CN103748113B - 神经丛蛋白b2活性的调节剂 - Google Patents

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Abstract

本文公开的是用于抑制神经丛蛋白B2介导的血管生成素活性的新型组合物和方法。此类组合物和方法可用于例如治疗癌症、治疗湿性AMD和抑制血管生成。本文还公开的是测定测试试剂是否是神经丛蛋白B2活性的调节剂的方法。

Description

神经丛蛋白B2活性的调节剂
相关申请
本申请要求于2011年3月28日提交的美国临时专利申请系列号61/468,271，和于2011年10月6日提交的美国临时专利申请系列号61/543,992的优先权利益；所述专利申请各自通过引用在此全文并入。
政府投资
本发明在美国国立卫生研究院授权CA105241下由政府支持进行。政府在本发明中拥有一定权利。
背景技术
小分泌性蛋白血管生成素(“ANG”)是血管生成的有力诱导物，其已牵涉多种肿瘤的建立、生长和转移。ANG活性的抑制因此是用于治疗癌症及其他血管生成相关疾病例如湿性老年性黄斑变性(“AMD”)的有吸引力的治疗策略。然而，尽管ANG在血管形成和癌症两者中的重要作用，与血管生成素ANG结合以介导其血管生成和肿瘤促进活性的受体仍是未知的。ANG受体的鉴定和表征将提供用于治疗癌症和抑制ANG介导的血管生成的新型治疗靶。
因此，存在鉴定和表征ANG受体的极大需要，以便开发用于抑制ANG活性、预防血管生成和治疗癌症的新型组合物和方法。
发明内容
如本文证实的，神经丛蛋白B2是介导ANG的血管生成和肿瘤促进活性的的ANG受体。本文还描述的是促成ANG结合的神经丛蛋白B2表位。因此，神经丛蛋白B2拮抗剂包括破坏ANG与神经丛蛋白B2的结合的试剂（例如抗神经丛蛋白B2抗体）可用于例如治疗癌症（例如前列腺癌或脑癌）、抑制血管生成和治疗血管生成相关疾病（例如湿性AMD）。
在某些实施例中，本发明涉及与神经丛蛋白B2的表位特异性结合的分离抗体或其抗原结合片段，所述神经丛蛋白B2的表位促成ANG结合。例如，在某些实施例中，抗体或其抗原结合片段与具有SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:3的氨基酸序列的神经丛蛋白B2的表位结合。在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段是单克隆、多克隆、嵌合、人源化或人的。在某些实施例中，抗体或其抗原结合片段是全长免疫球蛋白分子；scFv；Fab片段；Fab’片段；F(ab’)2；Fv；；或二硫键连接的Fv。在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段以不超过约10-6M、10-7M、10-8M或10-9M的解离常数与神经丛蛋白B2结合。在某些实施例中，抗体或其抗原结合片段抑制ANG与神经丛蛋白B2的结合和/或抑制ANG诱导的神经丛蛋白B2表达细胞的增殖。
在某些实施例中，本发明涉及包括SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和/或SEQ ID NO:3的氨基酸序列的分离可溶性多肽，其中所述多肽与ANG结合。在一些实施例中，该多肽包含SEQ ID NO:4的不超过25、30、40、50、60、70、80、90或100个连续氨基酸。在某些实施例中，该多肽还包括免疫球蛋白恒定结构域（例如人免疫球蛋白恒定结构域）。在某些实施例中，该多肽以不超过约10-6M、10-7M、10-8M或10-9M的解离常数与ANG结合。在某些实施例中，该多肽抑制ANG诱导的神经丛蛋白B2表达细胞的增殖。
在一些实施例中，本发明涉及含有本文描述的抗体、其抗原结合片段或多肽的药物组合物。
在某些实施例中，本发明涉及治疗受试者中（例如有此需要的受试者中）的癌症（包括前列腺癌或脑癌）、抑制血管生成和/或治疗湿性AMD的方法，其包括给该受试者施用治疗有效量的本文描述的抗体、其抗原结合片段或多肽的步骤。
在一些实施例中，本发明涉及抑制ANG诱导的神经丛蛋白B2表达细胞的增殖的方法，其包括使该细胞与本文描述的抗体、其抗原结合片段或多肽接触。
在某些实施例中，本发明涉及生产本文描述的抗体的方法，其包括给哺乳动物（例如小鼠）施用含有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和/或SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多肽（例如可溶性多肽）。在一些实施例中，该多肽含有SEQ ID NO:4的不超过25、30、40、50、60、70、80、90或100个连续氨基酸。在一些实施例中，该方法包括从哺乳动物中分离抗体的步骤。在一些实施例中，哺乳动物具有人免疫球蛋白可变区。
在一些实施例中，本发明涉及鉴定本文描述的抗体或其抗原结合片段的方法，其包括使抗体或其抗原结合片段与包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和/或SEQ ID NO:3.24的氨基酸序列的多肽接触。在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段是抗体或其抗原结合片段文库的部分。
在一些实施例中，本发明涉及治疗受试者中（例如有此需要的受试者中）的前列腺癌、抑制血管生成和/或治疗湿性AMD的方法，其包括给该受试者施用治疗有效量的神经丛蛋白B2拮抗剂（例如抗体或其抗原结合片段，干扰核酸例如siRNA、shRNA或反义RNA，或小分子）的步骤。在一些实施例中，神经丛蛋白B2拮抗剂抑制ANG与神经丛蛋白B2的结合或神经丛蛋白B2介导的ANG核转位。在一些实施例中，神经丛蛋白B2拮抗剂抑制神经丛蛋白B2蛋白质表达。
在一些实施例中，本发明涉及编码本文描述的抗体或其抗原结合片段的重链可变区和/或亲和力可变区的分离核酸。在一些实施例中，分离核酸包含在载体或细胞（例如表达本文描述的抗体或其抗原结合片段的细胞）内。
在一些实施例中，本发明涉及编码本文描述的多肽的分离核酸。在一些实施例中，分离核酸包含在载体或细胞（例如表达本文描述的多肽的细胞）内。
在某些实施例中，本发明涉及含有本文描述的抗体、其抗原结合片段、多肽和/或药物组合物的试剂盒。
在一些实施例中，本发明涉及测定测试试剂是否是神经丛蛋白B2活性的调节剂（例如抑制剂或增强剂）的方法。在某些实施例中，该方法包括形成包括神经丛蛋白B2多肽或其ANG结合片段、ANG多肽或其神经丛蛋白B2结合片段和测试试剂的测试反应混合物。在一些实施例中，该方法包括在有助于神经丛蛋白B2多肽或其ANG结合片段和ANG多肽或其神经丛蛋白B2结合片段之间的复合物形成的条件下，温育测试反应混合物的步骤。在一些实施例中，该方法包括测定测试反应混合物中的复合物的量的步骤。在一些实施例中，与对照反应混合物中的复合物的量相比较，减少测试反应混合物中的复合物的量的测试试剂是神经丛蛋白B2活性的抑制剂。在某些实施例中，与对照反应混合物中的复合物的量相比较，增加测试反应混合物中的复合物的量的测试试剂是神经丛蛋白B2活性的增强剂。
在一些实施例中，神经丛蛋白B2多肽或其ANG结合片段包含选自SEQ ID NO:1、SEQID NO:2和SEQ ID NO:3的氨基酸序列。在一些实施例中，ANG多肽或其神经丛蛋白B2结合片段包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列。
在一些实施例中，测试试剂是抗体、蛋白质、肽或小分子。在某些实施例中，测试试剂是测试试剂文库的成员。
在一些实施例中，对照反应混合物基本上等同于测试反应混合物，除了对照反应混合物不含测试试剂外。在某些实施例中，对照反应混合物基本上等同于测试反应混合物，除了对照反应混合物包含安慰剂试剂代替测试试剂外。
在一些实施例中，通过将测试试剂加入包含神经丛蛋白B2多肽或其ANG结合片段和ANG多肽或其神经丛蛋白B2结合片段的混合物，形成测试反应混合物。在某些实施例中，通过将神经丛蛋白B2多肽或其ANG结合片段加入包含测试试剂和ANG多肽或其神经丛蛋白B2结合片段的混合物，形成测试反应混合物。在某些实施例中，通过将ANG多肽或其神经丛蛋白B2结合片段加入包含测试试剂和神经丛蛋白B2多肽或其ANG结合片段的混合物，形成测试反应混合物。
在某些实施例中，神经丛蛋白B2多肽或其ANG结合片段锚定至测试反应混合物中的固体载体。在一些实施例中，在有助于ANG多肽或其神经丛蛋白B2结合片段与所锚定的神经丛蛋白B2多肽或其ANG结合片段结合的条件下，温育测试反应混合物。在一些实施例中，该方法还包括将结合神经丛蛋白B2多肽或其ANG结合片段的ANG多肽或其神经丛蛋白B2结合片段与未结合神经丛蛋白B2多肽或其ANG结合片段的ANG多肽或其神经丛蛋白B2结合片段相分离的步骤。在某些实施例中，通过检测与神经丛蛋白B2多肽或其ANG结合片段结合的ANG多肽或其神经丛蛋白B2结合片段的量，测定测试反应混合物中的复合物的量。在一些实施例中，ANG多肽或其神经丛蛋白B2结合片段连接（例如直接或间接结合）至可检测部分（例如荧光部分、发光部分、放射性部分等）。
在一些实施例中，ANG多肽或其神经丛蛋白B2结合片段锚定至测试反应混合物中的固体载体。在一些实施例中，在有助于神经丛蛋白B2多肽或其ANG结合片段与所锚定的ANG多肽或其神经丛蛋白B2结合片段结合的条件下，温育测试反应混合物。在某些实施例中，该方法还包括将结合ANG多肽或其神经丛蛋白B2结合片段的神经丛蛋白B2多肽或其ANG结合片段与未结合ANG多肽或其神经丛蛋白B2结合片段的神经丛蛋白B2多肽或其ANG结合片段相分离的步骤。在一些实施例中，通过检测与ANG多肽或其神经丛蛋白B2结合片段结合的神经丛蛋白B2多肽或其ANG结合片段的量，测定测试反应混合物中的复合物的量。在某些实施例中，神经丛蛋白B2多肽或其ANG结合片段连接至可检测部分。
在一些实施例中，本发明涉及测定测试试剂是否是神经丛蛋白B2活性的抑制剂的方法，其包括使包含具有选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的序列的表位的多肽与测试试剂接触，且测定该测试试剂是否与该表位结合；其中与该表位结合的该测试试剂是神经丛蛋白B2活性的抑制剂。在一些实施例中，测试试剂是抗体、蛋白质、肽或小分子。在某些实施例中，测试试剂是测试试剂文库的成员。
在一些实施例中，多肽附接至固体基质。在一些实施例中，该方法还包括将结合该表位的测试试剂与未结合该表位的测试试剂相分离的步骤。在一些实施例中，测试试剂连接至可检测部分。
在一些实施例中，测试试剂附接至固体基质。在某些实施例中，该方法还包括将结合该测试试剂的多肽与未结合该测试试剂的多肽相分离的步骤。在一些实施例中，多肽连接至可检测部分。在某些实施例中，测试试剂是测试试剂文库的成员。
附图说明
图1显示神经丛蛋白B1的三个ANG结合表位的氨基酸序列（分别鉴定为SEQ ID NO:1、2和3）。
图2显示人神经丛蛋白B2的氨基酸序列(SEQ ID NO:4)。
图3显示人ANG的氨基酸序列(SEQ ID NO:5)。
图4显示ANG在内皮细胞中的核转位是细胞密度依赖性的。(A)HUVE细胞在所示密度下培养且与0.1μg/ml ANG一起温育2小时。核ANG通过抗ANG单克隆抗体26-2F和Alexa488标记的兔抗小鼠IgG抗体进行检测。(B)125I-ANG的核转位。125I-ANG与在不同密度下培养的HUVE细胞一起温育2小时。分离核馏分，并且通过γ计数器测定125I-ANG的量。(C).HUVE细胞在所示密度下培养且与1μg/ml ANG一起温育48小时。细胞数目通过库尔特计数器进行测定。
图5显示ANG对LNCaP细胞的作用。(A)HUVE和LNCaP细胞在所示密度下培养且与0.1μg/ml ANG一起温育2小时。核ANG通过使用26-2F和Alex488标记的第二抗体的间接免疫荧光进行检测。(B)LNCaP细胞在无酚红和活性炭/右旋糖酐剥离（无类固醇）的FBS中培养2天，并且用DHT(10nM)、ANG(0.1μg/ml)或两者的混合物刺激所示时间。(C)剂量依赖性。将ANG加入细胞且培养4天。细胞数目通过库尔特计数器进行测定。
图6显示ANG与LNCaP细胞的结合。(A)亚汇合的LNCaP细胞与125I-ANG一起在4℃下温育30分钟，并且通过γ计数器测定结合的ANG。(B)在(A)中所述的实验中产生的结果的斯卡恰特作图。
图7显示神经丛蛋白B2是ANG结合分子。(A)制备来自总共2.5x108LNCaP细胞的质膜，溶解且经过RNA酶A-琼脂糖凝胶柱，以去除非特异性蛋白质。将来自RNA酶A柱的流通物馏分分成三个相等馏分，并且在与0.1mg游离ANG一起温育后分别施加于非亲和琼脂糖凝胶柱、ANG-琼脂糖凝胶柱和ANG-琼脂糖凝胶柱。将结合的材料用低pH缓冲液洗脱且在SDS-PAGE上分离。(B)将左图中间泳道中的条带切除，用胰蛋白酶消化且实施肽分子量的质谱测定。总共16种肽显示与神经丛蛋白B2匹配。(C)通过使用山羊抗人神经丛蛋白B2抗体(SantaCruz sc-34507,5μg/ml)的免疫荧光检测神经丛蛋白B2，并且通过DAPI染色核（中间泳道）。(D)加上Flag标签（C末端）的ANG与溶解的LNCaP细胞质膜一起在RT下温育30分钟。ANG-神经丛蛋白B2复合物通过抗ANG mAb26-2F或抗Flag IgG进行免疫沉淀，并且通过抗神经丛蛋白B2IgG进行检测（上泳道）。在另一实验中，复合物用抗神经丛蛋白B2IgG进行沉淀，且用抗ANG pAB R113进行检测（下泳道）。
图8显示神经丛蛋白B2特异性siRNA抑制ANG在LNCaP细胞中的核转位。LNCaP细胞用对照或以60nM最终浓度的神经丛蛋白B2特异性siRNA(Santa Cruz)进行转染。(A)神经丛蛋白B2mRNA在对照和siRNA转染的细胞中的RT-PCR分析（转染后48小时）。(B)神经丛蛋白B2蛋白质的蛋白质印迹检测（转染后72小时）。(C-H)LNCaP细胞在阳离子脂质体(lipofectamine)2000的存在下用对照和神经丛蛋白B2siRNA转染72小时，并且随后与1ug/ml ANG一起温育2小时。通过免疫荧光检测ANG（C和F），并且通过DAPI染色核（D和G）。合并的图像显示于E和H中。
图9显示在HeLa、LNCaP、HUVE和COS-7细胞中的神经丛蛋白B2表达。(A)在以所示密度培养的HeLa、LNCaP和HUVE细胞中的神经丛蛋白B2mRNA的RT-PCR分析。(B)将全长人神经丛蛋白B2cDNA克隆到pCI-Neo载体内，并且转染到COS-7细胞内。选择稳定转染子且通过RT-PCR分析人（转基因）和猴（内源）神经丛蛋白B2mRNA。(C)用同样识别猴蛋白质的山羊抗人神经丛蛋白B2抗体的神经丛蛋白B2蛋白质的蛋白质印迹分析。
图10显示ANG在用神经丛蛋白B2cDNA转染的COS-7细胞中的核转位。载体(A-C)和神经丛蛋白B2(D-F)转染的COS-7细胞与1μg/ml ANG一起温育2小时。通过免疫荧光检测ANG（A和D）。通过DAPI染色核（B和E）。合并的图像显示于C和F中。(G)载体和神经丛蛋白B2转染子与所示浓度的ANG一起温育2小时。将细胞裂解，使用各自抗体就磷酸-AKT和总AKT对细胞裂解产物（60μg蛋白质）实施SDS-PAGE和蛋白质印迹。
图11显示新霉素抑制ANG在神经丛蛋白B2转染的COS-7细胞中的核转位。神经丛蛋白B2转染子用新霉素以所示浓度处理10分钟，并且随后与1μg/ml ANG一起温育2小时。通过免疫荧光检测ANG（上图）。通过DAPI染色核（中图）。合并的图像显示于下图中。
图12显示ANG结合结构域的鉴定。(A)WT神经丛蛋白B2和缺失突变体的基因结构。(B)ANG在COS-7细胞的多个神经丛蛋白B2转染子中的核转位。WT神经丛蛋白B2cDNA或不同缺失突变体在pCI-Neo载体中构建且转染到COS-7细胞内。使转染子与1μg/ml ANG一起温育2分钟。通过免疫荧光检测ANG（上图）。通过DAPI染色核（中图）。合并的图像显示于下图中。ANG的代表性核染色由箭头指示。
图13显示抗神经丛蛋白B2抗体抑制ANG活性。(A)抗神经丛蛋白B2抗体抑制ANG在LNCaP细胞中的核转位。(B)抗神经丛蛋白B2抗体在HUVEC管形成测定中抑制ANG诱导的血管生成。(C)抗神经丛蛋白B2抗体抑制ANG诱导的LNCaP细胞增殖。
图14显示前列腺癌中增强的神经丛蛋白B2表达。(A)人前列腺癌（上2行）、BPH（下2行）和正常前列腺（右）组织中的神经丛蛋白B2的IHC染色。(B)正常和前列腺癌样品中的人神经丛蛋白B2染色的高倍放大图像。（C和D）来自WT和MPAKT小鼠的前列腺中的小鼠神经丛蛋白B2的IHC和IF染色。
图15显示增强的抗神经丛蛋白B2抑制小鼠中的肿瘤生长。(A)描述用60μg/小鼠的神经丛蛋白B2多克隆抗体或PBS对照的s.c.注射每天处理的，用PC-3细胞肿瘤移植的无胸腺小鼠的无肿瘤存活的图表。(B)描述(A)中所述的用PC-3移植的无胸腺小鼠的肿瘤大小的图表。(C)(A)中所述的用PC-3移植的无胸腺小鼠的照片。(D)得自(A)中所述的用PC-3移植的无胸腺小鼠的切除肿瘤的照片。
具体实施方式
总体
本文公开的是用于治疗癌症、抑制血管生成和治疗血管生成相关疾病例如湿性AMD的新型组合物和方法。
血管生成素(“ANG”)是血管形成的重要介质，其已牵涉肿瘤的建立、生长和转移。不幸的是，基于抑制ANG的血管生成和肿瘤促进活性的疗法的开发已受ANG受体迄今未知的事实阻碍。
如本文公开的，本发明人发现神经丛蛋白B2是介导ANG的血管生成和肿瘤促进效应的ANG受体。还如本文公开的，本发明人鉴定其中ANG与神经丛蛋白B2受体结合的位置，并且证实对这些结合位点特异性的抗神经丛蛋白B2抗体能够抑制神经丛蛋白B2/ANG相互作用且抑制ANG活性。
因此，在某些实施例中，本发明涉及通过抑制神经丛蛋白B2用于治疗ANG相关疾病或病症（例如癌症或湿性AMD）的组合物和方法。在一些实施例中，抑制神经丛蛋白B2的组合物包括例如与ANG或神经丛蛋白B2结合的抗体、其抗原结合片段或多肽。抑制ANG与神经丛蛋白B2结合的试剂包括例如与神经丛蛋白B2的ANG结合表位（例如含有SEQ ID NO:1、SEQID NO:2和/或SEQ ID NO:3的氨基酸序列的表位）结合的抗体或其抗原结合片段，和与ANG结合的多肽（例如含有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和/或SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多肽）。
定义
为了方便起见，说明书、实例和附加权利要求中采用的某些术语在此处收集。
如本文使用的，术语“施用”意指给受试者提供药物试剂或组合物，并且包括但不限于通过医学专业人员的施用和自施用。此类试剂可含有例如神经丛蛋白B2拮抗剂，例如本文描述的抗体、其抗原结合片段或多肽。
术语“试剂”在本文中用于指示化学化合物、小分子、化学化合物和/或生物大分子（例如核酸、抗体、抗体片段、蛋白质或肽）的混合物。试剂可通过本文下文描述的筛选测定鉴定为具有特定活性。此类试剂的活性可使其适合作为在受试者中局部或全身起作用的“治疗剂”，所述“治疗剂”是一种或多种生物学、生理学或药理学活性物质。
术语“氨基酸”意欲包含无论是天然还是合成的所有分子，所述分子包括氨基功能性和酸功能性，并且能够包括在天然存在的氨基酸的聚合物中。示例性氨基酸包括天然存在的氨基酸；其类似物、衍生物和同源物；具有变体侧链的氨基酸类似物；和前述任何的所有立体异构体。
如本文使用的，术语“抗体”可以是指完整抗体及其抗原结合片段。完整抗体是包括通过二硫键互联的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白。每条重链包括重链可变区（本文缩写为VH）和重链恒定区。每条轻链包括轻链可变区（本文缩写为VL）和轻链恒定区。VH和VL区还可再分成称为互补决定区(CDR)的高变区，由称为构架区（FR）的更保守区域点缀。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，从氨基末端到羧基末端以下述次序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，所述宿主组织或因子包括多种免疫系统细胞（例如效应子细胞）和经典补体系统的第一组分(Clq)。术语“抗体”包括例如单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、多特异性抗体（例如双特异性抗体）、单链抗体和抗原结合抗体片段。如本文使用的，“分离抗体”是指基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体。然而，分离抗体可与其他有关抗原具有一些交叉反应性。
如本文使用的，术语抗体的“抗原结合片段”和“抗原结合部分”是指保留与抗原结合的能力的一个或多个抗体片段。在术语抗体的“抗原结合片段”内包含的结合片段的例子包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、scFv、二硫键连接的Fv、Fd、双抗体、单链抗体、分离的CDRH3及其他保留完整抗体可变区的至少部分的抗体片段。这些抗体片段可使用常规重组和/或酶促技术获得，并且可以与完整抗体相同的方式筛选抗原结合。
术语“CDR”及其复数“CDRs”是指抗体或抗体片段的互补决定区(CDR)，其决定抗体或抗体片段的结合特征。在大多数情况下，三个CDR存在于轻链可变区中（CDRL1、CDRL2和CDRL3），并且三个CDR存在于重链可变区中（CDRH1、CDRH2和CDRH3）。CDR促成抗体分子的功能活性，并且通过包含支架或构架区的氨基酸序列分离。在多个CDR中，CDR3序列且特别是CDRH3是最多样化的，并且因此对抗体特异性具有最大贡献。存在至少两种用于测定CDR的技术：(1)基于交叉物种序列变异性的方法（即通过引用全文并入的Kabat等人，Sequencesof Proteins of Immunological Interest (National Institute of Health,Bethesda,Md.(1987)）；和(2)基于抗原-抗体复合物的结晶学研究的方法（通过引用全文并入的Chothia等人，Nature,342:877(1989)）。
术语“表位”意指能够与抗体特异性结合的蛋白质决定簇。表位通常由分子的化学活性表面分组例如氨基酸或糖侧链组成。某些表位可通过抗体能够与之结合的特定氨基酸序列，例如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3中提供的序列限定。
如本文使用的，术语“人源化抗体”是指具有衍生自除人外的哺乳动物的至少一个CDR，和人抗体的FR区和恒定区的抗体。人源化抗体可用作根据本发明的治疗剂中的有效组分，因为人源化抗体在人体中的抗原性是降低的。
在某些实施例中，术语“分离多肽”是指由重组DNA或RNA制备，或具有合成起源或其一些组合的多肽，所述多肽(1)不与它在自然界中通常与之一起发现的蛋白质结合，(2)从它通常存在于其中的细胞中分离，(3)不含来自相同细胞来源的其他蛋白质分离，(4)通过来自不同物种的细胞表达，或(5)在自然界中不存在。
术语“分离核酸”是指具有基因组、cDNA、或合成起源或其一些组合的多核苷酸，所述多核苷酸(1)不与在自然界中在其中发现“分离核酸”的细胞结合，或(2)可操作地连接至它在自然界中不与之连接的多核苷酸。
如本文使用的，术语“单克隆抗体”是指得自与相同表位特异性结合的基本上同质抗体群体的抗体，即群体包含的个别抗体是相同的，除了可以少量存在的可能天然存在的突变外。修饰词“单克隆的”指示如得自基本上同质的抗体群体的抗体特征，并且不应解释为需要通过任何特定方法的抗体生产。
术语“多核苷酸”和“核酸”可互换使用。它们指任何长度的聚合形式的核苷酸，脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物。多核苷酸可具有任何三维结构，并且可执行任何已知或未知的功能。下述是多核苷酸的非限制性例子：基因或基因片段的编码区或非编码区、由连锁分析确定的一个或多个基因座、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA、核糖体RNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离DNA、任何序列的分离RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可包含修饰过的核苷酸，例如甲基化核苷酸和核苷酸类似物。如果存在的话，对核苷酸结构的修饰可在聚合物装配前或后赋予。核苷酸序列可通过非核苷酸组分间断。多核苷酸还可例如通过与标记组分缀合进行修饰。术语“重组”多核苷酸意指具有基因组、cDNA、半合成或合成起源的多核苷酸，所述多核苷酸不存在于自然界中，或以非天然排列连接至另一多核苷酸。
如本文使用的，短语“可药用载体”意指可药用的材料、组合物或媒介物，例如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂或溶剂封装材料，涉及携带或转运主题化合物从身体的一个器官或部分到身体的另一器官或部分。
如本文使用的，“特异性结合”是指抗体与预定抗原结合的能力或多肽与其预定结合配偶体结合的能力。通常，抗体或多肽以对应于约10-7M或更少的KD的亲和力与其预定抗原或结合配偶体特异性结合，并且以这样的亲和力（如由KD表示的）与预定抗原/结合配偶体结合，所述亲和力比其与非特异性和无关抗原/结合配偶体（例如BSA、酪蛋白）结合的亲和力小至少10倍、小至少100倍或小至少1000倍。
如本文使用的，术语“受试者”意指选择用于处理或治疗的人或非人动物。
如本文使用的，短语“治疗有效量”和“有效量”意指试剂的量，其对于以适用于任何医学处理的合理利益/风险比在受试者中的至少细胞亚群中产生所需疗效。
“治疗”受试者中的疾病或“治疗”具有疾病的受试者是指对受试者实施药物治疗，例如药物的施用，使得至少一种疾病症状被降低或被阻止恶化。
抗神经丛蛋白B2抗体
在某些实施例中，本发明涉及与神经丛蛋白B2特异性结合的抗体及其抗原结合片段及其用途。在某些实施例中，抗体与具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和/或SEQ ID NO:3的氨基酸序列的神经丛蛋白B2表位结合，并且因此能够抑制ANG与神经丛蛋白B2结合。此类抗体可以是多克隆或单克隆的，并且可以是例如鼠、嵌合、人源化或全人的。
多克隆抗体可通过用多肽免疫原（例如具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和/或SEQID NO:3的序列的多肽）免疫接种合适受试者（例如小鼠）进行制备。可随着时间过去通过标准技术例如使用固定多肽的酶联免疫吸附测定(ELISA)，监控免疫接种受试者中的多肽抗体滴度。需要时，可从哺乳动物中（例如从血液中）分离针对抗原的抗体，并且还通过众所周知的技术例如蛋白A色谱法纯化，以获得IgG馏分。
在免疫接种后的合适时间，例如当抗体滴度最高时，可从受试者中获得抗体生产细胞且用于使用标准技术制备单克隆抗体，所述标准技术例如最初由Kohler和Milstein描述的杂交瘤技术(1975)Nature256:495-497)（还参见Brown等人(1981)J.Immunol.127:539-46；Brown等人(1980)J.Biol.Chem.255:4980-83；Yeh等人(1976)Proc.Natl.Acad.Sci.76:2927-31；和Yeh等人(1982)Int.J.Cancer29:269-75)、更近期的人B细胞杂交瘤技术（Kozbor等人(1983)Immunol.Today4:72）、EBV杂交瘤技术（Cole等人(1985)Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,Inc.,第77-96页）或三源杂交瘤技术。用于生产单克隆抗体杂交瘤的技术是众所周知的（一般参见Kenneth,R.H.于Monoclonal Antibodies:A New Dimension In Biological Analyses,PlenumPublishing Corp.,New York,New York(1980)；Lerner,E.A.(1981)Yale J.Biol.Med.54:387-402；Gefter,M.L.等人(1977)Somatic Cell Genet.3:231-36）。简言之，使永生细胞系（一般为骨髓瘤）融合至来自如上所述用免疫原免疫接种的哺乳动物的淋巴细胞（一般为脾细胞），并且筛选所得的杂交瘤细胞的培养上清液，以鉴定产生与多肽抗原优选特异性结合的单克隆抗体的杂交瘤。
作为制备单克隆抗体分泌杂交瘤的替代物，通过用合适多肽（例如具有SEQ IDNO:1的序列的多肽）筛选重组组合免疫球蛋白文库（例如抗体噬菌体展示文库或抗体酵母展示文库），可鉴定且分离对于神经丛蛋白B2特异性的单克隆抗体和/或具有SEQ ID NO:1的序列的多肽，从而分离结合该多肽的免疫球蛋白文库成员。
另外，可使用标准重组DNA技术制备对于神经丛蛋白B2特异性的重组抗体和/或具有SEQ ID NO:1的序列的多肽，例如嵌合或人源化单克隆抗体。此类嵌合和人源化单克隆抗体可通过本领域已知的重组DNA技术进行生产，例如使用下述中描述的技术：美国专利号4,816,567；美国专利号5,565,332；Better等人(1988)Science240:1041-1043；Liu等人(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA84:3439-3443；Liu等人(1987)J.Immunol.139:3521-3526；Sun等人(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.84:214-218；Nishimura等人(1987)CancerRes.47:999-1005；Wood等人(1985)Nature314:446-449；和Shaw等人(1988)J.Natl.CancerInst.80:1553-1559)；Morrison,S.L.(1985)Science229:1202-1207；Oi等人(1986)Biotechniques4:214；Winter U.S.Patent5,225,539；Jones等人(1986)Nature321:552-525；Verhoeyan等人(1988)Science239:1534；和Beidler等人(1988)J.Immunol.141:4053-4060。
使用携带人免疫系统而不是小鼠系统的部分的转基因或转染色体小鼠，可生成对于神经丛蛋白B2特异性的人单克隆抗体和/或具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和/或SEQ IDNO:3的序列的多肽。例如，“HuMAb小鼠”含有编码非重排的人重（μ和γ）和κ轻链免疫球蛋白序列的人免疫球蛋白基因小基因座，连同灭活内源μ和κ链基因座的靶向突变（Lonberg,N.等人(1994)Nature368(6474):856859）。因此，小鼠显示出减少的小鼠IgM或κ表达，并且响应免疫接种，引入的人重和轻链转基因经历类别转换和体细胞突变，以生成高亲和力的人IgGκ单克隆抗体（Lonberg,N.等人(1994)，同上；在Lonberg,N.(1994)Handbook ofExperimental Pharmacology113:49101中综述；Lonberg,N.和Huszar,D.(1995)Intern.Rev.Immunol.第13卷:6593，以及Harding,F.和Lonberg,N.(1995)Ann.N.YAcad.Sci764:536546）。HuMAb小鼠的制备在下述中描述：Taylor,L.等人(1992)NucleicAcidsResearch20:62876295；Chen,J.等人(1993)International Immunology5:647656；Tuaillon等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci USA90:37203724；Choi等人(1993)NatureGenetics4:117123；Chen,J.等人(1993)EMBO J.12:821830；Tuaillon等人(1994)J.Immunol.152:29122920；Lonberg等人，(1994)Nature368(6474):856859；Lonberg,N.(1994)Handbook of Experimental Pharmacology113:49101；Taylor,L.等人(1994)International Immunology6:579591；Lonberg,N.和Huszar,D.(1995)Intern.Rev.Immunol.第13卷:6593；Harding,F.和Lonberg,N.(1995)Ann.N.Y.Acad.Sci764:536546；Fishwild,D.等人(1996)Nature Biotechnology14:845851。还参见美国专利号5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,789,650；5,877,397；5,661,016；5,814,318；5,874,299；5,770,429；和5,545,807。
在某些实施例中，本发明的抗体能够以不超过10-6、10-7、10-8或10-9M的解离常数与具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和/或SEQ ID NO:3的氨基酸序列的神经丛蛋白B2表位结合。评估抗体的结合能力的标准测定是本领域已知的，包括例如ELISA、蛋白质印迹和RIA。抗体的结合动力学（例如结合亲和力）也可通过本领域已知的标准测定例如Biacore分析进行评价。在一些实施例中，抗体与神经丛蛋白B2的结合基本上抑制ANG与神经丛蛋白B2的结合。如本文使用的，当过量多肽使与配体结合的受体数量减少至少约20%、40%、60%或80%、85%或90%（如在体外竞争结合测定中测量的）时，抗体基本上抑制ANG与神经丛蛋白B2的结合。
可溶性神经丛蛋白B2受体多肽
在某些实施例中，本发明涉及包含神经丛蛋白B2的ANG结合表位的分离多肽（即包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和/或SEQ ID NO:3的氨基酸序列）。此类多肽可用于例如抑制ANG与神经丛蛋白B2的结合，和用于鉴定和/或生成与神经丛蛋白B2的ANG结合表位特异性结合的抗体。在某些实施例中，本发明的多肽不是神经丛蛋白B2。在一些实施例中，本发明的多肽包含天然神经丛蛋白B2蛋白质（例如具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的蛋白质）的小于100、90、80、70、60、50、40、30、25或20个连续氨基酸。在一些实施例中，本发明的多肽由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3组成。在一些实施例中，本发明的多肽包含如SEQID NO:4中所示的神经丛蛋白B2氨基酸序列的氨基酸165-441。
在一些实施例中，本发明的多肽能够与ANG结合。在一些实施例中，多肽以不超过10-5M、10-6M、10-7M、10-8M或10-9M的解离常数与ANG结合。评估多肽的结合能力的标准测定是本领域已知的，包括例如ELISA、蛋白质印迹和RIA，并且合适的测定在实例中描述。多肽的结合动力学（例如结合亲和力）也可通过本领域已知的标准测定例如Biacore分析进行评价。在一些实施例中，多肽与ANG的结合基本上抑制ANG与神经丛蛋白B2的结合。如本文使用的，当过量多肽使与配体结合的受体数量减少至少约20%、40%、60%或80%、85%或90%（如在体外竞争结合测定中测量的）时，多肽基本上抑制ANG与神经丛蛋白B2的结合。
在一些实施例中，可通过合适的纯化方案使用标准蛋白质纯化技术，从细胞或组织来源中分离本发明的多肽。在另一个实施例中，本发明的多肽通过重组DNA技术产生。作为另外一种选择，本发明的多肽可使用标准肽合成技术化学合成。
在一些实施例中，本发明的多肽包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和/或SEQ IDNO:3基本上等同的氨基酸序列。因此，在另一个实施例中，本发明的多肽包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和/或SEQ ID NO:3至少约80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%或更多等同的氨基酸序列。在某些实施例中，该多肽包含与SEQ ID NO:4的氨基酸165-441至少约80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%等同的氨基酸序列。
在某些实施例中，本发明的多肽包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和/或SEQ IDNO:2等同的氨基酸，除了1个或更多个（例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个）保守序列修饰外。如本文使用的，术语“保守序列修饰”意指基本上不影响或不改变含有氨基酸序列的抗体的结合特征的氨基酸修饰。此类保守修饰包括氨基酸置换、添加和缺失。修饰可通过本领域已知的标准技术引入抗体内，所述标准技术例如定点诱变和PCR介导的诱变。保守氨基酸置换是其中氨基酸残基替换为具有相似侧链的氨基酸残基的置换。具有相似侧链的氨基酸残基家族已在本领域中得到限定。这些家族包括具有碱性侧链（例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸）、酸性侧链（例如天冬氨酸、谷氨酸）、非荷电极性侧链（例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸）、非极性侧链（例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸）、β分支侧链（例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸）和芳香族侧链（例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸）的氨基酸。因此，本文描述的多肽的一个或多个氨基酸残基可替换为来自相同侧链家族的其他氨基酸残基，并且改变的抗体可使用本文描述的功能测定就保留的功能进行测试。
为了测定两个氨基酸序列或两个核酸序列的同一性百分比，序列就最佳比较目的进行比对（例如可在第一和第二氨基酸或核酸序列之一或两者中引入缺口用于最佳比对，并且可忽视非等同序列用于比较目的）。随后比较在相应氨基酸位置或核苷酸位置上的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置由与第二序列中的相应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，那么该分子在该位置上是等同的。两个序列之间的同一性百分比是由序列共享的等同位置数目的函数，考虑缺口数目和每个缺口的长度，所述缺口需要引入用于两个序列的最佳比对。
本发明还提供了嵌合或融合蛋白。如本文使用的，“嵌合蛋白”或“融合蛋白”包含连接至它在自然界中不与之连接的不同多肽的本发明的多肽（例如包含SEQ ID NO:1、SEQID NO:2或SEQ ID NO:3的多肽）。例如，不同多肽可直接、通过肽键或通过化学接头间接融合至多肽的N末端或C末端。在一些实施例中，本发明的多肽连接至免疫球蛋白恒定结构域（例如IgG恒定结构域例如人IgG恒定结构域）。
本发明的嵌合或融合多肽可通过标准重组DNA技术产生。例如，依照常规技术，例如通过采用平末端或交错末端用于连接、限制性酶消化以提供合适末端、适当时粘性末端的填入、碱性磷酸酶以避免不希望的连接和酶促连接，编码不同多肽序列的DNA片段在框内连接在一起。在另一个实施例中，融合基因可通过常规技术包括自动化DNA合成仪进行合成。作为另外一种选择，基因片段的PCR扩增可使用锚定引物执行，所述锚定引物产生在两个连续基因片段之间的互补突出端，所述互补突出端随后可退火且再扩增，以生成嵌合基因序列（参见例如，Current Protocols in Molecular Biology,Ausubel等人，编辑，JohnWiley&Sons:1992）。此外，已编码融合部分的许多表达载体是商购可得的。
本文描述的多肽可通过表达编码本发明多肽的多核苷酸在原核或真核宿主细胞中产生。作为另外一种选择，此类多肽可通过化学方法合成。用于在重组宿主中表达异源多肽、多肽的化学合成和体外翻译的方法是本领域众所周知的，并且还在下述中描述：Maniatis等人，Molecular Cloning:ALaboratory Manual(1989),第2版，Cold SpringHarbor,N.Y.；Berger和Kimmel,Methods in Enzymology,第152卷，Guide to MolecularCloning Techniques(1987),Academic Press,Inc.,San Diego,Calif.；Merrifield,J.(1969)J.Am.Chem.Soc.91:501；Chaiken I.M.(1981)CRC Crit.Rev.Biochem.11:255；Kaiser等人(1989)Science243:187；Merrifield,B.(1986)Science232:342；Kent,S.B.H.(1988)Annu.Rev.Biochem.57:957；和Offord,R.E.(1980)Semisynthetic Proteins,WileyPublishing，所述参考文献通过引用并入本文。
抑制性RNA分子
在某些实施例中，特异性靶向神经丛蛋白B2mRNA的抑制性RNA分子（例如反义分子、siRNA或shRNA分子、核酶或三螺旋分子）用于本发明的方法中。此类分子可用于例如抑制血管生成、治疗湿性AMD和/或治疗癌症包括前列腺癌的方法中。
本发明的抑制性RNA分子可与细胞接触或施用于生物体。作为另外一种选择，编码这些的构建体可与细胞或生物体接触或引入细胞或生物体内。反义构建体、反义寡核苷酸、RNA干扰构建体或siRNA双链体RNA分子可用于干扰目的蛋白质例如神经丛蛋白B2蛋白质的表达。一般地，神经丛蛋白B2mRNA序列（例如SEQ ID NO:4）的互补体的至少15、17、19或21个核苷酸对于反义分子是足够的。一般地，靶序列的至少19、21、22或23个核苷酸对于RNA干扰分子是足够的。RNA干扰分子可具有2核苷酸3'突出端。如果RNA干扰分子由构建体例如所需神经丛蛋白B2序列的发夹分子或反向重复在细胞中表达，则内源细胞机制将产生突出端。抑制性RNA分子可通过化学合成、体外转录或通过RNA酶III或切酶消化长dsRNA进行制备。这些可通过转染、电穿孔或本领域已知的其他方法引入细胞内。参见Hannon,GJ,2002,RNAInterference,Nature418:244-251；Bernstein E等人，2002,The rest is silence.RNA7:1509-1521；Hutvagner G等人，RNAi:Nature abhors a double-strand.Curr.Opin.Genetics&Development12:225-232；Brummelkamp,2002,A system forstable expression of short interfering RNAs in mammalian cells.Science296:550-553；Lee NS,Dohjima T,Bauer G,Li H,Li M-J,Ehsani A,Salvaterra P和Rossi J.(2002).Expression of small interfering RNAs targeted against HIV-1revtranscripts in human cells.Nature Biotechnol.20:500-505；Miyagishi M和Taira K.(2002).U6-promoter-driven siRNAs with four uridine3'overhangs efficientlysuppress targeted gene expression in mammalian cells.Nature Biotechnol.20:497-500；Paddison PJ,Caudy AA,Bernstein E,Hannon GJ和Conklin DS.(2002).Shorthairpin RNAs(shRNAs)induce sequence-specific silencing in mammaliancells.Genes&Dev.16:948-958；Paul CP,Good PD,Winer I和Engelke DR.(2002).Effective expression of small interfering RNA in human cells.NatureBiotechnol.20:505-508；Sui G,Soohoo C,Affar E-B,Gay F,Shi Y,Forrester WC和ShiY.(2002).A DNA vector-based RNAi technology to suppress gene expression inmammalian cells.Proc.Natl.Acad.Sci.USA99(6):5515-5520；Yu J-Y,DeRuiter SL和Turner DL.(2002).RNA interference by expression of short-interfering RNAs andhairpin RNAs in mammalian cells.Proc.Natl.Acad.Sci.USA99(9):6047-6052。
反义或RNA干扰分子可在体外递送至细胞或在体内递送至例如哺乳动物的肿瘤或缺氧组织。可使用本领域已知的一般递送方法。例如，干扰RNA可使用例如下述PCT申请号中所述的方法和组合物进行全身递送：PCT/US09/036223、PCT/US09/061381PCT/US09/063927、PCT/US09/063931和PCT/US09/063933，所述专利各自通过引用在此全文并入。在某些实施例中，siRNA局部递送。例如，当本文描述的siRNA用于治疗癌症时，对肿瘤的递送可通过瘤内注射完成，如例如Takahashi等人，Journal of Controlled Release116:90-95(2006)和Kim等人，Journal of Controlled Release129:107-116(2008)中所述，所述参考文献各自通过引用全文并入。作为另外一种选择，当本文描述的干扰RNA用于治疗湿性AMD时，干扰RNA可直接递送至眼，如例如通过引用全文并入的Reich等人，Mol Vis.,9:210-216(2003)中所述。
核酸分子
本发明的另一个方面涉及编码本文描述的抗体、其抗原结合片段和/或多肽的核酸分子。核酸可例如以全细胞、细胞裂解产物或部分纯化或基本上纯的形式存在。
本发明的核酸可使用标准分子生物学技术获得。例如，本文描述的核酸分子可使用标准PCR技术进行克隆或化学合成。对于通过杂交瘤表达的编码抗体的核酸，通过杂交瘤制备的编码抗体的轻和/或重链的cDNA可通过标准PCR扩增或cDNA克隆技术获得。对于得自免疫球蛋白基因文库的抗体（例如使用噬菌体或酵母展示技术），可从文库中回收编码抗体的核酸。
一旦获得编码VH和VL区段的DNA片段，这些DNA片段就还可通过标准重组DNA技术进行操作，例如以将可变区基因转换为全长抗体链基因、Fab片段基因或scFv基因。在这些操作中，编码VL-或VH-的DNA片段可操作地连接至编码另一蛋白质例如抗体恒定区或弹性接头的另一DNA片段。如这个背景下使用的，术语“可操作地连接的”意指两个DNA片段这样连接，使得由两个DNA片段编码的氨基酸序列保留在框内。
通过将编码VH的DNA可操作地连接至编码重链恒定区（CH1、CH2和CH3）的另一DNA分子，编码VH区的分离DNA可转换为全长重链基因。人重链恒定区基因的序列是本领域已知的（参见例如，Kabat,E.A.,等人(1991)Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,第五版，U.S.Department of Health and Human Services,NIH公开号91-3242），并且包含这些区域的DNA片段可通过标准PCR扩增获得。重链恒定区可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区，但最优选是IgG1或IgG4恒定区。对于Fab片段重链基因，编码VH的DNA可操作地连接至仅编码重链CH1恒定区的另一DNA分子。
通过将编码VL的DNA可操作地连接至编码轻链恒定区CL的另一DNA分子，编码VL区的分离DNA可转换为全长轻链基因（以及Fab轻链基因）。人轻链恒定区基因的序列是本领域已知的（参见例如Kabat,E.A.,等人(1991)Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,第五版，U.S.Department of Health and Human Services,NIH公开号91-3242），并且包含这些区域的DNA片段可通过标准PCR扩增获得。轻链恒定区可以是κ或λ恒定区，但最优选是κ恒定区。
在某些实施例中，本发明涉及含有本文描述的分离核酸分子的载体。如本文描述的，术语“载体”是指能够转运它已与之连接的另一核酸的核酸分子。一类载体是“质粒”，其是指另外的DNA区段可连接到其内的环状双链DNA环。另一类载体是病毒载体，其中另外的DNA区段可连接到病毒基因组内。某些载体能够在它们引入其内的宿主细胞中自主复制（例如具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体）。其他载体（例如非附加型哺乳动物载体）可在引入宿主细胞内之后整合到宿主细胞的基因组内，并且从而可连同宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导基因的表达。此类载体在本文中被称为“重组表达载体”（或简单的，“表达载体”）。
在某些实施例中，本发明涉及含有本文描述的核酸（例如编码本文描述的抗体、其抗原结合片段或多肽的核酸）的细胞。细胞可以是例如原核、真核、哺乳动物、禽类、鼠和/或人的。在某些实施例中，细胞是杂交瘤。在某些实施例中，本发明的核酸可操作地连接至转录控制元件例如启动子。在一些实施例中，细胞转录本发明的核酸，并且从而表达本文描述的抗体、其抗原结合片段或多肽。核酸分子可整合到细胞的基因组内，或它可以是染色体外的。
其他神经丛蛋白B2抑制剂
本发明的某些实施例涉及抑制血管生成和/或预防或治疗前列腺癌或湿性AMD的方法。这些方法包括施用降低神经丛蛋白B2的活性和/或表达，和/或预防神经丛蛋白B2与ANG的结合的试剂。可用于调节神经丛蛋白B2活性的试剂包括对于神经丛蛋白B2特异性的抗体（例如与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3结合的抗体）、蛋白质、肽、小分子和抑制性RNA分子例如siRNA分子、shRNA、核酶和反义寡核苷酸。
在一些实施例中，调节神经丛蛋白B2的任何试剂均可用于实践本发明的方法。此类试剂可以是本文描述的那些、本领域已知的那些、或通过常规筛选测定（例如本文描述的筛选测定）鉴定的那些。
在一些实施例中，用于鉴定在本发明的方法中有用的试剂的测定包括在神经丛蛋白B2和一种或多种测定组分之间的反应。其他组分可以是测试化合物（例如潜在试剂）、或测试化合物和ANG的组合。经由此类测定鉴定的试剂可例如用于预防或治疗前列腺癌或湿性AMD和/或抑制血管生成。
在本发明的方法中有用的试剂可得自任何可用来源，包括天然和/或合成化合物的系统文库。试剂还可通过本领域已知的组合文库法中的众多方法中的任何获得，所述方法包括：生物文库；类肽文库（具有肽功能性但具有新型非肽主链的分子文库，所述分子对酶促降解是抗性的，但仍保持生物活性；参见例如，Zuckermann等人，1994,J.Med.Chem.37:2678-85)；可空间寻址的平行固相或液相文库；需要重叠合法的合成文库法；‘一珠一化合物’文库法；和使用亲和色谱法选择的合成文库法。生物文库和类肽文库方法限制于肽文库，而其他四种方法可应用于肽、非肽寡聚物或化合物的小分子文库(Lam,1997,Anticancer Drug Des.12:145)。
用于合成分子文库的方法的例子可在本领域中找到，例如：DeWitt等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90:6909；Erb等人(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:11422；Zuckermann等人(1994).J.Med.Chem.37:2678；Cho等人(1993)Science261:1303；Carrell等人(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33:2059；Carell等人(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33:2061；和Gallop等人(1994)J.Med.Chem.37:1233。
试剂的文库可存在于溶液中（例如Houghten,1992,Biotechniques13:412-421），或珠(Lam,1991,Nature354:82-84)、芯片(Fodor,1993,Nature364:555-556)、细菌和/或孢子(Ladner,USP5,223,409)、质粒上（Cull等人，1992,Proc Natl Acad Sci USA89:1865-1869），或噬菌体上（Scott和Smith,1990,Science249:386-390；Devlin,1990,Science249:404-406；Cwirla等人，1990,Proc.Natl.Acad.Sci.87:6378-6382；Felici,1991,J.Mol.Biol.222:301-310；Ladner，同上）。
可例如使用用于筛选调节神经丛蛋白B2活性的候选或测试化合物的测定，鉴定在本发明的方法中有用的试剂。例如，可就抑制神经丛蛋白B2与ANG结合的能力筛选候选或测试化合物。
用于鉴定调节神经丛蛋白B2活性的化合物的测定系统的基本原理涉及在足以允许神经丛蛋白B2与ANG结合的条件和时间下，制备含有神经丛蛋白B2和ANG的反应混合物。为了就调节活性测试试剂，在测试化合物的存在和不存在下制备反应混合物。测试化合物可起初包括在反应混合物中，或可在神经丛蛋白B2和ANG添加以后的时间加入。对照反应混合物不与测试化合物一起或与安慰剂一起温育。随后检测在神经丛蛋白B2和ANG之间的任何复合物形成。在对照反应中的复合物形成，但在含有测试化合物的反应混合物中更少的此类形成或无此类形成，指示该化合物干扰神经丛蛋白B2和ANG的相互作用。
用于调节神经丛蛋白B2与ANG的相互作用的化合物的测定可以异质或同质形式进行。异质测定涉及将神经丛蛋白B2或ANG锚定到固相上，并且在反应结束时检测锚定至固相的复合物。在同质测定中，整个反应在液相中执行。在任一方法中，可改变反应物的添加次序，以获得关于待测试化合物的不同信息。例如，可通过在测试物质的存在下执行反应，即通过在神经丛蛋白B2和ANG之前或同时将测试物质加入反应混合物，来鉴定干扰神经丛蛋白B2和ANG之间的相互作用（例如通过竞争）的测试化合物。作为另外一种选择，可通过在复合物已形成后将测试化合物加入反应混合物，来测试破坏预先形成的复合物的测试化合物，例如以更高结合常数置换来自复合物的组分之一的化合物。多种形式在下文简要描述。
在异质测定系统中，将神经丛蛋白B2或ANG锚定到固体表面或基质上，而其他相应非锚定组分可直接或间接标记。在实践中，微量滴定板通常用于这种方法。锚定种类可通过许多非共价或共价方法进行固定，所述方法一般是实践该技术的人员众所周知的。非共价附接通常可通过用神经丛蛋白B2或ANG溶液包被固体表面且干燥而简单地完成。作为另外一种选择，对于待锚定的抗体组分特异性的固定抗体可用于这个目的。
在有关测定中，可提供添加结构域的融合蛋白，所述结构域允许测定组分中的一种或两种锚定至基质。例如，谷胱甘肽-S-转移酶/标记融合蛋白或谷胱甘肽-S-转移酶/结合配偶体可吸附到谷胱甘肽琼脂糖凝胶珠(Sigma Chemical,St.Louis,MO)或谷胱甘肽衍生的微量滴定板上，所述珠或微量滴定板随后与测试化合物或测试化合物和非吸附的神经丛蛋白B2或ANG组合，并且混合物在有助于复合物形成的条件（例如生理条件）下温育。在温育后，例如如上所述，将珠或微量滴定板孔洗涤以去除任何未结合的测定组分，直接或间接评价固定复合物。作为另外一种选择，复合物可与基质解离，并且使用标准技术测定神经丛蛋白B2结合或活性水平。
同质测定也可用于鉴定神经丛蛋白B2的抑制剂。这一般是类似于上文提及那些的反应，其在测试化合物的存在或不存在下在液相中进行。随后分离所形成的复合物与未反应的组分，并且测定形成的复合物的量。如对于异质测定系统提及的，反应物加入液相的次序可获得关于哪种测试化合物调节（抑制或增强）复合物形成且破坏预先形成的复合物的信息。
在此类同质测定中，反应产物可通过许多标准技术中的任何与未反应的测定组分分离，所述标准技术包括但不限于：差异离心、色谱法、电泳和免疫沉淀。在差异离心中，由于复合物基于其不同大小和密度的不同沉降平衡，分子的复合物可通过一系列离心步骤与未复合的分子分离（参见例如Rivas,G.和Minton,A.P.,Trends Biochem Sci1993Aug;18(8):284-7)。标准色谱技术也可用于分离复合分子与未复合分子。例如，凝胶过滤色谱法基于大小而分离分子，并且通过利用以柱形式的合适凝胶过滤树脂，例如，相对更大的复合物可与相对更小的未复合组分分离。类似地，与未复合分子相比较，复合物相对不同的电荷性质可例如通过使用离子交换色谱树脂用于差异分离复合物与剩余的个别反应物。此类树脂和色谱技术是本领域技术人员众所周知的（参见例如，Heegaard,1998,JMol.Recognit.11:141-148；Hage和Tweed,1997,J.Chromatogr.B.Biomed.Sci.Appl.,699:499-525）。凝胶电泳也可用于分离复合分子与未结合的种类（参见例如Ausubel等人（编辑），于：Current Protocols in Molecular Biology,J.Wiley&Sons,New York.1999）。在这种技术中，例如蛋白质或核酸复合物基于大小或电荷进行分离。为了维持电泳过程期间的结合相互作用，在不存在还原剂的情况下的非变性凝胶一般是优选的，但对于特定相互作用物合适的条件将是本领域技术人员众所周知的。免疫沉淀是用于从溶液中分离蛋白质-蛋白质复合物的另一常见技术（参见例如，Ausubel等人（编辑），于：Current Protocolsin Molecular Biology,J.Wiley&Sons,New York.1999）。在这种技术中，通过使抗体缀合至可通过离心容易地收集的聚合物珠，从溶液中沉淀与对于结合分子之一特异性的抗体结合的所有蛋白质。结合的测定组分从珠中释放（通过特异性蛋白分解事件或本领域众所周知的不扰乱复合物中的蛋白质-蛋白质相互作用的其他技术），并且执行第二免疫沉淀步骤，这次利用对于相应的不同相互作用测定组分特异性的抗体。以这种方式，仅形成的复合物应保持附接至珠。可比较在测试化合物的存在和不存在下的复合物形成中的变化，从而提供关于化合物调节神经丛蛋白B2和ANG之间的相互作用的能力的信息。
还可例如使用其中使细胞与候选化合物接触且测定神经丛蛋白B2mRNA或蛋白质表达的方法，鉴定神经丛蛋白B2表达的调节剂。在候选化合物的存在下mRNA或蛋白质的表达水平与在不存在候选化合物的情况下mRNA或蛋白质的表达水平相比较。候选化合物随后可基于这种比较鉴定为神经丛蛋白B2表达的抑制剂。
药物组合物
在某些实施例中，本发明涉及含有连同可药用载体一起配制的本文描述的至少一种抗体、其抗原结合片段或ANG结合多肽的组合物，例如药物组合物。在一个实施例中，该组合物包括本发明的多种（例如两种或更多种）试剂的组合。
本发明的药物组合物还可在联合治疗中施用，即与其他试剂组合施用。例如，本发明的药物组合物还可包括另外的血管生成抑制剂，例如贝伐珠单抗雷珠单抗和阿柏西普（VEGF肼）。
如下文详细描述的，本发明的药物组合物可特别配制用于以固体或液体形式施用，包括适合于下述的那些：(1)经口施用，例如一服药剂(drenches)（水或非水溶液或悬浮液），片剂例如靶向用于经颊、舌下和全身吸收的那些，弹丸，粉末，颗粒剂，用于应用于舌的糊剂；或(2)肠胃外施用，例如通过皮下、肌内、静脉内或硬膜外注射，如例如无菌溶液或悬浮液，或持续释放制剂。
制备这些制剂或组合物的方法包括使本文描述的试剂与载体和任选的一种或多种辅助成分结合的步骤。一般而言，制剂的制备方法包括：使本文描述的试剂与液体载体、或精细分开的固体载体或两者均匀且亲密地结合，且随后需要时，使产物成形。
本发明适合于肠胃外施用的药物组合物包含与一种或多种可药用的无菌等渗水或非水溶液、分散体、悬浮液或乳状液或无菌粉末组合的一种或多种本文描述的试剂，所述粉末可紧在使用前重构成无菌可注射溶液或分散体，其可含有糖、醇、抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、使得该制剂与预期接受者的血液等渗的溶质、或悬浮剂或增稠剂。
可用于本发明的药物组合物中的合适水和非水载体的例子包括水、乙醇、多元醇（例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等）及其合适混合物、植物油例如橄榄油、和可注射的有机酯例如油酸乙酯。例如可通过使用包衣材料例如卵磷脂、通过在分散体的情况下维持所需粒度和通过使用表面活性剂，维持合适的流动性。
与选择的施用途径无关，通过本领域技术人员已知的常规方法，将可以合适的水合形式使用的本发明的试剂和/或本发明的药物组合物配制成可药用的剂型。
治疗方法
本文公开的是治疗或预防ANG相关状况和/或抑制血管生成的新型治疗方法，所述ANG相关状况包括癌症（例如前列腺癌或脑癌，例如成胶质细胞瘤）和湿性AMD。
在一些实施例中，本发明提供了治疗癌症包括癌性肿瘤（例如实体瘤）的治疗方法，其包括给受试者（例如有此需要的受试者）施用有效量的试剂，所述试剂抑制神经丛蛋白B2表达或活性或者抑制ANG与神经丛蛋白B2的结合。在一些实施例中，本发明提供了抑制血管生成或治疗血管生成介导的疾病包括湿性AMD或癌症的治疗方法。
本发明的药物组合物可通过任何合适的施用途径递送，所述施用途径包括经口、如通过例如喷雾剂经鼻、经直肠、阴道内、肠胃外、脑池内和如通过粉末、软膏或滴剂局部，包括经颊和舌下。在某些实施例中，药物组合物一般递送（例如经由经口或肠胃外施用）。在某些其他实施例中，药物组合物通过直接注射到肿瘤内（在癌症治疗的情况下）或直接注射到眼内（在湿性AMD治疗的情况下）局部递送。
当用于治疗癌症时，此类方法可包括施用与一种或多种治疗剂和/或血管生成抑制剂结合的本文描述的药物组合物，所述血管生成抑制剂包括例如贝伐珠单抗雷珠单抗和阿柏西普（VEGF肼）。
联合疗法包括序贯、同时和分离的和/或活性化合物以此类方式的共施用，使得当施用后续试剂时，施用的第一试剂的疗效仍未完全消失。在某些实施例中，第二试剂可与第一试剂共配制，或在分离的药物组合物中配制。
在某些实施例中，本发明涉及治疗湿性AMD的治疗方法，其包括给受试者（例如有此需要的受试者）施用有效量的本文描述的试剂。有此需要的受试者可包括例如已诊断有湿性AMD的受试者、易受湿性AMD影响的受试者或已就湿性AMD治疗的受试者，包括已对先前治疗抗拒的受试者。
在某些实施例中，本发明提供了治疗癌症包括癌性肿瘤（例如实体瘤）的治疗方法，其包括给受试者（例如有此需要的受试者）施用有效量的本文描述的试剂。有此需要的受试者可包括例如已诊断有肿瘤包括癌前肿瘤、癌症的受试者，或已治疗的受试者，包括已对先前治疗抗拒的受试者。
本发明的方法可用于治疗任何癌性或癌前肿瘤。在某些实施例中，癌性肿瘤是前列腺癌或脑癌（例如成胶质细胞瘤）。可通过本发明的方法和组合物治疗的癌症还包括但不限于来自膀胱、血液、骨、骨髓、脑、乳腺、结肠、食管、胃肠、齿龈、头、肾、肝、肺、鼻咽、颈、卵巢、前列腺、皮肤、胃、睾丸、舌或子宫的癌细胞。此外，癌症可特别具有下述组织学类型，尽管它并不限于这些：赘生物，恶性；癌；癌，未分化的；巨细胞和梭形细胞癌；小细胞癌；乳头状癌；鳞状细胞癌；淋巴上皮癌；基底细胞癌；毛基质癌；移行细胞癌；乳头状移行细胞癌；腺癌；胃泌素瘤，恶性；胆管上皮癌；肝细胞癌；结合性肝细胞癌和胆管癌；小梁性腺癌；腺样囊性癌；腺瘤性息肉内腺癌；腺癌，家族性结肠息肉病；实体癌；类癌瘤，恶性；支气管-肺泡癌；乳头状腺癌；嫌色性癌；嗜酸性细胞癌；嗜酸性腺癌；嗜碱性细胞癌；透明细胞腺癌；粒细胞癌；滤泡性腺癌；乳头状和滤泡状腺癌；无包膜形成的硬化性癌；肾上腺皮质癌；子宫内膜癌；皮肤附件癌；大汗腺腺癌；皮脂性腺癌；耵聍腺腺癌；粘液表皮样癌；囊腺癌；乳头状囊腺癌；乳头状浆液性囊腺癌；粘液囊腺癌；粘液腺癌；印戒细胞癌；浸润性导管癌；髓样癌；小叶癌；炎性癌；佩吉特氏病，乳房的；腺泡细胞癌；腺鳞状癌；腺癌/鳞状化生；胸腺瘤，恶性；卵巢间质肿瘤，恶性；泡膜细胞瘤，恶性；粒层细胞瘤，恶性；和成神经细胞瘤(roblastoma)，恶性；塞尔托利细胞癌；莱迪希细胞瘤，恶性；脂质细胞瘤，恶性；副神经节瘤，恶性；乳房外副神经节瘤，恶性；嗜铬细胞瘤；血管球肉瘤；恶性黑素瘤；无色素性黑素瘤；浅表扩散性黑素瘤；巨大色素痣内恶性黑素瘤；上皮样细胞黑素瘤；蓝痣，恶性；肉瘤；纤维肉瘤；纤维组织细胞瘤，恶性；粘液肉瘤；脂肪肉瘤；平滑肌肉瘤；横纹肌肉瘤；胚胎型横纹肌肉瘤；小泡型横纹肌肉瘤；间质肉瘤；混合瘤，恶性；苗勒混合瘤；肾母细胞瘤；肝母细胞瘤；癌肉瘤；间叶瘤，恶性；勃勒纳肿瘤(brenner tumor)，恶性；叶状瘤，恶性；滑膜肉瘤；间皮瘤，恶性；无性细胞瘤；胚胎性癌；畸胎瘤，恶性；卵巢甲状腺肿，恶性；绒毛膜癌；中肾瘤，恶性；血管肉瘤；血管内皮瘤，恶性；卡波济氏肉瘤；血管外皮细胞瘤，恶性；淋巴管肉瘤；骨肉瘤；近皮质骨肉瘤；软骨肉瘤；软骨母细胞瘤，恶性；间质性软骨肉瘤；骨巨细胞瘤；尤文氏肉瘤；牙源性肿瘤，恶性；成釉细胞牙肉瘤；成釉细胞瘤，恶性；成釉细胞纤维肉瘤；松果体瘤，恶性；脊索瘤；神经胶质瘤，恶性；室管膜瘤；星形细胞瘤；原浆性星形细胞瘤；纤维性星形细胞瘤；成星形细胞瘤；成胶质细胞瘤；少突神经胶质瘤；成少突神经胶质细胞瘤；原始神经外胚层；小脑肉瘤；神经节成神经细胞瘤；成神经细胞瘤；成视网膜细胞瘤；嗅神经源性肿瘤；脑膜瘤，恶性；神经纤维肉瘤；神经鞘瘤，恶性；颗粒细胞瘤，恶性；恶性淋巴瘤；何杰金氏病；何杰金氏淋巴瘤；类肉芽肿；恶性淋巴瘤，小淋巴细胞性；恶性淋巴瘤，大细胞、弥散性；恶性淋巴瘤，滤泡性；蕈样肉芽肿病；其他指定的非何杰金氏淋巴瘤；恶性组织细胞增多症；多发性骨髓瘤；肥大细胞肉瘤；免疫增生性小肠病；白血病；淋巴样白血病；浆细胞白血病；红白血病；淋巴肉瘤细胞性白血病；髓样白血病；嗜碱细胞性白血病；嗜酸细胞性白血病；单核细胞性白血病；肥大细胞白血病；成巨核细胞性白血病；髓样肉瘤；和多毛细胞白血病。
在本发明的药物组合物中活性成分的实际剂量水平可这样改变，以便获得活性成分的量，所述量有效实现对于特定患者、组合物和施用模式的所需治疗应答，而对该患者无毒。
所选剂量水平将取决于多种因素，包括采用的特定试剂的活性，施用途径，施用时间，待采用的特定化合物的排泄或代谢率，治疗持续时间，与采用的特定化合物组合使用的其他药物、化合物和/或材料，待治疗患者的年龄、性别、重量、状况、一般健康和先前医疗史，和医学领域中众所周知的类似因素。
具有本领域普通技术的医生或兽医可容易地决定且开出所需药物组合物的有效量。例如，医生或兽医可以低于为了实现所需疗效需要那种的水平开出和/或施用在药物组合物中采用的本发明化合物的剂量，且逐步增加剂量直至达到所需效应。
例证
目前一般描述的本发明通过参考下述实例将更容易理解，所述实例仅包括用于举例说明本发明的某些方面和实施例的目的，并且不预期以任何方式限制本发明。
实例1.ANG受体在内皮细胞而不是前列腺癌细胞中的细胞密度依赖性表达。
因为ANG最初鉴定为血管生成蛋白质，所以先前努力已集中于内皮细胞。然而，如本文描述的，ANG对内皮细胞的活性严格依赖于细胞密度（图4）。免疫荧光显示外源ANG在人脐静脉内皮(HUVE)细胞中的核转位仅在稀疏培养的细胞中发生（图4A）。核转位随着细胞密度增加而降低，并且在汇合细胞中停止。如图4B中所示，使用125I标记的ANG证实ANG在HUVE细胞中的细胞密度依赖性核转位。一致地，ANG诱导的HUVE细胞增殖也依赖于细胞密度（图4C）。针对内皮细胞的ANG活性与细胞密度的反相关指示当细胞密度增加时，ANG受体在内皮细胞中是下调的。
人ANG在人前列腺癌尤其是非雄激素依赖型前列腺癌中是上调的。小鼠ANG是在鼠前列腺限制性AKT激酶转基因(MPAKT)小鼠中AKT诱导的前列腺上皮内瘤(PIN)组织中最高上调的基因。ANG在前列腺癌进展中发挥双重作用。它不仅介导肿瘤血管生成，还直接刺激癌细胞增殖。如本文描述的，与内皮细胞形成对比，ANG在LNCaP人前列腺癌细胞中的核转位不依赖于细胞密度（图5A）。通常，当在无酚红和无类固醇培养基中培养时，LNCaP细胞将存活但不增殖（图5B）。如图5B中所示，双氢睾酮(DHT)刺激LNCaP细胞增殖。ANG还在不存在雄激素的情况下刺激LNCaP细胞增殖，指示ANG可补偿雄激素剥夺。当ANG和DHT同时添加时，未观察到附加或协同效应，指示ANG和DHT在刺激LNCaP细胞增殖中共享相同机制。图5C显示ANG以剂量依赖性方式刺激LNCaP细胞增殖。这些结果指示ANG受体在LNCaP细胞中表达，并且当细胞密度增加时，ANG受体的表达在LNCaP细胞中不是下调的。
实例2.神经丛蛋白B2作为ANG结合蛋白的鉴定。
通过标准放射受体测定来测定ANG与LNCaP细胞结合的热力学。ANG用碘-125进行标记，并且与表达ANG受体的LNCaP细胞一起在4℃下温育。图6A显示125I-ANG与LNCaP细胞的结合是可饱和的。斯卡恰特分析鉴定分别具有0.45nM和170nM的表观Kd的两个ANG结合位点（图6B）。
在ANG-琼脂糖凝胶柱上的亲和色谱法用于分离假定的ANG受体。制备来自总共2.5x108LNCaP细胞的质膜，溶解且经过RNA酶A-琼脂糖凝胶柱，以去除非特异性蛋白质（RNA酶A和ANG具有35%氨基酸同一性，伴随总体56%的同源性。然而，RNA酶A不是生成血管的，并且不与LNCaP细胞表面结合）。将来自RNA酶A柱的流通物馏分分成三个相等馏分，并且在与0.1mg游离ANG一起温育后分别施加于非亲和琼脂糖凝胶柱、ANG-琼脂糖凝胶柱和ANG-琼脂糖凝胶柱。将结合的材料用低pH缓冲液洗脱且在SDS-PAGE上分离。如图7A中所示，从ANG-琼脂糖凝胶柱中洗脱具有～200kDa的表观MW的显著条带（中间泳道）。这个条带在来自非亲和琼脂糖凝胶柱的洗脱物中未出现（左泳道），并且当样品与游离ANG一起预温育时，它的丰度极大减少（右泳道），指示它对于ANG是特异性的。
从凝胶中切除这个条带，并且将胰蛋白酶肽提交用于质谱法分析。NCBInr数据库的Mascot搜索揭示与人神经丛蛋白B2的肽的总共16个匹配（图7B）。神经丛蛋白B2是主要在神经元起源的细胞中表达的细胞表面蛋白质。神经丛蛋白家族蛋白质与信号素(Semaphorin)相互作用，以调节神经元迁移和模式形成，以及血管生成、侵袭性生长和细胞凋亡。
通过免疫荧光检查神经丛蛋白B2在LNCaP细胞中的表达。如图7C中所示，神经丛蛋白B2主要在细胞表面上检测到，与其为跨膜蛋白质一致。为了了解ANG是否在体内与神经丛蛋白B2结合，执行共免疫沉淀实验。为了这个目的，将flag标签加入ANG的C末端，并且由大肠杆菌表达系统制备且纯化融合蛋白。使ANG-Flag与溶解的LNCaP细胞质膜馏分一起温育，并且实施IP-蛋白质分析。神经丛蛋白B2可通过抗ANG单克隆抗体以及抗Flag抗体进行沉淀（图7D，上图）。类似地，ANG可通过抗神经丛蛋白B2抗体进行沉淀（图7D，下图）。这些结果证实ANG事实上可与神经丛蛋白B2结合。
实例3.神经丛蛋白B2介导ANG的核转位。
合成siRNA用于击倒LNCaP细胞中的神经丛蛋白B2表达（图8）。击倒效率通过RT-PCR（图8A）和蛋白质印迹（图8B）分析进行测定。图8C显示ANG在LNCaP细胞中的核转位在神经丛蛋白B2击倒细胞中被抑制（图8F）。这些结果证实神经丛蛋白B2对于ANG的核转位是必需的。
如上所述，ANG的核转位在内皮细胞中是细胞密度依赖性的，但在癌细胞中是组成性的（图4）。因此检查在不同密度下培养的HUVE细胞中的神经丛蛋白B2表达水平。图9A显示当细胞处于10%汇合时，神经丛蛋白B2mRNA在HUVE细胞中是可检测的。该表达在30%汇合细胞中降低，并且当汇合达到60%时减小。相比之下，神经丛蛋白B2mRNA在90%汇合的HeLa和LNCaP细胞中仍是可检测的（图9A）。这些结果与神经丛蛋白B2是关于ANG的功能受体一致。
为了进一步表征神经丛蛋白B2在介导ANG活性中的作用，将全长神经丛蛋白B2cDNA克隆到pCI-neo载体内，将所述pCI-neo载体转染到COS-7细胞内。选择载体对照(pCI-neo)和神经丛蛋白B2（pCI-神经丛蛋白B2）的稳定转染子，并且通过RT-PCR分析使用对于人神经丛蛋白B2特异性的引物组检测转基因表达（图9B）。在载体和神经丛蛋白B2转染子中均检测到低水平的猴神经丛蛋白B2mRNA（图9B）。使用抗神经丛蛋白B2IgG的蛋白质印迹显示在COS-7细胞的载体转染子中低水平的神经丛蛋白B2蛋白质和在神经丛蛋白B2转染子中增加的水平（图9C）。神经丛蛋白B2蛋白质也在90%汇合的HeLA和LNCaP细胞与30%汇合的HUVE细胞检测到（图9C）。
接下来，检查ANG在COS-7细胞中的载体和神经丛蛋白B2转染子中的核转位。图10显示强核转位在神经丛蛋白B2转染子中出现，但在载体转染子中仅检测到最小量的核ANG。因此，人神经丛蛋白B2在COS-7细胞中的表达允许ANG的核转位，指示神经丛蛋白B2足以介导ANG的核转位。
ANG还已显示活化内皮细胞中的AKT。检查在COS-7细胞的神经丛蛋白B2转染子中的AKT磷酸化状态。图10G显示ANG处理诱导COS-7细胞的神经丛蛋白B2转染子而不是在载体对照转染子中的AKT磷酸化。这些结果暗示神经丛蛋白B2是关于ANG的功能受体，并且负责介导ANG的核转位和AKT磷酸化。
新霉素已显示阻断ANG在内皮细胞和癌细胞中的核转位。检查新霉素对COS-7细胞的神经丛蛋白B2转染子的作用。图11显示新霉素以剂量依赖性方式抑制ANG在COS-7细胞的神经丛蛋白B2转染子中的核转位。因此，人神经丛蛋白B2cDNA的转染将COS-7细胞转换为ANG响应细胞。就ANG生物活性必需的ANG的核转位而言，COS-7细胞的神经丛蛋白B2转染子以与LNCaP细胞和稀疏培养的HUVE细胞（两种已知的ANG响应细胞系）相似的方式起作用。
实例4.ANG结合结构域对神经丛蛋白B2的作图。
神经丛蛋白B2是具有大细胞外部分和相对小的细胞内结构域的单次跨膜蛋白质（图12A）。细胞外部分由Sema结构域、3个PSI结构域和3个TIG结构域组成。为了测定ANG结合位点，制备一系列其中Sema结构域或3个PSI结构域之一已被缺失的缺失突变型（图12A）。将这些缺失突变型转染到COS-7细胞内，并且通过免疫荧光测定ANG在这些转染子中的核转位。如图12B中所示，ANG的核转位仍在用突变体2、3和4转染的COS-7细胞而不是突变体1转染的细胞中发生，指示ANG与神经丛蛋白B2的Sema结构域结合。通过这种方法，关于ANG的假定结合位点位于神经丛蛋白B2氨基酸序列的残基316和449之间。化学合成覆盖这个区域的一系列18个氨基酸的肽，并且通过ELISA以及通过平衡分析检查它们与ANG蛋白质的结合亲和力。发现具有氨基酸序列GTSSEYDSILVEINKRVK(SEQ ID NO:1)、LDKVHAKMEANRNAC(SEQ IDNO:2)和RDGLRGTAVLQRGGLNL(SEQ ID NO:3)的肽能够与ANG结合，指示这些氨基酸序列是神经丛蛋白B2的ANG结合表位。
实例5.对于神经丛蛋白B2的ANG结合表位特异性的抗体抑制ANG活性。
以0.2μM的表观Kd结合ANG，由SEQ ID NO:1表示的这个ANG结合肽用于生成如本文描述的多克隆抗神经丛蛋白B2抗体。图10A显示用这个亲和力纯化的抗神经丛蛋白B2抗体处理LNCaP细胞阻断ANG的核转位，而非免疫IgG对ANG的核转位无作用（图13A）。类似地，抗神经丛蛋白B2抗体抑制ANG诱导的内皮管形成（图13B）以及LNCaP细胞增殖（图13C）。
实例6.在前列腺癌组织中增强的神经丛蛋白B2表达。
在人和小鼠癌组织中检查神经丛蛋白B2的表达水平。图14A描述神经丛蛋白B2在人前列腺组织阵列中的IHC染色。癌组织（上2行）具有比良性前列腺增生(BPH)（下2行）显著更强的染色。该阵列上的2个正常前列腺组织样品（最右侧）不具有染色或具有极弱的染色。图14B描述正常和前列腺癌组织的高倍放大图像。神经丛蛋白B2位于癌细胞的细胞表面上（箭头）。神经丛蛋白B2也在MPAKT小鼠的PIN组织中过表达（图14C和14D）。IHC和IF两者均显示神经丛蛋白B2在腺间血管的内皮细胞（图14C和图14D中的箭头）以及PIN组织的腺上皮细胞中强烈表达，但在WT小鼠中极弱表达。
实例7.针对神经丛蛋白B2的ANG结合表位的抗体抑制小鼠中的肿瘤生长
研究上文描述的神经丛蛋白B2抗体针对在无胸腺小鼠中的PC-3细胞肿瘤的异种移植物生长的抑制活性。60μg/小鼠的神经丛蛋白B2抗体的s.c.注射的每天处理使PC-3细胞肿瘤的建立减少50%（含有33μl基质胶的100μl体积中的1x106细胞）（图15A）。对照组（PBS处理）中的所有小鼠(n=6)到第18天时发展可触摸肿瘤。然而，一半神经丛蛋白B2抗体处理的小鼠在实验结束时（第40天）从未发展肿瘤。在的确发展肿瘤的小鼠中，它们的生长率显著减慢（图15B-D）。PBS处理和神经丛蛋白B2抗体处理的动物中的平均肿瘤重量分别为0.96±0.24g和0.2±0.16g。因此，神经丛蛋白B2IgG使无胸腺小鼠中的PC-3细胞肿瘤生长减少79%。
通过引用并入
本文提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用在此全文并入，如同每个个别出版物、专利或专利申请特别且个别指出通过引用并入相同。在冲突的情况下，以本申请包括本文的任何定义为准。
等价方案
本领域技术人员将认识到或能够使用不超过例行实验确定与本文描述的本发明的具体实施例的许多等价方案。此类等价方案预期由下述权利要求包含。

Claims (11)

1.一种与神经丛蛋白B2的血管生成素结合表位特异性结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述血管生成素结合表位由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成，其中所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段抑制血管生成素与神经丛蛋白B2的结合。
2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是嵌合、人源化或全人的。
3.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段是选自下述的抗体片段：
全长免疫球蛋白分子；
scFv；
Fab片段；
Fab’片段；
F(ab’)2；
Fv；和
二硫键连接的Fv。
4.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段以不超过10-7M的解离常数与神经丛蛋白B2结合。
5.根据权利要求l所述的抗体或其抗原结合片段在制备用于治疗癌症的药物中的用途。
6.根据权利要求5所述的用途，其中所述癌症是前列腺癌或脑癌。
7.根据权利要求6所述的用途，其中所述癌症是成胶质细胞瘤。
8.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段在制备用于抑制受试者中的血管生成的药物中的用途。
9.根据权利要求8所述的用途，其中所述受试者具有癌症。
10.根据权利要求8所述的用途，其中所述受试者具有湿性老年性黄斑变性。
11.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段在制备用于治疗湿性老年性黄斑变性的药物中的用途。
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