CN107303389A - 外周脑源性神经营养因子前体（proBDNF）作为炎性介质调节疼痛 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物制药领域，具体涉及外周脑源性神经营养因子前体(proBDNF)作为炎性介质调节疼痛。本发明公开了对proBDNF或其信号传递分子具有中和或抑制活性的结合分子可用于缓解、抑制或治疗疼痛。多克隆抗体中和proBDNF，在不同炎性疼痛的模型中使疼痛减弱。

Description

外周脑源性神经营养因子前体 (proBDNF)作为炎性介质调节疼痛

技术领域

本发明属于生物制药领域，涉及外周脑源性神经营养因子前体(proBDNF)作为炎性介质调节疼痛。更具体的，本发明涉及对proBDNF或其信号传递分子具有中和或抑制活性的结合分子在制备用于缓解、抑制或治疗疼痛的药物中的应用。

背景技术

脑源性神经营养因子(BDNF)是一种发挥多种生物学作用的神经营养因子，这些生物学作用包括神经元存活、神经元成形和突触可塑性^[1]。如其他神经营养因子一样，BDNF起始以前体合成，随后被蛋白酶切割为成熟BDNF^[2-4]。BDNF的前体结构域(prodomain)对成熟BDNF的正确折叠和分泌途径至关重要。proBDNF不仅作为成熟BDNF合成过程中的中间体，还与其受体p75泛神经营养因子受体(p75NTR)和sortilin结合，主要在中枢神经系统中起到与成熟BDNF相反的生物学作用。例如，与BDNF相反，proBDNF在神经元凋亡和轴突修剪(axonpruning)中发挥积极作用，并反向调节海马树突复杂度与脊柱密度^[5-6]。除在中枢神经系统中表达丰富之外，proBDNF还在外周神经系统和其他组织，诸如皮肤、嗅上皮和肠中表达^[7]。在皮肤的角化细胞和神经纤维中，观察到proBDNF免疫反应，而在肠中，proBDNF位于肌间神经丛层和黏膜及黏膜下层^[7]。尽管广泛研究了proBDNF在中枢神经系统中的作用，但proBDNF在外周组织中的生物学作用仍知之甚少。

发明概述

本发明人经过深入研究，首次发现外周proBDNF是治疗疼痛的重要靶点，可作为炎性介质调节疼痛。对proBDNF或其信号传递分子具有中和或抑制活性的结合分子，例如，特异性结合proBDNF的结合分子，尤其是抗proBDNF的多克隆抗体或单克隆抗体，可减弱各种不同类型的疼痛。因此，外周proBDNF是治疗疼痛的潜在候选物。

本发明提供对外周proBDNF或其信号传递分子具有中和或抑制活性的结合分子在制备用于缓解、抑制或治疗疼痛的药物中的应用。

根据本发明，所述信号传递分子是proBDNF的受体p75NTR(SEQID NO:3)或其片段。优选的，所述受体片段包括p75ECD-Fc(SEQ IDNO:4)。

根据本发明，所述疼痛包括炎性疼痛和手术疼痛。

根据本发明，所述结合分子为抑制和/或阻碍proBDNF或其信号传递分子基因表达的结合分子，例如反义核酸、siRNA、shRNA、dsRNA、miRNA或核酶。

根据本发明，所述结合分子为特异性结合proBDNF或其信号传递分子的结合分子，例如抗体，与proBDNF结合的受体p75或其片段，及其功能变体。其中，所述功能变体包括化学修饰变体，取代、添加或缺失变体。

根据本发明，所述结合分子为促进proBDNF(SEQ ID NO:1)切割为成熟BDNF(SEQ ID NO:2)的结合分子，例如，费林蛋白酶、基质金属蛋白酶(MMP)2/7/9和组织纤溶酶原激活物(tPA)。

根据本发明，所述结合分子还包括与proBDNF的受体p75或其片段结合并阻断由proBDNF触发的信号的分子，例如化合物质、肽和抗体等，或者miRNA/siRNA，它们抑制p75NTR及其下游分子的表达。

根据本发明，所述结合分子为阻止proBDNF与其受体p75结合的拮抗剂。

根据本发明，所述抗体是单克隆抗体、多克隆抗体、人源化抗体、嵌合抗体、鼠源抗体或其片段。其中，所述片段选自Fab、F(ab')、F(ab')₂、Fv、dAb、Fd、互补决定区(CDR)片段、单链抗体(scFv)、二价单链抗体、单链噬菌体抗体、双特异双链抗体、三链抗体或四链抗体。

根据本发明，所述多克隆抗体以proBDNF或其片段免疫动物而产生。其中，所述片段为SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。

本发明的结合分子作为药剂可以抑制基因表达(即抑制和/或阻遏基因的表达)。所属技术领域中，该药剂被称为“基因沉默物”，这对本领域技术人员来说是熟知的，包括但不限于核酸序列，例如RNA、DNA或核酸类似物，可以是单链的或双链的，选自编码目标蛋白的核酸、寡核苷酸、核酸、核酸类似物，包括但不限于肽核酸(PNA)、假性互补PNA(pc-PNA)、锁核酸(LNA)及其衍生物等。核酸药剂包括但不限于编码阻遏蛋白的核酸序列、反义分子、核酶、小抑制性核酸分子，包括但不限于RNAi、shRNAi、siRNA、微小RNAi(miRNA)、反义寡核苷酸等。

本发明的结合分子是蛋白药剂。在一些实施方案中，抑制proBDNF及其受体的药剂是蛋白和/或肽抑制剂或其片段，包括但不限于突变的蛋白、治疗性蛋白和重组蛋白。蛋白和肽抑制剂也可以包括例如突变蛋白、遗传修饰蛋白、肽、合成的肽、重组蛋白、嵌合蛋白、抗体、人源化蛋白、人源化抗体、嵌合抗体、修饰蛋白及其片段。在一些实施方案中，抑制proBDNF及其受体的药剂是proBDNF及其受体的显性失活变体，例如proBDNF及其受体的无功能变体。

本发明的结合分子可以是完整的免疫球蛋白分子，例如多克隆或单克隆抗体，或者抗原结合片段，包括但不限于Fab、F(ab’)、F(ab’)₂、Fv、dAb、Fd、互补决定区(CDR)片段、单链抗体(scFv)、二价单链抗体、单链噬菌体抗体、双特异双链抗体、三链抗体、四链抗体以及至少含有足以赋予与proBDNF及其受体的特异性抗原结合的免疫球蛋白的片段的(多)肽或其片段。在优选实施方案中，本发明的结合分子是多克隆抗体或单克隆抗体。

在一些实施方案中，本发明的抑制剂，例如抗体，包括单克隆的、嵌合的、人源化的和重组抗体，及其抗原结合片段。在一些实施方案中，可以使用中和抗体作为proBDNF及其受体的抑制剂。抗体可以通过用抗原免疫接种动物，例如兔或小鼠，来容易地产生。免疫的小鼠对于提供用于制造杂交瘤的B细胞源来说，是特别有用的，杂交瘤可以被培养以产生大量的单克隆抗体。

本发明还包括所述结合分子的功能变体。只要变体能与亲代结合分子竞争特异性结合proBDNF或其片段，则该变体分子就是本发明结合分子的功能变体。换言之，所述功能变体仍能结合proBDNF或其片段。功能变体包括但不限于一级结构序列基本相似，但含有例如在亲代结合分子中未发现的体外或体内化学和/或生化修饰的衍生物。这种修饰包括乙酰化、酰化、核苷酸或者核苷酸衍生物的共价附着、脂质或者脂质衍生物的共价附着、交联、二硫键形成、糖基化、羟基化、甲基化、氧化、聚乙二醇化、蛋白酶解加工、磷酸化等，只要亲代结合分子的氨基酸和/或核苷酸序列中的修饰不显著影响或改变由所述核苷酸序列编码的或者含有所述氨基酸序列的所述结合分子的结合特性，即所述结合分子仍能识别并结合其靶位。

所述功能变体可以具有保守序列修饰，包括核苷酸和氨基酸取代、添加和缺失。这些修饰可以通过本领域己知的标准技术导入，例如定向诱变和随机PCR介导的诱变，并且可包含天然以及非天然核苷酸和氨基酸。

保守氨基酸取代包括其中氨基酸残基由具有相似结构或者化学性质的另一氨基酸残基置换的取代。具有相似侧链的氨基酸残基在本领域中公知，包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、无电荷极性侧链氨基酸(例如天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半肤氨酸、色氨酸)、非极性侧链氨基酸(例如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、分支侧链氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及芳香侧链氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸)。本领域技术人员明白也可以使用除上述氨基酸之外的其它氨基酸。另外，变体可具有非保守的氨基酸取代，例如氨基酸由具有不同结构或者化学性质的另一氨基酸残基置换。相似的小变异也可包括氨基酸缺失或者插入，或者这二者。使用本领域熟知的计算机程序可以发现并确定哪些氨基酸残基可以被取代、插入或者缺失而不消除免疫学活性。

此外，功能变体还包含氨基酸序列在氨基末端或者羧基末端或者这两端的截短体。本发明的功能变体与亲代结合分子相比对proBDNF或其片段可具有增加或降低的结合亲和性。本发明的功能变体与所述亲代结合分子具有大约50％至大约99％、优选大约60％至大约99％、更优选大约70％至大约99％、甚至更优选大约80％至大约99％、最优选大约90％至大约99％、特别是大约95％至大约99％，以及特别是大约97％至大约99％的氨基酸序列同源性。本领域技术人员已知的计算机算法如Gap或者Bestfit可用于最佳地排列氨基酸序列以进行对比以及明确相似或相同的氨基酸残基。功能变体可以通过使用本领域己知的普通分子生物学方法改变亲代结合分子或其一部分而获得，所述方法包括但不限于易错PCR、寡核苷酸指导的诱变、定点诱变以及重链和/或轻链改组法。在一个实施方案中，本发明的功能变体对于proBDNF具有中和活性。所述中和活性与亲代结合分子相比可以相同或者更高或更低。当使用术语(人)结合分子时，其也涵盖所述(人)结合分子的功能变体。

本发明提供包含治疗有效量的所述结合分子的药物组合物。该组合物还可包含药学上可接受的载体。药物组合物可通过常规途径给药，包括但不限于静脉内、腹腔内注射等。本发明的药物组合物还可以与其他抑郁症的治疗剂联用。

上述核酸药剂和蛋白药剂都是现有技术公知的，也可参见，例如2015年8月18日提交的中国专利申请No.201510507083.8，在此全文引入作为参考。

除非特别说明，本发明所用实验动物和操作方法如下文所示：

实验动物

雄/雌性昆明小鼠(6-8周岁)和雄性SD大鼠(体重200-250g)均获自中南大学动物服务中心(中国长沙)，圈养在恒温(25℃)和恒湿(50％)条件下，12:12光/暗循环，自由取食和水。实验得到了中南大学动物保护与使用委员会的批准，并依据国家健康指导机构对实验动物保护与使用的要求。

proBDNF的多克隆和单克隆抗体的制备

本发明多克隆抗人proBDNF抗体的制备已描述在发明人早先的研究中^[10_,20]。简言之，人BDNF基因的肽序列69-82与钥孔戚血蓝素(KLH)偶联，或者获自大肠杆菌(E.coli)的重组前体结构域片段，用于免疫兔和羊(n＝2)。抗体利用固定在Sepharose 4B凝集上的免疫肽，通过亲和层析纯化。

对生成本发明的单克隆抗人proBDNF而言，利用EcoRI/XhoI酶切位点，将proBDNF的整个氨基酸序列亚克隆在pET22b(Novagen，EMD Bioscience)，构建pET22b-proBDNF。proBDNF蛋白在BL21(DE3)细菌细胞中表达，并如前所述纯化。纯化的proBDNF蛋白用于免疫小鼠，以及筛选杂交瘤克隆。单克隆抗体包括但不限于B19-2-C1、B34D10、PB19B2E2、PB17A2等^[25]，也可外购。

重组成熟BDNF和proBDNF

用于抗体表征的重组成熟BDNF和proBDNF的制备如前所述^[10]。在本申请中用于体内和体外生物分析法的重组proBDNF基于合同研究从Virovek的SF9昆虫细胞制备(http://www.virovek.com/)，并在发明人早先的研究中得到充分表征^[14_,25]。

编码人proBDNF基因的腺病毒的构建、制备和纯化

编码proBDNF基因的高滴度腺病毒载体(Ad-proBDNF)获自GeneChem(中国上海)。简言之，proBDNF的编码序列通过RT-PCR扩增。将PCT片段和pDC315-EGFP质粒与Age I一起消化，然后利用内融合克隆技术(Laboratories,Inc.,Mountain View,CA)构建pDC315-proBDNF-EGFP质粒。该质粒转化至感受态DH5α大肠杆菌(Escherichia coli)，用于鉴定。载体中，引物pDC315-F位于mCMV启动子，而引物EGFP-N-R位于EGFP的N端。引物(pDC315-F和EGFP-N-R)序列如下：

正向引物：5’-GGTATAAGAGGCGCGACCAG-3’(SEQ ID NO:6)；

反向引物：5’-CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG-3’(SEQ IDNO:7)。

利用Lipofectamine 2000(Invitrogen,USA)将质粒转染至293T细胞，从而进一步确认proBDNF-EGFP的表达。为生成重组腺病毒(Ad-proBDNF-EGFP)，pDC315-proBDNF-EGFP质粒(该质粒编码proBDNF-EGFP)与质粒pBHG loxΔE1,3Cre一起用于共转染HEK293细胞。转染溶液的制备方法，是将5μg pDC315-proBDNF-EGFP质粒，5μg pBHG loxΔE1,3Cre质粒和10μL Lipofectamine 2000在50μL无抗生素的DMEM中混合。10-15天后，从HEK 293细胞中收集上清。3轮病毒扩增后，上清经0.45μm过滤，并利用Adeno-X^TM病毒纯化试剂盒(BD Biosciences,Clontech)纯化。重悬浮后，系列稀释的腺病毒用于转导HEK293细胞。7天后，标记的HEK293细胞计数，以计算病毒效价(8.0×10⁹pfu/mL)。荧光显微镜可观察体内转染效果。

福尔马林诱导急性炎性疼痛

本发明采用经典福尔马林试验，研究proBDNF抗体对急性炎性疼痛的影响。该实验中的各小鼠首先置于底由金属丝网制成的树脂玻璃箱中30分钟，以消除自主探究行为。当测试开始时，各小鼠逐渐被限制，并分别腹膜内注射如上所述生成的0.2ml多克隆(5ml/kg)^[10]或单克隆(5mg/kg)抗人proBDNF抗体，或0.9％盐水。30分钟之后，所有小鼠以10μl 5％福尔马林足底内侧注射。其后，它们立即放回箱中，打开针对这些小鼠足底的固定相机，以记录其舔食活动。对方案毫不知情的实验员1小时内每5分钟分析累积的疼痛分数，以及各相中总的舔食时间，作为试验结果。

腹痛(visceral pain)

试验开始前，各小鼠容纳至不透明笼中30分钟。该测试中所用proBDNF抗体的时间和剂量同上。然后，小鼠被腹膜内注射0.6％醋酸，以建立如上所述的腹痛模型^[21]。对步骤一无所知的测试员，注射后立即在15分钟内观察，腹部明显翻转伴随两后肢伸直的次数，来评价腹痛强度。

爪缩阈(Paw Withdrawal Threshold，PWT)

PWT测量采用先前介绍的上下方法^[22]通过von frey纤维丝测痛仪进行。具体而言，将小鼠放在独立的箱(带有金属丝网)中，置于安静房间30分钟，以减少探索性行为。测试开始时，一系列纤维丝代表单独的力，每个纤维丝从0.16g开始，垂直于小鼠后爪足底。如果小鼠有阳性反应(明显的收缩、舔食和跳跃)，则记录为“X”，并且采用更弱的纤维素；如果相反，则记录为“O”，然后施加更硬的纤维丝，直到得到6个数序的O和X。最终的爪缩阈通过Chaplan的公式得到。该测试的最大和最小值设定为2.0g和0.02g。

免疫组织化学和免疫荧光

本发明实验小鼠分别在恰当时间以超剂量的水合氯醛麻醉，然后以0.9％生理盐水和4％多聚甲醛先后反主动脉灌注。各自去除后爪的无毛皮肤和脊髓腰骶肥大，并用相同固定剂后4℃固定过夜。接着，脊髓样品依序浸没在15％和30％蔗糖溶液中防止冷冻，无毛皮肤组织直接石蜡包埋。其后，上述脊髓和组织被切割成薄片，用于进一步免疫染色。

石蜡包埋的棍状无毛皮肤薄片首先依序浸没在两个二甲苯，两个100％乙醇，95％乙醇和75％乙醇中5分钟，然后充分以0.01M PBS冲洗。接着，将组织浸没在柠檬酸(Cwbiotech,北京)中，98℃下水浴加热18分钟，补救抗原。该步骤后，如下所述免疫染色。

漂浮脊髓切片和部分处理的棒状无毛皮肤薄片用于免疫组织化学分析。首先，以0.01M磷酸缓冲液生理盐水(pH＝7.4)冲洗3次，每次10分钟。然后，室温下浸没在3％H₂O₂的2％Triton X-100R中30分钟，以去除内源性过氧化物酶。接着，充分冲洗后，薄片以5％BSA37℃下封闭1小时。一级抗体包括p-ERK，IL-1β(Cell SignalingTechnology,Boston,1:1000稀释)，proBDNF(Millipore,Boston,1:1000稀释)，IL-6(Cell Signaling Technology,Boston,1:500稀释)，p75(Millipore,Boston,1:1000稀释)，分别在37℃下温育1小时和4℃下温育过夜。次日使用下列试剂：羊抗兔或羊抗小鼠二级抗体免疫球蛋白(Jackson ImmunoResearch Liboratories,Inc,PA,1:200稀释)和ABC试剂盒(Vector Laboratories,Burlingame,CA,1:200稀释)，分别在37℃下温育1小时。二氨基联苯胺盐酸盐(DAB,ZSGB-BIO,中国北京)用于可视化。所有切片以分级的乙醇和二甲苯连续脱水。

其他部分的棒状无毛皮肤薄片用于免疫荧光分析。二级抗体温育前的所有步骤与免疫组织化学染色完全一样，除H₂O₂浸没之外。猴抗兔(Alexa Fluor 594)或猴抗小鼠(Alexa Fluor 488)IgG H&L(Abcam,Cambridge,UK,1:1000稀释)二级抗体用于该部分，37℃下温育1小时。充分冲洗后，以封固剂(Vector Laboratories,Inc.Burlingame,CA)盖片，并通过荧光光学显微镜可视化。

蛋白印迹(Western Blotting)

不同操作的分开的小鼠后爪无毛皮肤在带有1％蛋白酶抑制剂鸡尾酒和1％EDTA溶液的裂解缓冲液(CWbiotech,中国北京)中均质。放置20分钟后，4℃下12000rpm离心20分钟。其后，上清液变性，用于进一步分析。各样品总100μg蛋白，根据各个靶蛋白的分子量，经10％或15％Bis-Tris SDS-PAGE凝胶分离，并分别转移至0.45μm或0.22μm PVDF膜。各膜首先以10％脱脂奶室温下封闭2小时，接着如上所述以单独的一级抗体4℃温育过夜。膜被充分冲洗，并与HRP-偶联的羊抗兔或羊抗小鼠二级抗体(Millipore,Boston,1:10000稀释)室温下温育2小时。最后，冲洗并曝光至带有化学发光HRP底物的照相胶片(Millipore,Boston)。通过平均灰度值和NIH Image J 7.0分析蛋白印迹，并标准化至GAPDH对照蛋白。

RNA抽提、逆转录(RT)和实时PCR

使用TRIzolR试剂，根据公司操作规程(Invitrogen,USA)，从海马中分离总RNA。对逆转录而言，含2μg RNA、2.5μM oligo(dT)引物和5单位莫洛尼(氏)鼠白血病病毒逆转录酶(MMLV,Promega,USA)的反应混合物，总体积25μl，42℃下温育1小时，75℃下加热5分钟终止反应。利用Green Real-Time PCR Master Mixes(Roche,Germany)，如发明人早先的研究^[23]所述，进行实时PCR分析。

PCR引物为：

ACCACCATGGAGAAGGCTGG(SEQ ID NO:8)和CTCAGTGTAGCCCAGGATGC(SEQ ID NO:9)(GAPDH)；

CCTCTGGTCTTCTGGAGTACC(SEQ ID NO:10)和ACTCCTTCTGTGACTCCAGC(SEQ ID NO:11)(IL-6)；

GTGCCTATGTCTCAGCCTCT(SEQ ID NO:12)和TGGTTTGTGAGTGTGAGGGT(SEQ ID NO:13)(TNF-α)；以及

ACCTTCCAGGATGAGGACATGA(SEQ ID NO:14)和CTAATGGGAACGTCACACACCA(SEQ ID NO:15)(IL-1β)。

各单个样品中具体基因归一化至GAPDH的水平。

BDNF、proBDNF、p75NTR和Sortilin的RT-PCR与本申请人早先提交的中国专利申请No.201510507083.8相同。

神经球辐射迁移

初步培养的神经球获自C57BL/6胚胎第14天(E14)，并稳定保持为神经球细胞系。第二次传代(P2)后，从细胞系中挑选神经球进行迁移分析。6组神经球以不同蛋白处理，包括对照组(基础神经干细胞培养基)，proBDNF(100ng/mL)组，成熟BDNF(100ng/mL)组，羊抗-proBDNF抗体(10μgmL)组，小鼠抗-proBDNF抗体(10μg/mL)组以及小鼠抗-proBDNF抗体(10μg/mL)补充有proBDNF(100ng/mL)。根据早先带有一些调整的研究^[24]，发明人挑出单一神经球，带有相似直径500-600μm，并将神经球涂铺在包被有Matrigel的24孔板中。神经球易连接至覆层，并在不同培养基中37℃、5％CO₂条件下培养48小时。所有细胞培养基都是无血清的，最好在观察时段(48小时)能抑制神经球分化。单一神经球辐射(radiantly)迁移，并形成特异性神经干细胞菌落。迁移的距离采用Image-Pro Plus软件测量。

统计学分析

本发明的数据显示为均值±标准误差。SPSS 13.0和GraphPad Prism 6软件用于分析统计和数据。未配对双尾学生t检验，单因素方差分析，之后Dunnett/Tukey多重比较事后检验，或两因素方差分析和邦弗朗尼多重比较事后检验，分别用于均值比较。p<0.05时，差视为统计学意义。图表中的N代表所用动物数。

本申请首次公开了proBDNF的新功能，即外周proBDNF调节疼痛。累积证据已显示，成熟BDNF通过中枢致敏调节疼痛。在炎性疼痛中，脊髓BDNF被上调，并介导炎性疼痛处理^[15-16]。此外，脊髓成熟BDNF从小神经胶质细胞分泌，也在神经性疼痛中调节机械性触刺激诱发痛^[17-18]。形成鲜明对比的是，proBDNF可通过外周致敏介导疼痛处理。特别的，proBDNF和p75NTR在感觉神经元中的丰富表达提示，proBDNF不仅直接作用于初级感觉神经元，而且间接激活炎症，后者有助于proBDNF的疼痛前效应。

本申请显示proBDNF及其主受体p75泛神经营养因子受体在炎性疼痛的局部组织的神经纤维和炎性细胞中被上调。多克隆抗体中和proBDNF，在不同炎性疼痛的模型中使疼痛减弱。通过注射外源性proBDNF或异位过表达，局部补充proBDNF导致疼痛超敏，并诱导脊髓磷酸化胞外信号调节的激酶激活。外源性proBDNF注射诱导炎性细胞浸润和前炎性细胞因子活化，提示炎性反应有助于proBDNF的疼痛前作用(proalgesic effect)。

虽然神经营养因子早已暗示作为治疗疼痛的潜在靶^[8_,19]，但成熟BDNF对疼痛的影响主要通过脊髓机理，要求鞘内注射，由此限制了临床应用。本发明的多克隆或单克隆抗-proBDNF抗体，可生物学阻断proBDNF，通过全身性给药缓解了不同类型的炎性疼痛和手术疼痛，提示它是治疗疼痛的潜在药物。更为重要的，proBDNF是常见的胞内中间体，因此Ab-proBDNF注射不会在生理条件下带来诸多严重的副作用。因此，本发明的多克隆或单克隆抗体相比成熟神经营养因子，可能是更好的治疗疼痛的候选物。

附图说明

为了更清楚地描述本发明的技术方案，下面将结合附图作简要介绍。显而易见，这些附图仅是本申请记载的一些具体实施方式，本发明包括但不限于这些附图。

图1.proBDNF在福尔马林注射诱导的炎性疼痛的局部组织中上调。A.福尔马林疼痛中，代表性蛋白印迹(a)及其半定量分析BDNF(b)，proBDNF(c)以及比率(d)(*p<0.05，**p<0.01与对照，单因素方差分析，之后Dunnett多重比较事后检验，n＝3)；B.proBDNF在足部皮肤中的H&E染色(a和d)和免疫组织化学(b-c和e-g)。proBDNF在足部皮肤的表皮层、基底层和皮下层中表达(b-c)；高放大倍数(b中小框)显示，proBDNF也在对照足底的神经纤维中少量表达(c)；在福尔马林足底注射的外周炎症的反应中，观察到强的proBDNF免疫反应，主要集中在炎性细胞(f，黑色箭头)和神经纤维样结构(g)。比例尺：50μm。数据条代表均值±标准误差。

图2.多克隆Ab-proBDNF处理减弱炎性疼痛，外源性proBDNF诱导疼痛超敏性和脊髓激活。A-B.proBDNF多克隆抗体减少福尔马林诱导的自发性疼痛。A，双相疼痛反应的时程(*P<0.05，**p<0.01对介质，两因素方差分析和邦弗朗尼多重比较事后检验，n＝8)；B，第一和第二相(*P<0.05,**p<0.01对介质，学生t检验，n＝8)。C.多克隆-Ab-proBDNF预处理减弱雄性和雌性小鼠的腹部翻转(**p<0.01对介质，学生t检验，n＝12)；D.外源性proBDNF蛋白对PWT的剂量影响(*P<0.05，**p<0.01对基线，单因素方差分析，之后Dunnett多重比较事后检验，n＝10-12)。E.通过足底内侧注射Ad-proBDNF或Ad-EGFP异位过表达proBDNF，使得PWT急剧下降。a,代表性proBDNF蛋白印迹(上图)及其半定量分析(下图，*P<0.05,***p<0.001与对照，###p<0.001与指示组，单因素方差分析，之后Tukey多重比较事后检验，n＝4)；b,递送Ad-EGFP后7天代表性荧光图像；c,Ad-proBDNF或Ad-EGFP对照注射后7天的PWT(***p<0.001对Ad-EGFP,学生t检验，n＝7)。F.外源性proBDNF(1μg)足底内侧注射，注射后3小时，诱导同侧脊髓后角中的ERK激活。比例尺：50μm。数据条代表均值±标准误差。

图3.p75NTR的上调以及局部proBDNF注射对炎性反应的影响。A.外周炎症后，p75NTR和sortilin的代表性蛋白印迹(a)和半定量分析其表达(b和c)(***p<0.001与对照，单因素方差分析，之后Dunnett多重比较事后检验，n＝3)。B.福尔马林足底内侧注射后，足垫中的p75NTR免疫组织化学。下图是上图小框的高放大倍数图。比例尺：50μm。C.外源性proBDNF(1μg)注射后，局部组织的H&E染色，比例尺：100μm。D.外源性proBDNF(1μg)足底内侧注射后，局部细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α表达的代表性蛋白印迹及其半定量分析(*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001与对照，单因素方差分析，之后Dunnett多重比较事后检验，n＝4)。E.proBDNF注射后，IL-1β、IL-6和TNF-α基因表达的时程(*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001与对照，单因素方差分析，之后Dunnett多重比较事后检验，n＝3)。数据条代表均值±标准误差。

图4.福尔马林足底内侧注射后，在足部皮肤中，以神经纤维标记物神经丝NF-200和PGP9.5双标记proBDNF。A.福尔马林后爪注射后，神经丝-200(绿色)与proBDNF(红色)的共定位。注意proBDNF与NF-200(细箭头)丰富的共定位。有些proBDNF阳性染色在NF-200阳性染色中未表达(粗箭头)。B.PGP9.5(绿色)和proBDNF(红色)的双标记显示，proBDNF与PGP9.5共定位。比例尺：50μm。

图5.在对福尔马林后爪注射的反应中，proBDNF分别与IL-1β和IL-6阳性染色细胞的共定位。有些阳性细胞(箭头)与DAPI清晰融合。比例尺：50μm。

图6.完全弗氏佐剂(CFA)足底内侧注射后，proBDNF在足底的上调。A.CFA注射后，BDNF和proBDNF在足底表达的时程。a,proBDNF和BDNF的代表性蛋白印迹；b-d,半定量分析BDNF、proBDNF及其比率(*p<0.05,**p<0.01与对照,单因素方差分析，之后Dunnett多重比较事后检验，n＝3)。B.CFA足底内侧注射后第1天，足底的组织学染色(a)和proBDNF免疫组织化学(b-c)；c,b中小框的高放大倍数图显示，proBDNF在炎性细胞高表达。比例尺：100μm。

图7.低浓度(0.5％)的福尔马林足底内侧注射后，共注射proBDNF恢复了双相疼痛性反应(*p<0.05对介质,两因素方差分析，之后邦弗朗尼多重比较事后检验，n＝10-12)。

图8.p75NTR在局部组织中的代表性免疫组织化学，正常对照(A-B)或福尔马林足底内侧注射后(C-D)。在正常对照足部皮肤中，p75NTR免疫反应显示以神经纤维样结构定位在皮下层中(A和B)。在福尔马林足底内侧注射后，p75NTR免疫反应急剧增加，并主要在炎性细胞中表达(箭头，C和D)。比例尺：50μm。

图9.0.25μg proBDNF蛋白足底内侧注射后，IL-1β、IL-6和TNF-α在3小时和24小时时的蛋白印迹。A.proBDNF蛋白注射后，IL-1β、IL-6和TNF-α的代表性免疫印迹；B-D.统计学分析IL-1β(B)、IL-6(C)和TNF-α(D)表达(*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001与对照,单因素方差分析，之后Dunnett多重比较事后检验，n＝3)。

具体实施方式

为了进一步理解本发明，下面将结合实施例对本发明的优选方案进行描述。这些描述只是举例说明本发明的特征和优点，而非限制本发明的保护范围。

实施例1

proBDNF的表达上调

1.免疫荧光双标：小鼠在水合氯醛麻醉下，采用4％多聚甲醛进行灌注，而后在10％福尔马林进行固定，经脱水后行石蜡包埋，切片。石蜡切片经加热进行抗原修复以及BSD封闭后，采用鼠抗人proBDNF单克隆抗体(Abcam公司，1:1000)和抗-IL-1β多克隆抗体(Cell Signaling公司，1:1000)或IL-6多克隆抗体(Cell Signaling公司，1:1000)4℃过夜孵育，经PBS洗涤3次，加入羊抗兔和驴抗鼠荧光抗体，孵育1小时后PBS洗3次，封片。

2.蛋白质免疫印迹(Western Blot)检测proBDNF的表达

每组各取6只小鼠，将小鼠深度麻醉，迅速取下给药侧足底皮肤、皮下及肌肉组织，置于已冰上预冷的组织裂解液中，匀浆机匀浆45s；4℃，12000g，离心15min，取上清液，BCA法测定蛋白浓度；用裂解液配平各个样品浓度，加5×上样缓冲液，沸水浴变性5min；取60μg总蛋白，12％SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，100v，2.5h；硝酸素纤维膜转膜，80v，2.5h；5％脱脂奶粉封闭2.5h，加一抗，proBDNF(鼠抗，1:1000)，GAPDH(鼠抗，1:1000)，5％脱脂奶粉/TBST稀释，4℃过夜；TBST洗涤3次，每次10min，加HRP二抗(1:2000)，室温2h；TBST洗涤3次，每次10min，ECL发光液显影，观察结果，Image J图像处理软件分析。

表1.足底proBDNF和BDNF在福尔马林炎性疼痛表达半定量(Western Blot)

蛋白	对照组	1小时	3小时	6小时	24小时
						BDNF/GAPDH	1400±280	540±85	730±120	900±200	820±90
proBDNF/GAPDH	250±80	570±120	500±80	480±90	440±70
						proBDNF/BDNF	0.16±0.035	1.05±0.14	0.71±0.08	0.56±0.03	0.45±0.06

与发明人的早期研究^[7]一致，在正常小鼠的足垫中检测到BDNF和proBDNF两者的表达(图1A)。proBDNF免疫反应分布于皮下层的神经纤维中(图1B a-c)。福尔马林足底内侧注射小鼠之后，proBDNF表达被上调，而在注射区域，成熟BDNF表达被下调(图1A)。增加的proBDNF可在神经纤维中检测(图1B)，由于丰富的proBDNF阳性染色与神经纤维的标记物神经丝-200和蛋白基因产物(PGP)9.5共定位(图4)。有趣的是，被上调的proBDNF也高度分布于相应外周炎症的炎性细胞中。实际上，双标记的免疫荧光显示，增加的proBDNF还与白介素-1β和IL-6阳性染色共定位(图5)。类似地，在弗氏完全佐剂注射引起的外周炎症中，proBDNF大幅升高，而在注射区域，成熟BDNF大幅下调(图6A)。增加的proBDNF还在炎性细胞中丰富表达(图6B)。这些发现提示，外周炎症抑制了proBDNF在局部组织中转化为成熟BDNF，炎性细胞很可能是被上调的proBDNF的重要来源。

实施例2

proBDNF的多克隆抗体可减弱炎性疼痛

众所周知，脊髓中的成熟BDNF参与炎性疼痛和神经性疼痛，中和增加的脊髓BDNF可减弱疼痛处理^[8]。外周炎症后上调的局部proBDNF暗示，外周proBDNF也参与炎性疼痛。为了测试该假设，发明人首先检查了中和增加的proBDNF是否可减弱福尔马林注射引起的炎性疼痛。福尔马林足底内侧注射通常引起两相疼痛反应，第一相在注射福尔马林后立即开始，并持续5分钟，第二相在注射后从第10分钟开始，并持续40-60分钟^[9]。多克隆抗人proBDNF抗体(poly-Ab-proBDNF)(5ml/kg)能完全阻断proBDNF的功能^[10]，在福尔马林足底内侧注射前30分钟，给药该多克隆抗体。

福尔马林炎性痛造模方法主要参照Bellasio S等的方法，先将小鼠放入透明树脂玻璃盒(30×20×20cm)适应30min，随后在其右后足底皮下注射50ul 1％福尔马林溶液，注射后即刻放回盒内，同时以5min为一时间段，记录注射后1h内小鼠舔和咬注射足的时间。足底皮下注射福尔马林是一种经典的急性炎性疼痛模型，在该模型中动物会出现特殊的自发性疼痛行为，表现为舔足和咬足，舔足或咬足的时间越长，说明疼痛程度越强。这种自发性疼痛行为一般可分为2相，第一相在注射后0-5min出现，第二相出现在注射后15-60min，在两相之间会出现一个间歇期。其中第二相被认为与疼痛敏感化(中枢敏感化)机制有关。

如表2数据所示，Ab-proBDNF多抗组第一相舔足时间较空白对照组缩短；而在第二相，Ab-proBDNF多抗组动物舔足时间较空白对照组显著减少，说明本发明的多克隆抗体对福尔马林第二相具有很明显的镇痛效果(**，p<0.01，对照组相比)。

表2.Poly-Ab-proBDNF对福尔马林双相痛的作用

鼠在腹腔注射醋酸后主要表现为腹壁收缩、伸直等翻转反应(Writhing Test)，尤其在注射后1小时表现最为明显，观察注射醋酸后1小时内翻转反应成为筛选镇痛药的常用模型之一。腹腔注射0.6％醋酸(0.2ml)只小鼠导致化学性腹痛。

注射醋酸前30分钟，对各实验组小鼠分别腹腔注射本发明的多克隆抗体(500μg/kg，0.2ml)或相同体积的空白对照(这里指的是PBS)。

如下表3数据所示，多克隆抗体实验组小鼠较空白对照组小鼠出现的翻转反应显著减少，说明给予本发明的多克隆抗体进行预处理可减轻醋酸腹腔注射引起腹痛。可以预期，本发明的单克隆抗体同样也能减轻腹痛。

表3.Poly-Ab-proBDNF对醋酸诱发的腹痛的作用

poly-Ab-proBDNF预处理大大减弱了两相的福尔马林引起的双相疼痛反应(图2A和2B)。而且，发明人研究了poly-Ab-proBDNF预处理是否也能缓解炎性腹痛。腹痛通过醋酸腹膜内(i.p.)注射建立，并由腹部翻转(abdominal writhes)的次数评估(Li F,Zhang JW,Wei R,Luo XG,Zhang JY,Zhou XF,Li CQ,Dai RP*.Sex-differentialmodulation of visceral pain by brain derived neurotrophic factor(BDNF)in rats.Neurosci Lett.2010 478,184-7)。如图2C所示，poly-Ab-proBDNF急剧抑制了雄性和雌性小鼠的内脏炎性疼痛，正如腹部翻转次数的急剧减少所显示的。这些发现暗示，中和内源性增加的proBDNF可减弱炎性疼痛。

实施例3

外周proBDNF是疼痛介质

该实验研究了上调proBDNF是否有助于疼痛超敏。首先，将重组人proBDNF蛋白注射至足底，并查验注射后的爪缩阈(paw withdrawalthreshold，PWT)。重组proBDNF足底内侧注射大大降低了PWT，剂量0.1μg时可检测到，而剂量0.25μg和1μg时，变得更为强劲(图2D)。然而，成熟BDNF(0.25μg)仅对PWT有边缘效应(图2D)。这些结果暗示，外周proBDNF，而非成熟BDNF，诱导机械性疼痛超敏。为了进一步证实上调proBDNF是否诱导机械性疼痛超敏，发明人查验了过表达外周proBDNF对PWT的作用。编码proBDNF基因和增强的绿色荧光蛋白(EGFP)基因的腺病毒载体(Ad-proBDNF)和仅携带EGFP基因的对照腺病毒载体(Ad-EGFP)递送至小鼠的足垫。注射后第7天，通过EGFP荧光和免疫印迹检测到proBDNF的高表达(图2E a-b)。由于非特异性炎症，递送Ad-EGFP稍稍差地降低了PWT。与之相反，通过足底内侧注射Ad-proBDNF过表达proBDNF显著降低了PWT(图2E c)，支持了proBDNF赋予疼痛超敏的假设。最后，发明人查验了proBDNF是否也有助于炎性自发性疼痛。较低浓度(0.5％)的福尔马林仅呈现第一相疼痛反应。将重组人proBDNF(0.1μg)或成熟BDNF(0.1μg)与0.5％福尔马林一起注射，以查验疼痛反应。0.5％福尔马林与proBDNF共注射可恢复第二相疼痛反应。然而，成熟BDNF与0.5％福尔马林共注射没有此效应(图7)。这些发现暗示，外源性局部proBDNF，而非成熟BDNF，会恶化自发性疼痛。

如果外周proBDNF有助于疼痛处理，则其应通向脊髓激活。脊髓中磷酸化胞外信号调节的激酶(p-ERK)是脊髓疼痛处理在疼痛中的指示剂^[11]。所以，发明人查验了外源性proBDNF注射对脊髓中p-ERK表达的影响。如图2F所示，足底内侧注射proBDNF(1μg)大大增加了p-ERK在同侧背角中的表达。这些发现进一步加强了外周proBDNF是疼痛介质的假设。

表4.足底注射proBDNF蛋白或BDNF蛋白对大鼠收缩阈值的影响

	溶媒组	0.1μg	0.25μg	1μg	BDNF
						基线	1.82±0.12	1.76±0.14	1.82±014	1.57±0.05	1.75±0.15
1小时	1.53±0.21	1.19±0.15	1.34±0.13	0.98±0.12	1.65±0.13
						3小时	1.62±0.13	1.02±0.11	1.24±0.15	0.94±0.11	1.56±0.17
6小时	1.55±0.13	0.86±0.15	1.05±0.13	0.85±0.12	1.46±0.15

表5.足底注射proBDNF腺病毒对大鼠足底收缩阈值的影响

	Ad-EGFP	Ad-proBDNF
			基线	1.32±0.13	1.56±0.23
7天	1.02±0.14	0.23±0.07

实施例4

p75NTR的上调和proBDNF激活炎性反应

在外周炎症中，增加的proBDNF在炎性细胞中高度表达，该炎性细胞多与IL-1β和IL-6阳性细胞共定位(图5)。鉴于proBDNF通过作用于其受体，p75NTR和sortilin，发挥其生物学功能，发明人查验了炎症是否也激活局部组织中的p75NTR和sortilin。在对炎症的反应中，p75NTR，而非sortilin，大幅增加，并广泛分布于炎性细胞中(图3A-B和图8)。早先的研究已显示，p75NTR死亡结构域(death domain)与受体相互作用蛋白-2相互作用，并导致NF-κB活化，后者是个熟知的转录因子，调节前炎性细胞因子表达^[12-13]。因此，激活的proBDNF-p75NTR信号通过炎性反应发挥其疼痛前效应。为了测试该假设，将重组人proBDNF蛋白(1μg)注射至足底，并检查其对炎性反应的影响。事实上，在外源性proBDNF足底内侧注射后，大量炎性细胞聚集至被注射区(图3C)。proBDNF足底内侧注射后，发明人进一步核查了局部前炎性因子，包括IL-1β、IL-6和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的水平。重组proBDNF注射提升了IL-1β、IL-6和TNF-α的表达(表6和表7，图3D和图9)。这些发现提示，proBDNF注射导致前炎性反应。与此相一致，局部前炎性细胞因子基因表达在对proBDNF足底内侧注射的反应中也被激活(图3E)。合在一起，本申请的结果强烈表明，proBDNF通过激活炎性反应恶化疼痛过程。

表6.足底注射外源性proBDNF对足底IL-1β，IL-6和TNF-α的基因表达

表7.足底注射外源性proBDNF对足底IL-1β，IL-6和TNF-α蛋白表达

	对照组	1μg-3小时	1μg-24小时
				IL-1β/GAPDH	0.21±0.05	2.45±0.43	1.98±0.37
IL-6/GAPDH	0.52±0.11	2.23±0.26	2.67±0.34
				TNF-α/GAPDH	0.56±0.08	1.38±0.23	1.45±0.26

上文提及的所有文献都在本申请中引作参考，就如同每一篇文献被单独引作参考那样。以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员而言，在不脱离本发明实质和原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，但这些改进和修饰也落入随附的权利要求请求保护的范围内。

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Claims (14)

1.对外周脑源性神经营养因子前体蛋白(proBDNF)或其信号传递分子具有中和或抑制活性的结合分子在制备用于缓解、抑制或治疗疼痛的药物中的应用。

2.权利要求1所述的应用，其中所述信号传递分子是proBDNF的受体p75NTR或其片段。

3.权利要求1或2所述的应用，其中所述疼痛包括但不限于炎性疼痛和手术疼痛。

4.权利要求1所述的应用，其中所述结合分子选自抑制和/或阻碍proBDNF或其信号传递分子基因表达的结合分子，特异性结合proBDNF或其信号传递分子的结合分子，或者促进proBDNF切割为成熟BDNF的结合分子。

5.权利要求4所述的应用，其中所述抑制和/或阻碍基因表达的结合分子选自反义核酸、siRNA、shRNA、dsRNA、miRNA或核酶。

6.权利要求4所述的应用，其中所述促进proBDNF切割为成熟BDNF的结合分子选自费林蛋白酶、基质金属蛋白酶(MMP)2/7/9和组织纤溶酶原激活物(tPA)。

7.权利要求4所述的应用，其中所述特异性结合proBDNF或其信号传递分子的结合分子选自抗体，与proBDNF结合的受体p75或其片段，及其功能变体。

8.权利要求2或7所述的应用，其中受体片段选自p75ECD-Fc。

9.权利要求7所述的应用，其中所述功能变体选自化学修饰变体，取代、添加或缺失变体。

10.权利要求7所述的应用，其中所述抗体是单克隆抗体、多克隆抗体、人源化抗体、嵌合抗体、鼠源抗体或其片段。

11.权利要求10所述的应用，其中所述片段选自Fab、F(ab')、F(ab')₂、Fv、dAb、Fd、互补决定区(CDR)片段、单链抗体(scFv)、二价单链抗体、单链噬菌体抗体、双特异双链抗体、三链抗体或四链抗体。

12.权利要求10所述的应用，其中所述多克隆抗体以proBDNF或其片段免疫动物而产生。

13.权利要求12所述的应用，其中所述片段为SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。

14.权利要求1或2所述的应用，其中所述结合分子为阻止proBDNF与其受体p75结合的拮抗剂。