NO340451B1

NO340451B1 - Monoklonale antistoff betegnet X120.545.1.1. og gitt ATCC aksesjonsnummer PTA-5803 eller en humanisert form av nevnte antistoff som binder spesifikt til STEAP-1, en modifisert form derav, et rekombinant protein derav, et deponert hybridom, en vektor som koder for antistoffet eller fragmentet, farmasøytisk preparat derav, samt anvendelser derav, blant annet til fremstilling av et medikament.

Info

Publication number: NO340451B1
Application number: NO20065366A
Authority: NO
Inventors: Aya Jakobovits; Arthur B Raitano; Pia M Challita-Eid; Soudabeh Etessami; Juan J Perez-Villar; Karen J Morrison; Xiao-Chi Jia; Mary Faris; Jean Gudas
Original assignee: Agensys Inc
Priority date: 2004-04-22
Filing date: 2006-11-21
Publication date: 2017-04-24
Also published as: AU2004319915A1; US20090004109A1; US20170275377A1; EA014870B1; US20130280163A1; CN101258166A; BRPI0418766A; EP1742966A2; WO2005113601A8; BRPI0418766B1; MXPA06012187A; HK1102012A1; JP4994224B2; CY1114855T1; JP2008509880A; US9023605B2; US9617346B2; PT1742966E; PL1742966T3; AU2004319915B9

Description

Oppfinnelsens område

Oppfinnelsen som er beskrevet her vedrører antistoffer, i tillegg til fragmenter derav og molekyler som er fremstilt fra disse, som binder proteiner betegnet STEAP-1. Oppfinnelsen vedrører ytterligere diagnostiske, prognostiske, profylaktiske og terapeutiske fremgangsmåter og preparater som er nyttige i behandlingen av kreftformer som uttrykker STEAP-1.

Bakgrunn for oppfinnelsen

Kreft er den mest vanligste årsaken til dødsfall ved siden av hjertesykdom. På verdensbasis dør millioner av kreft hvert år. I USA alene, som rapportert fra the American Cancer Society, forårsaker kreft dødsfallene for godt over en halv million mennesker hvert år, med over 1,2 millioner nye tilfeller diagnostisert hvert år. Mens dødsfall som skyldes hjertesykdom har gått signifikant ned, er de som skyldes kreft generelt på vei oppover. I den tidligere delen av det neste århundre, er kreft spådd å bli den ledende årsaken til dødsfall.

På verdensbasis fremstår flere kreftformer som de ledende dødsårsakene. Spesielt representerer karsinomer i lunge, prostata kraft, brystkreft, tykktarmskreft, bukspyttkjertelkreft, ovariekreft og blærekreft de primære årsakene til kreftdødsfall. Disse og nesten alle andre karsinomer deler en felles dødelig egenskap. Med svært få unntak er metastatisk sykdom fra et karsinom fatalt. Selv for de kreftpasientene som i utgangspunktet overlever deres primære kreft, så har dessuten felles erfaring vist at deres liv blir dramatisk endret. Mange kreftpasienter opplever sterk angst drevet av bevisstheten om muligheten for tilbakefall eller behandlingssvikt. Mange kreftpasienter opplever fysiske svekkelser som følge av behandling. Videre opplever mange kreftpasienter et tilbakefall.

På verdensbasis er prostatakreft den fjerde mest utbredte kreftformen hos menn. I Nord Amerika og Nord Europa er den uten tvil den mest vanlige kreftformen hos menn og er den nest vanligste årsaken til død som skyldes kreft hos menn. I USA alene dør godt over 30 000 menn årlig av denne sykdommen - nummer to bak lungekreft. På tross av størrelsen på disse tallene foreligger det fremdeles ingen effektiv behandling for metastatisk prostatakreft. Kirurgisk prostatektomi, strålingsterapi, hormonablasjons-terapi, kirurgisk kastrering og kjemoterapi fortsetter å være de viktigste behandlings-metodene. Uheldigvis er disse behandlingene ikke effektive for mange, og er ofte assosiert med uønskede konsekvenser.

På den diagnostiske fronten forblir mangelen på en prostatatumor markør som nøyaktig kan påvise tidlig stadium, lokaliserte tumorer en signifikant begrensning i diagnostiseringen og behandlingen av denne sykdommen. Selv om serum prostata-spesifikt antigen (PSA)-analysen har vært et svært nyttig redskap, er likevel dens spesifisitet og generelle anvendelse bredt ansett å mangle på flere viktige punkter.

Fremskritt i å identifisere ytterligere spesifikke markører for prostatakreft har blitt

forbedret med genereringen av prostatakreft-xenografter som kan rekapitulere ulike stadier for sykdommen hos mus. LAPC (Los Angeles Prostate Cancer)-xenografter er prostatakreft-xenografter som har overlevd passasje i alvorlig kombinerte immunsvikt (SCID)-mus og har oppvist evnen til å etterligne overgangen fra androgen avhengig til androgen uavhengig

(Klein et al., 1997, Nat. Med., 3:402). Mer nylig identifiserte prostatakreft markører inkluderer PCTA-1 (Su et al., 1996, Proe. Nati. Acad. Sei., USA 93:7252), prostata spesifikt membran (PSM)-antigen (Pinto et al., Clin Cancer Res 1996, Sep 2 (9): 1445-51), STEAP (Hubert et al., Proe. Nati Acad Sei, USA, 1999, 7. desember, 96(25): 14523-8) og prostata stamcelleantigen (PSCA) (Reiter et al., 1998, Proe. Nati. Acad. Sei., USA 95: 1735).

Mens tidligere identifiserte markører slik som PSA, PSM, PCTA og PSCA har tilrettelagt innsatsene for å diagnostisere og behandle prostatakreft er det et behov for identifiseringen av ytterligere markører og terapeutiske mål for prostatakreft og beslektede kreftformer for ytterligere å forbedre diagnostisering og terapi.

Nyrecellekarsinom (RCC) står for omtrent 3 % av voksne maligne tilstander. Med en gang adenomer når en diameter på 2 til 3 cm, eksisterer det et malignt potensial. Hos voksne er de to viktigste maligne nyretumorene nyrecelle adenokarsinom og urotelialt karsinom i nyrebekkenet eller urinlederen. Forekomsten av nyrecelle adeno-karsinomer er beregnet til å være mer enn 29 000 tilfeller i USA og mer enn 11 600 pasienter døde av denne sykdommen i 1998. Urotelialt karsinom er mindre hyppig, med en forekomst på omtrent 500 tilfeller per år i USA.

Kirurgi har vært den primære terapien for nyrecelle adenokarsinom i mange tiår. Inntil nylig har metastatisk sykdom vært motstandsdyktig ovenfor enhver systemisk terapi. Med nyere utviklinger i systemiske terapier, spesielt immunterapier, kan metastatisk nyrecelle karsinom bli kontaktet aggressivt hos egnede pasienter med en mulighet for varige responser. Likevel er det et gjenværende behov for effektive terapier for disse pasientene.

Av alle nye tilfeller med kreft i USA står blærekreft for omtrent 5 % hos menn (den femte mest vanlige neoplasme) og 3 % hos kvinner (den åttende mest vanlige neoplasme). Forekomsten øker sakte, samtidig med en økende eldre populasjon. I 1998 var det omtrent 54 500 tilfeller, inkludert 39 500 i menn og 15 000 i kvinner. Den aldersjusterte forekomsten i USA er 32 per 100 000 for menn og åtte per 100 000 for kvinner. Det historiske menn/kvinner forholdet på 3:1 kan være avtagende på grunn av røkevaner hos kvinner. Det var omtrent 11 000 dødsfall som skyldes blærekreft i 1998 (7 800 for menn og 3 900 for kvinner). Blærekreft forekomst og dødelighet øker sterkt med alder og vil bli et økende problem etter som populasjonen blir eldre.

De fleste blærekreftformer dukker opp igjen i blæren. Blærekreft blir håndtert med en kombinasjon av transuretral reseksjon av blæren (TUR) og intravesikal kjemoterapi eller immunterapi. Den multifokale og tilbakevendende naturen til blærekreft peker på begrensningene med TUR. De fleste muskelinvasive kreftformer blir ikke kurert med TUR alene. Radikal cystektomi og urinavledning er de mest effektive måtene å eliminere kreften på, men bærer i seg en unektelit innvirkning på urinveis- og seksuell funksjon. Det er fortsatt et signifikant behov for behandlingsformer som er fordelaktig for blærekreft pasienter.

Anslagsvis 130 200 tilfeller med kolorektalkreft forekom i 2000 i USA, inkludert

93 800 tilfeller med tykktarmskreft og 36 400 med endetarmskreft. Kolorektale kreftformer er den tredje mest vanlige kreftformen hos menn og kvinner. Insidensen falt betydelig i løpet av 1992-1996 (-2,1 % per år). Forskning tyder på at disse nedgangene har skyldes økt screening og polyppfjerning, som hindrer progresjon av polypper til invasive kreftformer. Det var anslagsvis 56 300 dødsfall (47 700 fra tykktarmskreft, 8 600 fra endetarmskreft) i 2000, noe som står for omtrent 11 % av alle kreftdødsfall i USA.

Per i dag er kirurgi den mest vanlige formen for terapi for kolorektalkreft, og for kreftformer som ikke har spredd seg er den ofte kurativ. Kjemoterapi, eller kjemoterapi pluss stråling, blir gitt før eller kirurgi til de fleste pasienter hvis kreft har dypt perforert tarmveggen eller spredd seg til lymfeknutene. En permanent kolostomi (opprettelse av en mageåpning for eliminering av kroppsavfall) er av og til nødvendig for tykktarmskreft og er av og til nødvendig for endetarmskreft. Det fortsetter å være et behov for effektiv diagnostikk og behandlingsmetoder for kolorektalkreft.

Det var anslagsvis 164 100 nye tilfeller med lunge- og bronkiekreft i 2000, noe som står for 14 % av alle kreftdiagnosene i USA. Insidensen av lunge- og bronkiekreft avtar signifikant hos menn, fra en høyde på 86,5 per 100 000 i 1984 til 70,0 i 1996. På 1990-tallet begynte økningen blant kvinner å bremse. I 1996 var insidensen hos kvinner 42,3 per 100 000.

Lungekreft og bronkiekreft forårsaket omtrent 156 900 dødsfall i 2000, og stod dermed for 28 % av alle kreftdødsfall. I løpet av 1992-1996 minsket dødelighet fra lungekreft signifikant blant menn (-1,7 % per år), mens rater for kvinner fremdeles økte signifikant (0,9 % per år). Siden 1987 har flere kvinner dødd hvert år lungekreft enn av brystkreft, noe som i over 40 år var hovedårsaken for kreftdødsfall hos kvinner. Minkende lungekreftforekomst og dødelighet skyldes mest sannsynlig minkende røking blant folk i løpet av de foregående 30 år, imidlertid henger avtagende røykevaner blant kvinner etter det for menn. Det er bekymringsfult at selv om nedgangen i tobakks bruk hos voksne har avtatt, så øker tobakksbruken hos unge igjen.

Behandlings alternativer for lungekreft og bronkiekreft blir bestemt ved typen og stadiet for kreften og inkluderer kirurgi, strålingsterapi og kjemoterapi. For mange lokaliserte kreftformer er kirurgi vanligvis den valgte behandlingen. Fordi sykdommen vanligvis har spredd seg på det tidspunktet den blir oppdaget, blir strålingsterapi og kjemoterapi ofte nødvendig i kombinasjon med kirurgi. Kjemoterapi alene eller kombinert med stråling er den valgte behandlingen for småcellet lungekreft, og i dette regimet opplever en stor prosentandel av pasienter remisjon, som i noen tilfeller er langvarig. Det er imidlertid et kontinuerlig behov for effektiv behandling og diagnostiske tilnærminger for lungekreft og bronkiekreft.

Anslagsvis 182 800 nye invasive tilfeller av brystkreft var forventet å forekomme blant kvinner i USA i løpet av 2000. Omtrent 1 400 nye tilfeller av brystkreft var i tillegg forventet å bli diagnostisert hos menn i 2000. Etter en økning med omtrent 4 % per år på 1980-tallet, har brystkreft insidensen hos kvinner flatet ut på 1990-tallet til omtrent 110,6 tilfeller per 100 000.

I USA alene var det omtrent 41 200 dødsfall (40 800 kvinner, 400 menn) i 2000 som skyldes brystkreft. Brystkreft er den nest vanligste kreftdødsårsaken hos kvinner. Ifølge de nyeste dataene avtok dødelighetsratene signifikant i løpet av 1992-1996 med den største nedgangen hos yngre kvinner, både hvite og svarte. Disse nedgangene var sannsynligvis resultatet av tidligere påvisning og forbedret behandling.

Ved å ta hensyn til de medisinske forholdene og pasientens preferanser kan behandling av brystkreft involvere lumpektomi (lokal fjerning av tumor) og fjerning av lymfeknutene under armen, mastektomi (kirurgisk fjerning av brystet) og fjerning av lymfeknutene under armen, strålingsterapi, kjemoterapi eller hormonterapi. Ofte blir to eller flere fremgangsmåter benyttet i kombinasjon. Utallige undersøkelser har vist at, for en tidlig stadium sykdom, er langtidsoverlevelsesrater etter lumpektomi pluss radioterapi tilsvarende overlevelsesrater etter modifisert radikal mastektomi. Signifikante fremskritt i rekonstruksjonsteknikker tilveiebringer flere muligheter for brystrekonstruksjon etter mastektomi. Nylig har slik rekonstruksjon blitt utført samtidig med mastektomien.

Lokal fjerning av duktalt karsinom in situ (DCIS) med adekvate mengder av omkringliggende normalt brystvev kan forhindre den lokale tilbakekomsten av DCIS. Stråling av brystet og/eller tamoksifen kan redusere mulighetene for at DCIS forekommer i det gjenværende brystvevet. Dette er viktig fordi DCIS, hvis den ikke blir behandlet, kan utvikle seg til invasiv brystkreft. Likevel er det alvorlige bivirkninger eller følgetilstander av disse behandlingene. Det er derfor et behov for effektive brystkreft-behandlinger.

Det var anslagsvis 23 100 nye tilfeller av ovariekreft i USA i 2000. Den står for

4 % av alle kreftformer hos kvinner og rangerer som nummer to blandt gynekologiske kreftformer. I løpet av 1992-1996 sank insidensen av ovariekreft signifikant. Som en følge av ovariekreft var det omtrent 14 000 dødsfall i 2000. Ovariekreft forårsaker flere dødsfall enn noen annen kreftform i det kvinnelige, reproduktive systemet.

Kirurgi, strålingsterapi og kjemoterapi er behandlings alternativer for ovariekreft. Kirurgi inkluderer vanligvis fjerningen av en eller begge ovarier, egglederne (salpingo-ooforektomi), og livmoren (hysterektomi). I noen svært tidlige tumorer vil kun det involverte ovariet bli fjernet, spesielt hos yngre kvinner som ønsker å ha barn. I fremskreden sykdom blir det gjort et forsøk på å fjerne all intra-abdominal sykdom for å forsterke effekten av kjemoterapi. Det fortsetter å være et viktig behov for effektive behandlingstilbud for ovariekreft.

Det var anslagsvis 28 300 nye tilfeller av bukspyttkjertelkreft i USA i 2000. I løpet av de siste 20 årene har forekomsten av bukspyttkjertelkreft avtatt hos menn. Forekomst blant kvinner har forblitt omtrent konstant, men kan nå begynne å avta. Bukspyttkjertelkreft forårsaket anslagsvis 28 200 dødsfall i 2000 i USA. I løpet av de siste 20 årene har det vært en liten, men signifikant nedgang i dødelighetsrater blant menn (rundt -0,9 % per år), mens ratene har økt noe blant kvinner.

Kirurgi, strålingsterapi og kjemoterapi er behandlings alternativer for bukspyttkjertelkreft. Disse behandlings alternativer kan forlenge overlevelse og/eller lindre symptomer hos mange pasienter, men frembringer sannsynligvis ikke en kur for de fleste. Det er et signifikant behov for ytterligere terapeutiske og diagnostiske alternativer for kreftformer. Disse inkluderer anvendelse av antistoffer, vaksiner og små molekyler som behandlingsmetoder. I tillegg er det også et behov for å benytte disse metodene som forskningsredskaper for å diagnostisere, påvise, overvåke og fremme kunnskapen på området på alle områder for kreftbehandling og studier.

Oppsummering av oppfinnelsen

Oppfinnelsen tilveiebringer antistoffer betegnet X120.545.1.1. og gitt ATCC aksesjonsnummer PTA-5803 i tillegg til bindingsfragmenter derav og molekyler som er konstruert derfra som definert i krav 1, som binder STEAP-l-proteiner og polypeptidfragmenter av STEAP-l-proteiner. Som anvendt her er uttrykket STEAP-1 synonymt med 8P1D4. Oppfinnelsen omfatter polyklonale og monoklonale antistoffer, murine antistoffer og andre pattedyrantistoffer, kimære antistoffer, humaniserte og fullt humane antistoffer, og antistoffer merket med en påvisbar markør eller et terapeutisk middel. I visse utførelses-former er det et forbehold om at hele nukleinsyresekvensen ifølge Figur 2 ikke er kodet for og/eller hele aminosyresekvensen ifølge Figur 2 ikke er fremstilt. Hele nukleinsyresekvensen ifølge Figur 2 kan være kodet for og/eller hele aminosyresekvensen i Figur 2 kan være fremstilt, når begge foreligger i respektive humane enhetsdoseformer.

Beskrivelsen tilveiebringer ytterligere fremgangsmåter for å påvise tilstedeværelse og status for STEAP-l-polynukleotider og proteiner i ulike biologiske prøver, i tillegg til fremgangsmåter for å identifisere celler som uttrykker STEAP-1. Beskrivelsen tilveiebringer fremgangsmåter for å overvåke STEAP-l-genprodukter i et vev eller hematologiprøve som har eller som er mistenkt å ha en form av vekstfeilregulering slik som kreft.

Beskrivelsen tilveiebringer ytterlige ulike immunogener eller terapeutiske preparater og strategier for å behandle kreftformer som uttrykker STEAP-1- slik som kreftformer i vev som angitt i Tabell 1, inkludert terapier som er rettet på å inhibere transkripsjon, translasjon, prosessering eller funksjon til STEAP-1 i tillegg til kreftvaksiner. Beskrivelsen tilveiebringer preparater, og fremgangsmåter som omfatter dem, for behandling av en kreftform som uttrykker STEAP-1 i et humant individ der preparatet omfatter en bærer som er egnet til human anvendelse og en human enhetsdose av ett eller flere enn ett middel som inhiberer produksjonen eller funksjonen til STEAP-1. Fortrinnsvis er bæreren en unik, human bærer. Middelet kan være en enhet som er immunreaktiv med STEAP-1. Eksempler på slike enheter inkluderer antistoffer (slik som enkeltkjede antistoffer, monoklonale, polyklonale, humaniserte, kimære eller humane antistoffer), funksjonelle ekvivalenter derav (uansett om de er naturlig forekommende eller syntetiske) og kombinasjoner derav. Antistoffene kan være konjugert med en diagnostisk eller terapeutisk enhet. Middelet kan være et lite molekyl som definert her.

Middelet kan omfatte ett eller flere enn ett peptid som omfatter en cytotoksisk T-lymfocytt (CTL)-epitop som binder et HLA-klasse-I-molekyl i et menneske for å utløse en

CTL-respons overfor STEAP-1 og/eller et eller mer enn et peptid som omfatter en hjelper-T-lymfocytt (HTL)-epitop som binder et HLA-klasse-II-molekyl i et menneske for å utløse HTL-respons. Peptidene kan foreligge på det samme eller på ett eller flere separate polypeptid-molekyler. Middelet kan omfatte ett eller flere enn ett nukleinsyremolekyl som uttrykker én eller flere enn én av CTL- eller HTL-responsene som stimulerer peptider som beskrevet ovenfor. Ett eller flere enn ett nukleinsyremolekyl kan uttrykke en enhet som er immunologisk reaktiv med STEAP-1 som beskrevet ovenfor. Det ene eller det mer enn ene nukleinsyremolekylet kan også være, eller kode for, et molekyl som inhiberer produksjon av STEAP-1. Eksempler på slike molekyler inkluderer de som er komplementære med en nukleotidsekvens som er essensiell for produksjon av STEAP-1 (f. eks. antisensesekvenser eller molekyler som danner en trippelheliks med en nukleotiddobbelheliks som er essensiell for STEAP-l-produksjon) eller et ribozym som er effektivt til å lysere STEAP-l-mRNA.

Også tilveiebragt er antistoffepitoper som omfatter en peptidregion, eller et oligonukleotid som koder for peptidregionen, som har én, to, tre, fire eller fem av de følgende karakteristika: i) en peptidregion på minst 5 aminosyrer i et spesielt peptid ifølge Figur 3, i enhver heltallig økning opp til den fulle lengden av dette proteinet ifølge Figur 3, som inkluderer en aminosyreposisjon som har en verdi som er lik eller større enn 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, eller som har en verdi som er lik 1,0 i hydrofilisitetsprofilen ifølge Figur 5,

ii) en peptidregion på minst 5 aminosyrer i et spesielt peptid ifølge Figur 3, i enhver heltallig økning opp til den fulle lengden av dette proteinet ifølge Figur 3, som inkluderer en aminosyreposisjon som har en verdi som er lik med eller mindre enn 0,5, 0,4, 0,3, 0,2, 0,1, eller som har en verdi som er lik med 0,0, i hydropatisitetsprofil ifølge Figur 6,

iii) en peptidregion på minst 5 aminosyrer for et spesielt peptid ifølge Figur 3, i enhver heltallig økning opp til den fulle lengden av dette proteinet ifølge Figur 3, som inkluderer en aminosyreposisjon som har en verdi som er lik med eller større enn 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, eller som har en verdi som er lik med 1,0, i profilen over prosentvis tilgjengelige rester ifølge Figur 7,

iv) en peptidregion på minst 5 aminosyrer i et spesielt peptid ifølge Figur 3, i enhver heltallig økning opp til den fulle lengden av dette proteinet ifølge Figur 3, som inkluderer en aminosyreposisjon som har en verdi som er lik med eller større enn 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, eller som har en verdi som er lik med 1,0, i profilen over gjennomsnittlig fleksibilitet ifølge

Figur 8, eller

v) en peptidregion på minst 5 aminosyrer for et spesielt peptid ifølge Figur 3, i enhver økning med et heltall opp til den fulle lengden av dette proteinet ifølge Figur 3, som inkluderer en aminosyreposisjon som har en verdi som er lik 0, større enn 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, eller som har en verdi som er lik 1,0, i beta-svingprofilen ifølge Figur 9.

Foreliggende beskrivelse vedrører også et gen, betegnet STEAP-1, som har blitt funnet å være overuttrykt i kreftformen(e) som angitt i Tabell 1. Northern-blot-ekspresjonsanalyse av STEAP-l-genekspresjon i normale vev viser et begrenset ekspresjonsmønster i utviklede vev. Nukleotidsekvensen (Figur 2) og aminosyresekvensen (Figur 2 og Figur 3) for STEAP-1 er tilveiebrakt. Den vevsrelaterte profilen til STEAP-1 i normale utviklede vev, kombinert med overekspresjonen som er observert i vevene som er listet opp i Tabell 1, viser at STEAP-1 er avvikende overuttrykt i minst noen kreftformer, og virker på det vis som et nyttig diagnostisk, profylaktisk, prognostisk og/eller terapeutisk mål for kreftformer i vevet/vevene slik som de som er angitt i Tabell 1.

Beskrivelsen tilveiebringer polynukleotider som tilsvarer til eller er komplementære med hele eller deler av STEAP-l-genene, mRNA og/eller kodende sekvenser, fortrinnsvis i isolert form, inkludert polynukleotider som koder for STEAP-l-beslektede proteiner og fragmenter av 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 eller mer enn 25 kontinuerlige aminosyrer, minst 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 80, 85, 90, 95, 100 eller mer enn 100 kontinuerlige aminosyrer for et STEAP-1-beslektet protein, i tillegg til peptidene/proteinene selv, DNA, RNA, DNA/RNA-hybrider og beslektede molekyler, polynukleotider eller oligonukleotider som er komplementære med eller som har minst 90 % homologi med STEAP-l-genet eller mRNA-sekvensene eller deler derav, og polynukleotider eller oligonukleotider som hybridiserer med STEAP-1-gener, mRNA eller til STEAP-1-kodende polynukleotider. Også tilveiebrakt er måter å isolere cDNA og genene som koder for STEAP-1. Rekombinante DNA-molekyler som inneholder STEAP-1-polynukleotider, celler som er transformert eller transdusert med slike molekyler og vert-vektorsystemet for ekspresjonen av STEAP-l-genprodukter blir også tilveiebrakt.

Kort beskrivelse av figurene

Figur 1. STEAP-1-SSH-sekvensen på 436 nukleotider

Figur 2. cDNA- og aminosyresekvensen for STEAP-1-variant-1 (også kalt "STEAP-l-v.l" eller "STEAP-l-variant-1") er vist i Figur 2A. Startmetioninet er understreket. Den åpne leserammen strekker seg fra nukleinsyren 66-1085 inkludert stoppkodonet.

cDNA- og aminosyresekvensen til STEAP-l-variant-2 (også kalt "STEAP-l-v.2") er vist i Figur 2B. Kodon for startmetioninet er understreket. Den åpne leserammen strekker seg fra nukleinsyre 96-872 inkludert stoppkodonet.

cDNA- og aminosyresekvensen til STEAP-l-variant-3 (også kalt "STEAP-l-v.3") er vist i Figur 2C. Kodon for startmetioninet er understreket. Den åpne leserammen strekker seg fra nukleinsyre 96-944 inkludert stoppkodonet.

cDNA- og aminosyresekvensen til STEAP-l-variant-4 (også kalt "STEAP-1-v.4") er vist i Figur 2D. Kodon for startmetioninet er understreket. Den åpne leserammen strekker seg fra nukleinsyre 96-872 inkludert stoppkodonet.

cDNA- og aminosyresekvensen til STEAP-l-variant-5 (også kalt "STEAP-l-v.5") er vist i Figur 2E. Kodon for startmetioninet er understreket. Den åpne leserammen strekker seg fra nukleinsyre 96-872 inkludert stoppkodonet.

cDNA- og aminosyresekvensen til STEAP-l-variant-6 (også kalt "STEAP-1-v.6") er vist i Figur 2F. Kodon for startmetioninet er understreket. Den åpne leserammen strekker seg fra nukleinsyre 96-872 inkludert stoppkodonet.

cDNA- og aminosyresekvensen til STEAP-l-variant-7 (også kalt "STEAP-l-v.7") er vist i Figur 2G. Kodon for startmetioninet er understreket. Den åpne leserammen strekker seg fra nukleinsyre 96-872 inkludert stoppkodonet.

cDNA- og aminosyresekvensen til STEAP-l-variant-8 (også kalt "STEAP-1-v.8") er vist i Figur 2H. Kodon for startmetioninet er understreket. Den åpne leserammen strekker seg fra nukleinsyre 96-872 inkludert stoppkodonet.

cDNA- og aminosyresekvensen til STEAP-l-variant-9 (også kalt "STEAP-l-v.9") er vist i Figur 21. Kodon for startmetioninet er understreket. Den åpne leserammen strekker seg fra nukleinsyre 96-872 inkludert stoppkodonet.

cDNA- og aminosyresekvensen til STEAP-l-variant-10 (også kalt "STEAP-l-v.10") er vist i Figur 2J. Kodon for startmetioninet er understreket. Den åpne leserammen strekker seg fra nukleinsyre 96-872 inkludert stoppkodonet.

cDNA- og aminosyresekvensen til STEAP-l-variant-11 (også kalt "STEAP-l-v.ll") er vist i Figur 2K. Kodon for startmetioninet er understreket. Den åpne leserammen strekker seg fra nukleinsyre 96-872 inkludert stoppkodonet.

cDNA- og aminosyresekvensen til STEAP-l-variant-12 (også kalt "STEAP-l-v.12") er vist i Figur 2L. Kodon for startmetioninet er understreket. Den åpne leserammen strekker seg fra nukleinsyre 96-872 inkludert stoppkodonet.

cDNA- og aminosyresekvensen til STEAP-l-variant-13 (også kalt "STEAP-l-v.13") er vist i Figur 2M. Kodon for startmetioninet er understreket. Den åpne leserammen strekker seg fra nukleinsyre 96-872 inkludert stoppkodonet.

cDNA- og aminosyresekvensen til STEAP-l-variant-14 (også kalt "STEAP-1 -v. 14") er vist i Figur 2N. Kodon for startmetioninet er understreket. Den åpne leserammen strekker seg fra nukleinsyre 96-872 inkludert stoppkodonet.

cDNA- og aminosyresekvensen til STEAP-l-variant-15 (også kalt "STEAP-1-v. 15") er vist i Figur 20. Kodon for startmetioninet er understreket. Den åpne leserammen strekker seg fra nukleinsyre 96-872 inkludert stoppkodonet.

cDNA- og aminosyresekvensen til STEAP-l-variant-16 (også kalt "STEAP-l-v.16") er vist i Figur 2P. Kodon for startmetioninet er understreket. Den åpne leserammen strekker seg fra nukleinsyre 96-872 inkludert stoppkodonet.

cDNA- og aminosyresekvensen til STEAP-l-variant-17 (også kalt "STEAP-l-v.17") er vist i Figur 2Q. Kodon for startmetioninet er understreket. Den åpne leserammen strekker seg fra nukleinsyre 96-872 inkludert stoppkodonet. Som benyttet her inkluderer en referanse til STEAP-1 alle varianter derav, inkludert de som er vist i Figurene 10, 11 og/eller 12, hvis ikke konteksten klart indikerer noe annet.

Figur 3. Aminosyresekvens for STEP-l-v. 1 er vist i Figur 3A, den har 339 aminosyrer.

Aminosyresekvensen til STEAP-l-v.2 er vist i Figur 3B, den har 258 aminosyrer. Aminosyresekvensen til STEAP-l-v.3 er vist i Figur 3C, den har 282 aminosyrer. Aminosyresekvensen til STEAP-l-v.4 er vist i Figur 3D, den har 258 aminosyrer.

Som benyttet her inkluderer en referanse til STEAP-1 alle varianter derav, inkludert de som er vist i Figurene 10, 11 og/eller 12, hvis ikke konteksten klart indikerer noe annet. Figur 4. Figur 4A. Aminosyresekvenssammenstillingen av STEAP-l-v.l med TNFa-indusert adiposebeslektet protein fra mus (gi/16095133). Figur 4B. Aminosyresekvenssammenstillingen av STEAP-l-v.l med pHyde-protein fra rotte (gi/21717655/). Figur 4C. Viser homologi for STEAP-1 med seks transmembrane epitelantigen fra prostata hos mus (gi/20820492/). Figur 5. Hydrofilisitetsaminosyreprofil for STEAP-l-variant-1 (Figur 5(a)). Hydrofilisitetsaminosyreprofil for STEAP-l-variant-2 (Figur 5(b)), bestemt ved hjelp av datamaskin-algoritme-sekvensanalyse ved anvendelse av fremgangsmåten til Hopp og Woods (HoppT.P., Woods K.R., 1981. Proe. Nati. Acad. Sei., USA 78:3824-3828) som er tilgjengelig på ProtScale-websiden lokalisert på internett-URL ch/cgi-bin/protscaqle.pl) via ExPasy-molekylærbiologi serveren. Figur 6. (Figur 6(a)). Hydropatisitetsaminosyreprofil for STEAP-l-variant-1. (Figur 6(b)). Hydropatisitetsaminosyreprofil for STEAP-l-variant-3, bestemt ved hjelp av datamaskin-algoritme-sekvensanalyse ved å anvende fremgangsmåten til Kyte og Doolittle (Kyte J., Doolittle R.F., 1982, J. Mol. Biol., 157:105-132) som er tilgjengelig på ProtScale-websiden lokalisert på internett-URL expasy.ch/cgi-bin/protscale.pl) via ExPasy-molekylærbiologi serveren. Figur 7. (Figur 7(a)). Profilen over prosentvise tilgjengelige aminosyre rester for STEAP-l-variant-1. (Figur 7(b)). Profilen over prosentvise tilgjengelige aminosyre rester STEA-l-variant-3, bestemt ved hjelp av datamaskin-algoritme-sekvensanalyse ved å anvende fremgangsmåten til Janin (Janin J., 1979 Nature 277:491-492) som er tilgjengelig på ProtScale websiden lokalisert på internett-URL expasy.ch/cgi-bin/protscale.pl) via ExPasy-molekylærbiologiserveren. Figur 8. (Figur 8(a)). Profilen over gjennomsnittlig aminosyre fleksibilitet for STEAP-l-variant-1. (Figur 8(b)). Profilen over gjennomsnittlig aminosyre fleksibilitet for STEAP-l-variant-3, bestemt ved hjelp av datamaskin-algoritme-sekvensanalyse ved å anvende fremgangsmåten til Bhaskaran og Ponnuswarny (Bhaskaran R. og Ponnuswarny P.K., 1988, Int. J. Pept. Protein Res. 32:242-255) som er tilgjengelig på ProtScale-websiden lokalisert på internett-URL expasy-ch/cgi-bin/protscale.pl) via ExPasy-molekylærbiologi serveren. Figur 9 (Figur 9(a)). Beta-sving-aminosyreprofil for STEAP-l-variant-1. (Figur 9(b)). Beta-sving-aminosyreprofil for STEAP-l-variant-3, bestemt ved hjelp av datamaskin-algoritme-sekvensanalyse ved å anvende fremgangsmåten til Deleage og Roux (Deleage, G., Roux B. 1987, Protein Engineering, 1:289-294) tilgjengelig på ProtScale-websiden lokalisert på internett-URL expasy.ch/cgi-bin/protscale.pl) via ExPasy-molekylær biologi-serveren. Figur 10. Skjematisk sammenstilling av SNP-varianter av STEAP-1. Varianter av STEAP-l-v.4 til -v.17 er varianter med enkeltnukleotidforskjeller sammenlignet med STEAP-l-v.2. Selv om disse SNP-variantene er vist separat, kan de også foreligge i enhver kombinasjon og i enhver transkriptvariant som inneholder baseparene, f. eks. STEAP-l-v.l og -v.3. Tall tilsvarer de for STEAP-l-v.2. Sort boks viser den samme sekvensen som STEAP-l-v.2. SNPer er indikert over boksen. Figur 11. Exonsammensetningen av transkriptvarianter av STEAP-1. Figuren viser strukturen til transkriptvariantene uten poly-A-hale. Variantene STEAP-l-v.2, -v.2 og -v.3 er transkriptvarianter som deler de samme exonene 2 og 3. Det første exon i STEAP-l-v.l er 30 baser kortere på 5' enden enn de første exonene på de andre to transkriptvariantene. Det fjerde exon i STEAP-l-v.2 er det samme som det kombinerte exon 4, intron 4 og exon 5 i STEAP-l-v.l. Sammenlignet med STEAP-l-v.l har variant STEAP-l-v.3 et ytterligere exon spleiset ut fra intron-4 i STEAP-l-v.l. Lengde på intron og exon er ikke proporsjonale. Figur 12. Skjematisk sammenligningsstilling av proteinvarianter av STEAP-1. Proteinvarianter tilsvarer nukleotidvarianter. Nukleotidvariantene STEAP-l-v.5 til -v.17 i Figur 10 koder for det samme proteinet som STEAP-l-v.2. Proteiner som er translatert fra transkriptvariantene STEAP-l-v.l og -v.3 som vist i Figur 11 kan inneholde aminosyre F(Phe)- eller L(Leu) i posisjon 169. Enkeltaminosyreforskjeller er indikert over boksene. Svarte bokser representerer den samme sekvensen til STEAP-l-v.l. Bokser med ulike mønstre av fyll viser ulike sekvenser. Tall under boksen svarer til STEAP-l-v.l. Figur 13. Figurene 13(a)-(c). Sekundærstruktur- og transmembran-domener prediksjon for STEAP-1-proteinvarianter. Sekundærstrukturen til STEAP-l-protein-varianten-1 (Sekv. id. nr. 46), -2 (Sekv. id. nr. 47) og -3 (Sekv. id. nr. 48), (henholdsvis Figurene 13a-13c) ble predikert ved å anvende HNN - Hierachical Neural Network method (Guermeur, 1997, lhttp:// pbil. ibcp. fr/ cqi- bin/ npsa automat. pl?paqe=npsa nm. htmlb, tilgjengelig fra ExPasy-molekylærbiologi-serveren lokalisert på internettsiden (.expasy.cn/tools/). Denne fremgangsmåten predikerer tilstedeværelsen og lokaliseringen av alfahelikser, forlengede tråder, og tilfeldige spiraler fra den primære proteinsekvensen. Prosentandelen av proteinet i en gitt sekundærstruktur er også gitt. Figurene 13(11), 13(f) og 13(h): Skjematisk representasjon av sannsynligheten for eksistens av transmembrane regioner og orientering av STEAP-1-variant 1-3, (henholdsvis Figurene 13(d), 13(f) og 13(h), basert på TMpred-algoritmen til Hofmann og Stoffel som benytter TMBASE (K. Hofmann, W. Stoffel. TMBASE - A database of membrane spanning protein segments, Biol. Chem., Hoppe-seyler, 374:166, 1993). Figurene 13(6), 13(g) og 13(i): Skjematiske representasjoner av muligheten for eksistensen av transmembrane regioner og den ekstracellulære og intracellulære orienteringen av STEAP-l-variantene 1-3, henholdsvis Figurene 13(e), 13(g) og 13(i), basert på TMHMM-algoritmen til Sonnhammer, von Heijne og Krogh (Erik L.L. Sonnhammer, Gunnar von Heijne og Anders Krogh: A hidden Markov model for predicting transmambrane helices in protein sequences. I Proe. Of Sixth Int. Conf. on Intelligent Systems of Molecular Biology, s. 175-182, red. J. Glasgow, T. Littlejohn, F. Major, R. Lathrop, D. Sankoff og C. Sensen, Menlo Park, CA:AAAI Press, 1998). TMpred-og TMHMM-algoritmene er tilgjengelige fra ExPasy-molekylærbiologi-serveren lokalisert på internettsiden (.expasy.ch/tools/). Figur 14. Figur 14a. Ekspresjon av STEAP-1 i magekreft pasientprøver. RNA ble ekstrahert fra normalmage (N) og fra 10 ulike magekreftpasientprøver (T). Northern-blott med 10 ug totalt RNA/spor ble probet med STEAP-l-sekvens. Resultater viser sterk ekspresjon av en STEAP-1 på omtrent 1.6 kb i magetumorvevene. Det nedre panelet representerer etidiumbromidfarging av blottet som viser kvaliteten for RNA-prøvene. Figur 14b. STEAP-1-ekspresjon i endetarmskreft pasientprøver. RNA ble ekstrahert fra normalt endetarm (N), endetarmskreftpasienttumorer (T) og endetarmskreft-metastaser (M). Northern-blott med 10 ug totalt RNA ble probet med STEAP-1-sekvensen. Resultater viser sterk ekspresjon av STEAP-1 i endetarmskreftpasientvevene. Det lavere panelet representerer etidiumbromidfarging av blottet som viser kvaliteten på RNA-prøvene. Figur 14c. Ekspresjon av STEAP-1 i humane navlevene endotelceller (HUVEC). Førstetråd-cDNA ble fremstilt fra HUVEC-celler, LAPC-4AD- og LAPC-9AD-prostatkreft-xenografter, i tillegg til fra humant hjernevev. Normalisering blir utført ved hjelp av PCR ved å anvende primere for aktin og GAPDH. Semi-kvantitativ PCR, ved å anvende primere for STEAP-1, ble utført ved 27 og 30 sykluser med amplifisering (A). Som en kontroll er PCR som benytter primere for aktin vist i (B). Resultater viser sterk ekspresjon av STEAP-1 i HUVEC-celler tilsvarende til ekspresjon som er påvist i prostata kreft-xenograftvev. Ekspresjon av STEAP-1 i HUVEC-celler indikerer at målsøking av STEAP-1 også kan målsøke endotelceller i neovaskulatur fra tumorene. Figur 14(d) og Figur 14(e). STEAP-1- ekspresjon i normalt vev og kreftvev. Førstetråd-cDNA ble fremstilt fra normale vev (blære, hjerne, hjerte, nyre, lever, lunge, prostata, milt, skjelettmuskel, testikler, pankreas, kolon og mage) og fra samlinger av pasientkreftprøver (prostatakreftsamling, blærekreftsamling, nyrekreftsamling, tykktarmskreftsamling, lungekreftsamling, ovariekreftsamling, brystkreftsamling, kreftmetastasesamling, bukspyttkjertelkreftsamling, prostatakreft xenograftsamling og prostata metastase til lymfeknutesamling. Normalisering ble utført ved PCR ved å anvende primere for aktin. Semi-kvantitativt PCR, ved å anvende primere for STEAP-1, ble utført ved 26 og 30 sykluser med amplifisering. I (Figur 14d) er bildet av RT-PCR-agarosegelen vist. I (Figur 14e) ble PCR-produkter kvantifisert ved å anvende Alphalmager-programvare. Resultater viser sterk ekspresjon av STEAP-1 i normal prostata blant alle de normale vevene som ble testet. Oppregulering av STEAP-1-ekspresjon ble påvist i prostatakreftsamling, blærekraftsamling, nyrekreftsamling, tykktarmskreftsamling, lungekreftsamling, ovariekreftsamling, brystkreftsamling og bukspyttkjertelkreftsamling. Sterk ekspresjon av STEAP-1 ble påvist i kreftmetastasesamling, prostatakreft xenograftsamling og prostatametastase i lymfeknute. Figur 14(f): STEAP-1-ekspresjon i lymfompasientprøver. Førstetråd-cDNA ble fremstilt fra et panel av lymfompasientprøver. Normalisering ble utført ved hjelp av PCR ved å anvende primere for aktin. Semi-kvantitativ PCR ble, ved å anvende primere for STEAP-1, utført ved 26 og 30 sykluser med amplifisering. Prøver ble kjørt på en agarosegel og PCR-produkter ble kvantifisert ved å anvende Alphalmager-programvare. Ekspresjon ble registrert som sterk eller medium, hvis signal er påvist som henholdsvis 26 eller 30 sykluser med amplifisering, og fraværende hvis ikke noe signal er påvist selv ved 30 sykluser med amplifisering. Resultater viser ekspresjon av STEAP-1 i 8 av 11 (72,7 %) tumorprøver som ble testet. Figur 15. Spesifikk celleoverflatefaring fra STEAP-1 ved MAb M2/92.30. Venstre paneler: FACS-analyse av rekombinante 3T3- og Ratl-celler som stabilt uttrykker enten STEAP-1 (mørke linjer) eller et kontrollneomycinresistesgen (lyse linjer) farget med anti-STEAP-MAb M2/92.30 (10 ug/ml) og celleoverflatebundet MAb ble påvist med et geit-anti-muse-IgG-PE-konjugert sekundært reagens. De fargede cellene ble deretter underkastet FACS-analyse. Som indikert ved fluorescensskiftet i Ratl-STEAPl- og 3T3-STEAPl-cellene sammenlignet med de respektive kontrollcellene binder MAb M2/92.30 spesifikt til celleoverflate-STEAPl. Høyre panel: Fluorescensmikroskopi av 3T3-STEAP1-celler farget med MAb M2/92.30 som viser lys celleoverflatefluorescens. Figur 16. STEAP1 M2/92.30-MAb gjenkjenner celleoverflate-STEAP-1 på humane prostatakreft xenografter

LAPC9-prostatakreftcelle ble farget med 10 ug/ml med enten MAb M2/92.30 eller med en kontroll-anti-KLH-MAb. Overflatebundet MAb ble påvist med geite-anti-muse-IgG-PE-konjugert sekundært Ab. Fargede celler ble deretter underkastet FACS-analyse. Disse resultatene viser at anti-STEAPl-MAb M2/120.545 spesifikt binder endogen celleoverflate-STEAPl uttrykt i prostatakreft xenograftceller.

Figur 17. STEAP1 Ms/92.30 MAb gjenkjenner muse-STEAP-1. 293T-celler ble transient transfektert med enten pCDNA3.1 som koder for det murine STEAP-1 cDNA eller med en tom vektor. 2 dager senere ble cellene høstet og farget med anti-STEAPl-MAb M2/92.30 (10 ug/ml) og celleoverflatebundet MAb ble påvist med et geit-anti-IgG-PE-konjugert sekundært reagens. Celler ble deretter underkastet FACS-analyse. Som indikert ved fluorescensskiftet for 293T-cellene som er transfektert med murint STEAP1 sammenlignet med cellene som er transfektert med den tomme vektoren, binder MAb M2/92.30 spesifikt til murint STEAPl-protein. Figur 18. STEAP1/120.545-MAb gjenkjenner celleoverflate-STEAP-1. Panel A og Panel B. 3T3-neo- (A, fylte histogrammer) og 3T3-STEAPl-celler (A, ingen fylte histogrammer) og Ratl-neo- (B, fylte histogrammer) og Ratl-STEAP-celle (B, ingen fylte histogrammer) ble farget med MAb M2/120.545 (10 ug/ml) og overflatebundet MAb ble påvist med geit-anti-muse-IgG-PE-konjugert sekundært Ab. Celler ble underkastet FACS-analyse. Som indikert ved fluorescensskifte for 3T3-STEAP1- og Ratl-STEAPl-cellene sammenlignet med deres respektive neo-kontroller, binder MAb-M2/120.545 spesifikt celleroverflate STEAP1. Panel C. LNCaP-celler ble farget med enten MAb-M2/120.545 eller et kontroll-anti-KLH-MAb og underkastet FACS-analyse som ovenfor. Panel D. Fluorescensmikroskopi av M2/120.545-fargede LNCaP-celler viser lys celleoverflatefluorescens. Disse resultatene viser at M2/120.545-MAb spesifikt binder endogent celleoverflate-STEAPl på LNCaP-celler. Figur 19. Figur 19(a). cDNA- (Sekv. id. nr. 49) og aminosyresekvensen (Sekv. id. nr. 50) for M2/X92.30-VH-klon-2. Figur 19(b) cDNA- (Sekv. id. nr. 51) og aminosyresekvensen (Sekv. id. nr. 52) til M2/X90.30-VL-kolon-2. Figur 19(c) cDNA- (Sekv. id. nr. 53) og aminosyresekvensen (Sekv. id. nr. 54) til M2/X92.30-VL-klon-6. Figur 19(d) cDNA- (Sekv. id. nr. 55) og aminosyresekvensen (Sekv. id. nr. 56) til M2/X120.545-VL-klon-8. Figur 20. Figur 20a. Aminosyresekvensen (Sekv. id. nr. 57) til M2/X92.30-VL-klon-2. Figur 20b. Aminosyresekvensen (Sekv. id. nr. 58) til M2/X92.30-VL-klon-2. Figur 20c. cDNA- (Sekv. id. nr. 59) og aminosyresekvensen (Sekv. id. nr. 60) til M2/X92.30-VL-klon-6. Figur 20d. Aminosyresammenstilling av M2/X92.30-VL-klon-2 (Sekv. id. nr. 61) og M2/M92.30-VL-klon-6 (Sekv. id. nr. 62). Figur 20e. Aminosyresekvensen (Sekv. id. nr. 62) til M2/X120.545-VL-klon-8.

Sekvensen til signalpeptidet er understreket.

Figur 21. STEAPl-M2/92.30-Mab gjenkjenner celleoverflate-STEAP-1 på humane prostata- og blærekreft xenografter. UGBl-blærekreftceller (venstre panel) og LAPC9-prostatakreftceller (høyre panel) ble farget med 10ug/ml med enten MAb-M2/92.30 eller med et kontroll-anti-KLH-MAb. Overflatebundet MAb ble påvist med geit-anti-muse-IgG-PE-konjugert sekundært Ab. Fargede celler ble deretter underkastet FACS- analyse. Disse resultatene viser at anti-STEAPl-MAb-M2/92.30 spesifikt binder endogent celleoverflate-STEAPl uttrykt på blære- og prostatakreftxenograftceller.

Figur 22. STEAP-1-internalisering ved STEAPl/92.30-MAb. 3T3-STEAP1-celler ble farget ved 4°C med M2/92.30-Mab (10^g/ml), vasket, deretter inkubert med geit-anti-muse-IgG-PE-konjugert sekundært Ab ved 4°C. Halvparten av cellene ble flyttet til 37°C i 30 minutter og den andre halvdelen forble ved 4°C. Celler fra hver behandling ble deretter underkastet fluorescensmikroskopi. Celler som forble ved 4°C viste lys "ringlignende" celleoverflatefluorescens. Celler som ble flyttet til 37°C viste tap av den "ringlignende" celleoverflatefluorescensen og fremkomsten av punktlignende og aggregert fluorescens som er indikativ på capping og internalisering. Figur 23. STEAP- 1-internalisering ved STEAP 1-M2/120.545-MAb. PC3-STEAPl-celler ble farget ved 4°C med M2/120.545-MAb (10ug/ml), vasket, deretter inkubert med geit-anti-muse-IgG-PE-konjugert sekundært Ab. Halvparten av cellene ble flyttet til 37°C i 30 minutter og den andre halvdelen forble ved 4°C. Celler fra hver behandling ble deretter usatt for fluorescensmikroskopi. Celler som forble ved 4°C viste lys "ringlignende" celleoverflatefluorescens. Celler som ble flyttet til 37°C viste tap av den "ringlignende" celleoverflatefluorescensen og fremkomsten av punktmessig og aggregert fluorescens som er indikativ på capping og internalisering. Figur 24. STEAP-1-internalisering. Anti-muse-IgG - saporinkonjugater (Advanced Targeting Systems, San Diego, CA) ble benyttet for å vise at murint Steap-1-M2/120.545 går inn i målceller via ekspresjon av Steap-1 på overflaten av LNCaP-celler. De følgende protokollene ble benyttet. LNCaP-celler ble platet ved 5000 celler/90 ul/brønn på en 96-brønners plate og inkubert over natt. Sekundære immunotoksinkonjugater (anti-muse-IgG-saporin og anti-geit-IgG-saporin) eller anti-muse-IgG ble fremstilt i cellekultur-medium for å gi en sluttkonsentrasjon på 100 ng/ml. Det primære antistoffet ble tilsatt ved konsentrasjoner fra 1 - 1000 ng/ml. Platene ble inkubert i 72 timer og levedyktigheten ble bestemt ved hjelp av MTT-analyse. Resultatene viser at LNCaP-celler ble drept i nærvær av M2/120.545 og anti-muse-IgG-saporin. Ingen effekter ble påvist med verken det sekundære antistoffet alene (anti-muse-IgG) eller ikke-spesifikke sekundære antistoffkonjugater (anti-geit-IgG-saporin). Ingen toksisitet ble observert med det primære antistoffet (M2/120.545) alene testet opp til 1 ng/ml). Figur 25. Immunpresipitering av STEAP1 ved anti-STEAP-l-MAb-M2/92.30 og M2/120.545. 3T3-STEAP1- og 3T3-neo-celler ble lysert i RIPA-buffer (25 mM Tris-HCI, pH 7,4, 150 mM NaCI, 0,5 mM EDTA, 1 % Triton X-100, 0,5 % deoksykolsyre, 0,1 % SDS og proteaseinhibitorcocktail). Cellelysatene ble forhåndsklaret med protein-G-sefarosekuler og deretter inkubert med 5 ng av enten MAb M2/92.30 eller M2/120.545 i 2 timer ved romtemperatur. Protein-G-kuler ble tilsatt og blandingen ble ytterligere inkubert i 1 time. Immunkompleksene ble vasket og løseliggjort i SDS-PAGE-prøvebuffer. De løseliggjorte prøvene ble deretter underkastet SDS-PAGE og Western-blot-analyse ved å anvende et kanin-anti-STEAP-pAb. Helcellelysater av 293T-celler transfektert med STEAP1 ble også kjørt som en positiv kontroll. Et immunreaktivt bånd på~37 kD ble kun sett i prøvene som er avledet fra 3T3-STEAP1 -celler, noe som er indikativt på spesifikk immunpresipitering av STEAP1 med både M2/92.30 og M2/120.545 MAb. Figur 26. Effekt av STEAP-1-MAb på veksten av LAPC9 humane prostatakreft xenografter hos mus. STEAP-l-Ms/92.30 og -M2/120.545 ble testet med to ulike doser på 100 ng og 500 ng. PBS og anti-KLH-MAb ble benyttet som kontroller. Studie kohorten bestod av 6 grupper med 10 mus i hver gruppe. MAb ble dosert IP to ganger i uken med totalt 12 doser, ved å starte på den samme dagen som tumorcelleinjeksjon. Tumorstørrelse ble overvåket med passer målinger to ganger i uken. Den lengste dimensjonen (L) og dimensjonen nitti grader på denne (W) ble tatt for å beregne tumorvolum ved å anvende formelen: W<2>x 172. Serum-PSA-konsentrasjon på behandlingsdag 40 for hvert dyr ble målt ved å anvende kommersielt ELISA-sett. Kruskal-Wallis-testen og Mann-Whitney-U-testen ble benyttet for å evaluere forskjeller i tumorvekst og PSA-nivå i gruppene. Alle tester var tosidede med a=0,05. Dataene viser at STEAP-1-M2/92.30 og - M2/120.545 vesentlig bremser veksten på humane prostata xenografter på en doseavhengig tumor. Figur 27. Effekt av STEAP-1-M Ab på veksten av LAPC9 humane prostatakreft xenografter i mus. STEAP-1-M2/92.30 og -M2/120.545 ble testet ved to ulike doser på 100 ng og 500 ng- PBS og anti-KLH-MAb ble benyttet som kontroller. Undersøkelsesmengden bestod av 6 grupper med 10 mus i hver gruppe. MAb ble dosert IP to ganger i uken med totalt 12 doser ved å starte på den samme dagen som tumorcelleinjeksjon. Tumorstørrelse ble overvåket ved hjelp av målepasser målinger to ganger i uken. Den lengste dimensjonen (L) og dimensjonen nitti grader på denne (W) ble tatt for å beregne tumorvolum ved å anvende formelen W<2>x L/2. Serum-PSA-konsentrasjon på behandlingsdag 40 for hvert dyr ble målt ved å anvende kommersielt ELISA-sett. Kruskal-Wallis-testen og Mann-Whitney-U-testen ble benyttet for å evaluere forskjeller i tumorvekst og PSA-nivå i gruppene. Alle tester var tosidede med a = 0,05. Resultatene viserat STEAP-1-M2/92.30 og -M2/120.545 vesentlig bremser veksten på humane prostata xenografter i en doseavhengig tumor. Figur 28. STEAP-1-indusert ERK-1- og ERK-2-fosforylering. Venstre paneler: PC3-celler ble transfektert med neomycinresistensgen alene eller med STEAP-1 i pSRcc-vektor. Celler ble dyrket over natt i 0,5 % FBS, deretter stimulert med 10 % FBS i 5 minutter med eller uten 10 \ ig/ m\ MEK-inhibitor PD98058. Cellelysater ble separert ved hjelp av 12,5 % SDS-PAGE og Western-blottet med anti-fosfo-ERK (cellesignalisering) og anti-ERK(Zymed). Høyre paneler: NIH-3T3-celler ble transfektert med neomycinresistensgen alene eller med STEAP-1 i pSRcc-vektor. Celler ble behandlet som ovenfor, men uten MEK-inhibitoren. I tillegg ble NIH-3T3-neo-celler behandlet med 10 mg/ml Na- salisylat. Ekspresjon av STEAP-1 induserer fosforyleringen av ERK-1 og ERK-2 i serum og ble inhibert av oppstrøms-MEK-kinaseinhibitoren PD98058. Figur 29. STEAP-1 medierer celle-celle-kommunikasjon. PC3-celler ble transfektert med neomycinresistensgenet alene eller med STEAP-1 eller et kontrollgen i pSRcc-vektor. Mottakerceller ble merket med 1 mg/ml dekstran-Texasrødt og donorceller ble merket med 2,5 ng/ml kalcein-AM. Donor- (grønt) og mottaker (rødt)-cellene ble dyrket sammen ved 37°C i 18-24 timer og analysert ved hjelp av mikroskopi for ko-lokaliseringen av fluorescensfargestoffer. Venstre panel: PC3-neo-celler ble benyttet som både donor og mottaker. Midtre panel: PC3-STEAP-l-celler ble benyttet som både donor og mottaker. Høyre panel: PC3-kontrollceller ble benyttet som både donor og mottaker. STEAP-1 induserte overføringen av kalcein til celler som inneholder dekstran-Texasrødt, noe som indikerer at STEAP-1 fremmer celle-celle-kommunikasjon. Figur 30. Cellekommunikasjon fordrer STEAP-1-ekspresjon på donor- og mottakerceller. PC3-celler ble transfektert med neomycinresistensgen alene eller med STEAP-1 i pSRcc-vektor. Mottakerceller ble merket med 1 mg/ml dekstran-Texasrødt og donorceller ble merket med 2,5ng/ml kalcein-AM. Donor (grønt) og mottaker (rødt)-celler ble dyrket sammen ved 37°C i 18-24 timer og analysert ved hjelp av mikroskopi for ko-lokaliseringen av fluorescensfargestoffene. Øvre paneler: Lysmikroskopi, lavere paneler: UV-fluorescens. Venstre paneler: PC3-neo-celler var både donor og mottaker. Midtre panel: PC3-neo var donorceller og PC3-STEAP-1 var mottaker. Høyre paneler: PC3-STEAP-1-celler var både donor og mottaker. Kun når STEAP-1 ble uttrykt på både donor og mottaker, ble celle-cellekommunikasjon påvist. Figur 31. STEAP-1/120.545-MAb-effekt på åpningsovergang. PC3-celler ble transfektert med neomycinresistensgen alene eller med STEAP-1 i pSRcc-vektor. Mottakerceller ble merket med 1 mg/ml dekstran/Texasrødt og donorceller ble merket med 2,5 nl/ml klacein-AM. Donor (grønt) og mottaker (rødt) celler ble dyrket sammen ved 37°C i 18-24 timer og analysert ved hjelp av mikroskopi for ko-lokaliseringen av fluorescensfargestoffene. I alle eksperimenter ble de samme cellene benyttet som donor og akseptor. Celler ble inkubert med de indikerte mengdene av STEAP-1-120.545-MAb i 10 minutter før utplating og MAb ble opprettholdt i kultur i 24 timer før analyse. STEAP1/120.545 reduserer STEAP- 1-mediert "gap-junction" på en doseavhengig måte. Figur 32. Inhibering av ERK-1- og ERK-2-fosforylering ved STEAP-1-MAb og RNAI. PC3-celler ble transfektert med neomycinresistensgen alene eller med STEAP-1 og MAb i pSRcc-vektor. For RNAi-knockdown, ble PC3-STEAP-l-celler stabilt transfektert med en pPUR-U6-27-STEAP-l-vektor inneholdende siRNA for STEAP-1. Celler ble sultet i 0,1 % FBS i 18 timer ved 37°C, plassert på is i 10 minutter med eller uten 10 ng/ml M2/92.30-MAb, brakt til RT i 3 minutter og deretter stimulert med 10 % FBS i 5 minutter. Celler ble lysert i RIPA-buffer, helcellelysater ble separert ved hjelp av 12,5 % SDS-PAGE og proteiner ble påvist ved hjelp av Western blotting. Fosfo-ERK ble påvist med kanin

antiserum (cellesignalisering) og ERK ble påvist med kanin-anti-ERK (Zymed). STEAP-1 ble påvist med sau-anti-STEAP-1 og aktin ble påvist med anti-aktin-MAb (Santa Cruz). ERK-1-og ERK-2-fosforylering ble begge indusert med 10 % serum og ble inhibert med M2/92.30-MAb og siRNA for STEAP-1.

Figur 33. Effekt av STEAP-1-RNAi på celle-celle-kommunikasjon. PC3-celle ble transfektert med neomycinresistensgen alene eller med STEAP-1 i pSRa-vektor. For RNAi-knockdown ble PC3-STEAP-l-celler stabilt transfektert med en pPUR-U6-27-STEAP-l-vektor inneholdende siRNA for STEAP-1 eller en tom vektor. Mottakercelle ble merket med 1 mg/ml dekstran-Texasrødt og donorceller ble merket med 2,5 ng/ml kalcein-AM. Donor (grønt) og mottaker (rødt)-celler ble dyrket sammen ved 37°C i 18-24 timer og analysert ved hjelp av mikroskopi for ko-lokaliseringen av fluorescensfargestoffer. I alle eksperimenter ble de samme cellene benyttet som donor og akseptor. Spesifikt STEAP-1-RNAi stabilt uttrykt i PC3-STEAP-l-celler reduserer den STEAP-1-induserte celle-celle-kommunikasjonen.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Oversikt over avsnitt

I. ) Definisjoner

II. ) STEAP-l-polynukleotider

ILA.) Anvendelser av STEAP-l-polynukleotider

II.A.l.) Overvåking av genetiske unormalheter

II.A.2.) Antisens-utførelsesformer

II.A.3.) Primere og primerpar

II.A.4.) Isolering av STEAP-l-kodende nukleinsyremolekyler

II.A.5.) Rekombinante nukleinsyremolekyler og vert-vektor-systemer

III. ) STEAP-l-beslektede proteiner

ULA.) Motivbærende proteinutførelsesformer

III.B.) Ekspresjon av STEAP-l-beslektede proteiner

III.C.) Modifiseringer av STEAP-l-beslektede proteiner

ULD.) Anvendelser av STEAP-l-beslektede proteiner

IV. ) STEAP-l-antsitoffer

V. ) STEAP-l-cellulære immunresponser

VI. ) STEAP-l-transgene dyr

VII. ) Fremgangsmåter for påvisning av STEAP-1

VIII. ) Fremgangsmåter for å overvåke statusen til STEAP-l-beslektede gener og deres

produkter

IX. ) Identifisering av molekyler som interagerer med STEAP-1

X. ) Terapeutiske fremgangsmåter og preparater

X.A.) Antikreftvaksine

X.B.) STEAP-1 som et mål for antistoffbasert terapi

X.C.) STEAP-1 som et mål for cellulære immunresponser

X.Cl. Minigenvaksiner

X.C.2. Kombinasjoner av CTL-peptider med hjelperpeptider

X.C.3. Kombinasjoner av CTL-peptider med T-celleprimingmidler

X.C.4. Vaksinepreparater som omfatter DC pulset med CTL og/eller HTL-peptider

X.D.) Adoptiv immunterapi

X.E.) Administrering av vaksiner til terapeutiske eller profylaktiske formål XI. ) Diagnostiske og prognostiske utførelsesformer med STEAP-1

XII. ) Inhibering av STEAP-l-funksjon

XII.A.) Inhibering av STEAP-1 med intracellulære antistoffer

XII.B.) Inhibering av STEAP-1 med rekombinante proteiner

XII.C.) Inhibering av STEAP-l-transkripsjon eller -translasjon

XII.D.) Generelle overveielser for terapeutiske strategier

XIII. ) Identifisering, karakterisering og anvendelse av modulatorer av STEAP-1

XIV. ) RNAi og terapeutiske anvendelser av små interfererende RNA (siRNA)

XV. Sett/fremstilte artikler

I.) Definisjoner

Hvis ikke annet er definert er alle faguttrykk, notasjoner og andre vitenskapelige

uttrykk eller terminologi som blir benyttet her ment å skulle ha betydningene som vanligvis blir tillagt dem av fagfolk på området, som denne oppfinnelsen gjelder. I noen tilfeller blir uttrykk med vanlig forståtte betydninger definert herfor klarhet og/eller for klar referanse, og inkluderingen av slike definisjoner her bør ikke nødvendigvis å bli ansett å representere en vesentlig forskjell fra det som vanligvis er forstått på fagområdet. Mange av teknikkene og prosedyrene som er beskrevet eller referert her er godt forstått og vanlig benyttet ved å anvende konvensjonell metodikk av fagfolk på området, slik som for eksempel de vidt utbredte molekylære kloningsmetodikkene som er beskrevet i Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratoy Manual, 2. utgave (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. Der det er hensiktsmessig, blir prosedyrer som involverer anvendelsen av kommersielt tilgjengelig sett og reagenser vanligvis utført i overensstemmelse med produsentdefinerte protokoller og/eller parametere hvis ikke annet er skrevet.

Uttrykkene "fremskreden prostatakreft", "lokalt fremtreden prostatakreft", "freskreden sykdom" og "lokalt fremskreden sykdom" betyr prostata kreftform er som har trengt gjennom prostatakapselen, og er ment å skulle inkludere stadium-C-sykdom ifølge systemet til the American Urological Association (AUA), stadium-Cl-C2-sykdom ifølge Whitmore-Jewett-systemet og stadium T3-T4 og N+-sykdom ifølge TNM-systemet (tumor, knute, metastase). Generelt er ikke kirurgi anbefalt for pasienter med lokalt fremskreden sykdom, og disse pasientene har vesentlig mindre fordelaktige utkommer sammenlignet med pasienter som har klinisk lokalisert (organbegrenset) prostatakreft. Lokalt fremskreden sykdom er klinisk identifisert ved følbare bevis for indurasjon ut over sidekanten av prostata, eller asymmetri eller indurasjon over prostatabasen. Lokalt fremskreden prostatakreft blir per i dag diagnostisert patologisk ved å følge radikal prostatektomi hvis tumoren invaderer eller penetrerer prostatakapselen, strekker seg inn i den kirurgiske marginen eller invaderer sædvesiklene.

"Endre det native glykosyleringsmønstret" er her ment å bety fjerne én eller flere karbohydratenheter som er funnet i nativsekvens-STEAP-1 (enten ved å fjerne det underliggende glykosyleringssetet eller ved å fjerne glykosyleringen ved hjelp av kjemiske og/eller enzymatiske måter) og/eller tilsette ett eller flere glykosyleringsseter som ikke er tilstede i nativsekvens-STEAP-1. I tillegg inkluderer uttrykket kvalitative endringer i glykosyleringen hos de native proteinene, som involverer en endring i egenskapene og proporsjonene for de ulike karbohydratenhetene som er til stede.

Uttrykket "analog" refererer til et molekyl som er strukturelt likt eller deler tilsvarende eller korresponderende egenskaper med et annet molekyl (for eksempel et STEAP-1-beslektet protein). For eksempel kan en analog av et STEAP-1-protein spesifikt bli bundet av et antistoff eller en T-celle som spesifikt binder til STEAP-1.

Uttrykket "antistoff" blir benyttet i den bredeste betydningen hvis ikke annet er klart indikert. Derfor kan et "antistoff" være naturlig forekommende eller fremstilt av mennesker, slik som monoklonale antistoffer som er fremstilt ved hjelp av konvensjonell hybridomteknologi. Anti-STEAP-l-antistoffer omfatter monoklonale og polyklonale antistoffer i tillegg til fragmenter som inneholder det antigenbindende domenet og/eller én eller flere komplementaritetsbestemmende regioner fra disse antistoffene. Som benyttet her refererer uttrykket "antistoff" til enhver form av antistoff eller antifragment derav som spesifikt binder STEAP-1 og/eller oppviser den ønskede, biologiske aktiviteten og dekker spesifikt monoklonale antistoffer (inkludert monoklonale fullengdeantistoffer), polyklonale antistoffer, multispesifikke antistoffer (f. eks. bispesifikke antistoffer) og antistoffragmenter, så lenge de spesifikt binder STEAP-1 og/eller oppviser den ønskede, biologiske aktiviteten. Ethvert spesifikt antistoffsom definert i krav 1 eller krav 2 kan bli benyttet i fremgangsmåtene og preparatene som blir tilveiebrakt her. Uttrykket "antistoff" omfatter et molekyl som omfatter minst én variabelregion fra et lettkjedeimmunglobulinmolekyl og minst én variabelregion fra et tungkjedemolekyl som i kombinasjon danner et spesifikt bindingssete for målantigenet. I en utførelsesform er antistoffet et IgG-antistoff. For eksempel er antistoffet et IgGi-, IgG2-, IgG3- eller IgG4-antistoff. Antistoffene som er nyttig i foreliggende fremgangsmåter og preparater kan bli fremstilt i cellekultur, fag eller i ulike dyr, inkludert men ikke begrenset til kuer, kaniner, geiter, mus, rotter, hamstere, marsvin, sauer, hunder, katter, aper, sjimpanser, menneskeaper. I en utførelsesform er derfor et antistoff ifølge oppfinnelsen et pattedyrantistoff. Bakteriofagteknikker kan bli benyttet for å isolere et første antistoff eller for å generere varianter med endrede spesifisitets- eller aviditetskarakteristika. Slike teknikker er rutinemessige og velkjente på fagområdet. I en utførelsesform blir antistoffet fremstilt på rekombinante metoder som er kjent på fagområdet. For eksempel kan et rekombinant antistoff blir fremstilt ved å transfektere en vertscelle med en vektor som omfatter en DNA-sekvens som koder for antistoffet. Én eller flere vektorer kan bli benyttet for å transfektere DNA-sekvensen som uttrykker minst én VL-og VH-region i vertscellen. Eksempelmessige beskrivelser av rekombinante metoder for antistoffgenerering og -fremstilling inkluderer Deleves, Antibody Production: Essential Techniques (Wiley, 1997); Shephard, et al., Monoclonal Antibodies (Oxford University Press, 2000), Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (Academic press, 1993), Current Protocols in Immunology (John Wiley & Sons, den nyeste utgaven). Et antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse kan bli modifisert ved hjelp av rekombinante metoder for å øke større virkning av antistoffet i å mediere den ønskede funksjonen. Det er slik innenfor omfanget av oppfinnelsen at antistoffet kan bli modifisert ved substitusjoner ved å anvende rekombinante metoder. Typisk vil substitusjonene være konservative substitusjoner. For eksempel kan minst én aminosyre i konstantregionen til antistoffet bli erstattet med en annen rest. Se f. eks. US patentskrift nr. 5 624 821, US patentskrift nr. 6 194 551, søknad nr. WP 9958572 og Angal et al., Mol. Immunol. 30: 105-08 (1993). Modifiseringen av aminosyrer inkluderer delesjoner, addisjoner, substitusjoner av aminosyrer. I noen tilfeller blir slike endringer gjort for å redusere uønskede aktiviteter, f. eks. komplementavhengig cytotoksisitet. Ofte blir antistoffene merket ved å binde, enten kovalent eller ikke-kovalent, et stoff som tilveiebringer et påvisbart signal. Et bredt utvalgt av merke og konjugerings-teknikker er kjent og er omfattende rapportert i både forskningslitteraturen og patent-litteraturen. Disse antistoffene kan bli screenet for binding til normal eller for aktiv STEAP-1. Se f. eks. Antibody Engineering: A Practical Approach (Oxford University Press, 1996). Passende antistoffer med de ønskede, biologiske aktivitetene kan bli identifisert ved å følge in wtro-analysene, inkludert: proliferasjon, migrasjon, adhesjon, bløtagar vekst, angiogenese, celle-celle-kommunikasjon, apoptose, transport, signaloverføring og ved å følge in wVo-analysene slik som inhibitoren av tumorvekst. Antistoffene som blir tilveiebrakt her kan også være nyttige i diagnostiske applikasjoner. Som innfangnings- eller ikke-nøytraliserende antistoffer kan de bli screenet for evnen til å binde til det spesifikke antigenet uten å inhibere reseptorbindingsaktiviteten eller den biologiske aktiviteten til antigenet. Som nøytraliserende antistoffer kan antistoffene være nyttige i kompetitive bindingsanalyser. De kan også bli benyttet for å kvantifisere STEAP-1 eller dens reseptor.

Et "antistoffragment" er definert som i det minste en del av va ria bel reg ionen til immunglobulinmolekylet som binder til sitt mål, dvs. den antigenbindende regionen. I en utførelsesform dekker det spesifikt enkle anti-STEAP-l-antistoffer og kloner derav (inkludert agonist-, antagonist- og nøytraliserende antistoffer) og anti-STEAP-l-antistoffpreparater med polyepitopspesifisitet. Antistoffet kan være monoklonalt eller polyklonalt. Et antistoff kan foreligge i form av et antigenbindende antistoffragment inkludert et Fab-fragment, F(ab')2-fragment, en enkeltkjede variabelregion og lignende. Fragmenter av intakte molekyler kan bli generert ved å anvende fremgangsmåter som er velkjente på fagområdet og inkluderer enzymatisk fordøying og rekombinante metoder.

Som benyttet her kan enhver form av "antigenet" bli benyttet til å generere et antistoff som er spesifikt for STEAP-1. Slik kan det utløsende antigenet være en enkelt epitop, flere epitoper eller hele proteinet alene eller i kombinasjon med ett eller flere immunogenisitetsforsterkende midler som er kjent på fagområdet. Det utløsende antigenet kan være et isolert fullengdeprotein, et celleoverflateprotein (f. eks. ved å immunisere med celler som er transfektert med i det minste en del av antigenet), eller et løselig protein (f. eks. ved å immunisere med kun den ekstracellulære domenedelen av proteinet). Antigenet kan bli fremstilt i en genetisk modifisert celle. DNA som koder for antigenet kan være genomisk eller ikke-genomisk (f. eks. cDNA) og koder for minst én del av det ekstracellulære domenet. Som benyttet her refererer uttrykket "del" til det minimale antallet aminosyrer eller nukleinsyre, som hensiktsmessig, for å utgjøre en immunogen epitop av antigenet av interesse. Enhver genetisk vektor som er egnet til transformasjon av cellene av interesse kan bli benyttet, inkludert adenovirusvektorer, plasmider og ikke-virusvektorer, slik som kationiske lipider. I en utførelsesform binder antistoffet ifølge fremgangsmåten og preparatene her spesifikt til minst én del av det ekstracellulære domenet fra STEAP-1 av interesse.

Antistoffene eller de antigenbindende fragmentene derav som blir tilveiebrakt her kan bli konjugert til et "biologisk aktivt middel". Som benyttet her refererer uttrykket "biologisk aktivt middel" til enhver syntetisk eller naturlig forekommende forbindelse som binder antigenet og/eller forsterker eller medierer en ønsket biologisk effekt for å forsterke celledrepende toksiner.

Bindingsfragmentene som er nyttige i foreliggende oppfinnelse kan være biologisk aktive fragmenter. Som benyttet her refererer uttrykket "biologisk aktiv" til et antistoff eller antistoffragment som er i stand til å binde den ønskede antigene epitopen og direkte eller indirekte utøve en biologisk effekt. Direkte effekter inluderer moduleringen, stimuleringen og/eller inhiberingen av et vekstsignal, moduleringen, stimuleringen og/eller inhiberingen av et antiapoptotisk signal, moduleringen, stimuleringen og/eller inhiberingen av et apoptotisk eller nekrotisk signal, moduleringen, stimuleringen og/eller inhiberingen av ADCC-kaskaden og moduleringen, stimuleringen og/eller inhiberingen av CDC-kaskaden.

"Bispesifikke antistoffer" er også nyttige i foreliggende fremgangsmåter og preparater. Som benyttet her refererer uttrykket "bispesifikke antistoff" til et antistoff, typisk et monoklonalt antistoff, som har bindingsspesifisiter for minst to ulike antigene epitoper. Epitopene kan være fra det samme antigenet, eller fra to ulike antigener.

Fremgangsmåter for å fremstille bispesifikke antistoffer er kjent på fagområdet. For eksempel kan bispesifikke antistoffer bli fremstilte rekombinant ved å anvende ko-ekspresjonen av to immunglobulin tungkjede/lettkjede par. Se f. eks. Milstein et al., Nature, 305:537-39 (1983). Alternativt kan bispesifikke antistoffer bli fremstilt ved å anvende kjemisk binding. Se f. eks. Brennan et al., Science, 229:81 (1985). Bispesifikke antistoffer inkluderer bispesifikke antistoffragmenter, se f. eks. Hollinger et al., Proe. Nati. Acad. Sei., USA, 90:6444-48 (1993), Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994).

De monoklonale antistoffene her inkluderer spesifikt "kimære" antistoffer der en del av tung- og/eller lettkjeden er identisk med eller homolog med tilsvarende sekvenser eller antistoffer som er avledet fra en spesiell art eller som tilhører en spesiell antistoffklasse eller -underklasse, mens de gjenværende av kjeden/kjedene er identisk med eller homolog med tilsvarende sekvenser i antistoffer som er avledet fra annen art eller som tilhører en annen antistoffklasse eller underklasse, i tillegg til fragmenter av slike antistoffer, så lenge de spesifikt binder målantigenet og/eller oppviser den ønskede, biologiske aktiviteten (US patentskrift nr. 4 816 567 og Morrison et al., Proe. Nati. Acad. Sei., USA, 81:6851-6855

(1984)).

Uttrykket "kodonoptimaliserte sekvenser" refererer til nukleotidsekvenser som har blitt optimalisert for en spesiell vertsart ved å erstatte ethvert kodon som har en anvendelsesfrekvens på mindre enn 20 %. Nukleotidsekvenser som har blitt optimalisert for ekspresjon i en gitt vertsart ved eliminering av uønskede polyadenyleringssekvenser, eliminering av exon/intron spleisesignaler, eliminering av transposonlignende repetisjoner og/eller optimalisering av GC-innhold i tillegg til kodonoptimalisering, blir her referert til som "ekspresjonsforbedrede sekvenser".

Et "kombinatorisk bibliotek" er en samling av ulike kjemiske forbindelser som er generert ved enten kjemisk syntese eller biologisk syntese ved å kombinere et antall kjemiske "byggestener" slik som reagenser. For eksempel blir et lineært kombinatorisk kjemisk bibliotek, slik som et polypeptid (f. eks. mutein)-bibliotek, dannet ved å kombinere et sett med kjemiske byggestener kalt aminosyrer på enhver mulig måte for en gitt forbindelseslengde (dvs. antallet aminosyrer i en polypeptidforbindelse). Utallige kjemiske forbindelser blir syntetisert via slik kombinatorisk blanding av kjemiske byggestener (Gallop et al., J. Med. Chem. 37(9): 1233-1251 (1994)).

Fremstilling og screening av kombinatoriske biblioteker er velkjente for fagfolk på området. Slike kombinatoriske, kjemiske biblioteker inluderer peptidbiblioteker (se f. eks.

US patentskrift nr. 5 010 175, Furka, Pept. Prot. Res. 37:487-493 (1991), Houghton et al., Nature, 354:84-88 (1991)), peptider (PCT-publikasjon nr. WO 91/19735), kodede peptider (PCT-publikasjon WO 93/20242), tilfeldige bio-oligomerer (PCT-publikasjon WO 92/00091), benzodiazepiner (US patentskrift nr. 5 288 514), diversomerer slik som hydantoiner, benzodiazepiner og dipeptider (Hobbs et al., Proe. Nat. Acad. Sei., USA, 90:6909-6913

(1993)), vinylinneholdende polypeptider (Hagihara et al., J. Amer. Chem. Soc, 114:9217- 9218 (1992)), ikke-peptid peptidhermere med et beta-D-glukoseskjelett (Hirschmann et al., J. Amer. Chem. Soc, 116:9217-9218 (1992)), analog organisk syntese av småforbindelses-biblioteker (Chen et al., J. Amer. Chem. Soc, 116:2661 (1994)), oligokarbamater (Cho, et al., Science, 261:1303 (1993)) og/eller peptidylfosfonater (Campbell et al., J. Org. Chem., 59:658 (1994)). Se generelt Gordon et al., J. Med. Chem., 37:1385 (1994), nukleinsyre-biblioteker (se f. eks. Stratagene. Corp.), peptidnukleinsyrebiblioteker (se f. eks. US patentskrift nr. 5 539 083), antistoffbiblioteker (se f. eks. Vaughn et al., Nature Biotechnology, 14(3): 309-314 (1996) og PCT/US96/10287), karbohydratbiblioteker (se f. eks. Liang et al., Science, 274:1520-1522 (1996) og US patentskrift nr. 5 593 853) og biblioteker av små, organiske molekyler (se f. eks. benzodiazepiner, Baum, C&.EN, 18. januar, side 33 (1993), isoprenoider, US patentskrift nr. 5 569 588, tiazolidinoner og metatiazanoner, US patentskrift nr. 5 549 974, pyrrolidiner, US patentskrift nr. 5 525 735 og 5 519 134, morfolino-forbindelser, US patentskrift nr. 5 506 337, benzodiazepiner, US patentskrift nr. 5 288 514 og lignende).

Innretninger i fremstillingen av kombinatoriske biblioteker er allment tilgjengelige (se f. eks. 357 NIPS, 390 NIPS, Advanced Chem Tech, Louisville KY, Symphony, Rainin, Woburn, MA, 433A, Applied Biosystems, Foster City, CA, 9050, Plus, Millipore, Bedford, NIA). Et antall velkjente robotsystemer har også blitt utviklet for løsningsfasekjemier. Disse systemene inkluderer automatiserte arbeidsstasjoner slik som det automatiserte synteseapparatet som er utviklet av Takeda Chemical Industries, LTD. (Osaka, Japan) og mange robotsystemer som benytter robotarmer (Zymate H, Zymark Corporation, Hopkinton, Mass; Orca, Hewlett-Packard, Palo Alto, Calif.) som etterligner de manuelle, syntetiske operasjonene som er utført av en kjemiker. Enhver av innretningene ovenfor er passende til anvendelse med foreliggende oppfinnelse. Egenskapene og implementeringen av modifikasjoner på disse innretningene (hvis noen) slik at de kan virke som diskutert her, vil være åpenbare for fagfolk på det relevante fagområdet. I tillegg er mange kombinatoriske biblioteker selv kommersielt tilgjengelige (se f. eks. ComGenex, Princeton, NJ, Asinex, Moskva, RU, Tripos, Inc., St. Louis, MO, ChemStar, Ltd., Moskva, RU, 3D Pharmaceuticals, Exton, PA, Martek Biosciences, Columbina, MD osv.).

Som benyttet her refererer uttrykket "konservativ substitusjon" til substitusjoner av aminosyrer som er kjent for fagfolk på området og som kan bli gjort generelt uten å endre den biologiske aktiviteten til det resulterende molekylet. Fagfolk på området er på det rene med at enkle aminosyresubstitusjoner i ikke-essensielle regioner av et polypeptid generelt ikke vesentlig endrer biologisk aktivitet (se f. eks. Watson et al., Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co., s. 224 (4. utgave 1987)). Slike eksempelmessige substitusjoner blir fortrinnsvis gjort i overensstemmelse med de som er fremlagt i Tabell Ill(a-b). For eksempel inkluderer slike endringer substitusjon av enhver av isoleucin (I), valin (V) og leucin (L) med enhver annen av disse hydrofobe aminosyrene, asparaginsyre

(D) for glutaminsyre (E) og vice versa, glutamin (Q) for asparagin (N) og vice versa og serin

(S) for treonin (T) og vice versa. Andre substitusjoner kan også bli ansett som konservative, avhengig av miljøet til den spesielle aminosyren og dens rolle i den tredimensjonale strukturen til proteinet. For eksempel kan glysin (G) og alanin (A) ofte være utbyttbare med hverandre, og det kan også alanin (A) og valin (V). Metionin (M),

som er relativt hydrofob, kan ofte bli byttet ut med leucin og isoleucin, og noen ganger med valin. Lysin (I) og arginin (R) er ofte mulig å bytte med hverandre på lokaliseringer der den signifikante egenskapen til aminosyrerestn er dens ladning og de ulike pK-verdiene for disse to aminosyrerestene ikke er signifikant. Andre endringer kan fremdeles bli ansett som

"konservative" i spesielle miljøer (se f. eks. Tabell III(a) her, side 13-15 "Biochemistry", 2. utgave, red. Lubert Stryer (Standford University), Henikoff et al., PNAS 1992, vol. 89, 10915-10919, Lei et al., J Biol Chem, 1995, 19. mai, 270(20):11882-6. Andre substitusjoner er også tillatte og kan bli bestemt empirisk eller i overensstemmelse med kjente konservative substitusjoner.

Uttrykket "cytotoksisk middel" refererer til et stoff som inhiberer eller hindrer ekspresjonsaktiviteten for celler, funksjon av celler og/eller som forårsaker ødeleggelse av celler. Uttrykket er ment å skulle inkludere radioaktive isotoper, kjemoterapeutiske midler og toksiner slik som småmolekyltoksiner eller enzymatisk aktive toksiner av bakteriopphav, soppopphav, planteopphav eller dyreopphav, inkludert fragmenter og/eller varianter derav. Eksempler på cytotoksiske midler inluderer auristatiner, auristatin-e, auromyciner, maytansinoider, yttrium, vismut, ricin, ricin-A-kjede, kombrestatin, duokarmyciner, dolostatiner, doksorubicin, daunorubicin, taxol, cisplatin, ccl065, etidiumbromid, mitomycin, etopsid, tenoposid, vinkristin, vinblastin, kolchicin, dihydroksyantracindion, aktinomycin, difteritoksin, Psudomonas-eksotoksin (PE)-A, PE40, abrin, abrin-A-kjede, modeccin-A-kjede, alfa-sarcin, gelonin, mitogellin, restriktocin, fenomycin, enomycin, kuricin, krotin, kalicheamicin, Sapaonaha officinalis-\ n\\\ b\ X. ov og glukokortikoid og andre kjemoterapeutiske midler, i tillegg til radioisotoper slik som At211, I131, I125, Y90, Re186,Sm<153>, Bi212 eller 213,P<32>og radioaktive isotoper av Lu, inkludert Lu<177>. Antistoffer kan også bli konjugert til et antikreftprolegemiddelaktiverende enzym som er i stand til å konvertere prolegemiddelet til dets aktive form.

Som benyttet her refererer uttrykket "dialegemer" til små antistoffragmenter med to antigenbindende seter, der fragmentene omfatter et tungkjedevariabeldomene (VH) bundet til et lettkjedevariabeldomene (VL) på den samme polypeptidkjeden (VH-VL). Ved å anvende en linker som er for kort til å tillate parring mellom de to domenene på den samme kjeden blir domenene tvunget til å pare med de komplementære domenene på en annen kjede og danner to antigenbindende seter. Dialegemer er beskrevet mer inngående i f. eks. EP 404 097, WO 93/11161 og Holliger et al., Proe. Nati. Acad. Sei., USA, 90:6444-48

(1993).

"Genproduktet" blir benyttet her for å indikere et peptid/protein eller mRNA. For eksempel blir et "genprodukt ifølge beskrivelsen" noen ganger referert her som en

"kreftaminosyresekvens", "kreftprotein", "protein fra en kreft som er angitt i Tabell I", et "kreft-mRNA", "mRNA for en kreft som er angitt i Tabell I" osv.. Kreftproteinet kan være kodet for av en nukleinsyre ifølge Figur 2. Kreftproteinet kan være et fragment, eller alternativt, være fullengdeproteinet som er kodet for av nukleinsyren ifølge Figur 2. En kreftaminosyresekvens kan være benyttet for å bestemme sekvensidentitet eller sekvenslikhet. Sekvensene kan være naturlig forekommende allelevarianter av et protein som er kodet for av en nukleinsyre ifølge Figur 2. Sekvensene kan være sekvensvarianter som ytterligere beskrevet her.

"Heterokonjugatantistoffer" er nyttige i foreliggende fremgangsmåter og preparater. Som benyttet her refererer uttrykket "heterokonjugatantistoff" til to kovalent sammenbundne antistoffer. Slike antistoffer kan bli fremstilt ved å anvende kjente fremgangsmåter i syntetisk proteinkjemi, inkludert å benytte kryssbindingsmidler. Se f. eks. US patentskrift nr. 4 676 980.

"Høyomsettings screeningsanalyser" for tilstedeværelsen, fraværet, kvantifiseringen eller andre egenskaper for spesielle nukleinsyrer eller proteinprodukter er velkjente for fagfolk på området. Tilsvarende er bindingsanalyser og reportergenanalyser velkjente. Slik beskriver f. eks. US patentskrift nr. 5 559 410 høyomsetnings screeningsfremgangsmåter for proteiner, US patentskrift nr. 5 585 639 beskriver høyomsetnings screeningsfremgangsmåter for nukleinsyrebinding (dvs. i samlinger), mens US patentskrift nr. 5 576 220 og 5 541 061 beskriver høyomsetningsfremgangsmåter for screening for ligand/antistoffbinding.

I tillegg er høyomsetnings screeningssystemer kommersielt tilgjengelige (se f. eks. Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, Zymark Corp., Hopkinton, MA, Air Technical Industries, Mentor, OH, Beckman Instruments, Inc., Fullerton, CA, Precision Systems, Inc., Natick, MA, osv.). Disse systemene automatiserer typisk hele prosedyrer, inkludert all prøvepipettering og reagenspipettering, fordeling av væske, tipsbegrensede inkuberinger og endelige avlesninger av mikroplaten i detektorer som er passende for analysen. Disse konfigurerbare systemene tilveiebringer høy omsetning og rask start i tillegg til en høy grad av fleksibilitet og individuell tilpasning. Produsentene av slike systemer tilveiebringer detaljerte protokoller for ulike høyomsetningssystemer. Slik tilveiebringer f. eks. Zymark Corp., tekniske bulletiner som beskriver screeningssystemer for å påvise moduleringen av gentranskripsjon, ligandbinding og lignende.

Uttrykket "homolog" refererer til et molekyl som oppviser homologi med et annet molekyl, ved for eksempel å ha sekvenser med kjemiske rester som er de samme eller tilsvarende på tilsvarende posisjoner.

I én utførelsesform er antistoffet som blir tilveiebrakt her et "humant antistoff". Som benyttet her refererer uttrykket "humant antistoff" til et antistoff der i det vesentlige hele sekvensen for lettkjede- og tungkjedesekvensen, inkludert de komplementaritetsbestemmende regionene (CDR), er fra humane gener. I en utførelsesform blir humane, monoklonale antistoffer fremstilt ved hjelp av triomteknikken, den humane B-celleteknikken (se f. eks. Kozbor, et al., Immunol., Today 4:72 (1983), EBV-transformasjonsteknikken (se f. eks. Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, 77-96 (1985)), eller ved å anvende phage-display (se f. eks. Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)). I en spesifikk utførelsesform blir det humane antistoffet fremstilt i en transgen mus. Teknikker for å fremstille slike partielt til fult humane antistoffer er kjent på fagområdet og enhver slik teknikk kan bli benyttet. Ifølge en spesielt foretrukket utførelsesform blir fullt humane antistoffsekvenser fremstilt i en transgen mus som er konstruert for å uttrykke humane tungkjede- og lettkjedeantistoffgener. En eksempelmessig beskrivelse av fremstilling av transgene mus som fremstiller humane antistoffer kan bli funnet i søknadsnummer WO 02/43478 og US patentskrift nr. 6 657 103 (Abgenix) og etterkommere av dette. B-celler fra transgene mus som produserer det ønskede antistoffet kan deretter bli fusjonert for å fremstille hybridomcellelinjer for kontinuerlig produksjon av antistoffet. Se f. eks. US patentskrift nr. 5 569 825, 5 625 126, 5 663 425, 5 661 016 og 5 545 806 og Jakobovits, Adv. Drug. Del. Rev., 31:33-42 (1998), Green et al., J. Exp. Med. 188:483-95 (1998).

"Humant leukocytt antigen" eller "HLA" er et humant klasse-I- eller klasse-II-vevsforlikelighetskompleks (MHC)-protein (se f. eks. Stites et al., Immunology, 8. utgave, Lange Publishing, Los Altos, CA (1994).

Som benyttet her refererer uttrykket "humanisert antistoff" til former av antistoffer som inneholder sekvenser fra ikke-humane (for eksempel murine) antistoffer i tillegg til humane antistoffer. Slike antistoffer er kimære antistoffer som inneholder minimalt med sekvens avledet fra ikke-humant immunglobulin. Generelt vil det humaniserte antistoffet omfatte vesentlig alt av minst ett, og typisk to, variabeldomener, der alt eller hovedsakelig alt av hypervariabelløkkene tilsvarer de i et ikke-humant immunglobulin og alt eller hovedsakelig alt av FR-regionene er de fra en human immunglobulinsekvens. Det humaniserte antistoffet vil eventuelt også omfatte minst én del av en immunglobulinkonstantregion (Fc), typisk den for et humant immunglobulin. Se f. eks. Cabilly, US patentskrift nr. 4 816 567, Queen et al. (1989) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 86:10029-10033; og Antibody Engineering: A Practical Approach (Oxford University Press 1996).

Uttrykkene "hybridisere", "hybridiserende", "hybridiserer" og lignende, benyttet i konteksten med polynukleotider, er ment å skulle referere til konvensjonelle hybridiseringsbetingelser, fortrinnsvis slik som hybridisering i 50 % formamid/6XSSC/0,l % SDS/100 ng/ml ssDNA, der temperaturene for hybridisering er over 37°C og der temperaturene for vasking i 0,1 X SSC/0,1 % SDS er over 55°C.

Uttrykkene "isolert" eller "biologisk rent" refererer til materiale som er vesentlig eller essensielt fritt fra komponenter som normalt finnes sammen med materialet slik det ble funnet i sin naturlige tilstand. Slik inneholder ikke-isolerte peptider materialer som normalt er assosiert med peptidene i deres in s/tu-miljø. For eksempel er et polynukleotid sagt å være "isolert" når det i hovedsak er separert fra forurensende polynukleotider som tilsvarer eller er komplementære med gener forskjellig fra STEAP-l-genene eller som koder for polypeptider forskjellig fra STEAP-l-genproduktet eller fragmenter derav. Fagfolk på området kan enkelt benytte nukleinsyreisoleringsprosedyre for å oppnå et isolert STEAP-1-polynukleotid. Et protein er sagt å være "isolert", for eksempel når fysiske, mekaniske eller kjemiske fremgangsmåter er benyttet for å fjerne STEAP-l-proteinet fra cellulære bestanddeler som normalt er assosiert med proteinet. Fagfolk på området kan enkelt benytte standard rensefremgangsmåter for å oppnå et isolert STEAP-l-protein. Alternativt kan et isolert protein bli fremstilt på kjemiske måter.

Egnede "merker" inkluderer radionuklider, enzymer, substrater, kofaktorer, inhibitorer, fluorescensenheter, kjemiluminiscensenheter, magnetiske partikler og lignende.

Patenter som beskriver anvendelsen av slike merker inkluderer US patentskrift nr. 3 817 837, 3 850 752, 3 939 350, 3 996 345, 4 277 439, 4 275 149 og 4 366 241. I tillegg kan antistoffene som blir tilveiebrakt her være nyttige som den antigenbindende komponenten i fluorlegemer. Se f. eks. Zeytun et al., Nat. Biotechnol., 21:1473-79 (2003).

Uttrykket "pattedyr" refererer til enhver organisme som er klassifisert som et pattedyr, inkludert mus, rotter, kaniner, hunder, katter, kuer, hester og mennesker. I en utførelsesform av oppfinnelsen er pattedyret en mus. I en annen utførelsesform av oppfinnelsen er pattedyret et menneske.

Uttrykkene "metastatisk prostatakreft" og "metastatisk sykdom" betyr prostatakreft som har spredd seg til regionale lymfeknuter eller fjerne steder, og er ment å skulle inkludere stadium-D-sykdom ifølge AUA-systemet og stadium-TxNxM+ ifølge TNM-systemet. Slik det er tilfellet for lokalt fremskreden prostatakreft, er kirurgi generelt ikke indikert for pasienter med metastatisk sykdom, og hormonell (androgenablasjon)-terapi er en foretrukket behandlingsmetoder. Pasienter med metastatisk prostatakreft utvikler etter hvert en androgen motstandsdyktig tilstand i løpet av 12 til 18 måneder etter behandlings-oppstart. Omtrent halvparten av disse androgenrefraktoriske pasientene dør i løpet av 6 måneder etter å ha utviklet denne statusen. Det mest vanlige stedet for prostatakreft metastaser er ben. Prostatakreft benmetastaser er ofte osteoblastiske heller enn osteolytiske (dvs. fører til netto bendannelse). Benmetastaser blir hyppigst funnet i ryggraden, etterfulgt av lårbena, bekkenet, ribbena, skallen og overarmsbena. Andre vanlige steder for metastaser inkluderer lymfeknuter, lunge, lever og hjerne. Metastatisk prostatakreft blir typisk diagnostisert ved hjelp av åpen eller laparoskopisk bekken lymfeknute disseksjon, radionuklidskanninger av hele kroppen, skjelettradiografi og/eller benlesjonsbiopsi.

Uttrykket "modulator" eller "testforbindelse" eller "legemiddelkandidat" eller grammatiske ekvivalenter slik de blir benyttet her, beskriver ethvert molekyl, f. eks. protein, oligopeptid, lite organisk molekyl, polysakkarid, polynukleotid osv., som skal bli testet for kapasiteten til direkte eller indirekte å endre kreftfenotypen eller ekspresjonen av en kreftsekvens, f. eks. en nukleinsyre- eller proteinsekvens, eller effekter av kreft - sekvenser (f. eks signalisering, genekspresjon, proteininteraksjon osv). En modulator kan nøytralisere effekten av et kreftprotein ifølge beskrivelsen. Med "nøytralisere" er det ment at en aktivitet for et protein blir inhibert eller blokkert, sammen med de påfølgende effektene på cellen. En modulator kan nøytralisere effekten av et gen, og dets tilsvarende protein, ifølge beskrivelsen ved å normalisere nivåer av nevnte protein. Modulatorer kan endre ekspresjonsprofiler, eller ekspresjonsprofil nukleinsyrer eller -proteiner som blir tilveiebrakt her, eller nedstrøms effektorveier. Modulatoren kan undertrykke en kreftfenotype, f. eks. til et normalt vevsfingeravtrykk. En modulator kan indusere en kreftfenotype. Vanligvis blir mange analyseblandinger kjørt i parallell med ulike konsentrasjoner av middel for å oppnå en ulik respons for de ulike konsentrasjonene. Typisk virker én av disse konsentrasjonene som en negativ kontroll, dvs. ved 0-konsentrasjon eller under nivået for påvisning.

Modulatorer, legemiddelkandidater eller testforbindelser omfatter uttallige kjemiske klasser, selv om de typisk er organiske molekyler, fortrinnsvis små organiske forbindelser som har en molekylvekt på mer enn 100 og mindre enn omtrent 2 500 dalton. Foretrukne små molekyler er mindre enn 2 000, eller mindre enn 1 500 eller mindre enn 1 000 eller mindre enn 500 D. Kandidatmidler omfatter funksjonelle grupper som er nødvendig for strukturell interaksjon med proteiner, spesielt hydrogenbinding, og inkluderer typisk minst én amin-, karbonyl-, hydroksyl- eller karboksylgruppe, fortrinnsvis minst to av de funksjonelle, kjemiske gruppene. Kandidatmidlene omfatter ofte sykliske karbon- eller heterosykliske strukturer og/eller aromatiske eller polyaromatiske strukturer som er substituert med én eller flere av de funksjonelle gruppene ovenfor. Modulatorer omfatter også biologiske molekyler slik som peptider, sakkarider, fettsyrer, steroider, puriner, pyrimidiner, derivater, strukturelle analoger eller kombinasjoner derav. Spesielt foretrukket er peptider. En klasse av modulatorer er peptider, for eksempel på fra omtrent fem til 35 aminosyrer, hvor fra omtrent fem til 20 aminosyrer er foretrukket, og hvor fra omtrent 7 til omtrent 15 er spesielt foretrukket. Fortrinnsvis er det kreftmodulatoriske proteinet løselig, inkluderer en ikke-transmembranregion og/eller har en N-terminal Cys for å hjelpe til med løselighet. C-terminalen på fragmentet kan være holdt som en fri syre og N-terminalen kan være et fritt amin for å hjelpe til i kobling, dvs. til cystein. Et kreftprotein ifølge beskrivelsen kan være konjugert til et immunogent middel som diskutert her. Kreftproteinet kan være konjugert til BSA. Peptidene f. eks. av foretrukne lengder, kan bli bundet til hverandre eller til andre aminosyrer for å danne lengre peptid/protein. De modulatoriske peptidene kan være fordøyingen av naturlig forekommende proteiner som forklart nedenfor, tilfeldige peptider eller "ensidige" tilfeldige peptider. Peptid/protein baserte modulatorer kan være antistoffer og fragmenter derav, som definert her.

Modulatorer av kreft kan også være nukleinsyrer. Nukleinsyremodulerende midler kan være naturlig forekommende nukleinsyrer, tilfeldige nukleinsyrer eller "ensidige"

tilfeldige nukleinsyrer. For eksempel kan fordøyinger av prokaryote eller eukaryote genomer bli benyttet i en tilnærming som er analog med den som er fremlagt ovenfor for proteiner.

Slik det blir benyttet her referer uttrykket "monoklonalt antistoff" til et antistoff som er fremskaffet fra en populasjon av vesentlig homogene antistoffer, dvs. at de individuelle antistoffene som utgjør populasjonen er identiske, bortsett fra mulige naturlige forekommende mutasjoner som kan foreligge i mindre mengder. Monoklonale antistoffer er svært spesifikke, fordi de er rettet mot en enkelt antigen epitop. I motsetning til dette inkluderer konvensjonelle (polyklonale) antistoff preparater typisk mange antistoffer som er rettet mot (eller spesifikke for) ulike epitoper. Det polyklonale antistoffet kan inneholde et flertall av monoklonale antistoffer med ulike epitopspesifisiteter, -affiniteter eller -aviditeter innenfor et enkelt antigen som inneholder flere antigene epitoper. "Monoklonal" indikerer karakteren til antistoffet som må være fremskaffet fra en vesentlig homogen populasjon av antistoffer, og skal ikke bli ansett som et krav om produksjon av antistoffet ved en spesiell fremgangsmåte. For eksempel kan de monoklonale antistoffene som skal bli benyttet i overensstemmelse med foreliggende oppfinnelse bli fremstilt ved hjelp av hybridom-fremgangsmåten som først ble beskrevet av Kohler et al., Nature, 256: 495 (1975) eller kan bli fremstilt ved rekombinante DNA-fremgangsmåter (se f. eks. US patentskrift nr. 4 816 567). De "monoklonale antistoffene" kan også bli isolert fra bakteriofag-antistoffbiblioteker ved å anvende teknikkene som er beskrevet i Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991) og Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991). Disse monoklonale antistoffene vil vanligvis binde med en Kdpå minst omtrent 1 nM, mer vanlig med minst 300 nM, typisk minst omtrent 30 nM, fortrinnsvis minst omtrent 10 nM, mer foretrukket minst omtrent 3 nM eller bedre, vanligvis bestemt ved hjelp av ELISA.

Et "motiv", som i biologisk motiv for et STEAP-l-beslektet protein, refererer til

ethvert mønster av aminosyrer som danner en del av den primære sekvensen for et protein, som er assosiert med en spesiell funksjon (f. eks. protein-protein interaksjon, protein-DNA-interaksjon osv.) eller modifisering (f. eks. som er fosforylert, glykosylert eller amidert) eller lokalisering (f. eks. sekretorisk sekvens, nukleær lokaliseringssekvens osv.) eller en sekvens som er korrelert med å være immunogen, enten humoralt eller cellulært. Et motiv kan enten være kontinuerlige eller i stand til å bli sammenstilt med visse posisjoner som vanligvis er korrelert med en viss funksjon eller egenskap. I konteksten med HLA-motiver, refererer "motiv" til mønster av rester i et peptid med definert lengde, vanligvis et peptid på fra omtrent 8 til omtrent 13 aminosyrer for et klasse-I-HLA-motiv og fra omtrent 6 til omtrent 25 aminosyrer for et klasse-II-HLA-motiv, som blir gjenkjent av et spesielt HLA-molekyl. Peptidmotivet for HLA-binding er typisk forskjellige for hvert protein som er kodet for av hvert humane HLA-allel og er forskjellig i mønstre med de primære og sekundære forankringsrestene.

En "farmasøytisk eksipiens" omfatter et materiale slik som en adjuvans, en bærer, pH-justerende og bufrende midler, tonisitetsjusterende midler, fuktgjørende midler, preserveringsmidler og lignende.

"Farmasøytisk akseptabel" refererer til et ikke-toksisk, inert og/eller preparat som er fysiologisk kompatibelt med mennesker eller andre pattedyr.

Uttrykket "polynukleotid" betyr en polymer form av nukleotider med minst 10 baser eller basepar i lengde, enten ribonukleotider eller deoksynukleotider eller en modifisert form av enhver type nukleotid, og er ment å skulle inkludere enkelttrådede og dobbelttrådede former av DNA og/eller RNA. Pa dette fagområdet blir dette uttrykket benyttet om hverandre med "oligonukleotid". Et polynukleotid kan omfatte en nukleotidsekvens som er beskrevet her, der tymidin (T), som for eksempel vist i Figur 2, også kan være uracil (U), og denne definisjonen gjelder ulikhetene mellom de kjemiske strukturene for DNA og RNA, spesielt ved observasjon av at en av de fire hovedbasene i RNA er uracil (U) i stedet for tymidin (T).

Uttrykket "polypeptid" betyr en polymer på minst omtrent 4, 5, 6, 7 eller 8 aminosyrer. Gjennom hele beskrivelsen blir standardbetegnelsene med tre bokstaver eller en bokstav for aminosyrer benyttet. På fagområdet blir dette uttrykket ofte benyttet om hverandre med "peptid" eller "protein".

En "primær HLA-forankringsrest" er en aminosyre på en spesifikk posisjon på peptidsekvensen som er forstått å tilveiebringe et kontaktpunkt mellom det immunogene peptidet og HLA-molekylet. Én til tre, vanligvis to, primære forankringsrester i et peptid med definert lengde definerer generelt et "motiv" for et immunogent peptid. Disse restene er forstått å skulle passe i nær kontakt med peptidbindingshulrommet i et HLA-molekyl, med deres sidekjeder begravd i spesifikke lommer i bindingshulrommet. For eksempel er de primære forankringsrestene for et HLA-klasse-II-molekyl lokalisert på posisjon 2 (fra den aminoterminale posisjonen) og på den karboksyterminale posisjonen for en restpeptidepitop på 8, 9, 10, 11 eller 12 i overensstemmelse med oppfinnelsen. Alternativt binder de primære forankringsrestene i et peptid et HLA-klasse-II-molekyl som er fordelt relativt i forhold til hverandre, heller enn til ende på et peptid, der peptidet vanligvis har en lengde på minst 9 aminosyrer. De primære forankringsposisjonene for hvert motiv og supermotiv er som fremlagt ifølge Tabell IV(a). For eksempel kan analoge peptider bli dannet ved å endre tilstedeværelsen eller fraværet av spesielle rester på primær- og/eller sekundær-forankringsposisjonene som vist i Tabell IV. Slike analoger ble benyttet for å modulere bindingsaffiniteten og/eller populasjonsdekningen for et peptid som omfatter et spesielt HLA-motiv eller -supermotiv.

"Radioisotoper" inluderer de følgende (ikke-begrensende eksempelmessige anvendelser som også er fremlagt i Tabell IV(I)).

Med "randomisert", eller grammatiske ekvivalenter slik de her blir benyttet på nukleinsyre eller proteiner, er det ment at hver nukleinsyre og hvert peptid hovedsaklig består av tilfeldige nukleotider og aminosyrer. Disse tilfeldige peptidene (eller nukleinsyrene som er diskutert her) kan inkorporere ethvert nukleotid eller aminosyre på enhver posisjon. Den syntetiske prosessen kan bli utviklet for å generere randomiserte proteiner eller nukleinsyrer, for å tillate dannelsen av alle eller de fleste av de mulige kombinasjonene over lengden av sekvensen, for slik å danne et bibliotek av randomiserte biologisk aktive kandidatproteininneholdende midler.

Et bibliotek kan være "fullt randomisert", uten noen sekvenspreferanse eller konstanter på enhver posisjon, eller kan være et "ensidig tilfeldig" bibliotek. Det betyr at noen posisjoner på sekvensen enten blir holdt konstante, eller at de er valgt fra et begrenset antall muligheter. For eksempel er nukleotidene eller aminosyrerestene randomisert innenfor en definert klasse, fof. eks. med hydrofobe aminosyrer, hydrofile rester, sterisk ensidige (enten små eller store) rester, mot dannelsen av nukleinsyre-bindingsdomener, dannelsen av cysteiner, til kryssbinding, proliner for SH-3-domener, seriner, treoniner, tyrosiner eller histidiner til fosforyleringsseter osv. eller for puriner osv.

Et "rekombinant" DNA- eller RNA-molekyl er et DNA- eller RNA-molekyl som har blitt usatt for molekylær manipulering in vitro.

Som benyttet her refererer uttrykket "enkeltkjede-Fv" eller "scFv" eller "enkeltkjede antistoff" til antistoffragmenter som omfatter VH- og VL-domener for antistoff, der disse domenene er tilstede på en enkel polypeptidkjede. Generelt omfatter Fv-polypeptidet ytterligere en polypeptidlinker mellom VH- og VL-domenet som gjør det mulig for sFv å danne den ønskede strukturen for antigenbinding. For en gjennomgang av sFv, se Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg og Morre, red., Springer-Verlag, New York, s. 269-315 (1994).

Eksempler på "små molekyler" inkluderer forbindelser som binder eller interagerer med STEAP-1, ligander inkludert hormoner, neuropeptider, kjemokiner, odoranter, fosfolipider og funksjonelle ekvivalenter derav som binder og fortrinnsvis inhiberer STEAP-1-proteinfunksjon. Slike ikke-begrensende små molekyler har fortrinnsvis en molekylvekt på mindre enn omtrent 10 kDa, mer foretrukket under omtrent 9, omtrent 8, omtrent 7, omtrent 6, omtrent 5 eller omtrent 4 kDa. Små molekyler kan fysisk assosieres med, eller binde STEAP-l-protein, og kan ikke være funnet i naturlig forekommende metabolske veier og/eller kan være mer løselige i vandige enn i ikke-vandige løsninger.

Som benyttet her refererer uttrykket "spesifikk" til den selektive bindingen av antistoffet til målantigenepitopen. Antistoffer kan bli testet for spesifisitet for binding ved å sammenligne binding med et passende antigen med binding til irrelevant antigen eller antigenblanding under et gitt sett med betingelser. Hvis antistoffet binder til det passende antigenet minst 2, 5, 7 og fortrinnsvis 10 ganger mer enn til irrelevant antigen eller antigenblanding, så er det ansett for å være spesifikt. I en utførelsesform er et spesifikt antistoffet som kun binder STEAP-l-antigenet, men som ikke binder det irrelevante antigenet. I en annen utførelsesform er et spesifikt antistoff et som binder humant STEAP- 1-antigen, men som ikke binder et ikke-humant STEAP-1-antigen med 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % eller større aminosyrehomologi med STEAP-l-antigen. I en annen utførelsesform er et spesifikt antistoffet som binder humant STEAP-l-antigen og som binder murint STEAP-l-antigen, men med en høyere grad av binding til det humane antigenet. I en annen utførelsesform er et spesifikt antistoff ett som binder humant STEAP-l-antigen og som binder primat-STEAP-1-antigen, men med en høyere grad av binding til det humane antigenet. I en annen utførelsesform binder det spesifikke antistoffet til humant STEAP-l-antigen og ethvert ikke-humant STEAP-l-antigen, men med en høyere grad av binding til det humane antigenet eller enhver kombinasjon derav.

"Stringens" ved hybridiseringsreaksjoner er enkelt bestemt av en fagperson på området, og er vanligvis en empirisk beregning som er avhengig av probelengde, vasketemperatur og saltkonsentrasjon. Vanligvis krever lengre prober høyere temperatur for riktig annealing, mens kortere prober krever lavere temperaturer. Hybridisering er vanligvis avhengig av evnen til denaturerte nukleinsyresekvenser i å anneale på nytt når komplementære tråder er tilstede i et miljø under deres smeltetemperatur. Jo høyere graden av ønsket homologi mellom proben og den hybridiserbare sekvensen er, jo høyere er den relative temperaturen som kan bli benyttet. Som et resultat følger det at høyere relative temperaturer vil ha en tendens til å gjøre reaksjonsbetingelsene mer stringente, mens lavere temperaturer gjør den mindre. For ytterligere detaljer og forklaringer omkring stringens for hybridiseringsreaksjoner, se Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers (1995).

"Stringente betingelser" eller "høyt stringente betingelser", som definert her, er identifisert av de som:

(1) benytter lav ionestyrke og høy temperatur til vasking, for eksempel 0,015 M natriumklorid/0,0015 M natriumcitrat/0,1 % natriumdodecylsulfat ved 50°C, (2) gjennom hybridisering benytter et denatureringsmiddel, slik som formamid, for eksempel 50 % (volum/volum) formamid med 0,1 % bovint serumalbumin/0,1 % Ficoll/0,1 % polyvinylpyrrolidon/50 mM natriumfosfatbuffer med pH 6,5 med 750 mM natriumklorid, 75 mM natriumcitrat ved 42°C, eller (3) benytter 50 % formamid, 5 x SSC (0,75 M NaCI, 0,075 M natriumcitrat), 50 mM natriumfosfat (pH 6,8), 0,1 % natriumpyrofosfat, 5 x Denhardts løsning, sonikert laksesperma-DNA (50 ng/ml), 0,1 % SDS og 10 % dekstransulfat ved 42°C, med vaskinger ved 42°C i 0,2 x SSC (natriumklorid/natriumcitrat) og 50 % formamid ved 55°C, etterfulgt av en høystringent vasking som består av 0,1 x SSC inneholdende EDTA ved 55°C. "Moderat stringente betingelser" er beskrevet ved de som er fremlagt i Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989, og inkluderer anvendelsen av vaskeløsning og hybridiseringsbetingelser (f. eks. temperatur, ionestyrke og % SDS) som er mindre stringente enn de som er beskrevet ovenfor. Et eksempel på moderat stringente betingelser er over natt inkubering ved 65°C i en løsning som omfatter: 1 % bovint serumalbumin, 0,5M natriumfosfat pH 7,5, 1,25 mM EDTA og 7 % SDS 5 x SSC (150 mM NaCI, 15 mM trinatriumcitrat), etterfulgt av vasking av filtrene i 2 x SSC/1 % SDS ved 50°C og 0,2 x SSC/0,1 % SDS ved 50°C. Den erfarne fagpersonen vil være på det rene med hvordan man kan justere temperaturen, ionestyrken osv., slik det er nødvendig for å ta hensyn til faktorer slik som probelengde og lignende.

Et "HI_A-supermotiv" er en peptidbindingsspesifisitet som er felles for HLA-molekyler som er kodet for av to eller flere HI_A-alleler. Totale fenotypiske frekvenser for HLA-supertyper i ulike etniske populasjoner er fremlagt i Tabell IV (f) Innholdet i ulike supertyper er som følger: A2: A*0201, A*0202, A*0203, A*0204, A*0205, A*0206, A*6901, A*0207

A3: A3, All, A31, A<*>3301, A<*>6801, A<*>0301, A<*>1101, A<*>3101

B7: B7, B<*>3501-03, B<*>51, B<*>5301, B<*>5401, B<*>5501, B<*>5502, B<*>5601, B<*>6701, B<*>7801, B<*>0702, B<*>5101, B<*>5602

B44: B<*>3701, B<*>4402, B<*>4403, B<*>60 (B<*>4001), B61 (B<*>4006)

Al: A<*>0102, A<*>2604, A<*>3601, A<*>4301, A<*>8001

A24: A*24, A*30, A*2403, A*2404, A*3002, A*3003

B27: B<*>1401-02, B<*>1503, B<*>1509, B<*>1510, B<*>1518, B<*>3801-02, B<*>3901, B<*>3902, B<*>3903-04, B<*>4801-02, B<*>7301, B<*>2701-08

B58: B<*>1516, B<*>1517, B<*>5701, B<*>5702, B58

B62: B<*>4601, B52, B<*>1501 (B62), B<*>1502 (B75), B<*>1513 (B77)

Beregnet populasjonsdekning gitt ved ulike HLA-supertypekombinasjoner er fremlagt I Tabell IV(g).

Som benyttet her refererer "å behandle" eller "terapeutisk" og grammatisk beslektede uttrykk til enhver forbedring av enhver konsekvens av sykdom, slik som forlenget overlevelse, mindre dødelighet og/eller minskning av bivirkninger som er biproduktene av en alternativ, terapeutisk modalitet, slik det er åpenbart på fagområdet, full utryddelse av sykdommen er et foretrukket mål, men ikke nødvendighet for en behandling.

Et "transgent dyr" (for eksempel en mus eller en rotte) er et dyr som inneholder celler som inneholder et transgen, der dette transgenet ble introdusert i dyret eller en forløper for dyret på en prenatalt, for eksempel et embryonalt stadium. Et "transgen" er et DNA som er integrert inn i genomet i en celle fra hvilken et transgent dyr utvikles.

Som benyttet her er en "HLA-vaksine" eller "cellulær immunrespons vaksine" et preparat som inneholder eller koder for ett eller flere peptider ifølge beskrivelsen. Det foreligger uttallige utførelsesformer av slike vaksiner, slik som en cocktail av ett eller flere individuelle peptider, ett eller flere peptider ifølge beskrivelsen omfattet av et polyepitoppeptid, eller nukleinsyrer som koder for slike individuelle peptider eller polypeptider, for eksempel et minigen som koder for et polyepitoppeptid. De "ett eller flere peptidene" kan inkludere enhver heltalls enhet fra 1-150 eller mer, for eksempel minst 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145 eller 150 eller flere peptider. Peptidene eller polypeptidene kan eventuelt være modifisert, slik som ved lipidering, påsetting av målsøkende sekvenser eller andre sekvenser. HLA-klasse-I-peptider kan bli blandet med eller bundet til, HLA-klasse-II-peptider, for å fremme aktivering av både cytotoksiske T-lymfocytter og hjelper-T-lymfocytter. HLA-vaksiner kan også omfatte peptidpulsede antigenpresenterende celler, f. eks. dendrittiske celler.

Uttrykket "variant" refererer til et molekyl som oppviser en variasjon fra en beskrevet type eller norm, slik som et protein som har én eller flere ulike aminosyrerester på de tilsvarende posisjonene på et spesifikt beskrevet protein (for eksempel STEAP-1-proteinet som er vist i Figur 2 eller Figur 3). En analog er et eksempel på et variantprotein. Spleise-isoformer og enkeltnukleotidpolymorfismer (SNP) er ytterligere eksempler på varianter.

De "STEAP-l-beslektede proteinene" ifølge beskrivelsen inkluderer de som spesifikt er identifisert her, i tillegg til allelevarianter, konservative substitusjonsvarianter, analoger og homolger som kan bli isolert/generert ogkarakterisertuten unødvendig eksperimentering ved å følge fremgangsmåtene som er fremlagt her eller som er lett tilgjengelige på fagområdet. Fusjonsproteiner som kombinerer deler av ulike STEAP-l-proteiner eller fragmenter derav, i tillegg til fusjonsproteiner av et STEAP-l-protein og et heterologt polypeptid er også inkludert. Slike STEAP-l-proteiner blir kollektivt referert til som de STEAP-l-beslektede proteinene, proteiner ifølge beskrivelsen eller STEAP-1. Uttrykket "STEAP-1-beslektet protein" refererer til et polypeptidfragment av en STEAP-1-proteinsekvens på 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 eller flere enn 25 aminosyrer; eller minst 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 330, 335, 339 eller flere aminosyrer.

11. ) STEAP-l-polynukleotider

Beskrivelsen tilveiebringer polynukleotider som tilsvarer eller er komplementære til hele eller en del av et STEAP-l-gen, mRNA og/eller kodende sekvens, fortrinnsvis i isolert form, inkludert polynukleotider som koder for et STEAP-1-beslektet protein og fragmenter derav, DNA, RNA, DNA/RNA-hybrid og beslektede molekyler, polynukleotider eller oligonukleotider som er komplementære med et STEAP-l-gen eller mRNA-sekvens eller en del derav, og polynukleotider eller oligonukleotider som hybridiserer med et STEAP-l-gen, mRNA eller til et STEAP-1-kodende polynukleotid (kollektivt, "STEAP-l-polynukleotider"). I alle tilfeller, når det blir referert til i denne seksjonen, så kan T også være U i Figur 2.

Utførelsesformer av et STEAP-l-polynukleotid inkluderer: et STEAP-l-polynukleotid som har sekvensen som er vist ifølge Figur 2, nukleotidsekvensen for STEAP-1 som vist ifølge Figur 2 der T er U, minst 10 kontinuerlige nukleotider for et polynukleotid som har sekvensen som er vist ifølge Figur 2 eller minst 10 kontinuerlige nukleotider for et polynukleotid som har sekvensen som er vist ifølge Figur 2 der T er U. For eksempel omfatter utførelsesformer av STEAP-l-nukleotider: (I) et polynukleotid som omfatter, hovedsaklig består av eller består av en sekvens som vist ifølge Figur 2, der T også kan være U, (II) et polynukleotid som omfatter, hovedsaklig består av eller består av sekvensen som er vist ifølge Figur 2A, fra nukleotidrestnummer 66 til nukleotidrestt nr. 1085, inkludert stoppkodon, der T også kan være U, (III) et polynukleotid som omfatter, hovedsaklig består av eller består av sekvensen som vist ifølge Figur 2B, fra nukleotidrestnummer 96 til nukleotidrestnummer 872, inkludert stoppkodonet der T også kan være U. (IV) et polynukleotid som omfatter, som hovedsaklig består av eller består av sekvensen som vist ifølge Figur 2C, fra nukleotidrestnummer 96 til nukleotidrestnummer 944, inkludert stoppkodonet der T også kan være U. (V) et polynukleotid som består av, som hovedsaklig består av eller består av sekvensen som vist ifølge Figur 2D, fra nukleotidrestnummer 96 til nukleotidrestnummer 872, inkludert stoppkodonet der T også kan være U. (VI) et polynukleotid som består av, som hovedsaklig består av eller består av sekvensen som vist ifølge Figur 2E, fra nukleotidrestnummer 96 til nukleotidrestnummer 872, inkludert stoppkodonet der T også kan være U. (VII) et polynukleotid som omfatter, som hovedsaklig består av eller består av sekvensen som vist ifølge Figur 2F, fra nukleotidrestnummer 96 til nukleotidrestnummer 872, inkludert stoppkodonet der T også kan være U. (VIII) et polynukleotid som omfatter, som hovedsaklig består av eller består av sekvensen som vist ifølge Figur 2G, fra nukleotidrestnummer 96 til nukleotidrestnummer 872, inkludert stoppkodonet der T også kan være U.

(IX) et polynukleotid som omfatter, som hovedsaklig består av eller består av sekvensen som vist ifølge Figur 2H, fra nukleotidrestnummer 96 til nukleotidrestnummer 872, inkludert stoppkodonet der T også kan være U.

(X) et polynukleotid som omfatter, som hovedsaklig består av eller består av sekvensen som vist ifølge Figur 21, fra nukleotidrestnummer 96 til nukleotidrestnummer 872, inkludert stoppkodonet der T også kan være U.

(XI) et polynukleotid som omfatter, som hovedsaklig består av eller består av sekvensen som vist ifølge Figur 2J, fra nukleotidrestnummer 96 til nukleotidrestnummer 872, inkludert stoppkodonet der T også kan være U.

(XII) et polynukleotid som omfatter, som hovedsaklig består av eller består av sekvensen som vist ifølge Figur 2K, fra nukleotidrestnummer 96 til nukleotidrestnummer 872, inkludert stoppkodonet der T også kan være U.

(XIII) et polynukleotid som omfatter, som hovedsaklig består av eller består av sekvensen som vist ifølge Figur 2L, fra nukleotidrestnummer 96 til nukleotidrestnummer 872, inkludert stoppkodonet der T også kan være U.

(XIV) et polynukleotid som omfatter, som hovedsaklig består av eller består av sekvensen som vist ifølge Figur 2M, fra nukleotidrestnummer 96 til nukleotidrestnummer 872, inkludert stoppkodonet der T også kan være U.

(XV) et polynukleotid som omfatter, som hovedsaklig består av eller består av sekvensen som vist ifølge Figur 2N, fra nukleotidrestnummer 96 til nukleotidrestnummer 872, inkludert stoppkodonet der T også kan være U.

(XVI) et polynukleotid som omfatter, som hovedsaklig består av eller består av sekvensen som vist ifølge Figur 20, fra nukleotidrestnummer 96 til nukleotidrestnummer 872, inkludert stoppkodonet der T også kan være U.

(XVII) et polynukleotid som omfatter, som hovedsaklig består av eller består av sekvensen som vist ifølge Figur 2P, fra nukleotidrestnummer 96 til nukleotidrestnummer 872, inkludert stoppkodonet der T også kan være U.

(XVIII) et polynukleotid som omfatter, som hovedsaklig består av eller består av sekvensen som vist ifølge Figur 2Q, fra nukleotidrestnummer 96 til nukleotidrestnummer 872, inkludert stoppkodonet der T også kan være U.

(XIX) et polynukleotid som koder for et STEAP-1-beslektet protein som er minst 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 eller 100 % homologt med en hel aminosyresekvens vist ifølge Figur 2A-Q.

(XX) et polynukleotid som koder for et STEAP-1-beslektet protein som er minst 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 eller 100 % identisk med en hel aminosyresekvens vist ifølge Figur 2A-Q.

(XXI) et polynukleotid som koder for minst et peptid fremlagt ifølge Tabellene V-XVIII og XXII-LI som fremlagt i US patentsøknad 10/236 878, innsendt 6. september 2002, der det spesifikke innholdet av denne fullt ut er inkorporert her ved referanse.

(XXII) et polynukleotid som koder for en peptidregion på minst 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminosyrer for et peptid ifølge Figur 3A i enhver trinnvis heltallig økning opp til 339 som inkluderer minst 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 eller 35 aminosyreposisjoner som har en verdi som er større enn 0,5 i hydrofilisitetsprofilen ifølge Figur 5,

(XXIII) et polynukleotid som koder for en peptidregion på minst 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminosyrer for et peptid ifølge Figur 3A i enhver trinnvis heltallig økning opp til 339

som inkluderer 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 eller 35 aminosyreposisjoner som har en verdi på mindre enn 0,5 i hydropatisitetsprofilen ifølge Figur 6,

(XXIV) et polynukleotid som koder for en peptidregion på minst 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminosyrer for et peptid ifølge Figur 3A i enhver trinnvis heltallig økning opp til 339 som inkluderer minst 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 eller 35 aminosyreposisjoner som har en verdi som er større enn 0,5 i profilen over prosentvis tilgjengelige rester ifølge Figur 7,

(XXV) et polynukleotid som koder for en peptidregion på minst 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminosyrer for et peptid ifølge Figur 3A i enhver trinnvis heltallig økning opp til 339 som inkluderer minst 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 eller 35 aminosyreposisjoner som har en verdi som er større enn 0,5 i profilen over gjennomsnittlig fleksibilitet ifølge Figur 8,

(XXVI) et polynukleotid som koder for en peptidregion på minst 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminosyrer for et peptid ifølge Figur 3A i enhver trinnvis heltallig økning opp til 339 som inkluderer 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 eller 35 aminosyreposisjoner som har en verdi som er større enn 0,5 i beta-sving-profilen ifølge Figur 9,

(XXVII) et polynukleotid som koder for en peptidregion på minst 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminosyrer for et peptid ifølge Figur 3B og 3D i enhver trinnvis heltallig økning opp til 258 som inkluderer 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 eller 35 aminosyreposisjoner som har en verdi som er større enn 0,5 i hydrofilisitetsprofilen ifølge Figur 5,

(XXVIII) et polynukleotid som koder for en peptidregion på minst 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminosyrer for et peptid ifølge Figur 3B og 3D i enhver trinnvis heltallig økning opp til 258 som inkluderer 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 eller 35 aminosyreposisjoner som har en verdi som er mindre enn 0,5 i hydropatisitetsprofilen ifølge Figur 6,

XXIX)et polynukleotid som koder for en peptidregion på minst 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminosyrer for et peptid ifølge Figur 3B og 3D i enhver trinnvis heltallig økning opp til 258 som inkluderer 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 eller 35 aminosyreposisjoner som har en verdi som er større enn 0,5 i profilen over prosentvis tilgjengelige rester ifølge Figur 7,

XXX) et polynukleotid som koder for en peptidregion på minst 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminosyrer for et peptid ifølge Figur 3B og 3D i enhver trinnvis heltallig økning opp til 258 som inkluderer 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 eller 35 aminosyreposisjoner som har en verdi som er større enn 0,5 i profilen over gjennomsnittlig fleksibilitet ifølge Figur 8,

XXXI) et polynukleotid som koder for en peptidregion på minst 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminosyrer for et peptid ifølge Figur 3B og 3D i enhver trinnvis heltallig økning opp til 258 som inkluderer 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 eller 35 aminosyreposisjoner som har en verdi som er større enn 0,5 i beta-sving-profilen ifølge Figur 9,

XXXII) et polynukleotid som koder for en peptidregion på minst 5, 6, 7, 8, 9, 10,

11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminosyrer for et peptid ifølge Figur 3C i enhver trinnvis heltallig økning opp til 282 som inkluderer 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 eller 35 aminosyreposisjoner som har en verdi som er større enn 0,5 i hydrofilitetsprofilen ifølge Figur 5,

(XXXIII) et polynukleotid som koder for en peptidregion på minst 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminosyrer for et peptid ifølge Figur 3C i enhver trinnvis heltallig økning opp til 282 som inkluderer 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 eller 35 aminosyreposisjoner som har en verdi som er mindre enn 0,5 i hydropatisitetsprofilen ifølge Figur 6,

XXXIV) et polynukleotid som koder for en peptidregion på minst 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminosyrer for et peptid ifølge Figur 3C i enhver trinnvis heltallig økning opp til 282 som inkluderer 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 eller 35 aminosyreposisjoner som har en verdi som er større enn 0,5 i profilen over prosentvis tilgjengelige rester ifølge Figur 7,

XXXV) et polynukleotid som koder for en peptidregion på minst 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminosyrer for et peptid ifølge Figur 3C i enhver trinnvis heltallig økning opp til 282 som inkluderer 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 eller 35 aminosyreposisjoner som har en verdi som er større enn 0,5 i profilen over gjennomsnittlig fleksibilitet ifølge Figur 8,

XXXVI) et polynukleotid som koder for en peptidregion på minst 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminosyrer for et peptid ifølge Figur 3C i enhver trinnvis heltallig økning opp til 282 som inkluderer 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 eller 35 aminosyreposisjoner som har en verdi som er større enn 0,5 i beta-sving-profilen ifølge Figur 9,

(XXVII) et polynukleotid som er fullt komplementært med et polynukleotid ifølge enhver av (I)-(XXXVI),

(XXVIII) et polynukleotid som er fullt komplementært med et polynukleotid ifølge enhver av (I)-(XXXVII),

(XXXIX) et peptid som er kodet for av enhver av (I) til (XXXVIIII), og

(XL) et preparat som omfatter en polynukleotid ifølge enhver av (I)-(XXXVIII) eller peptid ifølge (XXXIX) sammen med en farmasøytisk eksipiens og/eller i en human enhetsdoseringsform,

(XLI) en fremgangsmåte for å benytte et polynukleotid ifølge enhver av (I)-(XXXVIII) eller peptid ifølge (XXXIX) eller et preparat ifølge (XL) i en fremgangsmåte for å modulere en celle som uttrykker STEAP-1,

(XLII) en fremgangsmåte for å benytte et polynukleotid ifølge enhver av (I)-(XXXVIII) eller peptid ifølge (XXXIX) eller et preparat ifølge (XL) i en fremgangsmåte for å diagnostisere, profylaksebehandle, prognostisere eller behandle et individ som bærer en celle som uttrykker STEAP-1,

(XLIII) en fremgangsmåte for å benytte et polynukleotid ifølge enhver av (I)-(XXXVIII) eller peptid ifølge (XXXIX) eller et preparat ifølge (XL) i en fremgangsmåte for å diagnostisere, profylaksebehandle, prognostisere eller behandle et individ som bærer en celle som uttrykker STEAP-1, der nevnte celle er fra en kreftform i et vev fremlagt i Tabell I,

(XLIV) en fremgangsmåte for å benytte et polynukleotid ifølge enhver av (I)-(XXXVIII) eller peptid ifølge (XXXIX) eller et preparat ifølge (XL) i en fremgangsmåte for å diagnostisere, profylaksebehandle, prognostisere og behandle en kreftform,

(XLV)en fremgangsmåte for å benytte et polynukleotid ifølge enhver av (I)-(XXXVIII) eller peptid ifølge (XXXIX) eller et preparat ifølge (XL) i en fremgangsmåte for å diagnostisere, profylaksebehandle, prognostisere eller behandle en kreftform i et vev som er fremlagt i Tabell I, og

(XLVI) en fremgangsmåte for å benytte et polynukleotid ifølge enhver av (I)-(XXXVIII) eller peptid ifølge (XXXIX) eller et preparat ifølge (XL) i en fremgangsmåte for å identifisere eller karakterisere en modulator av en celle som uttrykker STEAP-1.

Som benyttet her er et område forstått å skulle spesifikt tilkjennegi alle helenhetsposisjoner derav.

Typiske kan STEAP-l-polynukleotider kode for spesifikke deler av STEAP-l-mRNA-sekvenser (og de som er komplementære med slike sekvenser) slik som de som koder for proteiner og/eller fragmentene derav, for eksempel: (a) 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 330, 335, 339 eller flere kontinuerlige aminosyrer for STEAP-l-variant-1, de maksimale lengdene som er relevante for andre varianter er: variant-2, 258 aminosyrer, variant-3, 282 aminosyrer og variant-4, 258 aminosyrer.

For eksempel representativer som er beskrevet herinkluderer: polynukleotider og deres kodede peptider selv som koder for omtrent aminosyre 1 til omtrent aminosyre 10 for STEAP-1-proteinet som vist ifølge Figur 2 eller Figur 3, polynukleotider som koder for omtrent aminosyre 10 til omtrent aminosyre 20 for STEAP-l-proteinet som er vist ifølge Figur 2 eller Figur 3, polynukleotider som koder for omtrent aminosyre 20 til omtrent aminosyre 30 for STEAP-l-proteinet som er vist ifølge Figur 2 eller Figur 3, polynukleotider som koder for omtrent aminosyre 30 til omtrent aminosyre 40 for STEAP-l-proteinet som er vist ifølge Figur 2 eller Figur 3, polynukleotider som koder for omtrent aminosyre 40 til omtrent aminosyre 50 for STEAP-l-proteinet som er vist ifølge Figur 2 eller Figur 3, polynukleotider som koder for omtrent aminosyre 50 til omtrent aminosyre 60 for STEAP-l-proteinet som er vist ifølge Figur 2 eller Figur 3, polynukleotider som koder for omtrent aminosyre 60 til omtrent aminosyre 70 for STEAP-l-proteinet som er vist ifølge Figur 2 eller Figur 3, polynukleotider som koder for omtrent aminosyre 70 til omtrent aminosyre 80 for STEAP-l-proteinet som er vist ifølge Figur 2 eller Figur 3, polynukleotider som koder for omtrent aminosyre 80 til omtrent aminosyre 90 for STEAP-l-proteinet som er vist ifølge Figur 2 eller Figur 3, polynukleotider som koder for omtrent aminosyre 90 til omtrent aminosyre 100 for STEAP-l-proteinet som er vist ifølge Figur 2 eller Figur 3, i trinnvise økninger på omtrent 10 aminosyrer, som slutter på den karboksyterminale aminosyren fremlagt i Figur 2 eller Figur 3. I henhold til dette er polynukleotidet som koder for deler av aminosyresekvensen (på omtrent 10 aminosyrer) for aminosyrene 100 til karboksyl-terminalaminosyren til STEAP-l-proteinet er beskrevet. Hvor det er forstått at hver spesielle aminosyreposisjon beskriver denne posisjonen pluss eller minus fem aminosyrerester.

Polynukleotider som koder for relativt lange deler av et STEAP-1-protein er også beskrevet. Foreksempel kan polynukleotider som koder for fra omtrent aminosyre 1 (eller 20 eller 30 eller 40 osv.) til omtrent aminosyre 20 (eller 30 eller 40 eller 50 osv.) for STEAP-l-proteinet "eller varianten" som er vist ifølge Figur 2 eller Figur 3 bli generert ved hjelp av en mengde ulike teknikker som er velkjente på fagområdet. Disse polynukleotidfragmentene kan inkludere enhver del av STEAP-1-sekvensen som vist ifølge

Figur 2.

Også beskrevet her er STEAP-l-polynukleotidfragmenter som koder for ett eller flere av de biologiske motivene som er inneholdt i en STEAP-l-proteinsekvens, "eller variantsekvens", inkludert én eller flere av de motivbærende undersekvensene av et STEAP-1-protein "eller variant", som er fremlagt ifølge Tabellene V-XVIII og XXII-LI. Typiske polynukleotidfragmenter koder for én eller flere av regionene i STEAP-l-proteinet eller varianten som oppviser homologi med et kjent molekyl. Typiske polynukleotidfragmenter kan kode for ett eller flere av STEAP-proteinsetene eller variant-N-glykosyleringssetene, cAMP- og cGMP-avhengig proteinkinasefosforyleringssetene, kaseinkinase-II-fosforylerings-setene eller N-myristoyleringssetet og amideringssetet.

Legg merke til at for å bestemme startposisjonen for ethvert peptid fremlagt ifølge Tabellene V-XVIII og Tabellene XXII til LI (kollektivt, HLA-peptidtabeller) med hensyn på dets morprotein, f. eks. variant-1, variant-2, ble referansegjort til tre faktorer: den spesielle varianten, lengden av peptidet i en HLA-peptidtabell og søkningspeptidene som er angitt ifølge Tabell LII. Vanligvis blir et unikt søkerpeptid benyttet for å fremskaffe HLA-peptider for en spesiell variant. Posisjonen for hvert søkepeptid relativt i forhold til dets respektive mormolekyl, er angitt ifølge Tabell LII. Hvis et søkepeptid begynner på posisjon "X", må man i overensstemmelse med dette plusse på verdien "X minus 1" på hver posisjon i Tabellene V-XVIII og Tabellene XXII-LI for å finne den faktiske posisjonen for HLA-peptidene i deres mormolekyl. Hvis et spesielt søkepeptid for eksempel begynner på posisjon 150 i dets mormolekyl, må man plusse på 150 - 1, dvs. 149 på hver HLA-peptidaminosyreposisjon for å beregne posisjonen for denne aminosyren i mormolekylet.

ILA.) Anvendelser av STEAP-l-polynukleotider

II.A.l.) Overvåkning av genetiske unormalheter

Polynukleotidene i de foregående avsnittene har et antall ulike spesifikke anvendelser. Det humane STEAP-l-genet ligger på den kromosomale lokaliseringen som er fremlagt i eksempelet med tittelen "kromosomal kartlegging av STEAP-1". Fordi STEAP-l-genet ligger på dette kromosomet, blir for eksempel polynukleotider som koder for ulike regioner i STEAP-l-proteinene benyttet for å karakterisere cytogenetiske unormalheter på dette kromosomale stedet, slik som unormalheter som er identifisert som å være assosiert med ulike kreftformer. I visse gener har en mengde kromosomale unormalheter inkludert rearrangeringer blitt identifisert som hyppige cytogenetiske unormalheter i et antall ulike kreftformer (se f. eks. Krajinovic et al., Mutat. Res. 382(3-4): 81-83 (1998), Johansson et al., Blood 86(10): 3905-3914 (1995) og Finger et al., P.N.A.S. 85(23): 9158-9162 (1988)). Slik tilveiebringer polynukleotider som koder for spesifikke regioner i STEAP-l-proteinene nye redskaper som kan bli benyttet for å utlede, med større presisjon enn det som tidligere har vært mulig, cytogenetiske unormalheter i den kromosomale regionen som koder for STEAP-1 som kan bidra til den maligne fenotypen. I denne konteksten oppfyller disse polynukleotidene et behov på fagområdet for å utvide sensitiviteten ved kromosomal screening for å kunne identifisere mer subtile og mindre vanlige kromosomale unormalheter (se f. eks. Evans et al., Am. J. Obstet. Gynecol, 171(4): 1055-1057 (1994)).

Siden STEAP-1 ble vist å være høyt uttrykt i prostatakreft og andre kreftformer blir videre STEAP-l-polynukleotider benyttet i fremgangsmåter som undersøker statusen for STEAP-l-genprodukter i normalt vev i forhold til kreftrammede vev. Typisk blir polynukleotider som koder for spesifikke regioner i STEAP-l-proteinet benyttet til å undersøke tilstedeværelsen av avvik (slik som delesjoner, insersjoner, punktmutasjoner eller endringer som fører til et tap av et antigen osv.) i spesifikke regioner i STEAP-l-genet, slik som regioner som inneholder ett eller flere motiver. Eksempelmessige analyser inkluderer både RT-PCR-analyser i tillegg til enkelttråd konformasjonspolymorfisme (SSCP)-analyse (se f. eks. Marriogi et al., J. Cutan. Pathol., 26(8): 369-378 (1999), der begge benytter polynukleotider som koder for spesifikke regioner for et protein for å undersøke disse regionene innenfor proteinet.

II.A.2.) Antisensutførelsesformer

Andre spesifikt omfattede nukleinsyrebr som er beskrevet er genomisk DNA, cDNA, ribozymer og antisensmolekyler, i tillegg til nukleinsyremolekyler basert på en alternativ rygg rad struktur, eller inkludert alternative baser, uansett om de er avledet fra naturlige kilder eller syntetisert, og inkluderer molekyler som er i stand til å inhibere RNA- eller proteinekspresjonen av STEAP-1. For eksempel kan antisensmolekyler være RNA eller andre molekyler, inkludert peptidnukleinsyrer (PNA) eller ikke-nukleinsyremolekyler slik som fosforotioatderivater som spesifikt binder DNA eller RNA på en baseparavhengig måte. En fagperson på området kan enkelt oppnå disse klassene av nukleinsyremolekyler ved å anvende STEAP-l-polynukleotidene og polynukleotidsekvensen som er beskrevet her.

Antisensteknologi omfatter administrering av eksogene oligonukleotider som binder et målpolynukleotid som er lokalisert innenfor cellene. Uttrykket "antisens" refererer til det faktumet at slike oligonukleotider er komplementære med deres intracellulære mål, for eksempel STEAP-1. Se f. eks. Jack Cohen, Oligodeoxynucleotides, Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, 1989, and Synthesis, 1:1-5 (1988). STEAP-l-antisens oligonukleotidene ifølge foreliggende oppfinnelse inkluderer derivater slik som S-oligonukleotider (fosforotioatderivater eller S-oligoer, se Jack Cohen, ovenfor), som oppviser forsterket kreftcellevekstinhibitorisk virkning. S-oligoer (nukleosidfosfortioater) er isoelektroniske analoger av et oligonukleotid (O-oligo) der et ikke-brodannende oksygenatom i fosfatgruppen blir erstattet med et svovelatom. S-oligoer ifølge foreliggende oppfinnelsen kan bli fremstilt ved behandling av de tilsvarende O-oligoene med 3H-1,2-benzoditiol-3-on-l,l-dioksid, som er et svoveloverføringsreagens. Se f. eks. lyer, R.P. et al., J. Org. Chem., 55:4693-4698 (1990) og lyer, R.P. et al., J. Am. Chem. Soc, 112:1253-1254 (1990). I tillegg inkluderer STEAP-l-antisens oligonukleotider ifølge foreliggende oppfinnelse morfolinoantisensoligonukleotider som er kjent på fagområdet (se f. eks. Partridge et al., 1996, Antisense & Nucleic Acid Drug Development 6: 169-175).

STEAP-l-antisens oligonukleotidene kan typisk være RNA eller DNA som er komplementært med og som stabilt hybridiserer med de første 100 5' kodon eller minst 100 3' kodon i en STEAP-l-genomisk sekvens eller det tilsvarende mRNA. Absolutt komplementaritet er ikke nødvendig, selv om høye grader av komplementaritet er foretrukket. Anvendelse av et oligonukleotid som er komplementært med denne regionen tillater den selektive hybridiseringen til STEAP-l-mRNA og ikke til mRNA som spesifiserer andre regulatoriske subenheter av proteinkinase. STEAP-l-antisens oligonukleotider kan være 15 til 30-mer-f rag menter av antisens-DNA-molekylet som har en sekvens som hybridiserer med STEAP-l-mRNA. Eventuelt er STEAP-l-antisensoligonukleotidet et 30-mer oligonukleotid som er komplementært med en region i de første 10 5' kodon eller minst 10 3' kodon i STEAP-1. Alternativt er antisensmolekylene modifisert for å benytte ribozymer i inhiberingen av STEAP-l-ekspresjon, se f. eks. L.A. Couture & D.T. Stinchcomb, Trends Genet, 12: 510-515 (1996).

II.A.3.) Primere og primerpar

Ytterligere spesifikke eksempler av disse nukleotidene ifølge oppfinnelsen inkluderer primere og primerpar, som tillater den spesifikke amplifiseringen av polynukleotider ifølge beskrivelsen eller av enhver spesifikk del derav, og prober som selektivt eller spesifikt hybridiserer med nukleinsyremolekylene ifølge beskrivelsen eller med enhver del derav. Prober kan bli merket med et påvisbart merke, slik som for eksempel en radioisotop, en fluorescerende forbindelse, en bioluminescerende forbindelse, en kjemiluminiscerende forbindelser, en metallchelator eller et enzym. Slike prober og primere blir benyttet for å påvise tilstedeværelsen av et STEAP-l-polynukleotid i en prøve og som et redskap til å påvise en celle som uttrykker et STEAP-l-protein.

Eksempler på slike prober inkluderer polypeptider som omfatter hele eller en del av den humane STEAP-l-cDNA-sekvensen som er vist i følge Figur 2. Eksempler på primerpar som er i stand til å spesifikt amplifisere STEAP-l-mRNA er også beskrevet i eksemplene. Slik det er åpenbart for fagfolk på området, kan en stor mengde ulike primere og prober bli fremstilt basert på sekvensene som er tilveiebrakt her, og benyttet effektiv for å amplifisere og/eller påvise et STEAP-l-mRNA.

STEAP-l-polynukleotidene ifølge oppfinnelsen er nyttige til en mengde formål, inkludert men ikke begrenset til deres anvendelse som prober og primere for amplifiseringen og/eller påvisningen av STEAP-1-genet/genene, mRNA eller fragmenter derav, som reagenser for diagnostiseringen og/eller prognosen av prostatakreft og andre kreftformer, som kodende sekvenser som er i stand til å styre ekspresjon av STEAP-1-polypeptider, som redskaper for å modulere eller inhibere ekspresjon av STEAP-1-genet/genene og/eller translasjon av STEAP-l-transkriptet/transkriptene, og som terapeutiske midler.

Foreliggende beskrivelse inkluderer anvendelsen av enhver probe som beskrevet her for å identifisere og isolere en STEAP-1- eller STEAP-1-beslektet nukleinsyresekvens fra en naturlig forekommende kilde, slik som mennesker eller andre pattedyr, i tillegg til den isolerte nukleinsyresekvensen perse, som vil omfatte hele eller det meste av sekvensene som er funnet i proben som blir benyttet.

II.A.4.) Isolering av STEAP-1-kodende nukleinsyremolekyler

STEAP-l-cDNA-sekvensene som er beskrevet her muliggjør isoleringen av andre polynukleotider som koder for STEAP-l-genprodukter, i tillegg til isoleringen av polynukleotider som koder for STEAP-l-genprodukt homologer, alternativt spleisede isoformer, allelevarianter og mutantformer av et STEAP-l-genprodukt i tillegg til polynukleotider som koder for analoger av STEAP-l-beslektede proteiner. Ulike molekylære kloningsfremgangsmåter som kan bli benyttet for å isolere fullengde-cDNA som koder for et STEAP-l-gen er velkjente (se f. eks. Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. utgave, Cold Spring Harbor press, New York, 1989, Current Protocols in Molecular Biology. Ausubel et al., red., Wiley and Sons, 1995). For eksempel kan lambdafag kloningsmetodikker hensiktsmessig bli benyttet, ved å anvende kommersielt tilgjengelige kloningssystemer (for eksempel lambda ZAP Express, Stratagene). Fagkloner som inneholder STEAP-l-gen-cDNA kan bli identifisert ved å probe med et merket STEAP-1-cDNA eller et fragment derav. I en utførelsesform kan for eksempel et STEAP-l-cDNA (for eksempel Figur 2) eller en del derav, bli syntetisert og benyttet som en probe for å fange inn overlappende og fullengde-cDNA som tilsvarer et STEAP-l-gen. Et STEAP-l-gen selv kan bli isolert ved å screene genomiske DNA-biblioteker, kunstige kromosombiblioteker fra bakterier (BAC), kunstig kromosombiblioteker fra gjær (YAC) og lignende, med STEAP-1-DNA-prober eller -primere.

II.A.5.) Rekombinante nukleinsyremolekyler og vert-vektor systemer

Beskrivelsen tilveiebringer også rekombinante DNA- eller RNA-molekyler som inneholder STEAP-l-polynukleotid, et fragment, en analog eller homolog derav, inkludert, men ikke begrenset til fag, plasmider, fagemider, kosmider, YAC, BAC i tillegg til ulike virusvektorer og ikke-virusvektorer som er velkjent på fagområdet, og celler som er transformert eller transfektert med slike rekombinante DNA- eller RNA-molekyler. Fremgangsmåter for å fremstille slike molekyler er velkjente (se f. eks. Sambrook et al., 1989, ovenfor).

Beskrivelsen tilveiebringer ytterligere et vert-vektor-system som omfatter et rekombinant DNA-molekyl som inneholder et STEAP-l-polynukleotid, fragment, analog eller homolog derav, i en passende prokaryot eller eukaryot vertscelle. Eksempler på passende eukaryote vertsceller inkluderer en gjærcelle, en plantecelle eller en dyrecelle, slik som en pattedyrcelle eller en insektscelle (for eksempel en baculovirus-infiserbar celle slik som en Sf9- eller HighFive-celle). Eksempler på passende pattedyrceller inkluderer ulike prostatakreftcellelinjer slik som DU 145 og TsuPrl, andre transfekterbare eller transduserbare prostatakreftcellelinjer, primære celler (PrEC), i tillegg til et antall pattedyrceller som rutinemessig ble benyttet til ekspresjonen av rekombinante proteiner (f. eks. COS-, CHO-, 293-, 293T-celler). Mer spesielt kan et polynukleotid som omfatter den kodende sekvensen for STEAP-1 eller et fragment, analog eller en homolog derav, bli benyttet for å fremstille STEAP-l-proteiner eller fragmenter derav ved å anvende ethvert antall av vert-vektor systemene som rutinemessig blir benyttet og som er godt kjent på fagområdet.

Et stort utvalgt av verts-vektor systemer som er passende til ekspresjonen av STEAP-l-proteiner eller fragmenter derav er tilgjengelige, se f. eks. Sambrook et al., 1989, ovenfor, Current Protocols In Molecular Biology, 1995, ovenfor). Foretrukne vektorer til pattedyrekspresjon inluderer pcDNA 3.1-myc-His-tag (Invitrogen) og retrovirusvektoren pSRatkeno (Muller et al., 1991, MCB 11:1785). Ved å anvende disse ekspresjonsvektorene kan STEAP-1 bli uttrykt i flere prostatakreftcellelinjer og ikke-prostatacellelinjer, inkludert for eksempel 293, 293T, rat-1, NIH 3T3 og TsuPrl. Vert-vektor systemene ifølge oppfinnelsen er nyttige for fremstillingen av et STEAP-l-protein eller fragment derav. Slike vert-vektor systemer kan bli benyttet for å undersøke de funksjonelle egenskapene til STEAP-1 og STEAP-l-mutasjoner eller -analoger.

Rekombinant, humant STEAP-l-protein eller en analog eller homolog eller fragment derav, kan bli fremstilt fra pattedyrceller som er transfektert med en konstruksjon som koder for et STEAP-l-beslektet nukleotid. For eksempel kan 293T-celler bli transfektert med et ekspresjonsplasmid som koder for STEAP-1 eller et fragment, en analog eller homolog derav, et STEAP-l-beslektet protein blir uttrykt i 293T-cellene, og det rekombinante STEAP-l-proteinet blir isolert ved å anvende standard rensefremgangsmåter (for eksempel affinitets ren sing ved å anvende anti-STEAP-l-antistoffer). En STEAP-1-kodende sekvens kan være subklonet inn i retrovirusvektoren pSRaMSVtkneo og benyttet til å infisere ulike pattedyrcellelinjer, slik som NIH 3T3, TsuPrl, 293 og rat-1 for å etablere STEAP-1-uttrykkende cellelinjer. Ulike andre ekspresjonssystemer som er velkjente på fagområdet kan også bli benyttet. Ekspresjonskonstruksjoner som koder for et lederpeptid koblet i ramme til en STEAP-l-kodende sekvens kan bli benyttet for å fremstille en utskilt form av rekombinant STEAP-l-protein.

Som diskutert her muliggjør overflødig heten i den genetiske koden variasjon i STEAP-1-gensekvenser. Spesielt er det kjent på fagområdet at spesifikke vertsarter ofte har spesifikke kodonpreferanser, og slik kan man tilpasse den beskrevete sekvensen slik det er foretrukket for en ønsket vert. For eksempel har typisk foretrukne analogkodonsekvenser sjeldne kodon (dvs. kodon som har en anvendelseshyppighet på mindre enn omtrent 10 % i kjente sekvenser hos den ønskede verten) erstattet med hyppigere benyttede kodon. Kodonpreferanser for en spesifikk art blir for eksempel beregnet ved å anvende kodonanvendelsestabeller som er tilgjengelige på internett slik som på URL-adressen dna.affrc.go.jp/~nakamura/codon.html.

Ytterligere sekvensmodifiseringer er kjent for å forsterke protein ekspresjon i en cellulær vert. Disse inkluderer eliminering av sekvenser som koder for kunstige polyadenyleringssignaler, exon/intron-spleisesetesignaler, transposonlignende repetisjoner og/eller andre slike ve I karakteriserte sekvenser som er skadelige for genekspresjon. GC-innholdet i sekvensen blir justert til nivåer som er gjennomsnittlige for en gitt cellulær vert, slik dette er beregnet med referanse til kjente sekvenser som er uttrykt i vertscellen. Der det er mulig, blir sekvensene modifisert for å unngå predikerte sekundære mRNA-hårnålsstrukturer. Andre nyttige modifiseringer inkluderer addisjonen av translasjonene initieringskonsensussekvenser på starten av den åpne leserammen, som beskrevet i Kozak, Mol. Cell. Biol., 9:5073-5080 (1989). Erfarne fagfolk forstår at den generelle regelen om at eukaryote ribosomer initierer translasjon kun på det 5' proksimale AUG-kodon blir opphevet kun under sjeldne betingelser (se f. eks. Kozak, PNAS, 92(7): 2662-2666 (1996) og Kozak NAR 15(20): 8125-8148 (1987)).

III. STEAP-l-beslektede proteiner

Også tilveiebragt er STEAP-l-beslektede proteiner. STEAP-l-proteiner kan omfatte et polypeptid som har hele eller deler av aminosyresekvensen til humant STEAP-1 som vist ifølge Figur 2 eller Figur 3, fortrinnsvis Figur 2A. Alternativt kan STEAP-l-proteiner omfatte variant, homolog eller analogpolypeptider som har endringer i aminosyresekvensen for STEAP-1 som vist ifølge Figur 2 eller Figur 3.

Utførelsesformer av et STEAP-l-polypeptid inkluderer: et STEAP-1-polypeptid som er en sekvens som vist ifølge Figur 2, en peptidsekvens for en STEAP-l-som vist ifølge Figur 2 der T er U, minst 10 kontinuerlige nukleotider for et polypeptid har sekvenser som vist ifølge Figur 2 eller minst 10 kontinuerlige peptider for et polypeptid som har sekvensen som vist ifølge Figur 2, der T er U. For eksempel omfatter STEAP-1-peptider: (I) et protein som omfatter, som hovedsaklig består av eller som består av en aminosyresekvens som vist i Figur 2A-Q eller Figur 3A-D, (II) et STEAP-l-beslektet protein som er minst 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 eller 100 % homlogt med en hel aminosyresekvens som vist ifølge Figur 2A-Q eller 3A-D, (III) et STEAP-l-beslektet protein som er minst 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 eller 100 % identisk med en hel aminosyresekvens som vist ifølge Figur 2A-Q eller 3A-D, (IV) et protein som omfatter minst et peptid fremlagt ifølge Tabell V eller LI som fremlagt ifølge US patentsøknad 10/236 878, innsendt 6. september 2002, der det spesifikke innholdet i denne hermed er fullt inkorporert ved referanse, eventuelt med et forbehold at det ikke er et helt protein ifølge Figur 2, (V) et protein som omfatter minst et peptid fremlagt ifølge Tabellene V-XVIII, kollektivt, der peptidet også er fremlagt i Tabellene XXII til LI, kollektivt, eventuelt med et forbehold om at det ikke er et helt protein ifølge Figur 2, (VI) et protein som omfatter minst to peptider som er valgt fra peptidene som er fremlagt ifølge Tabell V-LI, eventuelt met et forbehold om at det ikke er et helt protein ifølge Figur 2, (VII) et protein som omfatter minst to peptider som er valgt fra peptidene som er fremlagt ifølge Tabell V til LI kollektivt, med et forbehold om at proteinet ikke er en kontinuerlig sekvens fra en aminosyresekvens ifølge Figur 2, (VIII) et protein som omfatter minst et peptid som er valgt fra peptidene som er fremlagt ifølge Tabell V-XVIII, og minst et peptid som er valgt fra peptidene som er fremlagt ifølge Tabell XII til LI, med et forbehold om at proteinet ikke er en kontinuerlig sekvens fra en aminosyresekvens ifølge Figur 2,

(IX) et polypeptid som omfatter minst 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminosyrer for et protein ifølge Figur 3A i enhver trinnvis stigning med et helt tall opp til 339 som inkluderer minst 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminosyreposisjoner som har en verdi som er større enn 0,5 i hydrofilisitetsprofilen ifølge Figur 5,

(X) et polypeptid som omfatter minst 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminosyrer for et protein ifølge Figur 3A med henholdsvis en trinnvis stigning med et helt tall opp til 339 som inkluderer minst 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminosyreposisjoner som har en verdi som er større enn 0,5 i hydropatisitetsprofilen ifølge Figur 6,

(XI) et polypeptid som omfatter minst 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminosyrer for et protein ifølge Figur 3A i henholdsvis enhver trinnvis stigning med et helt tall opp til 339 som inkluderer minst 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminosyreposisjoner som har en verdi som er større enn 0,5 i profilen over prosentvis tilgjengelige rester ifølge Figur 7,

(XII) et polypeptid som omfatter minst 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16,

17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminosyrer for et protein ifølge Figur 3A i henholdsvis enhver trinnvis stigning med et helt tall opp til 339 som inkluderer minst 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminosyreposisjoner som har en verdi som er større enn 0,5 i profilen over gjennomsnittlig fleksibilitet ifølge Figur 8,

(XIII) et polypeptid som omfatter minst 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminosyrer for et protein ifølge Figur 3A i henholdsvis enhver trinnvis stigning med et helt tall opp til 339 som inkluderer minst 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminosyreposisjoner som har en verdi som er større enn 0,5 i beta-sving-profilen ifølge Figur 9,

(XIV) et polypeptid som omfatter minst 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminosyrer for et

protein ifølge Figur 3B eller 3D i henholdsvis enhver trinnvis stigning med et helt tall opp til 258 som inkluderer minst 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminosyreposisjoner som har en verdi som er større enn 0,5 i hydrofilisitetsprofilen ifølge Figur 5,

(XV) et polypeptid som omfatter minst 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminosyrer for et

protein ifølge Figur 3B eller 3D i henholdsvis en trinnvis stigning med et helt tall opp til 258 som inkluderer minst 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminosyreposisjoner som har en verdi som er større enn 0,5 i hydropatisitetsprofilen ifølge Figur 6,

(XVI) et polypeptid som omfatter minst 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminosyrer for et protein ifølge Figur 3B eller 3D i henholdsvis enhver trinnvis stigning med et helt tall opp til 258 som inkluderer minst 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminosyreposisjoner som har en verdi som er større enn 0,5 i profilen over prosentvis tilgjengelige rester ifølge Figur 7,

(XVII) et polypeptid som omfatter minst 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminosyrer for et protein ifølge Figur 3B eller 3D i henholdsvis enhver trinnvis stigning med et helt tall opp til 258 som inkluderer minst 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminosyreposisjoner som har en verdi som er større enn 0,5 i profilen over gjennomsnittlig fleksibilitet ifølge Figur 8,

(XVIII) et polypeptid som omfatter minst 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminosyrer for et protein ifølge Figur 3B eller 3D i henholdsvis enhver trinnvis stigning med et helt tall opp til 258 som inkluderer minst 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminosyreposisjoner som har en verdi som er større enn 0,5 i beta-sving-profilen ifølge Figur 9,

(XIX) et polypeptid som omfatter minst 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminosyrer for et protein ifølge Figur 3C i henholdsvis enhver trinnvis stigning med et helt tall opp til 282 som inkluderer minst 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminosyreposisjoner som har en verdi som er større enn 0,5 i hydrofilisitetsprofilen ifølge Figur 5,

(XX) et polypeptid som omfatter minst 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminosyrer for et protein ifølge Figur 3C i henholdsvis en trinnvis stigning med et helt tall opp til 282 som inkluderer minst 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22,

23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminosyreposisjoner som har en verdi som er større enn 0,5 i hydropatisitetsprofilen ifølge Figur 6,

(XXI) et polypeptid som omfatter minst 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminosyrer for et protein ifølge Figur 3C i henholdsvis enhver trinnvis stigning med et helt tall opp til 282 som inkluderer minst 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminosyreposisjoner som har en verdi som er større enn 0,5 i profilen over prosentvis tilgjengelige rester ifølge Figur 7,

(XXII) et polypeptid som omfatter minst 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminosyrer for et protein ifølge Figur 3C i henholdsvis enhver trinnvis stigning med et helt tall opp til 282 som inkluderer minst 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminosyreposisjoner som har en verdi som er større enn 0,5 i profilen over gjennomsnittlig fleksibilitet ifølge Figur 8,

(XXIII) et polypeptid som omfatter minst 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminosyrer for et protein ifølge Figur 3C i henholdsvis enhver trinnvis stigning med et helt tall opp til 282 som inkluderer minst 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminosyreposisjoner som har en verdi som er større enn 0,5 i beta-sving-profilen ifølge Figur 9,

(XXIV) et peptid som forekommer minst to ganger i Tabellene V-XVIII og XXII til LI kollektivt,

(XXV) et peptid som forekommer minst tre ganger i Tabellene VI-XVIII og XXII til LI kollektivt,

(XXVI) et peptid som forekommer minst fire ganger i Tabellene V-XXVIII og XXII til LI kollektivt,

(XXVII) et peptid som forekommer minst fem ganger i Tabellene V-XVIII og XXII til LI kollektivt,

(XXVIII) et peptid som forekommer minst én gang i Tabellene V-XVIII og minst én gang i Tabellene XXII til LI,

(XXIX) et peptid som forekommer minst én gang i Tabellene V-XVIII og minst to ganger i Tabellene XXII til LI,

(XXX) et peptid som forekommer minst to ganger i Tabellene V-XVIII og minst én gang i Tabellene XXII til LI,

(XXXI) et peptid som forekommer minst to ganger i Tabellene V-XVIII og minst to ganger i Tabellene XXII til LI,

(XXXII) et peptid som omfatter 1, 2, 3, 4 eller 5 av de følgende karakteristika, eller et oligonukleotid som koder for et slikt peptid: i) en region på minst 5 aminosyrer for et spesielt peptid ifølge Figur 3, i enhver trinnvis stigning med et helt tall opp til den fulle lengden for dette proteinet ifølge Figur 3, som inkluderer en aminosyreposisjon som har en verdi som er lik eller større enn 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, eller som har en verdi som er lik 1,0, i hydrofilisitetsprofilen ifølge Figur 5,

ii) en region på minst 5 aminosyrer for et spesielt peptid ifølge Figur 3, i enhver trinnvis stigning med et heltall opp til den fulle lengden av dette proteinet ifølge Figur 3, som inkluderer en aminosyreposisjon som har en verdi slik som lik eller mindre enn 0,5, 0,4, 0,3, 0,2, 0,1 eller som har en verdi som er lik med 0,0, i hydropatisitetsprofilen ifølge

Figur 6,

iii) en region på minst 5 aminosyrer for et spesielt peptid ifølge Figur 3, i enhver trinnvis stigning med et heltall opp til den fulle lengden av dette proteinet ifølge Figur 3, som inkluderer en aminosyreposisjon som har en verdi slik som lik eller større enn 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, eller som har en verdi som er lik med 1,0, i profilen over prosentvis tilgjengelige rester ifølge Figur 7,

iv) en region på minst 5 aminosyrer for et spesielt peptid ifølge Figur 3, i enhver trinnvis stigning med et heltall opp til den fulle lengden av dette proteinet ifølge Figur 3, som inkluderer en aminosyreposisjon som har en verdi slik som lik eller større enn 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, eller som har en verdi som er lik med 1,0, i profilen over gjennomsnittlig fleksibilitet ifølge Figur 8, eller

v) en region på minst 5 aminosyrer for et spesielt peptid ifølge Figur 3, i enhver trinnvis stigning med et heltall opp til den fulle lengden av dette proteinet ifølge Figur 3, som inkluderer en aminosyreposisjon som har en verdi slik som lik eller større enn 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, eller som har en verdi som er lik med 1,0, i beta-sving-profilen ifølge Figur 9,

(XXXIII) et preparat som omfatter et peptid ifølge (I)-(XXXII) eller et antistoff eller en bindingsregion derav sammen med en farmasøytisk eksipiens og/eller i en human enhetsdoseringsform,

(XXXIV) en fremgangsmåte for å benytte et peptid ifølge (I)-(XXXII) eller et antistoff eller en bindingsregion derav eller et preparat ifølge (XXXIII) i en fremgangsmåte for å modulere en celle som uttrykker STEAP-1,

(XXXV) en fremgangsmåte for å benytte et peptid ifølge (I)-(XXXII) eller et antistoff eller en bindingsregion derav eller et preparat ifølge (XXXIII) i en fremgangsmåte for å diagnostisere, profylaksebehandle, prognostisere eller behandle et individ som bærer en celle som uttrykker STEAP-1,

(XXXVI) en fremgangsmåte for å benytte et peptid ifølge (I)-(XXXII) eller et antistoff eller en bindingsregion derav eller et preparat ifølge (XXXIII) i en fremgangsmåte for å diagnostisere, profylaksebehandle, prognostisere eller behandle et individ som bærer en celle som uttrykker STEAP-1, der nevnte celle er fra en kreftform i et vev som er fremlagt ifølge Tabell I,

(XXXVII) en fremgangsmåte for å benytte et peptid ifølge (I)-(XXXII) eller et antistoff eller en bindingsregion derav eller et preparat ifølge (XXXIII) i en fremgangsmåte for å diagnostisere, profylaksebehandle, prognostisere eller behandle en kreftform,

(XXXVIII) en fremgangsmåte for å benytte et peptid ifølge (I)-(XXXII) eller et antistoff eller en bindingsregion derav eller et preparat ifølge (XXXIII) i en fremgangsmåte for å diagnostisere, profylaksebehandle, prognostisere eller behandle en kreftform i et vev som er fremlagt ifølge Tabell I, og

(XXXIX) en fremgangsmåte for å benytte et peptid ifølge (I)-(XXXII) eller et antistoff eller en bindingsregion derav eller et preparat ifølge (XXXIII) i en fremgangsmåte for å identifisere eller karakterisere en modulator av en celle som uttrykker STEAP-1.

Som benyttet her er et område forstått å skulle spesifikt tilkjennegi alle hele enhetsposisjoner derav.

Typiske kan STEAP-l-polynukleotider kode for spesifikke deler av STEAP-l-mRNA-sekvenser (og de som er komplementære med slike sekvenser) slik som de som koder for proteinene og/eller fragmentene derav, for eksempel: (a) 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 330, 335, 339 eller flere kontinuerlige aminosyrer for STEAP-l-variant-1, der de maksimale lengdene som er relevante for andre varianter er: variant-2, 258 aminosyrer, variant-3, 282 aminosyrer og variant-4, 258 aminosyrer.

Generelt deler naturlig forekommende allelevarianter av humant STEAP-1 en høy grad av strukturell identitet og homologi (for eksempel 90 % eller mer homologi). Typisk inneholder allele varianter av et STEAP-l-protein konservative aminosyresubstitusjoner innenfor STEAP-l-sekvensen som er beskrevet her eller inneholder en substitusjon av en aminosyre fra en tilsvarende posisjon på en homolog av STEAP-1. En klasse av STEAP-1-allelevarianter er proteiner som deler en høy grad av homologi med minst én liten region av en spesiell STEAP-l-aminosyresekvens, men som ytterligere inneholderen radikal endring fra sekvensen, slik som en ikke-konservativ substitusjon, trunkering, insersjoner eller rammeskift. Ved sammenligninger av proteinsekvenser har uttrykkene likhet, identitet og homologi hver bestemt betydning slik det er oppfattet på det genetiske fagområdet. Videre kan ortologi og paralogi være viktige konsepter som beskriver forholdet mellom medlemmer av en gitt proteinfamilie i en organisme med medlemmer av den samme familien i andre organismer.

Aminosyreforkortelser blir tilveiebrakt i Tabell II. Konservative aminosyresubstitusjoner kan ofte bli innført i et protein uten å endre verken konformasjonen eller funksjonen til proteinet. Proteiner ifølge beskrivelsen kan omfatte 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 konservative substitusjoner.

Også beskrevet her er et bredt utvalg av varianter eller analoger av STEAP-l-proteiner, slik disse er sitert på fagområdet, slik som polypeptider som har aminosyre-insersjoner, delesjoner og substitusjoner. STEAP-l-varianter kan bli fremstilt ved å anvende fremgangsmåter som er kjent på fagområdet, slik som seterettet mutagenese, alaninscanning og PCR-mutagenese. Seterettet mutagenese (Carter et al., Nucl. Acids Res., 13:4331 (1986), Zoller et al., Nucl. Acids Res., 10:6487 (1987)), kassettmutagenese (Wells et al., Gene, 34:315 (1985)), restriksjonsseleksjonsmutagenese (Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317:415 (1986)) eller andre kjente teknikker kan bli utført på det klonede DNA for å fremstille STEAP-1-variant-DNA.

Skanningsaminosyreanalyse kan også bli benyttet for å identifisere én eller flere aminosyrer langs en kontinuerlig sekvens som er involvert i en spesifikk, biologisk aktivitet, slik som en protein-protein interaksjon. Blant de foretrukne skanningsaminosyrene er relativt små, nøytrale aminosyrer. Slike aminosyrer inkluderer alanin, glysin, serin og cystein. Alanin er typisk en foretrukket skanningsaminosyre i denne gruppen fordi den eliminerer sidekjeden utover betakarbonet og endrer mindre sannsynlig hovedkjedekonformasjonen for varianten. Alanin er også typisk foretrukket fordi den er den mest vanlige aminosyren. Videre er den ofte funnet i både skjulte og eksponerte posisjoner (Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.), Chothia, J. Mol. Biol., 150:1 (1976)). Hvis alaninsubstitusjon ikke gir adekvate mengder av varianten, kan en isosterisk aminosyre bli benyttet.

Som definert her har STEAP-l-varianter, analoger eller homologer den spesielle attributtet av å ha minst én epitop som er "kryssreaktiv" med et STEAP-l-protein som har en aminosyresekvens ifølge Figur 3. Som benyttet i denne setningen betyr "kryssreaktiv" at et antistoff eller en T-celle som spesifikt binder til en STEAP-l-variant også spesifikt binder til et STEAP-l-protein som har en aminosyresekvens som fremlagt ifølge Figur 3. Et polypeptid slutter å være en variant av et protein som er vist ifølge Figur 3 når det ikke lenger inneholder noen epitoper som er i stand til å bli gjenkjent av et antistoff eller en T-celle som spesifikt binder til utgangs-STEAP-l-proteinet. Fagfolk på området vil forstå at antistoffer som gjenkjenner proteiner binder til epitoper av varierende størrelse, og at en gruppering av i området omtrent fire eller fem aminosyrer, kontinuerlig eller ikke, er ansett som et typisk antall aminosyrer i en minimal epitop. Se f. eks. Nair et al., J. Immunol, 2000 165(12): 6949-6955, Hebbes et al., Mol. Immunol (1989) 26(9):865-73, Schwartz et al., J. Immunol (1985) 135(4):2598-608.

Andre klasser av STEAP-l-beslektede proteinvarianter har 70 %, 75 %, 80 %,

85 % eller 90 % eller mer likhet med en aminosyresekvens ifølge Figur 3, eller et fragment derav. En annen spesifikk klasse av STEAP-l-proteinvarianter eller analoger omfatter ett eller flere av de STEAP-l-biologiske motivene som er beskrevet her eller som per i dag er kjent på fagområdet. Omfattet av foreliggende beskrivelse er slike analoger av STEAP-1-fragmenter (nukleinsyre eller aminosyre) som har endrede funksjonelle (f. eks.

immunogene) egenskaper relativt i forhold til utgangsfragmentet. Det er på det rene at motiver som er kjent nå eller som blir en del av fagområdet skal bli benyttet på nukleinsyresekvensene eller aminosyresekvensene ifølge Figur 2 eller Figur 3.

Som diskutert kan polypeptider inneholde mindre enn den fullstendige aminosyresekvensen for et STEAP-l-protein som vist ifølge Figur 2 eller Figur 3. For eksempel kan peptider/proteiner ha en hvilken som helst av 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 eller flere kontinuerlige aminosyrer for et STEAP-l-protein som vist i Figur 2 eller

Figur 3.

Også inkludert er polypeptider som består av omtrent aminosyre 1 til omtrent aminosyre 10 for et STEAP-l-protein som er vist ifølge Figur 2 eller Figur 3, polypeptider som består av omtrent aminosyre 10 til omtrent aminosyre 20 for et STEAP-l-protein som vist ifølge Figur 2 eller Figur 3, polypeptider som består av omtrent aminosyre 12 til omtrent aminosyre 30 for et STEAP-l-protein som vist ifølge Figur 2 eller Figur 3, polypeptider som består av omtrent aminosyre 30 til omtrent aminosyre 40 for et STEAP-l-protein som vist ifølge Figur 2 eller Figur 3, polypeptider som består av omtrent aminosyre 40 til omtrent aminosyre 50 for et STEAP-l-protein som vist ifølge Figur 2 eller Figur 3, polypeptider som består av omtrent aminosyre 50 til omtrent aminosyre 60 for et STEAP-l-protein som vist ifølge Figur 2 eller Figur 3, polypeptider som består av omtrent aminosyre 60 til omtrent aminosyre 70 for et STEAP-l-protein som vist ifølge Figur 2 eller Figur 3, polypeptider som består av omtrent aminosyre 70 til omtrent aminosyre 80 for et STEAP-l-protein som vist ifølge Figur 2 eller Figur 3, polypeptider som består av omtrent aminosyre 80 til omtrent aminosyre 90 for et STEAP-l-protein som vist ifølge Figur 2 eller Figur 3, polypeptider som består av omtrent aminosyre 90 til omtrent aminosyre 100 for et STEAP-l-protein som vist ifølge Figur 2 eller Figur 3 osv. gjennom hele en STEAP-1-aminosyresekvens. Videre er polypeptider som består av omtrent aminosyre 1 (eller 20 eller 30 eller 40 osv) til omtrent aminosyre 20 (eller 130 eller 140 eller 150 osv.) for et STEAP-l-protein som er vist i Figur 2 eller 3 er beskrevet. Det er på det rene at startposisjonene og stopposisjonene i dette avsnittet refererer til den spesifikke posisjonen i tillegg til denne posisjonen eller pluss eller minus 5 rester.

STEAP-l-beslektede proteiner ble fremstilt ved å anvende standard peptidsynteseteknologi eller ved å anvende kjemiske kløyvingsfremgangsmåter som er velkjente på fagområdet. Alternativt kan rekombinante fremgangsmåter bli benyttet for å generere nukleinsyremolekyler som koder for et STEAP-l-beslektet protein. Nukleinsyremolekyler kan tilveiebringe en måte for å generere definerte fragmenter for et STEAP-l-protein (eller varianter, homologer eller analoger derav).

III.A.) Motivbærende proteiner

Også beskrevet er STEAP-1-polypeptider som omfatter aminosyrerestene til ett eller flere av de biologiske motivene som er inneholdt i en STEAP-1-polypeptidsekvens som er fremlagt ifølge Figur 2 eller Figur 3. Ulike motiver er kjent på fagområdet, og et protein kan bli evaluert for tilstedeværelsen av slike motiver ved hjelp av et antall allment tilgjengelige internettsteder (se f. eks. URL-adressene: pfarn.wustl.edu/, searchlauncher.bcm.tmc.edu/seq-search/struc-predict.html, psort.ims.u-tokyo.ac.jp/, cbs.dtu.dk/, ebi.ac.uk/interpro/scan.html, expasy.ch/tools/scnpsitl.html, Epimatrix og Epimer, Brown University, brown.edu/Research/TB-HIV_Lab/epimatrix/epimatrix.html og BIMAS, bimas.dcrt.nih.gov/.).

Motivbærende sekvenser for alle STEAP-l-variantproteiner er fremlagt og identifisert i Tabellene V-XVIII og XXII-LI.

Tabell IV(h) fremlegger flere hyppig forekommende motiver basert på pfam-søk (se URL-adressen pfam.wustl.edu/). Kolonnene i Tabell IV(h) fremlegger (1) motivnavnforkortelse, (2) prosentvis identitet funnet i ulike medlemmer av motivfamilien, (3) motivnavn eller beskrivelse og (4) mest vanlige funksjon, lokaliseringsinformasjon er inkludert hvis motivet er relevant for lokaliseringen.

Polypeptider som omfatter ett eller flere av STEAP- 1-motivene som er diskutert ovenfor er nyttige for å finne ut av de spesifikke karakteristika for en malign fenotype i lys av observasjonen av at STEAP-1-motivene som er diskutert ovenfor er assosiert med vekstfeilregulering og fordi STEAP-1 er overuttrykt i visse kreftformer (se f. eks. Tabell 1). Kaseinkinase-II, cAMP og cAMP-avhengig proteinkinase og proteinkinase-C, for eksempel, er enzymer som er kjent for å være assosiert med utviklingen av den maligne fenotypen (se f. eks. Chen et al., Lab Invest., 78(2): 165-174 (1998), Gaiddon et al., Endocrinology 136(10): 4331-4338 (1995), Hall et al., Nucleic Acids Research 24(6): 1119-1126 (1996), Perterziel et al., Oncogene 18(46): 6322-6329 (1999) og 0'Brian, Oncol. Rep. 5(2): 305-309 (1998)). Videre er både glykosylering og myristoylering proteinmodifiseringer som også er assosiert med kreft og kreftprogresjon (se f. eks. Dennis et al., Biochem. Biophys. Acta, 1473(l):21-34 (1999), Raju et al., Exp. Cell Res., 235(1): 145-154 (1997)). Amidering er en annen proteinmodifisering som også er assosiert med kreft og kreftprogresjon (se f. eks. Treston et al., J. Nati. Cancer Inst. Monogr. (13): 169-175

(1992)).

Proteiner ifølge beskrivelsen omfatter én eller flere av de immunreaktive epitopene som er identifisert i overensstemmelse med fremgangsmåter som er akseptert på fagområdet, slik som peptidene som er fremlagt i Tabellene V-XVIII og XXII-LI. CTL-epitoper kan bli bestemt ved å anvende spesifikke algoritmer for å identifisere peptider i et STEAP-l-protein som er i stand til å ha optimal binding med spesifiserte HLA-alleler (for eksempel Tabell IV, Epimatrix og Epimer, Brown University, URL brown.edu/Research/TB-HIV_Lab/epimatrix/epimatrix.html og BIMAS, URL bimas.dcrt.nih.gov/.). Videre er prosesser for å identifisere peptider som har tilstrekkelig bindingsaffinitet for HLA-molekyler og som er korrelert med å være immunogene epitoper velkjente på fagområdet, og blir utført uten unødvendig eksperimentering. I tillegg er prosesser for å identifisere peptider som er immunogene epitoper velkjente på fagområdet, og blir utført uten unødvendig eksperimentering, enten in vitro eller in vivo.

Også kjent på fagområdet er prinsipper for å fremstille analoger av slike epitoper for å modulere immunogenisitet. For eksempel begynner man med en epitop som bærer et CTL- eller HTL-motiv (se f. eks. HLA-klasse-I og HLA-klasse-II motiver/supermotiver ifølge Tabell IV). Epitopen blir gjort til en analog ved å substituere ut en aminosyre på en av de spesifiserte posisjonene og erstatte den med en annen aminosyre som er spesifisert for denne posisjonen. På basis av rester som er definert i Tabell IV kan man for eksempel substituere ut en skadelig rest i favør av enhver annen rest, slik som en foretrukket rest, substituere en mindre foretrukket rest med en foretrukket rest eller substituere en originalt forekommende foretrukket rest med en annen foretrukket rest. Substitusjoner kan foregå på primære forankringsposisjoner eller på andre posisjoner i et peptid, se f. eks. Tabell IV.

En mengde referanser gjenspeiler fagområdet når det gjelder identifiseringen og genereringen av epitoper i et protein av interesse i tillegg til analoger derav. Se f. eks. WO 97/33602 til Chesnut et al., Sette, Immunogenetics 1999 50(3-4): 201-212, Sette et al., J. Immunol. 2001 166(2): 1389-1397, Sidney et al., Hum. Immunol. 1997, 58(1): 12-20, Kondo et al., Immunogenetics, 1997, 45(4): 249-258, Sidney et al., J. Immunol., 1996, 157(8): 3480-90 og Falk et al., Nature, 351: 290-6 (1991), Hunt et al., Science, 255: 1261-3 (1992), Parker et al., J. Immunol., 149:3580-7 (1992), Parker et al., J. Immunol., 152:163-75 (1994)), Kast et al., 1994, 152(8): 3904-12, Borras-Cuesta et al., Hum. Immunol. 2000, 61(3): 266-278, Alexander et al., J. Immunol., 2000, 164(3), 164(3): 1625-1633, Alexander et al., PMID: 7895164, Ul: 95202582, 0'Sullivan et al., J. Immunol., 1991, 147(8): 2663-2669, Alexander et al., Immunity, 1994, 1(9) : 751-761 og Alexander et al., Ummunol. Res., 1998, 18(2): 79-92.

Beskrivelsen omtaler også polypeptider som omfatter kombinasjoner av de ulike motivene som er fremlagt ifølge Tabell(s) IV(a), IV(b), IV(c), IV(d) og IV(h) og/eller én eller flere av de predikerte CTL-epitopene ifølge Tabellene V-XVIII og XXII-LI og/eller én eller flere av de predikerte HTL-epitopene ifølge Tabellene XLVIII-LI og/eller ett eller flere av T-cellebindingsmotivene som er kjent på fagområdet. De kan inneholde ingen insersjoner, delesjoner eller substitusjoner verken innenfor motivene eller innenfor de oppbrytende sekvensene i polypeptidene. I tillegg kan de inkludere et antall med enten N-terminale og/eller C-terminale aminosyrerester på begge sider av disse motivene være ønskelige (for eksempel å inkludere en større del av polypeptidarkitekturen der motivet er lokalisert). Typisk er antallet N-terminale og/eller C-terminale aminosyrerester på hver side av et motiv på mellom 1 til omtrent 100 aminosyrer, fortrinnsvis 5 til omtrent 50 aminosyrerester.

STEAP-l-beslektede proteiner er utført i mange former, fortrinnsvis i isolert form. Et renset STEAP-l-protein molekyl vil være vesentlig fritt for andre proteiner eller molekyler som ødelegger bindingen av STEAP-1 til antistoff, T-celle eller annen ligand. Egenskapene og graden av isolering og rensing vil være avhengig av den påtenkte anvendelsen. STEAP- 1-beslektet proteiner kan inkludere rensede STEAP-l-beslektede proteiner og funksjonelle, løselige STEAP-l-beslektede proteiner. Et funksjonelt, løselig STEAP-l-protein eller fragment derav kan beholde evnen til å bli bundet av antistoff, T-celle eller annen ligand.

Beskrivelsen tilveiebringer også STEAP-l-proteiner som omfatter biologisk aktive fragmenter av en STEAP-l-aminosyresekvens som vist i Figur 2 eller Figur 3. Slike proteiner oppviser egenskaper for utgangs-STEAP-l-proteinet, slik som evnen til å utløse genereringen av antistoffer som spesifikt binder en epitop som er assosiert med utgangs-STEAP-l-proteinet, som skal bli bundet av slike antistoffer, for å utløse aktiveringen av HTL eller CTL og/eller for å bli gjenkjent av HTL eller CTL som også spesifikt binder til utgangsproteinet.

STEAP-l-beslektede polypeptider som inneholder spesielt interessante strukturer kan bli predikert og/eller identifisert ved å anvende ulike analytiske teknikker som er velkjente på fagområdet, inkludert for eksempel fremgangsmåtene til Chou-Fasman, Garnier-Robson, Kyte-Doolittle, Eisenberg, Karplus-Schultz eller Jameson-Wolf-analyse, eller basert på immunogenisitet. Fragmenter som inneholder slike strukturer er spesielt nyttige for å generere s u be n hets pes if ikke anti-STEAP-l-antistoffer eller T-celler eller for å identifisere cellulære faktorer som binder til STEAP-1. For eksempel kan hydrofilisitetsprofiler bli generert og immunogenet peptidfragmenter kan bli identifisert ved å anvende fremgangsmåten til Hopp, T.P. og Woods, K.R., 1981, Proe. Nati. Acad. Sei., USA 78:3824-3828. Hydropatisitetsprofiler kan bli generert, og immunogene peptidfragmenter kan bli identifisert, ved å anvende fremgangsmåten til Kyte J. og Doolittle, R.f., 1982, J. Mol. Biol., 157:105-132. Profiler med prosentvis (%) tilgjengelige rester kan bli generert, og immunogene peptidfragmenter kan bli identifisert, ved å anvende fremgangsmåten til Janin, J., 1979, Nature, 277:491-492. Profiler for gjennomsnittlig fleksibilitet kan bli generert, og immunogene peptidfragmenter kan bli identifisert, ved å anvende fremgangsmåten til Bhaskaran R., Ponnuswarny P.K, 1988, Int. J. Pept. Protein Res. 32:242-255. Beta-sving-profiler kan bli generert, og immunogene peptidfragmenter kan bli identifisert, ved å anvende fremgangsmåten til Deleage, G., Roux B., 1987, Protein Engineering, 1:289-294.

CTL-epitoper kan bli bestemt ved å anvende spesifikke algoritmer for å identifisere peptider i et STEAP-l-protein som er i stand til å binde optimalt til spesifiserte HLA-alleler (for eksempel ved å anvende SYFPEITHI-stedet på internett-URL syfpeithi.bmi-heidelberg.com/, det som er fremlagt i Tabellene IV(A)-€, Epimatrix og Epimer, Brown University, URL (brown.edu/Research/TB-HIV_Lab/epimatrix/epimatrix.html) og BIMAS, URL bimas.dcrt.nih.gov/). For å illustrere dette ble peptidepitoper fra STEAP-1 som er presentert i konteksten med humane MHC-klasse-I-molekyler, foreksempel HLA-A1, -A2, - A3, -All, -A24, -B7 og -B35 predikert (se f. eks. Tabellene V-XVIII, XXII-LI). Spesifikt ble den fullstendige aminosyresekvensen til STEAP-l-proteinet og relevante deler av andre varianter, dvs. for HLA-klasse-I-prediksjoner av 9 flankerende rester på hver side av en punktmutasjon eller exonovergang, og for HLA-klasse-II-prediksjoner av 14 flankerende rester på hver side av en punktmutasjon eller exonovergang tilsvarende til denne varianten, lagt inn i HLA-peptidmotiv søkealgoritmen som er tilgjengelig på websiden til Bioinformatics og Molecular Analysis Section (BIMAS) som er gitt ovenfor, i tillegg til stedet SYFPEITHI på URL syfpeithi.bmi-heidelberg.com/.

HLA-peptidmotiv søkeralgoritmen ble utviklet av Dr. Ken Påker basert på binding av spesifikke peptidsekvenser i hulrommet på HLA-klasse-I-molekyler, spesielt HLA-A2 (se f. eks. Falk et al., Nature, 351: 290-6 (1991), Hunt et al., Science, 255: 1261-3 (1992), Parker et al., J. Immunol., 149:3580-7 (1992), Parker et al., J. Immunol., 152:163-75

(1994)). Denne algoritmen tillater lokalisering og rangering av 8-mer, 9-mer og 10-mer peptider fra en fullstendig proteinsekvens for å predikere binding til HLA-A2 i tillegg til utallige andre HLA-klasse-I-molekyler. Mange HLA-klasse-I-bindingspeptider er 8-, 9-, 10-eller 11-mer. For klasse-I-HLA-A2 inneholder epitopene fortrinnsvis en leucin (L) eller metionin (M) på posisjon-2 og et valin (V) eller leucin (L) på C-terminalen (se f. eks. Parker et al., J. Immunol., 149:3580-7 (1992)). Utvalgte resultater av STEAP-l-predikerte bindingspeptider er vist i Tabellene V-XVIII og XXII-LI her. I Tabellene V-XVIII og XXII-XLVIII er utvalgte kandidater, 9-mer og 10-mer, for hvert familiemedlem vist sammen med deres lokalisering, aminosyresekvensen for hvert spesifikke peptid og en estimert bindingsskåringsverdi. I Tabellene XLVIII-LI er utvalgte kandidater, 15-mer, for hvert familiemedlem vist sammen med deres lokalisering, aminosyresekvensen for hvert spesifikke peptid og en estimert bindingsskåringsverdi. Bindingsskåringsverdien tilsvarerer den estimerte halveringstiden for dissosiering av komplekser inneholdende peptider ved 37°C ved pH 6,5. Peptider med den høyeste bindingsskåringsverdien er predikert å være den som er tettest bundet til HLA-klasse-I på celleoverflaten i den lengste tidsperioden og som slik representerer de beste immunogene målene for T-cellegjenkjenning.

Faktisk binding av peptider til et HLA-allel kan bli evaluert ved stabilisering av HLA-ekspresjon på den antigenprosesserende manglende cellelinjen T2 (se f. eks. Xue et al., Prostate, 30:73-8 (1997) og Peshwa et al., Prostate, 36:129-38 (1998)). Immunogenisitet for spesifikke peptider kan bli evaluert in vitro ved stimulering av CD8+-cytotoksiske T-lymfocytter (CTL) i nærværet av antigenpresenterende celler slik som dendrittiske celler.

Det er på det rene at hver epitop som er predikert ved hjelp av BIMAS-stedet, Epimer- og Epimatrix-stedet eller som er spesifisert ved HLA-klasse-I- eller -klasse-II-motivene som er tilgjengelige på fagområdet, eller som blir en del av fagområdet, slik som fremlagt ifølge Tabell IV (eller som er bestemt ved å anvende internett-URL syfpeithi.bmi-heidelberg.com/ eller BIMAS, bimas.dcrt.nih.gov/) skal bli benyttet på et STEAP-l-protein i overensstemmelse med oppfinnelsen. Som benyttet i denne konteksten betyr "benyttet på" at et STEAP-l-protein er evaluert, dvs. visuelt eller ved hjelp av databaserte mønsterfunn fremgangsmåter, slik det er anerkjent av fagfolk på det relevante fagområdet. Hver undersekvens av et STEAP-l-protein på 8, 9, 10 eller 11 aminosyrerester som bærer et HLA-klasse-I-motiv, eller en undersekvens på 9 eller flere aminosyrerester som bærer et HLA-klasse-II-motiv er innenfor omfanget av beskrivelsen.

III.B.) Ekspresjon av STEAP-l-beslektede proteiner

STEAP-1 kan hensiktsmessig bli uttrykt i celler (slik som 293T-celler) transfektert med en kommersielt tilgjengelig ekspresjonsvektor slik som en CMV-drevet ekspresjonsvektor som koder for STEAP-1 med en C-terminal 6XHis og MYC-merke (pcDNA3.1/mycHIS, Invitrogen eller Tag5, GenHunter Coporation, Nashville TN). Tag5-vektoren tilveiebringer et IgGK-utskillingssignal som kan bli benyttet for å fremme produksjonen av et utskilt STEAP-l-protein i transfekterte celler. Dette utskilte HIS-merkede STEAP-1 i kulturmediet kan bli renset, forf. eks. ved å anvende en nikkelkolonne ved å anvende standardteknikker.

III.C.) Modifiseringer av STEAP-l-beslektede proteiner

Modifiseringer av STEAP-l-beslektede proteiner, slik som kovalente modifiseringer, er inkludert innenfor omfanget av denne beskrivelsen. En type kovalent modifisering inkluderer å reagere målaminosyrerester på et STEAP-1-polypeptid med et organisk derivatiserende middel som er i stand til å reagere med valgte sidekjeder eller med N- eller C-terminale rester på et STEAP-l-protein. En annen type kovalent modifisering av et STEAP-1-polypeptid som er inkludert i omfanget av denne beskrivelsen omfatter å endre det native glykosyleringsmønsteret for et protein ifølge beskrivelsen. En annen type kovalent modifisering av STEAP-1 omfatter å binde et STEAP-1-polypeptid til en av en mengde ulike ikke-proteininneholdende polymerer, f. eks. polyetylenglykol (PEG), polypropylenglykol eller polyoksyalkylener, på en måte som er fremlagt ifølge US patentskrift nr. 4 640 835, 4 496 689, 4 301 144, 4 670 417, 4 791 192 eller 4 179 337.

De STEAP-l-beslektede proteiner kan også bli modifisert for å danne et kimært molekyl som omfatter STEAP-1-fusjonert til en annen, heterolog polypeptidsekvens eller aminosyresekvens. Et slikt kimært molekyl kan bli syntetisert kjemisk eller rekombinant. Et kimært molekyl kan ha et protein ifølge beskrivelsen fusjonert til et annet tumorassosiert antigen eller fragment derav. Alternativt kan et protein i overensstemmelse med oppfinnelsen omfatte en fusjon av fragmenter fra en STEAP-l-sekvens (aminosyre eller nukleinsyre) slik at et molekyl blir dannet som ikke er, gjennom dets lengde, direkte homologt med amino- eller nukleinsyresekvensene som er vist i Figur 2 eller Figur 3. Et slikt kimært molekyl kan omfatte multipler av den samme undersekvensen av STEAP-1. Et kimært molekyl kan omfatte en fusjon av et STEAP-l-beslektet protein med et polyhistidinepitopmerke, som tilveiebringer en epitop på hvilken immobilisert nikkel selektivt kan binde, med cytokiner eller med vekstfaktorer. Epitopmerke blir generelt plassert på den aminoterminale eller karboksyterminale enden til et STEAP-l-protein. Det kimære molekylet omfatte en fusjon av et STEAP-l-beslektet protein med et immunglobulin eller en spesiell region på et immunglobulin. For en divalent form av det kimære molekylet

(også referert til som et "immunadhesin") kan en slik fusjon være til Fc-regionen på et IgG-molekyl. Ig-fusjoner inkluderer fortrinnsvis substitusjonen av en løselig (transmembrandomene deletert eller -inaktivert) form av et STEAP-1-polypeptid i stedet for minst én variabelregion innenfor et Ig-molekyl. Immunglobulinfusjon inkluderer fortrinsvis hengselregionen, CH2 og CH3, eller hengselregionene CH1, HC2 og CH3, i et IgGI-molekyl. For fremstilling av immunglobulinfusjoner, se f. eks. US patentskrift nr. 5 428 130, meddelt 27. juni, 1995.

III.D.) Anvendelser av STEAP-l-beslektede proteiner

Proteiner ifølge immunoglobulin har et antall ulike spesifikke anvendelser. Siden STEAP-1 er høyt uttrykt i prostatakreft og andre kreftformer, blir STEAP-l-beslektede proteiner benyttet i fremgangsmåter som undersøker statusen for STEAP-l-genprodukter i normalt i forhold til kreftrammede vev, for dermed å finne ut av den maligne fenotypen. Typisk blir polypeptider fra spesifikke regioner fra et STEAP-l-protein benyttet for å undersøke tilstedeværelsen av perturbasjoner (slik som delesjoner, insersjoner, punktmutasjoner osv.) i disse regionene (slik som regioner som inneholder ett eller flere motiver). Eksempelmessige analyser som benytter antistoffer eller T-celler som målsøker STEAP-l-beslektede proteiner omfatter aminosyrerestene til ett eller flere av de biologiske motivene som er inneholdt i en STEAP-1-polypeptidsekvens for å evaluere karakteristikaene for denne regionen i normalt vev i forhold til kreftrammet vev eller for å utløse en immunrespons mot epitopen. Alternativt blir STEAP-l-beslektede proteiner som inneholder aminosyrerester for ett eller flere av de biologiske motivene i et STEAP-l-protein benyttet for å screene etter faktorer som interagerer med denne regionen i STEAP-1.

STEAP-l-proteinfragmenter/-undersekvenser er spesielt nyttige for å generere og karakterisere domenespesifikke stoffer (for eksempel antistoffer som gjenkjenner en ekstracellulær eller intracellulær epitop på et STEAP-l-protein), for å identifisere midler eller cellulære faktorer som binder til STEAP-1 eller et spesielt strukturelt domene derav, og i ulike terapeutiske og diagnostiske kontekster, inkludert men ikke begrenset til diagnostiske analyser, kreftvaksiner og fremgangsmåte for å fremstille slike vaksiner.

Proteiner som er kodet for av STEAP-l-genet, eller av analoger, homologer eller fragmenter derav, har en mengde anvendelser, inkludert men ikke begrenset til generering av antistoffer og i fremgangsmåter for å identifisere ligander og andre midler og cellulære enheter som binder til et STEAP-l-genprodukt. Antistoffer som er frembrakt mot et STEAP-l-protein eller fragment derav er nyttige i diagnostiske og prognostiske analyser, og i synliggjøringsmetodikker i behandlingen av humane kreftformer som erkarakterisert vedekspresjon av STEAP-l-protein, slik som de som er fremlagt i Tabell I. Slike antistoffer kan bli uttrykt intracellulært og benyttet i fremgangsmåter for å behandle pasienter med slike kreftformer. STEAP-l-beslektede nukleinsyrer eller proteiner er også benyttet for å generere HTL- eller CTL-responser.

Ulike immunologiske analyser som er nyttige til påvisningen av STEAP-l-proteiner blir benyttet, inkludert men ikke begrenset til ulike typer radioimmunanalyser, enzymbundne immunosorbente analyser (ELISA), enzymbundne immunfluorescensanalyser (ELIFA), immuncytokjemiske fremgangsmåter og lignende. Antistoffer kan bli merket og benyttet som immunologiske avbildingsmidler som er i stand til å påvise STEAP-1-uttrykkende celler (foreksempel ved radioscintigrafiske synliggjøringsfremgangsmåter). STEAP-l-proteiner er også spesielt nyttige for å fremstille kreftvaksiner, slik det ytterligere er beskrevet her.

IV.) STEAP-1-antistoffer

Oppfinnelsen tilveiebringer antistoffersom definert i krav 1 og krav 2 som binder spesifikt til STEAP-1 og binder ikke til (eller binder svakt til) peptider eller proteiner som ikke er STEAP-l-beslektede proteiner ved fysiologiske betingelser. I denne konteksten inkluderer eksempler på fysiologiske betingelser: 1) fosfatbufret fysiologisk saltvann, 2) Tris-bufret fysiologisk saltvann inneholdende 25 mM Tris og 150 mM NaCI, eller normalt fysiologisk saltvann (0,9 % NaCI), 4) dyreserum slik som humant serum eller 5) en kombinasjon av enhver av 1) til 4), der disse reaksjonene fortrinnsvis foregår ved pH 7,5, alternativt i området med pH 7,0 til 8,0, eller alternativt i området med pH 6,5 til 8,5, og disse reaksjonene foregår også ved en temperatur på mellom 4°C til 37°C. For eksempel kan antistoffersom binder STEAP-1 binde STEAP-l-beslektede proteiner slik som homologene eller analogene derav.

STEAP-1-antistoffer ifølge oppfinnelsen er spesielt nyttige (se f. eks. Tabell I) ved kreftdiagnostiske og kreftprognostiske analyser, og synliggjøringsmetodikker. Likeledes er slike antistoffer nyttige i behandlingen, diagnostiseringen og/eller prognosen av prostatakreft og andre kreftformer, i det omfang STEAP-1 også er uttrykt eller overuttrykt i disse andre kreftformene. Videre er intracellulært uttrykte antistoffer (for eksempel enkeltkjede antistoffer) terapeutisk nyttige i behandling av kreft der ekspresjonen av STEAP-1 er involvert, slik som fremskreden eller metastatisk prostatakreft eller andre fremskredne eller metastatiske kreftformer.

Oppfinnelsen tilveiebringer også ulike immunologiske analyser som er nyttige til påvisningen og kvantifiseringen av STEAP-1 og mutante STEAP-l-beslektede proteiner. Slike analyser omfatter ett eller flere STEAP-l-antistoffer ifølge oppfinnelsen som er i stand til å gjenkjenne og binde et STEAP-l-beslektet protein. Disse analysene ble utført innenfor ulike immunologiske analyseformater som er velkjent på fagområdet, inkludert men ikke begrenset til ulike typer radioimmunanalyser, enzymbundne immunosorbente analyser (ELISA), enzymbundne immunfluorescensanalyser (ELIFA) og lignende.

Immunologiske ikke-antistoff analyser omfatter også T-celleimmunogenisitets-analyser (inhibitoriske eller stimulatoriske) i tillegg til vevsforlikelighetskompleks (MHC)-bindingsanalyser.

I tillegg blir immunologiske synliggjøringsfremgangsmåter som er i stand til å påvise prostatakreft og andre kreftformer som uttrykker STEAP-1 også tilveiebrakt, inkludert radioscintigrafiske synliggjøringsfremgangsmåter som benytter merkede STEAP-1-antistoffer. Slike analyser er klinisk nyttige i påvisning, overvåkningen og prognose av STEAP-1-uttrykkende kreftformer slik som prostatakreft.

STEAP-1-antistoffer blir også benyttet i fremgangsmåter for å rense STEAP-l-beslektet protein og for å isolere STEAP-l-homologer og beslektede molekyler. For eksempel omfatter en fremgangsmåte for å rense et STEAP-l-beslektet protein å inkubere et STEAP-1-antistoff, som har blitt koblet til en fast matriks, med et lysat eller annen løsning som inneholder et STEAP-l-beslektet protein ved betingelser som muliggjør STEAP-1-antistoffer og bindes til det STEAP-l-beslektede proteinet, vaske den faste matriksen for å eliminere urenheter og eluere det STEAP-l-beslektede proteinet fra det koblede antistoffet. Andre anvendelser av STEAP-1-antistoffer i overensstemmelse med oppfinnelsen inkluderer fremstilling av anti-idiotypiske antistoffer som hermer STEAP-l-protein.

Ulike fremgangsmåter for fremstillingen av antistoffer er velkjente på fagområdet. For eksempel kan antistoffer bli fremstilt ved å immunisere en passende pattedyrvert ved å anvende et STEAP-l-beslektet protein, peptid eller fragment, i isolert form eller i immun-konjugert form (Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press, red., Harlow og Lane (1988), Harlow, Antibodies, Cold Spring Harbor Press, NY (1989)). I tillegg kan fusjonsproteiner av STEAP-1 også bli benyttet, slik som et STEAP-1-GST-fusjonsprotein. Et GST-fusjonsprotein som omfatter hele eller det meste av aminosyresekvensen ifølge Figur 2 eller Figur 3 kan bli fremstilt, deretter benyttet som et immunogen for å generere passende antistoffer. Et STEAP-l-beslektet protein kan bli syntetisert og benyttet som et immunogen.

I tillegg blir naken-DNA-immuniseringsteknikker som er kjent på fagområdet benyttet (med eller uten renset STEAP-l-beslektet protein eller STEAP-1-uttrykkende celler) for å frembringe en immunrespons ovenfor det kodede immunogenet (for gjennomgang, se Donnelly et al., 1997, Ann. Rev. Immunol., 15: 617-648).

Aminosyresekvensen til et STEAP-l-protein som vist i Figur 2 eller Figur 3 kan bli analysert for å velge spesifikke regioner i STEAP-l-proteinet for fremstilling av antistoffer. For eksempel blir hydrofobisitets- og hydrofilisitetsanalyser av en STEAP-1-aminosyresekvens benyttet for å identifisere hydrofile regioner i STEAP-1-strukturen. Regioner i et STEAP-l-protein som viser immunogen struktur, i tillegg til andre regioner og domener, kan enkelt bli benyttet ved å anvende ulike andre fremgangsmåter som er kjent på fagområdet, slik som Chou-Fasman-, Garnier-Robson-, Kyte-Doolittle-, Eisenberg-, Karplus-Schultz- eller Jameson-Wolf-analyse. Hydrofilisitetsprofiler kan bli generert ved å anvende fremgangsmåten til Hopp, T.P. og Woods, K.R., 1981, Proe. Nati. Acad. Sei., USA, 78:3824-3828. Hydropatisitetsprofiler kan bli generert ved å anvende fremgangsmåten til Janin, J., 1979, nature, 277:491-492. Profiler med prosentvis (%) tilgjengelige rester kan bli generert ved å anvende fremgangsmåten til Janin J., 1979, Nature, 277:491-492. Profiler for gjennomsnittlig fleksibilitet kan bli generert ved å anvende fremgangsmåten til Bhaskaran R., Ponnuswarny P.K., 1988, Int. J. Pept. Protein Res., 32:242-255. Beta-sving-profiler kan bli generert ved å anvende fremgangsmåten til Deleage, G., Roux B., 1987, Protein Engineering, 1:289-294. Slik er hver region som er identifisert ved hjelp av ethvert av disse programmene eller fremgangsmåtene innenfor omfanget av foreliggende beskrivelse. Foretrukne fremgangsmåter for genereringen av STEAP-1-antistoffer er ytterligere illustrert ved hjelp av eksemplene som er tilveiebrakt her. Fremgangsmåter for å fremstille et protein eller polypeptid til anvendelse som et immunogen er velkjent på fagområdet. Også velkjent på fagområdet er fremgangsmåter for å fremstille immunogene konjugater av et protein med en bærer, slik som BSA, KLH eller annet bærerprotein. Visse tilfeller blir direkte konjugering ved å anvende for eksempel karbodiimidreagenser benyttet, og i andre tilfeller er bindingsreagenser slik som de som er tilveiebrakt av Pierce Chemical Co, Rockford, IL, effektive. Administrering av et STEAP-l-immunogen blir ofte utført ved injeksjon over en passende tidsperiode og ved anvendelse av en passende adjuvans, slik dette er forstått på fagområdet. I løpet av immuniseringsopplegget kan titre av antistoffer bli tatt for å bestemme hvor god antistoffdannelsen er.

Monoklonale STEAP-1-antistoffer kan bli fremstilt på mange ulike måter som er velkjente på fagområdet. For eksempel blir udødeliggjorte cellelinjer som utskiller et ønsket monoklonalt antistoff fremstilt ved å anvende standardhybridomteknologien til Kohler og Milstein eller modifikasjoner som udødeliggjør antistoff produserende B-celler, slik dette generelt er kjent. Udødeliggjorte cellelinjer som utskiller de ønskede antistoffene blir screenet ved hjelp av immunanalyse der antigenet er et STEAP-l-beslektet protein. Når den hensiktsmessige, udødeliggjorte cellekulturen er identifisert, kan cellene bli ekspandert og antistoffer produsert enten fra in vitro-kulturer eller fra ascitesvæske.

Antistoffene eller fragmentene ifølge oppfinnelsen kan også bli fremstilt på rekombinante metoder. Regioner som binder spesifikt til de ønskede regionene på et STEAP-l-protein kan også bli fremstilt i konteksten av kimære eller

komplementaritetsbestemmende region (CDR)-transplanterte antistoffer med opphav fra mange arter. Humaniserte eller humane STEAP-l-antistoffer kan også bli fremstilt, og er foretrukket for anvendelse i terapeutiske kontekster. Fremgangsmåter for humanisering av murine og andre ikke-humane antistoffer ved å substituere én eller flere av de ikke-humane antistoff-CDRene istedenfor tilsvarende humane antistoffsekvenser er velkjente (se f. eks. Jones et al., 1986, Nature, 321: 522-525, Reichmann et al., 1988, nature, 332: 323-327, Verhoeyen et al., 1988, Science, 239: 1534-1536). Se også Carter et al., 1993, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 89: 4285 og Suns et al., 1993, J. Immunol., 151:2296.

Fremgangsmåter for å fremstille fullt humane monoklonale antistoffer inkluderer phage-display og transgene fremgangsmåter (for en gjennomgang se Vaughan et al., 1998, Nature Biotechnology, 16: 535-539). Fullt humane monoklonale STEAP-1-antistoffer kan bli fremstilt ved å anvende kloningsteknikker som benytter store humane Ig-gen-kombinatoriske biblioteker (for eksempel phage-display) (Griffiths og Hoogenboom, Building an in vitro immune system: human antibodies from phage display libraries. I: Protein Engineering of Antibody Molecules for Prophylactic and Therapeutic Applications in Man, Clark, M. (red.), Nottingham Academic, s. 45-64 (1993), Burton og Barbas, Human Antibodies from combinatorial libraries, Id., s. 65-82). Fullt humane monoklonale STEAP-1-antistoffer kan også bli fremstilt ved å anvende transgene mus som er laget slik at de inneholder humane immunglobulin genlokus som beskrevet i PCT patentsøknad WO 98/24893, Kucherlapati og Jakobovits et al., publisert 3. desember, 1997 (se også Jakobovits, 1998, Exp. Opin. Invest. Drugs 7(4): 607-614, US patentskrift nr. 6 162 963, meddelt 19. desember 2000, 6 150 584, meddelt 12. november 2000 og 6 114 598, meddelt 5.september 2000). Denne fremgangsmåten unngår in vitro-manipulasjonen som er nødvendig med phage-display-teknologi og produserer effektivt humane autentiske høyaff i n itetsa ntistoffe r.

Reaktivitet for STEAP-1-antistoffer med et STEAP-l-beslektet protein kan bli etablert ved hjelp av et antall velkjente teknikker, inkludert Western-blot, immunpresipitering, ELISA- og FACS-analyser ved å anvende STEAP-l-beslektede proteiner, STEAP-1-uttrykkende celler eller ekstrakter derav. Et STEAP-1-antistoff eller fragment derav kan bli merket med et påvisbart merke eller konjugert til et annet molekyl. Passende påvisbare merker inluderer en radioisotop, en fluorescerende forbindelse, en bioluminiscerende forbindelse, en kjemiluminiscerende forbindelse, en metallchelator eller et enzym. Videre blir bispesifikke antistoffer som er spesifikke for to eller flere STEAP-1-epitoper generert ved å anvende fremgangsmåter som generelt er kjent på fagområdet. Homodimere antistoffer kan også bli generert ved hjelp kryssbindingsteknikker som er kjente på fagområdet (for eksempel Wolff et al., Cancer Res., 53: 2560-2565).

Oppfinnelsen tilveiebringer monoklonale antistoffer som er identifisert som musehybridom X120.545.1.1, deponert hos the American Type Culture Collection, lokalisert på 10801 University Blvd. Manassas, VA 20110-2209 den 6. februar 2004, og tilordnet ATCC-aksesjonsnummer PTA-5803.

V. STEAP-l-cellulære immunresponser

Mekanismen ved hvilken T-celler gjenkjenner antigener har blitt utledet. Effektive peptidepitop vaksinepreparater induserer en terapeutisk eller profylaktisk immunrespons i et svært bredt segment av verdenspopulasjonen. For en forståelse av verdien av og effektiviteten til preparater som induserer cellulær immunresponser blir en kort gjennomgang av immunologirelatert teknologi tilveiebrakt.

Et kompleks av et HLA-molekyl og et peptidantigen virker som liganden som blir gjenkjent av HLA-begrensende T-celler (Buus, S. et al., Cell, 47:1071, 1986, Babbitt, B.P. et al., Nature, 317:359, 1985, Townsend, A. og Bodmer, H., Annu. Rev. Immunol., 7:601, 1989, Germain, R.N., Annu. Rev. Immunol., 11:403, 1993). Via undersøkelsen av enkelte aminosyresubstituerte antigenanaloger og sekvenseringen av endogent bundet, naturlig prosesserte peptider var kritiske rester som tilsvarer motiver som er nødvendige for spesifikk binding til HLA-antigenmolekyler blitt en identifisert og fremlagt i Tabell IV (se også for eksempel Southwood, et al., J. Immunol., 160:3363, 1998, Rammensee, et al., Immunogenetics, 41:178, 1995, Rammensee et al., SYFPEITHI, med tilgang via internett-URL (134.2.96.221/scripts.hlaserver.dll/home.htm), Sette, A. og Sidney, J., Curr. Opin. Immunol., 10:478, 1998, Engelhard, V.H., Curr. Opin. Immunol., 6:13, 1994, Sette, A. og Grey, H.M., Curr. Opin. Immunol., 4:79, 1992, Sinigaglia, F. og Hammer, J., curr. Biol., 6:52, 1994, Ruppert et al., Cell, 74:929-937, 1993, Kondo et al., J. Immunol., 155:4307-4312, 1995, Sidney et al., J. Immunol., 157:3480-3490, 1996, Sidney et al., Human Immunol., 45:79-93, 1996, Sette, A. og Sidney, J. Immunogenetics, 1999, november, 50(3-4):201-12, Review).

Videre har røntgenkrystallografisk analyse av HLA-peptidkomplekser avslørt lommer i peptidbindingskløften/hulrommet i HLA-molekyler som på en allelspesifikk måte huser rester som er båret på peptidligander, der disse restene i sin tur bestemmer HLA-bindingskapasiteten til peptidene på hvilke de foreligger. (Se f. eks. Madden, D.R., Annu. Rev. Immunol., 13:587, 1995, Smith et al., Immunity, 4:203, 1996, Fremont et al., Immunity, 8:305, 1998, Stern et al., Structure, 2:245, 1994, Jones, E.Y., Curr. Opin. Immunol., 9:75, 1997, Brown, J.H., et al., Nature, 364:33, 1993, Guo, H.C. et al., Proe. Nati. Acad. Sei., USA 90:8053, 1993, Guo, H.C. et al., Nature, 360:364, 1992, Silver, M.L. et al., Nature, 360:367, 1992, Matsumura, M. et al., Science, 257:927, 1992, Madden et al., Cell, 70:1035, 1992, Fremont, D.H. et al., Science, 257:919, 1992, Såper, M.A., Bjorkman, P.J. og Wiley, D.C., J. Mol. Biol., 219:277, 1991).

I overensstemmelse med dette tillater definisjon av en klasse-I- og klasse-II-allelspesifikke HLA-bindingsmotiver, eller klasse-I- eller klasse-II-supermotiver identifiseringen av regioner i et protein som er korrelert med binding til spesielle HLA-antigener.

Ved hjelp av en prosess med HLA-motividentifisering har slike kandidater for epitopbaserte vaksiner blitt identifisert, der slike kandidater ytterligere kan bli evaluert ved hjelp av HLA-peptidbindingsanalyser for å bestemme bindingsaffinitet og/eller tidsperioden for assosiering av epitopen og dens korresponderende HLA-molekyl. Ytterligere bekreftende arbeid kan bli utført for å velge, blant disse vaksinekandidatene, epitoper med foretrukne karakteristika i kraft av populasjonsdekning og/eller immunogenisitet.

Ulike strategier kan bli benyttet for å evaluere cellulær immunogenisitet, inkludert: 1) Evaluering av primære T-cellekulturer fra normale individer (se f. eks. Wentworth, P.A. et al., Mol. Immunol. 32:603, 1995, Celis, E. et al., Proe. Nati. Acad. Sei., USA, 91:2105, 1994, Tsai, V. et al., J. Immunol., 158:1796, 1997, Kawashima, I. et al., Human Immunol., 59:1, 1998). Denne prosedyren involverer stimuleringen av perifere blodlymfocytter (PBL) fra normale individer med et testpeptid i nærvær av antigenpresenterende celler in vitro over en periode på flere uker. T-celler som er spesifikke for peptidet blir aktivert i løpet av denne tiden og blir påvist ved å anvende for eksempel en lymfokin- eller<51>Cr-frigjørende analyse som involverer peptidsensitiviserte målceller. 2) Immunisering av HLA-transgene mus (se f. eks. Wentworth, P.a. et al., J. Immunol., 26:97, 1996, Wentworth, P.A. et al., Int. Immunol., 8:651, 1996, Alexander, J. et al., J. Immunol., 159:4753, 1997). I slike fremgangsmåter blir for eksempel peptider i ukomplett Freunds adjuvans administrert subkutant til HLA-transgene mus. Flere uker etter immunisering blir splenocytter fjernet og dyrket in vitro i nærvær av testpeptid i omtrent en uke. Peptidspesifikke T-celler blir påvist ved å anvende for eksempel en<51>Cr-frigjøringsanalyse som involverer peptidsensitiviserte målceller og målceller som uttrykker endogent generert antigen. 3) Demonstrasjon av tilbakekall-T-celleresponser fra immune individer som enten har blitt effektivt vaksinert og/eller fra kronisk syke pasienter (se f. eks. Rehermann, B. et al., J. Exp. Med., 181:1047, 1995, Doolan, D.L. et al., Immunity, 7:97, 1997, Bertoni, R. et al., J. Clin. Invest., 100:503, 1997, Threlkeld, S.C. et al., J. Immunol., 159:1648, 1997, Diepolder, H.M. et al., J. Virol., 71:6011, 1997). I henhold til dette blir tilbakekallingsresponser påvist ved å dyrke PBL fra individer som har blitt eksponert for antigenet på grunn av sykdom og som slik har generert en immunrespons "naturlig", eller fra pasienter som ble vaksinert mot antigenet. PLB fra individer blir dyrket in vitro i 1-2 uker i nærvær av testpeptid pluss antigenpresenterende celler (APC) for å tillate aktivering av "hukommelses"-T-celler, sammenlignet med "naive" T-celler. På slutten av dyrkings-perioden blir T-celleaktivitet påvist ved å anvende analyser som inkluderer<51>Cr-frigjøring som involverer peptidsensitiviserte mål, T-celleproliferasjon eller lymfokinfrigjøring.

VI.) STEAP-l-transgene dyr

Nukleinsyrer som koder for et STEAP-l-beslektet protein kan også bli benyttet til å fremstille enten transgene dyr eller "knock out"-dyr som i sin tur er nyttige i utviklingen av screeningen av terapeutisk nyttige reagenser. I overensstemmelse med etablerte teknikker kan cDNA som koder for STEAP-1 bli benyttet til å klone genomisk DNA som koder for STEAP-1. De klonede genomiske sekvensene kan deretter bli benyttet til å generere transgene dyr som inneholder celler som uttrykker DNA som koder for STEAP-1. Fremgangsmåte for å generere transgene dyr, spesielt dyr slik som i mus eller rotter, har blitt konvensjonelle på fagområdet og beskrevet i for eksempel US patentskrift nr. 4 736 866, meddelt 12. april, 1998 og 4 870 009, meddelt 26. september, 1989. Typisk vil spesielle celler bli målrettet for STEAP-1-trasgen inkorporering med vevsspesifikke enhancere.

Transgene dyr som inkluderer en kopi av et transgen som koder for STEAP-1 kan bli benyttet til å undersøke effekten av økt ekspresjon av DNA som koder for STEAP-1. Slike dyr kan bli benyttet som testdyr for reagenser som er antatt å overføre beskyttelse fra for eksempel patologiske tilstander som er assosiert med dens overekspresjon. Et dyr kan bli behandlet med et reagens og en redusert fremkomst for en patologisk tilstand, sammenlignet med ubehandlede dyr som bærer transgener, vil indikere en potensiell, terapeutisk intervensjon for den patologiske tilstanden.

Alternativt kan ikke-humane homologer av STEAP-1 bli benyttet for å konstruere et STEAP-l-"knockout"-dyr som har et ødelagt eller endret gen som koder for STEAP-1 som er et resultat av homolog rekombinasjon mellom det endogene genet som koder for STEAP-1 og endret genomisk DNA som koder for STEAP-1 som er introdusert inn i en embryonal celle hos dyret. For eksempel kan cDNA som koder for STEAP-1 bli benyttet til å klone genomisk DNA som koder for STEAP-1 i overensstemmelse med etablerte teknikker. En del av de genomiske DNA som koder for STEAP-1 kan bli deletert eller erstattet med et annet gen, slik som et gen som koder for en selekterbar markør som kan bli benyttet til å overvåke integrering. Typisk blir flere kilobaser med uendret flankerende DNA (både på 5' og 3' ende) inkludert i vektoren (se f. eks. Thomas og Capecchi, Cell, 51:503 (1987) for en beskrivelse av homologe rekombinasjonsvektorer). Vektoren blir introdusert inn i en embryonal stamcellelinje (for eksempel ved hjelp av elektroporering) og celler der det introduserte DNA har blitt homologt rekombinert med det endogene DNA blir valgt (se f. eks. Li et al., Cell, 69:915 (1992)). De valgte cellene blir deretter injisert inn i en blastocyst hos et dyr (for eksempel en mus eller rotte) for å danne aggregeringskimærer (se f. eks. Bradley i Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E.J. Robertson, red. (IRL, Oxford, 1987), s. 113-152). Et kimært embryo kan deretter bli implantert inn i et passende pseudogravid hunnfosterdyr, og embryoet brakt frem for å danne et "knockout"-dyr. Avkom som bærer det homolog-rekombinerte DNA i deres kjønnsceller kan bli identifisert ved hjelp av standard teknikker og benyttet til å avle dyr der alle cellene til dyret inneholdt det homologt, rekombinante DNA. Knockoutdyr kan blikarakterisertfor eksempel for deres evne til å beskytte seg mot visse patologiske tilstander eller for deres utvikling av patologiske tilstander på grunn av fravær av et STEAP-l-polypeptid.

VII.) Fremgangsmåte for påvisning av STEAP-1

Foreliggende beskrivelse vedrører også fremgangsmåter for å påvise STEAP-l-polynukleotider og STEAP-l-beslektede proteiner, i tillegg til fremgangsmåter for å identifisere en celle som uttrykker STEAP-1. Ekspresjonsprofilen for STEAP-1 gjør den til en diagnostisk markør for metastasert sykdom. I overensstemmelse med dette tilveiebringer statusen for STEAP-l-genprodukter informasjon som er nyttig for å forutse en mengde faktorer inkludert mottagelighet for fremskreden stadiumsykdom, progresjonsrate og/eller tumoraggressivitet. Som diskutert i detalj her kan statusen til STEAP-1 genprodukter i pasientprøver bli analysert ved hjelp av en mengde protokoller som er velkjente på fagområdet, inkludert immunhistokjemisk analyse, en mengde Northern-blotting-teknikker inkludert in s/tu-hybridisering, RT-PCR-analyse (for eksempel på laserfangende mikrodissekerte prøver), Western-blot-analyser og vevssamlingsanalyse.

Mer spesielt tilveiebringer beskrivelsen analyser for påvisningen av STEAP-l-polynukleotider i en biologisk prøve slik som serum, ben, prostata og andre vev, urin, sæd, cellepreparater og lignende. Påvisbare STEAP-l-polynukleotider inkluderer for eksempel et STEAP-l-gen eller fragment derav, STEAP-l-mRNA, alternativt spleisevarianter av STEAP-l-mRNA og rekombinante DNA- eller RNA-molekyler som inneholder et STEAP-l-polynukleotid. Et antall fremgangsmåter for å amplifisere og/eller påvise tilstedeværelsen av STEAP-l-polynukleotider er velkjente på fagområdet og kan bli benyttet.

Fremgangsmåter for å påvise et STEAP-l-mRNA i en biologisk prøve kan omfatte å produsere cDNA fra prøven ved hjelp av revers transkripsjon ved å anvende minst én primer, amplifisere cDNA som er produsert på denne måten ved å anvende STEAP-l-polynukleotider som sens- og antisensprimere for å amplifisere STEAP-l-cDNA, og påvise tilstedeværelsen av det amplifiserte STEAP-l-cDNA. Eventuelt kan sekvensen til det amplifiserte STEAP-l-cDNA bli bestemt.

Fremgangsmåter for å påvise et STEAP-l-gen i en biologisk prøve kan omfatte først å isolere genomisk DNA fra prøven, amplifisere det isolerte genomiske DNA ved å anvende STEAP-l-polynukleotider som sens- og antisensprimere og påvise tilstedeværelsen av det amplifiserte STEAP-l-genet. Ethvert antall med passende sens- og antisens probekombinasjoner kan bli designet fra en STEAP-l-nukleotidsekvens (se f. eks. Figur 2) og blir benyttet til dette formålet.

Oppfinnelsen tilveiebringer analyse for å påvise tilstedeværelsen av et STEAP-l-protein i et vev eller annen biologisk prøve slik som serum, sæd, ben, prostata, urin, cellepreparater og lignende. Fremgangsmåter for å påvise et STEAP-l-beslektet protein er også velkjente og inkluderer for eksempel immunpresipitering, immunhistokjemisk analyse, Western-blot-analyse, molekylære bindingsanalyser, ELISA, ELIFA og lignende. For eksempel omfatter en fremgangsmåte for å påvise tilstedeværelsen av et STEAP-l-beslektet protein i en biologisk prøve først å kontakte prøven med et STEAP-l-antistoff, et STEAP-1-reaktivt fragment derav, eller et rekombinant protein som inneholder en antigenbindings-region fra et STEAP-1-antistoff ifølge oppfinnelsen, og deretter påvise bindingen av det STEAP-l-beslektede proteinet i prøven.

Fremgangsmåter for å identifisere en celle som uttrykker STEAP-1 er også beskrevet. En analyse for å identifisere en celle som uttrykker et STEAP-1-genkan omfatte å påvise tilstedeværelsen av STEAP-l-mRNA i cellen. Fremgangsmåte for påvisningen av spesielle mRNA i celler er velkjente og inkluderer for eksempel hybridiseringsanalyser som benytter komplementære DNA-prober (slik som in s/tu-hybridisering ved å anvende merkede STEAP-l-riboprober, Northern-blotting og beslektede teknikker) og ulike nukleinsyre amplifiseringsanalyser (slik som RT-PCR ved å anvende komplementære primere som er spesifikke for STEAP-1, og andre amplifiseringstype påvisningsfremgangsmåter, slik som for eksempel for forgrenet DNA, SISBA, TMA og lignende). Alternativt omfatter en analyse for å identifisere en celle som uttrykker et STEAP-l-gen kan omfatte å påvise tilstedeværelsen av STEAP-l-beslektet protein i cellen eller som er utskilt av cellen. Ulike fremgangsmåter for påvisningen av proteiner er velkjente på fagområdet og blir benyttet til påvisningen av STEAP-l-beslektede proteiner og celler som uttrykker STEAP-l-beslektede proteiner.

STEAP-l-ekspresjonsanalyse er også nyttig som et redskap for å identifisere og evaluere midler som modulerer STEAP-1-genekspresjon. For eksempel er STEAP-1-ekspresjon signifikant oppregulert ved prostatakreft, og blir uttrykt i kreftformer i vevene som er fremlagt i Tabell I. Identifisering av et molekyl eller et biologisk middel som inhiberer STEAP-1-ekspresjon eller overekspresjon i kreftceller er av terapeutisk verdi. For eksempel kan et slikt middel bli identifisert ved å anvende en screening som kvantifiserer STEAP-1-ekspresjon ved hjelp av RT-PCR, nukleinsyrehybridisering eller antistoffbinding.

VIII.) Fremgangsmåte for å overvåke statusen til STEAP-l-beslektede gener og deres produkter

Onkogenese er kjent for å være en flertrinnsprosess der cellulær vekst blir progressivt feilregulert og celler utvikles fra en normal fysiologisk tilstand til en forløperkreft tilstand og deretter krefttilstander (se f. eks. Ålers et al., Lab. Invest. 77(5): 437-438

(1997) og Isaacs et al., Cancer Surv., 23: 19-32 (1995)). I denne konteksten tillater undersøkelse av en biologisk prøve for å finne bevis på feilregulert cellevekst (slik som feilaktig STEAP-1-ekspresjon ved kreft) tidlig påvisning av slik avvikende fysiologi, før en patologisk tilstand slik som kreft her utviklet seg til et stadium der terapeutiske muligheter er mer begrenset eller der prognosen er forverret. I slike undersøkelser kan statusen til STEAP-1 i en biologisk prøve av interesse bli sammenlignet med for eksempel statusen til STEAP-1 i en tilsvarende normal prøve (for eksempel en prøve fra dette individet eller alternativt et annet individ som ikke er rammet av en patologi). En endring i statusen til STEAP-1 i den biologiske prøven (som sammenlignet med den normale prøven) tilveiebringer bevis på feilregulert cellulær vekst. I tillegg til å benytte en biologisk prøve som ikke er rammet av en patologi som en normal prøve, kan man også benytte en forhåndsbestemt normativ verdi slik som et forhåndsbestemt normalt nivå av mRNA-ekspresjon (se f. eks. Grever et al., J. Comp. Neurol., 1996, 9. desember, 376(2): 306-14 og US patentskrift nr. 5 837 501) for å sammenligne STEAP-1-status i en prøve. Uttrykket "status" i denne konteksten vil bli benyttet i overensstemmelse med det som er dets aksepterte betydning på fagområdet og refererer til tilstanden for et gen og dets produkter. Typisk benytter erfarne fagfolk et antall parametere for å evaluere tilstanden for et gen og dets produkter. Disse inluderer lokaliseringen av uttrykket genprodukter, inkludert lokalisering av STEAP-1-uttrykkende celler) i tillegg til nivået, og den biologiske aktiviteten til uttrykte genprodukter (slik som STEAP-l-mRNA, polynukleotider og polypeptider). Typisk omfatter en endring i statusen til STEAP-1 en endring i lokaliseringen av STEAP-1 og/eller STEAP-1-uttrykkende celler og/eller en økning i STEAP-l-mRNA og/eller proteinekspresjon. STEAP-l-status i en prøve kan bli analysert ved hjelp av et antall måter som er velkjente på fagområdet, inkludert uten begrensning, immunhistokjemisk analyse, in situ-hybridisering, RT-PCR-analyse på laserinnfangnings mikrodissekerte prøver, Western-blot-analyse og vevssamlingsanalyse. Typiske protokoller for å evaluere statusen til et STEAP-l-gen og -genprodukter er for eksempel funnet i Ausubel et al., red., 1995, Current Protocols in Molecular Biology, enhet 2 (Northern-blotting), 4 (Southern-blotting), 15 (Immunblotting) og 18 (PCR-analyse). Slik blir statusen til STEAP-1 i en biologisk prøve evaluert ved hjelp av ulike fremgangsmåter som blir benyttet av erfarne fagfolk, inkludert men ikke begrenset til, genomisk Southern-analyse (for eksempel for å undersøke perturbasjoner i et STEAP-l-gen), Northern-analyse og/eller PCR-analyse av STEAP-l-mRNA (for eksempel for å undersøke endringer i polynukleotidsekvensene eller ekspresjonsnivåene fra STEAP-l-mRNA) og Western-analyse og/eller immunhistokjemisk analyse (for eksempel for å undersøke endringer i polypeptidsekvenser, endringer i polypeptidlokalisering i en prøve, endringer i ekspresjonsnivåer for STEAP-l-proteiner og/eller assosiseringer av STEAP-l-proteiner med polypeptidbindingspartnere). Påvisbare STEAP-l-polynukleotider inkluderer for eksempel et STEAP-l-gen eller fragment derav, STEAP-l-mRNA, alternative spleisevarianter, STEAP-l-mRNA og rekombinante DNA- eller RNA-molekyler som inneholder et STEAP-l-polynukleotid. Ekspresjonsprofilen for STEAP-1 gjør den til en diagnostisk markør for lokal og/eller metastasert sykdom, og tilveiebringer informasjon for veksten eller det onkogene potensialet for en biologisk prøve. Spesielt tilveiebringer statusen for STEAP-1 informasjon som er nyttig for å forutse mottagelighet for spesielle sykdomsstadier, progresjon og/eller tumoraggressivitet. Beskrivelsen tilveiebringer fremgangsmåter og analyser for å bestemme STEAP-l-status og for å diagnostisere kreftformer som uttrykker STEAP-1, slik som kreftformer i vevene som er fremlagt i Tabell I. Fordi STEAP-l-mRNA er så høyt uttrykt i prostata kreftforme r og andre kreftformer, relativt i forhold til normalt prostatavev, kan analyser som evaluerer nivåene av STEAP-l-mRNA-transkripter eller -proteiner i en biologisk prøve bli benyttet for å diagnostisere en sykdom som er assosiert med STEAP-1-feilregulering, og kan tilveiebringe prognostisk informasjon som er nyttig for å definere passende terapeutiske muligheter. Ekspresjonsstatusen for STEAP-1 tilveiebringer informasjon, inkludert tilstedeværelsen, stadiet og lokaliseringen av dysplastiske, forløperkreftceller og kreftceller, forutse mottagelighet for ulike stadier for sykdom og/eller for å beregne tumoraggressivitet. Videre gjør ekspresjonsprofilen den nyttig som et synliggjøringsreagens for metastasert sykdom. Følgelig tilveiebringer beskrivelsen forskjellige molekylærprognostiske og diagnostiske fremgangsmåter for å undersøke statusen til STEAP-1 i biologiske prøver, slik som de fra individer som lider av, eller er antatt å lide av en patologi som erkarakterisertved feilregulert cellulær vekst, slik som kreft. Som beskrevet ovenfor kan statusen til STEAP-1 i en biologisk prøve bli undersøkt ved hjelp av et antall velkjente prosedyrer på fagområdet. For eksempel kan statusen til STEAP-1 i en biologisk prøve tatt fra et spesifikt sted i kroppen bli undersøkt ved å evaluere prøven for nærværet eller fraværet av STEAP-1-uttrykkende celler (for eksempel de som uttrykker STEAP-l-mRNA eller -proteiner. Undersøkelsen kan tilveiebringe bevis på feilregulert cellulær vekst, for eksempel når STEAP-1-uttrykkende celler er funnet i en biologisk prøve som normalt ikke inneholder slike celler (slik som en lymfeknute), fordi slike endringer i statusen til STEAP-1 i en biologisk prøve ofte er assosiert med feilregulert cellulær vekst. En indikator på feilregulert cellulær vekst er spesifikt metastasene av kreftceller fra et organ (slik som prostata) med opphav i et annet område i kroppen (slik som en lymfeknute). I denne konteksten er bevis på feilregulert cellulær vekst viktig for eksempel fordi skjulte lymfeknutemetastaser kan bli påvist i en vesentlig andel pasienter med prostatakreft, og slike metastaser er assosiert med kjente prediktorer på sykdomsprogresjon (se f. eks. Murphy et al., Prostate 42(4): 315-317 (2000), Su et al., Semin. Surg. Oncol. 18(1): 17-28 (2000) og Freeman et al., J. Uroi, 1995, August, 154/2 Pt l):474-8). Beskrivelsen tilveiebringer fremgangsmåter for å overvåke STEAP-l-genproduktet ved å bestemme statusen til STEAP-l-genprodukter som er uttrykt av celler fra et individ som er mistenkt for å ha en sykdom som er assosiert med feilregulert cellevekst (slik som hyperplasi eller kreft) og deretter sammenligne statusen som er bestemt på denne måten med statusen til STEAP-l-genprodukter i en tilsvarende normal prøve. Tilstedeværelsen av feilaktige STEAP-l-genprodukter i testprøven relativt i forhold til den normale prøver, tilveiebringer en indikasjon på tilstedeværelsen av feilregulert cellevekst i cellene fra individet. Også tilveiebragt er analyser som er nyttig for å bestemme tilstedeværelsen av kreft i et individ som omfatter å påvise en vesentlig økning i STEAP-l-mRNA- eller -proteinekspresjon i en testcelle eller vevsprøve relativt i forhold til ekspresjonsnivåene i den tilsvarende normale cellen eller vevet. Tilstedeværelsen av STEAP-l-mRNA kan for eksempel bli evaluert i vev, inkludert men ikke begrenset til de som er fremlagt i Tabell I. Tilstedeværelsen av vesentlig STEAP-1-ekspresjon i ethvert av disse vevene er nyttig for å indikere fremkomsten, tilstedeværelsen og/eller alvorligheten av en kreftform, siden de tilsvarende normale vevene ikke uttrykker STEAP-l-mRNA eller uttrykker dette ved lavere nivåer. STEAP-l-status kan bli bestemt på proteinnivået heller på en nukleinsyrenivået. For eksempel omfatter en slik fremgangsmåte å bestemme nivået av STEAP-l-protein som er uttrykt av celler i en testvevsprøve og sammenligne nivået som er bestemt på denne måten med nivået av STEAP-1 som er uttrykt i en tilsvarende normal prøve. Tilstedeværelsen av STEAP-l-protein kan bli evaluert for eksempel ved å anvende immunhistokjemiske fremgangsmåter. STEAP-l-antistoffer eller bindingspartnere som er i stand til å påvise STEAP-1-proteinekspresjon ble benyttet i en mengde ulike analyseformater som er velkjente på fagområdet for dette formålet. Man kan evaluere statusen til STEAP-l-nukleotid- og -aminosyre-sekvenser i en biologisk prøve for å identifisere perturbasjoner i strukturen til disse molekylene. Disse perturbasjonene kan inkludere insersjoner, delesjoner, substitusjoner og lignende. Slike evalueringer er nyttige fordi perturbasjoner i nukleotidsekvensene og aminosyresekvensene blir observert i et stort antall proteiner som er assosiert med en vekstfeilregulert fenotype (se f. eks. Marrogi et al., 1999, J. Cutan. Pathol. 26(8):369-378). En mutasjon i sekvensen for STEAP-1 kan for eksempel være indikativ på tilstedeværelsen eller promoteringen av en tumor. Slike analyser har derfor diagnostisk og prediktiv verdi da en mutasjon i STEAP-1 indikerer et potensielt tap av funksjon eller økning i tumorvekst. En mengde analyser for å observere perturbasjoner i nukleotidsekvenser og aminosyresekvenser er velkjente på fagområdet. For eksempel blir størrelsen og strukturen på nukleinsyresekvenser eller aminosyresekvenser for STEAP-l-genprodukter observert ved hjelp av Northern-analyse, Southern-analyse, Western-analyse, PCR- og DNA-sekvenseringsprotokoller som er diskutert her. I tillegg er andre fremgangsmåter for å observere perturbasjoner i nukleotidsekvenser og aminosyresekvenser, slik som enkelttrådkonformasjonspolymorfismeanalysene som er velkjente på fagområdet (se f. eks. US patentskrift nr. 5 382 510, meddelt 7. september 1999 o g5 952 170, meddelt 17. januar 1995). I tillegg kan man undersøke metyleringsstatusen for et STEAP-l-gen i en biologisk prøve. Feilaktig demetylering og/eller hypermetylering av CpG-øyer i 5' regulatoriske genregioner forekommer hyppig i udødeliggjorte og transformerte celler, og kan føre til endret ekspresjon for ulike gener. For eksempel ser det ut til at promotorhypermetylering av pi-klasse-glutation-S-transferase (et protein som blir uttrykt i normal prostata, men som ikke blir uttrykt i >90 % av prostatakarsinomer) og permanent stoppe transkripsjon av dette genet og er den hyppigst påviste genomiske endringen ved prostatakarsinomer (De Marzo et al., Am. J. Pathol. 155(6): 1985-1992 (1999)). I tillegg er denne endringen tilstede i minst 70 % av tilfeller med høyeregrads prostataintraepitelneoplasi (PIN) (Brooks et al., Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev., 1998, 7:531-536). I et annet eksempel blir ekspresjon av det spesifikke LAGE-I-tumorgenet (som ikke er uttrykt i normal prostata, men som er uttrykt i 25-50% av prostata kreftformer) indusert ved deoksyazacytidin i lymfoblastoide celler, noe som tyder på at tumorekspresjon skyldes demetylering (Lethe et al., Int. J. Cancer, 76(6): 903-908 (1998)). En mengde analyser for å undersøke metyleringsstatus for et gen er velkjente på fagområdet. Ved Southern-hybridisering kan man for eksempel benytte metyleringssensitive restriksjonsenzymer som ikke kan kløyve sekvenser som inneholder metylerte CpG-seter for å undersøke metyleringsstatusen på CpG-øyer. I tillegg kan MSP (metyleringsspesifikk PCR) raskt profilere metyleringsstatusen til alle CpG-setene som er tilstede i en CpG-øy for et gitt gen. Denne prosedyren involverer en første modifisering av DNA ved hjelp av natriumbisulfitt (som vil konvertere alle ikke-metylerte cytosiner til uracil) etterfulgt av amplifisering ved å anvende primere som er spesifikke for metylert versus ikke-metylert DNA. Protokoller som involverer metyleringsinterferens kan også bli funnet for eksempel i Current Protocols in Molecular Biology, enhet 12, Frederick M. Ausubel et al., red., 1995. Genamplifisering er en annen fremgangsmåte for å undersøke statusen til STEAP-1. Genamplifisering blir målt i en prøve direkte, for eksempel ved hjelp av konvensjonell Southern-blotting eller Northern-blotting for å kvantifisere transkripsjonen av mRNA (Thomas, 1980, Proe. Nati. Acad. Sei., USA, 77:5201-5205), dot-blotting (DNA-analyse) eller in s/tu-hybridisering ved å anvende den passende merkede proben, basert på sekvensene som er tilveiebrakt her. Alternativt blir antistoffer benyttet som gjenkjenner spesifikke duplekser, inkludert DNA-duplekser, RNA-duplekser og DNA-RNA-hybridduplekser eller DNA-proteinduplekser. Antistoffene blir i sin tur merket og analysen blir utført der dupleksene er bundet til en overflate, slik at tilstedeværelsen av antistoff bundet til dupleksen kan bli påvist ved dannelse av dupleks på overflaten. Biopsivev eller perifert blod kan med letthet bli analysert for tilstedeværelsen av kreftceller ved å anvende for eksempel Northern-blotting, dot-blotting eller RT-PCR-analyse for å påvise STEAP-1-ekspresjon. Tilstedeværelsen av RT-PCR-amplifiserbart STEAP-l-mRNA tilveiebringer en indikasjon på tilstedeværelsen av kreft. RT-PCR-analyser er velkjente på fagområdet. RT-PCR-påvisningsanalyse for tumorceller i perifert blod er i dag under evaluering for anvendelse i diagnostiseringen og behandlingen av et antall humane faste tumorer. På fagfeltet med prostatakreft inkluderer disse RT-PCR-analyser for påvisningen av celler som uttrykker PSA og PSM (Verkaik et al., 1997, Uroi. Res., 25:373-384, Ghossein et al., 1995, J. Clin. Oncol., 13:1195-2000, Helson et al., 1995, Clin. Chem., 41:1687-1688). Også tilveibragt er en undersøkelse av mottageligheten som et individ har for å utvikle kreft. En fremgangsmåte for å påvise mottagelighet for kreft kan være å påvise STEAP-l-mRNA eller STEAP-l-protein i en vevsprøve, der dens tilstedeværelse indikerer mottagelighet for kreft, der graden av STEAP-l-mRNA-ekspresjon korrelerer med graden av mottagelighet. Tilstedeværelsen av STEAP-1 i prostatavev eller annet vev kan bli undersøkt, der tilstedeværelsen av STEAP-1 i prøven tilveiebringer en indikasjon på prostatakreftmottagelighet (eller fremkomsten eller eksistensen av en prostatatumor). Likeledes kan man evaluere integriteten til STEAP-l-nukleotid- og -aminosyresekvenser i en biologisk prøve for å identifisere perturbasjon i strukturen for disse molekylene slik som insersjoner, delesjoner, substitusjoner og lignende. Tilstedeværelsen av én eller flere perturbasjoner i STEAP-l-genprodukter i prøven er en indikasjon på kreftmottagelighet (eller fremkomsten eller eksistensen av en tumor). Beskrivelsen omfatter også fremgangsmåter for å måle tumoraggressitivtet. En fremgangsmåte for å måle aggressivitet for en tumor kan være å bestemme nivået av STEAP-l-mRNA eller STEAP-l-protein som er uttrykt av tumorceller, sammenligne nivåer som er bestemt på denne måten med nivået av STEAP-l-mRNA eller STEAP-l-protein som er uttrykt i et tilsvarende normalt vev som er tatt fra det samme individet eller en normal vevs referanse prøve, der graden av STEAP-l-mRNA eller STEAP-l-proteinekspresjon i tumorprøven relativt i forhold til den normale prøven indikerer graden av aggressivitet. Aggressiviteten for en tumor kan bli evaluert ved å bestemme omfanget som STEAP-1 blir uttrykt ved i tumorcellene, der høyere ekspresjonsnivåer indikerer mer aggressive tumorer. Også tilveiebragt er evalueringen av integriteten for STEAP-l-nukleotidsekvenser og - aminosyresekvenser i en biologisk prøve for å identifisere perturbasjoner i strukturen til disse molekylene slik som insersjoner, delesjoner, substitusjoner og lignende. Tilstedeværelsen av én eller flere perturbasjoner indikerer mer aggressive tumorer. Beskrivelsen er også rettet mot fremgangsmåter for å observere progresjon av en malignitet i et individ over tid. Fremgangsmåter for å observere progresjonen av en malignitet i et individ over tid kan omfatte å bestemme nivået av STEAP-l-mRNA eller STEAP-l-protein som er uttrykt av en celle i en prøve av tumoren, sammenligne nivået som er bestemt på denne måten med nivået av STEAP-l-mRNA eller STEAP-l-protein som er uttrykt i en ekvivalent vevsprøve som er tatt fra det samme individet på et annet tidspunkt, der graden av STEAP-l-mRNA eller STEAP-l-proteinekspresjon i tumorprøven over tid tilveiebringer informasjon om progresjonen for kreften. Progresjonen for en kreft kan bli evaluert ved å bestemme STEAP-1-ekspresjon i tumorcellene over tid, der økt ekspresjon over tid indikerer en progresjon for kreften. Man kan også evaluere integriteten for STEAP-1-nukleotid- og -aminosyresekvenser i en biologisk prøve for å identifisere perturbasjoner i strukturen til disse molekylene slik som insersjoner, delesjoner, substitusjoner og lignende, der tilstedeværelsen av én eller flere perturbasjoner indikerer en progresjon for kreften. De diagnostiske tilnærmingene ovenfor kan bli kombinert med enhver av et vidt utvalg med prognostiske og diagnostiske protokoller som er kjent på fagområdet. For eksempel er beskrivelsen også rettet mot fremgangsmåter for å observere et sammenfall mellom ekspresjonen av STEAP-l-gen og STEAP-l-genprodukter (eller perturbasjoner i STEAP-l-gen og STEAP-l-genprodukter) og en faktor som er assosiert med malignitet, som en måte for å diagnostisere og prognostisere statusen for en vevsprøve. Et bredt utvalg av faktorer som er assosiert med malignitet kan bli benyttet, slik som ekspresjonen av gener som er assosiert med malignitet (for eksempel PSA, PSCA og PSM-ekspresjon for prostatakreft osv.) i tillegg til totale cytologiske observasjoner (se f. eks. Bocking et al., 1984, Anal. Quant. Cytol. 6(2):74-88, Epstein, 1995, Hum. Pathol., 26(2):223-9, Thorson et al., 1998, Mod. Pathol., 11(6):543-51, Baisden et al., 1999, Am. J. Surg.Pathol., 23(8):918-24). Fremgangsmåte for å observere et sammenfall mellom ekspresjon av STEAP-l-gen og STEAP-l-genprodukter (eller perturbasjoner i STEAP-l-gen og STEAP-l-genprodukter) og en annen faktor som er assosiert med malignitet er nyttige, for eksempel fordi tilstedeværelsen av et sett med spesifikke faktorer som sammenfaller med sykdom tilveiebringer informasjon som er avgjørende for å diagnostisere og prognostisere statusen for en vevsprøve. Fremgangsmåte for å observere et sammenfall mellom ekspresjonen av STEAP-l-gen og STEAP-l-genprodukter (eller perturbasjoner i STEAP-l-gen og STEAP-l-genprodukter) og en annen faktor som er assosiert med malignitet kan være å påvise overekspresjonen av STEAP-l-mRNA eller -protein inn i en vevsprøve, påvise overekspresjonen av PSA-mRNA eller -protein i en vevsprøve (eller PSCA- eller PSM-ekspresjon) og observere et sammenfall av STEAP-l-mRNA eller -protein og PSA-mRNA- eller -proteinoverekspresjon (eller PSCA- eller PSM-ekspresjon). Ekspresjonen av STEAP-1- og PSA-mRNA i prostatavev kan bli undersøkt, der sammenfallet av STEAP-1- og PSA-mRNA-overekspresjon i prøven indikerer eksistensen av prostatakreft, prostatakreft-mottagelighet eller fremkomsten eller statusen for en prostatatumor. Fremgangsmåte for å påvise og kvantifisere ekspresjon av STEAP-l-mRNA eller -protein er beskrevet her, og standard nukleinsyre- og proteinpåvisning og kvantifiserings-teknologier er velkjente på fagområdet. Standardfremgangsmåte for påvisningen og kvantifiseringen av STEAP-l-mRNA inkluderer in s/tu-hybridisering ved å anvende merkede STEAP-1-ribobrober, Northern-blott teknikker og beslektede teknikker ved å anvende STEAP-1-polynukleotidprober, RT-PCR-analyse ved å anvende primere som er spesifikke for STEAP-1, og andre amplifiseringstype påvisningsfremgangsmåter slik som for eksempel forgrenet DNA, SISBA, TMA og lignende. Semi-kvantitativ RT-PCR kan bli benyttet for å påvise og kvantifisere STEAP-l-mRNA-ekspresjon. Ethvert antall primere som er i stand til å amplifisere STEAP-1 kan bli benyttet til dette formålet, inkludert men ikke begrenset til, de ulike primersettene som spesifikt er beskrevet her. Polyklonale eller monoklonale antistoffer som er spesifikt reaktive med villtype-STEAP-l-proteiner kan bli benyttet i en immunhistokjemisk analyse av biopsivev.

IX.) Identifisering av molekyler som interagerer med STEAP-1

STEAP-l-proteinet og -nukleinsyresekvensene som er beskrevet her gjør det mulig for en erfaren fagperson å identifisere proteiner, små molekyler og andre midler som interagerer med STEAP-1, i tillegg til biokjemiske veier som er aktivert ved STEAP-1 via enhver av en mengde protokoller som er aksepterte på fagområdet. For eksempel kan man benytte ett av de såkalte interaksjonsfangingssystemene (også referert til som "to-hybrid analysen"). I slike systemer interagerer molekyler og rekonstituerer en transkripsjonsfaktor som styrer ekspresjon av et reportergen, hvorved ekspresjonen av reportergenet ble analysert. Andre systemer identifiserer protein-protein-interaksjoner in vivo via

rekonstituering av en eukaryot transkripsjonsaktivator, se f. eks. US patentskrift nr.

5 955 280, meddelt 21. september 1999, 5 925 523, meddelt 20. juni 1999, 5 846 722, meddelt 8. desember 1998 og 6 004 746, meddelt 21. desember 1999. Algoritmer er også tilgjengelige på fagområdet for genombaserte prediksjoner for proteinfunksjon (se f. eks. Marcotte, et al., Nature, 402: 4. november 1999, 83-86).

Alternativt kan man screene peptidbiblioteker for å identifisere molekyler som interagerer med STEAP-l-proteinsekvenser. I slike fremgangsmåter blir peptider som binder til STEAP-1 identifisert ved å screene biblioteker som koder for en tilfeldig eller kontrollert samling aminosyrer. Peptider som er kodet for i bibliotekene blir uttrykt som fusjonsproteiner med bakteriofag kappeproteiner, bakteriofagpartiklene blir deretter screenet mot STEAP-l-proteinet/proteinene.

I overensstemmelse med dette blir peptider som har et bredt utvalgt anvendelser, slik som terapeutiske, prognostiske eller diagnostiske reagenser, identifisert uten noen forhåndsinformasjon som gjelder strukturen til den forventede liganden eller reseptormolekylet. Typiske peptidbiblioteker og screeningsfremgangsmåter som kan bli benyttet for å identifisere molekyler som interagerer med STEAP-l-proteinsekvenser er for eksempel beskrevet i US patentskrift nr. 5 723 286, meddelt 3. mars, 1988 og 5 733 731, meddelt 31. mars 1998.

Alternativt blir cellelinjer som uttrykker STEAP-1 benyttet for å identifisere protein-protein-interaksjoner som er mediert ved STEAP-1. Slike interaksjoner kan bli undersøkt ved å anvende immunpresipiteringsteknikker (se f. eks. Hamilton, B.J., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 1999, 261:646-51). STEAP-l-protein kan bli immunpresipitert fra STEAP-1-uttrykkende cellelinjer ved å anvende anti-STEAP-l-antistoffer. Alternativt kan antistoffer mot His-tag bli benyttet i en cellelinje som er fremstilt slik at den uttrykker fusjoner av STEAP-1 og et His-tag (vektor nevnt ovenfor). Det immunpresipiterte komplekset kan bli undersøkt for proteinassosiering ved hjelp av prosedyrer slik som Wester-blotting,<35>S-metioninmerking av proteiner, proteinmikrosekvensering, sølvfarging og todimensjonal gelelektroforese.

Små molekyler og ligander som interagerer med STEAP-1 kan bli identifisert via beslektede utførelsesformer av slike screeningsanalyser. For eksempel kan små molekyler bli identifisert som interfererer med proteinfunksjon, inkludert molekyler som inkluderer med STEAP-1 sin evne til å mediere fosforylering og de-fosforylering, interaksjon med DNA-eller RNA-molekyler som en indikasjon på regulering av cellesykluser, second-messenger signalisering eller tumorigenese. Tilsvarende blir små molekyler som modulerer STEAP-l-beslektet ionekanalfunksjon, proteinpumpefunksjon eller cellekommunikasjonsfunksjoner identifisert og benyttet til å behandle pasienter som har en kreft som uttrykker STEAP-1 (se f. eks. Hille, B., Ionic Channels of Excitable Membranes, 2. utgave, Sinauer Assoc, Sunderland, MA, 1992). Videre kan ligander som regulerer STEAP-1-funksjon bli identifisert basert på deres evne til å binde STEAP-1 og aktivere en reporterkonstruksjon. Typiske fremgangsmåter er for eksempel diskutert i US patentskrift nr. 5 928 868, meddelt 27. juli, 1999, og inkluderer fremgangsmåte for å danne hybridligander der minst én ligand er et lite molekyl. I illustrative utførelsesformer blir celler som er fremstilt slik at de uttrykker et fusjonsprotein med STEAP-1 og et DNA-bindingsprotein benyttet til å ko-uttrykke et fusjonsprotein av et hybridligand/lite molekyl og et cDNA-bibliotek transkripsjonsaktivatorprotein. Cellene inneholder ytterligere et reportergen, der ekspresjonen av dette er kondisjonert på nærheten av de første og de andre fusjonsproteinene med hverandre, en hendelse som forekommer kun hvis hybridliganden binder til målsetene på begge hybridproteiner. De celle som uttrykker reportergenet blir valgt og det ukjente, lille molekylet eller den ukjente liganden blir identifisert. Denne fremgangsmåten tilveiebringer en måte for å identifisere modulatorer som aktiverer eller inhiberer STEAP-1.

Beskrivelsen tilveiebringer en fremgangsmåte for å screene etter et molekyl som interagerer med en STEAP-l-aminosyresekvens som vist ifølge Figur 2 eller Figur 3, som omfatter trinnet med å kontakte en populasjon av molekyler med en STEAP-l-aminosyresekvens, tillate populasjon av molekyler og STEAP-l-aminosyresekvensen å interagere ved betingelser som fremmer en interaksjon, bestemme tilstedeværelsen av et molekyl som interagerer med STEAP-l-aminosyresekvensen og deretter separere molekylene som ikke interagerer med STEAP-l-aminosyresekvensen fra molekylene som gjør dette. Fremgangsmåten kan ytterligere omfatte å rense, karakterisere og identifisere et molekyl som interagerer med STEAP-l-aminosyresekvensen. Det identifiserte molekylet kan bli benyttet til å modulere en funksjon som er utført av STEAP-1. STEAP-l-aminosyresekvensen kan bli kontaktet med et bibliotek av peptider.

X.) Terapeutiske fremgangsmåter og preparater

Identifiseringen av STEAP-1 som et protein som normalt blir uttrykt i et begrenset sett med vev, men som også blir uttrykt i kreftformer slik som de som er fremkommet i Tabell 1, åpner for et antall terapeutiske tilnærminger for behandlingen av slike kreftformer.

Verdt å bemerke er at målrettede anti-tumorterapier har vært nyttige til og med når det målsøkte proteinet blir uttrykt på normale vev, til og med vitale normale organvev. Et vitalt organ er et som er nødvendig for å opprettholde liv, slik som hjerte eller kolon. Et ikke-vitalt organ er et som kan bli fjernet hvorved individet fremdeles vil overleve. Eksempler på ikke-vitale organer er ovarier, bryst og prostata.

For eksempel er Herceptin et FDA-godkjent farmasøytisk middel som består av et antistoff som er immunreaktivt mot proteinet som er kjent som henholdsvis HER2, HER2/neu og erb-b2. Det blir markedsført av Genetech og har vært et kommersielt vellykket antitumormiddel. Salg av Herceptin nådde omtrent 400 millioner dollar i 2002. Herceptin er en behandling for HER2-positiv metastatisk brystkreft. Likevel er ikke ekspresjonen av HER2 begrenset til slike tumorer. Det samme proteinet er uttrykt i et antall normale vev. Spesielt er det kjent at HER2/neu foreligger i normal nyre og hjerte, og disse vevene foreligger i alle humane mottagere av Herceptin. Tilstedeværelsen av HER2/neu i normal nyre er også bekreftet av Latif, Z., et al., B.J.U. International (2002= 89:5-9. Som vist i denne artikkelen (som evaluerte hvorvidt nyrecellekarsinom burde være en foretrukket indikasjon for anti-HER2-antistoffer slik som Herceptin) blir både protein og mRNA produsert i godartede nyrevev. Verdt å legge merke til er at HER2/neu-protein var sterkt overuttrykt i godartet nyrevev. På tross av det faktumet at HER2/neu blir uttrykt i slike vitale vev som hjerte og nyre, er Herceptin svært verdifullt, FDA-godkjent og et kommersielt vellykket legemiddel. Effekten av Herceptin på hjertevev, dvs. "kardiotoksisitet", har kun vært en bivirkningseffekt på behandling. Når pasienter ble behandlet med Herceptin alene forekom vesentlig kardiotoksisitet i en svært lav prosentandel av pasienter. For å minimalisere kardiotoksisitet er det et mer stringent inngangskrav for behandling med HER2/neu. Faktorer slik som predisponering for hjertetilstand blir evaluert før behandling kan foregå.

Spesielt å bemerke, selv om nyrevev er indikert å oppvise normal ekspresjon, muligens til og med høyere ekspresjon enn hjertevev, så har nyre ingen særlige Herceptin-bivirkninger i det hele tatt. I de ulike samlingene av normale vev der HER2 blir uttrykt, er det videre svært lite forekomst av noen bivirkninger. Kun hjertevev har manifestert noen tydelige bivirkninger over hodet. Et vev slik som nyre, der HER2/neu-ekspresjon er spesiell påtagbar, har ikke vært basis for noen bivirkninger.

Videre har fordelaktige terapeutiske effekter blitt funnet for antitumorterapier som målsøker epidermal vekstfaktorreseptor (EGFR), Ebitux (ImClone). EGFR blir også uttrykt i et antall normale vev. Det har forekommet svært begrensede bivirkninger i normale vev som følge av anvendelse av anti-EGFR-terapeutiske midler. En generell bivirkning som forekommer ved EGFR-behandlingen er et alvorlig hudutslett som ble observert i 100 % av pasientene som gjennomgår behandling.

Slik undergraver ikke ekspresjon av et målprotein i normalt vev, til og med vitalt, normalt vev, anvendbarheten for et målsøkende middel for proteinet som et terapeutisk middel for visse tumorer der proteinet også er overuttrykt. For eksempel er ekspresjon i vitale organer i seg selv ødeleggende. I tillegg kan organer som er ansett som uunnværlige, slik som prostata og ovariet, bli fjernet uten å påvirke dødelighet. Til slutt er noen vitale organer ikke påvirket av normal organekspresjon på grunn av et immunprivilegium. Immunpriviligerte organer er organer som er beskyttet fra blod ved en blod-organ-barriere og er slik ikke tilgjengelige for immunterapi. Eksempler på immunprivilegerte organer er hjernen og testiklene.

I overensstemmelse med dette er terapeutiske tilnærminger som inhiberer aktiviteten til et STEAP-l-protein nyttige for pasienter som lider av en kreftform som uttrykker STEAP-1. Disse terapeutiske tilnærmingene faller generelt inn i tre klasser. Den første klassen modulerer STEAP-l-funksjon siden den vedrører tumorcellevekst som fører til inhibering eller tilbakedannelse av tumorcellevekst eller induserer dens død. Den andre klassen omfatter ulike fremgangsmåter for å inhibere bindingen eller assosieringen av et STEAP-l-protein med dens bindingspartner eller med andre proteiner. Den tredje klassen omfatter en mengde fremgangsmåter for å inhibere transkripsjonen av et STEAP-l-gen eller translasjon av STEAP-l-mRNA.

X.A.) Anti-kreft vaksiner

Beskrivelsen tilveiebringer kreftvaksiner som omfatter et STEAP-l-beslektet protein eller en STEAP-l-beslektet nukleinsyre. I lys av ekspresjonen av STEAP-1 forebygger

kreftvaksiner og/eller behandler STEAP-1-uttrykkende kreftformer med minimale eller ingen effekter på ikke-målsøkte vev. Anvendelsen av et tumorantigen i en vaksine som genererer cellemedierte humorale immunresponser som anti-kreftterapi er velkjent på fagområdet og har blitt benyttet ved prostatakreft ved å anvende humane PSMA- og gnager-PAP-immunogener (Hodge et al, 1995, Int. J. Cancer, 63:231-237, Fong et al., 1997, J. Immunol., 159:3113-3117).

Slike fremgangsmåter kan enkelt bli utøvd ved å anvende et STEAP-l-beslektet protein, eller et STEAP-l-kodende nukleinsyremolekyl og rekombinante vektorer som er i stand til å uttrykke og presentere STEAP-l-immunogenet (som typisk omfatter et antall T-celle epitoper eller antistoff). Erfarne fagfolk forstår at et bredt utvalg vaksinesystemer for levering av immunreaktive epitoper er kjent på fagområdet (se f. eks. Heryln et al., Ann Med, 1999, februar, 31(19:66-78, Maruyama et al., Cancer Immunol Immunother, 2000, juni, 49(3): 123-32). Kort fortalt omfatter slike fremgangsmåter for å generere en immunrespons (foreksempel cellemediert og/eller humoral) hos et pattedyr trinnene med å: eksponere pattedyrets immunsystem ovenfor en immunreaktiv epitop (foreksempel en epitop som er tilstede på et STEAP-l-protein som er vist ifølge Figur 3, eller analog eller homolog derav) slik at pattedyret generer en immunrespons som er spesifikk for denne epitopen (for eksempel generere antistoffer som spesifikt gjenkjenner denne epitopen). I en foretrukket fremgangsmåte inneholder et STEAP-l-immunogen et biologisk motiv, se f. eks. Tabellene V-XVIII og XXII-LI, eller et peptid med et størrelsesområde fra STEAP-1 som er indikert i Figur 5, Figur 6, Figur 7, Figur 8 og Figur 9.

Hele STEAP-l-proteinet, immunogene regioner eller epitoper derav, kan bli kombinert og levert på ulike måter. Slike vaksinepreparater kan for eksempel inkludere lipopeptider (for eksempel Vitiello, A. et al., J. Clin. Invest., 95:341, 1995), peptidpreparater innkapslet i poly(DL-laktid-ko-glykolid) ("PLG") mikrokuler (se f. eks. Eldrige, et al., Molec. Immunol., 28:287-294, 1991: Alonso et al., Vaccine, 12:299-306, 1994, Jones et al., Vaccine, 13:675-681, 1995), peptidpreparater inneholdt i immunstimulerende komplekser (ISCOMS) (se f. eks. Takahashi et al., Nature, 344:873-875, 1990, Hu et al., Clin Exp Immunol., 113:235-243, 1998), multippel antigensystemer (MAP) (se f. eks. Tam, J.P., Proe. Nati. Acad. Sei., USA, 85:5409-5413, 1988, Tam, J.P., J. Immunol. Methods, 196:17-32, 1996), peptider som er formulert som multivalente peptider, peptider til anvendelse i ballistiske leveringssystemer, typisk krystalliserte peptider, virusleveringsvektorer (Perkus, M.E. et al., I: Concepts in vaccine development, Kaufmann, S.H.E., red, s. 379, 1996, Chakrabarti, S. et al., Nature, 320:535, 1986, Hu, S.L. et al., Nature, 320:537, 1986, Kieny, M.P., et al., AIDS Bio/Technology, 4:790, 1986, Top, F.H. et al., J. Infect. Dis., 124:148, 1971, Chanda, P.K. et al., Virology, 175:535, 1990), partikler med virusopphav eller syntetisk opphav (for eksempel Kofler, N. et al., J. Immunol. Methods., 192:25, 1996, Eldrige, J.H. et al., Sem. Hematol., 30:16, 1993, Falo, LD., Jr. et al., Nature Med., 7:649, 1995), adjuvanser (Warren, H.S., Voge., F.R. og Chedid, L.A., Annu. Rev. Immunol., 4:369, 1986, Gupta, R.K. et al., Vaccine, 11:293, 1993), liposomer (Reddy, R. et al., J. Immunol., 148:1585, 1992, Rock, K.L., Immunol. Today, 17:131, 1996) eller nakent eller partikkelabsorbert cDNA (Ulmer, J.B. et al., Science, 259:1745, 1993, Robinson, H.L., Hunt, LA. og Webster, R.G., Vaccine, 11:957, 1993, Shiver, J.W. et al., I: Concepts in vaccine development, Kaufmann, S.H.E., red., s. 423, 1996, Cease, K.B. og Berzofsky, J.A., Annu. Rev. Immunol., 12:923, 1994 og Eldrige, J.H. et al., Sem. Hematol., 30:16, 1993). Toksinmålrettede leveringsteknologier, også kjent som reseptormediert målsøking, slik som de fra Avant Immunotherapeutics, Inc.

(Needham, Massachusettes) kan også bli benyttet.

Hos pasienter med STEAP-1-assosiert kreft kan vaksinepreparatene ifølge oppfinnelsen også bli benyttet i sammenheng med andre behandlinger som blir benyttet for kreft, for eksempel kirurgi, kjemoterapi, legemiddelterapi, strålingsterapier osv., inkludert anvendelse i kombinasjon med immunadjuvanser slik som IL-2, IL-12, GM-CSF og lignende.

Cellulære vaksiner:

CTL-epitoper kan bli bestemt ved å anvende spesifikke algoritmer for å identifisere peptider innenfor STEAP-l-protein som binder tilsvarende HLA-alleler (se f. eks. Tabell IV, Epimer og Epimatrix, Brown University (URL brown.edu/Research/TB-HIV_Lab/epimatrix/epimatrix.html), og BIMAS (UR bimas.dcrt.nih.gov/, SYFPEITHI på URL sufpeithi.bmi-heidelberg.com/). Et STEAP-l-immunogen kan inneholde én eller flere aminosyresekvenser som er identifisert ved å anvende teknikker som er velkjente på fagområdet, slik som sekvenser som er vist i Tabellene V-XVIII og XXII-LI eller et peptid med 8, 9, 10 eller 11 aminosyrer som er spesifisert ved HLA-klasse-I-motiv/-supermotiv (for eksempel Tabell IV (A), Tabell IV (D) eller Tabell IV (E)) og/eller et peptid på minst 9 aminosyrer som omfatter et HLA-klasse-II-motiv/-supermotiv (for eksempel Tabell IV (B) eller Tabell IV (C)). Slik det er anerkjent på fagområdet er HLA-klasse-I-bindingshulrommet essensielt lukket slik at kun peptidet med et spesielt størrelsesområde passer i hulrommet og kan bli bundet, og generelt er HLA-klasse-I-epitoper 8, 9, 10 eller 11 aminosyrer lange. I motsetning til dette er HLA-klasse-II-bindingshulrommet essensielt åpent, og derfor kan et peptid på omtrent 9 eller flere aminosyrer bli bundet av et HLA- klasse-II-motiv. Pa grunn av bindingshulrom forskjellene mellom HLA-klasse-I og -II er HLA-klasse-I-motiver lengdespesifikke, dvs. posisjon to i et klasse-I-motiv er den andre aminosyren i en amino til karboksyl retn ing for peptidet. Aminosyreposisjonene i et klasse-II-motiv er relative kun til hverandre, ikke det totale peptidet, dvs. at ytterligere aminosyrer kan bli bundet på aminoterminalen og/eller karboksyterminalen på en motivbærende sekvens. HLA-klasse-II-epitoper er ofte 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 eller 25 aminosyrer lange, eller lengre enn 25 aminosyrer.

Et bredt utvalgt av fremgangsmåter for å generere en immunrespons hos et pattedyr er kjent på fagområdet (for eksempel som det første trinnet i genereringen av hybridomer). Fremgangsmåte for å generere en immunrespons hos et pattedyr omfatter å eksponere pattedyrets immunsystem ovenfor en immunogen epitop på et protein (for eksempel et STEAP-l-protein) slik at en immunrespons blir generert. Et typisk eksempel består av en fremgangsmåte for å generere en immunrespons ovenfor STEAP-1 i en vert, ved å kontakte verten med en tilstrekkelig mengde av minst én STEAP-l-B-celle- eller cytotoksisk T-celleepitop eller analog derav, og minst et periodisk intervall deretter for å igjen kontakte verten med STEAP-l-B-celle-epitopen eller den cytotoksiske T-celleepitopen eller analogen derav. En spesifikt eksempel består av en fremgangsmåte for å generere en immunrespons mot et STEAP-l-beslektet protein eller et kunstig fremstilt multiepitoppeptid som omfatter å: administrere STEAP-l-immunogen (for eksempel et STEAP-l-protein eller peptidfragment derav, et STEAP-l-fusjonsprotein eller analog osv.) i et va ksi ne preparat til et menneske eller et annet pattedyr. Typisk inneholder slike vaksinepreparater ytterligere en passende adjuvans (se f. eks. US patentskrift nr. 6 146 635) eller en universal hjelperepitop slik som et PADRE-peptid (Epimmune Inc., San Diego, CA, se f. eks. Alexander et al., J. Immunol., 2000, 164(3): 164(3): 1625-1633, Alexander et la., Immunity, 1994, 1(9): 751-761 og Alexander et al., Immunol. Res., 1998, 18(2): 79:92). En alternativ fremgangsmåte omfatter å generere en immunrespons hos et individ mot et STEAP-l-immunogen ved å: administrere in vivo til muskel eller hud på individets kropp, et DNA-molekyl som omfatter en DNA-sekvens som koder for et STEAP-l-immunogen, der DNA-sekvensen operativt er bundet til regulatoriske sekvenser som kontrollerer ekspresjonen av DNA-sekvensen, der DNA-molekylet blir tatt opp av celler, DNA-sekvensen blir uttrykt i cellene og en immunrespons blir generert mot immunogenet (se f. eks. US patentskrift nr. 5 962 428). Eventuelt blir en genetisk vaksinefremmer slik som anioniske lipider, saponiner, lektiner, østrogenforbindelser, hydroksylerte lavere alkyler, dimetylsulfoksid og urea også administrert. I tillegg kan et antiidiotypisk antistoff bli administrert som herme-STEAP-1, for å generere respons mot målantigenet.

Nukleinsvrevaksiner

Vaksinepreparater kan inkludere nukleinsyremedierte modaliteter. DNA eller RNA som koder for protein/proteiner ifølge beskrivelsen kan bli administrert til en pasient. Genetiske immuniseringsfremgangsmåter kan bli benyttet for å generere profylaktiske eller terapeutiske humorale og cellulære immunresponser rettet mot kreftceller som uttrykker STEAP-1. Konstruksjoner som omfatter DNA kan kode for et STEAP-l-beslektet protein/immunogen og passende regulatoriske sekvenser kan bli injisert direkte inn i muskel eller hud hos et individ, slik at cellene i muskelen eller huden tar opp konstruksjonen og uttrykker det kodede STEAP-l-proteinet/immunogenet. Alternativt omfatter en vaksine et STEAP-l-beslektet protein. Ekspresjon av det STEAP-l-beslektede proteinimmunogenet fører til genereringen av profylaktisk eller terapeutisk humoral og cellulær immunitet mot celler som bærer et STEAP-l-protein. Ulike profylaktiske og terapeutiske genetiske immuniseringsteknikker som er kjent på fagområdet kan bli benyttet (for en gjennomgang, se informasjon og referanser som er publisert på internettadressen genweb.com). Nukleinsyrebasert levering er beskrevet, for eksempel i Wolff et al., Science, 247:1465

(1990) i tillegg til i US patentskrift nr. 5 580 859, 5 589 466, 5 804 566, 5 739 118, 5 736 524, 5 679 647, WO 98/04720. Eksempler på DNA-baserte leveringsteknologier inkluderer "nakent DNA", fremmet levering (bupivicain, polymerer, peptidmediert), kationiske lipidkomplekser og partikkelmediert ("genkanon") eller trykkmediert levering (se f. eks. US patentskrift nr. 5 922 687). For terapeutiske eller profylaktiske immuniseringsformål kan proteiner ifølge oppfinnelsen bli uttrykt via virusvektor eller bakterielle vektorer. Ulike virusgenleveringssystemer som kan bli benyttet i utøvelsen av oppfinnelsen inluderer vaksiniavirus, fuglekoppevirus, kanarikoppevirus, adenovirus, influensavirus, poliovirus, adenoassosiert virus, lentivirus og sindbisvirus (se f. eks. Restifo, 1996, Curr. Opin. Immunol. 8:658-663, Tsang et al., J. Nati. Cancer Inst. 87:982-990 (1995)). Ikke-virale leveringssystemer kan også bli benyttet ved å introdusere nakent DNA som koder for et STEAP-l-beslektet protein inn i pasienten (foreksempel intramuskulært eller intradermalt) for å indusere en anti-tumorrespons. Vaccinia-virus blir for eksempel benyttet som en vektor for å uttrykke nukleotidsekvenser som koder for peptidene ifølge beskrivelsen. Ved introduksjon inn i en vert uttrykker det rekombinante vaccinia-viruset det proteinimmunogene peptidet og utløser derved en vertsimmunrespons. Vaccinia-vektorer og fremgangsmåter som er nyttige ved immuniseringsprotokoller er f. eks. beskrevet i US patentskrift nr. 4 722 848. En annen vektor er BCG (Bacille Calmette Guerin). GCG-vektorer er beskrevet i Stover et al., Nature, 351:456-460 (1991). Et bredt utvalg av andre vektorer som er nyttige for terapeutisk administrering eller immunisering av peptidene ifølge beskrivelsen, f. eks. adeno- og adenoassosierte virusvektorer, ret rov i rus vektorer, Salmonelle typhi- vektorer, detoksifiserte antrax-toksinvektorer og lignende, vil være åpenbare for fagfolk på området ut fra beskrivelsen som er gitt her. Slik blir genleveringssystemet benyttet for å levere et STEAP-l-beslektet nukleinsyremolekyl. Det humane fullengde-STEAP-l-cDNA kan bli benyttet. STEAP-1- nukleinsyremolekyler som koder for spesifikke cytotoksiske T-lymfocytt-CTL og/eller antistoffepitoper kan bli benyttet.

Ex wVo- vaksiner

Ulike ex wVo-strategier kan også bli benyttet for å generere en immunrespons. En tilnærming involverer anvendelsen av antigenpresenterende celler (APC) slik som dendrittiske celler (DC) for å presentere STEAP-l-antigen ovenfor en pasients immunsystem. Dendrittiske celler uttrykker MHC-klasse-I- og -II-molekyler, B7-ko-stimulator og IL-12, og er slik svært spesialiserte antigenpresenterende celler. Ved prostatakreft blir autologe dendrittiske celler som er pulsert med peptider fra det prostataspesifikke membranantigenet (PSMA) benyttet i en fase-I-klinisk utprøvning for å stimulere prostata kreftpasienters immunsystem (Tjoa et al., 1996, Prostate 28:65-69, Murphy et al., 1996, Prostate, 29:371-380). Slik kan dendrittiske celler bli benyttet for å presentere STEAP-1-peptider for T-celler i konteksten av MHC-klasse-I- eller-II-molekyler. Autologe dendrittiske celler kan bli pulsert med STEAP-l-peptider som er i stand til binde til MHC-klasse-I- og/eller -klasse-II-molekyler. Dendrittiske celler kan bli pulsert med det fullstendige STEAP-l-proteinet. Nok en annen eksempel involverer fremkalling av overekspresjonen av et STEAP-l-gen i dendrittiske celler ved å anvende ulike implementerende vektorer som er kjent på fagområdet, slik som adenovirus (Arthur et al., 1997, Cancer Gene Ther. 4:17-25), retrovirus (Henderson et al., 1996, Cancer Res., 56:3763-3770), lentivirus, adenoassosierte virus, DNA-transfeksjon (Ribas et al., 1997, Cancer Res., 57:2865-2869) eller tumoravledet RNA-transfeksjon (Ashley et al., 1997, J. Exp. Med., 186:1177-1182). Celler som uttrykker STEAP-1 kan også bli fremstilt slik at de uttrykker immunmodulatorer, slik som GM-CSF, og blir benyttet som immuniserende midler.

X.B.) STEAP-1 som mål for antistoffbasert terapi

STEAP-1 er et attraktivt mål for antistoff baserte terapeutiske strategier. Et antall antistoffstrategier er kjent på fagområdet for å målsøke både ekstracellulære og intracellulære molekyler (se f. eks. komplement- og ADCC-mediert dreping i tillegg til anvendelsen av intralegemer). Fordi STEAP-1 er overuttrykt av kreftceller fra ulike cellelinjer relativt i forhold til tilsvarende normale celler, blir systemisk administrering av STEAP-l-immunreaktive preparater fremstilt som oppviser uovertruffen sensitivitet uten toksiske, ikke-spesifikke og/eller ikke-måleffekter som er forårsaket av binding av det immunreaktive preparatet til ikke-målsøkte organer og vev. Antistoffer som er spesifikt reaktive med domener på STEAP-1 er nyttige for å behandle STEAP-l-uttrykkende kreftformer systemisk, enten som konjugater med toksin eller et terapeutisk middel, eller som nakne antistoffer som er i stand til å inhibere celleproliferasjon eller cellefunksjon.

STEAP-1-antistoffer kan bli introdusert inn i en pasient slik at antistoffet binder til STEAP-1 og modulerer en funksjon slik som en interaksjon med en bindingspartner og dermed medierer ødeleggelse av tumorcellene og/eller inhibere veksten til tumorcellene. Mekanismer ved hvilke slike antistoffer utøver en terapeutisk effekt kan inkludere komplementmediert cytolyse, antistoffavhengig cellulær cytotoksisitet, modulering av den fysiologiske funksjonen til STEAP-1, inhibering av ligandbinding eller signaltransduksjonsveier, modulering av tumorcelledifferensiering, endring av tumorangiogenesefaktorprofiler og/eller apoptose. Eksempler inkluderer Rituxan for ikke-Hodgkins lymfom, Herceptin for metastatisk brystkreft og Erbitux for kolorektal kreft.

Fagfolk på området forstår at antistoffet kan bli benyttet for spesifikt å målsøke og binde immunogene molekyler slik som en immunogen region på en STEAP-1-sekvens som vist ifølge Figur 2 eller Figur 3. I tillegg forstår erfarne fagfolk at det er rutinemessig å konjugere antistoffer til cytotoksiske midler (se f. eks. Sleevers et al., Blood, 93:11, 3678-3684 (1. juni, 1999)). Når cytotoksiske og/eller terapeutiske midler blir levert direkte til celler, slik som ved å konjugere dem til antistoffer som er spesifikke for et molekyl som blir uttrykt av denne cellen (for eksempel STEAP-1), vil det cytotoksiske middelet utøve sin kjente biologiske effekt (dvs. cytotoksisitet) på disse cellene.

Et bredt utvalgt av preparater og fremgangsmåte for å benytte konjugater av antistoffcytotoksiske midler for å drepe celler er kjent på fagområdet. I konteksten med kreftformer medfører typiske fremgangsmåter å administrere til et dyr som har en tumor, en biologisk effektiv mengde av et konjugat som omfatter et valgt cytotoksisk og/eller terapeutisk middel bundet til et målsøkende middel (for eksempel et anti-STEAP-l-antistoff) som binder til en markør (for eksempel STEAP-1) som blir uttrykt, som er tilgjengelig for binding eller som er lokalisert på celleoverflatene. En typisk utførelsesform er en fremgangsmåte for å levere et cytotoksisk og/eller terapeutisk middel til en celle som uttrykker STEAP-1, og omfatter å konjugere det cytotoksiske middelet til et antistoff som immunspesifikt binder til en STEAP-1-epitop, og eksponerer cellen ovenfor antistoff-middel-konjugatet. En annen illustrativ utførelsesform er en fremgangsmåte for å behandle et individ som er mistenkt for å lide av metastasert kreft, som omfatter et trinn med å administrere parenteralt til nevnte individ et farmasøytisk preparat som omfatter en terapeutisk effektiv mengde av et antistoff som er konjugert til et cytotoksisk og/eller terapeutisk middel.

Kreftimmunterapi ved å anvende anti-STEAP-l-antistoffer kan bli utført i overensstemmelse med ulike tilnærminger som vellykket har blitt benyttet i behandlingen av andre krefttyper, inkludert men ikke begrenset til tykktarmskreft (Arien et al., 1998, Crit. Rev. Immunol., 18:133-138), multippelt myelom (Ozaki et al., 1997, Blood, 90:3179-3186, Tsunenari et al., 1997, Blood, 90:2437-2444), magekreft (Kasprzyk et al., 1992, Cancer Res., 52:2771-2776), B-cellelymfom (Funakoshi et al., 1996, J. Immunother. Emphasis Tumor Immunol., 19:93-101), leukemi (Zhong et al., 1996, Leuk. Res., 20:581-589), kolorektal kreft (Moun et al., 1994, Cancer Res., 54:6160-6166, Velders et al., 1995, Cancer Res., 55:4398-4403) og brystkreft (Shepard et al., 1991, J. Clin. Immunol. 11:117- 127). Noen terapeutiske tilnærminger involverer konjugering av nakent antistoff til et toksin eller en radioisotop, slik som konjugeringen av Y<91>eller I<131>til anti-CD20-antistoffer (for eksempel Zevalin, IDEC Pharmaceuticals Corp. eller Bexxar, Coulter Pharmaceuticals), mens andre involverer ko-administrering av antistoffer og andre terapeutiske midler som Herceptin (trastuzuMAb) med paklitaksel (Genentech, Inc.). Antistoffene kan bli konjugert til et terapeutisk middel. For å behandle prostatakreft kan for eksempel STEAP-l-antistoffet bli administrert i sammenheng med stråling, kjemoterapi eller hormonablasjon. Antistoffer kan også bli konjugert med et toksin slik som kalicheamicin (foreksempel Mylotarg, Wyeth-Ayerst, Madison, NJ, som er et rekombinant humanisert IgG4kappa antistoff konjugert til antitumor antibiotika kalicheamicin) eller et maytansinoid (foreksempel taksanbasert tumoraktivert prolegemiddel, TAP, plattform, ImmunoGen, Cambridge, MA, se også US patentskrift nr. 5 416 064) eller Auristatin-E (Seattle Genetics).

Selv om STEAP-l-antistoffterapi er nyttig i alle trinn ved kreft, kan antistoffterapi være spesielt hensiktsmessig ved fremskreden eller metastatisk kreft. Behandling med antistoffterapi ifølge oppfinnelsen er indikert for pasienter som har mottatt én eller flere omganger med kjemoterapi. Alternativt blir antistoffterapi ifølge oppfinnelsen kombinert med et kjemoterapeutisk regime eller strålingsregime for pasienter som ikke har mottatt kjemoterapeutisk behandling. I tillegg kan antistoffterapi muliggjøre anvendelsen av reduserte doseringer av samtidig kjemoterapi, spesielt for pasienter som ikke tolererer toksisiteten til det kjemoterapeutiske middelet godt. Fan et al. (Cancer Res. 53:4637-4642, 1993), Prewett et al. (Internasjonal J. of Onco. 9:217-224, 1996) og Hancock et al. (Cancer Res., 51:4575-4580, 1991) beskriver anvendelsen av ulike antistoffer sammen med kjemoterapeutiske midler.

Selv om STEAP-1-antistoffterapi er nyttige for alle stadier ved kreft, kan antistoffterapi være spesielt hensiktsmessig ved fremskreden eller metastatisk kreft. Behandling med antistoffterapien ifølge oppfinnelsen er indikert for pasienter som har mottatt én eller flere omganger med kjemoterapi. Alternativt blir antistoffterapi ifølge oppfinnelsen kombinert med et kjemoterapeutisk regime eller strålingsregime for pasienter som ikke har mottatt kjemoterapeutisk behandling. I tillegg kan antistoffterapi muliggjøre anvendelsen av reduserte doseringer av samtidig kjemoterapi, spesielt for pasienter som ikke tolererer toksisiteten til det kjemoterapeutiske middelet godt.

Kreftpasienter kan bli evaluert for tilstedeværelsen og nivået av STEAP-1-ekspresjon, fortrinnsvis ved å anvende immunhistokjemiske undersøkelser av tumorer, kvantitativ STEAP-l-synliggjøring eller andre teknikker som pålitelig indikerer tilstedeværelsen av graden av STEAP-l-ekspresjon. Immunhistokjemisk analyse av tumorbiopsier eller kirurgiske prøver er foretrukket til dette formålet. Fremgangsmåter for immunhistokjemisk analyse av tumorvev er velkjente på fagområdet.

Monoklonale anti-STEAP-l-antistoffer som behandler prostatakreft og andre kreftformer inkluderer de som initierer en sterk immunrespons mot tumoren eller de som er direkte cytotoksiske. I så henseende kan monoklonale anti-STEAP-l-antistoffer (MAb) utløse tumorcellelysis ved hjelp av enten komplementmediert eller antistoffavhengige cellecytotoksisitet (ADCC)-mekanismer, der begge disse krever en intakt Fc-del fra immunglobulinmolekylet for interaksjon med effektorcelle-Fc-reseptorseter på komplementproteiner. I tillegg er anti-STEAP-l-MAb som utøver direkte biologisk effekt på tumorvekst nyttige for å behandle kreftformer som uttrykker STEAP-1. Mekanismer ved hvilke direkte cytotoksiske MAber virker inkluderer: inhibering av cellevekst, modellering av cellulær differensiering, modulering av tumorangiogensefaktor profiler og induksjon av apoptose. Mekanismen/mekanismene ved hvilke en spesiell anti-STEAP-l-MAb utøver en anti-tumoreffekt blir evaluert ved å anvende ethvert antall av in wtro-analyser som evaluerer celledød slik som ADCC, ADMMC, komplementmediert cellelysis osv. slik det generelt er anerkjent på fagområdet.

Hos noen pasienter kan anvendelsen av murine eller andre ikke-humane monoklonale antistoffer, eller humane/muse-kimere MAber indusere moderate til sterke immunresponser mot det ikke-humane antistoffet. Dette kan føre til uttømming av antistoffet fra sirkulasjonen og redusert effektivitet. I de mest alvorlige tilfellene kan en slik immunrespons føre til den omfattende dannelsen av immunkomplekser som potensielt kan forårsake nyresvikt. I overensstemmelse med denne er foretrukne monoklonale antistoffer som blir benyttet i de terapeutiske fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen de som enten er fullt humane eller humaniserte og som binder spesifikt til mål-STEAP-l-antigenet med høy affinitet, men som oppviser lav eller ingen antigenisitet hos pasienten.

Terapeutiske fremgangsmåter ifølge oppfinnelsen omfatter administreringen av enkle anti-STEAP-l-MAber i tillegg til kombinasjoner, eller cocktailer, av ulike MAber. Slike MAb-cocktailer har visse fortrinn ved at de inneholder MAber som målsøker ulike epitoper, utnytter ulike effektormekanismer eller kombinerer direkte cytotoksiske MAber med MAber som støtter seg på immuneffektorfunksjonalitet. Slike MAber i kombinasjon kan utøve synergistiske terapeutiske effekter. I tillegg kan anti-STEAP-l-MAber bli administrert samtidig med andre terapeutiske modaliteter, inkludert men ikke begrenset til, ulike kjemoterapeutiske midler, androgen blokkere, immunmodulatorer (for eksempel IL-2, GM-CSF), kirurgi eller stråling. Anti-STEAP-l-MAbene blir administrert i sin "nakne" eller ukonjugerte form, eller de kan ha et terapeutisk middel/midler konjugert til seg.

Anti-STEAP-l-antistofformuleringer blir administrert på enhver måte som er i stand til å levere antistoffene til en tumorcelle. Administreringsmåter inluderer intravenøs, intraperitoneal, intramuskulær, intratumoralt, intradermalt og lignende. Behandling involverer generelt gjentatt administrering av anti-STEAP-l-antistoffpreparater via en akseptabel administreringsmåte slik som intravenøs injeksjon (IV), typisk en dose i området på omtrent 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 eller 25 mg/kg kroppsvekt. Generelt er doser i området på 10-1000 mg MAb per uke effektive og godt tolererte.

Basert på klinisk erfaring med Herceptin-MAb i behandlingen av metastatisk brystkreft, representerer en utgangsdose på omtrent 4 mg/kg pasient kroppsvekt IV, etterfulgt av ukentlige doser på omtrent 2 mg/kg IV med anti-STEAP-l-MAb-preparatet et akseptabelt doseringsregime. Fortrinnsvis blir utgangsdosen administrert som en 90-minutters eller lengre infusjon. Den periodiske opprettholdelsesdosen blir administrert som en 30-minutters eller lengre infusjon, gitt at utgangsdosen blir godt tolerert. Slik det er

åpenbart for fagfolk på området, kan ulike faktorer påvirke det ideelle doseringsregimet i et spesielt tilfelle. Slike faktorer inkluderer for eksempel bindingsaffiniteten og halveringstiden for Ab eller MAb som blir benyttet, graden av STEAP-l-ekspresjon hos pasienten, omfanget av sirkulerende utskilt STEAP-l-antigen, det ønskede steady-state-antistoffkonsentrasjons-nivået, hyppigheten av behandling og påvirkningen av kjemoterapeutiske eller andre midler som blir benyttet i kombinasjon med behandlingsfremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, i tillegg til helsetilstanden for en spesiell pasient.

Eventuelt bør pasienter bli evaluert for nivåene av STEAP-1 i en gitt prøve (for eksempel nivåene av sirkulerende STEAP-l-antigen og/eller STEAP-1-uttrykkende celler) for å hjelpe til i bestemmelsen av det mest effektive doseringsregimet osv. Slike evalueringer ble også benyttet til overvåkningsformål gjennom terapi, og er nyttige for å beregne terapeutisk vellykkethet i kombinasjon med evalueringen av andre parametere (for eksempel urincytologi og/eller ImmunoCyt-nivåer ved blærekreftterapi eller ved analogi, serum-PSA-nivåer ved prostata kreftte ra pi).

Anti-idiotypiske anti-STEAP-l-antistoffer kan også bli benyttet i anti-kreftterapi som en vaksine for å indusere en immunrespons ovenfor celler som uttrykker et STEAP-l-beslektet protein. Spesielt er fremstillingen av anti-idiotypiske antistoffer velkjent på fagområdet, og denne metodikken kan enkelt bli tilpasset til å generere anti-idiotypiske, anti-STEAP-l-antistoffer som hermer en epitop på et STEAP-l-beslektet protein (se f. eks. Wagner et al., 1997, Hybridoma, 16:33-40, Foon et al., 1995, J. Clin. Invest., 96:334-342, Herlyn et al., 1996, Cancer Immunol. Immunother, 43:65-76). Slike anti-idiotypiske antistoffer kan bli benyttet ved kreftvaksinestrategier.

X.C.) STEAP-1 som et mål for cellulære immunresponser

Vaksiner og fremgangsmåter for å fremstille vaksiner som inneholder en immunologisk effektiv mengde av ett eller flere HLA-bindingspeptider som beskrevet her er tilveiebragt. Videre omfatter vaksiner i overensstemmelse med beskrivelsen preparater med ett eller flere av de krevde peptidene. Et peptid kan foreligge i en vaksine individuelt. Alternativt kan peptidet eksistere som en homopolymer som omfatter flere kopier av det samme peptidet, eller som en heteropolymer med ulike peptider. Polymerer har fordelen av økt immunologisk reaksjon og, der ulike peptidepitoper blir benyttet for å bygge opp polymeren, den ytterligere evnen til å indusere antistoffer og/eller CTLer som reagerer med ulike antigene determinanter på den patogene organismen eller det tumorbeslektede peptidet som er målsøkt for en immunrespons. Preparatet kan være en naturlig forekommende region på et antigen eller kan for eksempel bli fremstilt rekombinant eller ved hjelp av kjemisk syntese.

Bærere som kan bli benyttet sammen med vaksiner ifølge beskrivelsen er velkjente på fagområdet og inkluderer for eksempel tyroglobulin, albuminer slik som humant serumalbumin, tetanustoksoid, polyaminosyrer slik som poly-L-lysin, poly-L-glutaminsyre, influensavirus, hepatitt-B-viruskjerneprotein og lignende. Vaksinene kan inneholde et fysiologisk tolererbart (dvs. akseptabelt) fortynningsmiddel slik som vann, eller fysiologisk saltløsning, fortrinnsvis fosfatbufret fysiologisk saltløsning. Vaksinene inkluderer også typisk en adjuvans. Adjuvanser slik som ukomplett Freunds adjuvans, aluminiumfosfat, aluminiumhydroksid eller alum er eksempler på materialer som er velkjente på fagområdet. I tillegg, slik det er beskrevet her, kan CTL-responser bli primet ved å konjugere peptider ifølge oppfinnelsen til lipider, slik som tripalmitoyl-S-glyserylcysteinylserylserin (P3CSS). Videre har en adjuvans slik som et syntetisk cytosinfosforotiolertguanininneholdende (CpG) oligonukleotid blitt funnet å øke CTL-responser 10 til 100 ganger (se f. eks. Davila og Celis, J. Immunol., 165:539-547 (2000)).

Ved immunisering med et peptid preparat, via injeksjon, aerosol, oralt, transdermalt, transmukosalt, intrapleuralt, intratekalt eller på annen passende måte, responderer immunsystemet til verten på vaksinen ved å produsere store mengder CTLer og/eller HTLer som er spesifikke for det ønskede antigenet. Dermed blir verten i det minste delvis immun ovenfor senere utvikling av celler som uttrykker eller overuttrykker STEAP-l-antigen, eller får i det minste noe terapeutisk fordel når antigenet var tumorassosiert.

Det kan det være ønskelig å kombinere klasse-I-peptidkomponentene med komponenter som induserer eller fremmer nøytraliserende antistoffresponser og/eller hjelper-T-celleresponser som er rettet mot målantigenet. Et slikt preparat kan omfatte klasse-I- og klasse-II-epitoper eller en klasse-I- og/eller klasse-II-epitop i sammen med en kryssreaktiv HTL-epitop slik som PADRE (Epimmune, San Diego, CA)-molekyl (for eksempel beskrevet i US patentskrift nr. 5 736 142).

En vaksine kan også inkludere antigenpresenterende celler (APC), slik som dendrittiske celler (DC) som en vehikkel for å presentere peptider ifølge beskrivelsen. Vaksinepreparater kan bli dannet in vitro, etter dendrittisk cellemobilisering og høsting, hvorved ladningen av de dendrittiske cellene foregår in vitro. For eksempel blir dendrittiske celler transfektert med for eksempel et minigen i overensstemmelse med beskrivelsen, eller blir pulset med peptider. De dendrittiske cellene kan deretter bli administrert til en pasient for å utløse immunresponser in vivo. Vaksinepreparater, enten DNA- eller peptid baserte, kan også bli administrert in vivo i kombinasjon med dendrittisk cellemobilisering hvorved ladning av de dendrittiske cellene foregår in vivo.

Fortrinnsvis blir de følgende prinsippene benyttet når man velger en samling epitoper som skal inngå i et polyepitoppreparat til anvendelse i en vaksine, eller for å velge bestemte epitoper som kan bli inkludert i en vaksine og/eller som skal bli kodet for av nukleinsyrer slik som et minigen. Det er foretrukket at hvert av de følgende prinsippene blir balansert for å gjøre utvelgelsen. Epitopene som skal bli inkorporert i et gitt vaksinepreparat kan være, men behøver ikke være, kontinuerlige i sekvens i det native antigenet fra hvilket epitopen er avledet. 1. ) Epitoper blir valgt som ved administrering hermer immunresponser som har blitt observert å være korrelert med tumoruttømming. For HLA-klasse-I inkluderer dette 3-4 epitoper som kommer fra minst et tumorassosiert antigen (TAA). For HLA-klasse-II blir en tilsvarende begrunnelse benyttet, igjen blir 3-4 epitoper valgt fra minst én TAA (se f. eks. Rosenberg et al., Science, 278:1447-1450). Epitoper fra en TAA kan bli benyttet i kombinasjon med epitoper fra én eller flere ytterligere TAAer for å fremstille en vaksine som målsøker tumorer med ulike ekspresjonsmønstre eller hyppig uttrykte TAAer. 2. ) Epitoper blir valgt som har den nødvendige bindingsaffiniteten som er etablert å være korrelert med immunogenisitet: for HLA-klasse-I, en IC50på 500 nM eller mindre, ofte 200 nM eller mindre, og for klasse-II, en IC50på 1 000 nM eller mindre. 3. ) Tilstrekkelig med supermotivbærende peptider, eller en tilstrekkelig samling av allelspesifikke motivbærende peptider, blir valgt for å gi en bred populasjonsdekning. For eksempel er det foretrukket å ha en populasjonsdekning på minst 80 %. En Monte-Carlo-analyse, som er en statistisk evaluering som er kjent på fagområdet kan bli benyttet for å undersøke bredden på, eller overskuddet av populasjonsdekning. 4. ) Når man velger epitoper fra kreftrelaterte antigener er det ofte nyttig å velge analoger fordi pasienten kan ha utviklet toleranse ovenfor den native epitopen. 5. ) Av spesiell relevans er epitoper som her blir referert til som "nestede epitoper". Nestede epitoper forekommer der minst to epitoper overlapper i en gitt peptidsekvens. En nestet peptidsekvens kan omfatte B-celle-, HLA-klasse-I- og/eller HLA-klasse-II-epitoper. Når man tilveiebringer nestede epitoper er et generelt mål å tilveiebringe det høyeste antallet epitoper per sekvens. Slik er et aspekt å unngå å tilveiebringe et peptid som er lengre enn aminoterminalen på den aminoterminale epitopen og karboksylterminalen på den karboksylterminalepitopen på peptidet. Når man tilveiebringer en multiepitopsekvens, slik som en sekvens som omfatter nestede epitoper, er det generelt viktig å screene sekvensen for å sikre at den ikke har patologiske eller andre skadelige, biologiske egenskaper. 6. ) Hvis et polyepitopprotein blir dannet, eller når man fremstiller et minigen, er et mål å generere det minste peptidet som omfatter epitopene av interesse. Dette prinsippet er tilsvarende, om ikke det samme, som det som blir benyttet når man velger et peptid som omfatter nestede epitoper. Med et kunstig polyepitoppeptid blir likevel størrelsesminimaliseringsmålet balansert mot behovet for å integrere enhver spacersekvens mellom epitopene i polyepitopproteinet. Spaceraminosyrerester kan for eksempel bli introdusert for å unngå overgangsepitoper (en epitop som er gjenkjent av immunsystemet, som ikke er tilstede i målantigenet, og kun dannet av den kunstig fremstilte oppstillingen av epitoper), eller for å fremme kløyving mellom epitoper og derved forsterke epitoppresentering. Overgangsepitoper bør generelt bli unngått fordi mottageren kan generere en immunrespons mot denne ikke-native epitopen. Av spesiell viktighet er en overgangsepitop som er en "dominant epitop". En dominant epitop kan føre til en slik omfattende respons slik at immunresponser mot andre epitoper blir forminsket eller undertrykt. 7.) Der sekvensene for flere varianter av det samme målproteinet er tilstede, kan potensielle peptidepitoper også bli valgt på basis av deres konserverte natur. For eksempel kan et kriterium for konservert natur definere at hele sekvensen for et HLA-klasse-I-bindingspeptid eller hele den 9-mer kjernen for et klasse-II-bindingspeptid være konservert i en bestemt prosentandel av sekvensene som er evaluert for et spesifikt proteinantigen.

X.C.l) Minigenvaksiner

Et antall ulike tilnærminger er tilgjengelige som tillater samtidig levering av flere epitoper. Nukleinsyrer som koder for peptidene ifølge beskrivelsen er spesielt nyttige. Epitoper til inkludering i et minigen blir fortrinnsvis valgt i overensstemmelse med retningslinjene som er fremlagt i det tidligere avsnittet. En foretrukket måte å administrere nukleinsyrer som koder for peptidene ifølge beskrivelsen benytter minigenkonstruksjon som koder for et peptid som omfatter ett eller flere epitoper ifølge beskrivelsen.

Anvendelsen av multiepitopminigener er beskrevet nedenfor og i Ishioka et al., J. Immunol., 162:3915-3925, 1999, An, L. og Whitton, J.L., J. Virol., 71:2292, 1997, Thomson, S.A. et al., J. Immunol., 157:822, 1996, Whitton, J.L. et al., J. Virol., 67:348, 1993, Hanke, R. et al., Vaccine, 16:426, 1998. For eksempel kan et multiepitop-DNA-plasmid som koder for supermotiv og/eller motivbærende epitoper som er avledet fra STEAP-1, PADRE universal hjelper-T-celleepitopén eller flere HTL-epitoper fra STEAP-1 (se f. eks. Tabellene V-XVIII og XXII til LI) og den endoplasmatiske retikulumtranslokaliserings-signalsekvensen bli fremstilt. En vaksine kan også omfatte epitoper som er avledet fra andre TAAer.

Immunogenisiteten til et multiepitopminigen kan bli bekreftet i transgene mus for å evaluere styrken på CTL-induksjonsresponser mot epitopene som ble testet. Videre kan immunogenisiteten til de DNA-kodede epitoper in vito bli korrelert med in Wtro-responsene for spesifikke CTL-linjer mot målceller som er transfektert med DNA-plasmidet. Slik kan disse eksperimentene vise at minigenet virker for både å: 1.) generere en CTL-respons og 2.) at de induserte CTLene gjenkjente celler som uttrykker de kodede epitopene.

For å danne en DNA-sekvens som koder for de valgte epitopene (minigen) for ekspresjon i humane celler, kan for eksempel aminosyresekvensene for epitopene bli revers translatert. En human kodonanvendelsestabell kan bli benyttet for å rettlede i kodonvalget for hver aminosyre. Disse epitopkodende DNA-sekvensene kan bli direkte bundet, slik at når de blir translatert så blir en kontinuerlig polypeptidsekvens dannet. For å optimalisere ekspresjon og/eller immunogenisitet kan ytterligere elementer bli inkorporert i minigen designen. Eksempler på aminosyresekvensen som kan bli revers translatert og inkludert i minigensekvensen inkluderer: HLA-klasse-I-epitoper, HLA-klasse-II-epitoper, antistoff epitoper, en ubikitineringssignalsekvens og/eller et endoplasmatisk retikulum målsøkingssignal. I tillegg kan HLA-presentering av CTL- og HTL-epitoper bli forbedret ved å inkludere syntetiske (for eksempel polyalanin) eller naturlig forekommende, flankerende sekvenser inntil CTL- eller HTL-epitopene, der disse større peptidene som omfatter epitopen/epitopene er innenfor omfanget av beskrivelsen.

Minigensekvensen kan bli konvertert til DNA ved å samle oligonukleotider som koder for pluss- og minustrådene til minigenet. Overlappende oligonukleotider (30-100 baser lange) kan bli syntetisert, fosforylert, renset og annealet ved passende betingelser ved å anvende velkjente teknikker. Endene på oligonukleotidene kan bli bundet sammen, for eksempel ved å anvende T4 DNA-ligase. Dette syntetiske minigenet, som koder for epitoppolypeptider, kan deretter bli klonet inn i en ønsket ekspresjonsvektor.

Standard regulatoriske sekvenser som er velkjente for fagfolk på området blir fortrinnsvis inkludert i vektoren for å sikre ekspresjon i målcellene. Flere vektorelementer er ønskelige: en promotor med et nedstrøms kloningssete for minigeninsersjoner, et polyadenyleringssignal for effektiv transkripsjonsteraminering, et replikasjonsstartsted fra E. coli og en selekterbar markør fra E. coli (for eksempel ampicillin- eller kanamycinresistens). Utallige promotorer kan bli benyttet til dette formålet, for eksempel den humane cytomega lovi rus (hCMV)-promotoren. Se f. eks. US patentskrift nr. 5 580 859 og 5 589 466 for andre passende promotorsekvenser.

Ytterligere vektormodifiseringer kan være ønskelige for å optimalisere minigenekspresjon og immunogenisitet. I noen tilfeller er intron nødvendige for effektiv genekspresjon, og ett eller flere syntetiske eller naturlig forekommende intron kan bli inkorporert inn i den transkriberte regionen til minigenet. Inkluderingen av mRNA-stabiliserende sekvenser og sekvenser for replikasjon i pattedyrceller kan også bli overveid for å øke minigenekspresjon.

Når en ekspresjonsvektor er valgt blir minigenet klonet inn i polylinkerregionen nedstrøms for promotoren. Dette plasmidet blir transformert inn i en passende E. coli-stamme, og DNA blir fremstilt ved å anvende standardteknikker. Orienteringen og DNA-sekvensen i minigenet, i tillegg til alle andre elementer som er inkludert i vektoren, blir bekreftet ved å anvende restriksjonskartlegging og DNA-sekvensanalyse. Bakterieceller som huser det korrekte plasmidet kan bli lagret som en mastercellebank og en arbeidscellebank.

I tillegg ser det ut til at immunstimulatoriske sekvenser (ISSs eller CpG) spiller en rolle i immunogenisiteten til DNA-vaksine. Disse sekvensene kan bli inkludert i vektoren, på utsiden av den minigenkodende sekvensen, hvis dette er ønskelig for å forsterke immunogenisitet.

En bi-cistronisk ekspresjonsvektor som tillater produksjon av både de minigenkodende epitopene og et annet protein (inkludert for å forsterke eller minske immunogenisitet) bli benyttet. Eksempler på proteiner eller polypeptider som fordelaktig kan forsterke immunresponsen hvis det blir ko-uttrykt inkluderer cytokiner (for eksempel IL-2, IL-12, GM-CSF), cytokininduserende molekyler (for eksempel LelF), kostimulatoriske molekyler, eller for HTL-responser, pan-DR-bindingsproteiner (PADRE, Epimmune, San Diego, CA). Hjelper (HTL)-epitoper kan bli bundet til intracellulære målsøkende signaler og uttrykt separat fra uttrykte CTL-epitoper, og dette tillater styring av HTL-epitopene til en celleavdeling som er forskjellig fra den for CTL-epitopene. Hvis nødvendig kan dette fremme mer effektiv inntrengning av HTL-epitoper inn i HLA-klasse-II-veien, for derved å forbedre HTL-induksjon. I motsetning til HTL- eller CTL-induksjon kan en spesifikk minskning av immunresponsen ved ko-ekspresjon av immundempende molekyler (for eksempel TGF-p) være fordelaktig ved visse sykdommer.

Terapeutiske mengder av plasmid-DNA kan bli fremstilt for eksempel ved fermentering i E. coli, etterfulgt av rensing. Volumer fra arbeidscellebanken blir benyttet for å inokulere vekstmedium, og for å dyrke til metning i risteflasker eller i en bioreaktor i overensstemmelse med velkjente teknikker. Plasmid-DNA kan bli renset ved å anvende standard bioseparasjonsteknologier slik som fastfase anionbytterresiner tilveiebrakt av Qiagen,Inc. (Valencia, California). Hvis det er nødvendig kan supercoilet DNA bli isolert fra de åpne sirkulære og lineære formene ved å anvende gelelektroforese eller andre fremgangsmåter.

Renseplasmid-DNA kan bli fremstilt til injeksjon ved å anvende en mengde formuleringer. Den enkleste av disse er rekonstituering av lyofilisert DNA i sterilt fosfatbufret cytologisk saltløsning (PBS). Denne tilnærmingen, som er kjent som "nakent DNA", blir per i dag benyttet til intramuskulær (IM) administrering i kliniske utprøvninger. For å maksimalisere de immunterapeutiske effektene for minigen-DNA-vaksiner kan en alternativ fremgangsmåte for å formulere renset plasmid-DNA være ønskelig. En mengde fremgangsmåter har blitt beskrevet, og nye teknikker kan bli tilgjengelige. Kationiske lipider, glykolipider og fysogene liposomer kan også bli benyttet i formuleringen (se f. eks. som beskrevet av WO 93/24640, Mannino & Gould-Fogerite, Bio Techniques 6(7):682

(1988), US patentskrift nr. 5 279 833, WO 91/06309 og Felgner et al., Proe. Nat'l Acad. Sei. USA, 84:7413 (1987). I tillegg kan peptider og forbindelser som kollektivt blir referert til som beskyttende, interaktive, ikke-kondenserende forbindelser (PINC) også bli kompleksert med renset plasmid-DNA for å påvirke variabler slik som stabilitet, intramuskulær fordeling eller trafikkering til spesifikke organer eller celletyper.

Målcellesensitivisering kan bli benyttet som en funksjonell analyse for ekspresjon og HLA-klasse-I-presentasjon av minigenkodede CTL-epitoper. For eksempel blir plasmid-

DNA introdusert inn i en pattedyrcellelinje som er passende som et mål for standard CTL-kromfrigjøringsanalyse. Transfeksjonsfremgangsmåten som blir benyttet vil være avhengig av den endelige formuleringen. Elektroporering kan bli benyttet for "nakent" DNA, mens kationiske lipider muliggjør direkte in wtro-transfeksjon. Et plasmid som uttrykker grønt fluorescerende protein (GFP) kan også bli ko-transfektert for å muliggjøre anrikelse av transfekterte celler ved å anvende fluorescensaktivert cellesortering (FACS). Disse cellene blir deretter krom-51 (<51>Cr)-merket og benyttet som målceller for e pito p-s pes if ikke CTL-linjer, cytolyse, påvist ved<51>Cr-frigjøring, indikerer både produksjon av og HLA-presentasjon av, minigenkodede CTL-epitoper. Ekspresjon av HTL-epitoper kan bli evaluert på en tilsvarende måte ved å anvende analyser for å undersøke HTL-aktivitet.

In wVo-immunogenisitet er en annen tilnærming for funksjonell testing av minigen-DNA-formuleringer. Transgene mus som uttrykker passende humane HLA-proteiner blir immunisert med DNA-produktet. Dosen og administreringsmåten er formuleringsavhengig (for eksempel IM for DNA i PBS, intraperitoneal (i.p.) for lipidkompleksert DNA). 21 dager etter immunisering blir splenocytter høstet og restimulert i en uke i nærvær av peptidene som koder for hver epitop som blir testet. Deretter, for CTL-effektorceller, blir analyser utført for cytolyse av peptidladde,<51>Cr-merkede målceller ved å anvende standardteknikker. Lysering av målceller som ble sensitivisert ved HLA ladd med peptidepitoper, tilsvarende til minigenkodende epitoper, viser DNA-vaksinefunksjon for in wVo-induksjon av CTLer. Immunogenisitet for HTL-epitoper blir bekreftet i transgene mus på en tilsvarende måte.

Alternativt kan nukleinsyrene bli administrert ved å anvende ballistisk levering som beskrevet i for eksempel US patentskrift nr. 5 204 253. Ved å anvende denne teknikken blir partikler som kun er sammensatt av DNA administrert. I en ytterligere alternativ utførelsesform kan DNA bli klistret på partikler, slik som gullpartikler.

Minigener kan også bli levert ved å anvende andre bakterielle systemer eller virusleveringssystemer som er velkjente på fagområdet, for eksempel kan en ekspresjonskonstruksjon som koder for epitoper ifølge beskrivelsen bli inkorporert i en virusvektor slik som vaccinia.

X.C.2. Kombinasjoner av CTL-peptider med hjelperpeptider

Vaksinepreparater som omfatter CTL-peptider ifølge oppfinnelsen kan bli modifisert, for eksempel lagd analoger av, for å tilveiebringe ønskede attributter, slik som forbedret halveringstid i serum, bredere populasjonsdekning eller forsterket immunogenisitet.

For eksempel kan evnen til et peptid i å indusere CTL-aktivitet blir forsterket ved å binde peptidet til en sekvens som inneholder minst én epitop som er i stand til å indusere en T-hjelpercellerespons. Selv om et CTL-peptid kan være direkte bundet til et T-hjelperpeptid blir ofte CTL-epitop/HTL-epitopkonjugater bundet med et spacermolekyl. Spaceren er typisk sammensatt av relativt små, nøytrale molekyler, slik som aminosyrer eller aminosyrehermere, som i all vesentlighet er uladde ved fysiologiske betingelser. Spacerne er typisk valgt fra for eksempel Ala, Gly eller andre nøytrale spacere eller ikke-polare aminosyrer eller nøytrale polare aminosyrer. Det er på det rene at den eventuelt tilstedeværende spaceren ikke trenger å være sammensatt av de samme restene og kan slik være en hetero- eller homo-oligomer. Når den foreligger vil spaceren være på omtrent en eller to rester, mer vanlig 3 til 6 rester og noen ganger 10 eller flere rester. CTL-peptidepitopen kan være bundet til T-hjelperpeptidepitopen enten direkte eller via en spacer, enten på aminoterminalen eller karboksyterminalen til CTL-peptidet. Aminoterminalen på enten det immunogene peptidet eller T-hjelperpeptidet kan være acylert.

T-hjelperpeptidet kan være ett som blir gjenkjent av T-hjelperceller som foreligger i hoveddelen av en genetisk ulik populasjon. Dette kan bli oppnådd ved å velge peptider som binder til mange, de fleste eller alle HLA-klasse-II-molekylene. Eksempler på slike aminosyrer som binder mange HLA-klasse-II-molekyler inkluderer sekvenser fra antigener slik som tetanustoxoid på posisjonen 830-843 QYIKANSKFIGITE (Sekv. id. nr. 64), Plasmodium /a/c/pa/x/m-cirkumsporozitt (CS)-protein på posisjonene 378-398 DIEKKIAKMEKASSVFNVVNS (Sekv. id. nr. 65) og Streptococcus-18kD-protein på posisjonene 116-131 GAVDSILGGVATYGAA (Sekv. id. nr. 66). Andre eksempler inkluderer peptider som bærer en DR-l-4-7-supermotiv eller ethvert av DR3-motivene.

Alternativt er det mulig å fremstille syntetiske peptider som er i stand til å stimulere T-hjelperlymfocytter på en løs HLA-begrenset måte, ved å anvende aminosyresekvenser som ikke er funnet i naturen (se f. eks. PCT-publikasjon WO 95/07707). Disse syntetiske forbindelsene som blir kalt Pan-DR-bindingsepitoper (for eksempel PADRE, Epimmun, Inc., San Diego, CA) blir designet, mest foretrukket for å binde de fleste HLA-DR (human HLA-klasse-II)-molekyler. For eksempel har et pan-DR-bindingsepitoppeptid som har formelen: XKXVAAWTLKAAX (Sekv. id. nr. 67) der "X" er enten sykloheksylalanin, fenylalanin eller tyrosin, og A er enten D-alanin eller L-alanin, blitt funnet å binde de fleste HLA-DR-allelene, og å stimulere responsen av T-hjelperlymfocytter fra de fleste individer, uavhengig av deres HLA-type. Et alternativ til en pan-DR-bindingsepitop omfatter alle naturlige "L"-aminosyrer og kan bli tilveiebrakt i formen av nukleinsyrer som koder for epitopen.

HTL-peptidepitopen kan også bli modifisert for å endre deres biologiske egenskaper. For eksempel kan det bli modifisert slik at det inkluderer D-aminosyrer for å øke deres resistens ovenfor proteaser og slik forlenge deres halveringstid i serum, eller de kan bli konjugert til andre molekyler slik som lipider, proteiner, karbohydrater og lignende for å øke deres biologiske aktivitet. For eksempel kan et T-hjelperpeptid bli konjugert til én eller flere palmitinsyrekjeder på enten den aminoterminale enden eller den karboksyterminale enden.

X.C.3. Kombinasjoner av CTL-peptider med T-celleprimingsmidler

Det kan i de farmasøytiske preparatene ifølge beskrivelsen være ønskelig å inkludere minst én komponent som primer B-lymfocytter eller T-lymfocytter. Lipider har blitt identifisert som midler som er i stand til å prime CTL in vivo. For eksempel kan palmitinsyrerester bli bundet på e- og a-aminogruppene på en lysinrest og deretter bundet, for eksempel via én eller flere sammenbindingsrester slik som Gly, Gly-Gly, Ser, Ser-Ser eller lignende, til et immunogent peptid. Det lipiderte peptidet kan deretter bli administrert enten direkte i en micelle eller partikkel, inkorporert i et liposom eller emulgert i en adjuvans, for eksempel ukomplett Freunds adjuvans. Et spesielt effektivt immunogent preparat kan omfatte palmitinsyre bundet til e- og a-aminogrupper på Lys, som er bundet via binding, for eksempel Ser-Ser, til aminoterminalen på det immunogene peptidet.

Som et annet eksempel på lipidpriming av CTL-responser, kan E. co//'-1 i poprote i ner, slik som tripalmitoyl-S-glyserylcysteinlyseryl-serin (P3CSS) bli benyttet for å prime virusspesifikk CTL når den er kovalent bundet til et hensiktsmessig peptid (se f. eks. Deres, et al., Nature, 342:561, 1989). Peptider ifølge beskrivelsen kan bli koblet til P3CSS, og lipopeptidet kan bli administrert til et individ for å prime spesifikt en immunrespons mot målantigenet. Fordi induksjon av nøytraliserende antistoffer også kan bli primet med P3CSS-konjugerte epitoper, kan videre to slike preparater bli kombinert for mer effektivt å utløse både humorale og cellemedierte responser.

X.C.4. Vaksinepreparater som omfatter DC pulset med CTL- og/eller HTL-peptider

Et vaksinepreparat kan omfatte ex wVo-administrering av en cocktail av epitopbærende peptider mot PBMC, eller isolert DC derfra, fra pasientens blod. Et farmasøytisk middel for å fremme høsting av DC kan bli benyttet, slik som Progenipoietin (Pharmacia-Monsanto, St. Louis, MO) eller GM-CSF/IL-4. Etter å ha pulset DC med peptider og før reinfusjon inn i pasienter blir DC vasket for å fjerne ubundne peptider. En vaksine kan omfatte peptidpulsede DCer som presenterer de pulserte peptidepitopene kompleksert med HLA-molekyler på deres overflate.

DCen kan bli pulset ex vivo med cocktail av peptider, der noen av disse stimulerer CTL-responser ovenfor STEAP-1. Eventuelt kan et hjelper-T-celle (HTL)-peptid, slik som et naturlig eller kunstig løst begrenset HLA-klasse-II-peptid, bli inkludert for å fremme CTL-responsen. Slik blir en vaksine i overensstemmelse med beskrivelsen benyttet til å behandle en kreftform som uttrykker eller overuttrykker STEAP-1.

X.D. Adoptiv immunterapi

Antigene STEAP-l-beslektede peptider ble benyttet til å utløse en CTL- og/eller HTL-respons ex vivo også. De resulterende CTL- eller HTL-cellene kan bli benyttet til å behandle tumorer hos pasienter som ikke responderer på andre konvensjonelle terapi- former, eller som ikke vil respondere på et terapeutisk vaksinepeptid eller -nukleinsyre i overensstemmelse med beskrivelsen. Ex wVo-CTL- eller HTL-responser ovenfor et spesielt antigen blir indusert ved å inkubere pasientens, eller genetisk kompatible, CTL- eller HTL-forløperceller i vevskultur sammen med en kilde for antigenpresenterende celler (APC), slik som dendrittiske celler og det passende immunogene peptidet. Etter en passende inkuberingstid (typisk omtrent 7-28 dager), der forløpercellene blir aktivert og ekspandert inn i effekto reel ler, blir cellene infusert tilbake inn i pasienten der de vil ødelegge (CTL) eller fremme ødeleggelsen (HTL) av deres spesifikke målcelle (for eksempel en tumorcelle). Transfekterte dendrittiske celler kan også bli benyttet som antigenpresenterende celler.

X.E. Administrering av vaksiner for terapeutiske eller profylaktiske formål

Farmasøytiske preparater og vaksinepreparater ifølge beskrivelsen blir typisk benyttet til å behandle og/eller forebygge en kreftform som uttrykker eller overuttrykker STEAP-1. I terapeutiske applikasjoner blir peptidpreparater og/eller nukleinsyrepreparater administrert til en pasient i en tilstrekkelig mengde for å utløse en effektiv B-celle-, CTL-og/eller HTL-respons ovenfor antigenet og for å kurere eller i det minste stoppe eller senke farten på symptomer og/eller komplikasjoner. En mengde som er passende for å oppnå dette, er definert som en "terapeutisk effektiv dose". Mengder som er effektive til dette vil være avhengig av for eksempel spesielle preparater som blir administrert, administreringsmåten, stadiet og alvorligheten av sykdommen som blir behandlet, vekten og den generelle helsetilstanden til pasienten og vurderingen til den foreskrivende legen.

For farmasøytiske preparater blir de immunogene peptidene ifølge beskrivelsen, eller DNA som koder for dem, generelt administrert til et individ som allerede har en tumor som uttrykker STEAP-1. Peptidene eller DNA som koder for dem kan bli administrert individuelt eller som fusjoner av én eller flere peptidsekvenser. Pasienten kan bli behandlet med de immunogene peptidene separat eller i sammenheng med andre behandlinger, slik som kirurgi, ettersom dette er hensiktsmessig.

For terapeutisk anvendelse bør administrering generelt begynne ved den første diagnostiseringen av STEAP-l-assosiert kreft. Dette blir fulgt av toppede doser inntil symptomer i det minste er vesentlig fjernet og i en periode deretter. Va ksi neprepa ratet (dvs. inkludert eksempler slik som peptidcocktailer, polyepitoppolypeptider, minigener eller TAA-spesifikke CTLer eller pulsede dendrittiske celler) levert til pasienten kan variere i overensstemmelse med stadiet for sykdommen eller pasientens helsestatus. Hos en pasient med en tumor som uttrykker STEAP-1 kan for eksempel en vaksine som omfatter STEAP-1-spesifikk CTL være mer effektiv i å drepe tumorceller hos pasienten med fremskreden sykdom enn alternative utførelsesformer.

Det er generelt viktig å tilveiebringe en mengde av peptidepitopen som blir levert på en administreringsmåte som er tilstrekkelig til effektivt å stimulere en cytotoksisitet-T-cellerespons, preparater som stimulerer hjelper-T-celleresponser kan også bli gitt.

Doseringen for en første, terapeutisk immunisering foregår generelt i et enhetsdoseringsområde der den lavere verdien er omtrent 1, 5, 50, 500 eller 1 000 ng og der den høyere verdien er omtrent 10 000, 20 000, 30 000 eller 50 000 ng. Doseringsverdier for et menneske ligger typisk i området fra omtrent 500 ng til omtrent 50 000 ng for en pasient på 70 kilogram. Boostingsdoseringer på mellom omtrent 1,0 ng til omtrent 50 000 ng peptid som passer et boostingregime over uker til måneder, kan bli administrert avhengig av pasientens respons og pasientens tilstand slik dette blir målt ved å bestemme spesifisitetsaktiviteten til CTL og HTL fremskaffet fra pasientens blod. Administrering bør bli fortsatt inntil i det minste kliniske symptomer eller laboratorietester indikerer at neoplasien har blitt eliminert eller redusert i en periode deretter. Doseringene, administreringsmåtene og doseskjemaene blir justert i overensstemmelse med metodologier som er kjent på fagområdet.

Peptidene og preparatene ifølge foreliggende beskrivelse kan bli benyttet ved alvorlige sykdomstilstander, dvs. livstruende eller potensielt livstruende situasjoner. I slike tilfeller, som et resultat av de minimale mengdene med de fremmede stoffene og den relative, ikke-toksiske egenskapen til peptidene i foretrukne preparater ifølge oppfinnelsen, er det mulig og det kan bli fult som ønskelig av den behandlede legen å administrere vesentlig overskudd av disse peptidpreparaten relativt i forhold til disse fastlukkede doseringsmengdene.

Vaksinepreparatene kan også bli benyttet kun som profylaktiske midler. Vanligvis foregår doseringen for en første profylaktisk immunisering i et doseringsområde der den lavere verdien er omtrent 1, 5, 50, 500 eller 1 000 ng og den høyere verdien er omtrent 10 000, 20 000, 30 000 eller 50 000 ng- Doseringsverdier for et menneske ligger typisk i området fra omtrent 500 ng til omtrent 50 000 ng per pasient på 70 kilogram. Dette blir fulgt ved boostingdoseringer på mellom omtrent 1,0 ng til omtrent 50 000 n9med peptid administrert ved definerte intervaller fra omtrent fire uker til omtrent seks måneder etter den første administreringen av vaksine. Immunogenisiteten til vaksinen kan bli undersøkt ved å måle den spesifikke aktiviteten til CTL og HTL som er fremskaffet fra en prøve fra pasientens blod.

De farmasøytiske preparatene til terapeutisk behandling er ment for parenteral, topisk, oral, nasal, intratekal eller lokal (for eksempel som en krem eller en topisk salve) administrering. Fortrinnsvis blir de farmasøytiske preparatene administrert parenteralt, for eksempel intravenøst, subkutant, intradermalt eller intramuskulært. Slik tilveiebringer besklrivelsen preparater for parenteral administrering som omfatter en løsning av de immunogene peptidene løst eller suspendert i en akseptabel bærer, fortrinnsvis en vandig bærer.

En mengde vandige bærere kan bli benyttet, for eksempel vann, bufret vann,

0,8 % saltløsning, 0,3 % glysin, hyaluronsyre og lignende. Disse preparatene kan bli sterilisert ved hjelp av konvensjonelle, velkjente steriliseringsteknikker, eller de kan bli

sterilfiltrert. De resulterende vandige løsninger kan bli pakket for anvendelse som de er, eller lyofilisert, der det lyofiliserte preparatet blir kombinert med en steril løsning før administrering.

Preparatene kan inneholde farmasøytisk akseptable tilleggsstoffer slik det er nødvendig for å tilnærme seg fysiologiske betingelser, slik som pH-justerende og bufrende midler, tonisitetsjusterende midler, fuktgjørende midler, preserveringsmidler og lignende, for eksempel natriumacetat, natriumlaktat, natriumklorid, kaliumklorid, kalsiumklorid, sorbitanmonolaurat, trietanolaminoleat osv.

Konsentrasjonen av peptider ifølge oppfinnelsen i de farmasøytiske formuleringene kan variere mye, dvs. fra mindre enn omtrent 0,1 %, vanligvis ved eller i det minste omtrent 2 % til så mye som omtrent 20 % til 50 % eller mer etter vekt, og vil bli valgt primært ved væskevolumer, viskositeter osv., i overensstemmelse med den valgte administreringsmåten.

En human enhetsdoseform av et preparat blir typisk inkludert i et farmasøytisk preparat som omfatter en human enhetsdose med en passende bærer, for eksempel en vandig bærer, og blir administrert i et volum/kvantitet som er kjent for fagfolk på området for å bli benyttet til administrering av slike preparater til mennesker (se f. eks. Remington's Pharmaceutical Sciences, 17. utgave, A. Gennaro, redaktør, Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania, 1985). For eksempel kan en peptiddose for utgangsimmunisering være fra omtrent 1 til omtrent 50 000 ng, generelt 100 til 5 000 ng for en pasient på 70 kg. For nukleinsyrer kan en utgangsimmunisering bli utført ved å anvende en ekspresjonsvektor i form av nakent nukleinsyre administrert IM (eller SC eller ID) i mengdene på 0,5-5 mg på flere steder. Nukleinsyren (0,1 til 1 000 ng) kan også bli administrert ved å anvende en genkanon. Etter en inkuberingsperiode på 3-4 uker, blir deretter en boosterdose administrert. Boosterdosen kan være rekombinant fuglekoppevirus administrert ved en dose på 5-10<7>til 5xl0<9>pfu.

For antistoffer involverer en behandling generelt repetert administrering av anti-STEAP-l-antistoffpreparatet via en akseptabel administreringsmåte slik som intravenøs injeksjon (IV), typisk ved en dose i området på omtrent 0,1 til omtrent 10 mg/kg kroppsvekt. Generelt er doser i områder på 10-500 mg MAb per uke effektive og godt tolererte. Videre representerer en utgangsdose på omtrent 4 mg/kg pasient kroppsvekt IV, etterfulgt av ukentlige doser på omtrent 2 mg/kg IV av anti-STEAP-l-MAb-preparatet et akseptabelt doseringsregime. Slik det er kjent for fagfolk på området kan ulike faktorer påvirke den ideelle dosen i et spesielt tilfelle. Slike faktorer inkluderer for eksempel halveringstiden for preparatet, bindingsaffiniteten til en Ab, immunogenisiteten for et stoff, graden av STEAP-1-ekspresjon hos pasienten, omfanget av sirkulerende utskilt STEAP-l-antigen, det ønskede steady-state-konsentrasjonsnivået, hyppighet og behandling og påvirkningen av kjemoterapeutiske eller andre midler som blir benyttet i kombinasjon med behandlingsfremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, i tillegg til helsetilstanden for en spesiell pasient. Ikke-begrensende foretrukne humane enhetsdoseringer er for eksempel 500 ng - lmg, 1 mg - 50 mg, 50 mg - 100 mg, 100 mg, - 200 mg, 200 mg - 300 mg, 400 mg - 500 mg, 500 mg - 600 mg, 600 mg - 700 mg, 700 mg - 800 mg, 800 mg - 900 mg, 900 mg - 1 g eller 1 mg - 700 mg. I visse utførelsesformer ligger dosen i området på 2-5 mg/kg kroppsvekt, for eksempel med følgende ukentlige doser på 1-3 mg/kg, 0,5 mg, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 mg kroppsvekt etterfulgt for eksempel i 2, 3 eller 4 uker av ukentlige doser, 0,5 - 10 mg/kg kroppsvekt, for eksempel etterfulgt i 2, 3 eller 4 uker med ukentlige doser, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400 mg m<2>per kroppsareal ukentlig, 1-600 mg m<2>kroppsareal ukentlig, 225-400 mg m<2>kroppsareal ukentlig, og disse dosene kan bli fulgt med ukentlige doser i 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 19, 11, 12 eller flere uker.

I en utførelsesform omfatter humane enhetsdoseformer av polynukleotider et passende doseringsområde eller en effektiv mengde som tilveiebringer enhver primær terapeutisk effekt. Slik det er åpenbart for fagfolk på området, avhenger en terapeutisk effekt av et antall faktorer, inkludert sekvensen til polynukleotidet, molekylvekten til polynukleotidet og administreringsmåten. Doseringer blir generelt valgt av legen eller annen profesjonell helsearbeider i overensstemmelse med en mengde parametere som er kjent på fagområdet, slik som alvorligheten av symptomer, pasientens historie og lignende. For et polynukleotid på omtrent 20 baser kan generelt et doseringsområde bli valgt fra for eksempel en uavhengig valgt nedre grense slik som omtrent 0,1, 0,25, 0,5, 1, 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400 eller 500 mg/kg opp til en uavhengig valgt øvre grense, som er høyere enn den lavere grensen, på omtrent 60, 80, 100, 200, 300, 400, 500, 750, 1000, 1500, 2000 ,3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000 eller 10 000 mg/kg. For eksempel kan en dose være omtrent enhver av de følgende: 0,1 til 100 mg/kg, 0,1 til 50 mg/kg, 0,1 til 25 mg(kg, 0,1 til 10 mg/kg, 1 til 500 mg/kg, 100 til 400 mg/kg, 200 til 300 mg/kg, 1 til 100 mg/kg, 100 til 200 mg/kg, 300 til 400 mg/kg, 400 til 500 mg/kg, 500 til 1000 mg/kg, 500 til 5000 mg/kg eller 500 til 10 000 mg/kg. Generelt kan parentale administreringsmåter kreve høyere doser av polynukleotider sammenlignet med mer direkte benyttelse av nukleotidet på sykdomsrammet vev, og det gjelder også polynukleotider med økende lengde.

I en utførelsesform omfatter humane enhetsdoseformer av T-celler et passende doseringsområde eller en effektiv mengde som tilveiebringer enhver terapeutisk effekt. Slik det er åpenbart for fagfolk på området, avhenger en terapeutisk effekt av et antall faktorer. Doseringer blir generelt valgt av legen eller av annen profesjonell helsearbeider i overensstemmelse med en mengde parametere som er kjent på fagområdet, slik som alvorlighet for symptomer, pasientens historie og lignende. En dose kan være på omtrent 10<4>celler til omtrent IO<6>celler, omtrent IO<6>celler til omtrent IO<8>celler, omtrent IO<8>til omtrent 10<11>celler, eller omtrent IO<8>til omtrent 5 x 10<10>celler. En dose kan også være på omtrent IO<6>celler/m<2>til omtrent 10<10>celler/m<2>, eller omtrent IO<6>celler/m<2>til omtrent IO<8>celler/m<2>.

Protein/proteiner ifølge oppfinnelsen og/eller nukleinsyrer som koder for proteinet/proteinene kan også bli administrert via liposomer, som også kan virke for å: 1) lede proteinet/proteinene til et spesielt vev, slik som lymfoidvev, 2) for å lede direkte til sykdomsceller, eller 3) for å øke halveringstiden til peptidpreparatet. Liposomer inkluderer emulsjoner, skum, miceller, uløselige monolag, flytende krystaller, fosfolipiddispersjoner, lamellag og lignende. I disse preparatene blir peptidet som skal bli levert inkorporert som del av et liposom, alene eller sammen med et molekyl som binder til en reseptor som er vanlig forekommende blant lymfoide celler, slik som monoklonale antistoffer som binder til CD45-antigenet, eller med andre terapeutiske eller immunogene preparater. Slik kan liposomer som enten er fylt eller dekorert med det ønskede peptidet ifølge oppfinnelsen bli styrt til stedet med lymfoide celler, der liposomene deretter leverer peptidpreparatene. Liposomer til anvendelse i overensstemmelse med beskrivelsen blir dannet fra standard vesikkeldannende lipider, som generelt inkluderer nøytrale og negativt ladde fosfolipider og et sterol, slik som kolesterol. Valget av lipider blir generelt rettledet ved hjelp av overveielser av for eksempel liposomstørrelse, syrelabilitet og stabilitet for liposomene i blodstrømmen. En mengde fremgangsmåter er tilgjengelige for å fremstille liposomer, som f. eks. beskrevet i Szoka et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng., 9:467 (1980) og US patentskrift nr. 4 235 871, 4 501 728, 4 837 028 og 5 019 369.

For å styre cellene i immunsystemet kan en ligand som skal bli inkorporert i liposome inkludere for eksempel antistoffer eller fragmenter derav som er spesifikke for celleoverflatedeterminanter på de ønskede immunsystemcellene. En liposomsuspensjon som inneholder et peptid kan bli administrert intravenøst, lokalt, topisk osv., i en dose som varierer i overensstemmelse med blant annet administreringsmåten, peptidet som blir levert og stadiet for sykdommen som blir behandlet.

For faste preparater kan konvensjonelle ikke-toksiske, faste bærere bli benyttet som for eksempel inkluderer farmasøytiske renhetsgrader av mannitol, laktose, stivelse, magnesiumstearat, natriumsakkarin, talkum, cellulose, glukose, sukkrose, magnesiumkarbonat og lignende. Til oral administrering blir et farmasøytisk akseptabelt ikke-toksisk preparat dannet ved inkorporering av enhver av de normalt benyttede eksipiensene, slik som de bærerne som tidligere er fremlagt, og generelt 10-95 % med aktiv ingrediens, dvs. ett eller flere peptider ifølge beskrivelsen, og mer foretrukket ved en konsentrasjon på 25 % -75 %.

Til aerosoladministrering er immunogene peptider fortrinnsvis gitt i fint oppdelt form sammen med et overflateaktivt middel og en drivgass. Typiske prosentandeler av peptider er omtrent 0,01 % til 20 % etter vekt, fortrinnsvis omtrent 1 % til 10 %. Det overflateaktive middelet må selvfølgelig være ikke-toksisk, og fortrinnsvis løselig i drivgassen. Representative slike midler er esterne eller de partielle esterne av fettsyrer som inneholder fra omtrent 6 til 22 karbonatomer, slik som kapronsyre, oktansyre, laurinsyre, palmitinsyre, stearinsyre, linolsyre, linolensyre, olestersyre og oleinsyre med en passende alifatisk, polyhydrinalkohol eller dens sykliske anhydrid. Blandede estere slik som blandede eller naturlige glyserider kan bli benyttet. Det overflateaktive stoffet kan utgjøre omtrent 0,1 % til 20 % etter vekt av preparatet, fortrinnsvis omtrent 0,25-5 %. Balansen for preparatet er ordinært drivgassen. En bærer kan også bli inkludert, etter som det er ønskelig, som med for eksempel kitin for intranasal levering.

XI.) Diagnostiske og prognostiske utførelsesformer av STEAP-1

Som beskrevet her blir STEAP-l-polynukleotider, polypeptider, reaktive cytotoksiske T-celler (CTL), reaktive hjelper-T-celler (HTL) og antipolypeptidantistoffer benyttet i velkjente diagnostiske, prognostiske og terapeutiske analyser som undersøker tilstander som er assosiert med feilregulert cellevekst slik som kreft, spesielt kreftformene som er angitt i Tabell I (se f. eks. både dens spesifikke mønster for vevsekspresjon i tillegg til dens overekspresjon i visse kreftformer som beskrevet for eksempel i eksempelet med tittelen "Ekspresjonsanalyse av STEAP-1 i normale vev og pasientprøver").

STEAP-l-kan bli analogisert med en prostataassosiert antigen PSA, som er den erketypiske markøren som har blitt benyttet av medisinere i en årrekke for å identifisere og overvåke tilstedeværelsen av prostatakreft (se f. eks. Merrill et al., J. Uroi., 163(2): 503-5120 (2000), Polascik et al., J. Uroi., Aug: 162(2):293,306 (1999) og Fortier et al., J. Nat. Cancer Inst., 91(19): 1635-1640 (1999)). En mengde andre diagnostiske markører ble også benyttet i tilsvarende kontekster, inkludert p53 og K-ras (se f. eks. Tulchinsky et al., Int J Mol Med, 1999, juli, 4(1):99-102 og Minimoto et al., Cancer Detect Prev, 2000:24(1): 1-12). Derfor tillater tilkjennegivelsen av STEAP-l-polynukleotider og polypeptider (i tillegg til STEAP-l-polynukleotidprober og anti-STEAP-l-antistoffer som blir benyttet for å identifisere tilstedeværelsen av disse molekylene) og deres egenskaper fagfolk i å benytte disse molekylene i fremgangsmåter som er analoge med de som for eksempel blir benyttet i en mengde diagnostisk analyser som er rettet mot å undersøke tilstander som er assosiert med kreft.

Typiske utførelsesformer av diagnostiske fremgangsmåter som benytter STEAP-1-polynukleotidene, -polypeptidene, reaktivitet-T-celler og antistoffer er analoge med de fremgangsmåtene som er fra godt etablerte diagnostiske analyser, som for eksempel benytter PSA-polynukleotider, polypeptider, reaktivitet-celler og antistoffer. Akkurat slik som PSA-polynukleotidet ble benyttet som prober (for eksempel i Northern-analyse, se f. eks. Sharief et al., Biochem. Mol. Biol. Int. 33(3):567-74(1994)) og primere (foreksempel i PCR-analyse, se f. eks. Okegawa et al., J. Uroi., 163(4): 1189-1190 (2000)) for å observere tilstedeværelsen og/eller nivået av PSA-mRNA i fremgangsmåter for å overvåke PSA-overekspresjon eller metastasene med prostatakreft kan også STEAP-l-polynukleotidene som er beskrevet her bli benyttet på samme måte for å påvise STEAP-1-overekspresjon eller metastasene ved prostatakreft og andre kreftformer som uttrykker dette genet. Akkurat som PSA-polypeptider ble benyttet for å generere antistoffer som er spesifikke for PSA som deretter kan bli benyttet til å observere tilstedeværelsen og/eller nivået av PSA-proteiner i fremgangsmåter for å overvåke PSA-proteinoverekspresjon (se f. eks. Stephan et al., Urology, 55(4):560-2 (2000)) eller metastasene ved prostataceller (se f. eks. Alanen et al., Pathol. Res. Pract., 192(3):233-7 (1996)), kan STEAP-1-polypeptidene som er beskrevet her bli benyttet til å generere antistoffer til anvendelse ve påvisning av STEAP-1-overekspresjon eller metastasene med prostataceller og celler for andre kreftformer som uttrykker dette genet.

Fordi metastaser involverer forflytningen av kreftceller fra et opphavsorgan (slik som lunge eller prostatakjertel osv.) til et annet område i kroppen (slik som en lymfeknute), kan spesifikt analyser som undersøker en biologisk prøve for tilstedeværelsen av celler som uttrykker STEAP-l-polynukleotider og/eller -polypeptider bli benyttet for å tilveiebringe bevis på metastase. Når en biologisk prøve fra vev som ikke normalt inneholder STEAP-1-uttrykkende celler (lymfeknute) blir funnet å inneholde STEAP-l-uttrykkende celler, slik som STEAP-1-ekspresjonen som ble sett ved LAPC4 og LAPC9, xenografter som er isolert fra lymfeknute og benmetastaser, så er dette funnet indikativt på metastaser.

Alternativt kan STEAP-l-polynukleotider og/eller polypeptider bli benyttet til å tilveiebringe bevis på kreft, for eksempel når celler i en biologisk prøve som normalt ikke uttrykker STEAP-1 eller som uttrykker STEAP-1 ved et annet nivå bli vunnet å uttrykke STEAP-1 eller ha en økt ekspresjon av STEAP-1 (se f. eks. STEAP-1-ekspresjonen i kreftformene som er fremlagt i Tabell I og i pasientprøver osv., som er vist i de tilhørende figurene). I slike analyser kan fagfolk ønske å ytterligere generere tilleggsbevis på metastaser ved å teste den biologiske prøven for tilstedeværelsen av en annen vevsbegrenset markør (i tillegg til STEAP-1) slik som PSA, PSCA osv. (se f. eks. Alanen et al., Pathol. Res. Pract. 192(3): 233-237 (1996)).

Anvendelsen av immunohistokjemi for å identifisere tilstedeværelsen av et STEAP-1-polypeptid i en vevsseksjon kan indikere en endret tilstand for visse celler i dette vevet. På fagområdet er det godt forstått at evnen til et antistoff i å lokalisere et polypeptid som blir uttrykt i kreftceller er en måte for å diagnostisere tilstedeværelsen av sykdom, sykdomstilstand, progresjon og/eller tumoraggressivitet. Et slikt antistoff kan også påvise en endret distribusjon av polypeptidet i kreftcellene, sammenlignet med tilsvarende ikke-malignt vev.

STEAP-l-polypeptidet og de immunogene preparatene er også nyttige lys av fenomenet med endret subcellulær proteinlokalisering ved sykdomstilstander. Endringer av celler fra normal til sykdomsrammet tilstand forårsaker endringer i cellulær morfologi og er ofte assosiert med endringer i subcellulær proteinlokalisering/distribusjon. For eksempel kan cellemembranproteiner som blir uttrykt på en polarisert måte i normale celler bli endret ved sykdom, noe som fører til distribuering av proteinet på en ikke-polar måte på hele celleoverflaten.

Fenomenet med endret subcellulær proteinlokalisering i en sykdomstilstand har blitt vist med MUC1- og Her2-proteinekspresjon ved hjelp av immunhistokjemiske måter. Normale epitelceller har en typisk toppdistribusjon av MUC1, i tillegg til noe supranukleær lokalisering av glykoproteinet, mens maligne lesjoner ofte viser et apolart fargingsmønster (Diaz et al., The Breast Journal, 7, 40-45 (2001), Zhang et al., Clinical Cancer Research, 4, 2669-2676 (1998), Cao et al., The Journal of Histochemistry and Cytochemistry, 45: 1547-1557 (1997)). I tillegg er normalt brystepitel enten negativt for HER2-protein eller det oppviser kun en basolateral distribusjon mens maligne celler kan uttrykke proteinet på hele celleoverflaten (De Potter et al., International Journal of Cancer, 44: 969-974 (1989), McCormick et al., 117, 935-943 (2002)). Alternativt kan distribueringen av proteinet som er endret fra kun en overflatelokalisering til å inkludere diffus cytoplasmisk ekspresjon i den sykdomsrammede tilstanden. Et slikt eksempel kan bli sett med MUC1 (Diaz et al., The Breast Journal, 7: 40-45 (2001)).

Endring i lokaliseringen/distribusjonen av et protein i cellen, slik det er påvist ved hjelp av immunhistokjemiske fremgangsmåter, kan også tilveiebringe verdifull informasjon som gjelder hvor godt visse behandlingsmetoderer passer. Dette siste punktet er illustrert ved en situasjon der et protein kan være intracellulært i normalt vev, men foreligger på celleoverflaten i maligne celler, der celleoverflatelokaliseringen gjør cellene hensiktsmessig tilpasset til antistoffbaserte diagnostiske regimer og behandlingsregimer. Når en slik endring av proteinlokalisering foregår for STEAP-1, er STEAP-l-proteinet og immunresponsene som er relatert til dette svært nyttige. Evnen til å bestemme hvorvidt endring av subcellulær proteinlokalisering forekom for 24P4C12, gjør alternativt STEAP-l-proteinet og immunresponsene som er relatert til dette svært nyttige. Anvendelse av STEAP-1-preparatene gjør det mulig for fagfolk på området å foreta viktige diagnostiske og terapeutiske avgjørelser.

Immunhistokjemiske reagenser som er spesifikke for STEAP-l-genet er også nyttig for på påvise metastaser av tumorer som uttrykker STEAP-1 når polypeptidet forekommer i vev der STEAP-1 normalt ikke blir produsert.

STEAP-l-polypeptider og antistoffer som fremkommer på grunn av immunresponser dertil er slik nyttig i en mengde viktige kontekster, slik som ved diagnostiske, prognostiske, preventive og/eller terapeutiske formål som er kjent for fagfolk på området.

På samme måte som PSA-polynukleotidfragmenter og polynukleotidvarianter blir benyttet av fagfolk for anvendelse i fremgangsmåte for å overvåke PSA blir STEAP-1-polynukleotidfragmenter og polynukleotidvarianter benyttet på en analog måte. Spesielt er typiske PSA-polynukleotider som ble benyttet i fremgangsmåter for å overlevere eller overvåke PSA prober eller primere som består av fragmenter av PSA-cDNA-sekvensen. For å illustrere dette må primere som blir benyttet for å PCR-amplifisere et PCR-polynukleotid inneholde minste enn hele PSA-sekvensen for å virke i polymerasekjedereaksjonen. I konteksten med slike PCR-reaksjoner fremstiller generelt fagfolk på området en mengde ulike polynukleotidfragmenter som kan benyttes som primere for å amplifisere ulike deler av et polynukleotid av interesse eller for å optimalisere amplifiseringsreaksjoner (se f. eks. Caetano-Anolles, G., Biotechniques, 25(39: 472-476, 478-480 (1998), Robertson et al., Methods Mol. Biol., 98:121-1254 (1998)). En ytterligere illustrasjon på anvendelsen av slike fragmenter blir tilveiebrakt i eksempelet med titteln "Ekspresjonsanalyse av STEAP-1 i normale vev, og pasientprøver", der et STEAP-l-polynukleotidfragment ble benyttet som en probe for å vise ekspresjonen av STEAP-1-RNA i kreftceller. I tillegg blir variantpolynukleotidsekvenser typisk benyttet som primere og prober for de tilsvarende mRNA i PCR- og Northern-analyse (se f. eks. Sawai et al., Fetal Diagn. Ther., 1996, nov-des, 11(6):407-13 og Current Protocols In Molecular Biology, volum 2, enhet 2, Frederick M. Ausubel et al., red., 1995)). Polynukleotidfragmenter og varianter er nyttige i denne konteksten der de er i stand til å binde til en målpolynukleotidsekvens (for eksempel et STEAP-l-polynukleotid som er vist i Figur 2 eller en variant derav) ved betingelser med høy stringens.

Videre blir PSA-polypeptider som inneholder en epitop som kan bli gjenkjent av et antistoff eller T-celle som spesifikt binder til denne epitopen bli benyttet i fremgangsmåter for å overvåke PSA. STEAP-l-polypeptidfragmenter og polypeptidanaloger eller varianter kan også bli benyttet på en analog måte. Denne praksisen med å benytte polypeptidfragmenter eller polypeptidvarianter for å generere antistoffer (slik som anti-PSA-antistoffer eller T-celler) er typisk på fagområdet med et bredt utvalgt av systemer slik som fusjonsproteiner blir benyttet av utøvere (se f. eks. Current Protocls In Molecular Biology, volum 2, enhet 16, Frederick M. Ausubel et al., red., 1995). I denne konteksten virker hver epitop/epitoper for å tilveiebringe arkitekturen med hvilken et antistoff eller en T-celle er reaktiv. Typisk fremstiller fagfolk på området en mengde ulike polypeptidfragmenter som kan bli benyttet for å generere immunresponser som er spesifikke for ulike deler av et polypeptid av interesse (se f. eks. US patentskrift nr. 5 840 501 og US patentskrift nr. 5 939 533). For eksempel kan det være foretrukket å benytte et polypeptid som omfatter et av de biologiske STEAP-1-motivene som er diskutert her eller en motivbærende undersekvens som lett kan bli identifisert av fagfolk på området basert på motiver som er tilgjengelige på fagområdet. Polypeptidfragmenter, varianter eller analoger er typisk nyttige i denne konteksten så lenge de omfatter en epitop som er i stand til å generere et antistoff eller en T-celle som er spesifikk for en målpolypeptidsekvens (for eksempel en STEAP-1-polypeptid som vist i Figur 3).

Som vist her oppviser STEAP-l-polynukleotidene og polypeptidene (i tillegg til STEAP-1-polynukleotidprobene og anti-STEAP-l-antistoffene eller T-cellene som er benyttet til å identifisere tilstedeværelsen av disse molekylene) spesifikke egenskaper som gjør dem nyttige i å diagnostisere kreft slik som de som er fremlagt i Tabell I. Diagnostiske analyser som måler tilstedeværelsen av STEAP-l-genprodukter, for å evaluere tilstedeværelsen eller fremkomsten av en sykdomstilstand som er beskrevet her, slik som prostatakreft, er nyttige for å identifisere pasienter for preventive innsatser eller for ytterligere overvåking, slik det vellykket har blitt gjort med PSA. Videre fyller disse materialene et behov på fagområdet for molekyler som har lignende eller komplementære karakteristika med PSA i situasjoner der for eksempel en definitiv diagnostisering av metastaser med prostataopphav ikke kan bli gjort på basis av en test for PSA alene (se f. eks. Alanen et al., Pathol. Res. Pract., 192(3): 233-237 (1996)) og dermed er det nødvendig at materialer slik som STEAP-l-polynukleotider og polypeptider (i tillegg til STEAP-l-polynukleotidprobene og anti-STEAP-1-antistoffene som blir benyttet for å identifisere tilstedeværelsen av disse molekylene) blir benyttet for å bekrefte en metastase av prostataopphav.

I tillegg til deres anvendelse i diagnostiske analyser har STEAP-l-polynukleotidene som er beskrevet her et antall andre anvendelse slik som deres anvendelse i identifiseringen av onkogent assosierte kromosomale unormalheter i den kromosomale regionen der STEAP-l-genet er kartlagt (se eksempelet med tittelen "kromosomal kartlegging av STEAP-1" nedenfor). I tillegg til deres anvendelse i diagnostiske analyser har videre de STEAP-l-beslektede proteinene og polynukleotidene som er beskrevet her andre anvendelser slik som deres anvendelse i rettsanalyse av vev av ukjent opphav (se f. eks. Takahama K, Forensic Sei Int, 1996, juni, 28:80 (1-2): 63-9).

I tillegg kan STEAP-l-beslektede proteiner eller polynukleotider ifølge oppfinnelsen bli benyttet til å behandle en patologisk tilstand som erkarakterisert vedoverekspresjon av STEAP-1. For eksempel kan aminosyresekvensen eller nukleinsyresekvensen ifølge Figur 2 eller Figur 3, eller fragmenter av begge, bli benyttet for å generere en immunrespons mot et STEAP-l-antigen. Antistoffer eller andre molekyler som reagerer med STEAP-1 kan bli benyttet til å modulere funksjonen til dette molekylet, og derved tilveiebringe en terapeutisk fordel.

XII. Inhibering av STEAP-l-proteinfunksjon

Beskrivelsen inkluderer ulike fremgangsmåter og preparater for å inhibere bindingen av STEAP-1 til dens bindingspartner eller dens assosiering med andre proteiner i tillegg til fremgangsmåter for å inhibere STEAP-1-funksjon.

XII.A.) Inhibering av STEAP-1 med intracellulære antistoffer

I en tilnærming blir en rekombinant vektor som koder for enkeltkjedeantistoffer som spesifikt binder til STEAP-1 introdusert i STEAP-1-uttrykkende celler via gen-overføringsteknologier. I overensstemmelse med dette blir det kodede enkeltkjede-anti-STEAP-l-antistoffet uttrykt intracellulært, binder til STEAP-l-protein og inhiberer derved dens funksjon. Fremgangsmåte for å fremstille slike intracellulære enkeltkjedeantistoffer er velkjente. Slike intracellulære antistoffer, som også er kjent som "intralegemer", er spesifikt målrettet mot en spesiell avdeling inn i cellen, og tilveiebringer kontroll på hvor den inhibitoriske aktiviteten ved behandlingen er fokusert. Denne teknologien har vellykket blitt benyttet på fagområdet (for en gjennomgang, se Richardson og Marasco, 1995, TIBTECH, vol. 13). Intralegemer har blitt vist å nesten fullstendig eliminere ekspresjonen av ellers rikelig forekommende celleoverflatereseptorer (se f. eks. Richardson et al., 1995, Proe. Nati. Acad. Sei., USA, 92: 3137-3141, Beerli et al., 1994, J. Biol. Chem., 289: 23931-23936, Deshane et al., 1994, Gene Ther., 1: 332-337).

Enkeltkjedeantistoffer omfatter varibeldomenene på den tunge og den lette kjeden bundet sammen et fleksibelt linkerpolypeptid, og blir uttrykt som et enkelt polypeptid. Eventuelt blir enkeltkjedeantistoffet uttrykt som et enkeltkjede variabelregionfragment bundet sammen med lettkjede konstantregionen. Velkjente intracellulære trafikken ngs-signaler blir innført i rekombinante polynukleotidvektorer som koder for slike enkeltkjede antistoffer for å presist målrette intralegeme til den ønskede intracellulære avdelingen. For eksempel blir intralegemer som er målrettet mot det endoplasmatiske retikulum (ER) fremstilt slik at de inkorporerer et lederpeptid og eventuelt et C-terminalt ER-retensjons-signal, slik som KDEL-aminosyremotivet. Intralegemer som er ment å skulle utøve aktivitet i kjernen blir fremstilt slik at de inkluderer et nukleært lokaliseringssignal. Lipidenheter blir bundet til intralegemer for å knyte intralegemet til cytosolsiden av plasmamembranen. Intralegemet kan også bli styrt slik at de utøver virkning i cytosolet. For eksempel blir cytosolintralegemer benyttet for å isolere faktorer i cytosol, for derved å forhindre at de blir transportert til deres naturlige cellulære destinasjon.

Intralegemer kan bli benyttet for å fange STEAP-1 i kjernen, for derved å forhindre dens aktivitet i kjernen. Kjernemålsøkingssignaler blir fremstilt inn i slike STEAP-1-intralegemer for å oppnå den ønskede målstyringen. Slike STEAP-l-intralegemer blir designet for spesifikt å binde til et spesielt STEAP-l-domene. Cytosolintralegemer som spesifikt binder til et STEAP-l-protein kan bli benyttet for å forhindre at STEAP-1 får tilgang til kjernen, for derved å forhindre den fra å utøve biologisk aktivitet i kjernen (for eksempel forhindre STEAP-1 i å danne transkripsjonskomplekser med andre faktorer).

For spesifikk å kunne styre ekspresjonen av slikt intralegeme til spesielle celler, blir transkripsjonen av intralegeme plassert under den regulatoriske kontroll av en passende tumorspesifikk promotor og/eller enhancer. For å styre intralegemeekspresjonen spesifikt til prostata for eksempel, kan PSA-promotoren og/eller promotoren/enhanceren bli benyttet (se for eksempel US patentskrift nr. 5 919 652, meddelt 6. juli, 1999).

XII.B.) Inhibering av STEAP-1 med rekombinante proteiner

I en annen tilnærming binder rekombinante molekyler til STEAP-1 og inhiberer derved STEAP-l-funksjon. For eksempel forhindrer eller inhiberer disse rekombinante molekylene STEAP-1 fra å møte/binde til sin bindingspartner/partnere eller å assosiere med andre proteiner. Slike rekombinante molekyler kan for eksempel inneholde den reaktive delen/delene av et STEAP-1-spesifikt antistoffmolekyl. STEAP-l-bindingsdomenet for en STEAP-1-bindingspartner kan bli fremstilt i et dimert fusjonsprotein, hvorved fusjonsproteinet omfatter to STEAP-l-ligandbindingsdomener bundet til Fc-delen av et humant IgG, slik som humant IgGl. En slik IgG-del kan for eksempel inneholde CH2- og CH3-domenene og hengselregionen, men ikke CHl-domenet. Slike dimerer fusjonsproteiner blir administrert i løselig form til pasienter som lider av en kreftform som er assosiert med ekspresjonen av STEAP-1, hvorved det dimere fusjonsproteinet spesifikt binder til STEAP-1 og blokkerer STEAP-l-interaksjon med en bindingspartner. Slike dimere fusjonsproteiner blir ytterligere kombinert til multimere proteiner ved å anvende kjente antistoffsammenkoblingsteknologier.

XII.C.) Inhibering av STEAP-l-transkripsjon eller -translasjon

Foreliggende beskrivelse omfatter også ulike fremgangsmåter og preparater for å inhibere transkripsjonen av STEAP-l-genet. Tilsvarende tilveiebringer også beskrivelsen fremgangsmåter og preparater for å inhibere translasjon av STEAP-l-mRNA til protein.

I én tilnærming omfatter en fremgangsmåte for å inhibere transkripsjonen av STEAP-l-genet å kontakte STEAP-l-genet med et STEAP-l-antisens polynukleotid. I en annen tilnærming omfatter en fremgangsmåte for å inhibere STEAP-l-mRNA-translasjon å kontakte et STEAP-l-mRNA med et antisens polynukleotid. I en annen tilnærming blir et STEAP-1-spesifikt ribozym benyttet for å kløyve en STEAP-l-beskjed, for derved å inhibere translasjon. Slike antisensfremgangsmåter og ribozym baserte fremgangsmåter kan også bli rettet mot de regulatoriske regionene i STEAP-l-genet, slik som STEAP-1-promotor og/eller -enhancerelementer. Tilsvarende blir proteiner som er i stand til å inhibere en STEAP-1-gentranskripsjonsfaktor benyttet for å inhibere STEAP-l-mRNA-transkripsjon. De ulike polynukleotidene og preparatene som er nyttige i de tidligere nevnte fremgangsmåtene har blitt beskrevet ovenfor. Anvendelsen av antisens- og ribozymmolekyler for å inhibere transkripsjon og translasjon er velkjent på fagområdet.

Andre faktorer som inhiberer transkripsjonen av STEAP-1 ved å interferere med STEAP-l-transkripsjonsaktivering er også nyttige for å behandle kreftformer som uttrykker STEAP-1. Tilsvarende er faktorer som interfererer med STEAP-1-prosessering nyttige for å behandle kreftformer som uttrykker STEAP-1. Kreftbehandlingsfremgangsmåter som benytter slike faktorer ligger også innenfor omfanget av beskrivelsen.

XII.D.) Generelle overveielser for terapeutiske strategier

Genoverførings- og genterapi-teknologier kan bli benyttet for å levere terapeutiske polynukleotidmolekyler til tumorceller som syntetiserer STEAP-1 (dvs. antisensmolekyler, ribozymer, polynukleotider som koder for intralegemer og andre STEAP-l-inhibitoriske molekyler). Et antall genterapitilnærminger er kjent på fagområdet. Rekombinante vektorer som koder for STEAP-l-antisenspolynukleotider, ribozymer, faktorer som er i stand til å interferere med STEAP-l-transkripsjon osv. kan bli levert til måltumorceller ved å anvende slike genterapitilnærminger.

De terapeutiske tilnærmingene ovenfor kan bli kombinert med enhver av et vidt utvalg kirurgiske, kjemoterapeutiske eller strålingsterapiregimer. De terapeutiske tilnærmingene ifølge beskrivelsen kan muliggjøre anvendelsen av reduserende doseringer av kjemoterapi (eller andre terapier) og/eller mindre hyppig administrering, noe som er en fordel for alle pasienter og spesielt for de som ikke tolererer toksisiteten til det kjemoterapeutiske middelet godt.

Anti-tumoraktiviteten til et spesielt preparat (for eksempel antisens, ribozym, intralegeme) eller en kombinasjon av slike preparater, kan bli evaluert ved å anvende ulike in vitro- og in wVo-analysesystemer. In wtro-analyser som evaluerer terapeutisk aktivitet inkluderer cellevekstanalyser, mykagaranalyser og andre analyser som er indikative på tumorfremmende aktivitet, bindingsanalyser som er i stand til å bestemme omfanget ved hvilket et terapeutisk preparat vil inhibere binding av STEAP-1 til en bindingspartner osv.

In vivo kan effekten av et terapeutisk STEAP-1-preparat bli evaluert i en passende dyremodell. For eksempel kan xenogene prostatakreftmodeller bli benyttet, der humane prostatakreft eksplanter eller passerte xenograftvev blir introdusert inn i immunkompromitterte dyr, slik som nakenmus eller SCID-mus (Klein et al., 1997, Nature Medicine, 3: 402-408). For eksempel beskriver PCT-patentsøknad WO 98/16628 og US patentskrift nr. 6 107 540 ulike xenograftmodeller med human prostatakreft som er i stand til å rekapitulere utviklingen av primære tumorer, mi kro metastase r og dannelsen av osteoblastmetastaser som er karakteristiske for sykdom i sent stadium. Effektivitet kan bli beregnet ved å anvende analyser som måler inhibering av tumordannelse, tumorregresjon eller metastase og lignende.

In wVo-analyser som evaluerer fremmingen av apoptose er nyttige i å evaluere terapeutiske preparater. I en utførelsesform kan xenografter fra tumorbærende mus som er behandlet med det terapeutiske preparatet bli undersøkt for tilstedeværelsen av apoptotiske fokuspunkter og sammenlignet med ubehandlede, kontrollxenograftbærende mus. Omfanget ved hvilket apoptotiske fokuspunkter blir funnet i tumorene for de behandlede musene tilveiebringer en indikasjon på den terapeutiske effektiviteten av preparatet.

De terapeutiske preparatene som blir benyttet til utøvelsen av de foregående fremgangsmåtene kan bli formulert til farmasøytiske preparater som omfatter en bærer som er passende for den ønskede leveringsfremgangsmåten. Passende bærer inkluderer ethvert materiale som når det blir kombinert med det terapeutiske preparatet opprettholder antitumorfunksjonen til det terapeutiske preparatet og er generelt ikke-reaktivt med pasientens immunsystem. Eksempler inluderer ethvert antall av standard farmasøytiske bærere slik som sterilt fosfatburet fysiologisk saltvannsløsning, bakteriostatisk vann og lignende (se generelt, Remingtons Pharmaceutical Sciences, 16. utgave, A. Osal, red., 1980).

Terapeutiske formuleringer kan bli løseliggjort og administrert på en måte som muliggjør levering av det terapeutiske preparatet til tumorstedet. Potensielt effektive administreringsmåter inluderer intravenøst, parenteralt, intraperitonealt, intramuskulært, intratumoralt, intradermalt, intraorganmessig, ortotopisk og lignende. En foretrukket formulering for intravenøs injeksjon omfatter det terapeutiske preparatet i en løsning med preservert bakteriostatisk vann, sterilt upreservert vann og/eller fortynningsmiddel i polyvinylklorid eller polyetylenposer inneholdende 0,9 % sterilt natriumklorid for injeksjon, USP. Terapeutiske proteinpreparater kan bli lyofilisert og lagret som sterile pulvere, fortrinnsvis ved vakuum, og deretter rekonstituert i bakteriostatisk vann (inneholdende for eksempel benzylalkoholpreserveringsmidler) eller i sterilt vann før injeksjon.

Doseringsprotokoller og administreringsprotokoller for behandlingen av kreft ved å anvende de foregående fremgangsmåtene vil variere med fremgangsmåten og kreftformen, og vil generelt være avhengig av et antall andre faktorer som er åpenbare på fagområdet.

XIII.) Identifisering, karakterisering og anvendelse av modulatorer av STEAP-1

Fremgangsmåter for å identifisere og benytte modulatorer

Screening kan bli utført for å identifisere modulatorer som induserer eller undertrykker en spesiell ekspresjonsprofil, undertrykker eller induserer spesifikke veier, og som ved dette fortrinnsvis genererer den assosierte fenotypen. Etter å ha identifisert ulike uttrykte gener som er viktige i en spesiell tilstand, kan screeninger bli utført for å identifisere modulatorer som endrer ekspresjon av individuelle gener, enten øker eller minsker. Screening kan bli utført for å identifisere modulatorer som endrer en biologisk funksjon for det uttrykte produktet fra et ulikt uttrykt gen. Etter å ha identifisert viktigheten av et gen i en spesiell tilstand blir igjen screeninger utført for å identifisere midler som binder og/eller modulerer den biologiske aktiviteten til genproduktet.

I tillegg blir screeninger utført for gener som blir indusert som respons på et kandidatmiddel. Etter å ha identifisert en modulator (en som undertrykker et kreftekspresjonsmønster som fører til et normalt ekspresjonsmønster, eller en modulator av et kreftgen som fører til ekspresjon av genet som i normalt vev) blir en screening utført for å identifisere gener som spesifikt blir modulert som respons på middelet. Sammenligning av ekspresjonsprofiler mellom normalt vev og middelbehandlet kreftvev avslører gener som ikke blir uttrykt i normalt vev eller kreftvev, men som blir uttrykt i middelbehandlet vev og vice versa. Disse middelspesifikke sekvensene blir identifisert og benyttet av fremgangsmåter som er beskrevet her for kreftgener eller -proteiner. Spesielt blir disse sekvensene og proteinene de koder for benyttet til å markere eller identifisere middelbehandlede celler. I tillegg blir antistoffer frembrakt mot de middelinduserte proteinene og benyttet til å målsøke nye terapeutiske midler mot de behandlede kreftvevs p røve n e.

Modulatorrelatert identifisering og screeninqsanalvser:

Genekspresionsrelaterte analyser

Proteiner, nukleinsyrer og antistoffer ifølge beskrivelsen blir benyttet i screeningsanalyse. De krefetassosierte proteinene, antistoffene, nukleinsyrene, modifiserte proteinene og cellene som inneholder disse sekvensene blir benyttet i screeningsanalyser, slik som for å evaluere effekten av legemiddelkandidater på en "genekspresjonsprofil", ekspresjonsprofil for polypeptider eller endring i biologisk funksjon. Ekspresjonsprofilene kan bli benyttet fortrinnsvis i sammenheng med høy omsetnings screeningsteknikker for å tillate overvåking av ekspresjonsprofilgener etter behandling med et kandidatmiddel (for eksempel Davis, GF et al., J Biol Screen, 7:69 (2002), Zlokarnik et al., Science, 279:84-8

(1998), Heid, Genome Res, 6:986-94, 1996).

Kreftproteinene, antistoffene, nukleinsyrene, de modifiserte proteinene og cellene som inneholder de native eller de modifiserte kreftproteinene eller genene blir benyttet i screeningsanalyse. Dvs. at foreliggende beskrivelse omfatter fremgangsmåter for screening av preparater som modulerer kreftfenotypen eller en fysiologisk funksjon for et kreftprotein ifølge beskrivelsen. Dette blir gjort på et gen eller ved å evaluere effekten av legemiddelkandidater på en "genekspresjonsprofil" eller biologisk funksjon. I en utførelsesform blir ekspresjonsprofiler benyttet, fortrinnsvis i sammenheng med høy omsetningsscreeningsteknikker for å tillate overvåking etter behandling med et kandidatgen, se Zlokanik, ovenfor.

Et utall av analyser blir utført direkte på genene og proteinene ifølge beskrivelsen. Analyser blir kjørt på et individuelt nukleinsyrenivå eller proteinnivå. Etter å ha identifisert et spesielt gen som oppregulert ved kreft, blir testforbindelser screenet for evnen til å modulere genekspresjon eller for binding til kreftproteinet ifølge beskrivelsen. "Modulering" i denne konteksten inkluderer en økning eller minskning i genekspresjon. Den foretrukne mengden av modulering vil være avhengig av den opprinnelige endringen i genekspresjonen i normalt versus vev som er rammet av kreft, med endringer på minst 10 %, fortrinnsvis minst 50 %, mer foretrukket 100-300% og i noen utførelsesformer 300-1 000 % eller mer. Hvis et gen oppviser en 4-gangers økning i kreftvev sammenlignet med normalt vev, er slik en minskning på omtrent 4-ganger ofte ønskelig, og tilsvarende er ofte en 10-gangers minskning i kreft sammenlignet med normalt vev en målverdi for en 10-gangers økning i ekspresjon ved testforbindelsen. Modulatorer som forverrer typen av genekspresjon som blir sett i kreft er også nyttige, for eksempel som et oppregulert mål i ytterligere analyser.

Mengden av genekspresjon blir overvåket ved å anvende nukleinsyreprober og kvantifiseringen av genekspresjonsnivåer eller alternativt, et genprodukt blir selv overvåket, for eksempel via anvendelsen av antistoffer og kreftproteinet og standard immunanalyse. Proteomikk og separasjonsteknikker tillater også kvantifisering av ekspresjon.

Ekspresionsovervåkninq for å identifisere forbindelser som modifiserer genekspresjon

Genekspresjonsovervåkning, dvs. en ekspresjonsprofil, kan bli overvåket samtidig for et antall enheter. Slike profiler vil typisk involvere ett eller flere av genene i Figur 2. Her blir f. eks. kreftnukleinsyreprober koblet på biobrikker for å påvise og kvantifisere kreftsekvenser i en spesiell celle. Alternativt kan PCR bli benyttet. Slik kan er serie, f. eks. brønner på en mikrotiterplate, bli benyttet med fordelte primere i ønskede brønner. En PCR-reaksjon kan deretter bli utført og analysert for hver brønn.

Ekspresjonsovervåking blir utført for å identifisere forbindelser som modifiserer ekspresjonen av én eller flere kreftassosierte sekvenser, for eksempel en polynukleotidsekvens som er fremlagt ifølge Figur 2. Generelt blir en testmodulator tilsatt til cellene før analyse. Videre blir screeninger også tilveiebrakt for å identifisere midler som modulerer kreft, modulerer kreftproteiner ifølge beskrivelsen, binder til et kreftprotein ifølge beskrivelsen eller som interfererer med bindingen av et kreftprotein ifølge beskrivelsen og et antistoff eller annen bindingspartner.

Høyomsetnings screeningsfremgangsmåter kan involvere å tilveiebringe et bibliotek som inneholder et stort antall potensielt terapeutiske forbindelser (kandidatforbindelser). Slike "kombinatoriske kjemiske biblioteker" blir deretter screenet i én eller flere analyser for å identifisere de medlemmene i biblioteket (spesielle kjemiske enheter eller underklasser) som oppviser en ønsket karakteristisk aktivitet. Forbindelsene som blir identifisert på den måten kan virke som konvensjonelle "lederforbindelser", som forbindelser for screening eller som terapeutiske midler.

Kombinatoriske biblioteker med potensielle modulatorer kan bli screenet for en evne til å binde til et kreftpolypeptid eller for å modulerer aktivitet. Konvensjonelt blir nye kjemiske enheter med nyttige egenskaper generert ved å identifisere en kjemisk forbindelse (kalt en "lederforbindelse") med en ønskelig egenskap eller aktivitet, for eksempel inhiberende aktivitet, for å danne varianter av lederforbindelsen, og evaluere egenskapen og aktiviteten for disse variantforbindelsene. Ofte blir

høyomsetningsscreeningsfremgangsmåte (HTS) benyttet i slike analyser.

Som påpekt ovenfor bli genekspresjonsovervåkning hensiktsmessig benyttet for å teste kandidatmodulatorer (for eksempel protein, nukleinsyre eller et lite molekyl). Etter at kandidatmiddelet har blitt tilsatt og cellene tillatt å inkubere i en periode, blir for eksempel prøven som inneholderen målsekvens som skal bli analysert påsatt en biobrikke.

Hvis ønskelig blir målsekvensen klargjort ved å anvende kjente teknikker. For eksempel blir en prøve behandlet for å lysere cellene, ved å anvende kjente lysisbuffere, elektroporering osv., med rensing og/eller amplifisering slik som PCR, utført der det er hensiktsmessig. For eksempel blir en in wtro-transkripsjon med merker kovalent bundet til nukleotidene utført. Generelt blir nukleinsyrene merket med biotin-FITC eller PE, eller med cy3 eller cy5.

Målsekvensen kan for eksempel bli merket med et fluorescerende, et kjemiluminiscens, et kjemisk eller et radioaktivt signal for å tilveiebringe en måte for å påvise målsekvensens spesifikke binding til en probe. Merket kan også være et enzym, slik som alkalisk fosfatase eller pepperrotperoksidase, som når det blir tilveiebrakt med et passende substrat frembringer et produkt som er påvistbart. Alternativt er merket en merkeforbindelse eller et lite molekyl, slik som en enzyminhibitor, som binder men som ikke katalyserer eller endrer enzymet. Merket kan også være en enhet eller en forbindelse slik som et epitopmerke eller biotin som spesifikt binder til streptavidin. For eksempel med biotin blir streptavidinet merket som beskrevet ovenfor, for derved å tilveiebringe et påvisbart signal for den bundne målsekvensen. Ubundet, merket streptavidin blir typisk fjernet før analyse.

Slik det er åpenbart for fagfolk på området, kan disse analysene være direkte hybridiseringsanalyser eller de kan omfatte "sandwichanalyser" som inkluderer anvendelsen av flere prober, slik det generelt er frembrakt i US patentskrift nr. 5 681 702, 5 597 909,

5 545 730, 5 594 117, 5 591 584, 5 571 670, 5 580 731, 5 571 670, 5 591 584, 5 624 802, 5 635 352, 5 594 118, 5 359 100, 5 124 246 og 5 681 697. Målnukleinsyren blir vanligvis fremstilt som fremlagt ovenfor, og deretter påsatt biobrikken som omfatter mange nukleinsyreprober, ved betingelser som tillater dannelsen av et hybridiseringskompleks. En mengde hybridiseringsbetingelser blir benyttet i foreliggende beskrivelsen, inkludert høyt, moderate og lave stringensbetingelser som fremlagt ovenfor. Analysen blir generelt kjørt ved stringensbetingelser som tillater dannelsen av merkeprobehybridiseringskomplekset kun i nærværet av mål. Stringens kan bli kontrollert ved å endre en trinnparameter som er en termodynamisk variabel, inkludert men ikke begrenset til, temperatur, formamidkonsentrasjon, saltkonsentrasjon, kaotropisk saltkonsentrasjon, pH, organisk løsningsmiddelkonsentrasjon osv. Disse parameterne kan også bli benyttet for å kontrollere ikke-spesifikk binding, slik det er fremlagt i US patentnr. 5 681 697. Slik kan det være ønskelig å utføre visse trinn ved høyere stringente betingelser for å redusere ikke-spesifikk binding.

Reaksjonene som er fremlagt her kan bli utført på en mengde ulike måter. Komponenter i reaksjonen kan bli tilsatt samtidig, eller sekvensielt, i ulik rekkefølge, med foretrukne eksempler beskrevet nedenfor. I tillegg kan reaksjonen inkludere en mengde andre reagenser. Disse inkluderer salter, buffere, nøytrale proteiner, for eksempel albumin, detergenter, osv., som kan bli benyttet for å fremme optimal hybridisering og deteksjon og/eller redusere ikke-spesifikke eller bakgrunnsinteraksjoner. Reagenser som ellers forbedrer effektiviteten av analysen, slik som proteaseinhibitor, nukleaseinhibitor, anti-mikrobemidler osv., kan også bli benyttet der det er hensiktsmessig, avhengig av prøveprepareringsfremgangsmåtene og renheten av målet. Analysedataene blir analysert for å bestemme ekspresjonsnivåene av individuelle gener og endringer i ekspresjonsnivåer mellom tilstander, for å danne en genekspresjonsprofil.

Biologiske aktivitetsrelaterte analyser

Beskrivelsen tilveiebringer fremgangsmåter for å identifisere eller screene etter en forbindelse som modulerer aktiviteten til et kreftrelatert gen eller protein ifølge beskrivelsen. Fremgangsmåten omfatter å tilsette en testforbindelse, som definert ovenfor, til en celle som omfatter et kreftprotein ifølge beskrivelsen. Cellene inneholder en rekombinant nukleinsyre som koder for et kreftprotein ifølge beskrivelsen. Et bibliotek av kandidatmidler kan bli testet på mange forskjellige celler.

Analysene kan bli evaluert i nærvær eller fravær av tidligere eller påfølgende eksponering av fysiologiske signaler, for eksempel hormoner, antistoffer, peptider, antigener, cytokiner, vekstfaktorer, virkningspotensialer, farmakologiske midler inkludert kjemoterapeutiske midler, stråling, karsinogene midler eller andre celler (dvs. celle-celle-kontakter). I et annet eksempel blir bestemmelsene gjort ved ulike stadier i cellesyklusprosessen. På denne måten blir forbindelser som modulerer gener eller proteiner ifølge beskrivelsen identifisert. Forbindelser med farmakologisk aktivitet er i stand til å forsterke eller interferere med aktiviteten til kreftproteinet ifølge beskrivelsen. Når de er identifisert, blir tilsvarende strukturer evaluert for å identifisere kritiske strukturegenskaper for forbindelsen.

En fremgangsmåte for å modulere (foreksempel inhibere) kreftcelledeling er tilveiebrakt, der fremgangsmåten omfatter administrering av en kreftmodulator. En fremgangsmåte for å modulere (for eksempel inhibere) kreft blir tilveiebrakt, der fremgangsmåten omfatter administrering av en kreftmodulator. Fremgangsmåter for å behandle celler eller individer med kreft blir ogsp tilveiebrakt, der fremgangsmåten omfatter administrering av en kreftmodulator.

En fremgangsmåte for å modulere statusen til en celle som uttrykker et gen ifølge beskrivelsen blir tilveiebrakt. Som benyttet her omfatter status slike fagområdeaksepterte parametere slik som vekst, proliferasjon, overlevelse, funksjon, apoptose, aldring, lokalisering, enzymatisk aktivitet, signaloverføring osv., for en celle. En kreftinhibitor kan være et antistoff som diskutert ovenfor eller et antisens molekyl. En mengde cellevekst-, proliferasjons- og metastase-analyser er kjent for fagfolk på området, som beskrevet her.

Høvomsetningsskreening for å identifisere modulatorer

Analysene for å identifisere passende modulatorer er mulig å tilpasse til høyomsetningsscreening. Foretrukne analyser påviser slik forsterkning eller inhibering av kreftgentranskripsjon, inhibering eller forsterkning av polypeptidekspresjon og inhibering eller forsterkning av polypeptidaktivitet.

Modulatorer som er evaluert i høyomsetningsscreeningsfremgangsmåter kan være proteiner, ofte naturlig forekommende proteiner eller fragmenter av naturlig forekommende proteiner. Slik blir for eksempel cellulære ekstrakter som inneholder proteiner, eller tilfeldige eller styrte fordøyelser av proteininneholdende cellulære ekstrakter benyttet. På denne måten blir biblioteker og proteiner fremstilt for screening i fremgangsmåter ifølge beskrivelsen. Spesielt foretrukket i denne utførelsesformen er biblioteker av bakterielle proteiner, sopproteiner, virusproteiner og pattedyrproteiner, der den siste er foretrukket, og der humane proteiner er spesielt foretrukket. Spesielt nyttige testforbindelser vil bli rettet mot klassen av proteiner til hvilken målet tilhører, for eksempel substrater for enzymer, eller ligander og reseptorer.

Anvendelse av mvkaqarvekst og kolonidannelse for å identifisere og karakterisere modulatorer

Normale celler krever et fast substrat for å feste seg på og vokse. Når celler blir transformert mister de denne fenotypen og vokser atskilt fra substratet. For eksempel kan transformerte celler vokse i rørte suspensjonskulturer eller suspendert i halvfaste medier, slik som halvfast eller myk agar. Når de er transfekterte med tumorsupressorgener kan de transformerte cellene regenerere normal fenotype og igjen kreve et fast substrat og sitte fast på og vokse. Mykagarvekst eller kolonidannelse i analyser er nyttige for å identifisere modulatorer av kreftsekvenser, som når de blir uttrykt i vertsceller oppviser unormal cellulær proliferasjon og transformasjon. En modulator reduserer eller eliminerer vertscellenes evne til å vokse suspendert i fast eller halvfast medium, slik som agar.

Teknikker for mykagarvekst eller kolonidannelse i suspensjonsanalyser er beskrevet i Freshney, Culture of Animal Cells a Manual of Basic Technique (3. utg., 1994). Se også fremgångsmåteavsnittet i Garkavtsev et al. (1996), ovenfor.

Evaluering av kontaktinhibering og veksttetthetsbegrensning for å identifisere og karakterisere modulatorer

Normale celler vokser typisk i et flatt og organisert mønster i cellekultur inntil de kommer i kontakt med andre celler. Når cellene kommer i kontakt med hverandre, blir de kontaktinhibert og stopper å vokse. Transformerte celler blir likevel ikke kontaktinhibert og fortsetter å vokse til høye tettheter i uorganiserte fokuspunkter. Slik vokser transformerte celler til en høyere metningstetthet enn tilsvarende normale celler. Dette blir påvist morfologisk ved dannelsen av uordnede monolag av celler eller celler i fokuspunkter. Alternativt blir merkingsindeks med (<3>H)-tymidin ved metningstetthet benyttet for å måle tetthetsbegrensning av vekst, og tilsvarende vil en MTT- eller almar-blue-analyse avsløre proliferasjonskapasitet for celler og evnen for modulatorer til å utøve det samme. Se Freshney (1994), ovenfor. Transformerte celler kan, når de er transfekterte med tumorsupressorgener regenerere en normal fenotype og bli kontaktinhibert og vil vokse til en lavere tetthet.

I denne analysen er merkingsindeksen med (<3>H)-tymidin med metningstetthet en foretrukket fremgangsmåte for å måle tetthetsbegrensning ved vekst. Transformerte vertsceller blir transfektert med en kreftassosiert sekvens og blir dyrket i 24 timer ved metningstett ved ikke-begrensende mediumsbetingelser. Prosentandelen av celler som er merket med (<3>H)-tymidin ble bestemt ved inkorporert cpm.

Kontaktuavhengig vekst blir benyttet til å identifisere modulatorer av kreftsekvenser, som kan føre til unormal celleproliferasjon og -transformasjon. En modulator reduserer eller eliminerer kontaktuavhengig vekst og returnerer cellene til en normal fenotype.

Evaluering av vekstfaktor- eller serumavhenqiqhet for å identifisere og karakterisere modulatorer

Transformerte celler har lavere serumavhengighet enn deres normale motparter (se f. eks. Temin, J. Nati. Cancer Inst., 37:167-175 (1966), Eagle et al., J. Exp. Med., 131:836-879 (1979)), Freshney, ovenfor. Dette skyldes delvis frigjøring av ulike vekstfaktorer fra de transformerte cellene. Graden av vekstfaktor- eller serumavhengighet for transformerte vertsceller kan bli sammenlignet med de for kontroller. For eksempel blir vekstfaktor-avhengighet eller serumavhengighet for en celle overvåket i fremgangsmåter for å identifisere og karakterisere forbindelser som modulerer kreftassosierte sekvenser ifølge beskrivelsen.

Anvendelse av tumorspesifikke markørnivåer for å identifisere og karakterisere modulatorer

Tumorceller frigjør en økt mengde av visse faktorer (heretter kalt "tumorspesifikke markører") enn deres normale motparter. For eksempel blir plasminogenaktivator (PA) frigjort fra humant gliom ved et høyere nivå enn fra normale hjerneceller (se f. eks. Gullino, Angiogenesis, Tumor Vascularization, and Potential Interference with Tumor Growth, in Biological Responses in Cancer, s. 178-184 (Mihich (red.) 1985)). Tilsvarende blir tumorangiogenesefaktor (TAF) frigjort ved et høyere nivå av tumorceller enn i deres normale motparter. Se f. eks. Folkman, Angiogenesis and Cancer, Sem Cancer Biol.

(1992)), mens bFGF blir frigjort fra endoteltumorer (Ensoli, B. et al.).

Ulike teknikker som måler frigjøringen av disse faktorene er beskrevet i Freshney

(1994), ovenfor. Se også Unkless et al., J. Biol. Chem. 249:4295-4305 (1974), Strickland & Beers, J. Biol. Chem., 251:5694-5702 (1976), Whur et al., Br. J. Cancer, 42:305-312

(1980), Gullino, Angiogenesis, Tumor Vascularization, and Potential Interference with Tumor Growth, in Biological Responses in Cancer, s. 178-184 (Mihich (red.) 1985), Freshney, Anticancer Res., 5:111-130 (1985). For eksempel blir tumorspesifikke markørnivåer overvåket i fremgangsmåter for å identifisere og karakterisere forbindelser som modulerer kreftassosierte sekvenser ifølge beskrivelsen.

Invasivitet inn i matriqel for å identifisere og karakterisere modulatorer

Graden av invasivitet inn i matrigel eller en ekstracellulær matriksenhet kan bli benyttet som en analyse for å identifisere og karakterisere forbindelser som modulerer kreftassosierte sekvenser. Tumorceller oppviser en positiv korrelasjon mellom malignitet og invasivitet av celler inn i matrigel eller andre ekstracellulære matriksenheter. I denne analysen blir tumorigene celler typisk benyttet som vertsceller. Ekspresjon av et tumorsupressorgen i disse vertscellene vil minske invasiviteten av vertscellene. Teknikker som er beskrevet i Cancer Res., 1999, 59:6010, Freshney (1994), ovenfor, kan bli benyttet. Kort fortalt blir nivået av invasjon av vertsceller målt ved å anvende filtre belagte med matrigel eller andre ekstracellulære matriksen hete r. Inntrengning i gelen, eller gjennom til den motsatte siden av filteret, blir betegnet som invasivitet, og gradert histologisk ved antall celler og distansen som er forflyttet, eller ved å forhåndsmerke cellene med<125>I og teller radioaktiviteten på den andre siden av filteret eller bunnen av skålen. Se f. eks. Freshney (1984), ovenfor.

Evaluering av tumorvekst in vivo for å identifisere og karakterisere modulatorer

Effekter av kreftassosierte sekvenser på cellevekst blir testet i transgene eller immunundertrykte organismer. Transgene organismer blir fremstilt på en mengde fagområdeaksepterte måter. For eksempel blir knockout-transgene organismer, for eksempel pattedyr slik som mus, fremstilt der et kreftgen blir ødelagt eller der et kreftgen er innsatt. Knockout-transgene mus blir fremstilt ved innsetting av et markørgen eller annet heterologt gen inn i det endogene kreftgensetet i musegenomet via homolog rekombinasjon. Slike mus kan også bli fremstilt ved å substituere det endogene kreftgenet med en mutert versjon av kreftgenet, eller ved å mutere det endogene kreftgenet, for eksempel ved eksponering ovenfor karsinogener.

For å fremstille transgene, kimære dyr, for eksempel mus, blir en DNA-konstruksjon introdusert inn i kjernen i embryonale stamceller. Celler som inneholder den nylig fremstilte genetiske lesjonen blir injisert inn i et vertsmuseembryo, som blir reimplantert inn i en mottakerhunn. Noen av disse embryoene utvikles til kimære mus som innehar kjønnsceller der noen av disse er avledet fra den mutante cellelinje. Ved å ale opp de kimære musene er det derfor mulig å fremskaffe en ny linje med mus som inneholder den introduserte genetiske lesjonen (se f. eks. Capecchi et al., Science, 244:1288 (1989)). Kimære mus kan bli avledet i overensstemmelse med US patentskrift nr. 6 365 797, meddelt 2. april, 2002, US patentskrift nr. 6 107 540, meddelt 22. august, 2000, Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory

(1988) og Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, Robertson, red., IRL Press, Washington, D.C., (1987).

Alternativt kan ulike immun undertrykte eller immunmanglende vertsdyr bli benyttet. For eksempel kan en genetisk atymisk "nakenmus" (se f. eks. Glovanella et al., J. Nati. Cancer Inst., 52:921 (1974)), en SCID-mus, en tymektornisert mus eller en bestrålt mus (se f. eks. Bradley et al., Br. J. Cancer, 38:263 (1978), Selby et al., Br. J. Cancer, 41:52 (1980)) bli benyttet som en vert. Transplanterbare tumorceller (typisk omtrent IO<6>celler) som er injisert inn i isogene verter frembringer invaderende tumorer i en høy andel tilfeller, mens normale celler av tilsvarende opphav ikke vil gjøre dette. I verter som utvikler invaderende tumorer blir celler som uttrykker kreftassosierte sekvenser injisert subkutant eller ortotopisk. Mus blir deretter separert i grupper, inkludert kontrollgrupper og behandlede eksperimentelle grupper), for eksempel behandlet med en modulator. Etter en passende tidslengde, fortrinnsvis 4-8 uker, blir tumorvekst målt (for eksempel ved volum eller ved dets to største dimensjoner eller vekt) og sammenlignet med kontrollen. Tumorer som har statistisk signifikant reduksjon (ved å anvende for eksempel Students T-test) blir sagt å ha inhibert vekst.

In wfro- analyse for å identifisere og karakterisere modulatorer

Analyse for å identifisere forbindelser med modulerende aktivitet kan bli utført in vitro. For eksempel blir et kreftpolypeptid først kontaktet med en potensiell modulator og inkubert i en passende tid, for eksempel fra 0,5 til 48 timer. Kreftpolypeptidnivåene kan bli bestemt in vitro ved å måle nivået av protein eller mRNA. Nivået av protein ble målt ved bruk av immunanalyse slik som Western-blotting, ELISA og lignende med et antistoff som selektivt binder til kreftpolypeptidet eller et fragment derav. For måling av mRNA er amplifisering, for eksempel ved å anvende PCR, LCR eller hybridiseringsanalyser, for eksempel Northern-hybridisering, RNAse-beskyttelse, dot-blotting foretrukket. Nivået av protein eller mRNA ble påvist ved å anvende direkte eller indirekte merkede påvisningsmidler, som for eksempel fluorescensmerkede eller radioaktivt merkede nukleinsyrer, radioaktivt eller enzymatisk merkede antistoffer og lignende, som beskrevet her.

Alternativt kan et reportergensystem bli benyttet, ved å anvende en kreftproteinpromotor opererbart bundet til et reportergen slik som luciferase, grønt fluorescerende protein, CAT eller P-gal. Reporterkonstruksjonen blir typisk transfektert inn i en celle. Etter behandling med en potensiell modulator blir mengden av reportergentranskripsjon, -translasjon eller aktiviteten målt i overensstemmelse med standard teknikker som er kjent for fagfolk på området (Davis GF, ovenfor, Gonzalez, J. & Negulescu, P. curr. Opin. Biotechnol., 1998, 9:624).

Som beskrevet ovenfor blir in wtro-screeninger utført på individuelle gener og genprodukter. Det betyr at når man har identifisert et spesielt ulikt uttrykt gen som viktig i en spesiell tilstand, blir screening av modulatorer av ekspresjonen av genet eller genproduktet selv utført.

Screening av modulatorer for ekspresjon av spesifikke gener kan bli utført. Typisk blir ekspresjonen av kun et eller noen få gener evaluert. Screeningen kan være designet for først å finne forbindelser som binder til ulikt uttrykte proteiner. Disse forbindelsene blir deretter evaluert for evnen til å modulere ulikt uttrykt aktivitet. Når innledende kandidatforbindelser er identifisert, kan videre varianter bli screenet for bedre å evaluere strukturaktivitetsforhold.

Bindinqsanalyse for å identifisere og karakterisere modulatorer

I bindingsanalyser blir et renset eller isolert genprodukt ifølge oppfinnelsen generelt benyttet. For eksempel blir antistoffer generert mot et protein ifølge beskrivelsen og immunanalysen blir kjørt for å bestemme mengden og/eller lokaliseringen av protein. Alternativt blir celler som omfatter kreftproteinene benyttet i analysene.

Slik omfatter fremgangsmåtene å kombinere et kreftprotein ifølge beskrivelsen og en kandidatforbindelse slik som en ligand, og bestemme bindingen av forbindelsen til kreftproteinet ifølge beskrivelsen. Foretrukne eksempler benytter det humane kreftproteinet og dyremodeller av human sykdom kan også bli utviklet og benyttet. I tillegg kan også andre analoge pattedyrproteiner bli benyttet slik det er åpenbart for fagfolk på området. I noen eksempler blir videre varianter eller deriverte kreftproteiner benyttet.

Vanligvis er kreftproteiner ifølge beskrivelsen, eller liganden, ikke-diffuserbart bundet til en uløselig bærer. Bæreren kan for eksempel være en som har isolerte prøvemottakerområder (en mikrotiterplate, en samling osv.). Den uløselige bæreren kan bli fremstilt av enhver sammensetning som preparatene kan bli bundet til, er enkelt separert fra løselig materiale og er på annen måte kompatibel med den totale fremgangsmåten for screening. Overflaten på slike bærere kan være fast eller porøs og av enhver hensiktsmessig utforming.

Eksempler på passende uløselige bærere inkluderer mikrotiterplater, samlinger, membraner og kuler. Disse er typisk fremstilt av glass, plastikk (for eksempel polystyren), polysakkarid, nylon, nitrocellulose eller Teflon osv. Mikrotiterplater og samlinger er spesielt hensiktsmessige fordi et stort antall analyser kan bli utført samtidig ved å anvende små mengder av reagenser og prøver. Den spesielle måten for binding av preparatet til bæreren er ikke avgjørende så lengde den er kompatibel med reagensene og de totale fremgangsmåtene ifølge beskrivelsen, opprettholde aktiviteten til preparatet og er ikke-diffuserbar. Foretrukne fremgangsmåter for binding inkluderer anvendelsen av antistoffer som ikke sterisk blokkerer verken ligandbindingssete eller aktiveringssekvensen når proteinet bindes til bæreren, direkte binding til "klistrende" eller ioniske bærere, kjemisk kryssbinding, syntesen av proteinet eller middelet på overflaten osv. Etter binding av proteinet eller ligand/bindingsmiddel til bærere blir overskudd av ubundet materiale fjernet ved hjelp av vasking. Prøvemottakingsområdene kan deretter bli blokkert ved inkubering med bovint serumalbumin (BSA), kasein eller annet uskadelig protein eller annen enhet.

Med en gang et kreftprotein ifølge beskrivelsen er bundet til bæreren, blir en testforbindelse tilsatt til analysen. Alternativt blir kandidatbindingsmiddelet bundet til bæreren og kreftproteinet ifølge beskrivelsen blir deretter tilsatt. Bindingsmidler inkluderer spesifikke antistoffer, ikke-naturlige bindingsmidler som er identifisert i screeninger av kjemiske biblioteker, peptidanaloger osv.

Av spesiell interesse er analyser for å identifisere midler som har en lav toksisitet for humane celler. Et bredt utvalg av analyser kan bli benyttet til dette formålet, inkludert proliferasjonsanalyser, cAMP-analyser, merkede in wtro-protein-protein-bindingsanalyser, elektroforetiske mobilitetsskift analyse, immunanalyse for proteinbinding, funksjonelle analyser (fosforyleringsanalyser osv.) og lignende.

En bestemmelse av binding av testforbindelsen (ligand, bindingsmiddel, modulator osv.) til et kreftprotein ifølge beskrivelsen kan bli utført på et antall forskjellige måter. Testforbindelsen kan være merket, og binding kan bli bestemt direkte, for eksempel ved å binde hele eller en del av kreftproteinet ifølge beskrivelsen til en fast bærer, tilsette en merket kandidatforbindelse (for eksempel et fluorescerende merke), vaske vekk overskudd av reagens og bestemme hvorvidt merket foreligger på den faste bæreren. Ulike blokkeringstrinn og vasketrinn kan bli benyttet der det er hensiktsmessig.

Kun én av komponentene kan være merket, f. eks. et protein ifølge beskrivelsen eller ligander. Alternativt er mer enn en komponent merket med ulike merker, f. eks.11<125>, for proteinet og en fluorofor for forbindelsen. Proksimitetsreagenser, f. eks. slukke- eller energioverførings-reagenser er også nyttige.

Kompetitiv binding for å identifisere og karakterisere modulatorer

Bindingen av "testforbindelsen" kan bli bestemt ved hjelp av kompetitiv bindingsanalyse med en "kompetitor". Kompetitoren er en bindingsenhet som binder til mål-molekylet (for eksempel et kreftprotein ifølge beskrivelsen). Kompetitorer inkluderer forbindelser slik som antistoffer, peptider, bindingspartnere, ligander osv. I visse tilfeller fortrenger den kompetitive bindingen mellom testforbindelsen og kompetitoren testforbindelsen. Testforbindelsen kan være merket. Enten blir testforbindelsen, kompetitoren eller begge tilsatt til proteinet i en tid som er tilstrekkelig for å tillate binding. Inkubering ble utført ved en temperatur som fremmer optimal aktivitet, typisk mellom 4 og 40°C. Inkuberingsperioder er typisk optimalisert, for eksempel for å fremme rask høyomsetningsscreening, typisk mellom 0 og 1 time vil være tilstrekkelig. Overskudd av reagens blir generelt fjernet eller vasket bort. Den andre komponenten blir deretter tilsatt og tilstedeværelsen eller fraværet av den merkede komponenten blir fulgt for å indikere binding.

Kompetitoren kan bli tilsatt først, etterfulgt av testforbindelsen. Fortrengningen av kompetitoren er en indikasjon på at testforbindelsen binder til kreftproteinet og slik er i stand til å binde til og eventuelt modulere aktiviteten til kreftproteinet. Enhver av komponentene kan være merket. Hvis for eksempel kompetitoren er merket, indikerer slik tilstedeværelsen av merket i forbindelsesvaskeløsningen etter test fortrengning av testforbindelsen. Hvis testforbindelsen er merket, indikerer alternativt tilstedeværelsen av merke på bæreren fortrengning.

Alternativt kan testforbindelsen bli tilsatt først, med inkubering og vasking, etterfulgt av kompetitor. Fraværet av binding ved kompetitoren indikerer at testforbindelsen binder til kreftproteinet med høyere affinitet enn kompetitoren. Hvis testforbindelsen er merket, indikerer slik tilstedeværelsen av merke på bæreren, koblet med en mangel på kompetitorbinding, at testforbindelsen binder til og slik potensielt modulerer kreftproteinet ifølge oppfinnelsen.

De kompetitive bindingsfremgangsmåtene omfatter følgelig differensiell screening for å identifisere midler som er i stand til å modulere aktiviteten til kreftproteinene ifølge beskrivelsen. Fremgangsmåtene kan omfatte å kombinere et kreftprotein og en kompetitor i en første prøve. En andre prøve omfatter en testforbindelse, kreftproteinet, og en kompetitor. Bindingen av kompetitoren blir bestemt for begge prøver, og en endring eller forskjell i binding mellom de to prøvene indikerer tilstedeværelsen av et middel som er i stand til å binde til kreftproteinet og potensielt modulere dens aktivitet. Det betyr at hvis bindingen av kompetitoren er forskjellig i den andre prøven relativt i forhold til den første prøven, så er middelet i stand til å binde til kreftproteinet.

Alternativt blir differensiell screening benyttet for å identifisere legemiddelkandidater som binder til det native kreftproteinet, men som ikke kan binde til modifiserte kreftproteiner. For eksempel blir strukturen til kreftproteinet modulert og benyttet i rasjonell legemiddeldesign for å syntetisere midler som interagerer med dette setet, midler som generelt ikke binder til setemodifiserte proteiner. Videre blir slike legemiddelkandidater som påvirker aktiviteten til et nativt kreftprotein også identifisert ved å screene legemidler for evnen til enten å forsterke eller redusere aktiviteten av slike proteiner.

Positive kontroller og negative kontroller kan bli benyttet i analysen. Kontroll og testprøve blir fortrinnsvis utført i minst triplikat for å oppnå statistisk signifikante resultater. Inkubering av alle prøver foregår i et tidsrom som er tilstrekkelig til å tillate bindingen av middelet til proteinet. Etter inkubering blir prøver vasket frie for ikke-spesifikk bundet materiale og mengden av bundet, generelt merket middel ble bestemt. Der et radiomerke blir benyttet, kan for eksempel prøvene bli telt i en scintillasjonsteller for å bestemme mengden av bundet forbindelse.

En mengde andre reagenser kan bli inkludert i screeningsanalyse. Disse inkluderer reagenser slik som salter, nøytrale proteiner, for eksempel albumin, detergenter osv., som blir benyttet for å fremme optimal protein-protein-binding og/eller redusere ikke-spesifikke interaksjoner eller bakgrunnsinteraksjoner. Reagenser som på en måte forbedrer effektiviteten til analysen, slik som proteaseinhibitorer, nukleaseinhibitorer, anti-mikrobemidler osv. kan også bli benyttet. Blandingen av komponenter blir tilsatt i en rekkefølge som tilveiebringer den nødvendige bindingen.

Anvendelse av polynukleotider for å nedregulere eller inhibere et protein ifølge beskrivelsen

Polynukleotidmodulatorer av kreft kan bli introdusert inn i en celle som inneholder målnukleotidsekvensen ved dannelse av et konjugat med et ligandbindingsmolekyl, slik som beskrevet i WO 91/04753. Passende ligandbindingsmolekyler inluderer celleoverflatereseptorer, vekstfaktorer, andre cytokiner eller andre ligander som binder til celleoverflatereseptorer. Fortrinnsvis interfererer ikke konjugering av ligandbindingsmolekylet vesentlig med evnen til det ligandbindende molekylet til å binde til sitt tilsvarende molekyl eller reseptor, eller blokkere innførselen av sens- eller antisens oligonukleotidet eller dens konjugerte versjon inn i cellen. Alternativt kan en polynukleotidmodulator av kreft bli introdusert inn i en celle som inneholder målnukleinsyresekvenser, for eksempel ved dannelse av et polynukleotid-lipidkompleks, som beskrevet i WO 90/10448. Det er på det rene at anvendelsen av antisens molekyler eller knockout- og knockin-modeller også kan bli benyttet i screeningsanalyser som diskutert over, i tillegg til fremgangsmåter for behandling.

Inhibitoriske nukleotider og antisensnukleotider

Aktiviteten til et kreftassosiert protein kan være nedregulert, eller fullstendig inhibering, ved anvendelse av antisenspolynukleotid eller inhibitorisk lite nuklært RNA (snRNA), dvs. en nukleinsyre som et komplementære med, og som fortrinnsvis kan hybridisere spesifikt med, en kodende mRNA-nukleinsyresekvens, for eksempel et kreftprotein ifølge beskrivelsen, mRNA eller en undersekvens derav. Binding av antisens polynukleotider til mRNA reduserer translasjonen og/eller stabiliteten for mRNA.

I konteksten av denne beskrivelsen kan antisens polynukleotider omfatte naturlig forekommende nukleotider eller syntetiske enheter som er dannet fra naturlig forekommende subenheter eller deres nære homologer. Antisenspolynukleotider kan også ha endrede sukkerenheter eller inter-sukkerbindinger. Eksempler på disse er fosforotioiat-inneholdende og andre svovelinneholdende enheter som er kjent for anvendelse på fagområdet. Analoger er omfattet av denne beskrivelsen så lenge de virker effektivt i å hybridisere med nukleotidene ifølge beskrivelsen. Se f. eks. Isis Pharmaceuticals, Carslbad, CA, Sequitor, Inc., Naatiack, MA.

Slike antisens polynukleotider kan enkelt bli syntetisert med rekombinante metoder, eller de kan bli syntetisert in vitro. Utstyr for slik syntese blir solgt av flere produsenter, inkludert Applied Biosystems. Fremstillingen av andre oligonukleotider slik som fosforotioater og alkylerte derivater er også velkjente for fagfolk på området.

Antisensmolekyler som det blir benyttet her inkluderer antisens- eller sensoligonukleotider. Sensoligonukleotider kan for eksempel bli benyttet for å blokkere transkripsjon med binding til antisenstråden. Antisens- og sensoligonukleotidet omfatter en enkelttrådet nukleinsyresekvens (enten RNA eller DNA) som er i stand til å binde til mål-mRNA (sens) eller DNA (antisens)-sekvenser for kreftmolekyler. Antisens- eller sensoligonukleotider, i overensstemmelse med beskrivelsen, omfatter et fragment som generelt er på omtrent 12 nukleotider, fortrinnsvis fra omtrent 12 til 30 nukleotider. Evnen til å avledet et antisens- eller et sensoligonukleotid, basert på en cDNA-sekvens som koder for et gitt protein er beskrevet i for eksempel Stein & Cohen (Cancer Res., 48:2659 (1988 og van der Krol et. al. (BioTechniques, 6:958 (1988)).

Ribozymer

I tillegg til antisens polynukleotider kan ribozymer bli benyttet for å målsøke og inhibere transkripsjon av kreftassosierte nukleotidsekvenser. Et ribozym er et RNA-molekyl som katalytisk kløyver andre RNA-molekyler. Ulike typer ribozymer har blitt beskrevet, inkludert gruppe-I-ribozymer, hammerhode ribozymer, hårnåls ribozymer, RNase-P og øksehode ribozymer (se f. eks. Castanotto et al., Adv. in Pharmacology, 25:289-317 (1994) for en generell gjennomgang av egenskaper for ulike ribozymer).

De generelle egenskapene til hårnåls ribozymer er for eksempel beskrevet i Hampel et al., Nucl. Acids Res., 18:299-304 (1990), Europeisk patentsøknad nr. 0360257, US patentskrift nr. 5 254 678. Fremgangsmåter for fremstilling er velkjente for fagfolk på området (se f. eks. WO 94/26877, Ojwang et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 90:6340-6344

(1993) , Yamada et al., Human Gene Therapy, 1:39-45 (2994), Leavitt et al., Proe. Nati. Acad. Sei., USA 92:699-703 (1995), Leavitt et al., Human Gene Therapy, 5:1151-120

(1994) og Yamada et al., Virology, 205: 121-126 (1994)).

Anvendelse av modulatorer i fenotype screening

En testforbindeise kan bli administrert til en populasjon av kreftceller som har en assosiert kreftuttrykingsprofil. Med "administrering" eller "kontakting" er det her ment at modulatoren blir tilsatt til cellene på en slik måte at modulatoren tillates å virke på cellen, hvorvidt dette er ved opptak og intracellulær virkning, eller ved virkning på celleoverflaten. En nukleinsyre som koder for et proteinmiddel (dvs. et peptid) kan bli satt inn i en viruskonstruksjon slik som en adenoviruskonstruksjon eller retroviruskonstruksjon, og tilsatt til cellen, slik at ekspresjon av peptidmiddelet blir utført, f. eks. PCT US 97/01019. Regulerbare genterapisystemer kan også bli benyttet. Når modulatoren har blitt administrert til cellene, blir cellene vasket hvis dette er ønskelig og blir tillatt å inkubere under fortrinnsvis fysiologiske betingelser i en tidsperiode. Cellene blir deretter høstet og en ny genekspresjonsprofil blir generert. Slik blir for eksempel kreftvev screenet for midler som modulerer, for eksempel induserer eller undertrykker, kreftfenotypen. En endring i minst et gen, fortrinnsvis mange, for ekspresjonsprofilen indikerer at middelet har en effekt på kreftakvititet. Tilsvarende er en endring av en biologisk funksjon eller en signaliseringsvei indikativ på modulatoraktivitet. Ved å definere en slik signatur for kreftfenotypen blir screeninger for nye legemidler som endrer fenotypen utledet. Med denne tilnærmingen trenger ikke legemiddelmålet å være kjent og trenger ikke å være representert på den opprinnelige gen/proteinekspresjons screeningsplattformen, og heller ikke trenger nivået for transkript av målproteinet å endres. Den modulatorinhiberende funksjonen vil virke som en surrogat markør.

Som beskrevet nedenfor blir screening utført for å undersøke gener eller genprodukter. Det betyr at når man har identifisert et spesielt differensielt uttrykt gen som viktig i en spesiell tilstand, blir screening av modulatorer av enten ekspresjonen av genet eller genproduktet selv utført.

Anvendelse av modulatorer for å påvirke peptider ifølge beskrivelsen

Målinger av kreftpolypeptid aktivitet, eller av kreftfenotypen blir utført ved å anvende en mengde ulike analyser. For eksempel blir effektene av modulatorer på virkningen av kreftpolypeptider målt ved å undersøke parametere som er beskrevet ovenfor. En fysiologisk endring som påvirker aktivitet blir benyttet for å undersøke påvirkningen av en testforbindelse på polypeptidene ifølge denne beskrivelsen. Når de funksjonelle utkommene blir bestemt ved å anvende intakte celler eller dyr, kan en mengde effekter blir undersøkt slik som, i tilfelle med en kreft assosiert med faste tumorer, tumorvekst, tumormetastase, neovaskularisering, hormonfrigjøring, transkripsjonene endringer på både kjente og ikke-karakteriserte genetiske markører (for eksempel ved Northern blott), endringer i cellemetabolisme slik som cellevekst eller pH-endringer og endringer i intracellulære second-messengers slik som cGNIP.

Fremgangsmåter for å identifisere karakteriserende kreftassosierte sekvenser

Ekspresjon av ulike gensekvenser er korrelert med kreft. I overensstemmelse med dette blir forstyrrelser som er basert på mutant- eller variantkreftgener bestemt. Beskrivelsen tilveiebringer en fremgangsmåte for å identifisere celler som inneholder variantkreftgener, f. eks. ved å bestemme tilstedeværelsen av hele eller en del av sekvensen for minst et endogent kreftgen i en celle. Dette blir utført ved å anvende enhver av et antall sekvenseringsteknikker. Beskrivelsen omfatter fremgangsmåter for å identifisere kreftgenotypen for et individ, f. eks. ved å bestemme hele eller en del av sekvensen for minst et gen ifølge beskrivelsen hos individet. Dette blir generelt utført på minst et vev fra individet, f. eks. et vev som er fremlagt ifølge Tabell I, og kan inkludere evalueringen av et antall vev eller ulike prøver fra det samme vevet. Fremgangsmåten kan inkludere å sammenligne sekvensen for det sekvenserte genet med et kjent kreftgen, dvs. et villtype gen for å bestemme tilstedeværelsen av familiemedlemmer, homologier, mutasjoner eller varianter. Sekvensen for hele eller en del av genet kan deretter bli sammenlignet med sekvensen for et kjent kreftgen for å bestemme hvorvidt noen forskjeller foreligger. Dette blir utført ved å anvende ethvert av et antall kjente homologiprogrammer, slik som BLAST, Bestfit, osv. Tilstedeværelsen av en forskjell i sekvensen mellom kreftgenet fra pasienten og det kjente kreftgenet korrelerer med en sykdomstilstand eller en tilbøyelighet for en sykdomstilstand, som fremlagt her.

Kreftgenet kan bli benyttet som prober for å bestemme antall kopier av kreftgenet i genomet. Kreftgener blir benyttet som prober for å bestemme den kromosomale lokaliseringen av kreftgenet. Informasjon slik som kromosomal lokalisering kan benyttes i å tilveiebringe en diagnostisering eller prognose spesielt når kromosomale unormalheter slik som translokeringer og lignende blir identifisert i kreftgen lokuset.

XIV.) RNAi og terapeutisk anvendelse av små interfererende RNA (siRNA)

Foreliggende beskrivelsen er også rettet mot siRNA-oligonukleotider, spesielt dobbelttrådet RNA som omfatter minst et fragment av den STEAP-1-kodende regionen eller 5"-UTR-regionene, eller komplement eller ethvert antisens oligonukleotid som er spesifikt for STEAP-1-sekvensen. Slike oligonukleotider kan bli benyttet for å utlede en funksjon for STEAP-1, eller blir benyttet for å screene etter eller evaluere modulatorer for STEAP-1-funksjon eller -ekspresjon. Genekspresjon av STEAP-1 kan bli redusert ved å anvende siRNA-transfeksjon og fører til signifikant minsket proliferativ kapasitet for transformerte kreftceller som endogent uttrykker antigenet, celler behandlet med spesifikke STEAP-1-siRNA viser redusert overlevelse slik dette blir målt med for eksempel en metabolsk avlesning av cellelevedyktighet korrelert med den reduserte proliferative kapasiteten. Slik omfatter STEAP-l-siRNA-preparater siRNA (dobbelttrådet RNA) som tilsvarer nukleinsyre-ORF-sekvensen for STEAP-l-proteinet eller undersekvenser derav, der disse undersekvensene generelt er på 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 eller flere enn 35 kontinuerlige RNA-nukleotider i lengde og inneholder sekvenser som er komplementære og ikke-komplementære med minst én del av den mRNA-kodende sekvensen. Undersekvensene kan være 19-25 nukleotider lange, mest foretrukket 21-23 nukleotider lange.

RNA-interferens er en ny tilnærming for å slå av genet in vitro og in vivo, og slik er små dobbelttrådede RNA (siRNA) verdifulle terapeutiske midler. Styrken til siRNA i å slå av spesifikke genaktiviteter har nå blitt brakt til dyremodeller for sykdom og blir benyttet på mennesker også. For eksempel har hydrodynamisk infusjon av en løsning med siRNA inn i en mus med et siRNA mot et spesielt mål blitt bevist å være terapeutisk effektiv.

Det banebrytende arbeidet til Song et al., indikerer at en type av fullstendig naturlig nukleinsyre, små interfererende RNA (siRNA) virket som terapeutiske midler til og med uten ytterligere kjemisk modifisering (Song, E. et al. "RNA interference targeting Fas protects mice from fulminant hepatitis", Nat. Med., 9(3): 347-51(2003)). Dette arbeidet tilveiebrakte det første in wVo-beviset på at infusjon av siRNA inn i et dyr kunne lindre sykdom. I dette tilfellet ga forfatterne mus injeksjoner av siRNA som er designet for å slå av FAS-proteinet (en celledød reseptor som induserer hepatocytter og andre celler slik at de dør når den er overaktivert i løpet av inflammatorisk respons). Den påfølgende dagen ble dyrene gitt et antistoffspesifikt sett for FAS. Kontrollmus døde av akutt leversvikt i løpet av noen få dager, mens over 80 % av de siRNA-behandlede musene forble frie fra alvorlig sykdom og overlevde. Omtrent 80 % til 90 % av deres leverceller inkorporerte de nakne siRNA-oligonukleotidene. Videre virket RNA-molekylene i 10 dager før de mistet effekt etter 3 uker.

For anvendelse i humanterapi blir siRNA levert ved hjelp av effektive systemer som induserer langtvirkende RNAi-aktivitet. En hovedhindring for klinisk anvendelse er å levere siRNA til de passende cellene. Hepatocytter ser ut til å være spesielt mottagelige for endogent RNA. Per i dag er mål som er lokalisert i leveren attraktive fordi leveren er et organ som enkelt kan bli målsøkt av nukleinsyremolekyler og virusvektorer. Likevel er andre vev og organer målsøkt i tillegg.

Formuleringer av siRNA med forbindelser som fremmer transitt gjennom cellemembraner blir benyttet for å forbedre administrering av siRNA ved terapi. Kjemisk modifisert syntetisk siRNA som er resistent ovenfor nukleaser og har serumstabilitet har samtidig forbedret varighet for RNAi-effekter, er også tilveiebragt.

Slik er siRNA-teknologi et terapeutisk middel for human malignitet ved å levere siRNA-molekyler som er rettet mot STEAP-1 til individer med kreftformene slik som de som er fremlagt i Tabell 1. Slik administrering av siRNA fører til redusert vekst for kreftceller som uttrykker STEAP-1 og tilveiebringer en andre tumorterapi som minsker sykeligheten og/eller dødeligheten som er assosiert med malignitet.

Effektiviteten for denne modaliteten med genprodukt knockdown er signifikant når den blir målt in vitro eller in vivo. Effektivitet in vitro er enkelt å vise via benyttelse av siRNA på celler i kultur (som beskrevet ovenfor) eller på volumer av kreftpasientsbiopsier når in wtro-fremgangsmåter blir benyttet for å påvise den reduserte ekspresjonen av STEAP-l-protein.

XV.) Sett/fremstilte artikler

For anvendelse i laboratoriet er prognostiske, profylaktiske, diagnostiske og terapeutiske applikasjoner som er beskrevet her, sett som er innenfor omfanget av beskrivelsen. Slike sett kan omfatte bærer, pakke eller beholder som er delt i avdelinger for å motta én eller flere beholdere slik som rør og lignende, der hver av beholderne inneholder et av de separate elementene som skal bli benyttet i fremgangsmåten sammen med et merke eller innstikk som omfatter instruksjoner for anvendelse, slik som en anvendelse som er beskrevet her. For eksempel kan beholderne omfatte en probe som er eller som kan bli påvisbart merket. En slik probe kan være et antistoff eller et polynukleotid som er spesifikt for et protein eller et gen eller en beskjed ifølge beskrivelsen. Der fremgangsmåten benytter nukleinsyrehybridisering for å påvise målnukleinsyren, kan settet også ha beholdere som inneholder nukleotider for amplifisering av målnukleinsyresekvenser. Sett kan omfatte en beholder som omfatter en reporter, slik som et biotinbindingsprotein, slik som avidin eller streptavidin, bundet til et reportermolekyl, slik som et enzymatisk merke, fluorescensmerke eller radioisotop merke, og en slik reporter kan bli benyttet med for eksempel en nukleinsyre eller et antistoff. Sette kan inkludere hele eller en del av aminosyresekvensene ifølge Figur 2 eller Figur 3 eller analoger derav, eller et nukleinsyremolekyl som koder for slike aminosyresekvenser.

Settet vil typisk omfatte beholderen som er beskrevet ovenfor og én eller flere andre beholdere sammen med denne som omfatter materialer som er ønskelige fra et kommersielt standpunkt og et brukerstandpunkt, inkludert buffere, fortynningsmidler, filtre, nåler, sprøyter, bærermerke, forpakningsmerke, beholdermerker, rørmerker som beskriver innholdet og/eller instruksjoner for anvendelse og forpakningsinnstikk med instruksjon for anvendelse.

Et merke kan foreligge på eller sammen med beholderen for å indikere at preparatet blir benyttet til en spesifikk terapi eller ikke-terapeutisk applikasjon, slik som en prognostisk, profylaktisk, diagnostisk eller laboratorieapplikasjon, og kan også indikere retninger for enten in vivo- eller in wtro-anvendelse, slik som de som er beskrevet her. Direksjoner og/eller annen informasjon kan også bli inkludert på et innstikk eller et merke som er inkludert sammen med eller på settet. Merket kan være på eller assosiert med beholderen. Et merke kan være på en beholder når bokstaver, tall eller andre karakterer som danner merket er trykt på eller etset inn i beholderen selv, et merke kan være assosiert med en beholder når det er tilstede i en samlepakke eller bærer som også holder beholderen, for eksempel som et forpakningsinnstikk. Merke kan indikere at preparatet blir benyttet til diagnostisering, behandling, profylaktisk behandling eller prognostisering av en tilstand, slik som en neoplasi i et vev fremlagt ifølge Tabell I.

Uttrykkene "sett" og "fremstilt artikkel" kan bli benyttet som synonymer.

En fremstilt artikkel som inneholder preparater, slik som aminosyresekvens(er), små molekyl(er), nukleinsyresekvens(er) og/eller antistoffer (f. eks. materialer som er nyttige for diagnostiseringen, prognostiseringen, profylaksen og/eller behandlingen av neoplasier i vev slik som de som er fremlagt ifølge Tabell I er også tilveiebrakt. Den fremstilte artikkelen omfatter typisk en beholder og minst et merke. Passende beholder inkluderer for eksempel flasker, rør, sprøyter og testrør. Beholderne kan bli utformet fra en mengde materialer slik som glass, metall eller plastikk. Beholderen kan inneholde aminosyresekvenser, små molekyler, nukleinsyresekvenser, cellepopulasjoner og/eller antistoffer. Beholderen kan inneholde et polynukleotid til anvendelse for å undersøke mRNA-ekspresjonsprofilen for en celle, sammen med reagenser som blir benyttet for dette formålet. En beholder kan inneholde et antistoff, bindingsfragment derav eller spesifikt bindingsprotein til anvendelse for å evaluere proteinekspresjon for STEAP-1 i celler og vev, eller for relevante laboratoriehensikter, prognostiske, diagnostiske, profylaktiske og terapeutiske hensikter, indikasjoner og/eller direksjoner for slike anvendelser kan bli inkludert på eller sammen med beholderen, det også reagenser og andre preparater eller redskaper som blir benyttet til disse formålene. En beholder kan omfatte materialer for å utløse en cellulær eller en humoral immunrespons, sammen med assosierte indikasjoner og/eller direksjoner. En beholder kan omfatte materialer for adaptiv immunterapi, slik som cytotoksiske T-celler (CTL) eller hjelper-T-celler (HTL), sammen med tilhørende indikasjoner og/eller direksjoner, reagenser og andre preparater eller redskaper som blir benyttet til dette formålet, kan også bli inkludert.

Beholderen kan alternativt inneholde et preparat som er effektivt for å behandle, diagnostisere, prognostisere eller profylaksebehandle en tilstand og kan ha en steril inngangsport (for eksempel kan beholderen være en intravenøs løsningspose eller et rør som har en stopper som er mulig å gjennomtrenge ved hjelp av en hypoderm injeksjonsnål). De aktive midlene i preparatet kan være et antistoff som er i stand til å spesifikt binde STEAP-1 og modulere funksjonen til STEAP-1.

Den fremstilte artikkelen kan ytterligere omfatte en annen beholder som omfatter en farmasøytisk akseptabel buffer, slik som fosfatbufret fysiologisk saltløsning, Ringers løsning og/eller dekstrose. Den kan ytterligere inkludere andre materialer som er ønskelige fra et kommersielt ståsted eller brukerståsted, inkludert andre buffere, fortynningsmidler, filtre, rør, nåler, sprøyter og/eller forpakningsinnstikk med indikasjoner og/eller instruksjoner for anvendelse.

EKSEMPLER

Ulike aspekter av oppfinnelsen blir ytterligere beskrevet og illustrert ved hjelp av de flere eksemplene som følger.

Eksempel 1: SSH-generert isolering av cDNA-fragment for STEAP-l-genet Materialer og Fremgangsmåter

LAPC- xenografter:

LAPC-xenografter blir fremskaffet fra Dr. Charles Sawyers (UCLA) og ble generert som beskrevet (Klein et al., 1997, Nature Med., 3: 402-408, Craft et al., 1999, Cancer Res., 59: 5030-5036). Androgenavhengige og uavhengige LAPC-4-xenografter (LAPC-4-AD og - Al) og LAPC-9-xenografter (LAPC-9-AD og -Al) ble dyrket i intakte SCID-hannmus eller kastrerte hanner, og ble gitt som små vevsbiter til mottakerhanner. LAPC-4-AI-xenografter ble avlevert fra LAPC-4-AD-tumorer og LAPC-9-AI-xenografter ble avledet fra LAPC-9-AD-tumorer. For å generere Al-xenograftene ble hannmus som hadde LAPC-AD-tumorer kastrert og opprettholdt i 2-3 måneder. Etter at LAPC-tumorene vokste på nytt ble tumorene høstet og gitt til kastrerte hanner eller SCID-mus.

LAPC-4-AD-xenografter ble dyrket intratibialt som følger. LAPC-4-AD-xenograft-tumorvev dyrket subkutant ble hakket opp til 1-2 mm<3>seksjoner mens vevet ble badet i IX Iscoves-medium, opphakket vev ble deretter sentrifugert ved 1,3K rpm i 4 minutter. Supernatanten ble respsuspendert i 10 ml iskald IX Iscoves-medium og sentrifugert ved 1,3K i 4 minutter. Pelleten ble deretter resuspendert i IX Iscoves med 1 % pronase-E og inkubert i 20 minutter ved romtemperatur med forsiktig risting etterfulgt av inkubering på is på 2-4 minutter. Filtrat ble sentrifugert ved 1,3K rpm i 4 minutter og pronasen ble fjernet fra den luftede pelleten ved å resuspendere i 10 ml Iscoves og sentrifugere på nytt. Klumpene med celler ble deretter platet på PrEGM-medium og dyrket over natt. Cellene ble deretter høstet, filtrert, vasket 2X RPMI og talt. Omtrent 50 000 celler ble blandet med et likt volum iskald Matrigel på is og kirurgisk injisert inn i proksimal tibia metafyses hos SCID-mus via en 27 kaliber nål. Etter 10-12 uker ble LAPC-4-tumorer som vokste i benmarg gjenvunnet.

Cellelinjer og vev:

Humane cellelinjer (for eksempel HeLa) ble fremskaffet fra ATCC og ble opprettholdt i DMEM med 5 % føtalt kalveserum. Humane vev for RNA- og proteinanalyser ble fremskaffet fra the Human Tissue Resource Center (HTRC) på UCLA (Los Angeles, CA) og fra QualTek, Inc. (Santa Barbara, CA).

RNA- isolering:

Tumorvev og cellelinjer ble homogenisert i Trizol-reagens (Life Technologies, Gibco BRL) ved å anvende 10 ml/g vev eller 10 ml/10<8>celler for å isolere total-RNA. Poly-A-RNA ble renset fra total-RNA ved å anvende Qiagens oligotex mRNA Mini- og Midi-sett. Total og mRNA ble kvantifisert ved hjelp av spektrofotometrisk analyse (O.D. 260/280 nm) og analysert ved hjelp av gelelektroforese.

Oligonukleotider:

De følgende HPLC-rensede oligonukleotidene ble benyttet.

Suppresjonsubtraktiv hybridisering:

Suppresjonsubtraktiv hybridisering (SSH) ble benyttet for å identifisere cDNA som tilførte gener som kan være oppregulert i androgenavhengig prostatakreft sammenlignet med godartet prostata hyperplasi (BPH).

Dobbelttrådede cDNA tilsvarende til LAPC-4-AD-xenograften (tester) og BPH-vevet (driver) ble syntetisert fra 2 ng poly(A)+-RNA isolert fra xenograftvev og BPH-vev, som beskrevet ovenfor, ved å anvende Clontech's PCR-Select cDNA Subtraction Kit og 1 ng oligonukleotid RSACDN som primer. Første og andre tråds syntese ble utført som beskrevet i settets brukermanualprotokoll (Clontech Protokoll nr. PT1117-1, katalog nr. K1804-1). Det resulterende cDNA ble fordøyd med Rsa I i 3 timer ved 37°C. Fordøyd cDNA ble ekstrahert med fenol/kloroform (1:1) og etanolpresipitert.

Driver-cDNA (BPH) ble generert ved i et forhold på 4 til 1 å kombinere Rsa-I-fordøyd BHP-cDNA med fordøyd cDNA fra muselever, for å sikre at murine gener ble fratrukket tester-cDNA (LAPC-4-AD).

Tester-cDNA (LAPC-4-AD) ble generert ved å fortynne 1 ni Rsa-I-fordøyd LAPC-4-AD-cDNA (400 ng) i 5 ni vann. Det fortynnede cDNA (2 ni, 160 ng) ble deretter ligert til 2 ni adaptor-1 og adaptor-2 (10 nM), i separate ligeringsreaksjoner, i et totalt volum på 10 ni ved 16°C over natt ved å anvende 400 u med T4-DNA-ligase (Clontech). Ligering ble avsluttet med 1 ni 0,2 M EDTA og oppvarming ved 72°C i 5 min.

Den første hybridiseringen ble utført ved å tilsette 1,5 n' (600 ng) driver-cDNA til hver av to rør inneholdende 1,5 ni (20 ng) adaptor-1 og adaptor-2 ligert tester-cDNA. I et sluttvolum på 4 ni ble prøvene overlagt mineralolje, denaturert i en MJ Research-termosykler ved 98°C i 1,5 minutter, og deretter tillatt å hybridisere i 8 timer ved 68°C. De to hybridiseringene ble deretter blandet sammen med ytterligere 1 n' frisk denaturert driver-cDNA og ble tillatt å hybridisere over natt ved 68°C. Den andre hybridiseringen ble deretter fortynnet i 200 ni 20 mM Hepes, pH 8,3, 50 mM NaCI, 0,2 mM EDTA, varmet ved 70°C i 7 min. og lagret ved -20°C.

PCR- amplifiserino, kloning og sekvensering av qenfraqmenter generert fra SSH:

For å amplifisere genfragmenter fremkommet fra SSH-reaksjoner ble to PCR-amplifiseringer utført. I den primære PCR-reaksjonen ble 1 ni med den fortynnede slutthybridiseringsblandingen tilsatt til 1 ni PCR-primer-1 (10nM), 0,5 ni dNTP-blanding (10 nM), 2,5 ni 10 x reaksjonsbuffer (Clontech) og 0,5 ni 50 x Advantage-cDNA-polymerase-blanding (Clontech) i et sluttvolum på 25 ni- PCR-1 ble utført ved å anvende de følgende betingelsene: 75°C i 5 min, 94°C i 25 sek., deretter 27 sykluser med 94°C i 10 sek., 66°C i 30 sek, 72°C i 1,5 min. Fem separate primær-PCR-reaksjoner ble utført for hvert eksperiment. Produktene ble slått sammen og fortynnet 1:10 med vann. Forden sekundære PCR-reaksjonen ble 1 ni fra den sammenslåtte og fortynnede primær-PCR-reaksjonen tilsatt til den samme reaksjonsblandingen som ble benyttet for PCR-1, bortsett fra at primerne NP1 og NP2 (10 nM) ble benyttet istedenfor PCR-primer-1. PCR-2 ble utført ved å anvende 10-12 sykluser ved 94°C i 10 sek., 68°C i 30 sek, 72°C i 1,5 min. PCR-produktene ble analysert ved å anvende 2% agarosegel elektroforese.

PCR-produktene ble innsatt i pCR2.1 ved å anvende T/A-vektorkloningssettet (Invitrogen). Transformert E. coli ble utsatt for blå/hvit-seleksjon og ampicillin seleksjon. Hvite kolonier ble plukket og overført til 96-brønners plater og ble dyrket i flytende kultur over natt. For å identifisere insersjoner ble PCR-amplifisering utført på 1 ml med bakteriekultur ved å anvende betingelsene med PCR1 og NP1 og NP2 som primere. PCR-produkter ble analysert ved å anvende 2% agarosegel elektroforese.

Bakterikloner ble lagret i 20% glyserol i et 96-brønners format. Plasmid-DNA ble fremstilt, sekvensert og utsatt for nukleinsyre homologisøk i GenBank, dbEST- og NCI-CGAP-data basene.

RT- PCR- ekspresionsanalvse:

Første tråd-cDNA ble generert fra 1 n9 mRNA med oligo/dT)12-18-priming ved å anvende Superscript Preamplification System fra Gibco-BRL. Produsentens protokoll ble benyttet og inkluderte en inkubering i 50 min ved 42°C med revers transkriptase etterfulgt av RNase-H-behandling ved 37°C i 20 min. Etter at reaksjonen var ferdig, ble volumet økt til 200 ni med vann før normalisering. Første tråd-cDNA fra 16 ulike normale humane vev ble fremskaffet fra Clontech.

Normalisering av første tråd-cDNA fra flere vev ble utført ved å anvende primerne 5'atatcgccgcgctcgtcgtcgacaa3' (Sekv. id. nr. 76) og 5'agccacacgcagctcattgtagaagg3' (Sekv. id. nr. 77) for å amplifisere p-aktin. Første tråd-cDNA (5 ni) ble amplifisert i et totalt volum på 50 ni inneholdende 0,4 nM primere, 0,2 nM av hver dNTP, lXPCR-buffer (Clontech, 10 mM Tris-HCL, 1,5 mM MgCI2, 50 mM KCI, pH 8,3) g lXKIentaq-DNA-polymerase (Clontech). 5 ni av PCR-reaksjonen ble fjernet ved 18, 20 og 22 sykluser og benyttet i agarosegel elektroforese. PCR ble utført ved å anvende en MJ-Research-termosykler, ved de følgende betingelsene: initiell denaturering ar ved 94°C i 15 sek, etterfulgt av 18, 20 og 22 sykluser ved 94°C i 15 min, 65°C i 2 min, 72°C i 5 sek. En siste forlengning ved 72°C ble utført i 2 min. Etter agarosegel elektroforese ble båndintensitetene til p-aktinbåndet på 283 bp fra flere vev sammenlignet ved hjelp av visuell inspeksjon. Fortynningsfaktorer for første tråd-cDNA ble beregnet å føre til like p-aktinbånd intensiteter i alle vev etter 22 sykluser med PCR. Tre runder med normalisering var nødvendig for å oppnå like båndintensiteter i alle vev eller 22 sykluser med PCR.

For å bestemme ekspresjonsnivåer av STEP-l-genet ble 5 ni av normalisert første tråd-cDNA analysert ved hjelp av PCR ved å anvende 20, 30 og 35 sykluser ved amplifisering ved å anvende de følgende primerparene:

Se mi kvantitativ ekspresjonsanalyse ble oppnådd ved å sammenligne PCR-produktene ved et syklusantall som gir lyse båndintensiteter.

Resultater

Flere SSH-eksperimenter blir utført som beskrevet i materialer og fremgangsmåter ovenfor, og førte til isoleringen av flere kandidat genfragmentkloner. Alle kandidatkloner ble sekvensert og utsatt for homologianalyse mot alle sekvenser i de store allmene gen-databasene og EST-databasene for å tilveiebringe informasjon på identiteten til det tilsvarende genet og for å hjelpe til å rettlede avgjørelsen av å analysere et spesielt gen for ulik ekspresjon. Generelt ble genfragmenter som ikke hadde noen homologi med noen kjent sekvens i noen av de gjennomsøkte databasene, og som slik er ansett for å representere nye gener, i tillegg til genfragmenter som viser homolgi med tidligere sekvenserte uttrykte sekvensmerker (EST) utsatt for differensiell ekspresjonsanalyse ved hjelp av RT-PCR og/eller Northern-analyse.

En av cDNA-klonene, beregnet STEAP-1, var 436 bp i lengde og viste homologi med en EST-sekvens i NCI-CGAP-tumorgen databasen. Fullengde-cDNA som koder for STEAP-l-genet var deretter isolert ved å anvende dette cDNA og navngitt på nytt som STEAP-1. STEAP- 1-cDNA-nukleotidsekvensen tilsvarer nukleotidrestene 150 til 585 i STEAP-l-cDNA-sekvensen som er vist i Figur 1. En annen klon, betegnet 28P3E1, som var 561 bp i lengde, viste homologi med et antall EST-sekvenser i NCI-CGAP-tumorgendatabasen eller i andre databaser. En del av 28P3El-sekvensen (356 bp) er identisk med en EST som er avledet fra humant, fetalt vev. Etter at fullengde-STEAP-l-cDNA var fremskaffet og sekvensert, ble det åpenbart at denne klonen også tilsvarte til STEAP-1 (mer spesifikt til restene 622 via den 3' enden av STEAP-1-nukleotidsekvensen som vist ifølge Fig. 1).

Eksempel 2: Isolering av fullengde-STEAP-l-kodende cDNA

STEAP-l-genfragmentet på 436 bp (se eksempelet med tittelen "SSH-generert isolering av cDNA-fragment fra STEAP-l-genet") ble benyttet for å isolere ytterligere cDNA som koder for 8PlD4/STEAP-l-genet. Kort fortalt ble et normalt, humant prostata-cDNA-biobliotek (Clontech) screenet med en merket probe generert fra STEAP-l-cDNA på 436 bp. En av de positive klonene, klon 10, har en lengde på 1195 pb og koder for et protein på 339 aminosyrer som har nukleotid- og kodet aminosyresekvens som ikke har noen signifikant homologi med noen kjente humane gener eller proteiner (homologi til et rotte-nyreskade-protein beskrevet i internasjonal søknad WO 98/53071). Det kodede proteinet inneholder minst 6 predikerte transmembranmotiver som tyder på en celleoverflate-orientering. Disse strukturelle egenskapene førte til betegnelsen "STEAP" for "Six Transmembrane Epithelial Antigen of the Prostate".

Påfølgende identifisering av ytterligere "STEAP"-proteiner fører til ny betegnelse for STEAP-l-genproduktet som "STEAP-1". STEAP-l-cDNA og de kodede aminosyresekvensene er vist i Fig. 2A-Q. STEAP-l-cDNA, klon 10, ble deponert hos the American Type Culture Collection ("ATCC") (10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209 USA) som plasmid-STEAP-l-klon 10.1, 26.august, 1998 som ATCC-aksesjonsnummer 98849. STEAP-l-cDNA klonen kan bli skåret ut derfra ved å anvende EcoRI/Xbal-dobbeltfordøying (EcoRI på en 5' enden, Xbal på den 3' enden).

Eksempel 3: Kromosomal kartlegging av STEAP-1

Kromosomal lokalisering kan implisere gener i sykdomspatogenese. Flere kromosom kartleggingstilnærminger er tilgjengelige, inkludert fluorescerende in situ-hybridisering (FISH), human/hamster-strålingshybrid (RH)-paneler (Walter et al., 1994, Nature Genetics, 7:22, Research Gneetics, Huntsville Al), human-gnager somatisk cellehybrid paneler slik som de som er tilgjengelige fra Coriell Institute (Camden, New Jersey) og genomiske oppsett ved å anvende BLAST-homologier på sekvenserte og kartlagte genomiske kloner (NCBI, Bethesda, Maryland).

STEAP-1 kartlegges til kromosomet 7q21 ved å anvende STEAP-l-sekvens og NCBI-BLAST-verktøyet: (lokalisert på internett på

(.ncbi.nlm.nih.gov/genome/seq/page.cgi?F=HsBlast.html&.&.ORG=Hs)).

Eksempel 4: Ekspresjonsanalyse av STEAP-1

Ekspresjon av STEAP-1 i magekreft pasientprøver et vist i Figur 14(a)-(e). I Figur 14(a) ble RNA ekstrahert fra normal mage (N) og fra 10 ulike magekreft pasientprøver (T). Northern-blott med 10 ng totalt RNA/spor ble probet med STEAP-l-sekvens. Resultater viser sterk ekspresjon av et STEAP-1 på omtrent 1,6 kb i magetumorvevene. Nedre panelet representerer etidiumbromid farging av blottet som viser kvalitet for RNA-prøvene.

Figur 14(b) viser at STEAP-1 kan være uttrykt i rektum kreftpasientvev. RNA ble ekstrahert fra normalt endetarm (N), endetarmskreftpasienttumor (T), og endetarms-kreftmetastaser (M). Northern-blott med 10 ng totalt RNA ble probet med STEAP-1-sekvensen. Resultater viser sterk ekspresjon av STEAP-1 i endetarmskreft pasientvevene. De nedre paneler representerer etidiumbromidfarging av blottet og viser kvaliteten på RNA-prøvene.

Ekspresjon av STEAP-1 ved RT-PCR viste at STEAP-1 er sterkt uttrykt i humane umbillikal vene-endotelceller (HUVEC) (Figur 14(c)). Første tråd-cDNA ble fremstilt fra HUVEC-celler, LAPC-4AD- og LAPC-9AD-prostatakreft xenografter og i tillegg fra humant hjernevev. Normalisering blir utført ved hjelp av PCR ved å anvende primere mot aktin og GAPDH. Semi-kvantitativ PCR, ved å anvende primere for STEAP-1 ble utført ved 27 og 39 sykluser med amplifisering. Som en kontroll er PCR som benytter primere for aktin vist. Resultater viser sterk ekspresjon av STEAP-1 i HUVEC-celler tilsvarende til ekspresjonen som er påvist i prostatakreft xenograftvev. Ekspresjon av STEAP-1 i HUVEC-celler tyder på at målsøking av STEAP-1 også kan målsøke endotelceller i neovaskulaturet til tumorene. I Figur 14(d) er bildet av RT-PCR-agarosegelen vist. I Figur 14(e) ble PCR-produkter kvantifisert ved å anvende Alphalmager-programvaren. Resultater viser sterk ekspresjon av STEAP-1 i normal prostata blant alle de normale vevene som blir testet. Oppregulering av STEAP-1-ekspresjon ble påvist i prostatakreftsamling, blærekreftsamling, nyrekreftsamling, tykktarmskreftsamling, lungekreftsamling, ovariekreftsamling og brystkreftsamling. Sterk ekspresjon av STEAP-1 ble påvist i kreftmetastasesamling, prostatakreft xenograftsamling og prostata metastase i lymfeknute.

STEAP-l-ekspresjon i lymfom pasientprøver (Figur 14(f)). Første tråd-cDNA blir fremstilt fra et panel av lymfom pasientprøver. Normalisering blir utført ved hjelp av PCR ved å anvende primere for aktin. Semi-kvantitativ PCR ved å anvende primere for STEAP-1 ble utført ved 26 og 30 sykluser med amplifisering. Prøver ble kjørt på en agarosegel og PCR-produkter ble kvantifisert ved å anvende Alphalmager-programvaren. Ekspresjon ble registrert som sterk eller medium, hvis signal henholdsvis er påvist som 26 eller 30 sykluser med amplifisering, og fraværende hvis ikke noe signal er påvist til og med ved 30 sykluser med amplifisering. Resultater viser ekspresjon av STEAP-1 i 8 av 11 (72,7%) av tumorprøvene som ble testet.

Eksempel 5: Spleisevarianter av STEAP-1

Transkriptvariaqnter er varianter av modent mRNA fra det samme genet som fremkommer ved alternativ transkripsjon eller alternativ spleising. Alternative transkripter er transkripter fra det samme genet, men som starter transkripsjon ved ulike punkter. Spleisevarianter er mRNA-varianter som er spleiset ulikt fra det samme transkriptet. I eukaryoter, når et multi-exon gen blir transkribert fra genomisk DNA, blir det opprinnelige RNA spleiset for å frembringe funksjonelt mRNA, som kun har exon og blir benyttet til translasjon til en aminosyresekvens. I overensstemmelse med dette kan et gitt gen ha null til mange alternative transkripter, og hvert transkript kan ha null til mange spleisevarianter. Hver transkriptvariant har en unik sammensetning av exon, og kan ha ulike kodende og/eller ikke-kodende (5' eller 3' ende) deler, fra det opprinnelige transkriptet. Transkriptvarianter kan kode for lignende eller ulike proteiner med den samme eller en lignende funksjon eller kan kode for proteiner med ulike funksjoner, og kan bli uttrykt i det samme vevet samtidig, eller i ulike vev samtidig, eller i det samme vevet ved ulike tidspunkter, eller i ulike vev ved ulike tidspunkter. Proteiner som er kodet for at transkriptvarianter kan ha lignende eller ulike cellulære eller ekstracellulære lokaliseringer, for eksempel utskilt i forhold til intracellulært.

Transkriptvarianter blir identifisert ved hjelp av en mengde fremgangsmåter som er akseptert på fagområdet. For eksempel blir alternative transkripter og spleisevarianter identifisert ved hjelp av fullengde kloningseksperimenter, eller ved anvendelse av fullengde transkripter og EST-sekvenser. Først ble alle humane ESTer gruppert i samlinger som viser direkte eller indirekte identitet med hverandre. For det andre ble ESTet i den samme samlingen ytterligere gruppert i undersamlinger og sammensatt til konsensussekvenser. Den opprinnelige gensekvensen blir sammenlignet med konsensussekvensen/sekvensene eller andre fullengde sekvenser. Hver konsensussekvens er en potensiell spleisevariant for dette genet (se f. eks. Kan, Z. et al., Gene structure Prediction and alternative splicing analysis using genomically aligned ESTs, Genome Research, 2001, mai, ll(5):889-900). Til og med når en variant er identifisert, som ikke er en fullengde klon, så er denne delen av varianten svært nyttig for antigengenerering og for ytterligere kloning av fullengde spleisevarianten, ved å anvende teknikker som er kjent på fagområdet.

Videre er dataprogrammer tilgjengelige på fagområdet som identifiserer transkriptvarianter basert på genomiske sekvenser. Genomisk baserte transkriptvariant identifiseringsprogrammer inkluderer FgenesH (A. Salamov og V. Solovyev, "Ab intiio gene finding in Drosophila genomic DNA", Gemone Research, 2000, april: 10(4):516-22), Grail (URL compbio.oml.gov/Grail-bin/EmptyGrailForm) og GenScan (URL genes.mit.edu/GENSCAN.html). For en generell diskusjon av spleisevariant identifiserings-protokoller, se f. eks. Southan, C, A Genomic perspective on human proteases, FEBS lett., 2001, 8. jni, 498(2-3):214-9, de Souza, S.J. et al., Identification of human chromosome 22 transcribed sequences with ORF expressed sequences tags, Proe. Nati Acad Sei, USA, 2000, 7. November, 97(23): 12690-3.

For ytterligere å bekrefte parameterne for en transkriptvariant er en mengde teknikker tilgjengelige på fagområdet, slik som fullengdekloning, proteomisk validering, PCR-basert validering og 5'-RACE-validering osv. (se f. eks. Proteomic Validation: Brennan, S.O., et al., Albumin banks peninsula: a new termination variantcharacterized byelectrospray mass spectrometry, Biochem Biophys Acta., 1999, 17. august, 1433(1-2):321-6, Ferranti P, et al., Differential splicing of pre-messenger RNA producesmultiple forms of mature caprine alpha(sl)-casein, Eur J Biochem. 1997, 1. oktober, 249(1): 1-7. For PCR-basert validering: Wellmann, S. et al., Specific reverse transcription-PCR quantification of vascular endothelial growth factor (VEGF) spleice variants by LightCycler technology, Clin CHem., 2001, april, 47(4):654-60, Jia, H.P. et al., Discovery of new human beta-defensins using a genomics-based approach, Gene, 2001, april, 47(4):654-60, Jia, H.P. et al., Discovery of new human beta-defensis using a genomics-based approach, Gene, 2001, 24. januar, 263(l-2):211-8. For PCR-basert og 5' RACE-validering: Brigle, K.E., et al., Organization of the murine reduced folate carrier gene and identification of variant splice forms, Biochem Biophys Acta. 1997, 7. august, 1353(2): 191-8).

Det er på fagområdet kjent at genomiske regioner blir modulert ved kreft. Når den genomiske regionen på hvilken et gen foreligger blir modelert ved en spesiell kreft, blir de alternative transkriptene eller spleisede variantene for genet modulert i tillegg. Beskrevet her er at STEAP-1 har en spesiell ekspresjonsprofil som er relatert til kreft. Alternative transkripter og spleisevarianter av STEAP-1 kan også være involvert i kreftformer i det samme eller i ulike vev, og virker slik som tumorassosierte markører/antigener.

Exonsammensetningen til det opprinnelige transkriptet, betegnet som STEAP-l-v.l er vist i Tabell LIII. Ved å anvende fullengdegenet og EST-sekvensene ble to transkriptvarianter identifisert, som ble betegnet som STEAP-l-v.2 og -v.3. Sammenlignet med STEP-l-v.l spleiset ikke-transkriptvariant STEAP-l-v.2 ut intron 4 i STEAP-l-v.l og varianten STEAP-l-v.3 spleiset ut et ytterligere exon fra intron 4 i STEAP-l-v.l, som vist i Figur 11. Teoretisk er hver ulike kombinasjon av exon i rommelig orden, for eksempel exon-2 og -3, en potensiell spleisevariant. Figur 11 viser den skjematiske sammenstillingen av ulike exon for transkriptvarianter.

Eksempel 6: Enkelt nukleotid polymorfismer for STEAP-1

En enkelt nukleotid polymorfisme (SNP) er en enkelt baseparvariasjon i en nukleotidsekvens på en spesifikk lokalisering. På ethvert gitt punkt i genomet er det fire mulige nukleotidbasepar: A/T, C/G, G/C og T/A. Genotype referer til den spesifikke baseparsekvensen for én eller flere lokaliseringer i genomet for et individ. Haplotyper refererer til paseparsekvensen for mer enn en lokalisering på det samme DNA-molekylet (eller det samme kromosomet i høyere organismer), ofte i konteksten av et gen eller i konteksten av flere tett sammenbundne gener. SNPer som forekommer på et cDNA blir kalt cSNP. Disse cSNPene kan endre aminosyrer for proteinet som er kodet for av genet og slik endre funksjonene til proteinet. Noen SNPer forårsaker arvelige sykdommer, andre bidrar til kvantitative variasjoner i fenotype og reaksjoner ovenfor miljømessige faktorer inkludert diett og legemidler blant individer. Derfor har SNP og/eller kombinasjoner av alleler (kalt haplotyper) mange applikasjoner, inkludert diagnostisering av arvelige sykdommer, bestemmelse av legemiddelreaksjoner og dosering, identifisering av gener som er ansvarlige for sykdommer og analyse av den genetiske sammenhengen mellom individer (P. Nowotny, J.M. Kvon og A.M. Goate, "SNP analysis to dissect human traits", Curr. Opin. Neurobiol. 2001, oktober, 11(5):637-641, M. Pirmohamed og B.K. Park, "Genetic susceptibility to adverse drug reactions", Trends Pharmacol. Sei, 2001, juni, 22(6):298-305, J.H. Riley, C.J. Allan, E. Lai og A: Roses, 'The use of single nucleotide polymorphisms in the isolation of common disease genes, "Pharmacogenomics, 2000, februar, l(l):39-47, R. Judson, J.C. Stephens og A. Windemuth, "The predictive power of haplotypes in clinical response", Pharmacogenomics, 2000, februar, 1(1): 15-26).

SNPer blir identifisert ved hjelp av en mengde fremgangsmåter som er akseptert på fagområdet (P. Bean, 'The promising voyage of SNP target discovery", Am. Clin. Lab., 2001, oktober-november, 20(9):18-20, K.M. Weiss, "in search of human variation", GEnome Res., 1998, juli, 8(7):691-697, M.M. She, "Enabling lage-scale pharmacogenetic studies by high-trhoughput mutation detection and genotyping technologies", Clin. Chem., 2001, februar, 47(2): 164-172). For eksempel blir SNP identifisert ved å sekvensere DNA-fragmenter som viser polymorfisme ved hjelp av gelbaserte fremgangsmåter slik som restriksjonsfragmentlengede polymorfisme (RFLP) og denaturerende gradientgel elektroforese (DGGE). De kan også bli oppdaget ved direkte sekvensering av DNA-prøver som er sammenslått fra ulike individer ved å sammenligne sekvenser fra ulike DNA-prøver. Med den raske akkumuleringen av sekvensdata i allment tilgjengelige og private databaser, kan man oppdage SNPer ved å sammenligne sekvenser ved å anvende dataprogrammer (Z. Gu., L. Hillierog P.Y. Kwok, "Single nucleotide polymorphism hunting in cyberspace", Hum., Mutat., 1998, 12(4):221-225). SNPer kan bli verifisert og genotype eller haplotype for et individ kan bli bestemt ved hjelp av en mengde fremgangsmåter, inkludert direkte sekvensering og høy-omsetnings mikroarrays (P.Y. Kwok, "Methods for genotypihng single nucleotide polymorphisms", Annu. Rev. Genomics Hum. Genet, 2001, 2:235; M. Kokoris, K. Dix, K. Moynihan, J. Mathis, B. Erwin, P. Grass, B. Hines og A. Duesterhoeft, "High-throughput SNP genotyping with the Masscode system", Mol. Diagn., 2000, desember, 5(4):329-340).

Ved å anvende fremgangsmåten som er beskrevet ovenfor ble fjorten SNPer identifisert i transkriptet fra klon GTH9, betegnet som STEAP-l-v.2, på posisjonene 602 (C/G), 386 (C/T), 1087 (T/G), 1447 (T/C), 1621 (A/T), 1625 (G/T), 1716 (C/A), 2358 (C/T), 2446 (T/G), 2859 (T/G), 2908 (A/T), 3006 (G/C), 3107 (C/T) og 3180 (A/T). Transkriptene eller proteinene med alternative alleler ble betegnet som varianter STEAP-1-v.4, -v.5, -v.6, -v.7, -v.8, -v.9, -v.10, -v.ll, -v.12, -v.13, -v.14, -v.15, -v.16 og -v.17. Figur 10 viser den skjematiske sammenstillingen av SNP-varianter. Figur 12 viser den skjematiske sammenstillingen av proteinvarianter, tilsvarende til nukleotidvarianter. Disse allelene for SNPene, selv om det er vist separat her, kan forekomme i ulike kombinasjoner (haplotyper) og i enhver av transkriptvariantene (slik som STEAP-l-v.l og -v.3) som inneholder sekvenskonteksten til SNPene, for eksempel tar de første to SNPene også på STEAP-l-v.3 på de samme posisjonene, men henholdsvis på 572 og 356 på STEAP-l-v.l.

Eksempel 7: Fremstilling av rekombinant STEAP-1 i prokaryote systemer

For å uttrykke rekombinant STEAP-1 og STEAP-l-varianter i prokaryote celler blir fullengde- eller partiellengde-STEAP-1 og STEAP-l-variant-cDNA-sekvenser klonet inn i enhver av en mengde ulike ekspresjonsvektorer som er kjent på fagområdet. Fullengde-cDNA eller enhver av 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 eller flere kontinuerlige aminosyrer fra STEAP-1, varianter eller analoger derav, bli benyttet.

A. In vitro- transkripsjon og translasjonskonstruksjoner:

<p>CRII: For å generere STEAP-l-sens- og -anti-sens-RNA-prober for RNA-/'/? situ-undersøkelser blir pCRII-konstruksjoner (Invitrogen, Carlsbad, CA) generert som koder for enten hele eller fragmenter av STEAP-l-cDNA. pCRII-vektoren har Sp6- og T7-promotorer som flankerer insersjoneret for å styre transkripsjon av STEAP-1-RNA for anvendelse som prober i RNA in s/tu-hybridiseringseksperimenter. Disse probene ble benyttet til å analysere celle- og vevsekspresjonen av STEAP-1 på RNA-nivået. Transkribert STEAP-1-RNA som representerer cDNA-aminosyre koderegionen for STEAP-l-genet blir benyttet til in vitro-translasjonssystemer slik som TnT Coupled Reticulolysate System (Promega, Corp., madison, WI) for å syntetisere STEAP-l-protein.

B. Bakteriekonstrksjoner:

pGEX- konstruksioner: For å generere rekombinante STEAP-l-proteiner i bakterier som er fusjonert til glutation-S-transferase (GST)-proteinet blir hele eller deler av STEAP-1-cDNA eller variantene klonet inn i G ST-fu sjon sve kto ren i pGEX-familien (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). Disse konstruksjonene tillater kontrollert ekspresjon av rekombinante STEAP-l-proteinsekvenser med GST fusjonert på aminoterminalen og en skes-histidinepitop (6X His) på karboksylterminalen. GST- og 6X-His-merkene muliggjør rensing av det rekombinante fusjonsproteinet fra induserte bakterier med den passende affinitetsmatriksen og tillater gjenkjenning av fusjonsproteinet med anti-GST- og anti-His-antistoffer. 6X-His-merket blir generert ved å sette på 6 histidinkodon på kloningsprimeren på den 3' enden, for eksempel av den åpne leserammen (ORF). En proteolytisk kløyvingssete, slik som PreScission-gjenkjenningssetet i pGEX-6P-l, kan bli benyttet slik at det tillater kløyving av GST-merket fra STEAP-l-beslektet protein. Ampicillinresistensgenet og pBR322-origo tillater seleksjon og opprettholdelse av pGEX-plasmider i E. coli.

pMAL- konstruksioner: For i bakterier å generere rekombinante STEAP-l-proteiner som er fusjonert til maltosebindingsprotein (MBP) blir hele eller deler av STEAP-l-cDNA-proteinkodingssekvensen fusjonert til MBP-genet ved kloning inn i pMAL-c2X- og pMAL-p2X-vektorene (New England Biolabs, Beverly, MA). Disse konstruksjonene tillater kontrollert

ekspresjon av rekombinante STEAP-l-proteinsekvenser med MBP fusjonert på aminoterminalen og et 6X-His-epitopmerke på karboksylterminalen. MBP- og 6X-His-merkene tillater rensing av det rekombinante proteinet fra induserte bakterier med den passende affinitetsmatriksen og tillater gjenkjenning av fusjonsproteinet med anti-MBP og anti-HIS-antistoffer. 6X-His-epitopmerket blir generert ved å tilsette 6 histidinkodon på detn 3' kloningsprimeren. Et Faktor-Xa-gjenkjenningssete tillater kløyving av pMAL-merket fra STEAP-1. pMAL-c2X og pMAL-p2X-vektorene er optimalisert for å uttrykke det rekombinante proteinet i henholdsvis cytoplasma eller periplasma. Periplasmaekspresjon forsterker folding av proteiner med disulfidbindinger.

pET- konstruksjoner: For å uttrykke STEAP-1 i bakterieceller blir hele eller deler av STEAP-l-cDNA-proteinkodingssekvensen klonet inn i pET-familien av vektorer (Novagen, Madison, WI). Disse vektorene tillater sterkt kontrollert ekspresjon av rekombinant STEAP-l-protein i bakterier med og uten fusjon til proteiner som forsterker løselighet, slik som NusA og tioredoksin (Trx) og epitopmerker slik som 6X His og S-Tag som hjelper til i rensing og påvisning av det rekombinante proteinet. For eksempel blir konstruksjoner fremstilt ved å anvende pET-NusA-fusjonssystem 43.1 slik at regioner i STEAP-l-proteinet blir uttrykt som aminoterminale fusjoner på NusA.

C. Gjærkonstruksjoner:

pESC- konstruksioner: For å uttrykke STEAP-1 i gjærarten Saccharomyces cerevisiae for fremstilling av rekombinant protein og funksjonelle undersøkelser blir hele eller deler av STEAP-l-cDNA-proteinkodingssekvensen klonet i pESC-familien av vektorer der hver av disse inneholder 1 av 4 selekterbare markører, HIS3, TRP1, LEU2 og URA3 (Stratagene, La Jolla, CA). Disse vektorene tillater kontrollert ekspresjon fra det samme plasmidet av opp til 2 ulike gener eller klonede sekvenser inneholdende enten Flag- eller Myc-epitopmerker i den samme gjærcellen. Dette systemet er nyttig for å bekrefte protein-protein-interaksjoner for STEAP-1. I tillegg gir ekspresjon i gjær lignende posttranslasjonelle modifiseringer, slik som glykosyleringer og fosforyleringer, som er funnet når de blir uttrykt i eukaryote celler.

pESP- konstruksioner: For å uttrykke STEAP-1 i gjærarten Saccharomyces pombe blir hele eller deler av STEAP-l-cDNA-proteinkodingssekvensen klonet inn i pESP-familien av vektorer. Disse vektorene tillater kontrollert høynivå ekspresjon av en STEAP-1-proteinsekvens som er fusjonert på enten aminoterminalen eller karboksyterminalen til GST som hjelper til i rensing av det rekombinante proteinet. Et Flag-epitopmerke tillater påvisning av det rekombinante proteinet med anti-Flag-antistoff.

Eksempel 8: Fremstilling av rekombinant STEAP-1- i høyere eukaryote systemer

A. Pattedyrkonstruksjoner:

For å uttrykke rekombinant STEAP-1 i eukaryote celler kan hele eller en del av lengden til STEAP-l-cDNA-sekvensene bli klonet inn i enhver av en mengde ekspresjonsvektorer som er kjent på fagområdet. Én eller flere av de følgende regionene i STEAP-1 blir uttrykt i disse konstruksjonene, aminosyrene 1 til 339 i STEAP-l-v.l, -v.4, aminosyrene 1 til 258 i -v.2, aminosyrene 1 til 282 i -v.3 eller enhver av 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 eller flere kontinuerlige aminosyrer fra STEAP-1, varianter eller analoger derav. En region for en spesifikk variant av STEAP-1 kan bli uttrykt, som koder for en aminosyre på en spesifikk posisjon som er forskjellig fra aminosyren for enhver annen variant som er tilgjengelig på denne posisjonen, eller en region for en variant av STEAP-1 kan bli uttrykt, som ligger delvis eller fullstendig innenfor en sekvens som er unik for denne varianten.

Konstruksjonene kan bli transfektert inn i enhver av et vidt utvalg av pattedyrceller slik som 293T-celler. Transfekterte 293T-cellelysater kan bli probet med det anti-STEAP-1-polyklonale serum, som er beskrevet her.

pcDNA4/ HisMax- konstruksioner: For å uttrykke STEAp-1 i pattedyrceller blir en STEAP-1-ORF, eller del derav, fra STEAP-1, klonet inn i pcDNA4/HisMax Versjon A (Invitrogen, Carlsbad, CA). Proteinekspresjon blir styrt fra cytomegalovirus (CMV)-promotoren og SP16-translasjonsenhanceren. Det rekombinante proteinet har Xpress- og seks-histidin (6X-His)-epitoper fusjonert på aminoterminalen. pcDNA4/HisMax-vektoren inneholder også det bovine veksthormon (BGH)-polyadenyleringssignal- og transkripsjonstermineringssekvensen for å forsterke mRNA-stabilitet sammen med SV40-origo for episomal replikasjon og enkel vektorredning i cellelinjer som uttrykker det store T-antigenet. Zeocin-resistensgenet tillater seleksjon av pattedyrceller som uttrykker proteinet og ampicillinresistensgenet og ColEl-origo tillater seleksjon og opprettholdelse av plasmidet i E. coli.

pcPNA3. 1/ MvcHis- konstruksioner: For å uttrykke STEAP-1 i pattedyrceller ble en STEAP-1-ORF, eller del derav, av STEAP-1 med et konsensus-Kozak-translasjons-initiseringssete klonet inn i pcDNA3.1/MycHis versjon-A (Invitrogen, Carlsbad, CA). Proteinekspresjon er styrt fra cytomegalovirus (CMV)-promotoren. Det rekombinante proteinet haren myc-epitop og 6X-His-epitopen fusjonert på karboksylterminalen. pcDNA3.1/MycHis-vektoren inneholder også den bovine veksthormon (BGH)-polyadenyleringssignalsekvensen og -transkripsjonstermineringssekvensen for å forsterke mRNA-stabilitet, sammen med SV40-origo for episomal replikasjon og enkel vektorredning i cellelinjer som uttrykker det store T-antigenet. Neomycin resistensgenet ble benyttet, fordi det tillater seleksjon av pattedyrceller som uttrykker proteinet og ampicillin resistensgenet og ColEl-origo tillater seleksjon og opprettholdelse av plasmidet i E. coli.

pcPNA3. 1/ CT- GFP- TPO- konstruksion: For å uttrykke STEAP-1 i pattedyrceller og for å tillate påvisning av de rekombinante proteinene ved å anvende fluorescens, ble en STEAP-1-ORF, eller del derav, med et konsensus-Kozak-translasjonsinitieringssete klonet inn i pcDNA3.1/CT-GFP-TOPO (Invitrogen, CA). Proteinekspresjon er styrt fra cytomegalovirus (CMV)-promotoren. De rekombinante proteinene har grønt fluorescerende protein (GFP) fusjonert på karboksylterminalen for å fremme ikke-invasive, in wVo-påvisning og cellebiologiundersøkelser. pcDNA3.1-CT-GFP-TOPO-vektoren inneholder også den bovine veksthormon (BGH)-polyadenyleringssignalsekvensen og -

transkripsjonstermineringssekvensen for å forsterme mRNA-stabilitet sammen med SV40-origo for episomal replikasjon og enkel vektorredning i cellelinjer som uttrykker det store T-antigenet. Neomycinresistensgenet tillater seleksjon av pattedyrceller som uttrykker proteinet og ampicillinresistensgenet og ColEl-origo tillater seleksjon og opprettholdelse av plasmidet i E. coli. Ytterligere konstruksjoner med en aminoterminal GFP-fusjon ble fremstilt i pdDNA3.1/NT-GFP-TOPO som dekker hele lengden av et STEAP-l-protein.

PAPtaa: En STEAP-1-ORF eller en del derav, blir klonet inn i pAPtag-5 (GenHunter Corp. Nashville, TN). Denne konstruksjonen genererer en alkalisk fosfatasefusjon på karboksylterminalen på et STEAP-l-protein mens IgGic-signalsekvensen blir fusjonert på aminoterminalen. Konstruksjonen ble også generert der alkalisk fosfatase med en aminoteraminal IgGic-signalsekvens blir fusjonert på aminoterminalen til et STEAP-l-protein. De resulterende rekombinante STEAP-l-proteiner blir optimalisert for utskilling i medium fra transfekterte pattedyrceller og kan bli benyttet for å identifisere proteiner slik som ligander eller reseptorer som interagerer med STEAP-l-proteiner. Proteinekspresjon er styrt fra CM V-pro motoren og de rekombinante proteinene inneholder også mye- og 6X-His-epitoper fusjonert på karboksylterminalen og fremmer påvisning og rensing. Zeocin-resistensgenet som foreligger i vektoren tillater seleksjon av pattedyrceller som uttrykker det rekombinante proteinet og ampicillin resistensgenet tillater seleksjon av plasmidet i E. coli.

Ptaa5: En STEAP-1-ORF eller en del derav, blir klonet inn i pTag-5. Denne vektoren er lik pAPtag, men uten den alkaliske fosfatasefusjonen. Denne konstruksjonen genererte STEAP-l-protein med en aminoterminal IgGic-signalsekvens og mye- og 6X His-epitopmerke på karboksylterminalen som fremmer påvisning og affinitetsrensing. Det resulterende rekombinante STEAP-l-proteinet ble optimalisert for utskilling i medium fra transfekterte pattedyrceller, og blir benyttet som immunogen eller ligand for å identifisere proteiner slik som ligander eller reseptorer som interagerer med STEAP-l-proteinet. Proteinekspresjon ble styrt fra CMV-promotoren. Zeocin-resistensgenet som foreligger i vektoren tillot seleksjon av pattedyrceller som uttrykker proteinet og ampicillin resistensgenet tillater seleksjon av plasmidet i E. coli.

PsecFc: En STEAP-1-ORF eller en del derav, ble også klonet inn i psecFc. psecFc-vektoren ble sammensatt ved kloning av det humane immunglobulinet Gl (IgG) Fc

(hengsel, CH2-, CH3-regioner) inn i pSecTag2 (Invitrogen, California). Denne konstruksjonen genererte en IgGl-Fc-fusjon på karboksylterminalen til STEAP-l-proteinet, mens IgGK-signalsekvensen ble fusjonert på N-terminalen. STEAP-1-fusjoner som benytter den murine IgGl-Fc-regionen ble også benyttet. De resulterende rekombinante STEAP-l-proteinene ble optimalisert for utskilling i medium fra transfekterte pattedyrceller, og ble benyttet som immunogener for å identifisere proteiner slik som ligander eller reseptorer som interagerer med STEAP-l-protein. Proteinekspresjon blir styrt fra CMV-promotoren. Hygromycin resistensgenet som foreligger på vektoren tillot seleksjon av pattedyrceller som uttrykker det rekombinante proteinet, og ampicillinresistensgenet tillater seleksjon av plasmidet i E. coli.

pSRg- konstruksioner: For å generere pattedyrcellelinjer som uttrykker STEAP-1 konstitutivt, ble STEAP-1-ORF, eller deler derav, fra STEAP-1 klonet inn i pSRcc-konstruksjoner. Amfotropiske og ekotropiske heterovirus ble generert ved transfeksjon av pSRa-konstruksjoner inn i 293T-10Al-pakkelinjen eller ko-transfeksjon av pSRa og et hjelperplasmid (inneholdende fjernede pakkesekvenser) inn i 293-celler. Retrovirusene ble benyttet for å infisere et mengde pattedyrcellelinjer, inkludert i integreringen av det klonede genet, STEAP-1, i vertscellelinjene. Proteinekspresjon ble styrt fra en lang terminal repetisjon (LTR). Neomycinresistensgenet som foreligger i vektoren tillot seleksjon av pattedyrcellene som uttrykker proteinet og ampicillinresistensgenet og ColEl-origo tillot seleksjon og opprettholdelse av plasmidet i E. coli. Retrovirusvektorene ble deretter benyttet til infeksjon og generering av ulike cellelinjer ved for eksempel å benytte PC3-, NIH 3T3-, TsuPrl-, 293- eller rotte-1-celler.

Ytterligere pSRa-konstruksjoner ble fremstilt som fusjonerer et epitopmerke sliksom FLAG-merket til karboksylterminalen på STEAP-l-sekvensen for å tillate påvisning ved å anvende anti-Flag-antistoffer. For eksempel blir FLAG-sekvensen 5' gat tac aag gat gac gac gata ag 3' (Sekv. id. nr. 80) tilsatt på kloningsprimeren på den 3' enden av ORF. Ytterligere pSRa-konstruksjoner ble fremstilt for å frembringe både aminoterminale og karboksyterminale GFP- og myc/6X-His-fusjonsproteiner av fullengde-STEAP-l-proteiner.

Ytterli<g>ere virusvektorer: Ytterligere konstruksjoner blir fremstilt for virusmediert levering og ekspresjon av STEAP-1. Høye virustiter som fører til høynivåekspresjon av STEAP-1 ble oppnådd i virusleveringssystemer slik som adenovirusvektorer og herpes amplicon vektorer. En STEAP-1-kodende sekvens eller fragment derav ble amplifisert ved PCR og subklonet inn i AdEasy-shuttle vektoren (Stratagene). Rekombinasjon og viruspakking ble utført i overensstemmelse med produsentes instruksjoner for å generere adenovirusvektor. Alternativt blir STEAP-1-kodende sekvenser eller fragmenter derav klonet inn i HSV-l-vektoren (Imgenex) for å generere herpesvirus vektorer. Virusvektorene blir deretter benyttet til infeksjon av ulike cellelinjer slik som PC3-, NIH 3T3-, 293- eller rotte-1-celler.

Regulerte ekspresjonssystemer: For å kontrollere ekspresjon av STEAP-1 i pattedyrceller blir kodende sekvenser for STEAP-1, eller deler derav, klonet inn i regulerte pattedyrekspresjonssystemer slik som T-Rex-system (Invitrogen), GeneSwitch-systemet (Invitrogen) og det sterkt regulerte Ecdysone systemet (Stratagene). Disse systemene tillater undersøkelsen av de temporære og de konsentrasjonsavhengige effektene for rekombinant STEP-1. Disse vektorene ble deretter benyttet for å kontrollere ekspresjon av STEAP-1 i ulike cellelinjer slik som PC3-, NIH 3T3-, 293- eller rotte-1-celler.

B. Baculovirus ekspresjonssystemer

For å generere rekombinante STEAP-l-proteiner i et baculovirus ekspresjonssystem blir STEAP-1-ORF, eller deler derav, klonet inn i baculovirus overføringsvektoren pBlueBac 4.5 (Invitrogen), som tilveiebringer et His-merke på N-terminalen. Spesifikt blir pBlueBac-STEAP-1 ko-transfektert med hjelperplasmid pBac-N-Blue (Invitrogen) inn i SF9-innsektsceller ( Spodoptera frugiperda) for å generere rekombinante baculovirus (se Invitrogens instruksjonsmanual for detaljer). Baculovirus ble deretter samlet fra cellesupernatant og renset ved hjelp av plakk-analyse. Rekombinant STEAP-l-protein ble deretter generert ved å infisere HighFive-insektsceller (Invitrogen) med renset baculovirus. Rekombinant STEAP-l-protein kan bli påvist ved å anvende anti-STEAP-1 eller anti-His-merke antistoff. STEAP-l-protein kan bli renset og benyttet i ulike cellebaserte analyser eller som immunogen for å generere polyklonale og monoklonale antistoffer som er spesifikke for STEAP-1.

Eksempel 9: Antigenisitetsprofiler og sekundær struktur

Figurene 5(a)-9(a) og 5(b)-9(b) avbilder grafisk fem aminosyreprofiler for STEAP-1-variant 1 og -3, der hver undersøkelse er tilgjengelig ved å gå inn på ProtScale websiden som er lokalisert på internett på (URL.expasy.ch/cgi-bin/protscale.pl) på ExPasy-molekylær biologiserveren.

Disse profilene: Figur 5(a) og (b), hydrofilisitet (HoppT.P., Woods K.R., 1981, Proe. Nati. Acad. Sei., USA, 78:3824-3828), Figur 68a) og (b), hyropatisitet (Kyte J, Doolittle R.F., 1982, J. Mol. Biol., 157:105-132), Figur 7(a) og (b), prosetntvis tilgjengelige rester (Janin J., 1979, Nature, 277:491-492), Figur 8(a) og (b), Gjennomsnittlig fleksibilitet (Bhaskaran, R. og Ponnuswarny P.K., 1988, Int. J. Pept. Protein Res., 32:242-255), Figur 9(a) og (b), Beta-sving (Deleage, G, Roux B., 1987, Protein Engineering, 1:289-294) og eventuelt andre som er tilgjengelige på fagområdet, slik som på ProtScale websiden, ble benyttet til å identifisere antigene regioner for STEAP-l-protein. Hver av aminosyre-profilene for STEAP-1 ovenfor ble generert ved å anvende de følgende ProtScale parameterne for analyse: 1) en vindustørrelse på 9, 2) 100% vekt av vindusgrensene sammenlignet med vindussenteret og 3) aminosyreprofilverdier normalisert til å ligge mellom 0 og 1.

Hydrofilisitet (Figur 5(a) og (b)), hydropatisitet (Figur 6(a) og (b)) og prosentvis tilgjengelige rester (Figur 7(a) og (b)-profiler ble benyttet for å bestemme strekninger av hydrofile aminosyrer (dvs. verdier større enn 0,5 på hydrofilisitetsprofilen og at profilen får prosentvis tilgjengelige rester, og en verdi på mindre enn 0,5 i hydropatisitetsprofilen). Slike regioner er sannsynligvis eksponert i det vandige miljøet, er til stede på overflaten av proteinet, og slik tilgjengelige for immungjenkjenning, slik som av antistoffer.

Profil for gjennomsnittlig fleksibilitet (Figur 8(a) og (b)) og Beta-sving-profil (figur 9(a) og (b)) bestemmer strekninger av aminosyrer (dvs. verdier større enn 0,5 i Beta-sving-profilen og profilen over gjennomsnittlig fleksibilitet) som ikke er begrenset i sekundærstrukturer slik som beta flater og alfa helikser. Slike regioner er mest sannsynlig eksponert på proteinet og slik tilgjengelige for immungjenkjenning, slik som ved antistoffer.

Antigene sekvenser for STEAP-l-proteinet og fra variantproteinene som er indikert, for eksempel ved profilene som fremlagt i Figur 5(a) og (b), Figur 6(a) og (b), Figur 7(a) og (b), Figur 8(a) og (b) og/eller Figur 9(a) og (b) bli benyttet for å fremstille immunogener, enten peptider eller nukleinsyrer som koder for dem, for å fremstille terapeutiske og diagnostiske anti-STEAP-l-antistoffer. Immunogenet kan være på enhver av 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50 eller flere enn 50 kontinuerlige aminosyrer, eller de tilsvarende nukleinsyrene som koder for dem, fra STEAP-1-proteinvariantene som er fremlagt i Figurer 2 og 3. Spesielt kan peptidimmunogener ifølge oppfinnelsen omfatte en peptidregion på minst 5 aminosyrer ifølge Figur 2 og 3 i enhver stigning med et helt tall som inkluderer en aminosyreposisjon som har en verdi som er større enn 0,5 i hydrofilisitetsprofilen ifølge Figur 5(a) og (b), en peptidregion på minst 5 aminosyrer ifølge Figurene 2 og 3 i enhver stigning med et helt tall som inkluderer en aminosyreposisjon som har en verdi som er mindre enn 0,5 i hydropatisitetsprofilen ifølge Figur 6(a) og (b), en peptidregion på minst 5 aminosyrer ifølge Figurene 2 og 3 i enhver stigning med et helt tall som inkluderer en aminosyreposisjon som har en verdi som er større enn 0,5 i profilen over prosentvis tilgjengelige rester ifølge Figur 7(a) og (b), en peptidregion på minst 5 aminosyrer ifølge Figur 2 og 3 i enhver stigning med et helt tall som inkluderer en aminosyreposisjon som har en verdi som er større enn 0,5 i profilen over gjennomsnittlig fleksbilitet ifølge Figur 8(a) og (b), og en peptidregion på minst 5 aminosyrer ifølge figur 2 og 3 i enhver stigning med et helt tall som inkluderer en aminosyreposisjon som har en verdi som et større enn 0,5 i Beta-sving-profilen ifølge Figur 9(a) og (b). Peptidimmunogener kan også omfatte nukleinsyrer som koder for enhver av de foregående.

Alle immunogener ifølge beskrivelsen, peptid eller nukleinsyre, kan bli utformet i human enhetsdoseringsform, eller sammensatt av et preparat som inkluderrer en farmasøytisk eksipiens som er kompatibel med human fysiologi.

Sekundærstrukturene til STEAP-l-variant 1 og -variant-3, nemmelig den predikerte tilstedeværelsen og lokaliseringen av alfa helikser, forlengede tråder og tilfeldige krumminger, er prediktert fra de respektive primære aminosyresekvensene ved å anvende HNN - Hierarchical Neural Network method (Guermeur, 1997, lhttp:// pbil. ibcp. fr/ cqi-bin/ npsa automat. pl?paqe=npsa mm.html^ tilgjengelig fra ExPasy-molekylær biologiserveren som er lokalisert på internett siden (.expasy-ch/tools/). Analysen indikerer at STEAP-l-variant-1 er sammensatt av 64,60% alfa heliks, 4,72% forlenget tråd og 30,68% tilfeldig krumming (Figur 13a). STEAP-l-variant-2 er sammensatt av 62,79% alfa heliks, 3,10% forlenget tråd og 34,11% tilfeldig krumming (Figur 13b). STEAP-l-variant-3 er sammensatt av 58,87% alfa heliks, 5,32% forlenget tråd og 35,82% tilfeldig krumming (Figur 13c).

Analyse av den potensielle tilstedeværelsen av transmembrandomener i STEAP-l-varianter blir utført ved å anvende en mengde transmembran prediksjonsalgoritmer som er tilgjengelige fra ExPasy molekylær biologiserveren lokalisert på internett siden (.expasy.ch/tools/). Grafisk vist er resultatene av analysen for variant-1 som avbilder tilstedeværelsen og lokaliseringen av seks transmembrandomener ved å anvende TMpred-programmet (Figur 13d) og TMHMM-programmet (Figur 13e). Også vist er resultatene fra analysen av variant-2 som avbilder tilstedeværelsen og lokaliseringen av fire transmembrandomener ved å anvende TMpred (Figur 13h) og 3 transmembrandomener ved å anvende TMHMM (Figur 13g). Analyse av variant-3 predikerer tilstedeværelsen av fire transmembrandomener ved å anvende TMpred (Figur 13h) og 3 transmembrandomener med TMHMM (Figur 13i). Resultatene fra hvert program, nemmelig aminosyrene som koder for transmembrandomenet er oppsummert i Tabell XX.

Eksempel 10: Generering av polyklonale STEAP-1-antistoffer

Polyklonale antistoffer kan bli frembrakt i et pattedyr, for eksempel ved hjelp av én eller flere injeksjoner av et immuniserende middel og hvis ønsket en adjuvans. Typisk vil det immuniserende middelet og/eller adjuvansen bli injisert i pattedyret ved hjelp av flere subkutane eller intraperitoneale injeksjoner. I tillegg ved å immunisere med en fullengde-STEAP-l-proteinvariant, blir dataalgoritmer benyttet til design av immunogenet som basert på aminosyresekvensanalyse inneholdende karakteristika av å være antigene og tilgjengelige for gjenkjenning av immunsystemet hos den immuniserte verten (se eksempelet med tittelen "Antigenisitetsprofiler og sekundær struktur"). Slike regioner vil være predikert å være hydrofile, fleksible, i beta-sving-konformasjoner og være eksponert på overflaten av proteinet (se f. eks. Figur 5(a) og (b), Figur 6(a) og (b), Figur 7(a) og (b), Figur 8(a) og (b) og/eller Figur 9(a) og (b) for aminosyreprofiler som indikerer slike regioner for STEAP-l-proteinvariantene 1 og 3).

For eksempel blir rekombinante bakteriefusjonsproteiner eller peptider som inneholder hydrofile, fleksible, beta-sving-regioner for STEAP-l-proteinvarianter benyttet som antigener for å generere polyklonale antistoffer i New Zealand White-kaniner eller monoklonale antistoffer som beskrevet i eksemplet med tittelen ("Generering av monoklonale STEAP-l-antistoffer (MAb)). For eksempel inkluderer slike regioner, men er ikke begrenset til, aminosyrene 1-40, aminosyrene 143-165, aminosyrene 180-220 i STEAP-1-variantene 1, 2 og 3, aminosyrene 312-339 i STEAP-l-variant 1 og aminosyrene 250-282 i STEAP-l-variant 3. Det er nyttig å konjugere det immuniserende middelet med et protein som er kjent for å være immunogent i pattedyret som blir immunisert. Eksempler på slike immunogene proteiner inluderer keyhole limpet hemocyanin (KLH), serumalbumin, bovin tyroglobulin og soyabønne trypsininhibitor. Et peptid som koder for aminosyrene 250-282 i STEAP-l-variant 3 kan bli konjutert til KLH. Dette peptidet blir deretter benyttet som immunogen. Alternativt kan det immuniserende middelet inkludere hele eller deler av STEAP-l-variantproteinet, analogen eller fusjonsproteiner derav. For eksempel kan STEAP-l-variant 1 aminosyresekvensen bli fusjonert ved å anvende rekombinante DNA-teknikker på enhver av en mengde fusjonsproteinpartnere som er velkjente på fagområdet, slik som glutation-S-transferase (GST) og HIS-merkede fusjonsproteiner. I et annet eksempel er aminosyrene 250-282 i STEAP-l-variant 1 fusjonert med GST ved å anvende rekombinante teknikker og pGEX-ekspresjonsvektoren, uttrykt, renset og benyttet for å immunisere en kanin. Slike fusjonsproteiner blir renset fra induserte bakterier ved å anvende den passende affinitetsmatriks.

Andre rekombinante bakteriefusjonsproteienr som kan bli benyttet inkluderer en maltosebindingsprotein, LacZ, tioredoksin, NusA eller en immunglobulinkonstant region (se avsnittet med tittelen "Produksjon av STEAP-1 i prokaryote systemer" og Current Protocols in Molecular Biology, volum 2, enhet 16, Frederick M. Ausubul et al., red., 1995, Linsley, PS, Brady, W. Urnes, M., Grosmaire, L, Damle, N. og Ledbetter, L. (1991), J. Exp. Med., 174, 561-566).

I tillegg til bakterielt avledede fusjonsproteiner blir pattedyruttrykte proteinantigener også benyttet. Disse antigenene blir uttrykt fra pattedyrekspresjons-vektorer slik som Tag5- og Fc-fusjonsvektoren (se avsnittet med tittelen "Produksjon av rekombinant STEAP-1 i eukaryote systemer"), og opprettholde post-translasjonelle modifikasjoner slik som glykosyleringer som er funnet i nativt protein. I ett eksempel ble aminosyrene 185-218 i STEAP-l-variant 1 klonet inn i pattedyrutskillingsvektoren Tag5 og uttrykt i 293T-celler. Det rekombinante proteinet ble renset ved hjelp av metallchelat-kromatografi fra vevskultursupernatanter fra 293T-celler som stabilt uttrykker den rekombinante vektoren. Det rensede Tag5-STEAP-l-variant 1 proteinet blir deretter benyttet som immunogen.

I løpet av immuniseringsprotokollen er det nyttig å blande eller emulgere antigenet i adjuvanser som forsterker immunresponsen til vertsdyret. Eksempler på adjuvanser inluderer komplett Freunds adjuvans (CFA) og MPL-TDM-adjuvans (monofosforyl-lipid-A, syntetisk trehalosedikorynomykolat).

I en typisk protokoll blir kaniner først immunisert subkutant med opp til 200 ng, typisk 100-200 ng med fusjonsprotein eller peptid konjugert til KLH blandet i komplett

Freunds adjuvans (CFA). Kaniner blir deretter injisert subkutant hver andre uke med opp til 200 ng, typisk 100-200 ng av immunogenet i ukomplett Freunds adjuvans (IFA). Testtapninger ble tatt ved omtrent 7-10 dager etter hver immunisering og benyttet for å overvåke titere av antiserum ved hjelp av ELISA.

For å teste reaktivitet og spesifisitet for immunserum, slik som kaninserumet som er avledet fra immunisering med GST-fusjon av STEAP-l-variant-l-protein, blir fullengde-STEAP-l-variant-l-cDNA klonet inn i pCDNA 3.1-myc-his-ekspresjonsvektor (Invitrogen, se eksempelet med tittelen "Produksjon av rekombinant STEAP-1 i eukaryote systemer"). Etter transfeksjon av konstruksjoner inn i 293T-celler ble cellelysater probet med anti-STEAP-l-serumet og med anti-His-antistoffet (Santa Cruz Biotechnologies, Santa Cruz, CA) for å bestemme spesifikk reaktivitet mot denaturert STEAP-l-protein ved å anvende Western-blott teknikken. I tillegg blir immunserumet testet ved hjelp av fluorescensmikroskopi, flow cytometri og immunpresipitering mot 293T- og andre rekombinante STEAP-1-uttrykkende celler for å bestemme spesifikk gjenkjenning av nativt protein. Western-blott, immunpresipitering, fluorescensmikroskopi og flow cytometriteknikker ved å anvende celler som endogent uttrykker STEAP-1 ble også utført for å teste reaktivitet og spesifisitet.

Antiserum fra kaniner som er immunisert med STEAP-l-variant fusjonsproteiner, slik som GST- og MBP-fusjonsproteiner, blir renset ved uttømming av antistoffer som er reaktive mot fusjonspartnersekvensen ved passering over en affinitetskolonne inneholdende fusjonsparteren enten alene eller i konteksten med et irrelevant fusjonsprotein. For eksempel blir antiserum avledet fra et GST-STEAP-l-variant 1 fusjonsprotein først renset ved passering over en kolonne med GST-protein kovalent koblet til AffiGel-matriks (BioRad, Hercules, California). Antiserumet blir deretter affinitetsrenset ved passering over en kolonne som er sammensatt av et MBP-STEAP-l-fusjonsprotein kovalent koblet til Affigel-matriks. Serumet blir deretter ytterligere renset ved hjelp av protein-G-affinitets-kromatografi for å isolere IgG-fraksjon. Serum fra andre His-merkede antigener og peptidimmuniserte kaniner i tillegg til fusjonspartner uttømt serum blir affinitetsrenset ved passering over en kolonne matriks sammensammensatt av det opprinnelige proteinimmunogenet og fritt peptid.

Eksempel 11: Generering av monoklonale STEAP-l-antistoffer (MAb)

I ett eksempel omfatter terapeutiske MAber mot STEAP-l-varianter de som reagerer med epitoper som er spesifikke for hvert variantprotein eller spesifikk for sekvenser som er felles mellom variantene som vil binde, internalisere, ødelegge eller modulere den biologiske funksjonen til STEAP-l-variantene, for eksempel de som vil ødelegge interaksjonen med ligander og bindingspartnere. Immunogener for generering av slike MAber inkluderer de som er designet for å kode for eller inneholde det ekstracellulære domenet til hele STEAP-l-proteinvariantsekvensen, regioner som er predikert å inneholde funksjonelle motiver og regioner i STEAP-l-proteinvariantene som er predikert å være antigene ut fra dataanalyse av aminosyresekvensen (se f. eks. Figur 5(a)-(b), Figur 6(a)-(b), Figur 7(a)-(b), Figur 8(a)-(b) eller Figur 9(a)-(b) og i eksempelet med tittelen "Antigenisitetsprofiler og sekundær struktur"). Immunogener inkluderer peptider, rekombinante bakterieproteiner og pattedyruttrykte Tag5-proteiner og humane og murine IgG Fc-fusjonsproteiner. I tillegg blir pTAG5-protein, DNA-vektorer som koder for pTAG5-cellene som er fremstilt for å uttrykke høye nivåer av en respektiv STEAp-l-variant, slik som 293T-STEAP-l-variant 1 eller 3T3-, RAT- eller 300.19-STEAP-l-variant 1 murine Pre-B-celler benyttet for å immunisere mus.

For å generere MAb mot STEAP-l-varianter blir mus først immunisert intraperitonealt (IP) eller i fotbladet med typisk 10-50 ng med proteinimmunogen eller IO<7>STEAP-1-uttrykkende celler blandet i komplett Freunds adjuvans. Eksempler på andre adjuvanser som blir benyttet er Titermax (Sigma) og Immuneasy (Qiagen). Mus blir deretter immunisert IP hver 2. til 4. uke med typisk 10-50 ng med proteinimmunogen eller IO<7>celler blandet i ukomplett Freunds adjuvans. Alternativt blir MPL-TDM-adjuvans benyttet i immuniseringer. I tillegg til proteinet ovenfor og de cellebaserte immuniserings-strategiene blir en DNA-basert immuniseringsprotokoll benyttet der en pattedyrekspresjons-vektor som koder for en STEAP-l-variantsekvens blir benyttet til å immunisere mus ved direkte injeksjon av plasmid-DNA. For eksempel ble aminosyrene 185-218 i STEAP-l-variant 1 klonet inn i pattedyrutskillingsvektoren Tag5 og den rekombinante vektoren ble benyttet som immunogen. I et annet eksempel ble de samme aminosyrene klonet inn i en Fc-fusjonsutskillingsvektor der STEAP-l-variant-l-sekvensen er fusjonert på aminoterminalen til en IgK-ledersekvens på karboksylterminalen til den kodende sekvensen for den humane eller den murine IgG-Fc-region. Denne rekombinante vektoren blir deretter benyttet som immunogen. Plasmidimmuniseringsprotokollene ble benyttet i kombinasjon med rensede proteiner uttrykt fra den samme vektoren og med celler som uttrykker den respektive STEAP-l-varianten. I et annet eksempel blir et monoklonalt antistoff mot STEAP-l-variant 3 generert ved å anvende et peptid som koder for aminosyrene 250-282. Peptider ble konjugert til KLH og benyttet som immunogen. ELISA på fritt peptid blir benyttet for å identifisere immunreaktive kloner. Reaktivitet og spesifisitet for de monoklonale antistoffene mot fullengde-STEAP-l-variant-l-protein ble overvåket ved hjelp av Western-blotting, immunpresipitering og flow cytometri ved å anvende både rekombinante og endogent uttrykkende STEAP-l-variant-l-celler.

I løpet av immuniseringsprotokollen blir testtapninger utført i 7-10 dager etter en injeksjon for å overvåke titer og spesifisitet for immunresponsen. Med en gang passende reaktivitet og spesifisitet blir oppnådd som bestemt ved hjelp av ELISA, blir Western-blotting, immunpresipitering, fluorescensmikroskopi og flow cytometri analyser, fusjons- og hybridomgenerering utført med etablerte prosedyrer som er velkjente på fagområdet (se f. eks. harlow og Lane, 1988).

Bindingsaffiniteten til STEAP-l-variant-l-spesifikke monoklonale antistoffer ble bestemt ved å anvende standard teknologier. Affinitetsmålinger kvantifiserer styrken til antistoffet på epitopbinding og blir benyttet til å hjelpe i å definere hvilket monoklonalt STEAP-l-variant antistoff som er foretrukket til diagnostiske eller terapeutiske anvendelser, slik det er åpenbart for fagfolk på området. BIAcore-systemet (Uppsala, Sverige) er en foretrukket fremgangsmåte for å bestemme bindingsaffinitet. BIAcore-systemet benytter surface-plasmon-resonance (SPR, Welford K, 1991, Opt. Quant. Elect., 23:1, Morton og Myszka, 1998, Methods in Enzymology, 295:268) for å overvåke biomolekylære interaksjoner i sanntid. BIAcore-analyse genererer hensiktsmessig assosiasjonsrate-konstanter, dissosiasjonsratekonstanter, likevekts dissosiasjonskonstanter og affinitets-konstanter.

For å generere monoklonale antistoffer som er spesifikke for andre STEAP-l-varianter blir immunogenet designet slik at de koder for aminosyresekvenser som er unike for variantene. Et peptid som koder for aminosyrer som er unike for STEAP-l-varianter kan bli syntetisert, koblet til KLH og benyttet som immunogen. Peptider og bakteriefusjonsproteiner kan bli fremstilt som omfatter den unike sekvensen som er generert ved alternativ spleising i variantene. Hybridomer blir deretter valgt som gjenkjenner det respektive variantspesifikke antigenet og som også gjenkjenner fullengde variantproteinet som blir uttrykt i celler. Slik seleksjon benytter immunanalyser som er beskrevet ovenfor, slik som Western blotting, immunpresipitering og flow cytometri.

Beskrivelsen tilveiebringer oppfinnelsen monoklonale antistoffer betegnet X92.1.30.1.1(1) (også kalt M2/92.30) og X120.545.1.1 (også kalt M2.120.545). M2/92.30 og M2/120.545 ble identifisert og er vist å ragere og binde celleoverflate-STEAP-1 (se Figurene 15 og 18). Figur 16 viser at anti-STEAP-l-MAb M2/92.30 binder endogent celleoverflate-STEAP-1 uttrykt på blære- og prostatakreft xenograftceller. I tillegg reagerer og binder M2/92.30 med murint STEAP-1 som vist i Figur 17.

Antistoffene som er betegnet X93.1.30.1.1(1) (også kalt M2/92.30) og X120.545.1.1 (også kalt M2.120.545) ble sendt (via Federal Express) til the American Type Culture Collection (ATCC), P.o.box 1549, Manassas, VA 20108 den 6. februar 2004 og ble tilordnet aksesjonsnummeret, henholdsvis PTA-5802 og PTA-5803.

For å klone M2/X92.30- og M2/X120.545-antistoffene ble de følgende protokollene benyttet. Hybridomceller ble lysert med trizol-reagens (Life Technologies, Gibco BRL). Total-RNA ble renset og kvantifisert. Førstetråd-cDNA ble generert fra total-RNA med oligo (dT) 12-18-priming ved å anvende Gibco-BRL-superskript-preamplification-systemet. PCR-produkter ble klonet inn i pCRScript-vektoren (Stratagene, La Jolla). Flere kloner ble sekvensert og variabel tung- ("VH") og variabel lett- ("VL") kjederegioner ble bestemt. Nukleinsyresekvensen og aminosyresekvensen for M2/X92.30 og M2/X120.545-tungkjedevariabelregioner og lettkjedeva ria bel reg ioner er vist i Figur 19(a)-19(d) og Figur 20(a)-(e).

Eksempel 12: Karakterisering av STEAP-1-antistoffer

A. Celleoverflatebindin<g>

Reaktivitet for STEAP- 1-antistoffer med et STEAP-l-beslektet protein kan bli etablert ved hjelp av et antall velkjente måter, inkludert Western blotting, immunpresipitering, ELISA- og FACS-analyse ved å anvende, der det er hensiktsmessig, STEAP-l-beslektede proteiner, STEAP-l-uttrykkende celler eller ekstrakter derav. Som vist i Figur 15 ble FACS-analyse av rekombinante 3T3- og Rat-l-celler som stabilt uttrykker enten STEAP-1 eller en kontroll farget med anti-STEAP-MAb M2/92.30 (10 ng/ml) og celleoverflatebundet MAb påvist med et geit-anti-muse-IgG-PE-konjugert sekundært reagens. De fargede cellene ble deretter underkastet FACS-analyse. Som indikert ved fluorescensskiftet i Ratl-STEAP-1- og 3T3-STEAP-l-cellene sammenlignet med de respektive kontrollcellene, binder M2/92.30 spesifikt til celleoverflate-STEAP-1.

Når UGBl-blærekreftceller og LAPC9-prostata kreftceller ble farget med 10 ng/ml med enten MAb-M2/92.30 eller med en kontroll anti-KLH-MAb ble i tillett overflatebundet MAb 92.30 påvist med geit-anti-mus-IgG-PE-konjugert sekundært Ab. Fargede celler blir deretter underkastet FACS-analyse. Disse resultatene viser at anti-STEAP-l-MAb M2/92.30 spesifikt binder endogent celleoverflate-STEAP-1-gen uttrykt i blære- og prostatakreft xenograftceller (Figur 21).

STEAP-1-M2/92.30 er også vist å binde til murint-STEAP-l-protein (se Figur 17). I dette eksperimentet ble 293T-celler transient transfektert med enten pCDNA3.1 som koder for det murine STEAP-l-cDNA, eller med en tom vektor. 48 timer senere ble cellene høstet og farget med anti-STEAP-MAb M2/92.30 (10 n9/ml) og celleoverflatebundet MAb 92.30 ble påvist med et geit-anti-muse-IgG-PE-konjugert sekundært reagens. Celler ble deretter underkastet FACS-analyse. STEAP-l-m2/92.30 ble vist å binde spesifikt til STEAP-l-uttrykkende 293T-celler.

STEAP-1-M2/120.545 er også vist å spesifikt binde til STEAP-1 (se Figur 18). 3T3-neo (Panel A, fylte histogrammer) og 3T3-STEAP-l-celler (Panel A, histogrammer uten fyll) og Ratl-neo (Panel B, fylte histogrammer) og Ratl-STEAP-celler (Panle B, histogrammer uten fyll) ble farget med MAb M2/120.545 (10 \ ig/ m\) og overflatebundet MAb ble påvist med geit-anti-muse-IgG-PE-konjugert sekundært Ab. Celler ble deretter underkastet FACS-analyse. Som indikert ved fluorescensskifte på T3T-STEAP-1- og Rat-l-STEAP-l-celler sammenlignet med deres respektive neo-kontroller, binder MAb M2/120.545 spesifikt til celleoverflate-STEAP-1. I Panel C ble LNCaP-celler farget med enten MAb M2/120.545 eller en kontroll-anti-KLH-Mab og underkastet FACS-analyse som ovenfor. I Panel D viser fluorescensmikroskopi av de M2/120.545-fargede LNCaP-cellene kraftig celleoverflate fluorescens.

Reaktivitet og spesifisitet for M2/92.30 og M2/120.545 ble også bestemt ved immunpresipitering. Figur 25 viser 3T3-STEAP-1- og 3T3-neo-celler lysert i RIPA-buffer (25 mM Tris-CI, pH 7,4, 150 mM NaCI, 0,5 mM EDTA, 1% Triton X-100, 0,5% deoksykolsyre, 0,1% SDS og proteaseinhibitor cocktail). Cellelysatene ble forhåndsklaret med protein-G-sefarosekuler og deretter inkubert med 5 ng med enten MAb M2/92.30 eller M2/120.545 i 2 timer ved romtemperatur. Protein-G-kuler ble tilsatt og blandingen ble ytterligere inkubert i 1 time. Immunkompleksene ble vasket og løseliggjort i SDS-PAGE prøvebuffer. De løseliggjorte prøvene ble deretter utsatt for SDS-PAGE og Western blott-analyse ved å anvende et kanin-anti-STEAP-pAb. Helcellelysater av 293T-celler transfektert med STEAP1 ble også kjørt som en positiv kontroll. Et immunreaktivt bånd på~37 kD ble kun sett i prøver som er avledet fra 3T3-STEAPl-celler, noe som er indikativ på spesifikk immunpresipitering av STEAP1 ved både M2/92.30 og M2/120.545 MAber.

B. STEAP- 1- antistoff internalisering

Immunterapi basert på levering av toksiner og spesifikke cellemål ved å anvende monoklonale antistoffer er ansett for å være en modalitet i terapien av maligniteter. Det generelle prinsippet er leveringen av toksiner eller antineoplastiske legemidler i kreftceller med molekyler som binder til antigener eller reseptorer som enten unikt er uttrykkt eller overuttrykt på målcellene relativt i forhold til normale vev.

Immuntoksiner består av celleselektive ligander (vanligvis monoklonale antistoffer eller cytokiner) bundet kovalent til toksiner. Interaksjonen av antistoff eller ligand med celleoverflatereseptorer utløser internalisering. I definerte intracellulære vesikkelavdelinger unnslipper toksinenheten til cytosol, der den katalytisk endrer kritiske cellefunksjoner som fører til celledød. Se Frankel AE, Increased Sophistication of Immunotoxins, Clinical cancer research, 8:942-944 (2002) og Allen TM, Ligand-Ta rgeted Therapeutics in Anti-cancer Therapy, Nature Reviews, 2:750-760 (2002).

Saporin er et ribosominaktiverende protein (RIP) som katalyserer in vitro-depurineringen av en spesifikk adeninrest i store ribosomale RNA. Endo Y, et al., Mechanism of Action of the Toxin Lecitin Ricin on Eukaryotic Cells, The Site and Characteristics of the Modification in 28S RNA Caused by the Toxin, J. Biol. Chem., 262, 5908-5912 (1987). Den kan vanligvis ikke trenge seg inn i celler hvis den ikke er i kompleks med en passende bærermolekyl. Kovalent konjugering av saporin med monoklonale antistoffer som gjenkjenner tumorantigener frembringer immuntoksiner som innehar både kreftcelleselektivitet og som blir internalisert. Se Flavell, DJ, Sapoin Immunotoxins, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 234: 51-61 (1998) og FLavell DJ, et al., THerapy of Human T-cell Acute Lymphoblastic Leukemia with a Combination of Anti-CD7 and ANti-CD38-Saporin Immunotoxins is Significantly Better than Therapy with Each Individual Immunotoxins, Br. J. Cancer, 84:571-578 (2001). Disse molekylene har nylig blitt utsatt for fase-l-kliniske utprøvninger for leukemi og multippelt myelom. Foon KA, Monoclonal Antibody Therapies for Lymphomas, Cancer, J., 6: 273-278 (2000).

Internaliseringen av STEAP-1-M2/92.30 er vist i Figur 22. I dette eksperimentet ble PC3-STEAP-l-celler farget ved 4°C med M2/120.545-MAb (10 ng/ml), vasket, deretter inkubert med geit-anti-muse-IgG-PE-konjugert, sekundært Ab. Halvparten av cellene ble flyttet til 37°C i 30 minutter og den andre halvparten forble ved 4°C. Celler fra hver behandling ble deretter utsatt for fluorescensmikroskopi. Celler som forble ved 4°C viste lys farging på omkretsen av celleoverflaten. Celler som ble flytte til 37°C viste tap av farging og celleomkretsen og fremtredelsen av punktmessig og aggregert fluorescens som er indikativ på capping og internalisering.

STEAP-l-internalisering ved hjelp av STEAP1 M2/120.545-MAb er vist i Figur 23. PC3-STEAP-l-celler blir farget ved 4°C med M2/120.545-MAb (10 ng/ml), vasket, deretter inkubert med geit-anti-mus-IgG-PE-konjugert sekundært Ab. Halvparten av cellene ble flyttet til 37°C i 30 minutter og den andre halvparten bfor ble ved 4°C. Celler fra hver behandling ble deretter utsatt for fluorescensmikroskopi. Celler som ble forble ved 4°C viste lys "ringlignende" celleoverflate fluorescens. Celler som ble flyttet til 37°C viste tap av "ringlignende" celleoverflate fluorescens og fremkomsten av punktmessig og aggregert fluorescens som er indikativ på capping og internalisering.

En tilnærming for å velge passende antistoff kandidater til immuntoksinlevering benytter dreping med et sekundært antistoff konjugert til et legemiddelmolekyl eller toksinmolekyl. Det sekundære konjugerte antistoffet sitter på det primære antistoffet, noe som tillater evalueringen av det primære antistoffet til å internalisere og traffikere til passende intracellulære avdelinger. Med en gang konjugatet er internalisert bryter saporin seg vekk fra det målsøkende middelet og inaktiverer ribosomene for å eliminere målcellene. Kohls MD og Lappi DA, MAb-ZAP: A Tool for Evaluating Antibody Efficacy for Use in an Immunotoxin, Bio Techniques, 28(1): 162-165 (2000).

For å velge den passende antigenkandidaten ved å anvende tilnærmingen ovenfor, ble et sekundært immuntoksin, anti-muse-IgG-saporinkonjugater (Advanced Trageting Systems, San Diego, CA) benyttet for å vise at murint STEAP-1-M2/120.545 trenger inn i målceller via ekspresjon av STEAP-1 på celleoverflaten av LNCaP-celler. De følgende protokollene ble benyttet. LNCap-celler ble platet ved 5000 celler/90nl/brønn i 96-brønners plater og inkubert over natt. Deretter ble immuntoksinkonjugater (anti-muse-IgG-saproin og anti-geit-IgG-saporin) og anti-muse-IgG fremstilt i cellemedium inneholdende sluttkonsentrasjonen ved 100 ng/ml. 10 ni ble tilsatt til hver brønn. Det primære antistoffet blir tilsatt ved konsentrasjonen fra 1 til 1 000 ng/ml. Platene ble inkubert i 72 timer og levedyktigheten ble bestemt ved hjelp av MTT-analyse. Resultatene i Figur 24 viser at LNCap-celler ble drept i nærvær av anti-muse-IgG-saporin. Ingen effekter er påvist med verken det sekundære antistoffet alene (anti-muse-IgG) eller ikke-spesifikke, sekundære antistoffkonjugater (anti-geit-IgG-saporin). Ingen toksisitet ble observert med det primære antistoffet (M2/120.545) alene testet opp til 1 ng/ml.

Eksempel 13: HLA klasse-I- og -klasse-II-bindingsanalyse

HLA klasse-I og -klasse-II-bindingsanalyser ved å anvende rensede HLA-molekyler ble utført i overensstemmelse med beskrevete protokoller (foreksempel PCT-publikasjon WO 94/20127 og WO 94/03205, Sidney et al., Current Protocls in Immunology, 18.3.1

(1998), Sidney, et al., J. Immunol., 154:247 (1995), Sette et al., Mol. Immunol., 31:813

(1994)). Kort fortalt blir rensede MHC-molekyler (5 til 500 nM) inkubert med ulike ikke-merkede peptidinhibitorer og 1-10 nM<125>I-radiomerkede probepeptider som beskrevet. Etter inkubering blir MHC-peptidkomplekser separert fra fritt peptid ved hjelp av gelfiltrering og fraksjonen med peptid som er bundet blir bestemt. I preliminære eksperimenter blir typisk hvert MHC-preparat titerbestemt i nærvær av fastsatte mengder med radiomerkede peptider for å bestemme konsentrasjon av HLA-molekyler som er nødvendig for å binde 10-20% av den totale radioaktiviteten. All påfølgende inhibering og direkte bindingsanalyse ble utført ved å anvende disse HLA-konsentrasjonene.

Siden de målte IC50-verdiene ved disse betingelsene [merke]<[HLA] og IC50>.[HLA] er fornuftige tilnærminger av de sanne KD-verdiene, blir peptidinhibitorer typisk testet ved konsentrasjoner som strekker seg fra 120 ng/ml til 1,2 ng/ml, og blir testet i to til fire fullstendig uavhengige eksperimenter. For å tillate sammenligning av dataene som er fremskaffet i ulike eksperimenter, blir et relativt bindingstall beregnet for hvert peptid ved å dele IC50-verdien for en positiv kontroll for inhibering med IC50-verdien for hvert testet peptid (typisk umerkede versjoner av det radiomerkede probepeptidet). For database-hensikter, og inter-eksperimentsammenligninger, blir relative bindingsverdier samlet. Disse verdiene kan deretter bli konvertert tilbake til IC50nM-verdier ved å dele IC50nM for de positive kontrollene for inhibering med den relative bindingen av peptidet av interesse. Denne fremgangsmåten med datasamling er nøyaktig og konsistens for å sammenligne peptider som har blitt testet på ulike dager, eller med ulike ladninger med renset MHC.

Bindingsanalyser som beskrevet ovenfor kan bli benyttet til å analysere HLA-supermotiv og/eller HLA-motivbærende peptider (se Tabell IV).

Eksempel 14: Konstruering av "minigen"-multiepitop-DNA-plasmider

Dette eksempelet diskuterer konstrueringen av et minigen ekspresjonsplasmid. Minigenplasmider kan selvfølgelig inneholde ulike konfigurasjoner av B-celle-, CTL- og/eller HTL-epitoper eller epitopanaloger som beskrevet her.

Et minigen ekspresjonsplasmid inkluderer typisk flere CTL- og HTL-peptidepitoper.

I foreliggende eksempel blir HLA-A2-, -A3-, -B7-motivbærende peptidepitoper og HLA-A1-og -A24-motivbærende peptidepitoper benyttet sammen med DR-supermotivbærende epitoper og/eller DR3-epitoper. HLA-klasse-I-supermotiv- eller motivbærende peptidepitoper avledet STEAP-1, blir valgt slik at flere supermotiv/motiver er representert for å sikre bred populasjonsdekning. Likeledes blir HLA-klasse-II-epitoper fra STEAP-1 for å tilveiebringe bred populasjonsdekning, dvs. både HLA-DR-l-4-7-supermotivbærende epitoper og HLA-DR-3-motivbærende epitoper valgt for inklusjon i minigen konstruksjon. Det valgte CTL- og HTL-epitopene blir deretter inkorporert i et minigen for ekspresjon i en ekspresjonsvektor.

En slik konstruksjon kan ytterligere inkludere sekvenser som styrer HTL-epitopene til det endoplasmatiske retikulum. For eksempel kan li-protienet bli fusjonert til én eller flere HTL-epitoper som beskrevet på fagområdet, der CLIP-sekvensen fra li-proteinet ble fjernet og erstattet med en HLA-klasse-II-epitopsekvens slik at HLA-klasse-II-epitop er rettet mot det endoplasmatiske retikulum, der epitopen binder til HLA-klasse-II-molekyler.

Dette eksempelet illustrerer fremgangsmåtene som kan bli benyttet for å konstruere et minigenbærende ekspresjonsplasmid. Andre ekspresjonsvektorer som kan bli benyttet til minigenpreparater er tilgjengelige og kjent for fagfolk på området.

Minigen-DNA-plasmidet i dette eksempelet inneholder en konsensus-Kozak-sekvens og en murin konsensus-kappa-Ig-lettkjede signalsekvens etterfulgt av CTL- og/eller HTL-epitoper som er valgt i overensstemmelse med prinsippene som er beskrevet her. Sekvensen koder for en åpen leseramme fusjonert til Mye- og His-antistoffepitopmerket kodet for av pcDNA 3.1-Myc-His-vektoren.

Overlappende oligonukleotider som for eksempel i gjennomsnitt kan være fra omtrent 70 nukleotider i lengde med 15 nukleotidoverlapper, ble syntetisert og HPLC-renset. Oligonukleotidene koder for de valgte peptidepitopene i tillegg til passende linkernukleotider, Kozak-sekvens og signalsekvens. Det endelige multiepitop minigenet blir sammensatt ved å forlenge de overlappende oligonukleotidene i tre sett med reaksjoner ved å anvende PCR. En Perkin/elmer 9600 PCR-maskin ble benyttet og totalt 30 sykluser ble utført ved å anvende de følgende betingelsene: 95°C i 15 sek., annealingstemperatur (5° under den lavest kalkulerte Tm for hvert primerpar) i 30 sekunder og 72°C i 1 minutt.

Et minigen blir for eksempel fremstilt som følger. I en første PCR-reaksjon blir 5 ng av hvert av to oligonukleotider annealet og forlenget: I et eksempel som benytter åtte oligonukleotider, dvs. fire par med primere, blir oligonukleotidene 1+2, 3+4, 5+6 og 7+8 kombinert i 100 ni reaksjoner inneholdende Pfu-polymerasebuffer (lx = 10 mM KCL, 10 mM (NH4)2S04, 20 mM Tris-klorid, pH 8,75, 2 mM MgS04, 0,1% Triton X-100, 100 ng/ml BSA), 0,25 mM av hver dNTP og 2,5 U med Pfu-polymerase. Fullengde dimerproduktene ble gelrenset og to reaksjoner inneholdende produktet fra 1+2 og 3+4, og produktet av 5+6 og 7+8 blir blandet, annealet og forlenget i 10 sykluser. Halvparten av de to reaksjonene ble deretter blandet og 5 sykluser med annealing og forlengning ble utført før flankerende primere ble tilsatt for å amplifisere fullengdeproduktet. Fullengdeprodukt ble gelrenset og klonet inn pCR-blunt (Invitrogen) og individuelle kloner blir screenet ved hjelp av sekvensering.

Eksempel 15: Plasmidkonstruksjonen og graden dette induerer immunogenisitet

I hvilken grad en plasmidkonstruksjon, for eksempel et plasmid som er konstruert i overensstemmelse med det tidligere eksempelet, er i stand til å indusere immungenisitet blir bekreftet in vitro ved å bestemme epitoppresentering ved APC etter transduksjon eller transfeksjon av APC med en epitoputtrykkende nukleinsyrekonstruksjon. En slik undersøkelse bestemmer "antigenisitet" og tillater anvendelsen av human APC. Analysen bestemmer evnen for epitopen i å være presentert ved APC i en kontekst som er gjenkjent av en T-celle ved å kvantifisere tettheten av epitop-HLA-klasse-I-komplekser på celleoverflaten. Kvantifisering kan bli utført ved direkte å måle mengden av peptid som har eluert fra APC (se f. eks. Sijts et al., J. Immunol., 156:683-692, 1996, Demotz et al., Nature, 342:682-684, 1989) eller antallet peptid-HLA-klasse-I-komplekser kan bli beregnet ved å måle mengden av lysis eller lymfokin frigjøring som er indusert ved sykdomsrammede eller transfekterte målceller, og deretter bestemme konsentrasjonen av peptid som er nødvendig for å oppnå tilsvarende nivåer med lysis eller lymfokinfrigjøring (se f. eks. Kageyama et al., J. Immunol., 154:567-576, 1995).

Alternativt blir immunogenisitet bekreftet via in wVo-injeksjoner i mus og påfølgende in wtro-undersøkelse av CTL- og HTL-aktivitet, som blir analysert ved å anvende cytotoksisitetsanalyser og proliferasjonsanalyser, slik dette er detaljert beskrevet i for eksempel alexander et al., Immunity, 1:751-761, 1994.

For å bekrefte kapasiteten til en DNA-minigenkonstruksjon som inneholder minst et HLA-A2-supermotivpeptid i å indusere CTLer in vivo, blir for eksempel HLA-A2.1/K<b>transgene mus, for eksempel immunisert intramuskulært med 100 ng nakent cDNA. For å kunne sammeligne nivået av CTLer som er indusert ved cDNA-immunisering, blir en kontrollgruppe av dyr også immunisert med et faktisk peptidpreparat som omfatter flere epitoper syntetisert som et enkelt polypeptid slik de vil være kodet for av minigenet.

Splenocytter fra immuniserte dyr blir stimulert 12 ganger med hver av de respektive preparatene (peptidepitoper kodet for i minigenet eller polyepitoppeptidet), deretter analysert for peptidspesifikk cytotoksisk aktivitet i en<51>Cr-frigjøringsanalyse. Resultatene indikerer omfanget av CTL-responsen som er rettet mot den A2-begrensede epitopen, og indikerer slik in wVo-immunogenisiteten for minigenvaksinen og polyepitopvaksinen.

Det er derfor funnet at minigenet utløser immunresponser som er rettet mot HLA-A2-supermotivpeptidepitopene og det gjør også polyepitoppeptidvaksinen. En lignende analyse ble også utført ved å anvende andre HLA-A3- og HLA-B7-transgene musemodeller for å undersøke CTL-induksjon ved HLA-A3- og HLA-B7-motivepitoper eller -supermotiv epitoper, hvorved det også blir funnet at minigenet utløser passende immunresponser rettet mot de tilveiebrakte epitopene.

For å bekrefte kapasiteten for et klasse-II-epitopkodende minigen i å induere HTLer in vivo, blir DR-transgene mus, eller for de epitoper som kryssreagerer med det passende muse-MHC-molekylet, I-Ab<->begrensede mus, immunisert intramuskulært med 100 ng med plasmid-DNA. For å sammenligne nivået av HTLer som blir indusert ved DNA-immunisering, blir en gruppe kontrolldyr også immunisert med det faktiske peptidpreparatet emulgert i komplett Freunds adjuvans. CD4+-T-celler, dvs. HTLer, blir renset fra splenocytter fra immuniserte dyr og stimulert med hvert av de respektive preparatene (peptider som er kodet for i minigenet). HTL-responsen blir målt ved å anvende en<3>H-tymidininkorporerings proliferasjonsanalyse (se f. eks. Alexander et al., Immunity, 1:751-761, 1994). Resultatene indikerer omfanget av HTL-responsen og viser slik in wVo-immunogenisitet til minigenet.

DNA-minigener, konstruert som beskrevet i det tidligere eksempelet, kan også bli bekreftet som en vaksine i kombinasjon med et boosting-middel ved å anvende en prime-boost-protokoll. Boostingmiddelet kan bestå av rekombinant protein (for eksempel Barnett et al., Aids Res. And Human Retroviruses 14, Supplement, 3:S299-S309, 1998) eller rekombinant vaksine, som for eksempel uttrykker et minigen eller DNA som koder for et fullstendig protein av interesse (se f. eks. Hanke et al., Vaccine, 16:439-445, 1998, Sedegah et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 95:7648-53, 1998, Hanke og McMichael, Immunol. Letters, 66:177-181, 1999, og Robinson et al., Nature Med., 5:526-34, 1999).

For eksempel blir effektiviteten til DNA-minigenet som blir benyttet i en prime-boost-protokoll i første omgang evaluert i transgene mus. I dette eksempelet blir A2.1/K<b->transgene mus immunisert IM med 100 ng av et DNA-minigen som koder for de immunogene peptidene inkludert minst et HLA-A2-supermotivbærende peptid. Etter en inkuberingsperiode (strekker seg fra 3 til 9 uker) blir musene boostet IP med IO<7>pfu/mus med et rekombinant vacciniavirus som uttrykker den samme sekvensen som er kodet for DNA-minigenet. Kontrollmus ble immunisert med 100 n9DNA eller rekombinant vaccinia uten minigensekvensen, eller med DNA som koder for minigenet, men uten vaccinia boostingen. Etter en ytterligere inkuberingsperiode på 2 uker blir splenocytter fra musene straks analysert for peptidspesifikk aktivitet i en ELISPOT analyse. I tillegg blir splenocytter stimulert in vitro med de A2-begrensede peptidepitopene som er kodet for i minigenet og rekombinant vaccinia, deretter analysert for peptidspesifikk aktivitet i en alfa-, beta-og/eller gamma-IFN-ELISA.

Det er funnet at minigenet som blir benyttet i prime-boost protokollen utløser større immunresponser mot HLA-Al-supermotivene enn med DNA alene. En slik analyse kan også bli utført ved å anvende HLA-A11- eller HLA-B7-transgene musemoddeller for å undersøke CTL-induksjon ved HLA-A3- eller HLA-B7-motiv epitoper eller -supermotiv epitoper. Anvendelsen av prime-boost protokoller hos mennesker er beskrevet nedenfor i eksempelet med tittelen "induksjon av CTL-responser ved å anvende en prime-boost-protokoll".

Eksempel 16: Polyepitop vaksinepreparater fra flere antigener

STEAP-l-peptidepitopene ifølge foreliggende beskrivelse ble benyttet sammen med epitoper fra andre måltumorassosierte antigener for å danne et vaksinepreparat som er nyttig i forebyggingen eller behandlingen av kreft som uttrykker STEAP-1 og slike andre antigener. For eksempel kan et vaksinepreparat bli tilveiebrakt som et enkelt polypeptid som inkorporerer flere epitoper fra STEAP-1 i tillegg til tumorassosierte antigener som ofte blir uttrykt med en målkreft som er assosiert med STEAP-l-ekspresjon, eller kan bli administrert som et preparat som omfatter en cocktail av én eller flere bestemte epitoper. Alternativt kan vaksinen bli administrert som en minigenkonstruksjon eller som dendrittiske celler som har blitt ladd med peptidepitopene in vitro.

Eksempel 17: Anvendelse av peptider for å evaluere en immunrespons

Peptider ifølge beskrivelsen kan bli benyttet til å analysere en immunrespons for tilstedeværelsen av spesifikke antistoffer, CTL eller HTL rettet mot STEAP-1. En slik analyse kan bli utført på en måte som er beskrevet av Ogg et al., Science, 279:2103-2106, 1998. I dette eksempelet blir peptider benyttet som et reagens for diagnostiske eller prognostiske hensikter, ikke som et immunogen.

I dette eksempelet blir svært sensitive humane leukocytt antigen tetramere komplekser ("tetramerer") benyttet til en krysseksjonsanalyse av for eksempel STEAP-1-HLA-A<*>0201-spesifikke CTL-frekvenser fra HLA-A<*>201-positive individer ved ulike stadier av sykdom eller etter immunisering som omfatter et STEAP-1-peptid inneholdende et A<*>0201-motiv. Tetramere komplekser blir syntetisert som beskrevet (Musey et al., N. Engl. J. Med., 337:1267, 1997). Kort fortalt blir renset HLA-tungkjede (A<*>0201 i dette eksempelet) og p2-mikroglobulin syntetisert ved hjelp av et prokaryot ekspresjonssystem. Tungkjeden blir modifisert ved delesjon av transmembran-cytosolhalen og COOH-terminal addisjon av en sekvens som inneholder et BirA-enzymatisk biotinyleringssete. Tungkjeden, p2-mikrogobulin og peptid blir reflodet ved fortynning. Det refollede produktet på 45 kD blir isolert ved hjelp av rask flytende proteinkromatografi og deretter biotinylert ved BirA i nærvær av biotin (Sigma, St. Louis, Missouri), adenosin-5'-trifosfat og magnesium. Streptavidin-fykoerytrinkonjugat blir tilsatt i et molart forhold på 1:4 og det tetramere produktet blir konsentrert til 1 mg/ml. Det resulterende produktet blir referert til som tetramer-fykoerytrin.

For analysen av pasientblodprøver blir omtrent 1 million PBMC sentrifugert ved 300 g i 5 minutter og resuspendert i 50 ni kald fosfatbufret fysiologisk saltløsning. Tri-fargeanalyse ble utført med tetramer-fykoerytrin, sammen med anti-CD8-trikolor og anti-CD38. PBMCene ble inkubert med tetramer og antistoffer på is i 30-60 minutter og deretter vasket to ganger før formaldehydfiksering. Grenser ble benyttet slik at de inneholder

>99,98% av kontroll prøve r. Kontroller for tetramerene inkluderer både A<*>0201-negative individer og A<*>0201-positive ikke-sykdomsrammede donorer. Prosentandelen av celler som

er farget med tetrameren blir deretter bestemt ved hjelp av flow cytometri. Resultatene indikerer antallet celler i PBMC-prøven som inneholder epitopbegrensede CTLer, for derved enkelt å indikere omfanget av immunresponsen ovenfor STEAP-1-epitopen og slik statusen for eksponering ovenfor STEAP-1, eller eksponering ovenfor en vaksine som utløser en beskyttende terapeutisk respons.

Eksempel 18: Induksjon av immunresponser ved å anvende en prime-boost-protokoll

En prime-boost-protokoll som er lignende i sitt underliggende prinsipp i forhold til den som ble benyttet til å bekrefte effektiviteten for en DNA-vaksine hos transgene mus, slik som beskrevet ovenfor i eksempelet med tittelen "Plasmidkonstruksjon og graden dette induserer immunogenisitet", kan også bli benyttet til administreringen av vaksinene til mennesker. Et slikt vaksineregime kan inkludere en første administrering av for eksempel nakent DNA etterfulgt av en boost ved å anvende rekombinant virus som koder for vaksine-eller det rekombinante proteinet/polypeptidet eller en peptidblanding administrerti i en adjuvans.

For eksempel kan den første immuniseringen bli utført ved å anvende en ekspresjonsvektor, slik som den som ble konstruert i eksempelet med tittelen "Konstruering av "Minigen"-multiepitop-DNA-plasmider" i formen av naken nukleinsyre administrert IM (eller SC eller ID) i mengdene på 0,5-5 mg på flere steder. Nukleinsyren (0,1 til 1000 ng) kan også bli administrert ved å anvende en genkanon. Etter en inkuberingsperiode på 3-4 uker blir en boosterdose administrert. Boosteren kan være rekombinant fuglekoppevirus administrert i en dose på 5xl0<7>til 5xl0<9>pfu. Et altenrativt rekombinant virus, slik som et MVA-virus, kanarikoppevirus, adenovirus eller adenoassosiert virus, kan også bli benyttet som boosteren, eller det polyepitope proteinet eller en blanding av peptidene kan bli administrert. For evaluering av vaksine effektivitet blir pasientblodprøver fremskaffet før immunisering i tillegg til ved intervaller etter administrering av den opprinnelige vaksinen og boosterdoser av vaksinen. Perifere blodmononukleære celler blir isolert fra friskt heparinisert blod ved hjelp av Ficoll-Hypaque-tetthetsgradientsentrifugering, fordelt i volumer i frysemedium og lagret frosne. Prøver blir analysert for CTL- og HTL-aktivitet.

Analyse av resultatene indikerer at en størrelse på respons som er tilstrekkelig til å oppnå en terapeutisk eller beskyttende immunitet mot STEAP-1 ble generert.

Eksempel 19: Komplementære polynukleotider

Sekvenser som er komplementære med de STEAP-1-kodende sekvensene, eller enhver del derav, blir benyttet for å påvise minskning, eller inhibere ekspresjon av naturlig forekommende STEAP-1. Selv om anvendelse av oligonukleotider som omfatter fra omtrent 15 til 30 basepar er beskrevet, blir omtrent den samme prosedyren benyttet med mindre eller med større sekvensfragmenter. Passende oligonukleotider ble designet ved å anvende for eksempel OLIGO 4.06-programvare (National Biosciences) og den kodende sekvensen for STEAP-1. For å inhibere transkripsjon blir et komplementært oligonukleotid designet fra den mest unike 5' sekvensen og benyttet for å forhindre promotorbinding til den kodende sekvensen. For å inhibere translasjon blir et komplememtært oligonukleotid designet for å forhindre ribosomal binding til et STEAP-1-kodende transkript.

Eksempel 20: Rensing av naturlig forekommende eller rekombinant STEAP-1 ved å anvende STEAP-1-spesifikke antistoffer

Naturlig forekommende eller rekombinant STEAP-1 blir vensentlig renset ved hjelp av immunaffinitetskromatografi ved å anvende antistoffer som er spesifikke for STEAP-1. En immunaffinitetskolonne blir konstruert ved kovalent å koble anti-STEAP-l-antistoff til et aktivert kromatografisk resin, slik som CNBr-aktivert Sefarose (Amersham Pharmacia Biotech). Etter koblingen blir resinet blokkert og vasket i overensstemmelse med produsentens instruksjoner.

Medium inneholdende STEAP-1 blir passert over immunaffinitetskolonnen og kolonnen blir vasket ved betingelser som tillater den ønskede absorbansen av STEAP-1 (for eksempel buffere med høy ionestyrke i nærvær av detergent). Kolonnen blir eluert ved betingelser som ødelegger antistoff/STEAP-l-binding (for eksempel en buffer med pH 2 til pH 3, eller en høy konsentrasjon av en kaotrop, slik som urea eller tiocyanation) og GCR.P blir samlet opp.

Eksempel 21: Identifisering av molekyler som interagerer med STEAP-1

STEAP-1 eller biologisk aktive fragmenter derav, blir merket med 121 1 Bolton-Hunter-reagens (se f. eks. Bolton et al. (1973) Biochem. J., 133-529). Kandidatmolekyler som tidligere er satt opp i brønnene i en multibrønners plate ble inkubert med det merkede STEAP-1, vasket, og enhver brønn med merket STEAP-l-kompleks ble analysert. Data som er fremskaffet ved å anvende ulike konsentrasjoner av STEAP-1 ble benyttet til å beregne verdier for antallet, affiniteten og assosieringen av STEAP-1 med kandidatmolekylene.

Eksempel 22: In wVo-analyse for STEAP-1-tumorvekst fremming

Effekten av STEAP-l-proteinet på tumorcellevekst blir evaluert in vivo ved å evaluere tumorutvikling og vekst av celler som uttrykker eller som mangler STEAP-1. For eksempel blir SCID-mus injisert subkutant på hver flanke med 1 x IO<6>med enten 3T3- eller prostatakreftcellelinjer (for eksempel PC3-celler) inneholdende tkNeo tom vektor eller STEAP-1. Minst to strategier kan bli benyttet: (1) Konstitutiv STEAP-1-ekspresjon under regulering av en promotor slik som en konstitutiv promotor som er fremskaffet fra genomet til virus slik som polyomavirus, fuglekoppevirus (UK 2 211 504, publisert 5. juli, 1989), adenovirus (slik som adenovirus-2), bovint papillomvirus, fuglesarkomvirus, cytomegalovirus, et retrovirus, hepatitt-B-virus og apevirus-40 (SV40) eller fra heterologe pattedyrpromotorer, foreksempel aktin promotoren eller en immunglobulinpromotor, gitt at slike promotorer er kompatible med vertscellesystemer, og (2) Regulert ekspresjon under kontroll av et induserbart vektorsystem, slik som ekdyson, tetrasyklin osv., gitt at slike protmotorer er kompatible med vertescellesystemene. Tumorvolum ble deretter overvåket ved målepasse målinger ved fremkomsten av tydelige tumorer og fulgt over tid for å bestemme om STEAP-l-uttrykkende celler vokser hurtigere og hvorvidt tumorer som blir produsert av STEAP-l-uttrykkende celler viser karakteristika med endret aggressivitet (for eksempel forsterket metastase, vaskularisering, redusert responsivitet ovenfor kjemoterapeutiske legemidler).

I tillegg kan mus bli implantert med 1 x IO<5>av de samme cellene ortotopisk for å bestemme om STEAP-1 har en effekt på lokal vekst i prostata, og hvorvidt STEAP-1 påvirker evnen til cellene i å metastasere, spesifikt til lymfeknuter og ben (Miki T. et al., Oncol Res., 2001, 12:209, Fu X et al., Int J Cancer, 1991, 49:938). Effekten av STEAP på bentumordannelse og vekst kan bli undersøkt ved å injisere prostatatumorceller intratibialt.

Analysen er også nyttig for å bestemme den STEAp-l-inhibitoriske effekten for kandidatterapeutiske preparater, slik som for eksempel STEAP-l-intralegemer, STEAP-l-antisens molekyler og ribozymer.

Eksempel 23: STEAP-1 monoklonalt antistoffmediert inhibering av tumorer in vivo

Den signifikante ekspresjonen av STEAP-1 i kreftvev og overflatelokaliseringen, sammen med dens begrensende ekspresjon i normale vev gjør STEAP-1 til et godt mål for antistoffterapi. Likeledes er STEAP-1 et mål for T-cellebasert immunterapi. Slik blir den terapeutiske effektiviteten til anti-STEAP-l-MAb i humane prostatakreft xenograft musemodeller evaluert ved å anvende rekombinante cellelinjer slik som PC3-STEAP-1 og 3T3-STEAP-1 (se f. eks. Kaighn, M.E. et al., Invest Uroi., 1979, 17(1): 16-23), i tillegg til humane prostata xenograftmodeller slik som LAPC 9AD (Saffran et al., PNAS, 1999, 10:1073-1078).

Antistoffeffektivitet på tumorvekst og metastasedannelse blir undersøkt, for eksempel i en museortotopisk prostatakreft xenograftmodell. Antistoffene kan være ukonjugerte, som diskutert i dette eksempelet, eller de kan være konjugert til en terapeutisk modalitet, slik det er åpenbart på fagområdet. Anti-STEAP-l-MAb inhiberer dannelse av både lunge- og prostata xenografter. Anti-STEAP-MAb hemmer også veksten av etablerte ortotopiske tumorer og forlenger overlevelse hos tumorbærende mus. Disse resultatene indikerer anvendeligheten av anti-STEAP-l-MAb i behandlingen av lokal prostatakreft og prostatakreft med fremskredent stadium. (Se f. eks. Saffran, D, et al., PNAS, 10:1073-1078 eller internett-URL pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.051624698).

Administrering av anti-STEAP-l-MAb fører til hemming av etablert ortotopisk tumorvekst og inhibering av metastaser på fjerne steder, noe som fører til en vesentlig forlengning i overlevelsen for tumorbærende mus. Disse undersøkelsene tyder på at STEAP-1 er et attraktivt mål for immunterapi og viser det terapeutiske potensialet for anti-STEAP-l-MAb i behandlingen av lokal og metastatisk prostatakreft. Dette eksempelet viser at ukonjugerte monoklonale STEAP-l-antistoffer er effektive i å inhibere veksten av humane prostatatumor xenografter som er dyrket i SCID-mus, og som følge av dette er en kombinasjon av slike effektive monoklonale antistoffer også effektive.

Tumorinhiberinq ved å anvende flere ukonjugerte STEAP- l- MAb

Materialer og Fremgangsmåter

Monoklonale STEAP-1-antistoffer:

Monoklonale antistoffer blir frembrakt mot STEAP-1 som beskrevet i eksempelet med tittelen "Generering av monoklonale STEAP-l-antistoffer (MAb)". Antistoffene blirkarakterisert vedhjelp av ELISA, Western blotting, FACS og immunpresipitering for deres evne til å binde STEAP-1. Epitopkartleggingsdata for anti-STEAP-l-MAb, som bestemt ved hjelp av ELISA og Western-analyse, gjenkjenner epitoper på STEAP-l-proteinet. Immunhistokjemisk analyse av prostatakrefvev og celler med disse antistoffene blir utført.

De monoklonale antistoffene blir renset fra ascites eller hybridomvevskultur supernatanter ved hjelp av protein-G-sefarosekromatografi, dialysert mot PBS, filtersterilisert og lagret ved -20°C. Protein bestem meise ble utført ved hjelp av en Bradford-analyse (Bio-Rad, Hercules, CA). Et terapeutisk monoklonalt antistoff eller en cocktail som omfatter en blanding av individulle monoklonale antistoffer blir fremstilt og benyttet til behandlingen av mus som mottar subkutane eller ortotopiske injeksjoner av UM-UC3- og Ca Lu 1-tumorxenog rafter.

Cellelinjer og Xenografter

Prostatakreft cellelinjene, PC3- og LNCaP-cellelinjer i tillegg til fibroblast cellelinje NIH 3T3 (American Type Culture Collection) ble opprettholdt i henholdsvis RPMI og DMEM, tilsatt L-glutamin og 10% FBS.

PC3-STEAP-1- og 3T3-STEAP-l-cellepopulasjoner blir generert ved hjelp av retrovirusgenoverføring som beskrevet i Hubert, R.S., et al., Proe nati Acad Sei, USA, 1999, 96(25): 14523.

LAPC-9-xenograften, som uttrykker en villtype androgen reseptor og produserer prostataspesifikt antigen (PSA), blir passert hos 6- til 8 uker gamle ICR-alvorlige, kombinerte, immunmanglende (SCID) hannmus (Taconic Farms) ved hjelp av s.c. trokarimplantat (Craft, N. et al., Nat. Med., 1999, 5:280). Enkeltcelle suspensjoner av LAPC-9-tumorceller blir fremstilt som beskrevet i Craft et al.

Xenoqraft musemodeller

Subkutane (s.c.) tumorer blir generert ved injeksjon av 1 x IO6 kreftceller blandet ved en fortynning på 1:1 med Matrigel (Collaborative Research) i den høyre flanken på SCID-hannmus. For å teste antistoffeffektivitet på tumordannelse, dvs. antistoff injeksjoner blir startet på den samme dagen som tumorcelleinjeksjoner. Som en kontroll blir mus injisert med enten renset muse-IgG (ICN) eller PBS, eller et renset monoklonalt antistoff som gjenkjenner et irrelevant antigen som ikke blir uttrykt på humane celler. I preliminære undersøkelser ble ingen forskjell funnet mellom muse-IgG eller PBS på tumorvekst. Tumorstørrelser blir bestemt ved hjelp av målepasser målinger, og tumorvolumet blir beregnet som lengden x bredden x høyden. Mus med subkutane tumorer som er større enn 1,5 cm i diameter blir avlivet.

Ortotopiske injeksjoner blir utført under anestesi ved å anvende ketamin/xylazin. For prostata ortotopiske undersøkelser blir et snitt gjort gjennom magen for å eksponere prostata og LAPC- eller PC3-tumorceller (5 x IO<5>) blandet med Matrigel blir injisert inn i prostatakapselen i et volum på 10 ni. For å overvåke tumorvekst blir mus palpert og blod blir samlet på en ukentlig basis for å måle PSA-nivåer. Musene blir delt i grupper for de passende behandlingene, med anti-STEAP-1- eller kontroll-MAb injisert i.p.

Anti- STEAP- l- MAb inhiberer vekst av STEAP- l- uttrvkkende xenoqraft krefttumorer

Effekten av anti-STEAP-l-MAb på tumordannelse blir testet ved å anvende LNCaP og LAPC9 ortotopiske modeller. Som sammenlignet med s.c.-tumormodellen fører den ortotopiske modellen, som krever injeksjon av tumorceller direkte inn i museprostata, i en lokal tumorvekst, utvikling av metastaser på fjerne steder, forverring av musehelse og påfølgende død (Saffran, D. et al., PNAS ovenfor). Egenskapene gjør den ortotopiske modellen mer representativ for human sykdomsprogresjon og tillog oss å følge den terapeutiske effekten av MAb på klinisk relevante endepunkter.

Tumorceller blir injisert inn i museprostata og 2 dager senere blir musene fordelt i to grupper og behandlet med enten: a) 200-500 ng med anti-STEAP-l-Ab eller b) PBS tre ganger per uke i to til fem uker.

En hovedfordel med den ortotopiske kreftmodellen er evnen til å undersøke utviklingen av metastaser. Dannelse av metastaser hos mus som bærer etablerte ortotopiske tumorer blir undersøkt ved hjelp av IHC-analyse på lungeseksjoner ved å anvende et antistoff mot et tumorspesifikt celleoverflateprotein slik som anti-CK20 for prostatakreft (Lin S et al., Cancer Detect Prev., 2001, 25:202).

Et annet fortrinn ved xenograft kreftmodeller er evnen til å kunne undersøke neovaskularisering og angiogenese. Tumorvekst er delvis avhengig av utviklingen av nye blodkar. Selv om kapillærsystemet og utviklende blodnettverk er av vertsopphav, blir initieringen og oppbygningen av neovaskulaturet regulert av xenograft tumoren (Davidoff AM et al., Clin Cancer Res., 2001, 7:2870, Solesvik O. et al., Eur J Cancer Clin Oncol., 1984, 20:1295). Effekten av antistoff og små molekyler på neovaskularisering er undersøkt i overensstemmelse med prosedyrer som er kjent på fagområdet, slik som ved IHC-analyse av tumorvev og deres omkringliggende mikromiljø.

Mus som bærer etablerte ortotopiske tumorer blir administrert 1000 ng injeksjoner med enten anti-STEAP-l-MAb eller PBS over en 4-ukers periode. Mus i begge grupper blir tillatt å etablere en høy tumorbyrde for å sikre en høy hyppighet av metastasedanneise i muselunger. Mus ble deretter avlivet og deres blære, levere, ben og lunger blir analysert for tilstedeværelsen av tumorceller ved hjelp av IHC-analyse. Disse undersøkelsene viser en bred anti-tumor effektivitet for anti-STEAP-l-antistoffer på initiering og progresjon av prostatakreft i xenograft musemodeller. Anti-STEAP-l-antistoffet inhiberer tumordannelse for tumorer i tillegg til å hemme veksten av allerede etablerte tumorer og forlenger overlevelsen hos behandlede mus. Videre viser anti-STEAP-l-MAb en dramatisk inhibitorisk effekt på spredningen av lokal prostatatumor til fjerne steder, til og med i nærvær av en stor tumorbyrde. Slik er anti-STEAP-l-MAb effektive på viktige klinisk relevante endepunkter (tumorvekst), forlengning av overlevelse og helsetilstand.

Effekt av STEAP- l- MAb på veksten av humane prostatakreftxenoqrafter hos mus

ICR-SCID-hannmus, 5-6 uker gamle (Charles River Laboratory, Wilmington, MA) ble benyttet. Musene ble opprettholdt i et kontrollert miljø ved å anvende protokollene som er fremlagt i NIH-Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. En LAPC-9AD-androgenavhengig human prostatakrefttumor ble benyttet for å etablere xenograftmodeller. Stock-tumorer regulert opprettholdt hos SCID-mus ble sterilt dissektert, oppmalt og fordøyd ved å anvende Pronase (Calbiochem, San Diego, CA). Cellesuspensjoner som ble generert ble inkubert over natt ved 37°C for å oppnå en homogen enkeltcellesuspensjon.

STEAP-1-M2/92.30 og M2/120.545 ble testet ved to ulike doser på 100 ng og 500 ng. PBS og anti-KLH-MAb ble benyttet som kontroller. Undersøkelsessamlingen bestod av 6 grupper med 10 mus i hver gruppe. MAb ble dosert IP to ganger i uken med totalt 12 doser, ved å starte på den samme dagen som tumorcelleinjeksjon.

Tumorstørrelse ble overvåket ved hjelp av målepassermålinger to ganger i uken. Den lengste dimensjonen (L) og dimensjonen nitti grader på denne (W) ble tatt for å beregne tumorvolum ved å anvende formelen: W<2>x L/2. Serum-PSA-konsentrasjon ved behandlingsdag 40 for hvert dyr ble målt ved å anvende kommersielt ELISA-sett. Kruskal-Wallis-testen og Mann-Whitney-U-testen ble benyttet for å evaluere forskjeller i tumorvekst og PSA-nivå i gruppene. Alle tester var tosidede med å = 0,05.

Resultatene av eksperimentet som er fremlagt ifølge Figur 26 og Figur 27 viser at STEAP-1-M2/92.30 og -M2/120.545 signifikant hemmer veksten av humant prostata xenograft på en doseavhengig måte.

Eksempel 24: Terapeutisk og diagnostisk anvendelse av anti-STEAP-l-antistoffer hos mennesker

Monoklonale anti-STEAP-l-antistoffer blir trygt og effektivt benyttet til diagnostiske, profylaktiske, prognostiske og/eller terapeutiske formål hos mennesker. Western-blott- og immunhistokjemisk analyse av kreftvev og kreft xenografter med anti-STEAP-l-MAb viser sterk omfattende farging i karsinom, men vesentlig lavere eller upåvisbare nivåer i normale vev. Påvisning av STEAP-1 i karsinom og i metastatisk sykdom viser nyttigheten av MAb som en diagnostisk og/eller prognostisk indikator. Anti-STEAP-l-antistoffer blir derfor benyttet i diagnostiske applikasjoner slik som immunhistokjemi av nyrebiopsiprøver for å påvise kreft fra mistenkte pasienter.

Som bestemt ved hjelp av flow cytometri binder anti-STEAP-l-MAb til karsinomceller. Slik blir anti-STEAP-l-antistoffet benyttet i diagnostiske applikasjoner for synliggjøring av hele kroppen, slik som radioimmunscintigrafi og radioimmunterapi (se f. eks. Potamianos S., et al., Anticancer Res 20(2A):925-948 (2000)) til påvisningen av lokaliserte og metastatiske kreftformer som oppviser ekspresjon av STEAP-1. Avbrytning eller frigjøring av et ekstracellulært domene for STEAP-1 inn i det ekstracellulære miljøet, slik som det blir sett for alkalisk fosfodiesterase B10 (Meerson, N.R., Hepatology, 27:563-568 (1998)) tillater diagnostisk påvisning av STEAP-1 ved hjelp av anti-STEAP-l-antistoffer i serum og/eller urinprøver fra utsatte pasienter.

Anti-STEAP-l-antistoffer som spesifikt binder STEAP-1 blir benyttet i terapeutiske applikasjoner til behandlingen av kreftformer som uttrykker STEAP-1. Anti-STEAP-l-antistoffer blir benyttet som en ukonjugert modalitet og som konjugert form der antistoffene er bundet til én eller flere terapeutiske modaliteter eller synliggjørings-modaliteter som er velkjente på fagområdet, slik som et prolegemiddel, enzymer eller radioisotoper. I prekliniske undersøkelser blir ukonjugerte og konjugerte anti-STEAP-l-antistoffer testet for effektivitet på tumorforebygging og vekstinhibering i SCID-musekreft xenograftmodellene, for eksempel nyrekreft modellene AGS-K3 og AGS-K6 (se f. eks. eksempelet med tittelen "Monoklonale STEAP-l-antistoffmediert inhibering av blære- og lungetumorer in vivo"). Enten konjugerte eller ukonjugerte blir anti-STEAP-1-antistoffet benyttet som en terapeutisk modalitet i humane kliniske utprøvinger, enten alene eller i kombinasjon med andre behandlinger som beskrevet i de følgende eksemplene.

Eksempel 25: Humane kliniske utprøvninger for behandlingen og diagnostiseringen av humane karsinomer via anvendelsen av humane anti-STEAP-l-antistoffer in vivo

Antistoffer blir benyttet i overensstemmelse med foreliggende oppfinnelse som gjenkjenner en epitop på STEAP-1, og blir benyttet i behandlingen av visse tumorer slik som de som er fremlagt ifølge Tabell I. Basert på et antall faktorer, inkludert STEAP-1-ekspresjonsnivåer, er tumorer slik som de som er fremlagt ifølge Tabell I per i dag foretrukne indikasjoner. I sammenheng med hver av disse indikasjonene blir tre kliniske tilnærminger vellykket fulgt. I. ) Tilleggsterapi: I tilleggsterapi blir pasienter behandlet med anti-STEAP-l-antistoffer i kombinasjon med et kjemoterapeutisk eller antineoplastisk middel og/eller strålingsterapi. Primære kreftmål, slik som de som er fremlagt ifølge Tabell I, blir behandlet under standard protokoller ved tilsetning av anti-STEAP-l-antistoffer til standard førstelinje terapi og andrelinje terapi. Protokolldesign adresserer effektivitet som vurdert ved reduksjon i tumormasse i tillegg til evnen til å redusere vanlige doser med standard kjemoterapi. Disse doseringsreduksjonene tillater ytterligere og/eller forlenget terapi ved å redusere doserelatert toksisitet av det kjemoterapeutiske middelet. Anti-STEAP-1-antistoffet blir benyttet i flere tilleggskliniske utprøvninger i kombinasjon med de kjemoterapeutiske eller antineoplastiske midlene adriamycin (fremskredent prostata-karsinom), cisplatin (fremskrede hode, nakke og lungekarsinomer), taxol (brystkreft) og doksorubicin (preklinisk). II. ) Monoterapi: I sammenheng med anvendelsen av anti-STEAP-l-antistoffene ved monoterapi av tumorer blir antistoffene administrert til pasienter uten et kjemoterapeutisk eller antineoplastisk middel. I et eksempel blir monoterapi utført klinisk på pasienter i siste stadium av kreft med omfattende metastatisk sykdom. Pasienter viser noe sykdomsstabilisering. Utprøvninger viser en effekt på refraktoriske pasienter med krefttumorer. III. ) Avbildingsmiddel: Via binding av et radionuklid (for eksempel jod eller yttrium (I<131>, Y<90>) til anti-STEAP-l-antistoffer blir de radiomerkede antistoffene benyttet som et diagnostisk og/eller avbildingsmiddel. I en slik rolle lokaliseres de merkede anti-stoffene til både faste tumorer i tillegg til metastatiske lesjoner av celler som uttrykker STEAP-1. I sammenheng med anvendelsen av anti-STEAP-1-antistoffene som avbildingsmidler blir antistoffene benyttet som et tillegg til kirurgisk behandling av faste tumorer, siden både en pre-kirurgisk screening i tillegg til en post-operativ oppfølgning for å bestemme hvilke tumorer som er igjen og/eller vender tilbake. I ett eksempel blir (<m>In)-STEAP-l-antistoff benyttet som et avbildingsmiddel i en fase-I Humant klinisk studium på pasienter som har et karsinom som uttrykker STEAP-1 (for analogi se f. eks. Divigi et al., J. Nati. Cancer Inst., 83:97-104 (1991)). Pasienter blir fulgt med standard anterior og posterior gamma-kamera. Resultatene indikerer at primære lesjoner og mestastatiske lesjoner blir identifisert.

Dose og administrerinqsmåte

Som åpenbart for fagfolk på området kan doseringesoverveiinger bli bestemt ved hjelp av sammenligning med de analoge produktene som foreligger på klinikken. Slik kan anti-STEAP-l-antistoffer bli administrert med doser i området fra 5 til 400 mg/m<2>, der de lavere dosene for eksempel benyttes i sammenheng med sikkerhetsundersøkelser. Affiniteten for anti-STEAP-l-antistoffer relativt i forhold til affiniteten for et kjent antistoff for dets mål er en parameter som blir benyttet av fagfolk på området for å bestemme analoge doseringsregimer. Videre har anti-STEAP-l-antistoffer som er fult humane antistoffer, sammenlignet med det kimere antistoffet, lavere uttømming, og i overensstemmelse med dette kan dosering hos pasienter med slike fult humant anti-STEAP-antistoffer være lavere, kanskje i området på 50 til 300 mg/m<2>, og fremdeles forbli effektive. Dosering i mg/m<2>, i motsetning til den konvensjonelle målingen av dose i mg/kg, er et mål basert på overflateareal og er et hensiktsmessig doseringsmål som er designet for å inkludere pasienter av alle størrelse fra barn til voksne.

Tre forskjellige leveringstilnærminger er nyttige for levering av anti-STEAP-l-antistoffer. Konvensjonell intravenøs levering er en standard leveringsteknikk for mange tumorer. I sammenheng med tumorer i det peritoneale hulrommet, slik som tumorerer i ovariene, gallekanalen, eller andre kanaler og lignende, kan likevel intraperitoneal administrering vise seg fordelaktig for å oppnå høy dose med antistoff på tumoren også for å minimalisere antistoffuttømming. På en tilsvarende måte innehar visse faste tumorer vaskulatur som er hensiktsmessig for regional perfusjon. Regional perfusjon tillater en høy dose av antistoff på stedet med en tumor og minimaliserer korttidsuttømming av antistoffet.

Klinisk utviklingsplan ( CDP)

Oppsummering: CDP følger og utvikler behandlinger med anti-STEAP-l-antistoffer

i sammenheng med tilleggsterapi, monoterapi og som et avbildingsmiddel. Utprøvninger viser i første omgang trygghet og bekrefter deretter virkningen i gjentatte doser. Utprøvninger er åpne og sammenligner standard kjemoterapi med standard terapi pluss anti-STEAP-l-antistoffer. Ett kriterium som kan bli benyttet i sammenheng med innrullering av pasienter er STEAP-l-ekspresjonsnivåer i deres tumorer som bestemt ved hjelp av biopsi.

Slik som for ethvert protein eller antistoff infusjonsbasert terapeutisk middel, er sikkerhetsoverveielser primært relatert til (i) cytokin frigjøringssyndrom, dvs. hypotensjon, feber, skjelving, frysninger, (ii) utviklingen av en immunogen respons ovenfor materialet (dvs. utvikling av humane antistoffer av pasienten mot det terapeutiske antistoffet eller HAHA-respons), og (iii) toksisitet ovenfor normale celler som uttrykker STEAP-1. Standardtester og oppfølgning ble benyttet for å overvåke hver av disse sikkerhets-overveielsene. Anti-STEAP-l-antistoffer er funnet å være trygge ved human administrering.

Eksempel 26: Humant klinisk studium: Monoterapi med humant anti-STEAP-1-an ti stoff

Anti-STEAP-l-antistoffer er trygge i sammenheng med den ovenfor diskuterte tilleggsutprøvingen, en human Fase-II-klinisk utprøvning bekrefter sikkerheten og optimalisering for monoterapi. Slike utprøvninger blir utført, og omfatter de samme sikkerhetsanalysene og utkomme analysene, med den ovenfor beskrevne tilleggsutprøvningen med det unntaket at pasienter ikke mottar kjemoterapi sammen med mottaker av doser med anti-STEAP-l-antistoffer.

Eksempel 27: Humant klinisk studium: Diagnostisk synliggjøring med anti-STEAP-1-antistoff

Igjen er tilleggsterapien som er beskrevet ovenfor trygg innenfor sikkerhets-kriteriene som er diskutert ovenfor, et humant klinisk studium blir utført som gjelder anvendelsen av anti-STEAP-l-antistoffer som et diagnostisk avbildingsmiddel. Protokollen er designet på en vesentlig tilsvarende måte som de som er beskrevet på fagområdet, slik som Divgi et al., J. Nati. Cancer Inst., 83:97-104 (1991). Antistoffene er funnet å være både trygge og effektive når de blir benyttet som en diagnostisk modalitet.

Eksempel 28: Humant klinisk studium: Tilleggsterapi med humant anti-STEAP-1-antistoff og kjemoterapeutisk terapi, strålingsterapi og/eller hormon ablasjonsterapi

Et humant fase-I-klinisk studium blir startet for å undersøke tryggheten for seks intravenøse doser med et humant anti-STEAP-l-antistoff i sammenheng med behandlingen av en fast tumor, f. eks. en kreftform i et vev som er fremlagt i Tabell I. I studien blir sikkerheten for enkeltdoser med anti-STEAP-l-antistoffer, når de blir benyttet som tilleggsterapi med et antineoplastisk eller kjemoterapeutisk middel eller hormonablasjons-middel som definert her, slik som: cisplatin, topotekan, doksorubicin, adriamycin, taxol, Lupron, Zoladex, Eulexin, Casodex, Anandron og lignende, undersøkt. Studiedesignen inkluderer levering av seks enkeltdoser med anti-STEAP-l-antistoff med dosering av antistoff som eskalerer fra omtrent 25 mg/m<2>til omtrent 275 mg/m<2>i løpet av behandlingen i overensstemmelse med det følgende skjemaet:

Pasienter blir fulgt nært i en uke etter hver administrering av antistoff og kjemoterapi. Spesielt blir pasienter undersøkt for sikkerhetsmålene nevnt ovenfor: (i) cytokinfrigjøringssyndrom, dvs. hypotensjon, feber, skjelving, frysninger, (ii) utviklingen av en immungen respons ovenfor materialet (dvs. utvikling av humane antistoffer av pasienten mot det humane terapeutiske antistoffet, eller HAHA-respons) og (iii) toksisitet for normale celler som uttrykker STEAP-1. Standardtester og oppfølging blir benyttet for å overvåke hvert av disse sikkerhetsmålene. Pasienter ble også undersøkt for klinisk utkomme, og spesielt reduksjon i tumormasse slik dette blir målt ved hjelp av MRI eller annen avbilding.

Anti-STEAP-l-antistoffene er vist å være trygge og effektive, Fase-II-studier bekrefter virkningen og avgrenser optimal dosering.

Eksempel 29: Identifisering og bekreftelse av potensielle signaloverføringsveier

Mange pattedyrproteiner har blitt rapportert å interagere med signaliserings-molekyler og å delta i regulering av signaliseringsveier. (J Neurochem., 2001, 76:217-223). Spesielt fibronektin har blitt assosiert med MAPK-signaliseringskaskaden som kontrollere cellemitogenese (Jiang F, Jia Y, Cohen I., Blood, 2002, 99:3579). I tillegg inneholder STEAP-l-proteinet flere fosforyleringsseter (se Tabell XXI), noe som tyder på en assosiering med spesifikke signaliseringskaskader. Ved å anvende immunpresipiteringsteknikker og Western-blotting teknikker, blir proteinet identifisert som assosieres med STEAP-1 og som medierer signaliseringshendelser. Flere veier som er kjent å spille en rolle i kreftbiologi kan bli regulert ved STEAP-1, inkludert fosfolipidveier slik som PI3K, AKT osv., adhesjon- og migrasjonsveier, inkludert FAK, Rho, Rac-1, Ikatenin osv., i tillegg til mitogene/over-levelseskaskader slik som ERK, p38 osv. (Cell Growth Differ., 2000, 11:279, J. Biol. Chem., 1999, 274:801, Oncogene, 2000, 10:3003, J. Cell Biol., 1997, 138:913). For å bestemme hvorvidt ekspresjon av STEAP-1 er tilstrekkelig til å regulere spesifikke signaliseringsveier som ikke eller feilaktig i hvilkende PC3-celler ble effekten av disse genene på aktivieringen av p38-MAPK-kaskaden undersøkt i prostata kreftcel lei i njen PC3. Aktivering av p38-kinasen er avhengig av dens fosforylering på tyrosin- og serinrester. Fosforylert p38 kan bli fylt fra den ikke-fosforylerte tilstanden ved en fosfo-p38-MAb. Denne fosfospesifikke Ad ble benyttet for å undersøke fosforyleringstilstanden til p38 i endrede PC3-cellelinjer.

PC3-celler ble transfektert med neomycinresistensgene alene eller med STEAP-1 i pSRcc-vektor. Celler ble dyrket over natt i 0,5% FBS, deretter stimulert med 10% FBS i 5 minutter eller uten 10ng/ml MEK-inhibitor PD98058. Cellelysater ble skilt ved hjelp av 12,5% SDS-PAGE og Western-blottet med anti-fosfo-ERK (Celle Signaling) og anti-ERK (Zymed). NIH-3T3-celler ble transfektert med neomycinresistensgen alene, eller med STEAP-1 i pSRcc-vektor. Celler ble dannet som ovenfor, men uten MEK-inhibitoren. I tillegg ble NIH-3T3-neo-celler behandlet med 10 mg/ml Na-salicylat. Ekspresjon av STEAP-1 induserer fosforyleringen av ERK-1 og ERK-2 i serum og blir inhibert av oppstrøms-MEK-kinaseinhibitoren PD98058.

I et annet sett med eksperimenter ble tilstrekkeligheten av ekspresjon av STEAP-1 i prostatakreftcellelinjen PC3 i å aktivere den mitogene MAPK-veien, nemmelig ERK-kaskaden, undersøkt. Aktivering av ERK er avhengig av dens fosforylering på tyrosin- og serinrester. Fosforylert ERK kan bli skilt fra den ikke-fosforylerte tilstanden ved hjelp av en fosfo-ERK-MAb. Denne fosfospesifikke Ab ble benyttet for å undersøke fosforyleringstilstanden til ERK i endrede PC3-cellelinjer. PC3-celler, som uttrykker en aktivert form av Ras, ble benyttet som en positiv kontroll.

Resultatene viser at mens ekspresjon av kontroll-neo-genet ikke har noen effekt på ERK-fosforylering, er ekspresjon av STEAP-1 i PCR3-celler tilstrekkelig til å indusere en økning i ERK-fosforylering (Figur 28). Disse resultatene ble bekreftet ved å anvende anti-ERK-western-blotting og bekrefter aktiveringen av ERK-veien ved STEAP-1.

Siden FBS inneholder flere avdelinger som kan bidra til reseptormediert ERK-aktivering undersøker vi effekten av STEAP-1 i lave og optimale nivåer med FBS. PC3-celler som uttrykker neo- eller STEAP-1 ble dyrket i enten 0,1% eller 10% FBS over natt. Cellene ble analysert ved hjelp av anti-fosfo-ERK-western blotting. Dette eksperimentet viser at STEAP-1 induserer fosforyleringen av ERK i 0,1% FBS, og bekrefter at ekspresjon av STEAP-1 er tilstrekkelig til å indusere aktivering av ERK-signaliseringskaskaden i fravær av ytterligere stimuli.

For å bekrefte at STEAP-1 direkte eller indirekte aktiverer kjente signaloverførings-veier i celler, ble luciferase (luc)-baserte transkripsjonsreporteranalyser utført i celler som uttrykker individuelle gener. Disse transkripsjonsreporterne inneholder konsensus-bindingssete for kjente transkripsjonsfaktorer som ligger nedstrøms for vel karakteriserte signaloverføringsveier. Reporterne og eksemplene på disse assosierte transkripsjons-faktorene, signaloverføringsveiene og aktiveringsstimuli er fremlagt nedenfor.

1. NFkB-luc, NFkB/Rel, Ik-kinase/SAPK, vekst/apoptose/stress

2. SRE-luc, SFR/TCF/ELK1, MAPK/SAPK, vekst/differensiering

3. AP-l-luc, FOS/JUN, MAPK/SAPK/PKC, vekst/apoptose/stress

4. ARE-luc, androgen reseptor, sterioder/MAPK,

ve kst/d iffe re n s i e ri n g/a po ptose

5. p53-luc, p53, SAPK, vekst/differensiering/apoptose

6. CRE-luc, CREB/ATF2, PKA/p38, vekst/apoptose/stress

7. TCF-luc, TCF/Lef, i-katenin, adhesjon/invasjon

Genmedierte effekter kan bli analysert i celler som viser mRNA-ekspresjon. Luciverase reporterplasmider kan bli introdusert ved hjelp av lipidmediert transfeksjon (TFX-50, Promega). Luciferaseaktivitet, som er en indikator på relativ transkripsjons-aktivitet, ble målt ved inkubering av ce I lee kst rakte r med luciferinsubstrat og luminescens av reaksjonen blir overvåket i et luminometer.

Signaliseringsveier som blir aktivert av STEAP-1 blir kartlagt og benyttet til identifiseringen og valideringen av terapeutiske mål. Når STEAP-1 er involvert i cellesignalisering, blir den benyttet som mål for diagnostiske, prognostiske, preventive og/eller terapeutiske formål.

Eksempel 30: Involvering av STEAP-1 i små-molekyl transport og celle-celle-kommunikasjon

Celle-cell-kommunikasjon er essensielt i å opprettholde organintegritet og homeostase, der begge blir deregulert i løpet av tumordannelse og progresjon. Intercellulær kommunikasjon kan bli målt ved å anvende to typer analyser (J. Biol. Chem., 2000, 275:25207). I den første analysen blir celler ladd med fluorescent fargestoff inkubert i nærvær av umerkede mottakerceller og cellepopulasjoner blir undersøkt ved fluorescensmikroskopi. Denne kvalitative analysen måler endringen av fargestoff mellom tilliggende celler. I den andre analysen blir donorcellepopulasjoner og mottakercellepopulasjoner behandlet som ovenfor og kvantitative målinger av mottakercellepopulasjoner ble utført ved hjelp av FACS-analyse. Ved å anvende disse to analysesystemene blir cellene som uttrykker STEAP-1 sammenlignet med kontroller som ikke uttrykker STEAP-1, og det er funnet at STEAP-1 forsterker cellekommunikasjon. Figur 29 viser at STEAP-12 medierer overføringen av det lille molekylet kalcein mellom tilliggende celler, og derved regulerer celle-celle-kommunikasjon i prostata kreftceller. I dette eksperimentet ble mottaker-PC3-celler merket med dekstran-Texas rødt og donor-PC3-celler ble merket med kalcein-AM

(grønt). Donor (grønn) og mottaker (rød) celler ble dyrket ved 37°C og analysert ved hjelp av mikroskopi for ko-lokaliseringen av Texas rødt og kalcein. Resultatene viser at når PC3-kontrollceller (ingen påvisbar STEAP-l-proteinekspresjon) oppviser lite klaceinoverføring, så tillater ekspresjonen av STEAP-1 overføringen av små molekyler mellom celler, hvorved de opprinnelige røde mottakercellene får en brunaktig farge og ko-lokaliserer de røde og grønne molekylene. Små molekyler og/eller antistoffer som modulerer celle-celle-kommunikasjon mediert ved STEAP-1 blir benyttet som terapeutiske midler for kreftformer som uttrykker STEAP-1. Figur 30 viser at ekspresjon av STEAP-1 er nødvendig for både donor- og mottakerpopulasjoner for overføringen av små molekyler. I dette eksperimentet ble PC3-celler transfektert med neomycinresistensgen alene eller med STEAP-1 i pSRcc-vektor. Mottakercelle ble merket med 1 mg/ml dekstran-Texas rødt og donorcelle ble merket med 2,5 ng/ml kalcein-AM. Donor (grønt) og mottaker (rødt)-celler ble dyrket sammen ved 37°C i 18-24 timer og analysert ved hjelp av mikroskopi for ko-lokaliseringen av fluorescensfargestoffer. Øvre paneler: lysmikroskopi, lavere paneler: UV-fluorescens. Venstre paneler: PC3-Neo-celler var både donor og mottaker. Midtre paneler: PC3-Neo var donorceller og PCR-STEAP-1 var mottaker. Høyre paneler: PC3-STEAP-l-celler var både donor og mottaker. Kun nr STEAP-1 ble uttrykt på både donor og mottaker ble celle-celle-kommunikasjon påvist.

Resultatene viser at sammendyrking av kontroll-PC3- og PC3-celler mislykkes i å mediere kalceinoverføring. Likeledes tillater ikke ko-inkubering av kontroll-PC3 og PC3-

STEAP-1 overføringen av kalcein. Sammendyrkning av PC3-STEAP-l-donorceller og PC3-STEAP-l-mottakerceller medierer likevel overføring av små molekyler som avbildet ved ko-lokalisering av grønne og røde pigmenter i de samme cellene. Holdt sammen viser dataene i figurene 29 og 30 at STEAP-1 medierer overføring av små molekyler og regulerer celle-celle-kommunikasjon ved å danne intercellulære kommunikasjonskanaler som er tilsvarende i funksjon til overgangskoblinger mellom celler.

I tillegg ble STEAP-l-M2/120.545-effekt på overgangskobling bekreftet (se Figur 31). I dette eksperimentet ble PC3-celler transfektert med neomycinresistensgen alene eller med STEAP-1 i pSRcc-vektor. Mottakerceller ble merket med 1 mg/ml dekstran-Texas rødt og donorceller ble merket med 2,5 ng/ml klacein-AM. Donor (grønt) og mottaker (rødt)-celler ble dyrket sammen ved 37°C i 18-24 timer og analysert ved hjelp av mikroskopi for ko-lokaliseringen av fluorescensfargestoffer. I alle eksperimenter ble de samme cellene benyttet som donor og akseptor. Celler ble inkubert med de indikerte mengdene av STEAP-1/120.545-MAb i 10 minutter før utplating og MAb ble opprettholdt i kulturen i 24 timer før analyse. STEAP-1/120.545 reduserer STEAP-l-mediert koblingsdannelse på en doseavhengig måte. Resultatene viser at STEAP-1/120.545 reduserer STEAP-l-mediert kobling på en doseavhengig måte.

Fordi STEAP-1 virker ved celle-celle-kommunikasjon og transport av små molekyler blir den slik benyttet som et mål eller en markør for diagnostiske, prognostiske, preventive og/eller terapeutiske formål.

Eksempel 31: RNA-interferens (RNAi)

RNA-interferens (RNAi)-teknologi er implementert i en mengde celleanalyser som er relevante for onkologi. RNAi er en post-transkripsjonell genavslåingsmekanisme som blir aktivert ved hjelp av dobbelttrådet RNA (dsRNA). RNAi induserer spesifikk mRNA-degradering som fører til endringer i proteinekspresjon og dermed genfunksjon. I pattedyrceller har disse dsRNA, kalt kort interferende RNA, den korrekte sammensetningen til å aktivere RNAi-veien som styrer noen spesifikke mRNA til degradering. Se Elbashir S.M. et al., Duplexes of 21-nucleotide RNAs Mediate RNA interference in Cultured Mammalian Cells, Nature, 4411(6836):494-8 (2001). Slik blir RNAi-teknologi benyttet vellykket på pattedyrceller for å slå av målsøkte gener.

Tap av celleproliferasjonskontroll er et kjennetegn på kreftceller, og slik er undersøkelse av rollen for STEAP-1 i celleoverlevelse/proliferasjonsanalyser relevant. I overensstemmelse med dette ble RNAi benyttet for å undersøke funksjonen til STEAP-1-antigenet. For å generere siRNA for STEAP-1 ble algoritmer benyttet som predikerer oligonukleotider som oppviser de kritiske molekylære parameterne (G:C-innhold, smeltetemperatur osv.) og har evnen til vesentlig å redusere ekspresjonsnivåene av STEAP-l-proteinet når det blir introdusert i celler. I overensstemmelse med dette er en målsøkt sekvens for STEAP-l-siRNA: 5' AAGCTCATTCTAGCGGGAAAT 3' (Sekv. id. nr. 81). I overensstemmelse med dette eksempelet blir STEAP-l-siRNA-preparatet benyttet og omfatter siRNA (dobbelttrådet, kort interferende RNA) som tilsvarer nukleinsyre-ORF-sekvensen til STEAP-l-proteinet eller undersekvenser derav. Slik er siRNA-undersekvenser som blir benyttet på denne måten generelt 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 eller flere enn 35 kontinuerlige RNA-nukleotider i lengde. Disse siRNA-sekvensene er komplementære og ikke-komplementære til minst én del av den mRNA-kodende sekvensen. Fortrinsvis er undersekvensene 19-25 nukleotider i lengde, mest foretrukket 21-23 nukleotider i lengde. Fortrinnsvis oppnår disse siRNA utslåing av STEAP-l-antigen i celler som uttrykker proteinet og har funksjonelle effekter som beskrevet nedenfor.

De valgte siRNA (STEAP-1.b-oligo) ble testet i utallige cellelinjer i overlevelse/proliferasjon-MTS-analysen (måle cellulær metabolismeaktivitet). Tetrazolium-baserte kolorimetriske analyser (dvs. MTS) påviser kun levedyktige celler, siden levelige celler er metabolsk aktive og derfor kan redusere tetrazolumsalter til fargede formazanforbindelser, mens døde celler ikke kan gjøre dette. Videre oppnådd denne STEAP-l.b-oligoen utslåing av STEAP-l-antigen i celler som uttrykker proteinet og hadde funksjonelle effekter som beskrevet nedenfor ved å anvende de følgende protokollene.

Pattedyr-siRNA-transfeksjoner: Dagen før siRNA-transfeksjon ble de ulike cellelinjene platet i medium (RPMI-1640 med 10% FBS w/o antibiotika) ved 2 x IO<3>celler/brønn i 80 ni (96-brønners plateformat) for overlevelse/MTS-analyse. I parallell med den STEAP-l-spesifikke siRNA-oligoen ble de følgende sekvensene inkludert i hvert eksperiment som kontroller: a) ikke-transfekterte celler med lipofektamin 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) og annealingsbuffer (ikke noe siRNA), b) luciferase-4-spesifikt siRNA (målsøkt sekvens: 5'-AAGGGACGAAGACGAACACIICTT-3') (Sekv. id. nr. 82) og c) Eg5-spesifikk siRNA (målsøkt sekvens: 5'-AACTGAAGACCTGAAGACAATAA-3') (Sekv. id. nr. 83). SiRNA ble benyttet ved 10 nM og 1ng/ml lipofektamin-2000 som sluttkonsentrasjon.

Prosedyren var som følger: siRNA ble først fortynnet i OPTIMEN (serumfritt transfeksjonsmedium, Invitrogen) ved 0,1 nM (10-ganger konsentrert) og inkubert 5-10 minutter i RT. Lipofektamin 2000 ble fortynnet ved 10 y. g/ m\ (10-ganger konsentrert) for det totale antallet transfeksjoner og inkubert 5-10 minutter ved romtemperatur (RT). Passende mengder av fortynnet 10-ganger konsentrert lipofektamin 2000 ble blandet 1:1 med fortynnet 10-ganger konsentrert siRNA og inkubert ved RT i 20-30 minutter (5 ganger konsentrert transfeksjonsløsning). 20 n' av 5-ganger konsentrert transfeksjonsløsning ble tilsatt til de respektive prøvene og inkubert ved 37°C i 96 timer før analyse.

MTS-analyse: MTS-analysen er en kolorimetrisk fremgangsmåte for å bestemme antallet levedyktige celler i proliferasjon-, cytotoksisitet- eller kjemosensitivitetsanalyser basert på en tetrazoliumforbindelse [3-(4,5-dimetyltiazol-2-yl)-5-(3-karboksymetoksyfenyl)-2-(4-sulfofenyl)-2H-tetrazolium, indre salt, MTS (b)] og et elektronkoblingsreagens (fenazinetosulfat, PES). Analysen ble utført ved å tilsette en liten mengde med løsningsreagenset direkte til kulturbrønner, inkubere 1-4 timer og deretter registrere absorbans ved 490 nm med en 96-brønners plateavleser. Mengden av farget formazanprodukt som målt ved mengden absorbans ved 490 nm er direkte proporsjonal med mitokondrieaktiviteten og/eller antallet levende celler i kultur.

For å kunne undersøke funksjonen av STEAP-1 i celler ble STEAP-1 slått av ved å transfektere den endogent uttrykkende STEAP-l-cellelinjen. Som vist i Figru 32 ble ERK-1-og ERK-2-fosforylering begge indusert ved 10% serum, og ble inhibert med M2/92.30-MAb og siRNA for STEAP-1. I dette eksperimentet ble PC3-celler transfektert med neomycinresistensgen alene eller med STEAP-1 og MAb i pSHa-vektor. For RNAi-knockdown ble PCE-STEAP-l-celler stabilt transfektert med en pPUR-U6-27-STEAP-l-vektor inneholdende siRNA for STEAP-1. Celler ble sultet i 0,1% FBS i 18 timer ved 37°C, plassert på is i 10 minutter med eller uten 10 ng/ml M2/92.30-MAb, brakt til RT i 3 minutter og deretter stimulert med 10% FBS i 5 minutter. Celler ble lysert i RIPA-buffer, helcellelysater ble skilt ved hjelp av 12,5% SDS-PAGE og proteient ble påvist ved hjelp av Western-blotting. Fosfo-ERK ble påvist med kaninantiserum (Cell Signaling) og ERK ble påvist med kanin-anti-ERK (Zymed). STEAP-1 ble påvist med sau-anti-STEAP-1 og aktin ble påvist med anti-aktin-MAb (Santa Cruz).

Som vist i Figur 33 reduserer i tillegg spesifikk STEAP-l-RNAi som er stabilt uttrykti PC3-STEAP-l-celler den STEAP-l-induserte celle-celle-kommunikasjon. I dette eksperimentet ble PC3-celler transfektert med neomycinresistensgen alene eller med STEAP-1 i pSRcc-vektor. For RNAi-knockdown ble PCE-STEAP-l-celler stabilt transfektert med en pPUR-U6-27-STEAP-l-vektor inneholdende siRNA for STEAP-1 eller en tom vektor. Mottakerceller ble merket med 1 mg/ml dekstran-Texas rødt og donorceller ble merket med 2,5 ng/ml kalsecin-AM. Donoren (grønt) og mottaker (rødt)-celler ble dyrket sammen ved 37°C i 18-24 timer og analysert ved hjelp av mikroskopi for samlokaliseringen av fluorescensfargestoffer. I alle eksperimenter ble de samme cellene benyttet som donor og akseptor.

En fremgangsmåte for å analysere STEAP-l-beslektet celleproliferasjon kan være målingen av DNA-syntesen som en markør for proliferasjon. Merkede DNA-forløpere (dvs.<3>H-tymidin) ble benyttet og deres inkorporering i DNA blir kvantifisert. Inkorporering av de merkede forløperne inn i DNA er direkte proporsjonal med mengden celledeling som forekommer i kulturen. En annen fremgangsmåte som blir benyttet til å måle celleproliferasjon er å utføre klonogene analyser. I disse analysene blir et definert antall celler platet på en passende matriks, antallet kolonier som blir dannet etter en periode med vekst etter siRNA-behandling blir talt.

Ved STEAP-l-kreftmålvalidering blir komplementering av celleoverlevelse/- proliferasjonsanalysen med apoptose og cellesyklusprofileringsundersøkelser overveid. Det biokjemiske kjennetegnet på den apoptotiske prosessen er fragmentering av genomisk DNA, en irreversibel hendelse som gjør at cellene dør. En fremgangsmåte for å observere fragmentert DNA i celler er den immunologiske påvisningen av histonkompleks-DNA-fragmenter ved hjelp av en immunanalyse (dvs. celledødspåvisnings-ELISA) som måler anrikingen av histonkompleksert-DNA-fregmanter (mono- og oligonukleosomer) i cytoplasma for apoptotiske celler. Denne analysen krever ikke forhåndsmerking av cellene og kan påvise DNA-degradering i celler som ikke prolifererer in vitro (dvs. nylig isolerte tumorceller).

De mest viktige effektormolekylene for å utløse apoptotisk celledød er kaspaser. Kaspaser er proteaser som når de blir aktivert kløyver utallige substrater på det karboksyterminale setet for en aspartatrest som medierer svært tidlige stadier av apoptose ved aktivering. Alle kaspaser blir syntetisert som proenzymer og aktivering involverer kløyving på aspartatrester. Spesielt ser det ut til at kaspase-3 spiller en sentral rolle i inhiberingen av cellulære hendelser ved apoptose. Analyse for å bestemme kaspase-T-aktivering påviser tidligere hendelser ved apoptose. Etter RNAi-behandlinger underbygger videre Western-blott påvisning av aktiv kaspase-3-tilstedeværelse eller proteolytisk kløyving av produktet (dvs. PARP) som ble funnet i apoptotiske celler ytterligere en aktiv induksjon av apoptose. Fordi de cellulære mekanismene som fører til apoptose er komplekse, har hver sine fortrinn og begrensninger. Overveielse av andre kriterier/endepunkter slik som cellulær morfologi, kromatinkondensering, membranutbobling, apoptotiske legemer, hjelper til i ytterligere å underbygge celledød som apoptotisk. Siden ikke alle genmålene som regulerer cellevekst er anti-apoptotiske, blir DNA-innholdet i permeabiliserte celler målt for å oppnå profilen for DNA-innhold eller cellesyklusprofil. Kjerne fra apoptotiske celler inneholder mindre DNA på grunn av utlekkingen i cytoplasma (sub-Gl-populasjon). Anvendelsen av DNA-fargestoffer (dvs. propidiumjodid) skiller i tillegg også mellom de ulike fasene i cellesyklusen i cellepopulasjonen på grunn av tilstedeværelsen av ulike kvantiteter av DNA i G0/G1, S og G2/M. I disse undersøkelsene kan sub-populasjoner bli kvantifisert.

For STEAP-l-genet fremmer RNAi-undersøkelser forståelsen av bidraget av genproduktet ved kreftveier. Slike aktive RNAi-molekyler har anvendelse i identifiseringsanalyser for å screene etter MAb som er aktive anti-tumorterapeutiske midler. Videre blir siRNA administrert som terapeutiske midler til kreftpasienter for å redusere den maligne veksten av flere krefttyper, inkludert de som er fremlagt i Tabell 1. Når STEAP-1 spiller en rolle i celleoverlevelse, celleproliferasjon, tumorigenese eller apoptose, blir den benyttet som et mål for diagnostiske, prognostiske, preventive og/eller terapeutiske formål.

Eksempel 32: Modulering av STEAP-1-funksjon

Ionetransport spiller en viktig rolle i å regulere cellevekst, intracellulær permeabilitet, molekylær traffikering og signaloverføring (Minke B. Cell Mol. Neurobiol., 2001, 21:629, Golovina et al., AM J Physiol Heart Circ Physiol., 2001, 280:H746) disse er funksjoner som er spesielt relevante til den neoplastiske tilstanden. Celle-celle-kommunikasjon regulerer homeostase, celleproliferasjon og celledød (Evans WH, Martin PE. Mol Membr Biol., 2002, 19:121, Carruba G. et al., Ann. NY Acad Sei, 2002, 963-156) og disse funksjonene er også spesielt relevante for den neoplastiske tilstanden.

Ved å anvende kontrollcellelinjer og cellelinjer som uttrykker STEAP-1 blir inhibitorer av STEAP-l-funksjonen identifisert. Foreksempel kan PC3- og PC3-STEAP-1-celler blir inkubert i nærvær og fravær av MAb eller små-molekyl inhibitorer. Effekten av disse MAb eller små-molekyl inhibitorene bli undersøkt ved å anvende ioneflyks analysen, cellekommunikasjonsanalysen, proliferasjons- og signaliseringsanalysene som er beskrevet ovenfor.

Signaloverføring og biologisk utkomme mediert ved transportere kan bli modulert i et hvilken som helst mekanisme, inkludert inhibering av en reseptor- og ligandbinding, ioneantagonister, proteininteraksjoner, regulering av transporten av ioner og små molekyler osv. (Tang W et al., Front Biosci, 2002, 7:1583). Ved å anvende kontrollcellelinjer og celler som uttrykker STEAP-1 blir modulatorer (inhibitorer eller enhancere) av STEAP-1-funksjon identifisert. For eksempel blir PC3- og PC3-STEAP-l-celler inkubert i nærvær og fravær av MAb eller små molekylmodulatorer. I lys av funksjoner til STEAP-1 som er beskrevet her, inkluderer modulatorer som er ionekanalblokkere som benyttet i konteksten ifølge foreliggende beskrivelse forbindelser slik som amlodipin, azulen, dihydropyridiner, tianiner, nifedin, verapamil og deres derivater (Tanaka Y, Shigenobu K., Cardiovasc Drug Rev., 2001, 19:297, Djuric D, Mitrovic V, Jakovljevic V., Arzneimittelforschung, 2002, 52:365, Kourie JI, Wood HB., Prog Biophys Mol Biol, 2000, 73:91) og modulatorer som er inhibitorer av cellekommunikasjon benyttet i konteksten av foreliggende beskrivelse inkluderer slike forbindelser som beta-glycyrrhetinsyre, retinoider, TPA (Krutovskikh VA et al., Oncogene, 2002, 21:1989, Rudkin et al., J Surg. Res, 2002, 103:183, Ruch J et al., J Cell Biochem, 2001, 83:163). I overensstemmelse med dette blir effekt/effektene av Mab eller små-molekylinhibitorer undersøkt ved å anvende ionfluks analysene, cellekommunikasjonsanalysene, proliferasjon- og signaliseringsanalysene som er beskrevet i eksemplene ovenfor.

Når MAb og små molekyler modulerer, for eksempel inhiberer, transporten og den tumorigene funksjonen til STEAP-1, blir de benyttet i prevantive, prognostiske, diagnostiske og/eller terapeutiske formål.

Rester i fet skrift er foretrukket, rester med skrå skrift er mindre foretrukket: Et peptid er ansett for å være motivbærend hvis det har primære ankere på hver primære ankerposisjon for et motiv eller supermotiv som spesifisert i tabellen ovenfor.

Rest i skråskrift indikerer mindre foretrukne eller "tolererte" rester.

Tabellene XXII - LI:

Fremlagt i US patentsøknad nr. 10/236 878, innsendt 6. september 2002, der det spesifikke innholdet her fullt ut er inkorporert ved referanse i sin helhet.

Claims

1. Monoklonale antistoff betegnet X120.545.1.1. og gitt ATCC aksesjonsnummer PTA-5803 eller en humanisert form av nevnte antistoff; eller et fragment av nevnte antistoff eller humaniserte form som inneholder det antigen bindende domenet av nevnte antistoff eller humaniserte formkarakterisert vedat den humaniserte formen og fragmentene derav binder spesifikt til STEAP-1.

2. En modifisert form av det monoklonale antistoffet betegnet X120.545.1.1. og gitt ATCC aksesjonsnummer PTA-5803 som spesifikt binder STEAP-1 og oppviser den biologiske aktiviteten til X120.545.1.1.

3. Den modifiserte formen ifølge krav 2 hvor modifikasjonen er valgt fra en aminosyre delesjon, addisjon og substitusjon.

4. Antistoffet eller fragmentet ifølge krav 1, hvor fragmentet er et Fab-, F(ab')2-, Fv-eller Sfv-fragment.

5. Et rekombinant proteinkarakterisert vedat det omfatter det antigenbindende setet i et antistoff ifølge hvilket som helst av kravene 1-4.

6. Antistoffet eller fragmentet ifølge hvilket som helst av kravene 1-4, hvor antistoffet eller fragmentet er koblet til et påvisbart merke, et toksin eller et terapeutisk middel.

7. Antistoffet eller fragmentet ifølge krav 6, hvor det påvisbare merket er en radioisotop, en metallchelator, et enzym, en fluorescerende forbindelse, en bioluminiscerende forbindelse eller en kjemiluminiscerende forbindelse.

8. Antistoffet eller fragmentet ifølge krav 7, hvor radioisotopen omfatter<212>Bi,131I, inln,90Y,18<6>Re,21<1>At,125I,188Re,153Sm,213Bi,32P eller177Lu.

9. Antistoffet eller fragmentet ifølge krav 6, hvor antistoffet eller fragmentet er koblet til et toksin og hvor toksinet er valgt fra ricin, ricin-A-kjede, doksorubicin, daunorubicin, et maytansinoid, taxol, etidiumbromid, mitomycin, etoposid, tenoposid, vinkristin, vinblastin, kolchicin, dihydroksyantracindion, aktinomycin, difteritoksin, Pseudomonas-eksotoksin (PE)-A, PE40, abrin, abrin-A-kjede, modeccin-A-kjede, alfa-sarcin, gelonin, mitogellin, restriktocin, fenomycin, enomycin, kuricin, krotin, kalicheamicin, sapaonaha officinalis- inhibitor, glukokortikoid, auristatin, auromycin, yttrium, vismut, kombrestatin, duokarmyciner, dolostatin, ccl065 eller et cisplatin.

10. Antistoffet eller fragmentet ifølge krav 9, hvor antistoffet eller fragmentet er koblet til et auristatin.

11. Hybridom, karakterisert vedat det er deponert med ATCC aksesjonsnummer PTA-5803.

12. Vektor, karakterisert vedat den omfatter et polynukleotid som koder for antistoffet eller fragmentet ifølge hvilket som helst av kravene 1-4 eller 6-10.

13. Vektor ifølge krav 12, hvor den koder for antistoffet eller fragmentet som en enkelt kjede.

14. Farmasøytisk preparat, karakterisert vedat det omfatter antistoffet eller fragmentet ifølge hvilket som helst av kravene 1-4 eller 6-10 i en human enhetsdoseform.

15. Analyse for påvisning av tilstedeværelsen av et STEAP-l-protein i en biologisk prøve, karakterisert vedat den omfatter å kontakte prøven med et antistoff eller fragment ifølge hvilket som helst av kravene 1-4 eller 6-10, og påvise bindingen av STEAP-l-protein i prøven.

16. Analysen ifølge krav 15, hvor den biologiske prøven er fra en pasient som har eller som er mistenkt for å ha en kreftform som er angitt i Tabell I.

17. Analysen ifølge krav 15 eller 16, hvor prøven er serum.

18. Analysen ifølge krav 15 eller 16, hvor prøven er prostata.

19. Vektoren ifølge krav 13, for anvendelse i en fremgangsmåte for medisinsk behandling.

20. Vektoren ifølge krav 19, for anvendelse i en fremgangsmåte for å inhibere vekst av kreftceller som uttrykker STEAP-1 i et individ, hvor fremgangsmåten omfatter: administrering av vektoren til nevnte individ, slik at vektoren leverer den enkeltkjedede antistoff- eller fragment-kodende sekvensen til kreftcellene, og det kodede enkeltkjedeantistoffet blir uttrykt der intracellulært.

21. Anvendelse av vektoren ifølge krav 13 ved fremstilling av et medikament, hvor medikamentet er for anvendelse i en fremgangsmåte for å hemme veksten av kreftceller som uttrykker STEAP-1 hos et individ, hvor fremgangsmåten omfatter: administrering av vektoren til nevnte individ, slik at vektoren leverer den enkeltkjedede antistoff- eller fragment-kodende sekvensen til kreftcellene, og det kodede enkeltkjedeantistoffet blir uttrykt der intracellulært.

22. Antistoffet eller fragmentet ifølge hvilket som helst av kravene 1-4 eller 6-10, for anvendelse i en fremgangsmåte for medisinsk behandling.

23. Anvendelse av antistoffet eller fragmentet ifølge hvilket som helst av kravene 1-4 eller 6-10, ved fremstilling av et medikament, hvor medikamentet er for anvendelse i en fremgangsmåte for å hemme veksten av kreftceller som uttrykker STEAP-1 hos et individ, hvor fremgangsmåten omfatter administrering av antistoffet eller fragmentet til nevnte individ.

24. Anvendelse ifølge krav 23, hvor kreftcellene er fra en kreftform som angitt i Tabell I.

25. Anvendelse ifølge krav 24, hvor kreftcellene er fra malign prostata.

26. En in vitro fremgangsmåte for å levere et cytotoksisk middel eller et diagnostisk middel til en celle som uttrykker et STEAP-l-protein, karakterisert vedat den omfatter: å tilveiebringe et cytotoksisk middel eller et diagnostisk middel konjugert til antistoffet eller fragment ifølge hvilket som helst av kravene 1-4 eller 6-10, for å danne et antistoff-middel eller fragment-middel-konjugat; og, å eksponere cellen for antistoff-middel- eller fragment-middel-konjugatet.

27. Et antistoff-middel eller fragment-middel konjugat dannet av et cytotoksisk middel eller et diagnostisk middel konjugert til antistoffet eller fragmentet ifølge hvilket som helst av kravene 1-4 eller 6-10, for anvendelse in vivo, i en fremgangsmåte for behandling eller diagnose.

28. Konjugatet ifølge krav 27 for anvendelse i en fremgangsmåte for å levere et cytotoksisk middel eller et diagnostisk middel til en celles som uttrykker et STEAP-1 protein hvor fremgangsmåten omfatter: å tilveiebringe et cytotoksisk middel eller et diagnostisk middel konjugert til antistoffet eller fragment ifølge hvilket som helst av kravene 1-4 eller 6-10, for å danne et antistoff-middel eller fragment-middel-konjugat; og, å eksponere cellen for antistoff-middel- eller fragment-middel-konjugatet.

29. Anvendelse av et konjugat i fremstillingen av et medikament, hvor konjugatet er et antistoff-middel- eller fragment-middel-konjugat dannet av et cytotoksisk middel eller et diagnostisk middel konjugert til antistoffet eller fragment ifølge hvilket som helst av kravene 1-4 eller 6-10, og hvor medikamenteter for levering av det cytotoksiske midlet eller det diagnostiske midlet til en celle som uttrykker STEAP-1 protein.

30. Fremgangsmåten, konjugatet eller anvendelsen ifølge hvilket som helst av kravene 26-29 hvor det cytotoksiske midlet eller det diagnostiske midlet er valgt fra gruppen som består av en påvisbar markør, et toksin og et terapeutisk middel.

31. Fremgangsmåten, konjugatet eller anvendelsen ifølge krav 30, hvor antistoffet eller fragmentet er konjugert til en påvisbar markør hvor den påvisbare markøren er en radioisotop, en metallchelator, et enzym, en fluorescerende forbindelse, en bioluminiscerende forbindelse eller en kjemiluminiscerende forbindelse.

32. Fremgangsmåten, konjugatet eller anvendelsen ifølge krav 31, hvor radioisotopen er valgt fra<2>12Bi,<131>I,<n>iIn, 9<0>Y,<186>Re,<211>At,<125>1,<188>Re,<153>Sm,<213>Bi, 3<2>P eller<177>Lu.

33. Fremgangsmåten, konjugatet eller anvendelsen ifølge krav 30, hvor antistoffet eller fragmentet er konjugert til et toksin og hvor toksinet er valgt fra ricin, ricin-A-kjede, doksorubicin, daunorubicin, et maytansinoid, taxol, etidiumbromid, mitomycin, etoposid, tenoposid, vinkristin, vinblastin, kolchicin, dihydroksyantracindion, aktinomycin, difteritoksin, Pseudomonas-eksotoksin (PE)-A, PE40, abrin, abrin-A-kjede, modeccin-A-kjede, alfa-sarcin, gelonin, mitogellin, restriktocin, fenomycin, enomycin, kuricin, krotin, kalicheamicin, sapaonaria officinalis-\ nh\ b\ X. or, glukokortikoid, auristatin, auromycin, yttrium, vismut, kombrestatin, duokarmyciner, dolostatin, ccl065 eller et cisplatin.

34. Fremgangsmåten, konjugatet eller anvendelsen ifølge krav 33, hvor antistoffet eller fragmentet er koblet til et auristatin.

35. En in vitro fremgangsmåte for å påvise et STEAP-l-protein i en biologisk prøve,karakterisert vedat den omfatter trinnen å: tilveiebringe den biologiske prøven og en kontrollprøve, kontakte den biologiske prøven og kontrollprøven med antistoffet eller fragmentet ifølge hvilket som helst av kravene 1-4 eller 6-10, som spesifikt binder til STEAP-l-proteinet, og bestemme en mengde av et kompleks av antistoffet eller fragmentet med STEAP-l-protein som er til stede i den biologiske prøven og kontrollprøven.

36. Fremgangsmåten ifølge krav 35, hvor den biologiske prøven og kontrollprøven er fra en pasient som har eller som er mistenkt for å ha en kreftform som er angitt i Tabell I.