CN103003294A - 基因融合靶向治疗 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于癌症治疗的组合物和方法,所述癌症治疗包括但不限于癌标记的靶向性抑制。具体地讲,本发明涉及用作前列腺癌的临床靶的复发基因融合。
Description
本申请要求2010年2月19日提交的临时专利申请61/306,262的优先权,该临时专利申请以引用方式整体并入本文。
关于联邦资助研究或开发的声明
本发明根据美国国立卫生研究院授予的CA069568、CA129565、CA132874和CA111275以及美国陆军医学研究和物资司令部授予的W81XWH-08-0110在美国政府的支持下完成。美国政府在本发明中享有某些权利。
技术领域
本发明涉及用于癌症治疗的组合物和方法,所述癌症治疗包括但不限于癌症标记的靶向性抑制。具体地讲,本发明涉及用作前列腺癌的临床靶的复发基因融合。
发明背景
癌症研究的一个核心目标是,鉴定改变的原因性地参与肿瘤生成的基因。已经鉴定出几类体细胞突变,包括碱基置换、插入、缺失、易位和染色体增加和减少,它们都会导致癌基因或肿瘤抑制基因活性的改变。在二十世纪早期首次假设,现在有确凿证据表明,染色体重排在癌症中的成因作用(Rowley,Nat Rev Cancer 1:245(2001))。认为复发的染色体畸变是白血病、淋巴瘤和肉瘤的基本特征。上皮肿瘤(癌)是更常见的,且会促成相对大部分的与人癌症有关的发病率和死亡率,它包含小于1%的已知疾病特异性染色体重排(Mitelman,MutatRes 462:247(2000))。虽然血液恶性肿瘤经常表征为平衡的、疾病特异性的染色体重排,但大多数实体瘤具有过多的非特异性染色体畸变。认为实体瘤的染色体组型的复杂性是由于通过癌症进化或进展获得的二级改变。
已经描述了染色体重排的2个基本机理。在一个机理中,一个基因的启动子/增强子元件重排在原癌基因附近,从而造成致癌蛋白表达的改变。这类易位的实例是,免疫球蛋白(IG)和T-细胞受体(TCR)基因向MYC的添附,这分别导致该癌基因在B-和T-细胞恶性肿瘤中的激活(Rabbitts,Nature 372:143(1994))。在第二个机理中,重排会导致2个基因的融合,这产生可能具有新的功能或改变的活性的融合蛋白。该易位的原型实例是慢性髓细胞性白血病(CML)中的BCR-ABL基因融合(Rowley,Nature 243:290(1973);de Klein等人,Nature 300:765(1982))。重要的是,该发现导致甲磺酸伊马替尼(Gleevec)的合理开发,该药物成功地靶向BCR-ABL激酶(Deininger等人,Blood 105:2640(2005))。因而,需要靶向普通上皮肿瘤中的复发基因重排的治疗。
发明概述
本发明涉及用于癌症治疗的组合物和方法,所述癌症治疗包括但不限于癌症标记的靶向性抑制。具体地讲,本发明涉及用作前列腺癌的临床靶的复发基因融合。
例如,在一些实施方案中,本发明提供抑制ERG基因在细胞中的表达的方法,其包括使细胞与抗ERG的siRNA接触(例如,选自例如SEQ ID NO:30-41的siRNA)。在一些实施方案中,所述细胞为癌细胞(例如前列腺癌细胞)。在一些实施方案中,所述细胞在体内。在一些实施方案中,所述细胞在动物(例如人)体内。在一些实施方案中,所述细胞为离体的。在一些实施方案中,ERG基因与TMPRSS2融合。
在其他实施方案中,本发明提供试剂盒,其包括抑制ERG基因在细胞中的表达的药物组合物,其中所述组合物包含抗ERG的siRNA(例如具有选自例如SEQ ID NO:30-41的序列的siRNA)。
在其他实施方案中,本发明提供抑制ERG基因在细胞中的表达的方法和组合物,包括反义、shRNA、miRNA、包含平端、突出端的siRNA、和miRNA治疗以及它们的使用方法。
在一些实施方案中,本发明提供包含与ETS家族成员基因(例如ERG)的ETS域结合的肽的组合物。在一些实施方案中,所述肽与包含肽序列RALRYYYDK(SEQ ID NO:1)的ETS域的区域结合。在一些实施方案中,所述肽与包含ERG的R367的ETS域的区域(例如ERG的氨基酸R367至K375)结合。在一些实施方案中,所述肽包含氨基酸序列LSFGSLP(SEQ ID NO:2)、FTFGTFP(SEQ ID NO:44)或LPPYLFT(SEQ ID NO:45)。
本发明的实施方案还提供使用肽来抑制细胞中ETS家族成员基因产物的至少一种生物活性(例如侵入性)的方法,其包括使细胞与肽接触,所述肽与ETS家族成员的ETS域结合。在一些实施方案中,所述细胞为癌细胞(例如前列腺癌细胞)。在一些实施方案中,所述细胞在体内(例如在诸如人或非人哺乳动物的动物体内)。在其他实施方案中,所述细胞为离体或在体外。在一些实施方案中,ETS家族成员基因(例如ERG)与雄激素调节基因(例如TMPRSS2)融合。
本文还描述了其他实施方案。
附图简述
图1示出前列腺癌中AR结合的基因组概貌。(A)在代表性染色体上的ChIP-Seq AR结合峰。(B)图示显示AR结合在KLK3增强子上的ChIP-Seq读数。(C)表示来自LNCaP和VCaP细胞的AR结合基因组区域的重叠的维恩图。(D)AR结合位点(ARBS)与最近的基因的转录起始位点(TSS)的距离。(E)AR结合峰的高度与包含ARE基序的序列的百分比(%ARE)以及每个峰区域的ARE平均数(#ARE)正相关。(F)AR结合峰的高度与雄激素应答性相关(对于4h,r=0.72;对于16h,r=0.68)。(G)通过ChIP-Seq鉴定的存在于AR结合区域中的共有基序。
图2示出结合在前列腺癌的5’融合伴侣上的AR以及其与雄激素介导的基因表达的相关性。(A-E)在此前表征的前列腺癌中的5’融合伴侣的调控区域处的AR结合峰。图示如图1B中所表示。Y轴上是VCaP(左)和LNCaP(右)中在每个25bp滑动窗口中的读数。插图表示通过常规ChIP-PCR对LNCaP细胞中在靶基因上的AR结合(作为输入百分比测定)的验证,所述LNCaP细胞已进行激素剥夺达3天并且用乙醇(E)或R1881(R)处理16h。在(E)图下面是在雄激素不敏感的看家基因HNRPA2B1的相应区域处PolII和H3K4me3富集的ChIPSeq峰。(F)雄激素调节的基因表达和AR结合之间的相关性。上图:在LNCaP前列腺癌细胞中通过在雄激素刺激之后4h和16h时相对于0h的t统计划分的雄激素诱导或阻遏基因。下图:(4h)和(16h)曲线表示在其基因内区域内或其TSS上游50kb内具有至少一个ChIP-SeqAR结合位点的差异表达基因的比率的500个基因的移动平均数。(G)包含至少一个AR结合位点的雄激素诱导或阻遏基因的百分比。
图3示出前列腺癌细胞中ERG结合的基因组概貌。(A)VCaP AR结合基因富集的分子概念的网络视图。每个节点表示分子概念或基因集合,其中节点大小与每个概念内的基因数成比例。(B)结合在此前报道的VCaP细胞中的ERG靶上的ERG的实例。(C)AR或ERG结合位点相对于最近的TSS的分布。(D)显示在VCaP细胞中鉴定的内源ERG结合位点与在具有稳定ERG过表达的RWPE+ERG细胞中发现的异位ERG结合位点的重叠的维恩图。
图4示出ERG介导途径和AR介导途径之间的分子交互作用。(A)LNCaP AR、VCaP AR、VCaP ERG、VCaP H3K4me3和VCaP PolII结合区域的重叠。通过超几何检验,*P<0.05,**P<0.01和***P<0.001。(B)VCaP细胞中被AR和ERG共同占位的基因的代表性实例。图示如图1B中所表示,不同的是Y轴分别表示AR结合(左)和ERG结合(右)的ChIP-Seq读数。(C)AR和ERG在4B中所示的一系列基因上共占位的ChIP-PCR证明。左边上的Y轴表示在R1881(R)处理的VCaP细胞中的靶基因的AR ChIP富集与在乙醇(E)处理的VCaP细胞中的靶基因的AR ChIP富集之比,所述VCaP细胞已经激素剥夺达3天。
图5示出连接TMPRSS2-ERG、野生型ERG和AR的反馈回路。(A)通过ChIP-Seq分析ERG结合AR的调控区域。A、E和I的图示如图1B中所表示,不同的是Y轴上是所指示的在VCaP细胞中的AR或ERG结合的ChIP-Seq序列数。(B)ERG结合AR的调控区域的常规ChIP-PCR证明。(C)在VCaP细胞中异位ERG过表达阻遏ARmRNA。(D)在VCaP细胞中异位ERG过表达抑制AR蛋白水平。(E)通过ChIP-Seq分析AR结合AR的调控区域。(F)AR结合AR的调控区域的常规ChIP-PCR证明。(G)合成雄激素R1881抑制VCaP细胞中AR mRNA表达。(H)R1881抑制VCaP细胞中AR蛋白表达。(I)通过ChIP-Seq分析ERG结合野生型ERG的调控区域。(J)ERG结合野生型ERG的调控区域的常规ChIP-PCR证明。误差线:n=3,平均值±SEM,P<0.01。(K)在前列腺癌中为普遍融合产物的截短ERG(外显子2-12)的异位表达诱导野生型ERG但不诱导TMPRSS2-ERG和总ERG。(L)TMPRSS2-ERG的特异性RNA干扰导致野生型ERG的阻遏。(M)在表达ETS基因融合的人前列腺癌亚组中野生型ERG被诱导。
图6示出在人前列腺癌组织中基因组范围的ERG和AR共定位的证明。(A)代表性人前列腺癌组织的ERG和AR ChIP-Seq分析。(B)显示AR或ERG结合基因组区域与H3K4me3(与活性染色质和基因表达相关的组蛋白标记)富集区域的重叠的维恩图。(C)在前列腺癌组织中被AR和ERG共同占位的基因的代表性实例。图示如图1B中所表示,不同的是Y轴表示组织中的AR和ERG结合并且示出的相对于染色体位置按比例绘制的示意性基因结构位于ChIP-Seq图下方。(D)AR在TMPRSS2和AR的增强子上占位的ChIP-PCR证明。(E)ERG在AR和野生型ERG的调控区域上占位的ChIP-PCR证明。(F)在转移性前列腺癌组织(组织-ERG)中ERG结合基因富集的分子概念的网络视图。
图7示出在不存在雄激素的情况下ERG的异位表达保持雄激素敏感的前列腺癌细胞的肿瘤性质。(A)由结合DNA介导的AR和ERG间接相互作用。VCaP(B)在不存在雄激素的情况下异位ERG过表达诱导VCaP细胞生长。(C)在激素剥夺的VCaP细胞中异位ERG过表达部分地挽救雄激素介导的细胞侵袭。(D)雄激素诱导的基因表达模式和ERG介导的基因表达模式之间的显著重叠(P<0.001)。(E)前列腺癌细胞中的异位ERG过表达加快细胞生长。(F)异位ERG过表达赋予雄激素非依赖性细胞增殖。(G)人前列腺肿瘤中的互连转录调节回路的概念模型。
图8示出ChIP-Seq的技术和生物重复性。(A)相同ChIP-Seq样品的技术重复(黑色上行峰对红色下行峰)之间的重复性。b,来自独立ChIP和样品制剂的两个生物样品的ChIP-Seq分析之间的重复性。
图9示出在FKBP5增强子上的AR ChIP-Seq结合峰。
图10示出人、鼠和另外15个脊椎动物基因组之间的转录因子结合位点的保守性。
图11示出最佳AR结合基因的前列腺组织特异性。
图12示出VCaP中差异表达和AR结合的相关性。(A),上图:在LNCaP前列腺癌细胞系中通过在4h和16h时相对于0h的t统计划分的被雄激素上调或下调的基因。下图:(4h)和(16h)曲线表示在VCaP细胞中在转录起始位点上游50kb内或基因内区域内包含AR结合位点的基因的比率的500个基因的移动平均数。(B),在LNCaP中在雄激素处理4h或16h时相对于0h被雄激素上调或下调的基因中在VCaP中包含至少一个AR结合位点的基因的百分比,如通过ChIPseq所鉴定(在右侧图示出)。
图13示出AR结合基因与体内基因表达的关联。AR结合基因与雄激素应答性(A)、前列腺癌分级(B-C)和ERG状态(C-D)相关。
图14示出ERG诱导的差异表达和ERG结合之间的相关性。(A),上图:通过在RWPE良性前列腺上皮细胞系中的t统计划分的被ERG过表达上调或下调的基因。下图:红线表示在VCaP细胞中在转录起始位点上游50kb内或基因内区域内包含ERG结合位点的基因的比率的500个基因的移动平均数。(B),在RWPE中被ERG过表达上调或下调的基因中在VCaP中包含至少一个ERG结合位点的基因的百分比,如通过ChIPseq所鉴定。
图15示出VCaP ERG结合基因富集的分子概念的网络视图。将VCaP细胞中的ChIP-Seq ERG结合基因基于峰高进行划分并且对最高的3000个基因分析在MCM中表示的分子标签或基因集合中的不成比例的富集。
图16示出ERG表达负调节AR表达的水平。(A)将VCaP细胞用腺病毒ERG或lacZ对照进行感染。进行QRTPCR来检测ERG和AR在lacZ或ERG感染细胞中的水平。(B)将VCaP细胞用针对ERG的siRNA双链体(siERG)或对照siRNA进行转染。进行QRT-PCR来检测ERG和AR的水平。(C)将RWPE良性前列腺上皮细胞用腺病毒ERG或lacZ对照进行感染。QRT-PCR。
图17示出在合成雄激素R1881的时序处理之后AR转录物的阻遏。
图18示出在LNCaP和PREC细胞中主要融合ERG产物的过表达上调野生型ERG表达。
图19示出在雄激素处理时序之后ERG变体的表达分析。
图20示出在RNA干扰各种ERG变体后侵袭性降低。在VCaP细胞中进行对每种ERG变体特异的RNA干扰。(A)使用修改的Boyden小室实验(Boyden Chamber Assay)进行侵袭性检测。(B)示出被侵袭的细胞的显微照片。
图21示出转移性前列腺癌组织的ChIP-Seq分析揭示在此前报道的KLK3和TMPRSS2基因的增强子处的AR结合。
图22示出ERG过表达诱导激素剥夺的前列腺癌细胞生长,如通过WST细胞增殖分析所确定。
图23示出ERG过表达挽救激素剥夺的LNCaP和VCaP前列腺癌细胞的细胞侵袭性。
图24示出在激素剥夺的(A),VCaP和(B),LNCaP前列腺癌细胞中的ERG过表达部分地挽救雄激素诱导的细胞侵袭性。
图25A-D示出ERG和TMPRSS2-ERG的siRNA抑制。
图26示出DQ204772(TMPRSS2:ERG融合)的序列。
图27示出a)通过噬菌体ELISA获得的代表性噬菌体克隆与ERG蛋白的特异性结合。b)富集的噬菌体克隆的共有肽序列。
图28示出a)通过HaloLink阵列定位ERG中的结合域和b)ERG上的相互作用位点的定位。
图29示出ETS域中的噬菌体肽结合位点的定位。
图30示出AR-ETS相互作用被LSFGSLP肽抑制,但不被随机肽抑制。
图31示出合成肽阻断用ERG腺病毒转染的RWPE细胞的ERG介导的侵袭。
图32示出(A)基于FISH评价在LNCaP细胞中用乙醇或DHT(100nM)刺激60分钟时TMPRSS2和ERG之间的诱导靠近。(B)在DU145和LNCaP细胞中TMPRSS2和ERG之间的诱导靠近被量化并表示为显示共定位信号的细胞核的百分比。
图33示出(A)使用多个跨越嵌合区和内源ERG的引物(参见插图)对TMPRSS2-ERG融合转录物进行的QRT-PCR分析。(B)使用跨越TMPRSS2的第一个外显子和ERG的第六个外显子的引物对代表性克隆进行的基于凝胶的RT-PCR分析。(C)使用跨越ERG基因座的5’(RP11-95I21)和3’(RP11-476D17)区域的BAC探针来检测基因重排的FISH。表示ERG重排的分离信号用箭头突出显示。(D)雄激素诱导的染色体靠近和基因融合发生的模型。
图34示出前列腺癌中AR结合的基因组概貌。(A)代表性染色体上的ChIP-Seq AR结合峰。(B)图示显示结合在KLK3增强子上的AR的ChIP-Seq读数。
图35示出ChIA-PET方法的示意图。
图36示出用于基因工程处理LNCaP细胞的策略。(A)TMPRSS2-ERG基因融合的示意图。(B)用于检测基因融合的荧光素酶系统的示意图。(C)用于检测基因融合的分离荧光素酶系统的示意图。
图37示出ERG中的相互作用残基。
图38示出通过SPR获得的示例性肽与ERG的结合亲和力。
图39示出TAT-肽抑制VCaP侵袭,但不抑制DU145和PC3侵袭。
图40示出本发明的实施方案的TAT-肽抑制VCaP增殖。
图41示出被ERG调节的基因表达。
图42示出本发明的实施方案的TAT肽抑制VCaP中的DNA损伤。
定义
为了有助于理解本发明,下面定义许多术语和短语:
如本文所用,术语“抑制基因融合的至少一种生物活性”是指任何试剂通过直接接触基因融合蛋白、接触基因融合mRNA或基因组DNA、导致基因融合多肽的构象变化、降低基因融合蛋白水平、或干扰与信号转导伴侣的基因融合相互作用、和影响基因融合靶基因的表达来降低基因融合的任何活性(例如,包括但不限于本文所述活性)。抑制剂也包括通过阻断上游信号转导分子来间接调节基因融合生物活性的分子。在一些实施方案中,基因融合包括ETS家族成员基因。
如本文所用,术语“抑制ETS家族成员基因的至少一种生物活性”是指任何试剂通过直接接触ETS家族成员蛋白、接触ETS家族成员mRNA或基因组DNA、导致ETS家族成员多肽的构象变化、降低ETS家族成员蛋白水平、或干扰与信号转导伴侣的ETS家族成员相互作用、和影响ETS家族成员靶基因的表达来降低ETS家族成员基因(例如ERG)的任何活性(例如,包括但不限于表达ETS家族成员基因的细胞的侵袭性以及本文所述的其他活性)。抑制剂也包括通过阻断上游信号转导分子来间接调节ETS家族成员生物活性的分子。
如本文所用,术语“基因融合”是指由第一个基因的至少一部分与第二个基因的至少一部分融合而产生的嵌合基因组DNA、嵌合信使RNA、截短的蛋白或嵌合蛋白。基因融合不必包括整个基因或基因的外显子。
如本文所用,术语“检测”可以描述发现或辨别的一般行为,或可检测地标记的组合物的具体观察。
如本文所用,术语“雄激素调节基因”指其表达会被雄激素(例如睾酮)诱导或阻遏的基因或基因的一部分。雄激素调节基因的启动子区可以含有与雄激素或雄激素信号转导分子(例如下游信号转导分子)相互作用的“雄激素应答元件”。
如本文所用,术语“siRNA”是指短干扰RNA。在一些实施方案中,siRNA包含大约18-25个核苷酸长的双链体或双链区域;通常siRNA在各链的3′末端包含大约2至4个未配对的核苷酸。siRNA的双链体或双链区域的至少一条链与靶RNA分子基本上同源或基本上互补。与靶RNA分子互补的链是“反义链”;与所述靶RNA分子同源的链是“有义链”,并且也与siRNA反义链互补。siRNA也可包含额外的序列;这类序列的非限制性实例包括连接序列或环以及茎和其他折叠结构。siRNA似乎在无脊椎或脊椎动物中在引发RNA干涉中和在植物的转录后基因沉默过程中引发序列特异性RNA降解中发挥至关重要的中间物的作用。
术语“RNA干扰”或“RNAi”是指通过siRNA沉默或降低基因表达。在动物和植物中,其是由siRNA启动的序列特异性、转录后基因沉默的过程,所述siRNA在其双链体区域与被沉默的基因序列同源。所述基因对生物体来说可以是内源或外源的,以整合入染色体内的形式存在或存在于未整合入基因组内的转染载体中。所述基因的表达被完全或部分地抑制。也可认为RNAi抑制靶RNA的功能;靶RNA的功能可以是完全的或部分的。
如本文所用,术语“癌症阶段”指癌症进展水平的定性或定量评估。用于确定癌症阶段的标准包括但不限于肿瘤的大小和转移的范围(例如局部或远程)。
如本文所用,术语“基因输送系统”指将包含核酸序列的组合物递送至细胞或组织的任意工具。例如,基因输送系统包括但不限于载体(例如逆转录病毒递送系统、腺病毒递送系统、腺相关病毒递送系统和其他基于核酸的递送系统),裸核酸的显微注射,基于聚合物的递送系统(例如,基于脂质体的系统和基于金属颗粒的系统),基因枪注射等。如本文所用,术语“病毒基因输送系统”指包含用于促进样品向期望细胞或组织递送的病毒元件(例如,完整病毒、改变的病毒和病毒组分例如核酸或蛋白)的基因输送系统。如本文所用,术语“腺病毒基因输送系统”指包含属于腺病毒科家族的完整或改变的病毒的基因输送系统。
如本文所用,术语“核酸分子”指任意含有核酸的分子,包括但不限于DNA或RNA。该术语包括含有DNA和RNA的任意已知碱基类似物的序列,所述碱基类似物包括但不限于4-乙酰胞嘧啶、8-羟基-N6-甲基腺苷、吖丙啶基胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-(羧基羟基甲基)尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羧基甲基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧基甲基-氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基腺嘌呤、1-甲基假尿嘧啶、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-甲基腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基辫苷(β-D-mannosylqueosine)、5′-甲氧基羰基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-乙醇酸甲酯、尿嘧啶-5-乙醇酸、oxybutoxosine、假尿嘧啶、辫苷(queosine)、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、N-尿嘧啶-5-乙醇酸甲酯、尿嘧啶-5-乙醇酸、假尿嘧啶、辫苷、2-硫胞嘧啶和2,6-二氨基嘌呤。
术语“基因”是指包含用于产生多肽、前体或RNA(例如,rRNA、tRNA)所必需的编码序列的核酸(例如DNA)序列。多肽可由全长编码序列或所述编码序列的任何部分编码,只要全长或片段的所需活性或功能特征(例如,酶活性、配体结合性、信号转导、免疫原性等)得以保留。所述术语也包括结构基因的编码区和与编码区5′和3′两个末端相邻的序列,所述序列距离任一端大约为1kb或更长,使得所述基因相应于全长mRNA的长度。位于编码区5′并存在于mRNA上的序列被称作5′非翻译序列。位于编码区3′或下游并存在于mRNA上的序列被称作3′非翻译序列。术语“基因”包括cDNA和基因的基因组形式。基因的基因组形式或克隆包含由称作“内含子”或“间插区”或“间插序列”的非编码序列打断的编码区。内含子是转录成核RNA(hnRNA)的基因片段;内含子可含有调控元件例如增强子。内含子被从细胞核或初级转录物中除去或“剪接掉”;因此内含子不存在于信使RNA(mRNA)转录物中。在翻译过程中mRNA的功能是确定新生多肽的序列或氨基酸顺序。
如本文所用,术语“异源基因”是指不是在其天然环境中存在的基因。例如,异源基因包括从一个物种引入另一个物种的基因。异源基因也包括生物体所固有的但以一些方式(例如,经突变、添加多个拷贝、连接至非天然调节序列等)改变的基因。异源基因与内源基因的区别在于异源基因序列通常被连接到DNA序列上,所述DNA序列不是与染色体中的基因序列天然连接的或与在自然界中不存在的染色体的部分(例如,在基因非正常表达的基因座上表达的基因)连接。
如本文所用,术语“寡核苷酸”指较短长度的单链多核苷酸链。寡核苷酸的长度通常小于200个残基(例如,在15和100之间),但是,如本文所用,该术语也意在包括更长的多核苷酸链。寡核苷酸经常用它们的长度来表示。例如,24个残基的寡核苷酸称作“24-mer”。通过自杂交或通过与其他多核苷酸杂交,寡核苷酸可以形成二级和三级结构。这样的结构可以包括但不限于双链体、发夹、十字形、弯曲和三链体。
如本文所用,术语“互补的”或“互补”用来指通过碱基配对规则相关联的多核苷酸(即核苷酸序列)。例如,序列“5′-A-G-T-3′”与序列“3′-T-C-A-5′”互补。互补可以是“部分的”,其中仅仅某些核酸的碱基根据碱基配对规则匹配。或者,核酸之间可以存在“完全”或“全部”的互补。核酸链之间的互补程度对于核酸链间杂交的效率和强度具有重大影响。这在扩增反应以及依赖于核酸之间的结合的检测方法中尤为重要。
术语“同源”是指互补程度。可存在部分同源或完全同源(即相同)。部分互补的序列是至少部分地抑制完全互补的核酸分子与“基本上同源的”靶核酸杂交的核酸分子。完全互补的序列与靶序列的杂交的抑制可使用杂交测定(DNA或RNA印迹、溶液杂交等),在低严格性条件下进行检查。在低严格性条件下,基本上同源的序列或探针将竞争并抑制完全同源的核酸分子与靶的结合(即杂交)。这并不是说低严格性条件是允许非特异性结合的条件;低严格性条件要求两序列彼此之间的结合是特异性(即选择性)的相互作用。非特异性结合的不存在可通过使用基本上不互补(如小于约30%的同一性)的第二靶进行检验;在非特异性结合不存在时,探针将不会与不互补的第二靶杂交。
当用于指双链核酸序列如cDNA或基因组克隆时,术语“基本上同源”是指在如上文所述的低严格性条件下能与所述双链核酸序列的一条或两条链杂交的任何探针。
基因可产生多种RNA种类,它们是通过初级RNA转录物的差异性剪接产生的。作为同一基因剪接变体的cDNA将含有序列相同或完全同源的区域(代表两cDNA上存在同一外显子或同一外显子的一部分),以及完全不同的区域(例如,代表cDNA1上存在外显子“A”,而cDNA2含有外显子“B”)。由于两cDNA含有序列相同的区域,它们都将与源自完整基因或含有见于两cDNA上的序列的基因部分的探针杂交;这两个剪接变体因此与此探针基本上同源并且彼此之间基本上同源。
当用于指单链核酸序列时,术语“基本上同源”是指在如上文所述的低严格性条件下能与所述单链核酸序列杂交(即是其互补物)的任何探针。
如本文所用,术语“杂交”用来指互补核酸的配对。杂交和杂交强度(即核酸之间的缔合强度)受到诸如核酸之间互补程度、涉及的条件的严格性、形成的杂交链的Tm、以及核酸内G∶C比等因素的影响。在其结构内包含互补核酸配对的单个分子被表述为“自杂交的”。
如本文所用,术语“严格性”用于指进行核酸杂交的有关温度、离子强度、以及其他化合物如有机溶剂的存在情况的条件。在“低严格性条件”下,目标核酸序列将与其精确互补物、具有单碱基错配的序列、密切相关的序列(如具有90%或更高同源性的序列)、以及仅有部分同源性的序列(如具有50-90%同源性的序列)杂交。在“中严格性条件”下,目标核酸序列将仅与其精确互补物、具有单碱基错配的序列、以及密切相关的序列(如90%或更高同源性)杂交。在“高严格性条件”下,目标核酸序列将仅与其精确互补物以及(取决于条件如温度)具有单碱基错配的序列杂交。换言之,在高严格性条件下,可提高温度从而排除与具有单碱基错配序列的杂交。
当“高严格性条件”用于指核酸杂交时,包括等同于如下的条件:在由5X SSPE(43.8g/l NaCl,6.9g/l NaH2PO4 H2O和1.85g/l EDTA,pH由NaOH调节至7.4)、0.5%SDS、5X Denhardt试剂和100μg/ml变性鲑鱼精DNA组成的溶液中于42℃下结合或杂交,接着在包含0.1X SSPE、1.0%SDS的溶液中于42℃下洗涤(如果使用的是长度约500个核苷酸的探针)。
当“中严格性条件”用于指核酸杂交时,包括等同于如下的条件:在由5X SSPE(43.8g/l NaCl、6.9g/l NaH2PO4 H2O和1.85g/l EDTA,pH由NaOH调节至7.4)、0.5% SDS、5X Denhardt试剂和100μg/ml变性鲑鱼精DNA组成的溶液中于42℃下结合或杂交,接着在包括1.0X SSPE、1.0%SDS的溶液中于42℃下洗涤(如果使用的是长度约500个核苷酸的探针)。
“低严格性条件”包括等同于如下的条件:在由5X SSPE(43.8g/lNaCl、6.9g/l NaH2PO4 H2O和1.85g/l EDTA,pH由NaOH调节至7.4)、0.1%SDS、5X Denhardt试剂[50X Denhardt每500ml含:5gFicoll(型号400,Pharamcia)、5g BSA(级分V;Sigma)]和100μg/ml变性鲑鱼精DNA组成的溶液中于42℃下结合或杂交,接着在包括5X SSPE、0.1%SDS的溶液中于42℃下洗涤(如果使用的是长度约500个核苷酸的探针)。
本领域熟知可采用众多的等同条件构成低严格性条件;可考虑诸如探针的长度和性质(DNA、RNA、碱基组成)和靶的性质(DNA、RNA、碱基组成、存在于溶液之中或者固定的等)以及盐和其他组分的浓度(如甲酰胺、硫酸葡聚糖、聚乙二醇的存在与否)等因素,并且可改变杂交溶液以产生不同于但又等同于上文所列条件的低严格性杂交条件。另外,本领域公知促进在高严格性条件下杂交的条件(如提高杂交和/或洗涤步骤的温度、在杂交溶液中使用甲酰胺等)(见上文“严格性”定义)。
当术语“分离”用于涉及核酸时,如在“分离的寡核苷酸”或“分离的多核苷酸”中,是指从至少一个组分或杂质中鉴定和分离的核酸序列,所述组分或杂质通常与所述核酸序列在其天然来源中缔合。分离的核酸就这样存在或以不同于其在自然界中被发现的形式存在。相反地,未分离的核酸是例如以其天然存在的状态被发现的DNA和RNA的核酸。例如,在宿主细胞染色体上发现给定的DNA序列(例如基因)与相邻基因接近;RNA序列,例如编码特定蛋白的特定mRNA序列,以与大量其他编码大量蛋白的mRNA混合的形式发现于细胞中。然而,分离的编码给定蛋白的核酸包括(通过示例的方式)这样的在细胞中通常表达所述给定蛋白的核酸,其中所述核酸存在于不同于天然细胞的染色体位置的染色体位置上,或以其它方式侧翼连接不同于天然发现的核酸序列的核酸序列。所述分离的核酸、寡核苷酸或多核苷酸以单链或双链的形式存在。当使用分离的核酸、寡核苷酸或多核苷酸表达蛋白时,所述寡核苷酸或多核苷酸至少包含有义链或编码链(即,所述寡核苷酸或多核苷酸可以是单链),还可同时包含有义链和反义链(即,所述寡核苷酸或多核苷酸可以是双链)。
如本文所用,术语“纯化的”或“纯化”是指从样品中除去组分(如污染物)。例如,抗体可通过除去污染的非免疫球蛋白类蛋白而纯化;它们也可通过除去不与靶分子结合的免疫球蛋白而纯化。非免疫球蛋白类蛋白的去除和/或不与靶分子结合的免疫球蛋白的去除导致样品中靶-反应性免疫球蛋白的百分比增大。在另一个实例中,重组多肽在细菌宿主细胞中表达,并且通过除去宿主细胞蛋白而纯化所述多肽;由此提高样品中重组多肽的百分比。
发明详述
本发明涉及用于癌症治疗的组合物和方法,所述癌症治疗包括但不限于癌症标记的靶向性抑制。具体地讲,本发明涉及用作前列腺癌的临床靶的复发基因融合。
在一些实施方案中,本发明提供靶向基因融合的治疗剂(例如基于核酸的治疗剂或小分子治疗剂)。基因融合描述于(例如)美国专利申请11/825,552和美国专利公开US-2007-0212702中,每个专利均以引用方式整体并入本文。在一些实施方案中,治疗剂靶向TMPRSS2:ERG基因融合。本发明并不限于具体的机制。事实上,对机制的理解并非实施本发明所必要。然而,可以预期,相对于靶向存在于所有细胞中的基因区域,靶向在天然基因中不存在而仅存在于癌细胞中的基因融合的部分(例如融合连接处)将降低副作用。
I.基因融合
如本文所述,本发明的实施方案提供用于抑制与癌症(例如前列腺癌)相关的复发基因融合的活性的组合物和方法。在一些实施方案中,基因融合被作为抗癌治疗的靶。在一些实施方案中,基因融合是雄激素调节基因或看家基因和ETS家族成员基因之间的融合的结果。
A.雄激素调节基因
雄激素调节的基因对于人前列腺正常生理功能是至关重要的。它们也为前列腺癌的发展和进展作出贡献。识别出的ARG包括但不限于:DDX5、TMPRSS2、PSA、PSMA、KLK2、SNRK、Seladin-1和FKBP51(Paoloni-Giacobino等人,Genom ics 44:309(1997);Velasco等人,Endocrinology 145(8):3913(2004))。已经证实,相对于其他正常人组织,跨膜丝氨酸蛋白酶2(TMPRSS2;NM_005656)在前列腺上皮中高度表达(Lin等人,Cancer Research 59:4180(1999))。TMPRSS2基因位于染色体21上。该基因位于离pter 41,750,797-41,801,948bp(共51,151bp;负链朝向)的位置处。人TMPRSS2蛋白序列可以参见GenBank登录号AAC51784(Swiss Protein登录号O15393),对应的cDNA是GenBank登录号U75329(也参见,Paoloni-Giacobino等人,Genomics 44:309(1997))。
在一些实施方案中,基因融合包括ARG的转录调控区。ARG的转录调控区可以含有ARG的编码区或非编码区,包括启动子区。ARG的启动子区还可以含有ARG的雄激素应答元件(ARE)。更具体地,TMPRSS2的启动子区由GenBank登录号AJ276404提供。
B.看家基因
看家基因呈组成型表达并通常广泛表达于所有组织中。这些基因编码提供所有细胞生存所需要的基本、必需功能的蛋白。看家基因在所有细胞和组织中通常以相同水平表达,但会有一些差异,特别是在细胞生长和生物体发育期间。尚未确切地知道人细胞具有多少看家基因,但大多数估计在300-500范围内。
许多看家基因已被鉴定。最常见的已知基因,GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶),编码对于糖酵解途径至关重要的酶。另一个重要的看家基因是白蛋白,其帮助运输化合物遍及全身。若干看家基因编码构成细胞骨架(例如β-肌动蛋白和微管蛋白)的结构蛋白。其他看家基因编码核糖体的18S或28S rRNA亚基。HNRPA2B1是广泛表达的异核核糖核蛋白的成员。其启动子已被证明是未甲基化的并且在转基因中抑制CMV启动子的转录沉默(Williams等人,BMC Biotechnol 5,17(2005))。示例性的看家基因列表可见于例如Trends in Genetics,19,362-365(2003)。
C.ETS家族成员基因
E-26(ETS)家族的转录因子调节控制基因表达的细胞内信号转导途径。作为下游效应子,它们激活或抑制特定靶基因。作为上游效应子,它们负责许多生长因子受体的空间和时间表达。该家族的接近30个成员已被鉴别出,并涉及许多生理和病理过程。它们包括但不限于:ERG、ETV1(ER81)、FLI1、ETS1、ETS2、ELK1、ETV6(TEL1)、ETV7(TEL2)、GABPα、ELF1、ETV4(E1AF;PEA3)、ETV5(ERM)、ERF、PEA3/E1AF、PU.1、ESE1/ESX、SAP1(ELK4)、ETV3(METS)、EWS/FLI1、ESE1、ESE2(ELF5)、ESE3、PDEF、NET(ELK3;SAP2)、NERF(ELF2)和FEV。示例性的ETS家族成员基因序列如图9所示。
更具体地,已经证实,相对于其他正常人组织,Ets相关基因(ERG;NM_004449)在前列腺上皮中高度表达。ERG基因位于染色体21上。该基因位于离pter 38,675,671-38,955,488碱基对的位置处。ERG基因共279,817bp;负链朝向。对应的ERG cDNA和蛋白序列分别见GenBank登录号M17254和GenBank登录号NP04440(Swiss Protein登录号P11308)。
ETS易位变体1(ETV1)基因位于染色体7上(GenBank登录号NC_000007.11;NC_086703.11和NT_007819.15)。该基因位于离pter13,708330-13,803,555碱基对的位置处。ETV1基因共95,225bp;负链朝向。对应的ETV1 cDNA和蛋白序列分别见GenBank登录号NM_004956和GenBank登录号NP_004947(Swiss Protein登录号P50549)。
人ETV4基因位于染色体14上(GenBank登录号NC_000017.9、NT_010783.14和NT_086880.1)。该基因位于离pter38,960,740-38,979,228碱基对的位置处。ETV4基因共18,488bp;负链朝向。对应的ETV4cDNA和蛋白序列分别见GenBank登录号NM_001986和GenBank登录号NP_01977(Swiss Protein登录号P43268)。
II.治疗应用
在一些实施方案中,本发明提供用于癌症(例如前列腺癌)的治疗。在一些实施方案中,治疗直接或间接靶向本发明的基因融合。
A.RNA干扰和反义治疗
在一些实施方案中,本发明靶向基因融合的表达。例如,在一些实施方案中,本发明使用包含寡聚反义或RNAi化合物特别是寡核苷酸(例如,本文所述的那些)的组合物,用于调节编码基因融合的核酸分子的功能,从而最终调节表达的基因融合的量。
1.RNA干扰(RNAi)
在一些实施方案中,RNAi用于抑制融合蛋白功能。RNAi代表用于在大多数真核生物包括人体内控制外源基因表达的进化保守的细胞防御。RNAi通常通过双链RNA(dsRNA)引发并导致响应dsRNA的单链靶RNA同源物的序列特异性mRNA降解。mRNA降解的介质是小的干扰性RNA双链体(siRNA),其通常在细胞中通过酶裂解长的dsRNA产生。siRNA通常在长度上为大约21个核苷酸(例如,长度为21-23个核苷酸),并且具有特征在于两个核苷酸3′突出端的碱基配对的结构。在将小RNA或RNAi引入细胞后,据信所述序列被递送至称作RISC(RNA诱导的沉默复合物)的酶复合物。RISC识别靶并且用内切核酸酶将其裂解。要指出的是如果更大的RNA序列被递送到细胞,则RNA酶III(Dicer)将更长的dsRNA转化成21-23nt的双链siRNA片段。在一些实施方案中,将RNAi寡核苷酸设计成靶向融合蛋白的连接区。
化学合成的siRNA已成为用于在培养的体细胞中进行基因组范围的哺乳动物基因功能分析的强有力的试剂。除了其用于确认基因功能的价值之外,siRNA也具有作为基因特异性治疗剂的巨大潜能(Tuschl和Borkhardt,Molecular Intervent.2002;2(3):158-67,以引用方式并入本文)。
将siRNA转染入动物细胞导致有效的、长效的特定基因的转录后沉默(Caplen等人,Proc Natl Acad Sci U.S.A.2001;98:9742-7;Elbashir等人,Nature.2001;411:494-8;Elbashi等人,Genes Dev.2001;15:188-200;和Elbashir等人,EMBO J.2001;20:6877-88,所有这些均以引用方式并入本文)。用于使用siRNA进行RNAi的方法和组合物描述于例如美国专利6,506,559(以引用方式并入本文)中。
siRNA在降低被靶向的RNA的量上非常有效,并且通过伸展蛋白(extension protein),常常降低至不可检测的水平。所述沉默效应可持续数月,并且具有极高的特异性,因为靶RNA和siRNA中心区域之间的一个核苷酸错配通常足以阻止沉默(Brummelkamp等人,Science 2002;296:550-3;和Holen等人,Nucleic Acids Res.2002;30:1757-66,两者均以引用方式并入本文)。
在设计siRNA时的一个重要因素是,存在siRNA结合的易接近位点。Bahoia等人(J.Biol.Chem.,2003;278:15991-15997;以引用方式并入本文)描述了称作扫描阵列的一类DNA阵列用于发现mRNA中的易接近位点以设计有效siRNA的用途。这些阵列包括大小为从单体至特定最大值(通常是Comer)的寡核苷酸,它们使用物理屏障(掩蔽物)来合成,其中逐步添加序列中的每个碱基。因而,所述阵列代表着靶基因区域的完整寡核苷酸补体。靶mRNA与这些阵列的杂交提供靶mRNA该区域的完全可接近性描述。这样的数据可以用于设计反义寡核苷酸(从7mer至25mer),其中重要的是达到寡核苷酸长度和结合亲合力之间的折衷,以保留功效和靶特异性(Sohail等人,Nucleic Acids Res.,2001;29(10):2041-2045)。选择siRNA的其他方法和关心的方面描述在例如WO 05054270、WO05038054A1、WO03070966A2、J Mol Biol.2005May 13;348(4):883-93,J Mol Biol.2005 May 13;348(4):871-81和Nucleic Acids Res.2003 Aug1;31(15):4417-24,其中每一个均以引用方式整体并入本文。另外,软件(例如MWG在线siMAX siRNA设计工具)是可商业上或公开得到的,用于选择siRNA。
在一些实施方案中,本发明利用siRNA,包括平端(参见例如US20080200420,以引用方式整体并入本文)、突出端(参见例如US20080269147A1,以引用方式整体并入本文)、锁核酸(参见例如WO2008/006369、WO2008/043753和WO2008/051306,其中的每一个均以引用方式整体并入本文)。在一些实施方案中,siRNA通过基因表达或使用细菌递送(参见例如Xiang等人,Nature 24:6(2006)和WO06066048,其中的每一个均以引用方式整体并入本文)。
在其他实施方案中,利用shRNA技术(参见例如20080025958,以引用方式整体并入本文)。小发夹RNA或短发夹RNA(shRNA)为形成紧密发夹环的RNA序列,所述紧密发夹环可用于通过RNA干扰沉默基因表达。shRNA使用引入细胞的载体并利用U6启动子来确保shRNA不断被表达。该载体通常被传递给子代细胞,从而使基因沉默被遗传。shRNA发夹结构通过细胞机制裂解成siRNA,siRNA随后结合RNA诱导沉默复合体(RISC)。该复合体结合mRNA并将其裂解,所述mRNA与和其结合的siRNA匹配。shRNA由RNA聚合酶III转录。
本发明还包括包含如下所述的本发明的RNAi化合物的药物组合物和制剂。
2.反义
在其他实施方案中,使用特异性地与一种或多种编码基因融合的核酸杂交的反义化合物,调节融合蛋白表达。寡聚化合物与其靶核酸的特异性杂交干扰了所述核酸的正常功能。这种通过特异性地与靶核酸杂交的化合物对靶核酸的功能的调节通常称作“反义”。被干扰的DNA的功能包括复制和转录。被干扰的RNA的功能包括所有重要的功能,例如,将RNA转移到蛋白翻译的位点,从RNA翻译蛋白,剪接RNA以产生一种或多种mRNA种类,和可由RNA参与或促进的催化活性。这种干扰靶核酸功能的总效应是调节基因融合的表达。在本发明的上下文中,“调节”表示增加(刺激)或减少(抑制)基因的表达。例如,可抑制表达以预防肿瘤增殖。
优选地,靶向特异性核酸以进行反义。将反义化合物“靶向”特定核酸,在本发明的上下文中是个多步骤过程。该过程通常从鉴定其功能要被调节的核酸序列开始。其可以是例如细胞基因(或从所述基因转录的mRNA)或来自感染剂的核酸分子,所述基因的表达与特定的病症或疾病状态相关。在本发明中,所述靶是编码本发明的基因融合的核酸分子。所述靶向过程也包括确定该基因内反义相互作用发生的位点以获得期望的效果,例如检测或调节所述蛋白的表达。在本发明的上下文中,优选的基因内位点是包含所述基因的开放阅读框(ORF)的翻译起始或终止密码子的区域。因为翻译起始密码子通常是5′-AUG(在转录的mRNA分子中;5′-ATG在相应的DNA分子中),所以翻译起始密码子也称为“AUG密码子”、“起始密码子”或“AUG起始密码子”。少数基因具有含有RNA序列5′-GUG、5′-UUG或5′-CUG的翻译起始密码子,并且5′-AUA、5′-ACG和5′-CUG已显示在体内发挥功能。因此,术语“翻译起始密码子”和“起始密码子”可包括许多密码子序列,尽管在每种情况下起始氨基酸通常是甲硫氨酸(在真核生物中)或甲酰甲硫氨酸(在原核生物中)。真核生物和原核生物基因可具有两种或更多种可替换的起始密码子,其中任何一种可优先地在特定的细胞类型或组织中或在一组特定的条件下用于翻译起始。在本发明的上下文中,“起始密码子”和“翻译起始密码子”是指在体内用于启动mRNA分子的翻译的密码子,所述mRNA分子转录自编码本发明的肿瘤抗原的基因,而不论所述密码子的序列如何。
基因的翻译终止密码子(或“终止密码子”)可具有三种序列(即5′-UAA、5′-UAG和5′-UGA;对应的DNA序列分别是5′-TAA、5′-TAG和5′-TGA)中的一种。术语“起始密码子区域”和“翻译起始密码子区域”是指从翻译起始密码子开始在任一方向上(即5′或3′)包含大约25至大约50个连续核苷酸的mRNA或基因的部分。类似地,术语“终止密码子区域”和“翻译终止密码子区域”是指从翻译终止密码子开始在任一方向上(即5′或3′)包含大约25至大约50个连续核苷酸的mRNA或基因的部分。
表示翻译起始密码子和翻译终止子之间的区域的开放阅读框(ORF)或“编码区”也是可被有效靶向的区域。其他靶区域包括5′非翻译区(5′UTR)和3′非翻译区(3′UTR),5′非翻译区是指从翻译起始密码子开始在5′方向上的mRNA的部分,因此包括mRNA的5′加帽位点和翻译起始密码子之间的核苷酸或基因上对应的核苷酸,3′非翻译区是指从翻译终止密码子开始在3′方向上的mRNA的部分,因此包括mRNA的翻译终止密码子和3′末端之间的核苷酸或基因上对应的核苷酸。mRNA的5′帽子包含通过5′-5′三磷酸键合连接至mRNA的最5′的残基上的N7-甲基化的鸟苷残基。mRNA的5′帽子区域被认为包括5′帽子结构自身和与帽子相邻的前50个核苷酸。帽子区域也可以是优选的靶区域。
尽管一些真核生物mRNA转录物被直接翻译,但许多包含一个或多个在转录物翻译前被从转录物中切除的区域,称作“内含子”。剩下的(因此被翻译的)区域称作“外显子”,其被剪接在一起形成连续的mRNA序列。mRNA剪接位点(即内含子-外显子接头)也可是优选的靶区域,并且特别可用于疾病牵涉异常的剪接或疾病牵涉特定mRNA剪接产物的过量产生的状况。由于重排或缺失而产生的异常融合连接也是优选的靶。还发现内含子也可以是有效的从而优选反义化合物的靶区域靶向例如DNA或前mRNA。
在一些实施方案中,使用可商购的软件程序(例如,Biognostik,Gottingen,Germany;SysArris Software,Bangalore,India;AntisenseResearch Group,University of Liverpool,Liverpool,England;GeneTrove,Carlsbad,CA)鉴定反义抑制的靶位点。在其他实施方案中,使用描述于PCT公开No.WO0198537A2(以引用方式并入本文)的可及位点(accessible site)方法鉴定用于反义抑制的靶位点。
一旦鉴定了一个或多个靶位点,就选择与靶充分互补(即十分良好地杂交和具有足够的特异性)的寡核苷酸以产生期望的效应。例如,在本发明优选的实施方案中,将反义寡核苷酸靶向至或接近起始密码子。
在本发明的上下文中,对于反义组合物和方法,“杂交”表示互补的核苷或核苷酸碱基之间的氢键,其可以是Watson-Crick、Hoogsteen或反向Hoogsteen氢键合。例如,腺嘌呤和胸腺嘧啶是通过形成氢键而配对的互补核碱基。应当理解反义化合物的序列不必100%地与其靶核酸序列互补才可特异性杂交。当反义化合物与靶DNA或RNA分子的结合干扰所述靶DNA或RNA的正常功能从而导致功效丧失,并且存在足够的互补程度以避免在期望特异性结合的条件下(即在体内测定或治疗处理的情况下是在生理学条件下而在体外测定的情况下是处于进行测定的条件下)所述反义化合物与非靶序列形成非特异性结合时,反义化合物就是可特异性杂交的。
反义化合物通常用作研究试剂和用于诊断学。例如,能够特异性抑制基因表达的反义寡核苷酸可用于阐明特定基因的功能。反义化合物也用于例如区别生物学途径的各种成员的功能。
反义的特异性和灵敏性也用于治疗用途。例如,反义寡核苷酸在动物和人的疾病状态的治疗中已用作治疗部分。已安全和有效地将反义寡核苷酸施用给人,并且目前正进行大量临床试验。因此确定寡核苷酸是可被设定成在治疗细胞、组织和动物特别是人的治疗方案中使用的有用治疗形式。
虽然反义寡核苷酸是优选的反义化合物的形式,但本发明还包括其他寡聚反义化合物,包括但不限于寡核苷酸模拟物,例如下面描述的模拟物。根据本发明的反义化合物优选地包含大约8至大约30个核碱基(即大约8至大约30个连接的碱基),但更长和更短的序列都可用于本发明。特别优选的反义化合物是反义寡核苷酸,更优选的是包含大约12至25个核碱基的寡核苷酸。
用于本发明的优选的反义化合物的具体实例包括含有经修饰的主链或非天然的核苷间键合的寡核苷酸。如本说明书中所定义的,具有经修饰的主链的寡核苷酸包括在主链上保留磷原子和在主链上不具有磷原子的寡核苷酸。对于本说明书的目的,在其核苷间主链中不具有磷原子的经修饰的寡核苷酸也可被认为是寡核苷。
优选的经修饰的寡核苷酸主链包括例如硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨烷基磷酸三酯、甲基和其他烷基膦酸酯包括3′-亚烷基膦酸酯和手性膦酸酯、次膦酸酯、氨基磷酸酯包括3′-氨基氨基磷酸酯和氨烷基氨基磷酸酯、硫羰基氨基磷酸酯、硫羰基烷基膦酸酯、硫羰基烷基磷酸三酯和具有正常3′-5′连接的硼磷酸酯(boranophosphate)、其2′-5′连接的类似物和其具有反向极性的类似物(其中,相邻的核苷单位对以3′-5′至5′-3′或2′-5′至5′-2′连接)。也包括各种盐、混合盐和游离酸形式。
优选的经修饰的其中不包含磷原子的寡核苷酸主链具有由短链烷基或环烷基核苷间键合、混合的杂原子与烷基或环烷基核苷间键合、或一个或多个短链杂原子或杂环核苷间键合形成的主链。这些包括具有吗啉代键合(部分形成于核苷的糖部分);硅氧烷主链;硫化物、亚砜和砜主链;甲酰基和硫代甲酰基主链;亚甲基甲酰基和硫代甲酰基主链;包含烯烃的主链;氨基磺酸酯主链;亚甲基亚氨基和亚甲基肼基主链;磺酸酯和氨磺酰主链;酰胺主链;和其他具有混合的N、O、S和CH2组分部分的寡核苷酸主链。
在其他优选的寡核苷酸模拟物中,用新的基团取代核苷酸单位的糖和核苷间键合(即主链)。保留碱基单位以用于与合适的核酸靶化合物杂交。一种这样的寡聚化合物,即已显示具有优良的杂交特性的寡核苷酸模拟物,被称作肽核酸(PNA)。在PNA化合物中,寡核苷酸的糖主链被包含酰胺的主链特别是氨基乙基甘氨酸主链取代。保留核碱基并直接或间接地与主链的酰胺部分的氮杂氮原子结合。教导PNA化合物制备的代表性的美国专利包括但不限于美国专利No.5,539,082、5,714,331和5,719,262,其中的每一个均以引用方式并入本文。其他的PNA化合物的教导可见于Nielsen等人,Science254:1497(1991)中。
本发明最优选的实施方案是具有硫代磷酸酯主链的寡核苷酸和具有杂原子主链的寡核苷酸,特别是上面提到的美国专利No.5,489,677的--CH2、--NH--O--CH2--、--CH2--N(CH3)--O--CH2--[称作亚甲基(甲基亚氨基)或MMI主链]、--CH2--O--N(CH3)--CH2--、--CH2--N(CH3)--N(CH3)--CH2--和--O--N(CH3)--CH2--CH2--[其中天然的磷酸二酯主链表示为--O--P--O--CH2--]和上述美国专利No.5,602,240的酰胺主链的寡核苷。同样优选的是具有上述美国专利No.5,034,506的吗啉代主链结构的寡核苷酸。
经修饰的寡核苷酸也可包含一个或多个被取代的糖部分。优选的寡核苷酸在2′位置包含一个下列基团:OH;F;O-、S-或N-烷基;O-、S-或N-烯基;O-、S-或N-炔基;或O-烷基-O-烷基,其中烷基、烯基和炔基可以是取代的或非取代的C1至C10烷基或C2至C10烯基和炔基。特别优选的是O[(CH2)nO]mCH3、O(CH2)nOCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2和O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2,其中n和m为1至约10。其他优选的寡核苷酸在2′位点包含一个下列基团:C1至C10低级烷基、取代的低级烷基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、杂环烷基、杂环烷芳基、氨基烷基氨基、多烷基氨基、取代的甲硅烷基、RNA裂解基团、报告基团、插入子(intercalator)、用于提高寡核苷酸的药物动力学特征的基团、或用于提高寡核苷酸的药效动力学特征的基团,以及其他具有类似性质的取代基。优选的修饰包括2′-甲氧基乙氧基(2′-O--CH2CH2OCH3,也称作′-O-(2-甲氧基乙基)或2′-MOE)(Martin等人,Helv.Chim.Acta 78:486[1995])即,烷氧基烷氧基基团。其他优选的修饰包括2′-二甲基氨基氧基乙氧基(即O(CH2)2ON(CH3)2基团),也称作2′-DMAOE和2′-二甲基氨基乙氧基乙氧基(在本领域也称作2′-O-二甲基氨基乙氧基乙基或2′-DMAEOE),即2′-O--CH2--O--CH2--N(CH2)2。
其他优选的修饰包括2′-甲氧基(2′-O--CH3)、2′-氨基丙氧基(2′-OCH2CH2CH2NH2)和2′-氟(2′-F)。也可在寡核苷酸的其他位置上进行类似的修饰,特别是在3′末端核苷酸上或在2′-5′连接的寡核苷酸中的糖的3′位置和5′末端核苷酸的5′位置。寡核苷酸也可以用糖模拟物例如环丁基部分替代五呋喃糖基(pentofuranosyl)糖。
寡核苷酸也可包括核碱基(通常在本领域简单地称作“碱基”)修饰或取代。如本文所用,“未修饰的”或“天然的”核碱基包括嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G),和嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。经修饰的核碱基包括其他合成的和天然的核碱基,例如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其他烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其他烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶、5-卤尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫尿嘧啶、8-卤代、8-氨基、8-巯基、8-硫代烷基、8-羟基和其他8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤、5-卤代特别是5-溴、5-三氟甲基和其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤、7-脱氮杂鸟嘌呤和7-脱氮杂腺嘌呤和3-脱氮杂鸟嘌呤和3-脱氮杂腺嘌呤。其他核碱基包括公开于美国专利No.3,687,808中的那些。这些核碱基中的某些特别地可用于增加本发明的寡聚化合物的结合亲和力。这些核碱基包括5-取代的嘧啶、6-氮杂嘧啶和N-2、N-6和O-6取代的嘌呤,包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶取代物已显示增加核酸双链体稳定性0.6-1.2℃并且是目前优选的碱基取代物,尤其当与2′-O-甲氧基乙基糖修饰物组合时更加优选。
本发明的寡核苷酸的另一种修饰包括通过化学方法将一个或多个增强寡核苷酸的活性、细胞分布和细胞吸收的部分或缀合物连接至寡核苷酸。这些部分包括但不限于脂质部分例如胆固醇部分、胆酸、硫醚(例如,己基-S-三苯甲基硫醇)、硫胆固醇(thiocholesterol)、脂肪族链(例如十二烷二醇或十一烷基残基)、磷脂(例如二十六烷基-rac-甘油或1,2-二-O-十六烷基-rac-甘油基-3-H-磷酸三乙基铵)、多胺或聚乙二醇或金刚烷乙酸、棕榈基部分、或十八烷基胺或己基氨基-羰基-氧基胆固醇部分。
相关领域技术人员熟知如何产生含有上述修饰的寡核苷酸。本发明不限于上述的反义寡核苷酸。可使用任何合适的修饰或取代。
不必在给定的化合物中对所有位置进行统一的修饰,事实上超过一个的前面提到的修饰可被并入单个化合物中或甚至在寡核苷酸内的单个核苷上。本发明也包括作为嵌合化合物的反义化合物。“嵌合的”反义化合物或“嵌合物”在本发明的上下文中是反义化合物,特别是寡核苷酸,其包含两个或更多个化学上不同的区域,各区域由至少一个单体单位(即在寡核苷酸化合物的情况下为核苷酸)构成。这些寡核苷酸通常包含至少一个这样的区域,其中所述寡核苷酸经修饰以赋予寡核苷酸增加的对核酸酶降解的抗性、增加的细胞吸收、和/或增加的对靶核酸的结合亲和力。寡核苷酸的另一区域可用作能够裂解RNA:DNA或RNA:RNA杂交物的酶的底物。作为示例,RNaseH是裂解RNA:DNA双链体的RNA链的细胞内切核酸酶。因此RNaseH的作用导致RNA靶的裂解,从而大大增强了寡核苷酸抑制基因表达的有效性。因此,与和相同靶区域杂交的硫代磷酸酯脱氧寡核苷酸相比,当使用嵌合寡核苷酸时,通常可用更短的寡核苷酸获得相当的结果。可通过凝胶电泳结合(如果需要)本领域已知的相关核酸杂交技术常规地检测RNA靶的裂解。
可以两种或更多种上述的寡核苷酸、经修饰的寡核苷酸、寡核苷和/或寡核苷酸模拟物的复合结构来形成本发明的嵌合反义化合物。
本发明还包括包含如下所述的本发明的反义化合物的药物组合物和制剂。
B.基因治疗
本发明包括用于调节本发明的基因融合表达的任何基因操作的用途。基因操作的实例包括但不限于基因敲除(例如,使用例如重组从染色体中除去融合基因)、有或无可诱导启动子的反义构建体的表达等。可通过使用任何合适的方法在体外或体内将核酸构建体递送入细胞。合适的方法是将核酸构建体引入细胞以使期望的事件发生(例如,表达反义构建体)的方法。基因治疗也可以用于递送siRNA或体内表达的其他干扰分子(例如,在诱导型启动子(例如,雄激素-响应性启动子)刺激后)。
通过各种方法中的任一种实现将携带遗传信息的分子引入细胞中,所述方法包括但不限于定向注射裸露的DNA构建体,用载有所述构建体的金颗粒轰击,和使用例如脂质体、生物聚合体等进行的大分子介导的基因转移。优选的方法使用来源于病毒的基因递送载体,所述病毒包括但不限于腺病毒、逆转录病毒、痘苗病毒和腺伴随病毒。因为与逆转录病毒相比具有更高的效率,来源于腺病毒的载体是优选的用于在体内将核酸分子转移入宿主细胞内的基因递送载体。已显示腺病毒载体在体内非常有效地将基因转入动物模型的多种实体瘤中和转入免疫缺陷小鼠的人实体瘤异种移植体中。用于基因转移的腺病毒载体和方法的实例描述于PCT公开WO 00/12738和WO 00/09675以及美国专利申请No.6,033,908、6,019,978、6,001,557、5,994,132、5,994,128、5,994,106、5,981,225、5,885,808、5,872,154、5,830,730和5,824,544中,其中的每一个均以引用方式整体并入本文。
可以多种方法将载体施用给测试者。例如,在本发明的一些实施方案中,使用直接注射将载体施用至肿瘤或与肿瘤相关的组织中。在其他实施方案中,通过血液或淋巴循环进行施用(参见例如PCT公开99/02685,其以引用方式整体并入本文)。示例性的腺病毒载体的剂量水平优选地是添加到灌流液中的108至1011个载体颗粒。
C.抗体治疗
在一些实施方案中,本发明提供了靶向表达基因融合的前列腺肿瘤的抗体。任何合适的抗体(例如,单克隆抗体、多克隆抗体或合成的抗体)可用于本文公开的治疗方法中。在优选的实施方案中,用于癌症治疗的抗体是人源化的抗体。使抗体人源化的方法是本领域众所周知的(参见例如美国专利No.6,180,370、5,585,089、6,054,297和5,565,332;其中的每一个均以引用方式并入本文)。
在一些实施方案中,治疗性抗体包括针对本发明的基因融合产生的抗体,其中所述抗体被缀合至细胞毒素剂。在这些实施方案中,产生不靶向正常细胞的肿瘤特异性治疗剂,从而减少了许多常规化疗方法的有害副作用。对于某些应用,可预期这些治疗剂是这样的药理学试剂,即所述药理学试剂用作用于附着至抗体的有用试剂,特别是细胞毒素剂或其他具有杀死内皮细胞或抑制内皮细胞生长或细胞分裂的能力的抗细胞试剂。本发明包括任何可缀合至抗体和以活性形式被递送的药理学试剂的用途。示例性地抗细胞试剂包括化疗剂、放射性同位素和细胞毒素。本发明的治疗性抗体可包括多种细胞毒性部分,包括但不限于放射性同位素(例如,碘-131、碘-123、锝(technicium)-99m、铟-111、铼-188、铼-186、镓-67、铜-67、钇-90、碘-125或砹-211),激素例如类固醇,抗代谢物例如胞嘧啶(例如,阿拉伯糖苷、氟尿嘧啶、氨甲蝶呤或氨基蝶呤;蒽环霉素;丝裂霉素C),长春花生物碱(例如,秋水仙胺;鬼臼亚乙苷;光神霉素)和抗肿瘤烷化剂例如苯丁酸氮芥或美法仑。其他实施方案可包括诸如促凝剂、细胞因子、生长因子、细菌内毒素或细菌内毒素的脂质A部分的试剂。例如,在一些实施方案中,治疗剂包括植物、真菌或细菌来源的毒素例如A链毒素、核糖体失活蛋白、α-八叠球菌、曲霉菌素、局限曲菌素、核糖核酸酶、白喉毒素或假单胞菌外毒素,仅举少量实例。在一些优选的实施方案中,使用去糖基化的蓖麻毒蛋白A链。
在任何情况下建议,如果期望,可通过使用已知的缀合技术(参见例如Ghose等人,Methods Enzymol.,93:280[1983]),以使其按要求在被靶向的肿瘤细胞的位点上靶向、内化、释放或提供到血液组分中的方式,将试剂例如这些试剂成功地缀合到抗体上。
例如,在一些实施方案中,本发明提供了靶向基因融合(例如ERG融合)的免疫毒素。免疫毒素是特异性靶向剂(通常是针对肿瘤的抗体或片段)与细胞毒素剂例如毒素部分的缀合物。所述靶向剂使毒素指向携带被靶向的抗原的细胞从而选择性地杀死这些细胞。在一些实施方案中,治疗抗体使用提供高度体内稳定性的交联剂(Thorpe等人,Cancer Res.,48:6396[1988])。
在其他实施方案中,特别是涉及实体瘤治疗的实施方案中,设计具有抗肿瘤血管系统(通过抑制血管内皮细胞生长或细胞分裂)的细胞毒性作用或抗细胞作用的抗体。该攻击是意图导致局限于肿瘤的血管崩溃,剥夺肿瘤细胞特别是血管系统末梢的肿瘤细胞的氧气和营养,最终导致细胞死亡和肿瘤坏死。
在优选的实施方案中,将基于抗体的治疗剂配制成如下所述的药物组合物。在优选的实施方案中,施用本发明的抗体组合物导致可测量的癌减小(例如,肿瘤的减小或消除)。
本发明还包括包含如下所述的本发明的抗体化合物的药物组合物和制剂。
D.拟肽
在一些实施方案中,本发明提供基于拟肽的治疗剂。使用肽作为先导化合物,并随后转化成低分子量非肽分子(拟肽),已成功地导致开发细胞内靶的小分子拮抗剂(Bottger等人,J Mol Biol,1997.269(5):p.744-56;Bottger等人,Oncogene,1996.13(10):p.2141-7)。因此,拟肽已作为用于克服肽的物理特性中的固有缺陷的有力手段而兴起,从而改善了它们的治疗潜能(Kieber-Emmons等人,Curr OpinBiotechnol,1997.8(4):p.435-41;Beeley,Trends Biotechnol,1994.12(6):p.213-6;Moore等人,Trends Pharmacol Sci,1994.15(4):p.124-9)。在一些实施方案中,相比于天然肽,拟肽具有比天然肽优越的理想药效动力学特性,包括良好的口服活性、作用时间长久、较好地透过细胞膜运输、降低的排泄率以及减少被肽酶水解。
开发小分子拟肽通常涉及鉴定能够抑制靶向相互作用的最小功能肽单元。越来越多的文献表明可以从展示在噬菌体上的肽库中选择高亲和力配体(Sulochana和Ge,Curr Pharm Des,2007.13(20):p.2074-86;Cwirla等人,Proc Natl Acad Sci U S A,1990.87(16):p.6378-82;Scott和Smith,Science,1990.249(4967):p.386-90;Devlin等人,Science,1990.249(4967):p.404-6),并且很多应用已针对抵消蛋白质配体的功能(Dower,Curr Opin Chem Biol,1998.2(3):p.328-34;Sidhu等人,Methods Enzymol,2000.328:p.333-63)。因为所述库可为非常大的(1011或更多的单个成员),所以既不需要初始假设来考虑如何对库产生倾向性,也不需要通过生物扩增和复筛来选择性富集稀少结合的噬菌体。那些结合的序列可通过对它们的编码DNA的序列测序而容易地鉴定。
在一些实施方案中,如此鉴定的肽配体进一步用作组合化学方法或基于药物化学的拟肽方法的起点以用于开发新的定向治疗剂。此外,确定这些肽对其底物的高结合亲和力的结构基础有助于合理设计治疗剂。
本发明还包括包含如下所述的本发明的拟肽化合物的药物组合物和制剂。
E.药物组合物
本发明进一步提供了药物组合物(例如,其包含调节本发明的基因融合的表达或活性的药剂)。可以许多方式施用本发明的药物组合物,这依赖于期望的是局部还是全身性治疗和待处理的区域。施用可以是局部(包括眼的和至粘膜的递送(包括阴道和直肠递送))、肺部(例如通过粉末或气雾剂的吸入或吹入,包括通过喷雾器;气管内的、鼻内的、表皮和经皮的)、经口或肠胃外的施用。肠胃外施用包括静脉内、动脉内、皮下、腹膜内或肌内注射或输注;或颅内例如鞘内或心室内施用。
用于局部施用的药物组合物和制剂可包括经皮的贴剂、软膏剂、洗剂、乳膏剂、凝胶、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体和粉末。常规的药物载体、水性、粉末或油性的基质,增稠剂等可以是必需的或期望的。
用于口服施用的组合物和制剂包括粉末或颗粒、水或非水性介质中的悬浮液或溶液、胶囊、囊剂或片剂。增稠剂、调味剂、稀释剂、乳化剂、分散助剂或粘合剂可以是期望的。
用于肠胃外、鞘内或心室内施用的组合物和制剂可包括灭菌的水溶液,其还可含有缓冲质、稀释剂和其他合适的添加物,例如但不限于渗透增强剂、载体化合物和其他药学上可接受的载体或赋形剂。
本发明的药物组合物包括但不限于溶液、乳剂和包含脂质体的制剂。这些组合物可从多种组分中产生,所述组分包括但不限于预制的液体、自乳化性固体和自乳化性半固体。
本发明的药物制剂可方便地以单位剂量形式存在,其可根据制药行业熟知的常规技术进行制备。这些技术包括使活性成分与药物载体或赋形剂结合的步骤。通常通过均匀地和紧密地使活性成分与液体载体或细分的固体载体或二者进行结合来制备制剂,然后,如果需要,为产品塑形。
本发明的组合物可配制成许多可能的剂型中的任一种,例如但不限于片剂、胶囊、液体糖浆、软明胶胶囊、栓剂和灌肠剂。本发明的组合物也可以配制成在水、非水或混合介质中的悬浮液。含水的悬浮液可进一步包含增加悬浮液粘度的物质,所述物质包括例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇和/或葡聚糖。悬浮液也可以包含稳定剂。
在本发明的一个实施方案中,药物组合物可配制成泡沫使用。药物泡沫包括这些的制剂,例如但不限于乳剂、微乳剂、乳膏剂、胶冻剂和脂质体。尽管在本质上基本相似,但这些制剂在终产物的组分和稠度上产生变化。
在细胞水平增强寡核苷酸吸收的试剂也可以加入到本发明的药物和其他组合物中。例如,阳离子脂质例如lipofectin(美国专利No.5,705,188)、阳离子甘油衍生物和聚阳离子分子,例如聚赖氨酸(WO97/30731),也增加寡核苷酸的细胞吸收。
本发明的组合物可额外地含有其他通常存在于药物组合物中的添加剂组分。因此,例如,组合物可包含额外的、相容的、药物活性物质,例如止痒药、收敛药、局部麻醉药或抗炎剂,或可包含额外的用于物理配制本发明组合物的各种剂型的材料,例如染料、调味剂、防腐剂、抗氧化剂、遮光剂、增稠剂和稳定剂。然而,这些材料,当加入时,不应当过度地干扰本发明组合物的组分的生物学活性。制剂可以灭菌,如果期望,可与不会有害地与制剂的核酸相互作用的助剂混合,例如,润滑剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、用于影响渗透压的盐、缓冲剂、着色剂、调味剂和/或芳香物质等。
本发明的某些实施方案提供了药物组合物,其包含(a)一种或多种反义化合物和(b)一种或多种通过非反义机理起作用的其他化疗剂。这类化疗剂的实例包括但不限于抗癌药物例如正定霉素、放线菌素D、多柔比星、博来霉素、丝裂霉素、氮芥、苯丁酸氮芥、美法仑、环磷酰胺、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷(CA)、5-氟尿嘧啶(5-FU)、氟尿苷(5-FUdR)、氨甲喋呤(MTX)、秋水仙碱、长春花新碱、长春花碱、鬼臼亚乙苷、替尼泊苷、顺铂和己烯雌酚(DES)。抗炎药物,包括但不限于非类固醇抗炎药和皮质类固醇,和抗病毒药物,包括但不限于利巴韦林(ribivirin)、阿糖腺苷、阿昔洛韦和更昔洛韦,也可以与本发明的组合物组合。其他非反义化疗剂也在本发明的范围内。两种或更多种组合的化合物可一起使用或顺次使用。
给药依赖于要治疗的疾病状态的严重性和应答性,治疗过程持续几天至几个月,或直至实现治愈或实现疾病状况的减弱。最佳给药方案可根据患者体内药物积累的测量值进行计算。施药医生可容易地确定最佳剂量、给药方法学和重复率。最佳剂量可视单独的寡核苷酸的相对效能而变化,并且通常可基于在体外和体内动物模型中发现有效的EC50或基于本文描述的实施例进行估计。一般地,剂量为每千克体重0.01μg至100g,可每天、每周、每月或每年给药一次或多次。治疗医生可给予药物在体液或组织中的驻留时间和浓度估计给药的重复率。在成功治疗之后,使测试者进行维持治疗以防止疾病状况复发可以是期望的,其中以维持剂量施用所述寡核苷酸,剂量为每千克体重0.01μg至100g,每天一次或多次至每20年一次。
F.联合治疗
在一些实施方案中,本发明提供包括本文所述的一种或多种组合物组合其他试剂(例如化疗剂)的治疗方法。本发明并不限于具体的化疗剂。
很多类抗肿瘤(例如抗癌)剂被预期用于本发明的某些实施方案。适合与本发明的实施方案一起使用的抗癌剂包括(但不限于)诱导细胞凋亡的试剂、抑制腺苷脱氨酶功能、抑制嘧啶生物合成、抑制嘌呤环生物合成、抑制核苷酸互变、抑制核糖核苷酸还原酶、抑制胸腺嘧啶核苷单磷酸(TMP)合成、抑制二氢叶酸还原、抑制DNA合成、与DNA形成加合物、损坏DNA、抑制DNA修复、插入DNA、脱氨基天冬酰胺、抑制RNA合成、抑制蛋白质合成或稳定、抑制微管合成或功能等的试剂。
在一些实施方案中,适用于本发明的实施方案的组合物和方法的示例性抗癌剂包括(但不限于):1)生物碱,包括微管抑制剂(例如,长春新碱、长春碱和长春地辛等)、微管稳定剂(例如,紫杉醇(TAXOL)和多西紫杉醇等),和染色质功能抑制剂,包括拓扑异构酶抑制剂,例如表鬼臼毒素(例如,依托泊苷(VP-16)和替尼泊苷(VM-26)等),和靶向拓扑异构酶I的试剂(例如喜树碱和伊立替康(isirinotecan)(CPT-11)等);2)共价DNA结合剂(烷化剂),包括氮芥(例如,双氯乙基甲胺、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、异环磷酰胺和白消安(MYLERAN)等)、亚硝基脲(例如,卡莫司汀、洛莫司汀和司莫司汀等),以及其他烷化剂(例如,达卡巴嗪、羟甲基三聚氰胺、噻替哌和丝裂霉素等);3)非共价DNA结合剂(抗肿瘤抗生素),包括核酸抑制剂(例如,更生霉素(放线菌素D)等)、蒽环类抗生素(例如,柔红霉素(道诺霉素和司比定)、多柔比星(亚德里亚霉素)和伊达比星(伊达米星)等)、蒽醌(例如,蒽环霉素类似物,例如米托蒽醌等)、博来霉素(BLENOXANE)等,和普卡霉素(光辉霉素)等;4)抗代谢物,包括抗叶酸剂(例如,甲氨蝶呤、FOLEX和MEXATE等)、嘌呤抗代谢物(例如,6-巯嘌呤(6-MP、PURINETHOL)、6-硫鸟嘌呤(6-TG)、硫唑嘌呤、阿昔洛韦、更昔洛韦、氯脱氧腺苷、2-氯脱氧腺苷(CdA)和2′-脱氧柯福霉素(喷司他丁)等)、嘧啶拮抗剂(例如氟嘧啶(例如,5-氟尿嘧啶(ADRUCIL)、5-氟脱氧尿苷(FdUrd)(氟尿苷))等)、和胞嘧啶阿拉伯糖苷(例如,CYTOSAR(阿糖胞苷)和氟达拉滨等);5)酶,包括L-天冬酰胺酶和羟基脲等;6)激素,包括糖皮质素、抗雌激素(例如,它莫西芬等)、非甾体类抗雄激素(例如氟他胺等)、和芳香化酶抑制剂(例如,阿那曲唑(ARIMIDEX)等);7)铂化合物(例如,顺铂和卡铂等);8)与抗癌药物、毒素和/或放射性核素等偶联的单克隆抗体;9)生物应答调节剂(例如,干扰素(如IFN-α等)和白介素(如IL-2等)等);10)过继性免疫治疗;11)造血生长因子;12)诱导肿瘤细胞分化的试剂(例如,全反式维甲酸等);13)基因治疗技术;14)反义治疗技术;15)肿瘤疫苗;16)针对肿瘤转移的治疗(如巴马司他等);17)血管生成抑制剂;18)蛋白酶体抑制剂(如VELCADE);19)乙酰化和/或甲基化抑制剂(例如,HDAC抑制剂);20)NFκB的调节剂;21)细胞周期调节的抑制剂(例如,CDK抑制剂);22)p53蛋白功能的调节剂;和23)辐射。
任何常规用于癌症治疗背景的溶瘤细胞剂可用于本发明的实施方案的组合物和方法中。例如,美国食品和药物管理局维护批准用于美国的溶瘤细胞剂的处方集。U.S.F.D.A.的国际同行机构维护类似的处方集。下表提供批准用于美国的示例性抗肿瘤剂的列表。本领域的技术人员将理解所有美国批准的化疗剂上必需的“产品标签”说明示例性试剂的批准指示、剂量信息、毒性数据等。
III.药物筛选应用
在一些实施方案中,本发明提供了药物筛选测定法(例如,以筛选抗癌药物)。本发明的筛选方法利用本文所述的基因融合。例如,在一些实施方案中,本发明提供了筛选改变(例如减少)基因融合的表达的化合物的方法。所述化合物或试剂可以干扰转录,这通过例如与启动子区的相互作用来实现。化合物或试剂可以干扰融合产生的mRNA(例如,通过RNA干扰、反义技术等)。化合物或试剂可以干扰在融合的生物活性上游或下游的途径。在一些实施方案中,候选化合物是针对基因融合的反义或干扰RNA试剂(例如,寡核苷酸)。在其他实施方案中,候选化合物是特异性结合本发明的基因融合调节剂或表达产物并抑制其生物功能的抗体或小分子。
在一个筛选方法中,通过将化合物与表达基因融合的细胞接触,然后测定候选化合物对表达的影响来就候选化合物改变基因融合表达的能力对候选化合物进行评估。在一些实施方案中,通过检测细胞表达的基因融合mRNA的水平来测定候选化合物对基因融合的表达的影响。可通过任何合适的方法检测mRNA表达。
在其他实施方案中,通过测量由基因融合编码的多肽的水平来检测候选化合物对基因融合的表达的影响。可使用任何合适的方法测量表达的多肽的水平,包括但不限于本文公开的方法。
特别地,本发明提供了用于鉴定调节剂的筛选方法,所述调节剂即结合本发明的基因融合的候选或测试化合物或试剂(例如蛋白、肽、拟肽(peptidomimetic)、类肽(peptoid)、小分子或其他药物),所述候选或测试化合物或试剂具有对例如基因融合的表达或基因融合活性的抑制(或刺激)作用,或具有对例如基因融合底物的表达或活性的刺激或抑制作用。在治疗方案中,经如此鉴定的化合物可直接或间接地用于调节靶基因产物(例如基因融合)的活性,以详细阐述靶基因产物的生物学功能或鉴定破坏正常靶基因相互作用的化合物。抑制基因融合的活性或表达的化合物用于治疗增殖性病症,例如癌症,特别是前列腺癌。
在一个实施方案中,本发明提供了用于筛选候选或测试化合物的测定方法,所述候选或测试化合物是基因融合蛋白或多肽或其生物学活性部分的底物。在另一个实施方案中,本发明提供了用于筛选结合基因融合蛋白或多肽或其生物学活性部分或者调节其活性的候选或测试化合物的测定法。
本发明的测试化合物可通过使用在本领域已知的组合文库方法中的许多途径中的任一种而获得,其包括生物学文库;类肽文库(具有肽功能性但具有新的、非肽主链的分子的文库,所述分子对酶促降解具有抗性但同时保持生物活性;参见例如Zuckennann等人,J.Med.Chem.37:2678-85[1994]);空间可寻址(addressable)平行固相或液相文库;要求去卷积的合成文库方法;‘一个微珠一个化合物’的文库方法;和使用亲和层析选择的合成文库方法。生物学文库和类肽文库方法优选地用于肽文库,而其他四种方法可用于化合物的肽、非肽寡聚体或小分子文库(Lam(1997)Anticancer Drug Des.12:145)。
在本领域中,用于分子文库合成的方法的实例,例如可见于下列文献:DeWitt等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90:6909[1993];Erb等人,Proc.Nad.Acad.Sci.USA 91:11422[1994];Zuckermann等人,J.Med.Chem.37:2678[1994];Cho等人,Science 261:1303[1993];Carrell等人,Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33.2059[1994];Carell等人,Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33:2061[1994];和Gallop等人,J.Med.Chem.37:1233[1994]。
化合物文库可存在于溶液中(例如,Houghten,Biotechniques13:412-421[1992])、或存在于微珠上(Lam,Nature 354:82-84[1991])、芯片上(Fodor,Nature 364:555-556[1993])、细菌或孢子上(美国专利No.5,223,409;以引用方式并入本文)、质粒上(Cull等人,Proc.Nad.Acad.Sci.USA 89:18651869[1992])或噬菌体上(Scott和Smith,Science 249:386-390[1990];Devlin Science 249:404-406[1990];Cwirla等人,Proc.NatI.Acad.Sci.87:6378-6382[1990];Felici,J.Mol.Biol.222:301[1991])。
实验
提供下列实施例以证明和进一步举例说明本发明的某些优选的实施方案和方面,而不应被解释为限制本发明的范围。
实施例1
A.实验程序
细胞系。从美国模式培养物保藏中心获得前列腺癌细胞系LNCaP和VCaP,并分别在补充有10%FBS的RPMI和DMEM-glutamax培养基中培养。将具有GUS(RWPE+GUS)对照和ERG(RWPE+ERG)的稳定过表达的良性永生化前列腺细胞系RWPE(Tomlins等人,Neoplasia(New York,NY 10,177-1882008)在补充有牛垂体提取物的角质形成细胞无血清培养基中培养。将VCaP细胞用ERG或对照(GUS)慢病毒感染,并选择表达ERG(VCaP+ERG)或GUS(VCaP+GUS)的稳定克隆以用于进一步分析。
染色质免疫共沉淀(ChIP)。使用抗AR(Millipore,#06-680)、ERG(Santa Cruz,#sc354)和兔IgG(Santa Cruz,#sc-2027)的抗体,按照此前所述(Yu等人,Cancer cell 12,419-4312007)进行ChIP。对于AR ChIP检测分析,将LNCaP和VCaP细胞在含有活性炭处理的血清的无酚红培养基中培养以进行激素剥夺3天,然后用1%乙醇或溶解于乙醇中的10nM的甲雌三烯醇酮(R1881,NEN Life Science Products)处理16小时。在成对的乙醇处理的和R1881处理的样品中进行AR ChIP。对于ERG ChIP,使用在相应的常规培养基中培养的LNCaP、VCaP、RWPE+ERG和RWPE+GUS细胞。
ChIP-on-Chip分析。使用Agilent启动子阵列(上游-8kb至下游2kb)按照此前所述(Yu等人,Cancer research 67,10657-106632007)进行ChIP-on-Chip。使用在整个滑动窗口上的评分方案来鉴定ChIP富集区域。对于每个探针,考虑围绕这个探针的400bp窗口并通过将围绕这个探针的窗口中的所有探针的换算对数比值(xDev,通过Agilent软件由单一阵列误差模型计算)平均化来指定评分。为了给每个评分指定P值,将该评分假定为正态分布并且由调整过的评分集合估计方差和平均值(可能接近于零),该评分集合排除了评分的最高5%和最低5%。P值<0.01的窗口被确定为ChIP富集区域,其被进一步定位到人基因组上以找出最近的基因。
ChIP-Seq。按照制造商方案使用基因组DNA样品制备试剂盒(Illumina)来制备ChIP样品以用于测序。根据标准制造商程序使用Illumina基因组分析仪进行ChIP测序。通过Illumina分析流水线分析原始测序图像数据,并使用ELAND软件(Illumina)与非掩蔽的人参考基因组(NCBI v36,hg18)比对,从而生成25-32bp的序列读数。
ChIP-Seq数据分析。首先计算每个样品中有多少个唯一定位的读数并将两个计数的比用作归一化因子以使两个样品中的可用读数的总数处于同一水平。然后在每个样品中将每个唯一定位的读数定向延伸以形成200bp的假想DNA片段(HDF)。200被假定为在样品制备期间大小选定的DNA片断(175-225bp)的平均长度。
在零假设条件下,刺激的样品相对于未刺激的样品无富集,将来自两个样品的读数假定为按照相同的泊松分布落在基因组上(在对未刺激的样品中的读数计数进行调整之后)。将整个基因组上的平均测序深度用作背景率估计r0。对在每个覆盖区域中观察到两个样品之间的读数差异的概率进行数值计算。使用邦弗伦尼(Bonferroni)校正的p值0.001,确定哪些覆盖区被显著地富集。
应用HMM来限定富集区域开始和结束的位置。具体地说,将整个基因组划分成25bp盒并对两个样品在每个盒中的读数覆盖进行计数。两种状态为富集区域和背景。观测数据为HDF覆盖差异。在富集区域,可以预期HDF的富集将存在于刺激的样品中而不在未刺激的样品中。因此所述差异被假定为具有比率r1和r2(r1>r2)的两个不同泊松分布的结果。在背景中,该差异被假定为来自具有比率r0的两个相同泊松分布。转换概率按照经验进行估计。从HMM的输出,基于在富集区域中的后验概率选择区域。过滤掉外区域,该外区域在盒中的最大读数计数不超过对应于邦弗伦尼校正的p值0.001的阈值,邦弗伦尼校正的p值0.001使用具有背景比率r0的两个泊松分布的差异计算。
结合位点基序分析。使用MatInspector包(Cartharius等人,Bioinformatics(Oxford,England)21,2933-29422005)(GenomatixSoftware,GmbH,Munich,Germany)进行已知转录因子结合位点(TFBS)的搜索。为了鉴定过表达的TFBS,在ChIP富集区域以及对照序列两者中进行基序扫描,该对照序列通过随机打乱原始ChIP富集区域中的所有碱基而获得。通过Fisher精确检验的p值来测定这两种类型的区域中的每个TFBS的过表达的显著性。将MatInspector中用于基序搜索的相同默认阈值用于所有序列和所有508个单独的脊椎动物TFBS矩阵。使用MEME进行从头基序寻找。使用了128个序列,该128个序列在LNCaP和VCaP细胞中重叠并在于AR的处理下显示差异表达的基因的上游50kb内。
基因表达谱分析。将VCaP细胞进行激素饥饿2天并用1%乙醇或10nM R1881处理,或用LacZ对照腺病毒或ERG腺病毒感染。使用Trizol(Invitrogen)分离总RNA,然后使用Qiagen RNeasy试剂盒(Qiagen)纯化。根据制造商方案(Agilent)使用Agilent整个人基因组寡核苷酸微阵列(Whole Human Genome Oligo Microarrays)完成表达谱。
从NCBI GEO数据库(GSE7868)下载使用Affymetrix基因芯片人基因组U133Plus 2.0阵列描绘饥饿的LNCaP细胞的时序基因表达数据集,所述LNCaP细胞经受DHT处理达0、4和16小时。使用RMA算法(Irizarry等人,Biostatistics(Oxford,England)4,249-2642003)并用最新的探针定位分析原始CEL数据,并且使用贝叶斯正规化t统计(Baldi和Long,Bioinformatics(Oxford,England)17,509-5192001)来计算在相对于0小时的每个时间点的差异表达的水平。
序列保守性分析。将AR富集区域通过Chip-Seq来鉴定并在它们的中心对齐。检索phastCons得分(Siepel等人,Genome research 15,1034-1050 2005)并在每个位置进行平均化。
基因集合富集分析(GSEA)。通过Agilent整个人基因组阵列形成AR处理的VCaP、ERG腺病毒感染的VCaP和对照细胞的表达谱数据。计算实验细胞中相对于对照的基因表达倍数变化并将在AR处理的细胞中具有至少4倍变化的基因定义为AR调节的基因集合。将ERG腺病毒感染的VCaP细胞中相对于对照的基因表达倍数变化用于对基因预分类并输入到GSEA程序(Subramanian等人,Proceedingsof the National Academy of Sciences of the United States of America 102,15545-15550 2005)中以检查AR调节的基因集合是否在该数据中富集。
定量PCR。如此前所述(Yu等人,Cancer cell 12,419-431 2007a),使用Power SYBR Green Mastermix(Applied Biosystems)在AppliedBiosystems 7300实时PCR仪上进行Q-PCR。所有引物使用Primer 3设计,通过整合DNA技术(Integrated DNA Technologies)合成,并列于表8中。所有PCR实验均重复三次进行。
免疫共沉淀和蛋白免疫印迹。将VCaP细胞在补充有10%FBS的DMEMglutamax(Invitrogen,Carlsbad,CA)中培养至80%细胞汇合。收获含或不含甲醛交联的细胞,随后分离细胞核。在用TBS洗涤两次之后,将细胞核在含有蛋白酶抑制剂(Roche applied science,Indianapolis,IN)的RIPA缓冲液中裂解和超声。将裂解物离心并用于与抗体免疫共沉淀。用于免疫沉淀的抗体为:抗AR(多克隆(PG21),Millipore)、抗ERG(多克隆,Santa Cruz)、对照抗体(兔IgG多克隆,Millipore)。来自Labvision(Thermo scientific,Fremont,CA)的鼠单克隆抗AR抗体(AR441)用于Western实验。
RNA干扰。使用非靶向性siRNA(D-001210-01,Dharmacon)、对ERG的两种同种型(即TMPRSS2-ERG融合转录物和野生型ERG(UGG UCA GAG AGA AGC AAU A;SEQ ID NO:43))有特异性的siRNA(D-003886-01,Dharmacon)来处理VCaP细胞。
细胞生长和WST细胞增殖测定。将VCaP细胞在24孔板(5x 104细胞/孔)中于DMEM-glutamax(Invitrogen,Carlsbad,CA)培养基中培养。将细胞在含有10%活性炭处理的FBS的无酚红DMEM中剥夺雄激素达48小时,然后通过腺-ERG病毒或腺-LacZ对照病毒(Tomlins等人,Neoplasia(New York,NY)10,177-1882008)感染。溶解于乙醇中的R1881以最终浓度1nM使用。在处理48小时之后进行测定。对于细胞计数测定,将细胞用胰蛋白酶处理并使用Z2Coulter粒子计数器和粒度分析仪(Beckman Coulter,Fullerton,CA)计数。按照制造商指示(Roche applied science,Indianapolis,IN)进行使用WST-1试剂的细胞增殖测定。在24孔培养板上进行反应,并将溶液转移到96孔板以使用SpectraMax M5酶标仪(Molecular Devices,Sunnyvale,CA)进行读数。
细胞侵袭分析。如此前所述(Yu等人,Cancer cell 12,419-4312007a)使用修改的基底膜室分析进行细胞侵袭。简而言之,将相等数量的标示的细胞接种到存在于24孔培养板的插入物中的基底膜基质(EC matrix,Chemicon)上,其中将胎牛血清添加到下室中作为化学引诱物。48小时之后,使用棉拭子移除未侵袭细胞和EC基质。使用结晶紫对侵袭的细胞染色并拍照。将插入物用10%乙酸处理并在560nm处测量吸光度。
B.结果
AR占位的基因组概貌。利用新兴ChIP-Seq技术(Barski等人,Cell 129,823-837 2007;Johnson等人,Science(New York,NY 316,1497-1502 2007;Mikkelsen等人,Nature 448,553-560 2007;Robertson等人,Nature methods 4,651-6572007),确定了在两个雄激素敏感的前列腺癌细胞系中被AR结合的基因组区域。这些包括VCaP细胞和LNCaP细胞,VCaP细胞具有最常见的前列腺癌基因融合TMPRSS2-ERG(Tomlins等人,Science 310,644-6482005),而LNCaP细胞对于ERG融合为阴性,而对于ETV1的隐匿性重排为阳性(Tomlins等人,Nature 448,595-5992007)。为了在ChIP-Seq实验HPeak中限定富集的基因组区域,使用了将基于隐马尔科夫模型的算法应用于ChIP-Seq峰寻找的程序。结果显示在ChIPSeq实验的技术和生物重复之间具有高度重复性(图8)。在不存在雄激素的情况下,基底AR结合活性处于非常低的水平,而在雄激素处理下,AR与多于大约10倍的基因组区域结合并且具有更强的富集(图1A,表1)。在使用HPeak归一化到对应的乙醇处理的对照样品之后,在雄激素处理的LNCaP和VCaP细胞中分别检测到总共37,439和12,965个AR结合峰。
许多此前报道的AR靶基因被鉴定。例如,已知FKBP5是由AR经由远端增强子调节(Magee等人,Endocrinology 147,590-598 2006),并且此前已作为重要的AR靶基因通过ChIP-on-Chip检测到((Bolton等人,Genes&development 21,2005-2017 2007)。FKBP5在LNCaP和VCaP细胞中均被鉴定为最佳靶基因,其在单个25bp的滑动窗口中具有最多数量的读数被定位,分别为1771和669(图9)。此外,在PSA基因的良好限定的增强子处检测到尖的ChIP-Seq AR结合峰,而在PSA启动子处发现微小的第二峰(Jia和Coetzee,Cancer research 65,8003-8008 2005)(图1B)。而且,LNCaP和VCaP细胞之间的AR结合区域的比较揭示了显著的重叠;在由HPeak定义的25bp窗口的分辨率下,VCaP细胞中大约61%的AR结合基因组区域,在LNCaP细胞中也募集AR(图1C)。总之,这些结果验证了ChIP-Seq分析在鉴定AR结合位点中的准确性。
此前有限数量的基因的研究支持AR通过远端增强子调节靶基因(Bolton等人,2007,同上)。为了在基因组规模上评估AR占位的模式,估计了AR结合区域的中点与最近的基因的转录起始位点(TSS)的距离。LNCaP细胞中鉴定的所有AR结合区域中仅5%位于靶基因的TSS的附近(表2)。而一些结合位点位于TSS上游超过100kb,大约50%的AR结合位点位于基因内区域,这表明由启动子、增强子或基因内元件介导的雄激素调节机制的多样性。与LNCaP细胞相反,VCaP细胞中高得多的比例(14%)的AR结合位点位于启动子区域内(图1D),这表明在具有TMPRSS2-ERG基因融合的VCaP细胞中的细胞系特异的启动子介导的靶基因调节。
AR结合位点的基序分析。为了确定优选的AR共有结合序列,使用MatInspector对通过ChIP-Seq鉴定的AR结合区域检查Genomatix数据库中的脊椎动物转录因子的所有508个预先定义的共有序列矩阵的出现率。这种筛选发现15-bp的典型ARE为AR结合位点中最显著富集的基序(表3);高达36.1%的来自LNCaP的AR结合峰和33.2%的来自VCaP的AR结合峰包含至少一个ARE位点(表4)。ARE位点的出现率与由AR结合峰的高度所指示的AR富集正相关(r=0.87,P<0.001);根据峰高排在前10%的AR结合位点中高达60%包含ARE(图1E)。此外,一些AR结合峰包含超过一个ARE,并且每个峰的ARE位点的平均数也与峰高正相关(r=0.93,P<0.001),从而进一步确认了ARE位点在募集转录因子中的重要性。在由基因表达谱限定的雄激素调节基因中的AR结合位点的分析(Wang等人,Molecular cell 27,380-392 2007)揭示了峰高和雄激素应答性(图1F)之间的正相关性(r=0.72,P<0.001)。
除ARE位点之外,AR结合序列的基序扫描确定了其他转录因子的结合基序(表3)的显著(通过Fisher精确检验P<1x10-158)富集,所述其他转录因子包括此前表征的AR辅因子,例如Forkhead转录因子(Heemers和Tindall,Endocrine reviews 28,778-808 2007)。发现ETS家族结合基序是第2最显著(通过Fisher精确检验P<1x10-300)富集的基序;VCaP中大约29%的AR结合峰和LNCaP中27%的AR结合峰包含ETS位点,分别相当于33%和36%的ARE位点出现率(表4)。该结果表明AR和ETS基因融合产物ERG可与共同的序列集合结合,特别是在表达TMPRSS2-ERG和AR两者的细胞中,例如VCaP细胞。为了进一步确认AR和ERG结合基序的共定位,分析了1,422个包含ARE和ETS位点两者的AR结合区域的亚组。在这些序列的51%中,ARE和ETS基序在距彼此50bp内。
接下来研究了ChIP-Seq数据是否可用于预测相应转录因子的未知共有基序。首先,跨物种的AR结合序列的分析显示峰的中心处的高度保守性,这符合如下观念:转录因子结合基因座通常为系统发育保守的(图10)。其次,通过MEME(基序启发的多Em)程序在128个AR结合峰(在LNCaP和VCaP之间重叠)的亚组中的从头基序搜索以及对雄激素应答基因的定位(Wang等人,Molecular cell 27,380-3922007)鉴定了频繁出现的共有基序,其被称为“memeARE”,其与典型ARE位点具有显著的相似性(图1G)。
AR结合与基因表达相关。为了研究AR结合和雄激素对基因表达的调节之间的关联,对最佳AR结合基因进行检查。除FKBP5之外,LNCaP细胞中的其他最佳5个靶是C6ORF81、TACC2、CUTL2和SLC43A1,所有这些也均包括在VCaP细胞中的最佳10个AR结合靶中。所有这些基因,除了C6ORF81(未表征的转录物),均显示相对于大规模多肿瘤微阵列数据集中的其他肿瘤类型在前列腺癌中具有显著过表达(图11),指示这些基因为相对“前列腺特异的”。
为了确认在复发基因融合情况下的AR结合,对AR在此前报道的在前列腺癌中的5’基因融合伴侣上的占位进行检查。AR结合所有5’融合伴侣基因的调控元件,这些5’融合伴侣基因是雄激素敏感的,包括TMPRSS2、C15ORF21、HERV-K和SLC45A3(Tomlins等人,Nature 448,595-599 2007)(图2A-D)。此外,使用对每个靶基因特异的引物的常规ChIP-PCR确认通过ChIP-Seq分析检测的AR结合(图2A-D插图)。相比之下,在5’融合伴侣HNRPA2B1的调控区域内未检测到AR占位,HNRPA2B1为雄激素不敏感的但为广泛表达的(Tomlins等人,Nature 448,595-599 2007),该特征可能导致融合产物的上调(图2E)。使用抗RNA PolII和组蛋白H3赖氨酸4三甲基化(H3K4me3)的抗体的ChIP-Seq分析确认了HNRPA2B1启动子的活性和开放性染色质结构(图2E)。
然后,为了关联AR结合与在基因组水平上通过雄激素的表达调节,对结合在雄激素调节基因上的AR的过表达进行检查,所述雄激素调节基因由LNCaP前列腺癌细胞的表达微阵列研究限定(Wang等人,2007,同上)。结果显示在雄激素应答基因的基因组区域中有显著更多的AR结合(图2F)。在雄激素处理的早(4h)和晚(16h)时间点之间这种富集没有大的差异。相比于雄激素抑制基因,观察到更高百分比的包含AR结合区域的雄激素诱导基因(图2G),从而确认AR作为转录激活因子的主要作用。被AR结合的雄激素诱导基因的百分比从雄激素处理4h时的85%降至处理16h时的77%,而雄激素抑制基因的百分比在早时间点和晚时间点保持基本上相同,大约60%。在VCaP细胞中观察到AR占位与雄激素应答性的类似相关性(图12)。
为了获得AR结合基因的功能注释,在Oncomine分子概念图谱(MCM)(Rhodes等人,Neoplasia(New York,NY 9,443-454 2007)中分析前3000个AR占位的基因在超过15,000个分子概念或生物关联中的富集。结果显示了富集网络,该网络显著地(P<1.0x 10-100)将VCaP中的AR结合基因与LNCaP细胞中的AR结合基因连接,并且将VCaP中的AR结合基因与体外或体内的多个雄激素调节基因集合连接(P<1.0x 10-10)(图3A,表5)。最富集(P<1.0x 10-20)的分子概念为被胚胎干细胞或转移性前列腺癌中的多梳家族蛋白沉默的基因集合,这确认了雄激素信号转导与正常细胞分化过程的关联。与观察到雄激素非依赖性转移性前列腺癌中降低的雄激素信号转导(Tomlins等人,Nature genetics 39,41-51 2007)一致,观察到AR结合的高度显著的富集(P<4.0x 10-15)与对应于“在转移性或高级别肿瘤中以受限方式表达的基因”的基因表达概念。MCM分析揭示了在前列腺癌中AR结合基因与ERG过表达标记的新型连接(P<4.0x 10-13),表明AR和ERG调节途径之间的潜在关联。概括地说,AR结合基因与具有雄激素敏感性的前列腺癌亚型、疾病状态、ERG表达和患者存活率显著地(P<2.0x 10-10)相关(表5)。使用AR结合基因分层聚类基因表达数据集的热图示于图6中。
前列腺癌细胞中基因组范围的ERG占位。为了研究AR和ERG介导的转录途径之间的潜在联系,在包含TMPRSS2-ERG基因融合的VCaP细胞中进行ERG的ChIP-Seq。作为阴性对照实验,在LNCaP细胞中也进行ERG ChIP-Seq,所述LNCaP细胞对于ERG融合为阴性的,因而表达非常低水平的ERG。在VCaP细胞中鉴定了42,568个ERG结合峰,而在LNCaP细胞中仅有608个ERG结合区域,代表背景水平(表1)。此外,ChIP-Seq成功地检测到ERG结合在此前报道的靶基因上,所述靶基因包括MMP3、MMP9、PLAT和PLAU(Tomlins等人,Neoplasia(New York,NY 10,177-188 2008))(图3B)。为了关联ERG结合与更大范围内的基因表达,对结合在异位ERG过表达差异调节的基因上的ERG的过表达(Tomlins等人,2008,同上)进行检查。结果显示ERG结合在ERG调节基因的基因组区域富集(图14)。
然后,确定了ERG结合位点与来自RefSeq的最近基因的TSS的基因组距离。虽然LNCaP中仅5%的AR结合位点和VCaP中14%的AR结合位点定位到启动子区域,但大约34%的ERG结合位点位于靶基因的TSS的附近(表2)。这符合如下理解:AR调节主要由增强子介导(Wang等人,2007,同上)但ERG调节由启动子介导(Tomlins等人,2008,同上)。此外,AR结合位点在VCaP中的分布显示从LNCaP中增强子占主导的AR结合模式向VCaP细胞中启动子更加占主导的ERG结合分布的整体转变(图3C),从而显示了在VCaP细胞中ERG将AR募集到这些启动子的潜在作用。
为了进一步检查ERG结合活性,在具有异位ERG基因融合产物(RWPE+ERG)的稳定过表达或GUS(β-葡萄糖苷酸酶)对照(RWPE+GUS)的RWPE良性前列腺上皮细胞中进行ERG ChIP-Seq。在RWPE+ERG细胞中观察到10,765个ERG结合峰,大约比在RWPE+GUS对照细胞中检测到的多10倍。为了移除非特异性结合,在每个25bp滑动窗口将RWPE+ERG细胞中的ERG结合峰与RWPE+GUS对照中的那些ERG结合峰进行比较,导致总共6,685个对RWPE+ERG细胞特异的ERG结合区域。58%的这些基因组区域也募集VCaP细胞中的内源ERG(图3D)。VCaP中内源ERG的结合峰大约比RWPE+ERG细胞中异位ERG的结合峰多30,000个,指示在内源环境中使用额外的辅因子将ERG完全募集到其靶基因。VCaP和RWPE+ERG两种细胞中的ERG结合区域的基序分析揭示ETS家族结合位点为最显著富集的基序(表4),而发现ARE是AR结合峰中最富集的基序并且NRSF结合基序对NRSF结合位点为最佳(Johnson等人,Science(New York,NY 316,1497-1502 2007)),因而支持ChIP-Seq数据的特异性。
为了深入了解ERG介导途径,对VCaP细胞中ERG占位的基因进行富集MCM分析(图15和表6)。最显著(P<1.0x 10-100)富集网络使分子概念“VCaP中的ERG结合”(查询的索引列表)、“RWPE+ERG中的ERG结合”和“ETS结合基序”互连。此外,ERG占位的基因与将ETS阳性前列腺癌与ETS阴性肿瘤区分开的基因显著重叠。ERG占位的基因也与转移性前列腺癌或更具侵袭性的其他实体肿瘤(例如膀胱癌、乳腺癌、少突神经胶质瘤和黑素瘤)中过表达的基因重叠。这与正在发展的观念一致:TMPRSS2-ERG阳性前列腺癌具有更具侵袭性的过程(Clark等人,Oncogene 27,1993-20032008;Demichelis等人,Oncogene 26,4596-4599 2007;Furusato等人,Mod Pathol 21,67-75 2008;Nam等人,British journal of cancer 97,1690-1695 2007;Rajput等人,Journal of clinical pathology 60,1238-1243 2007;Wang等人,Cancer research 66,8347-8351 2006)。在ERG的最强(P<1.0x 10-100)富集网络中,结合基因为“LNCaP中的AR结合”和“VCaP中的AR结合”概念,第一次证明在前列腺癌中这两种转录因子之间的联系。
AR和ERG共同占位多个靶基因。为了检查靶基因的潜在AR和ERG共占位,在每个25bp滑动窗口对每种转录因子结合的基因组区域进行重叠比较。虽然来自LNCaP和VCaP的AR结合区域中的61%重叠,但在VCaP细胞中大约44%的AR结合区域与被ERG结合的区域重叠(图4A)。然而,LNCaP中仅16.6%的AR结合区域与VCaP中ERG结合位点重叠,表明细胞系之间的差异。观察到的AR和ERG结合区域之间的重叠是明显的,因为AR和ERG结合区域覆盖整个人基因组的小于0.1%和0.7%,因而这种低百分比的重叠机会是极小的。这种机会被如下事实进一步减小:AR主要结合增强子元件而ERG结合靶基因的启动子。为了在统计学上确认AR和ERG之间的重叠不是随机事件,使用ChIP-Seq获得的NRSF结合位点(Johnson等人,Science(New York,NY 316,1497-1502 2007))作为对照,NRSF结合位点为未显示与AR或ERG相关的神经特异性的转录因子。AR或ERG的结合区域与NRSF具有小于2%的重叠。因此AR和ERG结合位点之间的重叠比它们与NRSF结合区域的重叠(通过卡方检验P<0.0001)显著更多。
为了排除如下可能性:AR和ERG共同占位靶区域仅仅是因为它们均结合活性转录基因,对主要结合活性转录基因(Barski等人,Cell129,823-837 2007)的TSS附近的H3K4me3和RNA PolII进行ChIP-Seq分析。观察到分别4.3%、14%和31%的LNCaPAR、VCaPAR和VCaP ERG结合区域与RNA PolII结合位点重叠(图4A)。AR与PolII的重叠显著低于ERG和PolII之间的重叠。本发明并不限于具体的机制。实际上,对机制的理解并非实施本发明所必要。然而,结果显示:虽然仅14%的AR结合区域与RNA PolII重叠,但有显著更多的(44%)AR结合区域与ERG结合位点重叠,从而表明它们的共占位是由于与结合表达基因不同的机制。因此,虽然与PolII重叠的量实际上反映特异性转录因子与活性TSS的结合,但AR和ERG之间的重叠比它们与PolII的重叠高得多,从而排除如下机制:它们的重叠仅与具有PolII结合的表达基因相关。这进一步被AR和ERG与活性基因的H3K4me3标记的类似重叠模式证实(图4A)。此外,比LNCaPAR(4.3%)结合位点高得多的百分比(14%)的VCaP AR结合位点与PolII或H3K4me3重叠,表明VCaP细胞中增强的启动子介导的AR调节(图3C)。
为了证实AR和ERG在靶基因上的共占位,随机选择被AR和ERG两者结合的一组5个基因,包括位于不同染色体上的NDRG1、C60rf81、LOC400451、ZBTB16和CUTL2。结果显示在这些靶基因附近AR和ERG结合区域有明显的重叠(图4B)。使用对这些基因中的每一个特异的引物,通过常规ChIP-PCR分析证实了AR和ERG结合(图4C)。相对于载体处理的细胞,在用合成雄激素处理的VCaP细胞中评估AR结合的富集。相对于用于ChIP的IgG对照,对ERG结合的富集进行评价。
连接TMPRSS2-ERG、野生型ERG和AR的反馈回路。在VCaP细胞中被ERG强烈结合的基因之一是AR(图5A)。ERG对AR的调节因而可提示它们之间的反馈回路。通过常规ChIP-PCR分析,证实了在VCaP细胞中ERG结合在AR基因座上(图5B)。此外,通过异位ERG过表达和RNA干扰分析,显示AR的转录水平被ERG负调节(图5C,图16)。而且,VCaP细胞的免疫印迹分析显示了在ERG过表达时AR蛋白的明显阻遏(图5D)。对AR和ERG在AR基因处的共占位的检查揭示AR结合其自身的基因组调控区(图5E)。常规ChIP-PCR分析显示,相对于载体处理的细胞,在雄激素处理的VCaP细胞中AR自身强烈富集(图5F)。此外,相比于载体处理的细胞,用合成雄激素处理的激素剥夺的VCaP细胞表达显著少量的AR(图5G),并且这种阻遏在处理24h之后达到超过10倍(图17)。免疫印迹分析进一步证实了这种在蛋白水平上的AR的负反馈回路(图5H)。由于观察到AR和ERG的交叉调节以及AR的自调节,对ERG是否可自调节进行了研究。ChIP-Seq分析显示了多个在ERG基因的基因座处的ERG结合峰(图5I)。通过使用ERG基因组区域内的最高结合峰两侧的引物的常规ChIP-PCR,证实了VCaP细胞中的强烈ERG结合(图5J)。为了研究ERG表达的自调节,将从外显子2起始到所报道的终止密码子的截短形式的ERG在VCaP细胞中过表达,并且使用对TMPRSS2-ERG、野生型ERG和这两者特异的引物检测相应的表达变化(图5K)。结果显示,在前列腺癌中为普遍的融合产物的截短ERG诱导野生型ERG的表达但不是TMPRSS2-ERG的表达,TMPRSS2-ERG的表达受TMPRSS2增强子的调节。该发现通过过表达融合ERG并检测野生型ERG在良性前列腺上皮细胞(PREC)和LNCaP前列腺癌细胞中得到证实(图18)。一致地,在雄激素处理之后,观察到野生型ERG相对于TMPRSS2-ERG延迟上调,显示了雄激素通过其对TMPRSS2-ERG的一级效应而对野生型ERG产生二级效应(图19)。此外,TMPRSS2-ERG的特异性RNA干扰导致对野生型ERG的阻遏,而野生型ERG的特异性RNA干扰不影响TMPRSS2-ERG表达(图5L)。ERG变体的RNA干扰也强烈的降低VCaP前列腺癌细胞的侵袭潜能(图20)。此外,对一组良性前列腺组织、局部前列腺癌和转移性前列腺癌中的三种ERG变体的qRT-PCR分析显示了在表达ETS基因融合的人前列腺癌的亚组中对野生型ERG的诱导(图5M)。因此,具有TMPRSS2-ERG融合的前列腺癌的亚组也可以诱导限定不同分子亚型的野生型ERG的表达。总之,TMPRSS2-ERG、野生型ERG和AR的交叉调节和自调节形成互连的转录“开关”,该转录“开关”参与AR-ERG调节网络的体内平衡和前列腺癌的发展。
ERG和AR在前列腺癌组织中的调节环路。使用体外细胞系模型,对AR和ERG的互连调节网络进行说明。为了进一步研究其体内相关性,通过对具有TMPRSS2-ERG基因融合并且还表达高水平的AR的人前列腺肿瘤的ChIP-Seq分析,对AR和ERG共占位进行验证。由于多个技术挑战,团队已难以发展人肿瘤中转录因子的全基因组图谱(相对于细胞系)。开发了针对来自冷冻人体组织标本的DNA优化的ChIP-Seq方案。通过对ERG+、AR+人前列腺癌组织的ChIP-Seq分析,可以检测到12,036个AR结合区域和6,967个ERG结合区域(表1)。如细胞系数据所提示,在此前限定的PSA和TMPRSS2基因的增强子元件处鉴定出AR结合峰(图21)。
组织AR和ERG结合区域的比较揭示了显著的重叠(44%),从而验证了在体内前列腺肿瘤中AR和ERG的基因组范围的共占位(图6A)。为了进一步验证这种重叠的特异性,在相同组织中进行H3K4me3(活性转录的组蛋白标记)的ChIP-Seq分析。由于抗H3K4me3抗体的良好质量和这种活性组蛋白标记的丰度,观察到31,836个结合区域。然而,尽管H3K4me3标记在整个基因组上覆盖相当广泛,但分别仅5.5%和6.5%的这些区域与组织AR和ERG结合位点重叠(图6B)。组织AR和ERG结合区域之间的重叠显著(通过卡方检验P<0.0001)高于它们与H3K4me3的重叠。此外,对一组AR和ERG共同占位的基因(包括NDRG1、C6orf81和ZBTB16)的仔细检查,证实组织AR和ERG结合位点与VCaPERG结合位点重叠(图6C)。
在组织中对在VCaP细胞中检测的连接TMPRSS2-ERG、野生型ERG和AR的反馈回路进行分析。在用于ChIP-Seq分析的相同转移性前列腺癌组织中对各个基因进行常规ChIP-PCR检测。相对于没有富集的对照IgG,对通过抗AR或抗ERG抗体富集的靶基因进行评价,并归一化到KIAA0066非靶向对照基因的3’内含子区域。证实了AR在TMPRSS2增强子上的强烈结合(图6D)。在AR自身的基因组区域上观察到显著(通过t检验P<0.05)AR ChIP富集。类似地,ChIP-PCR分析证实在前列腺肿瘤中ERG结合在ERG和AR基因两者的调控区域(图6E)。
为了探究ERG结合基因在转移性前列腺癌中的潜在功能,选择1,534个在TSS附近包含ERG结合峰的基因。比较这组基因在Oncomine MCM数据库(Rhodes等人,2007,同上)中所有分子概念或基因集合中的不成比例的富集。该分析揭示了由具有高度显著的重叠(P<1.0x 10-100)的生物关联组成的核心转录调节回路;这些包括肿瘤中的ERG结合和AR结合,VCaP细胞中的ERG结合和AR结合以及稳定的RWPE+ERG细胞中的ERG结合(图6F)。虽然在AR+和ERG+组织以及VCaP细胞中AR和ERG结合位点的重叠具有最高显著性,但它们与ERG阴性LNCaP细胞中的那些的重叠具有低得多的显著性(P<1.0x 10-50)(表7)。此外,在组织ERG结合基因和包含ETS基序的基因之间观察到显著的重叠,从而支持在通过ChIP-Seq鉴定的ERG结合区域中的ETS基序的相关富集。ERG结合基因与ETS+前列腺癌以及转移性前列腺癌中差异调节的基因相关,转移性前列腺癌中高达80%具有TMPRSS2-ERG基因融合。因此,组织中的ERG结合基因的MCM分析揭示了AR和ERG的核心转录调理网络,该调节网络与前列腺癌中的表达失控功能相关。
在不存在雄激素的情况下ERG过表达保持雄激素敏感的前列腺癌细胞的肿瘤性质。ChIP-Seq实验证实无论在体外细胞系中还是在体内组织中AR和ERG在基因组区域共占位,从而显示AR和ERG蛋白可相互作用或临近结合在靶DNA处。为了用实验方法验证这种相互作用,在VCaP细胞中进行免疫共沉淀(co-IP)分析。结果显示AR和ERG蛋白并不直接与彼此互作以形成蛋白质复合物(图7A)。然而,在蛋白质-DNA交联之后的co-IP分析在AR沉淀中检测到ERG蛋白但在对照IgG捕获中未检测到,从而显示由AR和ERG蛋白均结合的DNA介导的AR和ERG蛋白间接相互作用。
为了研究AR和ERG共占位靶基因的功能结果,将ERG过表达的影响与雄激素刺激的影响进行比较。假设通过调节共享的靶基因的组,ERG过表达可传达一些雄激素介导的效应。雄激素处理激素饥饿的VCaP细胞诱导细胞增殖,如通过细胞计数和WST细胞增殖测定监测的(图7B和图22)。ERG基因融合产物的过表达显著地诱导VCaP细胞生长,即使在不存在雄激素的情况下。类似地,正如所预期的,雄激素撤除使雄激素敏感的VCaP和LNCaP细胞的侵袭能力减弱,并且这种抑制可由ERG过表达部分地挽救(图7C和图23-24)。为了评价这种共享功能的基本机制,研究了被雄激素和异位ERG过表达诱导的基因表达变化。GSEA(基因集合富集分析)分析揭示了AR和ERG介导的基因表达模式的显著重叠(p<0.001)(图7D),该重叠可赋予AR和ERG的共同肿瘤性质。
然后假设:通过与AR介导途径的交互,ERG能够驱动雄激素敏感细胞以雄激素非依赖方式增殖。为了检验该假设,使用GUS对照慢病毒或ERG慢病毒感染雄激素敏感的VCaP前列腺癌细胞。选择表达ERG(VCaP+ERG)或GUS(VCaP+GUS)的稳定克隆并进行细胞增殖分析。观察到VCaP+ERG细胞的生长显著快于VCaP+GUS对照细胞;该差异在不存在雄激素的情况下尤其突出(图7E-F)。VCaP+ERG细胞在不存在雄激素的情况下能够持续增殖,而VCaP+GUS细胞不能生长。因此,ERG在调节雄激素非依赖性前列腺癌进展中可发挥关键作用。
表1:通过ChIP-seq获得的序列读数的汇总
表2:ChIPseq AR/ERG结合位点相对于最近的基因的TSS的分布
(负用于上游,正用于下游)。示出的是在每个距离盒处的结合位点数。
表3:在不同数据集中AR或ERG的结合序列中包含的最佳基序(和通过Fisher精确检验获得的p值)。最佳AR结合基序为黄色,
最佳ETS结合基序为绿色。
表4:基序在结合序列中出现的百分比和其在不同数据集上的富集比率。
表5:VCaP细胞中的AR结合基因的MCM分析
表6:VCaP细胞中的ERG结合基因的MCM分析
表7:转移性前列腺癌组织中的ERG结合基因的MCM分析
表8:用于本研究中的寡核苷酸序列
实施例2
siRNA靶向
设计靶向ERG或TMPRSS2-ERG融合的siRNA。示例性寡核苷
酸示于表9中。
表9
实施例3
肽抑制剂
为了鉴定用于与靶ETS家族蛋白(ERG蛋白作为初步研究)相互作用的短肽,使用噬菌体展示随机肽库来鉴定ERG结合伴侣。将全长ERG蛋白作为N端聚组氨酸标签融合蛋白在杆状病毒表达系统中表达,并从细胞裂解物中纯化在镍珠上。将噬菌体展示库在此前用洗脱的聚组氨酸融合蛋白覆盖的免疫试管中孵育。为了选择与ERG蛋白特异性结合的肽,使用覆盖在免疫试管上的聚组氨酸-GUS蛋白对噬菌体库进行预选。进行四轮富集以提高结合亲和力和特异性。结合的噬菌体被洗脱,并且随机选择克隆以使用噬菌体ELISA验证对ERG蛋白的结合特异性(图27a)。
对相互作用的噬菌体克隆测序并使用生物信息学方法进行分析以鉴定共有肽序列。对57个噬菌体克隆的测序分析揭示了共有基序(图27b)。此外,观察到展示这种基序的噬菌体(在第二轮中20个中的5个以及在第三轮中20个中的16个)的富集。这些结果表明噬菌体展示库可用于成功地鉴定目标蛋白的相互作用伴侣。使用一组作为HaloTag融合蛋白表达的ERG缺失突变体对ERG内介导分离的噬菌体克隆的结合的域进行定位。将称为N-端、ETS、CAE、PNT、CD和CTD(Carrere等人,Oncogene,1998.16(25):p.3261-8)的总共6个域进行克隆并在TNT SP6麦胚系统中表达。在没有纯化的情况下,将表达反应物涂布在HaloLink阵列系统上并与各个噬菌体克隆孵育。通过Cy3标记的抗M13抗体检测相互作用信号,所述抗M13抗体特异性地针对噬菌体衣壳蛋白(图28)。一个编码肽LSFGSLP的噬菌体克隆强烈地结合全长ERG蛋白和ETS域,但不结合其他域。相比之下,不含插入序列的空噬菌体不产生信号,表明靶蛋白特异性地结合重组噬菌体。使用ETS域的一系列重叠的19个氨基酸的片段的进一步定位研究将结合位点具体地确定到9个氨基酸的保守长度RALRYYYDK,其对应于ERG中的残基Arg367至Lys375(图29)。然后定位了特异性地参与肽结合的保守氨基酸区域。单个氨基酸取代R(ERG中的残基Arg367)→K完全破坏了噬菌体肽结合,表明R367对于噬菌体肽LSFGSLP和ERG之间的相互作用而言是重要的残基。这种定位也表明噬菌体肽通过空间竞争基本转录因子的相互作用来抑制ERG功能。
为了进一步验证展示在M13噬菌体上的肽独立于其他噬菌体组分与ERG相互作用,使用合成肽进行实验。因为已经证明ETS域是结合雄激素受体(AR)的充分必要条件,所以使用捕获实验检验合成肽是否与AR竞争结合ETS域。将Halo-ETS融合蛋白固定在HaloLink磁珠上,并且在存在各种浓度的合成肽LSFGSLP的情况下与在大肠杆菌(E.coli)系统中表达的重组GST-AR融合蛋白孵育,随机肽HSKINPT作为阴性对照。将珠用SDS上样缓冲液洗脱并与特异性针对GST-AR的抗GST mAb进行印迹杂交(图30)。在添加LSFGSLP时,AR与ETS域的结合以浓度依赖方式被抑制。相比之下,随机肽并不阻断AR与ETS的结合。这些数据表明肽LSFGSLP在ETS域上占位的位点与参与AR结合的位点重叠或邻近。
为了研究ERG结合肽阻断ERG介导的侵袭的能力,将用ERG或LACZ腺病毒转导的前列腺细胞系RWPE-1与TAT标记肽孵育。在48小时之后,相比于对照细胞,添加2μM浓度的肽LSFGSLP显著降低ERG驱动的侵袭,而添加随机肽HSKINPT未降低侵袭(图31)。还通过比色测定定量了受侵袭细胞的相对数量。
这些研究证明源自噬菌体库的肽能够特异性地破坏ERG相互作用途径。本发明并不限于具体的机制。实际上,对于机制的理解并非实施本发明所必要。然而,可以设想拮抗肽通过阻止结合ERG蛋白中的ETS域而发挥作用,而结合ERG蛋白中的ETS域是激活下游信号途径的必要步骤。
图37-42显示肽抑制剂的其他特征。图37-45显示肽(例如,TAT-LSFGSLP、TAT-FTFGTFP或TAT-LPPYLFT)阻断ERG相互作用组(通过ETS域)、减弱由ERG驱动的细胞侵袭、阻断ERG转录活性和抑制细胞增殖。
实施例4
肽鉴定
ETS蛋白的表达和纯化。将ETS家族基因的cDNA片段,包括ERG、ETV1和ETV4等,克隆到pDEST10载体(Invitrogen)中。根据制造说明基于Bac-to-Bac系统构建杆状病毒。在昆虫细胞中诱导蛋白并通过镍珠纯化。
ETS特异性噬菌体肽的富集。使用纯化的ETS蛋白进行五个连续的选择和扩增循环来富集M13噬菌体展示随机肽库(New EnglandBiolabs)。为了移除非特异性噬菌体肽,将纯化的GUS用作阴性选择来预先清理随机肽噬菌体库。
反向噬菌体ELISA。使用纯化的ETS蛋白涂布Maxisorp板。阻断之后,添加选择的噬菌体和阴性对照克隆(空噬菌体和随机克隆)并在常温下孵育1小时。洗涤之后,使用HRP标记的抗M13抗体(GEhealthcare)检测结合的噬菌体。添加TMB(Sigma)之后,在波长450nm处测定光密度(OD)。
肽合成。合成肽及其衍生物并通过AnaSpec(San Jose,CA)的反相高效液相色谱进行纯化。
体外蛋白质合成和捕获测定。按照制造商方案将cDNA和片段克隆到pFN19A载体中。通过麦胚表达系统(Promega)产生体外翻译蛋白并固定到HaloLink磁珠上。洗涤之后,在存在或不存在肽的情况下将偶联的珠与GST-AR融合蛋白孵育。将结合蛋白通过SDS-PAGE分析并与抗GST mAb(Sigma)进行印迹杂交。
表面等离子体共振。使用Biacore系统(GE Healthcare)研究肽与EST蛋白的相互作用。将来自昆虫细胞的纯化ETS蛋白通过伯胺残基共价连接到传感器芯片上。注入在HBS缓冲液中的一系列浓度的各种合成肽以检测共振单元中的结合。在每次运行之后,用甘氨酸使芯片表面再生。使用非线性回归分析来确定拟合单位点结合模型的平衡结合常数。
模型和监测肽转膜效率。将TAT标记肽与VCaP细胞和具有整合ERG或LACZ病毒的PrEC或RWPE细胞孵育。将肽进行FITC标记,然后通过荧光显微镜法或流式细胞术监测转膜效率。
细胞增殖、存活和凋亡分析。使用过表达系列和稳定敲除系列,采用标准细胞增殖和凋亡分析(Chinnaiyan等人,Cell,1995.81(4):p.505-12;Chinnaiyan等人,Proc Natl Acad Sci U S A,2000.97(4):p.1754-9;Varambally等人,Nature,2002.419(6907):p.624-9)来评估肽在由TMPRSS2:ETS融合驱动的前列腺细胞增殖中的抑制作用。
统计分析。使用基本生物统计学方法来比较在ETS基因融合过表达细胞系中由ERG结合肽诱导的表型和由对照肽诱导的表型。
实施例5
抑制剂鉴定
该实施例描述用于筛选基因融合抑制剂的方法。
雄激素信号转导途径诱导前列腺癌中的5’和3’基因融合伴侣基因之间的靠近
多重证据均表明雄激素信号转导参与前列腺癌中的ETS基因融合形成:(A)TMPRSS2-ETS基因融合仅限于前列腺癌,并且雄激素信号转导是前列腺癌的突出特征。(B)近期文献指出本质上类似于雄激素信号转导的雌激素信号转导与雌激素受体α结合基因家族中的染色体间相互作用有关(Hu等人,Proc Natl Acad Sci U S A l2008;105:19199-204)。
对雄激素信号转导是否导致产生5’和3’基因融合伴侣之间的诱导靠近的染色体内/间移动进行了研究。(C)数据表明使用DHT(二氢睾酮)处理LNCaP细胞(雄激素敏感的人前列腺腺癌细胞)诱导TMPRSS2和ERG基因座之间的靠近(图32)。LNCaP细胞不具有TMPRSS2-ERG基因融合,这使得其可用于使用TMPRSS2和ERG的诱导靠近实验。LNCaP细胞中这两个基因座之间的雄激素诱导靠近由雄激素受体(AR)介导。在DU145细胞(雄激素不敏感的前列腺癌细胞系)中未观察到TMPRSS2和ERG之间的雄激素诱导靠近。
雄激素信号转导和导致DNA双链断裂的试剂的组合引起前列腺癌中的癌基因融合
对使用雄激素(例如DHT)刺激是否可通过将雄激素刺激与导致DNA双链断裂的试剂偶联来引起基因融合进行了研究。使LNCaP细胞耗尽激素,然后使用DHT(10nM,12小时)刺激,辐照(1Gy或3Gy),然后使用流式分选在96孔板中克隆扩增单个细胞。使用定量反转录PCR(QRT-PCR),并用跨越嵌合区域的SYBR绿和TaqMan检测,确定了TMPRSS2-ERG融合转录物的存在。观察到分别有2.3%(1/43)和25%(3/12)的使用1Gy和3Gy辐照的克隆具有TMPRSS2-ERG融合转录物(图33A,B)。阳性LNCaP克隆表达的TMPRSS2-ERG水平类似于VCaP细胞,VCaP细胞内源地具有这种基因融合。此外,表达TMPRSS2-ERG的LNCaP细胞在ERG基因座处显示具有染色体畸变(图2C)。
前列腺癌中AR结合的基因组概貌
使用联合大规模平行测序的染色质免疫沉淀(ChIP-Seq)来系统地绘制LNCaP和VCaP前列腺癌细胞系中AR(来自Millipore的抗体,#06-680)的基因组概貌。结果验证了ChIP-Seq实验的技术和生物重复之间的高度重复性。在不存在雄激素的情况下,基底AR结合活性处于非常低的水平,而在雄激素处理下,AR与多大约10倍的基因组区域结合并且具有更强的富集(图34A)。许多此前报道的AR靶基因被鉴定。例如,如所预期的,在PSA基因的良好限定的增强子处检测到尖锐的ChIP-Seq AR结合峰,而在PSA启动子处发现微小的第二峰(图34B)。总之,这些结果验证了ChIP-Seq分析在鉴定AR结合位点中的准确性。VCaP细胞中大约61%的AR结合位点与LNCaP中的那些AR结合位点物理地重叠,从而显示了共享AR募集以及细胞类型特异的AR募集。
然后检查了在AR结合位点中的共有序列基序的存在。通过基于它们是否包含全长典型ARE或半长ARE或无ARE基序而将所有AR结合位点分类,发现包含全长ARE基序的结合位点的富集峰显著(通过t检验p<0.001)高于具有半长ARE基序的那些,而具有半长ARE基序的那些的峰高于无任何ARE基序的那些,从而支持ARE在募集AR中的作用。为了获得AR结合基因的功能分类,对AR结合基因在Oncomine数据库中的成千上万预先定义的分子概念/基因集合中的富集进行分子概念图(MCM)分析。在大约20,000个分子概念中,总共1462个(约7%)显示显著(P<0.001)富集。毫不奇怪,VCaP细胞中AR结合基因与LNCaP细胞中的那些显著重叠(P<1.0x 10-100)并且它们均与被体外或体内雄激素调节的基因相关(P<1.0x 10-10)。
雄激素信号途径在介导染色体相互作用中的作用
ChIA-PET是用于从头检测由目标转录因子所介导的全局染色质相互作用的方法。图35说明ChIA-PET策略。将这种策略应用于在饥饿和雄激素刺激条件下的LNCaP和VCaP细胞。通过使用甲醛交联来捕获远程染色质相互作用。使用抗AR的抗体(Millipore,#06-680)通过ChIP来富集超声处理的DNA-AR复合物。通过邻位连接将每个染色质复合物中拴缚的DNA片段与DNA接头连接,并且提取配对末端标签(PET)以用于使用Illumina基因组分析仪II测序。将所得ChIA-PET序列定位到参考基因组从而揭示被AR一起带进紧密空间靠近的远程染色质区域之间的关系。通过比较ChIA-PET、ChIP-Seq和基因表达数据库而鉴定的正相互作用通过QRTPCR(定量反转录PCR)进一步验证。
可检测DNA损伤和基因融合的细胞策略
开发了可感测DNA损伤和基因融合的细胞策略。对LNCaP细胞进行基因工程化以通过展示容易辨识的表型或标签来揭示TMPRSS2-ERG基因融合的形成。例如,在一些实施方案中,使用荧光素酶盒替代ERG基因的一部分(图36)。由于LNCaP细胞不具有ERG表达,所以工程化细胞将显示可忽略的或无荧光素酶活性。TMPSS2-ERG是迄今鉴定的最频繁的基因融合,并且其导致高水平的ERG活性。任何导致染色体易位形成(如通过产生TMPRSS2-ERG基因融合所揭示)的处理都将导致可容易检测到的荧光素酶活性。一个用于该细胞策略的替代性设计涉及采用分离荧光素酶系统。例如,在一些实施方案中,使用5’荧光素酶盒替代TMPRSS2的外显子1并使用3’荧光素酶盒替代ERG的外显子4,因为这些是最常与TMPRSS2-ERG基因融合关联的外显子。重要的是,分离的荧光素酶系统将降低该分析的固有噪音。
工程化锌指核酸酶(ZFN)逐渐作为可供选择用于哺乳动物细胞中基因组编辑的方法被采用(Santiago等人,Proc Natl Acad Sci U S Al2008;105:5809-14)。这种方法用于对LNCaP细胞进行基因工程处理。该技术采用定制设计的与内切核酸酶FokI的催化域融合的异源锌指蛋白(ZFP)DNA结合域(其特异性结合指定靶序列)。这种FokI域的二聚化是其DNA结合依赖性内切核酸酶活性所需要的。因此,将两个单独ZFN设计为以精确的序列特异性、间距和取向与靶DNA延伸结合的一对从而有利于二聚化和随后的DNA裂解。当在细胞中瞬时表达时,ZFN在内源靶基因中产生位点特异性DSB,该内源靶基因随后可通过与两侧有同源臂的荧光素酶盒一起共转染供体质粒经由同源重组进行编辑。通过使用雄激素刺激并施用不同剂量的辐射来检验工程化的荧光素酶LNCaP细胞和分离荧光素酶LNCaP细胞检测TMPRSS2-ERG基因融合的能力。
小分子库筛选用于鉴定促进或抑制基因融合/染色体易位的化合物
使用上述工程化的LNCaP细胞来筛选小分子库。采用化学基因组学中心的高通量化合物库筛选设备。首先运行2000个小分子和天然产物的试验性筛选,并基于该结果筛选30,000个化合物的更大清单。在化合物添加之前18小时,将细胞进行胰蛋白酶化并使用多分支(Multidrop)设备分配到384孔板中60μl培养基中。在时间零时,将化合物从1.5mM DMSO原液转移到细胞板中,最终化合物浓度为约5μM。48小时之后,通过添加50μl培养基和10μl Steady-Glo荧光素酶试剂(Promega)来测定表达的荧光素酶活性。在Pherastar酶标仪(BMG Labtech)中读取样品板。筛选中的每个板包含320个待测化合物和64个对照孔,对照孔放置在板每侧上的靠外两列。“阳性”对照为引起基因毒性应激和诱导易位的试剂,如依托泊苷和多柔比星(Lin等人,Cell 2009 139:1069)。
在上面说明书中提到的所有出版物、专利、专利申请和登录号均以引用方式整体并入本文。虽然本发明已结合具体实施方案进行描述,但应当理解本发明所要求保护的不应当不当地受限于这些具体实施方案。事实上,本发明的所述组合物和方法的多种修改形式和变型形式对本领域普通技术人员而言是显而易见的,且旨在以下权利要求书的范围之内。
Claims (23)
1.一种组合物,其包含与ETS家族成员基因的ETS域结合的肽。
2.根据权利要求1所述的组合物,其中所述ETS家族成员基因是ERG。
3.根据权利要求1所述的组合物,其中所述肽与包含所述肽序列RALRYYYDK(SEQ ID NO:1)的所述ETS域的区域结合。
4.根据权利要求2所述的组合物,其中所述肽与包含ERG的R367的所述ETS域的区域结合。
5.根据权利要求4所述的组合物,其中所述肽结合ERG的氨基酸R367至K375。
6.根据权利要求1所述的组合物,其中所述肽包含选自含有氨基酸序列LSFGSLP(SEQ ID NO:2)、FTFGTFP(SEQ ID NO:44)和LPPYLFT(SEQ ID NO:45)的肽的氨基酸序列。
7.根据权利要求1所述的组合物,其中所述肽包含由LSFGSLP(SEQ ID NO:2)组成的氨基酸序列。
8.一种抑制细胞中ETS家族成员基因的生物活性的方法,其包括使所述细胞与结合所述ETS家族成员基因的所述ETS域的肽接触。
9.根据权利要求8所述的方法,其中所述ETS家族成员基因是ERG。
10.根据权利要求8所述的方法,其中所述肽与包含肽序列RALRYYYDK(SEQ ID NO:1)的所述ETS域的区域结合。
11.根据权利要求9所述的方法,其中所述肽结合包含ERG的R367的所述ETS域的区域。
12.根据权利要求11所述的方法,其中所述肽结合ERG的氨基酸R367至K375。
13.根据权利要求8所述的方法,其中所述肽包含选自LSFGSLP(SEQ ID NO:2)、FTFGTFP(SEQ ID NO:44)和LPPYLFT(SEQID NO:45)的氨基酸序列。
14.根据权利要求8所述的方法,其中所述肽包含由LSFGSLP(SEQ ID NO:2)组成的氨基酸序列。
15.根据权利要求8所述的方法,其中所述细胞是癌细胞。
16.根据权利要求15所述的方法,其中所述癌细胞是前列腺癌细胞。
17.根据权利要求8所述的方法,其中所述细胞在体内。
18.根据权利要求17所述的方法,其中所述细胞在动物体内。
19.根据权利要求18所述的方法,其中所述动物为人。
20.根据权利要求8所述的方法,其中所述细胞为离体的。
21.根据权利要求8所述的方法,其中所述ETS家族成员基因与雄激素调节基因融合。
22.根据权利要求21所述的方法,其中所述ETS家族成员基因是ERG并且所述雄激素调节基因是TMPRSS2。
23.根据权利要求8所述的方法,其中所述生物活性为所述细胞的侵袭性。
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