MXPA06012187A - Anticuerpos y moleculas derivadas de estas que se enlazan a las proteinas steap-1. - Google Patents

Anticuerpos y moleculas derivadas de estas que se enlazan a las proteinas steap-1.

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Arthur B Raitano
Mary Faris
Aya Jakobovits
Soudabeh Etessami
Pia M Challita-Eid
Juan J Perez-Villar
Karen J Morrison
Jean Gudas
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Abstract

Se describen los anticuerpos y las moleculas derivadas de estos que se enlazan a una nueva proteina STEAP-1, y variantes de las mismas, en donde STEAP-1 muestra expresion especifica del tejido, en tejido de adulto normal, y es aberrantemente expresado en los canceres listados en la tabla I. En consecuencia, STEAP-1 proporciona un objetivo de diagnostico, de pronostico, profilactico y/o terapeutico para el cancer. El gen de STEAP-1 o fragmento del mismo, o su proteina codificada o variantes de la misma, o un fragmento de las mismas pueden ser utilizados para promover una respuesta inmune humoral o celular; los anticuerpos o las celulas T reactivas con STEAP-1 pueden ser utilizadas en la inmunizacion activa o pasiva.

Description

ANTICUERPOS Y MOLÉCULAS DERIVADAS DE ESTAS QUE SE ENLAZAN A LAS PROTEÍNAS STEAP-1 CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención descrita en la presente se refiere a los anticuerpos, así como a los fragmentos de enlace de los mismos y a las moléculas manipuladas por ingeniería genética a partir de éstas, que se enlazan a las proteínas, denominadas STEAP-1. La invención se refiere además a los métodos de diagnóstico, de pronóstico, profilácticos y terapéuticos y a las composiciones útiles en el tratamiento de cánceres que expresan STEAP-1.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El cáncer es la segunda causa principal de muerte humana junto a la enfermedad coronaria. Mundialmente, millones de personas mueren de cáncer cada año. En los Estados Unidos únicamente, como es reportado por la Sociedad Americana del Cáncer, el cáncer provoca la muerte de poco más de medio millón de personas anualmente, con más de 1.2 millones de nuevos casos diagnosticados por año. Mientras que las muertes por enfermedades cardiacas han estado declinando significativamente, aquellas resultantes del cáncer en general se están elevando. En la primera parte del próximo siglo, se predice que el cáncer se vuelva la causa REF:i76819 principal de muerte. Mundialmente, varios cánceres son considerados como asesinos líderes. En particular, los carcinomas de pulmón, de próstata, mama, colon, páncreas, ovario y vejiga representan las causas principales de muerte por cáncer. Éstos y virtualmente todos los otros carcinomas comparten una característica letal común. Con muy pocas excepciones, la enfermedad metastática a partir de un carcinoma es fatal. Además, incluso para aquellos pacientes con cáncer quienes inicialmente sobreviven a sus cánceres primarios, la experiencia común ha mostrado que sus vidas son dramáticamente alteradas. Muchos pacientes con cáncer experimentan ansiedades fuertes impulsadas por la alerta del potencial para la recurrencia o la falla del tratamiento. Muchos pacientes con cáncer experimentan debilitamiento físico después del tratamiento. Además, muchos pacientes con cáncer experimentan una recurrencia. Mundialmente, el cáncer de próstata es el cuarto cáncer más prevalente en hombres. En Norteamérica y en Europa del Norte, es por mucho el cáncer más común en hombres, y es la segunda causa principal de muerte por cáncer en hombres. En los Estados Unidos únicamente, más de 30,000 hombres mueren anualmente de esta enfermedad -segunda únicamente al cáncer de pulmón. A pesar de la magnitud de estas cifras, no existe todavía tratamiento efectivo para el cáncer metastático de próstata. La prostatectomía quirúrgica, la terapia con radiación, la terapia por ablación de hormonas, la castración quirúrgica y la quimioterapia continúan siendo las modalidades de tratamiento principales. Desafortunadamente, estos tratamientos no son efectivos para muchos y son a menudo asociados con consecuencias indeseables . En el frente de diagnóstico, la falta de marcador tumoral de la próstata que puede detectar de manera precisa los tumores localizados en etapa temprana, sigue siendo una limitación significativa en el diagnóstico y el manejo de esta enfermedad. Aunque el ensayo de antígeno prostético sérico específico (PSA por sus siglas en ingles) ha sido una herramienta muy útil, no obstante, su especificidad y utilidad general es ampliamente considerada como carente en varios aspectos importantes. El progreso en la identificación de marcadores específicos adicionales para el cáncer de próstata ha sido mejorado por la generación de xenoinjertos de cáncer de próstata que pueden recapitular diferentes etapas de la enfermedad en ratones. Los xenoinjertos de Cáncer de Próstata de Los Ángeles (LAPC por sus siglas en ingles) son xenoinjertos de cáncer de próstata que han sobrevivido al paso en ratones inmunodeficientes combinados severos (SCID por sus siglas en ingles) y han mostrado la capacidad de imitar la transición de la dependencia a andrógenos hasta la independencia a los andrógenos (Klein et al., 1997, Nat. Med. 3: 402). Más recientemente, los marcadores identificados del cáncer de próstata incluyen PCTA-1 (Su et al., 1996, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 93: 7252), antígeno membranal específico de la próstata (PSM) (Pinto et al., Clin Cáncer Res 1996 Sep 2 (9): 1445-51), STEAP (Hubert, et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 199 Dic. 7; 96 (25): 14523-8) y el antígeno de células madre de la próstata (PSCA) (Ralter et al., 1998, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 95: 1735). Mientras que los marcadores previamente identificados tales como PSA, PSM, PCTA y PSCA han facilitado los esfuerzos para diagnosticar y tratar el cáncer de próstata, existe una necesidad para la identificación de marcadores adicionales y objetivos terapéuticos para la próstata y cánceres relacionados, con el fin de mejorar adicionalmente el diagnóstico y la terapia. El carcinoma de células renales (RCC por sus siglas en ingles) representa aproximadamente 3 por ciento de las malignidades en adultos. Una vez que los adenomas alcanzan un diámetro de 2 a 3 cm, existe el potencial de malignidad. En el adulto, los dos principales tumores renales malignos son el adenocarcinoma de células renales y el carcinoma de células transicionales de la pelvis renal y del uréter. La incidencia del adenocarcinoma de células renales se estima en más de 29,000 casos en los Estados Unidos, y más de 11,600 pacientes murieron de esta enfermedad en 1998. El carcinoma de células transicionales es menor frecuente, con una incidencia de aproximadamente 500 casos por año en los Estados Unidos. La cirugía ha sido la terapia principal para el adenocarcinoma de células renales por muchas décadas. Solo recientemente, la enfermedad metastática ha sido refractaria a alguna terapia sistémica. Con los desarrollos recientes en las terapias sistémicas, particularmente las inmunoterapias, el carcinoma de células renales metastáticas puede ser tratado agresivamente en pacientes apropiados con una posibilidad de respuestas durables. No obstante, existe una necesidad remanente para terapias efectivas para estos pacientes. De todos los nuevos casos de cáncer en los Estados Unidos, el cáncer de vejiga representa aproximadamente 5 por ciento en hombres (el quinto neoplasma más común) y 3 por ciento en mujeres (octava neoplasma más común) . La incidencia se está incrementando lentamente, concurrente con un incremento en la población más anciana. En 1998, existió un estimado de 54,500 casos, incluyendo 39500 en hombres y 15,000 en mujeres. La incidencia ajustada a la edad en los Estados Unidos es de 32 por 100,000 para hombres y ocho por 100,000 en mujeres. La proporción histórica masculino/femenino de 3:1 puede estar disminuyendo con relación a los patrones de fumar en mujeres. Existió un estimado de 11,000 muertes por cáncer de vejiga en 1998 (7,800 en hombres y 3,900 en mujeres). La incidencia del cáncer de vejiga y la mortalidad se incrementa fuertemente con la edad, y serán un problema creciente conforme la población se haga más vieja. La mayoría de los cánceres de vejiga recurren en la vejiga. El cáncer de vejiga es manejado con una combinación de resección transuretral de la vejiga (TUR) y quimioterapia o inmunoterapia intravesical . La naturaleza multifocal y recurrente del cáncer de vejiga señala a las limitaciones de TUR. La mayoría de los cánceres invasores de los músculos no son curados por TUR solo. La cistectomía radical y la desviación urinaria son los medios más comunes para eliminar el cáncer, pero llevan un impacto no despreciable sobre la función urinaria y sexual. Sigue existiendo una necesidad significativa para modalidades de tratamiento que sean benéficas para pacientes con cáncer de vejiga. Un estimado de 130,200 casos de cáncer colorrectal ocurrieron en el año 2000 en los Estados Unidos, incluyendo 93,800 casos de cáncer de colon y 36,400 de cáncer rectal. Los cánceres colorrectales son los terceros cánceres más comunes en hombres y mujeres. Las proporciones de incidencia declinaron significativamente durante 1992-1996 (-2.1% por año) . La investigación sugiere que estas declinaciones han sido debidas a la selección incrementada y a la eliminación de pólipos, previendo la progresión de los pólipos a cánceres invasores. Existieron un estimado de 56,300 muertes (47,700 por cáncer de colon, 8,600 por cáncer rectal) en el año 2000, representando aproximadamente 11% de todas las muertes por cáncer en los Estados Unidos. A la fecha, la cirugía es la forma más común de la terapia para el cáncer colorrectal, y para los cánceres que no se han difundido, ésta es frecuentemente curativa. La quimioterapia, o la quimioterapia más radiación, es dada antes o después de la cirugía a la mayoría de los pacientes cuyo cáncer ha perforado profundamente la pared intestinal y se ha dispersado a los nodulos linfáticos. Una colostomía permanente (la creación de una abertura abdominal para la eliminación de los desechos corporales) es ocasionalmente necesaria para el cáncer de colon y no es frecuentemente requerida para el cáncer rectal. Sigue existiendo una necesidad para modalidades de diagnóstico y de tratamiento efectivas para el cáncer colorrectal. Existió un estimado de 164,100 nuevos casos del cáncer de pulmón y bronquial en el año 2000, representando 14% de todos los diagnósticos de cáncer en los Estados Unidos. La proporción de incidencia en el cáncer de pulmón y bronquial está disminuyendo significativamente en hombres, desde un máximo de 86.5 por 100,000 en 1984 hasta 70.0 en 1996. En los años 90, la proporción de incremento entre mujeres comenzó a disminuir. En 1996, la proporción de incidencia en mujeres fue de 42.3 por 100,000. El cáncer pulmonar y bronquial provocó un estimado de 156,900 muertes en el año 2000, representando 28% de todas las muertes por cáncer. Durante 1992-1996, la mortalidad por cáncer pulmonar disminuyó significativamente entre hombres (-1.7% por año) mientras que las proporciones para las mujeres se estaban incrementando significativamente (0.9% por año). Desde 1987, más mujeres han muerto cada año de cáncer pulmonar que de cáncer de mama, el cual, por más de 40 años, fue la principal causa de muerte por cáncer en mujeres. La disminución de la incidencia del cáncer pulmonar y las proporciones de mortalidad más probablemente resultaron de las proporciones disminuidas en el hábito de fumar en los pasados 30 años; no obstante, la disminución de los patrones del hábito de fumar entre mujeres se rezagó detrás de aquellas de los hombres. De interés, aunque las disminuciones en el uso de tabaco por adultos han disminuido, el uso de tabaco en jóvenes se está incrementando nuevamente. Las opciones de tratamiento para el cáncer pulmonar y bronquial son determinadas por el tipo y la etapa del cáncer e incluyen cirugía, radioterapia y quimioterapia. Para muchos cánceres localizados, la cirugía es usualmente el tratamiento de elección. Debido a que la enfermedad se ha difundido usualmente por el tiempo en que se descubre, la terapia con radiación y la quimioterapia son a menudo necesarias en combinación con la cirugía. La quimioterapia sola o combinada con la radiación es el tratamiento de elección para el cáncer pulmonar de células pequeñas; en este régimen, un gran porcentaje de pacientes experimentan remisión, que en algunos casos es de larga duración. No obstante, existe una necesidad creciente para el tratamiento efectivo y procedimientos de diagnóstico efectivos para cánceres pulmonar y bronquial. Un estimado de 182,800 nuevos casos invasores de cáncer de mama se esperó que ocurrieran entre las mujeres en los Estados Unidos durante el año 2000. Además, aproximadamente 1,400 nuevos casos de cáncer de mama se esperó que fueran diagnosticados en hombres en el año 2000. Después de incrementarse aproximadamente 4% por año en los años 80, las proporciones de incidencia del cáncer de mama en mujeres se ha elevado en los años 90 hasta aproximadamente 110.6 casos por 100,000. En los Estados Unidos únicamente, existió un estimado de 41,200 muertes (40,800 mujeres, 400 hombres) en el año 2000 debido al cáncer de mama. El cáncer de mama es el segundo entre las muertes por cáncer en mujeres. De acuerdo a los datos más recientes, las proporciones de mortalidad disminuyeron significativamente durante 1992-1996 con las mayores disminuciones en mujeres más jóvenes, blancas y negras. Estas disminuciones probablemente fueron el resultado de una detección más temprana y un tratamiento mejorado. Tomando en cuenta las circunstancias médicas y las preferencias de los pacientes, el tratamiento del cáncer de mama puede involucrar lumpectomía (eliminación local del tumor) y eliminación de los nodulos linfáticos bajo el brazo; mastectomía (eliminación quirúrgica de la mama) y eliminación de los nodulos linfáticos bajo el brazo; radioterapia; quimioterapia; o terapia hormonal. A menudo, son utilizados en combinación dos o más métodos. Numerosos estudios han mostrado que, para la enfermedad en etapa temprana, las proporciones de supervivencia a largo plazo después de la lumpectomía más radioterapia son similares a las proporciones de supervivencia después de la mastectomía radical modificada. Avances significativos en las técnicas de reconstrucción proporcionan "carias opciones para la reconstrucción de la mama después de la mastectomía. Recientemente, tal reconstrucción ha sido realizada al mismo tiempo que la mastectomía. La extirpación local del carcinoma ductal in situ (DCIS por sus siglas en ingles) con cantidades adecuadas de tejido de mama normal vecino, pueden prevenir la recurrencia local del DCIS. La radiación a la mama y/o el tamoxifeno pueden reducir la probabilidad de que ocurra DCIS en el tejido de mama remanente. Esto es importante debido a que DCIS, si se deja sin tratar, puede desarrollarse en cáncer de mama invasor. No obstante, existen efectos colaterales serios o secuelas a estos tratamientos. Por lo tanto, existe una necesidad para tratamientos eficaces contra el cáncer de mama . Existió un estimado de 23,100 nuevos casos de cáncer de ovario en los Estados Unidos en el año 2000. Esto representa 4% de todos los cánceres entre mujeres y califica como el segundo entre los cánceres ginecológicos. Durante 1992-1996, las proporciones de incidencia del cáncer de ovario disminuyeron significativamente. Consecuente al cáncer de ovario, existió un estimado de 14,000 muertes en el año 2000. El cáncer de ovario provoca más muertes que cualquier otro cáncer del sistema reproductor femenino. La cirugía, la radioterapia y la quimioterapia son opciones de tratamiento para el cáncer de ovario. La cirugía usualmente incluye la eliminación de uno o ambos ovarios.
Los tubos falopianos (salpingo-ooforectomía) , y el útero (histerectomía) . En algunos tumores muy tempranos, únicamente el ovario involucrado será eliminado, especialmente en mujeres jóvenes quienes desean tener hijos. En la enfermedad avanzada, se realiza un intento para eliminar toda la enfermedad intra-abdominal para aumentar el efecto de la quimioterapia. Sigue existiendo una necesidad importante para opciones de tratamiento efectivas para el cáncer de ovario. Existió un estimado de 28,300 nuevos casos de cáncer pancreático en los Estados Unidos en el año 2000. En los últimos 20 años, las proporciones de cáncer pancreático han disminuido en hombres. Las proporciones entre mujeres han permanecido aproximadamente constantes pero pueden estar empezando a disminuir. El cáncer pancreático provocó un estimado de 28,200 muertes en el año 2000 en los Estados Unidos. En los últimos 20 años, ha existido una disminución ligera pero significativa en las proporciones de mortalidad entre hombres (aproximadamente -0.9% por año) mientras que las proporciones se han incrementado ligeramente entre mujeres . La cirugía, la terapia con radiación y la quimioterapia son opciones de tratamiento para el cáncer pancreático. Estas opciones de tratamiento pueden extender la supervivencia y/o aliviar los síntomas en muchos pacientes, pero no es probable que produzcan una curación para la mayoría. Existe una necesidad significativa para opciones adicionales terapéuticas y de diagnóstico para los cánceres. Éstas incluyen el uso de anticuerpos, vacunas y moléculas pequeñas como modalidades de tratamiento. Además, existe también una necesidad para el uso de estas modalidades como herramientas de investigación para diagnosticar, detectar, monitorizar y seguir el estado de la técnica en todas las áreas del tratamiento y estudios del cáncer.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención proporciona los anticuerpos, así como los fragmentos de enlace de los mismos y las moléculas manipuladas por ingeniería genética provenientes de éstas, que se enlazan a las proteínas STEAP-1 y los fragmentos polipeptídicos de las proteínas STEAP-1. Como se utiliza en la presente, el término STEAP-1 es sinónimo con 8P1D4. La invención comprende los anticuerpos policlonales y monoclonales, anticuerpos murinos y otros anticuerpos de mamífero, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados y completamente humanos, y anticuerpos marcados con un marcador detectable o un agente terapéutico. En ciertas modalidades, existe una condición de que la secuencia de ácido nucleico de las Figuras 2A-2Q no sean codificadas y/o la secuencia entera de aminoácido de las Figuras 2A-2Q no sean preparadas. En ciertas modalidades, la secuencia entera de ácidos nucleicos de las Figuras 2A-2Q son codificadas y/o la secuencia entera de aminoácidos de las Figuras 21A-2Q son preparadas, cualquiera de las cuales son formas de dosis unitaria humanas respectivas.
La invención proporciona además los métodos para detectar la presencia y estado de los polinucleótidos STEAP-1 y las proteínas en diversas formas biológicas, así como los métodos para identificar las células que expresan STEAP-1. Una modalidad de esta invención proporciona los métodos para monitorizar los productos del gen STEAP-1 en un tejido o muestra hematológica que tiene o que es sospechosa de tener alguna forma de desregulación del crecimiento, tal como el cáncer. La invención proporciona además diversas composiciones inmunogénicas y terapéuticas y las estrategias para tratar los cánceres que expresan STEAP-1, tales como los cánceres de los tejidos listados en la Tabla I, incluyendo las terapias dirigidas a la inhibición de la transcripción, traducción, procesamiento o función de STEAP-1, así como las vacunas para el cáncer. En un aspecto, la invención proporciona las composiciones y los métodos que las comprenden, para tratar un cáncer que expresa STEAP-1 en un sujeto humano, en donde la composición comprende un portador adecuado para el uso en humanos y una dosis unitaria para humanos de uno o más de un agente que inhibe la producción o la función de STEAP-1. Preferentemente, el portador es un portador únicamente humano. En otro aspecto más de la invención, el agente es una porción que es inmunorreactiva con la proteína STEAP-1. Los ejemplos no limitantes de tales porciones incluyen, pero no están limitados a, anticuerpos (tales como los anticuerpos de cadena simple, monoclonales, policlonales, humanizados, quiméricos, o humanos) , los equivalentes funcionales de los mismos (ya sea de origen natural o sintéticos, y combinaciones de los mismos) . Los anticuerpos pueden ser conjugados a una porción de diagnóstico o terapéutica. En otro aspecto más, el agente es una molécula pequeña como se define en la presente. En otro aspecto más, el agente comprende uno o más de un péptido que comprende un epitopo de linfocito T citotóxico (CTL) que se enlaza a una molécula HLA de la clase I en un humano, para promover una respuesta CTL para STEAP-1 y/o uno o más de un péptido que comprende un epitopo de linfocito T cooperador (HTL) el cual se enlaza a una molécula HLA de la clase II en un humano, para promover una respuesta HTL. Los péptidos de la invención pueden estar sobre la misma o sobre una o más moléculas polipeptídicas separadas.
En un aspecto adicional de la invención, el agente comprende una o más de una molécula de ácido nucleico que expresa uno o más de uno de los péptidos estimuladores de la respuesta CTL o HTL como se describió anteriormente. En otro aspecto más de la invención, una o más de una molécula de ácido nucleico puede expresar una porción que es inmunológicamente reactiva con STEAP-1 como se describió anteriormente. Una o más de una molécula de ácido nucleico puede también ser, o codificar para una molécula que inhiba la producción de STEAP-1. Los ejemplos no limitantes de tales moléculas incluyen, pero no están limitados a aquellas complementarias a una secuencia nucleotídica esencial para la producción de STEAP-1 (por ejemplo, las secuencias antisentido o las moléculas que forman una triple hélice con una doble hélice nucleotídica esencial para la producción de STEAP-1) o una ribozima efectiva para lisar el ácido ribonucleico mensajero (mRNA por sus siglas en ingles) de STEAP-1. Otra modalidad más de la invención es los epitopos de anticuerpo, que comprenden una región peptídica o un oligonucleótido que codifica para la región peptídica, que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco de las siguientes características : i) una región peptídica de al menos 5 aminoácidos de un péptido particular de la Figura 3, en cualquier incremento de números enteros hasta la longitud completa de esa proteína en la Figura 3, que incluye una posición de aminoácido que tiene un valor igual a o mayor de 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9 o que tiene un valor igual a 1.0 en el perfil de Hidrofilicidad de la Figura 5; ii) una región peptídica de al menos 5 aminoácidos de un péptido particular de la Figura 3, en cualquier incremento de números enteros hasta la longitud completa de esa proteína en la Figura 3, que incluye una posición de aminoácido que tiene un valor igual a o menor de 0.5, 0.4, 0.3, 0.2, 0.1 o que tiene un valor igual a 0.0 en el perfil de Hidropaticidad de la Figura 6; iii) una región peptídica de al menos 5 aminoácidos de un péptido particular de la Figura 3, en cualquier incremento de números enteros hasta la longitud completa de esa proteína en la Figura 3, que incluye una posición de aminoácido que tiene un valor igual a o mayor de 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9 o que tiene un valor igual a 1.0 en el perfil de Residuos Accesibles Porcentuales de la Figura 7; iv) una región peptídica de al menos 5 aminoácidos de un péptido particular de la Figura 3, en cualquier incremento de números enteros hasta la longitud completa de esa proteína en la Figura 3, que incluye una posición de aminoácido que tiene un valor igual a o mayor de 0.5, 0 . 6, 0.7, 0.8, 0.9 o que tiene un valor igual a 1.0 en el perfil de Flexibilidad Promedio de la Figura 8; o v) una región peptídica de al menos 5 aminoácidos de un péptido particular de la Figura 3, en cualquier incremento de números enteros hasta la longitud completa de esa proteína en la Figura 3, que incluye una posición de aminoácido que tiene un valor igual a o mayor de 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9 o que tiene un valor igual a 1.0 en el perfil de Vuelta Beta de la Figura 9. La presente invención también se refiere a un gen, designado STEAP-1, que se ha encontrado que es sobre-expresado en el o los cánceres listados en la Tabla I. Los análisis de expresión de Northern blot de la expresión del gen STEAP-1 en tejidos normales muestra un patrón de expresión restringido en tejidos adultos. Las secuencias de nucleótidos (Figuras 2A-2Q) y de aminoácidos (Figuras 2A-2Q y Figuras 3A-3D) de STEAP-1 se proporcionan también. El perfil relacionado al tejido de STEAP-1 en los tejidos normales de adulto, combinados con la sobre-expresión observada en tejidos listados en la Tabla 1 muestra que STEAP-1 es aberrantemente sobre-expresada en al menos algunos cánceres, y de este modo sirve como un objetivo de diagnóstico, profiláctico, de pronóstico y/o terapéutico útil, para los cánceres del o de los tejidos tales como aquellos listados en la Tabla 1. La invención proporciona los polinucleótidos correspondientes o complementarios a todo o parte de los genes STEAP-1, los mRNAs, y/o las secuencias de codificación, preferentemente en forma aislada, incluyendo los polinucleótidos que codifican para las proteínas relacionadas a STEAP-1 y los fragmentos de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 o más de 25 aminoácidos contiguos; al menos 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 80, 85, 90, 95, 100 o más de 100 aminoácidos contiguos de una proteína relacionada a STEAP-1, así como los péptidos/proteínas mismas; el DNA, RNA, híbrido de DNA/RNA, y moléculas relacionadas, polinucleótidos u oligonucleótidos complementarios o que tienen al menos una homología de 90% a los genes STEAP-1 o a las secuencias de mRNA o partes de las mismas, y los polinucleótidos u oligonucleótidos que se hibridan a los genes STEAP-1, a los mRNAs o a los polinucleótidos que codifican para STEAP-1. También ser proporcionan los medios para aislar los cDNAs y los genes que codifican para STEAP-1. Se proporcionan también las moléculas de DNA recombinante que contienen los polinucleótidos STEAP-1, las células transformadas o transducidas con tales moléculas, y los sistemas hospedero-vector para la expresión de los productos del gen STEAP-1.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1. La secuencia SSH de 436 nucleótidos de STEAP-1. Figuras 2A-2Q. La secuencia de cDNA y de aminoácidos de la variante 1 de STEAP-1 (también llamada "STEAP-1 v.l" o "variante 1 de STEAP-1") se muestran en la Figura 2A. La metionina inicial está subrayada. La estructura de lectura abierta se extiende desde los ácidos nucleicos 66-1085 que incluyen el codón de detención. El cDNA y la secuencia de aminoácidos de la variante 2 de STEAP-1 (también llamada "STEAP-1 v.2") se muestra en la Figura 2B. El codón para la metionina inicial está subrayado. La estructura de lectura abierta se extiende desde el ácido nucleico 96-872 incluyendo el codón de detención. El cDNA y la secuencia de aminoácidos de la variante 3 de STEAP-1 (también llamada "STEAP-1 v.3") se muestra en la Figura 2C. El codón para la metionina inicial está subrayado. La estructura de lectura abierta se extiende desde el ácido nucleico 96-944 incluyendo el codón de detención. El cDNA y la secuencia de aminoácidos de la variante 4 de STEAP-1 (también llamada "STEAP-1 v.4") se muestra en la Figura 2D. El codón para la metionina inicial está subrayado. La estructura de lectura abierta se extiende desde el ácido nucleico 96-872 incluyendo el codón de detención. El cDNA y la secuencia de aminoácidos de la variante 5 de STEAP-1 (también llamada "STEAP-1 v.5") se muestra en la Figura 2E. El codón para la metionina inicial está subrayado. La estructura de lectura abierta se extiende desde el ácido nucleico 96-872 incluyendo el codón de detención. El cDNA y la secuencia de aminoácidos de la variante 6 de STEAP-1 (también llamada "STEAP-1 v.6") se muestra en la Figura 2F. El codón para la metionina inicial está subrayado. La estructura de lectura abierta se extiende desde el ácido nucleico 96-872 incluyendo el codón de detención. El cDNA y la secuencia de aminoácidos de la variante 7 de STEAP-1 (también llamada "STEAP-1 v.7") se muestra en la Figura 2G. El codón para la metionina inicial está subrayado. La estructura de lectura abierta se extiende desde el ácido nucleico 96-872 incluyendo el codón de detención. El cDNA y la secuencia de aminoácidos de la variante 8 de STEAP-1 (también llamada "STEAP-1 v.8") se muestra en la Figura 2H. El codón para la metionina inicial está subrayado. La estructura de lectura abierta se extiende desde el ácido nucleico 96-872 incluyendo el codón de detención. El cDNA y la secuencia de aminoácidos de la variante 9 de STEAP-1 (también llamada "STEAP-1 v.9") se muestra en la Figura 21. El codón para la metionina inicial está subrayado. La estructura de lectura abierta se extiende desde el ácido nucleico 96-872 incluyendo el codón de detención. El cDNA y la secuencia de aminoácidos de la variante 10 de STEAP-1 (también llamada "STEAP-1 v.10") se muestra en la Figura 2J. El codón para la metionina inicial está subrayado. La estructura de lectura abierta se extiende desde el ácido nucleico 96-872 incluyendo el codón de detención. El cDNA y la secuencia de aminoácidos de la variante 11 de STEAP-l (también llamada "STEAP-l v.ll") se muestra en la Figura 2K. El codón para la metionina inicial está subrayado. La estructura de lectura abierta se extiende desde el ácido nucleico 96-872 incluyendo el codón de detención. El cDNA y la secuencia de aminoácidos de la variante 12 de STEAP-1 (también llamada "STEAP-l v.12") se muestra en la Figura 2L. El codón para la metionina inicial está subrayado. La estructura de lectura abierta se extiende desde el ácido nucleico 96-872 incluyendo el codón de detención. El cDNA y la secuencia de aminoácidos de la variante 13 de STEAP-l (también llamada "STEAP-l v.13") se muestra en la Figura 2M. El codón para la metionina inicial está subrayado. La estructura de lectura abierta se extiende desde el ácido nucleico 96-872 incluyendo el codón de detención. El cDNA y la secuencia de aminoácidos de la variante 14 de STEAP-l (también llamada "STEAP-l v.14") se muestra en la Figura 2N. El codón para la metionina inicial está subrayado. La estructura de lectura abierta se extiende desde el ácido nucleico 96-872 incluyendo el codón de detención. El cDNA y la secuencia de aminoácidos de la variante 15 de STEAP-l (también llamada "STEAP-l v.15") se muestra en la Figura 20. El codón para la metionina inicial está subrayado. La estructura de lectura abierta se extiende desde el ácido nucleico 96-872 incluyendo el codón de detención. El cDNA y la secuencia de aminoácidos de la variante 16 de STEAP-l (también llamada "STEAP-l v.16") se muestra en la Figura 2P. El codón para la metionina inicial está subrayado. La estructura de lectura abierta se extiende desde el ácido nucleico 96-872 incluyendo el codón de detención. El cDNA y la secuencia de aminoácidos , de la variante 17 de STEAP-l (también llamada "STEAP-l v.17") se muestra en la Figura 2Q. El codón para la metionina inicial está subrayado. La estructura de lectura abierta se extiende desde el ácido nucleico 96-872 incluyendo el codón de detención. Como se utiliza en la presente, una referencia STEAP-l incluye todas las variantes del mismo, incluyendo aquellas mostradas en las Figuras 10, 11 y/o 12, a no ser que el contexto lo indique claramente de otro modo. Figuras 3A-3D. Muestran las secuencias de aminoácidos de STEAP-l v.l en la Figura 3A; ésta tiene 339 aminoácidos . La secuencia de aminoácidos de STEAP-l v.2 se muestra en la Figura 3B; ésta tiene 258 aminoácidos. La secuencia de aminoácidos de STEAP-l v.3 se muestra en la Figura 3C; ésta tiene 282 aminoácidos. La secuencia de aminoácidos de STEAP-l v.4 se muestra en la Figura 3D; ésta tiene 258 aminoácidos. Como se utiliza la presente, una referencia a STEAP-l incluye todas las variantes de la misma, incluyendo aquellas mostradas en las Figuras 10, 11 y/o 12 a no ser que el contexto lo indique claramente de otro modo. Figuras 4A-4C. Figura 4A. La alineación de la secuencia de aminoácidos de STEAP-l v.l con la proteína relacionada a la adiposis inducida por TNFa de ratón (gi/16905133) . Figura 4B. La alineación de la secuencia de aminoácidos de STEAP-l v.l con la proteína pHyde de rata (gi/21717655/) . Figura 4C. Muestra la homología de STEAP-l al antígeno epitelial transmembranal seis de ratón, de la próstata (gi | 20820492 | ) . Figuras 5A-5B. Perfil de hidrofilicidad de aminoácidos de la variante 1 de STEAP-1. Figura 5A. Perfil de hidrofilicidad de aminoácidos de la variante 3 de STEAP-l. Figura 5B, determinada por el análisis de secuencia por algoritmo de computadora, utilizando el método de Hopp y Woods (Hopp T.P., oods K.R., 1981, Proc. Nati. Acad. Sci.
EUA, 78: 3824-3828) accedido en el sitio de la red ProtScale localizado en la red mundial www. URLch/cgi .bin/protscale. pl) a través del servidor de biología molecular ExPasy. Figuras 6A-6B. Figura 6A. Perfil de aminoácidos de hidropaticidad de la variante 1 de STEAP-l. Figura 6B. Perfil de aminoácidos de hidropaticidad de la variante 3 de STEAP-l, determinada por el análisis de la secuencia por algoritmo de computadora utilizando el método de Kyte y Doolittle (Kyte J. , Doolittle R.F., 1982, J. Mol. Biol. 157: 105-132) accedida en el sitio de la red ProtScale localizado en la red mundial wwwURLexpasy . ch/cgi-bin/protscale .pl) a través del servidor de biología molecular ExPasy. Figuras 7A-7B. Figura 7A. Perfil del porcentaje del residuo de aminoácidos accesible de la variante 1 de STEAP-l. Figura 7B. Perfil porcentual de los residuos de aminoácidos accesibles de la variante 3 de STEAP-l, determinada por el análisis de la secuencia por algoritmo de computadora utilizando el método de Janin (Janin J. , 1979 Nature 277: 491-492) accedido en el sitio de la red ProtScale localizado en la red mundial www. URLexpasy. ch/cgi-bin/protscale .pl) a través del servidor de biología molecular ExPasy. Figuras 8A-8B. Figura 8A. Perfil de aminoácidos de flexibilidad promedio de la variante 1 de STEAP-l. Figura 8B. Perfil de aminoácidos de flexibilidad promedio de la variante 3 de STEAP-1, determinada por el análisis de la secuencia por algoritmo de computadora utilizando el método de Bhaskaran y Ponnuswamy (Bhaskaran R. , y Ponnuswamy P.K., 1988. Int. J. Pept. Protein. Res. 32: 242-255) accedida sobre el sitio de la red ProtScale localizado en la red mundial www. URLexpasy. ch/cgi-bin/protscale. pl) a través del servidor de biología molecular ExPasy. Figuras 9A-9B. Figura 9A. Perfil de aminoácidos de vuelta beta de la variante 1 de STEAP-l. Figura 9B. Perfil de aminoácidos de vuelta beta de la variante 3 de STEAP-l, determinada por el análisis de la secuencia por algoritmo de computadora utilizando el método de Deleage y Roux (Deleage, G., Roux B. 1987 Protein Engineering 21: 289-294) accedido en el sitio de la red ProtScale localizado en la red mundial www. URLexpasy. ch/cgi-bin/protscale .pl) a través del servidor de biología molecular ExPasy. Figura 10. Alineación esquemática de las variantes SNP de STEAP-l. Las variantes STEAP-l v.4 a la v.17 son variantes con diferencias de nucleótidos simples en comparación a STEAP-l v.2. Aunque estas variantes SNP son mostradas separadamente, éstas podrían también aparecer en cualesquiera combinaciones y en cualesquiera variantes del transcrito que contengan los pares de bases, por ejemplo, STEAP-l v.l y v.3. Los números corresponden a aquellos de STEAP-l v.2. El recuadro negro muestra la misma secuencia que STEAP-l v.2. Las SNPs son indicadas por arriba del recuadro. Figura 11. Composiciones de exón de las variantes del transcrito de STEAP-l. Esta figura muestra la estructura de las variantes del transcrito sin la cola poli A. Las variantes STEAP-l v.l, v.2 y v.3 son variantes de transcrito que comparten los mismos exones 2 y 3. El primer exón de STEAP-l v.l es 30 bases más corto en el extremo 5' que los primeros exones de las otras dos variantes del transcrito. El cuarto exón de STEAP-1 v.2 es el mismo que el exón 4, intrón 4 y exón 5 combinados de STEAP-l v.l. En comparación con STEAP-l v.l, la variante STEAP-l v.3 tiene un exón adicional empalmado fuera del intrón 4 del STEAP-l v.l. Las longitudes de los intrones y exones no son proporcionales. Figura 12. Alineación esquemática de las variantes de proteína de STEAP-l. Las variantes de proteína corresponden a las variantes nucleotídicas. Las variantes nucleotídicas STEAP-l v.5 a v.17 en la Figura 10 codifican para la misma proteína que STEAP-l v.2. Las proteínas traducidas a partir de las variantes de transcrito STEAP-l v.l y v.3 como se muestran en la Figura 11, pueden contener el aminoácido F (Phe) o L (Leu) en la posición 169. Diferencias de aminoácidos simples fueron indicadas por arriba de los recuadros. Los recuadros negros representan la misma secuencia que STEAP-l v.l. Los recuadros con diferentes patrones de relleno muestran diferentes secuencias. Los números por debajo del recuadro corresponden a STEAP-l v.l. Figuras 13A-13I. Figura 13A-C. Estructura secundaria y predicción de los dominios transmembranales para las variantes de la proteína STEAP-1. La estructura secundaria de la proteína STEAP-l variantes 1 (SEQ ID NO: 46), 2 (SEQ ID NO: 47) y 3 (SEQ ID NO: 48); las Figuras 13A- 13C, respectivamente) fueron predichas utilizando el método de Red Neural Jerárquica HNN por sus siglas en ingles (Guermeur, 1997, http://pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat .pl?page=npsa_nn. html) , accedida del servidor de biología molecular ExPasy localizado en la red mundial en (www.expasy.ch/tools/). Este método predice la presencia y localización de las hélices alfa, las hebras extendidas, y bucles aleatorios de la secuencia de proteína primaria. El porcentaje de la proteína en una estructura secundaria dada es también listado. Figuras 13D, 13F y 13H: representaciones esquemáticas de la probabilidad de existencia de regiones transmembranales y la orientación de las variantes 1-3 de STEAP-l, (Figuras 13D, 13F y 13H respectivamente, basadas en el algoritmo TMpred de Hofmann y Stoffel que utiliza TMBASE (K. Hofmann, W. Stoffel. TMBASE-A datábase of membrane spanning protein segments Biol. Chem. Hoppe-Seyler 374: 166, 1993). Figuras 13E, 13G y 131: representaciones esquemáticas de la probabilidad de la existencia de las regiones transmembranales y la orientación extracelular e intracelular de las variantes 1-3 de STEAP-l, las Figuras 13E, 13G y 131, respectivamente, con base en el algoritmo TMHMM de Sonnhammer, von Heijne, y Krogh (Erik L.L. Sonnhammer, Gunnar von Heijne y Anders Krogh: A Hidden Markov model for predicting transmembrane hélices in protein sequences. In Proc of Sixth Int. Conf. On Intelligent Systems for Molecular Biology, p. 175-182 Ed. J. Glasgow, T. Littlejohn, F. Major, R. Lathrop. D. Sankoff and C. Sensen Menlo Park, CA: AAAI Press, 1998) . Los algoritmos TMpred y TMHMM son accedidos del servidor de biología molecular ExPasy localizados en la Red Mundial en (www.expasy.ch/tools/). Figuras 14A-14F. Figura 14A. Expresión de STEAP-l en espécimen de paciente con cáncer de estómago. El RNA fue extraído del estómago normal (N) y de 10 diferentes especímenes (T) de pacientes con cáncer de estómago. El análisis de Northern blot con 10 µg de RNA total/banda fue sondeado con la secuencia STEAP-l. Los resultados muestran una fuerte expresión de un STEAP-l de aproximadamente 1.6 kb en los tejidos de tumor de estómago. El panel inferior representa la tinción con bromuro de etidio del manchado de transferencia que muestra la calidad de las muestras del RNA. Figura 14B. Expresión de STEAP-l en tejidos de pacientes con cáncer de recto. El RNA fue extraído del recto normal (N) , tumores de pacientes con cáncer de recto (T) , y metástasis de cáncer de recto (M) . Los análisis de Northern blot o transferencia de Northern con 10 µg del RNA total fueron sondeados con la secuencia STEAP-l. Los resultados muestran una fuerte expresión de STEAP-l en los tejidos de pacientes con cáncer de recto. El panel inferior representa la tinción con bromuro de etidio de la transferencia que muestra la calidad de las muestras de RNA. Figura 14C. Expresión de STEAP-l en células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC) . El cDNA de primera hebra fue preparado a partir de las células HUVEC, xenoinjertos de cáncer de próstata LAPC-4AD y LAPC-9AD, así como de tejidos cerebrales humanos. La normalización fue realizada mediante PCR utilizando los cebadores para la actina y GAPDH. La PCR semi-cuantitativa, utilizando los cebadores para STEAP-l, se realizó a 27 y 30 ciclos de amplificación (Figura 14A) . Como un control, la PCR utilizando los cebadores para la actina se muestra en (Figura 14B) . Los resultados muestran una fuerte expresión de STEAP-l en células HUVEC similar a la expresión detectada en tejidos de xenoinjerto de cáncer de próstata. La expresión de STEAP-l en las células HUVEC indica que la dirección de STEAP-1 puede también dirigirse a las células endoteliales de la neovasculatura de los tumores. Figura 14D y Figura 14E. Expresión de STEAP-l en Tejidos Normales y Cancerosos. El cDNA de primera hebra fue preparado a partir de tejidos normales (vejiga, cerebro, corazón, riñon, hígado, pulmón, próstata, bazo, músculo esquelético, testículo, páncreas, colon y estómago) , y de los combinados de especímenes de pacientes con cáncer (combinado de cáncer de próstata, combinado de cáncer de vejiga, combinado de cáncer de riñon, combinado de cáncer de colon, combinado de cáncer de pulmón, combinado de cáncer de ovario, combinado de cáncer de mama, combinado de metástasis de cáncer, combinado de cáncer de páncreas, combinado del xenoinjerto de cáncer de próstata y combinado de la metástasis de la próstata a los nodulos linfáticos) . La normalización fue realizada mediante PCR utilizando los cebadores para la actina. La PCR semi-cuantitativa, utilizando los cebadores para STEAP-l, fue realizada a 26 y 30 ciclos de amplificación. En la (Figura 14d) se muestra la imagen de agarosa de RT-PCR. En la (Figura 14E) los productos de PCR fueron cuantificados utilizando el software Alphalmager. Los resultados muestran una fuerte expresión de STEAP-1 en próstata normal entre todos los tejidos normales probados. La suprarregulación de la expresión de STEAP-l fue detectada en el combinado de cáncer de próstata, combinado de cáncer de vejiga, combinado de cáncer de riñon, combinado de cáncer de colon, combinado de cáncer de pulmón, combinado de cáncer de ovario, combinado de cáncer de mama y combinado de cáncer pancreático. Fue detectada una fuerte expresión de STEAP-l en el combinado de metástasis del cáncer, combinado del xenoinjerto del cáncer de próstata, y metástasis de próstata a los nodulos linfáticos. Figura 14F: Expresión de STEAP-l en especímenes de pacientes con linfoma. El cDNA de primera hebra fue preparado a partir de un panel de especímenes de pacientes con linfoma. La normalización fue realizada mediante PCR utilizando los cebadores para la actina. La PCR semi-cuantitativa, utilizando los cebadores para STEAP-l, se realizó a 26 y 30 ciclos de amplificación. Las muestras fueron corridas sobre un gel de agarosa, y los productos de PCR fueron cuantificados utilizando el software Alphalmager. La expresión fue registrada como fuerte o media, si la señal es detectada como 26 ó 30 ciclos de amplificación respectivamente, y ausente si no se detecta señal incluso a 30 ciclos de amplificación. Los resultados muestran la expresión de STEAP-l en 8 de 11 (72.7%) especímenes tumorales probados . Figura 15. Tinción Específica de la Superficie Celular de STEAP-l por el MAb M2/92.30. Paneles izquierdos: análisis de FACS de las células recombinantes 3T3 y Ratl que expresan establemente ya sea STEAP-l (líneas oscuras) y un gen de control de resistencia a la neomicina (líneas claras) teñido con el MAb M2/92.30 anti-STEAP (10 µg/ml) y el MAb enlazado a la superficie celular fue detectado con un reactivo secundario conjugado de PE-IgG de cabra anti-ratón.
Las células teñidas fueron luego sometidas a análisis FACS. Como se indica por el desplazamiento fluorescente de las células Ratl-STEAPl y 3T3-STEAP1 en comparación a las células control respectivas, el MAb M2/92.30 se enlaza específicamente a STEAP-l de la superficie celular. Panel derecho: microscopía fluorescente de las células 3T3-STEAP1 teñidas con el MAb M2/92.30 que muestran la fluorescencia brillante de las superficies celulares. Figura 16. El MAb M2/92.30 de STEAP1 Reconoce STEAP-l en la Superficie Celular sobre Xenoinjertos de Cáncer de Próstata Humano. Células de cáncer de próstata LAPC9 fueron teñidas con 10 µg/ml ya sea del MAb M2/92.30 o con un MAb control anti-KLH. El MAb enlazado a la superficie fue detectado con el anticuerpo secundario conjugado PE-IgG de cabra anti-ratón. Las células teñidas fueron luego sometidas a análisis de FACS. Estos resultados demuestran que el MAb M2/120.545 anti-STEAPl se enlaza específicamente a STEAP1 endógeno de la superficie celular expresa?o en las células de xenoinjerto de cáncer de próstata. Figura 17. El MAb M2/92.30 de STEAP1 Reconoce STEAP-l de Ratón. Las células 293T fueron transitoriamente transfectadas ya sea con pCDNA3.1 que codifica para el cDNA de STEAPl murino o con un vector vacío. 2 días después, las células fueron cosechadas y teñidas con el MAb M2/92.30 anti- STEAP1 (10 µg/ml) y el MAb enlazado a la superficie celular fue detectado con el reactivo secundario conjugado de PE-IgG de cabra anti-ratón. Las células fueron luego sometidas a análisis de FACS. Como se indica por el desplazamiento fluorescente de las células 293T transfectadas con STEAPl murino, en comparación a las células transfectadas con el vector vacío, el MAb M2/92.30 se enlaza específicamente a la proteína STEAPl murina. Figuras 18A-18C. STEAP1/ MAb 120.545 reconoce STEAP-l de la superficie celular. Figura 18A y Figura 18B. Células 3T3-neo (A, histrogramas rellenos) y 3T3-STEAP1 (A, histogramas sin relleno) y las células Ratl-neo (B, histogramas rellenos) y células Ratl-STEAP (B, histrogramas sin relleno) fueron teñidas con el MAb M2/120.545 (10 µg/ml) y el MAb enlazado a la superficie fue detectado con el anticuerpo secundario conjugado PE-IgG de cabra anti-ratón. Las células fueron luego sometidas a análisis de FACS. Como se indica por el desplazamiento de fluorescencia de las células 3T3-STEAP1 y Ratl-STEAPl en comparación a sus respectivos controles neo, el MAb M2/120.545 se enlaza específicamente a STEAP1 de la superficie celular. Panel C. Células LNCaP fueron teñidas ya sea con el MAb M2/120.545 o con un MAb control anti-KLH, y sometidas a análisis de FACS como se describe anteriormente. Panel D. Microscopía de fluorescencia de las células LNCaP teñidas con M2/120.545 que muestran la fluorescencia brillante de la superficie celular. Estos resultados demuestran que el MAb M2/120.545 se enlaza específicamente a STEAP1 de la superficie celular endógeno, en células LNCaP. Figuras 19A-19D. Figura 19A. El cDNA (SEQ ID NO: 49) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 50) de M2/X92.30 VH clon #2. Figura 19B. El cDNA (SEQ ID NO: 51) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 52) de M2/X92.30 VL clon #2. Figura 19C. El cDNA (SEQ ID NO: 53) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 54) de M2/X92.30 VL clon #6. Figura 19D. El cDNA (SEQ ID NO: 55) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 56) de M2/X120.545 VL clon #8. Figuras 20A-20E. Figura 20A. La secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 57) de M2/X92.30 clon #2. Figura 20B. La secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 58) de M2/X92.30 VL clon 32. Figura 20C. La secuencia de cDNA (SEQ ID NO: 59) y de aminoácidos (SEQ ID NO: 60) de M2/X92.30 VL clon #6. Figura 20D. Alineación de aminoácidos de M2/X92.30 VL clon #2 (SEQ ID NO: 61) y M2/M92.30 VL clon #6 (SEQ ID NO: 62) . Figura 20E. La secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 63) de M2/X120.545 VL clon #8. La secuencia del péptido de señal está subrayada.
Figura 21. El MAb M2/92.30 de STEAP1 Reconoce STEAP-l de la Superficie Celular sobre Xenoinjertos de Cáncer Humano de Próstata y Vejiga. Las células de cáncer de vejiga UGB1 (panel izquierdo) y las células de cáncer de próstata LAPC9 (panel derecho) fueron teñidas con 10 µg/ml del MAb M2/9230 o con un MAb control anti-KLH. El MAb enlazado a la superficie fue detectado con el anticuerpo secundario conjugado PE-IgG de cabra anti-ratón. Las células teñidas fueron sometidas a análisis de FACS. Estos resultados demuestran que el MAb M2/92.30 anti-STEAP-1 se enlaza específicamente a STEAP1 endógeno de la superficie celular, expresado en las células de xenoinjerto de cáncer de vejiga y de próstata. Figura 22. Internalización de STEAP-l por MAb STEAP-1/92.30. Las células 3T3-STEAP1 fueron teñidas a 4°C con el MAb M2/92.30 (10 µg/ml), lavadas, luego incubadas con el anticuerpo secundario conjugado PE-IgG de cabra anti-ratón a 4°C. La mitad de las células fueron movidas a 37 °C por 30 minutos y la otra mitad permaneció a 4°C. Las células para cada tratamiento fueron luego sometidas a microscopía de fluorescencia. Las células que permanecieron a 4°C mostraron fluorescencia brillante de la superficie celular "en forma de anillo". Las células que fueron movidas a 37 °C mostraron pérdida de la fluorescencia de la superficie celular "en forma de anillo" y la apariencia de la fluorescencia punteada y agregada fué indicadora del encasquetamiento y la internalización. Figura 23. Internalización de STEAP-l mediante el MAb M2/120.545 de STEAPl. Las células PC3-STEAP1 fueron teñidas a 4°C con el MAb M2/120.545 (10 µg/ml), lavadas, luego incubadas con el anticuerpo secundario conjugado PE-IgG de cabra anti-ratón. La mitad de las células fueron movidas a 37 °C por 30 minutos y la otra mitad permaneció a 4°C. Las células provenientes de cada tratamiento fueron luego sometidas a microscopía de fluorescencia. Las células que permanecieron a 4°C mostraron fluorescencia brillante en la superficie celular "en forma de anillo". Las células que se movieron a 37 °C mostraron pérdida de la fluorescencia de la superficie celular "en forma de anillo" y la apariencia de la fluorescencia punteada y agregada indicadora del encasquetamiento y la internalización. Figura 24. Internalización de STEAP-l. Conjugados de saporina-IgG anti-ratón (Advanced Targeting Systems, San Diego, CA) se utilizó para demostrar que STEAP-1-M2/120.545 murino entra a las células objetivo por medio de la expresión de STEAP-l sobre la superficie de las células LNCaP. Se utilizaron los siguientes protocolos. Las células LNCaP fueron sembradas en placa a 5000 células/90 µl/pozo en placas de 96 pozos y se incubaron toda la noche. Conjugados de inmunotoxina secundarios (saporina-IgG anti-ratón y saporina- IgG anti-cabra) o IgG anti-ratón se elaboraron en el medio de cultivo de células para producir una concentración final de 100 ng/ml. El anticuerpo primario fue agregado a concentraciones en el intervalo de 1 a 1000 ng/ml. Las placas fueron incubadas por 72 horas y la viabilidad fue determinada mediante el ensayo de MTT. Los resultados muestran que las células LNCaP fueron muertas en presencia de M2/120.545 y saporina-IgG anti-ratón. No fueron detectados efectos ya sea con el anticuerpo secundario solo (IgG antiratón) o los conjugados de anticuerpo secundarios no específicos (saporina-IgG anti-cabra) . No se observó toxicidad con el anticuerpo primario (M2/120.545) solo, probado hasta 1 µg/ml. Figura 25. Inmunoprecipitación de STEAP1 por los MAbs M2/92.30 y M2/120.545 anti-STEAP-1. Las células 3T3-STEAPl y 3T3-neo fueron Usadas en amortiguado RIPA (Tris-HCl 25 mM, pH 7.4; NaCl 150 mM, EDTA 0.5 mM, 1% de Tritón X-100, 0.5% de ácido desoxicólico, 0.1% de SDS y cóctel inhibidor de proteasa) . Los lisados celulares fueron preaclarados con esferas de proteína G sefarosa y luego incubadas con 5 µg ya sea del MAb M2/92.30 o del MAb M2/120.545 por 2 horas a temperatura ambiente. Las esferas de proteína G fueron agregadas y la mezcla fue adicionalmente incubada por 1 hora. Los complejos inmunes fueron lavados y solubilizados en el amortiguador de muestra de SDS-PAGE. Las muestras solubilizadas fueron luego sometidas a SDS-PAGE y análisis de Western blot utilizando un pAb de conejo anti-STEAP. Los lisados de células enteras de las células 293T transfectadas con STEAPl, fueron también corridos como un control positivo. Una banda inmunorreactiva de aproximadamente 37 kD fue observada únicamente en las muestras derivadas de las células 3T3-STEAP1, indicador de la inmunoprecipitación específica de STEAP1 por los MAbs M2/92.30 y M2/120.545. Figura 26. Efecto de los MAbs de STEAP-l sobre el Crecimiento de los Xenoinjertos de Cáncer de Próstata Humana LAPC9, en Ratones. STEAP-l M2/92.30 y M2/120.545 fueron probadas a dos diferentes dosis de 100 µg y 500 µg. Se utilizaron como controles PBS y el MAb anti-KLH. El grupo de estudio consistió de 6 grupos con 10 ratones en cada grupo.
Los MAbs fueron dosificados intraperitonealmente dos veces a la semana por un total de 12 dosis, comenzando el mismo día que la inyección de las células tumorales. El tamaño del tumor fue monitorizado a través de mediciones con calibrador dos veces a la semana. La dimensión más larga (L) y la dimensión perpendicular a ésta (W) fueron tomadas para calcular el volumen tumoral utilizando la fórmula: W2 x L/2. La concentración de PSA en suero en el día 40 del tratamiento para cada animal se midió utilizando el equipo comercial de ELISA. Se utilizaron la prueba de Kruskal-Wallis y la prueba de U de Mann-Whitney para evaluar la diferencia del crecimiento tumoral y el nivel de PSA entre grupos. Todas las pruebas fueron de dos lados con a=0.5. Los datos muestran que STEAP-l M2/92.30 y M2/120.545 retardan I significativamente el crecimiento del xenoinjerto de próstata humana en un tumor dependiente de la dosis. Figura 27. Efecto de los MAbs de STEAP-l sobre el Crecimiento de los Xenoinjertos de Cáncer de Próstata Humana LAPC9, en Ratones. STEAP-l M2/92.30 y M2/120.545 fueron probadas a dos diferentes dosis de 100 µg y 500 µg. Se utilizaron como controles PBS y el MAb anti-KLH. El grupo de estudio consistió de 6 grupos con 10 ratones en cada grupo. Los MAbs fueron dosificados intraperitonealmente dos veces a la semana por un total de 12 dosis, comenzando el mismo día que la inyección de las células tumorales. El tamaño del tumor fue monitorizado a través de mediciones con calibrador dos veces a la semana. La dimensión más larga (L) y la dimensión perpendicular a ésta (W) fueron tomadas para calcular el volumen tumoral utilizando la fórmula: W2 x L/2. La concentración de PSA en suero en el día 40 del tratamiento para cada animal se midió utilizando el equipo comercial de ELISA. Se utilizaron la prueba de Kruskal-Wallis y la prueba de U de Mann-Whitney para evaluar la diferencia del crecimiento tumoral y el nivel de PSA entre grupos. Todas las pruebas fueron de dos lados con a=0.5. Los datos muestran que STEAP-l M2/92.30 y M2/120.545 retardan significativamente el crecimiento del xenoinjerto de próstata humana en un tumor dependiente de la dosis. Figura 28. Fosforilación de ERK-1 y ERK-2 Inducida por STEAP-l. Paneles izquierdos: las células PC3 fueron transfectadas con el gen de resistencia a la neomicina solo, o con STEAP-l en el vector pSRa. Las células fueron desarrolladas toda la noche en FBS al 0.5%, luego estimuladas con FBS al 10% por 5 minutos, con o sin 10 µg/ml del inhibidor de MEK PD98058. Los lisados celulares fueron resueltos mediante SDS-PAGE al 12.5% y sometidos a transferencia de Western (Western blot) con un anticuerpo anti-fosfo-ERK (Cell Signaling) y anti-ERK (Zymed) . Paneles derechos: células NIH 3T3 fueron transfectadas con el gen de la resistencia a la neomicina, solo o con STEAP-l en el vector pSRa. Las células fueron tratadas como se describe anteriormente pero sin el inhibidor de MEK. Además, las células NIH-3T3-neo fueron tratadas con 10 mg/ml de salicilato de sodio. La expresión de STEAP-l induce la fosforilación de ERK-1 y ERK-2 en suero, y fue inhibida por el inhibidor PD98058 de la cinasa MEK corriente arriba (5' ) .
Figura 29. STEAP-1 es Mediador de la Comunicación Célula-Célula. Las células PC3 fueron transfectadas con el gen de la resistencia a la neomicina, solo o con STEAP-1 o un gen control en el vector pSRa. Las células recipientes fueron marcadas con 1 mg/ml de dextrano-Rojo Texas y las células donadoras fueron marcadas con 2.5 µg/ml de calceína AM. Las células donadoras (verdes) y recipientes (rojas) fueron co-cultivadas a 37 °C por 18-24 horas y analizadas mediante microscopía para la co-localización de los colorantes fluorescentes. Panel izquierdo: células PC3-Neo fueron utilizadas como donadoras y recipientes. Panel central: células PC3-STEAP-1 fueron utilizadas como donadoras y recipientes. Panel derecho: células control PC3 fueron utilizadas como donadoras y recipientes. STEAP-l indujo la transferencia de la calceína a las células que contienen dextrano-Rojo Texas, indicando que STEAP-l facilita la comunicación célula-célula. Figura 30. La Comunicación Celular Requiere Expresión de STEAP-l sobre las Células Donadoras y Recipientes. Las células PC3 fueron transfectadas con el gen de resistencia a la neomicina solo, o con STEAP-l en el vector pSRa. Las células recipientes fueron marcadas con 1 mg/ml de dextrano-Rojo Texas, y las células donadoras fueron marcadas con 2.5 µg/ml de calceína AM. Las células donadoras (verdes) y recipientes (rojas) fueron co-cultivadas a 37 °C por 18-24 horas y analizadas mediante microscopía para la co-localización de los colorantes fluorescentes. Paneles superiores: microscopía de luz; paneles inferiores; fluorescencia de UV. Paneles izquierdos: células PC3-Neo fueron donadoras y recipientes. Paneles centrales: PC3-Neo fueron células donadoras y PC3-STEAP-1 fueron recipientes. Paneles derechos: las células PC3-STEAP-1 fueron donadoras y recipientes. Únicamente cuando fue expresado STEAP-l sobre las células donadoras y recipientes, fue detectada la comunicación célula-célula. Figura 31. Efecto del MAb STEAP-1/120.545 sobre la Unión de Espacio Vacío. Las células PC3 fueron transfectadas con el gen de resistencia a la neomicina, solo o con STEAP-l en el vector pSRa. Las células recipientes fueron marcadas con 1 mg/ml de dextrano-Rojo Texas y las células donadoras fueron marcadas con 2.5 µg/ml de calceína AM. Las células donadoras (verdes) y recipientes (rojas) fueron co-cultivadas a 37 °C por 18-24 horas- y analizadas mediante microscopía para la co-localización de los colorantes fluorescentes. En todos los experimentos, las mismas células fueron utilizadas como donadoras y aceptoras . Las células fueron incubadas con las cantidades indicadas del MAb STEAP-1/120.545 por 10 minutos, antes de la siembra en placas y el MAb fue mantenido en el cultivo por 24 horas antes del análisis. STEAPl/120.545 reduce la unión de espacio vacío mediada por STEAP-l de una manera dependiente de la dosis. Figura 32. Inhibición de la Fosforilación de ERK-1 y ERK-2 por el MAb de STEAP-l y el RNAi. Las células PC3 fueron transfectadas con el gen de resistencia a la neomicina, solo o con STEAP-l, y el MAb en el vector pSRa. Para la eliminación del gen de RNAi, las células PC3-STEAP-1 fueron establemente transfectadas con un vector pPUR-U6-27-STEAP-l que contenía el siRNA para STEAP-l. Las células fueron privadas de alimento en 0.1% de FBS por 18 horas a 37 °C, colocadas sobre hielo por 10 minutos con o sin 10 µg/ml del MAb M2/92.30, llevadas a la temperatura ambiente por 3 minutos y luego estimuladas con 10% de FBS por 5 minutos. Las células fueron usadas en amortiguador RIPA, cuyos lisados celulares se resolvieron por SDS-PAGE al 12.5% y las proteínas fueron detectadas mediante transferencia de Western (Western blot). Se detectó fosfo-ERK con antisuero de conejo (Cell Signaling) y ERK fue detectado con el anti-ERK de conejo (Zymed). STEAP-l fue detectada con el anticuerpo anti-STEAP-1 de oveja, y la actina fue detectada con el MAb anti-actina (Santa Cruz) . La fosforilación de ERK-1 y ERK-2 fueron ambas inducidas por suero al 10%, y fueron inhibidas por el MAb M2/92.30 y el siRNA para STEAP-l.
Figura 33. Efecto del RNAi de STEAP-1 sobre la Comunicación Célula-Célula. Las células PC3 fueron transfectadas con el gen de resistencia a la neomicina solo, o con STEAP-l en el vector pSRa. Para la inactivación del gen de RNAi, las células PC3-STEAP-1 fueron establemente transfectadas con un vector pPUR-U6-27-STEAP-l que contenía siRNA para STEAP-l, o un vector vacío. Las células recipientes fueron marcadas con 1 mg/ml de dextrano-Rojo Texas, y las células donadoras fueron marcadas con 2.5 µg/ml de calceína AM. Las células donadoras (verdes) y recipientes (rojas) fueron co-cultivadas a 37°C por 18-24 horas, y analizadas mediante microscopía para la co-localización délos colorantes fluorescentes. En todos los experimentos, fueron utilizadas las mismas células como donadoras y aceptoras . El RNAi de STEAP-l, específico, establemente expresado en las células PCE-STEAP-1 reduce la comunicación célula-célula inducida por STEAP-l.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Descripción de las Secciones I . ) Definiciones II.) Polinucleótidos de STEAP-l II.A) Usos de los Polinucleótidos de STEAP-l II.A.l.) Monitoreo de las Anormalidades Genéticas II.A.2.) Modalidades Antisentido II.A.3.) Cebadores y Pares de Cebadores II.A.4.) Aislamiento de las Moléculas de Ácido Nucleico que Codifican para STEAP-l II. .5.) Moléculas de Ácido Nucleico Recombinantes y Sistemas Hospederos de un Vector III.) Proteínas Relacionadas a STEAP-l III.A.) Modalidades de Proteína que llevan la Porción III. B.) Expresión de las Proteínas relacionadas a STEAP-1 III. C.) Modificación de las Proteínas relacionadas a STEAP- 1 III. D.) Usos de las Proteínas relacionadas a STEAP-l IV.) Anticuerpos para STEAP-1 V. ) Respuestas Inmunes Celulares de STEAP-l VI.) Animales Transgénicos de STEAP-l VII.) Métodos para la Detección de STEAP-l VIII.) Métodos para el Monitoreo del Estado de los Genes relacionados a STEAP-l y Sus productos IX.) Identificación de las Moléculas que Interactúan con STEAP-l X.) Métodos Terapéuticos y Composiciones X.A.) Vacunas Anti-Cáncer X.B.) STEAP-l como un Objetivo para la Terapia Basada en Anticuerpo X.C.) STEAP-l como un Objetivo para las Respuestas Inmunes Celulares X.C.l.) Vacunas de Minigenes X.C.2.) Combinaciones de los Péptidos CTL con Péptidos Cooperadores X.C.3.) Combinaciones de los Péptidos CTL con los Agentes de Aprestamiento de Células T X.C.4.) Composiciones de Vacuna que Comprenden DC Pulsada con los Péptidos CTL y/o HTL X.D.) Inmunoterapia Adoptiva X.E.) Administración de Vacunas para Fines Terapéuticos o Profilácticos XI.) Modalidades de Diagnóstico y de Pronóstico de STEAP-1 XII.) Inhibición de la Función de la Proteína STEAP-l XII.A.) Inhibición de STEAP-l con Anticuerpos Intracelulares XII. B.) Inhibición de STEAP-l con Proteínas Recombinantes XII. C.) Inhibición de la Transcripción o la Traducción de STEAP-l XII. D.) Consideraciones Generales para las Estrategias Terapéuticas XIII.) Identificación, Caracterización y Uso de los Moduladores de STEAP-1 XIV. ) RNAi y Uso Terapéutico de los RNA de Interferencia Pequeños (siRNAs) XV. ) Equipos/Artículos de Fabricación I.) Definiciones A no ser que se defina de otro modo, todos los términos de la técnica, notaciones y otros términos o terminología científica utilizados en la presente, están destinados a tener los significados comúnmente entendidos por aquellos de experiencia en la técnica a la cual pertenece esta invención. En algunos casos, los términos con significados comúnmente entendidos son definidos en la presente para claridad y/o para una fácil referencia, y la inclusión de tales definiciones en ' la presente no debe ser necesariamente considerada como representante de una diferencia sustancial sobre lo que es comprendido en general en la técnica. Muchas de las técnicas y procedimientos descritos o referidos aquí son bien entendidos y comúnmente empleados utilizando metodología convencional conocida por aquellos expertos en la técnica, tales como, por ejemplo, las metodologías de clonación molecular ampliamente utilizadas descritas en Sammbrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2a Edición (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Col Spring Harbor, N.Y. Como es apropiado, los procedimientos que involucran el uso de equipos y reactivos comercialmente disponibles, son en general llevados a cabo de acuerdo con los protocolos y/o parámetros definidos por los fabricantes, a no ser que se indique de otro modo. Los términos "cáncer de próstata avanzado", "cáncer de próstata localmente avanzado", "enfermedad avanzada" y "enfermedad localmente avanzada" significan cánceres de próstata que se han extendido a través de la cápsula de la próstata, y se entiende que incluyen la enfermedad en etapa C bajo el sistema de la Asociación Urológica Norteamericana (American Urological Association (AUA) , la enfermedad en etapa C1-C2 bajo el sistema de Whitmore-Jewett, y la enfermedad en etapa T3-T4 y N+ bajo el sistema TNM (tumor, nodo, metástasis) . En general, la cirugía no es recomendada para pacientes con enfermedad localmente avanzada, y estos pacientes tienen sustancialmente resultados menos favorables en comparación a los pacientes que tienen cáncer de próstata clínicamente localizado (confinado al órgano) . La enfermedad localmente avanzada es clínicamente identificada por evidencia palpable de la induración más allá del límite lateral de la próstata, o asimetría o induración por arriba de la base de la próstata. El cáncer de próstata localmente avanzado es actualmente diagnosticado patológicamente después de la prostatectomía radical si el tumor invade o penetra la cápsula prostática, se extiende dentro del margen quirúrgico, o invade las vesículas seminales. "Alteración del patrón de glucosilación nativo" está destinado, para los fines de la presente invención, a significar la supresión de una o más porciones de carbohidratos encontradas en la secuencia nativa de STEAP-l (ya sea por eliminación del sitio de glucosilación subyacente o por supresión de la glucosilación por medios químicos y/o enzimáticos) , y/o la adición de uno o más sitios de glucosilación que no están presentes en la secuencia nativa de STEAP-l. Además, la frase incluye los cambios cualitativos en la glucosilación de las proteínas nativas, involucrando un cambio en la naturaleza y en las proporciones de las diversas porciones de carbohidratos presentes. El término "análogo" se refiere a una molécula que es estructuralmente similar o que comparte atributos similares o correspondientes con otra molécula (por ejemplo, como una proteína relacionada STEAP-l) . Por ejemplo, un análogo de una proteína STEAP-l puede ser específicamente enlazado por un anticuerpo o célula T que se enlaza específicamente a STEAP-l. El término "anticuerpo" se utiliza en el sentido más amplio, a no ser que se indique claramente de otro modo. Por lo tanto, un "anticuerpo" puede ser de origen natural o hecho por el hombre, tales como los anticuerpos monoclonales producidos mediante tecnología de^ hibridoma convencional. Los anticuerpos anti-STEAP-1 comprenden anticuerpos monoclonales y policlonales así como fragmentos que contienen el dominio de enlace al antígeno y/o una o más regiones de determinación de la complementariedad de estos anticuerpos. Como se utiliza en la presente, el término "anticuerpo" se refiere a cualquier forma de anticuerpo o fragmento del mismo que se enlaza específicamente a STEAP-l y/o que muestre la actividad biológica deseada y que cubra específicamente los anticuerpos monoclonales (incluyendo los anticuerpos monoclonales de longitud completa) , anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo anticuerpos biespecíficos) , y fragmentos de anticuerpo, siempre y cuando éstos se enlacen específicamente a STEAP-1 y/o muestren la actividad biológica deseada. Puede ser utilizado cualquier anticuerpo específico en los métodos y composiciones proporcionados en la presente. De este modo, en una modalidad el término "anticuerpo" abarca una molécula que comprende al menos una región variable proveniente de una molécula de inmunoglobulina de cadena ligera y al menos una región variable proveniente de una molécula de cadena pesada, que en combinación forman un sitio de enlace específico para el antígeno diana u objetivo. En una modalidad, el anticuerpo es un anticuerpo IgG. Por ejemplo, el anticuerpo es un anticuerpo IgG?, IgG2, IgG3 o IgG . Los anticuerpos útiles en los presentes métodos y composiciones, pueden ser generados en cultivo celular, en fagos, o en diversos animales, incluyendo pero no limitados a vacas, conejos, cabras, ratones, ratas, hámsteres, cobayos, ovejas, perros, gatos, monos, chimpancés, y micos. Por lo tanto, en una modalidad, un anticuerpo de la presente invención es un anticuerpo de mamífero. Las técnicas de fago pueden ser utilizadas para aislar un anticuerpo inicial o para generar variantes con características alteradas de especificidad o de avidez. Tales técnicas son rutinarias y bien conocidas en la materia. En una modalidad, el anticuerpo es producido por medios recombinantes conocidos en la materia. Por ejemplo, un anticuerpo recombinante puede ser producido mediante la transfección de una célula hospedera con un vector que comprende una secuencia de ADN y que codifica para el anticuerpo. Uno o más vectores pueden ser utilizados para transfectar la secuencia de ADN que expresa al menos una región VL y una región VH en la célula hospedera. Las descripciones ejemplares de los medios recombinantes de la generación de anticuerpo y la producción del mismo incluyen Delves, ANTIBODY PRODUCTION: ESSENTIAL TECHNIQUES (Wiley, 1997); Shepard, et al., MONOCLONAL ANTIBODIES (Oxford University Press, 2000); Goding, MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND PRACTICE (Academic Press, 1993); CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY (John Wiley & Sons, la edición más reciente) . Un anticuerpo de la presente invención puede ser modificado por medios recombinantes para incrementar la eficacia del anticuerpo en la mediación de la función deseada. De este modo, está dentro del alcance de la invención que los anticuerpo puedan ser modificados mediante sustituciones utilizando medios recombinantes. Típicamente, las sustituciones serán sustituciones conservadoras. Por ejemplo, al menos un aminoácido en la región constante del anticuerpo puede ser reemplazado con un residuo diferente. Ver, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos No. 5,624,821, la Patente de los Estados Unidos No. 6,194,551, Solicitud No. WO 9958572; y Angal et al., Mol . Immunol . 30: 105-08 (1993) . La modificación en los aminoácidos incluye supresiones, adiciones, sustituciones de aminoácidos. En algunos casos, tales cambios son realizados para reducir las actividades no deseadas, por ejemplo, citotoxicidad dependiente del complemento. Frecuentemente, los anticuerpos son marcados por enlace, ya sea covalente o no covalentemente, de una sustancia que proporciona una señal detectable. Una amplia variedad de marcadores y técnicas de conjugación son conocidas, y son reportadas extensamente en la literatura científica y de patentes. Estos anticuerpos pueden ser seleccionados para el enlace a STEAP-l normal o defectuosa. Ver, por ejemplo, ANTIBODY ENGINEERING: A PRACTICAL APPROACH (Oxford University Press, 1996) . Los anticuerpos adecuados con las actividades biológicas deseadas pueden ser identificados mediante los siguientes ensayos in vitro, incluyendo pero no limitados a: proliferación, migración, adhesión, crecimiento en agar suave, angiogénesis, comunicación célula-célula, apoptosis, transporte, transducción de señales, y los siguientes ensayos in vivo tales como la inhibición del crecimiento tumoral. Los anticuerpos proporcionados en la presente pueden también ser útiles en aplicaciones de diagnóstico. Como anticuerpos de captura o no neutralizadores, éstos pueden ser seleccionados para la habilidad de enlazarse al antígeno específico sin inhibir el enlace al receptor o la actividad biológica del antígeno. Como anticuerpos neutralizadores, los anticuerpos pueden ser útiles en ensayos de enlace competitivos. Éstos pueden ser también utilizados para cuantificar el STEAP-l o su receptor. Un "fragmento de anticuerpo" es definido -al menos como una porción de la región variable de la molécula de inmunoglobulina que se enlaza a su objetivo, por ejemplo, la región de enlace al antígeno. En una modalidad, éste cubre específicamente los anticuerpos simples anti-STEAP-1 y los clones de los mismos (incluyendo anticuerpos agonistas, antagonistas y neutralizadores) y composiciones de anticuerpo anti-STEAP-1 con especificidad poliepitópica. El anticuerpo de los presentes métodos y composiciones puede ser monoclonal o policlonal. Un anticuerpo puede estar en la forma de un fragmento de anticuerpo de enlace al antígeno que incluye un fragmento Fab, fragmento F(ab')2, una región variable de cadena simple, y similares. Los fragmentos de moléculas intactas pueden ser generados utilizando métodos bien conocidos en la materia que incluyen la digestión enzimática y medios recombinantes. Como se utiliza en la presente, cualquier forma del "antígeno" puede ser utilizada para generar un anticuerpo que sea específico para STEAP-l. De este modo, el antígeno promotor puede ser un epitopo simple, epitopos múltiples, o la proteína entera, sola o en combinación con uno o más agentes aumentadores de la inmunogenicidad, conocidos en la técnica. El antígeno promotor puede ser una proteína aislada de longitud completa, una proteína de la superficie celular (por ejemplo, la inmunización con células transfectadas con-al menos una porción del antígeno) , o una proteína soluble (por ejemplo, la inmunización únicamente con la porción del dominio extracelular de la proteína) . El antígeno puede ser producido en una célula genéticamente modificada. El DNA que codifica para el antígeno puede ser genómico o no genómico (por ejemplo, cDNA) y codifica para al menos una porción del dominio extracelular. Como se utiliza en la presente, el término "porción" se refiere al número mínimo de aminoácidos o ácidos nucleicos, como sea apropiado, para constituir un epitopo inmunogénico del antígeno de interés. Cualesquiera vectores genéticos adecuados para la transformación de las células de interés pueden ser empleados, incluyendo pero no limitados a vectores adenovirales, plásmidos, y vectores no virales, tales como los lípidos catiónicos. En una modalidad, el anticuerpo de los métodos y las composiciones en la presente se enlaza específicamente al menos a una porción del dominio extracelular de la STEAP-l de interés. Los anticuerpos o fragmentos de enlace al antígeno de los mismos, proporcionados en la presente, pueden ser conjugados a un "agente bioactivo". Como se utiliza en la presente, el término "agente bioactivo" se refiere a cualquier compuesto sintético o de origen natural que se enlace al antígeno y/o que se aumente o sea mediador de un efecto biológico deseado para mejorar las toxinas que matan células . En una modalidad, los fragmentos de enlace útiles en la presente invención, son fragmentos biológicamente activos. Como se utiliza en la presente "biológicamente activo" se refiere a un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que es capaz de enlazarse al epitopo antigénico deseado, y ejercer directa o indirectamente un efecto biológico. Los efectos directos incluyen, pero no están limitados a la modulación, estimulación y/o inhibición de una señal de crecimiento, la modulación, estimulación y/o la inhibición de una señal anti-apoptótica, la modulación, estimulación y/o inhibición de una señal apoptótica o necrótica, la modulación, estimulación y/o inhibición de la cascada ADCC, y la modulación, estimulación y/o inhibición de la cascada CDC.
Los anticuerpos "biespecíficos" son también útiles en los presentes métodos y composiciones. Como se utiliza en la presente, el término "anticuerpo biespecífico" se refiere a un anticuerpo, típicamente a un anticuerpo monoclonal que tiene especificidades de enlace para al menos dos diferentes epitopos antigénicos. En una modalidad, los epitopos son del mismo antígeno. En otra modalidad más, los epitopos son provenientes de dos antígenos diferentes. Los métodos para elaborar anticuerpos biespecíficos son conocidos en la técnica. Por ejemplo, los anticuerpos biespecíficos pueden ser producidos recombinantemente utilizando la co-expresión de dos pares de cadena pesada/cadena ligera de inmunoglobulina. Ver, por ejemplo, Milstein et al., Nature 305: 537-39 (1983). Alternativamente, los anticuerpos biespecíficos pueden ser preparados utilizando enlace químico. Ver, por ejemplo, Brennan, et al., Science 229: 81 (1985) . Los anticuerpos biespecíficos incluyen los fragmentos de anticuerpo biespecíficos. Ver, por ejemplo, Hollinger et al., Proc . Nati . Acad. Sci . EUA 90: 6444-48 (1993), Gruber et al., J. Immunol . 152: 5368 (1994). Los anticuerpos monoclonales incluyen específicamente en la presente los anticuerpos "quiméricos" en los cuales una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica con u homologa a las secuencias correspondientes en los anticuerpos derivados de una especie particular, o que pertenecen a una clase o subclase particular de anticuerpo, con el resto de la o las cadenas que es idéntico u homólogo a las secuencias correspondientes en los anticuerpos derivados de otras especies, o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpos, así como los fragmentos de tales anticuerpos, siempre y cuando éstos se enlacen específicamente al antígeno objetivo y/o muestren la actividad biológica deseada Patente de los Estados Unidos No. 4,816,567; y Morrison et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855 (1984)). El término "secuencias optimizadas en el codón" se refiere a las secuencias nucleotídicas que han sido utilizadas para una especie hospedera particular mediante el reemplazo de cualesquiera codones que tengan una frecuencia de uso de menos de aproximadamente 20%. Las secuencias nucleotídicas que han sido optimizadas para la expresión en una especie hospedera dada por eliminación de las secuencias de poliadenilación espurias, la eliminación de las señales de empalme de exon/intrón, la eliminación de las repeticiones similares al transposón y/o la optimización del contenido de GC además de la optimización del codón, son denominadas en la presente como "secuencias mejoradas en expresión". Una "biblioteca combinatoria" es una colección de diversos compuestos químicos generados ya sea por síntesis química o por síntesis biológica, al combinar un número de "bloques de construcción" químicos tales como reactivos. Por ejemplo, una biblioteca química combinatoria lineal, tal como una biblioteca de polipéptidos (por ejemplo, muteína) , es formada al combinar un grupo de bloques de construcción químicos llamados aminoácidos de cualquier manera posible para una longitud de compuesto dada (por ejemplo, el número de aminoácidos en un compuesto polipeptídico) . Son sintetizados numerosos compuestos químicos a través del mezclado combinatorio de los bloques de construcción químicos (Gallop et al., J. Med. Chem. 37(9): 1233-1251 (1994)). La preparación y selección de las bibliotecas combinatorias es bien conocida por aquellos expertos en la técnica. Tales bibliotecas químicas combinatorias incluyen, pero no están limitadas a, bibliotecas de péptidos (ver, por ejemplo la Patente de los Estados Unidos No. 5,010,175, Furka, Pept. Prot. Res. 37:487-493 (1991), Houghton et al., Nature, 354:84-88 (1991)), peptoides (Publicación del PCT No. WO 91/19735) , péptidos codificados (publicación del PCT WO 93/20242), bio-oligómeros aleatorios (Publicación del PCT WO 92/00091), benzodiazepinas (Patente de los Estados Unidos No. 5,288,514), diversómeros tales como hidantoinas, benzodiazepinas y dipéptidos (Hobbs et al., Proc. Nat. Acad.
Sci. USA 90:6909-6913 (1993)), polipéptidos vinilogos (Hagihara et al., J. Amer. Chem. Soc. 114:6568 (1992)), peptidomiméticos no peptídicos con un andamiaje de beta-D-glucosa (Hirschmann et al., J. Amer. Chem. Soc. 114:9217-9218 (1992)), síntesis orgánicas análogas de bibliotecas de compuestos pequeños (Chen et al., J. Amer. Chem. Soc. 116:2661 (1994)), oligocarbamatos (Cho, et al., Science 261:1303 (1993)), y/o fosfonatos de peptidilo (Campbell et al., J. Org. Chem. 59:658 (1994)). Ver, en general, Gordon et al., J. Med. Chem. 37:1385 (1994), bibliotecas de ácidos nucleicos (ver, por ejemplo, Stratagene, Corp.), bibliotecas de ácidos nucleicos peptídicos (ver, por ejemplo, Patente de los Estados Unidos No. 5,539,083), bibliotecas de anticuerpo (ver, por ejemplo, Vaughn et al., Nature Biotechnology 14(3): 309-314 (1996), y PCT/US96/10287) , bibliotecas de carbohidratos (ver, por ejemplo, Liang et al., Science 274:1520-1522 (1996), y Patente de los Estados Unidos No. 5,593,853), y bibliotecas de moléculas orgánicas pequeñas (ver, por ejemplo, benzodiazepinas, Baum, C&EN, Jan 18, page 33 (1993) ; isoprenoides, Patente de los Estados Unidos No. 5,569,588; tiazolidinonas y metatiazanonas, Patente' de los Estados Unidos No..5,549,974; pirrolidinas, Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,525,735 y 5,519,134; compuestos tipo morfolino, Patente de los Estados Unidos No. 5,506, 337; benzodiazepinas, Patente de los Estados Unidos No. 5,288,514; y similares) . Los dispositivos para la preparación de bibliotecas combinatorias son comercialmente disponibles (ver, por ejemplo, 357 NIPS, 390 NIPS, Advanced Chem Tech, Louisville KY; Symphony, Rainin, Woburn, MA; 433A, Applied Biosystems, Foster City, CA; 9050, Plus, Millipore, Bedford, NÍA) . Ha sido desarrollado un número de sistemas robóticos bien conocidos para las químicas en fase de solución. Estos sistemas incluyen estaciones de trabajo automatizadas tales como el aparato de síntesis automatizada desarrollada por Takeda Chemical Industries, LTD. (Osaka, Japón) y muchos sistemas robóticos que utilizan brazos robóticos (Zy ate H, Zymark Corporation, Hopkinton, Mass.; Orea, Hewlett-Packard, Palo Alto, Calif.), que imitan las operaciones sintéticas manuales realizadas por un químico. Cualquiera de los dispositivos anteriores son adecuados para el uso con la presente invención. La naturaleza e implementación de las modificaciones a estos dispositivos (si las hay) de modo que éstos puedan operar como se discute en la presente, serán aparentes para las personas expertas en la técnica relevante. Además, numerosas bibliotecas combinatorias son por sí mismas comercialmente disponibles (ver, por ejemplo, ComGenex, Princeton, NJ; Asinex, Moscow, RU; Tripos, Inc., St. Louis, MO; ChemStar, Ltd, Moscow, RU; 3D Pharmaceuticals, Exton, PA; Martek Biosciences, Columbia, MD; etc.). Como se utiliza en la presente, el término "sustitución conservadora" se refiere a las sustituciones de aminoácidos que son conocidas por aquellos expertos en la técnica, y pueden ser realizadas en general sin alterar la actividad biológica de la molécula resultante. Aquellos de experiencia en la técnica reconocerán que, en general, las sustituciones de aminoácidos simples en las regiones no esenciales de un polipéptido no alteran sustancialmente la actividad biológica (ver, por ejemplo, Watson, et al., MOLECULAR BIOLOGY OF THE GENE, The Benjamin/Cummings Pub. Co., p. 224 (4a Edición 1987)). Tales sustituciones ejemplares son preferentemente realizadas de acuerdo con aquellas descritas en las Tablas III (a-b). Por ejemplo, tales cambios incluyen la sustitución de cualquiera de isoleucina (I) , valina (V) , y leucina (L) por cualquiera otro de estos aminoácidos hidrofóbicos; ácido aspártico (D) por ácido glutámico (E) y viceversa; glutamina (Q) por asparagina (N) y viceversa; y serina (S) por treonina (T) y viceversa. Otras sustituciones pueden también ser consideradas como conservadoras, dependiendo del ambiente del aminoácido particular y su papel en la estructura tridimensional de la proteína. Por ejemplo, glicina (G) y alanina (A) pueden ser frecuentemente intercambiables, como lo puede ser la alanina (A) y la valína (V) . La metionina (M) , la cual es relativamente hidrofóbica, puede ser intercambiada frecuentemente con leucina e isoleucina, y algunas veces con valina. La lisina (K) y la arginina (R) son frecuentemente intercambiables en sitios en los cuales la característica significativa del residuo aminoácido es su cambio y los diferentes pK' s de estos dos residuos de aminoácidos no son significativos. Otros cambios pueden ser considerados "conservadores" en ambientes particulares (ver, por ejemplo Tablas III (a) en la presente; páginas 13-15 "Biochemistry" 2a ED. Lubert Stryer ed (Stanford University); Heñíkoff et al., PNAS 1992 Vol. 89 10915-10919; Leí et al., J Biol Chem 1995 May 19; 270 (20) : 11882-6) . Otras sustituciones son también permisibles y pueden ser determinadas empíricamente o de acuerdo con sustituciones conservadoras conocidas. El término "agente citotóxico" se refiere a una sustancia que inhibe o previene la actividad de expresión de las células, la función de las células y/o provoca destrucción de las células. El término está destinado a incluir los agentes quimioterapéuticos de isótopos radioactivos, y las toxinas tales como las toxinas de molécula pequeña o las toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, incluyendo fragmentos y/o variantes de las mismas. Los ejemplos de agentes citotóxicos incluyen, pero no están limitados a auristatinas, auristatina, auromicinas, maytansinoides, ytrio, bismuto, ricina, cadena A de ricina, combrestatina, duocarmicinas, dolostatinas, doxorrubicina, daunorrubicina, taxol, cisplatina, ccl065, bromuro de etidio, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina vinblastina, colchicina, dihidroxi-antracin-diona, actinomicina, toxina de la difteria, exotoxina de Pseudomonas (PE) A, PE40, abrina, cadena A de abrina, cadena A de modecina, alfa-sarcina, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina, curicina, crotina, calicheamicina, inhibidor de Sapaonaria officinalis, y glucocorticoides y otros agentes quimioterapéuticos, así como radioisótopos tales como At2U, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi21°213, P32 e isótopos radioactivos de Lu incluyendo Lu177. Los anticuerpos pueden también ser conjugados a una enzima de activación de profármaco anticanceroso, capaz de convertir el profármaco a su forma activa. Como se utiliza en la presente, el término "diacuerpos" se refiere a los fragmentos de anticuerpo pequeños con dos sitios de enlace al antígeno, cuyos fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) en la misma cadena polipeptídica (VH-VL) . Mediante el uso de un ligador que es demasiado corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios sobre la misma cadena, los dominios son forzados a aparearse con los dominios complementarios de otra cadena, y crear dos sitios de enlace al antígeno. Los diacuerpos son descritos más completamente por ejemplo en la Patente Europea EP-404,097; documento WO 93/11161; y Hollinger et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:6444-48 (1993) .
El "producto génico" se utiliza en la presente para indicar un péptido/proteína o mRNA. Por ejemplo, un "producto génico de la invención" es algunas veces denominado en la presente como una "secuencia de aminoácidos del cáncer", "proteína cancerosa", proteína de un cáncer listado en la Tabla I", un "mRNA de cáncer", "mRNA de un cáncer listado en la Tabla I", etc. En una modalidad, la proteína del cáncer es codificada por un ácido nucleico de la Figura 2. La proteína del cáncer puede ser un fragmento o alternativamente, ser la proteína de longitud completa codificada por los ácidos nucleicos de la Figura 2. En una modalidad, una secuencia de aminoácidos del cáncer es utilizada para determinar la identidad o similitud secuencial. En otra modalidad más, las secuencias son variantes alélicas de origen natural de una proteína codificada por un ácido nucleico de la Figura 2. En otra modalidad, las secuencias son variantes de secuencia como se describen en la presente. Los anticuerpos "heteroconjugados" son útiles en los presentes métodos y composiciones. Como se utiliza en la presente, el término "anticuerpo heteroconjugado" se refiere a dos anticuerpos covalentemente enlazados. Tales anticuerpos pueden ser preparados utilizando métodos conocidos en la química de las proteínas sintéticas, incluyendo el uso de agentes de reticulación. Ver, por ejemplo, Patente de los Estados Unidos No. 4,676,980. Los ensayos de "selección de alto rendimiento" para la presencia, ausencia, cuantificación u otras propiedades de los ácidos nucleicos o proteínas particulares, son bien conocidos por aquellos expertos en la materia. Similarmente, los ensayos de enlace y los ensayos de genes reporteros son similarmente bien conocidos. De este modo, por ejemplo a Patente de los Estados Unidos No. 5,559,410 describe los métodos de selección de alto rendimiento para las proteínas; la Patente de los Estados Unidos No. 5,585,639 describe los métodos de selección de alto rendimiento para el enlace de los ácidos nucleicos (por ejemplo, en arreglos) ; mientras que las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,576,220 y 5,541,061 describen los métodos de selección de alto rendimiento para el enlace del ligando/anticuerpo. Además, los sistemas de selección de alto rendimiento son comercialmente disponibles (ver, por ejemplo, Amersham Biosciences, Piscataway, NJ; Zymark Corp., Hopkinton, MA; Air Technical Industries, Mentor, OH; Beckman Instruments, Inc. Fullerton, CA; Precisión Systems, Inc., Natick, MA; etc.). Estos sistemas típicamente automatizan los procedimientos completos, incluyendo la toma con pipeta de todas las muestras y de los reactivos, el surtido de los líquidos, las incubaciones sincronizadas y las lecturas finales de la microplaca en uno o varios detectores apropiados para el ensayo. Estos sistemas configurables proporcionan alto rendimiento y arranque rápido, así como un alto grado de flexibilidad y personalización. Los fabricantes de estos sistemas proporcionan protocolos detallados para los diversos sistemas de alto rendimiento. De este modo, por ejemplo, Zymark Corp. proporciona boletines técnicos que describen los sistemas de selección para detectar la modulación de la transcripción de los genes, el enlace de los ligandos y similares. El término "homólogo" se refiere a una molécula que muestra homología a otra molécula, por ejemplo, al tener secuencias de residuos químicos que son las mismas o similares a las posiciones correspondientes. En una modalidad, el anticuerpo proporcionado en la presente es un "anticuerpo humano". Como se utiliza en la presente, el término "anticuerpo humano" se refiere a un anticuerpo en el cual esencialmente las secuencias enteras de la cadena ligera y de la cadena pesada, incluyendo las regiones de determinación de la complementariedad (CDRs por sus siglas en ingles), son provenientes de genes humanos. En una modalidad, los anticuerpos monoclonales humanos son preparados mediante la técnica del trioma, la técnica de células B humanas (ver, por ejemplo, Kozbor, et al, Immunol, Today 4: 72 (1983), la técnica de transformación EBV (ver, por ejemplo, Colé et al. MONOCLONAL ANTIBODIES AND C NCER THERAPY 77-96 (1985)), o utilizando la visualización de fagos (ver, por ejemplo, Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581 (1991) ) . En una modalidad específica, el anticuerpo humano es generado en un ratón transgénico. Las técnicas para la elaboración de tales anticuerpos parcial a completamente humanos, son conocidas en la materia y pueden ser utilizadas cualesquiera de tales técnicas. De acuerdo a una modalidad particularmente preferida, las secuencias de anticuerpo completamente humanas son elaboradas en un ratón transgénico manipulado por ingeniería genética para expresar los genes de anticuerpo de cadena pesada y ligera humanos. Una descripción ejemplar de la preparación de los ratones transgénicos que producen anticuerpos humanos es encontrada en la Solicitud No. WO 02/43478 y Patente de los Estados Unidos No. 6,657,103 (Abgenix) y su progenie. Las células B provenientes de ratones transgénicos que producen el anticuerpo deseado, pueden ser luego fusionadas para elaborar líneas celulares de hibridoma para la producción continua del anticuerpo. Ver, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016; y 5,545,806; y Jakobovíts, Adv. Drug Del. Rev. 31:33-42 (1998); Green, et al., J. Exp. Med. 188:483-95 (1998). "Antígeno Leucocitario Humano" o "HLA" es un Complejo Mayor de Histocompatibilidad (MHC por sus siglas en ingles) humano de la clase I o de la clase II, de naturaleza proteica (ver, por ejemplo, Stites, et al., IMMUNOLOGY, 8a ED., Lange Publishing, Los Altos, CA (1994). Como se utiliza en la presente, el término "anticuerpo humanizado" se refiere a las formas de los anticuerpos que contienen secuencias provenientes de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) así como anticuerpos humanos. Tales anticuerpos son anticuerpos quiméricos que contienen la secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todo de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en los cuales todos o sustancialmente todos los bucles hipervariables corresponden a aquellos de inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones FR son aquellas de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado también comprenderá opcionalmente al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc) , típicamente aquella de una inmunoglobulina humana. Ver, por ejemplo, Cabilly Patente de los Estados Unidos No. 4,816,567; Queen et al. (1989) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86: 10029-10033; y ANTIBODY ENGINEERING: A PRACTICAL APPROACH (Oxford University Press 1996) . Los términos , "hibridarse", "hibridación", "se hibrida" y similares, utilizados en el contexto de los polinucleótidos, se entiende que se refieren a las condiciones de hibridación convencionales, preferentemente tales como la hibridación en formamida al 50%/6XSSC/0.1% de SDS/100 µg/ml de ssDNA, en el cual las temperaturas para la hibridación están por arriba de 37 grados C y las temperaturas para el lavado en 0.1XSSC/0.1% de SDS están por arriba de 55 grados C. Las frases "aislado" o "biológicamente puro" se refieren al material que está sustancial o esencialmente libre de los componentes que normalmente acompañan al material como éste es encontrado en su estado nativo. De este modo, los péptidos aislados de acuerdo con la invención preferentemente no contienen materiales normalmente asociados con los péptidos en su ambiente in situ . Por ejemplo, se dice que un polinucleótido es "aislado" cuando éste es sustancialmente separado de los polinucleótidos contaminados que corresponden o que son complementarios a los genes diferentes de los genes STEAP-l o que codifican para los polipéptidos diferentes del producto del gen STEAP-l o fragmentos del mismo. Una persona experta puede emplear fácilmente los procedimientos de aislamiento de ácidos nucleicos para obtener un polinucleótido STEAP-l aislado. Se dice que una proteína es "aislada", por ejemplo, cuando son empleados métodos físicos, mecánicos o químicos para eliminar las proteínas STEAP-l de los constituyentes celulares que están normalmente asociados con la proteína. Una persona experta en la técnica puede emplear fácilmente los métodos de purificación estándares para obtener una proteína STEAP-l aislada. Alternativamente, una proteína aislada puede ser preparada por medios químicos. Los "marcadores" adecuados incluyen radionúclidos, enzimas, sustratos, cofactores, inhibidores, porciones fluorescentes, porciones quimioluminiscentes, partículas magnéticas, y similares. Las patentes que enseñan el uso de tales marcadores incluyen las Patentes de los Estados Unidos Nos. 3,817,837; 3,850,752; 3,939,350; 3,996,345; 4,277,437; 4,275,149; y 4,366,241. Además, los anticuerpos proporcionados en la presente pueden ser útiles como el componente de enlace al antígeno de los fluorocuerpos . Ver por ejemplo, Zeytun et al., Nat. Biotechnol. 21:1473-79 (2003) . El término "mamífero" se refiere a cualquier organismo clasificado como un mamífero, incluyendo ratones, ratas, conejos, perros, gatos, vacas, caballos y humanos. En una modalidad de la invención, el mamífero es un ratón. En otra modalidad más de la invención, el mamífero es un humano. Los términos "cáncer de próstata metastático" y "enfermedad metastática" significan los cánceres de próstata que se han dispersado a los nodulos linfáticos regionales o a sitios distantes, y se entiende que incluyen la enfermedad en etapa D bajo el sistema AUA y la etapa TxNxMt bajo el sistema TNM. Como es el caso con el cáncer de próstata localmente avanzado, en general la cirugía no es indicada para pacientes con enfermedad metastática, y la terapia hormonal (ablación de andrógenos) es una modalidad de tratamiento preferida. Los pacientes con cáncer de próstata metastático tarde o temprano desarrollan un estado refractario a los andrógenos dentro de 12 a 18 meses del inicio del tratamiento. Aproximadamente la mitad de estos pacientes refractarios a los andrógenos mueren dentro de 6 meses después del desarrollo de ese estado. El sitio más común para la metástasis del cáncer de próstata es el hueso. Las metástasis óseas por el cáncer de próstata son a menudo osteoblásticas en vez de osteolíticas (por ejemplo, que dan como resultado la formación neta del hueso) . Las metástasis óseas son encontradas más frecuentemente en la espina dorsal, seguido por el fémur, la pelvis, la caja de las costillas, el cráneo y el húmero. Otros sitios comunes para la metástasis incluyen los nodulos linfáticos, el pulmón, el hígado y el cerebro. El cáncer de próstata metastático es típicamente diagnosticado por linfadenoctomía pélvica abierta o laparoscópica, exploraciones de radionúclidos al cuerpo entero, radiografía esquelética y/o biopsia en la lesión ósea. El término "modulador" o "compuesto de prueba" o "fármaco candidato" o equivalentes gramaticales como se utilizan en la presente, describen cualquier molécula, por ejemplo, proteína, oligopéptido, molécula orgánica pequeña, polisacárido, polinucleótido, etc., que va a ser probado para la capacidad de alterar directa o indirectamente el fenotipo del cáncer o la expresión de una secuencia del cáncer, por ejemplo, secuencias de ácido nucleico o de proteínas, o los efectos de las secuencias del cáncer (por ejemplo, la señalización, la expresión del gen, la interacción de las proteínas, etc.). En un aspecto, un modulador neutralizará el efecto de una proteína de cáncer de la invención. Por "neutralizar" se entiende que una actividad de una proteína es inhibida o bloqueada, junto con el efecto consecuente sobre la célula. En otro aspecto más, un modulador neutralizará el efecto de un gen, y su proteína correspondiente, de la invención al normalizar los niveles de dicha proteína. En modalidades preferidas, los moduladores alteran los perfiles de expresión, o el perfil de expresión de los ácidos nucleicos o las proteínas proporcionadas en la presente, o las vías efectoras corriente abajo (3'). En una modalidad, el modulador suprime un fenotipo de cáncer, por ejemplo a una huella digital de tejido normal. En otra modalidad más, un modulador indujo un fenotipo de cáncer. En general, una pluralidad de mezclas de ensayo es corrida en paralelo con diferentes concentraciones del agente para obtener una respuesta diferencial hacia las diversas concentraciones. Típicamente, una de estas concentraciones sirve como un control negativo, por ejemplo, a la concentración cero o debajo del nivel de detección. Los moduladores, candidatos a fármacos o compuestos de prueba abarcan numerosas clases químicas, aunque típicamente éstas son moléculas orgánicas, preferentemente compuestos orgánicos pequeños que tienen un peso molecular no mayor de 100, y menor de aproximadamente 2,500 Daltones. Las moléculas pequeñas preferidas son de menos de 200, o menos de 1500 o menos de 1000 o menos de 500 D. Los agentes candidatos comprenden grupos funcionales necesarios para la interacción estructural con las .proteínas, particularmente enlace de hidrógeno, y típicamente incluyen al menos un grupo amina, carbonilo, hidroxilo o carboxilo, preferentemente al menos dos de los grupos químicos funcionales. Los agentes candidatos frecuentemente comprenden estructuras de carbono cíclicas o heterocíclicas y/o estructuras aromáticas o poliaromáticas sustituidas con uno o más de los grupos funcionales anteriores. Los moduladores también comprenden biomoléculas tales como péptidos, sacáridos, ácidos grasos, esteroides, purinas, pirimidinas, derivados, análogos estructurales o combinaciones de los mismos. Particularmente preferidos son los péptidos. Una clase de moduladores son los péptidos, por ejemplo de aproximadamente cinco a aproximadamente 35 aminoácidos, de aproximadamente cinco a aproximadamente 20 aminoácidos que son preferidos, y de aproximadamente 7 a aproximadamente 15 que son particularmente preferidos. Preferentemente, la proteína moduladora del cáncer es soluble, incluye una región no transmembranal, y/o, tiene una Cys N-terminal para ayudar en la solubilidad. En una modalidad, el extremo C del fragmento es mantenido como un ácido libre y el extremo N es una amina libre para ayudar en el acoplamiento, por ejemplo a la cisteína. En una modalidad, una proteína de cáncer de la invención es conjugada a un agente inmunogénico .como se discute en la presente. En una modalidad, la proteína del cáncer es conjugada a BSA. Los péptidos de la invención, por ejemplo, de las longitudes preferidas, pueden ser enlazados uno al otro o a otros aminoácidos para crear un péptido/proteína más larga. Los péptidos moduladores pueden ser digestiones de proteínas de origen natural como se describe anteriormente, péptidos aleatorios, o péptidos aleatorios "desviados". En una modalidad preferida, los moduladores basados en péptido/proteína son anticuerpos, y fragmentos de los mismos, como se definen en la presente. Los moduladores del cáncer pueden también ser ácidos nucleicos. Los agentes moduladores tipo ácido nucleico pueden ser ácidos nucleicos de. origen natural, ácidos nucleicos aleatorios, o ácidos nucleicos aleatorios "desviados". Por ejemplo, las digestiones de genomas procarióticos o eucarióticos pueden ser utilizadas en un procedimiento análogo a aquel descrito anteriormente para las proteínas . El término "anticuerpo monoclonal", como se utiliza en la presente, se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea, por ejemplo, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos, excepto por las posibles mutaciones de origen natural que puedan estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, siendo dirigidos contra un epitopo antigénico simple. En contraste, las preparaciones de anticuerpo convencionales (policlonales) incluyen típicamente una pluralidad de anticuerpos dirigidos contra (o específicos para) diferentes epitopos. En una modalidad, el anticuerpo policlonal contiene una pluralidad de anticuerpos monoclonales con diferentes especificidades de epitopo, afinidades o avideces entro de un antígeno simple que contiene múltiples epitopos antigénicos. El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo ya que éste es obtenido a partir de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no se debe considerar que requiera la producción del anticuerpo mediante algún método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que van a ser utilizados de acuerdo con la presente invención pueden ser elaborados mediante el método del hibridoma primeramente descrito por Kohler et al., Nature 256: 495 (1975), o pueden ser elaborados mediante métodos de DNA recombinante (ver, por ejemplo, Patente de los Estados Unidos No. 4,816,567). Los "anticuerpos monoclonales" pueden ser también aislados de las bibliotecas de anticuerpo de fago utilizando las técnicas descritas en Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991) y Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1991), por ejemplo. Estos anticuerpos monoclonales usualmente se enlazarán con al menos una K¿ de aproximadamente 1 µM, más usualmente al menos aproximadamente 300 nM, típicamente al menos aproximadamente 30 nM, preferentemente al menos 10 nM, más preferentemente al menos aproximadamente 3 nM o mejor, usualmente determinados por ELISA. Una "porción", como en porción biológica de una proteína relacionada a STEAP-l, se refiere a cualquier patrón de aminoácidos que forma parte de la secuencia primaria de una proteína, que está asociada con una función particular (por ejemplo la interacción proteína-proteína, interacción proteína-DNA, etc.) o la modificación (por ejemplo que está fosforilada, glucosilada o amidada) , o localización (por ejemplo secuencia secretora, secuencia de localización nuclear, etc.) o una secuencia que está correlacionada con ser inmunogénica, ya sea humoralmente o celularmente . Una porción puede ser ya sea contigua o capaz de ser alineada a ciertas posiciones que están en general correlacionadas con una cierta función o propiedad. En el contexto de las porciones de HLA, "porción" se refiere al patrón de residuos en un péptido de longitud definida, usualmente un péptido de aproximadamente 8 a aproximadamente 13 aminoácidos para una porción HLA de la clase I y de aproximadamente 6 a aproximadamente 25 aminoácidos para una porción HLA de la clase II, que es reconocida por una molécula de HLA particular. Las porciones peptídicas para el enlace a HLA son típicamente diferentes para cada proteína codificada por cada alelo de HLA humano y difieren en el patrón de los residuos de ancla primarios y secundarios. Un "excipiente farmacéutico" comprende un material tal como un adyuvante, un portador, agentes ajustadores y amortiguadores del pH, agentes ajustadores de la tonicidad, agentes humectantes, conservadores, y similares. "Farmacéuticamente aceptable" se refiere a una composición no tóxica, inerte, que es fisiológicamente compatible con humanos u otros mamíferos. El término "polinucleótido" significa una forma polimérica de nucleótidos de al menos 10 bases o pares de bases de longitud, ya sea ribonucleótidos o desoxínucleótidos o una forma modificada de cualquier tipo de nucleótido, y se entiende que incluye las formas de una sola hebra y de doble hebra del DNA y/o del RNA. En la técnica, este término es a menudo utilizado intercambiablemente con "oligonucleótido". Un polinucleótido puede comprender una secuencia nucleotídica descrita en la presente, en donde la timidina (T) , como se muestra por ejemplo en la Figura 2, puede ser también uracilo (U) ; esta definición pertenece a las diferencias entre las estructuras químicas de DNA y RNA, en particular la observación de que una de las cuatro bases mayores en RNA es el uracilo (U) en vez de la timidina (T) . El término "polipéptido" significa un polímero de al menos aproximadamente 4, 5, 6, 7 u 8 aminoácidos. A todo lo largo de la especificación, se utilizan las designaciones estándares de tres letras o de una sola letra para los aminoácidos. En la técnica, este término es a menudo utilizado intercambiablemente con "péptido" o "proteína". Un "residuo de ancla primario" de HLA es un aminoácido en una posición específica a lo largo de una secuencia peptídica que se entiende proporciona un punto de contacto entre el péptido inmunogénico y la molécula de HLA. Uno a tres, usualmente dos, residuos de ancla primarios dentro de un péptido de longitud definida, definen en general una "porción" o "motivo" para un péptido inmunogénico. Se entiende que estos residuos se ajustan en contacto estrecho con el canal de enlace al péptido de una molécula de HLA, con sus cadenas laterales enterradas en bolsas específicas del canal o muesca de enlace. En una modalidad, por ejemplo, los residuos de ancla primarios para una molécula HLA de la clase I están localizados en la posición 2 (de la posición amino-terminal) y en la posición carboxilo-terminal de un epitopo peptídico de 8, 9, 10, 11 ó 12 residuos de acuerdo con la invención. Alternativamente, en otra modalidad más, los residuos de ancla primarios de un péptido se enlazan a una molécula HLA de la clase II y están espaciados uno con relación al otro, en vez de a los extremos del péptido, donde el péptido es en general de al menos 9 aminoácidos de longitud. Las posiciones del ancla primaria para cada porción y superporción se describen en la Tabla IV (a). Por ejemplo, los péptidos análogos pueden ser creados al alterar la presencia o la ausencia de los residuos particulares en las posiciones de ancla primaria y/o secundaria mostradas en la Tabla IV. Tales análogos son utilizados para modular la afinidad de enlace y/o la cobertura de población de un péptido que comprende una porción o superporción de HLA particular. Los "radioisótopos" incluyen, pero no están limitados a los siguientes (los usos ejemplares no limitantes son también descritos en la Tabla IV(I)). Por "aleatorizado" o equivalentes gramaticales como se aplican en la presente a los ácidos nucleicos y a las proteínas, se entiende que cada ácido nucleico y péptido consiste esencialmente de nucleótidos aleatorios y aminoácidos, respectivamente. Estos péptidos aleatorios (o ácidos nucleicos, discutidos en la presente) pueden incorporar cualquier nucleótido o aminoácido en cualquier posición. El proceso sintético puede ser diseñado para generar proteínas o ácidos nucleicos aleatorizados, para permitir la formación de todas o la mayoría de las posibles combinaciones sobre la longitud de la secuencia, formando de este modo una biblioteca de agentes proteicos bioactivos, candidatos, aleatorizados. En una modalidad, una biblioteca es "completamente aleatorizada", sin preferencias de secuencia o constantes en alguna posición. En otra modalidad más, la biblioteca es una biblioteca de "azar desviado". Es decir, algunas posiciones dentro de la secuencia son ya sea mantenidas constantes, o son seleccionadas de un número limitado de posibilidades. Por ejemplo, los nucleótidos o los residuos de aminoácidos son aleatorizados dentro de una clase definida, por ejemplo de aminoácidos hidrofóbicos, residuos hidrofílicos, residuos estéricamente desviados (ya sea pequeños o grandes) hacia la creación de los dominios de enlace al ácido nucleico, la creación de cisteínas, para la reticulación, prolinas para los dominios SH-3, serinas, treoninas, tirosinas o histidinas para los sitios de fosforilación, etc., o a las purinas, etc. Una molécula de DNA o RNA "recombinante" es una molécula de DNA o RNA que ha sido sometida a manipulación molecular in vitro . Como se utiliza en la presente, el término "Fv de cadena simple" o "scFv" o anticuerpo de "cadena simple" se refiere a los fragmentos de anticuerpo que comprenden los dominios VH y VL del anticuerpo, en donde estos dominios están presentes en una cadena de polipéptido simple. En general, el polipéptido de Fv comprende además un ligador polipeptídico entre los dominios VH y VL, que hace posible que el sFv forme la estructura deseada para el enlace al antígeno. Para una revisión de sFv, ver Pluekthun, THE PHARMACOLOGY OF MONOCLONAL ANTIBODIES, vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer- Verlag, New York, pp. 269-315 (1994) . Los ejemplos no limitantes de "moléculas pequeñas" incluyen los compuestos que se enlazan o interactúan con STEAP-l, los ligandos que incluyen hormonas, neuropéptidos, quimiocinas, odorantes, fosfolípidos y equivalentes funcionales de los mismos, que se enlazan y preferentemente inhiben la función de la proteína STEAP-l. Tales moléculas pequeñas no limitantes tienen preferentemente un peso molecular de menos de aproximadamente 10 kDa, más preferentemente de menos de aproximadamente 9, aproximadamente 8, aproximadamente 7, aproximadamente 6, aproximadamente 5 o aproximadamente 4 kDa. En ciertas modalidades, las moléculas pequeñas se asocian físicamente con, o se enlazan a la proteína STEAP-l; no son encontradas en las vías metabólicas de origen natural; y/o son más solubles en soluciones acuosas que no acuosas. Como se utiliza en la presente, el término "específico" se refiere al enlace selectivo del anticuerpo al epitopo del antígeno objetivo. Los anticuerpos pueden ser probados para la especificidad de enlace por comparación del enlace al antígeno apropiado, al enlace al antígeno irrelevante o a la mezcla de antígenos, bajo un grupo dado de condiciones. Si el anticuerpo se enlaza al antígeno apropiado al menos 2, 5, 7 y preferentemente 10 veces más que al antígeno o mezcla de antígenos irrelevantes, entonces se considera que es específico. En una modalidad, un anticuerpo específico es uno que únicamente se enlaza al antígeno STEAP-1, pero no se enlaza al antígeno irrelevante. En otra modalidad más, un anticuerpo específico es uno que se enlaza al antígeno STEAP-l humano, pero no se enlaza al antígeno STEAP-l no humano, con 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o más de homología de aminoácidos con el antígeno STEAP-l. En otra modalidad más, un anticuerpo específico es uno que se enlaza al antígeno STEAP-l humano, y se enlaza al antígeno guardián STEAP-l murino, pero con un más alto grado de enlace al antígeno humano. En otra modalidad más, el anticuerpo específico es uno que se enlaza al antígeno STEAP-l humano y se enlaza al antígeno de primate, pero con un más alto grado de enlace al antígeno humano. En otra modalidad más, el anticuerpo específico se enlaza al antígeno STEAP-l humano, y a cualquier antígeno STEAP-l no humano, pero con un grado mayor de enlace al antígeno humano o cualquier combinación de los mismos . "Exigencia" o "severidad" de las reacciones de hibridación es fácilmente determinable por una persona de experiencia ordinaria en la técnica, y en general es un cálculo empírico dependiente de la longitud de la sonda, de la temperatura de lavado, y de la concentración salina. En general, sondas más largas requieren temperaturas más altas para el recocido adecuado, mientras que sondas más cortas necesitan menores temperaturas. La hibridación depende en general de la habilidad de las secuencias desnaturalizadas de ácido nucleico para recocerse cuando están presentes hebras complementarias en un ambiente por debajo de su temperatura de fusión. Entre mayor sea el grado de homología deseada entre la sonda y la secuencia hibridable, mayor es la temperatura relativa que puede ser utilizada. Como resultado, se desprende que las temperaturas relativamente más altas podrían tender a hacer más exigentes a las condiciones de reacción, mientras que las temperaturas más bajas lo hacen menos. Para detalles y explicación adicionales de la exigencia o severidad de las reacciones de hibridación, ver Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995) . "Condiciones estrictas" o "condiciones de alta exigencia" como se definen en la presente, son identificadas por, pero no están limitadas a, aquellas que: (1) emplean baja fuerza iónica y alta temperatura para el lavado, por ejemplo cloruro de sodio 0.015 M/citrato de sodio 0.0015 M/dodecilsulfato de sodio al 0.1% a 50 °C; (2) emplean durante la hibridación un agente de desnaturalización, tal como formamida, por ejemplo, formamida al 50% (v/v) con 0.1% de albúmina sérica bovina/0.1% de Ficoll/0.1% de polivinilpirrolidona/amortiguador de fosfato de sodio 50 mM a pH 6.5, con cloruro de sodio 750 mM, citrato de sodio 75 mM a 42 °C; o (3) emplean 50% de formamida, 5 x SSC (NaCl 0.075 M, citrato de sodio 0.075 M) , fosfato de sodio 50 M (pH 6.8), pirofosfato de sodio 0.1%, 5 x de solución de Denhardt, DNA sonicado de esperma de salmón (50 µg/ml), 0.1% de SDS, y 10% de sulfato de dextrano a 42 °C, con lavados a 42 °C en 0.2 x SSC (cloruro de sodio/citrato de sodio) y 50% de formamida a 55 °C, seguido por un lavado de alta exigencia que consiste de 0.1 x SSC que contiene EDTA a 55 °C. "Condiciones moderadamente estrictas" son descritas por, pero no limitadas a, aquellas en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989, e incluyen el uso de la solución de lavado y las condiciones de hibridación (por ejemplo, temperatura, fuerza iónica y % de SDS) menos exigentes que aquellas descritas anteriormente. Un ejemplo de condiciones moderadamente estrictas es la incubación toda la noche a 65 °C en una solución que comprende: 1% de albúmina sérica bovina, fosfato de sodio 0.5 M a pH 7.5, EDTA 1.25 mM, y 7% de SDS 5 x SSC (cloruro de sodio 150 mM, citrato trisódico 15 mM) , seguido por lavado de los filtros en 2 x SSC/1% de SDS a 50°C y 0.2 x SSC/0.1% de SDS a 50 °C. El experto en la técnica reconocerá cómo ajustar la temperatura, la fuerza iónica, etc. como sea necesario para acomodar factores tales como la longitud de la sonda y similares . Una "superporción" de HLA es una especificidad de enlace peptídico compartida por las moléculas de HLA codificadas por dos o más alelos de HLA. Las frecuencias fenotípicas generales de los supertipos de HLA en diferentes poblaciones étnicas, se describen en la Tabla IV (f) . Los constituyentes no limitantes de diversos supertipos son como sigue: A2: A*0201, A*0202, A*0203, A*0204, A* 0205, A*0206, A*6802, A*6901 , A*0207 A3: A3, All, A31, A*3301, A*6801, A*0301, A1101, A*3101 B7: B7, B*3501-03, B*51, B*5301, B*5401, B*5501, B*5502, B*5601, B*6701, B*7801, B*0702, B*5101, B*5602 B44: B*3701, B*4402, B*4403, B*60 (B*4001) , B61 (B*4006) Al: A*0102, A*2604, A*3601, A*4301 , A*8001 A24: A*24, A*30, A*2403, A*2404, A*3002, A*3003 B27: B*1401-02, B*1503, B*1509, B*1510, B*1518, B*3801- 02, B*3901, B*3902, B*3903~04, B*4801-02, B7301, B*2701-08 B58: B*1516, B*1517, B*5701, B*5702, B58 B62: B*4601. B52, B*1501 (B62), B*1502 (B75) , B*1513 (B77) La cobertura calculada a la población, proporcionada por diferentes combinaciones de supertipos de HLA, se describen en la Tabla IV (g) . Como se utiliza en la presente "tratar" o "terapéutico" y términos gramaticalmente relacionados, se refieren a cualquier mejoramiento de alguna consecuencia de enfermedad, tal como la supervivencia prolongada, menor morbididad, y/o una disminución de los efectos colaterales que son los productos secundarios de una modalidad terapéutica alternativa; como es fácilmente apreciado en la técnica, la erradicación completa de la enfermedad es algo preferido, aunque no un requerimiento para un acto de tratamiento. Un "animal transgénico" (por ejemplo un ratón o rata) es un animal que tiene células que contienen un transgen, cuyo transgen fue introducido dentro del animal o un ancestro del animal en una etapa prenatal, por ejemplo una etapa embrionaria. Un "transgen" es un DNA que es integrado dentro del genoma de una célula de la cual se desarrolla un animal transgénico. Como se utiliza en la presente, una "vacuna" de HLA o de la respuesta inmune celular, es una composición que contiene o que codifica para uno o más péptidos de la invención. Existen numerosas modalidades de tales vacunas, tales como un cóctel de uno o más péptidos individuales; uno o más péptidos de la invención comprendidos por un péptido poliepitópico; o ácidos nucleicos que codifican para tales péptidos o polipéptidos individuales, por ejemplo, un minigen que codifica para un péptido poliepitópico. "Uno o más péptidos" pueden incluir cualquier número entero unitario de l a 150 o más, por ejemplo, al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, ó 150 o más péptidos de la invención. Los péptidos 0 polipéptidos pueden ser modificados opcionalmente, tales como mediante lipidación, adición de secuencias de dirección al objetivo u otras secuencias. Los péptidos HLA de la clase 1 de la invención pueden ser mezclados con, o enlazados a, péptidos HLA de la clase II, para facilitar la activación de los linfocitos T citotóxicos y los linfocitos T cooperadores. Las vacunas de HLA pueden también comprender células presentadoras de antígeno pulsadas por péptidos, por ejemplo células dendríticas. El término "variante" se refiere a una molécula que muestra una variación a partir de un tipo o norma descrita, tal como una proteína que tiene uno o más residuos de aminoácidos en la o las posiciones correspondientes de una proteína específicamente descrita (por ejemplo la proteína STEAP-l mostrada en las Figuras 2A-2Q o las Figuras 3Q-3D. Un análogo es un ejemplo de una proteína variante. Las isoformas de empalme y los polimorfismos de nucleótidos simples (SNPs) son ejemplos adicionales de variantes. Las "proteínas relacionadas a STEAP-l" de la invención incluyen aquellas específicamente identificadas en la presente,' así como las variantes alélicas, variantes de sustitución conservadoras, análogos y homólogos que pueden ser aislados/generados y caracterizados en experimentación debida siguiendo los métodos detallados en la presente, o fácilmente disponibles en la técnica. Las proteínas de fusión que combinan parte de diferentes proteínas de STEAP-l o fragmentos de las mismas, así como las proteínas de fusión de una proteína STEAP-l y un polipéptido heterólogo, son también incluidas. Tales proteínas STEAP-l son colectivamente denominadas como proteínas relacionadas a STEAP-l, las proteínas de la invención, o STEAP-l. El término "proteína relacionada a STEAP-l" se refiere a un fragmento de polipéptido o una secuencia proteína de STEAP-l de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, o más de 25 aminoácidos; o, al menos 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 330, 335, 339 o más aminoácidos.
II.) Polinucleótidos de STEAP-l Un aspecto de la invención proporciona los polipéptidos correspondientes o complementarios a todo o parte de un gen de STEAP-l, el mRNA y/o la secuencia de codificación, preferentemente en forma aislada, incluyendo los polinucleótidos que codifican para una proteína relacionada a STEAP-l y fragmentos de la misma, DNA, RNA, el híbrido de DNA/RNA, y moléculas relacionadas, polinucleótido u oligonucleótidos complementarios a un gen de STEAP-l o la secuencia de mRNA o una parte de la misma, y los polinucleótidos u oligonucleótidos que se hibridan a un gen de STEAP-l, el mRNA o a un polinucleótido que codifica para STEAP-l (colectivamente, "polinucleótidos de STEAP-l") . En todos los casos cuando se hace referencia a esta sección, T puede también ser U en la Figura 2.
Las modalidades de un polinucleótido de STEAP-l incluyen: un polinucleótido de STEAP-l que tiene la secuencia mostrada en la Figura 2, la secuencia de nucleótidos de STEAP-l, como se muestra en la Figura 2, en donde T es U; al menos 10 nucleótidos contiguos de un polinucleótido que tiene la secuencia como se muestra en la Figura 2; o, al menos 10 nucleótidos contiguos de un polinucleótido que tiene la secuencia como se muestra en las Figuras 2A-2Q donde T es U. Por ejemplo, las modalidades de los nucleótidos de STEAP-1 comprenden, sin limitación: (I) un polinucleótido que comprende, que consiste esencialmente de, o que consiste de una secuencia como se muestra en las Figuras 2A-2Q, en donde T puede ser también U; (II) un polinucleótido que comprende, que consiste esencialmente de, o que consiste de la secuencia como se muestra en la Figura 2A, a partir del residuo de nucleótido número 66 hasta el residuo de nucleótido número 1085, incluyendo el codón de detención, en donde T puede ser también U; (III) un polinucleótido que comprende, que consiste esencialmente de, o que consiste de la secuencia como se muestra en la Figura 2B, a partir del residuo de nucleótido número 96 hasta el residuo de nucleótido número 872, incluyendo el codón de detención, en donde T puede ser también U; (IV) un polinucleótido que comprende, que consiste esencialmente de, o que consiste de la secuencia como se muestra en la Figura 2C, a partir del residuo de nucleótido número 96 hasta el residuo de nucleótido número 944, incluyendo el codón de detención, en donde T puede ser también U; (V) un polinucleótido que comprende, que consiste esencialmente de, o que consiste de la secuencia como se muestra en la Figura 2D, a partir del residuo de nucleótido número 96 hasta el residuo de nucleótido número 872, incluyendo el codón de detención, en donde T puede ser también U; (VI) un polinucleótido que comprende, que consiste esencialmente de, o que consiste de la secuencia como se muestra en la Figura 2E, a partir del residuo de nucleótido número 96 hasta el residuo de nucleótido número 872, incluyendo el codón de detención, en donde T puede ser también U; (VII) un polinucleótido que comprende, que consiste esencialmente de, o que consiste de la secuencia como se muestra en la Figura 2F, a partir del residuo de nucleótido número 96 hasta el residuo de nucleótido número 872, incluyendo el codón de detención, en donde T puede ser también U; (VIII) un polinucleótido que comprende, que consiste esencialmente de, o que consiste de la secuencia como se muestra en la Figura 2G, a partir del residuo de nucleótido número 96 hasta el residuo de nucleótido número 872, incluyendo el codón de detención, en donde T puede ser también U; (IX) un polinucleótido que comprende, que consiste esencialmente de, o que consiste de la secuencia como se muestra en la Figura 2H, a partir del residuo de nucleótido número 96 hasta el residuo de nucleótido número 872, incluyendo el codón de detención, en donde T puede ser también U; (X) un polinucleótido que comprende, que consiste esencialmente de, o que consiste de la secuencia como se muestra en la Figura 21, a partir del residuo de nucleótido número 96 hasta el residuo de nucleótido número 872, incluyendo el codón de detención, en donde T puede ser también U; (XI) un polinucleótido que comprende, que consiste esencialmente de, o que consiste de la secuencia como se muestra en la Figura 2J, a partir del residuo de nucleótido número 96 hasta el residuo de nucleótido número 872, incluyendo el codón de detención, en donde T puede ser también U; (XII) un polinucleótido que comprende, que consiste esencialmente de, o que consiste de la secuencia como se muestra en la Figura 2K, a partir del residuo de nucleótido número 96 hasta el residuo de nucleótido número 872, incluyendo el codón de detención, en donde T puede ser también U; (XIII) un polinucleótido que comprende, que consiste esencialmente de, o que consiste de la secuencia como se muestra en la Figura 2L, a partir del residuo de nucleótido número 96 hasta el residuo de nucleótido número 872, incluyendo el codón de detención, en donde T puede ser también U; (XIV) un polinucleótido que comprende, que consiste esencialmente de, o que consiste de la secuencia como se muestra en la Figura 2M, a partir del residuo de nucleótido número 96 hasta el residuo de nucleótido número 872, incluyendo el codón de detención, en donde T puede ser también U; (XV) un polinucleótido que comprende, que consiste esencialmente de, o que consiste de la secuencia como se muestra en la Figura 2N, a partir del residuo de nucleótido número 96 hasta el residuo de nucleótido número 872, incluyendo el codón de detención, en donde T puede ser también U; (XVI) un polinucleótido que comprende, que consiste esencialmente de, o que consiste de la secuencia como se muestra en la Figura 20, a partir del residuo de nucleótído número 96 hasta el residuo de nucleótido número 872, incluyendo el codón de detención, en donde T puede ser también U; (XVII) un polinucleótido que comprende, que consiste esencialmente de, o que consiste de la secuencia como se muestra en la Figura 2P, a partir del residuo de nucleótido número 96 hasta el residuo de nucleótido número 872, incluyendo el codón de detención, en donde T puede ser también U; (XVIII) un polinucleótido que comprende, que consiste esencialmente de, o que consiste de la secuencia como se muestra en la Figura 2Q, a partir del residuo de nucleótido número 96 hasta el residuo de nucleótido número 872, incluyendo el codón de detención, en donde T puede ser también U; (XIX) un polinucleótido que codifica para una proteína relacionada a STEAP-l que es al menos 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100% homologa a una secuencia entera de aminoácidos mostrada en la Figura 2A-Q; (XX) un polínucleótido que codifica para una proteína relacionada a STEAP-l que es al menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100% idéntica a una secuencia entera de aminoácidos mostrada en la Figura 2A-Q; (XXI) un polinucleótido que codifica para al menos un péptido descrito en las Tablas V-XVIII y XXII-LI como se describe en la Solicitud de Patente de los Estados Unidos 10/236,878 presentada el 06-Septiembre-2002, los contenidos específicos de la cual se incorporan completamente por referencia en la presente; (XXII) un polinucleótido que codifica para una región peptídica de al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminoácidos de un péptido de la Figura 3A en cualquier incremento de números enteros hasta 339 que incluye al menos 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posiciones de aminoácidos que tienen un valor mayor de 0.5 en el perfil de Hidrofilicidad de la Figura 5; (XXIII) un polinucleótido que codifica para una región peptídica de al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminoácidos de un péptido de la Figura 3A en cualquier incremento de números enteros hasta 339 que incluye 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posiciones de aminoácidos que tienen un valor menor de 0.5 en el perfil de Hidropaticidad de la Figure 6; (XXIV) un polinucleótido que codifica para una región peptídica de al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminoácidos de un péptido de la Figura 3A en cualquier incremento de números enteros hasta 339 que incluye 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posiciones de aminoácidos que tienen un valor mayor de 0.5 en el perfil de Residuos Accesibles Porcentuales de la Figura 7; (XXV) un polinucleótido que codifica para una región peptídica de al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminoácidos de un péptido de la Figura 3A en cualquier incremento de números enteros hasta 399 que incluye 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posiciones de aminoácidos que tienen un valor mayor de 0.5 en el perfil de Flexibilidad Promedio de la Figura 8; (XXVI) un polinucleótido que codifica para una región peptídica de al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminoácidos de un péptido de la Figura 3A en cualquier incremento de números enteros hasta 339 que incluye 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posiciones de aminoácidos que tienen un valor mayor de 0.5 en el perfil de vuelta Beta de la Figura 9; (XXVII) un polinucleótido que codifica para una región peptídica de al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminoácidos de un péptido de las Figuras 3B y 3D en cualquier incremento de. números enteros hasta 258 que incluye 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posiciones de aminoácidos que tienen un valor mayor de 0.5 en el perfil de Hidrofilicidad de la Figura 5; (XXVIII) un polinucleótido que codifica para una región peptídica de al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, .9, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminoácidos de un péptido de las Figuras 3B y 3D en cualquier incremento de números enteros hasta 258 que incluye 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posiciones de aminoácidos que tienen un valor menor de 0.5 en el perfil de Hidropaticidad de la Figure 6; (XXIX) un polinucleótido que codifica para una región peptídica de al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminoácidos de un péptido de las Figuras 3B y 3D en cualquier incremento de números enteros hasta 258 que incluye 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posiciones de aminoácidos que tienen un valor mayor de 0.5 en el perfil de Residuos Accesibles Porcentuales de la Figura 7; (XXX) un polinucleótido que codifica para una región peptídica de al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminoácidos de un péptido de las Figuras 3B y 3D en cualquier incremento de números enteros hasta 258 que incluye 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posiciones de aminoácidos que tienen un valor mayor de 0.5 en el perfil de Flexibilidad Promedio de la Figura 8; (XXXI) un polinucleótido que codifica para una región peptídica de al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminoácidos de un péptido de las Figuras 3B y 3D en cualquier incremento de números enteros hasta 258 que incluye 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posiciones de aminoácidos que tienen un valor mayor de 0.5 en el perfil de vuelta Beta de la Figura 9; (XXXII) un polinucleótido que codifica para una región peptídica de al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminoácidos de un péptido de la Figura 3C en cualquier incremento de números enteros hasta 282 que incluye 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posiciones de aminoácidos que tienen un valor mayor de 0.5 en el perfil de Hidrofilicidad de la Figura 5; (XXXIII) un polinucleótido que codifica para una región peptídica de al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminoácidos de un péptido de la Figura 3C en cualquier incremento de números enteros hasta 282 que incluye 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posiciones de aminoácidos que tienen un valor menor de 0.5 en el perfil de Hidropaticidad de la Figure 6; (XXXIV) un polinucleótido que codifica para una región peptídica de al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35 aminoácidos de un péptido de la Figura 3C en cualquier incremento de números enteros hasta 282 que incluye 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posiciones de aminoácidos que tienen un valor mayor de 0.5 en el perfil de Residuos Accesibles Porcentuales de la Figura 7; (XXXV) un polinucleótido que codifica para una región peptídica de al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminoácidos de un péptido de la Figura 3C en cualquier incremento de números enteros hasta 282 que incluye 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posiciones de aminoácidos que tienen un valor mayor de 0.5 en el perfil de Flexibilidad Promedio de la Figura 8; (XXXVI) un polinucleótido que codifica para una región peptídica de al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminoácidos de un péptido de la Figura 3C en cualquier incremento de números enteros hasta 282 que incluye 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posiciones de aminoácidos que tienen un valor mayor de 0.5 en el perfil de vuelta Beta de la Figura 9; (XXXVII) un polinucleótido que es completamente complementario a un polinucleótido de cualquiera de uno de (I) -(XXXVI) ; (XXXVIII) un polinucleótido que es completamente complementario a un polinucleótído de cualquiera de uno de (I) - (XXXVII) ; (XXXIX) un péptido que es codificado por cualquiera de (I) a (XXXVIII); y; (XL) una composición que comprende un polinucleótido de cualquiera de (I) - (XXXVIII) o un péptido de (XXXIX) junto con un excipiente farmacéutico y/o en una forma de dosis unitaria humana; (XLI) un método para utilizar un polinucleótido de cualquiera de (I) - (XXXVIII) o el péptido de (XXXIX) o una composición de (XL) en un método para modular una célula que expresa STEAP-l; (XLII) un método para utilizar un polinucleótido de cualquiera de (I) - (XXXVIII) o péptido de (XXXIX) o una composición de (XL) en un método para diagnosticar, hacer la profilaxis, pronosticar o tratar a un individuo que lleva una célula que expresa STEAP-1; (XLIII) un método para utilizar un polinucleótido de cualquiera de (I) - (XXXVIII) o un péptido de (XXXIX) o una composición de (XL) en un método para diagnosticar, hacer la profilaxis, pronosticar o tratar un individuo que lleva una célula que expresa STEAP-l, la célula es proveniente de un cáncer de un tejido listado en la Tabla I; (XLIV) un método para utilizar un polinucleótido de cualquiera de (I) - (XXXVIII) o un péptido de (XXXIX) o una composición de (XL) en un método para diagnosticar, realizar la profilaxis, pronosticar o tratar un cáncer; (XLV) un método para utilizar un polinucleótido de cualquiera de (I) - (XXXVIII) o un péptído de (XXXIX) o una composición de (XL) en un método para diagnosticar, realizar la profilaxis, pronosticar, o tratar un cáncer de un tejido listado en la Tabla I; y; (XLVI) un método para utilizar un polinucleótido de cualquiera de (I) - (XXXVIII) o un péptido de (XXXIX) o una composición de (XL) en un método para identificar o caracterizar a un modulador de una célula que expresa STEAP-1. Como se utiliza en la presente, se entiende que un intervalo describe específicamente todas las posiciones unitarias del mismo. Las modalidades típicas de la invención descritas en la presente incluyen los polinucleótidos de STEAP-l que codifican para porciones específicas de las secuencias de mRNA de STEAP-l (y aquellas que son complementarias a tales secuencias) tales como aquellas que codifican para las proteínas y/o fragmentos de las mismas, por ejemplo: (a) 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 330, 335, 339 o más aminoácidos contiguos de la variante 1 de STEAP-l; las longitudes máximas relevantes para otras variantes son: variante 2, 258 aminoácidos; variante 3, 282 aminoácidos, y variante 4, 258 aminoácidos. Por ejemplo, las modalidades representativas de la invención descrita en la presente incluyen: los polinucleótidos y sus péptidos codificados, los mismos que codifican para aproximadamente el aminoácido 1 hasta aproximadamente el aminoácido 10 de la proteína STEAP-l mostrada en las Figuras 2A-2Q o en las Figuras 3A-3D, los polinucleótidos que codifican para aproximadamente el aminoácido 10 hasta aproximadamente el aminoácido 20 de la proteína STEAP-l mostrada en las Figuras 2A-2Q o en las Figuras 3A-3D, los polinucleótidos que codifican para aproximadamente el aminoácido 20 hasta aproximadamente el aminoácido 30 de la proteína STEAP-l mostrada en las Figura- 2A-2Q 2 o en las Figuras 3A-3D, los polinucleótidos que codifican para aproximadamente el aminoácido 30 hasta aproximadamente el aminoácido 40 de la proteína STEAP-l mostrada en las figuras 2A-2Q o en las figuras 3A-3D, los polinucleótidos que codifican para aproximadamente el aminoácido 40 hasta aproximadamente el aminoácido 50 de la proteína STEAP-l mostrada en las figuras 2A-2Q o en las figuras 3A-3D, los polinucleótidos que codifican para aproximadamente el aminoácido 50 hasta aproximadamente el aminoácido 60 de la proteína STEAP-l mostrada en las figuras 2A-2Q o en las figuras 3A-3D, los polinucleótidos que codifican para aproximadamente el aminoácido 60 hasta aproximadamente el aminoácido 70 de la proteína STEAP-l mostrada en las figuras 2A-2Q o en las figuras 3A-3D, los polinucleótidos que codifican para aproximadamente el aminoácido 70 hasta aproximadamente el aminoácido 80 de la proteína STEAP-l mostrada en las figuras 2A-2Q o en las figuras 3A-3D, los polinucleótidos que codifican para aproximadamente el aminoácido 80 hasta aproximadamente el aminoácido 90 de la proteína STEAP-l mostrada en las figuras 2A-2Q o en las figuras 3A-3D, los polinucleótidos que codifican para aproximadamente el aminoácido 90 hasta aproximadamente el aminoácido 100 de la proteína STEAP-l mostrada en las figuras 2A-2Q o en las figuras 3A-3D, en incrementos de aproximadamente 10 aminoácidos, terminando en el aminoácido carboxilo-terminal descrito en las figuras 2A- 2Q o en las figuras 3A-3D. En consecuencia, los polinucleótidos que codifican para porciones de la secuencia de aminoácidos (de aproximadamente 10 aminoácidos) , de los aminoácidos 100 hasta el aminoácido carboxilo-terminal de la proteína STEAP-l, son modalidades de la invención. En donde se entiende que cada posición de aminoácido particular describe esa posición más o menos cinco residuos de aminoácidos . Los polinucleótidos que codifican para porciones relativamente grandes de una proteína STEAP-l están también dentro del alcance de la invención. Por ejemplo, los polinucleótidos que codifican de aproximadamente el aminoácido 1 (ó 20 ó 30 ó 40, etc.) hasta aproximadamente el aminoácido 20, (ó 30, ó 40 ó 50, etc.) de la proteína STEAP-l "o la variante" mostrada en las figuras 2A-20 o en las figuras 3A-3D, pueden ser generados por una variedad de técnicas bien conocidas en la materia. Estos fragmentos de polinucleótido pueden incluir cualquier porción de la secuencia de STEAP-l, como se muestra en la Figura 2. Las modalidades ilustrativas adicionales de la invención descrita en la presente, incluyen los fragmentos polinucleotídicos de STEAP-l que codifican para una o más de las porciones biológicas contenidas dentro de una proteína o secuencia "o variante" de STEAP-l, incluyendo una o más de las subsecuencias que poseen la porción, de una proteína de STEAP-l "o la variante" descrita en las Tablas V-XVIII y XXII-Ll . En otra modalidad, los fragmentos polinucleotídicos típicos de la invención codifican para una o más de las regiones de la proteína o variante de STEAP-l, que muestran homología a una molécula conocida. En otra modalidad de la invención, los fragmentos típicos de polinucleótido pueden codificar para uno o más de los sitios de N-glucosilación de la proteína o variante de STEAP-l, los sitios de fosforilación de la cinasa proteica dependiente del cAMP y del cGMP, los sitios de fosforilación de la caseína-cinasa II o el sitio de N-miristoilación y los sitios de amidación. Nótese que para determinar la posición inicial de cualquier péptido descrito en las Tablas V-XVIII y las Tablas XXII a Ll (colectivamente las Tablas del Péptido HLA) con respecto a su proteína progenitora, por ejemplo la variante 1, la variante 2, etc., se hace referencia a tres factores: la variante particular, la longitud del péptido en una Tabla de Péptidos de HLA; y los Péptidos de Búsqueda listados en la Tabla LII . En general, un Péptido de Búsqueda único es utilizado para obtener los péptidos HLA para una variante particular. La posición de cada Péptido de Búsqueda con relación a su molécula progenitora respectiva se lista en la Tabla LII. En consecuencia, si un Péptido de Búsqueda comienza en la posición "X", se debe agregar el valor "X menos 1" a cada posición en las Tablas V-XVIII y en las Tablas XXII-LI para obtener la posición efectiva de los péptidos HLA en su molécula progenitora. Por ejemplo, si un Péptido de Búsqueda particular comienza en la posición 150 de su molécula progenitora, se debe agregar 150-1, por ejemplo, 149 a cada posición de aminoácido del péptido HLA, para calcular la posición de ese aminoácido en la molécula progenitora.
II.A.) Uso de los Polinucleótidos STEAP-l II. .1.) Monitoreo de las Anormalidades Genéticas Los polinucleótidos de los párrafos precedentes tienen un número de diferentes usos específicos. El gen STEAP-l humano traza el mapa al sitio cromosómico descrito en el Ejemplo titulado "Mapeo Cromosómico de STEAP-l". Por ejemplo, debido a que el gen STEAP-l traza el mapa a este cromosoma, los polinucleótidos que codifican para diferentes regiones de las proteínas STEAP-l se utilizan para caracterizar anormalidades citogenéticas de este sitio cromosómico, tales como las anormalidades que son identificadas como asociadas con diversos cánceres. En ciertos genes, ha sido identificada una variedad de anormalidades cromosómicas incluyendo reacomodos, como anormalidades citogenéticas frecuentes en un número de diferentes cánceres (ver por ejemplo, Krajinovic et al., Mutat. Res. 382(3-4); 81-83 (1998); Johansson et al., Blood 86(10): 3905-3914 (1995) y Finger et al., P.N.A.S. 85(23): 9158-9162 (1988)). De este modo, los polinucleótidos que codifican para las regiones específicas de las proteínas STEAP-l, proporcionan nuevas herramientas que pueden ser utilizadas para delinear, con mayor precisión que lo que era previamente posible, las anormalidades citogenéticas en la región cromosómica que codifica para STEAP-l, que pueden contribuir al fenotipo maligno. En este contexto, estos polinucleótidos satisfacen una necesidad en la técnica para expandir la sensibilidad de la selección cromosómica, con el fin de identificar anormalidades cromosómicas más sutiles y menos comunes (ver, por ejemplo, Evans et al., Am. J. Obstet. Gynecol 171(4) : 1055-1057 (1994) ) . Además, ya que se mostró que STEAP-l es altamente expresado en próstata y otros cánceres, los polinucleótidos de STEAP-l son utilizados en los métodos para evaluar el estado de los productos del gen STEAP-l en tejidos normales versus cancerosos. Típicamente, los polinucleótidos que codifican para las regiones específicas de las proteínas STEAP-l, son utilizados para evaluar la presencia de las perturbaciones (tales como supresiones, inserciones, mutaciones puntuales, o alteraciones que dan como resultado una pérdida de un antígeno, etc.) en regiones específicas del gen STEAP-l, tales como las regiones que contienen una o más porciones. Los ensayos ejemplares incluyen ensayos de RT-PCR así como análisis de polimorfismo de conformación de una sola hebra (SSCP) (ver, por ejemplo, Marrogi et al., J. Cutan. Pathol. 26(8): 369-378 (1999), los cuales utilizan polinucleótidos que codifican para regiones específicas de una proteína, para examinar estas regiones dentro de la proteína. II.A.2.) Modalidades Antisentido Otras modalidades relacionadas a los ácidos nucleicos, específicamente contempladas de la invención descrita en la presente, son el DNA genómico, cDNAs, ribozimas, y moléculas antisentido, así como las moléculas de ácido nucleico basadas en una cadena principal alternativa, o que incluyen bases alternativas, ya sea derivadas de fuentes naturales o sintetizadas, e incluyen moléculas capaces de inhibir la expresión del RNA o de la proteína de STEAP-l. Por ejemplo, las moléculas antisentido pueden ser RNAs u otras moléculas, incluyendo ácidos nucleicos peptídicos (PNAs) u otras moléculas no de ácido nucleico tales como los derivados de fosforotioato que se enlazan específicamente al DNA o al RNA de una manera dependiente de los pares de bases.
Un experto en la técnica puede obtener fácilmente estas clases de moléculas de ácido nucleico utilizando los polinucleótidos de STEAP-l, y las secuencias de polipéptidos descritas en la presente. La tecnología antisentido involucra la administración de oligonucleótidos exógenos que se enlazan a un polinucleótido objetivo localizado dentro de las células. El término "antisentido" se refiere al hecho de que tales oligonucleótidos son complementarios a sus objetivos intracelulares, por ejemplo, STEAP-l. Ver, por ejemplo, Jack Cohén, Oligodeoxynucleotides, Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, 1989; and Synthesis 1:1-5 (1988). Los oligonucleótidos antisentido de STEAP-l de la presente invención incluyen derivados tales como los S-oligonucleótidos (derivados de fosforotioato de S-oligos, ver, Jack Cohén, supra) , que muestran acción inhibitoria mejorada del crecimiento de las células cancerosas. Los S-oligos (fosforotioatos del nucleósido) son análogos isoelectrónicos de un oligonucleótido (O-oligo) en el cual un átomo de oxígeno no formador de puente del grupo fosfato es reemplazado por un átomo de azufre. Los S-oligos de la presente invención pueden ser preparados mediante tratamiento de los O-oligos correspondientes con 3H-1, 2-benzoditiol-3-ona-1, 1-dióxido, que es un reactivo de transferencia de azufre. Ver, por ejemplo, Iyer, R. P. et al., J. Org. Chem. 55:4693-4698 (1990); y Iyer, R. P. et al, J. Am. Chem. Soc. 112:1253-1254 (1990). Los oligonucleótidos antisentido de STEAP-l adicionales de la presente invención incluyen oligonucleótidos antisentido de morfolino conocidos en la técnica (ver, polipéptidos, Partridge et al., 1996, Antisense & Nucleic Acid Drug Development 6: 169-175) . Los oligonucleótidos antisentido de STEAP-l de la presente invención pueden ser típicamente RNA o DNA que es complementario a y se hibrida establemente con los primeros 100 codones 5' o los últimos 100 codones 3' de la secuencia genómica de STEAP-l o el mRNA correspondiente. No se requiere complementariedad absoluta, aunque son preferidos altos grados de complementariedad. El uso de un oligonucleótido complementario para esta región permite la hibridación selectiva del mRNA de STEAP-l y no al mRNA que específica otras subunidades reguladoras de la proteína cinasa. En una modalidad, los oligonucleótidos antisentido de STEAP-l de la presente invención son de 15 a 30 fragmentos mer de la molécula de DNA antisentido que tienen una secuencia que se hibrida al mRNA de STEAP-l. Opcionalmente, el oligonucleótido antisentido de STEAP-l es un oligonucleótido de 30 mer que es complementario a una región en los primeros 10 codones 5' y los últimos 10 codones 3' de STEAP-l. Alternativamente, las moléculas antisentido son modificadas para emplear ribozimas en la inhibición de la expresión de STEAP-l, ver, por ejemplo L. A. Couture & D. T. Stinchcomb; Trends Genet 12: 510-515 (1996).
II.A.3.) Cebadores y Pares de Cebadores Modalidades específicas adicionales de estos nucleótidos de la invención, incluyen cebadores y pares de cebadores, que permiten la amplificación específica de los polinucleótidos de la invención o de cualesquiera partes específicas de los mismos, y las sondas que se hibridan de manera selectiva y específica a las moléculas de ácido nucleico de la invención o a cualquier parte de las mismas. Las sondas pueden ser marcadas con un marcador detectable, tal como, por ejemplo, un radioisótopo, compuesto fluorescente, compuesto bioluminiscente, un compuesto quimioluminiscente, quelante de metales o enzima. Tales sondas y cebadores son utilizados para detectar la presencia de un polinucleótido de STEAP-l en una muestra, y como un medio para detectar una célula que expresa una proteína STEAP-l. Los ejemplos de tales sondas incluyen los polipéptidos que comprenden toda o parte de la secuencia de cDNA de STEAP-l humana, mostrada en la Figura 2. Los ejemplos de pares de cebadores capaces de amplificar específicamente los mRNAs de STEAP-l, se describen también en los Ejemplos. Como será entendido por la persona experta, muchos cebadores y sondas muy diferentes pueden ser preparados con base en las secuencias proporcionadas en la presente, y utilizados efectivamente para amplificar y/o detectar un mRNA de STEAP-l. Los polinucleótidos de STEAP-l de la invención son útiles para una variedad de propósitos, incluyendo pero no limitados a su uso como sondas y cebadores para la amplificación y/o detección del o de los genes de STEAP-l, los mRNA(s), o fragmentos de los mismos, como reactivos para el diagnóstico y/o pronóstico del cáncer de próstata y otros cánceres; como secuencias de codificación capaces de dirigir la expresión de los polipéptidos de STEAP-l; como herramientas para modular o inhibir la expresión del o de los genes de STEAP-l y/o la traducción del o de los transcritos de STEAP-l; y como agentes terapéuticos. La presente invención incluye el uso de cualquier sonda como se describe en la presente, para identificar y aislar un STEAP-l o una secuencia de ácido nucleico relacionada a STEAP-1, a partir de una fuente de origen natural, tales como humanos u otros mamíferos, así como la secuencia de ácido nucleico aislada per se, que comprendería todas o la mayoría de las secuencias encontradas en la sonda utilizada.
II.A.4.) Aislamiento de las Moléculas de Ácido Nucleico que Codifican para STEAP-l Las secuencias de cDNA de STEAP-l descritas en la presente, hacen posible el aislamiento de otros polinucleótidos que codifican para el o los productos del gen de STEAP-l, así como el aislamiento de los polinucleótidos que codifican para los homólogos del producto génico de STEAP-1, alternativamente las isoformas empalmadas, las variantes alélicas, las formas mutantes de un producto del gen STEAP-l, así como los polinucleótidos que codifican para los análogos de proteínas relacionadas a STEAP-l. Diversos métodos de clonación molecular que pueden ser empleados para aislar los cDNAs de longitud completa que codifican para un gen de STEAP-1, son bien conocidos (ver, por ejemplo, Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edición, Cold Spring Harbor Press, New York, 1989; Current Protocols in Molecular Biology. Ausubel et al., Eds., Wiley and Sons, 1995) . Por ejemplo, las metodologías de clonación de fago lambda pueden ser convenientemente empleadas, utilizando sistemas de clonación comercialmente disponibles (por ejemplo, Lambda ZAP Express, Stratagene) . Los clones de fago que contienen cDNAs del gen de STEAP-l pueden ser identificados mediante sondeo con el cDNA de STEAP-l marcado, o un fragmento del mismo. Por ejemplo, en una modalidad, un cDNA de STEAP-l (por ejemplo, Figura 2) o una porción del mismo puede ser sintetizada y utilizada como una sonda para recuperar los cDNAs traslapados y de longitud completa correspondientes a un gen de STEAP-l. Un gen de STEAP-l mismo puede ser aislado mediante selección de las bibliotecas de ADN genómico, bibliotecas de cromosomas artificiales bacterianos (BACs) , bibliotecas de cromosomas artificiales de levadura (YACs) , y similares, con las sondas o cebadores de DNA de STEAP-l.
II.A.5.) Moléculas Recombinantes de Ácido Nucleico y Sistemas Hospedero-Vector La invención también proporciona las moléculas recombinantes de DNA o RNA que contienen un polinucleótido de STEAP-l, un fragmento, análogo u homólogo del mismo, incluyendo, pero no limitados a fagos, plásmidos, fagémidos, cósmidos, YACs, BACs, así como diversos vectores virales y no virales bien conocidos en la materia, y las células transformadas o transfectadas con tales moléculas de DNA o RNA recombinantes. Los métodos para generar tales moléculas son bien conocidos (ver, por ejemplo, Sambrook et al., 1989, supra) . La invención proporciona además un sistema de hospedero-vector que comprende una molécula de DNA recombinante que contiene un polinucleótido de STEAP-l, un fragmento, análogo u homólogo del mismo, dentro de una célula hospedera procariótica y eucariótica, adecuada. Los ejemplos de células hospederas eucarióticas adecuadas incluyen una célula de levadura, una célula vegetal, o una célula animal, tal como una célula de mamífero o una célula de insecto (por ejemplo, células infectables por baculovirus tales como una célula Sf9 o HighFive) . Los ejemplos de células de mamífero adecuadas incluyen diversas células de próstata y líneas tales como DU145 y TsuPrl, otras líneas celulares de cáncer de próstata transfectables o transducibles, células primarias (PrEC) , así como un número de células de mamífero rutinariamente utilizadas para la expresión de proteínas recombinantes (por ejemplo, células COS, CHO, 293, 293T) . Más particularmente, un polinucleótido que comprende la secuencia de codificación de STEAP-l o un fragmento, análogo u homólogo del mismo, puede ser utilizado para generar proteínas STEAP-l o fragmentos de las mismas utilizando cualquiera de los sistemas de hospedero-vector rutinariamente utilizados y ampliamente conocidos en la materia. Una amplía gama de sistemas hospedero-vector adecuados para la expresión de las proteínas STEAP-l o fragmentos de las mismas, son disponibles, (ver por ejemplo, Sambrook et al, 1989, supra; Current Protocols in Molecular Biology, 1995, supra) . Los vectores preferidos para la expresión en mamífero incluyen pero no están limitados a pcDNA 3.1 myc-His-tag (Invitrogen) y el vector retroviral pSRatkneo (Muller et al., 1991, MCB 11:1785). Utilizando estos vectores de expresión, STEAP-l puede ser expresado en varias líneas celulares de cáncer de próstata y no de próstata, incluyendo por ejemplo 293, 293T, rat-1, NIH 3T3 y TsuPrl . Los sistemas hospedero-vector de la invención son útiles para la producción de la proteína STEAP-l o un fragmento de la misma. Tales sistemas de hospedero-vector pueden ser empleados para estudiar las propiedades funcionales de STEAP-l y las mutaciones y análogos de STEAP- 1. La proteína STEAP-l humana recombinante o un análogo u homólogo o fragmento de la misma, puede ser producida por células de mamífero transfectadas con una construcción que codifica para un nucleótido relacionado a STEAP-l. Por ejemplo, las células 293T pueden ser transfectadas con un plásmido de expresión que codifica para STEAP-l o el fragmento, análogo u homólogo del mismo, una proteína relacionada a STEAP-l es expresada en las células 293T, y la proteína STEAP-l recombinante es aislada utilizando métodos de purificación estándares (por ejemplo, purificación de afinidad utilizando anticuerpos anti-STEAP-1) . En otra modalidad más, una secuencia de codificación de STEAP-l es subclonada dentro del vector retroviral pSRaMSVtkneo y utilizado para infectar diversas líneas celulares de mamífero, tales como NIH 3T3, TsuPrl, 293 y rat-1, con el fin de establecer líneas celulares que expresan STEAP-1. Otros diversos sistemas de expresión bien conocidos en la técnica pueden también ser empleados. Las construcciones de expresión que ^codifican para un péptido guía unido intraestructuralmente a una secuencia que codifica para STEAP-l, pueden ser utilizadas para la generación de una forma secretada de proteína STEAP-l recombinante. Como se discute en la presente, la redundancia en el código genético permite la variación en las secuencias del gen de STEAP-l. En particular, es conocido en la técnica que las especies hospederas específicas a menudo tienen preferencias de codón específicas, y de este modo se puede adaptar la secuencia descrita, como se prefiera, para un hospedero deseado. Por ejemplo, las secuencias preferidas de codón análogo tienen típicamente codones raros (por ejemplo, codones que tienen una frecuencia de uso de menos de aproximadamente 20% en las secuencias conocidas del hospedero deseado) reemplazados con codones de más alta frecuencia. Las preferencias de codón para una especie específica son calculadas, por ejemplo, mediante la utilización de las tablas de uso de codones, disponibles en la INTERNET tales como URL dna.affrc.go.jp/~nakamura/codon.html. Las modificaciones de secuencia adicionales se sabe que aumentan la expresión de la proteína en una célula hospedera. Éstas incluyen la eliminación de las secuencias que codifican para las señales de poliadenilación espurias, señales del sitio de empalme exón/intrón, repeticiones similares al transposon, y/o otras secuencias bien caracterizadas que son dañinas para la expresión del gen. El contenido de GC de la secuencia es ajustado a niveles promedio para un hospedero celular dado, como es calculado por referencia a los genes conocidos expresados en la célula hospedera. Donde sea posible, la secuencia es modificada para evitar las estructuras predichas del piRNA secundario en forma de orquilla. Otras modificaciones útiles incluyen la adición de una secuencia de consenso de inicio de la traducción, en el inicio de la estructura de lectura abierta, como se describe en Kozak, Mol. Cell Biol., 9:5073-5080 (1989) . Los expertos en la técnica entienden que la regla general que los ribosomas eucarióticos inician la traducción exclusivamente en el codón AUG 5' -proximal, es abrogado únicamente bajo condiciones raras (ver, por ejemplo, Kozak PNAS 92(7): 2662-2666, (1995) y Kozak NAR 15(20): 8125-8148 (1987) ) .
III . ) Proteínas Relacionadas a STEAP-l Otro aspecto de la presente invención proporciona las proteínas relacionadas a STEAP-l. Las modalidades específicas de las proteínas de STEAP-1 comprenden un polipéptido que tiene toda o parte de la secuencia de aminoácidos del STEAP-l humano, como se muestra en las figuras 2A-2Q o en las figuras 3A-3D, preferentemente la Figura 2A. Alternativamente, las modalidades de las proteínas STEAP-l comprenden polipéptidos variantes, homólogos o análogos que tienen alteraciones en la secuencia de aminoácidos de STEAP-l, mostrada en las figuras 2A-2Q o en las figuras 3A-3D. Las modalidades de un polipéptido de STEAP-l incluyen: un polipéptido de STEAP-l que tiene una secuencia mostrada en la Figura 2, una secuencia peptídica de un STEAP-1 como se muestra en la Figura 2, en donde T es U; al menos 10 nucleótidos contiguos de un polipéptido que tiene la secuencia como se muestra en la Figura 2; o, al menos 10 péptidos contiguos de un polipéptido que tienen la secuencia como se muestra en la Figura 2, donde T es U. Por ejemplo, las modalidades de los péptidos STEAP-1 comprenden, sin limitación: (I) una proteína que comprende, que consiste esencialmente de o que consiste de una secuencia de aminoácidos como se muestra en la Figura 2A-Q o Figura 3A-D; (II) una proteína relacionada a STEAP-l que es al menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100% homologa a una secuencia entera de aminoácidos mostrada en la Figura 2 -Q o 3 -D; (III) una proteína relacionada a STEAP-l que es al menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100% idéntica a una secuencia entera de aminoácidos mostrada en las Figuras 2A-Q o 3A-D; (IV) una proteína que comprende al menos un péptido descrito en las Tablas V a Ll como se describe en la Solicitud de Patente de los Estados Unidos 10/236,878 presentada el 06-Septiembre~2002 los contenidos específicos de las cuales se incorporan por referencia en la presente, opcionalmente con una condición de que no sea una proteína completa de la Figura 2; (V) una proteína que comprende al menos un péptido descrito en las Tablas V-XVIII, colectivamente, cuyo péptido es también descrito en las Tablas XXII a Ll, colectivamente, opcionalmente con una condición de que no sea una proteína completa de la Figura 2; (VI) una proteína que comprende al menos dos péptidos seleccionados de los péptidos descritos en las Tablas V-Ll, opcionalmente con una condición de que no sea una proteína completa de la Figura 2; (VII) una proteína que comprende al menos dos péptidos seleccionados de los péptidos descritos en las Tablas V a Ll colectivamente, con la condición de que la proteína no sea una secuencia contigua de una secuencia de aminoácidos de la Figura 2; (VIII) una proteína que comprende al menos un péptido seleccionado de los péptidos descritos en las Tablas V-XVIII; y al menos un péptido seleccionado de los péptidos descritos en las Tablas XXII a Ll, con la condición de que la proteína no sea una secuencia contigua de una secuencia de aminoácidos de la Figura 2; (IX) un polipéptido que comprende al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminoácidos de una proteína de la Figura 3A en cualquier incremento de números enteros hasta 339 respectivamente que incluye al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posiciones de aminoácidos que tienen un valor mayor de 0.5 en el perfil de Hidrofilicidad de la Figura 5; (X) un polípéptido que comprende al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminoácidos de una proteína de la Figura 3A en cualquier incremento de números enteros hasta 339 respectivamente que incluye al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posiciones de aminoácidos que tienen un valor menor de 0.5 en el perfil de Hidropaticidad de la Figura 6; (XI) un polipéptido que comprende al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminoácidos de una proteína de la Figura 3A en cualquier incremento de números enteros hasta 339 respectivamente que incluye al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posiciones de aminoácidos que tienen un valor mayor de 0.5 en el perfil de Residuos Accesibles Porcentuales de la Figura 7; (XII) un polipéptido que comprende al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminoácidos de una proteína de la Figura 3A en cualquier incremento de números enteros hasta 339 respectivamente que incluye al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posiciones de aminoácidos que tienen un valor mayor de 0.5 en el perfil de Flexibilidad Promedio de la Figura 8; (XIII) un polipéptido que comprende al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, aminoácidos de una proteína de la Figura 3A en cualquier incremento de números enteros hasta 339 respectivamente que incluye al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posiciones de aminoácidos que tienen un valor mayor de 0.5 en el perfil de vuelta Beta de la Figura 9; (XIV) un polipéptido que comprende al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminoácidos de una proteína de las Figuras 3B o 3D, en cualquier incremento de números enteros hasta 258 respectivamente que incluye al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posiciones de aminoácidos que tienen un valor mayor de 0.5 en el perfil de Hidrofilicidad de la Figura 5; (XV) un polipéptido que comprende al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminoácidos de una proteína de las Figuras 3B o 3D, en cualquier incremento de números enteros hasta 258 respectivamente que incluye al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posiciones de aminoácidos que tienen un valor menor de 0.5 en el perfil de Hidropaticidad de la Figura 6; (XVI) un polipéptido que comprende al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminoácidos de una proteína de las Figuras 3B o 3D, en cualquier incremento de números enteros hasta 258 respectivamente que incluye al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posiciones de aminoácidos que tienen un valor mayor de 0.5 en el perfil de Residuos Accesibles Porcentuales de la Figura 7; (XVII) un polipéptido que comprende al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminoácidos de una proteína de las Figuras 3B o 3D, en cualquier incremento de números enteros hasta 258 respectivamente que incluye al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posiciones de aminoácidos que tienen un valor mayor de 0.5 en el perfil de Flexibilidad Promedio de la Figura 8; (XVIII) un polipéptido que comprende al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, aminoácidos de una proteína de las Figuras 3B o 3D en cualquier incremento de números enteros hasta 258 respectivamente que incluye al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posiciones de aminoácidos que tienen un valor mayor de 0.5 en el perfil de vuelta Beta de la Figura 9; (XIX) un polipéptido que comprende al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminoácidos de una proteína de la Figura 3C, en cualquier incremento de números enteros hasta 282 respectivamente que incluye al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posiciones de aminoácidos que tienen un valor mayor de 0.5 en el perfil de Hidrofilicidad de la Figura 5; (XX) un polipéptido que comprende al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminoácidos de una proteína de la Figura 3C, en cualquier incremento de números enteros hasta 282 respectivamente que incluye al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posiciones de aminoácidos que tienen un valor menor de 0.5 en el perfil de Hidropaticidad de la Figura 6; (XXI) un polipéptido que comprende al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminoácidos de una proteína de la Figura 3C, en cualquier incremento de números enteros hasta 282 respectivamente que incluye al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posiciones de aminoácidos que tienen un valor mayor de 0.5 en el perfil de Residuos Accesibles Porcentuales de la Figura 7; (XXII) un polipéptido que comprende al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 aminoácidos de una proteína de la Figura 3C, en cualquier incremento de números enteros hasta 282 respectivamente que incluye al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posiciones de aminoácidos que tienen un valor mayor de 0.5 en el perfil de Flexibilidad Promedio de la Figura 8; (XXIII) un polipéptido que comprende al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, aminoácidos de una proteína de la Figura 3C en cualquier incremento de números enteros hasta 282 respectivamente que incluye al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 posiciones de aminoácidos que tienen un valor mayor de 0.5 en el perfil de vuelta Beta de la Figura 9; (XXIV) un péptido que aparece al menos dos veces en las Tablas V-XXVIII y XXII a Ll, colectivamente; (XXV) un péptido que aparece al menos tres veces en las Tablas VI-XXVIII y XXII a Ll, colectivamente; (XXVI) un péptido que aparece al menos cuatro veces en las Tablas V-XXVIII y XXII a Ll, colectivamente; (XXVII) un péptido que aparece al menos cinco veces en las Tablas V-XXVIII y XXII a Ll, colectivamente; (XXVIII) un péptido que aparece al menos una vez en las Tablas V-XVIII, y al menos una vez en las Tablas XXII a Ll; (XXIX) un péptido que aparece al menos once en las Tablas V-XVIII, y al menos dos veces en las Tablas XXII a Ll; (XXX) un péptido que aparece al menos dos veces en las Tablas V-XVIII, y al menos una vez en las Tablas XXII a Ll; (XXXI) un péptido que aparece al menos dos veces en las Tablas V-XVIII, y al menos dos veces en las Tablas XXII a Ll; (XXXII) un péptido que comprende una, dos, tres, cuatro o cinco de las siguientes características, o un oligonucleótido que codifica para tal péptido: i) una región de al menos 5 aminoácidos de un péptido particular de la Figura 3, en cualquier incremento de números enteros hasta la longitud completa de esa proteína en la Figura 3, que incluye una posición de aminoácidos que tiene un valor igual a o mayor de 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, o que tiene un valor igual a 1.0, en el perfil de Hidrofilicidad de la ' Figura 5; ii) una región de al menos 5 aminoácidos de un péptido particular de la Figura 3, en cualquier incremento de números enteros hasta la longitud completa de esa proteína en la Figura 3, que incluye una posición de aminoácidos que tiene un valor igual a o menor de 0.5, 0.4, 0.3, 0.2, 0.1, o que tiene un valor igual a 0.0, en el perfil de Hidropaticidad de la Figura 6; iii) una región de al menos 5 aminoácidos de un péptido particular de la Figura 3, en cualquier incremento de números enteros hasta la longitud completa de esa proteína en la Figura 3, que incluye una posición de aminoácidos que tiene un valor igual a o mayor de 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, o que tiene un valor igual a 1.0, en el perfil de Residuos Accesibles Porcentuales de la Figura 7; iv) una región de al menos 5 aminoácidos de un péptido particular de la Figura 3, en cualquier incremento de números enteros hasta la longitud completa de esa proteína en la Figura 3, que incluye una posición de aminoácidos que tiene un valor igual a o mayor de 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, o que tiene un valor igual a 1.0, en el perfil de Flexibilidad Promedio de la Figura 8; o, v) una región de al menos 5 aminoácidos de un péptido particular de la Figura 3, en cualquier incremento de números enteros hasta la longitud completa de esa proteína en la Figura 3, que incluye una posición de aminoácidos que tiene un valor igual a o mayor de 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, o que tiene un valor igual a 1.0, en el perfil de vuelta Beta de la Figura 9; (XXXIII) una composición que comprende un péptido de (I) -(XXXII) o un anticuerpo o región de enlace del mismo junto con un excipiente farmacéutico y/o una forma de dosis unitaria humana. (XXXIV) un método de uso de un péptido de (I)- (XXXII), o un anticuerpo o región de enlace del mismo, o una composición de (XXXIII) en un • método para modular una célula que expresa STEAP-l? (XXXV) un método de uso de un péptido de (I)- (XXXII) o un anticuerpo o región de enlace del mismo, o una composición de (XXXIII) en un método para diagnosticar, hacer la profilaxis, pronosticar, o tratar a un individuo quien posee una célula que expresa STEAP-l; (XXXVI) un método de uso de un péptido de (I)- (XXXII) o un anticuerpo o región de enlace del mismo, o una composición (XXXIII) en un método para diagnosticar, hacer la profilaxis, pronosticar, o tratar a un individuo quien posee una célula que expresa STEAP-l, la célula es proveniente de un cáncer de un tejido listado en la Tabla I; (XXXVII) un método de uso de un péptido de (I)- (XXXII) o un anticuerpo o región de enlace del mismo, o una composición de (XXXIII) en un método para diagnosticar, hacer la profilaxis, pronosticar o tratar un cáncer; (XXXVIII) un método de uso de un péptido de (I)- (XXXII) o un anticuerpo o región de enlace del mismo, o una composición de (XXXIII) en un método para diagnosticar, hacer la profilaxis, pronosticar o tratar un cáncer de un tejido listado en la Tabla I; y; (XXXIX) un método de uso de un péptido de (I)- (XXXII) o un anticuerpo o región de enlace del mismo, o una composición (XXXIII) en un método para identificar o caracterizar un modulador de una célula que expresa STEAP-l; Como se utiliza en la presente, se entiende que un intervalo describe específicamente todas las posiciones unitarias enteras del mismo. Las modalidades típicas de la invención descrias en la presente incluyen los polinucleótidos de STEAP-l que codifican para las porciones específicas de las secuencias de mRNA de STEAP-l (y aquellas que son complementarias para tales secuencias) tales como aquellas que codifican para proteínas y/o fragmentos de las mismas, por ejemplo: (a) 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 330, 335, 339 o más aminoácidos contiguos de la variante 1 de STEAP-l; las longitudes máximas relevantes para otras variantes son: variante 2, 258 aminoácidos; variante 3, 282 aminoácidos, variante 4, 258 aminoácidos . En general, las variantes alélicas de origen natural de STEAP-l humano comparten un alto grado de identidad estructural y homología (por ejemplo, 90% o más de homología) . Típicamente, las variantes alélicas de una proteína de STEAP-l contienen sustituciones conservadoras de aminoácidos dentro de las secuencias de STEAP-l descritas en la presente, o contienen una sustitución de un aminoácido a partir de una posición correspondiente en un homólogo de STEAP-l. Una clase de variantes alélícas de STEAP-l son las proteínas que comparten un alto grado de homología con al menos una pequeña región de una secuencia de aminoácidos particular de STEAP-l, pero además contienen una desviación radical de la secuencia, tal como una sustitución no conservadora, truncamiento, inserción o desplazamiento estructural. En comparaciones de las secuencias de proteína, los términos, similitud, identidad, y homología tienen cada uno un significado distinto como es apreciado en el campo de la genética. Además, la ortología y la paralogía pueden ser conceptos importantes que describen la relación de los miembros de una familia de proteínas dada, en un organismo a los miembros de la misma familia en otros organismos. Las abreviaturas de aminoácidos son proporcionadas en la Tabla II. Las sustituciones conservadoras de aminoácidos pueden ser frecuentemente realizadas en una proteína sin alterar la conformación o la función de la proteína. Las proteínas de la invención pueden comprender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 sustituciones conservadoras. Las modalidades de la invención descrita en la presente incluyen una amplia variedad de variantes o análogos aceptados en la técnica, de las proteínas de STEAP-l tales como los polipéptidos que tienen las inserciones, supresiones y sustituciones de aminoácidos. Las variantes de STEAP-l pueden ser elaboradas utilizando métodos conocidos en la técnica tales como la mutagénesis dirigida al sitio, mutagénesis de exploración de alanina y de PCR. La mutagénesis dirigida al sitio (Cárter et al., Nucí. Acids Res., 73:4331 (1986); Zoller et al., Nucí. Acids Res., 70:6487 (1987)), mutagénesis de cásete (Wells et al., Gene, 34:315 (1985)), mutagénesis de selección de restricción (Wells et al., Philos . Trans. R. Soc. London SerA, 317:415 (1986) ) u otras técnicas conocidas pueden ser realizadas sobre el DNA clonado para producir el DNA variante de STEAP- 1. El análisis de exploración de aminoácidos puede ser también empleado para identificar uno o más aminoácidos a lo largo de una secuencia contigua, que están involucrados en una actividad biológica específica, tal como una interacción proteína-proteína.- Entre los aminoácidos de exploración preferidos están los aminoácidos relativamente pequeños, neutros. Tales aminoácidos incluyen alanina, glicina, serina y cisteína. La alanina es típicamente un aminoácido de exploración preferido entre este grupo, debido a que ésta elimina la cadena lateral más allá del carbono beta, y es menos probable que altere la conformación de cadena principal de la variante. La alanina es también típicamente preferida debido a que éste es el aminoácido más común. Además, ésta es frecuentemente encontrada en "posiciones enterradas y expuestas (Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothía, J. Mol. Biol., 150:1 (1976)). Si la sustitución de alanina no produce cantidades adecuadas de la variante, puede ser utilizado un aminoácido isostérico. Como se definen en la presente, las variantes, análogos u homólogos de STEAP-l, tienen el atributo distintivo de tener al menos un epitopo que es de "reactividad cruzada" con una proteína STEAP-l que tiene una secuencia de aminoácidos de la Figura 3. Como se utiliza en este enunciado, "reactividad cruzada" significa que un anticuerpo o célula T que se enlaza específicamente a una variante de STEAP-l, también se enlaza específicamente a una proteína de STEAP-l que tiene una secuencia de aminoácidos descrita en la Figura 3. Un polipéptido deja de ser una variante de una proteína mostrada en la Figura 3, cuando éste ya no contiene ningún epitopo capaz de ser reconocido por un anticuerpo o célula T que se enlaza específicamente a la proteína STEAP-l inicial. Aquellos expertos en la técnica entienden que los anticuerpos que reconocen las proteínas se enlazan a los epitopos de tamaño variante, y un agrupamiento del orden de aproximadamente cuatro o cinco aminoácidos, contiguos o no, es considerado como un número típico de los aminoácidos en un epitopo mínimo. Ver, por ejemplo, Nair et al., J. Immunol 2000 165(12): 6949-6955; Hebbes et al., Mol Immunol (1989) 26(9): 865-73; Schwartz et al., J Immunol (1985) 135(4) : 2598-608. Otras clases de variantes de proteínas relacionadas a STEAP-l comparten 70%, 75%, 80%, 85% o 90% o más de similitud con una secuencia de aminoácidos de la Figura 3, o un fragmento de la misma. Otra clase específica de variantes o análogos de la proteína STEAP-l, comprende una o más de las porciones biológicas de STEAP-l descritas en la presente o actualmente conocidas en la técnica. De este modo, abarcados por la presente invención están los análogos de los fragmentos de STEAP-l (ácido nucleico o aminoácido) que tienen propiedades funcionales alteradas (por ejemplo inmunogénicas) con relación al fragmento inicial. Se debe apreciar que las porciones de ahora o las cuales se vuelvan parte de la técnica, tienen que ser aplicadas a las secuencias de ácido nucleico o de aminoácido de las figuras 2A-2Q o de las figuras 3A-3D. Como se discute en la presente, las modalidades de la invención reclamada incluyen los polipéptidos que contienen menos de la secuencia de aminoácidos completa de una proteína STEAP-l mostrada en las figuras 2A-2Q o en las figuras 3A-3D. Por ejemplo, las modalidades representativas de la invención comprenden péptidos/proteínas que tienen cualquiera de los 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o más aminoácidos contiguos de una proteína STEAP-l mostrada en las figuras 2A-2Q o en las figuras 3A-3D. Además, las modalidades representativas de la invención descrita en la presente, incluyen los polipéptidos que consisten de aproximadamente el aminoácido 1 a aproximadamente el aminoácido 10 de una proteína STEAP-l mostrada en las figuras 2A-2Q o en las figuras 3A-3D, polipéptidos que consisten de aproximadamente el aminoácido 10 a aproximadamente el aminoácido 20 de una proteína STEAP-l mostrada en las figuras 2A-2Q o en las figuras 3A-3D, polipéptidos que consisten de aproximadamente el aminoácido 20 a aproximadamente el aminoácido 30 de una proteína STEAP-l mostrada en las figuras 2A-2Q o en las figuras 3A-3D, polipéptidos que consisten de aproximadamente el aminoácido 30 a aproximadamente el aminoácido 40 de una proteína STEAP-l mostrada en las figuras 2A-2Q o en las figuras 3A-3D, polipéptidos que consisten de aproximadamente el aminoácido 40 a aproximadamente el aminoácido 50 de una proteína STEAP-l mostrada en las figuras 2A-2Q o en las figuras 3A-3D, polipéptidos que consisten de aproximadamente el aminoácido 50 a aproximadamente el aminoácido 60 de una proteína STEAP-l mostrada en las figuras 2A-2Q o en las figuras 3A-3D, polipéptidos que consisten de aproximadamente el aminoácido 60 a aproximadamente el aminoácido 70 de una proteína STEAP-l mostrada en las figuras 2A-2Q o en las figuras 3A-3D, polipéptidos que consisten de aproximadamente el aminoácido 70 a aproximadamente el aminoácido 80 de una proteína STEAP-l mostrada en las figuras 2A-2Q o en las figuras 3A-3D, polipéptidos que consisten de aproximadamente el aminoácido 80 a aproximadamente el aminoácido 90 de una proteína STEAP-l mostrada en las figuras 2A-2Q o en las figuras 3A-3D, polipéptidos que consisten de aproximadamente el aminoácido 90 a aproximadamente el aminoácido 100 de una proteína STEAP-1 mostrada en las figuras 2A-2Q o en las figuras 3A-3D, etc., a todo lo largo de la totalidad de una secuencia de aminoácidos de STEAP-l. Además, los polipéptidos que consisten de aproximadamente el aminoácido 1 (ó 20 ó 30 ó 40, etc.) hasta aproximadamente el aminoácido 20, (ó 130, ó 140, ó 150, etc.) de una proteína STEAP-l mostrada en las figuras 2A-2Q o en las figuras 3A-3D, son modalidades de la invención. Se debe apreciar que las posiciones iniciales y de detención en este párrafo se refieren a la posición especificada así como aquella posición más o menos 5 residuos . Las proteínas relacionadas de STEAP-l son generadas utilizando tecnología estándar de síntesis de péptidos o el uso de los métodos de escisión química bien conocidos en la técnica. Alternativamente, pueden ser utilizados los métodos recombinantes para generar moléculas de ácido nucleico que codifican para una proteína relacionada a STEAP-l. En una modalidad, las moléculas de ácido nucleico proporcionan un medio para generar fragmentos definidos de una proteína STEAP-l (o variantes, homólogos o análogos de la misma) .
III. .) Modalidades de Proteina que Poseen la Porción Las modalidades ilustrativas adicionales de la invención descrita en la presente, incluyen los polipéptidos de STEAP-1 que comprenden los residuos de aminoácidos de una o más de las porciones biológicas contenidas dentro de una secuencia del polipéptido de STEAP-l descrita en las figuras 2A-2Q o en las figuras 3A-3D. Diversas porciones son conocidas en la técnica, y una proteína puede ser evaluada para la presencia de tales porciones por un número de sitos de Internet públicamente disponibles (por ejemplo, las direcciones de URL: pfam.wustl.edu/; serachíauncher .bcm. tmc. edu/seq-search/struc-predict . html; sport.ims.u-tokyo.ac.jp/; cbs.dtu.dk/; ebi . ac.uk/interpro/scan. html; expasy . ch/tools/scnpsiti . html; Epimatrix™ y Epimer™, Brown University, brown. edu/Research/TB-HIV__Lab/epimatrix/epimatrix.html; y BIMAS, bimas.dcrt.nih.gov/.). Las subsecuencias que llevan porciones de todas las proteínas variantes de STEAP-l se describen y se identifican en las Tablas VV-XVII y XXII-LI. La Tabla IV (h) describe varias porciones que aparecen frecuentemente, basadas en las búsquedas de pfam (ver la dirección de URL pfa.wustl.edu/). Las columnas de la Tabla IV (h) listan (1) la abreviatura del nombre de la porción, (2) la identidad porcentual encontrada entre diferentes miembros de la familia de porciones, (3) el nombre o descripción de la porción y (4) la función más común; la información de la localización es incluida si la porción es relevante para la posición. Los polipéptidos que comprenden una o más de las porciones de STEAP-l discutidas anteriormente, son útiles en la elucidación de las características específicas de un fenotipo maligno en vista de la observación de que las porciones de STEAP-l discutidas anteriormente están asociadas con la desregulación del crecimiento, y debido a que STEAP-l es sobreexpresada en ciertos cánceres (ver, por ejemplo, Tabla I) . La caseína cinasa II, cAMP y la cinasa proteica dependiente de camp, y la cinasa proteica C, por ejemplo, son enzimas que se sabe están asociadas con el desarrollo del fenotipo maligno ver, por ejemplo, Chen et al., Lab Invest., 78(2): 165-174 (1998); Gaiddon et al., Endocrinology 136(10): 4331-4338 (1995); Hall et al., Nucleic Acids Research 24(6): 1119-1126 (1996); Peterziel et al., Oncogene 18(46): 6322-6329 (1999) y O'Brian, Oncol. Rep. 5(2): 305-309 (1998)). Además, la glucosilación y la miristoilación son modificaciones a las proteínas también asociadas con el cáncer y la progresión del cáncer ver por ejemplo Dennis et al., Biochem. Biophys. Acta 1473 (1) : 21-34 (1999); Raju et al., Exp. Cell Res. 235(1): 145-154 (1997)). La amidación es otra modificación de la proteína también asociada con el cáncer y progresión del cáncer (ver, por ejemplo, Treston et al., J. Nati. Cáncer Inst. Monogr. (13): 169-175 (1992)). En otra modalidad más, las proteínas de la invención comprenden uno o más de los epitopos inmunorreactivos identificados de acuerdo con los métodos aceptados en la técnica, tales como los péptidos descritos en las Tablas V-XVII y XXII-LI. Los epitopos de CTL pueden ser determinados utilizando algoritmos específicos para identificar los péptidos dentro de una proteína STEAP-l, que son capaces de enlazarse óptimamente a los alelos de HLA especificados (por ejemplo, por ejemplo, Tabla IV; Epimatrix™ and Epimer™, Brown University, URL brown.edu/Research/TB-HIV_Lab/epimatrix/epimatrix.html; y BIMAS, URL bimas.dcrt.nih.gov/.). Además, los procesos para identificar los péptidos que tienen suficiente afinidad de enlace para las moléculas HLA y que están correlacionados con los epitopos inmunogénicos, son bien conocidos en la técnica, y son llevados a cabo sin experimentación indebida. Además, los procesos para identificar los péptidos que son epitopos inmunogénicos, son bien conocidos en la técnica, y son llevados a cabo sin experimentación indebida ya sea in vitro o in vivo. También conocidos en la técnica están los principios para crear análogos de tales epitopos, con el fin de modular la inmunogenicidad. Por ejemplo, se empieza con un epitopo que posee una porción CTL o HTL (ver, por ejemplo, las porciones/superporciones de HLA de la clase I y HLA de la clase II, de la Tabla IV) . El epitopo es analogado mediante sustitución de un aminoácido en una de las posiciones especificadas, y reemplazándolo con otro aminoácido especificado para esa posición. Por ejemplo, con base en los residuos definidos en la Tabla IV, se puede sustituir un residuo dañino a favor de cualquier otro residuo, tal como un residuo preferido; sustituir un residuo menos preferido con un residuo preferido; o sustituir un residuo preferido que aparece originalmente, con otro residuo preferido. Las sustituciones pueden aparecer en posiciones de ancla primarias o en otras posiciones en un péptido; ver, por ejemplo, la Tabla IV. Una variedad de referencias reflejan la técnica respecto a la identificación y generación de epitopos en una proteína de interés, así como análogos de la misma. Ver, por ejemplo, WO 97/33602 a Chesnut et al.; Sette, Immunogenetics 199950(3-4): 201- 212; Sette et al., J. Immunol . 2001 166(2): 1389-1397; Sidney et al., Hum. Immunol. 1997 58(1): 12-20; Kondo et al., Im unogenetics 1997 45(4): 249-258; Sidney et al., J. Immunol. 1996 157(8): 3480-90; y Falk et al., Nature 351: 290-6 (1991); Hunt et al., Science 255:1261-3 (1992); Parker et al., J. Immunol. 149:3580-7 (1992); Parker et al., J. Immunol. 152:163-75 (1994)); Kast et al., 1994 152(8): 3904-12; Borras-Cuesta et al., Hum. Immunol. 2000 61(3): 266-278; Alexander et al., J. Im unol. 2000 164(3); 164(3): 1625-1633; Alexander et al., PMID: 7895164, Ul : 95202582; O'Sullivan et al., J. Im unol . 1991 147(8): 2663-2669; Alexander et al., Immunity 1994 1(9): 751-761 y Alexander et al., Immunol. Res. 1998 18(2): 79-92. Las modalidades relacionadas de la invención incluyen los polipéptidos que comprenden combinaciones de las diferentes porciones descritas en las Tablas IV (a), IV (b), IV(b), IV(c), IV(d), y IV(h), y/o uno o más de los epitopos de CTL predichos de las Tablas V-XVIII y XXII-LI, y/o uno o más de los epitopos de HTL predichos de las Tablas XLVII-VI, y/o una o más de las porciones de enlace a las células T conocidas en la técnica. Las modalidades preferidas no contienen inserciones, supresiones o sustituciones ya sea dentro de las porciones o dentro de las secuencias de intervención de los polipéptidos. Además, las modalidades que incluyen un número de residuos de aminoácidos N-terminales y/o C-terminales sobre cualquier lado de estas porciones, pueden ser deseables (por ejemplo, para incluir una porción mayor de la arquitectura del polipéptido en la cual está localizada la porción) . Típicamente, el número de residuos de aminoácidos N-terminales y/o C-terminales sobre cualquier lado de una porción, está entre aproximadamente 1 y aproximadamente 100 residuos de aminoácidos, preferentemente 5 a aproximadamente 50 residuos de aminoácidos. Las proteínas relacionadas a STEAP-l son ejemplificadas en muchas formas, preferentemente en forma aislada. Una molécula de proteína STEAP-l purificada estará sustancialmente libre de otras proteínas o moléculas que deterioran el enlace de STEAP-l al anticuerpo, a la célula T o a otro ligando. La naturaleza y el grado de aislamiento y purificación dependerán del uso pretendido. Las modalidades de una proteína relacionada a STEAP-l incluyen las proteínas purificadas relacionadas a STEAP-l y proteínas funcionales, solubles relacionadas a STEAP-l. En una modalidad, una proteína STEAP-l soluble, funcional, o fragmento de la misma, conserva la habilidad para ser enlazada por el anticuerpo, la célula T u otro ligando. La invención también proporciona las proteínas STEAP-l que comprenden fragmentos biológicamente activos de una secuencia de aminoácidos de STEAP-l mostrada en las figuras 2A-2Q o en las figuras 3A-3D. Tales proteínas muestran propiedades de la proteína STEAP-l inicial, tal como la habilidad para promover la generación de anticuerpos que se enlazan específicamente a un epitopo asociado con la proteína STEAP-l inicial; para ser enlazados por tales anticuerpos; para promover la activación de HTL o CTL; y/o, para ser reconocidas por HTL o CTL que también se enlazan específicamente a la proteína inicial. Los polipéptidos relacionados a STEAP-l que contienen estructuras particularmente interesantes, pueden ser predichos y/o identificados utilizando diversas técnicas analíticas bien conocidas en la materia incluyendo, por ejemplo, los métodos de Chou-Fasman, Garnier-Robson, Kyte-Doolittle, Eisenberg, Karplus-Schultz o Jameson-Wolf, o basados en inmunogenicidad. Los fragmentos que contienen tales estructuras son particularmente útiles en la generación de anticuerpos anti-STEAP-1 específicos de la subunidad, o las células T o en la identificación de factores celulares que se enlazan a STEAP-l. Por ejemplo, los perfiles de hidrofilicidad pueden ser generados, y los fragmentos peptídicos inmunogénicos identificados, utilizando el método de Hopp, T.P. and Woods, K.R., 1981, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 78:3824-3828. Los perfiles de hidropaticidad pueden ser generados, y pueden ser identificados los fragmentos peptídicos inmunogénicos, utilizando el método de Kyte, J. y Doolittle, R.F., 1982, J. Mol. Biol. 157:105-132. Los perfiles de los Residuos Accesibles Porcentuales (%) pueden ser generados, y pueden ser identificados los fragmentos peptídicos inmunogénicos, utilizando el método de Janin J. , 1979, Nature 277:491-492. Los perfiles de Flexibilidad Promedio pueden ser generados, y los fragmentos peptídicos inmunogénicos identificados utilizando el método de Bhaskaran R., Ponnuswamy P.K., 1988, Int. J. Pept. Protein Res. 32:242-255. Los perfiles de vuelta Beta pueden ser generados, y los fragmentos peptídicos inmunogénicos identificados, utilizando el método de Deleage, G., Roux B, 1987, Protein Engineering 1:289-294. Los epitopos de CTL pueden ser determinados utilizando algoritmos específicos para identificar los péptidos dentro de una proteína STEAP-l, que son capaces de enlazarse óptimamente a los alelos de HLA especificados (por ejemplo, mediante el uso del sitio SYFPEITHI en el sitio de la Red Mundial www.URLsyfpeithi.bmi-heidelberg.com/; los listados en la Tabla IV (A) - (E) ; Epimatrix™ y Epimer?a, Brown University, URL (brown.edu/Research/TB-HIV_Lab/epimatrix/epimatrix.html) ; y BIMAS, URLbimas.dcrt.nih.gov/). Ilustrando esto, los epitopos peptídicos de STEAP-l que son presentados en el contexto de moléculas MHC humanas de la clase I, por ejemplo, HLA-A1, A2, A3, All, A24, B7 y B35, fueron predichas (ver, por ejemplo, las Tablas V-XVIII, XXII-LI) . Específicamente, la secuencia completa de aminoácidos de la proteína STEAP-l y las porciones relevantes de otras variantes, por ejemplo, para las predicciones de HLA de la clase I, 9 residuos flanqueantes sobre cualquier lado de una mutación puntual o de la unión de exón, o para las predicciones de HLA de la clase II, 14 residuos flanqueantes sobre cualquier lado de la mutación puntual o de la unión de exón, correspondiente a esa variante, fueron introducidas en el algoritmo de Búsqueda de Porción Peptídica de HLA, encontrada en la Sección de Bioinformática y Análisis molecular (BIMAS) en el sitio de la red listado anteriormente; además del sitio SYFPEITHI, en URLsyfpeithi . bmi-heidelberg . com/ . El algoritmo de la búsqueda de la porción peptídica de HLA fue desarrollado por el Dr. Ken Parker con base en el enlace de las secuencias peptídicas específicas en la muesca de las moléculas HLA de la clase I, en particular HLA-A2 (ver, por ejemplo, Falk et al., Nature 351: 290-6 (1991); Hunt et al., Science 255:1261-3 (1992); Parker ef al., J. Immunol. 149:3580-7 (1992); Parker et al., J. Immunol. 152:163-75 (1994)). Este algoritmo permite la localización y la calificación de los péptidos 8-mer, 9-mer, y 10-mer a partir de una secuencia de proteína completa para predecir el enlace a HLA-A2, así como otras numerosas moléculas HLA de la clase I. Muchos péptidos que se enlazan HLA de la clase I son 8-, 9-, 10 o 11-mers. Por ejemplo, para HLA-A2 de la clase I, los epitopos contienen preferentemente una leucina (L) o metionina (M) en la posición 2, y una valina (V) o leucina (L) en el extremo C (ver, por ejemplo, Parker et al., J. Immunol . 149:3580-7 (1992)). Los resultados seleccionados de los péptidos de enlace predichos de STEAP-l, se muestran en las Tablas V-XVIII y XXII-LI en la presente. En las Tablas V-XVIII y XXII-XLVIII, los candidatos seleccionados, 9-mers y 10-mers, para cada miembro de la familia son mostrados junto con su localización, la secuencia de aminoácidos de cada péptido específico, y una calificación de enlace estimada. En las Tablas XLVIII-LI, los candidatos seleccionados, 15-mers, para cada miembro de la familia se muestran junto con su localización, la secuencia de aminoácidos de cada péptido específico, y una calificación de enlace estimada. La calificación de enlace corresponde al tiempo medio estimado de disociación de los complej os que contienen el péptido de 37 °C a pH 6. 5 . Los péptidos con la mayor calificación de enlace se predice que son los más fuertemente enlazados a HLA de la clase I sobre la superficie celular por el mayor periodo de tiempo, y de este modo representan los mej ores obj etivos inmunogénicos para el reconocimiento por las células T . El enlace efectivo de los péptidos a un alelo de HLA puede ser evaluado por estabilización de la expresión de HLA sobre la línea celular T2 defectuosa en el procesamiento del antígeno (ver, por ej emplo , Xue et al . , Prostate 30 : 73-8 (1997) y Peshwa et al. , Prostate 36: 129-38 (1998) ) . La inmunogenicidad de los péptidos específicos puede ser evaluada ín vitro mediante la estimulación de los linfocitos T citotóxicos CD8+ (CTL) en presencia de las células presentadoras de antígeno tales como las células dendríticas . Se debe apreciar que cada epitopo predicho por el sitio BIMAS, los sitos Epimer™ y Epimatrix™, o especificados por las porciones de HLA de la clase I o de la clase II, disponibles en la técnica o que se vuelvan parte de la técnica tal como se describe en la Tabla IV (o determinadas utilizando el sitio de la Red Mundial www. URL syfpeithi .bmi-heidelberg. com/, o BIMAS, bimas .dcrt .nih. gov/) tienen que ser "aplicadas" a una proteína STEAP-1 de acuerdo con la invención. Como se utiliza en este contexto "aplicada o aplicado" significa que una proteína STEAP-l es evaluada, por ejemplo, visualmente o por métodos de hallazgo de patrones basados en computadora, como es apreciado por aquellos expertos en la técnica relevante. Cada subsecuencia de una proteína STEAP-l de 8, 9, 10 u 11 residuos de aminoácidos que posee una porción HLA de la clase I, o una subsecuencia de 9 o más residuos de aminoácidos que posee una porción HLA de la clase I, están dentro del alcance de la invención.
III.B.) Expresión de las Proteínas Relacionadas a STEAP-l En una modalidad descrita en los ejemplos que siguen, STEAP-l puede ser convenientemente expresada en células (tales como las células 293T) transfectadas con un vector de expresión comercialmente disponible, tal como un vector de expresión impulsado por CMV, que codifica para STEAP-l, con un marcador 6XHis y MMYC C-terminal (pcDNA3.1/mycHIS, Invitrogen o Tag5, GenHunter Corporation, Nashville TN) . El vector tag5 proporciona una señal de secreción IgGK que puede ser utilizada para facilitar la producción de una proteína STEAP-l secretada, en células transfectadas. La STEAP-l marcada con HIS, secretada, en el medio de cultivo puede ser purificada, por ejemplo, utilizando una columna de níquel utilizando técnicas estándares .
III. C.) Modificaciones de las Proteínas Relacionadas a STEAP-l Las modificaciones de las proteínas relacionadas a STEAP-l tales como las modificaciones covalentes son incluidas dentro del alcance de esta invención. Un tipo de modificación covalente incluye hacer reaccionar los residuos de aminoácidos objetivo de un polipéptido de STEAP-l, con un agente de derivatización orgánico que es capaz de reaccionar con las cadenas laterales seleccionadas o los residuos N- o C-terminales de una proteína STEAP-l. Otro tipo de modificación covalente de un polipéptido de STEAP-l incluido dentro del alcance de esta invención, comprende la alteración del patrón de glucosilación nativo de una proteína de la invención. Otro tipo más de modificación covalente de STEAP-1 comprende el enlace de un polipéptido de STEAP-l a uno de una variedad de polímeros no proteicos, por ejemplo, polietilenglicol (PEG) , polipropilenglicol, o polioxialquilenos, de la manera descrita en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192 o 4,179,337. Las proteínas relacionadas a STEAP-l de la presente invención pueden ser también modificadas para formar una molécula quimérica de STEAP-l fusionada a otra secuencia polipeptídica o de aminoácidos heteróloga. Tal molécula quimérica puede ser sintetizada químicamente o recombinantemente. Una molécula quimérica puede tener una proteína de la invención fusionada a otro antígeno asociado al tumor o fragmento del mismo. Alternativamente, una proteína de acuerdo con la invención puede comprender una fusión de fragmentos de una secuencia de STEAP-l (aminoácido o ácido nucleico) tal que es creada una molécula que, a través de su longitud, no es directamente homologa a las secuencias de aminoácidos o de ácidos nucleicos mostradas en las figuras 2A-2Q o en las figuras 3A-3D. Tal molécula quimérica puede comprender múltiplos de la misma subsecuencia de STEAP-l. Una molécula quimérica puede comprender una fusión de una proteína relacionada a STEAP-l, con un marcador epitópico de polihistidina, que proporciona un epitopo al cual puede enlazarse selectivamente el níquel inmovilizado, con citocinas o factores de crecimiento. El marcador epitópico es en general colocado en el extremo amino o en extremo carboxilo de una proteína STEAP-l. En una modalidad alternativa, la molécula quimérica puede comprender una fusión de una proteína relacionada a STEAP-í con una inmunoglobulina, o una región particular de una inmunoglobulina. Para una forma bivalente de la molécula quimérica (también denominada como una "inmunoadhesina") , tal fusión podría ser a la región Fc de una molécula de IgG. Las fusiones de Ig incluyen preferentemente la sustitución de una forma soluble (dominio transmembranal suprimido o inactivado) de un polipéptidos de STEAP-l en lugar de al menos una región variable dentro de una molécula de Ig. En una modalidad preferida, la fusión de inmunoglobulina incluye una bisagra, CH2 y CH3, o las regiones de bisagra CH1, CH2 y CH3 de una molécula de IgGl . Para la producción de las fusiones de inmunoglobulina ver, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos No. 5,428,130 expedida el 27 de junio de 1995.
III.D.) Usos de las Proteínas Relacionadas a STEAP-l Las proteínas de la invención tienen un número de diferentes usos específicos. Ya que STEAP-l es altamente expresada en próstata y otros cánceres, las proteínas relacionadas a STEAP-l son utilizadas en métodos que evalúan el estado de los productos del gen de STEAP-l en tejidos normales versus cancerosos, con lo cual se elucida el fenotipo maligno. Típicamente, los polipéptidos de regiones específicas de una proteína STEAP-l son utilizados para evaluar la presencia de las perturbaciones (tales como supresiones, inserciones, mutaciones puntuales, etc.) en esas regiones (tales como las regiones que contienen una o más porciones) . Los ensayos ejemplares utilizan anticuerpos o células T que se dirigen a las proteínas relacionadas a STEAP-l, que comprenden los residuos de aminoácidos de una o más porciones biológicas contenidas dentro de una secuencia del polipéptido de STEAP-l, con el fin de evaluar las características de esta región en los tejidos normales versus cancerosos o para promover una respuesta inmune al epitopo. Alternativamente, las proteínas relacionadas a STEAP-l que contienen los residuos de aminoácidos de una o más de las porciones biológicas en una proteína STEAP-l, se utilizan para seleccionar los factores que interactúan con esa región de STEAP-l. Los fragmentos/subsecuencias de proteínas de STEAP- 1 son particularmente útiles en la generación y caracterización de anticuerpos específicos del dominio (por ejemplo, anticuerpos que reconocen un epitopo extracelular o intracelular de una proteína STEAP-l) , para identificar los agentes o factores celulares que se enlazan a STEAP-l o un dominio estructural particular de la misma, y en diversos contextos terapéuticos y de diagnóstico, incluyendo, pero no limitados a ensayos de diagnóstico, vacunas para el cáncer y métodos para preparar tales vacunas. Las proteínas codificadas por los genes de STEAP-l, o por análogos, homólogos o fragmentos de los mismos, tienen una variedad de usos, incluyendo pero no limitados a la generación de anticuerpos y en métodos para identificar los ligandos y otros agentes y constituyentes celulares que se enlazan a un producto del gen de STEAP-1. Los anticuerpos producidos contra una proteína STEAP-l o fragmento de la misma son útiles en ensayos de diagnóstico y de pronóstico, y en metodologías de formación de imagen en el manejo de los cánceres humanos caracterizados por la expresión de la proteína STEAP-l, tales como aquellos listados en la Tabla I. Tales anticuerpos pueden ser expresados intracelularmente y utilizados en los métodos para tratar pacientes con tales cánceres. Los ácidos nucleicos o proteínas relacionadas a STEAP-l son también utilizados en la generación de respuestas HTL o CTL. Diversos ensayos inmunológicos útiles para la detección de las proteínas STEAP-l son utilizados, incluyendo pero no limitados a los diversos tipos de radioinmunoensayos, ensayos inmunosorbentes ligados a enzimas (ELISA) , ensayos inmunofluorescentes ligados a enzimas (ELIFA) , métodos inmunocitoquímicos y similares. Los anticuerpos pueden ser marcados y utilizados como reactivos inmunológicos de formación de imagen, capaces de detectar células que expresan STEAP-l (por ejemplo, en métodos de formación de imagen radioscintigráfica) . Las proteínas STEAP-l son también particularmente útiles en la generación de vacunas para el cáncer, como se describe en la presente.
IV.) Anticuerpos para STEAP-l Otro aspecto más de la invención proporciona los anticuerpos que se enlazan a las proteínas relacionadas a STEAP-l. Los anticuerpos preferidos se enlazan específicamente a una proteína relacionada a STEAP-1, y no se enlazan (o se enlazan débilmente) a los péptidos o proteínas que no son proteínas relacionadas a STEAP-l bajo condiciones fisiológicas. En este contexto, los ejemplos de condiciones fisiológicas incluyen: 1) solución salina amortiguada con fosfato; 2) solución salina amortiguada con Tris que contiene Tris 25 mM y cloruro de sodio 150 mM; o solución salina normal (0.9% de NaCl) ; 4) suero animal tal como suero humano; o 5) una combinación de cualquiera de 1) al 4); estas reacciones tienen lugar preferentemente a pH 7.5, alternativamente en un intervalo de pH de 7.0 a 8.0, o alternativamente en un intervalo de pH 6.5 a 8.5; también, estas reacciones tienen lugar a una temperatura entre 4°C a 37°C. Por ejemplo, los anticuerpos que se enlazan a STEAP-l pueden enlazarse a las proteínas relacionadas a STEAP-l tales como los homólogos o análogos de las mismas. Los anticuerpos STEAP-l de la invención son particularmente útiles en ensayos de diagnóstico y pronóstico del cáncer (ver, por ejemplo Tabla I) y metodologías de formación de imagen. Similarmente, tales anticuerpos son útiles en el tratamiento, diagnóstico y/o pronóstico de cánceres de próstata y otros, al grado en que STEAP-l es también expresada o sobreexpresada en estos otros cánceres. Además, los anticuerpos intracelularmente expresados (por ejemplo, anticuerpos de cadena simple) son terapéuticamente útiles en el tratamiento de cánceres en los cuales está involucrada la expresión de STEAP-l, tales como los cánceres de próstata avanzados o metastáticos u otros cánceres avanzados o metastáticos. La invención también proporciona diversos ensayos inmunológicos útiles para la detección y cuantificación de STEAP-l y proteínas relacionadas a STEAP-l, mutantes. Tales ensayos pueden comprender uno o más anticuerpos STEAP-l capaces de reconocer y de enlazarse a una proteína relacionada a STEAP-l, como sea apropiado. Estos ensayos, son realizados dentro de diversos formatos de ensayo inmunológico bien conocidos en la materia, incluyendo pero no limitados a los diversos tipos de radioinmunoensayos, ensayos inmunosorbentes ligados a enzimas (ELISA) , ensayos inmunofluorescentes ligados a enzimas (ELIFA) , y similares. Los ensayos inmunológicos sin anticuerpo de la invención también comprenden ensayos de inmunogenicidad de células T (inhibidores o estimuladores) así como los ensayos de enlace al complejo mayor de histocompatibilidad (MHC). Además, los métodos de formación de imagen inmunológica capaces de detectar el cáncer de próstata y otros cánceres que expresan STEAP-l, son también proporcionados por la invención, incluyendo pero no limitados a los métodos de formación de imagen radioscintigráfica utilizando los anticuerpos para STEAP-l marcados. Tales ensayos son clínicamente útiles en la detección, monitoreo y pronóstico de los cánceres que expresan STEAP-l tales como el cáncer de próstata. Los anticuerpos para STEAP-l son también utilizados en los métodos para purificar una proteína relacionada a STEAP-l y para aislar los homólogos de STEAP-l y las moléculas relacionadas. Por ejemplo, un método para purificar una proteína relacionada STEAP-l comprende la incubación de un anticuerpo de STEAP-l, que ha sido acoplado a una matriz sólida, con un lisado u otra solución que contiene una proteína relacionada a STEAP-l, bajo condiciones que permiten que el anticuerpo para STEAP-l se enlace a la proteína relacionada STEAP-1; el lavado de la matriz sólida para eliminar las impurezas; y la elución de la proteína relacionada a STEAP-l a partir del anticuerpo acoplado. - Otros usos de los anticuerpos para STEAP-l de acuerdo con la invención, incluyen la generación de anticuerpo anti- idiotípicos que imitan a una proteína STEAP-l. Varios métodos para la preparación de los anticuerpos son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, pueden ser preparados los anticuerpos mediante la inmunización de un hospedero mamífero adecuado utilizando una proteína relacionada a STEAP-l, un péptido, o fragmento de la misma, en forma aislada o inmunoconjugada (Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press, Eds., Harlow, y Lañe (1988); Harlow, Antibodies, Cold Spring Harbor Press, NY (1989) ) .
Además, las proteínas de fusión de STEAP-l pueden ser también utilizadas, tal como una proteína de fusión con GST de STEAP- 1. En una modalidad particular, una proteína de fusión de GST que comprende toda o la mayoría de la secuencia de aminoácidos de las figuras 2A-2Q o las figuras 3A-3D, es producida, luego utilizada como un inmunógeno para generar anticuerpos apropiados. En otra modalidad más, la proteína relacionada a STEAP-l es sintetizada y utilizada como un inmunógeno . Además, son utilizadas las técnicas de inmunización de DNA desnudo conocidas en la materia (con o sin la proteína purificada relacionada a STEAP-l o las células que expresan STEAP-l) para generar una respuesta inmune al inmunógeno codificado (para una revisión, ver Donnelly et al., 1997, Ann. Rev. Immunol . 15: 617-648). La secuencia de aminoácidos de una proteína STEAP-l como se muestra en las figuras 2A-2Q o en las figuras 3A-3D, puede ser analizada para seleccionar las regiones específicas de la proteína STEAP-l para generar anticuerpos. Por ejemplo, los análisis de hidrofobicidad y de hidrofilicidad de una secuencia de aminoácidos de STEAP-l, son utilizados para identificar las regiones hidrofílicas en la estructura de STEAP-l. Las regiones de una proteína de STEAP-l que muestran la estructura inmunogénica, así como otras regiones y dominios, pueden ser identificadas fácilmente utilizando otros diversos métodos conocidos en la técnica, tales como los análisis de Chou-Fasman, Garnier-Robson, Kyte-Doolittle, Eisenberg, Karplus-Schultz o Jameson-Wolf. Los perfiles de hidrofilicidad pueden ser generados utilizando el método de Hopp, T.P. y Woods, K.R., 1981, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 78:3824-3828. Los perfiles de hidropaticidad pueden ser generados utilizando el método de Kyte, J. y Doolittle, R.F., 1982, J. Mol. Biol. 157: 105-132. Los perfiles de los Residuos Accesibles Porcentuales (%) pueden ser generados utilizando el método de Janin J. , 1979, Nature 277:491-492. Los perfiles de Flexibilidad Promedio pueden ser generados utilizando el método de Bhaskaran R. , Ponnuswamy P.K., 1988, Int. J. Pept. Protein Res. 32: 242-255. Los perfiles de vuelta Beta pueden ser generados utilizando el método de Deleage, G., Roux B., 1987, Protein Engineering 1: 289-294. De este modo, cada región identificada por cualquiera de estos programas o métodos está dentro del alcance de la presente invención. Los métodos preferidos para la generación de anticuerpos para STEAP-l son además ilustrados a manera de ejemplos proporcionados en la presente. Los métodos para preparar una proteína o polipéptido para el uso como un inmunógeno, son bien conocidos en la técnica. También son bien conocidos los métodos para preparar conjugados inmunogénicos de una proteína con un portador, tal como BSA, KLH u otra proteína portadora. En algunas circunstancias, la conjugación directa utilizando, por ejemplo, reactivos de carbodiimida es utilizada; en otros casos son efectivos los reactivos de enlace tales como aquellos suministrados por Pierce Chemical Co., Rockford, IL. La administración de un inmunógeno de STEAP-l es a menudo conducida por inyección en un periodo de tiempo adecuado y con el de un adyuvante adecuado, como es entendido en la técnica. Durante el esquema de inmunización, pueden ser tomados los títulos de anticuerpos para determinar la adecuación de la formación del anticuerpo. Los anticuerpos monoclonales para STEAP-l pueden ser producidos por diversos medios bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, las líneas celulares inmortalizadas que secretan un anticuerpo monoclonal deseado, son preparadas utilizando la tecnología de hibridoma estándar de Kohler y Milstein, o modificaciones que inmortalizan las células B productoras de anticuerpo, como es en general conocido. Las líneas celulares inmortalizadas que secretan los anticuerpos deseados son seleccionadas mediante inmunoensayo en el cual el antígeno es una proteína relacionada a STEAP-l. Cuando el cultivo celular inmortalizado apropiado es identificado, las células pueden ser expandidas y los anticuerpos producidos ya sea a partir de cultivos in vitro o a partir de fluido de ascitis. Los anticuerpos o fragmentos de la invención pueden ser también producidos, por medios recombinantes. Las regiones que se enlazan específicamente a las regiones deseadas de una proteína STEAP-l pueden ser también producidas en el contexto de los anticuerpos injertados con la región de determinación de la complementariedad (CDR) o anticuerpos quiméricos de múltiples especies de origen. Los anticuerpos para STEAP-l humanos o humanizados pueden ser también producidos, y son preferidos para el uso en los contextos terapéuticos. Los métodos para humanizar anticuerpos murinos y otros anticuerpos no humanos, al sustituir una o más de las CDRs del anticuerpo, no humanas, por secuencias de anticuerpo humanas, correspondiente, son bien conocidos (ver por ejemplo, Jones et al., 1986, Nature 321: 522-525; Riechmann et al., 1988, Nature 332: 323-327; Verhoeyen et al., 1988, Science 239: 1534-1536). Ver también, Cárter et al., 1993, Proc. Nati. Acad. ScL USA 89: 4285 y Sims et al., 1993, J. Immunol . 151: 2296. Los métodos para producir anticuerpos monoclonales completamente humanos incluyen los métodos de visualización de fagos y métodos transgénicos (para una revisión, ver Vaughan etal., 1998, Nature Biotechnology 16: 535-539). Los anticuerpos monoclonales para STEAP-l completamente humanos, pueden ser generados utilizando tecnologías de clonación que emplean bibliotecas combinatorias de genes de Ig humanos, grandes (por ejemplo, visualización de fagos) (Griffiths y Hoogenboom, Building an in vitro immune system: human antibodies from phage display libraries. en: Protein Engineering of Antibody Molecules for Prophylactic and Therapeutic Applications in Man, Clark, M. (Ed.), Nottingham Academic, pp 45-64 (1993) ; Burton and Barbas, Human Antibodies from combinatorial libraries. Jd. , pp 65-82). Los anticuerpos monoclonales para STEAP-l completamente humanos pueden ser también reducidos utilizando ratones transgénicos manipulados por ingeniería genética para contener los locus del gen de la inmunoglobulina humana como se describe en la Solicitud de Patente del PCT W098/24893, Kucherlapati y Jakobovits et al., publicada el 3 de Diciembre de 1997 (ver también, Jakobovits, 1998, Exp. Opin. Invest. Drugs 7(4): 607-614; Patente de los Estados Unidos No. 6,162,963 expedida el 19 de Diciembre del 2000; la Patente de los Estados Unidos No. 6,150,584 expedida el 12 Noviembre del 2000; y la Patente de los Estados Unidos No. 6,114598 expedida el 5 de Septiembre del 2000) . Este método evita la manipulación in vi tro requerida con la tecnología de visualización de fagos y produce eficientemente anticuerpos humanos auténticos de alta afinidad. La reactividad de los anticuerpos para STEAP-l con una proteína relacionada a STEAP-l puede ser establecida por un número de medios bien conocidos, incluyendo Western blot, inmunoprecipitación, análisis de ELISA y FACS utilizando, como sea apropiado, proteínas relacionadas a STEAP-1, células que expresan STEAP-l, o extractos de las mismas. Un anticuerpo para STEAP-l, o un fragmento del mismo puede ser marcado con un marcador detectable o conjugado a una segunda molécula. Los marcadores detectables adecuados incluyen, pero no están limitados a, un radioisótopo, un compuesto fluorescente, un compuesto bioluminiscente, un compuesto quimioluminiscente, un quelante de metales o una enzima. Además, los anticuerpos bi-específicos, específicos para dos o más epitopos de STEAP-l son generados utilizando los métodos en general conocidos en la materia. Los anticuerpos homodiméricos pueden también ser generados mediante técnicas de reticulación conocidas en la materia (por ejemplo, Wolff et al., Cáncer Res. 53: 2560-2565). En una modalidad, la invención proporciona los anticuerpos monoclonales identificados como hibridoma de ratón X92.1.30.1.1 (1) y hibridoma de ratón X120.545.1.1 depositado con American Type Culture Collection, localizada en 10801 University Blvd. Manassas, VA 20110-2209 el 06-Febrero-2004 y se le asignaron los números de Acceso de la ATCC PTA-5802 y PTA-5803 respectivamente.
V.) Respuestas Inmunes Celulares para STEAP-l Ha sido delineado el mecanismo mediante el cual las células T reconocen los antígenos. Composiciones eficaces de la vacuna del epitopo peptídico de la invención, inducen respuestas inmunes terapéuticas o profilácticas en segmentos muy amplios de la población mundial. Para un entendimiento del valor y la eficacia de las composiciones de la invención que inducen respuestas inmunes celulares, se proporciona una breve revisión de la tecnología relacionada a la inmunología. Un complejo de una molécula HLA y un antígeno peptídico actúa como el ligando reconocido por las células T restringidas a HLA (Buus, S. et al., Cell 47:1071, 1986; Babbitt, B. P. et al., Nature 317:359, 1985; Townsend, A. y Bodmer, H., Annu. Rev. Immunol . 7:601, 1989; Germain, R. N., Annu. Rev. Immunol . 11:403, 1993). Aunque el estudio de los análogos de antígeno sustituidos con aminoácidos simples, y el secuenciamiento de los péptidos naturalmente procesados, endógenamente enlazados, los residuos críticos que corresponden a las porciones requeridas para el enlace específico a las moléculas antigénicas de HLA, han sido identificados y se describen en la Tabla IV (ver también, por ejemplo, Southwood, et al., J. Immunol. 160:3363, 1998; Rammensee, et al., Immunogenetics 41:178, 1995; Rammensee et al., SYFPEITHI, access via World Wide Web at URL (134.2.96.221/scripts .hlaserver . dll/home. htm) ; Sette, A. y Sidney, J. Curr. Opin. Immunol . 10:478, 1998; Engelhard, V.
H., Curr. Opin. Immunol. 6:13, 1994; Sette, A. y Grey, H. M., Curr. Opin. Immunol . 4:79, 1992; Sinigaglia, F. y Hammer, J.
Curr. Biol. 6:52, 1994; Ruppert et al., Cell 74:929-937, 1993; Kondo et al, J. Immunol . 155:4307-4312, 1995; Sidney et al, J. Immunol. 157:3480-3490, 1996; Sidney et al, Human Im unol. 45:79-93, 1996; Sette, A. y Sidney, J. Immunogenetics 1999 Nov; 50(3-4)201 -12, Review). Además, los análisis cristalográficos de rayos X de los complejos HLA-péptido han revelado bolsas dentro de la hendidura/muesca de enlace al péptido de las moléculas HLA que acomodan, en un modo específico de alelo, los residuos llevados por los ligandos peptídicos; estos residuos a su vez determinan la capacidad de enlace de HLA de los péptidos en los cuales están presentes. (Ver por ejemplo, Madden, DR Annu. Rev. Immunol . 13: 587, 1995; Smith, et al, Immunity 4:203, 1996; Fre ont et al., Im unity 8: 305, 1998; Stern et al., Structure 2: 245, 1994; Jones, E.Y. Curr. Opin. Immunol. 9: 75, 1997; Brown, J. H. et al., Nature 364: 33, 1993; Guo, H. C. et al., Proc. Nati. Acad. ScL USA 90: 8053, 1993; Guo, H. C. et al., Nature 360: 364, 1992; Silver, M. L. et al., Nature 360: 367, 1992; Matsumura, M. et al., Science 257: 927, 1992; Madden et al., Cell 70: 1035, 1992; Fremont, D. H. et al., Science 257: 919, 1992; Saper, M. A., Bjorkman, P. J. y Wiley, D. C. J. Mol. Biol. 219: 277, 1991.). En consecuencia, la definición de porciones de enlace a HLA específicas del alelo de la clase I y de la clase II, o las superporciones de la clase I o de la clase II, permite la identificación de las regiones dentro de una proteína que están correlacionadas con el enlace a uno o varios antígeno particulares de HLA. De este modo, mediante un proceso de identificación de la porción HLA, han sido identificados los candidatos para vacunas basadas en epitopos; tales candidatos pueden ser además evaluados mediante los ensayos de enlace HLA-péptido, para determinar la afinidad enlace y/o el periodo de tiempo de la asociación del epitopo y su molécula de HLA correspondiente. El trabajo confirmatorio adicional puede ser realizado para seleccionar, entre estas vacunas candidatas, los epitopos con características preferidas en términos de la cobertura de población, y/o la inmunogenicidad. Pueden ser utilizadas diversas estrategias para evaluar la inmunogenicidad celular, incluyendo: 1) Evaluación de los cultivos de células T primarias de individuos normales (ver por ejemplo, Wentworth, P. A. et al, Mol. Immunol . 32: 603, 1995; Celis, E. et al, Pro.c. Nati. Acad. Sci. USA 91: 2105, 1994; Tsai, V. et al, J. Immunol. 158: 1796, 1997; Kawashi a, I. et al, Human Immunol . 59: 1, 1998). Este procedimiento involucra la estimulación de linfocitos de sangre periférica (PBL por sus siglas en ingles) provenientes de sujetos normales con un péptido de prueba en presencia de células presentadoras de antígeno in vitro, en un periodo de varias semanas. Las células T específicas para el péptido fueron inactivadas durante este tiempo y son detectadas utilizando, por ejemplo, el ensayo de liberación de linfocina o de 51Cr que involucra células objetivo sensibilizadas en el péptido. 2) Inmunización - de ratones transgénicos a HLA (ver, por ejemplo, Wentworth, P. A. et al, J. Immunol . 26:97, 1996; Wentworth, P. A. et al, Int. Immunol . 8: 651, 1996; Alexander, J. et al, J. Immunol 159: 4753, 1997). Por ejemplo, en tales métodos son administrados péptidos en adyuvante incompleto de Freund, subcutáneamente a los ratones transgénicos de HLA. Varias semanas después de la inmunización, son retirados los esplenocitos y cultivados in vitro en presencia del péptido de prueba por aproximadamente una semana. Las células T específicas del péptido son detectadas utilizando, por ejemplo, un ensayo de liberación de 1Cr que involucra las células objetivo sensibilizadas con el péptido, y las células objetivo que expresan el antígeno endógenamente generado . 3) La demostración de las respuestas de memoria de las células T a partir de individuos inmunes quienes han sido ya sea efectivamente vacunados y/o provenientes de pacientes crónicamente enfermos (ver, por ejemplo, Rehermann, B. et al, J. Exp. Med. 181:1047, 1995; Doolan, D. L et al, Immunity 7: 97, 1997; Bertoni, R. et al., J. Clin. Invest. 100: 503, 1997; Threlkeld, S. C. et al., J. Iramunol 159: 1648, 1997; Diepolder, H. M. et al, J. Virol. 71: 6011, 1997). En consecuencia, las respuestas de memoria son detectadas mediante el cultivo de PBL de sujetos que han sido expuestos al antígeno debido a la enfermedad y de este modo han generado una respuesta inmune "de manera natural", o a partir de pacientes quienes fueron vacunados contra el antígeno. Las PBL provenientes de sujetos son cultivadas in vitro por 1 a 2 semanas en presencia del péptido de prueba más las células presentadoras de antígeno (APC) para permitir la activación de las células T de "memoria", en comparación a las células T "intactas o vírgenes". Al final del periodo de cultivo, es detectada la actividad de las células T utilizando ensayos que incluyen la liberación de 51Cr que involucra objetivos sensibilizados con péptido, proliferación de células T o liberación de linfocina.
VI . ) Animales Transgénicos a STEAP-l Los ácidos nucleicos que codifican para una proteína relacionada a STEAP-l pueden ser también utilizados para generar ya sea animales transgénicos o animales "con supresión de gen" que, a su vez, son útiles en el desarrollo y selección de reactivos terapéuticamente útiles. De acuerdo con las técnicas establecidas, el cDNA que codifica para STEAP-l puede ser utilizado para clonar el DNA genómico que codifica para STEAP-l. Las secuencias genómicas clonadas pueden ser luego utilizadas para generar animales transgénicos que contienen células que expresan DNA que codifica para STEAP-l. Los métodos para la generación de animales transgénicos, particularmente animales tales como ratones o ratas, se han vuelto convencionales en la técnica y se describen, por ejemplo, en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 4,736,866 expedida el 12 Abril de 1988, y 4,870,009 expedida el 26 de Septiembre de 1989. Típicamente, las células particulares podrían ser dirigidas para la incorporación del transgen de STEAP-l con aumentadores específicos del tejido. Los animales transgénicos que incluyen una copia de un transgen que codifica para STEAP-l, pueden ser utilizados para examinar el efecto de la expresión incrementada del DNA que codifica para STEAP-l. Tales animales pueden ser utilizados como animales probadores para los reactivos que se piensa confieren protección contra, por ejemplo, las condiciones patológicas asociadas con su sobreexpresión. De acuerdo con este aspecto de la invención, un animal es tratado con un reactivo y una incidencia reducida de una condición patológica, comparada a los anímales no tratados que llevan el transgen, podría indicar una intervención terapéutica potencial para la condición patológica. Alternativamente, los homólogos no humanos de STEAP-l pueden ser utilizados para construir un animal "con supresión de gen" para STEAP-l que tiene un gen defectuoso o alterado que codifica para STEAP-l, como resultado de la recombinación homologa entre el gen endógeno que codifica para STEAP-l y un DNA genómico alterado que codifica para STEAP-l, introducido dentro de una célula embrionaria del animal. Por ejemplo, el cDNA que codifica para STEAP-l puede ser utilizado para clonar el cDNA genómico que codifica para STEAP-l, de acuerdo con las técnicas establecidas. Una porción del DNA genómico que codifica para STEAP-l puede ser suprimida o reemplazada con otro gen, tal como un gen que codifica para un marcador seleccionable que puede ser utilizado para monitorizar la integración. Típicamente, varias kilobases de DNA flanqueante no alterado (en los extremos 5' y 3' ) son incluidas en el vector (ver, por ejemplo, Thomas y Capecchi, Cell, 51: 503 (1987) para una descripción de los vectores de recombinación homologa) . El vector es introducido dentro de una línea de células madre embrionarias (por ejemplo, mediante electroporación) y células en las cuales el DNA introducido se ha recombinado homólogamente con el DNA endógeno, son seleccionadas (ver, por ejemplo, Li et al., Cell 69: 915 (1992)). Las células seleccionadas son luego inyectadas dentro de un blastocito de un animal (por ejemplo, una rata o ratón) para formar quimeras de agregación (ver, por ejemplo, Bradley, en Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), pp. 113- 152) . Un embrión quimérico puede ser luego implantado dentro de un animal adoptivo hembra pseudopreñado, adecuado, y el embrión llevado a término para crear un animal "con supresión de gen". La progenie que alberga el DNA homólogamente recombinado en sus células germinales, puede ser identificado mediante técnicas estándares utilizado para criar animales en los cuales todas las células del animal contengan el DNA homólogamente recombinado. Los animales con supresión de gen pueden ser caracterizados, por ejemplo, por su habilidad para defenderse contra ciertas condiciones patológicas o por su desarrollo de condiciones patológicas debidas a la ausencia de un polipéptido STEAP-l.
VII . ) Métodos para la Detección de STEAP-l Otro aspecto más de la presente invención se refiere a los métodos para detectar los polinucleótidos de STEAP-l y las proteínas relacionadas a STEAP-l así como los métodos para identificar una célula que expresa STEAP-l. El perfil de expresión de STEAP-l lo hace un marcador de diagnóstico para la enfermedad metastatizada. En consecuencia, el estado de productos del gen STEAP-l proporciona información útil para predecir una variedad de factores que incluyen la susceptibilidad a la enfermedad de etapa avanzada, la velocidad de progresión, y/o la agresividad del tumor. Como se discute con detalle en la presente, el estado de los productos del gen STEAP-l en muestras de pacientes, puede ser analizado por una variedad de protocolos que son bien conocidos en la técnica, incluyendo análisis inmunohistoquímico, la variedad de técnicas de Northern blot incluyendo la hibridación in situ, análisis de RT-PCR (por ejemplo sobre muestras micro-disectadas, de captura por láser) , análisis de Western blot y análisis de arreglo de tejidos. Más particularmente, la invención proporciona los ensayos para la detección de los polinucleótidos de STEAP-l en una muestra biológica, tal como suero, hueso, próstata u otros tejidos, orina, semen, preparaciones celulares y similares. Los polinucleótidos de STEAP-l detectables incluyen, por ejemplo, un gen de STEAP-l o fragmento del mismo, el mRNA de STEAP-1, los mRNAs variantes de empalme alternativos de STEAP-l, y las moléculas recombinantes de DNA o RNA que contienen un polinucleótido de STEAP-l. Un número de métodos para amplificar y/o detectar la presencia de los polinucleótidos de STEAP-1 son bien conocidos en la técnica y pueden ser empleados en la práctica de este aspecto de la invención. En una modalidad, un método para detectar un mRNA de STEAP-l en una muestra biológica, comprende la producción del cDNA a partir de la muestra mediante transcripción inversa, utilizando al menos un cebador; la amplificación del cDNA producido así utilizando los polinucleótidos de STEAP-l como cebadores en sentido y antisentido para amplificar los cDNAs de STEAP-l en ésta; y detectar la presencia del cDNA de STEAP-l amplificado. Opcionalmente, la secuencia de cDNA de STEAP-l, amplificado, puede ser determinada. En otra modalidad, un método para detectar un gen de STEAP-l en una muestra biológica comprende aislar primeramente el DNA genómico de la muestra; amplificar el DNA genómico aislado utilizando los polinucleótidos de STEAP-l, como cebadores en sentido y antisentido; y detectar la presencia del gen de STEAP-l amplificado. Cualquier número de combinaciones apropiadas de sonda en sentido y antisentido pueden ser diseñadas a partir de la secuencia nucleotídica de STEAP-l (ver, por ejemplo, Figura 2) y utilizada para este propósito. La invención también proporciona los ensayos para detectar la presencia de una proteína STEAP-l en un tejido u otra muestra biológica, tal como preparaciones de suero, semen, hueso, próstata, orina, células y similares. Los métodos para detectar una proteína relacionada a STEAP-l son también bien conocidos e incluyen, por ejemplo, inmunoprecipitación, análisis inmunohistoquímico, análisis de Western blot, ensayos de enlace molecular, ELISA, ELIFA y similares. Por ejemplo, un método para detectar la presencia de una proteína relacionada a STEAP-l en una muestra biológica, comprende poner primeramente en contacto la muestra con un anticuerpo para STEAP-l, un fragmento reactivo a STEAP-l del mismo, o una proteína recombinante que contiene una región de enlace al antígeno de un anticuerpo para STEAP- 1; y luego detectar el enlace de la proteína relacionada a STEAP-l, en la muestra. Los métodos para identificar una célula que expresa STEAP-l, están también dentro del alcance de la invención. En una modalidad, un ensayo para identificar una célula que expresa un gen de STEAP-1 comprende detectar la presencia del mRNA de STEAP-l en la célula. Los métodos particulares para la detección de los mRNAs particulares en células son bien conocidos e incluyen, por ejemplo, ensayos de hibridación que utilizan sonda de DNA complementario (tal como la hibridación in situ utilizando ribosondas de STEAP-l marcadas, técnicas de Northern blot y técnicas relacionadas) y diversos ensayos de amplificación de ácido nucleico (tales como RT-PCR utilizando cebadores complementarios específicos para STEAP-1, y otros métodos de detección tipo amplificación, tales como, por ejemplo, DNA ramificado, SISBA, TMA y similares) . Alternativamente, un ensayo para identificar una célula que expresa un gen de STEAP-l, comprende detectar la presencia de la proteína relacionada a STEAP-l en la célula o secretada por la célula. Diversos métodos para la -detección de las proteínas son bien conocidos en la técnica y son empleados para la detección de las proteínas relacionadas a STEAP-l y las células que expresan las proteínas relacionadas a STEAP- 1. El análisis de expresión de STEAP-l es también útil como una herramienta para identificar y evaluar los agentes que modulan la expresión del gen de STEAP-l. Por ejemplo, la expresión de STEAP-l es significativamente suprarregulada en cáncer de próstata, y es expresada en cánceres de los tejidos listados en la Tabla I. La identificación de una molécula o agente biológico que inhibe la expresión de STEAP-l o la sobreexpresión del mismo en células cancerosas, es de valor terapéutico. Por ejemplo, tal agente puede ser identificado mediante el uso de una selección que cuantifica la expresión de STEAP-l mediante RT-PCR, la hibridación del ácido nucleico o el enlace del anticuerpo.
VIII . ) Métodos para Monitorizar el Estado de los Genes Relacionados a STEAP-l y Sus Productos La oncogénesis es conocida como un proceso de pasos múltiples donde el crecimiento celular se vuelve progresivamente desregulado y las células progresan desde un estado fisiológico normal hasta estados precancerosos y luego cancerosos (ver, por ejemplo, Alers et al., Lab Invest. 77(5): 437-438 (1997) e Isaacs et al., Cáncer Surv. 23: 19-32 (1995) ) . En este contexto, el examen de una muestra biológica para la evidencia del crecimiento celular desregulado (tal como la expresión aberrante de STEAP-l en cánceres) permite la detección temprana de tal fisiología aberrante, antes que un estado patológico tal como el cáncer haya progresado a una etapa en que las opciones terapéuticas son más limitadas o el pronóstico es peor. En tales exámenes, el estado de STEAP-l en una muestra biológica de interés puede ser comparado, por ejemplo, al estado de STEAP-1 en una muestra normal correspondiente (por ejemplo, una muestra de aquel individuo o alternativamente de otro individuo que no es afectado por una patología) . Una alteración en el estado de STEAP-l en la muestra biológica (en comparación a la muestra normal) proporciona evidencia de crecimiento celular desregulado. Además del uso de una muestra biológica que no es afectada por una patología como una muestra normal, se puede utilizar también un valor normativo predeterminado tal como un nivel normal predeterminado de expresión del mRNA (ver, por ejemplo, Grever et al., J. Comp. Neurol. 1996 Dic 9; 376(2): 306-14 y la Patente de los Estados Unidos No. 5,837,501) para comparar el estado de STEAP-l en una muestra. El término "estado" o "condición" en este contexto se utiliza de acuerdo a su significado aceptado en la técnica, y se refiere a la condición o estado de un gen y sus productos. Típicamente, los expertos en la técnica utilizan un número de parámetros para evaluar la condición o estado de un gen y sus productos. Éstos incluyen, pero no están limitados a la localización de los productos génicos expresados (incluyendo la localización de las células que expresan STEAP-l) así como el nivel y la actividad biológica de los productos génicos expresados (tal como el mRNA de STEAP-l, los polinucleótidos y los polipéptidos) . Típicamente, una alteración en el estado de STEAP-l comprende un cambio en la localización de STEAP-l y/o las células que expresan STEAP-l y/o un incremento en el mRNA de STEAP-l y/o en la expresión de la proteína. El estado de STEAP-l en una muestra puede ser analizado mediante un número de medios bien conocidos en la materia, incluyendo sin limitación, el análisis inmunohistoquímico, la hibridación in situ, el análisis de RT-PCR sobre muestras micro-disectadas de captura por láser, análisis de Western blot y análisis de arreglo de tejidos. Los protocolos típicos para evaluar el estado de un gen de STEAP-l y los productos génicos son encontrados, por ejemplo, en Ausubel et al., eds., 1995, Current Protocols en Molecular Biology, Unidades 2 (Northern Blot) , 4 (Southern Blot) , 15 (Immunotransferencia) y 18 (Análisis de PCR) . De este modo, el estado de STEAP-l en una muestra biológica es evaluado por diversos métodos utilizados por las personas expertas incluyendo, pero no limitados al análisis de Sothern genómico (para examinar, por ejemplo las perturbaciones en un gen de STEAP-l) , el análisis de Northern y/o el análisis de PCR de mRNA de STEAP-l (para examinar, por ejemplo las alteraciones en las secuencias polinucleotídicas o los niveles de expresión de los mRNAs de STEAP-l) , y, el análisis de Western y/o inmunohistoquímico (para examinar, por ejemplo las alteraciones en las secuencias polipeptídicas, las alteraciones en la localización de polipéptido dentro de una muestra, las alteraciones en los niveles de expresión de las proteínas STEAP-l y/o las asociaciones de las proteínas STEAP-l con los socios de enlace polipeptídicos) . Los polinucleótidos de STEAP-l detectables incluyen, por ejemplo, un gen de STEAP-1 o un fragmento del mismo, el mRNA de STEAP-1, variantes de empalme alternativas, mRNAs de STEAP-l y moléculas recombinantes de DNA o RNA que contienen un polinucleótido de STEAP-l. El perfil de expresión de STEAP-l los hace un marcador de diagnóstico para la enfermedad local y/o metastatizada, y proporciona información sobre el crecimiento o el potencial oncogénico de una muestra biológica. En particular, el estado de STEAP-l proporciona información útil para predecir la susceptibilidad a etapas de la enfermedad particulares, a la progresión y/o a la agresión tumoral. La invención proporciona los métodos y ensayos para determinar el estado de STEAP-l y diagnosticar los cánceres que expresan STEAP-l, tales como los cánceres de los tejidos listados en la Tabla I. Por ejemplo, debido a que el mRNA de STEAP-l es tan altamente expresado en la próstata y otros cánceres con relación al tejido normal de la próstata, los ensayos que evalúan los niveles de los transcritos de mRNA de STEAP-l o las proteínas en una muestra biológica, pueden ser utilizados para diagnosticar una enfermedad asociada con la desregulación de STEAP-l, y pueden proporcionar información de pronóstico útil en la definición de las opciones terapéuticas apropiadas. El estado de expresión de STEAP-l proporciona información que incluye la presencia, etapa y localización de las células displásticas, precancerosas y cancerosas, la predicción de la susceptibilidad a diversas etapas de la enfermedad, y/o para medir la agresividad del tumor. Además, el perfil de expresión la hace útil como un reactivo de formación de imagen para la enfermedad metastatizada. En consecuencia, un aspecto de la invención está dirigido a los diversos métodos moleculares de pronóstico y diagnóstico para examinar el estado de STEAP-l en muestras biológicas, tales como aquellas de individuos que sufren de, o están sospechosos de sufrir de una patología caracterizada por crecimiento celular desregulado, tal como el cáncer.
Como se describió anteriormente, el estado de STEAP-l en una muestra biológica puede ser examinado por un número de procedimientos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, el estado de STEAP-l en una muestra biológica tomada de un sitio específico en el cuerpo, puede ser examinada mediante la evaluación de la muestra para la presencia o ausencia de las células que expresan STEAP-l (por ejemplo aquellas que expresan los mRNAs de STEAP-l o las proteínas del mismo) . Este examen puede proporcionar evidencia de crecimiento celular desregulado, por ejemplo, cuando las células que expresan STEAP-l son encontradas en una muestra biológica que no contiene normalmente tales células (tales como un nodulo linfático) , debido a que tales alteraciones en el estado de STEAP-l en una muestra biológica son frecuentemente asociadas con el crecimiento celular desregulado. Específicamente, un indicador del crecimiento celular desregulado es las metástasis de las células cancerosas a partir de un órgano de origen (tal como la próstata) a un área diferente del cuerpo (tal como un nodulo linfático) . En este contexto, la evidencia del crecimiento celular desregulado es importante por ejemplo, debido a que las metástasis ocultas en los nodulos linfáticos pueden ser detectadas en una proporción sustancial de los pacientes con cáncer de próstata, y tales metástasis están asociadas con los predictores conocidos de la progresión de la enfermedad (ver, por ejemplo Murphy et al., Prostate 42(4): 315-317 (2000); Su et al., Semin. Surg. Oncol. 18(1): 17-28 (2000) and Freeman et al, J ürol 1995 Aug 154 (2 Pt 1) : 474-8) . En un aspecto, la invención proporciona los métodos para monitorizar los productos del gen de STEAP-l mediante la determinación del estado de los productos del gen de STEAP-l expresados por las células provenientes de un individuo sospechoso de tener una enfermedad asociada con el crecimiento celular desregulado (tal como la hiperplasia o el cáncer) y luego comparando el estado determinado así, al estado de los productos del gen STEAP-l en una muestra normal correspondiente. La presencia de los productos del gen STEAP-l aberrantes en la muestra de prueba, con relación a la muestra normal, proporciona una indicación de la presencia del crecimiento celular desregulado dentro de las células del individuo. En otro aspecto más, la invención proporciona los ensayos útiles en la determinación de la presencia del cáncer en un individuo, que comprende detectar un incremento significativo en el mRNA de STEAP-l o en la expresión de proteína en una célula de prueba o en una muestra de tejido con relación a los niveles de expresión en la célula o tejido normal correspondiente. La presencia del mRNA de STEAP-l puede, por ejemplo, ser evaluada en tejidos que incluyen pero no están limitados a aquellos listados en la Tabla I. La presencia de la expresión de STEAP-l significativa en cualquiera de estos tejidos es útil para indicar la emergencia, presencia y/o severidad de un cáncer, ya que los tejidos normales correspondientes no expresan el mRNA de STEAP-l o lo expresan a niveles más bajos. En una modalidad relacionada, el estado de STEAP-l es determinado al nivel de las proteínas en vez de al nivel del ácido nucleico. Por ejemplo, tal método comprende la determinación del nivel de la proteína STEAP-l expresada por las células en una muestra de tejido de prueba, y comparando el nivel determinado así al nivel del STEAP-l expresado en una muestra normal correspondiente. En una modalidad, la presencia de la proteína STEAP-l es evaluada, por ejemplo, utilizando métodos inmunohistoquímicos . Los anticuerpos de STEAP-l o los socios de enlace capaces de detectar la expresión de la proteína STEAP-l, son utilizados en una variedad de formatos de ensayo bien conocidos en la técnica para este propósito. En una modalidad adicional, se puede evaluar el estado de las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de STEAP-l en una muestra biológica, con el fin de identificar las perturbaciones en la estructura de estas moléculas. Estas perturbaciones pueden incluir inserciones, supresiones, sustituciones y similares. Tales evaluaciones son útiles debido a que las perturbaciones en las secuencias de nucleótidos y/o de aminoácidos, son observadas en un gran número de proteínas asociadas con un fenotipo desregulado en crecimiento (ver, por ejemplo, Marrogi et al., 1999, J. Cutan. Pathol. 26 (8 ): 369-378 ) . Por ejemplo, una mutación en la secuencia de STEAP-l puede ser indicadora de la presencia o promoción de un tumor. Tales ensayos tienen por lo tanto valor de diagnóstico y predictivo donde una mutación en STEAP-1 indica una pérdida de potencial de la función o el incremento en el crecimiento tumoral. Una amplia variedad de ensayos para observar las perturbaciones en las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos, son bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, el tamaño y la estructura de las secuencias de ácido nucleico o de aminoácidos de los productos del gen de STEAP-l, son observadas por análisis de Northern, de Suthern, de Western, PCR y protocolos de secuenciamiento de DNA discutidos en la presente. Además, otros métodos para observar las perturbaciones en las secuencias de nucleótidos y aminoácidos tales como los análisis de polimorfismo de conformación de hebra simple son bien conocidos en la técnica (ver, por ejemplo las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,382,510 expedida el 7 de Septiembre de 1999, y 5,952,170 expedida el 17 de Enero de 1995) . Adicionalmente, se puede examinar el estado de metilación de un gen de STEAP-l en una muestra biológica. La desmetilación aberrante y/o la hipermetilación de las islas de CpG en las regiones reguladoras 5' del gen ocurren frecuentemente en células inmortalizadas y transformadas, y pueden dar como resultado expresión alterada de los diversos genes. Por ejemplo, la hipermetilación del promotor de la glutatión-S-transferasa de la clase pi (una proteína expresada en próstata normal pero no expresada en más del 90% de los carcinomas de próstata) parece silenciar permanentemente la transcripción de este gen y es la alteración genómica más frecuentemente detectada en carcinomas de próstata (De Marzo et al., Am. J. Pathol. 155(6): 1985-1992 (1999)). Además, esta alteración está presente en al menos 70% de los casos de neoplasia intraepitelial prostática de alto grado (PIN) (Brooks et al., Cáncer Epidemiol . Biomarkers Prev. , 1998, 7:531-536). En otro ejemplo más, la expresión del gen específico del tumor LAGE-I (que no es expresado en próstata normal sino que es expresado en 25-50% de los cánceres de próstata) es inducido por la desoxi-azacitidina en células linfoblastoides, sugiriendo que la expresión tumoral es debida a la desmetilación (Lethe et al., Int. J. Cáncer 76(6): 903-908 (1998) ) . Una variedad de ensayos para examinar el estado de metilación de un gen, son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, se puede utilizar, en los procedimiento de hibridación de Sothern, las enzimas de restricción sensibles a la metilación, que no pueden escindir las secuencias que contienen sitios CpG metilados para evaluar el estado de metilación de las islas de Cpg. Además, MSP (PCR específica de metilación) puede perfilar rápidamente el estado de metilación de todos los sitios CpG presentes en una isla CpG de un gen dado. Este procedimiento involucra la modificación inicial del DNA mediante bisulfito de sodio (el cual convertirá todas las citocinas no metiladas a uracilo) seguido por la amplificación utilizando cebadores específicos para el DNA metilado versus no metilado. Los protocolos que involucran la interferencia de metilación pueden también ser encontrados por ejemplo en Current Protocals In Molecular Biology, Unit 12, Frederick M. Ausubel et al. eds., 1995. La amplificación del gen es un método adicional para evaluar el estado de STEAP-l. La amplificación del gen es medida en una muestra directamente, por ejemplo, mediante análisis convencional de Sothern blot y de Northern blot, para cuantificar la transcripción del mRNA (Thomas, 1980, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205), transferencia por puntos (análisis de DNA) , o hibridación in situ, utilizando una sonda apropiadamente marcada, con base en las secuencias proporcionadas en la presente. Alternativamente, son empleados los anticuerpos que reconocen dúplex específico, incluyendo dúplex de DNA, dúplex de RNA, y dúplex híbridos de DNA-RNA o dúplex de DNA-proteína. Los anticuerpos a su vez son marcados y el ensayo llevado a cabo donde el dúplex es enlazado a una superficie, de modo que después de la formación del dúplex sobre la superficie, puede ser detectada la presencia del anticuerpo enlazado al dúplex. El tejido de biopsia o la sangre periférica pueden ser convenientemente evaluados para la presencia de las células cancerosas utilizando por ejemplo, análisis de Northern, de transferencia por puntos o de RT-PCR para detectar la expresión de STEAP-l. La presencia del mRNA de STEAP-l amplificable por RT-PCR, proporciona una indicación de la presencia del cáncer. Los ensayos de RT-PCR son bien conocidos en la técnica. Los ensayos de detección de RT-PCR para células tumorales en sangre periférica, están siendo actualmente evaluados para el uso en el diagnóstico y manejo de un número de .tumores sólidos humanos. En el campo del cáncer de la próstata, éstos incluyen ensayos de RT-PCR para la detección de las células que expresan PSA y PSM (Verkaik et al., 1997, Urol. Res .25 : 373-384; Ghossein et al., 1995, J. Clin. Oncol. 13: 1195-2000; Heston et al., 1995, Clin. Chem. 41: 1687-1688) . Un aspecto adicional de la invención es una evaluación de la susceptibilidad que un individuo tiene para desarrollar cáncer. En una modalidad, un método para predecir la susceptibilidad al cáncer comprende detectar el mRNA de STEAP-l o la proteína STEAP-l en una muestra de tejido, indicando su presencia la susceptibilidad al cáncer, en donde el grado de expresión del mRNA de STEAP-l correlaciona con el grado de susceptibilidad. En una modalidad específica, es examinada la presencia de STEAP-l en la próstata y otros tejidos. Con la presencia de STEAP-l en la muestra proporcionando una indicción de la susceptibilidad al cáncer de próstata (o la aparición o la existencia de un tumor de próstata) . Similarmente, se puede evaluar la integridad de las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de STEAP-l, en una muestra biológica, con el fin de identificar las perturbaciones en la estructura de estas moléculas tales como inserciones, supresiones, sustituciones y similares. La presencia de una o más perturbaciones en los productos del gen de STEAP-l en la muestra es una indicación de la susceptibilidad al cáncer (o la aparición o existencia de un tumor) . La invención también comprende los métodos para medir la agresividad del tumor. En una modalidad, un método para medir la agresividad de un tumor, comprende determinar el nivel del mRNA de STEAP-l o la proteína STEAP-l expresada por las células tumorales, comparando el nivel determinado así con el nivel de mRNA de STEAP-l o la proteína de STEAP-l expresada en un tejido normal correspondiente tomado del mismo individuo o una muestra de tejido normal de referencia, en donde el grado de mRNA de STEAP-l o la expresión de la proteína STEAP-l en la muestra de tumor con relación a la muestra normal, indica el grado de agresividad. En una modalidad específica, es evaluada la agresividad de un tumor al determinar el grado al cual es expresada STEAP-l en las células tumorales, con los más altos niveles de expresión que indican tumores más agresivos. Otra modalidad más es la evaluación de la integridad de las secuencias de aminoácidos y de nucleótidos de STEAP-l en una muestra biológica, con el fin de identificar las perturbaciones en la estructura de estas moléculas tales como inserciones, supresiones, sustituciones y similares. La presencia de una o más perturbaciones indica tumores más agresivos. Otra modalidad de la invención está dirigida a los métodos para observar la progresión de una malignidad en un individuo sobre el tiempo. En una modalidad, los métodos para la observación de la progresión de una malignidad en un individuo sobre el tiempo, comprenden la determinación del nivel del mRNA de STEAP-l o la proteína STEAP-l expresada por las células en una muestra del tumor, comparando el nivel determinado así al nivel del mRNA de STEAP-l o la proteína STEAP-l expresada en una muestra de tejido equivalente tomada del mismo individuo a un tiempo diferente, en donde el grado de expresión del mRNA de STEAP-l o la proteína STEAP-l en la muestra del tumor, sobre el tiempo, proporciona la información sobre la progresión del cáncer. En una modalidad específica, la progresión de un cáncer es evaluada mediante la determinación de la expresión de STEAP-l en las células tumorales sobre el tiempo, donde la expresión incrementada .sobre el tiempo indica una progresión del cáncer. También, se puede evaluar la integridad de las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de STEAP-l en una muestra biológica, con el fin de identificar las perturbaciones de la estructura de estas moléculas, tales como inserciones, supresiones, sustituciones y similares, donde la presencia de una o más perturbaciones indica una progresión del cáncer. Los procedimientos de diagnóstico anteriores pueden ser combinados con cualquiera de una amplia variedad de protocolos de pronóstico y de diagnóstico conocidos en la materia. Por ejemplo, otra modalidad más de la invención está dirigida a los métodos para observar una coincidencia entre la expresión de un gen de STEAP-l y los productos del gen de STEAP-l (o las perturbaciones en el gen de STEAP-l y los productos del gen de STEAP-l) y un factor que está asociado con la malignidad, como un medio para diagnosticar y pronosticar el estado de una muestra de tejido. Una amplia variedad de factores asociados con la malignidad pueden ser utilizados, tales como la expresión de los genes asociados con la malignidad (por ejemplo, la expresión de PSA, PSCA y PSM para el cáncer de próstata, etc.) así como las observaciones citológicas a groso modo (ver, por ejemplo, Booking et al., 1984, Anal. Quant. Cytol. 6(2): 74-88; Epstein, 1995, Hum. Pathol. 26(2): 223-9; Thorson et al., 1998, Mod. Pathol. 11 (6): 543-51; Baisden et al., 1999, Am. J. Surg. Pathol. 23(8): 918-24). Los métodos para observar una coincidencia entre la expresión de un gen de STEAP-l y los productos del gen de STEAP-l (o las perturbaciones en el gen de STEAP-l y los productos del gen de STEAP-1) y otro factor más que está asociado con la malignidad son útiles, por ejemplo, debido a la presencia de un grupo de factores específicos que coinciden con la enfermedad, lo cual proporciona información crucial para el diagnóstico y pronóstico del estado de una muestra de tejido. En una modalidad, los métodos para observar una coincidencia entre la expresión del gen de STEAP-l y los productos del gen de STEAP-l (o las perturbaciones en el gen de STEAP-l y los productos del gen de STEAP-l) y otro factor más asociado con la malignidad, involucra la detección de la sobreexpresión del mRNA o la proteína STEAP-l en una muestra de tejido, detectando la sobreexpresión de mRNA de PSA o la proteína en una muestra de tejido (o la expresión de PSCA o PSM) , y observando una coincidencia del mRNA de STEAP-l o la proteína, y el mRNA de PSA o la sobreexpresión de la proteína (o la expresión de PSCA o PSM) . En una modalidad específica, es examinada la expresión del mRNA de STEAP-l y de PSA en próstata, donde la coincidencia de la sobreexpresión del mRNA de STEAP-l y de PSA en la muestra indica la existencia de cáncer de próstata, susceptibilidad al cáncer de próstata o la aparición o el estado de un tumor de próstata. Los métodos para detectar y cuantificar la expresión del mRNA o la proteína STEAP-l son descritos en la presente, y son bien conocidas en la técnica las tecnologías de detección y cuantificación estándares de ácidos nucleicos y de proteínas. Los métodos estándares para la detección y cuantificación del mRNA de STEAP-l incluyen la hibridación in situ utilizando ribosondas de STEAP-l marcadas, Northern blot y técnicas relacionadas utilizando sondas de polinucleótidos de STEAP-l, análisis de RT-PCR utilizando cebadores específicos para STEAP-l, y otros métodos de detección tipo amplificación, tales como, por ejemplo, DNA ramificado, SISBA, TMA y similares. En una modalidad específica, la RT-PCR semi-cuantitativa es utilizada para detectar y cuantificar la expresión del mRNA de STEAP-l. Cualquier número de cebadores capaces de amplificar STEAP-l pueden ser utilizados para este propósito, incluyendo pero no limitados a los diversos grupos de cebadores específicamente descritos en la presente. En una modalidad específica, los anticuerpos policlonales y monoclonales específicos reactivos con la proteína STEAP-l de tipo silvestre pueden ser utilizados en un ensayo inmunohistoquímico de tejido de biopsia.
IX. ) Identi icación de las Moléculas que Interactúan con STEAP-l Las secuencias de proteína y de ácido nucleico de la presente invención descritas en la presente permiten que una persona experta identifique las proteínas, las moléculas pequeñas y otros agentes que interactúan con STEAP-l, así como las vías activadas por STEAP-l por medio de cualquiera de una variedad de protocolos aceptados en la técnica. Por ejemplo, se puede utilizar uno de los denominados sistemas de trampa de interacción (también denominado como el "ensayo de dos híbridos") . En tales sistemas, las moléculas interactúan y reconstituyen un factor de transcripción que dirige la expresión de un gen reportero, después de lo cual es evaluada la expresión del gen reportero. Otros sistemas identifican las interacciones proteína-proteína in vivo a través de la reconstitución de un activador transcripcional eucariótico, ver, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,955,280 expedida el 21 de Septiembre de 1999, 5,925,523 expedida el 20 de Julio de 1999, 5,846,722 expedida el 8 de Diciembre de 1998 y la 6,004,746 expedida el 21 de Diciembre de 1999. Los algoritmos son también disponibles en la técnica para las predicciones basadas en el genoma, de la función proteica (ver, por ejemplo, Marcotte, et al., Nature 402: 4 de Noviembre de 1999, 83-86). Alternativamente, se pueden seleccionar las bibliotecas peptídicas para identificar las moléculas que interactúan con las secuencias proteicas de STEAP-l. En tales métodos, los péptidos que se enlazan a STEAP-l son identificados mediante la selección de bibliotecas que codifican para una colección aleatoria o controlada de aminoácidos. Los péptidos codificados por las bibliotecas son expresados como proteínas de fusión de proteínas de recubrimiento de bacteriófagos, las partículas de bacteriófagos son luego seleccionadas contra la o las proteínas STEAP-l. En consecuencia, los péptidos que tienen una amplia variedad de usos, tales como los reactivos terapéuticos, de pronóstico o de diagnóstico, son de este modo identificados sin ninguna información previa sobre la estructura del ligando esperado o de la molécula del receptor. Las bibliotecas peptídicas típicas y los métodos de selección que pueden ser utilizados para identificar las moléculas que interactúan con las secuencias de la proteína STEAP-l, se describen por ejemplo en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,723,286 expedida el 3 de Marzo de 1998 y 5,733,731 expedida el 31 de Marzo de 1998. Alternativamente, las líneas celulares que expresan STEAP-l son utilizadas para identificar las interacciones proteína-proteína mediadas por STEAP-l. Tales interacciones pueden ser examinadas utilizando técnicas de inmunoprecipitación (ver, por ejemplo, Hamilton B. J. , et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999, 261: 646-51). La proteína STEAP-l puede ser inmunoprecipitada a partir de las líneas celulares que expresan STEAP-l utilizando anticuerpos anti-STEAP-1. Alternativamente, los anticuerpos contra el marcador de His pueden ser utilizados en una línea celular manipulada por ingeniería para expresar fusiones de STEAP-l y un marcador de His (vectores mencionados anteriormente) . El complejo inmunoprecipitado puede ser examinado para la asociación de la proteína mediante procedimientos tales como Western blot, marcación de las proteínas con 35S-metionina, microsecuenciamiento de las proteínas, tinción con plata y electroforesis en gel bidimensional. Las moléculas pequeñas y los ligandos que interactúan con STEAP-l pueden ser identificados a través de modalidades relacionadas de tales ensayos de selección. Por ejemplo, las moléculas pequeñas pueden ser identificadas interfiriendo con la función de la proteína, incluyendo las moléculas que interfieren con la habilidad de la STEAP-l para mediar la fosforilación y la desfosforilación, la interacción con las moléculas de DNA o RNA como una indicación de la regulación de los ciclos celulares, la señalización del segundo mensajero y la tumorigénesis. Similarmente, las moléculas pequeñas que modulan los canales de iones relacionados a STEAP-l, la bomba de proteínas, o las funciones de comunicación celular son identificadas y utilizadas para tratar a pacientes que tienen un cáncer que expresa STEAP-l (ver, por ejemplo, Hille, B., Ionic Channels of Excitable Membranes 2a Ed., Sinauer Assoc, Sunderland, MA, 1992) . Además, los ligandos que regulan la función de STEAP- 1 pueden ser identificados con base en su habilidad para enlazarse a STEAP-l y activar una construcción del reportero. Los métodos típicos son discutidos por ejemplo en la Patente de los Estados Unidos No. 5,928,868 expedida el 27 de Julio de 1999, e incluye los métodos para la formación de ligandos híbridos en los cuales al menos un ligando es una molécula pequeña. En una modalidad ilustrativa, las células manipuladas por ingeniería genética para expresar una proteína de fusión de STEAP-l y una proteína de enlace al DNA, se utilizan para co-expresar una proteína de fusión de un ligando híbrido/molécula pequeña y una proteína activadora de la transcripción de la biblioteca de cDNA. Las células contienen además un gen reportero, la expresión del cual es condicionada en la proximidad de la primera y segunda proteínas de fusión una con la otra, un evento que ocurre únicamente si el ligando híbrido se enlaza a los sitios objetivo sobre ambas proteínas híbridas. Aquellas células que expresan el gen reportero son seleccionadas y la molécula pequeña desconocida o el ligando desconocido son identificados. Este método proporciona un medio para identificar los moduladores, que activan o inhiben a STEAP-l. Una modalidad de esta invención comprende un método para seleccionar una molécula que interactúa con la secuencia de aminoácidos de STEAP-l mostrada en las figuras 2A-2Q o las figuras 3A-3D, que comprende los pasos de poner en contacto una población de las moléculas con una secuencia de aminoácidos de STEAP-l, permitiendo que la población de moléculas y la secuencia de aminoácidos de STEAP-l interactúen bajo condiciones que faciliten una interacción, determinando la presencia de una molécula que interactúa con la secuencia de aminoácidos de STEAP-1, y luego separando las moléculas que no interactúan con la secuencia de aminoácidos de STEAP-l a partir de las moléculas que sí lo hacen. En una modalidad específica, el método comprende además la purificación, la caracterización y la identificación de una molécula que interactúa con la secuencia de aminoácidos de STEAP-l. La molécula identificada puede ser utilizada para modular una función realizada por STEAP-l. En una modalidad preferida, la secuencia de aminoácidos de STEAP-l es puesta en contacto con una biblioteca de péptidos.
X.) Métodos y Composiciones Terapéuticas La identificación de STEAP-l como una proteína que es normalmente expresada en un grupo restringido de tejidos, pero que es también expresada en cánceres tales como aquellos listados en la Tabla I, abre un número de procedimientos o enfoques terapéuticos al tratamiento de tales cánceres. Hay que hacer notar que las terapias antitumorales dirigidas han sido útiles incluso cuando la proteína dirigida es expresada sobre tejidos normales, incluso los tejidos de órganos normales vitales. Un órgano vital es uno que es necesario para el sostenimiento de la vida, tal como el corazón o el colon. Un órgano vital es uno que puede ser retirado de éste y el individuo es todavía capaz de sobrevivir. Los ejemplos de órganos no vitales son los ovarios, mama y próstata. Por ejemplo, Herceptin® es un producto farmacéutico aprobado por la FDA que consiste de un anticuerpo que es inmunorreactivo con la proteína variamente conocida como HER2, HER2/neu, o erb-b-2. Ésta es comercializada por Genentech y ha sido un agente anti-tumoral comercialmente exitoso. Las ventas de Herceptin® alcanzaron casi 400 millones de dólares en el 2002. Herceptin® es un tratamiento para el cáncer de mama metastático positivo a HER2. No obstante, la expresión de HER2 no está limitada a tales tumores. La misma proteína es expresada en un número de tejidos normales. En particular, se sabe que HER2/neu está presente en riñon y corazón normales, de este modo, estos tejidos están presentes en todos los recipientes humanos de Herceptin. La presencia de HER2/neu en riñon normal es también confirmada por Latif, Z., et al., B.J.U. international (2002) 89: 5-9. Como se muestra en este artículo (el cual evaluó si el carcinoma de células renales debe ser una indicación preferida para los anticuerpos anti-HER2 tales como Herceptin) la proteína y el mRNA son producidos en tejidos renales benignos. Notablemente, la proteína HER2/neu fue fuertemente sobreexpresada en tejido renal benigno. A pesar del hecho de que HER2/neu es expresado en tales tejidos vitales como el corazón y el riñon, la Herceptina es un fármaco muy útil, aprobado por la FDA y comercialmente exitoso. El efecto de Herceptin sobre el tejido cardiaco, por ejemplo, "cardiotoxicidad" ha sido meramente un efecto colateral al tratamiento. Cuando los pacientes fueron tratados con Herceptina únicamente, la cardiotoxicidad significativa ocurrió en un porcentaje muy bajo de pacientes. Para reducir al mínimo la cardiotoxicidad existe un requerimiento de entrada más exigente para el tratamiento con HER2/neu. Los factores tales como la predisposición a la condición cardiaca son evaluados antes de que pueda ocurrir el tratamiento. De interés particular, aunque el tejido renal es indicado como poseedor de expresión normal, posiblemente expresión aún mayor que el tejido cardiaco, el riñon no tiene ningún efecto colateral a Herceptin, apreciable. Además, del arreglo diverso de los tejidos normales en los cuales HER2 es expresado, existe muy poca aparición de algún efecto colateral. Únicamente el tejido cardiaco ha manifestado algún efecto colateral apreciable del todo. Un tejido tal como el riñon, donde la expresión de HER2/neu es especialmente notable, no ha sido la base de ningún efecto colateral . Además, han sido encontrados efectos terapéuticos favorables para terapias anti-tumorales que se dirigen al receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) ; Erbitux (ImClone) . EGFR es también expresado en numerosos tejidos normales. Han existido efectos colaterales muy limitados en los tejidos normales después del uso de las terapéuticas anti-EGFR. Un efecto colateral general que ocurre con el tratamiento de EGFR es una comezón severa en la piel observada en 100% de los pacientes que sufren tratamiento. De este modo, la expresión de una proteína objetivo en tejido normal, incluso tejido normal vital, no elimina la utilidad de un agente de dirección al objetivo para la proteína, como un terapéutico para ciertos tumores en los cuales es también sobreexpresada la proteína. Por ejemplo, la expresión en órganos vitales no es por sí misma dañina. Además, los órganos considerados como dispensables, tales como la próstata y el ovario, pueden ser eliminados sin afectar la mortalidad. Finalmente, algunos órganos vitales no son afectados por la expresión de órganos normales debido a un inmunoprivilegio. Los órganos inmunoprivilegiados son órganos que son protegidos de la sangre en una barrera sangre/órgano, y de este modo no son accesibles a la inmunoterapia. Los ejemplos de órganos inmunoprivilegiados son el cerebro y los testículos. En consecuencia, los procedimientos terapéuticos que inhiben la actividad de una proteína STEAP-l son útiles para pacientes que sufren de un cáncer que expresa STEAP-l. Estos procedimientos terapéuticos en general caen dentro de tres clases. La primera clase modula la función de STEAP-l ya que ésta se relaciona al crecimiento de las células tumorales que conduce a la inhibición o al retardo del crecimiento de las células tumorales o a la inducción de su muerte. La segunda clase comprende diversos métodos para inhibir el enlace o la asociación de una proteína STEAP-l con su socio de enlace o con otras proteínas. La tercera clase comprende una variedad de métodos para inhibir la transcripción de un gen de STEAP-l o la traducción del mRNA de STEAP-l.
X.A.) Vacunas Anti-Cáncer La invención proporciona las vacunas del cáncer que comprenden una proteína relacionada a STEAP-l el ácido nucleico relacionado a STEAP-l. En vista de la expresión de STEAP-l, las vacunas para el cáncer previenen y/o tratan los cánceres que expresan STEAP-l, con efectos mínimos o nulos sobre los tejidos no objetivo. El uso de un antígeno tumoral en una vacuna que genera respuestas inmunes humorales mediadas por células, como terapia anticancerosa, es bien conocido en la técnica y ha sido empleado en cáncer de próstata utilizando los inmunógenos PSMA humano y PAP de roedor (Hodge et al., 1995, Int. J. Cáncer 63: 231-2-37; Fong et al, 1997, J. Im unol . 159: 3113-3117). Tales métodos pueden ser fácilmente practicados mediante el empleo de una proteína relacionada a STEAP-l, o una molécula de ácido nucleico que codifica para STEAP-l, y los vectores recombínantes capaces de expresar y presentar el inmunógeno de STEAP-l (que típicamente comprende un número de epitopos de células T o el anticuerpo) . Los expertos en la técnica entienden una amplia variedad de sistemas de vacuna para la distribución de epitopos inmunorreactivos son conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, Heryln et al., Ann Med 1999 Feb 31(1): 66-78; Maruyama et al., Cáncer Immunol Immunother 2000 Jun 49(3): 123-32). En resumen, tales métodos para la generación de una respuesta inmune (por ejemplo, mediada por las células y/o humoral) en un mamífero, comprende los pasos de: exponer el sistema inmune del mamífero a un epitopo inmunorreactivo (por ejemplo, un epitopo presente en una proteína STEAP-l mostrada en la Figura 3, o análogo u homólogo de la misma) de modo que el mamífero genera una respuesta inmune que es específica para ese epitopo (por ejemplo, genera los anticuerpos que reconocen específicamente ese epitopo) . En un método preferido, un inmunógeno de STEAP-l contiene una porción biológica, ver por ejemplo, las Tablas V-XVIII y XXII-LI, o un péptido de un intervalo de tamaño de STEAP-l indicado en la Figura 5, Figura 6, Figura 7, Figura 8, y Figura 9. La proteína STEAP-l entera, las regiones inmunogénicas o los epitopos de la misma pueden ser combinados y distribuidos por diversos medios. Tales composiciones de vacuna pueden incluir, por ejemplo, lipopéptidos (por ejemplo, Vitiello, A. et al., J. Clin . Invest . 95:341, 1995), composiciones peptídicas encapsuladas en microesferas de poli (DL-láctido-co-glicólido) ("PLG") (ver, por ejemplo, Eldridge, et al., Molec. Immunol. 28: 287- 294, 1991: Alonso et al., Vaccine 12: 299-306, 1994; Jones et al., Vaccine 13: 675-681, 1995), composiciones peptídicas contenidas en complejos inmunoestimuladores (ISCOMS) (ver, por ejemplo, Takahashi et al., Nature 344: 873-875, 1990; Hu et al., Clin Exp Immunol. 113: 235-243, 1998), sistemas peptídicos de antígenos múltiples (MAPs) (ver, por ejemplo, Tam, J. P., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 85: 5409-5413, 1988; Tam, J.P., J. Immunol . Methods 196: 17-32, 1996), péptidos formulados como péptidos multivalentes; péptidos para el uso en sistemas de distribución balística, típicamente péptidos cristalizados, vectores de distribución viral (Perkus, M. E. et al., en: Concepts in vaccine development, Kaufmann, S. H. E., ed., p. 379, 1996; Chakrabarti, S. et al., Nature 320: 535, 1986; Hu, S. L. et al., Nature 320: 537, 1986; Kieny, M.-P. et al., AIDS Bio/Technology 4: 790, 1986; Top, F. H. et al., J. Infect . Dis. 124: 148, 1971; Chanda, P. K. et al., Virology 175: 535, 1990) , partículas de origen viral o sintético (por ejemplo, Kofler, N. et al., J. Immunol . Methods. 192: 25, 1996; Eldridge, J. H. et al., Sem. He atol. 30: 16, 1993; Falo, L. D., Jr. et al., Nature Med. 7: 649, 1995), adyuvantes (Warren, H. S., Vogel, F. R. , y Chedid, L. A. Annu. Rev. Immunol. 4: 369, 1986; Gupta, R. K. et al., Vaccine 11: 293, 1993), liposomas (Reddy, R. et al., J. Immunol. 148: 1585, 1992; Rock, K. L., Immunol . Today 17:131, 1996), o cDNA desnudo o adsorbido en partículas (Ulmer, J. B. et al., Science 259: 1745, 1993; Robinson, H. L. Hunt, L. A., y Webster, R. G., Vaccine 11: 957, 1993; Shiver, J. W. et al., en: Concepts in vaccine development, Kaufmann, S. H. E., ed., p. 423, 1996; Cease, K. B., y Berzofsky, J. A., Annu. Rev. Immunol. 12: 923, 1994 y Eldridge, J. H. et al., Sem. Hematol. 30: 16, 1993). Las tecnologías de distribución dirigidas por toxina son conocidas como la dirección al objetivo mediada por el receptor, tales como aquellas de Avant Immunotherapeutics, Inc. (Needham, Massachusetts), que pueden ser también utilizadas. En pacientes con cáncer asociado a STEAP-l, las composiciones de vacuna de la invención pueden también ser utilizadas en conjunto con otros tratamientos utilizados para el cáncer, por ejemplo, cirugía, quimioterapia, terapias con fármacos, radioterapias, etc. incluyendo el uso en combinación con adyuvantes inmunes tales como IL-2, IL-12, GM-CSF, y similares.
Vacunas Celulares Los epitopos de CTL pueden ser determinados utilizando algoritmos específicos para identificar los péptidos dentro de la proteína STEAP-l que se enlazan a los correspondientes alelos de HLA (ver por ejemplo, Tabla IV; Epimer™ y Epimatrix™, Brown University (URL brown.edu/Research/TB- HIV_Lab/epimatrix/epimatrix.html) ; y, BIMAS, (URL bimas.dcrt.nih.gov/; SYFPEITHI URL syfpeithi .b i-heidelberg.com/). En una modalidad preferida, un inmunógeno de STEAP-l contiene una o más secuencias de aminoácidos identificadas utilizando técnicas bien conocidas en la materia, tales como las secuencias mostradas en las Tablas V-XVII y XXII-LI o un péptído de 8, 9, 10 u 11 aminoácidos especificado por una porción/superporción de HLA de la clase I (por ejemplo, Tabla IV (A), Tabla IV (D) , o Tabla IV (E) ) y/o un péptido de al menos 9 aminoácidos que comprende una porción/superporción de HLA de la clase II (por ejemplo, Tabla IV (B) o Tabla IV (C) ) . Como es apreciado en la técnica, la muesca de enlace de HLA de la clase I es esencialmente de extremo cerrado de modo que los péptidos únicamente de un intervalo de tamaño particular pueden ajustarse dentro de la muesca y ser enlazados, en general los epitopos de HLA de la clase I son de 8, 9, 10 u 11 aminoácidos de longitud. En contraste, la muesca de enlace de HLA de la clase II es esencialmente de extremo abierto; por lo tanto, un péptido de aproximadamente 9 o más aminoácidos puede ser enlazado por una molécula HLA de la clase II. Debido a las diferencias de la muesca de enlace entre las porciones HLA de la clase I y HLA de la clase II son específicas de longitud, por ejemplo la posición dos de la clase I es el segundo aminoácido en una dirección de amino a carboxilo del péptido. Las posiciones de los aminoácidos en una porción de la clase II son relativas únicamente una a la otra, no al péptido completo, por ejemplo, los aminoácidos adicionales pueden ser enlazados a los extremos amino y/o carboxilo de una secuencia que posee la porción. Los epitopos de HLA de la clase II son frecuentemente de 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, ó 25 aminoácidos de longitud, o más de 25 aminoácidos. .Una amplia variedad de métodos para generar una respuesta inmune en un mamífero es conocida en la técnica (por ejemplo como el primer paso en la generación de hibridomas) . Los métodos para la generación de una respuesta inmune en un mamífero comprende la exposición del sistema inmune del mamífero a un epitopo inmunogénico sobre una proteína (por ejemplo, una proteína STEAP-l) de modo que es generada una respuesta inmune. Una modalidad típica consiste de un método para generar una respuesta inmune para STEAP-l en un hospedero, al poner en contacto el hospedero con una cantidad suficiente de al menos una célula B de STEAP-1 o el epitopo de células T citotóxicas o el análogo del mismo; y al menos un intervalo periódico después de esto poniendo en contacto nuevamente el hospedero con el epitopo de célula B de STEAP-l o de célula T cítotóxíca o el análogo del mismo. Una modalidad específica consiste de un método para generar una respuesta inmune contra una proteína relacionada a STEAP-1 o un péptido multiepitópico hecho por el hombre que comprende: administrar un inmunógeno de STEAP-l (por ejemplo una proteína STEAP-l o un fragmento peptídico de la misma, una proteína de fusión de STEAP-l o análogo, etc.) en una preparación de vacuna a un humano u otro mamífero. Típicamente, tales preparaciones de vacuna contienen además un adyuvante adecuado (ver, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos No. 6,146,635) o un epitopo auxiliar universal tal como el péptido PADREME (Epi mune Inc., San Diego, CA; ver, por ejemplo, Alexander et al., J. Immunol. 2000 164(3); 164(3): 1625-1633; Alexander et al., Immunity 1994 1(9): 751- 761 and Alexander et al., Im unol. Res. 1998 18(2): 79-92). Un método alternativo comprende la generación de una respuesta inmune en un individuo contra un inmunógeno de STEAP-l medíante: la administración in vivo al músculo o a la piel del cuerpo del individuo, de una molécula de DNA que comprende una secuencia de DNA que codifica para un inmunógeno de STEAP-l, la secuencia de DNA operativamente enlazada a las secuencias reguladoras que controlan la expresión de la secuencia de DNA; en donde la molécula de DNA es recogida por las células, la secuencia de DNA es expresada en las células y es generada una respuesta inmune contra el inmunógeno (ver, por ejemplo, Patente de los Estados Unidos No. 5,962,428). Opcionalmente un facilitador de vacuna genético tales como los lípidos aniónicos; saponinas; lectinas; compuestos estrogénicos; alquilos inferiores hidroxilados; sulfóxido de dimetilo; y urea, es también administrado. Además, puede ser administrado también un anticuerpo anti-idiotípico que imita a STEAP-l, con el fin de generar una respuesta hacia el antígeno objetivo.
Vacunas de Ácido Nucleico Las composiciones de vacuna de la invención incluyen modalidades mediadas por ácido nucleico. El DNA o el RNA que codifican para la o las proteínas de la invención puede ser administrado a un paciente. Los métodos de inmunización genética pueden ser empleados para generar respuestas inmunes humorales y celulares, profilácticas o terapéuticas, dirigidas contra células cancerosas que expresan STEAP-1. Las construcciones que comprenden DNA que codifican para una proteína/inmunógeno relacionado a STEAP-l y las secuencias reguladoras apropiadas, pueden ser inyectadas directamente en el músculo o en la piel de un individuo, tal que las células del músculo o de la piel recogen la construcción y expresan la proteína STEAP-1/inmunógeno, codificada. Alternativamente, una vacuna comprende una proteína relacionada a STEAP-l. La expresión del inmunógeno de la proteína relacionada a STEAP-l da como resultado la generación de inmunidad humoral y celular, profiláctica o terapéutica, contra las células que poseen una proteína STEAP-l. Diversas técnicas de inmunización genética profilácticas y terapéuticas, conocidas en la técnica, pueden ser utilizadas (para una revisión, ver la información y referencias publicadas en la dirección de Internet genweb.com). La distribución basada en ácido nucleico es descrita, por ejemplo, en Wolff et al, Science 247: 1465 (1990) así como en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,580,859; 5,589,466; 5,804,566; 5,739,118; 5,736,524; 5,679,647; WO 98/04720. Los ejemplos de tecnologías de distribución basada en DNA incluyen el "DNA desnudo", distribución facilitada (bupivicaina, polímeros, mediada por péptidos) , complejos de lípidos catiónicos, y distribución mediada por partículas ("pistola de genes") o mediada por presión (ver, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos No. 5,922,687) . Para fines de inmunización terapéutica o profiláctica, las proteínas de la invención pueden ser expresadas por medio de vectores virales o bacterianos. Los diversos sistemas de distribución de genes virales que pueden ser utilizados en la práctica de la invención incluyen, pero no están limitados a vaccinia, viruela aviar, viruela del canario, adenovirus, influenza, poliovirus, virus adenoasociados, lentivirus, y virus sindbis (ver, por ejemplo, Restifo, 1996, Curr. Opin. Immunol. 8: 658-663; Tsang et al. J. Nati. Cáncer Inst. 87: 982-990 (1995)). Los sistemas de distribución no virales pueden ser también empleados mediante la introducción de DNA desnudo que codifica para una proteína relacionada a STEAP-l dentro del paciente (por ejemplo, intramuscular o intradérmicamente) para inducir una respuesta anti-tumoral. El virus de la vaccinia es utilizado, por ejemplo, como un vector para expresar las secuencias nucleotídicas que codifican para los péptidos de la invención. Después de la introducción dentro de un hospedero, el virus de la vaccinia recombinante expresa el péptido inmunogénico proteico, y con esto promueve una respuesta inmune del hospedero. Los vectores de vaccinia y los métodos útiles en los protocolos de inmunización son descritos en, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos No. 4,722,848. Otro vector más es BCG (Bacilo de Calmette Guerin) . Los vectores de BCG son descritos en Stover et al., Nature 351: 456-460 (1991). Una amplia variedad de otros vectores útiles para la administración o inmunización terapéutica de los péptidos de la invenció, por ejemplo los vectores vírales adeno y adeno-asociados, vectores retrovirales, vectores de Salmonella typhi, vectores de la toxina destoxificada del ántrax, y similares, serán aparentes para aquellos expertos en la técnica a partir de la descripción de la presente. De este modo, los sistemas de distribución de genes son utilizados para distribuir una molécula de ácido nucleico relacionada a STEAP-l. En una modalidad, es empleado el cDNA de STEAP-l, humano, de longitud completa. En otra modalidad más, las moléculas de ácido nucleico de STEAP-l que codifican para los epitopos de linfocito T citotóxico específico (CTL) y/o del anticuerpo, son empleados.
Vacunas Ex Vivo Pueden ser también empleadas diversas estrategias ex vivo para generar una respuesta inmune. Un procedimiento involucra el uso de las células presentadoras de antígeno (APCs) tales como las células dendríticas (DC) para presentar el antígeno STEAP-l al sistema inmune de un paciente. Las células dendríticas expresan moléculas MHC de la clase I y II, el co-estimulador B7, e IL-12, y son de este modo células presentadoras de antígeno, altamente especializadas. En cáncer de próstata, las células dendríticas autólogas pulsadas con péptidos del antígeno membranal específico de la próstata (PSMA) están siendo utilizadas en prueba clínica de Fase I para estimular los sistemas inmunes de pacientes con cáncer de próstata (Tjoa et al., 1996, Prostate 28: 65-69; Murphy et al., 1996, Prostate 29: 371-380). De este modo, las células dendríticas pueden ser utilizadas para presentar los péptidos STEAP-l a las células T en el contexto de las moléculas MHC de la clase I o II. En una modalidad, las células dendríticas autólogas son pulsadas con los péptidos STEAP-l capaces de enlazarse a las moléculas de MHC de la clase I o clase II. En otra modalidad más, las células dendríticas son pulsadas con la proteína STEAP-1 completa. Otra modalidad más involucra la manipulación por ingeniería de la sobreexpresión de un gen de STEAP-l en las células dendríticas, utilizando diversos vectores de implementación conocidos en la técnica, tales como adenovirus (Arthur et al., 1997, Cáncer Gene Ther. 4: 17-25), retrovirus (Henderson et al., 1996, Cáncer Res. 56: 3763-3770), lentivirus, virus adeno-asociados, transfección de DNA (Ribas et al., 1997, Cáncer Res. 57: 2865-2869), o la transfección del RNA derivado del tumor (Ashley et al., 1997, J. Exp. Med. 186: 1177-1182) . Las células que expresan STEAP-l pueden ser también manipuladas por ingeniería genética para expresar inmunomoduladores, tales como GM-CSF, y utilizados como agentes de inmunización.
X.B.) STEAP-l como un Objetivo para la Terapia Basada en Anticuerpo STEAP-1 es un objetivo atractivo para las estrategias terapéuticas basadas en el anticuerpo. Un número de especies de anticuerpo son conocidas en la técnica para dirigirse a las moléculas extracelulares e intracelulares (ver, por ejemplo, la muerte mediada por el complemento y por ADCC, así como el uso de intracuerpos) . Debido a que STEAP-l es expresada por células cancerosas de diversas líneas con relación a las células normales correspondiente, la administración sistémica de las composiciones inmunorreactivas con STEAP-1 son preparadas mostrando excelente sensibilidad sin efectos tóxicos, no específicos y/o no objetivos provocados por el enlace de la composición inmunorreactiva a órganos o tejidos no objetivo. Los anticuerpos específicamente reactivos con los dominios de STEAP-l son útiles para tratar los cánceres que expresan STEAP-l sistémicamente, ya sea como conjugados con una toxina o agente terapéutico, o como anticuerpos desnudos capaces de inhibir la proliferación o la función celular. Los anticuerpos para STEAP-l pueden ser introducidos dentro de un paciente, tal que el anticuerpo se enlaza a STEAP-l y modula una función, tal como una interacción con un socio de enlace, y consecuentemente es mediador de la destrucción de las células tumorales y/o inhibe el crecimiento de las células tumorales. Los mecanismos mediante los cuales tales anticuerpos ejercen un efecto terapéutico pueden incluir la citólisis mediada por el complemento, la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo, la modulación de la función fisiológica de STEAP-1, la inhibición del enlace al ligando o las vías de transducción de señales, la modulación de la diferenciación de células tumorales, la alteración de los perfiles del factor de angiogénesis tumoral, y/o la apoptosis. Los ejemplos incluyen Rituxan® para Linfoma No Hodgkins, Herceptin® para cáncer de mama metastático, y Erbitux® para cáncer colorectal. Aquellos expertos en la técnica entienden que los anticuerpos pueden ser utilizados para dirigirse específicamente y enlazar las moléculas inmunogénicas tales como una región inmunogénica de una secuencia de STEAP-l mostrada en las figuras 2A-2Q o en las figuras 3A-3D. Además, los expertos en la técnica entienden que es rutinario conjugar los anticuerpos a los agentes citotóxicos (ver, por ejemplo, Slevers et al. Blood 93: 11 3678-3684 (Junio 1, 1999) ) . Cuando los agentes citotóxicos y/o terapéuticos son distribuidos directamente a las células, tales como mediante la conjugación de éstos a anticuerpos específicos para una molécula expresada por esa célula (por ejemplo, STEAP-l), el agente citotóxico ejercerá su efecto biológico conocido (por ejemplo citotoxicidad) sobre esas células. Una amplia variedad de composiciones y métodos para utilizar los conjugados del anticuerpo-agente citotóxico para matar células, es conocida en la técnica. En el contexto de los cánceres, ' los métodos típicos involucran la administración a un animal que tiene un tumor, una cantidad biológicamente efectiva de un conjugado que comprende un agente citotóxico y/o terapéutico seleccionado, enlazado a un agente de dirección al objetivo (por ejemplo, un anticuerpo anti-STEAP-1) que se enlaza a un marcador (por ejemplo STEAP-1) expresado, accesible al enlace o localizado sobre las superficies celulares. Una modalidad típica es un método de distribución de un agente citotóxico y/o terapéutico a una célula que expresa STEAP-l, que comprende la conjugación del agente citotóxico a un anticuerpo que se enlaza inmunoespecíficamente a un epitopo de STEAP-l, y, la exposición de la célula al conjugado anticuerpo-agente. Otra modalidad ilustrativa es un método para tratar a un individuo sospechoso de sufrir de cáncer metastatizado, que comprende un paso de administrar parenteralmente_ a dicho individuo una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo conjugado a un agente citotóxico y/o terapéutico. La inmunoterapia para el cáncer utilizando anticuerpos anti~STEAP-l puede ser realizada de acuerdo con diversos procedimientos que han sido exitosamente empleados en el tratamiento de otros tipos de cánceres, incluyendo pero no limitados a cáncer de colon (Arlen et al., 1998, Crit. Rev. Immunol. 18: 133-138), mieloma múltiple (Ozaki et al., 1997, Blood 90: 3179-3186, Tsunenari et al., 1997, Blood 90: 2437-2444), cáncer gástrico (Kasprzyk et al., 1992, Cáncer Res. 52: 2771-2776), linfoma de células B (Funakoshi et al., 1996, J. Immunother. Emphasis Tumor Immunol. 19:93-101), leukemia (Zhong et al., 1996, Leuk. Res. 20: 581-589), cáncer colorrectal (Moun et al., 1994, Cáncer Res. 54: 6160-6166; Velders et al., 1995, Cáncer Res. 55: 4398-4403), y cáncer de mama (Shepard et al., 1991, J. Clin. Immunol. 11: 117-127). Algunos procedimientos terapéuticos involucran la conjugación del anticuerpo desnudo a una toxina o radioisótopo, tal como la conjugación de Y912 o I131 a anticuerpos anti-CD20 (por ejemplo, ZevalinMR, IDEC Pharmaceuticals Corp. o BexxarMR, Coulter Pharmaceuticals) respectivamente, mientras que otros involucran la co-administración de los anticuerpos y otros agentes terapéuticos, tales como HerceptinMR (transtuzuMAb) con paclitaxel (Genentech, Inc.). Los anticuerpos pueden ser conjugados a un agente terapéutico. Para tratar el cáncer de próstata, por ejemplo, los anticuerpos para STEAP-l pueden ser administrados en conjunto con radiación, quimioterapia o ablación hormonal. También, los anticuerpos pueden ser conjugados a una toxina tal como la caliqueamicina (por ejemplo, MylotargMR, Wyeth-Ayerst, Madison, NJ, un anticuerpo IgG4 kappa humanizado, recombinante, conjugado a la caliqueamicina que es un antibiótico antitumoral) o un maytansinoide (por ejemplo, Profármaco activado por Tumor, basado en taxano, TAP, plataforma, ImmunoGen, Cambridge, MA, también ver, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos No. 5,416,064) o Auristatina E (Seattle Genetics). Aunque la terapia con el anticuerpo para STEAP-l es útil para todas las etapas del cáncer, la terapia con el anticuerpo puede ser particularmente apropiada en cánceres avanzados o metastáticos . El tratamiento con la terapia de anticuerpo de la invención es indicado para pacientes quienes han recibido una o más rondas de quimioterapia. Alternativamente, la terapia con anticuerpo de la invención es combinada con un régimen quimioterapéutico o de radiación para pacientes quienes no han recibido tratamiento quimioterapéutico. Adicionalmente, la terapia con anticuerpo puede hacer posible el uso de dosis reducidas de quimioterapia concomitante, particularmente para pacientes quienes no toleran la toxicidad del agente quimioterapéutico muy bien. Fan et al. (Cáncer Res. 53: 4637-4642, 1993), Prewett et al. (International J. of Onco. 9: 217-224, 1996), y Hancock et al. (Cáncer Res. 51: 4575-4580, 1991) describen el uso de diversos anticuerpos junto con los agentes quimioterapéuticos . Aunque la terapia con el anticuerpo STEAP-l para todas las etapas del cáncer, la terapia con anticuerpo puede ser particularmente apropiada en cánceres avanzados o metastáticos. El tratamiento con la terapia de anticuerpo de la invención es indicado para pacientes quienes han recibido una o más rondas de quimioterapia. Alternativamente, la terapia con anticuerpo de la invención es combinada con un régimen quimioterapéutico o de radiación, para pacientes quienes no han recibido tratamiento quimioterapéutico. Además, la terapia con anticuerpo puede hacer posible el uso de dosis reducidas de la quimioterapia concomitante, particularmente para pacientes quienes no toleran la toxicidad del agente quimioterapéutico muy bien. Los pacientes con cáncer pueden ser evaluados para la presencia y el nivel de la expresión de STEAP-l, preferentemente utilizando evaluaciones inmunohistoquímicas del tejido tumoral, formación de imagen cuantitativa de STEAP-l, u otras técnicas que indican confiablemente la presencia y el grado de expresión de STEAP-l. El análisis inmunohistoquímico de las biopsias tumorales o los especímenes quirúrgicos es preferido para este propósito. Los métodos para el análisis inmunohistoquímico de los tejidos tumorales, son bien conocidos en la técnica. Los anticuerpos monoclonales anti-STEAP-1 que tratan los cánceres de próstata y otros cánceres, incluyen aquellos que inician una potente respuesta inmune contra el tumor, o aquellos que son directamente citotóxicos. A este respecto, los anticuerpos monoclonales (MAbs) anti-STEAP-1 pueden promover la lisis de las células tumorales ya sea por la toxicidad celular mediada por el complemento o dependiente del anticuerpo (ADCC) , cuyos mecanismos requieren una porción Fc intacta de la molécula de inmunoglobulina para la interacción con los sitios receptores Fc de células efectoras, sobre proteínas del complemento. Además, los MAbs anti-STEAP-1 que ejercen un efecto biológico directo sobre el crecimiento tumoral son útiles para tratar cánceres que expresan STEAP-l. Los mecanismos mediante los cuales actúan directamente los MAbs citotóxicos, incluyen: la inhibición del crecimiento celular, la modulación de la diferenciación celular, la modulación de los perfiles del factor de angiogénesis tumoral, y la inducción de la apoptosis. El o los mecanismos mediante los cuales un MAb anti-STEAP-1 particular ejerce un efecto anti-tumoral, es evaluado utilizando cualquier número de ensayos in vi tro que evalúan la muerte celular tales como ADCC, ADMMC, lisis celular mediada por el complemento y así sucesivamente, como es en general conocido en la técnica. En algunos pacientes, el uso de anticuerpos monoclonales murinos u otros no humanos, o los MAbs quiméricos humano/ratón pueden inducir respuestas inmunes moderadas a fuertes contra el anticuerpo no humano. Esto puede dar como resultado el despejo del anticuerpo de la circulación y eficacia reducida. En los casos más severos, tal respuesta inmune puede conducir a la formación extensa de complejos inmunes los cuales, potencialmente, pueden provocar insuficiencia renal. En consecuencia, los anticuerpos monoclonales preferidos utilizados en los métodos terapéuticos de la invención, son aquellos que son ya sea humanos o humanizados, y que se enlazan específicamente al antígeno STEAP-l objetivo, con alta afinidad pero que muestran baja o ninguna antigenicidad en el paciente. Los métodos terapéuticos de la invención contemplan la administración de MAbs anti-STEAP-1 simples, así como combinaciones, o cócteles de diferentes MAbs. Tales cócteles de MAbs pueden tener ciertas ventajas en cuanto que éstos contienen MAbs que se dirigen a diferentes epitopos, explotan diferentes mecanismos efectores o combinan los MAbs directamente citotóxicos con los MAbs que confían en la funcionalidad del efector inmune. Tales MAbs en combinación pueden mostrar efectos terapéuticos sinérgicos. Además, los MAbs anti-STEAP-1 pueden ser administrados concomitantemente con otras modalidades terapéuticas, incluyendo pero no limitadas a diversos agentes quimioterapéuticos, bloqueadores de andrógeno, inmunomoduladores (por ejemplo, IIL-2, GM-CSF), cirugía o radiación. Los MAbs anti-STEAP-1 son administrados en su forma "desnuda" o no conjugada, o pueden tener uno o varios agentes terapéuticos conjugados a ellos. Las formulaciones de anticuerpo anti-STEAP-1 son administradas vía cualquier ruta capaz de distribuir los anticuerpos a una célula tumoral. Las rutas de administración incluyen, pero no están limitadas a, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intratumoral, intradérmica y similares. El tratamiento involucra en general la administración repetida de la preparación del anticuerpo anti-STEAP-1, vía una ruta de administración aceptable tal como la inyección intravenosa (IV) , típicamente a una dosis en el intervalo de aproximadamente 0.1, .2, .3, .4, .5, .6, .7, .8, .9., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, o 25 mg/kg de peso corporal. En general, las dosis en el intervalo de 10-100 mg de MAb por semana, son efectivas y bien toleradas.
Con base en la experiencia clínica con MAb HerceptinMR en el tratamiento del cáncer de mama metastático, una dosis de carga inicial de aproximadamente 4 mg/kg de peso corporal del paciente IV, seguido por dosis semanales de aproximadamente 2 mg/kg IV de la preparación del MAb anti-STEAP-1, representa un régimen de dosificación aceptable. Preferentemente, la dosis de carga inicial es administrada como una infusión de 90 minutos o más prolongada. La dosis de mantenimiento periódica es administrada como una infusión dé 30 minutos o más tiempo, con la condición de que la dosis inicial sea bien tolerada. Como es apreciado por aquellos expertos en la técnica, diversos factores pueden influenciar el régimen de dosis ideal en un caso particular. Tales factores incluyen, por ejemplo, la actividad de enlace y la vida media del anticuerpo o los MAbs utilizados, el grado de expresión de STEAP-l en el paciente, el grado de antígeno STEAP-l difundido en la circulación, el nivel de concentración del anticuerpo deseado en estado de reposo, la frecuencia de tratamiento, y la influencia de los agentes quimioterapéuticos u otros, utilizados en combinación con el método de tratamiento de la invención, así como el estado de salud de un paciente particular. Opcionalmente, los pacientes deben ser evaluados para los niveles de STEAP-l en una muestra dada (por ejemplo, los niveles del antígeno STEAP-l en circulación y/o las células que expresan STEAP-l) con el fin de ayudar en la determinación del régimen de dosis más efectivo, etc. Tales evaluaciones son también utilizadas para fines de monitoreo a todo lo largo de la terapia, y son útiles para medir el éxito terapéutico en combinación con la evaluación de otros parámetros (por ejemplo, la citología urinaria y/o los niveles de ImmunoCyt en la terapia del cáncer de vejiga, o por analogía, los niveles de PSA en suero en la terapia del cáncer de próstata) . Los anticuerpos anti-STEAP-1 anti-idiotípicos pueden ser también utilizados en terapia anti-cáncer como una vacuna para la inducción de una respuesta inmune a las células que expresan una proteína relacionada a STEAP-l. En particular, la generación de los anticuerpos anti-idiotípicos es bien conocida en la técnica; esta metodología puede ser fácilmente adaptada para generar anticuerpos anti-STEAP-1 anti-idiotípicos que imitan un epitopo sobre una proteína relacionada a STEAP-l (ver, por ejemplo, Wagner et al.., 1997, Hybridoma 16: 33-40; Foon et al., 1995, J. Clin. Invest. 96: 334-342; Herlyn et al., 1996, Cáncer Immunol. Immunother. 43: 65-76). Tal anticuerpo anti-idiotípico puede ser utilizado en estrategias de vacuna para el cáncer.
X.C.) STEAP-l como un Objetivo para las Respuestas Inmunes Celulares Las vacunas y los métodos de preparación de vacunas que contienen una cantidad inmunogénicamente efectiva de uno o más • péptidos de enlace a HLA, como se describen en la presente, son modalidades adicionales de la invención. Además, las vacunas de acuerdo con la invención abarcan las composiciones de uno o más de los péptidos reclamados. Un péptido puede estar presente en una vacuna individualmente. Alternativamente, el péptido puede existir como un homopolímero que comprende copias múltiples del mismo péptido, o como un heteropolímero de diversos péptidos. Los polímeros que tienen la ventaja de reacción inmunológica incrementada y, donde son utilizados diferentes epitopos peptídicos para constituir el polímero, la habilidad adicional para inducir los anticuerpos y/o CTLs que reaccionan con diferentes determinantes antigénicos del organismo patogénico o el péptido relacionado al tumor, dirigido para una respuesta inmune. La composición puede ser una región de origen natural de un antígeno, o puede ser preparado, por ejemplo, recombinantemente o por síntesis química. Los portadores que pueden ser utilizados con las vacunas de la invención son bien conocidos en la técnica, e incluyen, por ejemplo, tiroglobulina, albúminas tales como albúmina sérica humana, toxoide tetánico, poliaminoácidos tales como poli-L-lisina, ácido poli-L-glutámico, proteína de núcleo del virus de la influenza, de la hepatitis B, y similares. Las vacunas pueden contener un diluyente fisiológicamente tolerable (por ejemplo, aceptable) tal como agua o solución salina, preferentemente solución salina amortiguada con fosfato. Las vacunas también incluyen típicamente un adyuvante. Los adyuvantes tales como el adyuvante incompleto de Freund, fosfato de aluminio, hidróxido- de aluminio o alumbre son ejemplos de materiales bien conocidos en la técnica. Adicionalmente, como se describe en la presente, las respuestas de CTL pueden ser cebadas por conjugación de los péptidos de la invención a lípidos, tales como tripalmitoil-S-glícerilcisteiniliseril-serina (P3CSS) . Además, un adyuvante tal como los nucleótidos que contienen citosina-guanina fosforotiolada (CpG) se ha encontrado que incrementan las respuestas de CTL 10 a 100 veces (ver, por ejemplo, Davíla and Celis, J. Immunol. 165:539-547 (2000)). Después de la inmunización con una composición peptídica de acuerdo con la invención, vía la inyección, aerosol, las rutas oral, transdérmica, transmucosal, intrapleural, intratecal u otras rutas adecuadas, el sistema inmune del hospedero responde a la vacuna al producir grandes cantidades de CTLs y/o HTLs específicos para el antígeno deseado. En consecuencia, el hospedero se vuelve al menos parcialmente inmune al desarrollo posterior de las células que expresan o que sobreexpresan el antígeno STEAP-l, o se deriva al menos un beneficio terapéutico cuando el antígeno fue asociado al tumor. En algunas modalidades, puede ser deseable combinar los componentes del polipéptido de la clase I con los componentes que inducen o que facilitan el anticuerpo neutralizador o las respuestas de células T cooperadoras, dirigidas al antígeno objetivo. Una modalidad preferida de tal composición comprende los epitopos de la clase I y clase II de acuerdo con la invención. Una modalidad alternativa de tal composición comprende un epitopo de la clase I y/o de la clase II de acuerdo con la invención, junto con un epitopo HTL de reactividad cruzada tal como la molécula PADRE101 (Epimmune, San Diego, CA) (descrita por ejemplo en la Patente de los Estados Unidos No. 5,736,142). Una vacuna de la invención puede también incluir células presentadoras de antígeno (APC) , tales como las células dendríticas (DC) , como un vehículo para presentar los polipéptidos de la invención. Las composiciones de vacuna pueden ser creadas in vitro, después de la movilización y la cosecha de células dendríticas, con lo cual la carga de la célula dendrítica ocurre in vi tro . Por ejemplo, las células dendríticas son transfectadas, por ejemplo, con un minigen de acuerdo con la invención, o son pulsadas con los péptidos. La célula dendrítica puede entonces ser administrada a un paciente para promover respuestas inmunes in vivo. Las composiciones de vacuna, ya sea basadas en DNA o en péptido, pueden también ser administradas in vivo en combinación con la movilización de células dendríticas, con lo cual ocurre la carga de las células dendríticas in vivo . Preferentemente, son utilizados los siguientes principios cuando se selecciona un arreglo de epitopos para la inclusión en una composición poliepitópica para el uso en una vacuna, o para seleccionar epitopos discretos para ser incluidos en una vacuna, y/o para ser purificados por los ácidos nucleicos tales como un minigen. Se prefiere que cada uno de los siguientes principios sea balanceado con el fin de realizar la selección. Los múltiples epitopos que van a ser incorporados en una composición de vacuna dada, pueden ser, pero no necesitan ser, contiguos en secuencia en el antígeno nativo del cual son derivados los epitopos. 1) Son seleccionados los epitopos, los cuales, después de la administración, imitan las respuestas inmunes que han sido observadas como correlacionadas con el despejo tumoral. Para HLA de la clase I este incluye 3 a 4 epitopos que vienen de al menos de un antígeno asociado al tumor (TAA) . Para HLA de la clase II es empleado un razonamiento similar; nuevamente son seleccionados 3 a 4 epitopos de al menos un TAA (ver por ejemplo, Rosenberg et al., Science 278:1447-1450). Los epitopos provenientes de un TAA pueden ser utilizados en combinación con los epitopos provenientes de uno o más TAAs adicionales, para producir una vacuna que se dirija a los tumores con patrones de expresión variantes de TAAs frecuentemente expresados. 2) Son seleccionados los epitopos que tienen la afinidad de enlace requerida, establecida para ser correlacionados con la inmunogenicidad. Para HLA de la clase I una IC50 de 500 nm o menos, frecuentemente 200 nmM o menor; y para la clase II una IC50 de 1000 nM o menor. 3) Son seleccionados suficientes péptidos que llevan superporciones, o un arreglo suficiente de péptidos que llevan porciones, específicas de alelo, para dar una amplia cobertura de población. Por ejemplo, es preferible tener al menos una cobertura de población del 80%. Un análisis Monte Cario, una evaluación estadística conocida en la técnica, puede ser empleado para evaluar la amplitud, o la redundancia de la cobertura de población. 4) Cuando se seleccionan epitopos provenientes de antígenos relacionados al cáncer, es frecuentemente útil seleccionar los análogos debido a que el paciente pueda haber desarrollado tolerancia al epitopo o nativo. 5) De relevancia particular son los epitopos denominados, como "epitopos anidados". Los epitopos anidados aparecen donde al menos dos epitopos se traslapan en una secuencia peptídica dada. Una secuencia peptídica anidada puede comprender epitopos de células B, de HLA de la clase I y/o HLA de la clase II. Cuando se proporcionan epitopos anidados un objetivo general es proporcionar el mayor número de epitopos por secuencia. De este modo, un aspecto es evitar la provisión de un epitopo que ya no es más que el extremo amino del epitopo amino-terminal y el extremo carboxilo del epitopo carboxilo-terminal en el péptido. Cuando se proporciona una secuencia multiepitópica, tal como una secuencia que comprende epitopos anidados, es importante en general seleccionar la secuencia con el fin de asegurar que ésta no tenga propiedades biológicas patológicas o dañinas . 6) Si es creada una proteína poliepitópica, o cuando se crea un minigen, un objetivo es generar el péptido más pequeño que abarque los epitopos de interés. Este principio es similar, sino es que igual a aquel empleado cuando se selecciona un epitopo que comprende epitopos anidados. No obstante, con un péptido poliepitópico artificial, el objetivo de minimización del tamaño es balanceado contra la necesidad de integrar a algunas secuencias espaciadoras entre los epitopos en la proteína poliepitópica. Los residuos de aminoácidos espaciadores pueden, por ejemplo, ser introducidos para evitar epitopos de unión (un epitopo reconocido por el sistema inmune, no presente en el antígeno objetivo, y únicamente creado por la yuxtaposición de epitopos hecha por el hombre) o para facilitar la escisión entre los epitopos y con esto aumentar la presentación del epitopo. Los epitopos de unión tienen que ser en general evitados debido a que el recipiente puede generar una respuesta inmune a ese epitopo no nativo. De interés particular es un epitopo de unión que es un "epitopo dominante". Un epitopo dominante puede conducir a una respuesta tan celosa que las respuestas inmunes a otros epitopos son disminuidas o suprimidas. 7) Cuando las secuencias de variantes múltiples de la misma proteína objetivo están presentes, pueden ser también seleccionados epitopos peptídicos potenciales, con base en su conservación. Por ejemplo, un criterio para la conservación puede definir que la secuencia completa de un péptido de enlace HLA de la clase I o el núcleo 9-mer completo de un péptido de enlace de la clase II, sea conservado en un porcentaje designado de las secuencias evaluadas para un antígeno proteico específico.
X. C .1 Vacunas de minigen Están disponibles un número de - diferentes procedimientos que permite la distribución simultánea de múltiples epitopos. Los ácidos nucleicos que codifican para los péptidos de la invención son una modalidad particularmente útil de la invención. Los epitopos para la inclusión en un minigen son preferentemente seleccionados de acuerdo a los lineamientos descritos en la sección previa. Un medio preferido de administrar los ácidos nucleicos que codifican para los péptidos de la invención utiliza construcciones de minigenes que codifican para un péptido que comprende uno o múltiples epitopos de la invención. El uso de los minigenes de epitopos múltiples se describe más adelante y en Ishioka et al., J. Immunol . 162:3915-3925, 1999; An, L y Whitton, J. L., J. Virol. 71:2292, 1997; Thomson, S. A. et al., J. Immunol . 157:822, 1996; Whitton, J. L et al., J. Virol. 67:348, 1993; Hanke, R. et al., Vaccine 16:426, 1998. Por ejemplo, un plásmido de DNA multiepitópíco que codifica para epitopos de superporciones y/o que tienen porciones, derivados de STEAP-1, el epitopo de células T cooperadoras universal PADRE® o epitopos de HTL múltiples provenientes de STEAP-l (ver por ejemplo, tablas V-XVIII y XXII a Ll) , y una secuencia de señal de translocación en el retículo endoplásmico, puede ser manipulada por ingeniería genética. Una vacuna puede también comprender epitopos que son derivados de otros TAAs. La inmunogenicidad de un minigen ultiepitópico puede ser confirmada en ratones transgénicos para evaluar la magnitud de las respuestas de inducción de CTL, contra los epitopos probados. Además, la inmunogenicidad de los epitopos codificados por el DNA in vivo puede ser correlacionada con las respuestas in vitro de las líneas de CTL específicas contra las células objetivo o diana transfectadas con el plásmido de DNA. De este modo, estos experimentos pueden mostrar que el minigen sirve para: 1) generar una respuesta de CTL y 2) que los CTL inducidos reconocieron las células que expresan los epitopos codificados. Por ejemplo, para crear una secuencia de DNA que codifica para los epitopos seleccionados (minigen) para la expresión en células humanas, las secuencias de aminoácidos de los epitopos pueden ser traducidos de manera inversa. Una tabla de uso de codones humanos, puede ser utilizada para guiar la elección- del codón para cada aminoácido. Estas secuencias de DNA que codifican para el epitopo pueden ser directamente adjuntadas, de modo que cuando se traducen, es creada una secuencia polipeptídica continua. Para optimizar la expresión y/o la inmunogenicidad, pueden ser incorporados elementos adicionales dentro del diseño del minigen. Los ejemplos de secuencias de aminoácidos que pueden ser traducidas de manera inversa e incluidas en la secuencia del minigen, incluyen: epitopos HLA de la clase I, epitopos HLA de la clase II, epitopos de anticuerpo, una secuencia de señal de ubiquitinación, y/o una secuencia de dirección al objetivo del retículo endoplásmico. Además, la presentación de HLA de los epitopos CTL o HTL, puede ser mejorado por la inclusión de secuencias flanqueantes sintéticas (por ejemplo, poli-alanina) o de origen natural adyacentes a los epitopos de CTL o HTL; estos péptidos más grandes que comprenden el o los epitopos están dentro del alcance de la invención. La secuencia del minigen puede ser convertida a DNA mediante el ensamblaje de los oligonucleótidos que codifican para las hebras más y menos del minigen. Los oligonucleótidos de traslape (de 30 a 100 bases de longitud) pueden ser sintetizados, fosforilados, purificados y recocidos bajo condiciones apropiadas utilizando técnicas bien conocidas. Los extremos de los oligonucleótidos pueden ser unidos, por ejemplo utilizando la DNA-ligasa T4. Este minigen sintético, que codifica para el polipéptido epitópico, puede ser luego clonado en un vector de expresión deseado. Las secuencias reguladoras estándares bien conocidas por aquellos expertos en la materia son preferentemente incluidas en el vector para asegurar la expresión en las células objetivo. Varios elementos vectores son deseables: un promotor con un sitio de clonación en dirección 3' para la inserción del minigen, una señal de poliadenilación para la terminación eficiente de la transcripción, un origen de replicación de E. coli; y un marcador seleccionable de E. coli (por ejemplo, resistencia a la ampicilina o a la kanamicina) . Pueden ser utilizados numerosos promotores para este propósito, por ejemplo, el promotor del citomegalovirus humanos (hCMV) . Ver por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos Nos. 5,580,859 y 5,589,466 para otras secuencias promotoras adecuadas. Pueden ser deseadas modificaciones de vectores, adicionales, para optimizar la expresión y la inmunogenicidad del minigen., En algunos casos, son requeridos intrones para la expresión eficiente del gen, y uno o más intrones sintéticos o de origen natural podrían ser incorporados dentro de la región transcrita del minigen. La inclusión de las secuencias de estabilización del mRNA y las secuencias para la replicación en células de mamífero, pueden ser también consideradas para incrementar la expresión del minigen. Una vez que se selecciona un vector de expresión, el minigen es clonado dentro de la región poliligadora en la dirección 3' del promotor. Este plásmido es transformado dentro de una cepa de E. coli apropiada, y el DNA es preparado utilizando técnicas estándares. La orientación y la secuencia del DNA del minigen, así como todos los otros elementos incluidos en el vector, son confirmados utilizando el mapeo de restricción y el análisis de la secuencia de DNA.
Las células bacterianas que albergan el plásmido correcto pueden ser almacenadas como un banco maestro de células y un banco de células de trabajo. Además, la secuencia inmunoestimuladora (ISSs o CpGs) parecen jugar un papel en la inmunogenicidad de las vacunas de DNA. Estas secuencias pueden ser incluidas en el vector, fuera de la secuencia de codificación del minigen, si se desea para aumentar la inmunogenicidad. En algunas modalidades, un vector de expresión bi-cistrónico, que permite la producción de los epitopos codificados por el mínigen, y una segunda proteína (incluida para aumentar o disminuir la inmunogenicidad) pueden ser utilizados. Los ejemplos de proteínas o polipéptidos que podrían aumentar benéficamente la respuesta inmune si son co-expresados, incluyen la citocinas (por ejemplo, IL-2, IL-12, GM- CSF) , moléculas inductoras de citosina (por ejemplo, LelF) , moléculas coestimuladoras, o para las respuestas de HTL, proteínas de enlace pan-DR (PADREMR, Epimmune, San Diego, CA) . Los epitopos cooperadores (HLT) pueden ser unidos en las señales de dirección al objetivo, intracelulares y expresados separadamente de los epitopos de células CTL expresados; esto permite la dirección de los epitopos de HTL a un compartimiento celular diferente de aquel de los epitopos de CTL. Si se requiere, esto podría facilitar la entrada más eficiente de los epitopos de CTL dentro de la vía de HLA de la clase II, con lo cual se mejora la inducción de HLT. En contraste a la inducción de HTL o CTL, disminuyendo específicamente la respuesta inmune mediante la co-expresión de las moléculas inmunosupresoras (por ejemplo, TGF-ß) puede ser benéfico en ciertas enfermedades. Las cantidades terapéuticas del DNA del plásmido pueden ser producidas por ejemplo, mediante fermentación en E. coli, seguido por la purificación. Las alícuotas proveniente del banco de células de trabajo son utilizadas para inocular el medio de crecimiento, y desarrolladas hasta la saturación en matraces o en un biorreactor de acuerdo a las técnicas bien conocidas. El DNA plásmido pueden ser purificado utilizando tecnologías estándares de bio-separación, tales como las resinas de intercambio aniónico en fase sólida, suministradas por QIAGEN, Inc. (Valencia, California) . Si se requiere, el DNA superenrollado puede ser aislado de las formas circulares y lineales abiertas utilizando electroforesis en gel u otros métodos. El DNA de plásmido purificado puede ser preparado para la inyección utilizando una variedad de formulaciones. La más simple de éstas, es la reconstitución del DNA lineal y liofilizado, en solución salina amortiguada con fosfato, estéril (PBS, por sus siglas en inglés) . Este procedimiento, conocido como "DNA desnudo" está siendo actualmente utilizado para la administración intramuscular (IM) en pruebas clínicas. Para elevar al máximo los efectos inmunoterapéuticos de las vacunas del DNA del minigen, puede ser deseable un método alternativo para formular el DNA plasmídico purificado. Han sido descritos una variedad de métodos, y pueden volverse disponibles nuevas técnicas. Los lípidos catiónicos, glucolípidos y liposomas fusogénicos, pueden ser también utilizados en la formulación (ver por ejemplo, como se describe por WO 93/24640; Mannino y Gould- Fogerite, BioTechniques 6(7): 682 (1988); patente de los Estados Unidos No. 5,279,833; WO 91/06309; y Feigner, et al., Proc. Nati Acad. Sci. EUA 84:7413 (1987). Además, los péptidos y compuestos referidos colectivamente como compuestos protectores, interactivos, de no condensación (PINC, por sus siglas en inglés) podrían ser también formados en complejo al DNA plasmídico purificado para influenciar las variables tales como la estabilidad, la dispersión intramuscular, o el tráfico a órganos a tipos celulares específicos . La sensibilización de las células diana u objetivo puede ser utilizada como un ensayo funcional para la expresión y la presentación de HLA de la clase I de los epitopos de CTL codificados por el minigen. Por ejemplo, el DNA plásmido es introducido dentro de una línea celular de mamífero que es adecuada como un objetivo para los ensayos estándares de liberación de cromo de CTL. El método de transfección utilizado será dependiente de la formulación final. La electroforación puede ser utilizada para el DNA "desnudo", mientras que los lípidos catiónicos permiten la transfección directa in vitro. Un plásmido que expresa la proteína fluorescente verde (GFP, por sus siglas en inglés) puede ser co-transfectado para permitir el enriquecimiento de las células transfectadas utilizando clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) . Estas células son luego marcadas con cromo 51 (51Cr) y utilizadas como células diana para las líneas CTL específicas del epitopo; la citólisis, detectada por la liberación 51CR, indica la producción de, y la presentación de HLA de los epitopos de CTL codificados por el minigen. La expresión de los epitopos de HTL puede ser evaluada de una manera análoga utilizando los ensayos para evaluar la actividad de HTL. La inmunogenicidad in vivo es un segundo procedimiento para la prueba funcional de las formulaciones de DNA del minigen. Ratones transgénicos que expresan las proteínas HLA humanas apropiadas, son inmunizados con el producto de DNA. La dosis y la ruta de administración son dependientes de las formulaciones (por ejemplo, IM para DNA en PBS, intraperítoneal (i.p.) para el DNA complejado con lípido) . Veintiún días después de la inmunización, los esplenocitos son cosechados y reestimulados por una semana en presencia de los péptidos que codifican para cada epitopo que se prueba. Después de esto, para las células efectoras de CTL, son conducidos ensayos para la citólisis de las células diana marcadas con 51CR, cargadas con el péptido utilizando técnicas estándares. La lisis de las células diana que fueron sensibilizadas por HLA cargado con epitopos peptídicos, correspondientes a los epitopos codificados por el minigen, demuestra que la vacuna de DNA funciona para la inducción in vivo de CTLs. La inmunogenicidad de los epitopos de HTL es confirmada en ratones transgénicos de una manera análoga. Alternativamente, Los ácidos nucleicos pueden ser administrados utilizando la distribución balística como se describe, por ejemplo, en la patente de los Estados Unidos No. 5,204,253. Utilizando esa técnica, son administradas las partículas comprendidas únicamente de DNA. En una modalidad alternativa adicional, el DNA puede ser adherido a las partículas, tales como partículas de oro. Los minigenes pueden ser también distribuidos utilizando otros sistemas de distribución bacterianos o virales bien conocidos en la técnica, por ejemplo, una construcción de expresión que codifica para los epitopos de la invención, puede ser incorporada dentro de un vector viral tal como la vaccinia.
X.C.2 Combinaciones de péptidos de CTL con péptidos cooperadores Las composiciones de vacuna que comprenden los péptidos CTL de la invención pueden ser modificadas, por ejemplo, analogadas, para proporcionar atributos deseados, tales como vida media en suero mejorada, cobertura de población ampliada, o inmunogenicidad mejorada. Por ejemplo, la habilidad de un péptido para inducir actividad CTL puede ser aumentada por el enlace del péptido a una secuencia que contiene al menos un epitopo que es capaz de inducir una respuesta de células T cooperadoras. Aunque un péptido CTL puede ser directamente enlazado a un péptido de células T cooperadoras, frecuentemente los conjugados de epitopo de CTL/epitopo de HTL son ligados por una molécula espaciadora. El espaciador está típicamente comprendido de moléculas neutras, relativamente pequeñas, tales como aminoácidos o miméticos de aminoácidos, que están sustancialmente descargados bajo condiciones fisiológicas. Los espaciadores son típicamente seleccionados de, por ejemplo, Ala, Gly u otros espaciadores neutros de aminoácidos no polares o aminoácidos polares neutros. Se entenderá que el espaciador opcionalmente presente no necesita estar comprendido de los mismos residuos y de este modo puede ser un hetero- u homo-oligómero. Cuando está presente, el espaciador será al menos de uno o dos residuos, más usualmente de tres a seis residuos y algunas veces de 10 ó más residuos. El epitopo del péptido CTL puede ser enlazado al epitopo del péptido de las células T cooperadoras, ya sea directamente por medio de un espaciador en el extremo amino o carboxilo del péptido CTL. El extremo amino ya sea del péptido inmunogénico o bien del péptido cooperador T, puede ser acilado. En ciertas modalidades, el péptido cooperador T es uno que es reconocido por las células T cooperadoras presentes en una mayor parte de una población genéticamente diversa. Esto puede ser logrado mediante la selección de los péptidos que se enlazan a muchas, a la mayoría o todas las moléculas HLA de la clase II. Los ejemplos de tales aminoácidos que se enlazan a muchas moléculas HLA de la clase II, incluyen secuencias provenientes de antígenos tales como el toxoide tetánico en las posiciones 830-843 QYIKANSKFIGITE; (SEQ ID No: 64), la proteína del circunsporozoito de Plasmodium falciparum (CS) en las posiciones 378-398 DIEKKIAKMEKASSVFNVVNS; (SEQ ID No: 65), y la proteína de 18kD de Streptococcus en las posiciones 116-131 GAVDSILGGVATYGAA; (SEQ ID No: 66). Otros ejemplos incluyen los péptidos que poseen una superporción de DR-1-4-7 o cualquiera de las porciones de DR3. Alternativamente, es posible preparar los péptidos sintéticos capaces de estimular los linfocitos cooperadores T, de una manera restringida a HLA, de manera suelta, utilizando secuencias de aminoácidos no encontradas en la naturaleza (ver por ejemplo, publicación del PCT WO 95/07707). Estos compuestos sintéticos llamados epitopos de enlace a Pan-DR (por ejemplo, PADREMR, Epimmune, Inc., San Diego, CA) son diseñados, lo más preferentemente para enlazarse a la mayoría de las moléculas de HLA-DR (HLA humana de la clase II). Por ejemplo, un péptido epitópico que se enlaza a Pan-DR que tiene la fórmula XKXVAAWTLKAAX (SEQ ID No: 67), donde "X" es ciclohexilalanina, fenilalanina, o tirosina, y una es D-alanina o L-alanina, se ha encontrado que se enlaza a la mayoría de los alelos de HLA-DR, y estimula la respuesta de los linfocitos T cooperadores provenientes de la mayoría de los individuos, no obstante de su tipo de HLA. Una alternativa de un epitopo de enlace a Pan-DR, comprende todos los aminoácidos naturales "L" y puede ser proporcionado en la forma de ácidos nucleicos que codifican para el epitopo. Los epitopos peptídicos de HLT pueden ser también modificados para alterar sus propiedades biológicas. Por ejemplo, éstos pueden ser modificados para incluir la D-aminoácidos, para incrementar su resistencia a las proteasas y de este modo para prolongar su vida media en suero, o éstos pueden ser conjugados a otras moléculas tales como lípidos, proteínas, carbohidratos, y similares para incrementar su actividad biológica. Por ejemplo, el péptido T cooperador puede ser conj ugado a una o más cadenas de ácido palmítico en cualquiera de los extremos amino o carboxilo .
X . C .3 Combinaciones de Péptido CTL con los Agentes de Aprestamiento de Células T En algunas modalidades , puede ser deseable incluir en las composiciones farmacéuticas de la invención al menos un componente que cede o apreste los linfocitos B o los linfocitos T . Los lípidos han sido identificados como agentes capaces de cebar CTL in vivo . Por ej emplo, los residuos de ácido palmítico pueden ser enlazados a los grupos e- y a-amino de un residuo de lisina, y luego enlazados , por ej emplo, vía uno o más residuos de ligadura tales como Gly, Gly-Gly- , Ser, Ser-Ser, o similares , a un péptido inmunogénico . El péptido lipidado puede ser luego administrado ya sea directamente en una micela o partícula incorporado dentro de un liposoma, o emulsificado en un adyuvante, por ejemplo, adyuvante incompleto de Freund. En una modalidad preferida, una composición inmunogénica, particularmente efectiva comprende ácido palmítico enlazado a los grupos e- y a-amino de Lys, que es enlazado vía el enlace, por ejemplo, Ser-Ser al extremo amino del péptido inmunogénico. Como otro ejemplo más de la cebadura o aprestamiento de lípidos de las respuestas de CTL, las lipoproteínas de E. coli, tales como la tripalmitoil-S-glicerilcisteinliseril-serina (P3CSS) puede ser utilizada para cebar el CTL específico del virus, cuando se enlaza covalentemente a un péptido apropiado (ver por ejemplo, Deres, et al, Nature 342:561, 1989). Los péptidos de la invención pueden ser acoplados a P3CSS por ejemplo, y el lipopéptido administrado a un individuo para cebar específicamente una respuesta inmune al antígeno diana u objetivo. Además, debido a que la inducción de anticuerpos neutralizadores puede ser también cebada o aprestada con epitopos conjugados a P3CSS, dos de tales composiciones pueden ser combinadas para promover de manera más efectiva las respuestas humorales y mediadas por las células.
X.C.4 Composiciones de Vacuna que Comprenden DC Pulsada con los Péptidos CTL y/o HTL Una modalidad de una composición de vacuna de acuerdo con la invención comprende la administración ex vivo de un cóctel de péptidos que poseen epitopo a PBMC, o el DC aislado de éstos, proveniente de la sangre del paciente. Un producto farmacéutico para facilitar la cosecha de DC puede ser utilizado, tal como Progenipoietin™ (Pharmacia-Monsanto, St. Louis, MO) o GM-CSF/IL-4. Después de pulsar la DC con los péptidos y antes de la re-infusión dentro de los pacientes, las DCs son lavadas para eliminar los péptidos no enlazados. En esta modalidad, una vacuna comprende los DCs pulsados con péptidos que presentan los epitopos peptídicos pulsados, formados en complejos con las moléculas de HLA sobre sus superficies. Las DC pueden ser pulsadas ex vivo con un cóctel de péptidos, algunos de los cuales estimulan las respuestas de CTL para STEAP-l. Opcionalmente, el péptido de células T cooperadoras (HTL) tal como un péptido de HLA de la clase II natural o artificial restringido de manera suelta, puede ser incluido para facilitar la respuesta de CTL. De este modo, una vacuna de acuerdo a la invención se utiliza para tratar un cáncer que expresa o que sobreexpresa STEAP-l.
X.D. Inmunoterapia Adoptiva Los péptidos relacionados a STEAP-l, antigénicos son utilizados para promover una respuesta de CTL y/o de HTL ex vivo, también. Las células HTL o CTL resultantes, pueden ser utilizadas para tratar tumores en pacientes que no responden a otras formas convencionales de terapia o no responderán a un péptido de vacuna terapéutica o un ácido nucleico de acuerdo con la invención. La respuesta de CTL o HTL ex vivo para un antígeno particular, son inducidas mediante la incubación en cultivo de tejidos de las células precursoras de CTL o de HTL, del paciente, o genéticamente compatibles, junto con una fuente de células presentadoras de antígeno (APC) , tales como las células dendríticas, y el péptido inmunogénico apropiado. Después de un tiempo de incubación apropiado (es típicamente de aproximadamente 7-28 días), en el cual las células precursoras son activadas y expandidas en células efectoras, las células son infundidas nuevamente al paciente, donde éstas destruirán (CTL) o facilitarán la destrucción (HTL) de su célula diana específica (por ejemplo, una célula tumoral) . Las células dendríticas transfectadas pueden ser también utilizadas como células presentadoras de antígeno.
X.E. Administración de Vacunas para Fines Terapéuticos o Profilácticos Las composiciones farmacéuticas y de vacuna de la invención son típicamente utilizadas para tratar y/o prevenir un cáncer que expresa o que sobreexpresa STEAP-l. En aplicaciones terapéuticas, las composiciones de péptidos y/o de ácidos nucleicos son administradas en un paciente en una cantidad suficiente para promover una respuesta efectiva de células B, CTL y/o HTL hacia el antígeno, y para curar o al menos detener parcialmente o retardar los síntomas y/o las complicaciones. Una cantidad adecuada para lograr esto, es definida como una "dosis terapéuticamente efectiva". Las cantidades efectivas para este uso, dependerán por ejemplo, de la composición particular administrada, de la manera de administración, de la etapa y severidad de la enfermedad que se trata, del peso y del estado general de salud del paciente, y el juicio del médico que prescribe. Para las composiciones farmacéuticas, los péptidos inmunogénicos de la invención, o el DNA que los codifica, son en general administrados a un individuo que ya posee un tumor que expresa STEAP-l. Los péptidos o el DNA que los codifica pueden ser administrados individualmente o como fusiones de una o más secuencias peptídicas. Los pacientes pueden ser tratados con los péptidos inmunogénicos separadamente, o en conjunto con otros tratamientos, tales como cirugía, como sea apropiado. Para el uso terapéutico, la administración debe comenzar en general, en el primer diagnóstico del cáncer asociado a STEAP-l. Esto es seguido por dosis de refuerzo hasta que al menos los síntomas son sustancialmente abatidos y por un periodo después de esto. La modalidad de la composición de vacuna (por ejemplo, incluyendo pero no limitada a las modalidades tales como los cócteles peptídicos, polipéptidos, poliepitopos, minigenes, o CTLs específicos de TAA, o células dendríticas pulsadas) , distribuidas al paciente, pueden variar de acuerdo a la etapa de la enfermedad o al estado de salud del paciente. Por ejemplo, un paciente con un tumor que expresa STEAP-l, una vacuna que comprende un CTL específico de STEAP-l puede ser más eficaz para matar las células tumorales en pacientes con la enfermedad avanzada, que las modalidades alternativas. Es importante en general, proporcionar una cantidad del epitopo peptídico distribuido por un modo de administración suficiente para estimular efectivamente una respuesta de células T citotóxicas; las composiciones que estimulan las respuestas de células T cooperadoras pueden ser también dadas de acuerdo con esta modalidad de la invención. La dosis para una inmunización terapéutica inicial ocurre en general en un intervalo de dosis unitaria en donde el valor inferior es de aproximadamente 1, 5, 50, 500, ó 1000 µg y el valor superior es de aproximadamente 10,000; 20,000; 30,000; ó 50,000 µg. Los valores de dosis para un humano, típicamente están en el intervalo de aproximadamente 500 µg a aproximadamente 50,00 µg por paciente - de 70 kilogramos. La dosis de refuerzo de entre aproximadamente 1.0 µg a aproximadamente 50,000 µg del péptido de acuerdo a un régimen de refuerzo de semanas a meses, puede ser administrada dependiendo de la respuesta y la condición del paciente, como es determinado por la medición de la actividad específica de CTL y HTL obtenidas a partir de la sangre del paciente. La administración debe continuar hasta que al menos los síntomas clínicos o las pruebas de laboratorio indican que la neoplasia ha sido eliminada o reducida, y por un periodo después de esto. Las dosis, rutas de administración y esquemas de dosis son ajustados de acuerdo con las metodologías conocidas en la técnica. En ciertas modalidades, los péptidos y las composiciones de la presente invención son empleados en estados de enfermedad serios, es decir, situaciones que amenazan la vida o que potencialmente amenazan la vida. En tales casos, como resultado de las cantidades mínimas de las sustancias extrañas y la naturaleza no tóxica relativa de los péptidos en composiciones preferidas de la invención, es posible y puede ser sentido como deseable por el médico que atiende, administrar excesos sustanciales de estas composiciones peptídicas con relación a estas cantidades de dosis establecidas. Las composiciones de vacuna de la invención pueden ser utilizadas, puramente como agentes profilácticos. En general, la dosis para una inmunización profiláctica inicial ocurren en general en un intervalo de dosis unitaria donde el valor inferior es de 1, 5, 50, 500, ó 1000 µg y el valor superior es de aproximadamente 10,000; 20,000; 30,000; ó 50,000 µg. Los valores de dosis para un humano típicamente están en el intervalo de aproximadamente 500 µg hasta aproximadamente 50,000 µg por paciente de 70 kilogramos. Esto es seguido por dosis de refuerzo de entre aproximadamente 1.0 µg a aproximadamente 50,000 µg del péptido administrado a intervalos definidos de aproximadamente 4 semanas a aproximadamente 6 meses después de la administración inicial de la vacuna. La inmunogenicidad de la vacuna puede ser evaluada mediante la administración de la actividad específica de CTL, y HTL obtenida de una muestra de la sangre del paciente. Las composiciones farmacéuticas para el tratamiento terapéutico están destinadas para la administración parenteral, tópica, oral, nasal, intratecal o local (por ejemplo, como una crema o ungüento tópico) . Preferentemente, las composiciones farmacéuticas son administradas parenteralmente, por ejemplo, intravenosamente, subcutáneamente, intradérmicamente o intramuscularmente. De este modo, la invención proporciona las composiciones para la administración parenteral que comprenden una solución de los péptidos inmunogénicos disueltos o suspendidos en un portador aceptable, preferentemente un portador acuoso. Se pueden utilizar una variedad de portadores acuosos, por ejemplo, agua, agua amortiguada, solución salina al 0.8%, lisina al 0.3%, ácido hialurónico. Estas composiciones pueden ser esterilizadas mediante técnicas de esterilización convencionales, bien conocidas, o pueden ser esterilizadas mediante filtración. Las soluciones acuosas resultantes pueden ser envasadas por el uso tal cuales, o liofilizadas, siendo combinada la preparación liofilizada con una solución estéril antes de la administración. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables como es requerido para aproximarse a las condiciones fisiológicas, tales como el ajuste del pH y agentes amortiguadores, agentes ajustadores de la tonicidad, agentes humectantes, conservadores, y similares, por ejemplo, acetato de sodio, lactato de sodio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, -cloruro de calcio, monolaurato de sorbitan, oleato de trietanolamina, etc. La concentración de los péptidos de la invención en las formulaciones farmacéuticas puede variar ampliamente, por ejemplo, de menos de aproximadamente 0.1%, usualmente en o de al menos 2% hasta tanto como 20% a 50% o más en peso, y serán seleccionadas principalmente por los volúmenes de fluido, las viscosidades, etc., de acuerdo con el modo particular de administración seleccionada. Una forma de dosis unitaria para humanos de una composición, es típicamente incluida en una composición farmacéutica que comprende una dosis unitaria para humanos de un portador aceptable, en una modalidad, un portador acuoso, y es administrada en un volumen/cantidad que es conocido por aquellos expertos en la técnica, para ser utilizada para la administración de tales composiciones a humanos (ver por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 17a edición, A.
Gennaro, Editor, Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania, 1985) . Por ejemplo, una dosis peptídica para la inmunización inicial puede ser de aproximadamente 1 a aproximadamente 50,000 µg, en general 100 a 5,000 µg para un paciente de 70 kg. Por ejemplo, para los ácidos nucleicos puede ser realizada una inmunización inicial utilizando un vector de expresión en la forma de ácido nucleico desnudo administrado intravenosamente (o SC o ID) en las cantidades de 0.5-5 mg en múltiples sitios. El ácido nucleico (0.1 a 1000 µg) puede ser también administrado utilizando una pistola de genes. Después de un periodo de incubación de 3 a 4 semanas, es entonces administrada una dosis de refuerzo. El refuerzo puede ser virus de la viruela aviar recombinante, administrado a una dosis de 5-107 a 5 x 109 ufp. Para los anticuerpos, un tratamiento involucra en general la administración repetida de la preparación del anticuerpo anti-STEAP-1, por medio de una ruta de administración aceptable tal como la inyección intravenosa (IV) , típicamente a una dosis en el intervalo de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal. En general, dosis en el intervalo de 10-500 mg de MAb por semana son efectivas y bien toleradas. Además, una dosis de carga inicial de aproximadamente 4 mg/kg de peso corporal del paciente IV, seguida por dosis semanales de aproximadamente 2 mg/kg IV de la preparación del MAb anti- STEAP-1 representa un régimen de dosificación aceptable. Como es apreciado por aquellos de experiencia en la técnica, diversos factores pueden influenciar la dosis ideal en un caso particular. Tales factores incluyen, por ejemplo, la vida media de una composición, la afinidad de enlace de un Ab, la inmunogenicidad de una sustancia, el grado de expresión de STEAP-l en el paciente, el grado del antígeno STEAP-l difundido hacia la circulación, el nivel de concentración en estado de reposo deseado, la frecuencia del tratamiento y la influencia de agentes quimioterapéuticos u otros agentes utilizados en combinación con el método de tratamiento de la invención, así como el estado de salud de un paciente particular. Las dosis unitarias para humanos preferidas, no limitantes son, por ejemplo, 500 µg-1 mg, 1 mg-50 mg, 50 mg-100 mg, 100 mg-200 mg, 200 mg-300 mg, 400 mg-500 mg, 500 mg-600 mg, 600 mg-700 mg, 700 mg-800 mg, 800 g-900 mg, 900 mg-1 g, ó 1 mg-700 mg. En ciertas modalidades, la dosis está en un intervalo de 2-5 mg/kg de peso corporal, por ejemplo, con seguimientos de dosis semanales de 1-3 mg/kg; 0.5 mg, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 mg/kg de peso corporal seguido, por ejemplo, en dos, tres o cuatro semanas por dosis semanales; 0.5-10 mg/kg de peso corporal, por ejemplo, seguido en dos, tres o cuatro semanas por dosis semanales; 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400 mg por 2 de área corporal semanalmente; 1-600 mg por m2 de área corporal semanalmente; 225-400 mg por m2 de área corporal semanalmente; estas dosis pueden ser seguidas por dosis semanales .por 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12 ó más semanas. En una modalidad, la forma de dosis unitaria para humanos, de los polinucleótidos, comprenden un intervalo de dosis adecuado o una cantidad efectiva que proporciona algún efecto terapéutico. Como es apreciado por una persona de experiencia ordinaria en la técnica, un efecto terapéutico depende de un número de factores, incluyendo la secuencia del polinucleótido, el peso molecular del polinucleótido y la ruta de administración. Las dosis son en general seleccionadas por el médico u otro profesional del cuidado de la salud de acuerdo con una variedad de parámetros conocidos en la técnica, tales como severidad de los síntomas, la historia del paciente y similares. En general, para un polinucleótido de aproximadamente 20 bases, puede ser seleccionado un intervalo de dosis de, por ejemplo, un límite inferior independientemente seleccionado tal como de aproximadamente 0.1, 0.25, 0.5, 1, 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400 ó 500 mg/kg hasta un límite superior independientemente seleccionado mayor que el límite inferior, de aproximadamente 60, 80, 100, 200, 300, 400, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000 ó 10,000 mg/kg. Por ejemplo, una dosis puede ser aproximadamente cualquiera de las siguientes: 0.1 a 100 mg/kg, 0.1 a 50 mg/kg, 0.1 a 25 mg/kg, 0.1 a 10 mg/kg, 1 a 500 mg/kg, 100 a 400 mg/kg, 200 a 300 mg/kg, 1 a 100 mg/kg, 100 a 200 mg/kg, 300 a 400 mg/kg, 400 a 500 mg/kg, 500 a 1000 mg/kg, 500 a 5000 mg/kg, ó 500 a 10,000 mg/kg. En general, las rutas parenterales de administración pueden requerir dosis más altas del polinucleótido en comparación a la aplicación más directa del nucleótido al tejido enfermo, como lo hacen los polinucleótidos de longitud incrementada. En una modalidad, las formas de dosis unitarias para humanos de las células T comprenden un intervalo de dosis adecuado o una cantidad efectiva que proporciona algún efecto terapéutico. Como es apreciado por una persona de experiencia ordinaria en la técnica, un efecto terapéutico depende de un número de factores. Las dosis son en general seleccionadas por el médico u otro profesional del cuidado de la salud de acuerdo con una variedad de parámetros conocidos en la técnica, tales como la severidad de los síntomas, la historia del paciente, y similares. Una dosis puede ser de aproximadamente 104 células hasta aproximadamente 106 células, aproximadamente 106 células hasta aproximadamente 108 células, aproximadamente 108 hasta aproximadamente 1011 células, o aproximadamente 108 hasta aproximadamente 5 x 1010. Una dosis puede ser de aproximadamente 106 células/m2 hasta aproximadamente 1010 células/m2, o aproximadamente 10d células/m2 hasta aproximadamente 108 células/m2. La o las proteínas de la invención, y/o los ácidos nucleicos que codifican para las proteínas, pueden ser también administrados vía liposomas, que pueden servir también para: 1) dirigir la o las proteínas para un tejido particular, tal como el tejido linfoide; 2) elegir selectivamente a las células enfermas; o 3) incrementar la vida media de la composición peptídica. Los liposomas incluyen emulsiones, espumas, micelas, monocapas insolubles, cristales líquidos, dispersiones de fosfolípidos, capas laminares y similares. En esas preparaciones, el péptido que va a ser distribuido es incorporado como parte de un liposoma, solo o en conjunto con una molécula que se enlaza a un receptor prevalerte entre las células linfoides, tales como los anticuerpos monoclonales que se enlazan al antígeno CD45, o con otras composiciones terapéuticas o inmunogénicas. De este modo, los liposomas ya sea rellenos o decorados con un péptído deseado de la invención, pueden ser dirigidos al sitio de las células linfoides, donde los liposomas pueden distribuir las composiciones peptídicas. Los liposomas para el uso de acuerdo con la invención son formados a partir de lípidos formadores de vesículas, estándares, los cuales en general incluyen fosfolípidos neutros y negativamente cargados, y un esterol, tal como colesterol. La selección de los lípidos es en general guiada por la concentración de, por ejemplo, el tamaño del liposoma, la labilidad al ácido y la estabilidad de los liposomas en la corriente sanguínea. Son extendidos una variedad de métodos para preparar liposomas, como se describe por ejemplo en Szoka, et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9:467 (1980), y patentes de los Estados Unidos Nos. 4,235,871, 4,501,728, 4,837,028, y 5,019,369. Para dirigirse a las células del sistema inmune un ligando que va a ser incorporado en el liposoma puede incluir, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de los mismos, específicos para los determinantes de la superficie celular de las células deseadas del sistema inmune. Una suspensión liposomal que contiene un péptido puede ser administrada intravenosamente, localmente, tópicamente, etc., en una dosis que varía de acuerdo a, entre otras cosas, la manera de administración, el péptido que se administra y la etapa de la enfermedad que se trata. Para las composiciones sólidas, pueden ser utilizados portadores sólidos no tóxicos, convencionales, los cuales incluyen, por ejemplo, grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina de sodio, talco, celulosa, glucosa, sucrosa, carbonato de magnesio y similares. Para la administración oral, una composición no tóxica farmacéuticamente aceptable es formada mediante la incorporación de cualquiera de los excipientes normalmente empleados, tales como aquellos portadores previamente listados, y en general 10 a 95% del ingrediente activo, es decir, uno ó más péptidos de la invención, y más preferentemente a una concentración de 25% a 75%. Para la administración en aerosol, los péptidos inmunogénicos son preferentemente suministrados en forma finamente dividida junto con un surfactante y propelente. Los porcentajes típicos de los péptidos son de aproximadamente 0.01%-20% en peso, preferentemente de aproximadamente 1%-10%. El surfactante, por supuesto, debe ser no tóxico y preferentemente soluble en el propelente. Representativos de tales agentes son los esteres o esteres parciales de ácidos grasos que contienen de aproximadamente 6 a 22 átomos de carbono, tales como los ácidos caproico, etanoico, láurico, palmítico, esteárico, linoleico, linolénico, olestérico y oleico, con un alcohol polihídrico alifático o su anhídrido cíclico. Los esteres mixtos, tales como los glicéridos mixtos naturales pueden ser empleados. El surfactante puede constituir aproximadamente 0.1%-20% en peso de la composición, preferentemente aproximadamente 0.25-5%. El resto de la composición es ordinariamente propelente. Puede ser también incluido un portador, como se desee, por ejemplo, como lecitina para la distribución intranasal.
I) Modalidades de Diagnóstico y Pronóstico de STEAP-l Como se describe en la presente, los polinucleótidos de STEAP-l, los polipéptidos, las células T citotóxicas reactivas (CTL) , las células T cooperadoras reactivas (HTL) , y los anticuerpos anti-polipéptido son utilizados en ensayos de diagnóstico, de pronóstico y terapéuticos bien conocidos que examinan las condiciones asociadas con el' crecimiento celular no regulado tal como el cáncer, en particular los cánceres listados en la tabla I (ver por ejemplo, su patrón específico de expresión tisular, así como su sobreexpresión en ciertos cánceres, como se describe por ejemplo, en el ejemplo titulado "Análisis de expresión de STEAP-l en tejidos normales, y especímenes de pacientes") . STEAP-l puede ser analogado a un antígeno asociado a la próstata (PSA, por sus siglas en inglés) , el marcador arquetípico que ha sido utilizado por los practicantes médicos por años para identificar y monitorizar la presencia del cáncer de próstata (por ejemplo, Merrill et al., J. Urol. 163(2): 503-5120 (2000); Polascik et al., J. Urol. Aug; 162 (2) :293-306 (1999) y Fortier et al., J. Nat. Cáncer Inst. 91(19): 1635-1640(1999)). Una variedad de otros marcados de diagnóstico son también utilizados en contextos similares, incluyendo p53 y K-ras (ver por ejemplo, Tulchinsky et al., Int J Mol Med 1999 Jul 4(1):99-102 y Minimoto et al., Cáncer Detect Prev 2000; 24(1):1-12). Por lo tanto, la descripción de los polinucleótidos y polipéptidos de STEAP-l (así como las sondas polinucleotídicas de STEAP-l y los anticuerpos anti-STEAP-1 utilizados para identificar la presencia de estas moléculas) y sus propiedades, permite a los expertos en la técnica utilizar estas moléculas en métodos que son análogos a aquellos utilizados, por ejemplo, en una variedad de ensayos de diagnóstico dirigidos a examinar las condiciones asociadas con el cáncer. Las modalidades típicas de los métodos de diagnóstico que utilizan los polinucleótidos STEAP-l, polipéptidos, células T reactivas y anticuerpos, son análogos a aquellos métodos provenientes de los ensayos de diagnóstico bien establecidos, los cuales emplean, por ejemplo, polinucleótidos PSA, polipéptidos, células T reactivas y anticuerpos. Por ejemplo, justo como los polinucleótidos PSA son utilizados como sondas (por ejemplo, en el análisis de Northern, ver por ejemplo, Sharief et al., Biochem. Mol. Biol. Int. 33 (3) : 567-74 (1994) ) y los cebadores (por ejemplo en análisis de PCR, ver por ejemplo, Okegawa et al., J. Urol. 163(4): 1189-1190 (2000)) para observar la presencia y/o el nivel de los mRNAs de PSA en los métodos de monitoreo de la sobreexpresión de PSA o las metástasis de los cánceres de próstata, los polinucleótidos de STEAP-l descritos en la presente, pueden ser utilizados de la misma manera para detectar la sobreexpresión de STEAP-l o la metástasis de la próstata y otros cánceres que expresan este gen. Alternativamente, justo como son utilizados los polipéptidos PSA para generar anticuerpos específicos para PSA que pueden ser luego utilizados para observar la presencia y/o el nivel de proteínas PSA en los métodos para monitorizar la sobreexpresión de la proteína PSA (ver por ejemplo, Stephan et al., Urology 55(4):560~3 (2000)) o las metástasis de las células de próstata (ver por ejemplo, Alanen et al., Pathol. Res. Pract. 192(3): 233-7 (1996)), los polipéptidos STEAP-l descritos en la presente pueden ser utilizados para generar anticuerpos para el uso en la detección de la sobreexpresión de STEAP-l o la metástasis de las células de próstata y células de otros cánceres que expresan este gen. Específicamente, debido a que las metástasis involucran el movimiento de las células cancerosas de un órgano de origen (tal como el pulmón o la próstata) hacia un área diferente del cuerpo (tal como un nodulo linfático) , los ensayos que examinan una muestra biológica para la presencia de las células que expresan los polinucleótidos y/o polipéptidos STEAP-l., puede ser utilizada para proporcionar evidencia de la metástasis. Por ejemplo, cuando una muestra biológica del tejido que normalmente no contiene células que expresan STEAP-l (nodulo linfático) se encuentra que contiene células que expresan STEAP-l tales como la expresión de STEAP-l observada en LAPC4 y LAPC9, los xenoinjertos aislados del nodulo linfático y las metástasis óseas, respectivamente, este hallazgo es indicador de la metástasis. Alternativamente, los polinucleótidos y/o los polipéptidos de STEAP-l pueden ser utilizados., para proporcionar evidencias del cáncer, por ejemplo, cuando las células en una muestra biológica que normalmente no expresan STEAP-l o expresan STEAP-l a un nivel diferente, se encuentra que expresan STEAP-l o que tienen una expresión incrementada de STEAP-1 (ver por ejemplo, la expresión de STEAP-l en los cánceres listados en la tabla 1, y en muestras de pacientes, etc., mostradas en las figuras anexas). En tales ensayos, los expertos pueden desear además generar evidencia suplementaria de metástasis al probar la mezcla biológica para la presencia de un segundo marcador restringido al tejido (además de STEAP-l), tal como PSA, PSCA etc. (ver por ejemplo, Alanen et al., Pathol. Res. Pract. 192(3): 233-237 (1996) ) . El uso de la inmunohistoquímica para identificar la presencia de un polipéptido STEAP-l dentro de una sección tisular, puede indicar un estado alterado de ciertos niveles de este tejido. Es bien comprendido en la técnica que la habilidad de un anticuerpo para localizarse a un polipéptido que es expresado en células cancerosas, es una manera de diagnosticar la presencia de la enfermedad, la etapa de la enfermedad, la progresión y/o la agresividad del tumor. Tal anticuerpo puede también detectar una distribución alterada del polipéptido dentro de las células cancerosas, en comparación al tejido no maligno correspondiente. El polipéptido STEAP-l y las composiciones inmunogénicas son también útiles en vista de los fenómenos de localización alterada de la proteína subcelular, en estados de enfermedad. La alteración de las células de lo normal a estados de enfermedad, provoca cambios en la morfología celular, y está a menudo asociado con cambios en la localización/distribución de la proteína subcelular. Por ejemplo, las proteínas de la membrana celular que son expresadas de una manera polarizada en células normales, pueden ser alteradas en la enfermedad, dando como resultado la distribución de la proteína de una manera no polar, sobre la superficie de la célula entera. El fenómeno de localización de la proteína subcelular alterada, en un estado de enfermedad, ha sido demostrado con la expresión de la proteína MUC1 y Her2 mediante el uso de medios inmunohistoquímicos . Las células epiteliales normales tienen una distribución apical típica de MUCl, además de alguna localización supranuclear de la glucoproteína, mientras que las lesiones malignas a menudo demuestran un patrón de tinción apolar (Diaz et al, The Breast Journal, 7; 40-45 (2001); Zhang et al, Clinical Cáncer Research, 4; 2669-2676 (1998) : Cao, et al, The Journal of Histochemistry and Cytochemistry, 45: 1547-1557 (1997)). Además, el epitelio de mama normal es ya sea negativo para la proteína Her2 o muestra únicamente una distribución bazolateral mientras que las células malignas pueden expresar las proteínas sobre la superficie celular entera (De Potter, et al, International Journal of Cáncer, 44; 969-974 (1989) : McCormick, et al, 117; 935-943 (2002)). Alternativamente, la distribución de la proteína puede ser alterada a partir de una superficie sobre la localización para incluir la expresión citoplásmica difusa en el estado de enfermedad. Tal ejemplo puede ser observado con MUC1 (Diaz, et al, The Breast Journal, 7: 40-45 (2001)). La alteración en la localización/distribución de una proteína en la célula, como es detectada por métodos inmunohistoquímicos, puede también proporcionar información valiosa concerniente a la adecuación de ciertas modalidades de tratamiento. Este último punto es ilustrado por una situación donde una proteína puede ser intracelular en el tejido normal, pero la superficie celular en células malignas; la localización en la superficie celular hace a las células favorablemente adecuadas para el diagnóstico basado en anticuerpo, y los regímenes de tratamiento. Cuando tal alteración de la localización de la proteína ocurre para STEAP-l, la proteína STEAP-l y las respuestas inmunes relacionadas a éstas son muy útiles. En consecuencia, la habilidad para determinar si la alteración de la localización de la proteína celular ocurrió o no para 24P4C12, hacen a la proteína STEAP-l y las respuestas inmunes relacionadas a éstas muy valiosas. El uso de las composiciones de STEAP-l permite a aquellos expertos en la técnica realizar decisiones de diagnóstico y terapéuticas importantes. Los reactivos inmunohistoquímicos específicos para STEAP-l son también útiles para detectar las metástasis de tumores que expresan STEAP-l cuando el polipéptido aparece en tejidos donde STEAP-l no es normalmente producido. De este modo, los polipéptidos de STEAP-l y los anticuerpos que resultan de las respuestas inmunes a éstos son útiles en una variedad de contextos importantes tales como los propósitos de diagnóstico, de pronóstico, preventivos y/o terapéuticos, conocidos por aquellos expertos en la técnica. Justo como los fragmentos polinucleotídicos PSA y las variantes polinucleotídicas son empleadas por los expertos en la técnica para el uso en los métodos de monitoreos de PSA, los fragmentos polinucleótidos y las variantes polinucleotídicas de STEAP-l se utilizan de una manera análoga. En particular, los polinucleótidos de PSA típicos, utilizados en los métodos de monitoreo de PSA son sondas o cebadores que consisten de fragmentos de la secuencia de cDNA de PSA. Ilustrando esto, los cebadores utilizados para la amplificación por PCR, para amplificar un polinucleótido de PSA, debe de incluir menos que la secuencia PSA entera para funcionar en la reacción en cadena de polimerasa. En el contexto de tales reacciones de PCR, los expertos en la técnica en general crean una variedad de diferentes fragmentos de nucleotídicos que pueden ser utilizados como cebadores, con el fin de amplificar diferentes porciones de un polinucleótido de interés, o para optimizar las reacciones de amplificación (ver por ejemplo, Caetano-Anolles, G. Biotechniques 25(3): 472-476, 478-480 (1998); Robertson et al., Methods Mol. Biol. 98:121-154 (1998)) . Una ilustración adicional del uso de tales fragmentos es proporcionada en el ejemplo titulado "Análisis de expresión de STEAP-l en tejidos normales, y especímenes de pacientes", donde un fragmento polinucleotídico de STEAP-l es utilizado como una sonda para mostrar la expresión de los RNAs de STEAP-l en células cancerosas. Además, las secuencias polinucleotídicas variantes son típicamente utilizadas como cebadores y sondas para los mRNAs correspondientes, en análisis de PCR y de Northern (ver por ejemplo, Sawai et al., Fetal Diagn. Ther. 1996 Nov-Dec 11(6):407-13 y Current Protocols In Molecular Biology, Volumen 2, Unidad 2, Frederick M. Ausubel et al. eds., 1995) ) . Los fragmentos polinucleotídicos y las variantes son útiles en este contexto, donde éstos son capaces de enlazarse a una secuencia polinucleotídica objetivo (por ejemplo, el polinucleótido de STEAP-l mostrado en la figura 2 o la variante del mismo) bajo condiciones de alta exigencia. Además, los polipéptidos de PSA que contienen un epitopo que puede ser reconocido por un anticuerpo o célula T que se enlaza específicamente a ese epitopo, se utilizan en métodos de monitoreo de PSA. Los fragmentos polipeptídicos de STEAP-l y los análogos polipeptídicos o variantes pueden ser también utilizados de una manera análoga. Esta práctica de uso de los fragmentos polipeptídicos o las variantes polipeptídicos para generar anticuerpos (tales como los anticuerpos anti-PSA o células T) es típico en la técnica con una amplia variedad de sistemas tales como las proteínas de fusión que son utilizadas por los practicantes (ver por ejemplo, Current Protocols In Molecular Biology, Volumen 2, Unidad 16, Frederick M. Ausubel et al. eds., 1995). En este contexto, cada epitopo funciona para proporcionar la arquitectura con la cual es reactivo un anticuerpo o una célula T. Típicamente, los expertos en la técnica crean una variedad de diferentes fragmentos polipeptídicos que pueden ser utilizados con el fin de generar respuestas inmunes específicas para diferentes porciones de un polípéptido de interés (ver por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos Nos. 5,840,501 y 5,939,533). Por ejemplo, puede ser preferible utilizar un polipéptido que comprende una de las porciones biológicas de STEAP-l discutidas en la presente o una subsecuencia que posee una porción, que es fácilmente identificada por una persona experta en la técnica, con base en las porciones disponibles en la técnica. Los fragmentos polipeptídicos, variantes, o análogos son típicamente útiles en este contexto, siempre y cuando éstos comprendan un epitopo capaz de generar un anticuerpo o célula T específica para una secuencia del polipéptido objetivo (por ejemplo, un polipéptido de STEAP-l mostrado en la figura 3) . Como se muestra en la presente, los polinucleótidos y polipéptidos de STEAP-l (así como las sondas de polinucleótidos de STEAP-l y los anticuerpos anti-STEAP-1 o las células T utilizadas para identificar la presencia de estas moléculas) muestran propiedades específicas que los hacen útiles en el diagnóstico de cánceres tales como aquellos listados en la tabla I. Los ensayos de diagnóstico que miden la presencia de los productos del gen de STEAP-l, con el fin de evaluar la presencia o inicio de una condición de enfermedad descrita en la presente, tales como' el cáncer de próstata, son utilizados para identificar a los pacientes para medidas preventivas o para el monitoreo adicional, como ha sido realizado tan exitosamente con PSA. Además, estos materiales satisfacen una necesidad en la técnica para moléculas que tienen características similares o complementarias a PSA en situaciones donde, por ejemplo, no puede ser realizado un diagnóstico definitivo de la metástasis de origen prostético con base en una prueba de PSA sólido (ver por ejemplo, Alanen et al., Pathol. Res. Pract. 192(3): 233-237 (1996)), y en consecuencia, los materiales tales como los polinucleótidos y polipéptidos de STEAP-l (así como las sondas del polinucleótido de STEAP-l y los anticuerpos anti-STEAP-1 utilizados para identificar la presencia de estas moléculas) necesitan ser empleados para confirmar una metástasis de origen prostético. Finalmente, además de su uso en ensayos y diagnóstico, los polinucleótidos de STEAP-l descritos en la presente, tienen un número de otras utilidades tales como su uso en la identificación de anormalidades cromosómicas asociadas a los oncogenes, en la región cromosómica a la cual el gen STEAP-l traza el mapa (ver el ejemplo titulado "Mapeo cromosómico de STEAP-l" más adelante) . Además, de su uso en ensayos de diagnóstico, las proteínas relacionadas a STEAP-l y los polínucleótidos descritos en la presente tienen otras utilidades tales como su uso en análisis forense de tejidos, de origen desconocido (ver por ejemplo, Takahama K Forensic Sci Int 1996 Junio 28;80 (1-2) : 63-9) . Además, las proteínas y los polinucleótidos relacionados a STEAP-l, de la invención, pueden ser utilizados para tratar una condición patológica caracterizada por la sobreexpresión de STEAP-l. Por ejemplo, la secuencia de aminoácido o de ácido nucleico de las figuras 2 o de la figura 3, o fragmentos de cualquiera de ellos, pueden ser utilizadas para generar una respuesta inmune para un antígeno STEAP-l. Los anticuerpos u otras moléculas que reaccionan con STEAP- 1 pueden ser utilizados para modular la función de esta molécula, y proporcionar con esto un beneficio terapéutico .
XII . ) Inhibición de la Función de la Proteína STEAP-l La invención incluye diversos métodos y composiciones para inhibir el enlace de STEAP-l a su socio de enlace, o su asociación con otra u otras proteínas, así como los métodos para inhibir la función de STEAP-l.
XII.A.) Inhibición de STEAP-l con Anticuerpos Intracelulares En un procedimiento, un vector recombinante que codifica para los anticuerpos de cadena simple que se enlazan específicamente a STEAP-l, es introducido dentro de las células que expresan STEAP-l, vía las tecnologías de transferencia de genes. En consecuencia, el anticuerpo anti-STEAP-1 de cadena simple, codificado, es expresado intracelularmente, se enlaza a la proteína STEAP-l, y con esto inhibe su función. Los métodos para la manipulación por ingeniería genética de tales anticuerpos intracelulares de cadena simple, son bien conocidos. Tales anticuerpos intracelulares, también conocidos como "intracuerpos" son específicamente dirigidos a un compartimiento particular dentro de las células, proporcionando control sobre donde está enfocada la actividad inhibitoria del tratamiento. Esta tecnología ha sido exitosamente aplicada en la técnica (para una revisión ver Richardson y Marasco, 1995, TIBTECH vol. 13) . Se ha mostrado que los intracuerpos eliminan virtualmente la expresión de los receptores de la superficie celular de otro modo abundantes (ver por ejemplo, Richardson et al., 1995, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 92: 3137-3141; Beerli et al., 1994, J. Biol. Chem. 289: 23931-23936; Deshane et al., 1994, Gene Ther. 1: 332-337). Los anticuerpos de cadena simple comprenden los dominios variables de la cadena pesada y ligera, unidas por un polipéptido ligador flexible, y son expresados como un polipéptido simple. Opcionalmente, los anticuerpos de cadena simple son expresados como un fragmento de la región variable de cadena simple unido a la región constante de la cadena ligera. Las señales de tráfico intracelular bien conocidas son manipuladas por ingeniería genética en vectores polinucleotídicos recombinantes que codifican para tales anticuerpos de cadena simple, con el fin de dirigir de manera precisa el intracuerpo hacia el compartimiento intracelular deseado. Por ejemplo, los intracuerpos dirigidos al retículo endoplásmico (ER) son manipulados por ingeniería genética para incorporar un péptido guía, opcionalmente, una señal de retención de ER C-terminal, tal como la porción del aminoácido KDEL. Los intracuerpos destinados para ejercer actividad en el núcleo son manipulados por ingeniería genética para incluir una señal de localización nuclear. Las porciones lipídicas son unidas a los intracuerpos con el fin de trabar el intracuerpo al lado citosólico de la membrana plasmática. Los anticuerpos pueden ser también dirigidos para ejercer función en el citosol. Por ejemplo, los anticuerpos citosólicos son utilizados para secuestrar factores dentro del citosol, previniendo con esto que éstos sean transportados hacia su destino celular natural. En una modalidad, los intracuerpos son utilizados para capturar STEAP-l en el núcleo, con lo cual se previene su actividad dentro del núcleo. Las señales de dirección nucleares son manipuladas por ingeniería en tales intracuerpos STEAP-l, con el fin de lograr la dirección deseada. Tales anticuerpos de STEAP-l están diseñados para enlazarse específicamente a un dominio STEAP-l particular. En otra modalidad más, los intracuerpos citosólicos que se enlazan específicamente a una proteína STEAP-l son utilizados para prevenir que STEAP-l tenga acceso al núcleo, con lo cual se previene que éste ejerza alguna actividad biológica dentro del núcleo (por ejemplo, previniendo que STEAP-l forme complejos de transcripción con otros factores) . Con el fin de dirigir específicamente la expresión de tales intracuerpos a células particulares, la transcripción del intracuerpo es colocada bajo el control regulador de un promotor y/o aumentador apropiado, específico del tumor. Con el fin de dirigir la expresión del intracuerpo específicamente a la próstata, por ejemplo, el promotor de PSA y/o el promotor/aumentador pueden ser utilizados (ver por ejemplo, la patente de los Estados Unidos No. 5,919,652 presentada el 6 de Julio del 1999).
XII.B.) Inhibición de STEAP-l con Proteínas Recombinantes En otro procedimiento más, las moléculas recombinantes se enlazan a STEAP-l y con esto inhiben la función de STEAP-l. Por ejemplo, estas moléculas recombinantes previenen o inhiben que STEAP-l acceda/se enlace a su o a sus socios de enlace, o se asocie con otra u otras proteínas. Tales moléculas recombinantes pueden, por ejemplo, contener la o las partes reactivas de una molécula de anticuerpo específica de STEAP-l. En una modalidad particular, el dominio de enlace de STEAP-l de un socio de enlace de STEAP-l es manipulado por ingeniería genética dentro de una proteína de fusión dimérica, con lo cual la proteína de fusión comprende dos dominios de enlace a ligandos STEAP-l, enlazados a la porción Fc de una IgG humana tal como la IgGl humana. Tal porción de IgG puede contener, por ejemplo, los dominios CH2 y CH3 y la región de bisagra, pero no el dominio CH1. Tales proteínas de fusión diméricas son administradas en forma soluble a pacientes que sufren de un cáncer asociado con la expresión de STEAP-l, con lo cual la proteína de fusión dimérica se enlaza específicamente a STEAP-l y bloquea la interacción de STEAP-l con un socio de enlace. Tales proteínas de fusión diméricas son además combinadas en proteínas multiméricas utilizando tecnologías de enlace al anticuerpo, conocidas.
XII . C . ) Inhibición de la Transcripción y Traducción de STEAP-l La presente invención también comprende los diversos métodos y composiciones para inhibir la transcripción del gen de STEAP-l. Similarmente, la invención también proporciona métodos y composiciones para inhibir la traducción de mRNA de STEAP-l en proteína. En un procedimiento, un método para inhibir la transcripción del gen de STEAP-1, comprende poner en contacto el gen de STEAP-l con un polinucleótído antísentido de STEAP-1. En otro procedimiento más, un método para inhibir la traducción del mRNA de STEAP-l comprende poner en contacto un mRNA de STEAP-l con un polinucleótido antisentido. En otro procedimiento más, una ribozima específica de STEAP-l se utiliza para escindir un mensaje de STEAP-l, con lo cual se inhibe la traducción. Tales métodos basados en antisentido y en ribozimas, pueden ser también dirigidos a las regiones reguladoras del gen de STEAP-l, tales como los elementos promotores y/o aumentadores de STEAP-l. Similarmente, las proteínas capaces de inhibir un factor de transcripción del gen de STEAP-l son utilizadas para inhibir la transcripción del mRNA de STEAP-l. Los diversos polinucleótidos y las composiciones útiles en los métodos anteriormente mencionados, han sido descritos anteriormente. El uso de las moléculas antisentido y de ribozima para inhibir la traducción y la transcripción, es bien conocido en la técnica. Otros factores que inhiben la transcripción de STEAP-l al interferir con la activación transcripcional de STEAP-l son también útiles para tratar los cánceres que expresan STEAP-l. Similarmente, los factores que interfieren con el procesamiento de STEAP-l son útiles para tratar los cánceres que expresan STEAP-l. Los métodos de tratamiento del cáncer que utilizan tales factores están también dentro del alcance de la invención.
XII.D.) Consideraciones Generales para las Estrategias Terapéuticas La transferencia de genes y las tecnologías de terapia de genes pueden ser utilizadas para distribuir moléculas polinucleotídicas terapéuticas a células tumorales que sintetizan STEAP-l (por ejemplo, antisentido, ribozima, polinucleótido que codifican para intracuerpos y otras moléculas inhibitorias de STEAP-l) . Un número de procedimientos de terapéutica génica son conocidos en la técnica. Los vectores recombinantes que codifican para los polinucleótidos antisentido de STEAP-l, ribozimas, factores capaces de interferir con la transcripción de STEAP-l y así sucesivamente, pueden ser distribuidos a las células tumorales objetivo utilizando tales procedimientos de terapia génica. Los procedimientos terapéuticos anteriores pueden ser combinados con cualquiera de una amplia variedad de regímenes quirúrgicos, de quimioterapia o radioterapia. Los procedimientos terapéuticos de la invención pueden hacer el uso de dosis reducidas de quimioterapia (u otras terapias, y/o administración menos frecuente) una ventaja para todos los pacientes y particularmente para aquellos que no toleran la toxicidad del agente quimioterapéutico. La actividad antitumoral de una composición particular (por ejemplo, antisentido, ribozima, intracuerpo) o una combinación de tales composiciones, puede ser evaluada utilizando diversos sistemas de ensayos in vitro e in vivo. Los ensayos in vitro que evalúan la actividad terapéutica incluyen ensayo de crecimiento celular, ensayos en agar suave, y otros ensayos indicadores de la actividad de promoción tumoral, ensayos de enlace capaces de determinar el ' grado al cual una composición terapéutica inhibirá el enlace de STEAP-l a un socio de enlace, etc. In vivo, el efecto de una composición terapéutica de STEAP-l puede ser evaluado en un modelo animal adecuado. Por ejemplo, pueden ser utilizados modelos de cáncer de próstata xenogénicos, en donde los explantes de cáncer de próstata humano o los tejidos de xenoinjertos pasados son introducidos dentro de los animales inmunocomprometidos, tales como ratones desnudos o SCID (Klein et al., 1997, Nature Medicine 3: 402-408). Por ejemplo, la Solicitud de patente del PCT W098/16628 y la patente de los Estados Unidos No. 6,107,540 describen diversos modelos de xenoinjerto de cáncer de próstata humano, capaces de recapitular el desarrollo de tumores primarios, micrometástasis, y la formación de metástasis osteoblásticas características de la enfermedad en etapa tardía. La eficacia puede ser predicha utilizando los ensayos que miden la inhibición de la formación del tumor, la regresión del tumor o las metástasis, y similares. Los ensayos in vivo que evalúan la promoción de la apoptosis son útiles en la evaluación de las composiciones terapéuticas. En una modalidad, los xenoinjertos provenientes de ratones que poseen tumores, tratados con la composición terapéutica pueden ser examinados para la presencia de los focos apoptóticos y comparados a los ratones control que poseen xenoinjerto, no tratados. El grado al cual son encontrados los focos apoptóticos en los tumores de los ratones tratados, proporcionan una indicación de la eficacia terapéutica de la composición. Las composiciones terapéuticas utilizadas en la práctica de los métodos anteriores pueden ser formuladas en composiciones farmacéuticas que comprenden un portador adecuado para el método de distribución deseado. Los portadores adecuados incluyen cualquier material que cuando se combina con la composición terapéutica conserva la función antitumoral de la composición terapéutica, y es en general no reactiva con el sistema inmune del paciente. Los ejemplos, incluyen, pero no están limitados a, cualquiera de un número de portadores farmacéuticos estándares tales como las soluciones salinas amortiguadas con fosfato, estériles, agua bacteriostática y similares (ver en general, Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edición, A. Osal., Ed. , 1980). Las formulaciones terapéuticas pueden ser solubilizadas y administradas por medio de cualquier ruta capaz de distribuir la composición terapéutica al sitio tumoral. Las rutas potencialmente efectivas de administración incluyen, pero no están limitadas a, intravenosa, parenteral, intraperitoneal, intramuscular, intratumoral, intradémica, intraórgano, ortotópica y similares. Una formulación preferida para la inyección intravenosa comprende la composición terapéutica en una solución de agua bacteriostática preservada, agua no preservada estéril, y/o diluida en bolsas de cloruro de polivinilo o de polietileno que contienen 0.9% de cloruro de sodio estéril, para inyección, USP. Las preparaciones de proteínas terapéuticas pueden ser liofilizadas y almacenadas como polvos estériles, preferentemente a vacío, y luego reconstituidas en agua bacteriostática (que contienen por ejemplo, conservadores de alcohol bencílico), o en agua estéril antes de la inyección. Los protocolos de dosificación y de administración para tratamientos de los cánceres utilizando los métodos anteriores, variarán con el método y el cáncer objetivo, y en general dependerán de un número de otros factores apreciados en la técnica.
XIII.) Identificación, Caracterización y uso de los Moduladores de STEAP-l Métodos para Identificar y Utilizar los Moduladores En una modalidad, se realiza la . selección para identificar los moduladores que inducen o suprimen un perfil de expresión particular, suprimen o inducen vías específicas, generando preferentemente el fenotipo asociado así. En otra modalidad más, habiendo identificado los genes diferencialmente expresados, importantes en un estado particular; se realizan las selecciones para identificar los moduladores que alteran la expresión de los genes individuales, ya sea el incremento o la disminución. En otra modalidad más, la selección es realizada para identificar los moduladores que alteran una función biológica del producto de expresión de un gen diferencialmente expresado. Nuevamente, habiendo identificado la importancia de un gen en un estado particular, se realizan las selecciones para identificar los agentes que se enlazan y/o modulan la actividad biológica del producto génico. Además, se realizan las selecciones para genes que son inducidos en respuesta a un agente candidato. Después de identificar un modulador (uno que suprime un patrón de expresión del cáncer que conduce a un patrón de expresión normal, o un modulador de un gen del cáncer que conduce a la expresión del gen como en el tejido normal) se realiza una selección para identificar los genes que son específicamente modulados en respuesta al agente. La comparación de los perfiles de expresión entre el tejido normal y el tejido canceroso tratado con el agente, revela los genes que no son expresados en el tejido normal y en el tejido canceroso, pero son expresados en tejido tratado con el agente, y viceversa. Estas secuencias específicas del agente son identificadas y utilizadas mediante los métodos descritos en la presente para genes o proteínas del cáncer. En particular, estas secuencias y las proteínas que codifican se utilizan en la marcación o identificación de células tratadas con el agente. Además, son producidos los anticuerpos contra las proteínas inducidas por el agente, y utilizadas para dirigir nuevos productos terapéuticos a la muestra de tejido canceroso tratada.
Ensayos de Identificación y Selección Relacionados al Modulador: Ensayos Relacionados a la Expresión del Gen Las proteínas, ácidos nucleicos y anticuerpos de la invención son utilizados en los ensayos de selección. Las proteínas asociadas al cáncer, los anticuerpos, ácidos nucleicos, proteínas modificadas y células que contienen estas secuencias se utilizan en los ensayos de selección, tales como la evaluación del efecto de los fármacos candidatos sobre un "perfil de expresión gen", perfil de expresión de los polipéptidos o alteración de la función biológica. En una modalidad, los perfiles de expresión son utilizados, preferentemente en conjunto con las técnicas de selección de alto rendimiento para permitir el monitoreo para la expresión de los genes del perfil, después del tratamiento con un agente candidato (por ejemplo, Davis, GF, et al, J Biol Screen 7:69 (2002); Zlokarnik, et al., Science 279:84-8 (1998); Heid, Genome Res 6:986- 94,1996). Las proteínas del cáncer, los anticuerpos, los ácidos nucleicos, las proteínas modificadas y las células que contienen las proteínas o genes del cáncer, nativos o modificados, se utilizan en los ensayos de selección. Es decir, la presente invención comprende los métodos para seleccionar las composiciones que modulan el fenotipo del cáncer o una función fisiológica de una proteína cancerosa de la invención. Esto es realizado sobre un gen mismo o mediante la evaluación del efecto de los fármacos candidatos sobre un "perfil de expresión del gen" o función biológica. En una modalidad, se utilizan perfiles de expresión, preferentemente en conjunto con las técnicas de selección de alto rendimiento para permitir el monitoreo después del tratamiento con un agente candidato, ver Zlokamik, supra. Son ejecutados una variedad de ensayos dirigidos a los genes y a las proteínas de la invención. Los ensayos son corridos a un nivel de ácido nucleico o de proteína individuales. Es decir, habiendo identificado un gen particular como suprarregulado en el cáncer, los compuestos de prueba son seleccionados para la habilidad para modular la expresión del gen, o para enlazarse a la proteína cancerosa de la invención. "Modulación" en este contexto incluye un incremento o una disminución en la expresión del gen. La cantidad preferida de la modulación dependerá del cambio original de la expresión del gen en tejido normal versus tejido que sufre de cáncer, con cambios de al menos 10%, preferentemente 50%, más preferentemente 100-300%, y en algunas modalidades 300-1000% o más. De este modo, si un gen muestra un incremento de 4 veces en el tejido canceroso en comparación al tejido normal, es frecuentemente deseada una disminución de aproximadamente 4 veces; similarmente, una disminución de 10 veces en el tejido del cáncer en comparación al tejido normal, es frecuentemente deseado un valor objetivo de un incremento de 10 veces en la expresión por el compuesto de prueba. Los moduladores que exacerban el tipo de expresión del gen observado en el cáncer, son también útiles, por ejemplo, como un objetivo suprarregulado en análisis posteriores. La cantidad de expresión del gen es monitorizado utilizando sondas de ácido nucleico y la cuantificación de los niveles de expresión del gen, o alternativamente, un producto génico mismo es monitorizado, por ejemplo, a través del uso de anticuerpos para la proteína del cáncer e inmunoensayos estándares. Las técnicas proteómicas y de separación también permiten la cuantificación de la expresión.
Monitoreo de la Expresión para Identificar los Compuestos que Modifican la Expresión del Gen En una modalidad, el monitoreo de la expresión del gen, por ejemplo, un perfil de expresión, es monitorizado simultáneamente para un número de entidades. Tales perfiles involucrarán típicamente uno o más de los genes de la figura 2. En esta modalidad, por ejemplo, las sondas del ácido nucleico del cáncer son acopladas a biochips para detectar y cuantificar las secuencias del cáncer en una célula particular. Alternativamente, puede ser utilizada la PCR. De este modo, puede ser utilizada una serie por ejemplo, de pozos de una placa de microtitulación, con cebadores surtidos en los pozos deseados. Puede ser luego realizada una reacción de PCR y analizada para cada pozo. El monitoreo de la expresión es realizado para identificar los compuestos que modifican la expresión de una o más secuencias asociadas al cáncer, por ejemplo, una secuencia polinucleotídica descrita en la figura 2. En general, es agregado un modulador de prueba a las células antes del análisis. Además, son también proporcionadas las selecciones para identificar los agentes que modulan el cáncer, modulan las proteínas del cáncer de la invención, se enlazan a una proteína del cáncer de la invención o interfieren con el enlace de una proteína del cáncer de la invención, y un anticuerpo u otro socio de enlace. En una modalidad, los métodos de selección de alto rendimiento involucran la provisión de una biblioteca que contiene un gran número de compuestos terapéuticos potenciales (compuestos candidatos) . Tales "bibliotecas químicas combinatorias" son luego seleccionadas en uno o más ensayos para identificar aquellos miembros de la biblioteca (especies o subclases químicas particulares) que muestran una actividad característica deseada. Los compuestos identificados de este modo pueden servir como "compuestos guía" convencionales, como compuestos para la selección o como agentes terapéuticos. En ciertas modalidades, las bibliotecas modulatorias de los moduladores potenciales se seleccionan para una habilidad de enlazarse a un polipéptido del cáncer o para modular la actividad. Convencionalmente, son generadas nuevas entidades químicas con propiedades útiles mediante la identificación de un compuesto químico (llamado un "compuesto guía") con alguna propiedad o actividad deseable, por ejemplo, la actividad inhibitoria, la creación de variantes del compuesto guía, y la evaluación de la propiedad y actividad de esos compuestos variantes. Frecuentemente, son empleados métodos de selección de alto rendimiento (HTS) para tal análisis.
Como se anotó anteriormente, el monitoreo de expresión del gen es convenientemente utilizado para probar los moduladores candidatos (por ejemplo, proteína, ácido nucleico o molécula pequeña) . Después de que el agente candidato ha sido agregado y las células se dejan incubar por un periodo, la muestra que contiene una secuencia objetivo que va a ser analizada, es por ejemplo, agregada a un biochip. Si se requiere, la secuencia objetivo es preparada utilizando técnicas conocidas. Por ejemplo, es tratada una mezcla para lisar las células, utilizando amortiguadores de lisis conocidos, electroporación, etc., con la purificación y/o amplificación tal como la PCR, realizadas como sea apropiado. Por ejemplo, una transcripción in vitro con marcadores covalentemente enlazados a los nucleótidos es realizada. En general, los ácidos nucleicos son marcados con biotina-FITC o PE, o con cy3 o cy5. La secuencia objetivo puede ser marcada con, por ejemplo, un agente fluorescente, un quimioluminiscente, un producto químico, o una señal radioactiva, para proporcionar un medio de detectar el enlace específico de la secuencia objetivo a una sonda. El marcador también puede ser una enzima tal como la fosfatasa alcalina o la peroxidasa de rábano, que cuando se proporciona con un sustrato apropiado, produce un producto que es detectado. Alternativamente, el marcador es un compuesto marcado o una molécula pequeña, tal como un inhibidor enzimático, que se enlaza pero no es catalizado o alterado por la enzima. El marcador puede también ser una porción o compuesto tal como un marcador epitópico o biotina que se enlaza específicamente a la estreptavidina. Para el ejemplo de la biotina, la estreptavidina, es marcada como se describe anteriormente, con lo cual se proporciona una señal detectable para la secuencia objetivo enlazada. La estreptavidina marcada no enlazada es típicamente removida antes del análisis. Como será apreciado por aquellos expertos en la técnica, estos ensayos pueden ser ensayos de hibridación directa o pueden comprender "ensayos de emparedado" que incluyen el uso de múltiples sondas, como es en general descrito en las patentes de los Estados Unidos Nos. 5, 681,702; 5,597,909; 5,545,730; 5,594,117; 5,591,584; 5,571,670; 5,580,731; 5,571,670; 5,591,584; 5,624,802; 5,635,352; 5,594,118; 5,359,100; 5,124, 246; y 5,681,697. En esta modalidad, en general, el ácido nucleico objetivo es preparado como se describe anteriormente, y luego agregado al biochip que comprende una pluralidad de sondas de ácido nucleico, bajo condiciones que permiten la formación de un complejo de hibridación. Son utilizadas una variedad de condiciones de hibridación en la presente invención, incluyendo condiciones de exigencia, alta, moderada y baja como se describen anteriormente. Los ensayos son en general corridos bajo condiciones estrictas que permiten la formación del complejo de hibridación de la sonda marcadora, únicamente en presencia del objetivo. La exigencia puede ser controlada mediante la alteración de un parámetro clave que es una variable termodinámica, incluyendo pero no limitada a, la temperatura, la concentración de formamida, la concentración de sal, la concentración de la sal caotrópica, el pH, la concentración del solvente orgánico, etc. Estos parámetros pueden ser también utilizados para controlar el enlace no específico como es en general descrito en la patente de los Estados Unidos No. 5,681,697. De este modo, puede ser deseable realizar ciertos pasos a condiciones de mayor exigencia para reducir el enlace no específico. Las reacciones descritas en la presente pueden ser logradas de una variedad de formas. Los componentes de la reacción pueden ser agregados simultáneamente, o secuencialmente, en diferentes órdenes, con las modalidades preferidas descritas más adelante. Además, la reacción puede incluir una variedad de otros reactivos. Estos incluyen sales, amortiguadores, proteínas neutras, por ejemplo, albúmina, detergentes, etc., que pueden ser utilizados para facilitar la hibridación y detección óptimas y/o reducir las interacciones no específicas o antecedentes. Los reactivos que de otro modo mejoran la eficacia del ensayo, tales como los inhibidores de proteasa, inhibidores de nucleasa, agentes antimicrobianos, etc., pueden ser también utilizados como sea apropiado, dependiendo de los métodos de preparación de la muestra y la pureza del objetivo. Los datos de ensayo son analizados para determinar los niveles de expresión de los genes individuales, y los cambios en los niveles de expresión como entre estado, formando un perfil de expresión de genes. Ensayos Relacionados a la Actividad Biológica La invención proporciona los métodos para identificar o seleccionar un compuesto que modula la actividad de un gen o proteína relacionado al cáncer, de la invención. Los métodos comprenden la adición de un compuesto de prueba, como se definió anteriormente, a una célula que comprende una proteína del cáncer de la invención. Las células contienen un ácido nucleico recombinante que codifica para una proteína del cáncer de la invención. En otra modalidad más, una biblioteca de agentes candidatos es probada en una pluralidad de células. En un aspecto, los ensayos son evaluados en presencia o ausencia o exposición previa o subsecuente de señales fisiológicas, por ejemplo, hormonas, anticuerpos, péptidos, antígenos, citocinas, factores de crecimiento, potenciales de acción, agentes farmacológicos incluyendo agentes quimioterapéuticos, radiación, carcinógenos, u otras células (por ejemplo, contacto, célula a célula) . En otro ejemplo más, se realizan las determinaciones en diferentes etapas del proceso del ciclo celular. De esta manera, los compuestos que modulan los genes de las proteínas de la invención son identificados. Los compuestos con actividad farmacológica son capaces de aumentar o de interferir con la actividad de la proteína del cáncer de la invención. Una vez identificadas, son evaluadas estructuras similares para identificar características estructuras críticas del compuesto. En una modalidad, se proporciona un método para modular (por ejemplo, para inhibir) la división de las células cancerosas; el método comprende la administración de un modulador del cáncer. En otra modalidad más, se proporciona un método de modulación del cáncer (por ejemplo, inhibición) ; el método comprende la administración de un modulador del cáncer. En una modalidad adicional, son proporcionados los métodos para tratar las células o a los individuos con cáncer; el método comprende la administración de un modulador del cáncer. En una modalidad, se proporciona un método para modular el estado de una célula que expresa un gen de la invención. Como se utiliza en la presente, el estado comprende parámetros aceptados en la técnica tales como el crecimiento, proliferación, supervivencia, función, apoptosis, senectud, localización, actividad enzimática, transducción de señales, etc., de una célula. En una modalidad, un inhibidor del cáncer es un anticuerpo como se discutió anteriormente. En otra modalidad más, el inhibidor del cáncer es una molécula antisentido. Una variedad de ensayos de crecimiento celular, de proliferación y de metástasis son conocidos por aquellos expertos en la técnica, como se describe en la presente.
Selección de Alto Rendimiento para Identificar los Moduladores Los ensayos para identificar los moduladores adecuados son apropiados para la selección de alto rendimiento. Los ensayos preferidos de este modo detectan el aumento o la inhibición de la transcripción del gen del cáncer, la inhibición o el aumento de la expresión del polipéptido, y la inhibición o el aumento de la actividad del polipéptido. En una modalidad, los moduladores evaluados en los métodos de selección de alto rendimiento son proteínas, frecuentemente proteínas de origen natural o fragmentos de proteínas de origen natural. De este modo, por ejemplo, los extractos celulares que contienen proteínas, o digestiones aleatorias o dirigidas de los extractos celulares proteicos, son utilizados. De esta manera, son elaboradas las bibliotecas de proteínas para la selección en los métodos de la invención. Particularmente preferidas en esta modalidad, son las bibliotecas de proteína bacterianas, fúngicas, virales y de mamífero, con las últimas que son las preferidas, y proteínas de humano que son especialmente preferidas. El compuesto de prueba particularmente útil será dirigido a la clase de proteínas a las cuales pertenece el objetivo, por ejemplo, los sustratos para enzimas, o ligandos y receptores.
Uso de Crecimiento en Agar Suave y Formación de Colonias para Identificar y Caracterizar a los Moduladores Las células normales requieren un sustrato sólido para adherirse y desarrollarse. Cuando las células son transformadas, éstas pierden su fenotipo y se desarrollan desprendidas del sustrato. Por ejemplo, las células transformadas pueden desarrollarse en cultivo en suspensión agitada o suspendidas en medios semi-sólidos tales como en agar semi-sólido o suave. Las células transformadas, cuando son transfectadas con los genes supresores de tumores, pueden regenerar el fenotipo normal y una vez más requieren un sustrato sólido para adherirse y desarrollarse. El crecimiento en agar suave y la formación de colonias en ensayos, se utilizan para identificar los moduladores de las secuencias del cáncer, que cuando son expresadas en las células hospederas, inhiben la proliferación y transformación celulares anormales. Un modulador reduce o elimina la habilidad de las células hospederas para desarrollarse suspendidas en medios sólidos o semi-sólidos, tal como agar. Las técnicas para el crecimiento en agar suave y la formación de colonias en ensayos en suspensión, se describen en Freshney, Culture of Animal Cells a Manual of Basic Technique (3a edición, 1994) . Ver también, la sección de métodos de Garkavtsev et al. (1996), supra.
Evaluación de la Inhibición por Contacto y Limitación de la Densidad de Crecimiento, para Identificar y Caracterizar Moduladores Las células normales típicamente se desarrollan sobre un patrón plano y organizado en el cultivo celular, hasta que éstas tocan a otras células. Cuando las células se tocan una a la otra, éstas son inhibidas por contacto y dejan de crecer. Las células transformadas, no obstante, no son inhibidas por contacto y continúan desarrollándose hasta que altas densidades en focos desorganizados. De este modo, las células transformadas se desarrollan a una mayor densidad de saturación que las células normales correspondientes. Esto es detectado morfológicamente por la formación de una monocapa desorientada de células, o células en focos. o Alternativamente, el índice de marcación con ( H) -timidina a una densidad de saturación se utiliza para medir la limitación de la densidad de crecimiento, similarmente un ensayo de MTT o azul Alamar revelarán la capacidad de proliferación de las células y la habilidad de los moduladores para afectar la misma. Ver Freshney (1994), supra. Las células transformadas cuando son transfectadas con genes supresores de tumores, pueden regenerar un fenotipo normal y volverse inhibidas por contacto y podrían desarrollarse a una menor densidad. En este ensayo, el índice de marcación con (3H) -timidina a la densidad de saturación es un método preferido para medir la limitación de la densidad de crecimiento. Las células hospederas transformadas son transfectadas con una secuencia asociada al cáncer, y son desarrolladas por 24 horas a una densidad de saturación en condiciones de medio no limitantes. El porcentaje de marcación de las células con (3H) -timidina es determinado por la cpm incorporadas. El crecimiento independientemente del contacto es utilizado para identificar los moduladores de las secuencias del cáncer, que han conducido a proliferación y transformación celulares anormales. Un modulador reduce o elimina el crecimiento independientemente del contacto, y regresa las células a un fenotipo normal.
Evaluación del Factor de Crecimiento o Dependencia del Suero para Identificar y Caracterizar los Moduladores Las células transformadas tienen menor dependencia al suero que sus contrapartes formales (ver por ejemplo, Temin, J. Nati. Cáncer Inst. 37:167-175 (1966); Eagle et al., J. Exp. Med 131 :836-879 (1970)); Freshney, supra. Esto es en parte debido a la liberación de los diversos factores de crecimiento por las células transformadas. El grado de factor de crecimiento o dependencia al suero de las células hospederas transformadas puede ser comparado con aquel del control.
Por ejemplo, el factor de crecimiento o la dependencia al suero de una célula es monitorizado en métodos para identificar y caracterizar los compuestos que modulan las secuencias asociadas al cáncer, de la invención. Uso de los Niveles de Marcadores Específicos del Tumor para Identificar y Caracterizar los Moduladores Las células tumorales liberan una cantidad incrementada de ciertos factores (de aquí en adelante los "marcadores específicos del tumor") que sus contrapartes normales. Por ejemplo, el activador de plasminógeno (PA) es liberado del glioma humano ' a un nivel más alto que de las células cerebrales normales (ver por ejemplo, Gullino, Angiogenesis, Tumor Vascularization, and Potential Interference with Tumor Growth, in Biological Responses in Cáncer, pp. 178-184 (Mihich (ed.) 1985)). Similarmente, el factor de angiogénesis tumoral (TAF) es liberado a un nivel más alto en las células tumorales que sus contrapartes normales (ver por ejemplo, Folkman, Angiogenesis and Cáncer, Sem Cáncer Biol. (1992)), mientras que bFGF es liberado de los tumores endoteliales (Ensoli, B et al) . Diversas técnicas que miden la liberación de estos factores son descritas en Freshney (1994), supra. También ver, 'ünkless et al., J. Biol. Chem. 249:4295-4305 (1974); Strickland & Beers, J. Biol. Chem. 251:5694-5702 (1976); Whur et al., Br. J. Cáncer 42:305 312 (1980); Gullino, Angiogenesis, Tumor Vascularization, and Potential Interference with Tumor Growth, in Biological Responses in Cáncer, pp. 178-184 (Mihich (ed. ) 1985); Freshney, Anticancer Res. 5:111-130 (1985). Por ejemplo, los niveles del marcador específico del tumor son monitorizados en métodos para identificar y caracterizar los compuestos que modulan las secuencias asociadas al cáncer, de la invención.
Invasibidad en Matrigel para Identificar y Caracterizar Moduladores El grado de invasibidad en matrigel o un constituyente de la matriz extracelular, puede ser utilizado como un ensayo para identificar y caracterizar los compuestos que modulan las secuencias asociadas al cáncer. Las células tumorales muestran una correlación positiva entre la malignidad y la invasibidad en Matrigel o algún otro constituyente de la matriz extracelular. En este ensayo, las células tumorigénicas son típicamente utilizadas como las células hospederas. La expresión de un gen supresor del tumor en estas células hospederas, podría disminuir la invasibidad de las células hospederas. Las técnicas descritas en Cáncer Res. 1999; 59:6010; Freshney (1994), supra, pueden ser utilizadas. En resumen, el nivel de invasión de las células hospederas es medido mediante el uso de filtros recubiertos con Matrigel o algún otro constituyente de la matriz extracelular. La penetración dentro del gel, o a través del lado distal del filtro, es calificado como la invasibidad, y calificado histológicamente por número de células y distancia movida, o por la pre-marcación de las células con 125I y contando la radioactividad sobre el lado distal del filtro o el fondo de la caja. Ver por ejemplo, Freshney (1984), supra.
Evaluación del Crecimiento Tumoral In Vivo para Identificar y Caracterizar los Moduladores Los efectos de las secuencias asociadas al cáncer sobre el crecimiento celular, son probados en organismos transgénicos o inmunosuprimidos. Los organismos transgénicos son preparados en una variedad de formas aceptadas en la técnica. Por ejemplo, los organismos transgénicos suprimidos en un gen (agónicos), por ejemplo, mamíferos tales como ratones, son elaborados en los cuales un gen del cáncer es perturbado o en el cual es insertado un gen del cáncer. Los ratones transgénicos agónicos son elaborados mediante la inserción de un gen marcador u otro gen heterólogo dentro del sitio del gen del cáncer endógeno, en el genoma del ratón vía la recombinación homologa. Tales ratones pueden también ser elaborados mediante la sustitución del gen del cáncer endógeno con una versión mutada del gen del cáncer, o mediante la mutación del gen del cáncer endógeno, por ejemplo, mediante exposición a carcinógenos. Para preparar animales quiméricos transgénicos, por ejemplo, ratones es introducida una construcción de ADN dentro de los núcleos de células madre embrionarias. Las células que contienen la lesión genética manipulada por ingeniería genética reciente, son inyectadas dentro de un embrión de ratón hospedero, que es reimplantado dentro de una hembra recipiente. Algunos de estos embriones se desarrollan en ratones quiméricos que poseen células germinales, algunas de las cuales son derivadas de la línea celular mutante. Por lo tanto, mediante la crianza de ratones quiméricos es posible obtener una nueva línea de ratones que contienen la lesión genética introducida (ver por ejemplo, Capecchi et al., Science 244:1288 (1989)). Los ratones quiméricos pueden ser derivados de acuerdo a la patente de los Estados Unidos No. 6,365,797, expedida el 2 de Abril del 2002; la patente de los Estados Unidos No. 6,107,540 expedida el 22 de Agosto del 2000; Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988) y Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, Robertson, ed. , IRL Press, Washington, D.C., (1987) . Alternativamente, pueden ser utilizados diversos animales hospederos inmunosuprimidos o inmunodeficientes . Por ejemplo, un ratón "desnudo" genéticamente atímico (ver por ejemplo, Giovanella et al., J. Nati. Cáncer Inst. 52:921 (1974)), un ratón SCID, un ratón timectomizado, o un ratón irradiado (ver por ejemplo, Bradley et al., Br. J. Cáncer 38:263 (1978); Selby et al., Br. J. Cáncer 41:52 (1980)) pueden ser utilizados como un hospedero. Las células tumorales transplantadas (típicamente de aproximadamente 10d células) inyectadas en hospederos isogénicos, producen tumores invasores en una alta proporción de casos, mientras que las células normales de origen similar no lo harán. En hospederos que desarrollaron tumores invasores, las células que expresan secuencias asociadas al cáncer son inyectadas subcutáneamente u ortotópicamente . Los ratones son luego separados en grupos, incluyendo grupos control y grupos experimentales tratados (por ejemplo, tratados con un modulador) . Después de una longitud de tiempo adecuada, preferentemente, 4-8 semanas, se mide el crecimiento del tumor (por ejemplo, por el volumen o por sus dos dimensiones más grandes, o el peso), y se comparan al control. Los tumores que tienen reducción estadísticamente significativa (utilizando por ejemplo, la prueba T Student) se dice que tienen crecimiento inhibido.
Ensayos In Vitro para Identificar y Caracterizar los Moduladores Los ensayos para identificar los compuestos con actividad moduladora pueden ser realizados in vitro. Por ejemplo, un polipéptido del cáncer es primeramente puesto en contacto con un modulador potencial e incubado por una cantidad de tiempo suficiente, por ejemplo, de 0.5 a 48 horas. En una modalidad, los niveles de polipéptido del cáncer son determinados in vitro mediante la medición del nivel de proteína del mRNA. El nivel de proteína es medido utilizando inmunoensayos tales como Western Blot, ELISA y similares, con un anticuerpo que se enlaza selectivamente al polipéptido del cáncer o a un fragmento del mismo. Para la medición del mRNA, la amplificación, por ejemplo, utilizando PCR, LCR, o ensayos de hibridación por ejemplo, hibridación de Northern, protección de RNAasa, transferencia por puntos, son preferidos. El nivel de proteína o mRNA es detectado utilizando agentes de detección directa o indirectamente marcados, por ejemplo, ácidos nucleicos florescentemente o radioactivamente marcados, anticuerpos radioactivamente o enzimáticamente marcados, y similares, como se describe en la presente . Alternativamente, un sistema de gen reportero puede ser considerado utilizando un promotor de la proteína del cáncer operablemente enlazado a un gen reportero, tal como la luciferasa, proteína fluorescente verde, CAT o P-gal . La construcción del reportero es típicamente transfectada dentro de una célula. Después del tratamiento con un modulador potencial, la cantidad de transcripción, traducción o actividad del gen reportero, es medida de acuerdo a las técnicas estándares conocidas por aquellos expertos en la materia (Davis GF, supra; González, J. y Negulescu, P. Curr. Opin. Biotechnol. 1998: 9:624). Como se describió anteriormente, las selecciones in vitro son realizadas sobre genes individuales y productos génicos, es decir, habiendo identificado un gen particular diferencialmente expresado como importante en un estado particular, la selección de los moduladores de la expresión del gen o el producto génico mismo, es realizada . En una modalidad, se realiza la selección para los moduladores de la expresión del o de los genes específicos. Típicamente, la expresión únicamente de uno o unos pocos genes es evaluada. En otra modalidad más, son diseñadas las selecciones para encontrar primeramente los compuestos que se enlazan a proteínas diferencialmente expresadas. Estos compuestos son luego evaluados para la habilidad de modular la actividad diferencialmente expresada. Además, una vez que son identificados los compuestos candidatos iniciales, las variantes pueden ser además seleccionadas para evaluar mejor las relaciones de estructura-actividad.
Ensayos de Enlace para Identificar y Caracterizar los Moduladores En los ensayos de enlace de acuerdo con la invención, un producto génico purificado o aislado de la invención es en general utilizado. Por ejemplo, son generados los anticuerpos para una proteína de la invención, y son corridos los inmunoensayos para determinar la cantidad y/o localización de la proteína. Alternativamente, las células que comprenden las proteínas cancerosas se utilizan en los ensayos. De este modo, los métodos comprenden la combinación de una proteína del cáncer de la invención y un compuesto candidato, tal como un ligando, y determinar el enlace del compuesto a la proteína del cáncer de la invención. Las modalidades preferidas utilizan la proteína del cáncer humana, los modelos humanos de la enfermedad humana pueden ser también desarrollados y utilizados. También, pueden ser también utilizadas otras proteínas de mamífero, análogas, como es apreciado por aquellos expertos en la técnica. Además, en algunas modalidades se utilizan proteínas del cáncer variantes o derivadas. En general, la proteína del cáncer de la invención, o el ligando, no es enlazada de manera difusa a un soporte insoluble. El soporte puede ser, por ejemplo, uno que tenga áreas de recepción de muestra aisladas (una placa de microtitulación, un arreglo, etc.). Los soportes insolubles pueden ser elaborados mediante cualquier composición a la cual puedan ser enlazadas las composiciones, que sea fácilmente separada de material soluble, y que sea de otro modo compatible con el método de selección general. La superficie de tales soportes puede ser sólida o porosa y de cualquier forma conveniente. Los ejemplos de soportes de insolubles adecuados incluyen placas de microtitulación, arreglos, membranas y esferas. Estas son típicamente elaboradas de vidrio, plástico (por ejemplo, poliestireno), polisacárido, nailon, nitrocelulosa o TeflonMR, etc. Las placas de microtitulación y los arreglos son especialmente convenientes debido a que pueden ser llevados a cabo un gran número de ensayos simultáneamente, utilizando pequeñas cantidades de reactivos y de muestras. La manera particular del enlace de la composición al soporte no es crucial, siempre y cuando sea compatible con los reactivos y los métodos generales de la invención, que mantengan la actividad de la composición y sea no difundióle . Los métodos preferidos de enlace incluyen el uso de anticuerpos que no bloquean estéricamente el sitio de enlace al ligando o la secuencia de activación, cuando se adhiere la proteína al soporte, el enlace directo a soportes "pegajosos" o iónicos, la reticulación química, la síntesis de la proteína o el agente sobre la superficie, etc. Después del enlace de la proteína o del agente del ligando-enlace al soporte, el material no enlazado al exceso es removido mediante lavado. Las áreas de recepción de muestra pueden ser luego bloqueadas a través de la incubación con albúmina sérica bovina (BSA), caseína u 'otra proteína inocua u otra porción. Una vez que una proteína en el cáncer de la invención es enlazada al soporte, y un compuesto de prueba es agregado al ensayo. Alternativamente, el agente de ensayo candidato es enlazado al soporte y la proteína del cáncer de la invención es luego agregada. Los agentes de enlace incluyen cantidades a anticuerpos específicos, agentes de enlace no naturales identificados en selecciones de bibliotecas químicas, análogos peptídicos, etc. De interés particular son los ensayos para identificar los agentes que tienen una baja toxicidad para las células humanas. Puede ser utilizada una amplia variedad de ensayos para este propósito, incluyendo ensayos de proliferación, ensayos de cAMP, ensayos de enlace proteína-proteína in vitro, marcadas, ensayos de desplazamiento de movilidad electroforética, inmunoensayos para el enlace las proteínas, ensayos funcionales (ensayo de fosforilación, etc.) y similares. Una determinación del enlace del compuesto de prueba (ligando, agente de enlace, modulador, etc.) a una proteína del cáncer de la invención puede ser realizada en un número de formas. El compuesto de prueba puede ser marcado, y el enlace es determinado directamente, por ejemplo, mediante el acoplamiento de toda o una porción de la proteína del cáncer de la invención a un soporte sólido, agregando un compuesto candidato marcado (por ejemplo, un marcador fluorescente) , lavando el reactivo en exceso, y determinando si el marcador está presente sobre el soporte sólido. Pueden ser utilizados diversos pasos de bloqueo y lavado, como sea apropiado. En ciertas modalidades, únicamente uno de los compuestos está marcado, por ejemplo, una proteína de la invención o ligandos marcados. Alternativamente, más de un componente está marcado con diferentes marcadores, por ejemplo I125, para las proteínas y un fluoróforo para el compuesto. Los reactivos de proximidad, por ejemplo, reactivos de apagado o de transferencia de energía son también útiles.
Enlace Competitivo para Identificar y Caracterizar los Moduladores En una modalidad, el enlace del "compuesto de prueba" es determinado por el ensayo de enlace competitivo con un "competidor". El competidor es una porción de enlace que se enlaza a la molécula objetivo (por ejemplo, una proteína del cáncer de la invención) . Los competidores incluyen compuestos tales como anticuerpos, péptidos, socios de enlace, ligandos, etc. Bajo ciertas circunstancias, el enlace competitivo entre el compuesto de prueba y el competidor desplaza al compuesto de prueba. En una modalidad, el compuesto de prueba está marcado. El compuesto de prueba, el competidor o ambos, son agregados a la proteína por un tiempo suficiente para permitir el enlace. Las incubaciones son realizadas a una temperatura que facilita la actividad óptima, típicamente entre 4 y 40°C. Los periodos de incubación son típicamente optimizados, por ejemplo, para facilitar la selección rápida de alto rendimiento, típicamente entre cero y una hora serán suficientes. El reactivo en exceso es en general removido o lavado. El segundo componente es luego agregado, y es seguida la presencia o la ausencia del componente marcado, para indicar el enlace. En una modalidad, el competidor es agregado primeramente, seguido por el compuesto de prueba. El desplazamiento del competidor es una indicación de que el compuesto de prueba se está enlazado a la proteína del cáncer, y de este modo es capaz de enlazarse a, y modular potencialmente, la actividad de la proteína del cáncer. En esta modalidad, cualquier componente puede ser marcado. De este modo, por ejemplo, si el competidor está marcado, la presencia del marcador en la solución de lavado del compuesto post-prueba, indica el desplazamiento del compuesto de prueba. Alternativamente, si el compuesto de prueba está marcado, la presencia del marcador sobre el soporte indica el desplazamiento . En una modalidad alternativa, el compuesto de prueba es agregado primeramente, con la incubación y el lavado, seguidos por el competidor. La ausencia del enlace por el competidor indica que el compuesto de prueba se enlaza a la proteína del cáncer con mayor afinidad que el competidor. De este modo, si el compuesto de prueba está marcado, la presencia del marcador de soporte, aunado con una falta de enlace del convertidor, indica que el compuesto de prueba se enlaza a y este modo modula potencialmente la proteína del cáncer de la invención. En consecuencia, los métodos de enlace competitivos comprenden la selección diferencial para identificar los agentes que son capaces de modular la actividad de las proteínas del cáncer de la invención. En esta modalidad, los métodos comprenden combinar una proteína del cáncer y un competidor en una muestra. Una segunda muestra comprende un compuesto de prueba, la proteína del cáncer y un competidor. El enlace del competidor es determinado para ambas muestras, y un cambio, o diferencia en el enlace entre las dos muestras, indica la presencia de un agente capaz de enlazarse a la proteína del cáncer, y modular potencialmente su actividad. Es decir, si el enlace del competidor es diferente en la segunda muestra con relación a la primera muestra, el agente es capaz de enlazarse a la proteína del cáncer. Alternativamente, la selección diferencial es utilizada para identificar los fármacos candidatos que se enlazan a la proteína del cáncer nativa, pero no pueden enlazarse a las proteínas del cáncer modificadas. Por ejemplo, la estructura de la proteína del cáncer es modelada y utilizada en el diseño racional de fármacos, para sintetizar los agentes que interactúan con ese sitio, los agentes que en general no se enlazan a las proteínas modificadas en el sitio. Además, tales fármacos candidatos que afectan la actividad de una proteína del cáncer nativa son también identificados por la selección de los fármacos para la habilidad de aumentar o bien de reducir la actividad de tales proteínas. Los controles positivos y los controles negativos pueden ser utilizados en los ensayos. Preferentemente, las muestras de control y de prueba son realizadas en al menos por triplicado para obtener resultados estadísticamente significativos. La incubación de todas las muestras ocurre con un tiempo suficiente para permitir el enlace del agente a la proteína. Después de la incubación, las muestras son lavadas para liberarlas del material no específicamente enlazado, y se determina la cantidad del agente marcado en general, enlazado. Por ejemplo, donde un radiomarcador es empleado, las muestras pueden ser contadas en un contador de cintilación, para determinar la cantidad del compuesto enlazado. Pueden ser incluidos una variedad de otros reactivos en los ensayos de selección. Estos incluyen reactivos como sales, proteínas neutras, por ejemplo, albúmina, detergentes, etc., que se utilizan para facilitar el enlace óptimo proteína-proteína y/o para reducir las interacciones no específicas o antecedentes. También, los reactivos que de otro modo mejoran la eficiencia del ensayo, tales como inhibidores de proteasa, inhibidores de nucleasa, agentes anti-microbianos, etc., pueden ser utilizados. La mezcla de los componentes es agregada en un orden que proporciona el enlace requerido.
Uso de los Polinucleótidos para Subregular o Inhibir una Proteína de la Invención Los moduladores polinucleótidos del cáncer pueden ser introducidos dentro de una célula que contiene la secuencia nucleotídica objetivo, por la formación de un conjugado con una molécula de enlace al ligando, como se describe en WO 91/04753. Las moléculas de enlace al ligando adecuadas incluyen, pero no están limitadas a, receptores de la superficie celular, factores de crecimiento, otras citocinas, u otros ligandos que se enlazan a los receptores de la superficie celular. Preferentemente, la conjugación de la molécula de enlace al ligando sustancialmente no interfiere con la habilidad de la molécula de enlace al ligando para enlazarse a su molécula o receptor correspondiente, o bloquear la entrada del oligonucleótido en sentido o antisentido, o su versión conjugada dentro de la célula. Alternativamente, un modulador polinucleótido del cáncer puede ser introducido dentro de una célula que contiene la secuencia de ácido nucleico objetivo, por ejemplo, mediante formación de un complejo polinucleótido- lípido, como se describe en WO 90/10448. Se entiende que el uso de las moléculas antisentido o los modelos agónicos y con genes adicionales, pueden también ser utilizados en ensayos de selección como se discute anteriormente, además de los métodos de tratamiento.
Nucleótidos Inhibitorios y Antisentido En ciertas modalidades, la actividad de una proteína asociada al cáncer es subregulada, o completamente inhibida, por el uso del polinucleótido antisentido o el RNA nuclear pequeño inhibitorio (snRNA) , por ejemplo, un ácido nucleico complementario a, y el cual puede preferentemente hibridarse específicamente a, una secuencia de ácido nucleico de mRNA de codificación, por ejemplo, una proteína del cáncer de la invención, mRNA o una subsecuencia del mismo. El enlace del polinucleótido antisentido al mRNA reduce la traducción y/o la estabilidad del mRNA. En el contexto de esta invención, los polinucleótidos antisentido pueden comprender nucleótidos de origen natural o especies sintéticas formadas a partir de subunidades de origen natural o sus homólogos cercanos. Los polinucleótidos antisentido pueden también tener porciones de azúcar alteradas o enlaces ínter-azúcar . Ejemplares entre éstos son el fosforotioato y otras especies que contienen azufre, que son conocidas para el uso en la técnica. Los análogos están comprendidos por esta invención siempre y cuando éstos funcionen efectivamente para hibridarse con los nucleótidos de la invención. Ver por ejemplo, Isis Pharmaceuticals, Carlsbad, CA; Sequitor, Inc., Natick, MA. Tales polinucleótidos antisentido pueden ser fácilmente sintetizados utilizando medios recombinantes, o pueden ser sintetizados in vitro. El equipo para tal síntesis es vendido por varios vendedores, incluyendo Applied Biosystems. La preparación de otros oligonucleótidos tales como fosforotioatos y derivados alquilados, es también conocida para aquellos expertos en la técnica. Las moléculas antisentido como son utilizadas en la presente, incluyen oligonucleótidos antisentido o en sentido.
Los oligonucleótidos en sentido pueden, por ejemplo, ser empleados para bloquear la transcripción mediante el enlace a la hebra antisentido. El oligonucleótido antisentido o en sentido comprende una secuencia de ácido nucleico de una sola hebra (ya sea RNA o DNA) capaz de enlazarse al mRNA objetivo (sentido) o las secuencias de DNA (antisentido) para las moléculas del cáncer. Los oligonucleótidos antisentido o en sentido, de acuerdo a la presente invención, comprenden un fragmento en general de al menos aproximadamente 12 nucleótidos, preferentemente de aproximadamente 12 a 30 nucleótidos. La habilidad para derivar un oligonucleótido antisentido o uno en sentido, con base en una secuencia de cDNA que codifica para una proteína dada, se describe por ejemplo, en Stein y Cohén (Cáncer Res. 48:2659 (1988 y van der Krol et al. (BioTechniques 6:958 (1988)).
Ribozimas Además de los polinucleótidos antisentido, las ribozimas pueden ser utilizadas para dirigir o inhibir la transcripción de las secuencias nucleotídicas asociadas al cáncer. Una ribozima es una molécula de RNA que escinde catalíticamente otras moléculas de RNA. Han sido descritos diferentes tipos de ribozimas, incluyendo las ribozimas del grupo I, ribozimas en forma de cabeza de martillo, ribozimas en forma de orquilla, RNasa P, y ribozimas de cabeza de hacha (ver por ejemplo, Castanotto et al., Adv. in Pharmacology 25: 289-317 (1994) para una revisión general de las propiedades de las diferentes ribozimas) . Las características generales de las ribozimas en orquilla, se describen, por ejemplo, en Hampel et al., Nucí. Acids Res. 18:299-304 (1990); Publicación de patente Europea No. 0360257; patente de los Estados- Unidos No. 5,254,678. Los métodos de preparación son bien conocidos para- aquellos expertos en la técnica (ver por ejemplo, WO 94/26877; Ojwang et al-, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:6340-6344 (1993); Yamada et al., Human Gene Therapy 1:39-45 (1994); Leavitt et al., Proc. Nati. Acad Sci. EUA 92:699-703 (1995); Leavitt et al., Human Gene Therapy 5: 1151-120 (1994); y Yamada et al., Virology 205: 121-126 (1994)).
Uso de los Moduladores en Selección Fenotípica En una modalidad, es administrado un compuesto de prueba a un compuesto de prueba a una población de células cancerosas, que tienen un perfil de expresión del cáncer asociado. Por "administración" o "contacto" se entiende en la presente que el modulador es agregado a las células de una manera tal como para permitir que el modulador actúe sobre las células, ya sea por captación y acción intracelular o por acción en la superficie celular. En algunas modalidades, un ácido nucleico que codifica para un agente proteico (por ejemplo, un péptido) es puesto en una construcción viral tal como una construcción adenoviral o retroviral, y agregada a la célula, tal que es lograda la expresión del agente peptídico, por ejemplo, PCT US97/01019. Pueden ser también utilizados los sistemas regulables de terapia génica. Una vez que el modulador ha sido administrado a las células, las células son lavadas si se desea, y se dejan incubar bajo condiciones fisiológicas preferentemente, por algún periodo. Las células son luego cosechadas y es generado un nuevo perfil de expresión del gen. De este modo, por ejemplo, el tejido canceroso es seleccionado por agentes que modulan, por ejemplo,- inducen o suprimen el fenotipo del cáncer. Un cambio en al menos un gen, preferentemente muchos, del perfil de expresión indica que el agente tiene un efecto sobre la actividad del cáncer. Similarmente, la alteración de una función biológica o una vía de señalización es indicadora de la actividad moduladora. Al definir tal firma para el fenotipo del cáncer, son consideradas selecciones para nuevos fármacos que alteran el fenotipo. Con este procedimiento, el fármaco objetivo no necesita ser conocido y no necesita ser representado en la plataforma de selección original de expresión del gen/proteína, ni tampoco el nivel del transcrito para la proteína objetivo necesita cambiar. La función de inhibición del modulador servirá como un marcador sustituto. Como se describió anteriormente, son realizadas las selecciones para evaluar los genes o productos génicos. Es decir, habiendo identificado un gen particular diferencialmente expresado como importante en un estado particular, es realizada la selección de los moduladores ya sea de la expresión del gen o del producto génico mismo.
Uso del Moduladores para Afectar los Péptidos de la Invención Mediciones de la actividad del polipéptido del cáncer, o del fenotipo del cáncer se realizan utilizando una variedad de ensayos. Por ejemplo, los efectos de los moduladores sobre la función de uno o varios polipéptidos cancerosos se miden al examinar los parámetros descritos anteriormente. Un cambio fisiológico que afecta la actividad es utilizado para evaluar la influencia de un compuesto de prueba sobre los polipéptidos de esta invención. Cuando los resultados funcionales son determinados utilizando células o animales intactos, pueden ser evaluados una variedad de efectos tales como, en el caso de un cáncer asociado con los tumores sólidos, el crecimiento tumoral, las metástasis tumorales, la neovascularización, la liberación de hormonas, los cambios transcripcionales para ambos marcadores genéticos conocidos y no caracterizados (por ejemplo, por análisis de Northern blots) los cambios en el metabolismo de las células tales como el crecimiento celular o cambios en el pH y los cambios en los segundos mensajeros intracelulares tales como cGNIP. Métodos para Identificar y Caracterizar Secuencias asociadas al Cáncer La expresión de diversas secuencias génicas es correlacionada con el cáncer. En consecuencia, son determinados los trastornos basados en genes del cáncer mutantes o variantes. En una modalidad, la invención proporciona los métodos para identificar las células que contienen genes del cáncer variantes, por ejemplo, para determinar la presencia de, toda o parte de la secuencia de al menos un gen del cáncer endógeno en una célula. Esto es logrado utilizando cualquier número de técnicas de secuenciamiento. La invención comprende los métodos para identificar el genotipo del cáncer de un individuo, por ejemplo, para determinar toda o parte de la secuencia de al menos un gen de la invención en el individuo. Esto es en general realizado en al menos un tejido el individuo, por ejemplo, un tejido descrito en la tabla I, y puede incluir la evaluación de un número de tejidos de diferentes muestras del mismo tejido. El método puede incluir la comparación de la secuencia del gen secuenciado a un gen conocido del cáncer, por ejemplo, un gen tipo silvestre para determinar la presencia de miembros de la familia, homologías, mutaciones, o variantes. La secuencia de toda o parte del gen puede ser luego comparada a la secuencia de un gen conocido del cáncer para determinar si existen diferencias. Esto es realizado utilizando cualquier número de programas de homología conocidos tales como BLAST, Bestfit, etc. La presencia de una diferencia en la secuencia entre el gen del cáncer del paciente y el gen del cáncer conocido, correlaciona con un estado de enfermedad o una propensión para un estado de enfermedad, como se describe en la presente. En una modalidad preferida, los genes del cáncer son utilizados como sondas para determinar el número de copias del gen del cáncer en el genoma. Los genes del cáncer son utilizados como sondas para determinar la localización cromosómica de los genes del cáncer. La información tal como la localización cromosómica en la provisión de un diagnóstico o pronóstico, en particular cuando las anormalidades cromosómicas tales como las traslocaciones y similares, son identificadas en el locus del gen del cáncer.
XIV) RNAi y Uso Terapéutico del RNA de Interferencia Pequeña (siRNAs) La presente invención está también dirigida hacia los oligoncleótidos de siRNA, particularmente, los RNAs de doble hebra que abarcan al menos un fragmento de la región de codificación de STEAP-l o las regiones 5' UTR, o el complemento, o cualquier oligonucleótido antisentido específico para la secuencia de STEAP-l. En una modalidad, tales oligonucleótidos son utilizados para elucidar una función de STEAP-l, o son utilizados para seleccionar o evaluar los moduladores de la función o expresión de STEAP-l. En otra modalidad más, la expresión del gen de STEAP-l es reducida mediante el uso de la transfección del siRNA y da como resultado capacidad proliferativa significativamente disminuida de las células cancerosas transformadas, que expresan endógenamente el antígeno; las células tratadas con los siRNAs específicos de STEAP-l muestran supervivencia reducida como se mide, por ejemplo, por una lectura metabólica de la viabilidad celular, correlacionando la capacidad proliferativa reducida. De este modo, las composiciones de siRNAs de STEAP-l comprenden el siRNA (RNA de doble hebra) que corresponden a la secuencia ORF de ácido nucleico de la proteína STEAP-l o subsecuencias de la misma; estas subsecuencias son en general de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30,31, 32, 33, 34, 35 ó más de 35 nucleótidos de RNA contiguos de longitud, y contienen secuencias que son complementarias y no complementarias al menos a una porción de la secuencia de codificación del mRNA. En una modalidad preferida, las subsecuencias son de 19-25 nucleótidos de longitud, lo más preferentemente de 21-23 nucleótidos de longitud. La interferencia del ARN es un nuevo procedimiento para silenciar los genes in vitro e in vivo, de este modo, los RNAs de doble hebra, pequeños (siRNAs) son agentes terapéuticos valiosos. El poder de los siRNAs para silenciar actividades de genes específicos ha sido llevada ahora a modelos animales de enfermedad y se utiliza también en humanos. Por ejemplo, la infusión hidrodinámica de una solución de siRNA dentro de un ratón con un siRNA contra un objetivo particular, ha sido probada como terapéuticamente efectiva.
El trabajo pionero por Song et al., indica que un tipo de ácido nucleico completamente natural, los RNAs de interferencia pequeños (siRNAs) , sirvieron como agentes terapéuticos incluso sin modificación química adicional (Song, E., et al. "RNA interference targeting Fas protects mice from fulminant hepatitis" Nat. Med. 9(3): 347-51(2003)). Este trabajo proporcionó la primera evidencia in vivo de que la infusión de los siRNAs dentro un animal podría aliviar la enfermedad. En este caso, los autores dieron a los ratones inyecciones de siRNAS diseñados para silenciar la proteína FAS (un receptor de muerte celular cuando es sobreactivado durante la respuesta inflamatoria, induce la muerte de los hepatocitos y otras células) . Al siguiente día, a los animales se les dio un anticuerpo específico para la FAS. Los ratones control murieron de insuficiencia hepática aguda dentro de unos pocos días, mientras que más del 80% de los ratones tratados con siRNA permanecieron libres de la enfermedad seria y sobrevivieron. Aproximadamente 80% al 90% de sus células hepáticas incorporaron los oligonucleótidos de siRNAs desnudos. Además, las moléculas de RNA funcionaron por 10 días antes de perder efecto después de 3 semanas. Para el uso en terapia humana, el siRNA es distribuido por sistemas eficientes que inducen la actividad de RNAi a largo plazo. Una advertencia mayor para el uso clínico es la distribución de los siRNAs a las células apropiadas. Los hepatocitos parecen ser particularmente receptivos al ARN exógeno. Hoy en día, los objetivos localizados en el hígado son atractivos debido a que el hígado es un órgano que puede ser fácilmente distribuido con las moléculas de ácido nucleico y los vectores virales. No obstante, son también preferidos otros objetivos tisulares y de órganos . Las formulaciones de los siRNAs con compuestos que promueven el tránsito a través de las membranas celulares, son utilizadas para mejorar la administración de los siRNAs en terapia. Los siRNAs sintéticos químicamente modificados, que son resistentes a las nucleasas y tienen estabilidad en suero, tienen duración mejorada concomitante de los efectos de RNAi, y son una modalidad adicional. De este modo, la tecnología de siRNA es una terapéutica para la malignidad por distribución de moléculas de siRNA dirigidas por STEAP-l a individuos con los cánceres, tales como aquellos listados en la tabla 1. Tal administración de siRNA conduce a crecimiento reducido de las células cancerosas que expresan STEAP-l y proporcionan una terapia anti-tumoral, disminuyendo la morbididad y/o la mortalidad asociada con la malignidad. La efectividad de esta modalidad de la agenicidad del producto génico es significativa cuando se mide in vitro o in vivo. La efectividad in vitro es fácilmente demostrable a través de la aplicación de siRNAs a las células en cultivo (como se describe anteriormente) o a alícuotas de biopsias de pacientes con cáncer, cuando son utilizados métodos in vitro para detectar la expresión reducida de la proteína STEAP-l.
XV.) Equipos/artículos de fabricación Para el uso en el laboratorio, las aplicaciones de pronóstico, profilácticas, de diagnóstico y terapéuticas descritas en la presente, están dentro del alcance de la invención. Tales equipos pueden comprender un portador, un envase o recipiente que está compartimentalizado para recibir uno o más recipientes tales como frascos, tubos y similares, cada uno de los recipientes comprende uno de los elementos separados que van a ser utilizados en el método, junto con una etiqueta o inserto que comprende instrucciones para el uso, tal como un uso descrito en la presente. Por ejemplo, el o los recipientes pueden comprender una sonda que es o que puede ser detectablemente marcada. Tal sonda puede ser un anticuerpo o polinucleótido específico para una proteína o un gen o mensaje de la invención, respectivamente. Donde el método utiliza la hibridación de ácido nucleico para detectar el ácido nucleico objetivo, el equipo puede también tener recipientes que contiene uno o varios nucleótidos para la amplificación de la secuencia objetivo de ácido nucleico.
Los equipos pueden comprender un recipiente que comprende un reportero, tal como una proteína de enlace a la biotina, tal como avidina o estreptavidina, enlazada a una molécula reportera, tal como un marcador enzimático, fluorescente o radioisotópico; tal reportero puede ser utilizado, por ejemplo, un ácido nucleico o anticuerpo. El equipo puede incluir todo o parte de las secuencias de aminoácidos en la figura 2 o en la figura 3 o análogos de las mismas, o una molécula de ácido nucleico que codifica para tales secuencias de aminoácidos. El equipo de la invención comprenderá típicamente el recipiente descrito anteriormente y uno o más de otros recipientes asociados con éste, que comprende materiales deseables desde un punto de vista comercial y de usuario, que incluyen amortiguadores, diluyentes, filtros, agujas, jeringas; el portador, el envase, el recipiente, el frasco y/o el tubo, las etiquetas que listan contenidos y/o las instrucciones para el uso, y los insertos de empaque con instrucciones para el uso. Una etiqueta puede estar presente sobre o con el recipiente, para indicar que la composición es utilizada para una terapia específica o una aplicación o terapéutica tal como una aplicación de pronóstico, profiláctica, de diagnóstico o de laboratorio, y puede también indicar las instrucciones ya sea para el uso in vivo o in vitro, tales como aquellas descritas en la presente. Las direcciones y/o otra información pueden ser también incluidas sobre uno o varios insertos o etiquetas, que se incluyen con o sobre el equipo. La etiqueta puede estar sobre o asociada con el recipiente. Una etiqueta puede estar sobre un recipiente con letras, números u otros caracteres que forman la etiqueta que está moldeada o grabada al ácido en el recipiente mixto; una etiqueta puede estar asociada con el recipiente cuando está presente dentro de un receptáculo o portador que también sujeta al recipiente, por ejemplo, como un inserto de empaque. El marcador puede indicar que la composición es utilizada para diagnosticar, tratar para fines profilácticos o de pronóstico de una condición, tal como una neoplasia de un tejido descrito en la tabla I. Los términos "equipo" y "artículo de fabricación" pueden ser utilizados como sinónimos. En otra modalidad más de la invención, es proporcionado un artículo de fabricación que contienen las composiciones, tales como una o varias secuencias de aminoácidos, una o varias moléculas pequeñas, una o varias secuencias de ácido nucleico y/o uno o varios anticuerpos, por ejemplo, los materiales útiles para el diagnóstico, pronóstico, profilaxis y/o tratamiento de las neoplasias de los tejidos tales como aquellos descritos en la tabla I. El artículo de fabricación comprende típicamente al menos un recipiente y al menos una etiqueta. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, botellas, frascos, jeringas y tubos de ensayo. Los recipientes pueden ser formados desde una variedad de materiales tales como vidrio, metal o plástico. El recipiente puede mantener una o varias secuencias de aminoácidos, una o varias moléculas pequeñas, una o varias secuencias de ácidos nucleicos, una o varias poblaciones celulares y/o uno o varios anticuerpos. En una modalidad, el recipiente mantiene un polinucleótido para el uso en el examen del perfil de expresión de mRNA de una célula, junto con los reactivos utilizados para este propósito. En otra modalidad más, un recipiente comprende un anticuerpo, un fragmento de enlace del mismo o la proteína de enlace específica para el uso en la evaluación de la expresión de la proteína de STEAP-l en células de tejidos para fines relevantes de laboratorio, de pronóstico, de diagnóstico, profilácticos y terapéuticos; las indicaciones y/o instrucciones para tales usos pueden ser incluidas sobre o con tal recipiente como lo pueden ser los reactivos y otras composiciones o herramientas utilizadas para estos propósitos. En otra modalidad más, un recipiente contiene los materiales para promover una respuesta inmune celular o humoral, junto con las indicaciones y/o instrucciones asociadas. En otra modalidad más, un recipiente comprende los materiales para la inmunoterapia adoptiva, tales como las células T citotóxicas (CTL) o células T cooperadoras (HTL) junto con las indicaciones asociadas y/o las instrucciones; los reactivos y otras composiciones o herramientas utilizadas para tal propósito pueden ser también incluidas. El recipiente puede mantener alternativamente una composición que es selectiva, para tratar, diagnosticar, pronosticar o realizar la profilaxis de una condición, y puede tener una compuerta de acceso estéril (por ejemplo el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o un frasco que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica) . Los agentes activos en la composición pueden ser un anticuerpo capaz de enlazar específicamente STEAP-l y modular la función de STEAP-l. El artículo de fabricación puede comprender además un segundo recipiente que comprende un amortiguador farmacéuticamente aceptable, tal como solución salina amortiguada con fosfato, solución de Ringer y/o solución de dextrosa. Este puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y de usuario, incluyendo otros amortiguadores, diluyentes, filtros, agitadores, agujas, jeringas y/o insertos de envase con indicaciones y/o instrucciones para el uso.
EJEMPLOS : Diversos aspectos de la invención son además descritos e ilustrados a manera de varios ejemplos siguientes, ninguno de los cuales está destinado a limitar el alcance de la invención.
Ejemplo 1: Aislamiento Generado por SSH del Fragmento de cDNA del gen de STEAP-l Materiales y Métodos Xenoinjertos LAPC: Los xenoinjertos LAPC fueron obtenidos del Dr. Charles Sawyers (UCLA) y generados como se describe (Klein et al, 1997, Nature Med. 3: 402-408; Craft et al., 1999, Cáncer Res. 59: 5030-5036). Los xenoinjertos LAPC-4 dependientes e independientes de andrógeno (LAPC-4 AD y Al, respectivamente) y los xenoinjertos LAPC-9 (LAPC-9 AD y Al, respectivamente) fueron desarrollados en ratones SCID machos intactos, o en machos castrados, respectivamente, y fueron pasados como trozos de tejidos pequeños en machos recipientes. Los xenoinjertos LAPC-4 AI fueron derivados de los tumores LAPC-4 AD y los xenoinjertos LAPC-4 AI fueron derivados de los tumores LAPC-9 AD. Para generar los xenoinjertos de AI, ratones machos que poseen los tumores LAPC AD fueron castrados y mantenidos por 2 a 3 meses. Después de que los tumores LAPC AD volvieran a crecer, los tumores fueron cosechados y pasados a machos castrados o a ratones SCID hembras.
Los xenoinjertos LAPC-4 AD fueron desarrollados intratibialmente como sigue. El tejido tumoral del xenoinjerto LAPC-4 AD desarrollados subcutáneamente fue desmenuzado en secciones de 1-2 mm3, mientras que el tejido era bañado en un medio IX Icoves, el tejido desmenuzado fue luego centrifugado a 1.3 K rpm por 4 minutos. El sobrenadante fue resuspendido en 10 mm de medio Iscoves IX enfriado con hielo, y centrifugado a 1.3 K rpm por 4 minutos. El botón fue resuspendido en IX Iscoves con 1% de pronasa E e incubado por 20 minutos a temperatura ambiente con agitación oscilante leve, seguido por la incubación sobre hielo de 2-4 minutos. El filtrado fue centrifugado a 1.3 K rpm por 4 minutos, y la pronasa fue retirada del botón aspirado mediante resuspensión en 10 ml de Iscoves y recentrifugación. Los grumos de células fueron luego sembrados en placa en medio PrEGM y desarrolladas toda la noche. Las células fueron luego cosechadas, filtradas, lavadas con 2X RPMl, y contadas. Aproximadamente 50,000 células fueron mezcladas con un volumen igual de Matrigel enfriada con hielos, sobre hielo, y quirúrgicamente inyectadas dentro de las metafisis tibiales proximales de ratones SCID vía una aguja de calibre 27. Después de 10-12 semanas, los tumores LAPC-4 que se desarrollan en la médula ósea fueron recuperados.
Líneas Celulares y Tejidos: Líneas celulares humanas (por ejemplo, HeLa) fueron obtenidas de la ATCC y fuero mantenidas en DMEM con 5% de suero fetal de ternera. Los tejidos humanos para los análisis de RNA y de proteína fueron obtenidos del Centro de Recursos de Tejidos Humanos (Human Tissue Resource Center (HTRC) en UCLA (Los Angeles, CA) y de QualTek, Inc. (Santa Barbara, CA) .
Aislamiento del RNA: Líneas de tejido tumoral de células fueron homogeneizadas en reactivo Trizol (Life Technologies, Gibco BRL) utilizando 10 ml/g de tejido o 10 ml/108 células para aislar el RNA total. El RNA poliA fue purificado del RNA total utilizando los equipos Mini y Midi de mRNA Oligotex de Qiagen. El total y el mRNA fueron cuantificados mediante análisis espectrofotométrico (O.D. 260/280 ml) y analizados mediante electroforesis en gel.
Oligonucleótidos : Se utilizaron los siguientes oligonucleótidos purificados por HPLC.
DPNCDN (cebador de síntesis de cDNA) : 5'TTTTGATCAAGCTT303' (SEQ ID NO: 68) Adaptador 1 : 5 ' CTAATACGACTCACTATAGGGCTCGAGCGGCCGCCCGGGCAGS ' (SEQ ID NO: 69) 3 ' GGCCCGTCCTAG5 ' (SEQ ID NO: 70) Adaptador 2 : 5 ' GTAATACGACTCACTATAGGGCAGCGTGGTCGCGGCCGAGS ' (SEQ ID NO: 71) 3 ' CGGCTCCTAG5 ' (SEQ ID NO: 72) PCR cebador 1: 5 ' CTAATACGACTCACTATAGGGC3 * (SEQ ID NO: 73) Cebador anidado (NP)1: 5'TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGA3' (SEO ID NO: 74) Cebador anidado (NP)2: 5?GCGTGGTCGCGGCCGAGGA3* (SEO ID NO: 75) Hibridación Sustractiva de Supresión: La hibridación sustractiva de supresión (SSH, por sus siglas en inglés) fue utilizada para identificar los cDNAs correspondientes a los genes, los cuales pueden ser suprarregulados en cáncer de próstata dependiente del andrógeno, en comparación a la hiperplasia prostática benigna (BPH) . Los cDNAs de doble hebra correspondientes al xenoinjerto LAPC-4 AD (probador) y el tejido BPH (impulsor) fueron sintetizados a partir de 2 µg del RNA poli (A) + aislado del xenoinjerto del tejido BPH, como se describe anteriormente, utilizando el equipo de sustracción de cDNA PCR-Select de CLONTECH, y 1 ng del oligonucleótido RSACDN como cebador. La síntesis de la primera y de la segunda hebra fueron llevadas a cabo como se describe en el protocolo del manual del usuario del equipo ((CLONTECH Protocolo No. PT1117-1, Catálogo No. K1804-1) . cDNA resultante fue digerido con Rsa 1 por 3 horas a 37 °C. El cDNA digerido fue extraído con fenol/cloroformo (1:1) y se precipitó con etanol . El cDNA impulsor (BPH) fue generado mediante la combinación en una proporción 4 a 1 del cDNA de BPH digerido con Rsa 1, con el cDNA digerido proveniente de hígado de ratón, con el fin de asegurar que los genes murinos fueron sustraídos del cDNA probador (LPAC-4 AD>) . El cDNA probador (LAPC-4 AD) fue generado mediante la dilución de 1 µl de cDNA de LAPC-4 AD digerido con Rsa I (400 ng) en 5 µl de agua. El cDNA diluido (2 µl, 160 ng) fue luego ligado a 2 µl del adaptador 1 y del adaptador 2 (10 µM) , en reacciones de ligaduras separadas, en un volumen total de 10 µl a 16°C toda la noche, utilizando 400 u de DNA ligada T4 (CLONTECH) . La ligadura fue terminada con 1 µl de EDTA 0.2 M y calentando a 72 °C por 5 minutos. La primera hibridación fue realizada mediante la adición de 1.5 µl (600 ng) del cDNA impulsor a cada uno de los dos tubos que contenían 1.5 µl (20 ng) del cDNA probador ligado con el adaptador 1 y con el adaptador 2.
En un volumen final de 4 µl, las muestras fueron cubiertas con aceite mineral, desnaturalizadas en un ciclador térmico MJ Research a 98 °C por 1.5 minutos, y luego se dejaron hibridar por 8 horas a 68°C. Las dos hibridaciones fueron luego mezcladas entre sí con 1 µl adicional del cDNA impulsor desnaturalizado, fresco, y se dejaron hibridar toda la noche a 68 °C. La segunda hibridación fue luego diluida en 200 µl de Hepes 20 mM, pH 8.3, cloruro de sodio 50 mM, EDTA 0.2 mM, calentado a 70°C por 7 minutos, y se almacenó -20°C.
Amplificación de PCR, Clonación y Secuenciamiento de los Fragmentos Génicos Generados a partir de SSH: Para amplificar los fragmentos de genes que resultan de las reacciones de SSH, se realizaron dos amplificaciones de PCR. En la reacción de PCR primaria, se agregó 1 µl de la mezcla de hibridación final diluida a 1 µl del cebador de PCR 1 (10 µM) , 0.5 µl de dNTP (10 µM) , 2.5 µl de amortiguador de reacción lOx (CLONTECH) y 0.5 µl de la mezcla de polimerasa de cDNA 50x Advantage (CLONTECH) en un volumen final de 25 µl . La PCR 1 fue conducida utilizando las siguientes condiciones: 75°C por 5 minutos, 94°C por 25 segundos, luego 27 ciclos de 94°C por 10 segundos, 66°C por 30 segundos, 72°C por 1.5 minutos. Se realizaron cinco reacciones de PCR primarias, separadas para cada experimento. Los productos fueron combinados y diluidos 1:10 con agua. Para la reacción de PCR secundaria, 1 µl del combinado y la reacción de PCR primaria, diluida se agregó a la misma mezcla de reacción que se utilizó para la PCR 1, excepto que los cebadores NP1 y NP2 (10 µM) fueron utilizados en vez del cebador 1 de PCR. La PCR 2 fue realizada utilizando 10-12 ciclos de 94°C por 10 segundos, 68°C por 30 segundos, 72°C por 1.5 minutos. Los productos de PCR fueron analizados utilizando electroforesis en gel de agarosa al 2%. Los productos de PCR fueron insertados dentro de pCR2.1 utilizando el equipo de clonación del vector T/A (Invitrogen). E. coli transformado fue sometido a selección de azul/blanco y ampicilina. Las colonias fueron recogidas y acomodadas en placas de 96 pozos y fueron desarrolladas en cultivo líquido toda la noche. Para identificar los insertos, la amplificación de PCR fue realizada en 1 ml de cultivo bacteriano utilizando las condiciones de PCR 1 y NP1 y NP2 como cebadores. Los productos de PCR fueron analizados utilizando electroforesis en gel de agarosa al 2%. Los clones bacterianos fueron almacenados en 20% de glicerol en un formato de 96 pozos. El DNA plásmido fue preparado, secuencial y sometido a búsquedas de homología de ácido nucleico de la base de datos GenBank, dbEST, y NCl- CGAP.
Análisis de Expresión de RT-PCR: Los cDNAs de primera hebra fueron generados a partir de un programa del mRNA con aprestamiento con oligo (dT) 12-18 utilizando el sistema de preamplificación Superscript de Gibco-BRL. Se utilizó el protocolo del fabricante y se incluyó una incubación por 50 minutos a 42°C con la transcriptasa inversa, seguido por el tratamiento con RNasa H a 37 °C por 20 minutos. Después de la terminación de la reacción, el volumen fue incrementado a 200 µl con agua antes de la normalización. Los cDNAs de primera hebra provenientes de 16 tejidos humanos normales diferentes fueron obtenidos de Clontech. La normalización de los cDNAs de primera hebra a partir de tejidos múltiples se realizó mediante el uso de los cebadores 5 ' atatcgccgcgctcgtcgtcgacaa3 ' (SEQ ID No: 76) y 5 ' agccacacgcagctcattgtagaagg 3' (SEQ ID No: 77) para amplificar la ß-actina. 5 µl del cDNA de primera hebra fueron amplificados en un volumen total de 50 µl que contenían cebadores 0.4 µM, 0.2 µM de cada uno de los dNTPs, amortiguador 1XPCR (Clontech, Tris-HCl 10 mM, MgCl2 1.5 Mm, cloruro de potasio 50 mM, pH 8.3) y la DNA-polimerasa IX Klentaq (Clontech) . 5 µl de la reacción de PCR fueron retirados a 18, 20 y 22 ciclos y se utilizaron para la electroforesis en gel de agarosa. La PCR fue realizada utilizando un ciclador térmico MJ Research bajo las siguientes condiciones: la desnaturalización inicial fue de 94°C por 15 segundos, seguida por 18, 20, y 22 ciclos de 94°C por 15 segundos, 65°C por 2 minutos, 72°C por 5 segundos. Una extensión final a 72 °C fue llevada a cabo por 2 minutos. Después de la electroforesis en gel de agarosa, las intensidades de banda de las bandas de ß-actina de 283 pb provenientes de múltiples tejidos, fueron comparadas mediante inspección visual. Los factores de dilución para los cDNAs de primera hebra fueron calculados para dar como resultado intensidades iguales de la banda de ß-actina en todos los tejidos después de 22 ciclos de PCR. Tres rondas de normalización fueron requeridas para lograr intensidades de bandas iguales en todos los tejidos después de 22 ciclos de PCR. Para determinar los niveles de expresión del gen de STEAP-1, 5 µl del cDNA de primera hebra, normalizados fueron analizados mediante PCR utilizando 25, 30 y 35 ciclos de amplificación utilizando los siguientes pares de cebadores. 5' ACT TTG TTG ATG ACC AGG ATT GGA 3' (SEQ ID No: 78) 5' CAG AAC TTC AGC ACÁ CAC AGG AAC 3' (SEQ ID No: 79) El análisis de expresión semicuantitativa fue logrado al comparar los productos de PCR a los números de ciclo que dan intensidades de banda ligera.
Resultados Fueron conducidos varios experimentos de SSH como se describe en la sección de materiales y métodos anterior, y condujeron al aislamiento de numerosos clones de fragmentos de genes candidatos. Todos los clones candidatos fueron secuenciados y sometidos a análisis de homología contra todas las secuencias en el gen público mayor y las bases de datos de EST, con el fin de proporcionar información sobre la identidad del gen correspondiente y ayudar a guiar la decisión para analizar un gen particular para la expresión diferencial. En general, los fragmentos de genes que no tuvieron homología a ninguna secuencia conocida en cualquiera de las bases de datos investigadas, y de este modo consideradas como representantes de los nuevos genes, así como los fragmentos de genes que muestran la homología a los marcadores secuenciales expresados, previamente secuenciados (ESTs), fueron sometidas a análisis de expresión diferencial mediante RT-PCR y/o análisis de Northern. Uno de los clones de cDNA, designados de STEAP-1, fue de 436 pares de bases de longitud y mostró homología a una secuencia de EST en la base de datos de genes tumorales NCI-CGAP. El cDNA de longitud completa que codifica para el gen STEAP-l fue subsecuentemente aislado utilizando este cDNA y renombrado STEAP-l. La secuencia nucleotídica del cDNA de STEAP-l corresponde a los residuos de nucleótidos 150 a 585 al 585 en la secuencia de cDNA de STEAP-l, como se muestra en la figura 1. Otro clon designado 28P3E1 de 561 pares de bases de longitud mostró homología a un número de secuencias de EST en la base de datos de genes tumorales NCI-CGAP y otras bases de datos. Parte de la secuencia de 28P3E1 (356 pares de bases) es idéntica a un EST derivado de un tejido fetal humano. Después de que el cDNA de STEAP-l de longitud completa fue obtenido y secuenciado, se volvió aparente que este clon también corresponde a STEAP-l (más específicamente, a los residuos 622 hasta el extremo 3' de la secuencia nucleotídica de STEAP-l, como se muestra en la figura 1) .
Ejemplo 2: Aislamiento del cDNA que Codifica para STEAP- 1, de Longitud Completa El fragmento del gen de STEAP-l de 436 pares de bases (ver ejemplo titulado "aislamiento del fragmento de cDNA generado por SSH, del gen de STEAP-l") se utilizó para aislar los cDNAs adicionales que codifican para el gen 8P1D4/STEAP-1. En resumen, una biblioteca de cDNA de próstata humana normal (Clontech) fue seleccionada con una sonda marcada generada a partir del cDNA de STEAP-l de 436 pares de bases. Uno de los clones positivos, el clon 10 es de 1195 pares de bases de longitud y codifica para una proteína de 339 aminoácidos que tiene las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos codificados que no poseen homología significativa para ninguno de los genes humanos o proteínas humanas conocidas (homología a una Proteína de Daño Renal de rata descrita en la solicitud internacional WO98/53071) . La proteína codificada contiene al menos 6 porciones transmembranales predichas que implican una orientación de la superficie celular. Estas características estructuras condujeron a la designación "STEAP" para "Six Transmembrane Epithelial Antigen of the .Prostate" (Antígeno Epitelial Transmembranal Seis de la Próstata) . La identificación subsecuente de proteínas "STEAP" adicional condujo a la redesignación del producto del gen STEAP-l, como "STEAP-l". El cDNA de STEAP-l y las secuencias de aminoácidos codificadas se muestran en la figura 2A-Q. El clon 10 del cDNA de STEAP-l fue depositado con la American Type Culture Collection ("ATCC") (10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209 EUA) como clon 10.1 de STEAP-l plásmido en Agosto 26 de 1998 como ATCC Número de acceso 98849. El clon de cDNA de STEAP-l puede ser extirpado de éste utilizando la doble digestión con EcoRI/Xbal (EcoRI en el extremo 5', Xbal en el extremo 3').
Ejemplo 3. Mapeo Cromosómico de STEAP-l La localización cromosómica puede implicar genes en la patogénesis de la enfermedad. Están disponibles varios procedimientos de mapeo de cromosomas incluyendo la hibridación fluorescente in situ (FISH) , los paneles híbridos de radiación de humano-hámster (RH) (Walter et al., 1994; Nature Genetics 7:22; Research Genetics, Huntsville Al), los paneles híbridos de células somáticas de humano-roedor tales como son disponibles del Instituto Coriel (Camden, New Jersey) , y observadores genómicos que utilizan homologías BLAST a los clones genómicos secuenciados y mapeados (NCBl, Bethesda, Maryland) . Los mapas de STEAP-1 para el cromosoma 7q21 utilizando las secuencias STEAP-l y la herramienta NCBl BLAST: localizada en la Red Mundial en ( . ncbi . nlm. nih. gov/genome/seq/page . cgi?F=HsBlast . html&&ORG=Hs) ) .
Ejemplo 4: Análisis de Expresión de STEAP-l La expresión de STEAP-l en especímenes de pacientes con cáncer de estómago se muestra en la figura 14 (a) -(e). El RNA de la figura 14 (a) fue extraído del estómago normal (N) y de 10 diferentes especímenes de pacientes con cáncer de estómago (T) . El análisis de Northern blot con 10 µg del RNA/banda total fue sondeado con la secuencia STEAP-l. Los resultados muestran la fuerte expresión de un STEAP-l de aproximadamente 1.6 kb en los tejidos tumorales del estómago.
El panel inferior representa la tinción con bromuro de etidio de la transferencia que muestra la calidad de las muestras de RNA. La figura 14 (b) muestra que STEAP-l fue expresado en tejidos de pacientes con cáncer del recto. El RNA fue extraído del recto normal (N) , de tumores de pacientes con cáncer de recto (T) y de metástasis de cáncer de recto (M) .
Los análisis de Nothern blot con 10 µm del RNA total fueron sondeados con la secuencia de STEAP-l. Los resultados muestran la fuerte expresión de STEAP-l en tejidos de pacientes con cáncer de recto. El panel inferior representa la tinción con bromuro de etidio de la transferencia que muestra la calidad de las muestras de RNA. La expresión de STEAP-l por RT-PCR demostró que STEAP-l es fuertemente expresado en células endoteliales de vena endotelial humana (HUVEC) (figura 14 (c) ) . El cDNA de primera hebra fue preparado a partir de las células HUVEC, xenoinjertos de cáncer de próstata LAPC-4AD y LAPC-9AD, así como de tejidos cerebrales humanos. La normalización fue realizada mediante PCR utilizando los cebadores para la actina y GAPDH. La PCR semi-cuantitativa utilizando los cebadores para STEAP-l, se realizó a 27 y 30 ciclos de amplificación. Como un control, se muestra la PCR utilizando los cebadores para la actina. Los resultados muestran la fuerte expresión de STEAP-l en células HUVEC, similares a la expresión detectada en tejidos de xenoinjertos de cáncer de próstata. La expresión de STEAP-l en las células HUVEC indica que STEAP-l de dirección al objetivo puede también dirigirse a las células endoteliales de la neovasculatura de los tumores. La suprarregulación de la expresión de STEAP-l fue detectada en el combinado de cáncer de próstata, combinado de cáncer de vejiga, combinado de cáncer de riñon, combinado de cáncer de colon, combinado de cáncer de pulmón, combinado de cáncer de ovario, y combinado de cáncer de mama. La fuerte expresión de STEAP-l fue detectada en el combinado de metástasis cancerosas, combinado del xenoinjerto del cáncer de próstata y metástasis de próstata hacia el nodulo linfático . La expresión de STEAP-l en especímenes de pacientes con linfoma (figura 14 (f) ) . El cDNA de primera hebra fue preparado a partir de un panel de especímenes de pacientes con linfoma. La normalización fue realizada mediante PCR utilizando los cebadores para la actina. La PCR semi-cuantitativa utilizando los cebadores para STEAP-l, se realizó a 26 y 30 ciclos de amplificación. Las muestras fueron corridas sobre un gel de agarosa, y los productos de PCR fueron cuantificados utilizando el software Alfalmager. La expresión fue registrada como fuerte o media, si la señal es detectada como 26 ó 30 ciclos de amplificación respectivamente, y ausentes si no se detectó señal incluso a 30 ciclos de amplificación. Los resultados muestran la expresión de STEAP-l en 8 de 11 (72.7%) especímenes tumorales probados .
Ejemplo 5: Variantes de Empalme de STEAP-l Variantes de transcritos son variantes de mRNA maduro proveniente del mismo gen, que surgen por transcripción alternativa o empalme alternativo. Los transcritos alternativos son transcritos provenientes del mismo gen pero comienzan la transcripción en diferentes puntos. Las variantes de empalme son variantes de mRNA empalmadas de manera diferente del mismo transcrito. En eucariotes, cuando el gen de exones múltiples es transcrito a partir del ADN genómico, el RNA inicial es empalmado para producir el mRNA funcional, el cual tiene únicamente exones y es utilizado para la traducción en una secuencia de aminoácidos. En consecuencia, un gen dado puede tener cero a muchos transcritos alternativos y cada transcrito puede tener cero o muchas variantes de empalme. Cada variante de transcrito tiene una constitución de exón únicamente, y puede tener diferentes porciones de codificación y/o de no codificación (extremo 5' o 3' ) del transcrito original. Las variantes del transcrito pueden codificar para proteínas similares o diferentes con la misma o una función similar o pueden codificar con proteínas con diferentes funciones, y pueden ser expresadas en el mismo tejido al mismo tiempo, o en diferentes tejidos al mismo tiempo, o en el mismo tejido a diferentes tiempos, o en tejidos diferentes a diferentes tiempos. Las proteínas codificadas por las variantes del transcrito pueden tener localizaciones celulares y extracelulares similares o diferentes, por ejemplo, secretadas versus vascular. Las variantes del transcrito son identificadas por una variedad de métodos aceptados en la técnica, por ejemplo, los transcritos alternativos y las variantes de empalme son identificadas mediante el experimento de clonación de longitud completa, o mediante el uso del transcrito de longitud completa y secuencias EST. Primeramente, todos los ESTs humanos fueron agrupados en grupos que muestran identidad directa o indirecta uno con el otro. En segundo lugar, los ESTs en el mismo grupo fueron además agrupados en subgrupos y ensamblados en una secuencia de consenso. La secuencia del gen original es comparada a la o las secuencias de consenso o a otras secuencias de longitud completa. Cada secuencia de consenso es una variante de empalme potencial para ese gen (ver por ejemplo, Kan, Z., et al., Gene structure prediction and alternative splicing analysis using genomically aligned ESTs, Genome Research, 2001 Mayo, 11 (5) : 889-900.) . Incluso cuando una variante es identificada la cual no tiene un clon de longitud completa, esa porción de la variante es muy útil para la generación del antígeno y para la clonación posterior de la variante de empalme de longitud completa, utilizando técnicas conocidas en la materia. Además, son disponibles los programas de computadora en la técnica que identifican las variantes del transcrito basadas en secuencias genómícas. Los programas de identificación de las variantes del transcrito basadas en genomas incluyen FgenesH (A. Salamov y V. Solovyev, "Ab initio gene finding in Drosophila genomic DNA, " Genome Research. 2000 Abril; 10 (4) : 516-22) ; Grail (URL compbio.ornl.gov/Grail-bin/EmptyGrailForm) y GenScan (URL genes.mit.edu/GENSCAN.html). Para una discusión general de los protocolos de identificación de la variante de empalme ver por ejemplo, Southan, C, A genomic perspective on human proteases, FEBS Lett. 2001 Junio 8; 498 (2-3) : 214-8; de Souza, S.J., et al., Identification of human chromosome 22 transcribed sequences with ORF expressed sequence tags, Proc. Nati Acad Sci EUA. 2000 Noviembre 7; 97 (23) : 12690-3. Para continuar adicionalmente los parámetros de una variante del transcrito, son disponibles una cantidad de técnicas en la materia, tales como la clonación de longitud completa, validación proteónica, validación basada en PCR, y validación 5' RACE, etc. (ver por ejemplo, validación proteónica: Brennan, S.O., et al., Albumin banks península: a new termination variant characterized by electrospray mass spectrometry, Biochem Biophys Acta. 1999 Agosto 17; 1433(1 - 2):321 -6; Ferranti P, et al., Differential splicing of pre-messenger RNA produces múltiple forms of mature caprine alpha (si) -casein, Eur J Biochem. 1997 Octubre 1; 249 (1) : 1-7. Para validación basada en PCR: Wellmann S, et al., Specific reverse transcription-PCR quantification of vascular endothelial growth factor (VEGF) splice variants by LightCycler technology, Clin Chem. 2001 Abril; 47 (4) : 654-60; Jia, HP., et al., Discovery of new human beta- defensins using a genomics-based approach, Gene. 2001 Enero 24; 263(1-2): 211-8. para la validación basada en PCR y RACE 5': Brigle, K.E., et al., Organization of the murine reduced folate carrier gene and identification of variant splice forms, Biochem Biophys Acta. 1997 Agosto 7; 1353(2): 191-8). Como se sabe en la técnica, que las regiones genómicas son moduladas en cánceres. Cuando la región genómica a la cual un gen traza el mapa, es modulada en un cáncer particular, los transcritos alternativos o variantes de empalme del gen son también modulados. En la presente se describe que STEAP-l tiene un perfil de expresión particular relacionado al cáncer. Los transcritos alternativos y las variantes de empalme de STEAP-l pueden también estar involucrados en los cánceres en el mismo o en diferente tejidos, sirviendo de este modo como marcadores/antígenos asociados al tumor. La composición de exón del transcrito original, designada como STEAP-l, v. 1 se muestra en la tabla Lili. Utilizando el gen de longitud completa y las secuencias STEAP-l, fueron identificadas dos variantes del transcrito, designadas como STEAP-l v.2 y v.3. En comparación con STEAP-1 v.l, la variante la transcrito STEAP-l v.2 no se empalmó fuera del intrón 4 de STEAP-l, y la variante STEAP-l v.3 se empalmó fuera de un exón adicional proveniente del intrón 4 de STEAP-l v.l, como se muestra en la figura 11. Técnicamente, cada combinación diferente de exones en orden espacial, por ejemplo, los exones 2 y 3, es una variante de empalme potencial. La figura 11 muestra la eliminación esquemática de los exones de las variantes del transcrito.
Ejemplo 6: Polimorfismos de Nucleótido Simple de STEAP-l Un polimorfismo del nucleótido simple (SNP) es una variación de par de base simple en una secuencia nucleotídica en un sitio específico, en cualquier punto dado del genoma, existen cuatro posibles pares de datos nucleotídicas: A/T, C/G, G/C y T/A. El genotipo se refiere a las secuencias específicas de los pares de bases de- uno o más sitios en el genoma de un individuo. El haplotipo se refiere a la secuencia de los pares de bases de más de un sitio sobre la misma molécula de DNA (o el mismo cromosoma) en un organismo superior) , a menudo en el contexto de un gen o del contexto de varios genes fuertemente enlazados. Los SNPs que aparecen sobre un cDNA son llamados cSNPs . Estos cSNPs pueden cambiar los aminoácidos de la proteína modificada por el gen y de este modo cambiar las condiciones de la proteína. Algunos SNPs provocan enfermedades heredadas; otras contribuyen a las variaciones cuantitativas en el fenotipo, y reacciones para los factores ambientales que incluyen dieta y fármacos entre individuos. Por lo tanto, los SNPs y/o combinaciones de alelos (llamados haplotipos) tienen muchas aplicaciones, incluyendo el diagnóstico de enfermedades heredadas, determinación de las reacciones de fármaco y la dosificación, identificación de genes responsables de las enfermedades, y análisis de la relación genética entre individuos (P. Nowotny, J. M. Kwon and A. M. Goate, "SNP analysis to dissect human traits," Curr. Opin. Neurobiol. 2001 Octubre; 11 (5) .-637-641; M. Pir ohamed y B. K. Park, "Genetic susceptibility to adverse drug reactions," Trends Pharmacol. Sci. 2001 Junio; 22 ( 6) : 298-305; J. H. Riley, C. J. Alian, E. Lai y A. Roses, "The use of single nucleotide polymorphisms in the isolation of common disease genes," Pharmacogenomics . 2000 Febrero; l(l):39-47; R. Judson, J. C. Stephens y A. Windemuth, "The predictive power of haplotypes in clinical response," Pharmacogenomics. 2000 Febrero.; l(l):15-26).
Los SNPs son identificados por una variedad de métodos aceptados en la técnica (P. Bean, "The promising voyage of SNP target discovery," Am. Clin. Lab. 2001 Octubre-Noviembre; 20(9):18-20; K. M. Weiss, "In search of human variation," Genome Res. 1998 Julio; 8 (7 ): 691-697; M. M. She, "Enabling large-scale pharmacogenetic studies by high-throughput mutation detection and genotyping technologies, " Clin. Chem. 2001 Febrero; 47 (2) : 164-172) . Por ejemplo, los SNPs son identificados por el secuenciamiento de fragmentos de DNA que muestran polimorfismos mediante métodos basados en gel, tales como el polimorfismo de longitud del fragmento de restricción (RFLP) y electroforesis en gel en gradiente desnaturalizador (DGEE) . Estos pueden ser también descubiertos mediante secuenciamiento directo de las muestras de DNA combinadas a partir de diferentes individuos o por comparación de las secuencias provenientes de diferentes muestras de DNA. Con la acumulación rápida de los datos de la secuencia, en base de datos públicas y privadas, se pueden descubrir los SNPs al comparar las secuencias utilizando programas de computadora (Z. Gu, L. Hiilier and P. Y. Kwok, "Single nucleotide polymorphism hunting in cyberspace," Hum. Mutat. 1998; 12 (4 ): 221-225) . Los SNPs pueden ser verificados y el genotipo o el haplotipo de un individuo puede ser determinado por una variedad de métodos que incluyen el secuenciamiento directo y los microarreglos de alto rendimiento (P. Y. Kwok, "Methods for genotyping single nucleotide polymorphisms," Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 2001; 2:235-258; M. Kokoris, K. Dix, K. Moynihan, J. Mathis, B. Erwin, P. Grass, B. Hiñes y A. Duesterhoeft, "High-throughput SNP genotyping with the Masscode system," Mol. Diagn. 2000 Diciembre; 5 (4) : 329-340) . Utilizando los métodos descritos anteriormente, catorce SNPs fueron identificados en el transcrito proveniente del clon GTH9, designado como STEAP-l v.2, en las posiciones 602 (C/G), 386 (C/T), 1087 (T/G), 1447 [TIC), 1621 (A/T), 1625 (G/T), 1716 [CÍA), 2358 (C/T), 2646 (T/G), 2859 (T/G), 2908 (A/T)l 3006 (G/C), 3107 (C/T), y 3180 (A/T). Los transcritos o proteínas con alelos alternativos fueron designados como variantes de STEAP-l v.4, v.5, v.6, v.7, v.8, v.9, v.10, v.ll, v.12, v.13, v.14, v.15, v.16 y v.17, respectivamente. La figura 10 muestra la alineación esquemática de las variantes de SNP. La figura 12 muestra la alineación esquemática de las variantes de proteína, correspondiente a las variantes nucleotídicas. Estos alelos de los SNPs, aunque son mostrados separadamente, pueden aparecer en diferentes combinaciones (haplotipos) y en cualquiera de las variantes de los transcritos (tales como STEAP-l vl . y v.3) que contienen el contexto de la secuencia de los SNPs, por ejemplo, los primeros dos SNP estuvieron también sobre STEAP-l v.3 en las mismas posiciones, pero en 572 y 356, respectivamente, sobre STEAP-l v.l.
Ejemplo 7: Producción de STEAP-l Recombinante y Sistemas Procarióticos Para expresar STEAP-l recombinante y las variantes de STEAP-l en células procarióticas, son clonadas las secuencias de cDNA de STEAP-l de longitud parcial o completa y la variante de STEAP-l, dentro de una variedad de vectores de expresión conocidos en la técnica. El cDNA de longitud completa o cualquiera de los 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 o más aminoácidos contiguos de STEAP-l, variantes o análogos de los mismos, son utilizados. A. Construcciones de transcripción y traducción in vitro : pCRII : Para generar las sondas de RNA en sentido y antisentido de STEAP-l para las investigaciones de RNA in situ, son generadas construcciones de pCRII (Invitrogen, Carlsbad CA) que codifican ya sea para todos o para los fragmentos del cDNA de STEAP-l. El vector de pCRII tiene los promotores Sp6 y T7 que flanquean el inserto para impulsar la transcripción del RNA de STEAP-l para el uso como sondas en experimentos de hibridación in situ de RNA. Estas sondas son utilizadas para analizar la expresión celular del tejido de STEAP-l al nivel del RNA. El RNA de STEAP-l transcrito que representa la región de codificación de los aminoácidos de cDNA del gen de STEAP-l, se utiliza en los sistemas de traducción in vitro tales como el sistema de Reticulolisado Acoplado TnTMR (Promega, Corp., Madison, Wl) para sintetizar la proteína STEAP-l.
B. Construcciones bacterianas: Construcciones pGEX: Para generar las proteínas STEAP-l recombinantes en bacterias que son fusionadas a la proteína de la Glutatione S-transferasa (GST) , toda o parte del cDNA de STEAP-l o las variantes son clonadas dentro del vector de fusión de GST de la familia pGEX (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) . Estas construcciones permite la expresión controlada de las secuencia de proteínas STEAP-l recombinantes, con GST fusionado en el extremo amino y el epitopo de seis histidinas ( 6X His) en el extremo carboxilo. Los marcadores GST y 6X His permiten la purificación de la proteína de fusión recombinante a partir de bacterias inducidas, con la matriz de afinidad apropiada, y permiten el reconocimiento de la proteína de fusión con los anticuerpos anti-GST y anti His. El marcador 6X-His es generado por la adición de 6 codones de histidina al cebador de clonación en el extremo 3', por ejemplo de la estructura de lectura abierta (ORF) . Un sitio de escisión proteolítica tal como el sitio de reconocimiento PreScission501 en pGEX-6P- 1, puede ser empleado, tal que éste permite la escisión del marcador GST de la proteína relacionada a STEAP-l. El gen de resistencia a la ampicilina y el origen pBR322 permite la selección y el mantenimiento de los plásmidos de pGEX en E. coli .
Construcciones de pMAL: Para generar, en bacterias, las proteínas de STEAP-l recombínantes que son fusionadas a la proteína de enlace a la maltosa (MBP) , toda o parte de la secuencia de codificación de la proteína del cDNA de STEAP-l son fusionadas al gen MBP mediante la clonación dentro de los vectores pMAL-c2X y pMAL-p2X (New England Biolabs, Beverly, MA) . Estas construcciones permiten la construcción controlada de las secuencias de proteína STEAP-l recombinantes con MBP fusionado en el extremo amino y un marcador epitópico de 6X His en el extremo carboxilo. Los marcadores MBP y 6X His permiten la purificación de la proteína recombinante a partir de bacterias inducidas, con la matriz de afinidad apropiada y permite el reconocimiento de la proteína de fusión con los anticuerpos anti-MBP y anti-His. El marcador epitópico 6X His es generado por la adición de seis codones de histidina hacia el cebador de clonación 3' . Un sitio de reconocimiento del factor Xa permite la escisión del marcador pMAL a partir de STEAP-l. Los vectores pMAL-c2X y pMAL-p2X son optimizados para expresar la proteína recombinante en el citoplasma o el periplasma, respectivamente. La expresión en el periplasma aumenta el plegamiento de las proteínas con enlaces disulfuro.
Construcciones de pET: Para expresar STEAP-l en células bacterianas, todo o partes de la secuencia que codifica para la proteína STEAP-l de cDNA, son clonadas dentro de la familia pET de vectores (Novagen, Madison, Wl) . Estos vectores permiten la expresión fuertemente controlada de la STEAP-l recombinante en bacterias con o sin la fusión a proteínas que aumentan la solubilidad, tal como NusA y tioredoxina (Trx) , y marcadores epitópicos tales como 6X His y S-TagMR que ayudan a la purificación y detección de la proteína recombinante. Por ejemplo, son realizadas las construcciones utilizando el sistema de fusión 43.1 de pET NusA, tal que las regiones de la proteína STEAP-l son expresadas como fusiones amino-terminales para NusA.
C. Construcciones de Levadura: Construcciones pESC: Para expresar STEAP-l en la especie de levadura Saccharomyces cerevisiae para la generación de la proteína recombinante y los estudios funcionales, toda o parte de las secuencias que codifican para la proteína de cDNA de STEAP-l son clonadas dentro de la familia pESC de vectores, cada uno de los cuales contienen uno de cuatro marcadores seleccionables, HIS3, TRP1, LEU2, y URA3 (Stratagene, La JoIIa, CA) . Estos vectores permiten la expresión controlada a partir del mismo plásmido de hasta dos genes diferentes o secuencias clonadas que contienen ya sea los marcadores epitópicos FlagMR o Myc en la misma célula de levadura. Este sistema es útil para confirmar las interacciones proteína-proteína de STEAP-l. Además, la expresión de levadura produce modificaciones post-traduccionales similares, tales como glucosilaciones y fosforilaciones, que son encontradas cuando son expresadas en células eucarióticas. Construcciones de pESP: Para expresar STEAP-l en la especie de levadura Saccharomyces pombe, toda o partes de las secuencias que codifican para la proteína de cDNA de STEAP-l, son clonadas dentro de la familia de vectores pESC. Estos vectores permiten el alto nivel controlado de expresión de una secuencia de proteína STEAP-l que está fusionada ya sea en el extremo mismo o en el extremo carboxilo a GST, que ayuda a la purificación de la proteína recombinante. Un marcador epitópico FlagMR permite la detección de la proteína recombinante con el anticuerpo anti-FlagMR'.
Ejemplo 8: Producción de STEAP-l Recombinante en Sistemas Eucarióticos Superiores A. Construcciones en mamífero: Para expresar STEAP-l recombinante en células eucarióticas, las secuencias de cDNA de STEAP-l de longitud completa parcial pueden ser clonadas dentro de cualquiera de una variedad de vectores de expresión conocidos en la técnica. Una o más de las siguientes regiones de STEAP-l son expresadas en estas construcciones, los aminoácidos 1 al 339 de STEAP-l v.l, v4, los aminoácidos 1 a 258 de v.2, los aminoácidos 1 a 282 de v.3, o cualquiera de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 o más aminoácidos contiguos de STEAP-l, variantes o análogos de los mismos. En ciertas modalidades, una región de una variante específica de STEAP-l es expresada, la cual codifica para un aminoácido, en una posición específica que difiere del aminoácido de cualquier otra variante encontrada en esa posición. En otras modalidades, una región de una variante de STEAP-l es expresada la cual yace parcial o completamente dentro de una secuencia que es única a esa variante. Las construcciones pueden ser transfectadas dentro de cualquiera de una amplia variedad de células de mamífero tales como las células 293T. Los listados de células 293T transfectadas pueden ser sondeados con el suero policlonal anti-STEAP-1 descrito en la presente.
Construcciones de pcDNA4/HisMax: Para expresar STEAP-l en células de mamífero, una ORF de STEAP-l o porciones de la misma, de STEAP-l son clonadas dentro de la versión A de pcDNA4/HisMax (Invitrogen, Carlsbad, CA) . La expresión de la proteína es impulsada a partir de promotores de citomegalovirus (CMV) y el aumentador traduccional SP16. La proteína recombinante tiene XpressMR y seis epitopos de histidina ( 6X His) fusionadas al extremo amino. El vector de pcDNA4/HisMax contiene también la señal de poliadenilación de la hormona bovina del crecimiento (BGH) y la secuencia de terminación de la transcripción para aumentar la estabilidad del mRNA junto con el origen SV40 para la replicación episomal, y el rescate del vector simple en líneas celulares que expresan el antígeno T grande. El gen de resistencia a la zeocina permite la selección de las células de mamífero que expresan la proteína, y el gen de resistencia a la ampicilina, y el gen y ColEl permite la selección y el mantenimiento del plásmido en E. coli.
Construcciones de pcDNA3.1/MycHis : Para expresar STEAP-l en células de mamífero, la ORF de STEAP-l, o porciones de la misma, de STEAP-l con un sitio de inicio de la traducción de consenso fue clonado dentro de la versión A de pcDNA3.1/MycHis (Invitrogen, Carlsbad, CA) . La expresión de la proteína es expresada a partir del promotor del citomegalovirus (CMV) . Las proteínas recombinantes tienen el epitopo myc y el epitopos 6X His fusionado al extremo carboxilo. El vector pcDNA3.1/MycHis también contiene la señal de poliadenilación y la secuencia de terminación de la transcripción de la hormona bovina de crecimiento (BGH) para aumentar la estabilidad del mRNA, junto con el origen SV40 para la replícación episomal y el rescate del vector simple en líneas celulares que expresan el antígeno T grande. Fue utilizado el gen de resistencia a la neomicina, ya que éste permite la selección de las células de mamífero que expresan la proteína, y el gen de resistencia a la ampicilina y el origen ColEl permiten la selección y el mantenimiento del plásmido en E. coli.
Construcción de pcDNA3.1/CT-GFP-TOPO: Para expresar STEAP-l en células de mamífero y para permitir la detección de las proteínas recombinantes utilizando fluorescencia, una ORF de STEAP-l o porciones de la misma con un sitio de inicio de la traducción Kozak de consenso clonado dentro de pcDNA3.1/CT-GFP-T0P0 (Invitrogen, CA) . La expresión de la proteína es impulsada a partir del promotor de citomegalovirus (CMV) . Las proteínas recombinantes tienen la proteína fluorescente verde (GFP) fusionada al extremo carboxilo, facilitando la detección no invasora in vivo y estudios de biología celular. El vector pcDNA3.1 CT-GFP-TOPO también contiene la señal de poliadenilación y la secuencia de terminación de la transcripción de la hormona bovina de crecimiento (BGH) para aumentar la estabilidad del mRNA junto con el origen SV40 para la replicación episomal, y el rescate del vector simple en líneas celulares que expresan el antígeno T grande. El gen de resistencia a la neomicina permite la selección de las células de mamífero que expresan la proteína, y enciende la resistencia a la ampicilina en el origen gen y ColEi permite la selección y el mantenimiento del plásmido en E. coli. Construcciones adicionales con una fusión GFP amino-terminal son realizadas en pcDNA3.1/NT-GFP-T0P0, que abarca la longitud completa de una proteína STEAP-1.
PAPtag: ün ORF de STEAP-l, o porciones de la misma, es clonada dentro de pAPtag-5 (GenHunter Corp. Nashville, TN) . Esta construcción genera una fusión de fosfatasa alcalina en el extremo carboxilo de una proteína STEAP-l, mientras que fusiona la secuencia de señal IgG? al extremo amino. Son también generadas las construcciones en las cuales la fosfatasa alcalina con una secuencia de señal de IgG? amino-terminal, es fusionada al extremo amino de una proteína STEAP-l. Las proteínas STEAP-l recombinantes, resultantes son optimizadas para la secreción en medios de células de mamífero transfectadas y pueden ser utilizadas para identificar las proteínas tales como ligandos o receptores que interactúan con las proteínas STEAP-l. La expresión de proteína es impulsada a partir del promotor el CMV y las proteínas recombinantes también contiene myc y los epitopos 6X His fusionados al extremo carboxilo que facilita la detección y la purificación. El gen de resistencia a la zeocina, presente en el vector, permite la selección de células de mamífero que expresan la proteína recombinante y el gen de resistencia a la ampicilina permite la selección del plásmido en E. coli. ptag5: Una ORF de STEAP-l, o porciones de la misma, fue clonada dentro de pTag-5. Este vector es similar a pAPtag pero sin la fusión de fosfatasa alcalina. Esta construcción genera la proteína STEAP-l con una secuencia de señal IgG? amino-terminal, y los marcadores epitópicos myc y 6X His en el extremo carboxilo, lo que facilita la detección y la purificación por afinidad. Las proteínas STEAP-l recombinante resultante fue optimizada para la secreción dentro de medio de células de mamífero transfectadas, y se utiliza como inmunógeno o ligando para identificar las proteínas tales como los ligandos y los receptores que interactúan con las proteínas STEAP-l. La expresión de la proteína fue impulsada a partir del promotor del CMV. El gen de resistencia a la zeocina presente en el vector permitió la selección de las células de mamífero que expresan la proteína, y el gen de resistencia a la ampicilina permite la selección del plásmido en E. coli.
PsecFc: Una ORF de STEAP-l, o porciones de la misma, fue también clonada dentro de peecFc. El vector peecFc fue ensamblado mediante clonación de la región Fc de la inmunoglobulina humana Gl (IgG) (regiones de bisagra, CH2, CH3) dentro pSecTag2 (Invitrogen, California) . Esta construcción generó una fusión de IgGl Fc en el extremo carboxilo de las proteínas STEAP-l mientras que fusiona la secuencia de señal de IgG? al extremo N. Las fusiones de STEAP-l que utilizan la región Fc de IgGl murina son también utilizadas. Las proteínas STEAP-l recombinantes, resultantes fueron optimizadas para la secreción hacia el medio de las células de mamífero transfectadas, y fueron utilizadas como inmunógenos para identificar las proteínas tales como ligandos o receptores que interactúan con la proteína STEAP-1. La expresión de la proteína es impulsada a partir del promotor de CMV. El gen de resistencia a la higromicina presente en el vector, permitió la selección de células de mamífero que expresan la proteína recombinante, y el gen de resistencia a la ampicilina permite la selección del plásmido en E. coli.
Construcciones de pSRa: Para generar líneas celulares de mamífero que expresan STEAP-l constitutivamente la ORF de STEAP-l o porciones de la misma, de STEAP-l fueron clonadas dentro de las construcciones de PCRa. Los retrovirus anfotrópicos y ecotrópicos fueron generados mediante transfección de las construcciones de pSRa dentro de la línea de empaquetamiento 293T-10A1 o la co-transfección de pSRa y un plásmido cooperador (que contiene las secuencias de empaquetamiento suprimidas) dentro de las células 293, respectivamente. El retrovirus fue utilizado para infectar una variedad de líneas celulares de mamífero, dando como resultado la integración del gen clonado, STEAP-l, dentro de las líneas celulares del hospedero. La expresión de la proteína fue impulsada a partir de una repetición terminal larga (LTR) . El gen de resistencia a la neomicina, presente en el vector, permitió la selección de células de mamífero que expresan la proteína, y el gen de resistencia a la ampicilina y el origen gen y ColEl permiten la selección y el mantenimiento del plásmido en E. coli. Los vectores retrovirales fueron después de esto utilizados para la infección y generación de diversas líneas celulares, utilizando, por ejemplo, las células PC3, NIH 3T3, TsuPrl, 293 o células 1 de rata.. Construcciones adicionales de pSRa son elaboradas, las cuales fusionan un marcador epitópico tal como el marcador FLAGMR al extremo carboxilo de las secuencias STEAP- 1, para permitir la detección utilizando anticuerpo anti- Flag. Por ejemplo, la secuencia de FLAGME 5' gat tac aag gat gac gac gat aag 3' (SEQ ID No: 80) es agregada al cebador de clonación en el extremo 3' de la ORF. Las construcciones adicionales de pSRa, fueron realizadas para producir GFP amino-terminal y carboxilo-terminal y proteínas de fusión myc/6X His de las proteínas STEAP-l de longitud completa.
Vectores Virales Adicionales: Son realizadas construcciones adicionales para la distribución mediada por virus y la expresión de STEAP-l. El alto título viral que conduce al alto nivel de expresión de STEAP-l, es logrado en sistemas de distribución virales, tales como los vectores adenovirales y vectores de amplicón del herpes. Las secuencias de codificación de STEAP-l y fragmentos de las mismas son amplificadas por PCR y subclonados dentro del vector lanzadera AdEasy (Stratagene) . La recombinación y el empaquetamiento del virus fue realizado de acuerdo a las instrucciones del fabricante para generar vectores adenovirales. Alternativamente, las secuencias de codificación de STEAP-l o los fragmentos de las mismas son clonados dentro del vector HSV-1 (Ingenex) para generar vectores virales del herpes. Los vectores virales son después de esto utilizados para la infección de diversas líneas celulares tales como las células PC3, NIH 3T3, 293 o células 1 de rata.
Sistemas de expresión regulados: Para controlar la expresión de STEAP-l en células de mamífero, las secuencias de codificación de STEAP-l o porciones de las mismas, son clonadas dentro de los sistemas de expresión de mamífero y regulados, tales como el sistema T-Rex (Invitrogen) , el sistema GeneSwitch (Invitrogen) y el sistema Ecdysone fuertemente regulado (Sratagene) . Estos sistemas permiten el estudio de los efectos temporales y dependientes de la concentración del STEAP-l recombinante. Estos vectores son posteriormente utilizados para controlar la expresión de STEAP-l en diversas líneas celulares, tales como las células PC3, NIH 3T3, 293 o células 1 de rata.
B. Sistemas de Expresión Baculoviral Para generar proteínas de tipo I recombinantes en un sistema de expresión baculoviral, la ORF de STEAP-l, o porciones de la misma, son clonadas dentro del vector de transferencia de baculovirus pBlueBac 4.5 (Invitrogen), que proporciona un marcador de His en el extremo N. Específicamente, pBlueBac STEAP-l es co-transfectado con el plásmido pBAc-N-Blue auxiliar (Invitrogen) dentro de células de insecto SF9 ( Spodoptera frugiperda ) para generar baculovirus recombinantes (ver el manual de instrucciones de Invitrogen para detalles) . El baculovirus es luego recolectado del sobrenadante celular y purificado mediante ensayo en placa. La proteína STEAP-l recombinante es luego generada mediante infección de las células de insecto HighFive (Invitrogen) con baculovirus purificados. La proteína STEAP-l recombinante puede ser detectada utilizando el anticuerpo anti-STEAP-1 o anti-His-tag . La proteína STEAP-l puede ser purificada y utilizada en diversos ensayos basados en células o como inmunógeno para generar anticuerpos policlonales y monoclonales específicos para STEAP-l.
Ejemplo 9: Perfiles de Antigenicidad y Estructura Secundaria Las figuras 5 (a) -9 (a) y 5(b)-9(b) describen gráficamente cinco perfiles de aminoácidos de las variantes 1 y 3 de STEAP-l respectivamente, cada evaluación disponible mediante el acceso al sitio de la red ProtScale localizado en la Red Mundial (URL. expasy. ch/cgi-bin/protscale. pl) en el servidor de biología molecular Expasy. Estos perfiles: figura 5 (a) y (b) , Hidrofilicidad (Hopp T.P., Woods K.R., 1981. Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 78: 3824-3828); Figura 6 (a) y (b) , Hidropaticidad (Kyte J. , Doolittle R.F., 1982. J. Mol. Biol. 157: 105-132); Figura 7 (a) y (b) , Residuos Accesibles Porcentuales (Janin J. , 1979 Nature 277: 491-492); Figura 8 (a) y (b) , Flexibilidad Promedio (Bhaskaran R. , and Ponnuswamy P.K., 1988. Int. J. Pept. Protein Res. 32: 242-255); Figura 9 (a) y (b) , Vuelta beta (Deleage, G., Roux B. 1987 Protein Engineering 1: 289- 294); y opcionalmente otros disponibles en la técnica tales como en el sitio de la red ProtScale, fueron utilizados para identificar regiones antigénicas de la proteína STEAP-l. Cada uno de los perfiles de aminoácidos anteriores de STEAP-l fueron generados utilizando los siguientes parámetros ProtScale para el análisis: 1) Un tamaño de ventana de 9; 2) peso de 100% de los bordes de ventana comparados al centro de la ventana; y, 3) valores del perfil de aminoácidos normalizados para caer entre 0 y 1. La Hidrofilicidad (Figura 5 (a) y (b) ) , Hidropaticidad (Figura 6 (a) y (b) ) , y perfiles de Residuos Accesibles Porcentuales (Figura 7 (a) y (b) ) fueron usados para determinar los tramos de aminoácidos hidrofílicos (por ejemplo, los valores mayores de 0.5 sobre el perfil de Hidrofilicidad y Residuos Accesibles Porcentuales, y valores menores de 0.5 en el perfil de Hidropaticidad). Es probable que tales regiones sean expuestas al ambiente acuoso, que estén presentes sobre la superficie de la proteína, y de este modo estén disponibles para el reconocimiento inmune, tales como por anticuerpos. Los perfiles de Flexibilidad Promedio (Figura 8 (a) y (b) ) y Vuelta beta (Figura 9 (a) y (b) ) determinan los tramos de aminoácidos (por ejemplo, los valores mayores de 0.5 sobre el perfil de Vuelta beta y el perfil de Flexibilidad Promedio) que no están constreñidos en las estructuras secundarias tales como las láminas beta y las hélices alfa. Es más probable que tales regiones sean expuestas sobre la proteína y de este modo sean accesibles para el reconocimiento inmune, tal como por anticuerpos. Las secuencias antigénicas de la proteína STEAP-l y de las ProtScale variantes indicadas, por ejemplo por los perfiles descritos en la Figura 5 (a) y (b) , Figura 6 (a) y (b) , Figura 7 (a) y (b) , Figura 8 (a) y (b) , y/o Figura 9 (a) y (b) se utilizan para preparar inmunógenos, ya sean péptidos o ácidos nucleicos que los codifican, para generar anticuerpos anti-STEAP-1 terapéuticos y de diagnóstico. El inmunógeno puede ser cualquiera de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50 ó más de 50 aminoácidos contiguos, o los ácidos nucleicos correspondientes que los codifican, a partir de las variantes de la proteína STEAP-l listadas en las Figuras 2 y 3. En particular, los inmunógenos peptídicos de la invención pueden comprender una región peptídica de al menos 5 aminoácidos de las Figuras 2 y 3, en cualquier incremento de números enteros que incluya una posición de aminoácido que tenga un valor mayor de 0.5 en el perfil de Hidrofilicidad de la Figura 5 (a) y (b) ; una región peptídica de al menos 5 aminoácidos de las Figuras 2 y 3, en cualquier incremento de números enteros que incluya una posición de aminoácido que tenga un valor menor de 0.5 en el perfil de Hidropaticidad de la Figura 6 (a) y (b) ; una región peptídica de al menos 5 aminoácidos de las Figuras 2 y 3 en cualquier incremento de números enteros que incluya una posición de aminoácido que tenga un valor mayor de 0.5 en el perfil de Residuos Accesibles Porcentuales de la Figura 7 (a) y (b) ; una región peptídica de al menos 5 aminoácidos de las Figuras 2 y 3, en cualquier incremento de números enteros que incluya una posición de aminoácido que tenga un valor mayor de 0.5 en el perfil de Flexibilidad Promedio en la Figura 8 (a) y (b) ; y, una región peptídica de al menos 5 aminoácidos de las Figuras 2 y 3, en cualquier incremento de números enteros que incluya una posición de aminoácido que tenga un valor mayor de 0.5 en el perfil de Vuelta beta de la Figura 9 (a) y (b) . Los inmunógenos peptídicos de la invención pueden también comprender ácidos nucleicos que codifican para cualquiera de los anteriores. Todos los inmunógenos de la invención, péptidos o ácidos nucleicos, pueden ser ejemplificados en forma de dosis unitaria en humanos, o comprendidos por una composición que incluye un excipiente farmacéutico compatible con la fisiología humana. Las estructuras secundarias de las variantes 1 y 3 de STEAP-l, a saber la presencia predicha y la posición de las hélices alfa, las hebras extendidas, y las hélices aleatorias, son predichas a partir de las secuencias respectivas de aminoácidos primarios utilizando el método de Red Neural Jerárquica HNN (Guermeur, 1997, http: //pbil. ibcp. fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_nn.html) , accedido del servidor de biología molecular Expasy localizado en la Red Mundial (. expasy. ch/tools/) . El análisis indica que la variante 1 de STEAP-l está compuesta de 64.60% de hélice alfa, 4.72% de hebra extendida, y 30.68% de espiral aleatoria (Figura 13a). La variante 2 de STEAP-l está compuesta de 62.79% de hélice alfa, 3.10% de hebra extendida, y 34.11% de espiral aleatoria (Figura 13b). La variante 3 de STEAP-1 está compuesta de 58.87% de hélice alfa, 5.32% de hebra extendida, y 35.82% de espiral aleatoria (Figura 13c). El análisis para • la presencia potencial de los dominios transmembranales en las variantes de STEAP-l, se llevó a cabo utilizando una variedad de algoritmos de predicción transmembranal accedidos del servidor de biología molecular Expasy localizado en la Red Mundial en (. expasy. ch/tools/) . Mostrados gráficamente están los resultados del análisis de la variante 1 que describe la presencia y posición de los 6 dominios transmembranales utilizando el programa TMpred (Figura 13d) y el programa TMHMM (Figura 13e) . También se muestran los resultados del análisis de la variante 2 que describe la presencia y posición de 4 dominios transmembranales utilizando TMpred (Figura 13f) y 3 dominios transmembranales utilizando TMHMM (Figura 13g) . El análisis de la variante 3 predice la presencia de 4 dominios transmembranales utilizando TMpred (Figura 13h) y 3 dominios transmembranales con TMHMM (figura 13i) . Los resultados de cada programa, a saber los aminoácidos que codifican para los dominios transmembranales son resumidos en la Tabla XX.
Ejemplo 10: Generación de Anticuerpos Policlonales para STEAP-l Los anticuerpos policlonales pueden ser producidos en un mamífero, por ejemplo, mediante una o más inyecciones de un agente de inmunización y, si se desea, un adyuvante. Típicamente, el agente de inmunización y/o el adyuvante serán inyectados en el mamífero mediante múltiples inyecciones subcutáneas o intraperitoneales. Además de la inmunización con una variante de la proteína STEAP-l de longitud completa, se emplean algoritmos de computadora en el diseño de los inmunógenos que, con base en el análisis de la secuencia de aminoácidos contienen características de ser antigénicos y disponibles para el reconocimiento por el sistema inmune del hospedero inmunizado (ver el Ejemplo titulado "Perfiles de Antigenicidad y Estructura Secundaria") . Tales regiones podrían ser predichas como hidrofílicas, flexibles, en conformaciones de vuelta o bucle delta, y ser expuestas sobre la superficie de la proteína (ver, por ejemplo, Figura 5 (a) y (b) , Figura 6 (a) y (b) , Figura 7 (a) y (b) , Figura 8 (a) y (b) , y/o Figura 9 (a) y (b) para los perfiles de aminoácidos que indican tales regiones de las variantes 1 y 3 de la proteína STEAP-l. Por ejemplo, las proteínas de fusión bacterianas recombinantes o los péptidos que contienen regiones de vuelta beta, flexibles, hidrofílicas de las variantes de la proteína STEAP-l, se utilizan como antígenos para generar anticuerpos policlonales en conejos blancos New Zealand o anticuerpos monoclonales como se describe en el ejemplo titulado ("Generación de Anticuerpos Monoclonales de STEAP-l (Mabs) ) .
Por ejemplo, tales regiones incluyen, pero no están limitadas a, los aminoácidos 1-40, los aminoácidos 143-165, los aminoácidos 180-220, de las variantes 1, 2 y 3 de STEAP-l, los aminoácidos 312-339 de la variante 1 de STEAP-l, y los -aminoácidos 250-282 de la variante 3 de STEAP-l. Es útil conjugar el agente de inmunización a una proteína que se sabe que es inmunogénica en el mamífero que es inmunizado. Los ejemplos de tales proteínas inmunogénicas incluyen, pero no están limitados a, hemocianina de lapa en forma de hoyo de cerradura (KLH) , albúmina sérica, tiroglobulina bovina, e inhibidor de tripsina de soya. En una modalidad, un péptido que codifica para los aminoácidos 250-282 de la variante 3 de STEAP-l, es conjugado a KLH. Este péptido es luego utilizado como inmunógeno. Alternativamente, el agente de inmunización puede incluir todas o porciones de las proteínas variantes de STEAP-l, los análogos o las proteínas de fusión de las mismas. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de la variante 1 de STEAP-l puede ser fusionada utilizando técnicas de DNA recombinantes para cualquiera de una variedad de socios de las proteínas de fusión que son bien conocidos en la técnica, tales como la glutatión-S-transferasa (GST) y las proteínas de fusión marcadas con HIS. En otra modalidad más, los aminoácidos 250-282 de la variante 1 de STEAP-l se fusionan a GST utilizando técnicas recombinantes y el vector de expresión pGEX, expresado, purificado y utilizado para inmunizar un conejo. Tales proteínas de fusión son purificadas a partir de bacterias inducidas utilizando la matriz de afinidad apropiada. Otras proteínas de fusión recombinantes que pueden ser empleadas incluyen la proteína de enlace a la maltosa, LacZ, tiorredoxina, NusA, o una región constante de inmunoglobulina (ver la sección titulada "Producción de STEAP-l en Sistemas Procarióticos" y Current Protocols In Molecular Biology, Volumen 2, Unidad 16, Frederick M. Ausubul et al . Eds., 1995; Linsley, P.S., Brady, W. , Urnes, M. , Grosmaire, L., Damle, N., and Ledbetter, L. (1991) J. Exp. Med. 174, 561-566) . Además de las proteínas de fusión derivadas de bacterias, también se usan los antígenos proteicos expresados en mamíferos.' Estos antígenos son expresados a partir de vectores de expresión de mamífero tales como los vectores de fusión a Taq5 y a Fc (ver la sección titulada "Producción de STEAP-l Recombinante en Sistemas Eucarióticos") , y conservan las modificaciones post-traduccionales tales como las glucosilaciones encontradas en la proteína nativa. En una modalidad, los aminoácidos 185-218 de la variante 1 de STEAP- 1 fueron clonados dentro del vector de secreción de mamífero Taq5 y expresados en células 293T. La proteína recombinante fue purificada mediante cromatografía de quelato metálico a partir de los sobrenadantes de cultivo de tejidos de las células 293T que expresan establemente el vector recombinante. La proteína variante 1 de STEAP-l de Taq 5, purificada es luego utilizada como inmunógeno. Durante el protocolo de inmunización, es útil mezclar o emulsificar el antígeno en adyuvantes que aumentan la respuesta inmune del animal hospedero. Los ejemplos de adyuvantes incluyen, pero no están limitados a, adyuvante completo de Freund (CFA) y adyuvante MPL-TDM (monofosforil-Lípido A, dicorinomicolato de trehalosa sintético) . En un protocolo típico, los conejos son inicialmente inmunizados subcutáneamente con hasta 200 µg, típicamente 100 a 200 µg, de la proteína de fusión o el péptido conjugado a KLH mezclado en el adyuvante completo de Freund (CFA). Los conejos son luego inyectados subcutáneamente cada dos semanas con hasta 200 µg, típicamente de 100 a 200 µg, del inmunógeno en el adyuvante incompleto de Freund (IFA) . Los sangrados de prueba son tomados aproximadamente a los 7-10 días después de cada inmunización y son utilizados para monitorizar el título del antisuero por ELISA. Para probar la reactividad y la especificidad del suero inmune, tal como el suero de conejo derivado de la inmunización con la fusión GST de la proteína variante 1 de STEAP-l, el cDNA de la variante 1 de STEAP-l de longitud completa, es clonado dentro del vector de expresión myc-his de pCDNA 3.1 (Invitrogen, ver el Ejemplo titulado "Producción de STEAP-l Recombinante en Sistemas Eucarióticos") . Después de la transfección de las construcciones dentro de las células 293T, los lisados celulares son sondeados con el suero anti-STEAP-1 y con el anticuerpo anti-His (Santa Cruz Biotechnologies, Santa Cruz, CA) para determinar la reactividad específica a la proteína STEAP-1 desnaturalizada utilizando la técnica de Western blot. Además, el suero inmune es probado mediante espectroscopia de fluorescencia, citometría de flujo e inmunoprecipitación contra 293T y otras células que expresan STEAP-1 recombinante, para determinar el reconocimiento específico de la proteína nativa. Las técnicas de Western blot, inmunoprecipitación, microscopía fluorescente y citometría de flujo utilizando las células que expresan endógenamente STEAP-l, también se llevan a cabo para 'probar la reactividad y la especificidad. El antisuero proveniente de conejos inmunizados con las proteínas de fusión variantes de STEAP-l, tales como las proteínas de fusión GST y MBP, son purificados mediante agotamiento de los anticuerpos reactivos a la secuencia del socio de fusión, mediante pase sobre una columna de afinidad que contiene el socio de fusión, ya sea solo o en el contexto de una proteína de fusión irrelevante. Por ejemplo, el antisuero derivado de una proteína de fusión GST-STEAP-1 variante 1, es primeramente purificado mediante el paso sobre una columna de la proteína GST covalentemente acoplada a la matriz AffiGel (BioRad, Hercules, Calif.). El antisuero es luego purificado por afinidad mediante el paso sobre una columna compuesta de una proteína de fusión MBP-STEAP-1 covalentemente acoplada a la matriz Affigel . El suero es luego adicionalmente purificado mediante cromatografía de afinidad de proteína G para aislar la fracción de IgG. Los sueros provenientes de otros antígenos marcados con His y los conejos inmunizados con el péptido, así como los sueros agotados del socio de fusión, son purificados por afinidad mediante el paso sobre una matriz de columna compuesta del inmunógeno de la proteína original, o el péptido libre.
Ejemplo 11: Generación de los Anticuerpos Monoclonales (MAbs) para STEAP-l En una modalidad, los MAbs terapéuticos para las variantes de STEAP-1 comprenden aquellos que reaccionan con los epitopos específicos para cada proteína variante o específicos para las secuencias en común entre las variantes que podrían enlazarse, internalizarse, perturbar o modular la función biológica de las variantes de STEAP-l, por ejemplo aquéllas que podrían perturbar la interacción con los ligandos y los socios de enlace. Los inmunógenos para la generación de tales MAbs incluyen aquellos diseñados para codificar o contener el dominio extracelular o la secuencia variante de la proteína STEAP-l completa, regiones predichas para contener porciones funcionales, y regiones de las variantes de la proteína STEAP-l, que se predice son antigénicas a partir del análisis en computadora de la secuencia de aminoácidos (ver por ejemplo, Figura 5(a)-(b), Figura 6(a)-(b), Figura 7 (a) - (b) , Figura 8(a)-(b), o Figura 9 (a) - (b) , y el Ejemplo titulado "Perfiles de Antigenicidad y Estructura Secundaria") . Los inmunógenos incluyen péptidos, proteínas bacterianas recombinantes, y proteínas Taq 5 expresadas en mamífero y proteínas de fusión de IgG FC humanas y murinas. Además, la proteína pTAG5, los vectores de DNA que codifican para las células pTAG5 manipuladas por ingeniería para expresar altos niveles de una variante de STEAP-l respectiva, tal como la variante 1 de 293T-STEAP-1 o las células 3T3, RAT, o las células Pre-B murinas de la variante 1 de STEAP-1-300.19, se utilizan para inmunizar ratones . Para generar los MAbs para las variantes de STEAP- 1, los ratones son primeramente inmunizados intraperitonealmente (IP) o en la almohadilla de la pata con, típicamente, 10-50 µg de inmunógeno proteico o 107 células que expresan STEAP-l mezcladas en el adyuvante completo de Freund. Los ejemplos de otros adyuvantes utilizados son Titermax (Sigma) e Immuneasy (Qiagen) . Los ratones son subsecuentemente inmunizados IP cada 2 a 4 semanas con, típicamente, 10-50 µg de inmunógeno proteico o 107 células mezcladas en el adyuvante incompleto de Freund. Alternativamente, el adyuvante MPL-TDM se utiliza en las inmunizaciones. Además de la proteína anterior y de las estrategias de inmunización basadas en células, se emplea un protocolo de inmunización basado en DNA en el cual un vector de expresión de mamífero que codifica para una secuencia variante de STEAP-l, se utiliza para inmunizar ratones mediante inyección directa del DNA plásmido. Por ejemplo, los aminoácidos 185-218 de variante 1 de STEAP-1, fueron clonados dentro del vector de secreción de mamífero Tag5 y el vector recombinante fue utilizado como el inmunógeno. En otro ejemplo más, los mismos aminoácidos fueron clonados dentro de un vector de secreción de la fusión con Fc, en el cual se fusiona la secuencia de la variante 1 de STEAP-1 en el extremo amino a una secuencia guía de IgK y en el extremo carboxilo a la secuencia de codificación de la región Fc de IgG humana o murina. Este vector recombinante fue luego utilizado como el inmunógeno. Fueron utilizados los protocolos de inmunización de plásmidos en combinación con las proteínas purificadas expresadas a partir del mismo vector, y con las células que expresan la variante de STEAP-l respectiva. En otro ejemplo más, un anticuerpo monoclonal para la variante 3 de STEAP-l es generado mediante el uso de un péptido que codifica para los aminoácidos 250-282. El péptido es conjugado a KLH y utilizado como el inmunógeno. La ELISA sobre el péptido libre es utilizada para identificar los clones inmunorreactivos. La reactividad y la especificidad de los anticuerpos monoclonales para la proteína variante 1 de STEAP-l de longitud completa, es monitorizada mediante transferencia de Western (Western blot) , inmunoprecipitación, y citometría de flujo utilizando las células de la variante 1 de STEAP-l de expresión recombinante y endógena. . Durante el protocolo de inmunización, sangrados de prueba son tomados 7-10 días después de una inyección, para monitorizar el título y la especificidad de la respuesta inmune. Una vez que es obtenida la reactividad y la especificidad apropiadas, como se determina mediante ELISA, Western blot, inmunoprecipitación, microscopía de fluorescencia, y análisis citométricos de flujo, la fusión y la generación de hibridoma es luego llevada a cabo con procedimientos establecidos bien conocidos en la técnica (ver por ejemplo, Harlow and Lañe, 1988) . La afinidad de enlace de los anticuerpos monoclonales específicos de la variante 1 de STEAP-l fue determinada utilizando tecnologías estándares. Las mediciones de afinidad cuantifican la fuerza del enlace del anticuerpo al epitopo, y se utilizan para ayudar a definir cuáles anticuerpos monoclonales de la variante de STEAP-l son preferidos para utilizarse con fines de diagnóstico o terapéuticos, como es apreciado por una persona experta en la técnica. El sistema BIAcore (Uppsala, Suecia) es un método preferido para determinar la afinidad de enlace. El sistema BIAcore utiliza la resonancia de plasmón superficial (SPR, Welford K. 1991, Opt. Quant . Elect. 23:1; Morton and Myszka, 1998, Methods in Enzymology 295: 268) para monitorizar interacciones biomoleculares en tiempo real. El análisis BIAcore genera convenientemente constantes de la velocidad de asociación, constantes de la velocidad de disociación, constantes de la disociación en el equilibrio, y constantes de afinidad. Para generar anticuerpos monoclonales específicos para otras variantes de STEAP-l, son diseñados los inmunógenos para codificar las secuencias de aminoácidos únicas para las variantes. En una modalidad, un péptido que codifica para aminoácidos únicos para las variantes de STEAP- 1 son sintetizados, acoplados a KLH, y utilizados como el inmunógeno. En otra modalidad más, los péptidos o las proteínas de fusión bacterianas son elaborados, los cuales abarcan la secuencia única generada por el empalme alternativo en las variantes. Los hibridomas son, luego seleccionados, los cuales reconocen el antígeno específico de la variante, respectivo, y también reconocen la proteína variante de longitud completa expresada en las células. Tal selección utiliza los inmunoensayos descritos anteriormente, tales como el Western blot, la inmunoprecipitación, y la citometría de flujo. ' En una modalidad, la invención proporciona los anticuerpos monoclonales designados X92.1.30.1.1 (1) (a.k.a. M2/92.30) y X120.545.1.1 (a.k.a. M2.120.545). M2/92.30 y M2/120.545 fueron identificados y se muestra que reaccionan y se enlazan con STEAP-l de la superficie celular (ver Figuras 15 y 18). La Figura 16 muestra que el Mab M2/92.30 anti-STEAP-l se enlaza al STEAP-l endógeno de la superficie celular, expresado en células de xenoinjerto de cáncer de vejiga y de próstata. Adicionalmente, M2/92.30 reacciona y se enlaza con STEAP-l murino como se muestra en la Figura 17. Los anticuerpos designados X92.1.30.1.1 (1) (a.k.a.
M2/92.30) y X120.545.1.1 (a.k.a. M2.120.545) fueron enviados (vía Federal Express) a la American Type Culture Collection (ATCC), P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108 el 6 de Febrero de 2004 y se les asignaron los números de Acceso PTA-5802 y PTA- 5803 respectivamente. Para clonar los anticuerpos M2/X92.30 y M2/X120.545 fueron utilizados los siguientes protocolos. Células hibridoma fueron usadas con el reactivo de Trizol (Life Technologies, Gíbco BRL) . El RNA total fue purificado y cuantificado . Los cDNAs de primera hebra fueron generados a partir de RNA total con aprestamiento con el oligo (dT) 12-18, utilizando el sistema de Preamplificación de Gibco-BRL Superscript. Los productos de PCR fueron clonados dentro del vector de pCRScript (Stratagene, La Jolla) . Varios clones fueron secuenciados y se determinaron las regiones de cadena pesada variable ("VH") y de cadena ligera variable ("VL") . Las secuencias de ácido nucleico y de aminoácidos de las regiones de cadena pesada y ligera variables de M2/X92.30 y M2/X120.545 son listadas en las Figuras 19 (a) -19 (d) y en la Figura 20 (a)-(e) .
Ejemplo 12: Caracterización de los Anticuerpos para STEAP-l A. Enlace a la Superficie Celular La reactividad de los anticuerpos para STEAP-l con una proteína relacionada a STEAP-l, puede ser establecida mediante un número de medios bien conocidos, incluyendo Western blot, inmunoprecípítación, ELISA y análisis de FACS utilizando, como sea apropiado, proteínas relacionadas a STEAP-l, células que expresan STEAP-l, o extractos de las mismas. Como se muestra en la Figura 15, el análisis de FACS de las células 3T3 y Rat-1 recombinantes que expresan establemente STEAP-l o un control teñido con el MAb M2/92.30 anti-STEAP (10 µg/ml) y el MAb enlazado a la superficie celular, fue detectado con un reactivo secundario conjugado de PE-IgG de cabra anti-ratón. Las células teñidas fueron luego sometidas a análisis de FACS. Como se indica por el desplazamiento fluorescente de las células Rat-1-STEAPl y 3T3-STEAP1 en comparación a las células control respectivas, M2/92.30 se enlaza específicamente a STEAP1 de la superficie celular. Además, cuando las células de cáncer de vejiga UGB1 y las células de cáncer de próstata LAPC9 fueron teñidas con 10 µg/ml ya sea del MAb M2/92.30 o con el MAb anti-KLH control. El MAb 92.30 enlazado a la superficie fue detectado con el anticuerpo secundario conjugado de PE-IgG de cabra anti-ratón. Las células teñidas fueron luego sometidas a análisis de FACS. Estos resultados demuestran que el MAb M2/92.30 anti-STEAPl, se enlaza específicamente al STEAP1 endógeno de la superficie celular, expresado en células de xenoinjerto de cáncer de vejiga y de próstata (Figura 21) .
El M2/92.30 de STEAP-l muestra también que se enlaza a la proteína murina STEAP-l (ver Figura 17) . En este experimento, las células 293T fueron transitoriamente transfectadas ya sea con el Pcdna3.1 que codifica para el cDNA de STEAP1 murino, o con un vector vacío. 48 horas más tarde, las células fueron cosechadas y teñidas con un MAb M2/92.30 anti-STEAPl (10 µg/ml) y el MAb 92.30 enlazado a la superficie celular fue detectado con un reactivo secundario conjugado de PE-IgG de cabra anti-ratón. Las células fueron luego sometidas a análisis de FACS. M2/92.30 de STEAP-l mostró que se enlaza específicamente a las células 293T que expresan STEAP-l. Se muestra también que M2/120.545 de STEAP-l se enlaza específicamente a STEAP-l (ver Figura 18). Las células 3T3-neo (Panel A, histogramas rellenos) y 3T3-STEAP1 (Panel A, histogramas sin relleno) y las células Ratl-neo (Panel B, histogramas rellenos) y Ratl-STEAP (Panel B, histogramas sin relleno) fueron teñidas con el MAb M2/120.545 (10 µg/ml) y el MAb enlazado a la superficie fue detectado con el anticuerpo secundario conjugado de PE-IgG de cabra anti-ratón. Las células fueron luego sometidas a análisis de FACS. Como se indica por el desplazamiento de fluorescencia de las células 3T3-STEAP1 y Ratl-STEAPl comparadas a sus respectivos controles neo, el MAb M2/120.545 se enlaza específicamente a STEAP1 de la superficie celular. En el Panel C, las células LNCaP fueron teñidas ya sea con el MAb M2/120.545 o con un MAb anti-KLH control, y sometidas a análisis de FACS como se describe anteriormente. En el Panel D, la microscopía de fluorescencia del M2/120.545 tiñó las células LNCaP mostrando una fluorescencia superficial brillante de las células. La reactividad y la especificidad de M2/92.30 y M2/120.545 fueron también determinadas mediante inmunoprecipitación. La Figura 25 muestra las células 3T3-STEAPl y 3T3-neo que fueron Usadas en amortiguador RIPA (Tris-Cl 25 mM, pH 7.4; NaCl 150 mM, EDTA 0.5 mM, 1% de Tritón X-100, 0.5% de ácido desoxicólico, 0.1% de SDS, y cóctel inhibidor de proteasa) . Los lisados celulares fueron preaclarados con esferas de sefarosa con proteína G y luego incubados con 5 µg del MAb M2/92.30 o el M2/120.545 por 2 horas a temperatura ambiente. Las esferas de proteína G fueron agregadas y la mezcla fue adicionalmente incubada por 1 hora. Los complejos inmunes fueron lavados y solubilizados en amortiguador de muestra SDS-PAGE. Las muestras solubilizadas fueron luego sometidas a SDS-PAGE y el análisis de Western blot utilizando un pAb de conejo anti-STEAP. Los lisados celulares completos de las células 293T transfectadas con STEAP1 fueron también corridos como un control positivo. Una banda inmunorreactiva de aproximadamente 37 kD fue observada únicamente en las muestras derivadas de las células 3T3-STEAP1, indicador de la inmunoprecipitación específica de STEAP1 por los MAbs M2/92.30 y M2/120.545.
B. Internalización del Anticuerpo de STEAP-l La inmunoterapia basada en la distribución de toxinas hacia los objetivos celulares específicos utilizando anticuerpos monoclonales, es considerada una modalidad en la terapia de malignidades. El principio general es la distribución de toxinas o fármacos antineoplásicos a las células cancerosas que se enlazan a los antígenos o receptores que son ya sea únicamente expresados o sobreexpresados sobre las células objetivo con relación a los tejidos normales. Las inmunotoxinas consisten de ligandos selectivos de las células (usualmente anticuerpos monoclonales o citocinas) enlazados covalentemente a las toxinas. La interacción del anticuerpo o el ligando con los receptores de la superficie celular dispara la internalización. En los compartimientos de vesículas intracelulares definidas, la porción de la toxina escapa al citosol, donde éste altera catalíticamente las funciones celulares críticas que conducen a la muerte celular. ' Ver, Frankel AE., Increased Sophistication of Immunotoxins, Clinical cáncer research 8: 942-944, (2002) y Alien TM, Ligand-Targeted Therapeutics in Anti-cancer Therapy. Nature Reviews . 2:750-760, (2002).
La saporina es una proteína de inactivación del ribosoma (RIP) que cataliza la despurinación in vitro de un residuo de adenina específico en los RNAs ribosomales grandes. EndoY, et. al., Mechanism of Action of the Toxin Lectin Ricin on Eukaryotic Cells; The Site and Characteristics of the Modification in 28S RNA Caused by the Toxin, J. Biol . Chem . 262,5908-5912 , (1987). Éste usualmente no puede entrar a las células a no ser que sea formado en complejo a una molécula portadora apropiada. La conjugación covalente de la saporina a los anticuerpos monoclonales que reconocen los antígenos tumorales, produce inmunotoxinas que poseen selectividad de células cancerosas y son internalizadas. Ver, Flavell, DJ, Sapoin Immunotoxins, Curr. Top. Microbiol . Immunol . 234: 51-61, (1998) and Flavell DJ, et. al., Therapy of Human T-cell Acute Lymphoblastic Leukemia with a Combination of Anti-CD7 and Anti-CD38-Saporin Immunotoxins is Significantly Better than Therapy with Each Individual Immunotoxins . Br. J. Cáncer -84: 571-578, (2001). Estas moléculas han entrado recientemente a las pruebas clínicas de fase I para leucemia y mieloma múltiple. Foon KA. Monoclonal Antibody Therapies for Lymohomas . Cáncer J. 6: 273-278, (2000). La internalización de M2/92.30 de STEAP-l es mostrada en la Figura 22. En este experimento, las células PC3-STEAP1 fueron teñidas a 4°C con el MAb M2/120.545 (10 µg/ml) , lavadas, luego incubadas con el anticuerpo secundario conjugado de PE-IgG de cabra anti-ratón. La mitad de las células fueron movidas a 37 °C por 30 minutos y la otra mitad permaneció a 4°C. Las células de cada tratamiento fueron luego sometidas a microscopía fluorescente. Las células que permanecieron a 4°C mostraron tinción brillante sobre la circunferencia de la superficie celular. Las células que fueron movidas a 37 °C mostraron pérdida de la tinción sobre la circunferencia de la célula y la aparición de fluorescencia punteada y agregada indicadora del encasquetamiento y la internalización. La internalización de STEAP-l por el MAb M2/120.545 de STEAP1 se muestra en la Figura 23. Las células PC3-STEAP1 fueron teñidas a 4°C con MAb M2/120.545 (10 µg/ml), lavadas, luego incubadas con el anticuerpo secundario de PE-IgG de cabra anti-ratón. La mitad de las células fueron movidas a 37 °C por 30 minutos y la otra mitad permaneció a 4°C. Las células de cada tratamiento fueron luego sometidas a microscopía fluorescente. Las células que permanecieron a 4°C mostraron fluorescencia de la superficie de la célula brillante, en forma de anillo. Las células que fueron movidas a 37 °C mostraron pérdida de la fluorescencia de la superficie celular "en forma de anillo" y la aparición de fluorescencia punteada y agregada, indicadora del encasquetamiento y la internalización.
Un procedimiento para seleccionar anticuerpos candidatos apropiados para la distribución de inmunotoxina, emplea la muerte con un anticuerpo secundario conjugado con un fármaco o molécula de toxina. El anticuerpo conjugado secundario se incrusta sobre el anticuerpo primario, permitiendo la evaluación del anticuerpo primario para internalizarse y el tráfico a los compartimientos intracelulares apropiados. Una vez que el conjugado se internaliza, la saporina se suelta del agente de dirección al objetivo, e inactiva los ribosomas para eliminar las células objetivo. Kohls MD and Lappi DA. MAb-ZAP: A Tool for Evaluating Antibody Effícacy for Use in an Immunotoxin. Bio Techniques. 28(1): 162-165 (2000). Para seleccionar el anticuerpo candidato apropiado utilizando el procedimiento anterior, se utilizó una inmunotoxina secundaria, los conjugados de saporína-IgG antiratón (Advanced Targeting Systems, San Diego, CA) para demostrar que el M2/120.545 de STEAP-l murino entra a las células diana por medio de la expresión de STEAP-l sobre la superficie celular de la célula LNCap. Se utilizaron los siguientes protocolos. Las células LNCap fueron sembradas en placa a 5000 células/90 µl/pozo en una placa de 96 pozos, y se incubaron toda la noche. Los conjugados de segunda inmunotoxina (saporina-IgG anti-ratón y saporina-IgG anti-cabra) y la IgG anti-ratón fueron elaborados en el medio celular que contenía la concentración final de 100 ng/ml. Se agregaron 10 µl a cada pozo. El anticuerpo primario se agrega a la concentración de 1-1000 ng/ml. Las placas fueron incubadas 72 horas y la viabilidad fue determinada mediante el ensayo MTT. Los resultados en la Figura 24 muestran que las células LNCaP fueron muertas en presencia de saporina-IgG anti-ratón. No fueron detectados efectos con el anticuerpo secundario solo (IgG anti-ratón) o los conjugados de anticuerpos secundarios no específicos (saporina-IgG anti- cabra) . No se observó toxicidad con el anticuerpo primario (M2/120.545) solo, probado hasta 1 µg/ml.
Ejemplo 13: Ensayos de Enlace de HLA de la Clase I y Clase II Los ensayos de enlace de HLA de la clase I y la clase II utilizando moléculas de HLA purificadas, son realizados de acuerdo con los protocolos descritos por ejemplo, publicaciones de PCT WO 94/20127 y WO 94/03205; Sidney et al . , Current Protocols in Immunology 18.3.1 (1998); Sidney, et al . , J. Immunol . 154:247 (1995); Sette, et al . , Mol. Immunol. 31:813 (1994)). En resumen, las moléculas purificadas de MHC (de 5 a 500 nM) son incubadas con varios inhibidores peptídicos no marcados y los péptídos de la sonda radiomarcada con 125I, 1-10 nM, como se describe. Después de la incubación, los complejos MHC-péptido son separados del péptido libre mediante filtración en gel y la fracción del péptido es determinada. Típicamente, en experimentos preliminares, cada preparación de MHC es titulada en presencia de cantidades fijas de los péptidos radiomarcados, para determinar la concentración de las moléculas de HLA necesarias para enlazar 10-20% de la radioactividad total. Toda la inhibición subsiguiente y los ensayos de enlace directo son realizados utilizando estas concentraciones de HLA. Ya que bajo estas condiciones [marcador] < [HLA] e IC50>HLA, los valores de IC5o medidos son aproximaciones razonables de los valores de KD verdaderos. Los inhibidores peptídicos son típicamente probados a concentraciones en el intervalo de 120 µg/ml hasta 1.2 ng/ml, y son probados en dos a cuatro experimentos completamente independientes. Para permitir la comparación de los datos obtenidos en diferentes experimentos, se calcula una cifra de enlace relativo para cada péptido al dividir el IC5o de un control positivo para la inhibición por el IC50 para cada péptido probado (versiones típicamente no marcadas del péptido de la sonda radiomarcada) . Para fines de bases de datos, y comparaciones interexperimentos, son recopilados los valores de enlace relativo. Estos valores pueden ser subsecuentemente convertidos nuevamente a valores de IC50 nM al dividir el IC50 nM de los controles positivos para la inhibición entre el enlace relativo del péptido de interés. Este método de recopilación de datos es preciso y consistente para comparar los péptidos que han sido probados en diferentes días, o con diferentes lotes de MHC. Los ensayos de enlace como se describen anteriormente, pueden ser utilizados para analizar la superporción de HLA y/o los péptidos que poseen la porción HLA (ver Tabla IV) .
Ejemplo 14: Construcción de los Plásmidos de ADN Multiepitópicos del "Minigen" Este ejemplo discute la construcción de un plásmido de expresión de minígen. Los plásmidos de minigen pueden, por supuesto, contener varias configuraciones de epitopos de células B, de CTL y/o HTL o análogos de epitopos como se describe en la presente. Un plásmido de expresión de minigen incluye típicamente múltiples epitopos de péptido CTL y HTL. En el presente ejemplo, los epitopos peptídicos que poseen la superporción HLA-A2, -A3, -B7 y los epitopos de péptidos que poseen las porciones HLA-Al y -A24, se utilizan en conjunto con los epitopos que poseen la superporción DR y/o los epitopos DR3. Los epitopos peptídicos que poseen la porción o la superporción HLA de la clase I derivados de STEAP-1, se seleccionan tal que múltiples superporciones/porciones son representadas para asegurar la amplia cobertura de población.
Similarmente, los epitopos HLA de la clase II son seleccionados a partir de STEAP-l para proporcionar amplia cobertura de población, por ejemplo los epitopos que poseen la superporción HLA DR-1-4-7 y los epitopos que poseen la porción HLA DR-3, son seleccionados para la inclusión en la construcción del minigen. Los epitopos CTL y HTL seleccionados son luego incorporados dentro de un mínigen para la expresión en un vector de expresión. Tal construcción puede incluir adicionalmente las secuencias que dirigen los epitopos de HTL al retículo endoplásmíco. Por ejemplo, la proteína li puede ser fusionada a uno o más epitopos de HTL como se describe en la técnica, en donde la secuencia CLIP de la proteína li es retirada y reemplazada con una secuencia de epitopo HLA de la clase II, de modo que el epitopo HLA de clase II es dirigido al retículo endoplásmico, donde el epitopo se enlaza a una de las moléculas HLA de la clase II. Este ejemplo ilustra los métodos que van a ser usados para la construcción de un plásmido de expresión que posee el minigen. Otros vectores de expresión que pueden ser utilizados para las composiciones de minigen son disponibles y conocidos por aquellos expertos en la técnica. El plásmido de DNA del minigen de este ejemplo contiene una secuencia Kozak de consenso y una secuencia de señal de cadena ligera de Ig kappa murina, de consenso, seguida por los epitopos CTL y/o HTL seleccionados de acuerdo con los principios descritos en la presente. La secuencia codifica para una estructura de lectura abierta fusionada al marcador epitópico del anticuerpo Myc y His, codificado por el vector Myc-His del pcDNA 3.1. Los oligonucleótidos traslapados que pueden, por ejemplo, promediar aproximadamente 70 nucleótidos de longitud con 15 nucleótidos traslapados, son sintetizados y purificados por HPLC. Los oligonucleótidos codifican para los epitopos peptídicos seleccionados, así como para los nucleótidos ligadores apropiados, la secuencia Kozak, y la secuencia de señal. El minigen multiepitópico final es ensamblado por extensión de los oligonucleótidos traslapados, en tres grupos de reacciones utilizando PCR. Una máquina de PCR Perkin/Elmer 9600 es utilizada, y se realizan un total de 30 ciclos utilizando las siguientes condiciones: 95°C por 15 segundos, temperatura de recocido (5o por debajo de la Tm calculada más baja de cada par de cebadores) por 30 segundos, y 72 °C por 1 minuto. Por ejemplo, es preparado como sigue un minigen.
Para una primera reacción de PCR, 5 µg de cada uno de los dos oligonucleótidos son recocidos y extendidos: En un ejemplo utilizando ocho oligonucleótidos, por ejemplo, cuatro pares de cebadores, los oligonucleótidos 1+2, 3+4, 5+6, y 7+8 son combinados en reacciones de 100 µl que contienen el amortiguador de polimerasa Pfu (Ix = KCl 10 mM, (NH4)2S04 10 mM, Tris-cloruro 20 mM, pH 8.75, sulfato de magnesio 12 mM, Tritón X-100 al 0.1%, 100 µg/ml de BSA), 0.25 de cada dNTP, y 2.5 U de la polimerasa Pfu . Los productos diméricos de longitud completa son purificados en gel, y dos reacciones que contienen el producto de 1+2 y 3+4, y el producto de 5+6 y 7+8 son mezclados, recocidos, y extendidos por 10 ciclos. La mitad de las reacciones es luego mezclada, y se llevan a cabo 5 ciclos de recocido y extensión antes de que los cebadores flanqueantes sean agregados para amplificar el producto de longitud completa. El producto de longitud completa es purificado en gel y clonado dentro de pCR-blunt (romo) (Invitrogen) y los clones individuales son seleccionados mediante secuenciamiento.
Ejemplo 15: La Construcción del Plásmido y el Grado al Cual Éste Induce la Inmunogenicidad El grado al cual una construcción plasmídica, por ejemplo un plásmido construido de acuerdo con el Ejemplo previo, es capaz de inducir inmunogenicidad, es confirmado in vi tro por la determinación de la presentación del epitopo por APC después de la transducción o transfección del APC con una construcción de ácido nucleico que expresa el epitopo. Tal estudio determina la "antigenicidad" y permite el uso de APC humano. El ensayo determina la habilidad del epitopo para ser presentado por el APC en un contexto que es reconocido por una célula T mediante la cuantificación de la densidad de los complejos epitopo-HLA clase I, sobre la superficie celular. La cuantificación puede ser realizada midiendo directamente la cantidad del péptido eluido del APC (ver, por ejemplo, Sijts et al . , J. Immunol . 156:683-692, 1996; Demotz et al . , Nature 342:682-684, 1989); o el número de complejos péptido-HLA clase I puede ser estimado al medir la cantidad de lisis o la liberación de linfocina inducida por las células objetivo enfermas o transfectadas, y luego determinando la concentración del péptido, necesaria para obtener niveles equivalentes de lisis o liberación de linfocina (ver, por ejemplo, Kageyama et al . , J. Immunol . 154:567-576, 1995) . Alternativamente, la inmunogenicidad es confirmada a través de inyecciones ín vivo en ratones, y la evaluación in vitro subsecuente de la actividad de CTL y HTL, que son analizadas utilizando ensayos de citotoxicidad y proliferación, respectivamente, como se detalla por ejemplo en Alexander et al . , Immuni ty 1:751-761, 1994. Por ejemplo, para confirmar la capacidad de una construcción de minigen de DNA que contiene al menos un péptido de superporción de HLA-A2 para inducir CTLs in vivo, ratones transgénicos HLA-A2.1/Kb, por ejemplo, son inmunizados intramuscularmente con 100 µg del cDNA desnudo.
Como un medio para comparar el nivel de CTLs inducidos por la inmunización con cDNA, un grupo control de animales es también inmunizado con una composición del péptido efectiva, que contiene múltiples epitopos sintetizados como un polipéptido simple, como éstos serían codificados por el minigen. Los esplenocitos provenientes de anímales inmunizados son estimulados dos veces con cada una de las composiciones respectivas (epitopos peptídicos codificados en el minigen o el péptido poliepitópico) , luego evaluados para la actividad citotóxica específica del péptido, en un ensayo de liberación de 51Cr. Los resultados indican la magnitud de la respuesta de CTL dirigida contra el epitopo restringido a A2, indicando de este modo la inmunogenicidad in vivo de la vacuna del minigen y la vacuna poliepitópica. Por lo tanto, se encuentra que el minigen promueve respuestas inmunes dirigidas hacia los epitopos peptídicos de la superporción HLA-A2 como lo hace la vacuna peptídica poliepitópica. Un análisis similar es también realizado utilizando otros modelos de ratón transgénico HLA-A3 y HLA-B7, para evaluar la inducción de CTL por la porción HLA-A3 y HLA-B7 o los epitopos de superporción, con lo cual se encuentra también que el minigen promueve las respuestas inmunes apropiadas dirigidas hacia los epitopos proporcionados.
Para confirmar la capacidad de un minigen que codifica para el epítopo de la clase II, para inducir HTLs in vivo, ratones transgénicos DR, o para aquellos epitopos que reaccionan cruzadamente con la molécula MHC de ratón, apropiada, los ratones restringidos a I-Ab, por ejemplo, son inmunizados intramuscularmente con 100 µg del ADN plásmido. Como un medio de comparar el nivel de los HTLs inducidos por inmunización del DNA, un grupo de animales control también es inmunizado con una composición efectiva del péptido, emulsificada en el adyuvante completo de Freund. Las células T CD4+, por ejemplo, HTLs, son purificadas a partir de esplenocítos de los animales inmunizados y estimuladas con cada una de las composiciones respectivas (péptidos codificados en el minigen) . La respuesta de HTL es medida utilizando el ensayo de proliferación de incorporación de 3H-timidina (ver, por ejemplo, Alexander et al . , Immunity 1:751-761, 1994) . Los resultados indican la magnitud de la respuesta de HTL, demostrando de este modo la inmunogenicidad in vivo del minigen. Los minigenes de DNA, construidos como se describe en el Ejemplo previo, pueden ser también confirmados como una vacuna en combinación con un agente de reforzamiento utilizando un protocolo de refuerzo con aprestamiento. El agente de refuerzo puede consistir de la proteína recombinante (por ejemplo, Barnett et al . , Aids Res . and Human Retroviruses 14, Suplemento 3:S299-S309, 1998) o la vaccinia recombinante, por ejemplo que expresa un minigen o DNA que codifica para la proteína completa de interés (ver, por ejemplo, Hanke et al . , Vaccine 16:439- 445, 1998; Sedegah et al . , Proc. Nati . Acad. Sci USA 95:7648-53, 1998; Hanke and McMichael, Immunol . Letters 66:177- 181, 1999; y Robinson et al . , Nature Med. 5:526-34, 1999). Por ejemplo, la eficacia del minigen DNA utilizado en un protocolo de refuerzo aprestador es inicialmente evaluada en ratones transgénicos. En este ejemplo, los ratones transgénicos A2.1/Kb son inmunizados iñtramuscularmente con 100 µg del mínígen de DNA que codifica para los péptidos inmunogénicos que incluyen al menos un péptido que posee la superporción HTL-A2. Después de un periodo de incubación (en el intervalo de 3 a 9 semanas) , los ratones son' reforzados IP con 107 ufp/ratón de un virus de la vaccinia recombinante que expresa la misma secuencia codificada por el minigen de DNA. Los ratones control son inmunizados con 100 µg de DNA o la vaccinia recombinante sin la secuencia del minigen, o con el DNA que codifica para el minigen, pero sin el refuerzo de la vaccinia. Después de un periodo adicional de dos semanas, los esplenocitos provenientes de los ratones son inmediatamente evaluados para la actividad específica del péptido en un ensayo ELISPOT. Adicionalmente, los esplenocítos son estimulados in vitro con los epitopos peptídicos restringidos a A2, codificados en el minigen y la vaccínía recombinante, luego evaluados para la actividad específica del péptido en un ELISA IFN alfa, beta y/o gamma . Se encuentra que el minigen utilizado en un protocolo de refuerzo aprestador promueve mayores respuestas inmunes hacia los péptidos de la superporción HLA-A2 que con el DNA solo. Tal análisis puede también ser realizado utilizando modelos de ratón transgénico HLA-All o HLA-B7 para valorar la inducción de CTL por los epitopos de la porción o superporción HLA-A3 o HLA-B7. El uso de los protocolos de refuerzo aprestador en humanos se describe más adelante en el Ejemplo titulado "Inducción de Respuestas de CTL Utilizando Protocolo de Refuerzo Aprestador".
Ejemplo 16: Composiciones de Vacuna Poliepitópicas a Partir de Antígenos Múltiples Los epitopos de STEAP-l de la presente invención son utilizados en conjunto con los epitopos de otros antígenos asociados al tumor objetivo, para crear una composición de vacuna que es útil para la prevención o tratamiento de cáncer que expresa STEAP-l y otros antígenos tales. Por ejemplo, una composición de vacuna puede ser proporcionada como un polipéptido simple que incorpora múltiples epitopos de STEAP-l, así como antígenos asociados al tumor que son a menudo expresados con un cáncer objetivo asociado con la expresión de STEAP-l, o pueden ser administrados como una composición que comprende un cóctel de uno o más epitopos discretos. Alternativamente, la vacuna puede ser administrada como una construcción de minigen o como células dendríticas que han sido cargadas con los epitopos peptídicos in vitro.
Ejemplo 17: Uso de los Péptidos para Evaluar una Respuesta Inmune Los péptidos de la invención pueden ser utilizados para analizar una respuesta inmune para la presencia de anticuerpos específicos, CTL o HTL dirigidos a STEAP-l. Tal análisis puede ser realizado de una manera descrita por Ogg et al . , Science 279:2103-2106, 1998. En este Ejemplo, los péptidos de acuerdo con la invención son utilizados como un reactivo para fines de diagnóstico o de pronóstico, no como un inmunógeno . En este ejemplo, los complejos tetraméricos de antígeno leucocitario humanos, altamente sensibles ("tetrámeros") son utilizados para un análisis de sección transversal de, por ejemplo, las frecuencias de CTL específicas de STEAP-l HLA-A*0201 a partir de los individuos positivos a HLA A*0201 en diferentes etapas de la enfermedad, o después de la inmunización que comprende un péptido de STEAP-l que contiene una porción A*0201. Los complejos tetraméricos son sintetizados como se describe (Musey et al . , N. Engl . J. Med. 337:1267, 1997). En resumen, la cadena pesada de HLA purificada (A*0201 en este ejemplo) y la beta2-microglobulina son sintetizadas por medio de un sistema de expresión procariótico. La cadena pesada es modificada por supresión de la cola transmembranal-citosólica y la adición de COOH-terminal de una secuencia que contiene un sitio de biotinilación enzimático BirA. La cadena pesada, beta2-microglobulina, y el péptido son replegados por dilución. El producto replegado de 45 kD es aislado mediante cromatografía líquida de proteína rápida y luego biotinilado por BirA en presencia de biotina (Sigma, St. Louis, Missouri), 5-trifosfato de adenosina y magnesio. El conjugado de estreptavidina-ficoeritrina es agregado en una proporción molar 1:4, y el producto tetramérico es concentrado a 1 mg/ml. El producto resultante es denominado como tetrámero-ficoeritrina . Para el análisis de las muestras de sangre del paciente, aproximadamente un millón de PBMCs son centrifugadas a 300 g por 5 minutos y resuspendidas en 50 µl de solución salina amortiguada con fosfato, fría. El análisis de tri-color es realizado con el tetrámero-ficoeritrina, junto con el anti-CD8-Tricolor, y anti- CD38. Las PBMCs son incubadas con el tetrámero y anticuerpos sobre hielo por 30 a 60 minutos, y luego lavadas dos veces antes de la fijación con formaldehído. Las entradas son aplicadas para contener más de 99.98% de las muestras control. Los controles para los tetrámeros incluyen individuos negativos a A*0201 y donadores no enfermos positivos a A*0201. El porcentaje de células teñidas con el tetrámero es luego determinado por citometría de flujo. Los resultados indican que el número de células en la muestra de PBMC que contienen CTLs restringidos al epitopo, con lo cual se indica fácilmente el grado de respuesta inmune al epitopo de STEAP-l, y de este modo el estado de exposición a STEAP-1, o la exposición a una vacuna que promueve una respuesta protectora o terapéutica. Ejemplo 18: Inducción de las Respuestas Inmunes Utilizando un Protocolo de Refuerzo Aprestador . Un protocolo de refuerzo aprestador similar en su principio subyacente a aquél utilizado para confirmar la eficacia de una vacuna de DNA en ratones transgénicos, tal como se describe en el Ejemplo titulado "La Construcción de Plásmido y el Grado al Cual Ésta Induce la Inmunogenicídad", puede ser también utilizado para la administración de la vacuna a humanos. Tal régimen de vacunación puede incluir una administración inicial de, por ejemplo, un DNA desnudo seguido por un refuerzo utilizando el virus recombinante que codifica para la vacuna, o la proteína/polipéptido recombinante o una mezcla peptídica administrada en un adyuvante . Por ejemplo, la inmunización puede ser realizada utilizando un vector de expresión, tal como aquél construido en el Ejemplo titulado "Construcción de los Plásmidos de DNA Multiepitópicos del "Minigen"", en la forma de ácido nucleico desnudo administrado IM (o SC o ID) en las cantidades de 0.5-5 mg en múltiples sitios. El ácido nucleico (de 0.1 a 1000 µg) puede ser también administrado utilizando una pistola de genes. Después de un periodo de incubación de 3 a 4 semanas, es entonces administrada una dosis de refuerzo. El refuerzo puede ser el virus recombinante de la viruela aviar, administrado a una dosis de 5-107 hasta 5xl09 ufp. Un virus recombinante alternativo, tal como un • MVA, virus de la viruela del canario, adenovirus, o virus adeno-asociado, puede ser también utilizado para el refuerzo, o la proteína poliepitópica o una mezcla de los péptidos puede ser administrada. Para la evaluación de la eficacia de la vacuna, muestras de sangre de pacientes son obtenidas antes de la inmunización, así como a intervalos después de la administración de la vacuna inicial y dosis de refuerzo de la vacuna. Células mononucleares de sangre periférica son aisladas de la sangre heparinizada fresca mediante centrifugación en gradiente de densidad Ficoll-Hypaque, tomadas en alícuotas en medios de congelamiento y almacenadas congeladas. Las muestras son evaluadas para la actividad de CTL y HTL. El análisis de los resultados indica que se genera una magnitud de respuesta suficiente para lograr una inmunidad terapéutica o protectora contra STEAP-l .
Ejemplo 19: Polinucleótidos Complementarios Las secuencias complementarias a las secuencias que codifican para STEAP-l, o cualesquiera partes de las mismas, se utilizan para detectar, disminuir, o inhibir la expresión de STEAP-l de origen natural. Aunque se describe el uso de los oligonucleótidos que comprenden de aproximadamente 15 a 30 pares de bases, esencialmente se utiliza el mismo procedimiento con fragmentos de secuencia más pequeños o con más grandes. Los oligonucleótidos apropiados son diseñados utilizando, por ejemplo, el software de OLIGO 4.06 (National Biosciences) y la secuencia de codificación de STEAP-l. Para inhibir la transcripción, es diseñado un oligonucleótido complementario a partir de la secuencia más 5' única, y utilizado para prevenir que el promotor se enlace a la secuencia de codificación. Para inhibir la traducción, es diseñado un oligonucleótido complementario para prevenir el enlace ribosomal a un transcrito que codifica para STEAP-l.
Ejemplo 20: Purificación de STEAP-l de Origen Natural o Recombinante Utilizando Anticuerpos Específicos de STEAP-l STEAP-l de origen natural o recombinante es sustancialmente purificado mediante cromatografía de inmunoafinidad utilizando anticuerpos específicos para STEAP- 1. Una columna de inmunoafinidad es construida mediante el acoplamiento covalente del anticuerpo anti-STEAP-1 a una resina cromatográfica activada, tal como SEPHAROSE activada con CNBr (Amersham Pharmacia Biotech) . Después del acoplamiento, la resina es bloqueada y lavada de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Los medios que contienen STEAP-l se hacen pasar sobre la columna de inmunoafinidad, y la columna es lavada bajo condiciones que permiten la absorbancia preferencial de STEAP-l (por ejemplo amortiguadores de alta fuerza iónica en presencia de detergente) . La columna es eluida bajo condiciones que perturban el enlace anticuerpo/STEAP-1 (por ejemplo, un amortiguador de pH 2 a pH 3, o una alta concentración de un caótropo, tal como urea o el ion tiocianato) y GCR.P es recolectado.
Ejemplo 21: Identificación de las Moléculas que Interactúan con STEAP-l STEAP-l, o los fragmentos biológicamente activos de la misma, son marcados con el reactivo 121 1 Bolton-Hunter (ver, por ejemplo, Bolton et al . (1973) Biochem. J. 133:529). Las moléculas candidatas previamente acomodadas en los pozos de una placa de pozos múltiples, son incubadas con el STEAP-l marcado, lavadas, y cualesquiera pozos con el complejo de STEAP-1 marcado, son valoradas. Los datos obtenidos utilizando diferentes concentraciones de STEAP-l se utilizan para calcular los valores para el número, la afinidad, y la asociación de STEAP-l con las moléculas candidatas.
Ejemplo 22: Ensayo In Vivo para la Promoción del Crecimiento Tumoral de STEAP-l El efecto de la proteína STEAP-l sobre crecimiento de células tumorales es evaluado in vivo mediante la evaluación del desarrollo del tumor y el crecimiento de las células que expresan o que carecen de STEAP-l. Por ejemplo, los ratones SCID son inyectados subcutáneamente sobre cada flanco con 1 x 106 de cualquiera de las células 3T3, o células de cáncer de próstata (por ejemplo células PC3) que contienen el vector vacío tkNeo o STEAP-l. Pueden ser utilizadas al menos dos estrategias: (1) la expresión constitutiva de STEAP-l bajo la regulación de un promotor tal como un promotor constitutivo obtenido a partir de los genomas de virus tales como el virus del polioma, el virus de la viruela aviar (patente del Reino Unido 2,211,504 publicada el 5 de Julio de 1989) , adenovirus (tal como el Adenovirus 2) , virus del papiloma bovino, virus del sarcoma aviar, citomegalovirus, un retrovirus, virus de la hepatitis B y el virus de simio 40 (SV40) , o a partir de promotores de mamífero, heterológos, por ejemplo, el promotor de actina o un promotor de inmunoglobulina, con la condición de que tales promotores sean compatibles con los sistemas de células hospederas, y (2) la expresión regulada bajo el control de un sistema vector inducible, tal como ecdisona, tetraciclina, etc., con la condición de que tales promotores sean compatibles con los sistemas de células hospederas. El volumen del tumor es luego monitorizado por medición con calibrador en la aparición de tumores palpables y seguido sobre el tiempo para determinar si las células que expresan STEAP-1 se desarrollan a una mayor velocidad y los tumores producidos por las células que expresan STEAP-1 demuestran características de agresividad alterada (por ejemplo metástasis aumentada, vascularización, capacidad de respuesta reducida a los fármacos quimioterapéuticos) . Adicionalmente, los ratones pueden ser implantados con 1 x 10d de las mismas células ortotópicamente para determinar si STEAP-l tiene un efecto sobre el crecimiento local en la próstata, y si STEAP-l afecta la habilidad de las células para metastatizarse, específicamente a los nodulos linfáticos, y el hueso (Miki T et al . , Oncol Res. 2001; 12:209; Fu X et al . , Int J Cáncer. 1991, 49:938). El efecto de STEAP-l sobre la formación del tumor óseo y el crecimiento del mismo, puede ser evaluado mediante la inyección de células de tumor de próstata intratibialmente . El ensayo es también útil para determinar el efecto inhibitorio de STEAP-l de las composiciones terapéuticas candidatas, tales como, por ejemplo, los intracuerpos de STEAP-l, las moléculas antisentido de STEAP-l y las ribozimas .
Ejemplo 23: Inhibición Mediada por el Anticuerpo Monoclonal para STEAP-l, de los Tumores In Vivo La expresión significativa de STEAP-l en tejidos cancerosos y la localización superficial, junto con su expresión restrictiva en tejidos normales, hace a STEAP-l un buen objetivo para la terapia con anticuerpo. Similarmente, STEAP-l es un objetivo para la inmunoterapia basada en células T. De este modo, la eficacia terapéutica de los MAbs anti-STEAP-1 en modelos de ratón con xenoinjerto de cáncer de próstata humano, es evaluada mediante el uso de líneas celulares recombinantes tales como PC3-STEAP-1, y 3T3-STEAP-1 (ver, por ejemplo Kaighn, M.E., et al . , Invest Urol, 1979. 17 (1) : 16-23) , así como modelos de xenoinjerto de próstata humana tales como LAPC 9AD (Saffran et al . , PNAS 1999, 10:1073-1078) .
La eficacia del anticuerpo sobre el crecimiento tumoral y la formación de metástasis es estudiada, por ejemplo, en modelos de xenoinjerto de cáncer de próstata ortotópicos en ratón. Los anticuerpos pueden ser no conjugados, como se discute en este Ejemplo, o pueden ser conjugados a una modalidad terapéutica, como es apreciado en la técnica. Los MAbs anti-STEAP-1 inhiben la formación de xenoinjertos de pulmón y de próstata. Los MAbs anti-STEAP-1 también retardan el crecimiento de los tumores ortotópicos establecidos y supervivencia prolongada de los ratones que poseen tumores. Estos resultados indican la utilidad de los MAbs anti-STEAP-1 en el tratamiento del cáncer de próstata en etapas local y avanzada. (Ver, por ejemplo, Saffran, D., et al., PNAS 10:1073-1078 o www URL pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.051624698) . La administración de los MAbs anti-STEAP-1 condujo al retardo del crecimiento tumoral ortotópico establecido y la inhibición de la metástasis a sitios distantes, dando como resultado una prolongación significativa de la supervivencia de los ratones que poseen tumores. Estos estudios indican que STEAP-l es un objetivo atractivo para inmunoterapia y demuestran el potencial terapéutico de los MAbs anti-STEAP-1 para el tratamiento de cáncer de próstata local y metastático. Este ejemplo demuestra que los anticuerpos monoclonales para STEAP-l no conjugado son efectivos para inhibir el crecimiento de los xenoinjertos de tumor de próstata humana desarrollados en ratones SCID; en consecuencia, es también efectiva una combinación de tales anticuerpos monoclonales eficaces. \ Inhibición del Tumor Utilizando MAbs de STEAP-l, No Conjugados, Múltiples Materiales y Métodos Anticuerpos Monoclonales para STEAP-l: Son producidos anticuerpos monoclonales contra STEAP-1 como se describe en el Ejemplo titulado "Generación de Anticuerpos Monoclonales para STEAP-l (MAbs)". Los anticuerpos son caracterizados por ELISA, Western blot, FACS, e inmunoprecipitación para su capacidad de enlazarse a STEAP-1. Los datos de mapeo del epitopo para los MAbs anti-STEAP-1, como es determinado por ELISA y análisis de Western, reconocen los epitopos sobre la proteína STEAP-l. El análisis inmunohistoquímico de los tejidos de cáncer de próstata y las células con estos anticuerpos, es también realizado. Los anticuerpos monoclonales son purificados a partir de sobrenadantes de cultivo de ascitis o de tejido de hibridoma mediante cromatografía en Sefarosa de Proteína G, dializados contra PBS, esterilizados por filtración, y almacenados a -20 °C. Las determinaciones de proteínas son realizadas medíante un ensayo de Bradford (Rio-Rad, Hercules, CA) . Un anticuerpo monoclonal terapéutico o un cóctel que contiene una mezcla de anticuerpos monoclonales individuales, es preparada y utilizada para el tratamiento de ratones que reciben inyecciones subcutáneas u ortotópicas de xenoinjertos tumorales ÜM-UC3 y CaLul . Líneas Celulares y Xenoinjertos Líneas celulares de cáncer de próstata, la línea celular PC3 y LNCaP así como la línea de fibroblastos NIH 3T3 American Type Culture Collection) son mantenidas en RPMl y DMEM respectivamente, suplementadas con L-glutamina y 10% de FBS. Las poblaciones de células PC3-STEAP-1 y 3T3-STEAP-1 son generadas mediante transferencia de gen retroviral como se describe en Hubert, R.S., et al . , Proc Nati Acad Sci U S A, 1999. 96(25) : 14523. El xenoinjerto LAP-9, el cual expresa un receptor de andrógeno de tipo silvestre y produce el antígeno específico de la próstata (PSA) , es pasado a ratones inmunodeficíentes combinados con ISR severa, machos, de 6 a 8 semanas de edad (SCID) (Taconic Far s) mediante implante de trocar subcutáneo (Craft, N., et al., Nat Med. 1999, 5:280). Suspensiones de células simples de células tumorales LAPC-9 son preparadas como se describe en Craft et al.
Modelos de Ratón de Xenoinjerto Tumores subcutáneos (s.c.) son generados mediante inyección de 1 x 106 células cancerosas mezcladas a una dilución 1:1 con Matrigel (Collaborative Research) en el flanco derecho de ratones SCID machos. Para probar la eficacia del anticuerpo sobre la formación de tumor, por ejemplo inyecciones de anticuerpo son iniciadas en el mismo día que las inyecciones de células tumorales. Como un control, los ratones son inyectados ya sea con la IgG de ratón purificada (ICN) o PBS; o un anticuerpo monoclonal purificado que reconoce un antígeno irrelevante no expresado en células humanas. En estudios preliminares, no es encontrada ninguna diferencia entre la IgG de ratón o el PBS sobre el crecimiento tumoral. Los tamaños de los tumores son determinados mediante mediciones con calibrador, y el volumen del tumor es calculado como longitud x anchura x altura. Los ratones con tumores subcutáneos mayores de 1.5 cm de diámetro, son sacrificados. Son realizadas inyecciones ortotópicas bajo anestesia mediante el uso de cetamina/xilazina. Para estudios ortotópicos de próstata, se realiza una incisión a través del abdomen, para exponer la próstata y las células tumorales LAPC o PC3 (5 x 105) mezcladas con Matrigel son inyectadas dentro de la cápsula de la próstata en un volumen de 10 µl. Para monitorizar el crecimiento tumoral, los ratones son palpados y la sangre es recolectada en una base semanal para medir los niveles de PSA. Los ratones son segregados en grupos para los tratamientos apropiados, con los MAbs anti-STEAP-1 o control, que son inyectados i.p.
MAbs Anti-STEAP-1 Inhiben el Crecimiento de los Tumores de Cáncer de Xenoinjerto que Expresan STEAP-l El efecto de los MAbs anti-STEAP-1 sobre la formación del tumor es probada mediante el uso de modelos ortotópicos de LNCaP y LAPC9. En comparación con el modelo tumoral s.c., el modelo ortotópico, que requiere la inyección de células tumorales directamente- en la próstata del ratón, respectivamente, da como resultado un crecimiento tumoral local, el desarrollo de metástasis en sitios distales, el deterioro de la salud del ratón, y la muerte subsiguiente (Saffran, D., et al., PNAS supra). Las características hacen al modelo ortotópico más representativo de la progresión de la enfermedad humana y nos permiten seguir el efecto terapéutico de los MAbs sobre puntos finales clínicamente relevantes . En consecuencia, las células tumorales son inyectadas dentro de la próstata del ratón, y 2 días más tarde, los ratones son segregados en dos grupos y tratados ya sea con: a) 200-500 µg de anticuerpo anti-STEAP-1, o b) PBS tres veces por semana durante dos a cinco semanas. Una ventaja mayor de los modelos de cáncer ortotópico es la habilidad para estudiar el desarrollo de las metástasis. La formación de metástasis en ratones que poseen tumores ortotópicos establecidos, es estudiada mediante análisis IHC sobre secciones pulmonares utilizando un anticuerpo contra una proteína de la superficie celular específica del tumor, tal como un anti-CK20 para cáncer de próstata (Lin S et al, Cáncer Detect Prev. 2001; 25 : 202) . Otra ventaja más de los modelos de cáncer de xenoinjerto es la habilidad para estudiar la neovascularización y la angiogénesis. El crecimiento del tumor es parcialmente dependiente del nuevo desarrollo de vasos sanguíneos. Aunque el sistema capilar y el desarrollo de la red sanguínea es de origen del hospedero, el inicio y la arquitectura de la neovasculatura son regulados por el tumor de xenoinjerto (Davidoff AM et al., Clin Cáncer Res. 2001; 7:2870; Solesvik O et al., Eur J Cáncer Clin Oncol. 1984, 20:1295). El efecto del anticuerpo y la molécula pequeña sobre la neovascularización es estudiado de acuerdo con los procedimientos conocidos en la técnica, tal como mediante el análisis IHC de los tejidos tumorales, y su mícroambiente circunvecino. Los ratones que poseen tumores ortotópicos establecidos son administrados con inyecciones de 1000 µg ya sea del MAb anti-STEAP-1 o PBS en un periodo de 4 semanas. Los ratones en ambos grupos se dejan establecer con una alta carga tumoral, para asegurar una alta frecuencia de formación de metástasis en pulmones de ratón. Los ratones son luego sacrificados y sus vejigas, hígados, huesos y pulmones son analizados para la presencia de células tumorales por análisis IHC. Estos estudios demuestran una amplia eficacia antitumoral de los anticuerpos anti-STEAP-1 sobre el inicio y la progresión del cáncer de próstata en modelos de ratón con xenoinjerto. Los anticuerpos anti-STEAP-1 inhiben la formación de tumor de los tumores así como el retardo del crecimiento de tumores ya establecidos, y prolongan la supervivencia de los ratones tratados. Además, los MAbs anti-STEAP-1 demuestran un efecto inhibitorio dramático sobre la dispersión del tumor de próstata local así como de los sitios distales, incluso en presencia de una carga tumoral grande. De este modo, los MAbs anti-STEAP-1 son eficaces sobre los puntos finales clínicamente relevantes, mayores (crecimiento tumoral) , la prolongación de la supervivencia, y la salud.
Efecto de los MAbs para STEAP-l sobre el Crecimiento de Xenoinjertos de Cáncer de Próstata Humano en Ratones Ratones macho ICR-SCID, de 5 a 6 semanas de edad (Charles River Laboratory, Wilmington, MA) fueron utilizados.
Los ratones fueron mantenidos en un ambiente controlado utilizando los protocolos descritos en la Guía de NIH para el Cuidado y Uso de Animales de Labora torio. Fue utilizado un tumor de cáncer de próstata humano dependiente del andrógeno, LAPC-9AD, para establecer modelos de xenoinjerto. Tumores de reserva regularmente mantenidos en ratones SCID fueron disectados de manera estéril, desmenuzados, y digeridos utilizando Pronase (Calbiochem, San Diego, CA) . Las suspensiones celulares generadas . fueron incubadas toda la noche a 37 °C, para obtener una suspensión homogénea de las células simples . Los anticuerpos M2/92.30 y M2/120.545 de STEAP-l fueron probados a dos diferentes dosis de 100 µg y 500 µg. Fueron utilizados como controles PBS y el MAb anbti-KLH. El grupo de estudio consistió de 6 grupos con 10 ratones en cada grupo. Los MAbs fueron dosificados IP dos veces a la semana para un total de 12 dosis, comenzando el mismo día que la inyección de la célula tumoral. El tamaño del tumor fue monitorizado a través de mediciones con calibrador dos veces a la semana. La dimensión más larga (L) y la dimensión perpendicular a ésta (W) fueron tomadas para calcular el volumen tumoral utilizando la fórmula: W2 x L/2. La concentración de PSA en suero en el día 40 para cada animal fue medida utilizando el equipo de ELISA comercial. La prueba de Kruskal-Wallis y la prueba U de Mann-Whitney se utilizaron para evaluar las diferencias del crecimiento tumoral y el nivel de PSA entre grupos. Todas las pruebas fueron de dos lados con alfa = 0.05. Los resultados del experimento descrito en la Figura 26 y en la Figura 27 muestran que los MAb M2/92.30 y M2/120.545 de STEAP-l retardan significativamente el crecimiento del xenoinjerto de próstata humano de una manera dependiente de la dosis.
Ejemplo 24: Uso Terapéutico y Diagnóstico de los Anticuerpos Anti-STEAP-1 en Humanos Los anticuerpos monoclonales anti-STEAP-1 son utilizados de manera segura y de manera efectiva para fines terapéuticos, de diagnóstico, profilácticos, y/o de pronóstico en humanos. Los análisis de Western blot e inmunohistoquímicos de tejidos del cáncer y de xenoinjertos del cáncer con el MAb anti-STEAP-1, muestran una fuerte tinción extensa en el carcinoma, ' pero niveles significativamente menores o indetectables en tejidos normales. La detección de STEAP-l en carcinoma y en enfermedad metastática demuestra la utilidad del MAb como un indicador de diagnóstico y/o de pronóstico. Los anticuerpos anti-STEAP-1 son por lo tanto utilizados en aplicaciones de diagnóstico tales como la inmunohistoquímica de especímenes de biopsia de riñon para detectar el cáncer a partir de pacientes sospechosos. Como es determinado por citometría de flujo, el MAb anti-STEAP-1 se enlaza específicamente a las células de carcinoma. De este modo, los anticuerpos anti-STEAP-1 son utilizados en el diagnóstico de aplicaciones de formación de imagen del cuerpo entero, tales como radioinmunocintigrafía y radioin unoterapia (ver, por ejemplo, Potamianos S., et . al. Anticancer Res 20 (2A) : 925-948 (2000)) para la detección de los cánceres localizados y metastáticos que muestran expresión de STEAP-l. La difusión o liberación de un dominio extracelular de STEAP-l hacia el medio extracelular, tal como aquél observado para la fosfodiesterasa alcalina BIO (Meerson, N. R., Hepatology 27:563-568 (1998)), permite la detección de diagnóstico de STEAP-l por anticuerpos anti-STEAP-1 en suero y/o en muestras de orina provenientes de pacientes sospechosos. Los anticuerpos anti-STEAP-1 que se enlazan específicamente a STEAP-l son utilizados en aplicaciones terapéuticas para el tratamiento de cánceres que expresan STEAP-l. Los anticuerpos anti-STEAP-1 son utilizados como una modalidad no conjugada y como una forma conjugada en la cual los anticuerpos son enlazados a una de diversas modalidades terapéuticas o de formación de imagen, bien conocidas en la técnica, tales como los profármacos, enzimas o radioisótopos. En estudios preclínicos, los anticuerpos anti-STEAP-1 no conjugados y conjugados son probados para la eficacia de la prevención del tumor y la inhibición del crecimiento del tumor en modelos de xenoinjerto de cáncer en ratones, por ejemplo, modelos de cáncer de riñon AGS-K3 y AGS-K6 (ver, por ejemplo, el Ejemplo titulado "Inhibición de los Tumores de la Vejiga y Pulmón In Vivo, mediada por el anticuerpo monoclonal para STEAP-l. Los anticuerpos anti-STEAP-1 conjugados y no conjugados son utilizados como una modalidad terapéutica en pruebas clínicas en humanos, ya sea solos o en combinación con otros tratamientos como se describe en los siguientes Ejemplos.
Ejemplo 25: Pruebas Clínicas en Humanos para el Tratamiento y Diagnóstico de Carcinomas Humanos a través del uso de Anticuerpos Anti-STEAP-1 Humanos, In Vivo Son utilizados los anticuerpos de acuerdo con la presente invención los cuales reconocen un epitopo sobre STEAP-l, y son utilizados en el tratamiento de ciertos tumores tales como aquellos listados en la Tabla I. Con base en un número de factores, incluyendo los niveles de expresión de STEAP-l, los tumores tales como aquellos listados en la Tabla I son indicaciones actualmente preferidas. Con conexión con cada una de estas indicaciones, son exitosamente seguidos tres procedimientos clínicos. I) Terapia adjunta: En la terapia adjunta, los pacientes son tratados con anticuerpos anti-STEAP-1 en combinación con un agente quimioterapéutico o antineoplásico y/o terapia con radiación. Los objetivos del cáncer primario, tales como aquellos listados en la Tabla I, son tratados bajo protocolos estándares por la adición de anticuerpos anti-STEAP-1 para terapia estándar de primera y segunda línea. Los diseños del protocolo se dirigen a la efectividad evaluada por la reducción en la masa tumoral así como la habilidad para reducir las dosis usuales de la quimioterapia estándar. Estas reducciones en la dosis permiten una terapia adicional y/o prolongada al reducir la toxicidad relacionada a la dosis del agente quimioterapéutico. Los anticuerpos anti-STEAP-1 son utilizados en varias pruebas clínicas adjuntas en combinación con los agentes quimioterapéuticos o antineoplásicos adriamicina (carcinoma de próstata avanzado) , cisplatino (carcinomas avanzados de cabeza y cuello y pulmón) , taxol (cáncer de mama) , y doxorrubicina (preclínico) . II) Monoterapia: En conexión con el uso de los anticuerpos anti-STEAP-1 en la monoterapia de tumores, los anticuerpos son administrados a pacientes sin un agente quimioterapéutico o antineoplásico. En una modalidad, la monoterapia es conducida clínicamente en pacientes con cáncer en etapa final con la enfermedad metastática extensa. Los pacientes muestran cierta estabilización de la enfermedad. Las pruebas demuestran un efecto en los pacientes refractarios con tumores cancerosos. III) Agente de Formación de Imagen: A través del enlace de un radionúclido (por ejemplo, yodo o itrio (I131, Y90) a los anticuerpos antí-STEAP-1, los anticuerpos radiomarcados son utilizados como un agente de diagnóstico y/o de formación de imagen. En tal papel, los anticuerpos marcados se localizan hacia los tumores sólidos, así como las lesiones metastáticas de las células que expresan STEAP-l. En conexión con el uso de los anticuerpos anti-STEAP-1 como agentes formadores de imagen, los anticuerpos son utilizados como un tratamiento adjunto al quirúrgico de los tumores sólidos, como una selección prequirúrgica así como un seguimiento post-operatorio para determinar qué tumor permanece y/o regresa. En una modalidad, un anticuerpo (?:L1In) -STEAP-l es utilizado como un agente de formación de imagen en una prueba clínica de Fase I humana en pacientes que tienen un carcinoma que expresa STEAP-l (por analogía ver, por ejemplo, Divgi et al. J. Nati. Cáncer Inst. 83:97-104 (1991) ) . Los pacientes son seguidos con cámara gamma anterior y posterior, estándar. Los resultados indican que las lesiones primarias y las lesiones metastáticas son identificadas .
Dosis y Ruta de Administración Como es apreciado por aquellas personas de experiencia ordinaria en la técnica, las consideraciones de dosis pueden ser determinadas a través de la comparación con los productos análogos que están en la clínica. De este modo, los anticuerpos anti-STEAP-1 pueden ser administrados con dosis en el intervalo de 5 a 400 mg/m2, con las dosis menores utilizadas, por ejemplo, en conexión con estudios de seguridad. La afinidad de los anticuerpos anti-STEAP-1 con relación a la afinidad de un anticuerpo conocido para su objetivo, es un parámetro utilizado por aquellos expertos en la técnica para determinar los regímenes de dosis análogos. Además, los anticuerpos anti-STEAP-1 que son anticuerpos completamente humanos, en comparación al anticuerpo quimérico, tienen despejo más lento; en consecuencia, las dosis en pacientes con anticuerpos anti-STEAP-1 completamente humanos, pueden ser menores, quizás en el intervalo de 50 a 300 mg/m2, y todavía son eficaces. La dosificación en mg/m2, contrariamente a la medición convencional de dosis en mg/kg, es una medición basada en área superficial y es una medición de dosis conveniente que está diseñada para incluir pacientes de todos los tamaños desde infantes hasta adultos. Tres procedimientos de distribución distintos son útiles para distribuir anticuerpos anti-STEAP-1. La distribución intravenosa convencional es una técnica de distribución estándar para muchos tumores. No obstante, en conexión con tumores en la cavidad peritoneal, tales como tumores de los ovarios, el conducto biliar, otros conductos, y similares, la administración intraperitoneal puede probar que es favorable para obtener grandes dosis de anticuerpos en el tumor y para minimizar también el despejo de anticuerpos. De una manera similar, ciertos tumores sólidos poseen vasculatura que es apropiada para la perfusión regional. La perfusión regional permite una gran dosis de anticuerpo en el sitio de un tumor y minimiza el despejo del anticuerpo en poco tiempo.
Plan de Desarrollo Clínico (CDP) Panorama general: El CDP sigue y desarrolla los tratamientos de anticuerpos anti-STEAP-1 en conexión con la terapia adjunta, monoterapia, y como un agente de formación de imagen. Las pruebas demuestran inicialmente la seguridad y después de esto confirman la eficacia en dosis repetidas. Las pruebas son de etiqueta abierta en comparación a la quimioterapia estándar, con la terapia estándar más anticuerpos anti-STEAP-1. Como será apreciado, un criterio que puede ser utilizado en conexión con el enrolamiento de los pacientes es los niveles de expresión de STEAP-l en sus tumores, como es determinado por la biopsia.
Como con cualquier terapéutica basada en la infusión de proteínas o de anticuerpos, los problemas de seguridad están relacionados principalmente a (i) el síndrome de liberación de citosina, por ejemplo, la hipotensión, fiebre, temblor, escalofríos; (ii) el desarrollo de una respuesta inmunogénica al material (por ejemplo, el desarrollo de anticuerpos humanos por el paciente hacia el anticuerpo terapéutico, o la respuesta HAHA) ; y (iii) la toxicidad para células normales que expresan STEAP-l. Las pruebas estándares y el seguimiento son utilizados para monitorizar cada uno de estos problemas de seguridad. Los anticuerpos anti-STEAP-1 son encontrados como seguros después de la administración a humanos.
Ejemplo 26: Prueba Clínica en Humanos: Monoterapia con el Anticuerpo Humano Anti-STEAP-1 Los anticuerpos anti-STEAP-1 son seguros en conexión con la prueba adjunta discutida anteriormente, una prueba clínica en humanos de Fase II confirma la eficacia y la dosificación óptima para la monoterapia. Tal prueba es lograda, e involucra los mismos análisis de seguridad y resultados, para la prueba adjunta descrita anteriormente, con la excepción de que los pacientes no reciben quimioterapia concurrentemente con la recepción de dosis de anticuerpos anti-STEAP-1.
Ejemplo 27: Prueba Clínica en Humanos: Formación de Imagen de Diagnóstico con el Anticuerpo Anti-STEAP-1 Una vez más, ya que la terapia adjunta discutida anteriormente es segura dentro de los criterios de seguridad discutidos anteriormente, una prueba clínica en humanos es conducida concerniente al uso de los anticuerpos anti-STEAP-1 como un agente de formación de imagen de diagnóstico. El protocolo es diseñado de una manera sustancialmente similar a aquéllas descritas en la técnica, tales como en Divgi et al. J. Nati . Cáncer Inst . 83:97-104 (1991)). Se encuentra que los anticuerpos son seguros y eficaces cuando son utilizados como una modalidad de diagnóstico.
Ejemplo 28: Terapia Adjunta de Prueba Clínica en Humanos con el Anticuerpo Humano Anti-STEAP-1 y Terapia con Agentes Ouimioterapéuticos, Radiación, y/o Ablación Hormonal Una prueba clínica en humanos de Fase I es iniciada para evaluar la seguridad de seis dosis intravenosas de un anticuerpo anti-STEAP-1 en conexión con el tratamiento de un tumor sólido, por ejemplo, un cáncer de un tejido listado en la Tabla I. En el estudio, la seguridad de las dosis simples de los anticuerpos anti-STEAP-1 cuando se utilizan como una terapia adjunta a un agente antineoplásico o quimioterapéutico o de ablación hormonal, como se define en la presente, tal como, sin limitación: cisplatino, topotecan, doxorrubicina, adriamicina, taxol, Lupron, Zoladex, Eulexin, Casodex, Anandron o similares, es evaluada. El diseño de la prueba incluye la distribución de seis dosis simples de un anticuerpo anti-STEAP-1, con la dosis del anticuerpo que escala desde aproximadamente 25 mg/m2 hasta aproximadamente 275 mg/m2 en el curso del tratamiento de acuerdo con el siguiente esquema: Día 0 Día 7 Día 14 Día 21 Día 28 Día 35 Dosis del MAb 25 mg/m2 75 mg/m2 1 12255 175 225 275 mg/m2 mg/pr mg/m2 mg/m2 Quimioterapia + + + + + + (dosis estándar) Los pacientes son estrechamente seguidos por una semana después de cada administración del anticuerpo y la quimioterapia. En particular, los pacientes son evaluados para los problemas de seguridad mencionados anteriormente: (i) el síndrome de liberación de citosina, por ejemplo, la hipotensión, fiebre, temblor, escalofríos; (ii) el desarrollo de una respuesta inmunogénica al material (por ejemplo, el desarrollo de anticuerpos humanos por el paciente hacia el anticuerpo humano terapéutico, o respuesta HAHA) ; y (iii) la toxicidad hacia las células normales que expresan STEAP-l.
Las pruebas estándares y el seguimiento son utilizados para monitorizar cada uno de estos problemas de seguridad. Los pacientes son también evaluados para el resultado clínico, y particularmente la reducción en la masa tumoral como se pone en evidencia por MRl u otra formación de imagen. Los anticuerpos anti-STEAP-1 son demostrados como seguros y eficaces, las pruebas en Fase II confirman la eficacia y retinan la dosificación óptima.
Ejemplo 29: Identificación y Confirmación de las Vías Potenciales de Transducción de Señales Se ha reportado que muchas proteínas de mamífero interactúan con moléculas de señalización y participan en la regulación de las vías de señalización. (J Neurochem. 2001; 76:217-223). La fibronectina en particular, ha sido asociada con la cascada de señalización de MAPK que controla la mitogénesis celular (Jiang F, Jia Y, Cohén I. Blood. 2002, 99:3579). Además, la proteína STEAP-l contiene varios sitios de fosforilación (ver Tabla XXI) indicando una asociación con cascadas de señalización específicas. Utilizando inmunoprecipitación y técnicas de Western blot, son identificadas las proteínas que se asocian con STEAP-l y son mediadoras de los eventos de señalización. Varias vías conocidas por jugar un papel en la biología del cáncer, pueden ser reguladas por STEAP-l, incluyendo las vías de los fosfolípidos tales como PI3K, AKT, etc., las vías de adhesión y migración, incluyendo FAK, Rho, Rac-1, alfa-catenina, etc., así como cascadas mitogénicas/supervivencia tales como ERK, p38, etc. (Cell Growth Differ. 2000, 11:279; J Biol Chem. 1999, 274:801; Oncogene. 2000, 19:3003, J. Cell Biol. 1997, 138:913). Con el fin de determinar si la expresión de STEAP- 1 es suficiente para regular las vías de señalización específicas no de otro modo activas en células PC3 en reposo, el efecto de estos genes sobre la activación de la cascada de p38 MAPK fue investigado en la línea celular de cáncer de próstata PC3. La activación de la cinasa p38 es dependiente de su fosforilación sobre los residuos de tirosina y de serina. p38 fosforilada puede ser distinguida del estado no fosforilado por un MAb Fosfo-p38. Este anticuerpo específico de fosfo fue utilizado para estudiar el estado de fosforilación de p38 en líneas celulares PC3 manipuladas por ingeniería genética. Las células PC3 fueron transfectadas con el gen de resistencia a la neomicina solo, o con STEAP-l en el vector de pSRalfa. Las células fueron desarrolladas toda la noche en 0.5% de FBS, luego estimuladas con 10% de FBS por 5 minutos con o sin 10 µg/ml de inhibidor de MEK, PD98058. Los lisados celulares fueron resueltos mediante SDS-PAGE al 12.5% y analizados por Western blot con anti-fosfo-ERK (Cell Signaling) y anti-ERK (Zymed) . Las células NIH-3T3 fueron transfectadas con el gen de resistencia a la neomicina, solo o con STEAP-l en el vector pSRalfa. Las células fueron tratadas como se describe anteriormente pero sin el inhibidor de MEK. Además, las células NIH-3T3-Neo fueron tratadas con 10 mg/ml de salicilato de sodio. La expresión de STEAP-l induce la fosforilación de ERK-1 y ERK-2 en suero, y fue inhibida por el inhibidor de cinasa MEK corriente arriba (5'), PD98058. En otro grupo más de experimentos, fue examinada la suficiencia de expresión de STEAP-l en la línea celular de cáncer de próstata PC3 para activar la vía mitogénica MAPK, a saber la cascada de ERK. La activación de ERK es dependiente de su fosforilación sobre los residuos de tirosina y serina. ERK fosforilada puede ser distinguida del estado no fosforilado por un MAb Fosfo-ERK. Este anticuerpo fosfo-específico fue utilizado para estudiar el estado de fosforilación de ERK en líneas celulares PC3 manipuladas por ingeniería genética. Las células PC3 que expresan una forma activada de Ras, fueron utilizadas como un control positivo. Los resultados muestran que mientras que la expresión del gen neo control no tiene efecto sobre la fosforilación de ERK, la expresión de STEAP-l en las células PC3 es suficiente para inducir un incremento en la fosforilación de ERK (Figura 28). Estos resultados fueron verificados utilizando la transferencia de Western anti-ERK y confirman la activación de la vía de ERK por STEAP-l. Ya que FBS contiene varios componentes que pueden contribuir a la activación de ERK mediada por el receptor, se examinó el efecto de STEAP-l en niveles bajos y óptimos de FBS. Las células PC3 que expresan neo o STEAP-l fueron desarrolladas ya sea en 0.1% o en 10% de FBS toda la noche. Las células fueron analizadas mediante transferencia de Western anti-Fosfo-ERK. Este experimento muestra que STEAP-l induce la fosforilación de ERK en 0.1% de FBS, y confirma que la expresión de STEAP-l es suficiente para inducir la activación de la cascada de señalización de ERK en ausencia de estímulos adicionales. Para confirmar que STEAP-l activa directa o indirectamente las vías de transducción de señales conocidas en células, son llevados a cabo ensayos de reporteros transcripcional basados en luciferasa (luc) en células que expresan genes individuales. Estos reporteros transcripcionales contienen sitios de enlace de consenso para factores de transcripción conocidos que yacen corriente abajo de las vía de transducción de señales bien caracterizadas. Los reporteros y los ejemplos de estos factores de transcripción asociados, las vías de transducción de señales, y los estímulos de activación, son listados en seguida. l.NFkB-luc, NFkB/Rel; Ik-cinasa/SAPK; crecimiento/apoptosis/estrés 2.SRE-luc, SRF/TCF/ELK1; MAPK/SAPK; crecimiento/diferenciación 3.AP-l-luc, FOS/JUN; MAPK/SAPK/PKC; crecimiento/apoptosis/estrés 4.ARE-luc, androgen receptor; steroids/MAPK; crecimiento/diferenciación/apoptosis 5.p53-luc, p53; SAPK; crecimiento/diferenciación/apoptosis 6-CRE-luc, CREB/ATF2; PKA/p38; crecimiento/apoptosis/estrés 7.TCF-luc, TCF/Lef; alfa-catenina, Adhesión/invasión Los efectos mediados por genes pueden ser evaluados en células que muestran expresión del mRNA. Los plásmidos reporteros de luciferasa pueden ser introducidos por transfección mediada por lípidos (TFX-50, Promega) . La actividad de luciferasa, un indicador de la actividad transcripcional relativa, es medido por incubación de los extractos celulares con el sustrato de luciferasa, y la luminiscencia de la reacción es monitorizada en un luminómetro . Vías de señalización activadas por STEAP-l son mapeadas y utilizadas para la identificación y validación de los objetivos terapéuticos. Cuando STEAP-l está involucrada en la señalización celular, ésta es utilizada como objetivo para fines de diagnóstico, de pronóstico, preventivos y/o terapéuticos.
Ejemplo 30: Involucramiento de STEAP-l en el Transporte de Molécula Pequeña y la Comunicación Célula-Célula La comunicación célula-célula es esencial en el mantenimiento de la integridad de los órganos y la homeostasis, las cuales se vuelven desreguladas durante la formación y progresión del tumor. Las comunicaciones intercelulares pueden ser medidas utilizando dos tipos de ensayos (J. Biol. Chem. 2000, 275:25207). En el primer ensayo, las células cargadas con un colorante fluorescente son incubadas en presencia de células recipientes no marcadas y las poblaciones celulares son examinadas bajo microscopía fluorescente. Este ensayo cualitativo mide el intercambio del colorante entre las células adyacentes. En el segundo sistema de ensayo, poblaciones de células donadoras y recipientes son tratadas como se describe anteriormente y son realizadas mediciones cuantitativas de la población de células recipientes por análisis de FACS. Utilizando estos dos sistemas de ensayo, las células que expresan STEAP-l son comparadas a los controles que no expresan STEAP-l, y se encuentra que STEAP-l mejora las comunicaciones entre células. La Figura 29 demuestra que STEAP-l es mediadora de la transferencia de la molécula pequeña calceína entre células adyacentes, y con esto regula la comunicación célula- célula en células con cáncer de próstata. En este experimento, las células PC3 recipientes fueron marcadas con dextrano-rojo texas y las células PC3 donadoras fueron marcadas con calceína AM (verde) . Las células donadoras (verdes) y recipientes (rojas) fueron co-cultivadas a 37°C y analizadas mediante microscopía para la co-localización del rojo texas y la calceina. Los resultados demostraron que mientras que las células control PC3 (expresión de proteína STEAP-l no detectables) muestran poca transferencia de calceína, la expresión de STEAP-l permite la transferencia de moléculas pequeñas entre células, con lo cual las células recipientes inicialmente rojas toman un color pardo y co-localizan las moléculas rojas y verdes. Las moléculas pequeñas y/o anticuerpos que modulan la comunicación célula-célula mediada por STEAP-l, son utilizadas como agentes terapéuticos para los cánceres que expresan STEAP-l. La figura 30 demuestra que la expresión de STEAP-l es necesaria sobre poblaciones donadores y recipientes para que tengan lugar la transferencia de moléculas pequeñas. En este experimento, las células PCR3 fueron transfectadas con el gen de resistencia a la neomicina, solo o con STEAP-l en el vector pSRa. Las células recipientes fueron marcadas con 1 mg/ml de dextrano-rojo texas, y las células donadoras fueron marcadas con 2.5 µg/ml de calceína AM. Las células donadoras (verdes) y recipientes (rojas) fueron co-cultivadas a 37°C por 18-24 horas, y analizadas mediante microscopía para la co-localización de los colorantes fluorescentes. Los paneles superiores: microscopía de luz; paneles inferiores: fluorescencia de UV; paneles izquierdos: células PC3-Neo fueron ambas donadoras y recipientes. Paneles centrales: PC3-neo fueron células donadoras y P3-STEAP-1 fueron recipientes. Paneles derechos: células PC3-STEAP-1 fueron donadoras y recipientes. Únicamente cuando STEAP-l fue expresada sobre las donadoras y los recipientes fue detectada la comunicación célula/célula. Los resultados muestran que el co-cultivo de las células PC3 control y PC fallan en mediar la transferencia de calceína. Similarmente, la co-incubación de PC3 control y PC3-STEAP-1 no permite la transferencia de la calceina. No obstante, el co-cultivo de las células donadoras PC3 STEAP-l y células recipientes PC3 STEAP-l es mediadora de la transferencia de moléculas pequeñas, como se describe por co-localización de los pigmentos verde y rojo en las mismas células. Tomados conjuntamente, los datos mostrados en las figuras 29 y 30 demuestran que STEAP-l es mediador de la transferencia de moléculas pequeñas y regula la comunicación célula a célula al formar canales de comunicación intracelulares que son similares en función a las uniones de espacio y vacio. Adicionalmente, el efecto de STEAP-1-M2/120.545 sobre la unión de Gap fue confirmado (ver figura 31) . En este experimento, las células PC3 fueron transfectadas con el gen de resistencia a la neomicina solo o con STEAP-l en el vector pSRa. Las células recipientes fueron marcadas 1 mg/ml de dextrano-rojo Texas y las células donadoras fueron marcadas con 2.5 µg/ml de calceína AM. Las células donadoras verdes y recipientes rojas fueron co-cultivadas a 37 °C por 18-24 horas y analizadas con microscopía para la co-localización de los colorantes fluorescentes. En todos los experimentos, las mismas células fueron utilizadas como donadoras y aceptoras. Las células fueron incubadas con las cantidades indicadas del MAb STEAP-1/120.545 por 10 minutos, antes de la siembra en placas, y el MAb fue mantenido en el cultivo por 24 horas, antes del análisis. STEAP-1/120.545 reduce la unión de espacio vacío mediada por STEAP-l de una manera dependiente de la dosis. Los resultados muestran que STEAP-1/120.545 reduce la unión de espacio vacío mediada por STEAP-l de una manera dependiente de la dosis. De este modo, debido a que STEAP-l funciona en comunicación en la comunicación célula-célula y en el transporte de moléculas pequeñas, ésta es utilizada como un objetivo o marcador como fines de diagnóstico, de pronóstico, preventivos y/o terapéuticos.
Ejemplo 31: Interferencia de RNA (RNAi) La tecnología de interferencia de RNA (RNAi) es implementada a una variedad de ensayos celulares relevantes para la oncología. El RNAi es un mecanismo de silenciamiento de genes, post-transcripcional, activado por el RNA de doble hebra (dsRNA) . El RNAi induce la degradación del mRNA específica que conduce a cambios en la expresión de proteínas y subsecuentemente en la función del gen. En células de mamífero, éstos dsRNA llamados RNA de interferencia cortos (siRNA) tienen la composición correcta para activar la vía de RNAi que se dirige' para la degradación, específicamente algunos mRNAs. Ver, Elbashir S.M., et . al., Duplexes of 21 -nucleotide RNAs Medíate RNA interference in Cultured Mammalian Cells. Nature 411 (6836) : 494-8 (2001). De este modo, la tecnología de RNAi es utilizada exitosamente en células de mamífero para silenciar los genes objetivo. La pérdida del control de la proliferación celular es una marca notable de las células cancerosas. De este modo, la evaluación del papel de STEAP-l en ensayos de supervivencia/proliferación de células, es relevante. En consecuencia, el RNAi fue utilizado para investigar la función del antígeno STEAP-l. Para generar siRNA para STEAP-1, fueron utilizados los algoritmos que predicen los oligonucleótidos que muestran los parámetros moleculares críticos (contenido de G:C, tapa extrema de fusión, etc.) y tienen la habilidad para reducir significativamente los niveles de expresión de la proteína STEAP-l cuando son introducidos dentro de las células. En consecuencia, una secuencia objetivo para el siRNA de STEAP-l es: 5' AAGCTCATTCTAGCGGGAAAT 3' (SEQ ID No: 81). De acuerdo con este ejemplo, las composiciones de siRNA de STEAP-l son utilizadas, que comprenden el siRNA (RNA de interferencia corto, de doble hebra) que corresponden a la secuencia ORF de ácido nucleico de la proteína STEAP-l o las subsecuencias de la misma. De este modo, las subsecuencias de siRNA son utilizadas de esta manera, y son en general de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30,31, 32, 33, 34, 35 o más de 35 nucleótidos contiguos de RNA de longitud. Estas secuencias de siRNA son complementarias y no complementarias al menos a una porción del RNA que codifica para la secuencia. En una modalidad, las subsecuencias son de 19-25 nucleótidos de longitud, más preferentemente de 21-23 nucleótidos de longitud. En modalidades preferidas, estos siRNAs logran la supresión de un gen del antígeno STEAP-l en células que expresan la proteína, y tienen efectos funcionales como se describen más adelante. El siRNA seleccionado (STEAP-l .b. oligo) fue probado en numerosas líneas celulares en el ensayo de MTS de supervivencia/proliferación (mide la actividad metabólica celular) . Los ensayos colorimétricos basados en tetrasolio (por ejemplo, MTS) , detectan exclusivamente las células viables, ya que las células vivas son metabólicamente activas y por lo tanto pueden reducir las sales de tetrasolio a compuestos de formazan coloreados; sin embargo, las células muertas, no lo hacen. Además, este oligo de STEAP-l. b logró la supresión del gen del antígeno STEAP-l en células que expresan la proteína, y tuvo efectos funcionales como se describe más adelante, utilizando los siguientes protocolos.
Transfecciones de siRNA de mamífero: El día antes de la transfección de siRNA, las diferentes líneas celulares fueron sembradas en placa en los medios (RPMl 1640 con 10% de FBS con/sin antibióticos) a 2 x 103 células/pozo en 80 µl (formato de placa de 96 pozos) para el ensayo de supervivencia/MTS. Paralelo con el oligo de siRNA específico de STEAP-l, fueron incluidas las siguientes secuencias en cada experimento como control: a) células pseudotransfectadas con lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) y el amortiguador de recocido (sin siRNA) ; b) siRNA específico de la luciferasa 4 (secuencia dirigida: 5'-AAGGGACGMGACGAACACUUCTT-3 ' ) (SEQ ID No: 82); y, c) siRNA específico de Eg5 (secuencia dirigida: 5'- AACTGAAGACCTGAAGACAATAA-3 ' ) (SEQ ID No: 83). Los SiRNAs fueron utilizados a 10 nM y una concentración final de lipofectamine de 1 µg/ml. El procedimiento fue como sigue: los siRNAs fueron primeramente diluidos en OPTIMEM (medio de transfección libre de suero, Invitrogen) a 0.1 µM (concentrado 10 veces) e incubado 5-10 a temperatura ambiente. Lipofectamide 2000 fue diluido a 10 µg/ml (concentrado 10 veces) para las transfecciones del número total, y se incubó 5-10 minutos a temperatura ambiente (TA) . Cantidades apropiadas de lipofectamine 2000 concentrado 10 veces, diluido, se mezclaron 1:1 con el siRNA concentrado 10 veces, diluido, y se incubaron a temperatura ambiente por 20-30 minutos (solución de transfección concentrada 5 veces) . 20 µls de la solución de transfección concentrada 5 veces fueron agregadas a las muestras respectivas e incubadas a 37 °C por 96 horas antes del análisis.
Ensayo de MTS: El ensayo de MTS es un método colorimétrico para determinar el número de células viables en proliferación, los ensayos de citotoxicidad o quimiosensibilidad basados en un compuesto de tetrazolio (sal interna de [3- (4, 5-dimetiltiazol-2-il) -5- (3-carboximetoxifenil) -2- (4-sulfofenil) -2H~tetrazoliuo; MTS (b) ] y un reactivo de acoplamiento de electrones (etosulfato de fenazina; PES) . Los ensayos fueron realizados mediante la adición de una pequeña cantidad del reactivo en solución directamente a los pozos de cultivo, incubando por 1-4 horas y luego registrando la absorbancia a 490 nm con un vector de placas de 96 pozos. La cantidad de producto formazan coloreado como se mide por la cantidad de absorbancia a 490 nm es directamente proporcional a la actividad mitocondrial y/o al número de células vivas en cultivo. Con el fin de dirigir la función de STEAP-l en las células, STEAP-l fue silenciado por la transfección de las líneas celulares de STEAP-l que expresan endógenamente. Como se muestra en la figura 32, la fosforilación de ERK-1 y ERK-2 fueron ambas inducidas por 10% de suero, y fueron inhibidas por el MAb M2/92.30 y siRNA para STEAP-l. En este experimento, las células PC3 fueron transfectadas con el gen de resistencia a la neomicina o con STEAP-l y el MAb en el vector pSHa. Para la supresión del gen de RNAi, las células PCE-STEAP-1 fueron establemente transfectadas con un vector pPur-U6-27-STEAP-l que contenía siRNA para STEAP-l. Las células fueron privadas de alimento en 0.1% de FBS por 18 horas a 37°C, colocadas sobre hielo por 10 minutos con o sin 10 µg/ml del MAb M2/9°2.30, llevadas a temperatura ambiente por 3 minutos y luego estimuladas con 10% de FBS por 5 minutos. Las células fueron usadas en amortiguador RIPA, los lisados de células enteras fueron resueltos mediante SDS- PAGE al 12.5% y las proteínas fueron detectadas mediante Western blot. Fosfo-ERK fue detectado con antisuero de conejo (Cell Signaling) y ERK fue detectado con anti-ERK de conejo (Zymed) . STEAP-l fue detectada con el anti-STEAP-1 de oveja, y la actina fue detectada con el MAb anti-actina (Santa Cruz) . Adicionalmente, como se muestra en la figura 33, el RNAi de STEAP-l específico, expresado establemente en células PC3-STEAP-1, reduce la comunicación célula-célula inducida por STEAP-l. En este experimento, las células PC3 fueron transfectadas con el gen de resistencia a la neomicina, solo o con STEAP-l en el vector pSRa. Para la supresión del RNAi, las células PCE-STEAP-1 fueron establemente transfectadas con un vector pPUR-U6-27-STEAP-l que contiene el siRNA para STEAP-l o un vector vacío . Las células recipientes fueron marcadas con 1 mg/ml de dextrano-rojo Texas y las células donadoras fueron marcadas con 2.5 µg/ml de calceína AM. Las células donadoras (verdes) y recipientes (rojas) fueron co-cultivadas a 37 °C por 18-24 horas y analizadas mediante microscopía para la co-localización de los colorantes fluorescentes. En todos los experimentos, las mismas células fueron utilizadas como donadoras y aceptoras.
Otra modalidad más de la invención es un método para analizar la proliferación celular relacionada a STEAP-l que es la medición de la síntesis de DNA como un marcador para la proliferación. Los precursores de DNA marcados (por Ejemplo, 3H-timidina) son utilizados y su incorporación al DNA es cuantificada. La incorporación del precursor marcado dentro del DNA es directamente proporcional a la cantidad de la división celular que ocurre en el cultivo. Otro método más, utilizado para medir la proliferación celular es la realización de ensayos clonogénicos . En estos ensayos, un número definido de células son sembradas en placas sobre la matriz apropiada y se cuenta el número de colonias formadas después de un periodo de crecimiento después del tratamiento con siRNA. En la validación del objetivo canceroso de STEAP-l, se considera la complementación del análisis de supervivencia/proliferación celular con apoptosis y los estudios de perfilamiento de ciclo celular. La marca notable bioquímica del proceso apoptótico es la fragmentación del DNA genómico. Un evento irreversible que compromete la célula hacia la muerte. Un método para observar el DNA fragmentado en las células es la detección inmunológica de fragmentos de DNA formados en complejo en histonas, mediante un inmunoensayo (por ejemplos, ELISA de detección de muerte celular) que mide el enriquecimiento de los fragmentos de DNA complej ados con histona (mono- y oligo-nucleosomas) en el citoplasma de células apoptóticas. Este ensayo no requiere la pre-marcación de las células y puede detectar la degradación del DNA en células que no proliferan in vitro (por ejemplo, células tumorales recién aisladas) . Las células efectoras más importantes para disiparar la muerte celular apoptótica, son las caspasas. Las caspasas son proteasas que cuando son activadas rompen numerosos sustratos en el sitio carboxilo-terminal de un residuo de aspartato, que es mediador de etapas muy tempranas de la apotosis después de la activación. Todas las caspasas son sintetizadas como por enzimas y la activación involucra la escisión en los residuos de aspartato. En particular, la caspasa 3 parece jugar un papel central en el inicio de los eventos celulares de la apoptosis. Los ensayos para la determinación de la activación de la caspasa 3, detecta los eventos tempranos de la apoptosis. Después de los tratamientos con RNAi, detección con Western blot de la presencia de la caspasa 3 activa de la escisión proteolítica de los productos (por ejemplo, PARP) encontrados en las células apoptóticas, apoyan adicionalmente una inducción activa de la apoptosis. Debido a que los mecanismos celulares que dan como resultado la apoptosis son complejos, cada uno tiene sus ventajas y limitaciones. La consideración de otros criterios/puntos finales tales como la morfología celular, condensación de cromatina, formación de vejigas membranales, los ' cuerpos apoptóticos ayudan a soportar adicionalmente la muerte celular como apoptótica. Ya que no todos los objetivos génicos que regulan el crecimiento celular son no apoptótico, el contenido de DNA de las células permeabilizadas, es medido para obtener el perfil de contenido de DNA o el perfil de ciclo celular. Los núcleos de células apoptóticas contienen menos DNA debido a la fuga hacia el citoplasma (población sub-Gl) . Además, el uso de manchas de DNA U (por ejemplo, yoduro de propidio) también diferencia entre las diferentes fases del ciclo celular en la población celular, debido a la presencia de diferentes cantidades de DNA en G0/G1, S y G2M. En estos estudios pueden ser cuantificadas las sub-poblaciones . Para el gen STEAP-l, los estudios del RNAi facilitan el entendimiento de la contribución del producto génico en las vías del cáncer. Tales moléculas de RNAi activas tienen uso en ensayos de identificación para seleccionar los MAbs que son terapéuticos anti-tumorales activos. Además, son administrados los siRNAs como productos terapéuticos a pacientes con cáncer para reducir el crecimiento maligno de varios tipos de cáncer incluyen aquellos listados en la tabla 1. Cuando STEAP-l juega un papel en la supervivencia celular, la proliferación celular, la tumorogénesis o la apoptosis, ésta es utilizada como un objetivo para fines de diagnóstico, de pronóstico, preventivos y/o terapéuticos.
Ejemplo 32: Modulación de la función de STEAP-l El transporte de iones juega un papel importante en la regulación del crecimiento celular, la permeabilidad intracelular, el tráfico molecular y la transducción de señales (Minke B. Cell Mol Neurobiol. 2001, 21:629; Golovina et al, Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2001, 280:H746) estas son funciones que son especialmente relevantes para la función neoplásica. La comunicación célula-célula regula la homeostasis, la proliferación celular y la muerte celular (Evans WH, Martin PE. Mol Membr Biol. 2002 19:121; Carruba G, et al, Ann N Y Acad Sci. 2002, 963:156) estas funciones también son especialmente relevantes para la condición neoplásica. El uso de líneas de células control y líneas celulares que expresan STEAP-l, los inhibidores de la función de STEAP-l, son identificadas. Por ejemplo, las células PC3 y PC3-STEAP-1 pueden ser incubadas en presencia y ausencia del MAb o inhibidores de molécula pequeña. El efecto de estos MAb o inhibidores de molécula pequeña son investigados utilizando el flujo de iones, la comunicación celular, la proliferación y los ensayos de señalización descritos anteriormente.
La transducción de señales y la salida biológica mediada por los transportadores, puede ser modulada a través de diversos mecanismos, incluyendo la inhibición del enlace al receptor y al ligando, antagonistas de iones, interacciones de proteínas, regulación de transporte de iones y moléculas pequeñas, etc. (Tang W et al, Front Biosci 2002, 7:1583). Utilizando las líneas celulares control y las líneas celulares que expresan STEAP-l, son identificados los moduladores (inhibidores o aumentadores) de la función de STEAP-l. Por ejemplo, las células PC3 y PC3 de STEAP-l son incubadas en presencia y ausencia de MAb o moduladores de molécula pequeña. En vista de las funciones de STEAP-l descritas en la presente, los moduladores que son bloqueadores de los canales de iones utilizados en el contexto de la presente invención, incluyen compuestos tales como amlodipina, azuleno, dihidropiridinas, tiaminas, nifedina, verapamil y sus derivados (Tanaka Y, Shigenobu K. Cardiovasc Drug Rev. 2001, 19:297; Djuric D, Mitrovic V, Jakovljevic V. Arzheimittelforschung. 2002, 52:365; Kourie Jl, Wood HB. Prog Biophys Mol Biol. 2000; 73:91); y los moduladores que son inhibidores de la comunicación celular utilizados en el contexto de la presente invención, incluyen compuestos tales como ácido beta-glicirretínico, retinoides, TPA (Krutovskikh VA et al, Oncogene. 2002, 21:1989; Rudkin et al, J Surg Res. 2002, 103:183; Ruch J et al, J Cell Biochem. 2001, 83:163). En consecuencia, el o los efectos de MAb o los inhibidores de moléculas pequeñas son investigados utilizando el flujo de iones, la comunicación celular, los ensayos de proliferación y señalización descritos en los ejemplos anteriores. Cuando el MAb y las moléculas pequeñas modulan, por ejemplo, inhiben, el transporte y la función tumorigénica de STEAP-l, éstos son utilizados para fines preventivos, de pronóstico, de diagnóstico y/o terapéuticos. A todo lo largo de esta solicitud, son referidos diversos contenidos de datos del sitio de la red, publicaciones, solicitudes de patente y patentes (los sitios de la red son referidos por su localizador de recursos uniforme o URL, las Direcciones en la Red Mundial) . Las descripciones de cada una de estas referencias son incorporadas por referencia en la presente, en su totalidad. La presente invención no está limitada en alcance por las modalidades descritas en la presente, las cuales están destinadas a ser ilustraciones simples de los aspectos inhibidores de la invención, y cualesquiera que sean funcionalmente equivalentes están dentro del alcance de la invención. Diversas modificaciones a los modelos y métodos de la invención, además de aquellos descritos en la presente, se volverán aparentes para aquellos expertos en la técnica, a partir de la descripción anterior y de las enseñanzas anteriores, y están similarmente destinadas a caer dentro de la invención. Tales modificaciones u otras modalidades pueden ser practicadas sin apartarse del espíritu y alcance verdaderos de la invención.
TABLAS: TABLA I: Tejidos que Expresan STEP-1 cuando hay malignidad: Próstata Vejiga Riñon Colon Pulmón Páncreas Ovario Mama Estomago Recto Linfoma TABLA II : Abreviaturas de Aminoácidos TABLA III (a) : Matriz de Substitución de Aminoácidos Adaptada de la matriz de substitución de aminoácidos BLOSUM62 del Software 9.0 de GCG (matriz de substitución en bloque). Entre más alto sea el valor, es más probable que sea encontrada una substitución en proteínas natural relacionadas. (Ver www. URL ikp. unibe . ch/manual/blosum62.html) A C D E F G H I K L M N P Q R S T V W Y . 4 0 -2 -1 -2 O -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1 -1 -1 1 O O -3 -2 A 9 -3 -4 -2 -3 -3 -1 -3 -1 -1 -3 -3 -3 -3 -1 -1 -1 -2 -2 C 6 2 -3 -1 -1 -3 -1 -4 -3 1 -1 0 -2 0 -1 -3 -4 -3 D 5 -3 -2 0 -3 1 -3 -2 0 -1 2 0 0 -1 -2 -3 -2 E 6 -3 -1 0 -3 0 0 -3 -4 -3 -3 -2 -2 -1 1 3 F 6 -2 -4 -2 -4 -3 0 -2 -2 -2 0 -2 -3 -2 -3 G 8 -3 -1 -3 -2 1 -2 0 0 -1 -2 -3 -2 2 H 4 -3 2 1 -3 -3 -3 -3 -2 -1 3 -3 -1 1 5 -2 -1 0 -1 1 2 0 -1 -2 -3 -2 K 4 2 -3 -3 -2 -2 -2 -1 1 -2 -1 L 5 -2 -2 0 -1 -1 -1 1 -1 -1 M 6 -2 0 0 1 0 -3 -4 -2 N 7 -1 -2 -1 -1 -2 -4 -3 P 5 1 0 -1 -2 -2 -1 Q 5 -1 -1 -3 -3 -2 R 4 1 -2 -3 -2 S 5 0 -2 -2 T 4 -3 -1 V 11 2 W 7 Y TABLA III (b) TABLA IV: Porciones/Superporciones de HLA de la Clase I/II TABLA IV (A) : Superporciones/Porciones de HLA de la Clase I Los residuos en negritas son preferidos, los residuos en cursivas son menos preferidos se considera que un péptido lleva porciones si éste tiene anclas primarias en cada posición de anclas primaria para una porción o superporción como se especifica en la tabla anterior.
TABLA IV (B) : Superporción de HLA de la clase II TABLA IV (C) : Porciones de HLA de la clase II os residuos en cursivas indican residuos menos preferidos o "tolerados" TABLA IV (D) Superposiciones de HLA de la Clase I Los residuos en cursivas indican los residuos menos preferidos o "tolerados" TABLA IV (E) : Porciones HLA de la Clase I POSICIÓN 1 2 3 4 5 6 7 8 I 3 Extremo C o Extremo C A1 Preferido GFYW 1a ancla DEA YFW P DEON YFW 1a ancla 9-mer STM Y Dañino DE RHKLIVMP A G A A1 Preferido GRHK ASTCLIVM 1a ancla GSTC ASTC LIV DE 1a. ancla 9-mer DEAS Y Dañino A RHKDEPYFW DE PQN RHK PG GP A1- Preferido YFW 1a ancla DEAQN A YFWQN PASTC GDE P 1a ancla - STM Y mer Dañino GP RHKGLIVM DE RHK QNA RHKYFW RHK A A1- Preferido YFW STCLIVM 1a. ancla A YFW PG G YFW 1a ancla - DEAS Y Mer Dañino RHK RHKDEPYFW P G PRHK QN A2-1 Preferido YFW 1a ancla YFW STC YFW A P 1a ancla 9- LMIVQAT VLIMAT mer Dañino DEP DERKH RKH DERKH POSICIÓN 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Extremo C A2.1 Preferido AYFW 1a ancla L.VIM G G FYWL 1a ancla - LMIVQAT VIM VLIMAT mer Dañino DEP DE RKHA P RKH DERKH RKH A3 Preferido RHK 1a ancla YFW PRHKYF A YFW P 1a ancla LMVISATFCGD W KYRHF4 Dañino DEP DE A11 Preferido A 1a ancla YFW YFW A YFW YFW P 1a ancla VTLMSAGNCDF KRYH Dañino DEP A G A24-9- Preferido YFWRHK 1a ancla STC YFW YFW 1a ancla mer DEG YFWM FLIW Dañino DE G QNP DERH KG AQN A24 Preferido 1a ancla P YFWP P ' 1a ancla - YFWM FLIW mer Dañino GDE QN RHK DE A QN DEA A3101 Preferido RHK 1a ancla YFW P YFW YFW AP 1a ancla MVTALIS RK Dañino DEP DE ADE DE DE DE A3301 Preferido 1a ancla YFW AYFW 1a ancla MVALF/S7 RK Dañino GP DE A680 Preferido YFWSTC 1a ancla YFWLIVM YFW P 1a ancla GP ' AVTMSLI RHK RK Dañino DEG A B0702 Preferido RHKFWY 1a ancla RHK RHK RHK RHK PA 1a ancla DEQNP P LIMFWYAIV Dañino DEP DE DE GDE QN DE A1 Preferido GFYW 1a ancla DEA YFW P DEQN YFW 1a ancla 9-mer STM Y Dañino DE RHKLIVMP A G A A1 Preferido GRHK ASTCUVM 1a ancla GSTC ASTC LIVM DE 1a. ancla 9-mer DEAS Y Dañino A RHKDEPYFW DE PQN RHK PG GP B3501 Preferido FWYLIVM 1a ancla FWY FWY 1a ancla AGP P LIMFWYIVA Dañino B51 Preferido IVMFWY 1a ancla FWY STC PWY G FWY 1a ancla AGPDER P UVFWYAM Dañino HKSTC DE DEQN GDE B5301 Preferido IVMFWY 1a ancla PWY STC RWY LIVMF WFWY 1a ancla P DE IMFWYALV Dañino G RHKQN B5401 Preferido FW? 1a ancla FWYL1VM LIVM ALIVM PWYA 1a ancla P P ATVLMFWY Dañino GPQNDE GDESTC RHKDE DE QNDGE TABLA IV (F) : TABLA IV (G) : Cobertura de población calculada proporcionada por diferentes combinaciones de supertipos de HLA Las porciones indican los residuos que definen las especificidades de supertipo. Las porciones incorporan residuos determinados con base en los datos publicados para ser reconocidos por múltiples alelos dentro del supertipo. Los residuos dentro de corchetes son residuos adicionales también predichos para ser tolerados por alelos múltiples dentro del supertipo.
Rvp 79% Proteasa de Proteasas de aspartilo o de aspartilo ácido, centradas sobre un retroviral centro de aspartilo catalítico Colágeno 42% Repetición de Proteínas estructurales hélice de intracelulares involucradas colágeno (20 en la formación del tejido copias) conectivo. La secuencia consiste de un G-X-Y y las cadenas polipeptídicas forman una triple hélice Fn3 20% Dominio tipo III Localizado en la región de de fibronectina enlace al ligando, extracelular de los receptores, y es de aproximadamente 200 residuos de aminoácidos de longitud con 2 pares de histeinas involucradas en los enlaces disulfuro TABLA IV(I): Ejemplos de isótopos médicos isótopo Descripción de uso Actinio-225 Ver torio 229 (Th-229) (AC-225) Actinio-227 Progenitor del radio 223 (Ra-223) el (AC-227) cual es un emisor alfa utilizado para tratar metástasis en el esqueleto que resultan del cáncer (por ejemplo, cánceres de mama y próstata) y radioinmunoterapia del cáncer Bismuto-212 Ver torio 228 (Th-228) (Bi-212) Bismuto-213 Ver torio 229 (Th-229) (Bi-213) Cadmio-109 Detección del cáncer (Cd-109) Cobalto-60 Fuente de radiación para la radioterapia (Co-60) del cáncer, para irradíadores de alimentos y para estabilización de suministros médicos Cobre-64 ün emisor de positrones utilizado para (Cu-64) la terapia del cáncer y formación de imagen SEPCT Cobre-67 Emisor beta/gamma utilizado en la (Cu-67) radioinmunoterapia del cáncer y estudios de diagnóstico (por ejemplo, cáncer de mama y colon, y linfoma) Disprosio-166 Radioinmunoterapia del cáncer (Dy-166) Erbio-169 Tratamiento de la artritis reumatoide, (Er-169) particularmente para articulaciones pequeñas asociadas con los dedos de las manos y los pies Europio-152 Fuente de radiación para irradiación de (Eu-152) alimentos y para esterilización de suministros médicos Europio-154 Fuente de radiación para irradiación de alimentos y para esterilización de (Eu-154) suministros médicos Gadolinio-153 Detección de osteoporosis y dispositivos (Gd-153) nucleares de aseguramiento de la calidad médica Oro-198 Terapia de implantes y de intracavidad (Au-198) de cánceres de ovario, de próstata y cerebro Holmio-166 Tratamiento del mieloma múltiple en (Ho-166) terapia dirigida al esqueleto, radioinmunoterapia del cáncer, ablasión de la médula ósea y tratamiento del artritis reumatoide Yodo-125 Detección de osteoporosis, formación de (1-125) imagen de diagnóstico, fármacos rastreadores, tratamiento de cáncer de cerebro, radiomarcación, formación de imagen tumoral, mapeo de receptores en el cerebro, terapia de radiación intersticial, braquiterapia para tratamiento del cáncer de próstata, determinación de la velocidad de filtración glomerular (GFR) , determinación del volumen plasmático, detección de trombosis de venas profundas de las piernas Yodo-131 Evaluación de función de la tiroides, (1-131) detección de la enfermedad de la tiroides, tratamiento del cáncer de la tiroides, así como otras enfermedades tiroideas no malignas (por ejemplo, enfermedad de Graves, bocio e hipertiroidismo) , tratamiento de la leucemia, linfoma y otras formas de cáncer (por ejemplo, cáncer de mama) utilizando radioinmunoterapia Iridio-192 Braquiterapia, tratamiento del tumor (Ir-192) del cerebro y de la médula espinal, tratamiento de arterias bloqueadas (por ejemplo, arteroesclerosis y restenosis) e implantes para tumores de mama y próstata Lutecio-177 Radioinmunoterapia del cáncer y (Lu-177) tratamiento de arterias bloqueadas (por ejemplo, arterioesclerosis y restenosis ) Molibdeno-99 Progenitor del tecnecío-99m (Tc-99m) (Mo-99) que es utilizado para la formación de imagen del cerebro, higado, pulmones, corazón y otros órganos. Actualmente, el Tc-99m es el radioisótopo más ampliamente utilizado para formación de imagen de diagnóstico de diversos cánceres y enfermedades que involucran el cerebro, el corazón, el hígado, los pulmones; también utilizado en la detección de trombosis de venas profundas de las piernas Osmio-194 Radioinmunoterapia del cáncer (Os-194) Paladio-103 Tratamiento del cáncer de próstata (Pd-103) Platino-195m Estudios sobre la biodistribución y (Pt-195m) metabolismo del cisplatino, un fármaco quimioterapéutico Fósforo-32 Policite ia rubra vera (enfermedad de (P-32) las células sanguíneas) y tratamiento de la leucemia, diagnóstico/tratamiento del cáncer de hueso; tratamiento del cáncer de colon, pancreático y hepático; radiomarcación de ácidos nucleicos para la investigación in vitro, diagnóstico de tumores superficiales, tratamiento de arterias bloqueadas (por ejemplo, ateroesclerosis y restenosis) y terapia intracavidad Fósforo-33 Tratamiento de la leucemia, (P-33) diagnóstico/tratamiento de la enfermedad ósea, radiomarcación, y tratamiento de -^ las arterias - bloqueadas (por ejemplo, ateroesclerosis y restenosis) Radio-223 Ver actinio-227 (Ac-227) (Ra-223) Renio-186 Alivio del dolor por cáncer de hueso, ° (Re-186) tratamiento de artritis reumatoide y diagnóstico y tratamiento del linfoma y cánceres de hueso, de mama, de colon y de hígado, utilizando radioinmunoterapias 5 Renio-188 Diagnóstico del cáncer y tratamiento (Re-188) utilizando radioinmunoterapia, alivio del dolor del cáncer de hueso, tratamiento de artritis reumatoide, y tratamiento del cáncer de próstata Rodio-105 Radioinmunoterapia del cáncer (Rh-105) Samario-145 Tratamiento del cáncer ocular (Sm-145) Samario-153 Radioinmunoterapia del cáncer y alivio (Sm-153) del dolor por cáncer de hueso Escandio-47 Radioinmunoterapia del cáncer y alivio (Sc-47) del dolor por cáncer de hueso Selenio-75 Radiorrastreador utilizado en estudios (Se-75) cerebrales, formación de imagen de corteza adrenal por gamma-citigrafia, localizaciones laterales de tumores secretores de esteroides, exploración pancreática, detección de glándulas paratiroideas hiperactivas, mide la velocidad de pérdida de ácido biliar a partir del combinado endógeno Estroncio-85 Detección de cáncer de hueso y (Sr-85) exploraciones cerebrales Estroncio-89 Alivio del dolor por cáncer de hueso, (Sr-89) tratamiento del mieloma múltiple y terapia osteoblástica Tecnecio-99n Ver molibdeno-99 (Mo-99) (Tc-99m) Torio-228 Progenitor de bismuto-212 (Bi-212) (Th-228) que es un emisor alfa utilizado en la radioinmunoterapia del cáncer Torio-229 Progenitor del actinio-225 (Ac-225) y (Th-229) abuelo del bismuto-213 (Bi-213) que son emisores alfa utilizados en la radioinmunoterapia del cáncer Tulio-170 Fuente gamma para irradiadores de (Tm-170) sangre, fuente de energía para dispositivos médicos implantados Estaño-117m Inmunoterapia del cáncer y alivio del (Sn-117m) dolor por cáncer de hueso Tungsteno-18í Progenitor del renio-188 ((Re-188) que (W-188) es utilizado para el diagnóstico/tratamiento del cáncer, alivio del dolor por cáncer de hueso, tratamiento del artritis reumatoide, y tratamiento de arterias bloqueadas (por ejemplo, ateroesclerosis y restenosis) Xenon-127 Neuroformación de imagen de trastorno (Xe-127) cerebrales, estudios SPECT de alta resolución, pruebas de función pulmonar, y estudios de flujos sanguíneos cerebral Iterbio-175 Radioinmunoterapia del cáncer (Yb-175) Itrio-90 Microsomillas obtenidas de la evaluación (Y-90) de Itrio-89 (Y-89) para el tratamiento del cáncer de hígado Itrio-91 Marcador de emisión gamma para el itrio-(Y-91) 90 (Y-90) que es utilizado para la radioinmunoterapia del cáncer (por ejemplo, linfoma, cánceres de mama, de colon, de riñon, de pulmón, de ovario, de próstata, pancreático y hepático inoperable) Tablas V-XVIII: Descritas en la solicitud de patente de los Estados Unidos No. 10/236,878; presentada el 6 de Septiembre del 2002, los contenidos específicos son también incorporados por referencia en la presente.
Tabla IV (h): Porciones que aparecen frecuentemente Nombre % de Descripción Función potencial Identidad promedio ZÍ-C2-H2 34% Dedo de zinc, La proteína de tipo C2H2 enlace al ácido nucleico funciona como factor de transcripción, probable localización nuclear Citocromo b N 68% Citocromo b (N- Oxidasa enlazada a terminal) b6 / la membrana, genera petB superóxido ig 19% Dominio de Los dominios son de inmunoglobulina cien de aminoácidos de longitud e incluyen un enlace disulfuro intradominio, Tabla XX: Porciones y modificaciones posttraduccionales de STEAP-l Sitio de N-gluccosilación 143 - 146 NGTK (SEQ ID NO: 84) 331 - 334 NKTE (SEQ ID NO: 85) Sitio de fosforilación de las proteínas cinasas C 3-5 SrK 160-162 TrK 187-189 SyR 246-248 TwR Sitio de fosforilación de la caseina cinasa II 3-6 SrkD (SEQ ID No: 86) 8-11 TnqE (SEQ ID No: 87) 240-243 SvsD (SEQ ID No: 88) 246-249 TwrE (SEO ID No: 89) Sitio de fosforilación de la tirosina cinasa 19-27 RRNLEEDDY (SEO ID No: 90) Sitio de N-miristoilación 133-138 GVIAAI (SEQ ID No: 91) 265-270 GTIHAL (SEQ ID No: 92) Secuencia de dirección nuclear bipartite 4-20 RKDITNQEEL KMKPRR (SEQ ID No: 93) Tabla XXI Características proteicas de STEAP-l Tablas XXII-LI: Descrita en la solicitud de patente de los Estados Unidos No. 10/236,878, presentada el 6 de septiembre del 2002, los contenidos específicos son completamente incorporados por referencia en la presente.
Tabla LII : Péptidos de búsqueda STEAP 1 Variante 1: nonámeros, decámeros y 15-mers: aa 1-339 (SEQ ID No: 94) MESRKDITNQ EELWKMKPRR NLEEDDYLHK DTGETSMLKR PVLLHLHQTA HADEFDCPSE 60 LQHTQELFPQ HLPIKIAAI lASLTFLYTL LREVIHPLAT SHQQYFYKIP ILVINKVLPM 120 VSITLLALVY LPGVIAAIVQ LHNGTKYKKF PH LDKWMLT RKQFGLLSFF FAVLHAIYSL 180 SYPMRRSYRY KLLNWAYQQV QQNKEDAWIE HDVWRMEI V SLGIVGLAIL ALLAVTSIPS 240 VSDSLTWREF HYIQSKLGIV SLLLGTIHAL IFAWNKWIDI KQFVWYTPPT FMIAVFLPIV 300 VLIFKSILFL PCLRKKILKI RHGWEDVTKI NKTEICSQL 339 Variante 2 : 9-mers aa 247-258 (SEQ ID No: 95) WREFHYIQVNNI 10-mers aa 246-258 (SEQ ID No: 96) TWREFHYIQVNNI 15-mers aa 241-258 (SEQ ID No: 97) VSDSLTWREFHYIQVNN1 Variante 3: 9-mers aa 247- (SEQ ID No: 98) WREFHYIQIIHKKSDVPESL DPCLTRFKGLNLIQS 10-mers aa 246- (SEQ ID No: 99) T REFHYIQIIHKKSDVPESL DPCLTRFKGLNLIQS 15-mers aa 241- (SEQ ID No: 100) VDSLT REFHYIQIIHKKSDVPESLWDPCLTRFKGLNLIQS Variante 4: 9-mers aa 160-176 (SEQ ID No: 101) RKQFGLLSLFFAVLHAI 10-mers aa 159-177 (SEQ ID No: 102) TRKQFGLLSLFFAVLHAIY 15-mers aa 154-182 (SEQ ID No: 103) DK MLTRKOFGLLSLFFAVLHAIYSLSYP Tabla Lili Composición de exón de la variante 1 de STEAP-1 (8P1D4) .
Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (44)

  1. REIVINDICACIONES
  2. Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones: 1. ün anticuerpo o fragmento del mismo, caracterizado porque comprende un sitio de enlace al antígeno que se enlaza específicamente a la proteína STEAP-l (SEQ ID NO: ) . 2. El anticuerpo o fragmento de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
  3. 3. El anticuerpo o fragmento de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el anticuerpo es designado X92.1.30.1.1 (1) y se le asignó el No. de acceso de la A.T.C:C: PTA-5802.
  4. 4. El anticuerpo o fragmento de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el anticuerpo es designado X120.545.1.1 y se le asignó el No. de acceso la A.T.C:C: PTA-5803.
  5. 5. El anticuerpo o fragmento de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo humanizado.
  6. 6. El anticuerpo o fragmento de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el fragmento es un fragmento Fab, F(ab')2, Fv o SFv.
  7. 7. El anticuerpo o fragmento de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo humano .
  8. 8. El anticuerpo o fragmento de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el sitio de enlace al antígeno es un dominio de enlace de antígeno murino.
  9. 9. El anticuerpo o fragmento de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque es recombinantemente producido.
  10. 10. El anticuerpo o fragmento de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la proteína recombinante comprende la región de enlace al antígeno.
  11. 11. El anticuerpo o fragmento de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo es acoplado a un marcador detectable, una toxina, o un agente terapéutico .
  12. 12. El anticuerpo o fragmento de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el marcador detectable es un radioisótopo, un quelante de metales, una enzima, un compuesto fluorescente, un compuesto bioluminiscente o un compuesto quimioluminiscente.
  13. 13. El anticuerpo o fragmento de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el radioisótopo comprende 212Bi, 131I, 131In, 90Y, 186Re, 211At, 125I, 188Re, 153Sm, 213Bi, 32P, o Lu.
  14. 14. El anticuerpo o fragmento de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque la toxina comprende ricina, cadena A de ricina, doxorrubicina, daunorrubicina, un maitansinoide, taxol, bromuro de etidio, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, dihidroxi-antracin-diona, actinomicina, toxina de la difteria, exotoxina de Pseudomonas (PE) , PE40, abrina, cadena A de abrina, cadena A de modecina, alfa-sarcina, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina, curicina, crotina, caliqueamicina, inhibidor de sapaonaria officinalis, glucocorticoide, auristatina, auromicina, itrio, bismuto, combrestatina, duocarmicinas, dolostatina, ccl065, o un cisplatino.
  15. 15. El anticuerpo o fragmento de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el sitio de enlace al antígeno se enlaza específicamente a un epitopo dentro de los aminoácidos de una proteína de la Figura 2 (SEQ ID NO: ) .
  16. 16. ün animal transgénico, caracterizado porque produce el anticuerpo monoclonal de conformidad con la reivindicación 2.
  17. 17. ün hibridoma, caracterizado porque produce el anticuerpo monoclonal de conformidad con la reivindicación 2.
  18. 18. Un vector, caracterizado porque comprende un polinucleótido que codifica para un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 2.
  19. 19. El vector de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque es una cadena simple que comprende los dominios variables de las cadenas pesada y ligera.
  20. 20. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende el anticuerpo o fragmento de conformidad con la reivindicación 1 en una forma de dosis unitaria humana.
  21. 21. Un ensayo para detectar la presencia de una proteína STEAP-l en una muestra biológica, caracterizado porque comprende poner en contacto la muestra con un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, y detectar el enlace de la proteína STEAP-l (SEQ ID NO: ) en la muestra.
  22. 22. Un método para inhibir el crecimiento de las células que expresan STEAP-l (SEQ ID NO:) en un sujeto, caracterizado porque comprende: administrarle al sujeto un vector que codifica para un anticuerpo monoclonal de cadena simple, que comprende los dominios variables de las cadenas pesada y ligera de un anticuerpo monoclonal que se enlaza específicamente a una proteína STEAP-1, tal que el vector distribuye una secuencia que codifica para el anticuerpo monoclonal de cadena simple, a las células cancerosas, y el anticuerpo de cadena simple codificado es expresado intracelularmente en éstas.
  23. 23. Un método para distribuir un agente citotóxico o un agente de diagnóstico a una célula que expresa una proteína STEAP-l (SEQ ID NO: ), caracterizado porque comprende : la provisión de un agente citotóxico o un agente de diagnóstico conjugado al anticuerpo o al fragmento de conformidad con la reivindicación 1, para formar un conjugado anticuerpo-agente o fragmento-agente; y la exposición de la célula al conjugado anticuerpo- agente o fragmento-agente.
  24. 24. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque el agente citotóxico o el agente de diagnóstico se selecciona del grupo que consiste de un marcador detectable, una toxina y un agente terapéutico.
  25. 25. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque el marcador detectable es un radioisótopo, un quelante de metales, una enzima, un compuesto fluorescente, un compuesto bioluminiscente o un compuesto quimioluminiscente.
  26. 26. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el radioisótopo comprende 12Bi, 131I, 131In, 90Y, 186Re, 211At, 125I, 188Re, 153Sm, 213Bi, 32P, o Lu.
  27. 27. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque la toxina comprende ricina, doxorrubicina, daunorrubicina, un maitansinoide, taxol, bromuro de etidio, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, dihidroxi-antracin- diona, actinomicina, toxina de la difteria, exotoxina de Pseudomonas (PE)A, PE40, abrina, cadena A de abrina, cadena A de modecina, alfa-sarcina, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina, curicina, crotina, caliqueamicina, inhibidor de sapaonaria officinalis, glucocorticoide, auristatina, auromicina, itrio, bismuto, combrestatina, duocarmicinas, dolostatina, ccl065, o un cisplatino.
  28. 28. ün método para detectar una proteína STEAP-l (SEQ ID NO: ) en una muestra biológica, caracterizado porque comprende los pasos de: proporcionar la muestra biológica y la muestra control; poner en contacto la muestra biológica y la muestra control con el anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, que se enlaza específicamente a la proteína STEAP-l; y determinar una cantidad de un complejo de la sustancia con la proteína SEAP-1, y el anticuerpo presente en la muestra biológica y la muestra control.
  29. 29. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque comprende además: la toma de la muestra biológica y la muestra control de un paciente quien tiene o que es sospechoso de tener un cáncer listado en la Tabla I. '
  30. 30. Una composición, caracterizada porque comprende el siRNA (RNA de doble hebra) de STEAP-l que corresponde al ácido nucleico que codifica para una proteína descrita en la Figura 2 o una subsecuencia de la misma, en donde la subsecuencia es de 19, 20, 21, 22, 23, 24 ó 25 nucleótidos de RNA contiguos de longitud, y contiene las secuencias que son complementarias y no complementarias al menos a una porción del mRNA que codifica para la secuencia.
  31. 31. Un método para identificar una molécula que modula la proliferación celular, caracterizado porque comprende : (a) introducir una molécula a un sistema que comprende un ácido nucleico que incluye una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste de: (i) la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1; (ii) una secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido que consiste de la secuencia de aminoácidos descrita en la Figura 3; (iii) una secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido que es 90% o más idéntico a la secuencia de aminoácidos descrita en la Figura 3; y (iv) un fragmento de una secuencia de nucleótidos de (i) , (ii) , o (iii) ; o la introducción de una molécula de prueba a un sistema que comprende una proteína codificada por una secuencia de nucleótidos de (i) , (ii) , (iii) , o (iv) ; y (b) determinar la presencia o la ausencia de una interacción entre la molécula y la secuencia de nucleótidos o la proteína, con lo cual la presencia de una interacción entre la molécula y la secuencia de nucleótidos o la proteína, identifica la molécula como una molécula que modula la proliferación celular.
  32. 32. El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque el sistema es in vivo .
  33. 33. El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque el sistema es in vitro.
  34. 34. El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque la molécula comprende un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se enlaza específicamente a la proteína codificada por la secuencia de nucleótidos de (i) , (ii) , (iii) , o (iv) .
  35. 35. El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque la molécula es una composición que comprende el siRNA (RNA de doble hebra) de STEAP-l que corresponde al ácido nucleico que codifica para una proteína descrita en la Figura 2 o una subsecuencia de la misma, en donde la subsecuencia es de 19, 20, 21, 22, 23, 24 ó 25 nucleótidos de RNA contiguos de longitud, y contiene las secuencias que son complementarias y no complementarias al menos a una porción del mRNA que codifica para la secuencia.
  36. 36. Un método para tratar un cáncer en un sujeto, caracterizado porque comprende administrar una molécula identificada por el método de conformidad con la reivindicación 31 a un sujeto diagnosticado con cáncer, con lo cual la molécula inhibe o retarda un cáncer en el sujeto.
  37. 37. El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque el cáncer es un cáncer descrito en la Tabla I.
  38. 38. Un método para identificar un agente terapéutico para el tratamiento de un cáncer listado en la Tabla I, caracterizado porque comprende: (a) introducir una molécula a un sistema que comprende un ácido nucleico que incluye una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste de: (i) la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1; (ii) una secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido que consiste de la secuencia de aminoácidos descrita en la Figura 3; (iii) una secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido que es 90% o más idéntico a la secuencia de aminoácidos descrita en la Figura 3; y (iv) un fragmento de una secuencia de nucleótidos de (i) , (ii) , o (iii) ; o la introducción de una molécula de prueba a un sistema que comprende una proteína codificada por una secuencia de nucleótidos de (i) , (ii) , (iii) , o (iv) ; y (b) determinar la presencia o la ausencia de una interacción entre la molécula y la secuencia de nucleótidos o la proteína, con lo cual la presencia de una interacción entre la molécula y la secuencia de nucleótidos o la proteína, identifica la molécula como un agente terapéutico para el tratamiento de un cáncer de un tejido listado en la Tabla I.
  39. 39. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque el sistema es in vitro .
  40. 40. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque el sistema es in vivo.
  41. 41. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque la molécula comprende un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se enlaza específicamente a la proteína codificada por la secuencia de nucleótidos de (i) , (ii) , (iii) , o (iv) .
  42. 42. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque la molécula es una composición que comprende el siRNA (RNA de doble hebra) de STEAP-l que corresponde al ácido nucleico que codifica para una proteína descrita en la Figura 2 o una subsecuencia de la misma, en donde la subsecuencia es de 19, 20, 21, 22, 23, 24 ó 25 nucleótidos de RNA contiguos de longitud, y contiene las secuencias que son complementarias y no complementarias al menos a una porción del mRNA que codifica para la secuencia.
  43. 43. Un método para tratar un cáncer en un sujeto, caracterizado porque comprende administrar una molécula identificada por el método de conformidad con la reivindicación 38, a un sujeto diagnosticado con cáncer, con lo cual la molécula inhibe o retarda un cáncer en el sujeto.
  44. 44. El método de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado porque el cáncer es un cáncer descrito en la Tabla I.
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