KR101477374B1

KR101477374B1 - 인돌아민 2,3-디옥시게나제 억제제 스크리닝 방법

Info

Publication number: KR101477374B1
Application number: KR20130007743A
Authority: KR
Inventors: 최은영; 이훈복; 민창기; 이철범
Original assignee: 가톨릭대학교 산학협력단
Priority date: 2013-01-24
Filing date: 2013-01-24
Publication date: 2015-01-06
Also published as: KR20140095175A

Abstract

본 발명은 인돌아민 2,3-디옥시게나제(indoleamine 2,3-dioxygenase)인 IDO1 및 IDO2를 동시에 발현할 수 있는 재조합 벡터를 제조하고, 이를 동시에 발현시킬 수 있도록 세포주에 재조합 벡터로 형질전환한 후, IDO1 및 IDO2를 모두 억제할 수 있는 억제제를 스크리닝 하는 방법에 관한 것이다.
IDO1과 IDO2는 종양 세포에서 서로 다른 기전에 의해 종양의 증식과 전이를 촉진시키는 것으로 알려져 있어, 본 발명에 의한 스크리닝 방법을 활용한다면 IDO1과 IDO2를 동시에 효과적으로 억제할 수 있는 억제제를 손쉽게 동정할 수 있을 것이다.

Description

인돌아민 2,3-디옥시게나제 억제제 스크리닝 방법{Indoleamine 2,3-dioxygenase inhibitor screening method}

본 발명은 인돌아민 2,3-디옥시게나제(indoleamine 2,3-dioxygenase)인 IDO1 및 IDO2를 모두 억제할 수 있는 억제제 스크리닝 방법에 관한 것이다.

진행성 암이 빠르게 증식할 수 있는 이유는 면역계의 공격을 회피할 수 있는 면역회피 능력 때문인데, 트립토판이 면역 회피 능력의 중요한 요소라는 것이 여러 논문을 통해 보고되고 있다. 즉, 트립토판 분해의 주요 산물인 키누레닌(kynurenine)은 침습적 암의 증식을 매개하는 수용체로 알려져 있는 아릴탄화수소 수용체(AHR)의 내인성 리간드로 알려져 있으며, 트립토판이 키누레닌(kynurenine)으로 분해되면 아릴탄화수소 수용체(AHR)와 결합하여 암으로 하여금 면역계의 장벽을 넘어 진행성 암으로 발전하게 하는 것이다.

암은 세포 내 유전자의 구조가 변형되거나 발현이 제대로 이루어지지 않아 발생하고, 이 때 면역세포와 암세포의 복잡한 상호작용은 초기 암세포의 생사를 결정하는 가장 중요한 요인이 된다. 즉, 면역세포는 암세포의 내부에 축적된 유전자 변형을 탐지하여 암세포를 공격함으로써 암세포의 증식과 전이를 방지할 수 있으나, 면역계의 공격을 회피할 수 있는 암세포는 침습성 강한 암이나 전이성 암으로 발전할 수 있다.

지금까지 밝혀진 바에 따르면, 암이 면역계의 공격을 회피하는데 이용되는 많은 경로들이 면역억제경로와 관련되어 있어, 이러한 경로를 약리학적 방법으로 무력화시킬 경우 면역계를 정상화하여 암세포의 증식과 전이를 억제할 수 있을 것이다.

특히 최근 과학자들의 주목을 받고 있는 암의 면역억제경로는 인돌아민 2,3-디옥시게나제(IDO)에 의해 트립토판이 분해되는 과정과 그 결과 키누레닌이 생성되는 과정이다. IDO는 트립토판을 분해하여 키누레닌을 생성시키는데, 이 과정에서 다양한 메커니즘을 통해 T 세포를 비롯한 면역세포들의 활성을 저해한다. IDO는 암세포 자체는 물론, 수지상 세포와 조절 B세포에도 분포되어 있으며, IDO는 이러한 부위에 작용하여 면역계가 암세포를 인식하고 공격하는 것을 방해한다. 이외에도 IDO는 만성 바이러스 감염과 알러지에도 관여하며, 다양한 자가면역질환과 염증질환에도 관여하는 것으로 알려져 있다.

인간 IDO는 IDO1 및 IDO2가 알려져 있다. 이 중 IDO1은 403개의 아미노산으로 이루어진 분자량 45kDa의 단백질로, 체내에 광범위하게 발현되어 있으나, 암, 만성 염증 질환, 알러지, 자가면역 질환 및 국소 면역 억제 질환과 관련하여 특히 과발현되는 것으로 알려져 있다. IDO1은 세포질에 존재하는 효소이며, 트립토판 대사에서 첫번째 속도 제한 과정을 촉매한다. IDO1에 의한 트립토판 대사는 감염 반응에서 항증식성(antiproliferation)에 관여하고, 키누레닌을 증가시켜 세포사멸(apoptosis)을 유도하며, 수지상 세포에서 조절 T 세포 증식과 생존에 영향을 주어 면역관용(immune tolerance)를 유도하고, 자궁 내 태아 거부반응을 방지하는 기능을 수행한다. 특히, IDO1이 종양과 종양 침윤 림프절에서 과발현되고, 종양 환자의 소변 및 혈액에서 트립토판 대사가 증가한다는 연구 결과에 근거할 때, IDO1은 암 발생과 밀접한 상관관계가 있는 것으로 유추할 수 있다.

한편, IDO2는 402개의 아미노산으로 이루어진 분자량 45kDa의 단백질로, IDO1과 구조적 유사성을 가지고 있고, 다양한 항원제시 세포에서 발현된다고 보고되고 있다. 따라서, 많은 과학자들은 IDO2도 일종의 면역 조절 단백질로 예상하고 있다. IDO2는 또한 트립토판 대사에도 관여하는데, 그 대사 경로는 IDO1과는 상이한 것으로 보고되고 있다. IDO2와 암과의 상관관계에 대한 연구는 아직 미흡한 상태이나, IDO2가 위암, 신장암, 췌장암에서 발현되는 것으로 알려져 있고, 항종양 분석법으로 분석해 본 결과, IDO2의 선택적 저해제인 D-1MT에 의할 때 IDO1의 선택적 저해제인 L-1MT보다 더 나은 항암 효과를 발휘한다는 보고가 있는바, IDO2도 암과 밀접한 상관관계를 가지고 있을 것으로 예상된다.

따라서, IDO1 및 IDO2는 모두 암을 비롯한 다양한 IDO 관련 질병을 치료하거나 예방하는데 있어서 중요한 타겟 분자가 될 수 있다. 본 발명은 상기와 같은 점에 착안하여 IDO1 및 IDO2가 모두 발현되는 재조합 벡터를 제조하고 이를 세포주에 도입함으로써 IDO1 및 IDO2를 모두 억제할 수 있는 억제제를 스크리닝 하는 방법을 제시하고자 한다.

1. Prendergast GC., Oncogene. 2008 Jun 26;27(28):3889-900. Epub 2008 Mar 3. Review 2. Ball HJ, Yuasa HJ, Austin CJ, Weiser S, Hunt NH., Int J Biochem Cell Biol. 2009 Mar;41(3):467-71. Epub 2008 Jan 11 3. Lob S, Konigsrainer A, Zieker D, Brucher BL, Rammensee HG, Opelz G, Terness P., Cancer Immunol Immunother. 2009 Jan;58(1):153-7. Epub 2008 Apr 17.

본 발명의 목적은 IDO1 및 IDO2를 모두 억제할 수 있는 억제제를 효과적으로 스크리닝하기 위한 재조합 벡터를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 IDO1 및 IDO2를 모두 억제할 수 있는 억제제를 효과적으로 스크리닝하기 위하여 본 발명에 따른 재조합 벡터가 형질전환된 형질전환체를 제공하는데 있다.

본 발명은 또 다른 목적은 본 발명에 따른 재조합 벡터가 형질전환된 형질전환체를 이용하여 종양 억제제를 스크리닝하는 방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2를 포함하는 인돌아민 2,3-디옥시게나제(indoleamine 2,3-dioxygenase, IDO) 억제제 스크리닝용 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 재조합 벡터는 상기 서열번호 1 및 서열번호 2 사이에 연결 펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오티드를 더 포함하여 구성되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 연결 펩타이드는 자기 절단 능력이 있는 펩타이드인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 연결 펩타이드는 서열번호 3인 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터가 세포주에 형질전환된 인돌아민 2,3-디옥시게나제(indoleamine 2,3-dioxygenase, IDO) 억제제 스크리닝용 형질전환체를 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 세포주는 HEK293 세포주인 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2가 과발현되는 형질전환체에 인돌아민 2,3-디옥시게나제(indoleamine 2,3-dioxygenase, IDO) 억제 후보물질을 첨가하는 단계; 및 인돌아민 2,3-디옥시게나제(indoleamine 2,3-dioxygenase, IDO) 억제 후보물질을 첨가한 경우와 인돌아민 2,3-디옥시게나제(indoleamine 2,3-dioxygenase, IDO) 억제 후보물질을 첨가하지 않은 경우의 종양 억제능을 비교하는 단계를 포함하여 구성되는 것을 특징으로 하는 인돌아민 2,3-디옥시게나제(indoleamine 2,3-dioxygenase, IDO) 억제제 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 종양 억제능의 비교는 키누레닌 분석법(kynurenine Assay)에 의하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 종양 억제능의 비교는 세포증식 분석법(Cell Proliferation Assay)에 의하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 종양 억제능은 IDO1 및 IDO2의 활성을 모두 저해함으로써 발휘되는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 인돌아민 2,3-디옥시게나제(indoleamine 2,3-dioxygenase, IDO) 억제제 스크리닝용 재조합 벡터는 IDO1 및 IDO2의 유전자를 모두 포함하고 있어 인돌아민 2,3-디옥시게나제(indoleamine 2,3-dioxygenase, IDO)를 효과적으로 억제할 수 있는 억제제 스크리닝에 활용할 수 있다.

특히, 상기 재조합 벡터를 형질전환한 형질전환체를 이용한다면, 인돌아민 2,3-디옥시게나제(indoleamine 2,3-dioxygenase, IDO)를 더욱 효과적으로 억제할 수 있을 것이다.

또한, 본 발명은 인돌아민 2,3-디옥시게나제(indoleamine 2,3-dioxygenase, IDO) 억제제 스크리닝 방법을 제공함으로써, 종양 억제능을 나타내는 종양 예방 또는 치료용 약물을 손쉽게 동정할 수 있을 것이다.

도 1은 hIDO1 및 hIDO2에 각각 FLAG 또는 HA를 태깅(tagging)한 단백질을 발현시키기 위한 DNA 구조를 표현한 다이아그램이다.
도 2는 PA2 펩타이드를 이용하여 각각 FLAG 또는 HA를 태깅(tagging)한 hIDO1 및 hIDO2 단백질을 발현시키기 위한 DNA 구조를 표현한 다이아그램이다.
도 3은 hIDO1 및 hIDO2 발현용 안정한 세포주(stable cell line)에서 hIDO1 및 hIDO2의 발현을 보여주는 웨스턴 블라팅이다.
도 4는 hIDO1과 hIDO2를 모두 발현할 수 있는 안정한 세포주(stable cell line)에서 hIDO1과 hIDO2의 발현을 보여주는 웨스턴 블라팅이다.
도 5는 hIDO1 및 hIDO2 발현용 안정한 세포주(stable cell line)에서 100uM의 L-Trp 또는 D-Trp을 처리한 경우 각각 트립토판 대사를 분석한 HPLC 결과이다.
도 6은 hIDO1 및 hIDO2 발현용 안정한 세포주(stable cell line)에서 각각의 트립토판 대사를 보여주는 HPLC 그래프이다.
도 7은 hIDO1 발현용 안정한 세포주 및 hIDO1과 hIDO2를 모두 발현할 수 있는 안정한 세포주(stable cell line)에서 L-1MT에 의한 트립토판 대사의 저해 효과를 보여주는 HPLC 그래프이다.
도 8은 hIDO1 및 hIDO2 발현용 안정한 세포주(stable cell line)에서 각각의 트립토판 대사를 보기 위한 키누레닌 분석법의 결과이다.
도 9는 hIDO1 발현용 안정한 세포주 및 hIDO1과 hIDO2를 모두 발현할 수 있는 안정한 세포주(stable cell line)에서 L-1MT에 의한 트립토판 대사의 저해 효과를 보여주는 키누레닌 분석법의 결과이다.
도 10은 hIDO 발현용 안정한 세포주(stable cell line)의 형태 변화를 보여주는 결과이다.
도 11은 hIDO 발현용 안정한 세포주(stable cell line)에서 트립토판 농도에 따른 절대적 세포수를 보여주는 그래프이다.
도 12는 hIDO 발현용 안정한 세포주(stable cell line)에서 WST 분석법을 통하여 세포 증식을 보여주는 그래프이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에서 "재조합 벡터"란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 벡터로써, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다.

본 발명에서 용어 "작동 가능하게 연결된다(operably linked)"는 것은 본 발명의 폴리뉴클레오티드가 발현 조절 서열과 결합되어 그의 기능 또는 발현이 상기 발현 조절 서열에 의해 영향을 받는 것을 말한다. 즉, 발현 조절서열의 조절 하에 폴리뉴클레오티드의 서열이 발현되어 원하는 폴리펩티드가 형성되도록 정확한 해독프레임을 유지시키는 것을 포함한다. 이와 같이 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드와 발현 조절 서열은 프로모터, 전사 종결부위, 선택 마커 및 복제 개시점(replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 벡터 내에 포함될 수 있다.

본 발명에서 용어 "프로모터"는 구조 유전자의 전사를 지시하는 뉴클레오티드 서열이다. 전형적으로, 프로모터는 구조 유전자의 전사 개시부위에 인접하는, 유전자의 5' 비-코딩 부위에 위치한다.

본 발명의 재조합 벡터는 hIDO1 및/또는 hIDO2 유전자가 프로모터와 작동 가능하게 연결되어 있는 것을 특징으로 한다. 또한, hIDO1과 hIDO2 유전자의 말단에 FLAG, HA, IRES3, EGFP 등을 발현할 수 있는 유전자 서열을 더 포함하여 구성될 수 있다. 또한, hIDO1 및 hIDO2의 유전자 사이에 P2A를 발현할 수 있는 유전자 서열을 더 포함하여 구성될 수 있다.

본 발명은 항암제, 항암치료 보조제로 사용될 수 있는 화합물 및 유전자가 hIDO1 및 hIDO2를 동시에 저해 또는 억제하는지 스크리닝 하는데 유용하게 사용될 수 있는 재조합 벡터 및 이를 안정적으로 발현하는 형질전환 세포주에 관한 것이다.

본 발명의 재조합 벡터는 5'에서 3' 방향으로 hIDO1 및 hIDO2 유전자; 및 상기 두 유전자 사이에 자기 절단 능력이 있는 P2A 유전자를 포함하고 이들의 발현이 하나의 프로모터에 의해 조절되도록 고안된다. 한편, hIDO1의 3' 말단에는 FLAG이 태깅되고, hIDO2 유전자의 3' 말단에는 HA가 태킹되며, 이들 유전자 하부에는 IRES 리보솜 결합 염기서열 및 형광 단백질 유전자가 함께 연결될 수 있다. 여기에서 상기 단백질이 발현된 세포의 형태와 세포질의 위치를 정확히 분석하기 위하여 형광 단백질을 사용한다. 형광단백질은 다른 단백질과 융합되어도 본래의 형광을 유지하는 경향이 매우 높아 목적단백질과 융합된 융합단백질 형태로 세포 내에서 발현되어 상기 목적단백질의 정량적 및 정성적 분석에 응용될 수 있다. 특히 이와 같이 발현된 융합단백질은 형광 단백질에 피융합된 단백질의 고유한 성질에 의해 세포 내 위치와 이동성이 결정되기 때문에, 상기 hIDO1 및 hIDO2 단백질의 세포 내 위치와 관련한 연구에도 유용하게 활용할 수 있을 것이다. 본 발명에서 형광단백질은 에쿠오레아 빅토리아(Aequorea Victoria)라는 발광 해파리에서 유래된 녹색형광단백질(green fluorescence protein, GFP), 이를 유전공학적으로 돌연변이시켜 다른 여기 및 방출파장을 갖도록 조작된 청색(CFP), 황색(YFP), 적색(DsRed) 형광단백질 등이 사용될 수 있다.

본 발명은 상기와 같은 특징을 갖는 재조합 단백질 발현벡터를 이용하여 hIDO 단백질 활성에 관여하는 물질을 검색하기 위한 바이오 센서로서 상기 발현벡터가 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 안정적으로 재조합 hIDO 단백질을 발현하는 형질전환 세포주를 제공한다. 본 발명의 재조합 벡터를 숙주세포로 도입하는 방법으로는 일렉트로포레이션법, 프로토플라스트법, 알칼리금속법, 인산칼슘침전법, DEAE덱스트란법, 마이크로 인젝션법, 바이러스 입자를 이용한 방법, 리포좀 매개 형질감염법, 형질도입, 세포융합법, 폴리브렌 매개된 형질감염, 유전자 건을 활용할 수 있으며, 이 외에도 세포내로 DNA를 유입시키기 위한 다른 공지의 방법에 의해 세포 내로 도입할 수 있다. 상기 재조합 벡터는 상기와 같은 형질전환 방법에 의해 숙주세포, 바람직하게는 동물세포, 더욱 바람직하게는 HEK 293 세포, 293T 세포, HeLa 세포, BHK 세포, CHO 세포, COS 세포, Namalwa 세포 등 재조합 벡터가 발현될 수 있는 적당한 암세포를 사용할 수 있다.

본 발명의 재조합 벡터 및 이를 안정적으로 발현하는 형질전환체는 hIDO 억제하는 화합물 및 유전자의 스크리닝, 항암 치료시 항암제 등을 스크리닝 하는 목적으로 사용할 수 있다. 또한, 상기 형질전환 세포주는 현재 임상에서 치료 목적으로 사용되고 있는 화학 항암제의 효능을 평가하는데도 적용할 수 있다. 더욱이 본 발명의 재조합 벡터는 형질전환 세포주, 재조합 아데노 바이러스, 형질전환 동물 등에 도입되어 바이오 센서로서 유용하게 사용될 수 있다. 여기에서 형질전환 동물은 hIDO의 이동성 및 안정화를 관찰할 수 있는 실험 질환 모델 동물로 사용될 수 있을 것이다. 따라서 본 발명의 재조합 벡터 및 이를 안정적으로 발현하는 형질전환 세포주를 이용한 본 발명의 스크리닝 시스템의 hIDO 단백질(hIDO1 및 hIDO2)의 활성에 동시에 관여하는 물질을 검색하기 위한 바이오 센서로서 상기 단백질 모두와 상호작용하는 효과적인 항암제 및 항암 보조제 개발에 유용한 도구가 될 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

<실시예 1>

hIDO1 와 hIDO2 유전자 확보 및 재조합 발현 벡터 구축

인간의 수지상 세포에서 전체 RNA를 분리한 후, 분자생물학적 기법을 이용하여 인간의 cDNA를 합성하였다. 이후, hIDO1 및 hIDO2의 유전자를 증폭하기 위한 프라이머를 설계하였다.

hIDO1을 발현벡터인 IRES3-eGFP-EF6A(한양대학교 박창환 교수님 실험실 제공)로 삽입하기 위하여 프라이머 hIDO1-F와 프라이머 hIDO1-R를 설계하였으며, 3’말단에는 FLAG 염기서열을 추가로 삽입하였다(서열번호 4 참조). 각 프라이머는 올리고 핵산을 주문합성하여 사용하였다. PCR 산물을 pGemT-easy 벡터(Promega)에 삽입한 후 pGemT에 있는 EcoRI 제한효소 부위를 이용하여 발현벡터 IRES3-eGFP-EF6A에 삽입하였다.

또한, hIDO2도 상기한 hIDO1 재조합 벡터를 제작한 방식과 동일하게 제조하였다. 이 경우 프라이머는 hIDO2-F 및 hIDO2-R를 사용하였고, hIDO2의 3‘말단에는 HA 발현용 염기서열을 추가로 삽입하였다(서열번호 5 참조).

본 실시예에서 사용한 프라이머 서열은 하기와 같으며, 프라이머는 마크로젠(한국)에 의뢰하여 제작하였다.

hIDO1-F:5‘- ATGGCACACGCTATGGAAAACTC-3’

hIDO1-R:5‘- CTATCTAGATTTGTCATCGTCATCCTTGTAGTCTCCTCCACCTTCCTTCAAAAGGGATTT-3’

hIDO2-F:5‘- ACTAGTATGTTGCATTTTCATTATTATGATACTTCAAACAAAATAATGGAGCCC-3’

hIDO2-R:5‘- CTAAGCGTAATCTGGAACATCGTATCCTCCCAGTGGGTGAAGGATTGACT-3’

한편, hIDO1과 hIDO2를 동시 발현시키기 위한 재조합 벡터는 P2A 펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오티드(서열번호 6)를 이용하여, hIDO1에는 Xba1 제한효소 자리를 이용하여 P2A 앞쪽에 위치 하도록 제조하였으며, hIDO2에는 SpeI 제한효소 자리를 이용하여 P2A 뒤쪽에 위치 하도록 제조하였다. 이렇게 만들어진 hIDO1-FLAG-P2A-hIDO2-HA는 발현벡터인 IRES3-eGFP-EF6A벡터에 EcoRI 제한효소 자리를 이용하여 삽입하였다.

상기와 같은 방법으로 제작된 각각의 재조합 벡터는 염기서열 결정법(DNA sequencing)으로 최종 확인하였다.

<실시예 2>

hIDO 재조합 벡터의 HEK 293 세포주로의 형질전환

HEK 293 세포는 다양한 기능성 발현 분석법에서 이용되고 높은 수준의 재조합 단백질을 생산하는 것으로 보고된 바, 본 발명자들은 단백질 발현용 인간 세포주로 HEK 293 세포를 사용하였다.

1×10⁶의 HEK 293 세포를 6 웰 플레이트에 분주하고 다음날, calcium phosphate (Ca₂PO₄)을 이용하여 제조자 방식에 따라 상기한 재조합 벡터로 형질전환하였다.

상기 재조합 벡터가 HEK 293 세포의 게놈 DNA로 삽입되어 안정하게 발현되는 세포주를 선별하기 위하여 blasticidin S HCl(invitrogen) 20ug/ml을 처리하고 생존하는 세포를 선별하여 96 웰 플레이트로 이전하였다. blasticidin S HCl(invitrogen) 20ug/ml를 처리하여 생존하는 세포를 반복하여 96 웰 플레이트로 이전시키며 hIDO1 및 hIDO2를 과발현시키는 형질전환체를 선별하였다.

< 실시예 3>

hIDO 발현 확인: 웨스턴 블라팅

본 발명자들은 상기 기재된 방법으로 만들어진 hIDO1 및 hIDO2를 과발현시킬 수 있는 HEK 293 안정한 세포주에서 hIDO1 및 hIDO2의 발현 여부를 실제로 확인하기 위하여 웨스턴 블라팅을 실시하였다.

hIDO를 발현하는 HEK 293 안정한 세포주를 포획하고 PBS로 3번 세척한 후, 원심분리하여 세포만을 수집하였다. 프로테아제 저해제(Sigma)를 포함하는 RIPA buffer(150mM NaCl, 50mM Tris-HCl(pH7.4), 1% NP-40, 0.1% sodium deoxycholate, 1mM EDTA)를 이용하여 상기 세포를 용해시키고, 단백질을 5X 환원용 샘플 버퍼로 분리한 후 SDS-PAGE로 전기영동하고 PVDF 멤브레인으로 단백질을 이동시켰다. PVDF 멤브레인을 블라킹 용액(5% 스킴 밀크)을 이용하여 상온에서 1시간 동안 블라킹 한 후, 마우스 anti-FLAG 단일항체(1:2000, Sigma) 또는 마우스 anti-HA(1:1000, abm) 단일항체와 상온에서 2시간 반응시켰다. 상기 PVDF 멤브레인을 TBST로 10분간 3번 세척한 후, anti-mouse HRP conjugated (1:4000, Sigma) 이차 항체로 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 한편, 로딩 컨트롤로는 베타-액틴을 사용하였는데, 상기 사용한 PVDF 멤브레인을 스트리핑 솔루션을 이용하여 60℃에서 2번 반복하여 반응시킨 후 블라킹 용액(5% 스킴 밀크)을 이용하여 상온에서 1시간 동안 블라킹 한 후, anti-actin 단일항체(1:40000, Sigma)를 이용하여 상온에서 1시간 반응시키고, TBST세척 후 anti-mouse HRP conjugated(1:4000, Sigma) 이차 항체로 상온에서 1시간 동안 반응시켰다.

그 결과, 도 3 및 도 4에서와 같은 밴드를 확인할 수 있었는데, 즉, hIDO1 발현 안정한 세포주에서는 FLAG 항체에 의해, hIDO2 발현 안정한 세포주에서는 HA 항체에 의해 hIDO1 및 hIDO2의 발현을 확인할 수 있었다 한편, hIDO1 및 hIDO2를 모두 발현할 수 있는 안정한 세포주(P2A)에서는 FLAG 항체 및 HA 항체 모두에 의해서 밴드를 확인할 수 있었다.

<실시예 4>

<4-1> HPLC에 의한 IDO 효소 활성 측정

본 발명자들은 HPLC 분석법을 통하여 트립토판 및 키누레닌 농도를 측정함으로써 IDO 발현 벡터로 형질전환된 HEK 293 세포에서의 IDO 효소 활성을 확인해보고자 하였다.

이를 위하여 본 발명자들은 hIDO 발현용 HEK 293 안정한 세포주를 96 웰 플레이트의 각 웰에 2×10⁵ 씩 분주하여 100μM의 L-Trp 또는 D-Trp을 포함하는 완전배지 상태에서 배양하였다. 24시간 배양 후, 상층액을 포집하여 아세토니트릴(acetonitrile)을 이용하여 농축시키고, 농축된 샘플 20㎕를 5분간 주입한 후, 5% ACN in H₂O(0.1% TFA)에서 15% ACN in H₂O(0.1% TFA)로의 농도 구배로 15분간, 15% ACN in H₂O(0.1% TFA)에서 95% ACN in H₂O(0.1% TFA)로의 농도 구배로 7분간 0.8㎖/min의 유속으로 분석을 진행하였다. 결과 분석은 UV 흡광도 280 및 360 nm에서 측정하였다.

도 5은 HPLC 분석에 따른 트립토판과 키누레닌 피크를 보여주고, 도 6는 그 결과를 그래프로 표현한 것이다. IDO1을 발현시킨 세포주에서 특히 트립토판의 피크가 현저히 감소하고, 키누레닌의 피크가 현저히 증가한 것을 확인할 수 있다. 한편, 이를 그래프로 표현한 것이 도 6인데, 도 6에서도 IDO1을 발현시킨 세포주에서 현저하게 L-Trp 및 D-Trp이 감소하고, 키누레닌이 증가하는 것을 확인할 수 있다.

<4-2> HPLC에 의한 L-1MT의 IDO 효소 활성 저해 측정

IDO1이 L-Trp을 효과적으로 분해하여 키누레닌을 생성한다는 상기 실험결과를 통하여 본 발명자들은 IDO1의 저해제인 L-1MT를 이용하여 트립토판 대사가 저해되는지 HPLC를 통해 확인하고자 하였다. 특히, 이 경우 IDO1 및 IDO2가 동시 발현되는 경우 트립토판 대사 저해활성을 동시에 비교하였다.

HPLC는 상기 기술한 방법과 동일한 방법으로 진행하였으며, 세포를 배양하는 단계에서 100μM의 L-Trp과 함께 100μM의 L-1MT를 포함하는 완전배지 상태에서 배양하였다.

그 결과, 도 7에서 볼 수 있는 바와 같이 IDO1을 단독으로 발현시킨 경우 트립토판이 키누레닌으로 효과적으로 분해되는 것을 확인할 수 있었고, IDO1의 저해제인 L-1MT를 함께 처리하였을 때에는 분해 효과가 상당부분 감소되는 것을 확인하였다. 한편, IDO1 및 IDO2를 함께 발현시킨 경우(P2A), 트립토판이 키누레닌으로 분해되는 효과는 있었으나 그 정도는 IDO1을 단독 발현시킨 경우에 비하여 다소 낮은 것으로 확인되었고, IDO1의 저해제인 L-1MT를 함께 처리한 경우 트립토판 분해 효과가 상당부분 감소되는 것을 확인하였다.

<실시예 5>

<5-1> 키누레닌 분석법에 의한 IDO 효소 활성 측정

본 발명자들은 키누레닌 분석법(kynurenine assay)을 통하여 IDO 효소 활성에 따른 트립토판 대사활성을 측정해 보고자 하였다. 즉, IDO에 의해 트립토판이 분해되어 생성되는 키누레닌의 농도를 정량화하여 검출함으로써 IDO의 효소 활성을 측정하였다.

이를 위해 본 발명자들은 hIDO 발현용 HEK 293 안정한 세포주를 96 웰 플레이트의 각 웰에 2×10⁵ 씩 분주하여 100μM의 L-Trp 또는 D-Trp을 포함하는 완전배지 상태에서 배양하였다. 24시간 배양 후, 상층액 160㎕와 30% TCA 10㎕를 새로운 96 웰 플레이트에서 혼합한 후, 플라스틱 랩으로 감싸 50℃에서 30분간 반응하도록 하였다. 이 단계에서, N-포밀키누레닌이 키누레닌으로 가수분해 되는 것으로, 이 후 원심분리기를 이용하여 3000×g에서 10분간 원심분리하고, 상층액 100㎕를 ELISA 분석용 플레이트로 옮겨 2% Ehrlich's reagent(2% p-dimethylaminobenzaldehyde w/v in glacial acetic acid) 100㎕와 상온에서 10분과 반응시켰다. ELISA reader를 이용하여 492nm에서 흡광도를 측정하고 데이터는 Excel 소프트웨어를 이용하여 분석하였고, 키누레닌 표준곡선을 이용하여 정상화하였다. 데이터는 3번 이상 반복한 실험 데이터를 평균하여 도시하였다.

그 결과, 도 8에서 볼 수 있듯이, IDO1에서만 특이적으로 L-Trp을 분해하여 약 30μM 이상의 키누레닌을 생성하는 것으로 나타났다. 한편, IDO1은 D-Trp을 분해하여 키누레닌을 생성하는 것으로 나타났으나, 그 양은 L-Trp을 분해하는 것에 비하여 현저히 낮은 것으로 확인되었다. 이에 비하여 IDO2는 트립토판을 분해하여 키누레닌을 생성하지 않는 것으로 확인되었다.

<5-2> 키누레닌 분석법에 의한 L-1 MT 의 IDO 효소 활성 저해 측정

IDO1이 L-Trp을 효과적으로 분해하여 키누레닌을 생성한다는 상기 실험결과를 통하여 본 발명자들은 IDO1의 저해제인 L-1MT를 이용하여 트립토판 대사가 저해되는지 확인하고자 하였다. 특히, 이 경우 IDO1 및 IDO2가 동시 발현되는 경우 트립토판 대사 저해활성을 동시에 비교하였다.

키누레닌 분석법은 상기 기술한 방법과 동일한 방법으로 진행하였으며, 세포를 배양하는 단계에서 100μM의 L-Trp과 함께 각각 0, 100, 500 μM의 L-1MT를 포함하는 완전배지 상태에서 배양하였다.

그 결과, 도 9에서 볼 수 있는바와 같이 L-1MT를 처리하지 않은 경우 IDO1은 트립토판을 효과적으로 분해하여 키누레닌을 생성하였고, IDO1 및 IDO2를 함께 발현한 경우(P2A)에는 IDO1에 비해 낮은 수치이지만 트립토판 분해 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 한편, IDO1을 단독으로 발현하는 경우 및 IDO1과 IDO2를 함께 발현하는 경우(P2A)에서 모두 L-1MT의 농도 의존적으로 트립토판 분해 활성이 저해되는 것을 확인할 수 있었다.

<실시예 6>

IDO 발현 세포주에서의 세포 증식 측정

본 발명자들은 IDO가 트립토판을 분해함으로써 세포 내 트립토판이 고갈되었을 때 세포 증식에 미치는 영향을 확인해 보고자 하였다.

이를 확인하기 위하여 본 발명자들은 96 웰 플레이트에 4.0×10⁴의 세포를 분주하였다. hIDO를 안정적으로 발현하는 HEK 293 세포주에서 트립토판(0, 25, 50, 100μM)을 처리하고, 각 1일, 2일, 3일째 WST-1(itsbio, Korea)를 첨가하고 37℃, 5% CO₂ 조건의 습식 배양기에서 1시간 동안 배양하였다. 각 웰의 흡광도는 450nm에서 ELISA reader를 이용하여 측정하였다. 실험은 3회에 걸쳐 수행되었고, 그래프는 그 평균값을 나타낸 것이다.

도 12에서 볼 수 있듯이, IDO1을 발현시키는 세포주에서는 대조군에 비하여 트립토판이 고갈되면서 세포 증식력이 현저히 감소하였으나 IDO2를 발현시키는 세포주는 대조군과 세포 증식력에서 큰 차이를 나타내지 않는 것으로 확인되었다. 한편, IDO1 및 IDO2를 함께 발현시키는 세포주(P2A)는 대조군에 비하여 세포 증식력이 상당 정도 감소하는 것을 확인할 수 있었다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

<110> CATHOLIC UNIVERSITY INDUSTRY ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Indoleamine 2,3-dioxygenase inhibitor screening method <130> PN1210-487 <160> 6 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1212 <212> DNA <213> IDO1 DNA sequence from homo sapiens <400> 1 atggcacacg ctatggaaaa ctcctggaca atcagtaaag agtaccatat tgatgaagaa 60 gtgggctttg ctctgccaaa tccacaggaa aatctacctg atttttataa tgactggatg 120 ttcattgcta aacatctgcc tgatctcata gagtctggcc agcttcgaga aagagttgag 180 aagttaaaca tgctcagcat tgatcatctc acagaccaca agtcacagcg ccttgcacgt 240 ctagttctgg gatgcatcac catggcatat gtgtggggca aaggtcatgg agatgtccgt 300 aaggtcttgc caagaaatat tgctgttcct tactgccaac tctccaagaa actggaactg 360 cctcctattt tggtttatgc agactgtgtc ttggcaaact ggaagaaaaa ggatcctaat 420 aagcccctga cttatgagaa catggacgtt ttgttctcat ttcgtgatgg agactgcagt 480 aaaggattct tcctggtctc tctattggtg gaaatagcag ctgcttctgc aatcaaagta 540 attcctactg tattcaaggc aatgcaaatg caagaacggg acactttgct aaaggcgctg 600 ttggaaatag cttcttgctt ggagaaagcc cttcaagtgt ttcaccaaat ccacgatcat 660 gtgaacccaa aagcattttt cagtgttctt cgcatatatt tgtctggctg gaaaggcaac 720 ccccagctat cagacggtct ggtgtatgaa gggttctggg aagacccaaa ggagtttgca 780 gggggcagtg caggccaaag cagcgtcttt cagtgctttg acgtcctgct gggcatccag 840 cagactgctg gtggaggaca tgctgctcag ttcctccagg acatgagaag atatatgcca 900 ccagctcaca ggaacttcct gtgctcatta gagtcaaatc cctcagtccg tgagtttgtc 960 ctttcaaaag gtgatgctgg cctgcgggaa gcttatgacg cctgtgtgaa agctctggtc 1020 tccctgagga gctaccatct gcaaatcgtg actaagtaca tcctgattcc tgcaagccag 1080 cagccaaagg agaataagac ctctgaagac ccttcaaaac tggaagccaa aggaactgga 1140 ggcactgatt taatgaattt cctgaagact gtaagaagta caactgagaa atcccttttg 1200 aaggaaggtt aa 1212 <210> 2 <211> 1263 <212> DNA <213> IDO2 DNA sequence from homo sapiens <400> 2 atgttgcatt ttcattatta tgatacttca aacaaaataa tggagcccca cagaccgaat 60 gtgaagacag cagtgccatt gtctttggaa agctatcaca tatctgaaga gtatggcttt 120 cttcttccag attctctgaa agaacttcca gatcattata ggccttggat ggaaattgcc 180 aacaaacttc ctcaattgat tgatgctcac cagcttcaag ctcatgtgga caagatgccc 240 ctgctgagct gccagttcct gaagggtcac cgggagcagc gcctggccca cctggtcctg 300 agcttcctca ccatgggtta tgtctggcag gaaggagagg cgcagcctgc agaggtcctg 360 ccaaggaatc ttgcccttcc atttgtcgaa gtctccagga acttggggct ccctcctatc 420 ctggtccact cagacttggt gctgacgaac tggaccaaaa aagatccaga cggattcctg 480 gaaattggga acctggagac catcatctca tttcctgggg gagagagcct gcatggtttt 540 atactggtga ctgctttggt agagaaagaa gcagtgcctg ggataaaggc tcttgttcag 600 gccacgaatg ctatcttgca gcccaaccag gaggccctgc tccaagccct gcagcgactg 660 agactgtcta ttcaggacat caccaaaacc ttaggacaga tgcatgatta tgtagatcca 720 gacatatttt atgcaggcat ccggatcttt ctctctggat ggaaagacaa cccagcaatg 780 cctgcagggc tgatgtatga aggagtttcc caagagcccc tgaaatactc cggcgggagt 840 gcagctcaga gcacagtgct tcatgccttt gatgagttct taggcattcg tcatagcaag 900 gaaagtggtg actttctgta cagaatgagg gattacatgc ctccttccca taaggccttc 960 atagaagaca tccactcagc accttccctg agggactaca tcctgtcatc tggacaggac 1020 cacttgctga cagcttataa ccagtgtgtg caggccctgg cagagctgcg gagctatcac 1080 atcaccatgg tcaccaaata cctcatcaca gctgcagcca aggcaaagca tgggaagcca 1140 aaccatctcc cagggcctcc tcaggcttta aaagacaggg gcacaggtgg aaccgcagtt 1200 atgagctttc ttaagagtgt cagggataag accttggagt caatccttca cccacgtggt 1260 tag 1263 <210> 3 <211> 22 <212> PRT <213> P2A amino acid sequence from porcine teschovirus <400> 3 Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val 1 5 10 15 Glu Glu Asn Pro Gly Pro 20 <210> 4 <211> 1248 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FLAG tagged IDO1 DNA sequence <400> 4 atggcacacg ctatggaaaa ctcctggaca atcagtaaag agtaccatat tgatgaagaa 60 gtgggctttg ctctgccaaa tccacaggaa aatctacctg atttttataa tgactggatg 120 ttcattgcta aacatctgcc tgatctcata gagtctggcc agcttcgaga aagagttgag 180 aagttaaaca tgctcagcat tgatcatctc acagaccaca agtcacagcg ccttgcacgt 240 ctagttctgg gatgcatcac catggcatat gtgtggggca aaggtcatgg agatgtccgt 300 aaggtcttgc caagaaatat tgctgttcct tactgccaac tctccaagaa actggaactg 360 cctcctattt tggtttatgc agactgtgtc ttggcaaact ggaagaaaaa ggatcctaat 420 aagcccctga cttatgagaa catggacgtt ttgttctcat ttcgtgatgg agactgcagt 480 aaaggattct tcctggtctc tctattggtg gaaatagcag ctgcttctgc aatcaaagta 540 attcctactg tattcaaggc aatgcaaatg caagaacggg acactttgct aaaggcgctg 600 ttggaaatag cttcttgctt ggagaaagcc cttcaagtgt ttcaccaaat ccacgatcat 660 gtgaacccaa aagcattttt cagtgttctt cgcatatatt tgtctggctg gaaaggcaac 720 ccccagctat cagacggtct ggtgtatgaa gggttctggg aagacccaaa ggagtttgca 780 gggggcagtg caggccaaag cagcgtcttt cagtgctttg acgtcctgct gggcatccag 840 cagactgctg gtggaggaca tgctgctcag ttcctccagg acatgagaag atatatgcca 900 ccagctcaca ggaacttcct gtgctcatta gagtcaaatc cctcagtccg tgagtttgtc 960 ctttcaaaag gtgatgctgg cctgcgggaa gcttatgacg cctgtgtgaa agctctggtc 1020 tccctgagga gctaccatct gcaaatcgtg actaagtaca tcctgattcc tgcaagccag 1080 cagccaaagg agaataagac ctctgaagac ccttcaaaac tggaagccaa aggaactgga 1140 ggcactgatt taatgaattt cctgaagact gtaagaagta caactgagaa atcccttttg 1200 aaggaaggtg gaggagacta caaggatgac gatgacaaat ctagatag 1248 <210> 5 <211> 1296 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HA tagged IDO2 DNA sequence <400> 5 atgttgcatt ttcattatta tgatacttca aacaaaataa tggagcccca cagaccgaat 60 gtgaagacag cagtgccatt gtctttggaa agctatcaca tatctgaaga gtatggcttt 120 cttcttccag attctctgaa agaacttcca gatcattata ggccttggat ggaaattgcc 180 aacaaacttc ctcaattgat tgatgctcac cagcttcaag ctcatgtgga caagatgccc 240 ctgctgagct gccagttcct gaagggtcac cgggagcagc gcctggccca cctggtcctg 300 agcttcctca ccatgggtta tgtctggcag gaaggagagg cgcagcctgc agaggtcctg 360 ccaaggaatc ttgcccttcc atttgtcgaa gtctccagga acttggggct ccctcctatc 420 ctggtccact cagacttggt gctgacgaac tggaccaaaa aagatccaga cggattcctg 480 gaaattggga acctggagac catcatctca tttcctgggg gagagagcct gcatggtttt 540 atactggtga ctgctttggt agagaaagaa gcagtgcctg ggataaaggc tcttgttcag 600 gccacgaatg ctatcttgca gcccaaccag gaggccctgc tccaagccct gcagcgactg 660 agactgtcta ttcaggacat caccaaaacc ttaggacaga tgcatgatta tgtagatcca 720 gacatatttt atgcaggcat ccggatcttt ctctctggat ggaaagacaa cccagcaatg 780 cctgcagggc tgatgtatga aggagtttcc caagagcccc tgaaatactc cggcgggagt 840 gcagctcaga gcacagtgct tcatgccttt gatgagttct taggcattcg tcatagcaag 900 gaaagtggtg actttctgta cagaatgagg gattacatgc ctccttccca taaggccttc 960 atagaagaca tccactcagc accttccctg agggactaca tcctgtcctc tggacaggac 1020 cacttgctga cagcttataa ccagtgtgtg caggccctgg cagagctgcg gagctatcac 1080 atcaccatgg tcaccaaata cctcatcaca gctgcagcca aggcaaagca tgggaagcca 1140 aaccatctcc cagggcctcc tcaggcttta aaagacaggg gcacaggcgg aaccgcagtt 1200 atgagctttc ttaagagtgt cagggataag accttggagt caatccttca cccacgtggt 1260 ggaggatacc catacgatgt tccagattac gcttag 1296 <210> 6 <211> 66 <212> DNA <213> P2A DNA sequence from porcine teschovirus <400> 6 ggaagcggag ctactaactt cagcctgctg aagcaggctg gagacgtgga ggagaaccct 60 ggacct 66

Claims

삭제
서열번호 1의 뉴클레오티드; 서열번호 2의 뉴클레오티드 및; 서열번호 1과 서열번호 2 사이에 위치한 서열번호 3의 연결 펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오티드를 포함하여 구성되는 인돌아민 2,3-디옥시게나제(indoleamine 2,3-dioxygenase, IDO) 억제제 스크리닝용 재조합 벡터.
제2항에 있어서,
상기 연결 펩타이드는 자기 절단 능력이 있는 펩타이드인 것을 특징으로 하는 인돌아민 2,3-디옥시게나제(indoleamine 2,3-dioxygenase, IDO) 억제제 스크리닝용 재조합 벡터.
삭제
제2항 또는 제3항의 재조합 벡터가 세포주에 형질전환된 인돌아민 2,3-디옥시게나제(indoleamine 2,3-dioxygenase, IDO) 억제제 스크리닝용 형질전환체.
제5항에 있어서,
상기 세포주는 HEK293 세포주인 것을 특징으로 하는 인돌아민 2,3-디옥시게나제(indoleamine 2,3-dioxygenase, IDO) 억제제 스크리닝용 형질전환체.
서열번호 1의 뉴클레오티드, 서열번호 2의 뉴클레오티드 및 서열번호 1과 서열번호 2 사이에 위치한 서열번호 3의 펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오티드로 구성되는 유전자가 과발현되는 형질전환체에 인돌아민 2,3-디옥시게나제(indoleamine 2,3-dioxygenase, IDO) 억제 후보물질을 첨가하는 단계; 및
인돌아민 2,3-디옥시게나제(indoleamine 2,3-dioxygenase, IDO) 억제 후보물질을 첨가한 경우와 인돌아민 2,3-디옥시게나제(indoleamine 2,3-dioxygenase, IDO) 억제 후보물질을 첨가하지 않은 군의 종양 억제능을 비교하는 단계를 포함하는, 인돌아민 2,3-디옥시게나제(indoleamine 2,3-dioxygenase, IDO) 억제제 스크리닝 방법.
제7항에 있어서,
상기 종양 억제능의 비교는 키누레닌 분석법(kynurenine Assay)으로 수행하는 것을 특징으로 하는 인돌아민 2,3-디옥시게나제(indoleamine 2,3-dioxygenase, IDO) 억제제 스크리닝 방법.
제7항에 있어서,
상기 종양 억제능의 비교는 세포증식 분석법(Cell Proliferation Assay)으로 수행하는 것을 특징으로 하는 인돌아민 2,3-디옥시게나제(indoleamine 2,3-dioxygenase, IDO) 억제제 스크리닝 방법.
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