CN108367068A

CN108367068A - 用于治疗白血病的抗-s100a8

Info

Publication number: CN108367068A
Application number: CN201680053104.6A
Authority: CN
Inventors: 菲利普·特斯耶尔; 马利卡·劳乌基; 弗雷德里克·巴拉贝; 纳塔莉·佩奇
Original assignee: Universite Laval
Current assignee: Universite Laval
Priority date: 2015-09-14
Filing date: 2016-09-13
Publication date: 2018-08-03
Anticipated expiration: 2036-09-13
Also published as: US20180256710A1; EA038980B1; CN108367068B; EP3349793B1; US10894082B2; HK1250649A1; CA2998410A1; EA201890739A1; WO2017045070A1; EP3349793A4; JP2018527410A; EP3349793A1; JP6750018B2

Abstract

本说明书涉及用于治疗白血病的抗‑S1008蛋白。更具体而言，本发明公开了用于治疗白血病的特异性结合一部分S100A8蛋白和/或S100A8/S100A9异源二聚体的抗‑S100A8抗体。

Description

用于治疗白血病的抗-S100A8

技术领域

本发明涉及用于治疗白血病的抗-S1008蛋白。

背景技术

急性白血病是由于干造血细胞或祖代造血细胞中发生的一系列遗传和表观遗传(epigenetic)事件所致，导致分化能力受损的祖细胞克隆扩增。过去20年来，在识别急性白血病中的复发性遗传病变方面取得了丰硕的成果。无白血病存活的改进主要是由于允许调整治疗强度并也容许同种异体造血干细胞移植的更好的风险分层(risk stratification)所致。然而，用于急性髓系治疗(AML)的药物现今基本上与25～30年前相同，预后仍然很差。AML患儿的5年生存率低至55％，而成年人(30％～40％)和老年人(>65岁)(<15％)患者5年生存率甚至更差。因此，需要探索新颖和创新的方法以改进急性白血病患者的无白血病存活率。

因此，对于提供用于治疗白血病的组合物或方法仍存需要。

发明内容

根据本发明，现在提供了用于治疗白血病的抗-S100A8。

在一个实施方式中，所述抗-S100A8是抗体。

在另一个实施方式中，所述抗-S100A8特异性结合于一部分S100A8蛋白(aportion of S100A8 protein，S100A8蛋白的一部分)。

在进一步的实施方式中，所述抗-S100A8特异性结合于S100A8/S100A8同源二聚体(homodimer)或S100A8/S100A9异源二聚体(heterodimer)。

在一个另外的实施方式中，所述S100A8蛋白是人S100A8。

在另一个实施方式中，所述人S100A8包含SEQ ID NO：1中所示的所述氨基酸序列。

在另一个实施方式中，所述抗-S100A8是单克隆或多克隆抗体。

在一个实施方式中，所述抗-S100A8是小鼠抗体，山羊抗体，人抗体或兔抗体。

在另一个实施方式中，所述抗-S100A8是人源化抗体。

在一个实施方式中，所述抗-S100A8抗体包含选自由Fv，F(ab')或F(ab')2组成的组中的表位结合片段。

在另一个实施方式中，所述抗-S100A8抗体包含由SEQ ID NO：3中列出的核苷酸序列编码的重链可变区。

在补充实施方式中，所述抗-S100A8抗体包含由SEQ ID NO：4构成的重链可变区。

在另一个实施方式中，所述抗-S100A8抗体包含由SEQ ID NO：5中所示的所述核苷酸序列编码的轻链可变区。

在另一个实施方式中，所述抗-S100A8抗体包含由SEQ ID NO：6构成的轻链可变区。

在另一个实施方式中，所述抗-S100A8配制用于注射。

在另一个实施方式中，所述抗-S100A8配制用于与化学治疗剂一起给药。

在一个实施方式中，所述化学治疗剂是柔红霉素(daunorubicin)，多柔比星(doxorubicin)和阿糖胞苷(cytarabine)中的至少一种。

在另一个实施方式中，所述抗-S100A8配制用于与化学治疗剂同时或分开给药。

在另一个实施方式中，所述抗-S100A8配制用于对受试者进行化疗治疗后给药。

本文还提供了包含如本文描述的所述抗-S100A8和载体(carrier)的组合物。

在一个实施方式中，本文描述的所述组合物用于治疗白血病。

在一个实施方式中，所述白血病是急性淋巴细胞性白血病(ALL)，急性髓性白血病(AML)，慢性淋巴细胞性白血病(CLL)，慢性髓性白血病(CML)和慢性骨髓单核细胞性白血病(CMML)。

在一个实施方式中，本文描述的所述组合物用于刺激细胞分化。

在一个实施方式中，本文描述的所述组合物用于抑制细胞增殖。

在一个实施方式中，本文描述的所述组合物用于治疗急性髓性白血病(AML)。

本发明还提供了治疗受试者中的白血病的方法，包括向所述受试者给药本文中描述的所述抗-S100A8或所述组合物的步骤。

本发明还提供了刺激受试者中细胞分化的方法，包括向受试者给药本文描述的所述抗-S100A8或所述组合物的步骤。

本发明还提供了用于抑制受试者中的细胞增殖的方法，包括向受试者给药本文描述的所述抗-S100A8或所述组合物的步骤。

本发明还提供了体外刺激细胞分化的方法，包括向所述受试者给药本文描述的所述抗-S100A8或所述组合物的步骤。

本发明进一步提供用于体外抑制细胞增殖的方法，包括将本文描述的所述抗-S100A8或所述组合物给药于所述受试者的步骤。

另外本发明提供了本文描述的所述抗-S100A8或所述组合物用于治疗受试者中的白血病的用途。

本发明还提供了本文中描述的所述抗-S100A8或所述组合物在制备用于治疗受试者的白血病的药物中的用途。

本发明还提供了本文描述的所述抗-S100A8或所述组合物用于刺激细胞分化的用途。

本发明还提供了本文描述的所述抗-S100A8或所述组合物用于抑制细胞增殖的用途。

在一个实施方式中，所述受试者是哺乳动物。

在另一个实施方式中，所述受试者是小鼠或人。

在一个实施方式中，本文描述的所述组合物进一步包含S100A9肽或其肽模拟物。

在另一个实施方式中，本文涵盖的所述抗-S100A8配制用于与S100A9肽一起给药。

在另一个实施方式中，所述S100A9肽是人S100A9蛋白。

在另一个实施方式中，其中所述肽包含SEQ ID NO：7中所示的所述氨基酸序列。

在另外的实施方式中，所述肽与SEQ ID NO：7具有至少60％，至少70％或至少80％，至少90％一致性或至少约95％一致性。

在另一个实施方式中，所述肽由SEQ ID NO：7所示的所述氨基酸序列构成。

附图说明

现在参考附图。

图1图示说明了原发性白血病小鼠血清中S100A8/A9的分泌，其中原发性白血病是通过注射转染有表达GFP以及所述基因HOXA9和MEIS1或融合基因MLL-ENL的逆转录病毒的小鼠造血干细胞/祖细胞而产生，所述S100A8/A9浓度通过ELISA在血清中测定(数据是3次独立测定结果的平均值±sem)。

图2图示说明了原发性白血病小鼠血清中分泌的S100A8、S100A9和S100A8/A9的水平，其中原发性白血病通过注射转染有表达GFP以及所述基因HOXA9和MEIS1的逆转录病毒的小鼠造血干细胞/祖细胞而产生，然后通过将来自白血病小鼠的100,000个骨髓细胞注射于对照小鼠中诱发继发性白血病，并通过ELISA在血清中测定所述S100A8/A9浓度(数据是3次独立测定结果的平均值±sem)。

图3图示说明了S100A8/A9的分泌与外周血中白血病细胞的存在之间的相关性，其中原发性白血病是通过注射转染有表达GFP以及所述基因HOXA9和MEIS1的逆转录病毒的小鼠造血干/祖细胞产生的，然后通过将来自白血病小鼠的100,000个骨髓细胞注射于天然小鼠(naive mice)中诱导继发性白血病，所述血液中白血病细胞的数量通过流式细胞术测定，所述S100A8/A9浓度通过ELISA在血清中测定(数据是3次独立测定结果的平均值±sem)。

图4图示说明了根据一个实施方式的抗-S100A8抗体延长注射HOXA9-MEIS1白血病的继发性小鼠的存活率，其中来自HOXA9-MEIS1原发性白血病小鼠的100,000个骨髓细胞与兔抗-S100A8pAbs或非特异性兔IgG(150μg/注射)、大鼠抗-S100A9mAb或同种型对照Ab(大鼠IgG1)或PBS(对照物)一起每周3次从第3天至第35天注射于亚致死性照射的继发性小鼠(每组6只小鼠)中。

图5图示说明了根据一个实施方式的抗-S100A8抗体降低了注射HOXA9-MEIS1白血病的继发性小鼠的体重减轻，其中来自HOXA9-MEIS1原发性白血病小鼠的100,000个骨髓细胞与兔抗-S100A8pAb或非特异性兔IgG(150μg/注射)一起每周3次从第3天到第35天注射于亚致命照射继发性小鼠(每组6只小鼠)中。

图6图示说明了根据一个实施方式的抗-S100A8抗体推迟了所述外周血中白血病细胞的出现，其中来自HOXA9-MEIS1原发性白血病小鼠的100,000个骨髓细胞与兔抗-S100A8pAb或非特异性兔IgG(150μg/注射)一起一周3次从第3天到第35天注射于亚致死剂量照射继发性小鼠(每组6只小鼠)中，所述白血病细胞数量通过流式细胞术测定。

图7图示说明了根据一个实施方式的抗-S100A8抗体增加了AML母细胞的分化，其中来自HOXA9-MEIS1原发性白血病小鼠的100,000个骨髓细胞与兔抗-S100A8pAb或非特异性兔IgG(150μg/注射)一起从第3天至第35天每周3次注射于亚致死剂量照射的继发性小鼠(每组6只小鼠)中，并且其中濒死小鼠被处死，收获外周血、脾脏和骨髓，并通过流式细胞术分析细胞的分化标志物(CD11b和Gr1)的表达(数据来自3只其他小鼠的一只鼠代表)。

图8图示说明了根据一个实施方式的抗-S100A8抗体抑制AML母细胞的增殖，其中来自HOXA9-MEIS1原发性白血病小鼠的100,000个骨髓细胞与兔抗-S100A8pAb或非特异性兔IgG(150μg/注射)一起从第3天至第35天每周3次注射于亚致死剂量照射的继发性小鼠(每组6只小鼠)中，其中濒死的小鼠被处死并收获骨髓，细胞周期通过碘化丙啶鎓染色进行分析(数据是3次实验的平均值)。

图9图示说明了抗-S100A8处理的小鼠中AML细胞的分化增加，其中来自HOXA9-MEIS1原发性白血病小鼠的100,000个骨髓细胞与兔抗-S100A8pAb或非特异性兔IgG(150μg/注射)一起从第3天至第35天每周3次注射于亚致死剂量照射的继发性小鼠(每组6只小鼠)中，其中濒死的小鼠被处死，收获外周血和骨髓，然后所述细胞用Wright-Giemsa染色从而揭示细胞形态(数据来自3只其他鼠的一个鼠代表)。

图10图示说明了根据一个实施方式的抗-S100A8抗体促进人白血病细胞的分化和生长停滞，其中表达所述融合基因MLL-AF9的人脐带血细胞用抗-S100A8mAb 1F8(20μg/mL)或同种型对照Ab刺激72小时，在(A)中显示了用抗-CD14标记的所述细胞，并通过流式细胞术检测；在(B)中显示了通过碘化丙啶鎓染色分析的细胞周期。

图11图示说明了根据一个实施方式与S100A9肽组合的抗-S100A8抗体延长了注射HOXA9-MEIS1白血病的继发性小鼠的存活，其中来自HOXA9-MEIS1原发性白血病小鼠的骨髓细胞与抗-S100A8、S100A9肽或其组合注射于亚致死剂量照射的继发性小鼠中。

具体实施方式

本发明提供了用于治疗或预防白血病的抗-S100A8。

因此，本文描述了抗-S100A8作为抗体用于治疗或预防白血病的用途。

本文涵盖的白血病可以是急性淋巴细胞性白血病(ALL)，急性髓性白血病(AML)，慢性淋巴细胞性白血病(CLL)，慢性髓性白血病(CML)和/或慢性骨髓单核细胞性白血病(CMML)。

根据S100蛋白家族的发现时间和发现它们所处的染色体组，S100蛋白家族包含22个成员的小(10～14kDa)酸性钙结合蛋白，命名为S100A1，S100A2等。这些细胞内蛋白参与蛋白磷酸化、酶活性、Ca2+稳态(homeostasis)和中间丝聚合(intermediate filamentpolymerisation)的控制。S100A8、S100A9和S100A12属于称为髓系相关蛋白(MRP)的子集，因为它们主要表达于嗜中性粒细胞(30％的细胞质蛋白)和单核细胞(源自髓性前体)。

S100A8和S100A9排列为非共价键合的同源二聚体。此外，在钙存在下，S100A8和S100A9会形成称为S100A8/A9或钙卫蛋白(calprotectin)的非共价异源二聚体，推测其会参与钙浓度的细胞控制。

S100A8和S100A9排列为非共价结合的同源二聚体。S100A8和S100A9在钙存在下也会形成称为S100A8/A9或钙卫蛋白的非共价异源二聚体，并推测这种异源二聚体会参与钙浓度的细胞控制。在所述细胞内部，钙卫蛋白结合脂质并至少部分通过将花生四烯酸转移至NADPH氧化酶，激活嗜中性粒细胞内的NADPH氧化酶。据推测，S100A8和S100A9会结合于RAGE，所述清道夫受体(scavenger receptor)(CD36)或所述Toll样受体4(TLR4)。

S100A8的人肽序列由以下构成：

MLTELEKALNSIIDVYHKYSLIKGNFHAVYRDDLKKLLETECPQYIRKKGADVWFKELDINTDGAVNFQEFLILVIKMGVAAHKKSHEESHKE(SEQ ID NO：1).

因此，本发明公开了人源化抗体和来自非人物种抗S100A8，特别是人S100A8的抗体，其蛋白序列能够进行修改从而增加它们与人类天然产生的抗体变体的相似性。当开发特异性抗体的方法涉及在非人免疫系统(例如，小鼠中的免疫系统)中产生时，人源化可能是必要的。当给药于人时，抗体人源化方法经过设计以产生具有最小免疫原性的分子，同时保留所述亲本非人抗体的特异性和亲和力。以这种方式产生的抗体的所述蛋白序列部分不同于人类天然存在的同源抗体，因此当给药于人类患者时具有潜在的免疫原性。

本文涵盖的人源化抗体能够经由富集技术，如噬菌体展示产生，或携带所述抗体人基因库(gene repertoire)的转基因小鼠的免疫已经提供了产生人抗体的有力手段。

更具体而言，本文描述的所述抗体会特异性结合于S100A8上的表位。

在具体的实施方式中，所述抗体包含选自Fv和/或F(ab＇)和/或F(ab＇)2的表位结合片段。具体而言，所述抗体包含表位结合单链抗体。

具体而言，本文包含的所述抗体包含由以下核苷酸序列编码的重链可变区：

GGATCCCAGGTTCAGCTGCAGCAGTCAGGGGCAGAGCTTGTGAAGCCAGGGGCCTCAGTCAAGTTGTCCTGCACAGCTTCTGGCTTCAACATTAAAGACACCTATTTGCACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGAGCAGGGCCTGGAGTGGGTTGGAAGGATTGATCCTGCGAATGGTGATACTAAATATGACCCGAAGTTCCAGGCCAAGGCCACTATAACAGCTGACACAACCTCCAACACAGCCTACGTGCACCTCAACAGCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTCTATTTCTGTACTGGGGGATGGCAGATGGGGGGCCGGTACTTCGATGTCTGGGGCGCAGGGACAACGGTCACCGTCTCCTCAGCCAAAACGACACCCCCATCTGTCTATGGTGGCGGTGGTTCT(SEQ ID NO：3)。

在具体的实施方式中，所述抗体包含由以下构成的重链可变区：

GSQVQLQQSGAELVKPGASVKLSCTASGFNIKDTYLHWVKQRPEQGLEWVGRIDPANGDTKYDPKFQAKATITADTTSNTAYVHLNSLTSEDTAVYFCTGGWQMGGRYFDVWGAGTTVTVSSAKTTPPSVYGGGGS(SEQ ID NO：4).

具体而言，本文涵盖的所述抗体包含由以下核苷酸序列编码的轻链可变区：

GATGTTGTGATGACCCAGTCTCCTGCTTCCTTAGCTGTATCTCTGGGGCAGAGGGCCACCATCTCATACAGGGCCAGCAAAAGTGTCAGTACATCTGGCTATAGTTATATGCACTGGAACCAACAGAAACCAGGACAGCCACCCAGACTCCTCATCTATCTTGTATCCAACCTAGAATCTGGGGTCCCTGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCAACATCCATCCTGTGGAGGAGGAGGATGCTGCAACCTATTACTGTCAGCACATTAGGGAGCTTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAA(SEQ ID NO：5).

在具体的实施方式中，所述抗体包含由以下构成的轻链可变区：

DVVMTQSPASLAVSLGQRATISYRASKSVSTSGYSYMHWNQQKPGQPPRLLIYLVSNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHIRELTRSEGGPSWK(SEQ ID NO：6).

本文描述的所述抗-S100Ab可以以与合适的生理或药学载体的掺混物一起使用。此类组合物包含治疗有效量的所述抗体，以及生理学上或药学上可接受的载体或赋形剂。这种载体包括，但不限于，盐水，缓冲盐水，葡萄糖(dextrose，右旋糖)，水，甘油，乙醇及其组合。所述制剂应该适合给药模式。

本文定义的充当S100A8蛋白的抑制剂或拮抗剂的抗体能够单独给药或与针对其它互补靶标的其他抗体，包括但不限于，其他S100多核苷酸或多肽一起组合给药。

本文涵盖的所述抗体可以有利地与其他单克隆或嵌合抗体，与细胞因子或与S100蛋白组合使用。所述抗体可以单独给药或与其他类型的治疗组合给药。例如，本文描述的所述抗体可以与，例如，化疗剂，如柔红霉素(盐酸正定霉素(Cerubidine))，多柔比星(阿霉素(adriamycin))和阿糖胞苷组合、同时或分开给药。一般而言，优选给药与患者的物种相同物种的物质源或物种反应性(在抗体的情况下)的产物。因此，在一个优选的实施方式中，将人抗体、片段、衍生物或类似物给药于人或动物患者用于治疗或预防。

优选利用高亲和力和/或效力体内抑制和/或中和针对本文涵盖的S100多肽或多核苷酸的抗体，其片段或区域，用于治疗与S100多核苷酸或多肽(包括其片段)相关的病症。此类抗体、片段或区域将优选具有对本文涵盖的S100多肽的亲和力。

具体而言，本发明提供了用于治疗白血病的方法，包括向需要其的受试者给药有效量的如本文中定义的所述抗体或如本文中定义的所述组合物的步骤。

癌症基因组图谱研究网络(The Cancer Genome Atlas(TCGA)Research Network)对200个成人AML病例实施了全基因组/全外显子组(exome)测序以及RNA，microRNA和DNA-甲基化分析。S100A8和S100A9是主要由髓性单核细胞和单核细胞AML组成的具有高RPKM水平的一个重要亚组的前5个区别基因(discriminatory gene)(Cancer Genome AtlasResearch，N.，2013，The New England journal of medicine，368：2059-2074)。在急性和慢性髓性白血病患者的血清中发现了高浓度的S100A8和S100A9蛋白(Ivanov et al.,1996,Immunology letters,49:7-13)，并且这些浓度与这些血清中的生长刺激活性相关。此外，S100A8已被识别为新生(de novo)AML患者存活期不佳的预测因子(Nicolas et al.,2011,Leukemia:official journal of the Leukemia Society of America,LeukemiaResearch Fund,U.K,25:57-65)。S100A8/A9的组成型过表达也与MLL重排B-ALL中的泼尼松(prednisone)治疗的抗性相关，并且MLL重排B-ALL细胞中的S100A8/A9的强制表达在体外将泼尼松敏感转变为泼尼松不敏感细胞(Spijkers-Hagelstein et al.,2012,Leukemia:official journal of the Leukemia Society of America,Leukemia Research Fund,U.K,26:1255-1265)。

为了解决S100A8和S100A9蛋白可能参与AML，则其表达使用由在移植到致死剂量照射受体中的造血祖细胞和干细胞(HPSC)中Hoxa9和所述辅因子Meis1的过表达或致癌基因MLL-ENL的表达诱导的两种充分表征的骨髓性白血病模型进行测定。正如在AML患者中那样，观察到了表达Hoxa9和Meis1(H9M)和MLL-ENL(分别为5.0μg/mL±1.0pg/mL和3.8μg/mL±0.5μg/mL)的原发性受体小鼠的血浆中S100A8/A9浓度相比于对照小鼠(0.5μg/mL±0.08pg/mL)的显著增加(参见图1)。H9M继发性受体血浆中的S100A8/A9水平也增加约10倍。虽然所述异源二聚体形式占主导地位，但在AML小鼠血浆中观察到了同源二聚体S100A8和S100A9(见图2)。在AML受体的骨髓和脾脏上清液中发现了S100A8/A9浓度升高，这表明细胞外流体也富含这些蛋白，S100A8/A9浓度会随着白血病进展(progress)而逐渐增加，并与白血病细胞从骨髓至所述血液中的回归(regress，减少)密切相关(见图3)。

为了研究S100A8和S100A9在白血病进展中的作用，H9M驱动的AML继发性受体用10mg/kg pAb抗-Si00A8或mAb抗-S100A9i.p.处理。这些抗体分别与同源二聚体S100A8/A8或S100A9/A9和异源二聚体S100A8/A9相互作用。与对照免疫球蛋白相比，注射抗-S100A8会导致白血病进展显著延迟并显著延长存活(图4)。这与抗-S100A8处理的小鼠中白血病小鼠的体重减轻和行为改善相关(图5)。抗-S100A8处理的小鼠的外周血中的白血病细胞百分比和S100A8/A9浓度也显著降低(图6)。相对而言，在血浆S100A8/A9水平、血液中白血病细胞或总体存活率方面，对照IgG和抗-S100A9处理的小鼠之间没有观察到差异(图4)。抗-S100A8处理小鼠的分析揭示了成熟骨髓细胞标志物CD11b和Gr1表达(图7)，G0/G1细胞周期阶段中的细胞(图8)和粒细胞性细胞的细胞学修饰特性的增加(图9)，而在抗-S100A9中未观察到变化，这表明了AML细胞分化的增强，并且所述抗-S100A8诱导了髓性分化。因此，S100A8通过干扰髓细胞分化促进了AML发病机制。

为了证实所述抗-S100A8的效果，用抗-S100A8刺激用所述融合基因MLL-AF9转染的人脐带血细胞72小时。使用CD14表达作为细胞分化的标志物来检查细胞分化。抗-S100A8mAb 1F8使CD14的细胞表达数量加倍(图10中的A)，这表明了细胞分化的刺激作用。此外，抗-S100A8mAb1F8增加了G0/G1和S阶段细胞的数量(图10中的B)，这指示细胞增殖的抑制作用。

正如图11中所示，本文涵盖的所述抗-S100A8抗体能够与S100A9肽一起给药，从而与对照免疫球蛋白相比，或与单独给药抗-S100A8抗体或S100A9肽相比，显著地增加了白血病进展的延迟和延长的存活。

S100A9，也称为钙粒蛋白B(calgranulin B)和骨髓相关蛋白-14(MRP-14)，是属于所述S100蛋白家族的钙-和锌-结合蛋白。S100A9由骨髓细胞谱系高度表达，并在炎性病症期间发现于细胞外环境中。S100A9与S100家族另一成员的S100A8形成异源二聚体。然而，S100A9也可以形成执行特定功能的单体。人S100A9具有约13kDa的分子量并由114个氨基酸残基构成。

人S100A9

因此，本发明公开了包含抗-S100A8抗体和S100A9肽的组合物。

更具体而言，本发明公开了包含抗-S100A8抗体的用于治疗白血病的组合物，所述抗-S100A8抗体包含由SEQ ID NO:3或4所示的核苷酸序列编码的重链可变区，由SEQ IDNO:5或6所示的所述核苷酸序列编码的轻链可变区和包含由SEQ ID NO：7所示的所述氨基酸序列的S100A9肽。

因此，抗-S100A8的注射通过促进白血病细胞的分化保护免受AML，导致增殖降低。

本公开通过参考下面的实施例会更容易理解，给出下面的实施例是为了举例说明实施方式而非限制其范围。

实施例I

骨髓祖细胞转导和移植步骤

将从5-氟尿嘧啶处理的C57BL/6小鼠(8～12周龄雌性)分离出的骨髓细胞在含有10ng/ml IL-3、10ng/ml IL-6和100ng/ml干细胞因子，含有15％胎牛血清的DMEM中培养2天从而促进进入细胞循环(cell cycle entry)。然后在5μg/mL聚凝胺(polybrene)存在下将骨髓细胞与用MSCV-hoxa9-ires-meis1hpgk-EGFP(病毒产生细胞)转染的经照射的GP+E86细胞共培养2天。

原发性白血病受体C57BL/6小鼠经过照射(7Gy)，接着24小时后i.v.注射4×10⁵个感染的骨髓细胞(表达Hoxa9，Meis1和Egfp)。每天跟踪小鼠的白血病迹象。每周收集外周血以通过流式细胞术定量所述白血病细胞(表达GFP)的数量。处死濒死小鼠，收获外周血和骨髓。

通过将来自原发性白血病小鼠的2×10⁵个骨髓细胞注射于亚致死剂量照射(4Gy)的受体中而诱导继发性白血病。

实施例II

抗-S100A8抗体治疗

将从原发性白血病小鼠的骨髓中分离出的白血病细胞注射于亚致死剂量照射(4Gy)的受体C57BL/6小鼠中。14天后通过流式细胞术评价外周血中AML细胞(EGFP+)的存在。小鼠从第3天开始每周三次以100μg纯化的兔IgG抗-S100A8进行i.p.注射。处死表现出不良健康体征的小鼠，收集外周血和骨髓进行组织学和流式细胞术分析。

实施例III

刺激MLL-AF9

用所述融合基因MLL-AF9转染的人脐带血细胞在补充有15％胎牛血清、IL-6和干细胞因子的IMDM中培养。将所述细胞铺板于96-孔微量滴定板(microtiter plate)(200000个细胞/孔)上，然后用20μg/mL mAb1 F8抗-S100A8或PBS进行刺激。72小时后，收集细胞并在用抗-CD14染色后通过流式细胞术进行免疫表型分析(immunophenotyping)。通过碘化丙啶鎓染色分析细胞周期。

实施例IV

抗-S100A8和S100A9肽的组合

将从原发性白血病小鼠骨髓中分离出的白血病细胞注射至亚致死剂量照射(4Gy)的受体C57BL/6小鼠中。14天后通过流式细胞术评价外周血中AML细胞(EGFP+)的存在。小鼠从第3天开始每周三次i.p.注射100μg纯化的兔IgG抗-S100A8、20μg重组小鼠S100A9蛋白或抗-S100A8和S100A9蛋白的组合。处死表现出不良健康体征的小鼠，收集外周血和骨髓用于组织学和流式细胞术分析。

尽管已经结合其具体实施方式描述了本公开，但应该理解的是，其能够进一步修改，并且当在本公开内容所属领域内的已知或惯用实践范围内时，以及当可应用于前面阐述的基本特征时，以及在所附权利要求范围中时，本申请旨在涵盖包括与本公开偏离的任何后来的变型，用途或改编。

序列表

<110> 拉瓦尔大学

<120> 用于治疗白血病的抗-S100A8

<130> 05006013-408PCT

<150> US 62/218,000

<151> 2015-09-14

<150> US 62/259,738

<151> 2015-11-25

<160> 7

<170> FastSEQ 用于 Windows版本4.0

<210> 1

<211> 93

<212> PRT

<213> 人（Human）

<220>

<221> MUTAGEN

<223> S100A8

<400> 1

Met Leu Thr Glu Leu Glu Lys Ala Leu Asn Ser Ile Ile Asp Val Tyr

1 5 10 15

His Lys Tyr Ser Leu Ile Lys Gly Asn Phe His Ala Val Tyr Arg Asp

20 25 30

Asp Leu Lys Lys Leu Leu Glu Thr Glu Cys Pro Gln Tyr Ile Arg Lys

35 40 45

Lys Gly Ala Asp Val Trp Phe Lys Glu Leu Asp Ile Asn Thr Asp Gly

50 55 60

Ala Val Asn Phe Gln Glu Phe Leu Ile Leu Val Ile Lys Met Gly Val

65 70 75 80

Ala Ala His Lys Lys Ser His Glu Glu Ser His Lys Glu

85 90

<210> 2

<211> 279

<212> DNA

<213> 人（Human）

<220>

<221> misc_feature

<223> S100A8

<400> 2

atgttgaccg agctggagaa agccttgaac tctatcatcg acgtctacca caagtactcc 60

ctgataaagg ggaatttcca tgccgtctac agggatgacc tgaagaaatt gctagagacc 120

gagtgtcctc agtatatcag gaaaaagggt gcagacgtct ggttcaaaga gttggatatc 180

aacactgatg gtgcagttaa cttccaggag ttcctcattc tggtgataaa gatgggcgtg 240

gcagcccaca aaaaaagcca tgaagaaagc cacaaagag 279

<210> 3

<211> 408

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> misc_feature

<223> 抗-S100A8的重链可变区（heavy chain variable region of anti-S100A8）

<400> 3

ggatcccagg ttcagctgca gcagtcaggg gcagagcttg tgaagccagg ggcctcagtc 60

aagttgtcct gcacagcttc tggcttcaac attaaagaca cctatttgca ctgggtgaag 120

cagaggcctg agcagggcct ggagtgggtt ggaaggattg atcctgcgaa tggtgatact 180

aaatatgacc cgaagttcca ggccaaggcc actataacag ctgacacaac ctccaacaca 240

gcctacgtgc acctcaacag cctgacatct gaggacactg ccgtctattt ctgtactggg 300

ggatggcaga tggggggccg gtacttcgat gtctggggcg cagggacaac ggtcaccgtc 360

tcctcagcca aaacgacacc cccatctgtc tatggtggcg gtggttct 408

<210> 4

<211> 136

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> MUTAGEN

<400> 4

Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro

1 5 10 15

Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys

20 25 30

Asp Thr Tyr Leu His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Val Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asp Thr Lys Tyr Asp Pro

50 55 60

Lys Phe Gln Ala Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Thr Ser Asn Thr

65 70 75 80

Ala Tyr Val His Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Phe Cys Thr Gly Gly Trp Gln Met Gly Gly Arg Tyr Phe Asp Val Trp

100 105 110

Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro

115 120 125

Ser Val Tyr Gly Gly Gly Gly Ser

130 135

<210> 5

<211> 327

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> misc_feature

<223> 抗-S100A8的轻链可变区（light chain variable region of anti-S100A8）

<400> 5

gatgttgtga tgacccagtc tcctgcttcc ttagctgtat ctctggggca gagggccacc 60

atctcataca gggccagcaa aagtgtcagt acatctggct atagttatat gcactggaac 120

caacagaaac caggacagcc acccagactc ctcatctatc ttgtatccaa cctagaatct 180

ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 240

cctgtggagg aggaggatgc tgcaacctat tactgtcagc acattaggga gcttacacgt 300

tcggaggggg gaccaagctg gaaataa 327

<210> 6

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> MUTAGEN

<400> 6

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Tyr Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser

20 25 30

Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Asn Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His

65 70 75 80

Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ile Arg

85 90 95

Glu Leu Thr Arg Ser Glu Gly Gly Pro Ser Trp Lys

100 105

<210> 7

<211> 114

<212> PRT

<213> 人（Human）

<220>

<221> MUTAGEN

<223> S100A9

<400> 7

Met Thr Cys Lys Met Ser Gln Leu Glu Arg Asn Ile Glu Thr Ile Ile

1 5 10 15

Asn Thr Phe His Gln Tyr Ser Val Lys Leu Gly His Pro Asp Thr Leu

20 25 30

Asn Gln Gly Glu Phe Lys Glu Leu Val Arg Lys Asp Leu Gln Asn Phe

35 40 45

Leu Lys Lys Glu Asn Lys Asn Glu Lys Val Ile Glu His Ile Met Glu

50 55 60

Asp Leu Asp Thr Asn Ala Asp Lys Gln Leu Ser Phe Glu Glu Phe Ile

65 70 75 80

Met Leu Met Ala Arg Leu Thr Trp Ala Ser His Glu Lys Met His Glu

85 90 95

Gly Asp Glu Gly Pro Gly His His His Lys Pro Gly Leu Gly Glu Gly

100 105 110

Thr Pro

Claims

1.一种抗-S100A8，用于治疗白血病。

2.根据权利要求1所述的抗-S100A8，其中所述抗-S100A8是抗体。

3.根据权利要求1或2所述的抗-S100A8，其中所述抗-S100A8特异性结合S100A8蛋白的部分。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的抗-S100A8，其中所述抗-S100A8特异性结合S100A8/S100A8同源二聚体或S100A8/S100A9异源二聚体。

5.根据权利要求3或4所述的抗-S100A8，其中S100A8蛋白是人S100A8。

6.根据权利要求5所述的抗-S100A8，其中所述人S100A8包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。

7.根据权利要求1～6中任一项所述的抗-S100A8，其中所述抗-S100A8是单克隆抗体或多克隆抗体。

8.根据权利要求1～7中任一项所述的抗-S100A8，其中所述抗-S100A8是小鼠抗体、山羊抗体、人抗体或兔抗体。

9.根据权利要求1～7中任一项所述的抗-S100A8，其中所述抗-S100A8是人源化抗体。

10.根据权利要求2～9中任一项所述的抗-S100A8，其中所述抗-S100A8抗体包含选自由Fv、F(ab')或F(ab')2组成的组中的表位结合片段。

11.根据权利要求2～9中任一项所述的抗-S100A8，其中所述抗-S100A8抗体包含由SEQID NO：3所示的核苷酸序列编码的重链可变区。

12.根据权利要求2～11中任一项所述的抗-S100A8，其中所述抗-S100A8抗体包含由SEQ ID NO：4组成的重链可变区。

13.根据权利要求2～9、11和12中任一项所述的抗-S100A8，其中所述抗-S100A8抗体包含由SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列编码的轻链可变区。

14.根据权利要求2～9和11～13中任一项所述的抗-S100A8，其中所述抗-S100A8抗体包含由SEQ ID NO：6组成的轻链可变区。

15.根据权利要求1～14中任一项所述的抗-S100A8，其中抗-S100A8配制用于注射。

16.根据权利要求1～15中任一项所述的抗-S100A8，配制用于与化学治疗剂一起给予。

17.根据权利要求16所述的抗-S100A8，其中所述化学治疗剂是柔红霉素、多柔比星和阿糖胞苷中的至少一种。

18.根据权利要求15或16所述的抗-S100A8，其中所述抗-S100A8配制用于与所述化学治疗剂同时或分开给予。

19.根据权利要求1～18中任一项所述的抗-S100A8，其中所述抗-S100A8配制用于在对受试者进行化疗治疗后给予。

20.一种包含载体和权利要求1～19中任一项所述的抗-S100A8的组合物。

21.根据权利要求20所述的组合物，用于治疗白血病。

22.根据权利要求21所述的组合物，其中所述白血病是急性淋巴细胞性白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性髓性白血病(CML)和慢性骨髓单核细胞性白血病(CMML)。

23.根据权利要求20所述的组合物，用于刺激细胞分化。

24.根据权利要求20所述的组合物，用于抑制细胞增殖。

25.根据权利要求20所述的组合物，用于治疗急性髓性白血病(AML)。

26.根据权利要求20～25中任一项所述的组合物，进一步包含S100A9肽或其肽模拟物。

27.根据权利要求26所述的组合物，其中所述S100A9肽是人S100A9蛋白。

28.根据权利要求26或27所述的组合物，其中所述肽包含SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列。

29.根据权利要求28所述的组合物，其中所述肽与SEQ ID NO：7具有至少60％、至少70％或至少80％、至少90％一致性、或至少约95％一致性。

30.根据权利要求28或29所述的组合物，其中所述肽由SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列组成。

31.一种治疗受试者中的白血病的方法，包括向所述受试者给予权利要求1～19中任一项所述的抗-S100A8或权利要求20～30中任一项所述的组合物的步骤。

32.根据权利要求31所述的方法，其中所述白血病是急性淋巴细胞性白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性髓性白血病(CML)和慢性骨髓单核细胞性白血病(CMML)。

33.根据权利要求31或32所述的方法，进一步包括向所述受试者给予化学治疗剂的步骤。

34.根据权利要求33所述的方法，其中所述化学治疗剂是柔红霉素、多柔比星和阿糖胞苷中的至少一种。

35.根据权利要求33或34所述的方法，其中所述抗-S100A8或组合物与所述化学治疗剂同时或分开给予。

36.根据权利要求31～35中任一项所述的方法，其中所述抗-S100A8或组合物在对所述受试者进行化疗治疗后给予。

37.一种刺激受试者中的细胞分化的方法，包括向所述受试者给予权利要求1～19中任一项所述的抗-S100A8或权利要求20～30中任一项所述的组合物的步骤。

38.一种用于抑制受试者中的细胞增殖的方法，包括向所述受试者给予权利要求1～19中任一项所述的抗-S100A8或权利要求20～30中任一项所述的组合物的步骤。

39.一种体外刺激细胞分化的方法，包括给予权利要求1～19中任一项所述的抗-S100A8或权利要求20～30中任一项所述的组合物的步骤。

40.一种体外抑制细胞增殖的方法，包括给予权利要求1～19中任一项所述的抗-S100A8或权利要求20～30中任一项所述的组合物的步骤。

41.权利要求1～19中任一项所述的抗-S100A8或权利要求20～25中任一项所述的组合物用于治疗受试者中的白血病的用途。

42.权利要求1～19中任一项所述的抗-S100A8或权利要求20～30中任一项所述的组合物在制备用于治疗受试者中的白血病的药物中的用途。

43.根据权利要求41或42所述的用途，其中所述白血病是急性淋巴细胞性白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性髓性白血病(CML)和慢性骨髓单核细胞性白血病(CMML)。

44.根据权利要求41～43中任一项所述的用途，其中所述抗-S100A8或组合物配制用于与化学治疗剂一起给予。

45.根据权利要求44所述的用途，其中所述化学治疗剂是柔红霉素、多柔比星和阿糖胞苷中的至少一种。

46.根据权利要求44或45所述的用途，其中所述抗-S100A8或组合物配制用于与所述化学治疗剂同时或分开给予。

47.根据权利要求41～46中任一项所述的用途，其中所述抗-S100A8或组合物配制用于在对受试者进行化疗治疗后给予。

48.权利要求1～19中任一项所述的抗-S100A8或权利要求20～30中任一项所述的组合物用于刺激细胞分化的用途。

49.权利要求1～19中任一项所述的抗-S100A8或权利要求20～30中任一项所述的组合物用于抑制细胞增殖的用途。

50.根据权利要求26～38中任一项所述的方法或根据权利要求41～47中任一项所述的用途，其中所述受试者是哺乳动物。

51.根据权利要求26～38和50中任一项所述的方法或根据权利要求41～47和50中任一项所述的用途，其中所述受试者是小鼠或人。

52.根据权利要求26～38，50和51中任一项所述的方法或根据权利要求41～47和50～51中任一项所述的用途，其中所述抗-S100A8配制用于与S100A9肽或其肽模拟物一起给予。

53.根据权利要求52所述的方法或根据权利要求52所述的用途，其中所述S100A9肽是人S100A9蛋白。

54.根据权利要求52或53所述的方法或根据权利要求52或53所述的用途，其中所述肽包含SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列。

55.根据权利要求52或53所述的方法或根据权利要求52或53所述的用途，其中所述肽与SEQ ID NO：7具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％一致性、或至少约95％一致性。

56.根据权利要求52或53所述的方法或根据权利要求52或53所述的用途，其中所述肽由SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列组成。