ сЕЕЕЕаЕдЕЕ адЕЕЕЕЕаЕс саЕЕЕЕаЕаЕ адаЕЕЕасЕд аЕсасЕсЕдд асЕдссааЕЕ саасЕаЕссс ЕЕЕддааадЕ ЕсасадааЬЕ аЕЕаааЕадс ЕадасЕЕсаЕ сааЕассЕад дасаЕдкаЕЕ сасЕасаадЕ ЕсасЕдддас ЕдассаЕЕЬс сассдЕЕдад аадсаЕссса дасаЕЕдааа саЕаддссаа ЕсдссЕЕсас сЕассЕаЕаЕ ссЕдсЕаЕаа саааЕасаса дадааададЕ сасЕЕадаса ададсадааа ааддаЕЕЕсс ассааЕсЕЕс асЕдддсаса ЕдЕаЕддЕаЕ аЕЕЕаааадс ЕЕдддаадас ЕЕЕасасаса ЕдЕЕааЕааа сасссаЕсас ЕддссаддсЕ ЕдсЕдддаЕд дЕЕадасааЕ ЕаЕЕЕсЕЕаа асасаасЕЕа ЕассааадаЕ асЕЕасЕсас аддЕЕЕаЕсЕ даЕссЕЕдЕс ассдЕЕЕаЕд ЕЕсЕасаЕдЕ аЕдссЕссаЕ ЕссЕааЕЕЕЕ ЕЕЕсЕЕсаса ЕаддааЕЕЕа сссаЕааЕад ЕЕЕсаасЕад ЕассЕЕддад ЕЕаадааЕдс садЕааадЕд аЕЕасаЕадд аЕдсаддсЕд аааЕЕдЕЕса дЕЕсаЕЕсас аасЕдаЕааа ЕЕааЕЕдада дЕаадасЕса ададасааад адасааадЕЕ дсЕЕддадас даЕдЕдааЕд аадсаасада ассааЕЕЕЕд аЕасасдсаЕ асассЕссаа аЕасЕаЕЕсс дЕсассаааа ЕЕЕЕЕдЕЕса аХдаЕЕаЕЕс саЕдЕссадс ддЕсЕсдаЕс асадЕЕдЕда ЕЕдсЕассса ааааааЕаЕЕ дсасЕЕЕсса аЕдсЕадЕдЕ ЕЕдаадЕЕЕс ЕсЕддЕддЕа ЕдасаадаЕХ ддЕадасаЕс ссасасдЕаЕ сЕдааЕЕадЕ дЕаддЕЕсад саЕЕдсЕсЕд ддасЕдсаЕс дЕаЕасааЕа ЕаассЕадаа аЕЕсаЕаЕаЕ дссЕдааЕаа ааЕададдЕс ЕдаасаасЕа аааЕдЕЕЕса ЕаЕЕаЕЕЕсс ЕЕсаЕЕаХЕс даЕсасЕдаа аксЕааааХд дЕсссЕдаЕЕ сасааааааЕ ЕЕЕдаЕсасс аадаааЕЕас дасаЕЕдЕЕд дсаЕаЕссад ЕЕЕЕЕСЕЕЕЕ ЕдаЕЕЕЕЕдс СЕЕЕЕаЕдаЕ ЕдссаЕдсЕЕ ЕЕаасаааас аЕаЕЕдаЕаЕ ааддаааааа
ЕааЕЕЕЕЕдЕ ЕссЕдассЕс дссассасас ЕсЕааЕдЕда сЕЕЕЕассЕд дааасааааа СЕсаЕЕЕсаа ЕаааЕаЕЕсЕ даЕЕаЕссаЕ саааддасЕа ЕЕЕддаааЕЕ асЕссаасас ссадЕдЕддс ссЕдаЕаасс ссЕдЕЕасас ЕЕдасаасЕд сасаЕЕЕддЕ аЕдЕЕЕсасЕ даааасдсаа ЕЕдЕдадЕЕс адаадЕсдЕа ЕЕЕЕЕаадса ЕсасаЕсЕсЕ аЕдЕЕаЕсад аЕЕЕаЕсааа дЕсаааЕЕда ЕасаааЕсаЕ ЕЕаддЕаЕсс аааЕаЕсаЕа ЕдссЕЕсааа ссаааадЕаа адаааЕдЕда аЕдаддЕадд дсададсаад сЕддааЕаад адсЕдЕЕЕЕс даддаадаад ЕдадаЕаЕдЕ аЕЕЕЕаЕсаС с1с1с1с1с1сЬс1с1с1с1 аЕЕЕЕЕадЕа аааЕдаЕссд ЕсадссЕдсЕ ЕаЕЕЕЕадда ЕсассЕдааЕ сЕсЕсЕссЕЕ аддсЕдсЕЕЕ ЕдЕааЕЕЕЕа аадаададЕд ааЕЕЕааЕЕс ЕссасааддЕ ЕЕЕаЕЕаддс ЕЕададЕЕдд асЕддадЕЕс аЕаЕдаЕдаа адссЕаЕЕсЕ аааасЕааЕЕ ЕааааЕсЕда асЕЕадсЕаЕ даЕЕЕдЕЕсЕ ЕаааададдЕ асСЕЕаЕЕЕд ддаЕсЕсЕсЕ ааЕаЕЕЕдаЕ аЕсададЕда ЕЕЕЕсдсЕаЕ ЕдЕдЕЕдаЕЕ ЕдХдаХаадс аддддаЕдаа даааддсЕдЕ ддхдаддадд Еаддааааса аЕдддаЕааа сЕаддааЕЕд ЕддаЕадаЕа сЕЕссааЕЕд аЕасЕдаада ЕсссадЕЕдЕ саасаЕЕЕса ааааа дадасадддЕ сссассЕсдд СЕЕЕсЕааЕа аЕссааЕаЕд ЕЕадЕааЕдс даааЕааЕад ЕЕссадсЕЕа ааасЕаЕсЕс аЕдЕдссада адЕсаЕдаас садасаЕЕсд аЕсЕдаЕЕад ЕасаасаЕЕс ЕЕЕддЕссЕс сасЕдсЕЕЕЕ асЕаЕаЕдЕа ЕЕсаассааЕ даасЕддЕЕа ЕЕдаЕЕдЕаЕ ддсаддсЕаа дЕЕдЕсадаа ЕдЕадЕдаса аЕЕЕЕдЕдса ЕЕЕЕЕааааа аЕсасаЕЕад ааЕсЕЕсааЕ сЕдсадЕдаЕ адааЕЕаада сааааЕддЕд дааЕЕЕЕдЕЕ аЕаддсаааа аЕсаЕадаЕа сЕсЕЕаЕЕда ЕЕЕсссЕЕсЕ ЕаааасааЕЕ ЕЕдЕссЕдаЕ ЕЕадасаЕдд адааЕЕасЕд адЕЕЕдЕаЕЕ
1302 1362 1422 1482 1542 1602 1662 1722 1782 1842 1902 1962 2022 2082 2142 2202 2262 2322 2382 2442 2502 2562 2622 2682 2742 2802 2862 2922 2982 3042 3102 3162 3222 3282 3342 3402 3462 3522 3582 3627 <210> 29 <211> 258 <212> РКТ <213> Ното вархепз <400> 29
МеЕ <Э1и Зег Агд Ьуз Азр 11е ТЬг Азп 01п С1и С1и Ьеи Тгр Ьуз МеЕ
1 5 10 15
Ьуз Рго Агд Агд Азп Ьеи С1и С1и Азр Азр Туг Ьеи ΗΪ3 Ьуз Азр ТЬг
20 25 30
С1у С1и ТЬг Зег МеЕ Ьеи Ьуз Агд Рго Уа1 Ьеи Ьеи Ηίε Ьеи Н13 01п
35 40 45
ТЬг А1а ΗΪ3 А1а Азр 01и РЬе Азр Суз Рго Зег С1и Ьеи <31п Н1з ТЬг
50 55 60
С1П С1и Ьеи РЬе Рго С1п Тгр Низ Ьеи Рго 11е Ьуз Не А1а А1а 11е
65 70 75 80
Не А1а Зег Ьеи ТЬг РЬе ьеи Туг ТЬг Ьеи Ьеи Агд 01и Уа1 11е Н1з
85 90 95
Рго Ьеи А1а ТЬг Зег ΗΪΒ <31п <31п Туг РЬе Туг Ьуз Не Рго Не Ьеи
100 105 110
Уа1 Не Аеп Ьуз Уа1 Ьеи РГО МеЕ Уа1 Зег 11е ТЬг Ьеи Ьеи А1а Ьеи
115 120 125
Уа1 Туг Ьеи Рго С1у Уа1 Не А1а А1а Не Уа1 <31п Ьеи Н1з Азп С1у
- 161 014870
130 135 140
ТЬг БуЗ Туг Буз Буз РЬе Рго Низ Тгр Беи Азр Буз Тгр МеС Беи ТЬг
145 150 155 160
Агд Буз С1п РЬе О1у Беи Беи Зег РЬе РЬе РЬе А1а Уа1 Беи Нив А1а
165 170 175
Не Туг Зег Беи Зег Туг Рго МеС Агд Агд Зег Туг Агд Туг Буз Беи
180 185 190
Беи Азп Тгр А1а Туг 61п С1п Уа1 61п 01п Азп Буз 01и Авр А1а Тгр
195 200 205
Не С1и Низ Авр νβΐ Тгр Агд МеС 61и Не Туг Уа1 зег Беи 61у Не
210 215 220
Уа1 С1у Беи А1а 11 е Беи А1а Беи Беи А1а Уа1 ТЬг Зег Не Рго Зег
225 230 235 240
Уа1 Зег Азр Зег Беи ТЬг тгр Агд О1и РЬе Ηίε туг Не С1п Уа1 Азп
245 250 255
Азп Не <210> 30 <211> 3627 <212> ДНК <213> Ното зариепз <220>
<221> СОЗ <222> (96) . . .(872) <400> 30 ддддсссдса ссСсСдддса дсадсддсад ссдадасСса сддСсаадсС ааддсдаада 60 дСдддСддсС даадссаСас СаССССаСад ааССа аСд даа аде ада ааа дас 113
МеС О1и Зег Агд Буз Азр
5
аСс 11е аса ТЪг аас Азп саа С1п 10 даа С1и даа О1и сСС Беи Сдд Тгр ааа Буз 15 аСд МеС аад Буз ссС Рго адд Агд ада Агд 20 ааС Азп ССа Беи 161
даа даа дас дас Сас ссд саС аад дас асд дда да-9 асе аде аед сСа 209
01и С1и Азр Азр Туг Беи Ηίβ Буз Азр ТЬг 01у 01и ТЬг Зег МеС Беи
25 30 35
ааа ада ссС дед сСС ССд саС ССд сас саа аса дсс саС дсС дае даа 257
Буз Агд Рго Уа1 Беи Беи Н1з Беи Низ 01п ТЬг А1а Н1з А1а Азр О1и
40 45 50
ссс дас Сдс ссС Сса даа сСС сад сас аса сад даа сСс ССС сса сад ЗОЕ
РЬе Азр Суз Рго Зег О1и Беи 01п Низ ТЬг 01п С1и Беи РЬе Рго С1п
55 60 65 70
Сдд сас ССд сса аСС ааа аса дсС дес аСС аса дса СсС сСд асе ССС 353
Тгр Н13 Беи Рго Не Буз Не А1а А1а Не Не А1а Зег Беи ТЬг РЬе
75 80 85
сСС £ас асС сСС сСд адд даа дса аее сас ссс ССа дса асе Ссс сас 401
Беи Туг ТЬг Беи Беи Агд 01и Уа1 Не Низ Рго Беи А1а ТЬг Зег ΗΪ3
90 95 100
саа саа СаС ССС СаС ааа аСС сса аСс сСд дСс аСс аас ааа дСс ССд 449
С1п С1п Туг РЬе Туг Буз Не Рго Не Беи Уа1 Не Азп Буз Уа1 Беи
105 110 115
сса аЪд дСС Ссс аСс асС сСс ССд дса ССд дСС Сас сСд сса 99^ дСд 497
Рго Уа1 Зег Не ТЬг Беи Беи А1а Беи Уа1 Туг Беи Рго 01у Уа1
- 162 014870
120 125 130
аба дса дса абб дбе саа ебб саб ааб дда асе аад баб аад аад ббб 545
Не А1а А1а Не Уа1 31п Ьеи ΗΪΒ Азп Н1у ТЬг ьуз Туг Ьуз Ьуз РЬе
135 140 145 150
сса саб бдд ббд даб аад одд абд Оба аса ада аад сад ббб ддд ебб 553
Рго ΗΪΞ Тгр Ьеи Авр Ьуз Тгр Меб Ьеи ТЬг Агд Ьуз Й1п РЬе <31у Ьеи
155 160 165
сбс адб ббс ббб ббб дсб дба ебд саб дса абб баб адб ебд бсб бас 641
Ьеи Зег РЬе РЬе РЬе А1а Уа1 Ьеи Н1з А1а Не Туг Зег Ьеи Зег Туг
170 175 180
сса абд адд еда бес бас ада бас аад ббд оба аас бдд дса баб саа 689
Рго Меб Агд Агд Зег Туг Агд Туг Ьуз Ьеи Ьеи Азп Тгр А1а туг <31П
185 190 195
сад дбс саа саа ааб ааа даа даб дсе ьдд абб дад саб даб дбб бдд 737
<31п Уа1 Θ1Π О1п Азп Ьуз Й1и Азр А1а Тгр 11е а1и Н13 Азр Уа1 Тур
200 205 210
ада абд дад абб баб дбд бсб ебд дда абб дбд дда ббд дса аба ебд 755
Агд Меб С1и Не Туг Уа1 Зег Ьеи С1у Не Уа1 61у Ьеи А1а Не Ьеи
215 220 225 230
дсб ебд ь^д дсб дрд аса бсб абб сса бсб дбд адб дас бсб ббд аса 833
А1а Ьеи ьеи А1а Уа1 ТЬг Зег Не Рго Зег Уа1 Зег Азр Зег Ьеи ТЬг
235 240 245
бдд ада даа ббб сас баб абб сад дба ааб аба баа аабаасссба 882
Тгр Агд 01и РЬе Η1Ξ Туг Не (31п Уа1 Азп Азп Не *
250 255
ададдбаааб сббсбббббд бдбббабдаб абадаабабд ббдасбббас абаасааабд ббОббсааса дсааадабсб бабасббдбб ссааббааба сбдббдбббб сссбаббдсб бсбааббадд асаадбдббб ссбадасаба аббаааабае бсбебдеббе ееебббеббд бббдееедбб ббббдбббдб ббббдадабд аадбсбсдсб сбдббдссса бдсбддадба садбддсасд асбдсаассб дсдссбссбд ддббсаддсд аббсбсббдс сбсадссбсс ддаббасадд сасссабсас сабдбссадс баабббббдб абббббадба бббсссабдб бддссаддсб ддбсбсдабс бссбдассбс ааабдабссд ссбсссааад бдсбдддабд асадббдбда дссассасас бсадссбдсб бббдааасбб дббадасааб ббдсбассса бсбаабдбда баббббадда сабддбббаб бабббсббаа аааааабабб сббббассбд бсассбдааб сббббабдбб асасаасбба дсасбббсса дааасааааа сбсбсбссбб адбсбббабс Сассааадаб абдсбадбдб сбсабббсаа аддсбдсббб саббббабаб асббасбсас ббдаадбббс бааабаббсб бдбаабббба адабббасбд аддбббабсб бсбддбддба даббабссаб аадаададбд абсасбсбдд дабссббдбс бдасаадабб саааддасба аабббааббс асбдссаабб ассдбббабд ддбадасабс бббддааабб бссасааддб саасбабссс ббсбасабдб ссасасдбаб асбссаасас бббаббаддс бббддааадб абдссбссаб сбдааббадб ссадбдбддс ббададббдд бсасадаабб бссбаабббб дбаддббсад ссбдабаасс асбддадббс аббааабадс бббсббсаса саббдсбсбд ссбдббасас абабдабдаа бадасббсаб баддааббба ддасбдсабс ббдасаасбд адссбаббсб саабассбад сссабаабад дбабасааба сасабббддб аааасбаабб дасабдбабб бббсаасбад баассбадаа абдбббсасб баааабсбда сасбасаадб бассббддад аббсабабаб даааасдсаа асббадсбаб бсасбдддас ббаадаабдс дссбдаабаа ббдбдадббс дабббдббсб бдассабббс садбааадбд аабададдбс адаадбсдба баааададдб сассдббдад аббасабадд бдаасаасба бббббаадса асбббабббд аадсабссса абдсаддсбд ааабдбббса бсасабсбсб ддабсбсбсб дасаббдааа аааббдббса баббабббсс абдббабсад аабабббдаб сссабааааа 942 абдбдсбсбс 1002 аабааааддс 1062 Сбдбббдббб 1122 абсбсддсбс 1182 бдадбадсбд 1242 дадасадддб 1302 сссассбсдд 1362 сбббсбааба 1422 абссаабабд 1482 ббадбаабдс 1542 дааабаабад 1602 ббссадсбба 1662 ааасбабсбс 1722 абдбдссада 1782 адбсабдаас 1842 садасаббсд 1902 абсбдаббад 1962 басаасаббс 2022 бббддбссбс 2082 сасбдсбббб 2142 асбабабдба 2202 ббсаассааб 2262 даасбддбба 2322 ббдаббдбаб 2382 ддсаддсбаа 2442 дббдбсадаа 2502 бдбадбдаса 2562 аббббдбдса 2622 бббббааааа 2682
- 1б3 014870 саБаддссаа РсдссРБсас сБассРаРаБ ссБдсРаРаа саааРасаса дадааададр сасРРадаса ададсадааа ааддаеерсс ассааРсБРс асРдддсаса РдБаРддРаР аРРРаааадс РРдддаадас РБРасасаса РдРРааРааа дРРсаБРсас аасРдаБааа РРааРРдада дРаадасРса ададасааад адасааадРР дсРРддадас дардрдаард аадсаасада ассааРРРБд аРасасдсаБ асассБссаа аРасРаРРсс дрсассаааа РСРБРдББса аРдаРРаРРс
РРсаБРаБРс даРсасРдаа аРсЬааааБд дРсссБдаРС сасааааааР РРРсаРсасс аадаааБРас дасаррдррд дсаРаРссад РРРРРСРРРР РдаСРРРРдс сРБРРаРдаР РдссаБдсРР РБаасаааас араБРдаРаР ааддаааааа аРРБаРсааа дРсаааРБда РасаааБсаР РРаддРаРсс аааРаРсаРа РдссРРсааа ссаааадраа адаааРдРда аРдаддРадд дсададсаад сРддааРаад адсРдРРРРс даддаадаад БдадаРаРдР аЬРБРаРсас аааааааааа аРсададРда БРРРРдсРаР БдБдРБдаРР РдРдаааадс аддддардаа даааддсБдБ ддрдаддадд Раддааааса аРдддаРааа сРаддааРБд РддаРадаБа сРРссааРРд аРасРдаада РсссадРБдБ саасаБРРса ааааа аРсасаРРад ааРсРРсааР срдсадрдар адааРРаада сааааРддбд дааРРРБдРР аРаддсаааа аРсаРадаРа сБсБРаРРда РРРсссРРсР РаааасааРР БРдРссБдаР РБадасаРдд адааРРасРд адРРРдРаРР
2742
2302
2362
2922
2982
3042
3102
3162
3222
3282
3342
3402
3462
3522
3582
3627 <210> 31 е211> 258 <212> РЕТ «213> Ното заррепз <400> 31
Мер (31и Зег Агд Ьуз Азр Не ТЬг Азп С1п 01и С1и Ьеи Тгр Ьуз Мер
1 5 10 15
ьуз Рго Агд Агд АЗП Ьеи 61и (Пи Азр Азр Туг Ьеи Н1з Ьуз Азр ТЬг
20 25 30
а1у С1и ТЬг Зег Мер Ьеи Ьуз Агд Рго Уа1 Ьеи Ьеи Ηί3 Ьеи Н13 <Э1п
35 40 45
ТЬг А1а Ηίθ А1а Азр В1и РЬе Азр Суз Рго Зег <31и Ьеи 61п Ηίδ ТЬг
50 55 60
С1п Й1и Ьеи РНе Рго <31п Тгр Н1з Ьеи Рго Не ьуз Не А1а А1а 11е
65 70 75 80
Не А1а Зег Ьеи ТЬг РЬе Ьеи Туг ТЬг Ьеи Ьеи Агд С1и Уа1 Не Н1з
85 90 95
Рго Ьеи А1а ТЬг Зег Н1з <31п С1п Туг РЬе Туг Ьуз Не Рго Не Ьеи
100 105 110
Уа1 Не Азп Ьуз Уа1 Ьеи Рго Мер ча1 Зег Не ТЬг Ьеи Ьеи А1а Ьеи
115 120 125
Уа1 Туг Ьеи Рго <31у Уа1 Не А1а А1а Не Уа1 01п Ьеи Н13 Азп <31у
130 135 140
ТНг Ьуз Туг Ьуа Ьуз РНе Рго ΗΪ3 Тгр Ьеи Азр Ьуз Тгр Мер Ьеи ТЬг
145 150 155 160
Агд Ьуз <31п РНе 31у Ьеи Ьеи Зег РЬе РЬе РЬе А1а ча! Ьеи ΗΪ3 А1а
165 170 175
11е Туг Зег Ьеи Зег Туг Рго Мер Агд Агд Зег Туг Агд Туг Ьуз Ьеи
180 185 190
Ьеи Азп Тгр А1а Туг С1п 31п Уа1 С1п С1п Азп Ьуз С1и Азр А1а Тгр
195 200 205
Не <31и ΗΪ3 Азр Уа1 Тгр Агд Мер 61и Не Туг Ча1 Зег Ьеи О1у Не
210 215 220
Уа1 <31у Ьеи А1а Не ьеи А1а Ьеи Ьеи А1а Уа1 ТЬг Зег Не Рго Зег
225 230 235 240
Уа1 Зег Азр Зег Ьеи ТНг Тгр Агд С1и РЬе Н1з Туг Не 01п Уа1 АЗП
245 250 255
АЗП Не
<210> 32 <211> 3627 <212> ДНК <213> Ното зар!епз
- 164 014870 <220?
<221? СОЕ <222? (96) . . . (872) <400? 32 ддддсссдса ссесЬдддса дсадсддсад ссдадасЬса сддесаадсС ааддсдаада 60
ЗЬдддСддсС даадссарас СаРСССаСад ааССа аСд даа аде ада ааа дас 113
Мер С1и Зег Агд Дуз Азр
5
асс аса аас саа <31п 10 даа даа еее Деи Сдд ааа аСд аад ссС адд Агд ада аае СРа Деи 161
Не ТЬг Авп 01и 01и Тгр Дуз 15 Мее Дуз Рго Агд 20 Азп
даа даа дас дае РаР РРд саР аад дас асд дда дад асе аде ард сеа 209
С1и С1и Авр 25 Азр Туг Деи Н1з Дуз 30 Авр ТЬг С1у <31и ТЬг 35 Зег Мее Деи
ааа ада ССЪ дрд еСС ССд саР ССд сас саа аса дсс сае дсс дас даа 257
Дуз Агд 40 Рго Уа1 Деи Деи Низ 45 Деи Н±з С1п ТЬг А1а 50 Н1з А1а Азр <31и
ССС дас Сдс ССР Сса даа СРС сад сас аса сад даа сРс ССС сса сад 305
РЬе 55 Азр Суз Рго Зег 01и 60 Деи С1п Н18 ТЬг σΐη 65 С1и Деи РЬе Рго е1п 70
сдд сас ССд сса асе ааа аса дсе дсе аес аса дса РсР сед асе еее 353
Тгр Η1Ξ Деи Рго Не 75 Дуз Не А1а А1а Не 80 Не А1а Зег Деи ТЬг 85 РЬе
СРР Сас асе еРР сСд адд даа дРа асе сас ссс ССа дса асС Ссс сас 401
Деи Τ'..-· Ьви Деи С1и Уа1 Не ΗΪΞ Рго Деи А1а ТЬг Зег
* 2 - 90 - — 3 95 100
саа саа Рас РРР СаС ааа асе сса аес сед дСс аСс аас ааа дес еед 449
<31п 01п Туг 105 РЬе Туг Дуз Не Рго 110 Не Деи ν»ι Не Азп 115 Дуз Уа1 Деи
сса аСд дРС Ссс аРС асР сСс ССд дса ССд дес Рас сед сса ддс дед 497
Рго МеС 120 Уа1 Зег 11е ТЬг Деи 125 Деи А1а Деи Уа1 Туг 130 Деи Рго 01у Уа1
аСа дса дса аСР дрс саа сРС саР ааС дда асе аад Рае аад аад еее 545
11е 13 5 А1а А1а Не Уа1 С1п 140 Деи Н1з Авп С1у ТЬг 145 Дуз Туг Дуз Дуз РЬе 150
сса сас сдд РРд дас аад сдд асд ССа аса ада аад сад сес ддд сес 593
Рго Н13 Тгр Деи Авр 155 Дуз Тгр МеС Деи ТЬг 160 Агд Дуз Θΐη РЬе 01у 165 Деи
сСс аде еее ССС ссс дсс дса сед сае дса аСС Рас адр сСд еее Сас 641
Деи Зег РЬе РЬе 170 РЬе А1а Уа1 Деи Нёв 175 А1а 11е Туг Зег Деи 130 Зег Туг
сса аСд адд еда Ссс Сас ада Рас аад еед сСа аас Сдд дса СаЬ саа 689
Рго мес Агд 185 Агд Зег Туг Агд Туг 190 Дуз Деи Деи Азп Тгр 195 А1а Туг 81п
сад дРс саа саа аар ааа даа даС дсс Сдд аЬС дад саР дае дес Сдд 737
<31п Уа1 200 С1п <з1п Азп Дуз О1и 205 Авр А1а Тгр Не С1и 210 Н13 Азр Уа1 Тгр
ада асд дад аРР РаР дед есс сед дда асе дед дда ССд дса аСа сед 785
- 165 014870
Агд Ξ15 МеС С1и Не Туг Уа1 220 Зег Беи 01у Не Уа1 225 <31у Беи А1а Не Беи 230
дес сСд СЬд дсС дед аса есе аЬС сса есс дед аде дас СсС сед аса 833
А1а Беи Беи А1а νήΐ ТЬг Зег Не Рго Зег Уа1 Зег Азр Зес Беи ТЬг
235 240 245
Сдд ада даа ССС сас СаЬ асе сад дса аае аае аСа Саа ааСаасссСа 882
Тгр Агд 61и РЬе ΗΪ3 Туг Не В1П νβΐ Азп Азп Не *
250 255 ададдСаааС аСаасаааСд сЬдСЬдееее аеСааааСае СЬССдадаСд аседсаассС ддаССасадд ЬССсссаЬдС ссСсссааад СССдааасСС саСддСССаС сьсьсасдсе адЬСЬЬСаСс саССССаСаС адаЬСЬасЬд аЬсасСседд асЬдссааЬС саассасссс СЬЬддааадС ЬсасадааЬС асеаааСадс СадасСЬсаС сааСассСад дасасдсаьс сасСасаадЬ СсасСдддас СдассаСЬСс сассдССдад аадсаьссса дасаЬСдааа саЬаддссаа ЬсдссЬЬсас сСассСаеаС ссСдсСаЬаа саааьасаса дадааададс сасСЬадаса ададсадааа ааддаЬСЬсс ассааСсССс асЬдддсаса ЬдЬаЬддЬаЬ аСЬСаааадс ЬЬдддаадас СССасасаса ЬдСЬааСааа сЬСсЬЬЬЬСд ЬЬЬЬСсааса сссСаССдсе есеседееее аадСсЬсдсЬ дсдссСссСд сасссаСсас ЬддссаддсЬ ЬдсЬдддаЬд дССадасаае ьаьььсььаа асасаасЬЬа ЬассааадаЬ асЬЬасЬсас аддЬЬЬаЬсЬ даСссЬЬдСс ассдЬЬЬаЬд ССсСасаСдС аЬдссЬссаЬ ЬссЬааЬЬЬЬ ССЬсЬЬсаса ЬаддааЬЬЬа сссаСааСад есесаасеад СассЬЬддад ЬЬаадааЬдс садьааадьд аЬЬасаЬадд аСдсаддсСд аааЬЬдЬЬса дССсаССсас аасСдаСааа СЬааЬЬдада дьаадасьса ададасааад адасааадьь дсССддадас даедЬдааСд аадсаасада ассааЬЬЬЬд аСасасдсаЬ асассьссаа аСасСаСЬсс дьсассаааа ЬЬЬСЬдЬЬса аЬдаССаЬЬс
ЬдЬСЬаЬдаЬ дсааадаСсС СсСааССадд ьеьеесеесд сСдЬСдссса ддЬЬсаддсд саЬдЬссадс ддЬсЬсдаЬс асадЬСдЬда ССдсСассса ааааааСаее дсасСССсса аСдсСадСдС СЬдаадЬЬСс ЬсСддЬддЬа СдасаадаСС ддеадасаСс ссасасдбаь сЬдааЬЬадЬ дЬаддЬЬсад саЬСдсЬсЬд ддасЬдсаСс дСаЬасааЬа ЬаассСадаа аССсаСаеаС дссСдааЬаа аасададдес ЬдаасаасСа аааСдЬЬЬса ЬаЬЬаЬСЬсс ССсаССаСес даЬсасСдаа ассьааааьд дьсссьдаьь сасааааааь ееедаесасс аадааасЬас дасаССдССд дсаСаСссад ееьсссееее ьдаьеееьдс сеесеасдае Ьдссасдсес ЬЬаасаааас аЬаСЬдаЬаЬ ааддаааааа аСадааСаед СаСасССдСС асаадьдььь сеСдСССдСС СдсСддадьа аССсСсССдс СааСЬСССдС СссСдассСс дссассасас ЬсСааЬдЬда сьеььассьд дааасааааа сСсаСССсаа СаааЬаЬСсе даССаСссаС саааддасСа ессддаааее асессаасас ссадСдСддс ссСдаСаасс ссСдССасас ССдасаасСд сасаСССддС аСдСССсасС даааасдсаа ЬСдЬдадССс адаадСсдСа СССЬСаадса ЬсасаСсЬсС аСдССаСсад аССеаСсааа дСсаааССда СасаааСсаС ССаддСаСсс аааСаСсаСа СдссЬСсааа ссаааадСаа адаааЬдСда аСдаддСадд дсададсаад седдааСаад адссдсеесс даддаадаад СдадаСаСдС аССССаСсас аааааааааа
ССдасСССас ссааССааСа ссСадасаСа еееедеесде садеддсасд сСсадссСсс аССЬССадСа аааСдаСссд СсадссСдсС СаССССадда СсассСдааС сесссСссСС аддсСдсССС СдСааССССа аадаададСд ааСССааССс Сссасаадде СССаССаддс СЬададССдд асСддадЬСс аЬаСдаЬдаа адссСаССсЬ аааасСааСС СааааСсСда асЬСадсСаС дасседьссе СаааададдС асСЬСаССед ддаСсСсСсС ааСаСССдаС аСсададЬда еееесдссас СдСдССдаСС СдСдаааадс аддддаСдаа даааддссдс ддсдаддадд Саддааааса аСдддаСааа сЬаддааССд СддаСадаСа сССссааССд асассдаада СсссадсЬдС саасаСССса ааааа сссаСааааа аСдСдсСсСс аасааааддс еедсесдссс аСсСсддсСс СдадСадсСд дадасадддС сссассСсдд сЬССсСааСа аСссааЬаед СеадЬааСдс даааСааСад ССесадсЬСа ааасСаСсСс аСдЬдссада адСсаСдаас садасасссд аСсСдасьад СасаасаСЬс ееьддСссЬс сасСдсСССЬ асЬаСаСдЬа ССсаассааС даасСддееа ССдаССдСаС ддсаддсСаа дЬСдСсадаа СдСадСдаса аССССдСдса СЬССЬааааа аСсасаССад ааСсССсааС сСдсадСдаС адааССаада сааааСддСд дааССССдье асаддсаааа аСсаСадаСа сСсССаССда ЬССсссССсС СаааасааСС ССдСсседае ССадасаедд адааССасСд адСССдСаСС
942 1002 1052 1122 1132 1242 1302 1352 1422 1482 1542 1602 1662 1722 1782 1842 1902 1962 2022 2082 2142 2202 2262 2322 2382 2442 2502 2562 2622 2682 2742 2802 2862 2922 2982 3042 3102 3162 3222 3282 3342 3402 3462 3522 3582 3627
с210> <211> <212> <213> 33 258 РКТ Ното зарБепз
<400> 33
- 166 014870
Мек 6111 Зег Агд Ьуз Азр Не 61и Ьуз Ткг Азп 61п 10 61и <31 и Ьеи Тгр Ьуз 15 Мек Ткг 61п
1 Ьуз 01у ₽го Агд Агд 20 Зег 5 Азп Ьеи Мек Ьеи
61и Агд 40 Азр Азр 25 Туг Ьеи Н13 И1з 45 Ьуз 30 Ьеи Азр Н1з
61и Ткг 35 Рго Ча1 Ьеи Ьеи
Ткг А1а ΗΪ3 А1а Азр 61и Рке Азр Суз Рго Зег 61и Ьеи 61п Н18 ткг
50 55 60
61п О1и Ьеи Рке Рго 61п Тгр Нхз Ьеи Рго Не Ьуз Не А1а А1а Не
65 70 75 ВО
Ь1е А1а Зег Ьеи Ткг Рке Ьеи Туг Ткг Ьеи Ьеи Агд 61и Ча1 Не Н13
85 90 95
Рго Ьеи А1а Ткг Зег ΗΪ3 61п 01п Туг Рке Туг ьуз 11е Рго Не Ьеи
100 105 110
Ча1 Не Азп Ьуз Ча1 Ьеи Рго Мек Ча1 Зег Не Ткг Ьеи Ьеи А1а Ьеи
115 120 125
Ча1 Туг Ьеи Рго С1у Ча1 Не А1а А1а Не Ча1 61 п Ьеи Н13 Азп 61у
130 135 140
Ткг Ьуз Туг Ьуз Ьуз Рке Рго Н1з Тгр Ьеи Азр Ьуз Тгр Мек Ьеи Ткг
145 150 155 160
Агд Ьуз 31п Рке С1у Ьеи Ьеи Зег Рке Рке Рке А1а Ча1 Ьеи ΗΪ3 А1а
165 170 175
Не Туг Зег Ьеи Зег Туг Рго Мек Агд Агд Зег Туг Агд Туг Ьуз Ьеи
180 185 190
Ьеи Азп Тгр А1а Туг 61п 61п Ча1 61п 61п Азп Ьуз 61и Азр А1а Тгр
195 200 205
Не С1и Н1з Азр Ча1 Тгр Агд Мек 61и Не Туг Ча1 Зег Ьеи С1у Не
210 215 220
Ча1 61у ьеи А1а Не Ьеи А1а Ьеи Ьеи А1а Ча1 Ткг Зег Не Рго Зег
225 230 235 240
Ча1 Зег Азр Зег Ьеи Ткг Тгр Агд С1и Рке Н1з Туг Не 61п Ча1 Азп
245 250 255
Азп Не
<210> 34 <211> 3627 <212> ДНК <213> Ното зархепз <220>
<221> СПЗ <222> (96)...(В72) <400> 34 ддддсссдса сскскдддса дсадсддсад ссдадаскса сддксаадск ааддсдаада 60 дкдддкддск даадссакас каккккакад аакка акд даа аде ада ааа дас 113
Мек <31и Зег Агд Ьуз Азр
5
акс аса аас саа даа даа С££ кдд ааа акд аад сск *дд ада аак кка 161
Не Ткг Азп 61п 61и 61и Ьеи Тгр Ьуз Мек Ьуз Рго Агд Агд Азп Ьеи
10 15 20
даа О1и даа 61и дас Азр 25 дак Азр как Туг ккд сак аад дас асд дда дад асе аде акд Мек ска Ьеи 209
Ьеи Нтз Ьуз Азр Ткг С1у 61и Ткг Зег
30 35
ааа ада сск дкд екк ккд сак ккд сас саа аса дсс сак дек дак даа 257
Вуз Агд Рго Ча1 Ьеи Ьеи ΗίΒ Ьеи нхе С1п ткг А1а Н1з А1а Азр 61и
40 45 50
- 167 014870
еее РЬе 55 дас Азр Еде ссЕ Еса Зег даа <31и 60 сЕЕ Ьеи сад О1п сас Н1з аса ТЬг сад даа СЕС Ьеи ЕЕЕ РЬе сса Рго сад <31п 70 305
Суз Рго 31п 65 С1и
^дд сас ЕСд сса аЕЕ ааа аЕа дсЕ дсЕ аЕЕ аЕа дса ЕсЕ сЕд асЕ ЕЕЕ 353
Тгр Н13 Ьеи Рго 11е Ьуз Не А1а А1а Не 11е А1а Зег Ьеи ТЬг РНе
75 80 85
сЕЕ Еас ас! СЕЕ сЕд адд даа дЕа аЕЕ сас ССС ЕЕа дса асЕ Есс саЕ 401
Ьеи. Туг ТЬг Ьеи Ьеи Агд С1и Уа1 Не ΗΪ3 Рго Ьеи А1а ТЬг Зег ΗΪ3
90 95 100
саа саа ЕаЕ ЕЕЕ ЕаЕ ааа аЕЕ сса аЕс с Ед дЕс аЕс аас ааа дЕс ЕЕд 44 9
С1п С1п Туг РЬе Туг Ьуз Не Рго Не Ьеи Уа1 Не Азп Ьув Уа1 Ьеи
105 110 115
сса аЕд дЕЕ Есс аЕс аск сЕс ЕЕд дса ^д дЕЕ Еас сЕд сса ддЕ дЕд 497
Рго мес Уа1 Зег 11е ТЬг Ьеи Ьеи А1а Ьеи Уа1 Туг Ьеи Рго <Э1у Уа1
120 125 130
аЕа дса дса аЕЕ дЕс саа сЕЕ саЕ ааЕ дда асе аад ЕаЕ аад аад ЕЕЕ 545
Не А1а А1а Не Уа1 О1п Ьеи Н1з Азп О1у ТЬг ьуз Туг Ьуз Ьуз РЬе
135 140 145 150
сса саЕ ^дд ЕЕд даЕ аад Едд аЕд ЕЕа аса ада аад сад ЕЕЕ ддд сЕЕ 593
Рго ΗΪ5 Тгр Ьеи Азр Ьуз Тгр МеЕ Ьеи ТЬг Агд Ьуз <31п РЬе С1у Ьеи
155 160 165
сЕс адЕ ЕЕс ЕСЕ ЕЕЕ дсЕ дЕа сед саЕ дса аЕЕ ЕаЕ адЕ сЕд ЕсЕ Еас 641
Ьеи Зег РЬе РЬе РЬе А1а Уа1 Ьеи Н1з А1а 11е Туг Зег Ьеи Зег Туг
170 175 180
сса аЕд адд еда Есс Еас ада Еас аад ЕЕд сЕа а ас Едд дса ЕаЕ саа 689
Рго Мес Агд Агд Зег Туг Агд Туг Ьуз Ьеи ьеи Азп Тгр А1а Туг С1п
135 190 195
сад дЕс саа саа ааЕ ааа даа даС дсс Едд аЕЕ дад саЕ даЕ дЕЕ Едд 737
31п Уа1 01п 01п Азп Ьуз 01и Азр А1а Тгр Не С1и Н1з Азр Уа! Тгр
200 205 210
ада аСд дад аЕЕ ЕаЕ дьд ЕсЕ сЕд дда аЕЕ дЬд дда ЕЕд дса аЕа сЕд 785
Агд МеЕ 01и Не Туг Уа1 Еег Ьеи С1у Не Уа1 С1у Ьеи А1а Не Ьеи
215 220 225 230
дсЕ сЕд ЕЕд дсЕ д^д аса ЕсЕ аЕЕ сса ЕсЕ дьд адЕ дас ЕсЕ ЕЕд аса 833
А1а Ьеи Ьеи А1а Уа1 ТНг зег Не Рго Зег Уа! Зег Азр Зег Ьеи ТНг
235 240 245
Едд ада даа ЕЕЕ сас ЕаЕ аЕЕ сад дЕа ааЕ ааЕ аЕа Еаа ааЕаасссЕа 882
Тгр Агд С1и РЬе ΗΪ3 Туг Не С1п Уа1 Азп Азп 11е А·
250 255
ададдЕаааЕ аЕаасаааЕд сЕдЕЕдЕЕЕЕ аЕЕааааЕаЕ ЕЕЕЕдадаЕд асбдсаассЕ ддаЕЕасадд СЕЕСссаЕдЕ ссЕсссааад ЕЕЕдааасЕЕ саЕддЕЕЕаЕ сЕЕсЕЕЕЕЕд ЕЕЕЕЕсааса сссЕаЬЕдсЕ ЕсЕЕЕдЕЕЕЕ аадЕсЕсдсЕ дсдссЕссЕд сасссаЕсас ЕддссаддсЕ ЕдсЕдддаЕд дЕЕадасааЕ ЕаЕЕЕсЕЕаа
ЕдЕЕЕаЕдаЕ дсааадаЕсЕ ЕсЕааЕЕадд ЕЕЕЕЕЕЕЕЕд сЕдЕЕдссса ддЕЕсаддсд саЕдЕссадс ддЕсЕсдаес асадЕЕдЕда ЕЕдсЕассса ааааааЕаЕЕ аЕадааЕаЕд ЕаЕасЕЕдЕЕ асаадЕдЕЕЕ ЕЕЕдЕЕЕдЕЕ ЕдсЕддадЕа аЕЕсЕсЕЕдс ЕааЕЕЕЕЕдЕ ЕссЕдассЕс дссассасас ЕсЬааЕдЕда сЕЕЕЕассЕд
ЕЕдасЕЕЕас ссааЕЕааЕа ссЕадасаЕа ЬЕЕЕдЕЕЕдЕ садЕддсасд сЕсадссЕсс аЕЕЕЕЕадЕа аааЕдаЕссд ЕсадссЕдсЕ ЕаЕЕЕЕадда ЕсассЕдааЕ сссаЕааааа аЕдЕдсЕсЕс ааЕааааддс ЕЕдЕЕЕдЕЕЕ аЕсЕсддсЕс ЕдадЕадсЕд дадасадддЕ сссассЕсдд сЕЕЕсЕааЕа аЕссааЕаЕд ЕЕадЕааЕдс
942
1002
1062
1122
1182
1242
1302
1362
1422
1482
1542
- 168 014870 сккккакдкк адкккккакс саккккакак адакккаскд аксаскскдд аскдссаакк сааскакссс кккддааадк ксасадаакк аккааакадс кадаскксак саакасскад дасакдкакк саскасаадк ксаскдддас кдассакккс сассдккдад аадсакссса дасаккдааа сакаддссаа ксдсскксас скасскакак сскдскакаа сааакасаса дадааададк сасккадаса ададсадааа ааддаккксс ассааксккс аскдддсаса кдкакддкак акккаааадс ккдддаадас кккасасаса кдккаакааа асасааскка кассааадак асккасксас аддкккакск дакссккдкс ассдкккакд ккскасакдк акдсскссак ксскаакккк кккскксаса каддааккка сссакаакад ккксааскад кассккддад ккаадаакдс садкааадкд аккасакадд акдсаддскд аааккдккса дкксакксас ааскдакааа ккааккдада дкаадаскса ададасааад адасааадкк дсккддадас дакдкдаакд аадсааскда ассааккккд акасаадсак асасскссаа акаскакксс дксассаааа кккккдккса акдаккаккс дсасккксса акдскадкдк ккдаадкккс кскддкддка кдасаадакк ддкадасакс ссасасдкак скдааккадк дкаддкксад саккдскскд ддаскдсакс дкакасаака каасскадаа акксакакак дсскдаакаа аакададдкс кдаасааска ааакдкккса каккаккксс кксаккаккс даксаскдаа акскаааакд дкссскдакк сасаааааак кккдаксасс аадаааккас дасаккдккд дсакакссад кккккскккк кдакккккдс сккккакдак кдссакдскк ккаасаааас акаккдакак ааддаааааа дааасааааа сксаккксаа кааакаккск даккакссак саааддаска кккддааакк аскссаасас ссадкдкддс сскдакаасс сскдккасас ккдасааскд сасакккддк акдккксаск даааасдсаа ккдкдадккс адаадксдка кккккаадса ксасакскск акдккаксад акккаксааа дксаааккда касаааксак ккаддкаксс ааакаксака кдсскксааа ссаааадкаа адааакдкда акдаддкадд дсададсаад скддаакаад адскдккккс даддаадаад кдадакакдк аккккаксас аааааааааа сксксксскк аддскдсккк кдкаакккка аадаададкд аакккааккс кссасааддк кккаккаддс ккададккдд аскддадккс акакдакдаа адсскаккск ааааскаакк каааакскда асккадскак дакккдккск каааададдк аскккакккд ддакскскск аакакккдак аксададкда кккккдскак кдкдккдакк кдкдаааадс аддддакдаа даааддскдк ддкдаддадд каддааааса акдддакааа скаддааккд кддакадака сккссааккд акаскдаада ксссадккдк саасакккса ааааа дааакаакад ккссадскка аааскакскс акдкдссада адксакдаас садасакксд акскдаккад касаасаккс кккддксскс саскдскккк аскакакдка кксаассаак дааскддкка ккдаккдкак ддсаддскаа дккдксадаа кдкадкдаса аккккдкдса кккккааааа аксасаккад аакскксаак скдсадкдак адааккаада саааакддкд дааккккдкк акаддсаааа аксакадака сксккаккда ккксссккск каааасаакк ккдксскдак ккадасакдд адааккаскд адкккдкакк
1602
1662
1722
1782
1842
1902
1962
2022
2032
2142
2202
2262
2322
2332
2442
2502
2562
2622
2682
2742
2802
2862
2922
2982
3042
3102
3162
3222
3282
3342
3402
3462
3522
3582
3627 <210> 35 <211> 258 <212> РКТ <213> Ното зарАепз <400> 35
Мек 61и Зег Агд Ьуз Азр Не ТЬг Азп 61п С1и 61и ьеи Тгр ьуз Мек
1 5 10 15
Ьуз Рго Агд Агд Азп Ьеи 61и 61и Азр Азр Туг Ьеи Н1з Ьуз Азр ТЬг
20 25 30
61у 6113 ТЬг Зег Мек ьеи Ьуз Агд РГО Уа1 Ьеи Ьеи ΗΪ3 Ьеи Ηί3 61п
35 40 45
ТЬг А1а ΗΪ3 А1а Азр 61и РЬе Авр Суз Рго Зег 61и Ьеи 61п Н1з Ткг
50 55 60
61п 61и Ьеи Рке Рго 61п Тгр ΗΪ3 Ьеи Рго Не Ьуз Не А1а А1а Не
65 70 75 80
Не А1а Зег ьеи ТЬг РЬе Ьеи Туг ТЬг ьеи Ьеи Агд <31и ν»ι Не ΗΪ3
85 90 95
Рго Ьеи А1а ТЬг Зег ΗΪ3 61п 61п Туг Рке Туг Ьув Не Рго Не Ьеи
100 105 110
Уа1 Не Азп Ьуз Уа1 Ьеи Рго Мек Уа1 Зег Не Ткг Ьеи Ьеи А1а Ьеи
115 120 125
Уа1 Туг Ьеи Рго 61у Уа1 Не А1а А1а Не Уа1 □1п Ьеи ΗΪΒ Азп 61у
13 0 135 140
тНг Ьуз Туг Ьуз Ьуз РЬе Рго Н1з Тгр Ьеи Азр Ьув Тгр Мек Ьеи ТЬг
145 150 155 160
Агд ьуз 61п Рке О1у Ьеи Ьеи Зег РЬе Рке Рке А1а Уа1 Ьеи Н13 А1а
165 170 175
- 169 014870
Не Туг Зег Беи 180 Зег Туг Рго Мек Агд Агд Зег Туг Агд Туг Ьуз Беи
185 190
Беи Азп Тгр А1а туг 01п 31п Уа1 31 п С1п АЗП Буз <31и Азр А1а Тгр
195 200 205
11е <31и Ηίε Аар νβΐ Тгр Агд Мек <31и 11е Туг Уа1 Зег Беи С1у 11е
210 215 220
Уа1 01у Беи А1а 11е Беи А1а Беи Беи А1а Уа1 ТЬг Зег 11е Рго Зег
225 230 235 240
Уа1 Зег Азр Зег Беи ТЬг Тгр Агд С1и РЬе Н13 туг 11е С1п Уа1 Азп
245 250 255
Азп 11е
<210> 36 <211> 339 <212> ??.Т <213> Ното зараепэ <400> 36
Мек 1 <31и Зег Агд Буз 5 Азр 11е ТЬг Азп <Э1п <31и 01и Беи Тгр Буз Мек
10 15
Ьуз Рго Агд Агд Азп Беи С1и С1и Азр Азр туг Беи Н13 Ьуз Азр ТЬг
20 25 30
<31у С1и ТЬг Зег Мек Беи ьуз Агд РГО Уа1 Беи Беи Низ Беи ΗΪ3 61п
35 40 45
ТЬг А1а Η1Ξ А1а Азр С1и РЬе Азр Суз Рго Зег 01и Беи 01п ΗΪ3 ТЬг
50 55 60
01п С1и Беи РЬе Рго С1п Тгр Ηίβ Беи Рго 11е Буз Не А1а А1а Не
65 70 75 80
11е А1а Зег Беи ТЬг РЬе Беи Туг ТЬг Беи Беи Агд О1и Уа1 11е Н1з
85 90 95
Рго Беи А1а тЬг Зег Н1з 31п 61П Туг РЬе Туг Ьуз Не Рго Не Беи
100 105 110
Уа1 Не Азп Буз Уа1 Беи Рго Мек Уа1 Зег 11е ТЬг Беи Беи А1а Беи
115 12 0 125
Уа1 Туг Беи Рго 01у Уа1 Не А1а А1а Не Уа1 <31П Беи Нхз Азп (31у
130 135 14 0
ТЬг Ьуз Туг Буз Буз РЬе Рго Н1з Тгр Беи Азр Буз Тгр Мек Беи ТЬг
145 150 155 160
Агд Ьуз <31п РЬе <з1у Беи Беи Зег РЬе РЬе РЬе А1а Уа1 Беи Н1з А1а
165 170 175
11е Туг Зег Беи Зег Туг Рго Мек Агд Агд Зег Туг Агд Туг Буз Беи
180 185 190
Беи Азп Тгр А1а Туг С1п <31п Уа1 С1п С1п Азп Буз <31и Азр А1а Тгр
195 200 205
Не <31и ΗΪΞ Азр Уа1 Тгр Агд Мек 01и Не Туг Уа1 Зег Беи 01у Не
210 215 220
Уа1 О1у Беи А1а Не Беи А1а Беи Беи А1а Уа1 ТЬг Зег Не Рго Зег
225 230 235 240
Уа1 Зег Азр Зег Беи ТЬг Тгр Агд 61и РЬе Н13 Туг Не С1п Зег Ьуз
245 250 255
Беи О1у 11е Уа1 Зег Беи Беи Беи 01у ТЬг Не Н13 А1а Беи Не РЬе
260 265 270
А1а Тгр Азп Ьуз Тгр Не Азр Не Ьуз 01П РЬе Уа1 Тгр Туг ТЬг Рго
275 280 285
Рго ТЬг РЬе Мек Не А1а Уа1 РЬе Беи Рго Не Уа1 νβΐ Беи Не РЬе
290 295 300
Буз Зег 11е Беи РЬе Беи Рго Суз Беи Агд Ьуз Буз Не Беи Ьуз Не
305 310 315 320
Агд Н1з 01у Тгр <Э1и Азр Уа1 ТЬг Буз Не Азп Буз Ткг О1и Не Суз
325 330 335
Зег С1п Беи
- 170 014870 <210> 37 <211> 258 <212> РЕТ <213> Ното зархепз <400> 37
МеЕ С1и Зег Агд Ьуз Азр Не ТЬг Азп 61П <31и 61υ Ьеи Тгр Ьуз МеЕ
1 5 10 15
Ьуз Рго Агд Агд Азп Ьеи 01и 01и Азр Азр Туг Ьеи И1з Ьуз Азр ТЬг
20 25 30
С1у С1и ТЬг Зег МеЕ Ьеи ьуз Агд Рго Уа1 Ьеи Ьеи Ηίε Ьеи Н1з <31п
35 40 45
ТЬг А1а ΗΪ3 А1а Азр <31и РЬе Азр Суз Рго Зег С1и Ьеи <31п Н±з ТЬг
50 55 60
αΐη 01и Ьеи РЬе Рго <Э1п Тгр ΗΪ3 Ьеи Рго Не Ьуз Не А1а А1а 11е
65 70 75 80
Не А1а Зег Ьеи ТЬг РЬе Ьеи Туг ТЬг Ьеи Ьеи Агд 01и Уа1 11е Н±з
85 90 95
Рго Ьеи А1а ТЬг Зег ΗΪ3 <31п С1п Туг РЬе Туг Ьуз Не Рго Не Ьеи
100 105 110
Уа1 11е Азп Ьуз Уа1 Ьеи Рго МеЕ ν&1 Зег Не ТЬг Ьеи Ьеи А1а Ьеи
115 120 125
νβΐ Туг Ьеи Рго (31у Уа1 Не А1а А1а Не Уа1 О1п Ьеи Н1з Азп <31у
130 135 140
ТЬг Ьуз Туг Ьуз Ьуз РЬе Рго ΗΪΒ Тгр ьеи Азр Ьуз Тгр МеЕ Ьеи ТЬг
145 150 155 160
Агд Ьуз С1п РЬе 01у Ьеи Ьеи Зег РЬе РЬе РЬе А1а Уа1 Ьеи ΗΪΘ А1а
165 170 175
11е Туг зег Ьеи Зег Туг Рго МеЕ Агд Агд Зег Туг Агд Туг Ьуз Ьеи
180 185 190
Ьеи Азп Тгр А1а Туг 01п 01п Уа1 С1п С1п Азп Ьуз С1и Авр А1а Тгр
195 200 205
Не 01и Н1з Азр Уа1 Тгр Агд МеЕ 01 и Не Туг Уа1 Зег Ьеи 01у 11е
210 215 220
Уа1 01у Ьеи А1а Не Ьеи А1а Ьеи Ьеи А1а Уа1 ТЬг Зег Не Рго Зег
225 230 235 240
Уа1 Зег Азр Зег Ьеи ТЬг Тгр Агд <31и РЬе ΗΪ3 Туг Не С1П Уа1 Азп
245 250 255
Азп Не
<210> 38 <211= 282 <212> РЕТ <213> Ното зархепз <40О> 38
МеЕ С1и Зег Агд Ьуз Азр Не ТЬг Азп С1п 01и 31и Ьеи Тгр Ьуз МеЕ
1 5 10 15
Ьуз Рго Агд Агд Азп Ьеи 01и 01и Азр Азр Туг Ьеи Н13 ьуз Авр ТЬг
20 25 30
С1у В1и ТЬг Зег МеЕ Ьеи Ьуз Агд Рго Уа1 Ьеи Ьеи ΗΪ5 Ьеи Нгз С1п
35 40 45
ТЬг А1а Н13 А1а Азр 01и РЬе Азр Суз Рго Зег СТи Ьеи С1п ΗΪ3 ТЬг
50 55 60
01П 01и Ьеи РЬе Рго Я1п Тгр Н±з Ьеи Рго Не Ьуз Не А1а А1а Не
65 70 75 80
Не А1а Зег Ьеи ТЬг РЬе Ьеи Туг ТЬг Ьеи Ьеи Агд 61и Уа1 Не ΗΪ3
85 90 95
Рго Ьеи А1а ТЬг Зег ΗΪΞ 01п С1п Туг РЬе Туг Ьуз Не Рго Не Ьеи
100 105 но
- 171 014870
Уа1 11е Азп Ьуз 115 Уа1 Ьеи Рго Меб Уа1 120 Зег Не ТЬг Ьеи Ьеи А1а 12 5 Ьеи
Уа1 Туг Ьеи Рго С1у Уа1 Не А1а А1а Не Уа1 01п Ьеи ΗΪ3 Ави е1у
130 135 14 0
ТЬг Ьуз Туг Ьуз Ьуз РЬе Рго Н1з Тгр Ьеи Азр Ьуз Тгр Меб Ьеи ТЬг
145 150 155 160
Агд Ьуз <31п РЬе С1у Ьеи ьеи Зег РЬе РЬе РЬе А1а Уа1 Ьеи ΗΪΞ А1а
165 170 175
Не Туг Зег Ьеи Зег Туг Рго Меб Агд Агд Зег Туг Агд Туг Ьуз Ьеи
180 185 190
Ьеи Азп Тгр А1а Туг Е1п С1п Уа1 31п С1п Азп Ьуз С1и Азр А1а Тгр
195 200 205
11е С1и Н£з АЗр Уа1 Тгр Агд Меб С1и Не Туг Уа1 Зег Ьеи С1у Не
210 215 220
Уа1 <31у Ьеи А1а Не Ьеи А1а Ьеи Ьеи А1а Уа1 ТЬг Зег Не Рго Зег
225 230 235 240
Уа1 Бег Азр Зег Ьеи ТЬг Тгр Агд С1и РЬе Н13 Туг Не С1п Не Не
245 250 255
ΗΪ3 Ьуз Ьуз Зег Азр Уа1 Рго С1и Зег Ьеи Тгр Азр Рго Суз ьеи ТЬг
260 265 270
Агд РЬе Ьуз Е1у Ьеи Азп Ьеи Не О1п Зег
275 280
<210> 39 <211> 258 <212> РКТ <213> Ното зархепз <400=· 39
меб <31и Зег Агд ьуз Авр Не ТЬг АЗП С1п 61и С1и Ьеи Тгр Ьуз Меб
1 5 10 15
Ьуз Рго Агд Агд Азп Ьеи С1и С1и Азр Авр Туг Ьеи Нив Ьуз Авр ТЬг
20 25 30
<31у <31и ТЬг Зег Меб Ьеи Ьуе Агд Рго Уа1 Ьеи Ьеи Н1з Ьеи Н13 С1п
35 40 45
ТЬг А1а Нгз А1а Азр О1и РЬе Азр Суз Рго Зег Е1и Ьеи С1п ΗΪ3 ТЬг
50 55 60
С1п (31и Ьеи РЬе Рго С1п Тгр ΗΪ3 Ьеи Рго 11е Ьуз Не А1а А1а Не
65 70 75 ВО
Не А1а Зег Ьеи ТЬг РЬе Ьеи Туг ТЬг Ьеи Ьеи Агд С1и Уа1 11е ΗΪΒ
85 90 95
Рго Ьеи А1а ТЬг Зег Н1з <31п <Э1п Туг РЬе Туг Ьуз Не Рго Не Ьеи
100 105 но
Уа1 Не Азп ьуз Уа1 Ьеи Рго Меб Уа1 Зег Не ТЬг Ьеи Ьеи А1а Ьеи
115 120 125
ναΐ Туг Ьеи РГО О1у Т7а1 Не А1а А1а Не Уа1 Θΐη Ьеи ΗίΒ Азп С1у
130 135 140
ТЬг Ьуз Туг Ьув Ьуз РЬе Рго Η13 Тгр Ьеи Азр Ьуз Тгр Меб Ьеи ТЬг
145 150 155 160
Агд Ьуз Е1п РЬе <31у Ьеи Ьеи Зег Ьеи РЬе РЬе А1а Уа1 Ьеи Н1з А1а
165 170 175
Не Туг Зег Ьеи Зег Туг Рго Меб Агд Агд Зег Туг Агд Туг Ьуз Ьеи
180 185 190
Ьеи Азп Тгр А1а Туг б1п Е1п Уа1 С1п С1п Азп Ьуз <31и Азр А1а Тгр
195 200 205
Не 51и Н13 Азр Уа1 Тгр Агд Меб С1и Не Туг Уа1 Зег Ьеи Е1у Не
210 215 220
Уа1 С1у Ьеи А1а 11е Ьеи А1а Ьеи Ьеи А1а Уа1 ТЬг Зег Не Рго Зег
225 230 235 240
Уа1 Зег Азр Зег Ьеи ТЬг Тгр Агд С1и РЬе Нгз Туг Не <Э1п Уа1 Азп
245 250 255
Азп Не
- 172 014870 <210? 40 <211? 270 <212? РКТ <213? Ното зархепз <400? 40
61и Ьеи РНе Рго (31п Тгр Η1Ξ Ьеи Рго Не Ьуз Не А1а А1а Не 11е
1 5 10 15
А1а Йег Ьеи ТНг РЬе Ьеи Туг ТНг Ьеи Ьеи Агд С1и ν&ι Не Н1з Рго
20 25 30
Ьеи А1а ТНг йег Н1з С1п С1п Туг Рке Туг Ьуз Не Рго Не Ьеи ν»ι
35 40 45
Не Азп Ьуз Уа1 Ьеи Рго Мек Уа1 Зег 11е Ткг ьеи ьеи А1а Ьеи Уа1
50 55 60
Туг ьеи Рго В1у Уа1 11е А1а А1а Не Уа1 С1п Ьеи Н1з Азп С1у Ткг
65 70 75 80
Ьуз Туг Ьуз Ьуз Рке Рго Н1з Тгр Ьеи Азр Ьуз Тгр Мек Ьеи Ткг Агд
85 90 95
Ьуз 61п РЬе <31у Ьеи Ьеи Зег Рке Рке Рке А1а 7а1 Ьеи ΗΪΞ А1а Не
100 105 110
туг Зег Ьеи Зег Туг Рго Мек Агд Агд Зег Туг Агд Туг Ьуз Ьеи Ьеи
115 120 125
Азп Тгр А1а Туг С1п С1п Уа1 61п С1п Азп Ьуз С1и Азр А1а Тгр Не
130 135 140
Н1и Н13 Азр Уа1 Тгр Агд Мек 61и Не Туг νβΐ Зег Ьеи С1у Не Уа1
145 150 155 160
С1у Ьеи А1а Не Ьеи А1а Ьеи Ьеи А1а Уа1 Ткг Зег Не Рго Зег Уа1
165 17 0 175
Зег Азр Йег Ьеи Ткг Тгр Агд 01и Рке Н1з Туг Не <31п Зег Ьуз Ьеи
130 185 190
С1у Не Уа1 Зег Ьеи Ьеи Ьеи С1у Ткг 11е Низ А1а Ьеи Не Рке А1а
195 200 205
Тгр Азп Ьуз Тгр Не Азр Не Ьуз 61п Рке Уа1 Тгр Туг ТНг Рго Рго
210 215 220
ТНг РНе мек Не А1а \7а1 Рке Ьеи Рго Не Уа1 Уа1 Ьеи Не Рке Ьуз
225 230 235 240
Зег Не Ьеи Рпе Ьеи Рго Суз Ьеи Агд Ьуз Ьуз Не Ьеи Ьуз Не Агд
245 250 255
Ηίε <31у Тгр <31и Азр ν&1 Ткг Ьуз Не Азп Ьуз Ткг 61и Не
260 265 270
<210? 41 <211? 270 <212? РКТ <213? Ното зархепз <400? 41
С1п Ьеи Рке Рго Мек Тгр Агд РНе Рго РНе Туг Ьеи Зег Зег Уа1 Ьеи
1 5 10 15
Суз Не Рке Рке Рке Уа1 туг Суз А1а Не Агд С1и Уа1 Не Туг Рго
20 25 30
Туг Уа1 Азп О1у Ьуз ТНг Азр А1а ТНг Туг Агд Ьеи А1а Не Зег Не
35 40 45
Рго Азп Агд Уа1 Рке Рго Не ТНг А1а Ьеи Не Ьеи Ьеи А1а Ьеи Уа1
50 55 60
Туг Ьеи Рго <31у Не Ьеи А1а А1а 11е Ьеи 61п Ьеи Туг Агд 61 у Ткг
65 70 75 80
Ьуз Туг Агд Агд РНе Рго Азп Тгр Ьеи Азр ΗΪ3 Тгр Мек Ьеи Суз Агд
85 90 95
Ьуз <Э1п Ьеи О1у Ьеи Уа1 А1а Ьеи <31у РНе А1а РНе Ьеи Н1з Уа1 Не
100 105 110
- 173 014870
Туг ТЬг Ьеи 115 Уа1 Не Рго 11е Агд 12 0 Туг Туг Уа1 Агд Тгр 125 Агд Ьеи Агд
Азп А1а ТЬг Не ТЬг С1п А1а Ьеи ТЬг Азп Ьуз Азр Зег РГО РЬе Не
130 135 140
ТЬг зег Туг А1а Тгр Не Азп Азр Зег Туг Ьеи А1а Ьеи С1у Не Ьеи
145 150 155 160
<31у РЬе РЬе Ьеи РЬе Ьеи Ьеи Ьеи 01у Не ТЬг Зег Ьеи Рго Зег Уа1
165 170 175
Зег Азп МеЬ Уа1 Азп Тгр Агд 01и РЬе Агд РЬе Т7а1 С1п Зег Ьуз Ьеи
180 185 190
С1у Туг Ьеи ТЬг Ьеи Уа1 Ьеи Суз ТЬг А1а Н±в ТЬг Ьеи Уа1 Туг 01у
195 200 205
С1у ьуз Агд РЬе Ьеи Зег Рго Зег Не Ьеи Агд Тгр Зег Ьеи Рго Зег
210 215 220
А1а Туг Т1е Ьеи А1а Ьеи Не Не Рго Суз А1а Уа1 Ьеи Уа1 Ьеи ьуз
225 230 235 240
Суз Не Ьеи Не МеЬ Рго Суз Не Азр Ьуз ТЬг ьеи ТЬг Агд Не Агд
245 250 255
01п С1у Тгр <31и Агд Азп Зег Ьуз Туг ТЬг С1п Зег А1а Ьеи
260 265 270
<210> 42 <211> 259 <212> РЕТ <213> Ното заргепз
<400> 42
Ьеи РЬе Рго 01п Тгр Нгз Ьеи Рго Не Ьуз Не А1а А1а Не Не А1а
1 5 10 15
Зег Т ВТ1 ТЬг РЬе Ьеи ТЧ !·*- ТЬг Ьеи Ъеи С1и Уа1 Т1 л о Рго Ъеи
20 25 30
А1а ТЬг Зег Н1з δΐη С1п Туг РЬе Туг Ьуз Не Рго Не Ьеи ν®1 Не
35 40 45
Азп Ьуз Уа1 Ьеи Рго МеС Уа1 Зег Не ТЬг Ьеи Ьеи А1а Ьеи Уа1 Туг
50 55 60
Ьеи Рго 61у Уа1 Не А1а А1а Не Уа1 С1п Ьеи ΗΪ3 Азп е1у ТЬг Ьуз
65 70 75 80
Туг Ьуз Ьуз РЬе Рго н±з Тгр Ьеи Авр Ьуз Тгр МеЬ Ьеи ТЫ Агд Ьуз
85 90 95
С1п РЬе 01у Ьеи Ьеи Зег РЬе РЬе РЬе А1а Уа1 Ьеи Нгз А1а Не Туг
100 105 110
Зег Ьеи Зег Туг Рго МеЬ Агд Агд Зег Туг Агд Туг Ьуз Ьеи Ьеи Азп
115 120 125
Тгр А1а Туг Б1п О1п Уа1 δΐη О1п Азп Ьуз 61и Азр А1а Тгр Не Б1и
130 135 14 0
Ηίβ Азр Уа1 Тгр Агд МеС С1и Не Туг Уа1 Зег Ьеи е1у Не Уа1 61у
145 150 155 160
Ьеи А1а Не Ьеи А1а Ьеи Ьеи А1а Уа1 ТЬг Зег 11е Рго Зег Уа1 Зег
165 170 175
Авр Зег ьеи ТЬг Тгр Агд О1и РЬе Ηίε Туг Не С1п Зег Ьуз Ьеи 61у
180 185 190
Не Уа1 Зег Ьеи Ьеи Ьеи С1у ТЬг Не Н1з А1а Ьеи 11е РЬе А1а Тгр
195 200 205
Азп Ьуз Тгр Не Азр Не Ьуз 01п РЬе Уа1 Тгр Туг ТЬг Рго Рго ТЬг
210 215 220
РЬе МеЬ Не А1а Уа1 РЬе Ьеи Рго Не Уа1 Уа1 Ьеи Не РЬе Ьуз Зег
225 23 0 235 240
Не Ьеи РЬе Ьеи Рго Суз Ьеи Агд Ьуз Ьуз Не Ьеи Ьуз Не Агд Н1з
245 250 255
<31у Тгр С1и
- 174 014870 <210> 43 <211> 259 <212> РЕТ <213> Ното зараепз <400> 43
Беи Беи 1 Рго Зег Тгр 5 Буз Уа1 Рго ТЬг Беи 10 Беи А1а Беи 01у Беи 15 Зег
ТЬг С1п Зег Туг А1а Туг Азп РЬе Не Агд Азр Уа1 Беи С1п Рго Туг
20 25 30
Не Агд Буз Авр 61и Азп Буз РЬе Туг Буз МеС Рго Беи Зег Уа1 Уа1
35 40 45
Азп ТЫ ТЬг Не Рго Суз Уа1 А1а Туг Уа1 Беи Беи Зег Беи Уа1 Туг
50 55 60
Беи Рго С1у Уа1 Беи А1а А1а А1а Беи С1п Беи Агд Агд С1у ТЬг Буз
65 70 75 80
Туг (31п Агд РЬе Рго Авр Тгр Беи Азр Нйв Тгр Беи С1п Н1 з Агд Буз
85 90 95
С1п Не 61у Беи Беи Зег РЬе РЬе РЬе А1а МеС Беи Н1з А1а Беи Туг
100 105 110
Зег РЬе Суз Беи Рго Беи Агд Агд Зег Н1В Агд Туг Авр Беи Уа1 Азп
115 120 12 5
Беи А1а νβΐ Буе С1п νβΐ Беи А1а Авп Буз Зег Агд Беи Тгр Уа1 <31и
130 135 14 0
С1и С1и Уа1 Тгр Агд МеС С1и Не Туг Беи Зег Беи 51у Уа1 Беи А1а
14 5 150 155 160
Беи С1у МеС. Беи Зег Беи Беи А1а Уа1 ТЬг Зег Не Рго Зег Не А1а
165 170 175
Азп Зег Беи Азп Тгр Буз С1и РЬе Зег РЬе Уа1 <31п Зег ТЬг Беи С1у
180 185 190
РЬе Уа1 А1а Беи МеС Беи Зег ТЬг МеС Низ ТЬг Беи ТЬг Туг Е1у Тгр
195 200 205
ТЫ Агд А1а РЬе б1и С1и Азп Н13 Туг Буе РЬе Туг Беи Рго Рго ТЬг
210 215 220
РЬе ТЫ Беи ТЬг Беи Беи Беи Рго Суз Уа1 Не Не Беи А1а Буз <31у
225 230 235 240
Беи РЬе Беи Беи РГО Суз Беи Зег ΗΪΒ Агд Беи ТЬг Буз Не Агд Агд
245 250 255
С1у Тгр С1и
<210> 44 <211> 303 <212 > РЕТ <213> Ното зараепв <400> 44
МеС 1 Беи Буз Агд Рго Уа1 5 Беи Беи Ηίε Беи 10 Ηίε 01п ТЬг А1а ΗΪ3 15 А1а
Азр С1и Рке Азр Суе Рго Зег С1и Беи С1п ΗΪΒ ТЫ С1п ©1и Беи РЬе
20 25 30
Рго 01п Тгр Н13 Беи Рго Не Бу в Не А1а А1а Не Не А1а Зег Беи
35 40 45
ТЬг РЬе Беи Туг ТЬг Беи Беи Агд (31и Уа1 Не Н18 Рго Беи А1а ТЬг
50 55 60
Зег ΗΪ5 (51п <31п Туг РЬе Туг Буз Не Рго Не Беи Уа1 Не Азп Буз
65 70 75 80
Уа1 Беи Рго МеС Уа1 Зег Не ТЬг Беи Беи А1а Беи Уа! Туг Беи Рго
85 90 95
С1у Уа! Не А1а А1а Не Уа1 О1п Беи ΗΪ8 Азп 01у ТЬг Буз Туг Був
100 105 110
Буз РЬе Рго Ηίε Тгр Беи Азр Буз Тгр МеС Беи ТЫ Агд Буз 01п РЬе
115 12 0 125
- 175 014870
Е1у Ьеи Ьеи Зег ₽Ие РЬе РЬе А1а Уа1 Ьеи Н1з А1а Не Туг Зег Ьеи
130 135 140
Зег Туг Рго нее Агд Агд Зег Туг Агд Туг Ьув Ьеи Ьеи Азп Тхр А1а
145 150 155 160
Туг 01п С1п Уа1 βΐη С1п Азп Ьуз С1и Азр А1а Тгр Не 61и Н13 Азр
165 170 175
Уа1 Тгр Агд МеЬ <31и Не Туг Уа1 Зег Ьеи 31у Не Уа1 51у Ьеи А1а
180 185 190
Не Ьеи А1а Ьеи ьеи А1а ν»1 ТЬг Зег Не Рго Зег Уа1 Зег Азр Зег
195 2С0 205
Ьеи ТЬг Тгр Агд 31и РЬе ΗΪ3 Туг Не <31п Зег Ьуз Ьеи <31у Не Уа1
210 215 220
Зег Ьеи Ьеи Ьеи 31у ТЬг Не Н13 А1а Ьеи Не РЬе А1а Тгр Азп Ьуз
225 230 235 240
Тгр 11е Азр Не Ьуз С51п РЬе νβΐ Тгр Туг ТЬг Рго Рго ТЬг РЬе МеС
245 250 255
Не А1а Уа1 РЬе Ьеи Рго 11е Уа1 Уа1 Ьеи 11е РЬе Ьуз Зег Не Ьеи
250 265 270
РЬе Ьеи Рго Суз Ьеи Агд Ьуз Ьуз Не Ьеи Ьуз Не Агд Н1з 01у Тгр
275 280 285
01и Азр ν&ι ТЬг Ьуз Не Азп Ьуз ТЬг <31и Не Суз Зег <31п Ьеи
290 295 300
<210> 45 <211> 303 <212> РКТ <213> Ното зархепз
<400> 45
МеС Ьеи Ьуз Агд Рго <31у Ьеи Зег Н13 Ьеи С1п ΗίΒ А1а Уа1 Ηίδ Уа1
1 5 10 15
Азр А1а РЬе Авр Суз Рго Зег О1и Ьеи С1п ΗΪ8 ТЬг 61п С1и РЬе РЬе
20 25 30
РГО Азп Тгр Агд ьеи Рго Уа1 Ьуз Уа1 А1а А1а Не Не Зег Зег ьеи
35 40 45
ТЬг РЬе Ьеи Туг ТЬг Ьеи Ьеи Агд (31и Не Не Туг Рго Ьеи Уа1 ТЬг
50 55 60
Зег Агд Е1и 61п Туг РЬе Туг Ьуз Не Рго Не Ьеи Уа1 Не Азп Ьуз
65 70 75 80
Уа1 Ьеи Рго МеС Уа.1 А1а Не ТНг ьеи Ьеи А1а Ьеи Уа1 Туг Ьеи Рго
85 90 95
(31у <31и Ьеи А1а А1а Уа1 Уа1 <31п Ьеи Агд Азп <31у ТЬг Ьуз Туг Ьув
100 105 но
Ьуз РЬе Рго Рго Тгр Ьеи Азр Агд Тгр МеС Ьеи А1а Агд Ьуз О1п РЬе
115 120 125
(31у Ьеи Ьеи зег РЬе РЬе РЬе А1а Уа1 Ьеи ΗΪΒ А1а Уа1 туг Зег Ьеи
130 135 140
Зег Туг Рго МеС Агд Агд Бег Туг Агд Туг Ьув Ьеи Ьеи Азп Тгр А1а
145 150 155 160
Туг Ьуз 31п Уа1 <31п <31п Азп Ьуз <31и Азр А1а Тгр Уа1 <31и ΗΪ3 Азр
165 170 175
Уа1 Тгр Агд МеС <31и Не Туг Уа1 Бег Ьеи С1у Не Уа1 С1у Ьеи А1а
180 185 190
Не Ьеи А1а Ьеи Ьеи А1а Уа1 ТЬг Бег Не Рго Зег Уа1 Бег Авр Бег
195 200 205
Ьеи ТЬг Тгр Агд <31и РЬе Н1з Туг Не С1п Бег Ьуз Ьеи С1у Не Уа1
210 215 220
Зег Ьеи Ьеи Ьеи 01у ТЬг Уа1 ΗΪ8 А1а Ьеи Уа1 РЬе А1а Тгр АЗП Ьув
225 230 235 240
Тгр Уа1 Азр Уа1 Зег (31п РЬе Уа1 Тгр Туг МеС Рго Рго ТНг РЬе МеС
245 250 255
Не А1а Уа1 РЬе Ьеи Рго ТЬг Ьеи Уа1 Ьеи Не Суэ Ьуз Т1е А1а Ьеи
260 265 270
- 176 014870
Суз Ьеи Рго Суз Ьеи Агд Ьуз Ьуз 280 11е Ьеи Ьуз 11е Агд 285 Суз 01у Тгр
275
Э1и Азр Уа1 Зег Ьуз 11е Азп Агд ТНг 01и Мек А1а Зег Агд Ьеи
290 295 300
<210? 46 <211? 339 <212? РЕТ <213? Ното зарХепз <400? 46
Мек 01и Зег Агд Ьуз Азр Не ТНг Азп С1п С1и 01и Ьеи Тгр Ьуз Мек
1 5 10 15
Ьуз Рго Агд Агд Азп Ьеи 01и С1и Азр Азр Туг Ьеи ΗΪ3 Ьуз Азр ТНг
20 25 30
С1у 01и ТНг Зег Мек Ьеи Ьуз Агд Рго Уа1 Ьеи Ьеи ΗΪ3 Ьеи Ηίε <31п
35 40 45
ТНг А1а ΗίΒ А1а Азр 01и РНе Азр Суз Рго зег С1и Ьеи С1п ΗίΒ ТНг
50 55 60
С1п С1и Ьеи РНе Рго О1п Тгр Ηίβ Ьеи Рго Не Ьуз Не А1а А1а Не
65 70 75 80
Не А1а Зег Ьеи ТНг РНе Ьеи Туг ТНг Ьеи ьеи Агд 01и νβΐ Не ΗίΒ
85 90 95
Рго Ьеи А1а ТНг Зег ΗΪ3 01П С1п Туг РНе Туг Ьуз 11е Рго Не Ьеи
100 105 но
Уа1 Не Азп Ьуз Уа1 Ьеи Рго Мек Уа1 Зег Не ТНг Ьеи Ьеи А1а Ьеи
115 12 0 125
Уа1 Туг Ьеи Рго С1у Уа1 Не А1а А1а Не Уа1 01п Ьеи ΗΪ3 Азп 01у
130 135 14 0
ТНг ьуз Туг Ьуз Ьуз РНе РГО Ηίε Тгр ьеи Азр Ьуз Тгр Мек Ьеи ТНг
145 150 155 160
Агд Ьуз 01п РНе С1у Ьеи Ьеи Зег РНе РНе РНе А1а Уа1 Ьеи Н13 А1а
165 170 175
11е туг зег Ьеи Зег Туг Рго Мек Агд Агд Зег Туг Агд Туг Ьуз Ьеи
180 185 190
ьеи Азп тгр А1а Туг С1п 01П νβΐ С1п 01п Азп Ьуз С1и Азр А1а Тгр
195 200 205
11е 01и Н1з Азр Уа1 Тгр Агд Мек С1и Не Туг Уа1 Зег Ьеи В1у Не
210 215 220
Уа1 01у Ьеи А1а Не Ьеи А1а ьеи Ьеи А1а 7а1 ТНг Зег 11е Рго Зег
225 230 235 240
νβΐ Зег Азр Зег Ьеи ТНг Тгр Агд С1и РНе ΗΪ3 Туг Не 01п Зег Ьуз
245 250 255
Ьеи О1у Не 17а1 Зет Ьеи Ьеи Ьеи С1у ТНг 11е Н1з А1а Ьеи Не РНе
260 265 270
А1а Тгр АЗП Ьуз Тгр Не Азр Не Ьуз 01п РНе 7а1 Тгр Туг ТНг Рго
275 280 285
Рго ТНг РНе Мек Не А1а Уа1 РНе Ьеи Рго 11е Уа1 Уа1 Ьеи Не Рке
290 295 300
Ьуз Зег Не Ьеи РНе Ьеи Рго Суз Ьеи Агд Ьуз Ьуз Не Ьеи Ьуз Не
305 310 315 320
Агд Н1з С1у Тгр 61и Азр Уа1 ТНг Ьуз Не Азп Ьуз ТНг С1и Не Суз
325 330 335
Зег 01п Ьеи
<210? <211> <212? <213? 47 258 РЕТ Ното заргепз
<400? 47
- 177 014870
Мер С1и Зег Агд Ьуз Авр Не ТЬг Азп (31п 01и С1и Ьеи Тгр Ьуз Мер
1 5 10 15
Ьуз Рго Агд Агд Азп Ьеи 51и 31и Азр Азр Туг Ьеи ΗίΞ Ьуз Авр ТЬг
20 25 30
С1у С1и ТЬг Зег Мер Ьеи Ьуз Агд РГО Уа1 Ьеи Ьеи Низ Ьеи Н1з 01п
35 40 45
ТЬг А1а ΗΪ3 А1а Азр Н1и РЬе Азр Суз Рго Зег С1и Ьеи С1п ΗΪΒ ТЬг
50 55 60
С1п (31и Ьеи РЬе Рго С1п Тгр Н13 Ьеи Рго Не Ьуз 11е А1а А1а 11е
65 70 75 ВО
Не А1а Зег Ьеи ТЬг РЬе Ьеи Туг ТЬг Ьеи Ьеи Агд С1и Уа1 Не ΗΪ8
85 90 95
Рго Ьеи А1а ТЬг Бег Н1з 01п С1п туг РЬе Туг Ьуз Не Рго Не Ьеи
100 105 но
Уа1 Не Азп Ьуз Уа1 Ьеи Рго МеР Уа1 Зег Не ТЬг Ьеи Ьеи А1а Ьеи
115 12 0 125
Уа1 Туг Ьеи Рго 01у Уа1 11е А1а А1а Не Уа1 С1п Ьеи ΗΪ3 Азп <Э1у
130 135 14 0
ТНг Ьуз Туг Ьуз Ьуз РЬе Рго ΗΪ3 Тгр Ьеи Азр Ьуз Тгр Мер Ьеи ТЬг
145 150 155 160
Агд Ьуз С1п РЬе 31у Ьеи Ьеи Зег РЬе РЬе РЬе А1а Уа1 Ьеи Ηϊβ А1а
165 170 175
11е Туг Зег Ьеи Зег Туг Рго Мер Агд Агд Зег Туг Агд Туг ьув Ьеи
180 185 190
Ьеи Азп Тгр А1а Туг 01п О1п Уа1 61п 01п Азп Ьув 31и Авр А1а Тгр
195 200 205
Не С1и Низ Азр Уа1 Тгр Агд Мер 01и Не Туг Уа1 Зег Ьеи С1у Не
210 215 220
Уа1 С1у Ьеи А1а Не Ьеи А1а Ьеи Ьеи А1а Уа1 ТЬг Зег Не Рго Зег
225 230 235 240
Уа1 Зег Азр Зег Ьеи ТЬг Тгр Агд 01и РЬе Ηί3 Туг Не 01п Уа1 АВП
245 250 255
Азп Не
<210> 48 <211> 282 <212> РЕТ <213> Ното зархепз
<400> 48
Мер 01и Зег Агд Ьув Азр Не ТЬг Азп 01п 01и 01и Ьеи Тгр Ьуз Мер
1 5 10 15
Ьув Рго Агд Агд Азп Ьеи С1и 01и Азр Азр Туг Ьеи Н13 Ьуз Азр ТЬг
20 25 30
С1у С1и ТЬг Зег Мер Ьеи Ьув Агд Рго Уа1 Ьеи Ьеи Н±з Ьеи Низ О1п
35 40 45
ТЬг А1а Н13 А1а Азр С1и РЬе Азр Суз Рго Зег 01и Ьеи 01п Низ ТЬг
50 55 60
С1п В1и Ьеи РЬе Рго 61п Тгр Н1В Ьеи Рго Не ьуз Не А1а А1а Не
65 70 75 80
11е А1а Зег ьеи ТЬг РЬе Ьеи Туг ТЬг Ьеи Ьеи Агд С1и Уа1 Не ηϊβ
85 90 95
Рго Ьеи А1а ТЬг Зег Н13 <31п 01п Туг РЬе Туг Ьуз Не Рго Не Ьеи
100 105 110
Уа1 Не Азп Ьуз Уа1 Ьеи Рго Мер Уа1 Зех- Не ТЫ Ьеи Ьеи А1а Ьеи
115 120 125
Уа1 Туг Ьеи Рго С1у Уа1 Не А1а А1а Не Уа1 01п Ьеи Н1з Азп 01у
130 135 140
ТЬг Ьуз Туг Ьуз Ьуз РЬе Рго ΗίΒ Тгр ьеи Авр ьуз Тгр Мер Ьеи ТЬг
145 150 155 160
Агд Ьуз С1п РЬе 01у Ьеи Ьеи Зег РЬе РЬе РЬе А1а Уа1 Ьеи Н1з А1а
165 170 175
- 178 014870
Не Туг Зег ьеи 180 Зег Туг Рго МеЕ Агд Агд Зег Туг Агд Туг Ьув Ьеи
185 190
Ьеи Ав η Тгр А1а Туг С1п 01п Уа1 С1п С1п Азп Ьув С1и Азр А1а Тгр
195 200 205
Не 01и Н1з Азр Уа1 Тгр Агд МеЕ <31и Не Туг Уа1 Зег Ьеи 01у Не
210 215 220
Уа1 <31у Ьеи А1а Не ьеи А1а Ьеи Ьеи А1а Уа1 ТЬг Зег Не Рго Зег
225 230 235 240
Уа1 Зег Азр Зег Ьеи ТЬг Тгр Агд <Э1и РЬе ΗΪ3 Туг Не С1п Не Не
245 250 255
Н1з Ьуз Ьуз Зег Азр Уа1 Рго С1и Зег Ьеи Тгр Азр Рго Суз Ьеи ТЬг
260 255 270
Агд РЬе Ьуз 31у Ьеи Азп Ьеи Не 01п Зег
275 280
<210> 49 <211> 339 <212> ДНК <213> Ното ; 5ар1епз
<220>
<221> СОЗ
<222? (1)... (339)
<400> 49
дЕс аад СЕд сад дад ЕсЕ дда ссЕ дад сЕд аад аад ссЕ дда дад аса 48
Уа1 Ьуз Ьеи 61П С1и Зег О1у Рго С1и Ьеи Ьуз Ьуз Рго 01у <31и ТЬг
1 5 10 15
дЕс аад аЕс Есс Еде аад дсЕ ЕСЕ ддд ЕаЕ асе ЕЕс аса аас ЕаЕ дда 96
Уа1 Ьуз Не Зег Суз Ьуз А1а Зег С1у Туг ТЬг РЬе ТЬг Азп Туг <Э1у
20 25 30
аЕд аас Едд дЕд аад сад дсЕ сса дда аад ддЕ ЕЕа аад Едд аЕд ддс 144
МеЕ Азп Тгр Уа1 Ьуз 01п А1а Рго С1у Ьуз 01у Ьеи Ьуз Тгр МеЕ <Э1у
35 40 45
Едд аЕа аас асе Еас асЕ дда дад сса аса ЕаЕ дсЕ даЕ дас ЕЕс аад 192
Тгр 11е Азп ТЬг Туг ТЬг 01у С1и Рго ТЬг Туг А1а Азр Азр РЬе Ьуз
50 55 60
дда едд ЕЕЕ дес ЕЕс ЕсЕ ЕЕд даа асе ЕсЕ дсс аде асЕ дсс ЕаЕ ЕЕд 240
С1у Агд Рке А1а РЬе Зег Ьеи <31и Ткг Зег А1а Зег ТЬг А1а Туг Ьеи
65 70 75 80
сад аЕс аас аас СЕС ааа ааЕ дад дас асд дсЕ аса ЕаЕ ЕЕс ЕдЕ дса 288
Б1п Не Азп Азп Ьеи Ьуз АЗП 01и Азр ТЬг А1а ТЬг Туг РЬе Суз А1а
85 90 95
ада ссс Едд ЕЕЕ дсЕ Еас Едд ддс саа ддд асе асд дЕс асе дЕс Есс 336
Агд Рго Тгр РЬе А1а Туг Тгр <Э1у С1п <31у ТЬг ТЬг Уа1 ТЬг νβΐ Зег
100 105 110
Еса 339
Зег
<210? <211> <212? <213> 50 113 РНТ Ното зархепз
- 179 014870 <400> 50
Ча1 Ьуз Ьеи С1п С1и Зег 01у Рго С1и Ьеи Ьуз Ьуз Рго С1у О1и ТЬг
1 5 10 15
Ча1 ьуз Не Зег Суз Ьуз А1а Зег 01у Туг ты- РЬе Ткг Азп Туг 01у
20 25 30
МеЕ Άεη Тгр Ча1 Ьуз С1п А1а Рго 01у Ьуз О1у Ьеи Ьуз тгр МеЕ 01у
35 40 45
Тгр 11е Азп ТЬг Туг ТЬг 01у 01и Рго ТЬг Туг А1а Азр Азр РНе Ьуз
50 55 60
<31у Агд РНе А! а РЬе Зег Ьеи 01и ТЬг Зег А1а Зег ТЬг А1а Туг Ьеи
65 70 75 80
01П Не Азп Азп Ьеи Ьуз Азп С1и Азр ТЫ А1а ТЬг Туг РЬе Суз А1а
85 90 95
Агд Рго Тгр РЬе А1а Туг Тгр 01у 01п 01у ТНг ТЬг Уа1 ты Ча1 Зег
100 105 110
Зег <210> 51 <211> 435 с212> ДНК <213> Ното зариепз <220>
<221> СЬБ <222> (1) . . .(435) <400> 51 дда сЕд ЕЕс даа дес дес асе аЕд аад ЕЕд ссЕ дЕЕ адд сЕд ЕЕд дЕд 48
О1у Ьеи РЬе С1и А1а А1а ТНг МеЕ Ьуз Ьеи Рго Ча1 Агд Ьеи Ьеи Ча1
1 5 10 15
сЕс ндд аЕЕ едд даа асе аас дде даЕ дЕЕ д^д аЕд асе сад асЕ сса 96
Ьеи Тгр Не Агд 01и ТЬг Азп 01у Азр Ча1 ча1 МеЕ ТЫ Й1П ТЫ РГО
20 25 30
СЕС асЕ ЕЕд Есд дЕЕ асе аЕЕ дда саа сса дсс Есс аЕс ЕсЕ Еде аад 144
Ьеи ТНг Ьеи Зег Ча1 ТНг Не 01у С1п Рго А1а Зег Не Зег Суз Ьуз
35 40 45
Еса адЕ сад аде сЕс ЕЕа даЕ адЕ даЕ дда аад аса ЕаЕ ЕЕд ааЕ ьдд 192
Зег Зег С1п Зег Ьеи Ьеи Азр Зег Азр 31у Ьуз ТЬг Туг Ьеи Азп Тгр
50 55 60
ЕЕд ЕЕа сад адд сса дде сад ЕсЕ сса аад сдс сЕа апс ЕаЕ сЕд дЕд 240
Ьеи Ьеи <31п Агд Рго 01у 01п Зег РГО Ьуз Агд Ьеи Не Туг Ьеи Ча1
65 70 75 80
ЕсЕ ааа сЕд дас ЕсЕ дда дне ССЕ дас адд ЕЕС асЕ дде адЕ дда Еса 288
Зег Ьуз Ьеи Азр Зег С1у ча! Рго Авр Агд РЬе ТЫ С1у Зег 01у Зег
35 90 95
ддд аса даЕ ЕЕС аса сЕд ааа аЕс аде ада дЕд дад дсЕ дад даЕ ЕЕд 336
01у ТЬг Азр РЬе ТЫ Ьеи ьуз Не Бег Агд Ча1 С1и А1а 01и Азр Ьеи
100 105 110
дда ды; ЕаЕ ЕаЕ Еде ьдд саа ддь аса саЕ ЕЕЕ сса ЕЕс асд ЕЕс дде 384
О1у Ча1 Туг Туг Суз Тгр 01п 01у ТЬг Низ РЬе Рго РЬе ТЬг РЬе 01у
115 120 125
Есд ддд аса аад ЕЕд даа аЕа ааа сдЕ асд даЕ дсЕ дса сса асЕ дЕа 432
Зег 01у ТЬг Ьуз Ьеи 01и Не Ьуз Агд ТЬг Азр А1а А1а Рго ТЫ Ча!
130 13 5 140
- 180 014870
435
Ссс
Зег
145 <210> 52 <211? 145 <212? РКТ <213> Ното зар!епе <400> 52
<31у Беи РЬе 01и А1а А1а ТЬг МеС Буз Беи Рго ¥а1 Агд Беи Беи Уа1
1 5 10 15
Беи Тгр Не Агд 01и ТЬг Азп С1у Азр Уа1 Уа1 мес ТЬг С1п ТЬг Рго
20 25 30
Беи ТЬг Беи Зег Уа1 ТЬг Не 01у 01п Рго А1а Зег Не Зег Суз Буз
35 40 45
Зег Зег С1п Зег Беи Беи Авр Зег Азр 01у Буз ТЬг Туг Беи Азп Тгр
50 55 60
Беи Беи Я1п Агд Рго С1у С51п Бег Рго Буа Агд Беи Не Туг Беи Уа1
65 70 75 80
Зег Був Беи Азр Бег 01у Уа1 Рго Азр Агд РЬе ТЬг С1у Зег С1у Зег
85 90 95
С1у ТЫ Аар РЬе ТЫ Беи Буз Не Зег Агд Уа1 С1и А1а О1и Азр Беи
ЮО 105 НО
01у ¥а1 Туг Туг Суз Тгр С1п С1у ТЬг Н1в РЬе Рго РНе ТЬг РЬе 01у
115 120 125
Зег <31у ТЬг Буз Беи С1и Не Буз Агд ТЫ Азр А1а А1а Рго ТЬг Уа1
130 135 140
Зег
145
<2П> 53 <211> 378 <212 > ДНК <213> Ното аархепз <220?
<221> СОЗ <222? (1),..(378)
<400? 53 даа 01и дес А1а 5 дсс А1а асе ТЬг асд Мес
дда □1у 1 ССд ССС
Беи РЬе
сед дсс асе аСС дда саа сса дсс
Зег νβΐ ТЬг Не 20 О1у 01п Рго А1а
аде сСс ЬСа дас адС да С дда аад
Зег Беи Беи 35 Азр Бег Азр С1у Буз 40
адд сса ддс сад ссс сса аад сдс
Асд Рго 50 51у О1п Зег Рго Буз 55 Агд
дас СсС дда дСс ссЬ дас адд ССс
Авр 65 Зег С1у Уа1 Рго Авр 70 Агд РЬе
даа С1и дсс А1а 10 сса Рго дсС А1а сад 01п сСс Беи асС ТЫ 15 ссд Беи 48
Ссс аСС Сдс аад Сса адС сад 96
Зег 25 11е 5ег Суз Буз Бег 30 Бег 01п
аса СаЬ ССд ааС Сдд ЬСд ЬСа сад 144
ТЬг Туг Беи Аап Тгр 45 Беи Беи 01п
сСа асе сас сСд дед СсС ааа сед 192
Беи Не Туг Беи 60 Уа1 Зег Буа Беи
асС ддс адС дда Сса ддд аса даС 240
ТЬг 01у Зег 75 01у Бег 01у ТЬг Аар 30
- 181 014870
ккс аса скд ааа акс аде ада дкд дад дек дад дак ккд дда дкк ван Туг
Рке Ткг Ьеи Ьуз 11е Зег 85 Агд Ча1 С1и А1а 90 С1и Азр Ьеи 61у Ча1 95
как кде кдд саа ддк аса сак ккк сса ккс асд ккс ддс кед ддд аса
туг Суз Тгр С1п 61у Ткг ΗΪΞ Рке Рго Рке Ткг Рке Б1у Зег С1у ткг
100 105 110
аад ккд даа ака ааа едк асд дас дек дса сса аск дка ксс
Ьуз Ьеи 01и 11е Ьуз Агд ткг Азр А1а А1а Рго Ткг Ча1 Зег
115 12 0 125
<210> 54 <211> 125 <212> РНТ <213> Нотс ί зархепз
<400> 54
61у Ьеи РНе О1и А1а А1а Ткг Мек 61и А1а Рго А1а С1п Ьеи Ткг Ьеи
1 5 10 15
Зег Ча1 Ткг 11е С1у 01л Рго А1а Зег 11е Зег Суз Ьуз Зег Зег <31п
20 25 30
Зег Ьеи Ьеи Азр Зег Азр 01у Ьуз Ткг Туг Ьеи Азп Тгр Ьеи Ьеи 61п
35 40 45
Агд Рго С1у Е1п Зег Рго Ьуз Агд Ьеи 11е Туг Ьеи Ча1 Зег Ьуз Ьеи
50 55 60
Азр Зег 61у Ча1 Рго Азр Агд Рке Ткг С1у Зег 01у Зег 01у Ткг Азр
65 70 75 80
Рке Ткг Ьеи Ьуз 11е Зег Агд Ча1 С1и А1а 01и Азр Ьеи О1у Ча1 Туг
О г а л а г
о - V
Туг Суз Тгр 01п 61у Ткг ΗΪ3 Рке Рго Рке Ткг Рке е1у Зег С1у Ткг
100 105 110
Ьуз Ьеи Е1и 11е Ьуз Агд Ткг Азр А1а А1а Рго Ткг Ча1 Зег
115 12 0 125
<210> 55 <211> 438 <212> ДНК <213> Ното варсепз
<220> <221> СОЗ
<222> (1).. .(438)
<400> 55 акд ддс ккс аад акд дад Сса сад дсс сад дкк екк акд ига скд скд
Мек 61у Рке Ьуз Мек 01и Зег О1п А1а С1п Ча1 Ьеи Мек Ьеи Ьеи Ьеи
1 5 10 15
ска кдд дка кок ддк асе едк ддд дас акк дкд акд кса сад кек сса
Ьеи Тгр Ча1 Зег 01у Ткг Суд С1у Азр 11е ча1 Мек Зег Θΐη Зег Рго
20 25 30
ксс ксс ска дек дкд Сса дкк дда дад аад дкк асе акд аде кде аад
Зег Зег Ьеи А1а Ча1 Зег Ча1 01у <31и Ьуз Ча1 Ткг Мек зег Суз Ьуз
35 40 45
ксс адк сад аде екк Ска как адд аде аак саа аад аас Ъас ккд дсс
Зег Зег С1п Зег Ьеи Ьеи Туг Агд Зег Азп С1п Ьуз Азп Туг Ьеи А1а
50 55 60
- 182 014870
сдд Тгр 65 Рас Туг сад 61η сад ааа С1п Ьуз сса ддд сад Ссе ссе ааа Дув 75 ерд Деи сРд аРР РаР Сдд 240
Рго 70 61у 61п Зег Рго Деи Не Туг Тгр 80
дсс Ссс асС адд даа СсС ддд дРс ссР дас сдс СРс аса ддс адС дда 288
А1а Зег ТЬг Агд 61и Зег 61у Уа1 Рго Азр Агд РЬе ТЬг Б1у Зег О1у
85 90 95
сое ддд аса да С ССс асР сСс асе аРс аде адС дед аад дсР даа дас 336
Зег 61у ТЬг Азр РЬе ТЬг Деи ТЬг Не Зег Зег Уа1 Дуз А1а 61и Азр
100 105 110
сед дса дес еае Рас РдС сад саа РаС СаС аас СаР ссС сдд асд ере 384
Ьеи А1а Уа1 Туг Туг Суз 61п С1п Туг Туг АВП Туг Рго Агд ТЬг РЬе
115 120 125
дде дда ддс асе аад сед даа аСс ааа сдС асд дас дсС дса сса асе 432
61у 61у 01у ТЬг Дуз Деи 61и Не Дуз Агд ТЬг Азр А1а А1а Рго ТЫ
130 135 14 0
438 дСа Ссс νβΐ Зег
145 <210? 56 <211> 146 <212> РЕТ <213? Ното варДепэ <400? 56
Мер С1у РЬе Ьуз Мер С1и Зег 61п А1а <31п Уа1 Деи Мер Деи Деи Деи
1 5 10 15
Деи Тгр Уа1 Зег С1у ТЬг Суз С1у Авр Не Уа1 Мер Зег 61 п Зег Рго
20 25 30
Зег Зег Ьеи А1а Уа1 Зег Уа1 Б1у 61и Дуэ Уа1 ТЬг Мер Зег Суз Дуз
35 40 45
Зег Зег 61п Зег Деи Деи Туг Агд Зег Азп 61п Дуз Азп Туг Деи А1а
50 55 60
Тгр Туг С1п С1п Дув Рго С1у 61п Зег Рго Дув Деи Деи Не Туг Тгр
65 70 75 80
А1а Зег ТЬг Агд 61и Зег 61у Уа1 Рго Авр Агд РЬе ТЬг 61у Зег С1у
85 90 95
Зег <31у ТЬг Авр РЬе ТЫ Деи ТЬг Не Бег Зег Уа1 Дуз А1а С1и Азр
100 105 110
Деи А1а Уа1 Туг Туг Суз 61п 61п Туг Туг Авп Туг Рго Агд ТЬг РЬе
115 120 125
<31у б1у С1у ТЬг Дув Деи 61и Не Дуз Агд ТЬг Авр А1а А1а Рго ТЬг
130 135 140
Уа1 Зег
145
<210> 57
<211? 113
<212> РЕТ
<213> Ното варгепв
<400? 57
Уа1 Дув Ьеи С1п 61и Зег 61у Рго 61и Деи Ьуз Дуз Рго С1у 61и ТЬг
1 5 10 15
Уа1 Ьуз Не Зег Сув Ьуз А1а Зег 61у Туг ТЬг ₽Ье ТЬг Азп Туг ОХу
20 25 30
МеС Азп Тгр Уа1 Ьуз 61п А1а Рго <31у Дуз <31у Ьеи Ьуз Тгр Мер О1у
- 183 014870
40 45
Тгр Не 50 Азп ТЬг Туг ТЬг 01у 55 31и Рго ТЬг Туг А1а Азр Азр 60 РЬе Ьуз
С1у Агд РЬе А1а РЬе Зег Ьеи <31и ТЬг Зег А1а Зег ТЬг А1а Туг Ьеи
65 70 75 ВО
С1п Не Азп Азп. Ьеи Ьуз Азп 31и Азр ТЬг А1а ТЬг Туг РЬе Суз А1а
85 90 95
Агд Рго тгр РЬе А1а Туг Тгр <31у С1п С1у ТЬг ТЬг Уа1 ТЬг Уа1 Зег
100 105 НО
Зег
<210> 58 <211> 145 <212? ΡΕ.Τ <213> Ното зархепз <400? 58
С1у Ьеи РЬе <31и А1а А1а ТЬг МеЕ Ьуе Ьеи Рго Уа1 Агд Ьеи Ьеи Уа1
1 5 10 15
Ьеи Тгр Не Агд С1и ТЬг Азп <31у Азр Уа1 Уа1 МеЕ ТЬг С1п ТЬг Рго
20 25 30
Ьеи ТЬг Ьеи Зег νβΐ ТЬг Не Б1у 01п Рго А1а Зег Не Зег Суз Ьуз
35 40 45
Зег Зег <31п Зег Ьеи Ьеи Азр Зег Азр С1у Ьуа ТЬг Туг Ьеи Азп Тгр
50 55 60
Ьеи Ьеи <31п Агд Рго 31у С1п Зег Рго Ьуз Агд Ьеи Не Туг Ьеи Уа1
65 70 75 80
Зег Ьуа Ьеи Азр зег О1у ν&1 Рго Азр Агд РЬе ТЬг С1у Зег В1у Зег
85 90 95
<31у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи Ьуз Не Зег Агд Уа1 <31и А1а С1и Азр Ьеи
100 105 110
<31у 7а1 Туг Тух Суз Тгр <31п С1у ТЬг ΗΪΒ РЬе Рго РЬе ТЬг РЬе С1у
115 120 125
Зег С1у ТЬг Ьуз Ьеи (31и Не Ьуз Агд ТЬг Азр А1а А1а Рго ТЬг Уа1
130 135 140
Зег
145
<210? 59 <211? 378 <212? ДНК <213> Ното зархепз
<220> <221> СПЗ
<222> (1) . . .(378)
<400> 59 дда сЕд ЕЕс даа дсс дсс асе аЕд даа дсс сса дсЕ сад сЕс асЕ ЕЕд 48
(31 у Ьеи РЬе С1и А1а А1а ТЬг МеЕ <31и А1а Рго А1а <31п Ьеи ТЬг Ьеи
1 5 10 15
Есд дЕЕ асе аЕЕ дда саа сса дсс Есс аЕс ЕсЕ Еде аад Еса адЕ сад 96
Зег 7а1 ТЬг Не С1у С1п Рго А1а Зег Не Зег Суз Ьуз Зег Зег 61п
20 25 30
аде сЕс ЕЕа даЕ адЕ даЕ дда аад аса ЕаЕ ЕЕд ааЕ Едд ЕЕд ЕЕа сад 144
Зег Ьеи Ьеи Азр Зег Азр С1у Ьуз ТЬг Туг Ьеи Азп Тгр Ьеи Ьеи С1п
35 40 45
- 184
адд Агд сса ддс Рго 01у 50 сад кек сса аад сдс Агд ска Ьеи акс как 11е Туг скд Ьеи 60 дкд Уа1 Еск Зег ааа Ьуз скд Ьеи
С1п Зег Рго Ьуз 55
дас кек дда дке сск дас адд ккс аск ддс адк дд* Еса 399 аса дак
Азр Зег С1у Уа1 Рго Азр Агд РЬе ТЬг С1у Зег С1у Зег С1у ТЬг Азр
65 70 75 80
ккс аса скд ааа акс аде ада дкд дад дек дад дак ккд дда дкк как
РЬе ТЬг Ьеи Ьуз Не Зег Агд Уа1 С1и А1а 01и Азр Ьеи С1у 17а1 Туг
85 90 95
как Еде ьдд саа ддь аса сак ккк сса Екс асд ккс дзе кед ддд аса
Туг суа Тгр О1п 01у ТЬг ΗΪ3 РЬе Рго РЬе ТЬг РЬе 01у Зег <31у ТЬг
100 105 110
аад ккд даа ака ааа едк асд даЕ дек дса сса аск дка Есс
Ьуз Ьеи 31и 11е Ьуз Агд ТЬг Азр А1а А1а Рго ТЬг Уа1 Зег
115 120 125
<210=· 60 <211> 126 <212> РЕТ <213 = Ното варкепз
<400 = 60
01у Ьеи РЬе 01и А1а А1а ТЬг Мек С1и А1а Рго А1а □1п Ьеи ТЬг Ьеи
1 5 10 15
Зег Уа1 ТЬг 11е 01у 01п Рго А1а Зег Не Бег Суз Ьув Зег Зег Е1п
20 25 30
Зег Ьеи Ьеи Азр Бег Азр С1у Ьуз ТЬг Туг Ьеи Азп Тгр Ьеи Ьеи 01п
35 40 45
Агд Рго С1у 01 η Бег Рго Ьуз Агд Ьеи Не Туг Ьеи Уа1 Зег Ьуз Ьеи
50 55 60
Азр Зег 31у Уа1 Рго Азр Агд РЬе ТЬг О1у Зег О1у Зег <31у ТЫ Азр
65 70 75 80
РЬе ТЫ Ьеи ьуз Не Зег Агд Уа1 01и А1а 01и Азр Ьеи О1у Уа1 Туг
85 90 95
Туг Суз тгр <31п 01у ТЫ ΗΪ3 РЬе Рго РЬе ТЬг РЬе О1у Зег С1у ТЬг
100 105 110
Ьуз Ьеи <31и 11е Ьуз Агд тЬг Азр А1а А1а Рго ТЬг Уа1 Зег
115 120 125
<210> 61 <211> 145 <212 = РЕТ <213> Ното зар1епз <400 = 61
С1у Ьеи РЬе 01и А1а А1а ТЬг Мек Ьуз Ьеи Рго Уа1 Агд Ьеи Ьеи Уа1
1 5 10 15
Ьеи Тгр Не Агд 01и ТЬг Азп 01у Азр Уа1 Уа1 Мек ТЫ 31п ТЫ Рго
20 25 30
Ьеи ТЬг Ьеи Зег Уа1 ТЬг Не С1у □ Ιη Рго А1а Зег Не Зег Суз Ьув
35 40 45
Зег Зег С1п Зег Ьеи Ьеи Азр Зег Азр С1у Ьув ТЬг Туг Ьеи Азп Тгр
50 55 60
Ьеи Ьеи <3111 Агд Рго С1у С1п Зег Рго Ьуз Агд Ьеи Не Туг Ьеи Уа1
65 70 75 80
Зег Ьув Ьеи Азр Зег 01у Уа1 Рго Азр Агд РЬе ТЬг 01у Зег 01у Зег
85 90 95
- 185
е1у Ткг Азр Рке ТИв 100 Ьеи Ьуз 11е Зег Агд Уа1 С1и А1а С1и Авр Ьеи
105 110
С1у Уа1 Туг Туг Суз Тгр 61п С1у Ткг НТВ Рке Рго Рке ткг Рке С1у
115 120 125
Зег С1у Ткг Ьуз Ьеи <31и Не Ьуз Агд ткг Авр А1а А1а Рго Ткг Уа1
130 135 140
Зег
145
<210> 62 <211> 126 <212> РЕТ <213 > Ното : вар!епе
<400? 62
С1у Ьеи РЬе С1и А1а А1а ТЬг Мек 01и А1а Рго А1а <31п Ьеи ТЬг Ьеи
1 5 10 15
Зег Уа1 ТЬг Не С1у 01ц Рго А1а Зег Не Зег Суз Ьуз Зев Бев <31п
20 25 30
Зег Ьеи Ьеи Авр Бев Авр 01у Ьуз Ткг Туг Ьеи Азп Тгр Ьеи Ьеи <31п
35 40 45
Агд Рго С1у С1п Зег Рго Ьуз Агд Ьеи Не Туг Ьеи Уа1 Зег Ьуз Ьеи
50 55 60
Авр Зег С1у νηΐ Рго Азр Агд Рке ТЬг 01у Бег С1у Зег С1у Ткг Азр
65 70 75 80
Рке Ткг Ьеи ьуз Не зег Агд Уа1 01и А1а 01и Авр Ьеи <Э1у Уа1 Туг
85 90 95
Туг Суз Тгр С1п С1у ТЬг Нтз Рке Рго Рке Ткг Рке С1у Зег 01у Ткг
100 105 110
Ьуз Ьеи 01и Не Ьуз Агд Ткг Азр А1а А1а Рго Ткг Уа1 Бег
115 120 125
<210> 63 <211> 146 <212> РЕТ <213> Ното вархепз
<400> 63
Мек 01у РЬе ьув Мек 01и Зег С1п А1а 01п Уа1 Ьеи мек Ьеи Ьеи Ьеи
1 5 10 15
Ьеи Тгр Уа1 Бег 01у Ткг Суз С1у Авр Не Уа1 Мек Зег 01п Зег Рго
20 25 30
Зег Зег Ьеи А1а Уа1 Зег Уа1 С1у 01 и Ьув Уа1 Ткг Мек Бег Сув Ьуз
35 40 45
Зег Зев 01п Зев Ьеи Ьеи Туг Агд Зев Азп βΐη Ьуз АЗП Туг Ьеи А1а
50 55 60
Тгр Туг 31п О1п Ьув РГО 01у 01п Бег Рго Ьув ьеи Ьеи Не Туг Тгр
65 70 75 80
А1а Зег ТЬг Агд С1и Зег С1у 7а1 Рго Авр Агд Рке ТЬг С1у Зев 01у
85 90 95
Зег 31у ТЬг Авр ₽Ие Ткг Ьеи Ткг Не Бев Зег Уа1 Ьуз А1а 01и Азр
100 105 110
Ьеи А1а Уа1 Тух Туг Сув С51п 01п Туг Туг Азп Тув Рго Агд Ткх Рке
115 120 125
С1у 01у С1у Ткг Ьув Ьеи С1и Не Ьуз Авд Ткг Авр А1а А1а Рго Ткг
130 135 140
7а1 Зег
145 <210=· 64
- 186 014870 <211?
<212>
<213?
РКТ
ТеЕапиз Εοχοΐά <400?
С1п Туг Не Ьуз А1а Азп Зег
Ьув
РЬе
Не
С1у
Не
ТЬг <31и <210>
<211?
<212?
<213>
РКТ рГазтосИит £а1с1рагип» <400?
Азр 11е
Азп Уа1 е1ч
Уа1 ьуз ьуз
Азп Бег
Не А1а
Ьув
МеЕ
01и
Ьув
А1а
Зег
Зег
Уа1 РЬе <210>
<211>
<212?
<213>
РНТ
ЗЕгерЕососсив <400>
С1у А1а Уа1 Азр Бег
Не Ьеи
С1у С1у νβΐ
А1а
ТЬг
Туг
91у
А1а А1а <210?
<211>
<212?
<213>
РЕТ
Искусственная последовательность <220>
<221>
<222>
<223>
ВАРИАНТ
Хаа циклогексилаланин, фенилаланин или тирозин <221>
<222>
<223?
ВАРИАНТ
1, 13
Хаа=Р-аланмн или Ь-аланин <223>
рап-РН-связывающий эпитоп <400>
Хаа Ьув Хаа \7а1 А1а А1а Тгр ТЬг Ьеи Ьуз А1а А1а Хаа <210>
<211>
<212>
<213>
ДНК
Искусственная последовательность <220?
<223>
Праймер <400?
ЕЕЕЕдаЕсаа дсЬЕ
- 187 014870 <210? 69 <211> 42 <212? ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Праймер <400> 69 сьааьасдас ссаскабадд дсксдадсдд ссдсссдддс ад 42 <210> 70 <211> 12 <212? ДНК <213> Искусственная последовательность <220?
<223> Праймер <400? 70 даксскдссс дд 12 <210> 71 <211? 40 <212? ДНК <213> Искусственная последовательность <220?
<223> Праймер <400? 71 дкаакасдас ксаскакадд дсадсдкддк сдсддссдад 40 <210? 72 <211> 10 <212? ДНК <213> Искусственная последовательность <220?
<223> Праймер <400? 72 дакссЬсддс 10 <210? 73 <211> 22 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220?
<223> Праймер <400? 73 скаакасдас ксаскакадд до 22 <210? 74 <211? 22 <212? ДНК <213> Искусственная последовательность <220?
<22 3> Праймер
- 188 014870 <400? 74
Ьсдадсддсс дсссдддсад да <210? 75 <211> 30 <212? ДНК <213> Искусственная последовательность <220?
<223> Праймер <400? 75 адсдбддбсд сддссдадда 20 <210? 76 <211? 25 <212? ДНК <213> Искусственная последовательность <220?
<223> Праймер <400? 76 абабсдссдс дсбсдбсдбс дасаа <210? 77 <211? 26 <212? ДНК <213> Искусственная последовательность <220?
<223> Праймер <400? 77 адссасасдс адсДсаРРдЬ адаадд 26 <210? 78 <211? 24 <212? ДНК <213> Искусственная последовательность <220?
<223> Праймер <400? 78 асбЬбдббда ДдассаддаР Ддда <210? 79 <211? 24 <212? ДНК <213> Искусственная последовательность <220?
<223> Праймер <400? 79 садаасббса дсасасасад даас 24 <210? 80 <211? 24 <212? ДНК <213> Искусственная последовательность
- 189 014870 <220>
<400> 80
Саад
<211= <212>
<213>
ДНК ното зар!епз <400>
<210>
<211>
<212>
ДНК
Ното зархепв
<400>
<210>
<211>
<212>
<213>
ДНК Ното
<400> аасСдаадас
сСдаадасаа
Саа
<211>
<213>
РКТ
Ното
АЗП
<210>
<211>
<212>
РКТ
Ното зар^епз
ТЬг
<210>
с211>
<212г
РЕТ
Ното
Зег
<210> 87 <211> 4
- 190 014870
<210> 93
<211> 17
<212? ΡΡΤ
<213> Ното зархепз
<400? 93
- 191 014870
Агд Ьуз Азр Не ТЬг· Азп С1п С1и <31и 1 5
Агд
Ьеи ю
Тгр Ьуз МеЕ Ьуз
Рго Агд <210? 94 <211> 339 <212> РЕТ <213? Ното зархепз <400> 94
МеЕ С1и Зег Агд Ьуз Азр 11е ТЬг Азп С1п С1и 01и Ьеи Тгр Ьуз МеЕ
1 5 10 15
Ьуз Рго Агд Агд Азп Ьеи <31и *31и Азр Азр Туг Ьеи Ηίε Ьуз Азр ТЬг
20 25 30
31у С1и ТЬг Зег МеЕ Ьеи Ьуз Агд Рго Уа1 Ьеи Ьеи Н13 Ьеи Н1з <31п
35 40 45
ТЬг А1а Н18 А1а Азр С1и РЬе Азр Суз Рго Зег С1и Ьеи С1п Нхв ТЬг
50 55 60
С1п С1и Ьеи РЬе Рго <31п Тгр ΗΪ3 Ьеи Рго Не Ьуз Не А1а А1а Не
65 70 75 80
Не А1а Зег Ьеи ТЬг РЬе Ьеи Туг ТЬг Ьеи Ьеи Агд 01и Уа1 11е Н1з
85 90 95
Рго Ьеи А1а ТЬг Зег Нхз Б1п О1п туг РЬе Тух Ьуз Не Рго 11е Ьеи
100 105 но
Уа1 Не Азп Ьуз ν&ι Ьеи Рго МеЕ νβχ Зег Не ТЬг Ьеи Ьеи А1а Ьеи
115 120 125
Уа1 Туг Ьеи РГО С1у νβΐ Не А1а А1а Не Vа1 01п Ьеи Н13 Азп <31у
130 135 140
ТЬг Ьуз Туг Ьуз Ьуз РЬе Рго ΗΪ3 Тгр Ьеи Азр Ьуз Тгр Мес Ьеи ТЬг
145 150 155 160
Агд ьуз С1п РЬе е1у ьеи ьеи Зег РЬе РЬе РЬе А1а Уа1 ьеи ηϊβ А1а
165 170 175
Не Туг Зег Ьеи Зег Туг Рго МеЕ Агд Агд Зег Туг Агд Туг Ьуз Ьеи
180 185 190
Ьеи Азп Тгр А1а Туг Θΐη 61п Уа1 (31п 51п Азп Ьуз <31и Азр А1а Тгр
195 200 205
Не С1и Н1з Азр Уа1 Тгр Агд МеЕ 01и Не туг Уа1 Зег ьеи <31у Не
210 215 220
Уа1 С1у Ьеи А1а Не Ьеи А1а Ьеи Ьеи А1а Уа1 ТЬг Зег Не Рго Зег
225 230 235 240
Уа1 Зег Азр Зег Ьеи ТЬг Тгр Агд (31и РЬе Н13 Туг Не С1п Зег Ьуз
245 250 255
Ьеи С1у Не Уа1 Зег ьеи ьеи Ьеи Б1у ТЬг Не ΗΪ8 А1а Ьеи Не РЬе
260 265 270
А1а Тгр АЗП ьуз тгр Не Азр 11е ьуз 61П РЬе Уа1 Тгр Туг ТЬг Рго
275 280 285
Рго ТЬг РЬе МеЕ Не А1а νβΐ РЬе Ьеи Рго Не Уа1 Уа1 Ьеи Не РЬе
290 295 300
Ьуз Зег Не Ьеи РЬе Ьеи РГО Суз Ьеи Агд Ьуз Ьуз Не Ьеи Ьуз Не
305 310 315 320
Агд Ηίε <31у Тгр С1и Азр Уа1 ТЬг Ьуз Не Азп ьуз тЬг <31и Не Суз
325 330 335
Зег С1п Ьеи
<210> <211? <212? <213? 95 12 РЕТ Ното зархепз
<400? 95
- 192 014870
Тгр Агд О1и РЬе Ηίθ Туг Не О1п Не Не Η1Ξ Ьуз ьуз Зег Азр Уа1
1 5 10 15
Рго С1и Зег Ьеи Тгр Авр Рго Суз Ьеи ТЬг Агд Рке Ьуз С1у Ьеи Азп
20 25 30
Ьеи Не 61п Зег
35
ТЬг Тгр Агд Е1и РЬе Н13 Туг Не С1п 11е 11е Н15 Ьуз Ьуз Зег Азр
1 5 10 15
Уа1 Рго С1и Зег Ьеи Тгр Азр Рго Суз Ьеи ТЬг Агд РЬе Ьуз С1у Ьеи
20 25 30
АЗП Ьеи Не <31п Зег
35
Уа1 Зег Азр Зег Ьеи ТЬг Тгр Агд Е1и РЬе Ηίε Туг Не 51п Не 11е
1 5 10 15
ΗΪ5 ьуз Ьуз Зег Азр Уа1 Рго <з1и Зег Ьеи Тгр Азр Рго Суз Ьеи ТЬг
20 25 30
- 193 014870
<210> 101 <211> 17 <212> ΡΒΤ <213> Ното зархепв
<400> 101
Агд Ьуз <31п Рке <31 у Ьеи Ьеи Зег Ьеи Рке
1 5 10
11е
Рке А1а Уа1 Ьеи Нхз А1а <210? 102 <211? 19 <212? РКТ <213? Ното зархепз с400> 102
Ткг Агд Ьуз С1п Рке 61у Ьеи Ьеи Зег Ьеи Рке 15 10
А1а Не Туг
Рке А1а Уа1 Ьеи Н1з <210? 103 <211> 29 <212> РЕТ <213? Ното зархепз <400> 103
Азр Ьуз Тгр Мек Ьеи Ткг Агд Ьуз <31п Рке О1у Ьеи Ьеи Зег Ьеи Рке
1 5 10 15
Рке А1а Уа1 Ьеи Ηί3 А1а 11е Туг Зег Ьеи Зег Туг Рго
20 25
- 194 -

Claims (70)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Антитело или его фрагмент, содержащие:
    (a) определяющую комплементарность область (СИЕ) из антитела, обозначенного как Х92.1.30.1.1 (1) (АТСС РТА-5802), или из антитела, обозначенного как Х120.545.1.1 (АТСС РТА-5803);
    (b) последовательность БЕР ГО N0: 50 вариабельной области тяжелой цепи или (c) последовательность вариабельной области легкой цепи, выбранную из группы, состоящей из БЕр ГО N0: 52, БЕр ГО N0: 54 и БЕр ГО N0: 56, причем антитело или фрагмент антитела согласно (а), (Ь) или (с) связывается с белком БТЕАР-1, имеющим последовательность БЕр ГО N0: 3.
  2. 2. Антитело или его фрагмент по п.1, где антитело является моноклональным антителом.
  3. 3. Антитело или его фрагмент по п.2, где антитело представляет собой антитело Х92.1.30.1.1 (1) АТСС РТА-5802.
  4. 4. Антитело или его фрагмент по п.2, где антитело представляет собой Х120.545.1.1 (АТСС РТА-5803).
  5. 5. Антитело или его фрагмент по п.2, где моноклональное антитело является гуманизированным антителом.
  6. 6. Антитело или его фрагмент по п.1, где фрагмент представляет собой фрагмент ЕаЬ, Е(аЬ')2, Εν или 8Γν.
  7. 7. Рекомбинантный белок, содержащий антигенсвязывающий участок антитела по п.1.
  8. 8. Антитело или его фрагмент по п.1, связанные с детектируемым маркером, токсином или терапевтическим средством.
  9. 9. Антитело или его фрагмент по п.8, где детектируемый маркер выбран из радиоактивного изотопа; соединения, образующего хелатные комплексы с металлами; фермента; флуоресцентного соединения; биолюминесцентного соединения или хемилюминесцентного соединения.
  10. 10. Антитело или его фрагмент по п.9, где радиоактивный изотоп выбран из Βί, I, Ιη, Ύ, 186Ее, 211А1, 125Ι, 188Ее, 153Бт, 213Βί, 32Р и Ьи.
  11. 11. Антитело или его фрагмент по п.8, связанные с токсином.
  12. 12. Антитело или его фрагмент по п.11, где токсин выбран из рицина, А-цепи рицина, доксорубицина, даунорубицина, маутанзиноида, таксола, бромида этидия, митомицина, этопозида, тенопозида, винкристина, винбластина, колхицина, дигидроксиантрациндиона, актиномицина, дифтерийного токсина, экзотоксина Рзеиботопаз (РЕ) А, РЕ40, абрина, А-цепи абрина, А-цепи модексина, альфа-сарцина, гелонина, митогеллина, ретстриктоцина, феномицина, эномицина, курицина, кротина, калихимицина, ингибитора Бараопапа оГЕстаИ^ глюкокортикоида, ауристатина, ауромицина, иттрия, висмута, комбрестатина, дуокармицинов, долостатина, сс1065 и цисплатина.
  13. 13. Антитело или его фрагмент по п.12, связанные с ауристатином.
  14. 14. Трансгенное животное, которое продуцирует моноклональное антитело по п.2.
  15. 15. Гибридома, которая продуцирует моноклональное антитело по п.2.
  16. 16. Вектор, содержащий полинуклеотид, кодирующий моноклональное антитело по п.2.
  17. 17. Вектор по п.16, где антитело, кодируемое полинуклеотидом, представляет собой одноцепочечное моноклональное антитело, содержащее вариабельные области тяжелой и легкой цепей.
  18. 18. Фармацевтическая композиция, которая содержит антитело или его фрагмент по п.1 в стандартной лекарственной форме для применения человеком.
  19. 19. Способ детектирования наличия белка БТЕАР-1 в биологическом образце, включающий приведение в контакт указанного образца с антителом по п.1 и детектирование белка БТЕАР-1 в образце по его связыванию с антителом.
  20. 20. Способ по п.19, где указанный биологический образец взят у пациента, который имеет или который предположительно имеет злокачественное заболевание ткани, приведенной в табл. I.
  21. 21. Способ по п.20, где указанный биологический образец представляет собой сыворотку.
  22. 22. Способ по п.20, в котором биологическим образцом является ткань предстательной железы.
  23. 23. Способ по п.20, в котором биологическим образцом является периферическая кровь.
  24. 24. Способ по п.23, в котором периферическая кровь содержит раковые клетки предстательной железы.
  25. 25. Способ ингибирования роста клеток, экспрессирующих БТЕАР-1, у субъекта, включающий введение указанному субъекту вектора по п.17, где одноцепочечное моноклональное антитело экспрессируется в указанных клетках.
  26. 26. Способ доставки цитотоксического или диагностического средства к клетке, которая экспрессирует белок БТЕАР-1, включающий получение цитотоксического или диагностического средства, конъюгированного с антителом или его фрагментом по п.1, с образованием конъюгата антитело-средство или фрагмент-средство и воздействие на клетку конъюгатом антитело-средство или фрагмент-средство.
  27. 27. Способ по п.26, где цитотоксическое или диагностическое средство выбрано из группы, состоя
    - 195 014870 щей из детектируемого маркера, токсина и терапевтического средства.
  28. 28. Способ по п.27, где диагностическое средство представляет собой детектируемый маркер, выбранный из радиоактивного изотопа; соединения, образующего хелатные комплексы с металлами; фермента; флуоресцентного соединения; биолюминесцентного соединения и хемилюминесцентного соединения.
  29. 29. Способ по п.28, где радиоактивный изотоп выбран из 212Βί, ^Э, ^Ш, 90Υ, 186Ке, 2ПА!, ^Э, 188Ке, 1538ш, 213Βί, 32Р и Ьи.
  30. 30. Способ по п.27, где доставляют цитотоксическое средство.
  31. 31. Способ по п.30, где цитотоксическое средство представляет собой токсин, выбранный из рицина, А-цепи рицина, доксорубицина, даунорубицина, майтанзиноида, таксола, бромида этидия, митомицина, этопозида, тенопозида, винкристина, винбластина, колхицина, дигидроксиантрациндиона, актиномицина, дифтерийного токсина, экзотоксина Ркеийотопак (РЕ) А, РЕ40, абрина, А-цепи абрина, А-цепи модексина, альфа-сарцина, гелонина, митогеллина, ретстриктоцина, феномицина, эномицина, курицина, кротина, калихимицина, ингибитора 8араопапа ойютайк, глюкокортикоида, ауристатина, ауромицина, иттрия, висмута, комбрестатина, дуокармицинов, долостатина, сс1065 и цисплатина.
  32. 32. Способ по п.31, в котором токсином является ауристатин.
  33. 33. Способ детектирования белка 8ТЕАР-1 в тестируемом образце, включающий приведение в контакт тестируемого образца, полученного у пациента, который имеет или который предположительно имеет злокачественную клетку, экспрессирующую 8ТΒЛР-1, с антителом или фрагментом антитела по п.1 и определение количества 8ТЕАР-1 в тестируемом образце по связыванию с антителом или фрагментом антитела.
  34. 34. Способ по п.33, дополнительно предусматривающий сравнение количества 8ТΒАР-1, связанного с антителом или фрагментом антитела, из тестируемого образца с количеством 8ТΒЛР-1 из контрольного образца.
  35. 35. Способ по п.33, в котором тестируемым образцом является образец крови, мочи, семенной жидкости, предстательной железы, толстой кишки, мочевого пузыря, поджелудочной железы, яичника, шейки матки, семенника, молочной железы, кости, лимфатического узла, легкого, печени, мозга, сыворотки или клеточного препарата.
  36. 36. Способ по п.33, в котором тестируемым образцом является образец периферической крови.
  37. 37. Способ по п.36, в котором периферическая кровь содержит раковые клетки предстательной железы.
  38. 38. Способ по п.34, дополнительно включающий взятие тестируемого образца и контрольного образца у пациента, который имеет или предположительно имеет злокачественное заболевание ткани, приведенной в табл. I.
  39. 39. Способ ингибирования роста клеток, которые экспрессируют 8ТΒАР-1, предусматривающий воздействие на клетки антителом или фрагментом антитела по п.1.
  40. 40. Способ по п.39, в котором клетками являются раковые клетки.
  41. 41. Способ по п.40, в котором раковые клетки представляют собой раковые клетки предстательной железы.
  42. 42. Способ лечения рака у субъекта, предусматривающий введение субъекту фармацевтической композиции, содержащей антитело или его фрагмент по п.1.
  43. 43. Способ по п.42, где раком является рак предстательной железы.
  44. 44. Способ ингибирования роста раковых клеток, которые экспрессируют 8ТΒЛР-1, предусматривающий воздействие на клетки антителом или фрагментом антитела по п.11.
  45. 45. Способ по п.44, где антитело или его фрагмент связаны с токсином, выбранным из рицина, Ацепи рицина, доксорубицина, даунорубицина, майтанзиноида, таксола, бромида этидия, митомицина, этопозида, тенопозида, винкристина, винбластина, колхицина, дигидроксиантрациндиона, актиномицина, дифтерийного токсина, экзотоксина Ркеибошопак (РЕ) А, РЕ40, абрина, А-цепи абрина, А-цепи модексина, альфа-сарцина, гелонина, митогеллина, ретстриктоцина, феномицина, эномицина, курицина, кротина, калихимицина, ингибитора 8араопапа ойютайк, глюкокортикоида, ауристатина, ауромицина, иттрия, висмута, комбрестатина, дуокармицинов, долостатина, сс1065 и цисплатина.
  46. 46. Способ по п.45, в котором токсином является ауристатин.
  47. 47. Способ по п.44, где раковые клетки представляют собой раковые клетки злокачественного заболевания ткани, приведенной в табл. I.
  48. 48. Способ по п.47, где раковые клетки представляют собой раковые клетки предстательной железы.
  49. 49. Способ лечения рака у субъекта, предусматривающий введение субъекту фармацевтической композиции, содержащей антитело или его фрагмент по п.11.
  50. 50. Способ по п.49, где антитело или его фрагмент связаны с токсином, выбранным из рицина, Ацепи рицина, доксорубицина, даунорубицина, майтанзиноида, таксола, бромида этидия, митомицина, этопозида, тенопозида, винкристина, винбластина, колхицина, дигидроксиантрациндиона, актиномицина, дифтерийного токсина, экзотоксина Ркеибошопак (РЕ) А, РЕ40, абрина, А-цепи абрина, А-цепи модексина, альфа-сарцина, гелонина, митогеллина, ретстриктоцина, феномицина, эномицина, курицина,
    - 196 014870 кротина, калихимицина, ингибитора Зараоиапа оЕйстаНк, глюкокортикоида, ауристатина, ауромицина, иттрия, висмута, комбрестатина, дуокармицинов, долостатина, сс1065 и цисплатина.
  51. 51. Способ по п.50, в котором токсином является ауристатин.
  52. 52. Способ по п.49, где раком является рак предстательной железы.
  53. 53. Антитело или его фрагмент, содержащие все определяющие комплементарность области (СОВ) тяжелой цепи и легкой цепи из антитела, обозначенного Х92.1.30.1.1 (1) (АТСС РТА-5802), или антитела, обозначенного Х120.545.1.1 (АТСС РТА-5803), причем антитело или фрагмент антитела связывается с белком ЗТЕАР-1, имеющим последовательность ЗЕЦ ΙΌ NО: 3.
  54. 54. Антитело или его фрагмент, содержащие последовательность ЗЕЦ ΙΌ NО: 50 вариабельной области тяжелой цепи и последовательность вариабельной области легкой цепи, выбранную из группы, состоящей из последовательности ЗЕЦ ΙΌ NО: 52, ЗЕЦ ΙΌ NО: 54 и ЗЕЦ ΙΌ NО: 56, причем антитело или фрагмент антитела связывается с белком ЗТЕАР-1, имеющим последовательность ЗЕЦ ΙΌ NО: 3.
  55. 55. Антитело или его фрагмент, которое представляет собой гуманизированную или модифицированную форму моноклонального антитела Х92.1.30.1.1 (1) (АТСС РТА-5802), где антитело или его фрагмент специфически связывается с белком ЗТЕАР-1, имеющим последовательность ЗЕЦ ΙΌ NО: 3.
  56. 56. Антитело или его фрагмент, которое представляет собой гуманизированную или модифицированную форму моноклонального антитела Х120.545.1.1 (АТСС РТА-5803), где антитело или его фрагмент специфически связывается с белком ЗТЕАР-1, имеющим последовательность ЗЕЦ ΙΌ NО: 3.
  57. 57. Антитело или его фрагмент по пп.53-56, связанные с детектируемым маркером, токсином или терапевтическим средством.
  58. 58. Антитело или его фрагмент по п.57, где детектируемый маркер выбран из радиоактивного изотопа; соединения, образующего хелатные комплексы с металлами; фермента; флуоресцентного соединения; биолюминесцентного соединения или хемилюминесцентного соединения.
  59. 59. Антитело или его фрагмент по п.57, связанные с токсином.
  60. 60. Антитело или его фрагмент по п.59, где токсин выбран из рицина, А-цепи рицина, доксорубицина, даунорубицина, маутанзиноида, таксола, бромида этидия, митомицина, этопозида, тенопозида, винкристина, винбластина, колхицина, дигидроксиантрациндиона, актиномицина, дифтерийного токсина, экзотоксина Ркеиботоиак (РЕ) А, РЕ40, абрина, А-цепи абрина, А-цепи модексина, альфа-сарцина, гелонина, митогеллина, ретстриктоцина, феномицина, эномицина, курицина, кротина, калихимицина, ингибитора Зараоиапа оЕйстаЕк, глюкокортикоида, ауристатина, ауромицина, иттрия, висмута, комбрестатина, дуокармицинов, долостатина, сс1065 и цисплатина.
  61. 61. Антитело или его фрагмент по п.60, связанные с ауристатином.
  62. 62. Способ ингибирования роста раковых клеток, которые экспрессируют ЗТЕАР-1, предусматривающий воздействие на клетки антителом или фрагментом антитела по п.59.
  63. 63. Способ по п.62, где антитело или его фрагмент связаны с токсином, выбранным из рицина, А-цепи рицина, доксорубицина, даунорубицина, майтанзиноида, таксола, бромида этидия, митомицина, этопозида, тенопозида, винкристина, винбластина, колхицина, дигидроксиантрациндиона, актиномицина, дифтерийного токсина, экзотоксина Ркеиботоиак (РЕ) А, РЕ40, абрина, А-цепи абрина, А-цепи модексина, альфа-сарцина, гелонина, митогеллина, ретстриктоцина, феномицина, эномицина, курицина, кротина, калихимицина, ингибитора Зараоиапа оЕйстаНк, глюкокортикоида, ауристатина, ауромицина, иттрия, висмута, комбрестатина, дуокармицинов, долостатина, сс1065 и цисплатина.
  64. 64. Способ по п.62, в котором токсином является ауристатин.
  65. 65. Способ по п.44, где раковые клетки представляют собой раковые клетки злокачественного заболевания ткани, приведенной в табл. Ι.
  66. 66. Способ по п.65, где раковые клетки представляют собой раковые клетки предстательной железы.
  67. 67. Способ лечения рака у субъекта, предусматривающий введение субъекту фармацевтической композиции, содержащей антитело или его фрагмент по п.59.
  68. 68. Способ по п.67, где антитело или его фрагмент связаны с токсином, выбранным из рицина, Ацепи рицина, доксорубицина, даунорубицина, майтанзиноида, таксола, бромида этидия, митомицина, этопозида, тенопозида, винкристина, винбластина, колхицина, дигидроксиантрациндиона, актиномицина, дифтерийного токсина, экзотоксина Ркеиботоиак (РЕ) А, РЕ40, абрина, А-цепи абрина, А-цепи модексина, альфа-сарцина, гелонина, митогеллина, ретстриктоцина, феномицина, эномицина, курицина, кротина, калихимицина, ингибитора Зараоиапа оЕйстаНк, глюкокортикоида, ауристатина, ауромицина, иттрия, висмута, комбрестатина, дуокармицинов, долостатина, сс1065 и цисплатина.
  69. 69. Способ по п.68, в котором токсином является ауристатин.
  70. 70. Способ по п.67, где раком является рак предстательной железы.
EA200601946A 2004-04-22 2004-04-22 Антитела к белку steap-1 и их применение EA014870B1 (ru)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/US2004/012625 WO2005113601A2 (en) 2004-04-22 2004-04-22 Antibodies and molecules derived therefrom that bind to steap-1 proteins

Publications (3)

Publication Number Publication Date
EA200601946A2 EA200601946A2 (ru) 2007-06-29
EA200601946A3 EA200601946A3 (ru) 2007-08-31
EA014870B1 true EA014870B1 (ru) 2011-02-28

Family

ID=35428918

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200601946A EA014870B1 (ru) 2004-04-22 2004-04-22 Антитела к белку steap-1 и их применение

Country Status (22)

Country Link
US (5) US8008442B2 (ru)
EP (1) EP1742966B1 (ru)
JP (1) JP4994224B2 (ru)
KR (1) KR101215179B1 (ru)
CN (1) CN101258166B (ru)
AU (1) AU2004319915B9 (ru)
BR (1) BRPI0418766B8 (ru)
CA (1) CA2563735C (ru)
CY (1) CY1114855T1 (ru)
DK (1) DK1742966T3 (ru)
EA (1) EA014870B1 (ru)
ES (1) ES2443996T3 (ru)
HK (1) HK1102012A1 (ru)
HR (1) HRP20140171T1 (ru)
IL (1) IL178761A (ru)
MX (1) MXPA06012187A (ru)
NO (1) NO340451B1 (ru)
NZ (1) NZ550816A (ru)
PL (1) PL1742966T3 (ru)
PT (1) PT1742966E (ru)
SI (1) SI1742966T1 (ru)
WO (1) WO2005113601A2 (ru)

Families Citing this family (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6136311A (en) 1996-05-06 2000-10-24 Cornell Research Foundation, Inc. Treatment and diagnosis of cancer
EP1086223B1 (en) 1998-06-01 2009-07-29 Agensys, Inc. Novel serpentine transmembrane antigens expressed in human cancers and uses thereof
US20040141975A1 (en) 1998-06-01 2004-07-22 Raitano Arthur B. Nucleic acid and corresponding protein entitled 98P4B6 useful in treatment and detection of cancer
US6833438B1 (en) 1999-06-01 2004-12-21 Agensys, Inc. Serpentine transmembrane antigens expressed in human cancers and uses thereof
US20060052321A1 (en) 2002-04-05 2006-03-09 Raitano Arthur B Nucleic acid and corresponding protein entitled 98P4B6 useful in treatment and detection of cancer
US20030149531A1 (en) 2000-12-06 2003-08-07 Hubert Rene S. Serpentine transmembrane antigens expressed in human cancers and uses thereof
ES2532757T3 (es) 2001-09-06 2015-03-31 Agensys, Inc. Ácido nucleico y proteína correspondiente denominados STEAP-1 útiles en el tratamiento y la detección de cáncer
US7494646B2 (en) 2001-09-06 2009-02-24 Agensys, Inc. Antibodies and molecules derived therefrom that bind to STEAP-1 proteins
PL1742966T3 (pl) 2004-04-22 2014-04-30 Agensys Inc Przeciwciała i pochodzące z nich cząsteczki, które wiążą się z białkami STEAP-1
CA2646329C (en) 2006-03-20 2018-07-03 The Regents Of The University Of California Engineered anti-prostate stem cell antigen (psca) antibodies for cancer targeting
AU2013202022B2 (en) * 2006-10-27 2015-06-11 Genentech, Inc. Antibodies and immunoconjugates and uses therefor
ZA200902161B (en) * 2006-10-27 2010-06-30 Genentech Inc Antiobodies and immunoconjugates and uses therefor
PT2061814E (pt) 2006-10-27 2012-09-10 Genentech Inc Anticorpos e imunoconjugados e suas utilizações
JP5394246B2 (ja) * 2007-03-30 2014-01-22 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗体及びイムノコンジュゲートとこれらの使用方法
EP2197491A4 (en) 2007-09-04 2011-01-12 Univ California HIGHAFFINE ANTI-PROSTATE STEM CELL ANTIGEN (PSCA) ANTIBODIES TO CANCER AND TO THE DETECTION OF CANCER
WO2009046294A2 (en) * 2007-10-03 2009-04-09 Cornell University Treatment of proliferative disorders using antibodies to psma
WO2009046739A1 (en) 2007-10-09 2009-04-16 Curevac Gmbh Composition for treating prostate cancer (pca)
US20100069616A1 (en) * 2008-08-06 2010-03-18 The Regents Of The University Of California Engineered antibody-nanoparticle conjugates
WO2010037408A1 (en) 2008-09-30 2010-04-08 Curevac Gmbh Composition comprising a complexed (m)rna and a naked mrna for providing or enhancing an immunostimulatory response in a mammal and uses thereof
WO2010059787A1 (en) * 2008-11-20 2010-05-27 Genentech, Inc. Therapeutic protein formulations
JP5906090B2 (ja) 2009-02-17 2016-04-20 コーネル・リサーチ・ファンデーション・インコーポレイテッドＣｏｒｎｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ， Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ 癌の診断のための方法およびキットならびに治療価の推定
CA2782333C (en) 2009-12-02 2019-06-04 Imaginab, Inc. J591 minibodies and cys-diabodies for targeting human prostate specific membrane antigen (psma) and methods for their use
NZ602840A (en) * 2010-06-03 2014-11-28 Genentech Inc Immuno-pet imaging of antibodies and immunoconjugates and uses therefor
MX350807B (es) * 2011-11-29 2017-09-20 Genentech Inc Composiciones y metodos para el analisis de cancer de prostata.
EP4137158A1 (en) 2015-08-07 2023-02-22 Imaginab, Inc. Antigen binding constructs to target molecules
CN107303389A (zh) * 2016-04-19 2017-10-31 周意 外周脑源性神经营养因子前体（proBDNF）作为炎性介质调节疼痛
CN106267232A (zh) * 2016-08-29 2017-01-04 苏州普罗达生物科技有限公司 一种小分子udp糖基转移酶抗体多肽与长春新碱偶联的结合物
CA3045466A1 (en) 2016-12-01 2018-06-07 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Radiolabeled anti-pd-l1 antibodies for immuno-pet imaging
US11266745B2 (en) 2017-02-08 2022-03-08 Imaginab, Inc. Extension sequences for diabodies
US20200040401A1 (en) * 2017-02-24 2020-02-06 Kaohsiung Medical University Method for determining, predicting and treating cancer
SG11201909218RA (en) * 2017-04-03 2019-11-28 Hoffmann La Roche Antibodies binding to steap-1
CN109957023A (zh) * 2017-12-25 2019-07-02 深圳宾德生物技术有限公司 一种靶向cd22的单链抗体、嵌合抗原受体t细胞及其制备方法和应用
BR112020026724A2 (pt) 2018-07-02 2021-03-30 Amgen Inc. Proteína de ligação ao antígeno anti-steap1
CN110522906B (zh) * 2019-07-31 2023-04-07 天津市泌尿外科研究所 多维、多价、前列腺癌特异性肿瘤抗原组装体的制备方法
JP2022546572A (ja) * 2019-09-05 2022-11-04 メモリアル スローン ケタリング キャンサー センター 抗ｓｔｅａｐ１抗体およびその使用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2139934C1 (ru) * 1993-12-08 1999-10-20 Астра АБ Гуманизированные антитела и их использование
WO2003022995A2 (en) * 2001-09-06 2003-03-20 Agensys, Inc. Nucleic acid and corresponding protein entitled steap-1 useful in treatment and detection of cancer
RU2002103870A (ru) * 2000-05-18 2003-08-20 Джапан Тобакко, Инк. Человеческое моноклональное антитело против AILIM, костимулирующей молекулы передачи сигнала, и его фармацевтическое применение
RU2216593C2 (ru) * 1994-10-07 2003-11-20 Ридженерон Фармасьютикалз, Инк. Рецепторное тело, специфически связывающее tie-2 лиганд, выделенная молекула нуклеиновой кислоты, плазмида, фармацевтическая композиция и способ предотвращения или ослабления неоваскуляризации у млекопитающих

Family Cites Families (55)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6020145A (en) 1989-06-30 2000-02-01 Bristol-Myers Squibb Company Methods for determining the presence of carcinoma using the antigen binding region of monoclonal antibody BR96
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5489525A (en) 1992-10-08 1996-02-06 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Monoclonal antibodies to prostate cells
WO1995014772A1 (fr) 1993-11-12 1995-06-01 Kenichi Matsubara Signature genique
US5859045A (en) * 1996-05-08 1999-01-12 Novo Nordisk A/S Novo Alle Crystalline -! 3R 4R-trans-7 methoxy 2,2-dimethyl1-3-phenyl 1-4 4-12 pyrrolidin-1 -Y1!ethoxyl 1!chromane hydrogen fumarate
US5824504A (en) 1996-09-26 1998-10-20 Elshourbagy; Nabil A. Human 7-transmembrane receptor and DNA
WO1998018489A1 (en) 1996-10-30 1998-05-07 The Uab Research Foundation Enhancement of tumor cell chemosensitivity and radiosensitivity using single chain intracellular antibodies
CO4870792A1 (es) 1997-02-25 1999-12-27 Corixa Corp Compuestos y conjunto de medios de diagnostico para detectar y vigilar la progresion de cancer de prostata
US6800746B2 (en) 1997-02-25 2004-10-05 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of prostate cancer
CA2281952C (en) 1997-02-25 2011-07-19 Corixa Corporation Compounds for immunotherapy of prostate cancer and methods for their use
WO1998053071A1 (en) 1997-05-23 1998-11-26 Biogen, Inc. Modulators of tissue regeneration
EP1000148A2 (en) 1997-08-01 2000-05-17 Genset 5' ESTs FOR SECRETED PROTEINS EXPRESSED IN PROSTATE
PT1000146E (pt) 1997-08-01 2006-10-31 Serono Genetics Inst Sa Ests 5' para proteinas secretadas sem especificidade tecidular
JPH1164691A (ja) 1997-08-25 1999-03-05 Furukawa Electric Co Ltd:The 無切断クリップ
JPH11164691A (ja) 1997-10-03 1999-06-22 Rikagaku Kenkyusho 胚盤胞ｃＤＮＡ
US20030060612A1 (en) 1997-10-28 2003-03-27 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
US6048970A (en) 1998-05-22 2000-04-11 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Prostate growth-associated membrane proteins
US20030064397A1 (en) 1998-05-22 2003-04-03 Incyte Genomics, Inc. Transmembrane protein differentially expressed in prostate and lung tumors
EP1086223B1 (en) 1998-06-01 2009-07-29 Agensys, Inc. Novel serpentine transmembrane antigens expressed in human cancers and uses thereof
CA2334038A1 (en) 1998-07-14 2000-01-27 Corixa Corporation Compositions and methods for therapy and diagnosis of prostate cancer
AU757961B2 (en) * 1998-09-30 2003-03-13 Sankyo Company Limited Anti-Fas antibodies
JP2002532083A (ja) 1998-12-17 2002-10-02 ヒューマン ジノーム サイエンシーズ， インコーポレイテッド ４７個のヒト分泌タンパク質
EP1185559A2 (en) 1999-04-28 2002-03-13 Board Of Regents, The University Of Texas System Compositions and methods for cancer treatment by selectively inhibiting vegf
AU5457000A (en) 1999-06-11 2001-01-02 Human Genome Sciences, Inc. 48 human secreted proteins
CA2382015A1 (en) 1999-08-17 2001-02-22 Incyte Genomics, Inc. Membrane associated proteins
GB2354821A (en) 1999-09-29 2001-04-04 Dine O Quick Threshold crossing counter
AU7994200A (en) 1999-10-04 2001-05-10 Corixa Corporation Compositions and methods for therapy and diagnosis of prostate cancer
UA74798C2 (ru) 1999-10-06 2006-02-15 Байоджен Айдек Ма Інк. Способ лечения рака у млекопитающих с помощью полипептида, который препятствует взаимодействию между april и его рецепторами
AU8023100A (en) 1999-10-13 2001-04-23 Curagen Corporation Proteins and polynucleotides encoded thereby
CA2391369A1 (en) 1999-11-12 2001-05-17 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of prostate cancer
JP4827357B2 (ja) 1999-12-06 2011-11-30 アジェンシス，インコーポレイテッド ヒト前立腺癌において発現されるヘビ状膜貫通抗原およびその使用方法
CZ20022756A3 (cs) 2000-01-14 2003-02-12 Corixa Corporation Prostředky a způsoby pro léčení a diagnostiku rakoviny prostaty
EP1572987A4 (en) 2000-02-03 2005-11-30 Nuvelo Inc NUCLEIC ACIDS AND POLYPEPTIDES
AU2001233114A1 (en) 2000-02-04 2001-08-14 Aeomica, Inc. Methods and apparatus for predicting, confirming, and displaying functional information derived from genomic sequence
WO2001060860A2 (en) 2000-02-17 2001-08-23 Millennium Predictive Medicine, Inc. Genes differentially expressed in human prostate cancer and their use
AU4941101A (en) 2000-03-24 2001-10-08 Fahri Saatcioglu Novel prostate-specific or testis-specific nucleic acid molecules, polypeptides,and diagnostic and therapeutic methods
JP2004504808A (ja) 2000-03-27 2004-02-19 コリクサ　コーポレイション 前立腺癌の治療及び診断のための組成物及び方法
US6436703B1 (en) 2000-03-31 2002-08-20 Hyseq, Inc. Nucleic acids and polypeptides
RU2262511C2 (ru) * 2000-05-18 2005-10-20 Джапан Тобакко, Инк. Человеческое моноклональное антитело против ailim, костимулирующей молекулы передачи сигнала, и его фармацевтическое применение
AU2001264559A1 (en) 2000-06-05 2001-12-17 Avalon Pharmaceuticals Cancer gene determination and therapeutic screening using signature gene sets
CA2412223A1 (en) 2000-06-09 2001-12-20 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of colon cancer
IL154129A0 (en) 2000-07-28 2003-07-31 Compugen Inc Oligonucleotide library for detecting rna transcripts and splice variants that populate a transcriptome
EP1445317A3 (en) 2000-08-24 2004-12-15 Genentech Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
EP1474528A4 (en) 2000-10-13 2006-06-14 Protein Design Labs Inc METHODS FOR DIAGNOSING PROSTATE CANCER, COMPOSITIONS AND METHODS FOR SCREENING PROSTATE CANCER MODULATORS
WO2002059260A2 (en) 2000-11-17 2002-08-01 Hyseq, Inc. Nucleic acids and polypeptides
WO2002057303A2 (en) 2001-01-12 2002-07-25 Hybrigenics Protein-protein interactions between shigella flexneri polypeptides and mammalian polypeptides
EP1379264A4 (en) 2001-03-21 2009-07-08 Human Genome Sciences Inc HUMAN SECRETED PROTEINS
US20030108963A1 (en) 2001-07-25 2003-06-12 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Novel genes, compositions, kit, and methods for identification, assessment, prevention and therapy of prostate cancer
US7494646B2 (en) 2001-09-06 2009-02-24 Agensys, Inc. Antibodies and molecules derived therefrom that bind to STEAP-1 proteins
WO2003022955A1 (en) 2001-09-11 2003-03-20 Nessdisplay Co., Ltd. Organic electroluminescent device having a polyimide hole transport layer
US7091186B2 (en) * 2001-09-24 2006-08-15 Seattle Genetics, Inc. p-Amidobenzylethers in drug delivery agents
EP1308459A3 (en) 2001-11-05 2003-07-09 Research Association for Biotechnology Full-length cDNA sequences
DK2489364T3 (en) * 2003-11-06 2015-03-02 Seattle Genetics Inc Monomethylvaline compounds conjugated to antibodies
PL1742966T3 (pl) 2004-04-22 2014-04-30 Agensys Inc Przeciwciała i pochodzące z nich cząsteczki, które wiążą się z białkami STEAP-1
AU2005286607B2 (en) 2004-09-23 2011-01-27 Genentech, Inc. Cysteine engineered antibodies and conjugates

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2139934C1 (ru) * 1993-12-08 1999-10-20 Астра АБ Гуманизированные антитела и их использование
RU2216593C2 (ru) * 1994-10-07 2003-11-20 Ридженерон Фармасьютикалз, Инк. Рецепторное тело, специфически связывающее tie-2 лиганд, выделенная молекула нуклеиновой кислоты, плазмида, фармацевтическая композиция и способ предотвращения или ослабления неоваскуляризации у млекопитающих
RU99120702A (ru) * 1998-09-30 2003-09-27 Санкио Компани Лимитед Гуманизированная анти-Fas антитело-подобная молекула (варианты), ДНК (варианты), вектор (варианты), полипептид, способ получения, использование антитела
RU2002103870A (ru) * 2000-05-18 2003-08-20 Джапан Тобакко, Инк. Человеческое моноклональное антитело против AILIM, костимулирующей молекулы передачи сигнала, и его фармацевтическое применение
WO2003022995A2 (en) * 2001-09-06 2003-03-20 Agensys, Inc. Nucleic acid and corresponding protein entitled steap-1 useful in treatment and detection of cancer

Also Published As

Publication number Publication date
AU2004319915A1 (en) 2005-12-01
US20090004109A1 (en) 2009-01-01
US20170275377A1 (en) 2017-09-28
US20130280163A1 (en) 2013-10-24
CN101258166A (zh) 2008-09-03
BRPI0418766A (pt) 2007-10-09
EP1742966A2 (en) 2007-01-17
WO2005113601A8 (en) 2007-06-28
BRPI0418766B1 (pt) 2019-04-30
MXPA06012187A (es) 2007-03-28
HK1102012A1 (en) 2007-11-02
JP4994224B2 (ja) 2012-08-08
NO340451B1 (no) 2017-04-24
CY1114855T1 (el) 2016-12-14
JP2008509880A (ja) 2008-04-03
US9023605B2 (en) 2015-05-05
US9617346B2 (en) 2017-04-11
PT1742966E (pt) 2014-02-05
PL1742966T3 (pl) 2014-04-30
AU2004319915B9 (en) 2011-12-22
ES2443996T3 (es) 2014-02-21
US11401347B2 (en) 2022-08-02
KR101215179B1 (ko) 2012-12-24
EP1742966B1 (en) 2013-11-27
IL178761A (en) 2014-06-30
NO20065366L (no) 2007-01-19
IL178761A0 (en) 2007-02-11
DK1742966T3 (da) 2014-02-03
AU2004319915B2 (en) 2011-07-14
US8008442B2 (en) 2011-08-30
CN101258166B (zh) 2013-01-30
NZ550816A (en) 2009-12-24
CA2563735A1 (en) 2005-12-01
HRP20140171T1 (hr) 2014-04-11
BRPI0418766B8 (pt) 2021-05-25
US10597463B2 (en) 2020-03-24
EA200601946A3 (ru) 2007-08-31
US20200247905A1 (en) 2020-08-06
EA200601946A2 (ru) 2007-06-29
WO2005113601A2 (en) 2005-12-01
SI1742966T1 (sl) 2014-03-31
US20150239986A1 (en) 2015-08-27
EP1742966A4 (en) 2008-04-02
KR20070034471A (ko) 2007-03-28
CA2563735C (en) 2020-07-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA014870B1 (ru) Антитела к белку steap-1 и их применение
CN101090729B (zh) 前列腺干细胞抗原(psca)变体及其序列
ES2532757T3 (es) Ácido nucleico y proteína correspondiente denominados STEAP-1 útiles en el tratamiento y la detección de cáncer
JP4490502B2 (ja) 癌の処置および検出において有用な２８２ｐ１ｇ３と称される、核酸および対応タンパク質
JP4177877B2 (ja) 癌の処置および検出において有用な１６１ｐ２ｆ１０ｂと称される、核酸および対応タンパク質
JP4299872B2 (ja) 癌の処置および検出において有用な１６１ｐ２ｆ１０ｂと称される、核酸および対応タンパク質
JP2011152132A (ja) 癌の処置および検出において有用な１０９ｐ１ｄ４と称される、核酸および対応タンパク質
JP2010110325A (ja) 癌の処置および検出において有用な１９３ｐ１ｅ１ｂと称される、核酸および対応タンパク質
KR101282396B1 (ko) Ｐｓｃａ 단백질에 결합하는 암 진단용 항체
JP2008509700A (ja) 癌の処置および検出において有用な５８ｐ１ｄ１２と称される核酸および対応するタンパク質
JP5840351B2 (ja) 癌の処置および検出において有用な９８ｐ４ｂ６と称される、核酸および対応タンパク質
JP2006508163A (ja) 癌の処置および検出において有用な２４ｐ４ｃ１２と称される、核酸および対応タンパク質
CN101223191B (zh) 与psca蛋白结合的抗体和相关分子
JP5122592B2 (ja) 癌の処置および検出において有用な２４ｐ４ｃ１２と称される、核酸および対応タンパク質
JP2005537797A (ja) 癌の処置および検出において有用な９８ｐ４ｂ６と称される、核酸および対応タンパク質