RU2765242C2

RU2765242C2 - Антигенсвязывающие конструкции против молекул-мишеней

Info

Publication number: RU2765242C2
Application number: RU2018105374A
Authority: RU
Inventors: Чио Муй ЧАН; Жан Гудас; Туве ОЛАФСЕН; Даулет Кадыл САТПАЕВ; Михаил Юрий ТОРГОВ
Original assignee: Имаджинаб, Инк.
Priority date: 2015-08-07
Filing date: 2016-08-04
Publication date: 2022-01-27
Also published as: JP2020100668A; JP7097923B2; JP2018529758A; EP4137158A1; WO2017027325A1; US11254744B2; HK1255107A1; US20220089730A1; AU2023200616A1; JP2024069225A; CN115960230A; JP7026613B2; AU2016304764A1; EP3331564A1; KR20180050321A; RU2018105374A; SG10201913625XA; MX2022014463A; RU2018105374A3; ZA201801391B

Abstract

Группа изобретений относится к биотехнологии и иммунологии, в частности к шарнирным структурам в антигенсвязывающих конструкциях. Предложена аминокислотная шарнирная область, содержащая EPKSSDKTHTCPPCPPC. Также предложена аминокислотная шарнирная область, содержащая центральную шарнирную последовательность CPPCPPC (SEQ ID NO: 52) или CPPCPPCPPC (SEQ ID NO: 54), присоединенную к верхней шарнирной последовательности ELKTPLGDTTHT (SEQ ID NO: 48) или EPKSSDKTHT (SEQ ID NO: 46). Указанные шарнирные области находятся в мини-антителах, которые связываются с молекулой-мишенью. Мини-антитела в составе композиции могут применяться для диагностической визуализации или доставки полезной терапевтической нагрузки. Изобретения обеспечивают улучшенную конструкцию мини-антитела, содержащего указанную шарнирную область, позволяют улучшить стабильность и/или снизить агрегацию мини-антител, снизить уровень полумолекул до менее 1%. 6 н. и 19 з.п. ф-лы, 80 ил., 8 табл., 25 пр.

Description

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

[0001] Настоящая заявка испрашивает приоритет на основании предварительной заявки США №62/202,665, поданной 7 августа 2015 года, которая полностью включена в настоящую заявку посредством ссылки.

ССЫЛКА НА ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

[0002] Настоящая заявка подается вместе с перечнем последовательностей в электронном формате. Перечень последовательностей представлен в виде файла под именем IGNAB030WOSEQUENCE.TXT, который был создан и последний раз изменен 3 августа 2016 года, размер которого составляет 270446 байт. Информация из электронного перечня последовательностей полностью включена в настоящую заявку посредством ссылки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

[0003] Варианты реализации, описанные в настоящем документе, в общем смысле относятся к шарнирным структурам в антигенсвязывающих конструкциях (таких как любые слитые белки scFv, такие как миниантитела), а также к антигенсвязывающим конструкциям самим по себе, а также к способам их применения.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0004] Существует широкий спектр антигенсвязывающих конструкций, известных в данной области техники. Последовательности таких конструкций часто варьируют в участках CDR (участки, определяющие комплементарность); вариации в каркасных участках и в других частях антител (таких как C_H3 и шарнирные области) являются менее частыми.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0005] Согласно некоторым аспектам предложена аминокислотная шарнирная область, содержащая последовательность SEQ ID NO: 1 (X_n1CX_n2X_n3CX_n4X_n5C). Xn₁ может представлять собой любую аминокислоту, которая в природе не образует ковалентной перекрестно-сшивающей связи. X_n2 представляет собой одну аминокислоту из: A, R, N, D, Е, Q, G, Н, I, L, K, М, F, Р, S, Т, W, Y или V. X_n3 может представлять собой любую аминокислоту. X_n4 может представлять собой любую аминокислоту. X_n5 может представлять собой любую аминокислоту.

[0006] Согласно некоторым аспектам X_n1 не образует ковалентной перекрестно-сшивающей связи с другой аминокислотой (SEQ ID NO: 191). Согласно некоторым аспектам X_n1 не представляет собой цистеин (SEQ ID NO: 192). Согласно некоторым аспектам X_n1 представляет собой одну аминокислоту из: A, R, N, D, Е, Q, G, Н, I, L, K, М, F, Р, S, Т, W, Y или V (SEQ ID NO: 193). Согласно некоторым аспектам X_n2 представляет собой Р, V или Е (SEQ ID NO: 194). Согласно некоторым аспектам X_n2 представляет собой Р или V (SEQ ID NO: 195). Согласно некоторым аспектам X_n4 представляет собой Р, V или Е (SEQ ID NO: 196). Согласно некоторым аспектам X_n4 представляет собой Р или V (SEQ ID NO: 197). Согласно некоторым аспектам X_n3 представляет собой Р или Е (SEQ ID NO: 198). Согласно некоторым аспектам X_n5 представляет собой Р или Е (SEQ ID NO: 199). Согласно некоторым аспектам X_n3 представляет собой Р или Е (SEQ ID NO: 200). Согласно некоторым аспектам X_n2X_n3 представляет собой VE (SEQ ID NO: 201). Согласно некоторым аспектам X_n2X_n3 представляет собой РР (SEQ ID NO: 202). Согласно некоторым аспектам X_n4X_n5 представляет собой VE (SEQ ID NO: 203). Согласно некоторым аспектам X_n4X_n5 представляет собой РР (SEQ ID NO: 204). Согласно некоторым аспектам X_n2X_n3 представляет собой VE, и X_n4X_n5 представляет собой РР (SEQ ID NO: 205). Согласно некоторым аспектам X_n2X_n3 представляет собой РР, и X_n4X_n5 представляет собой РР или VE (SEQ ID NO: 206). Согласно некоторым аспектам X_n2X_n3 представляет собой VE, и X_n4X_n5 представляет собой VE или РР (SEQ ID NO: 207). Согласно некоторым аспектам шарнир дополнительно содержит удлиняющую или нижнюю шарнирную последовательность, С-концевую относительно последнего цистеина в X_n1CX_n2X_n3CX_n4X_n5C (SEQ ID NO: 1). Согласно некоторым аспектам удлиняющая или нижняя шарнирная последовательность содержит по меньшей мере одну аминокислоту из S, G, А, Р или V. Согласно некоторым аспектам удлиняющая последовательность содержит по меньшей мере GGGSSGGGSG (SEQ ID NO: 59). Согласно некоторым аспектам линкерная последовательность содержит по меньшей мере APPVAGP (SEQ ID NO: 60). Согласно некоторым аспектам шарнирная область по п. 1 является частью центральной (коровой) шарнирной области. Согласно некоторым аспектам шарнир дополнительно содержит верхнюю шарнирную область, примыкающую к центральной шарнирной области. Согласно некоторым аспектам шарнир дополнительно содержит нижнюю шарнирную область или удлиняющую область, примыкающую к центральной шарнирной области. Согласно некоторым аспектам шарнир дополнительно содержит верхнюю шарнирную область, примыкающую к центральной шарнирной области. Согласно некоторым аспектам X_n1 содержит серии, треонин или аланин (SEQ ID NO: 209). Согласно некоторым аспектам X_n1 содержит серии (SEQ ID NO: 210). Согласно некоторым аспектам X_n1 содержит аланин (SEQ ID NO: 211). Согласно некоторым аспектам аминокислотная шарнирная область содержит по меньшей мере одну из следующих последовательностей: SCVECPPCP (SEQ ID NO: 56) или ТСРРСРРС (SEQ ID NO: 166). Согласно некоторым аспектам аминокислотная шарнирная область содержит по меньшей мере одну из следующих последовательностей: ERKSCVECPPCP (SEQ ID NO: 167), EPKSSDKTHT (SEQ ID NO: 46) и CPPCPPC (SEQ ID NO: 52). Согласно некоторым аспектам аминокислотная шарнирная область содержит по меньшей мере одну из следующих последовательностей: ERKSCVECPPCPGGGSSGGGSG (SEQ ID NO: 34), или ERKSCVECPPCPAPPVAGP (SEQ ID NO: 33), или EPKSSDKTHTCPPCPPCGGGSSGGGSG (SEQ ID NO: 26), или EPKSSDKTHTCPPCPPCAPELLGGP (SEQ ID NO: 25).

[0007] Согласно некоторым аспектам предложена аминокислотная шарнирная область. Аминокислотная шарнирная область содержит последовательность SEQ ID NO: 2 (X_n1X_n2X_n3X_n4X_n5X_n6CX_n7X_n8CX_n9X_n10C). X_n1 может представлять собой любые m аминокислот (где m представляет собой любое количество аминокислот любого типа). X_n2 может представлять собой любую аминокислоту. X_n3 может представлять собой любую аминокислоту. X_n4 может представлять собой любую аминокислоту. X_n5 может представлять собой любую аминокислоту. X_n6 может представлять собой любую аминокислоту, отличную от цистеина. X_n7 может представлять собой любую аминокислоту. X_n8 может представлять собой любую аминокислоту. X_n9 может представлять собой любую аминокислоту. X_n10 может представлять собой любую аминокислоту (см., например, SEQ ID NO: 212). Согласно некоторым аспектам X_n1 не представляет собой цистеин (см., например, SEQ ID NO: 213). Согласно некоторым аспектам X_n2 не представляет собой цистеин (см., например, SEQ ID NO: 214). Согласно некоторым аспектам X_n2 представляет собой D (см., например, SEQ ID NO: 215). Согласно некоторым аспектам X_n3 представляет собой K (см., например, SEQ ID NO: 216). Согласно некоторым аспектам X_n4 представляет собой Т (см., например, SEQ ID NO: 217). Согласно некоторым аспектам X_n5 представляет собой Н (см., например, SEQ ID NO: 218). Согласно некоторым аспектам X_n6 представляет собой Т (см., например, SEQ ID NO: 219). Согласно некоторым аспектам X_n7 представляет собой Р или V (см., например, SEQ ID NO: 220). Согласно некоторым аспектам X_n8 представляет собой Р или Е (см., например, SEQ ID NO: 221). Согласно некоторым аспектам X_n9 представляет собой Р или V (см., например, SEQ ID NO: 222). Согласно некоторым аспектам X_n10 представляет собой Р или Е (см., например, SEQ ID NO: 223). Согласно некоторым аспектам аминокислотная шарнирная область дополнительно содержит мотив СХХС (см., например, SEQ ID NO: 224) или СХХС (см., например, SEQ ID NO: 225), который расположен перед X_n1. Согласно некоторым аспектам аминокислотная шарнирная область дополнительно содержит последовательность X_n11X_n12C, непосредственно присоединенную к С-концевому цистеину в SEQ ID NO: 2, где X_n11 может представлять собой любую аминокислоту, и где X_n12 может представлять собой любую аминокислоту (см., например, SEQ ID NO: 226). Согласно некоторым аспектам X_n11 представляет собой Р или V, и X_n12 представляет собой Р или Е (см., например, SEQ ID NO: 227). Согласно некоторым аспектам X_n1 представляет собой серии, X_n2 представляет собой D, X_n3 представляет собой K, X_n4 представляет собой Т, X_n5 представляет собой Н, X_n6 представляет собой Т, X_n7 представляет собой Р, X_n8 представляет собой Р, X_n9 представляет собой Р, и X_n10 представляет собой Р (см., например, SEQ ID NO: 228). Согласно некоторым аспектам шарнирная область содержит по меньшей мере одну из следующих последовательностей: СРРСРРС (SEQ ID NO: 52), CPPCVECPPC (SEQ ID NO: 53) или CPPCPPCPPC (SEQ ID NO: 54). Согласно некоторым аспектам шарнирная область содержит по меньшей мере одну из следующих последовательностей: EPKSSDKTHTCPPCPPC (SEQ ID NO: 168), EPKSSDKTHTCPPCVECPPC (SEQ ID NO: 169) или EPKSSDKTHTCPPCPPCPPC (SEQ ID NO: 170). Согласно некоторым аспектам шарнирная область содержит по меньшей мере одну из следующих последовательностей: EPKSSDKTHTCPPCPPCGGGSSGGGSG (SEQ ID NO: 26), EPKSSDKTHTCPPCVECPPCGGGSSGGGSG (SEQ ID NO: 28) или EPKSSDKTHTCPPCPPCPPCGGGSSGGGSG (SEQ ID NO: 30).

[0008] Согласно некоторым аспектам предложена аминокислотная шарнирная область. Шарнирная область содержит центральную шарнирную последовательность, имеющую по меньшей мере одной последовательность из: CVECPPCP (SEQ ID NO: 57), СРРСРРС (SEQ ID NO: 52) или CPPCPPCPPC (SEQ ID NO: 54), или CPPCVECPPC (SEQ ID NO: 53), присоединенную к последовательности верхнего шарнира ELKTPLGDTTHT (SEQ ID NO: 48) или EPKSSDKTHT (SEQ ID NO: 46).

[0009] Согласно некоторым аспектам предложена аминокислотная шарнирная область для антитела, причем данная область может содержать верхнюю шарнирную область, которая не содержит аминокислот, способных к перекрестному сшиванию с соответствующей аминокислотой; и центральную шарнирную область, присоединенную к С-концу верхней шарнирной области, причем центральная шарнирная область содержит по меньшей мере три цистеина на цепь. Согласно некоторым аспектам аминокислотная шарнирная область дополнительно содержит нижнюю шарнирную область или удлиняющую область, присоединенную с С-конца к центральной шарнирной области, причем нижняя шарнирная последовательность или удлиняющая последовательность представляет собой по меньшей мере одну последовательность из: APPVAGP (SEQ ID NO: 60), APELLGGP (SEQ ID NO: 58) и/или GGGSSGGGSG (SEQ ID NO: 59). Согласно некоторым аспектам верхняя шарнирная область не содержит цистеинов, которые образуют поперечные сшивки с верхней шарнирной областью. Согласно некоторым аспектам верхняя шарнирная область не содержит цистеинов. Согласно некоторым аспектам данная область дополнительно содержит нижнюю шарнирную область или удлиняющую область. Согласно некоторым аспектам нижняя шарнирная область или удлиняющая область содержит по меньшей мере одну последовательность из: GGGSSGGGSG (SEQ ID NO: 59) или APPVAGP (SEQ ID NO: 60), или APELLGGP (SEQ ID NO: 58). Согласно некоторым аспектам при расположении в миниантителе, и когда миниантитело вводят субъекту-человеку, миниантитело выводится из организма субъекта преимущественно через печень. Согласно некоторым аспектам при расположении в миниантителе, и когда миниантитело вводят субъекту-человеку, миниантитело не выводится из организма субъекта преимущественно через через почки. Согласно некоторым аспектам шарнирная область находится в антителе. Согласно некоторым аспектам шарнирная область находится в связывающем фрагменте антитела. Согласно некоторым аспектам шарнирная область находится в миниантителе. Согласно некоторым аспектам шарнирная область находится в моноспецифичном антителе. Согласно некоторым аспектам шарнирная область содержит по меньшей мере три цистеина на цепь. Согласно некоторым аспектам шарнирная область содержит по меньшей мере четыре цистеина на цепь. Согласно некоторым аспектам шарнирная область содержит по меньшей мере пять цистеинов на цепь. Согласно некоторым аспектам цистеины распределены на протяжении аминокислотной шарнирной области в повторяющемся мотиве СХХ или CXY. Согласно некоторым аспектам шарнирная область находится в биспецифичном антителе. Согласно некоторым аспектам биспецифичное антитело сконструировано в соотношении 1:1. Согласно некоторым аспектам биспецифичное антитело содержит фрагмент антитела. Согласно некоторым аспектам биспецифичное антитело представляет собой миниантитело.

[0010] Согласно некоторым аспектам предложена фармацевтическая композиция. Фармацевтическая композиция может содержать аминокислотную шарнирную область согласно любой из таковых, раскрытых в настоящем документе. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения данный подход приводит к тому, что в композиции наблюдается менее 5% агрегации антитела.

[0011] Согласно некоторым аспектам предложена фармацевтическая композиция, содержащая аминокислотную шарнирную область согласно любой из таковых, раскрытых в настоящем документе. Согласно некоторым аспектам присутствует по меньшей мере от 1 микрограмма до 100 мг антитела.

[0012] Согласно некоторым аспектам предложено миниантитело, содержащее центральную шарнирную область. Центральная шарнирная область содержит по меньшей мере три цистеина на цепь, образующих по меньшей мере три дисульфидные связи в центральной шарнирной области. Согласно некоторым аспектам первый остаток центральной области представляет собой серии. Согласно некоторым аспектам центральная шарнирная область содержит SCVECPPCP (SEQ ID NO: 56).

[0013] Согласно некоторым аспектам предложено миниантитело. Миниантитело может содержать последовательность X_n1CX_n2X_n3CX_n4X_n5C (SEQ ID NO: 3). Данная последовательность может быть расположена в виде центральной шарнирной области миниантитела. X_n1 может представлять собой любую аминокислоту или отсутствие аминокислоты. X_n2 может представлять собой любую аминокислоту. X_n3 может представлять собой любую аминокислоту. X_n4 может представлять собой любую аминокислоту. X_n5 может представлять собой любую аминокислоту. Согласно некоторым аспектам X_n1 представляет собой любую аминокислоту, отличную от цистеина (SEQ ID NO: 229). Согласно некоторым аспектам X_n1 представляет собой серии (SEQ ID NO: 230).

[0014] Согласно некоторым аспектам предложен вариант шарнира миниантитела. Вариант шарнира может содержать первое измененное положение аминокислоты. Первое измененное положение представляет собой аминокислоту, которая в шарнире нативного антитела представляла бы собой цистеин, и была изменена в первом измененном положении так, что она не образует дисульфидной связи. Вариант шарнира может также содержать по меньшей мере три цистеина на цепь, С-концевых относительно первого измененного положения аминокислоты. Согласно некоторым аспектам шарнирная область состоит из SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым аспектам SEQ ID NO: 1 представляет собой центральную шарнирную область, и причем центральная шарнирная область по существу состоит из SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым аспектам центральная шарнирная область состоит из SEQ ID NO: 1.

[0015] Согласно некоторым аспектам предложено миниантитело. Миниантитело связывается с антигеном-мишенью, причем антиген-мишень представляет собой по меньшей мере один антиген из CD3, CD8, 5Т4, ПСМА (простатический специфический мембранный антиген) или АСКП (антиген стволовых клеток предстательной железы). Миниантитело содержит полипептид, содержащий: одноцепочечный вариабельный фрагмент (single-chain variable fragment, scFv), который связывается с антигеном-мишенью, причем scFv содержит вариабельный домен тяжелой цепи (V_H), соединенный с вариабельным доменом легкой цепи (V_L); и вариант шарнирной области, содержащий по меньшей мере три цистеина на каждой цепи шарнира.

[0016] Согласно некоторым аспектам миниантитело дополнительно содержит последовательность C_H3 IgG человека. Согласно некоторым аспектам миниантитело дополнительно содержит поддающийся обнаружению маркер, который выбран из группы, состоящей из радиоактивного вещества, красителя, контрастного вещества, флуоресцентного соединения, биолюминесцентного соединения, фермента, усиливающего средства и наночастицы.

[0017] Согласно некоторым аспектам миниантитело содержит: HCDR1 согласно HCDR1, раскрытому в настоящем документе; HCDR2 согласно HCDR2, раскрытому в настоящем документе; HCDR3 согласно HCDR3, раскрытому в настоящем документе; LCDR1 согласно LCDR1, раскрытому в настоящем документе; LCDR2 согласно LCDR2, раскрытому в настоящем документе; и LCDR3 согласно LCDR3, раскрытому в настоящем документе.

[0018] Согласно некоторым аспектам вариабельный домен тяжелой цепи (V_H) и вариабельный домен легкой цепи (V_L) представляют собой последовательности человека.

[0019] Согласно некоторым аспектам предложена нуклеиновая кислота, кодирующая миниантитело, раскрытое в настоящем документе.

[0020] Согласно некоторым аспектам предложена линия клеток, продуцирующая миниантитело, раскрытое в настоящем документе.

[0021] Согласно некоторым аспектам предложен набор, содержащий любое из миниантител, описанных в настоящем документе, и поддающийся обнаружению маркер.

[0022] Согласно некоторым аспектам предложен способ обнаружения присутствия или отсутствия антигена-мишени. Антиген-мишень представляет собой по меньшей мере один антиген из CD3, CD8, 5Т4, ПСМА или АСКП. Способ включает применение миниантитела, раскрытого в настоящем документе, в отношении образца; и обнаружение связывания или отсутствия связывания антигенсвязывающей конструкции указанного миниантитела с антигеном-мишенью.

[0023] Согласно некоторым аспектам миниантитело содержит поддающийся обнаружению маркер, который выбран из группы, состоящей из радиоактивного вещества, красителя, контрастного вещества, флуоресцентного соединения, биолюминесцентного соединения, фермента, усиливающего средства и наночастицы. Согласно некоторым аспектам применение миниантитела включает введение миниантитела субъекту. Согласно некоторым аспектам обнаружение связывания или отсутствия связывания миниантитела с антигеном-мишенью включает позитронно-эмиссионную томографию. Согласно некоторым аспектам способ также включает применение вторичного антитела или его фрагмента в отношении образца, причем вторичное антитело или его фрагмент специфично связывается с миниантителом. Согласно некоторым аспектам миниантитело инкубируют с образцом в течение не более 1 часа.

[0024] Согласно некоторым аспектам предложен способ нацеливания терапевтического средства на антиген-мишень. Антиген-мишень представляет собой по меньшей мере один антиген из CD3, CD8, 5Т4, ПСМА или АСКП. Способ включает введение субъекту миниантитела, раскрытого в настоящем документе, причем миниантитело конъюгировано с терапевтическим средством.

[0025] Согласно некоторым аспектам предложен способ нейтрализации клетки В- или Т-лимфоцита у субъекта, который нуждается в такой нейтрализации. Способ включает введение субъекту миниантитела, раскрытого в настоящем документе, которое связывается с CD8 и/или CD3. Согласно некоторым аспектам субъект страдает от по меньшей мере одного из нарушений, указанных в настоящем документе.

[0026] Согласно некоторым аспектам предложено антитело и/или миниантитело, которое связывается с антигеном-мишенью (таким как CD8, CD3, 5Т4, ПСМА, АСКП). Антитело и/или миниантитело содержит шарнирную область, причем шарнирная область содержит по меньшей мере один элемент из следующих:

а) аминокислотную шарнирную область, содержащую последовательность SEQ ID NO: 1 (X_n1CX_n2X_n3CX_n4X_n5C), где X_n1 может представлять собой любую аминокислоту, которая в природе не образует ковалентной перекрестно-сшивающей связи, где X_n2 представляет собой одну аминокислоту из: A, R, N, D, Е, Q, G, Н, I, L, K, М, F, Р, S, Т, W, Y или V, где X_n3 может представлять собой любую аминокислоту, где X_n4 может представлять собой любую аминокислоту, и где X_n5 может представлять собой любую аминокислоту;

b) аминокислотную шарнирную область, содержащую последовательность SEQ ID NO: 2 (X_n1X_n2X_n3X_n4X_n5X_n6CX_n7X_n8CX_n9X_n10C), где X_n1 может представлять собой любые m аминокислот (где m представляет собой любое количество аминокислот любого типа), где X_n2 может представлять собой любую аминокислоту, где X_n3 может представлять собой любую аминокислоту, где X_n4 может представлять собой любую аминокислоту, где X_n5 может представлять собой любую аминокислоту, где X_n6 может представлять собой любую аминокислоту, отличную от цистеина, где X_n7 может представлять собой любую аминокислоту, где X_n8 может представлять собой любую аминокислоту, где X_n9 может представлять собой любую аминокислоту, и где X_n10 может представлять собой любую аминокислоту;

c) центральную шарнирную последовательность, имеющую по меньшей мере одной последовательность из: CVECPPCP (SEQ ID NO: 57), СРРСРРС (SEQ ID NO: 52), или CPPCPPCPPC (SEQ ID NO: 54), или CPPCVECPPC (SEQ ID NO: 53), присоединенную к последовательности верхнего шарнира ELKTPLGDTTHT (SEQ ID NO: 48) или EPKSSDKTHT (SEQ ID NO: 46);

d) верхнюю шарнирную область, которая не содержит аминокислот, способных к перекрестному сшиванию с соответствующей аминокислотой; и центральную шарнирную область, присоединенную к С-концу верхней шарнирной области, причем центральная шарнирная область содержит по меньшей мере три цистеина на цепь;

e) антитело и/или миниантитело, содержащее центральную шарнирную область, причем центральная шарнирная область содержит по меньшей мере три цистеина на цепь, образующих по меньшей мере три дисульфидные связи в центральной шарнирной области; или

f) первое измененное положение аминокислоты, причем первое измененное положение представляет собой аминокислоту, которая в шарнире нативного антитела представляла бы собой цистеин, и была изменена в первом измененном положении так, что она не образует дисульфидной связи; и по меньшей мере три цистеина на цепь, С-концевых относительно первого измененного положения аминокислоты.

[0027] Согласно некоторым аспектам любое миниантитело согласно настоящему документу может быть вместо этого представлено в формате полноразмерного антитела. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения миниантитело содержит гуманизированную аминокислотную последовательность.

[0028] Согласно некоторым аспектам способ получения миниантитела, описанный в настоящем документе, включает экспрессию миниантитела в линии клеток.

[0029] Согласно некоторым аспектам предложен способ лечения состояния у субъекта, который нуждается в таком лечении. Способ включает введение субъекту любого одного или нескольких из миниантител, описанных в настоящем документе, для лечения любого одного или нескольких из нарушений CD3, CD8, АСКП, ПСМА и/или 5Т4, представленных в настоящем изобретении.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[0030] На ФИГ. 1 представлена иллюстрация сконструированного миниантитела (МА).

[0031] На ФИГ. 2 представлена иллюстрация различных вариантов реализации шарниров МА на основе IgG1 человека (ЕН1 γ1 сверху и ЕН2 γ1 снизу).

[0032] На ФИГ. 3 представлена иллюстрация различных вариантов реализации шарниров МА на основе IgG2 человека (ЕН1 γ2 сверху и ЕН2 γ2 снизу).

[0033] На ФИГ. 4 представлена иллюстрация различных вариантов реализации дополнительных шарниров МА на основе IgG2 человека (NH1 γ2 сверху и NH2 γ2 снизу).

[0034] На ФИГ. 5А представлены изображения анализа вариантов шарнира IAB2M методом ДСН-ПААГ (электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия) в нередуцирующих условиях.

[0035] На ФИГ. 5В представлена информация о последовательности белка для некоторых вариантов реализации IAB2M ЕН1 γ1.

[0036] На ФИГ. 5С представлена информация о последовательности белка для некоторых вариантов реализации IAB2M ЕН2 γ1.

[0037] На ФИГ. 5D представлена информация о последовательности белка для некоторых вариантов реализации IAB2M ЕН2 γ2.

[0038] На ФИГ. 5Е представлена информация о последовательности белка для некоторых вариантов реализации IAB2M- ЕН1 γ2.

[0039] На ФИГ. 6А представлен анализ интактной массы варианта IAB2M ЕН1 γ1. На верхнем чертеже представлена полная ионная хроматограмма в условиях обращенной фазы. На среднем чертеже представлены деконволированные интактные массы, подтверждающие присутствие полумолекул, и на нижнем чертеже представлены полноразмерные массы, которые были идентифицированы.

[0040] На ФИГ. 6В представлен анализ интактной массы варианта IAB2M ЕН1 γ2. На верхнем чертеже представлена полная ионная хроматограмма в условиях обращенной фазы. На среднем чертеже представлены деконволированные интактные массы, подтверждающие присутствие полумолекул, и на нижнем чертеже представлены полноразмерные молекулярные массы, которые были идентифицированы.

[0041] На ФИГ. 6С представлен анализ интактной массы варианта IAB2M ЕН2 γ1. На верхнем чертеже представлена полная ионная хроматограмма в условиях обращенной фазы. На среднем чертеже представлены деконволированные интактные массы, подтверждающие присутствие полумолекул, и на нижнем чертеже представлены полноразмерные молекулярные массы, которые были идентифицированы.

[0042] На ФИГ. 6D представлен анализ интактной массы варианта IAB2M ЕН2 γ2. На верхнем чертеже представлена полная ионная хроматограмма. На нижнем чертеже представлены деконволированные интактные массы, подтверждающие присутствие молекул с полноразмерной массой. Полумолекулы не были обнаружены.

[0043] На ФИГ. 7А представлены кривые связывания и значения связывания ЕС50 сконструированных вариантов шарнира IAB2M, определенные методом FACS (fluorescent-activated cell sorting, сортировки флуоресцентно-активированных клеток) с применением клеток LNCaP-AR.

[0044] На ФИГ. 7В представлены кривые связывания и значения связывания ЕС50 сконструированных вариантов шарнира IAB2M, определенные методом FACS с применением клеток С4-2 XCL.

[0045] На ФИГ. 7С представлена информация о последовательности белка для некоторых вариантов реализации IAB2M ЕН3 γ1 без канонической сигнальной последовательности.

[0046] На ФИГ. 7D представлена информация о последовательности белка для некоторых вариантов реализации IAB2M ЕН3 γ1 без канонической сигнальной последовательности.

[0047] На ФИГ. 7Е представлена информация о последовательности ДНК для IAB2M ЕН3 γ1 без канонической сигнальной последовательности.

[0048] На ФИГ. 8 представлен перечень содержащих дисульфид пептидов, идентифицированных в димере IAB2M ЕН1 γ1.

[0049] На ФИГ. 9 представлена иллюстрация картирования дисульфидных связей IAB2M ЕН1 γ1, которая демонстрирует, где образовались неправильно спаренные цистеины.

[0050] На ФИГ. 10 представлена иллюстрация картирования дисульфидных связей IAB2M ЕН1 γ2, которая свидетельствует об отсутствии неправильно спаренных цистеинов.

[0051] На ФИГ. 11А представлены изображения сканов ПЭТ/КТ (позитронно-эмиссионной томографии/компьютерной томографии) ⁸⁹Zr-Df-IAB2M ЕН1 γ1 у бестимусной мыши, несущей ксенотрансплантат опухоли 22Rv1 (ПСМА+).

[0052] На ФИГ. 11В представлен график биораспределения ⁸⁹Zr-Df-IAB2M ЕН1 γ1 у бестимусных мышей.

[0053] На ФИГ. 12А представлены изображения сканов ПЭТ/КТ ⁸⁹Zr-Df-IAB2M ЕН2 γ1 у бестимусной мыши, несущей ксенотрансплантат опухоли 22Rv1 (ПСМА+).

[0054] На ФИГ. 12В представлен график биораспределения ⁸⁹Zr-Df-IAB2M ЕН2 γ1 у бестимусных мышей.

[0055] На ФИГ. 13А представлены изображения сканов ПЭТ/КТ ⁸⁹Zr-Df-IAB2M ЕН2 γ2 у бестимусной мыши, несущей ксенотрансплантат опухоли 22Rv1 (ПСМА+).

[0056] На ФИГ. 13В представлен график биораспределения ⁸⁹Zr-Df-IAB2M ЕН2 γ2 у бестимусных мышей.

[0057] На ФИГ. 14А представлен анализ интактной массы варианта IAB22M ЕН1 γ2. На верхнем чертеже представлена полная ионная хроматограмма. На среднем чертеже представлены деконволированные интактные массы, подтверждающие присутствие полумолекул, и на нижнем чертеже представлены полноразмерные массы, которые были идентифицированы.

[0058] На ФИГ. 14В представлена информация о последовательности белка для некоторых вариантов реализации IAB22M ЕН1 γ2.

[0059] На ФИГ. 15А представлен анализ интактной массы варианта IAB22 ЕН2 γ2. Белок разделяли в условиях обращенной фазы. На верхнем чертеже представлено сканирование в диапазоне полной массы. Увеличенная область полноразмерной массы подтверждает присутствие интактного, т.е. связанного дисульфидными мостиками белка (средний чертеж), тогда как увеличенная область полумолекул продемонстрировала, что полумолекулы по существу отсутствуют (нижний чертеж).

[0060] На ФИГ. 15В представлена информация о последовательности белка для некоторых вариантов реализации варианта IAB22M ЕН2 γ2.

[0061] На ФИГ. 16А представлены изображения сканов ПЭТ/КТ мышей, несущих ксенотрансплантат опухоли HPB-ALL (CD8+), сравнивающие миниантитела 89Zr-Df-IAB22M с последовательностями шарнира, полученными из IgG1 человека и IgG2 человека.

[0062] На ФИГ. 16В представлена информация о последовательности белка для некоторых вариантов реализации IAB22M ЕН1 γ1.

[0063] На ФИГ. 16С представлена информация о последовательности белка для некоторых вариантов реализации IAB22M NH1 γ2.

[0064] На ФИГ. 16D представлена информация о последовательности белка для некоторых вариантов реализации IAB22M NH2 γ2.

[0065] На ФИГ. 17 представлены изображения сканов ПЭТ/КТ, сравнивающие поглощение 89Zr-Df-IAB22M ЕН1 γ1 у мыши NOD-SCID с антиген-положительной опухолью HPB-ALL и антиген-отрицательной опухолью Дауди (только правый чертеж).

[0066] На ФИГ. 18 представлен график биораспределения 89Zr-Df-IAB22M ЕН1 γ1 у мышей с антиген-положительной опухолью HPB-ALL и антиген-отрицательной опухолью Дауди. Количества показаны справа.

[0067] ФИГ. 19 представляет собой иллюстрацию некоторых вариантов реализации вариантов шарнира, перечисленных в таблице 7 (ЕН1 γ1 сверху, ЕН3 γ1 посередине, ЕН4 γ1 снизу).

[0068] На ФИГ. 20А представлен график, обобщающий процент полумолекул, присутствующих в различных вариантах шарнира для IAB2M, который был определен методом масс-спектрометрии.

[0069] На ФИГ. 20В представлен график, обобщающий процент полумолекул, присутствующих в различных вариантах шарнира для IAB22M, который был определен методом масс-спектрометрии.

[0070] На ФИГ. 20С представлена информация о последовательности белка для некоторых вариантов реализации IAB22M ЕН3 γ1.

[0071] На ФИГ. 20D представлена информация о последовательности белка для некоторых вариантов реализации IAB22M ЕН5 γ1.

[0072] На ФИГ. 20Е представлена информация о последовательности белка для некоторых вариантов реализации IAB22M ЕН6 γ3/γ1.

[0073] На ФИГ. 20F представлена информация о последовательности белка для некоторых вариантов реализации IAB22M ЕН7 γ3/γ1.

[0074] На ФИГ. 20G представлена информация о последовательности белка для некоторых вариантов реализации IAB22M ЕН8 γ3/γ1.

[0075] На ФИГ. 21А представлено изображение анализа вариантов шарнира MA IAB2M методом ДСН-ПААГ в нередуцирующих условиях (левый чертеж) и процент полумолекул, количественно определенный методом денситометрии (правый чертеж).

[0076] На ФИГ. 21В представлена информация о последовательности белка для некоторых вариантов реализации IAB2M ЕН5 γ1.

[0077] На ФИГ. 21С представлена информация о последовательности белка для некоторых вариантов реализации IAB2M ЕН6 γ3/γ1.

[0078] На ФИГ. 21D представлена информация о последовательности белка для некоторых вариантов реализации IAB2M ЕН7 γ3/γ1.

[0079] На ФИГ. 21Е представлена информация о последовательности белка для некоторых вариантов реализации IAB2M ЕН8 γ3/γ1.

[0080] На ФИГ. 22А представлено изображение анализа вариантов шарнира MA IAB22M методом ДСН-ПААГ в нередуцирующих условиях (левый чертеж) и процент полумолекул, количественно определенный методом денситометрии (правый чертеж).

[0081] На ФИГ. 22В представлена информация о последовательности белка для некоторых вариантов реализации IAB22M ЕН2 γ1.

[0082] На ФИГ. 23 представлен анализ интактной массы варианта IAB22M ЕН1 γ1. На верхнем чертеже представлена полная ионная хроматограмма. На среднем чертеже представлены деконволированные интактные массы, подтверждающие присутствие полумолекул, и на нижнем чертеже представлены полноразмерные массы, которые были идентифицированы.

[0083] На ФИГ. 24 представлен анализ интактной массы варианта IAB22M ЕН3 γ1. Белок разделяли в условиях обращенной фазы. На верхнем чертеже представлено сканирование в диапазоне полной массы. Увеличенная область полноразмерной массы подтверждает присутствие интактного белка (средний чертеж). Увеличенная область полумолекул продемонстрировала, что полумолекулы по существу отсутствуют (нижний чертеж).

[0084] На ФИГ. 25А и 25В представлен анализ интактной массы вариантов шарнира IAB22M γ2. На ФИГ. 25А представлена полная ионная хроматограмма варианта IAB22M ЕН1 γ2 (ФИГ. 14В) в условиях обращенной фазы (верхний чертеж). На среднем чертеже представлены деконволированные интактные массы, подтверждающие присутствие полумолекул, и на нижнем чертеже представлены полноразмерные массы, которые были идентифицированы. Отметим, что гетерогенность является следствием отщепления концевого лизина. На ФИГ. 25В представлен деконволированный скан варианта IAB22M ЕН2 γ2 (ФИГ. 15В) в полном диапазоне (верхний чертеж), который идентифицирует одиночные молекулы с m/z (соотношением масса/заряд) 79053,1 Да. Увеличенная полноразмерная молекулярная масса показана на среднем чертеже; полумолекула является малораспространенной, и ее количество незначительно превышает уровень шума (нижний чертеж).

[0085] На ФИГ. 26 представлены кривые связывания и значения связывания ЕС50 сконструированных вариантов шарнира IAB2M, определенные методом FACS с применением клеток С4-2 XCL.

[0086] На ФИГ. 27 представлены кривые связывания и значения связывания ЕС50 сконструированных вариантов шарнира IAB22M, определенные методом FACS с применением клеток HPB-ALL.

[0087] На ФИГ. 28А представлено изображение анализа вариантов шарнира MA IAB20M методом ДСН-ПААГ в нередуцирующих условиях (левый чертеж) и процент полумолекул, количественно определенный методом денситометрии (правый чертеж).

[0088] На ФИГ. 28В представлена информация о последовательности белка для некоторых вариантов реализации IAB20M ЕН1 γ1.

[0089] На ФИГ. 28С представлена информация о последовательности белка для некоторых вариантов реализации IAB20M ЕН3 γ1.

[0090] На ФИГ. 28D представлена информация о последовательности белка для некоторых вариантов реализации IAB20M ЕН2 γ1.

[0091] На ФИГ. 28Е представлена информация о последовательности белка для некоторых вариантов реализации IAB20M ЕН5 γ1.

[0092] На ФИГ. 29А представлено изображение анализа вариантов шарнира MA IAB1M методом ДСН-ПААГ в нередуцирующих условиях (левый чертеж) и процент полумолекул, количественно определенный методом денситометрии (правый чертеж).

[0093] На ФИГ. 29В представлена информация о последовательности белка для некоторых вариантов реализации IAB1M ЕН1 γ1.

[0094] На ФИГ. 29С представлена информация о последовательности белка для некоторых вариантов реализации IAB1M ЕН2 γ2.

[0095] На ФИГ. 29D представлена информация о последовательности белка для некоторых вариантов реализации IAB1M ЕН3 γ1.

[0096] На ФИГ. 30 представлены изображения сканов ПЭТ/КТ, сравнивающие поглощение меченных радиоактивным изотопом ⁸⁹Zr MA IAB22 с различными последовательностями шарнира на мышах NOD-SCID, несущих на левом плече антиген-положительные ксенотрансплантаты HPB-ALL.

[0097] На ФИГ. 31 представлен график данных биораспределения меченных радиоактивным изотопом ⁸⁹Zr MA IAB22 с различными последовательностями шарнира на мышах NOD-SCID, несущих на левом плече антиген-положительные ксенотрансплантаты HPB-ALL.

[0098] На ФИГ. 32 представлена информация о последовательности белка для некоторых вариантов реализации IAB20M ЕН2 γ2.

[0099] На ФИГ. 33 представлена информация о последовательности белка для некоторых вариантов реализации IAB25M-EH2 γ2.

[0100] На ФИГ. 34А представлена последовательность ДНК, кодирующая некоторые варианты реализации MA IAB2M.

[0101] На ФИГ. 34В представлена последовательность ДНК, кодирующая некоторые варианты реализации MA IAB2M.

[0102] На ФИГ. 34С представлена последовательность ДНК, кодирующая некоторые варианты реализации MA IAB2M.

[0103] На ФИГ. 34D представлена последовательность ДНК, кодирующая некоторые варианты реализации MA IAB2M.

[0104] На ФИГ. 34Е представлена последовательность ДНК, кодирующая некоторые варианты реализации МА IAB2M.

[0105] На ФИГ. 34F представлена последовательность ДНК, кодирующая некоторые варианты реализации МА IAB2M.

[0106] На ФИГ. 35А представлена информация о последовательности белка вариантов шарнира МА IAB2M.

[0107] На ФИГ. 35В представлена информация о последовательности белка вариантов шарнира МА IAB2M.

[0108] На ФИГ. 35С представлена информация о последовательности белка вариантов шарнира МА IAB2M.

[0109] На ФИГ. 36А представлена информация о последовательности белка доменов VL и VH МА с различными антигенными специфичностями.

[0110] На ФИГ. 36В представлена информация о последовательности белка доменов VL и VH МА с различными антигенными специфичностями.

[0111] На ФИГ. 36С представлена информация о последовательности белка доменов VL и VH МА с различными антигенными специфичностями.

[0112] На ФИГ. 36D представлена информация о последовательности белка доменов VL и VH МА с различными антигенными специфичностями.

[0113] На ФИГ. 36Е представлена информация о последовательности белка доменов VL и VH МА с различными антигенными специфичностями.

[0114] На ФИГ. 37 представлена информация о последовательности белка различных вариантов реализации линкерных последовательносетй.

[0115] На ФИГ. 38 представлена информация о последовательности белка различных вариантов реализации шарнирных областей.

[0116] На ФИГ. 39 представлена информация о последовательности белка различных вариантов реализации доменов C_H3.

[0117] На ФИГ. 40 представлено выравнивание последовательностей белка варианта реализации каждого из IAB22M ЕН1 γ1 (M1) и IAB22M ЕН3 γ1 (M1). Различия последовательности показаны в прямоугольниках.

[0118] На ФИГ. 41 представлена линкерные последовательность ДНК и транслированного белка варианта реализации IAB22M ЕН3 γ1 (M1). В прямоугольниках показаны сигнальная последовательность, CDR, последовательности и шарнира.

[0119] На ФИГ. 42 представлена последовательность ДНК и транслированного белка варианта реализации IAB22M ЕН5 γ1 (M1).

[0120] На ФИГ. 43 представлена последовательность ДНК и транслированного белка варианта реализации IAB22M ЕН7 γ1 (M1).

[0121] На ФИГ. 44 представлена последовательность ДНК и транслированного белка варианта реализации IAB22M ЕН8 γ1 (M1).

[0122] На ФИГ. 45 представлена последовательность ДНК и транслированного белка варианта реализации IAB22M ЕН2 γ2 (M1).

[0123] На ФИГ. 46 представлена последовательность ДНК и транслированного белка варианта реализации IAB22M ЕН2 γ2 (M1) с полиморфизмом VH-K67R.

[0124] На ФИГ. 47 представлено выравнивание последовательностей белка варианта реализации каждого из IAB2M ЕН1 γ1 (М2) и IAB2M ЕН3 yl (М2). Различия последовательности показаны в прямоугольниках.

[0125] На ФИГ. 48 представлена последовательность ДНК и транслированного белка варианта реализации IAB2M ЕН3 γ1 (М2). В прямоугольниках показаны сигнальная последовательность, CDR, линкерные и шарнирные последовательности.

[0126] На ФИГ. 49 представлена последовательность ДНК и транслированного белка варианта реализации IAB2M ЕН3 γ1 (М2) (G1m1).

[0127] На ФИГ. 50 представлена последовательность ДНК и транслированного белка варианта реализации IAB2M ЕН5 γ1 (М2).

[0128] На ФИГ. 51 представлена последовательность ДНК и транслированного белка варианта реализации IAB2M ЕН7 γ1 (М2).

[0129] На ФИГ. 52 представлена последовательность ДНК и транслированного белка варианта реализации IAB2M ЕН8 γ1 (М2).

[0130] На ФИГ. 53 представлена последовательность ДНК и транслированного белка варианта реализации IAB2M ЕН3 γ1 (M1).

[0131] На ФИГ. 54 представлено выравнивание последовательностей белка варианта реализации каждого из IAB20M ЕН1 γ1 (М2) и IAB20M ЕН3 γ1 (М2) с полиморфизмами VL-Q79E, V83E; VH-Q1E, Q6E. Различия последовательности показаны в прямоугольниках.

[0132] На ФИГ. 55 представлена последовательность ДНК и транслированного белка варианта реализации IAB20M ЕН3 γ1 (М2) с полиморфизмами VL-Q79E, V83E; VH-Q1E, Q6E. В прямоугольниках показаны сигнальная последовательность, CDR, линкерные и шарнирные последовательности.

[0133] На ФИГ. 56 представлена последовательность ДНК и транслированного белка варианта реализации IAB20M ЕН3 γ1 (М2).

[0134] На ФИГ. 57 представлена последовательность ДНК и транслированного белка варианта реализации IAB20M ЕН3 γ1 (М2) с полиморфизмами VL-A9D, T10S, S12A, P15L, L21I, S22N; VH-Q1E, Q6E.

[0135] На ФИГ. 58 представлена последовательность ДНК и транслированного белка варианта реализации IAB20M ЕН5 γ1 (М2) с полиморфизмами VL-Q79E, V83E; VH-Q1E, Q6E.

[0136] На ФИГ. 59 представлена последовательность ДНК и транслированного белка варианта реализации IAB20M ЕН5 γ1 (М2) с полиморфизмами VL-A9D, T10S, S12A, P15L, L21I, S22N; VH-Q1E, Q6E.

[0137] На ФИГ. 60 представлено выравнивание последовательностей белка варианта реализации каждого из IAB1M ЕН1 γ1 (M1) и IAB1M ЕН3 γ1 (M1). Различия последовательности показаны в прямоугольниках.

[0138] На ФИГ. 61 представлена последовательность ДНК и транслированного белка варианта реализации IAB1M ЕН3 γ1 (M1). В прямоугольниках показаны сигнальная последовательность, CDR, линкерные и шарнирные последовательности.

[0139] На ФИГ. 62 представлена последовательность ДНК и транслированного белка варианта реализации IAB1M ЕН2 γ2 (M1).

[0140] На ФИГ. 63 представлена последовательность ДНК и транслированного белка варианта реализации IAB1M ЕН5 γ1 (M1).

[0141] На ФИГ. 64 представлена последовательность ДНК и транслированного белка варианта реализации IAB1M ЕН7 γ1 (M1).

[0142] На ФИГ. 65А представлена последовательность ДНК и транслированного белка варианта реализации IAB1M ЕН8 γ1 (M1).

[0143] На ФИГ. 65В представлена последовательность ДНК и транслированного белка варианта реализации IAB25M NH γ2 (M1).

[0144] На ФИГ. 65С представлена последовательность ДНК и транслированного белка варианта реализации IAB25M EH γ2 (M1).

[0145] На ФИГ. 66 представлена последовательность белка варианта реализации домена VHIAB22M.

[0146] На ФИГ. 67 представлена последовательность белка некоторых вариантов реализации домена VL IAB20.

[0147] На ФИГ. 68 представлена последовательность белка варианта реализации домена VH IAB20.

[0148] На ФИГ. 69 представлена последовательность белка некоторых вариантов реализации доменов VL и VH антитела против CD3.

[0149] На ФИГ. 70 представлена последовательность белка варианта реализации ПСМА (простатического специфического мембранного антигена), также известного как глутаматкарбоксипептидаза 2, из Homo sapiens.

[0150] На ФИГ. 71 представлена последовательность белка варианта реализации АСКП (антигена стволовых клеток предстательной железы) из Homo sapiens.

[0151] На ФИГ. 72 представлена последовательность белка варианта реализации онкофетального трофобластного гликопротеина 5Т4 из Homo sapiens.

[0152] На ФИГ. 73 представлена последовательность белка варианта реализации цепи альфа гликопротеина поверхности Т-клеток CD8 из Homo sapiens.

[0153] На ФИГ. 74 представлена последовательность белка варианта реализации цепи бета гликопротеина поверхности Т-клеток CD8 из Homo sapiens.

[0154] На ФИГ. 75 представлена последовательность белка варианта реализации цепи дельта гликопротеина поверхности Т-клеток CD3 из Homo sapiens.

[0155] На ФИГ. 76 представлена последовательность белка варианта реализации цепи гамма гликопротеина поверхности Т-клеток CD3 из Homo sapiens.

[0156] На ФИГ. 77 представлена последовательность белка варианта реализации цепи эпсилон гликопротеина поверхности Т-клеток CD3 из Homo sapiens.

[0157] На ФИГ. 78 представлена последовательность белка варианта реализации цепи дзета гликопротеина поверхности Т-клеток CD3 из Homo sapiens.

[0158] На ФИГ. 79 представлена информация о последовательности белка для некоторых вариантов реализации IAB25M - ЕН2 γ2.

[0159] На ФИГ. 80 представлена информация о последовательности белка для некоторых вариантов реализации IAB20M - ЕН2 γ2.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0160] В настоящем документе описаны компоненты антигенсвязывающих конструкций, включая антитела и их фрагменты, такие как миниантитела, которые связываются с молекулой-мишенью. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения данные компоненты представляют собой новые последовательности шарнира и/или последовательности, связанные с последовательностью шарнира и/или являющиеся частью последовательности шарнира. Данные последовательности шарнира могут обеспечить различные преимущества. Также в настоящем изобретения предложены антигенсвязывающие конструкции (такие как антитела, миниантитела и т.д.), которые содержат одну или более из последовательностей шарнира или субпоследовательностей, описанных в настоящем документе.

[0161] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антигенсвязывающие конструкции могут быть подходящими для нацеливания терапевтических средств на клетки, которые экспрессируют молекулу-мишень. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложены способы обнаружения присутствия или отсутствия молекулы-мишени (или «мишени») с применением антигенсвязывающих конструкций (включая антитела и конструкции, такие как миниантитела). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложены способы применения антигенсвязывающих конструкций для терапевтических целей.

[0162] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения scFv и антитела миниантитела могут обладать превосходящими фармакокинетическими свойствами для более быстрой диагностической визуализации при сохранении специфичности связывания и аффинности родительского антитела. В применяемой на сегодняшний день технологии используют визуализацию с помощью полноразмерных антител, для которой часто требуется более длительное время (~7 - 8 дней после инъекции) для получения высококонтрастных изображений в связи с медленным клиренсом интактного антитела в сыворотке. Некоторые варианты реализации миниантитела, описанного в настоящем документе, обеспечивают возможность визуализации в тот же день или на следующий день. Визуализация в тот же день или на следующий день также обеспечивает решение логистической проблемы, с которой сталкивается множество пациентов, которые преодолевают большие расстояния для получения лечения/диагностики, поскольку длительное пребывание в поездке или необходимость вернуться через неделю будет отсутствовать при визуализации с применением миниантител по сравнению с интактными антителами.

[0163] Как подробно описано ниже, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антигенсвязывающие конструкции предназначены для диагностики. При мечении соответствующими радионуклидами (например, излучателями позитронов Иодом-124, Медью-64, Фтором-18, Галлием-68 и/или Цирконием-89 для визуализации методом ПЭТ) или флуорофором (для флуоресцентной визуализации) фрагменты антитела можно применять для доклинической визуализации, как показано в настоящем документе, и для клинической визуализации у пациентов. Данные антигенсвязывающие конструкции также можно применять в качестве потенциальных средств для визуализации методом ОЭКТ (однофотонной эмиссионной компьютерной томографии) посредством простой замены радиоактивной метки испускающими один фотон радионуклидами, такими как Индий-111, Иод-123 и Лютеций-177.

[0164] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антигенсвязывающие конструкции могут представлять собой клинические визуализирующие средства (ПЭТ/ОЭКТ) у людей. Соответственно, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антигенсвязывающие конструкции можно применять для прицельного диагностического обнаружения данных нарушений. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антигенсвязывающую конструкцию можно применять в качестве терапевтического средства.

Определения и различные варианты реализации

[0165] Термин «шарнир» означает по меньшей мере часть шарнирной области антигенсвязывающей конструкции, такой как антитело или миниантитело. Шарнирная область может содержать комбинацию верхней шарнирной, основной (или средней) шарнирной и нижней шарнирной областей. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения шарнир определяют согласно любым определениям шарнира антитела. Нативные антитела IgG1, IgG2 и IgG4 содержат шарнирные области, содержащие по 12-15 аминокислот. IgG3 содержит удлиненную шарнирную область, содержащую 62 аминокислоты, в том числе 21 пролин и И цистеинов. Согласно результатам кристаллографических исследований функциональная шарнирная область встречающихся в природе антител простирается от остатков аминокислот 216-237 цепи Н IgG1 (нумерация согласно EU; ссылка 12) и содержит небольшой сегмент N-конца домена СН2 в нижней области шарнира, причем нижний шарнир является N-концом домена СН2. Шарнир можно разделить на три области: «верхнюю шарнирную, «основную» и «нижнюю шарнирную».

[0166] Термин «искусственный» или «неприродный» при модификации шарнира (или его части) означает, что последовательность, о которой идет речь, не присутствует в указанном состоянии в природе. В настоящем контексте шарниры были изменены по сравнению с их нативным состоянием, так что их последовательности уже не являются таковыми, обнаруженными в антителах дикого типа. Как очевидно специалистам в данной области техники, миниантитела естественным образом не встречаются в природе, и, таким образом, любая конструкция, которая представляет собой конструкцию миниантитела, также не обнаружена в природе. Это также применимо к по меньшей мере некоторым из конструкций, представленных в любой из таблиц последовательностей шарнира, и/или содержащих последовательности любой из таблиц последовательностей шарнира, представленных в настоящем изобретении (например, таблицы 2). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения любая из последовательностей частей шарнира или полного шарнира в таблице 11 может представлять собой искусственные последовательности шарнира, поскольку последовательность (или полученная в результате комбинация для шарнира) не встречается в природе.

[0167] Термин «полная шарнирная область» или «целая шарнирная область» означает присутствие целой верхней, основной и нижней шарнирных областей в виде единой конструкции. Верхняя, основная и нижняя области могут быть расположены непосредственно рядом друг с другом, или между ними либо с N- или с С-конца от областей могут быть добавлены дополнительные остатки. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения нативный нижний шарнир может быть заменен удлиняющей последовательностью. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения можно объединить нативный нижний шарнир с удлиняющей последовательностью. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения после последовательности верхнего и/или основного шарнира можно добавить удлинение или другой набор последовательностей.

[0168] Фраза «эффективная шарнирная область» означает, что присутствует надлежащее количество части по меньшей мере одной из верхней, основной и нижней шарнирных областей, чтобы обеспечить эффективность шарнирной области для предусмотренного применения. Таким образом, данная фраза включает варианты шарнирных областей и фрагменты различных шарнирных областей. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения функция шарнирной области представляет собой одну или более функций из следующих: связывание scFv с доменом C_H3, обеспечение гибкости и дистанцирования двух scFv для надлежащего связывания с мишенью, связывание двух полумолекул вместе, обеспечение общей стабильности молекулы и/или обеспечение участка для сайт-специфичной конъюгации в связи с его экспонированием в раствор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения шарнир должен быть близок к природному для снижения потенциальной иммуногенности. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения верхний шарнир обеспечивает гибкость scFv (в нативных IgG начинается с остатка 216), средний шарнир обеспечивает стабильность, и нижний шарнир обеспечивает гибкость C_H3 (в нативных IgG начинается с остатка 231).

[0169] Термин «верхний шарнир» означает первую часть шарнира, которая начинается в конце scFv. Примеры верхних шарнирных областей можно найти в таблице 1. Верхний шарнир содержит аминокислоты от конца scFv до, но не включая, первого остатка цистеина в основном шарнире, представленном в таблице 1. Как указано выше, термин «эффективный верхний шарнир» означает, что присутствует достаточная часть последовательности, чтобы позволить участку функционировать в качестве верхнего шарнира; данный термин включает функциональные варианты и фрагменты указанного участка шарнира.

[0170] Термин «основный шарнир» означает вторую часть шарнирной области, которая является С-концевой относительно верхнего шарнира. Примеры основных шарнирных областей можно найти в таблице 1. Основный шарнир содержит межцепочечные дисульфидные мостики и характеризуется высоким содержанием пролина. Как указано выше, термин «эффективный основный шарнир» означает, что присутствует достаточная часть последовательности, чтобы позволить участку функционировать в качестве основного шарнира; данный термин включает функциональные варианты и фрагменты указанного участка шарнира.

[0171] Термин «нижний шарнир» означает третью часть шарнирной области, которая является С-концевой относительно основного шарнира. Примеры нижней шарнирной области можно найти в таблице 1. В контексте миниантитела или фрагмента антитела нижний шарнир соединен с доменом C_H3 МА. Как указано выше, термин «эффективный нижний шарнир» означает, что присутствует достаточная часть последовательности, чтобы позволить участку функционировать в качестве нижнего шарнира; данный термин включает функциональные варианты и фрагменты указанного участка шарнира. Термин «нижний шарнир» в настоящем документе может включать различные аминокислотные последовательности, включая встречающиеся в природе последовательности нижнего шарнира IgG и искусственные удлиняющие последовательности друг вместо друга или их комбинацию, описанную в настоящем документе. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения различные удлинения можно считать полностью нижней шарнирной областью или замещением.

[0172] Термин «лечение» состояния может означать предотвращение состояния, замедление манифестации и/или скорости развития состояния, снижение риска развития состояния, предотвращение и/или отсрочивание развития симптомов, связанных с состоянием, снижение или прекращение симптомов, связанных с состоянием, обеспечение полной или частичной регрессии состояния или некоторую комбинацию указанных событий. Термин «предотвращать» не требует полного прекращения нарушения или заболевания.

[0173] «Терапевтически эффективное количество» или «терапевтически эффективная доза» представляет собой количество, которое вызывает целевой терапевтический эффект у субъекта, такой как предотвращение, лечение целевого состояния, отсрочивание манифестации нарушения и/или симптомов, и/или облегчение симптомов, связанных с состоянием. Данное количество будет варьировать в зависимости от множества факторов, включая, без ограничения, характеристики терапевтического соединения (включая активность, фармакокинетику, фармакодинамику и биодоступность), физиологическое состояние субъекта (включая возраст, пол, тип и стадию заболевания, общее физическое состояние, восприимчивость к вводимой дозе и тип лекарственной терапии), природу фармацевтически приемлемого носителя или носителей в составе и/или путь введения. Специалист в клинической или фармакологической области способен определить терапевтически эффективное количество в результате проведения общепринятых экспериментов, например, посредством контроля над ответом субъекта на введение соединения и соответствующей корректировки дозы с учетом настоящего изобретения. Дополнительные указания см. в руководстве Remington: The Science and Practice of Pharmacy 21^st Edition, Univ. of Sciences in Philadelphia (USIP), Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA, 2005.

[0174] Термин «антигенсвязывающая конструкция» включает все разновидности антител, в том числе их связывающие фрагменты. Также включены конструкции, которые содержат 1, 2, 3, 4, 5 и/или 6 CDR. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения могут быть предложены последовательно расположенные scFv, которые могут обеспечить два плеча с бивалентным связыванием. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения данные CDR могут быть распределены между их соответствующими каркасными участками в традиционном антителе. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения CDR могут содержаться в вариабельной области тяжелой и/или легкой цепей. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения CDR могут находиться в тяжелой цепи и/или легкой цепи. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения CDR могут находиться в единичной пептидной цепи. Если в настоящей заявке не указано обратное, антигенсвязывающие конструкции, описанные в настоящем документе, связываются с указанной молекулой-мишенью. Термин «мишень» или «молекула-мишень» означает белок, с которым связывается антигенсвязывающая конструкция. Примеры белков-мишеней известны в данной области техники и включают, например, ПСМА (такой как FOLH1) (ФИГ. 70; SEQ ID NO: 131), АСКП (ФИГ. 71; SEQ ID NO: 132), 5Т4 (такой как TPBG) (ФИГ. 72; SEQ ID NO: 133), CD8 (например, α-цепь) (ФИГ. 73; SEQ ID NO: 134), CD8 (например, β-цепь) (ФИГ. 74; SEQ ID NO: 135), CD3 (например, δ-цепь) (ФИГ. 75; SEQ ID NO: 136), CD3 (например, γ-цепь) (ФИГ. 76; SEQ ID NO: 137), CD3 (например, ε-цепь) (ФИГ. 77; SEQ ID NO: 138), CD3 (например, ζ-цепь) (ФИГ. 78; SEQ ID NO: 139).

[0175] Термин «антитело» включает, без ограничения, генно-инженерные или другим способом модифицированные формы иммуноглобулинов, такие как интраантитела, химерные антитела, полностью человеческие антитела, гуманизированные антитела, фрагменты антитела, scFv и гетероконъюгированные антитела (например, биспецифичные антитела, диатела, триатела, тетратела и т.д.). Термин «антитело» включает scFv и миниантитела. Таким образом, все без исключения варианты реализации, описанные в настоящем документе в отношении «антител», также предусмотрены в качестве вариантов реализации scFv и/или миниантител, если однозначно не указано обратное. Термин «антитело» включает полипептид семейства иммуноглобулинов или полипептид, содержащий фрагменты иммуноглобулина, способный к нековалентному обратимому и специфичному связыванию с соответствующим антигеном. Иллюстративная структурная единица антитела включает тетрамер. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полноразмерное антитело может состоять из двух идентичных пар полипептидных цепей, причем каждая пара содержит одну «легкую» и одну «тяжелую» цепь (соединенные дисульфидной связью). Обнаруженные гены иммуноглобулинов включают гены константной области каппа, лямбда, альфа, гамма, дельта, эпсилон, шарнир и мю, а также мириады генов вариабельной области иммуноглобулинов. В случае полноразмерных цепей легкие цепи классифицируют как каппа или лямбда. В случае полноразмерных цепей тяжелые цепи классифицируют как гамма, мю, альфа, дельта или эпсилон, которые в свою очередь определяют классы иммуноглобулинов IgG, IgM, IgA, IgD и IgE, соответственно. N-конец каждой цепи определяет вариабельную область, состоящую из приблизительно от 100 до 110 или более аминокислот, преимущественно отвечающих за распознавание антигена. Термины «вариабельная область легкой цепи» (V_L) и «вариабельная область тяжелой цепи» (V_H) означают данные области легкой и тяжелой цепей, соответственно. В настоящей заявке «антитело» включает все варианты антитела и их фрагменты. Таким образом, в пределах данной концепции находятся полноразмерные антитела, химерные антитела, гуманизированные антитела, одноцепочечные антитела (scFv), Fab, Fab' и мультимерные версии данных фрагментов (например, F(ab')₂) с той же специфичностью связывания. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитело специфично связывается с целевой мишенью.

[0176] Термины «определяющие комплементарность домены» или «участки, определяющие комплементарность» («complementarity-determining regions, CDR»), взаимозаменяемо означают гипервариабельные участки V_L и V_H. CDR представляют собой участок цепи антитела, связывающий молекулу-мишень, который обладает специфичностью в отношении такой молекулы-мишени. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения в каждой V_L и/или V_H существует три CDR (CDR1-3, пронумерованы последовательно от N-конца), составляющие приблизительно 15-20% вариабельных доменов. CDR структурно комплементарны эпитопу молекулы-мишени и, таким образом, непосредственно отвечают за специфичность связывания. Оставшиеся фрагменты V_L или V_H, так называемые каркасные участки (framework regions, FR), демонстрируют меньше изменений в аминокислотной последовательности (Kuby, Immunology, 4th ed., Chapter 4. W.H. Freeman & Co., New York, 2000).

[0177] Положения CDR и каркасных участков можно определить с применением различных хорошо известных в данной области техники определений, например, Кэбота (Wu, Т.Т. et al., "An analysis of the sequences of the variable regions of Bence Jones proteins and myeloma light chains and their implications for antibody complementarity," J. Exp. Med., Vol. 132, No. 2, pp. 211-250, 1970; Kabat, E.A. et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest," 5th Ed., NIH Publication No. 91-3242, Bethesda, MD, 1991, Chothia C. et al., "Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins," J. Mol. Biol., Vol. 196, No. 4, pp. 901-917, 1987; Chothia C. et al., "Conformations of immunoglobulin hypervariable regions," Nature, Vol. 342, No. 6252, pp. 877-883, 1989; Chothia C. et al., "Structural repertoire of the human VH segments," J. Mol. Biol., Vol. 227, No. 3, pp. 799-817, 1992; Al-Lazikani B. et al., "Standard conformations for the canonical structures of immunoglobulins," J. Mol. Biol., Vol. 273, No. 4, pp. 927-748, 1997), с помощью базы данных ImMunoGeneTics (IMGT) (во всемирной сети по адресу imgt.org/) (Giudicelli, V. et al., "IMGT/LIGM-DB, the IMGT® comprehensive database of immunoglobulin and T cell receptor nucleotide sequences," Nucleic Acids Res., Vol. 34 (Database Issue), pp. D781-D784, 2006; Lefranc, M.P. et al., "IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains," Dev. Comp. Immunol., Vol. 27, No. 1, pp. 55-77, 2003; Brochet, X. et al, "IMGT/V-QUEST: the highly customized and integrated system for IG and TR standardized V-J and V-D-J sequence analysis," Nucleic Acids Res, Vol. 36 (Web Server Issue), pp. W503-508, 2008; с помощью AbM (Martin, A.C. et al, "Modeling antibody hypervariable loops: a combined algorithm, "Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., Vol. 86, No. 23, pp. 9268-9272, 1989); с помощью контактного определения (MacCallum, R.M. et al, "Antibody-antigen interactions: contact analysis and binding site topography," J. Mol. Biol, Vol. 262, No. 5, pp. 732-745, 1996) и/или с помощью инструмента для автоматического моделирования и анализа (Honegger, A. et al, доступно во всемирной сети по адресу bioc.uzh.ch/plueckthun/antibody/Numbering/).

[0178] Термины «детерминанта специфичности связывания» или «BSD» (binding specificity determinant) взаимозаменяемо означают минимальную смежную или несмежную аминокислотную последовательность в участке, определяющем комплементарность, необходимую для определения специфичности связывания антитела. Минимальная детерминанта специфичности связывания может находиться в одной или нескольких последовательностях CDR. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения минимальные детерминанты специфичности связывания находятся (т.е. определяются исключительно) в части или полноразмерных последовательностях CDR3 тяжелой и легкой цепей антитела. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения CDR3 вариабельной области тяжелой цепи является достаточным для специфичности антигенсвязывающей конструкции.

[0179] «Вариабельная область легкой цепи антитела» или «вариабельная область тяжелой цепи антитела» в настоящем документе означает полипептид, содержащий V_L или V_H, соответственно. Эндогенная V_L кодируется сегментами гена V (variable, вариабельный) и J (junctional, соединительный), а эндогенная V_H - V, D (diversity, разнообразие) и J. Каждая из V_L или V_H содержит CDR, а также каркасные участки. В настоящей заявке вариабельная область легких цепей антитела и/или вариабельная область тяжелых цепей антитела могут, время от времени, в совокупности называться «цепями антитела». Данные термины включают цепи антитела, содержащие мутации, которые не нарушают основной структуры V_L или V_H, как с легкостью поймет специалист в данной области техники. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предусмотрены полноразмерные тяжелая и/или легкая цепи. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предусмотрено, что присутствует только вариабельная область тяжелой и/или легкой цепей.

[0180] Антитела могут существовать в виде интактных иммуноглобулинов или в виде множества фрагментов, полученных в результате расщепления различными пептидазами. Так, например, пепсин расщепляет антитело ниже дисульфидной связи в шарнирной области с получением F(ab)'2, димера Fab', который сам по себе представляет собой легкую цепь (V_L-C_L), присоединенную к V_H-C_H1 посредством дисульфидной связи. F(ab)'₂ можно восстановить в мягких условиях для разрушения дисульфидной связи в шарнирной области, и посредством этого преобразовать димер F(ab)'₂ в мономер Fab'. Мономер Fab' представляет собой Fab с частью шарнирной области. (Paul, W.Е., "Fundamental Immunology," 3d Ed., New York: Raven Press, 1993). Несмотря на то, что различные фрагменты антитела определены с точки зрения расщепления интактного антитела, специалист понимает, что такие фрагменты можно синтезировать de novo химическим способом или с применением методологии рекомбинантной ДНК. Таким образом, термин «антитело» в настоящем документе также включает фрагменты антитела, полученные посредством модификации целых антител, или таковые, синтезированные de novo с применением методологии рекомбинантной ДНК (например, одноцепочечные Fv), или таковые, идентифицированные с применением библиотек фагового дисплея (см., например, публикацию McCafferty, J. et al., "Phage antibodies: filamentous phage displaying antibody variable domains," Nature, Vol. 348, No. 66301, pp. 552-554, 1990).

[0181] Для получения моноклональных или поликлональных антител можно применять любую методику, известную в данной области техники (см., например, публикации Kohler, G. et al., "Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity," Nature, Vol. 256, No. 5517, pp. 495-497,1975; Kozbor, D. et al., "The production of monoclonal antibodies from human lymphocytes," Immunology Today, Vol. 4, No. 3, pp. 72-79, 1983; Cole, et al., "Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy," Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96, 1985; Wang, S., "Advances in the production of human monoclonal antibodies," Antibody Technology Journal, Vol. 1, pp. 1-4, 2011; Sharon, J. et al., "Recombinant polyclonal antibodies for cancer therapy," J. Cell Biochem., Vol. 96, No. 2, pp. 305-313, 2005;; Haurum, J.S., "Recombinant polyclonal antibodies: the next generation of antibody therapeutics?," Drug Discov. Today, Vol. 11, No. 13-14, pp. 655-660, 2006). Методики получения одноцепочечных антител (патент США №4,946,778) можно приспособить для получения антител против полипептидов согласно настоящему изобретению. Также для экспрессии полностью человеческих моноклональных антител можно применять трансгенных мышей или другие организмы, такие как другие млекопитающие. В качестве альтернативы, для идентификации антител, связывающихся с высокой аффинностью с выбранными антигенами, можно применять технологию фагового дисплея (см., например, публикации McCafferty et al, ссылка выше; Marks, J.D. et al., "By-passing immunization: building high affinity human antibodies by chain shuffling," Biotechnology (N.Y.), Vol. 10, No. 7, pp. 779-783, 1992).

[0182] Способы гуманизации или приматизации антител, отличных от антител человека, хорошо известны в данной области техники. Как правило, гуманизированное антитело содержит один или более остатков аминокислот, введенных в него из источника, отличного от человека. Данные отличные от человека остатки аминокислот часто называют импортными остатками, которые, как правило, отбирают из импортного вариабельного домена. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения можно применять термины «донорная» и «акцепторная» последовательности. Гуманизацию можно осуществить по существу согласно способу Winter с соавторами (см., например, публикации Jones, Р.Т. et al., "Replacing the complementarity-determining regions in a human antibody with those from a mouse," Nature, Vol. 321, No. 6069, pp. 522-525, 1986; Riechmann, L. et al., "Reshaping human antibodies for therapy," Nature, Vol. 332, No. 6162, pp. 323-327, 1988; Verhoeyen, M. etal., "Reshaping human antibodies: grafting an antilysozyme activity," Science, Vol. 239, No. 4847, pp. 1534-1536, 1988; Presta, L. G., "Antibody engineering,", Curr. Op. Struct. Biol., Vol. 2, No. 4, pp. 593-596, 1992) посредством замены последовательности CDR или последовательностей CDR грызунов соответствующими последовательностями антитела человека. Соответственно, такие гуманизированные антитела являются химерными антителами (патент США №4,816,567), в которых по существу менее чем интактный вариабельный домен человека был заменен соответствующей последовательностью вида, отличного от человека. На практике гуманизированные антитела представляют собой, как правило, антитела человека, в которых некоторые остатки участка, определяющего комплементарность («CDR»), и, возможно, некоторые каркасные («FR») остатки заменены остатками из аналогичных участков антител грызунов.

[0183] «Химерное антитело» представляет собой молекулу антитела, в которой (а) константная область или ее часть изменена, заменена или обменяна так, что антигенсвязывающий участок (вариабельная область) присоединен к константной области другого или измененного класса, эффекторной функции и/или вида, или к полностью отличной молекуле, которая обеспечивает химерному антителу новые свойства, например, к ферменту, токсину, гормону, фактору роста и лекарственному средству; или (b) вариабельная область или ее часть изменена, заменена или обменяна на вариабельную область, обладающую отличной или измененной антигенной специфичностью.

[0184] Антитела также включают одну или более цепей иммуноглобулина, которые конъюгированы химическим способом с другими белками или экспрессированы в виде слитых с другими белками белков. Антитела также включают биспецифичные антитела. Биспецифичное или бифункциональное антитело представляет собой искусственное гибридное антитело, содержащее две различные пары тяжелой/легкой цепи и два различных связывающих участка.

[0185] Другие антигенсвязывающие фрагменты или части антитела согласно настоящему изобретению включают биспецифичные scFv антитела, в которых молекула антитела распознает два различных эпитопа, единичные связывающие домены (sdAb или наноантитела) и миниантитела.

[0186] Термин «фрагмент антитела» включает, без ограничения, один или более антигенсвязывающих фрагментов антител самих по себе или в комбинации с другими молекулами, включая, без ограничения, фрагменты Fab', F(ab')₂, Fab, Fv, rIgG (восстановленный IgG), scFv, однодоменные фрагменты (наноантитела), пептид-ассоциированные антитела, миниантитела. Термин «scFv» означает одноцепочечное Fv-антитело («fragment variable», вариабельный фрагмент), в котором вариабельные домены тяжелой цепи и легкой цепи традиционного двухцепочечного антитела были объединены для образования одной цепи.

[0187] Фармацевтически приемлемый носитель может представлять собой фармацевтически приемлемое вещество, композицию или носитель, который вовлечен в перенос или транспортирование соединения, представляющего интерес, из одной ткани, органа или части тела в другую ткань, орган или часть тела. Например, носитель может представлять собой жидкий или твердый наполнитель, разбавитель, вспомогательное вещество, растворитель или инкапсулирующее вещество либо некоторые комбинации указанных веществ. Каждый компонент носителя является «фармацевтически приемлемым» в том смысле, что он является совместимым с другими компонентами состава. Носитель также должен быть подходящим для осуществления контакта с любой тканью, органом или частью тела, с которыми он может сталкиваться; это означает, что носитель не должен нести риска токсичности, раздражения, аллергического ответа, иммуногенности или любого другого осложнения, которое чрезмерно превышает его терапевтическую пользу. Фармацевтические композиции, описанные в настоящем документе, можно вводить посредством любого подходящего пути введения. Путь введения может означать любой путь введения, известный в данной области техники, включая, без ограничения, аэрозоль, энтеральный, назальный, офтальмический, пероральный, парентеральный, ректальный, трансдермальный (например, крем или мазь для местного применения, пластырь) или вагинальный. «Трансдермальное» введение можно осуществить с применением крема или мази для местного применения или посредством трансдермального пластыря. «Парентеральный» означает путь введения, который, как правило, связан с инъекцией, включая инфраорбитальную, инфузию, внутриартериальную, внутрикапсульную, внутрисердечную, внутрикожную, внутримышечную, интраперитонеальную, внутрилегочную, внутриспинальную, интрастернальную, интратекальную, внутриматочную, внутривенную, субарахноидальную, субкапсулярную, подкожную, чресслизистую или транстрахеальную. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антигенсвязывающую конструкцию можно доставить интраоперационным способом в виде местного введения в течение хирургического вмешательства или резекции.

[0188] Термин «нарушение, зависимое от молекулы-мишени», или «нарушение, связанное с молекулой-мишенью», включает любое нарушение, при котором молекула-мишень играет роль в нарушении сама по себе. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения это означает сверхэкспрессию молекулы-мишени. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения нарушения могут включать любые нарушения, которые обсуждаются в настоящем документе. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения нарушение может являться любым, для которого существует молекула-мишень, на которую можно нацелиться посредством связывания, и связывание которой приведет к обнаружению и/или к лечению нарушения. Без ограничения, молекула-мишень может представлять собой, например, CD8, CD3, 5Т4, ПСМА и/или АСКП.

[0189] Миниантитело представляет собой формат антитела, который характеризуется меньшей молекулярной массой, чем полноразмерное антитело, при сохранении бивалентного свойства связывания с антигеном. Благодаря своему меньшему размеру, отсутствию домена СН2, который связывается с рецепторами Fc-гамма и FcRN, отсутствию гликозилирования миниантитело характеризуется более быстрым клиренсом из системы и потенциально усиленным проникновением при нацеливании на ткань опухоли. Благодаря способности к мощному нацеливанию в сочетании с быстрым клиренсом миниантитело обладает преимуществами для диагностической визуализации и доставки радиоактивных веществ, для которых пролонгированные времена циркуляции могут привести к нежелательному введению доз пациентам или дозиметрии. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения миниантитела также могут характеризоваться преимуществом для доставки цитотоксических веществ в связи с вышеуказанными свойствами, такими как проникновение в опухоль и более быстрый клиренс. «Миниантитело», описанное в настоящем документе, включает гомодимер, в котором каждый мономер представляет собой одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv), присоединенный к домену C_H3 IgG человека с помощью последовательности шарнира. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения миниантитело представляет собой бивалентный или биспецифичный ковалентно связанный гомодимер молекулярной массой ~80 кДа. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения каждый мономер (полумолекула) состоит из вариабельного домена тяжелой цепи (V_H), присоединенного к соответствующему вариабельному домену легкой цепи (V_L) посредством линкерной последовательности, обогащенной Gly-Ser, размером приблизительно 15-18 аминокислот.

[0190] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения каждый одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv) присоединен к домену C_H3 IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 человека последовательностью шарнира.

[0191] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения нижнаяя шарнирная/удлиняющая последовательность может представлять собой нижний шарнир нативного IgG1, 2, 3 или 4 и/или (G₃)S_n или (G₄)S_n (n может представлять собой любое количество S; согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения n составляет 1 или 2) и/или отсутствие нижнего шарнира, и/или любую комбинацию аминокислот (не обязательно должны представлять собой G и S). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения нижнаяя шарнирная / удлиняющая последовательность может содержать GGGSSGGGSG (SEQ ID NO: 59).

[0192] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения линкер может представлять собой любой линкер, который будет функционировать. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения линкерная последовательность может содержать мотив, который представляет собой (G₃)S_n или (G₄)S_n (n может представлять собой любое количество S; согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения n составляет 1 или 2). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения линкер может содержать GSTSGGGSGGGSGGGGSS (SEQ ID NO: 62).

[0193] Фраза «специфично (или селективно) связываются» в контексте описания взаимодействия между антигеном, например, белком, с антителом или полученным из антитела связывающим агентом означает реакцию связывания, которая является определяющей для присутствия антигена в гетерогенной популяции белков и других биологических молекул, например, в биологическом образце, например, крови, сыворотке, плазме или образце ткани. Таким образом, в заданных условиях иммуноанализа согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитела или связывающие агенты с конкретной специфичностью связывания связываются с конкретным антигеном по меньшей мере в два раза выше фона и по существу не связываются в значительном количестве с другими антигенами, присутствующими в образце. Для специфичного связывания с антителом или связывающим агентом в таких условиях может требоваться, чтобы антитело или средство были выбраны на основании их специфичности к конкретному белку. Для выбора антител, специфично иммунореактивных с конкретным белком, можно применять множество форматов иммуноанализа. Например, для выбора антител, специфично иммунореактивных с белком, обычно применяют твердофазные варианты иммуноанализа ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay, твердофазный иммуноферментный анализ, см., например, описание форматов иммуноанализа и условий, которые можно применять для определения специфичной иммунореактивности, в руководстве Harlow, Е. & Lane D., "Using Antibodies, А Laboratory Manual," Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1998). Как правило, специфичная или селективная реакция связывания обеспечит сигнал, по меньшей мере в два раза превышающий сигнал фона, и, более часто, по меньшей мере в от 10 до 100 раз превышающий фон.

[0194] Термин «равновесная константа диссоциации (K_D, M)» означает константу скорости диссоциации (k_d, время^-1), разделенную на константу скорости ассоциации (k_a, время^-1 М^-1). Равновесные константы диссоциации можно измерять с применением любого способа, известного в данной области техники. Антитела согласно настоящему изобретению, как правило, будут характеризоваться равновесной константой диссоциации менее приблизительно 10^-7 или 10^-8 М, например, менее приблизительно 10^-9 М или 10^-10 М, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения - менее приблизительно 10^-11 М, 10^-12 М или 10^-13 М.

[0195] Термин «выделенный» при применении в отношении нуклеиновой кислоты или белка означает, что нуклеиновая кислота или белок по существу не содержат других компонентов клетки, с которыми они связаны в природном состоянии. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения выделенная нуклеиновая кислота или белок может находиться в сухом виде или в водном растворе. Чистоту и гомогенность можно определить с применением методик аналитической химии, таких как электрофорез в полиакриламидном геле или высокоэффективная жидкостная хроматография. Белок, который представляет собой доминирующую молекулу, присутствующую в препарате, является по существу очищенным. В частности, выделенный ген отделяют от открытых рамок считывания, которые фланкируют ген и кодируют белок, отличный от гена, представляющего интерес. Термин «очищенный» означает, что нуклеиновая кислота или белок приводит к получению по существу одной полосы на электрофоретическом геле. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения это может означать, что нуклеиновая кислота или белок по меньшей мере на 85% чисты, более предпочтительно, по меньшей мере на 95% чисты, и, наиболее предпочтительно, по меньшей мере на 99% чисты от молекул, которые присутствуют в условиях in vivo.

[0196] Термин «нуклеиновая кислота» или «полинуклеотид» означает дезоксирибонуклеиновые кислоты (ДНК) или рибонуклеиновые кислоты (РНК) и их полимеры в одно- или двухцепочечной форме. Если конкретно не ограничено, данный термин включает нуклеиновые кислоты, содержащие известные аналоги природных нуклеотидов, которые обладают аналогичными свойствами связывания, что и эталонная нуклеиновая кислота, и метаболизируются способом, аналогичным встречающимся в природе нуклеотидам. Если не указано обратное, конкретная последовательность нуклеиновой кислоты также косвенно включает ее варианты, модифицированные консервативным способом (например, замены вырожденных кодонов), аллели, ортологи, SNP (single nucleotide polymorphism, однонуклеотидный полиморфизм) и комплементарные последовательности, а также однозначно указанную последовательность. Более конкретно, замены вырожденных кодонов можно обеспечить посредством получения последовательностей, в которых третье положение одного или нескольких выбранных (или всех) кодонов заменено остатками смешанных оснований и/или дезоксиинозиновыми остатками (Batzer, М.A. et al, "Enhanced evolutionary PCR using oligonucleotides with inosine at the 3'-terminus," Nucleic Acid Res, Vol. 19, No. 18, pp. 5081, 1991; Ohtsuka, E. et al, "An alternative approach to deoxyoligonucleotides as hybridization probes by insertion of deoxyinosine at ambiguous codon positions," J. Biol. Chem, Vol. 260, No. 5, pp. 2605-2608, 1985; Rossolini, G.M. et al, "Use of deoxyinosine-containing primers vs degenerate primers for polymerase chain reaction based on ambiguous sequence information," Mol. Cell. Probes, Vol. 8, No. 2, pp. 91-98, 1994).

[0197] Термины «полипептид», «пептид» и «белок» используются в настоящем документе взаимозаменяемо для обозначения полимера остатков аминокислот. Данные термины применяют в отношении полимеров аминокислот, в которых один или более остатков аминокислот являются искусственным химическим миметиком соответствующей аминокислоты, встречающейся в природе, а также к полимерам аминокислот, встречающихся в природе, и полимеру аминокислот, не встречающихся в природе.

[0198] Термин «аминокислота» означает встречающиеся в природе и синтетические аминокислоты, а также аналоги аминокислот и миметики аминокислот, которые функционируют образом, аналогичным встречающимся в природе аминокислотам. Встречающиеся в природе аминокислоты являются таковыми, кодируемыми генетическим кодом, а также таковыми аминокислотами, которые были позже модифицированы, например, гидроксипролин, гамма-карбоксиглутамат и О-фосфосерин. Аналоги аминокислот относятся к соединениям, которые характеризуются той же базовой химической структурой, что и встречающаяся в природе аминокислота, например, альфа-углерод, который связан с водородом, карбоксильная группа, аминогруппа и R-группа, например, гомосерин, норлейцин, метионинсульфоксид, метионинметилсульфоний. Такие аналоги содержат модифицированные R-группы (например, норлейцин) или модифицированные пептидные остовы, но сохраняют ту же химическую структуру, как и встречающаяся в природе аминокислота. Миметики аминокислот означают химические соединения, которые характеризуются структурой, отличающейся от общей химической структуры аминокислоты, но которые функционируют сходным образом с встречающейся в природе аминокислотой.

[0199] Термин «консервативно модифицированные варианты» относится к аминокислотным последовательностям и к последовательностям нуклеиновой кислоты. В отношении конкретных последовательностей нуклеиновой кислоты консервативно модифицированные варианты относятся к тем нуклеиновым кислотам, которые кодируют идентичные или по существу идентичные аминокислотные последовательности, или, если нуклеиновая кислота не кодирует аминокислотную последовательность, к по существу идентичным последовательностям. Вследствие вырожденности генетического кода большое количество функционально идентичных нуклеиновых кислот кодирует любой данный белок. Например, кодоны GCA, GCC, GCG и GCU все кодируют аминокислоту аланин. Таким образом, в каждом положении, где кодоном определен аланин, кодон может быть изменен на любой из соответствующих описанных кодонов без изменения кодируемого полипептида. Такие вариации нуклеиновой кислоты представляют собой «молчащие вариации», которые являются видом консервативно модифицированных вариаций. В настоящем документе каждая последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид, также описывает каждую возможную молчащую вариацию нуклеиновой кислоты. Специалист поймет, что каждый кодон в нуклеиновой кислоте (кроме AUG, который обычно является единственным кодоном для метионина, и TGG, который обычно является единственным кодоном для триптофана) можно модифицировать с получением функционально идентичной молекулы. Соответственно, в каждой описываемой последовательности подразумевается каждая молчащая вариация нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид.

[0200] Что касается аминокислотных последовательностей, специалист поймет, что индивидуальные замены, делеции и добавления к последовательности нуклеиновой кислоты, пептидной, полипептидной или белковой последовательности, которые изменяют, добавляют или удаляют единичную нуклеиновую кислоту или малый процент аминокислот в кодируемой последовательности, представляют собой «консервативно модифицированный вариант», в котором изменение приводит к замене аминокислоты на химически сходную аминокислоту. В данной области техники хорошо известны таблицы консервативных замен, предоставляющие функционально сходные аминокислоты. Такие консервативно модифицированные варианты добавляются к полиморфным вариантам, межвидовым гомологам и аллелям согласно настоящему изобретению и не исключают их.

[0201] Следующие восемь групп содержат аминокислоты, которые являются консервативными заменами друг для друга: 1) аланин (А), глицин (G); 2) аспарагиновая кислота (D), глутаминовая кислота (Е); 3) аспарагин (N), глутамин (Q); 4) аргинин (R), лизин (K); 5) изолейцин (I), лейцин (L), метионин (М), валин (V); 6) фенилаланин (F), тирозин (Y), триптофан (W); 7) серии (S), треонин (Т) и 8) цистеин (С), метионин (М) (см., например, публикацию Creighton, Т. Е., "Proteins - Structures and Molecular Properties," W.H. Freeman & Co. Ltd., 1984).

[0202] Термин «процент идентичности последовательности» можно определить посредством сравнения двух оптимально выровненных последовательностей в окне сравнения, причем часть полинуклеотидной последовательности в окне сравнения может содержать добавления или делеции (то есть «пропуски») по сравнению с эталонной последовательностью (например, полипептидом согласно настоящему изобретению), не содержащей добавлений или делеции, которые используют для оптимального выравнивания двух последовательностей. Процент вычисляют путем определения количества положений, в которых идентичное основание нуклеиновой кислоты или остаток аминокислоты присутствует в обеих последовательностях, в результате чего получают ряд совпадающих положений, и количество совпадающих положений делят на общее количество положений в окне сравнения, а затем полученный результат умножают на 100 и получают процент идентичности последовательностей.

[0203] Термины «идентичный» или процент «идентичности» в контексте двух или более последовательностей нуклеиновых кислот или полипептидных последовательностей означает две или более последовательностей или субпоследовательностей, которые являются одинаковыми последовательностями. Две последовательности являются «по существу идентичными», если две последовательности содержат определенный процент остатков аминокислот или нуклеотидов, которые являются одинаковыми (например, идентичность последовательности 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% в заданном участке или, если не определено, в целой эталонной последовательности), при сравнении и выравнивании для максимального соответствия в окне сравнения либо обозначенной области, что измеряют с применением одного из следующих алгоритмов сравнения последовательностей или посредством выравнивания вручную и визуального изучения. Некоторые варианты реализации, описанные в настоящем документе, обеспечивают полипептиды или полинуклеотиды, которые являются по существу идентичными полипептидам или полинуклеотидам, соответственно, примеры которых приведены в настоящем документе (например, любая одна или более из вариабельных областей, примеры которых приведены в любой из таблиц 1, 2, 5, 6 или 7 и на ФИГ. 5В-5Е, 1С, 7D, 14В, 15В, 16B-16D, 20C-20G, 21В-21Е, 22В, 28В-28Е, 29B-29D, 32, 33, 35А-35С, 36А-36Е, 40-69, 79, 80, и любая одна или более из последовательностей нуклеиновой кислоты, примеры которых приведены на любой из ФИГ. 7Е, 34A-34F, 41-46, 48-53, 55-59, 61-64, 65А, 65В и 65С). Необязательно, идентичность существует в пределах области, которая составляет по меньшей мере приблизительно 15, 25 или 50 нуклеотидов в длину или, более предпочтительно, в пределах области, которая составляет от 100 до 500 или 1000 или более нуклеотидов в длину, или в пределах полноразмерной эталонной последовательности. В отношении аминокислотных последовательностей идентичность или существенная идентичность может существовать в пределах области, которая составляет по меньшей мере 5, 10, 15 или 20 аминокислот в длину, необязательно, по меньшей мере приблизительно 25, 30, 35, 40, 50, 75 или 100 аминокислот в длину, необязательно, по меньшей мере приблизительно 150, 200 или 250 аминокислот в длину, или в пределах полноразмерной эталонной последовательности. В отношении более коротких аминокислотных последовательностей, например, аминокислотных последовательностей из 20 или менее аминокислот, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения существенная идентичность существует, когда один или два остатка аминокислот консервативно заменены в соответствии с консервативными заменами, определенными в настоящем документе.

[0204] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения процент идентичности измеряют в пределах шарнирных областей, указанных в настоящем документе (шарнирная область и/или ее части - верхняя, основная и нижняя шарнирные области). В данных ситуациях процент идентичности шарнирной области или ее части можно идентифицировать отдельно от остальной последовательности белка или нуклеиновой кислоты. Таким образом, две шарнирные области (или верхняя, основная и/или нижняя области) могут содержать указанный процент остатков аминокислот или нуклеотидов, которые являются одинаковыми (например, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности в пределах указанной области или, если не указано, в пределах целой последовательности эталонной последовательности), при этом позволяя оставшейся части белка оставаться на 100% идентичной белку сравнения, или также позволяя оставшейся части белка также содержать вариации с указанным процентом идентичности.

[0205] При сравнении последовательностей, как правило, одна последовательность выступает в качестве эталонной последовательности, с которой сравнивают исследуемые последовательности. При применении алгоритма сравнения исследуемую и эталонную последовательности вводят в компьютер, если необходимо, назначают координаты субпоследовательности и устанавливают параметры алгоритма программы последовательности. Можно использовать параметры программы по умолчанию или можно задать альтернативные параметры. Затем алгоритм сравнения последовательностей вычисляет основанный на параметрах программы процент идентичностей последовательности для исследуемых последовательностей по отношению к эталонной последовательности.

[0206] «Окно сравнения» в настоящем документе включает ссылку на сегмент, состоящий из любого количества смежных положений, который выбран из группы, состоящей из приблизительно из от 20 до 600, как правило, от приблизительно 50 до приблизительно 200, более часто от приблизительно 100 до 150, последовательность которого можно сравнить с эталонной последовательностью из того же количества смежных положений, после того как две последовательности оптимально выровняют. Способы выравнивания последовательностей для сравнения хорошо известны в данной области техники. Оптимальное выравнивание последовательностей для сравнения можно проводить, например, с помощью алгоритма локальной гомологии Smith and Waterman (1970) Adv. Appl. Math. 2:482c, с помощью алгоритма выравнивания гомологии Needleman, S.В. et al., "A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequence of two proteins," J. Mol. Biol., Vol. 48, No. 3, pp. 443-453, 1970, способом поиска сходства Pearson, W.R. et al., "Improved tools for biological sequence comparison," Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., Vol. 85, No. 8, pp. 2444-2448, 1988, с помощью компьютеризированной реализации данных алгоритмов (GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA на программном обеспечении Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Мэдисон, Висконсин) или с помощью ручного выравнивания и визуальной инспекции (см., например, публикацию Ausubel, F.М. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Supplement, 1995).

[0207] Двумя примерами алгоритмов, которые подходят для определения процента идентичности последовательностей и подобия последовательностей, являются алгоритмы BLAST и BLAST 2.0, которые описаны в публикациях Altschul, S.F. et al., "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs," Nucleic Acids Res., Vol. 25, No. 17, pp. 3389-3402, 1977, и Altschul, S.F. et al., "Basic local alignment search tool," J. Mol. Biol., Vol. 215, No. 3, pp. 403-410, 1990, соответственно. Программное обеспечение для проведения анализа BLAST является общедоступным через Национальный центр биотехнологической информации. Данный алгоритм включает первичную идентификацию пар последовательностей с максимальным сходством (high scoring sequence pairs, HSP) посредством идентификации коротких слов с длиной W в представляющей интерес последовательности, которые либо совпадают, либо удовлетворяют некоторому оцениваемому положительно порогу значения Т при выравнивании со словом такой же длины в последовательности из базы данных. Т определяют как порог значений для соседних слов (Altschul, S.F. et al, ссылка выше). Данные изначальные совпадения соседних слов выступают в роли затравок для начала поиска для обнаружения более длинных HSP, содержащих их. Поиск совпадений слов распространяется в обоих направлениях вдоль каждой последовательности до тех пор, пока суммарное значение для выравнивания можно увеличить. Для нуклеотидных последовательностей суммарные значения вычисляют с применением параметров М (значение компенсации за пару совпавших остатков; всегда >0) и N (штрафной балл за несоответствие остатков, всегда <0). Для аминокислотных последовательностей с целью вычисления суммарного значения используют оценочную матрицу. Продолжение поиска совпадений слов в каждом направлении останавливают, если: суммарное значение для выравнивания снижается по величине X ниже максимально достижимого значения; суммарное значение снижается до нуля или ниже в связи с накоплением одного или нескольких выровненных остатков с отрицательным значением; или если достигнут конец любой последовательности. Параметры алгоритма BLAST W, Т и X определяют чувствительность и скорость выравнивания. В программе BLASTN (для нуклеотидных последовательностей) используют в качестве параметров по умолчанию длину слова (W) 11, ожидаемое значение (Е) 10, М=5, N=-4 и сравнение обеих цепей. Для аминокислотных последовательностей в программе BLASTP используют в качестве параметров по умолчанию длину слова 3 и ожидаемое значение (Е) 10, и оценочную матрицу BLOSUM62 (Henikoff, S. et al., "Amino acid substitution matrices from protein blocks," Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., Vol. 89, No. 22, pp. 10915-10919, 1992), выравнивание (В) 50, ожидаемое значение (Е) 10, М=5, N=-4 и сравнение обеих цепей.

[0208] Алгоритм BLAST также проводит статистический анализ подобия между двумя последовательностями (см., например, публикацию Karlin, S. et al., "Applications and statistics for multiple high-scoring segments in molecular sequences," Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., Vol. 90, No. 12, pp. 5873-5787, 1993). Одним показателем подобия, предусматриваемым алгоритмом BLAST, является наименьшая суммарная вероятность (P(N)), которая обеспечивает показатель вероятности, с которой случайно могло бы иметь место соответствие двух последовательностей нуклеотидов или аминокислот. Например, нуклеиновую кислоту считают подобной эталонной последовательности, если наименьшая суммарная вероятность при сравнении исследуемой нуклеиновой кислоты с эталонной нуклеиновой кислотой составляет менее приблизительно 0,2, более предпочтительно, менее приблизительно 0,01 и, наиболее предпочтительно, менее приблизительно 0,001

[0209] Признак того, что две последовательности нуклеиновой кислоты или полипептида являются по существу идентичными, заключается в том, что полипептид, кодируемый первой нуклеиновой кислотой, является иммунологически перекрестно-реактивным с антителами, наработанными против полипептида, кодируемого второй нуклеиновой кислотой, как описано ниже. Таким образом, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептид, как правило, по существу идентичен второму полипептиду, например, если два пептида отличаются только консервативными заменами. Другой признак того, что две последовательности нуклеиновой кислоты по существу идентичны, заключается в том, что две молекулы или их комплементы гибридизуются друг с другом в жестких условиях, как описано ниже. Еще один признак того, что последовательности нуклеиновой кислоты по существу идентичны, заключается в том, что для амплификации последовательностей можно применять одни и те же праймеры.

[0210] Термины «субъект», «пациент» и «индивидуум» взаимозаменяемо означают организм, обследование и/или лечение которого проводят. Данный термин может включать, например, млекопитающее, например, человека или млекопитающего-примата, отличного от человека. Млекопитающее может также представлять собой лабораторное млекопитающее, например, мышь, крысу, кролика, хомяка. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения млекопитающее может представлять собой сельскохозяйственное млекопитающее (например, лошадей, овец, крупный рогатый скот, свиней, верблюдов) или домашнее млекопитающее (например, собак, кошек).

[0211] Термин «совместное введение» означает введение двух активных средств в кровь индивидуума или в образец, исследование которого проводят. Активные средства, которые совместно вводят, можно доставлять одновременно или последовательно.

Антигенсвязывающие конструкции

[0212] В настоящем документе следует принимать во внимание, что последовательности в шарнирной области могут характеризоваться особой значимостью в случае различных антигенсвязывающих конструкций. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения значение шарнирной области может быть в особенности высоким, например, при сборке миниантитела. Последовательности в шарнире могут содержать дисульфидные связи, которые являются благоприятными для функционирования шарнира, но могут приводить к различающимся результатам при их изменении. Как раскрыто в настоящем документе и показано в примерах ниже, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения последовательности шарнирной области можно сконструировать для предотвращения и/или снижения нежелательных перестановок дисульфидов с остатками цистеина, присутствующими в других областях белка, и/или для обеспечения содержания достаточного количества пар цистеинов с целью поддержания целостности димера in vivo, для предотвращения образования конкатемеров и/или обеспечения сайт-специфичной конъюгации с одним из спаренных цистеинов.

[0213] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения стабильность димера миниантитела in vivo можно приписать природным ван-дер-ваальсовым связям между доменами C_H3, образованию дисульфидных связей в шарнирных областях и/или взаимодействиям между V_H и V_L. На сегодняшний день большинство миниантител были сконструированы с применением верхней и основной шарнирной областей IgG1 человека с удлиняющей последовательностью, присоединенной к домену C_H3 IgG1 человека. Помимо вышеуказанных параметров, в настоящем документе предложены и охарактеризованы обе ориентации миниантител (например, варианты V_L-V_H (M1) и V_H-V_L (М2) scFv), поскольку ориентация конструкций также может изменить их характеристики (как показано в примерах ниже).

[0214] Некоторые предыдущие шарниры (например, шарнир-удлинение hulgG1 или ЕН1 γ1) содержали нативный hulgG1 в верхнем шарнире (ФИГ. 2). Данный цистеин в положении 245 в контексте IgG1 человека, который был определен согласно Кэботу и отмечен первым кругом, создает проблемы как с гетерогенностью белка, так и со стабильностью в формате миниантитела согласно результатам дисульфидного картирования анализом ЖХ/МС (жидкостной хроматографии/масс-спектрометрии), ДСН-ПААГ и согласно данным биораспределения in vivo. Как показано в примерах ниже, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения Cys245 можно мутировать на серии, что приводит к получению искусственного шарнира или «шарнира ЕН2», как описано в настоящем документе. Таким образом, удаление данного цистеина из цепи (как показано в примерах ниже) привело к улучшению шарнирной области. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полученная в результате конструкция (в которой отсутствует первый цистеин в шарнирной области) является недостаточно жесткой для поддержания стабильности димера миниантитела in vivo с двумя оставшимися дисульфидными мостиками (в отношении ЕН/ЕН2 γ1). Таким образом, как показано в примерах ниже, для получения улучшенной конструкции можно осуществить введение третьего или последующих цистеинов на цепь (например, в основной области). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения введение 3^его (или последующих) цистеина в шарнире (дополнительный цистеин в нативном шарнире IgG1, на цепь) увеличивает образование дисульфидной связи и увеличивает стабильность белка. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения добавленная стабильность, предоставляемая посредством дисульфидных связей в шарнирной области, обеспечивает сайт-специфичную конъюгацию с одним или более чем одним цистеином с сохранением интактного димера. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения миниантитела IAB2M, 20М, 1М и IAB22M huIgG2 содержат шарнирную/удлиняющую последовательность IgG2 человека (huIgG2), присоединенную к домену C_H3 huIgG2. Таким образом, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения домен C_H3 может представлять собой домен C_H3 huIgG2. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения для образования дисульфидной связи можно применять любой вариант создания ковалентной связи между двумя цепями пептида вместо цистеинов.

[0215] В настоящей заявке, когда упоминается введение цистеина (если не указано обратное), это означает введение цистеина на цепь шарнира (который содержит две цепи). Таким образом, 3, 4, 5 или 6 цистеинов в цепи будет означать 6, 8, 10 или 12 цистеинов в шарнире и 3, 4, 5 или 6 возможных присутствующих дисульфидных связей (разумеется, если не указано, количество дисульфидных связей может быть отличным, поскольку некоторые из цистеинов можно использовать для меток и других применений).

[0216] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения шарнир/удлинение IgG2 - ЕН1 γ2 привел к увеличению агрегации, поскольку реактивный первый цистеин шарнира отвечал за образование конкатемеров в формате IAB2M-EH1 γ2. Согласно таким вариантам реализации настоящего изобретения можно применять нативный верхний шарнир huIgG2.

[0217] Затем вышеуказанные аспекты учитывали при разработке второй конфигурации некоторых вариантов реализации конструкции шарнира. В данной второй структуре первый цистеин шарнира (который в нативном антителе образует пару с легкой цепью каппа) мутировали на серии с получением ЕН2 IgG2 (ЕН2 γ2). Данная конструкция хорошо экспрессировалась и обладала хорошей стабильностью in vivo, содержала все 3 дисульфидные связи, образованные надлежащим образом, что подтверждалось анализом интактной массы, и обладала стабильностью, продемонстрированной обеими конструкциями IAB2M и IAB22M (как показано в примерах ниже). Таким образом, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения в настоящем документе предложен искусственный или модифицированный шарнир IgG2, в котором был изменен первый цистеин и который обеспечивает улучшенную конструкцию миниантитела.

[0218] Как показано в примерах ниже, результаты продемонстрировали, что для предотвращения неправильного спаривания цистеина было благоприятно мутировать первый цистеин шарнира в шарнирах IgG1 и IgG2. Как показано в примерах ниже, результаты продемонстрировали, что для поддержания структурной целостности белка было благоприятно иметь более 2 остатков цистеина в основной шарнирной области на цепь. Как показано в примерах ниже, результаты продемонстрировали, что шарнир IgG2 обеспечивает одно из возможных решений для увеличения стабильности in vivo. Таким образом, в настоящем изобретения предложены антигенсвязывающие конструкции с более высокой стабильностью in vivo, такие как миниантитела.

[0219] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения можно применять шарнир IgG2. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения можно применять шарнир IgG2, в котором мутирован первый цистеин шарнира. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения мутация концевого лизина (K) в конструкциях МА не влияет на экспрессию белка, но позволяет получить белок с более однородным зарядом.

[0220] Как обсуждается в примерах, оценивали дополнительные варианты МА на основе последовательностей верхнего шарнира IgG3 и модифицированного основного шарнира IgG1, в которых в основной шарнирной области присутствовали по меньшей мере 3 остатка цистеина на цепь. Как указано в примерах ниже, оценивали конструкции IAB2M, IAB22M и IAB20M, чтобы продемонстрировать универсальность результатов среди различных конструкций, имеющих различные ориентации и различные мишени. Результаты свидетельствуют, что преимущества, описанные в настоящем документе относительно раскрытых в настоящей заявке шарниров, будут доступны и применимы к любым без исключения антигенсвязывающим конструкциям и, в частности, к миниантителам.

[0221] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения шарниры могут представлять собой пептидные шарниры и/или последовательности нуклеиновой кислоты, которые кодируют пептидные шарниры. Все обсуждения относительно пептидной формы шарниров, приведенные в настоящем изобретении, также означают соответствующие структуры и функции для последовательностей нуклеиновой кислоты, кодирующих пептиды. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения шарниры могут быть введены в антигенсвязывающую конструкцию, такую как антитело, такое как миниантитело. Любой шарнир или часть шарнира (такая как верхняя шарнирная, основная шарнирная и/или нижняя шарнирная область) могут быть введены в любую из антигенсвязывающих конструкций, описанных в настоящем документе, включая, без ограничения, таковые в таблицах 1, 2, 5, 6 или 7 и на ФИГ. 5В-5Е, 7С, 7D, 14В, 15В, 16В-16D, 20C-20G, 21В-21Е, 22В, 28В-28Е, 29B-29D, 32, 33, 35А-35С, 36А-36Е, 40-69, 79, 80, и в любую одну или более из последовательностей нуклеиновой кислоты, примеры которых приведены на любой из ФИГ. 7Е, 34A-34F, 41-46, 48-53, 55-59, 61-64, 65А, 65В и 65С. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения шарнир может содержать любую одну или более последовательностей или частей, представленных в таблице 1. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения любой из нижних шарниров может затем быть присоединен напрямую или опосредованно к домену C_H3.

[0222] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения шарнир содержит, состоит из или состоит по существу из любой из последовательностей таблицы 1 выше. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения шарнир состоит из каждой из указанных верхней, основной и нижней шарнирной области таблицы 1. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения любая из вышеуказанных частей (такая как верхний, основный и/или нижний шарнир) может также быть предложена в виде ее варианта. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения варианты обладают существенной идентичностью с вышеуказанными последовательностями. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения варианты отличаются на одну, две или три аминокислоты от последовательностей, представленных выше. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения варианты отличаются на одну, две или три аминокислоты от последовательностей, представленных выше, и отличия представляют собой консервативные отличия.

[0223] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения мотив СРРС (SEQ ID NO: 50) в основной области можно заменить на любой другой эффективный основный мотив, при условии, что количество и/или эффективность ковалентных связей, представленных в таблице выше, изменена надлежащим образом.

[0224] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложена пептидная шарнирная область для антитела. Шарнирная область может содержать верхнюю шарнирную область, которая не содержит аминокислот, способных к перекрестному сшиванию с соответствующей аминокислотой. Аминокислотная шарнирная область может также содержать основную шарнирную область, присоединенную с С-конца к верхней шарнирной области. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения основная шарнирная область содержит по меньшей мере три цистеина на каждой стороне шарнира (то есть, по меньшей мере шесть цистеинов для собранной структуры). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения аминокислотная шарнирная область дополнительно содержит нижнюю шарнирную область или удлиняющую область, присоединенную с С-конца к основной шарнирной области. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения нижняя шарнирная область или удлиняющая область может содержать по меньшей мере одну последовательность из: APPVAGP (SEQ ID NO: 60), APELLGGP (SEQ ID NO: 58) или GGGSSGGGSG (SEQ ID NO: 59).

[0225] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения верхняя шарнирная область не содержит цистеинов, которые образуют поперечные сшивки с верхней шарнирной областью. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения верхняя шарнирная область не содержит цистеинов. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения аминокислотная шарнирная область дополнительно содержит нижнюю шарнирную область. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения данные конструкции являются не встречающимися в природе конструкциями.

[0226] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложен вариант шарнирной области миниантитела. Вариант шарнирной области миниантитела содержит первое измененное положение аминокислоты. Первое измененное положение аминокислоты представляет собой аминокислоту, которая в шарнире нативного антитела представляла бы собой цистеин, и была изменена в первом измененном положении так, что она не образует дисульфидной связи. Вариант шарнирной области миниантитела дополнительно содержит по меньшей мере три цистеина на цепь, С-концевых относительно первого измененного положения аминокислоты. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения может присутствовать 4, 5, 6 или более цистеинов на цепь, С-концевых относительно первого измененного положения аминокислоты. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения данные дополнительные цистеины полностью содержатся в основной области шарнира (разумеется, основный шарнир может быть модифицированным и может простираться за пределы последовательностей дикого типа, в результате чего можно добавить дополнительные цистеины). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения шарнирная область состоит из SEQ ID NO: 1 (X_n1CX_n2X_n3CX_n4X_n5C). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения SEQ ID NO: 1 представляет собой основную шарнирную область, и основная шарнирная область по существу состоит из SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения основная шарнирная область состоит из SEQ ID NO: 1. В описании, представленном выше, количество цистеинов относится к количеству цистеинов в одной шарнирной области пептидной цепи. Следует понимать, что количество цистеинов в димерной форме шарнира (в которой пептидные цепи перекрестно присоединены друг к другу) будет в два раза большим, поскольку каждый из указанных цистеинов является частью дисульфидной связи, в образовании которой участвуют два цистеина.

[0227] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения конструкции МА содержат антигенсвязывающие scFv с варьирующими длинами линкера, которые могут находиться в VL-VH или VH-VL ориентации. Любое раскрытие в настоящем документе относительно одной ориентации, также включает противоположную ориентацию и обе ориентации. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения любую последовательность шарнира, описанную в таблице 1, можно добавить к scFv с С-конца. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения любой домен СН3 из антител IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 можно добавить к scFv и соответствующим шарнирам с С-конца. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения для обеспечения соответствующего образования дисульфидной связи первый цистеин шарнира (цистеин, который обычно образует пару с легкой цепью в нативных антителах IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4) мутирован на серин или аланин или другую соответствующую аминокислоту для предотвращения перестановок дисульфидов и/или конкатемеризации. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения для снижения присутствия или предотвращения образования полумолекул и обеспечения оптимальной стабильности in vivo шарнирная область может содержать по меньшей мере 3 дисульфидные связи, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения шарнирная область может содержать большее количество дисульфидных связей. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения в шарнире присутствуют по меньшей мере 3 дисульфидные связи, расположенные на соответствующих расстояниях друг от друга, которые введены для предотвращения ненадлежащего образования дисульфидных связей и обеспечения надлежащего образования дисульфидных связей. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения 3 дисульфидные связи в шарнире расположены на соответствующих расстояниях друг от друга и введены для обеспечения стабильности белка in vivo и клиренса через печень вместо клиренса через почки. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения в шарнире обеспечены по меньшей мере 3 дисульфидные связи (например, 4 или более) с применением цистеина в качестве основы, с последующим мягким восстановлением дисульфидов, лекарственных средств, хелаторов металлов, радионуклидов, радиоактивных изотопов, сайт-специфичной конъюгацией хелатора, а затем - с присоединением радиоактивного изотопа к хелатору, или с присоединением флуоресцентных красителей с применением цистеина в качестве участка присоединения. Как понимает специалист в данной области техники, присутствие каждой единичной дисульфидной связи свидетельствует о присутствии двух цистеинов, по одному на каждой пептидной последовательности шарнира.

[0228] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения МА конструируют так, чтобы они содержали любые компоненты шарнира, описанные в настоящем документе, и сохраняли аналогичную (или одинаковую) аффинность родительских антител. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения МА, сконструированные, как описано выше, могут быть разработаны для содержания двух различных антигенсвязывающих доменов.

[0229] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения превосходящие шарниры для антигенсвязывающих конструкций можно получить посредством удаления первого цистеина в шарнирной области, как указано в таблице 1 выше и в примерах ниже. Таким образом, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения можно обеспечить шарнирную область, в которой данный цистеин (который в противном случае присутствует в природном шарнире) удален или заменен другим остатком (например, остатком, который не может образовывать ковалентной связи). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения данную корректировку проводят в контексте IgG1 человека или любой другой шарнирной области, которая содержит цистеин в указанном положении в таблице 1 (например, ЕН1 γ2, измененный на ЕН2 γ2 (Cys на Ser), и NH1 γ2, измененный на NH2 γ2 (Cys на Ser)).

[0230] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложена аминокислотная шарнирная область, которая содержит последовательность SEQ ID NO: 1 (X_n1CX_n2X_n3CX_n4X_n5C). X_n1 может представлять собой любую аминокислоту, которая не образует ковалентной перекрестно-сшивающей связи. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения X_n2 представляет собой любую аминокислоту из: А, R, N, D, Е, Q, G, Н, I, L, K, М, F, Р, S, Т, W, Y или V. X_n3 может представлять собой любую аминокислоту. X_n4 представляет собой любую аминокислоту. X_n5 представляет собой любую аминокислоту. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения X_n1 содержит серин или аланин (SEQ ID NO: 235). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения X_n1 содержит серин (SEQ ID NO: 210). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения X_n1 содержит аланин (SEQ ID NO: 211). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения X_n1 содержит Т (SEQ ID NO: 236). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первый цистеин в SEQ ID NO: 1, который изменен, представляет собой цистеин в домене γ2. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения аминокислотная шарнирная область дополнительно содержит дополнительные аминокислоты перед SEQ ID NO: 1 (X_n1CX_n2X_n3CX_n4X_n5C).

[0231] Согласно некоторым вариантам реализации X_n1CX_n2X_n3CX_n4X_n5C (SEQ ID NO: 1) X_n1 не образует ковалентной перекрестно-сшивающей связи с другой аминокислотой (SEQ ID NO: 191). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения X_n1 не представляет собой цистеин (SEQ ID NO: 192). Согласно некоторым вариантам реализации SEQ ID NO: 1 X_n1 представляет собой одну аминокислоту из: А, R, N, D, Е, Q, G, Н, I, L, K, М, F, Р, S, Т, W, Y или V (SEQ ID NO: 193). Согласно некоторым вариантам реализации SEQ ID NO: 1 X_n2 представляет собой Р, V или Е (SEQ ID NO: 194). Согласно некоторым вариантам реализации SEQ ID NO: 1 X_n4 представляет собой Р, V или Е (SEQ ID NO: 196). Согласно некоторым вариантам реализации SEQ ID NO: 1 X_n4 представляет собой Р или V (SEQ ID NO: 197). Согласно некоторым вариантам реализации SEQ ID NO: 1 X_n2 представляет собой Р или V (SEQ ID NO: 195). Согласно некоторым вариантам реализации SEQ ID NO: 1 X_n3 представляет собой Р или Е (SEQ ID NO: 198). Согласно некоторым вариантам реализации SEQ ID NO: 1 X_n5 представляет собой Р или Е (SEQ ID NO: 199). Согласно некоторым вариантам реализации SEQ ID NO: 1 X_n3 представляет собой Р или Е, и X_n5 представляет собой Р или Е (SEQ ID NO: 237). Согласно некоторым вариантам реализации SEQ ID NO: 1 X_n2X_n3 представляет собой VE (SEQ ID NO: 201). Согласно некоторым вариантам реализации SEQ ID NO: 1 X_n2X_n3 представляет собой РР (SEQ ID NO: 202). Согласно некоторым вариантам реализации SEQ ID NO: 1 X_n4X_n5 представляет собой VE (SEQ ID NO: 203). Согласно некоторым вариантам реализации SEQ ID NO: 1 X_n4X_n5 представляет собой РР (SEQ ID NO: 204). Согласно некоторым вариантам реализации SEQ ID NO: 1 X_n2X_n3 представляет собой VE, и X_n4X_n5 представляет собой РР (SEQ ID NO: 205). Согласно некоторым вариантам реализации SEQ ID NO: 1 X_n2X_n3 представляет собой VE или РР (SEQ ID NO: 238). Согласно некоторым вариантам реализации SEQ ID NO: 1 X_n2X_n3 представляет собой VE (SEQ ID NO: 239).

[0232] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения любая из вышеуказанных шарнирных областей также содержит нижнюю шарнирную или удлиняющую последовательность, С-концевую относительно последнего цистеина в X_n1CX_n2X_n3CX_n4X_n5C (SEQ ID NO: 1). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения можно применять любую нижнюю шарнирную область. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения любая из вышеуказанных шарнирных областей также содержит удлиняющую или нижнюю шарнирную последовательность, С-концевую относительно последнего цистеина в X_n1CX_n2X_n3CX_n4X_n5C (SEQ ID NO: 1).

[0233] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения шарнирная область SEQ ID NO: 1 и/или 2 представляет собой основную шарнирную область. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения шарнир дополнительно содержит верхнюю шарнирную область, примыкающую к основной шарнирной области. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения шарнир дополнительно содержит нижнюю шарнирную область или удлиняющую область, примыкающую к основной шарнирной области. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения аминокислотная шарнирная область дополнительно содержит верхнюю шарнирную область, примыкающую к основной шарнирной области.

[0234] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения аминокислотная шарнирная область содержит следующую последовательность: SCVECPPCP (SEQ ID NO: 56). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения аминокислотная шарнирная область содержит следующую последовательность: ERKSCVECPPCP (SEQ ID NO: 167). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения аминокислотная шарнирная область содержит следующую последовательность: EPKSSDKTHTCPPCPPC (SEQ ID NO: 168). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения аминокислотная шарнирная область содержит по меньшей мере одну из следующих последовательностей: ERKSCVECPPCPGGGSSGGGSG (SEQ ID NO: 34) или ERKSCVECPPCPAPPVAGP (SEQ ID NO: 33). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения аминокислотная шарнирная область содержит по меньшей мере ТСРРСРРС (SEQ ID NO: 166). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения аминокислотная шарнирная область содержит по меньшей мере EPKSSDKTHTCPPCPPCGGGSSGGGSG (SEQ ID NO: 26) или EPKSSDKTHTCPPCPPCAPELLGGP (SEQ ID NO: 25).

[0235] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения превосходящие шарниры могут быть обеспечены посредством удаления цистеина шарнира, который отвечает за присоединение тяжелой и легкой цепей IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4, соответственно, представленных в таблице 1 и 7 (например, ЕН1 γ1 - ЕН2 γ1). Более того, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения применение основной области с по меньшей мере тремя цистеинами (например, ЕН3 γ1, ЕН4 γ1 и ЕН5 γ1) на цепь может привести к получению превосходящих конструкций. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения шарнир может быть обеспечен посредством удаления цистеина из верхней шарнирной области, представленной в таблице 1 и 7 (например, ЕН1 γ1 - ЕН2 γ1).

[0236] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения такие конструкции могут быть описаны как аминокислотная шарнирная область, содержащая последовательность SEQ ID NO: 2 (X_n1X_n2X_n3X_n4X_n5X_n6CX_n7X_n8CX_n9X_n10C), где X_n1 представляет собой любую аминокислоту, которая не образует ковалентной перекрестно-сшивающей связи с другой аминокислотой, где X_n2 представляет собой любую аминокислоту, где X_n3 представляет собой любую аминокислоту, где X_n4 представляет собой любую аминокислоту, где X_n5 представляет собой любую аминокислоту, где X_n6 представляет собой любую аминокислоту, где X_n7 представляет собой любую аминокислоту, где X_n8 представляет собой любую аминокислоту, где X_n9 представляет собой любую аминокислоту, и где X_n10 представляет собой любую аминокислоту (SEQ ID NO: 240).

[0237] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения такие конструкции могут быть описаны как аминокислотная шарнирная область, содержащая последовательность SEQ ID NO: 2 (X_n1X_n2X_n3X_n4X_n5X_n6CX_n7X_n8CX_n9X_n10C), где X_n1 может представлять собой любую аминокислоту, где X_n2 может представлять собой любую аминокислоту, где X_n3 может представлять собой любую аминокислоту, где X_n4 может представлять собой любую аминокислоту, где X_n5 может представлять собой любую аминокислоту, где X_n6 может представлять собой любую аминокислоту, отличную от цистеина, где X_n7 может представлять собой любую аминокислоту, где X_n8 может представлять собой любую аминокислоту, где X_n9 может представлять собой любую аминокислоту, и где X_n10 может представлять собой любую аминокислоту (SEQ ID NO: 241).

[0238] Согласно некоторым вариантам реализации SEQ ID NO: 2 X_n1 не представляет собой цистеин (SEQ ID NO: 213). Согласно некоторым вариантам реализации SEQ ID NO: 2 X_n1 представляет собой серин или аланин (SEQ ID NO: 242). Согласно некоторым вариантам реализации SEQ ID NO: 2 X_n2 не представляет собой цистеин (SEQ ID NO: 214). Согласно некоторым вариантам реализации SEQ ID NO: 2 X_n2 представляет собой D (SEQ ID NO: 215). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения X_n3 представляет собой K (SEQ ID NO: 216). Согласно некоторым вариантам реализации SEQ ID NO: 2 X_n4 представляет собой Т (SEQ ID NO: 217). Согласно некоторым вариантам реализации SEQ ID NO: 2 X_n5 представляет собой Н (SEQ ID NO: 218). Согласно некоторым вариантам реализации SEQ ID NO: 2 X_n6 представляет собой Т (SEQ ID NO: 219). Согласно некоторым вариантам реализации SEQ ID NO: 2 X_n7 представляет собой Р или V (SEQ ID NO: 220). Согласно некоторым вариантам реализации SEQ ID NO: 2 X_n8 представляет собой Р или Е (SEQ ID NO: 221). Согласно некоторым вариантам реализации SEQ ID NO: 2 X_n9 представляет собой Р или V (SEQ ID NO: 222). Согласно некоторым вариантам реализации SEQ ID NO: 2 X_n10 представляет собой Р или Е (SEQ ID NO: 223). Согласно некоторым вариантам реализации SEQ ID NO: 2 X_n2 представляет собой D, X_n3 представляет собой K, X_n4 представляет собой Т, X_n5 представляет собой Н, X_n6 представляет собой Т, X_n7 представляет собой Р или V, X_n8 представляет собой Р или Е, и X_n9 представляет собой Р или V (SEQ ID NO: 243).

[0239] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения аминокислотная шарнирная область дополнительно содержит последовательность X_n11X_n12C Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения данная последовательность может быть непосредственно присоединена к С-концевому цистеину в SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 244) или SEQ ID NO: 2 (SEQ ID NO: 245). Согласно некоторым вариантам реализации SEQ ID NO: 2 X_n11 может представлять собой любую аминокислоту, и X_n12 может представлять собой любую аминокислоту (SEQ ID NO: 245). Согласно некоторым вариантам реализации SEQ ID NO: 2 X_n11 представляет собой Р или V, и причем X_n12 представляет собой Р или Е (SEQ ID NO: 246). Согласно некоторым вариантам реализации SEQ ID NO: 2 X_n1 представляет собой серин, X_n2 представляет собой D, X_n3 представляет собой K, X_n4 представляет собой Т, X_n5 представляет собой Н, X_n6 представляет собой Т, X_n7 представляет собой Р, X_n8 представляет собой Р, X_n9 представляет собой Р, и X_n10 представляет собой Р (SEQ ID NO: 247).

[0240] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения любым шарнирным последовательностям может предшествовать любое количество начальных аминокислот. Таким образом, к молекуле можно добавить дополнительные линкеры или спейсеры из аминокислот перед указанной последовательностью (такой как SEQ ID NO: 1 и/или NO: 2). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения за любыми последовательностями шарнира может следовать любое количество дополнительных аминокислот. Таким образом, к молекуле можно добавить дополнительные линкеры или спейсеры аминокислот после указанной последовательности (такой как SEQ ID NO: 1 и/или NO: 2).

[0241] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения шарнирная область содержит по меньшей мере одну из следующих последовательностей: СРРСРРС (SEQ ID NO: 52), CPPCVECPPC (SEQ ID NO: 53) или СРРСРРСРРС (SEQ ID NO: 54). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения шарнирная область содержит по меньшей мере одну из следующих последовательностей: ERKSCVECPPCPGGGSSGGGSG (SEQ ID NO: 34), EPKSSDKTHTCPPCPPC (SEQ ID NO: 168), EPKSSDKTHTCPPCVECPPC (SEQ ID NO: 169) или EPKSSDKTHTCPPCPPCPPC (SEQ ID NO: 170). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения шарнирная область содержит по меньшей мере одну из следующих последовательностей: EPKSSDKTHTCPPCPPCGGGSSGGGSG (SEQ ID NO: 26), EPKSSDKTHTCPPCVECPPCGGGSSGGGSG (SEQ ID NO: 28) или EPKSSDKTHTCPPCPPCPPCGGGSSGGGSG (SEQ ID NO: 30).

[0242] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения нижняя шарнирная область/последовательность может представлять собой удлиняющую последовательность (например, 8-25 аминокислот, например, 8-20, 10-25, 10-22, 12-20, 14-16, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 аминокислот). Примеры нижнего шарнира представлены в таблице 1 и таблице 7. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения нижний шарнир может представлять собой нативный нижний шарнир из γ1, γ2, γ3 или γ4. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения можно иметь последовательность нативного шарнира и добавить одну или более спейсерных аминокислот (например, 1, 2, 3, 4 или более аминокислот, таких как G или S).

[0243] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения аминокислотная шарнирная область содержит последовательность основного шарнира согласно по меньшей мере одной последовательности из: CVECPPCP (SEQ ID NO: 57), СРРСРРС (SEQ ID NO: 52), СРРСРРСРРС (SEQ ID NO: 54) или CPPCVECPPC (SEQ ID NO: 53), присоединенную к последовательности верхнего шарнира ELKTPLGDTTHT (SEQ ID NO: 48) или EPKSSDKTHT (SEQ ID NO: 46).

[0244] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения любой из вариантов реализации, описанных в настоящем документе, может быть модифицирован или дополнен любым одним или несколькими из следующих вариантов.

[0245] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения шарнирная область содержит по меньшей мере три цистеина (на каждой цепи, всего по меньшей мере 6 цистеинов между двумя цепями в димерной шарнирной конструкции). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения шарнирная область содержит по меньшей мере четыре цистеина (на каждой цепи). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения шарнирная область содержит по меньшей мере пять цистеинов (на каждой цепи). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения присутствуют 6, 7, 8, 9, 10 или более цистеинов (на каждой цепи). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения шарнирная область в целом содержит вышеуказанное количество цистеинов (на каждой цепи и/или в димерной конструкции). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения все из указанных цистеинов присутствуют в основной шарнирной области. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения все из указанных цистеинов присутствуют в основной шарнирной области, и в верхней шарнирной области и/или нижней шарнирной области отсутствуют дополнительные цистеины. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения цистеины распределены на протяжении аминокислотной шарнирной области в повторяющемся мотиве «СХХ» (таком как СХХСХХСХХ (SEQ ID NO: 171), или СХХСХХ (SEQ ID NO: 172), или СХХСХХСХХСХХ (SEQ ID NO: 173). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения цистеины распределены на протяжении основной шарнирной области в повторяющемся мотиве СХХ. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения мотив повторяется 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более раз. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения каждый X может представлять собой Р, V или Е (SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO: 173). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения X не представляет собой цистеин (SEQ ID NO: 248, SEQ ID NO: 249, SEQ ID NO: 250).

[0246] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения основная шарнирная область содержит по меньшей мере три цистеина на цепь, образующих по меньшей мере три дисульфидные связи в основной шарнирной области. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения конструкции экспрессируются намного лучше в клетках млекопитающих и позволяют получить более высокие титры, а также низкий уровень агрегации и более однородный продукт. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения каждый из цистеинов, присутствующих в основной шарнирной области, может образовать дисульфидную связь с соответствующим цистеином на его спаренной цепи в шарнире. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения дисульфидная связь образована между соответствующими цистеинами на двух отдельных цепях белка, каждая из которых является шарнирной областью. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения образованы по меньшей мере 3 дисульфидные связи, например, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения способны образоваться по меньшей мере 3 дисульфидные связи, например, в структуре могут образоваться одновременно 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более дисульфидных связей.

[0247] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первый остаток основной шарнирной области представляет собой серин. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения основная шарнирная область содержит SCVECPPCP (SEQ ID NO: 56).

[0248] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения домен C_H3 любой конструкции может быть из γ1, γ2 или γ3 и их любых встречающихся в природе аллелей. В настоящем документе «γ» является сокращенным обозначением гамма.

[0249] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения удлинение или нижняя шарнирная область содержит по меньшей мере одну аминокислоту из S, G, А, Р или V. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения удлиняющая последовательность содержит по меньшей мере GGGSSGGGSG (SEQ ID NO: 59). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения удлинение или нижняя шарнирная область содержит по меньшей мере APPVAGP (SEQ ID NO: 60). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения нижняя шарнирная область содержит по меньшей мере одну последовательность из: GGGSSGGGSG (SEQ ID NO: 59) или APPVAGP (SEQ ID NO: 60). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения нижняя шарнирная последовательность может представлять собой линкер GS, удлиняющую последовательность и/или любую нативную нижнюю шарнирную область из γ1, γ2, γ3 и γ4.

Свойства

[0250] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения шарниры, описанные в настоящем документе, могут обеспечить меньший процент образования и/или присутствия полумолекул в композиции любого миниантитела или другой антигенсвязывающей конструкции. Например, менее 7% композиции может представлять собой полумолекулу, включая диапазоны, такие как менее 6, 5, 4, 3, 2, 1 и/или 0,5% композиции, представляющие собой полумолекулу.

[0251] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, когда шарнир расположен в миниантителе и когда миниантитело вводят субъекту-человеку, клиренс миниантитела из субъекта может осуществляться через печень и/или почки. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клиренс через печень составляет по меньшей мере 10% или более, например, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 99 или 100%. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения при расположении в миниантителе, и когда миниантитело вводят субъекту-человеку, клиренс миниантитела из субъекта может осуществляться преимущественно через почки. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения по меньшей мере в 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 раз больше или более антитела выводится через почки.

[0252] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения в композиции миниантитела наблюдается менее 30% агрегации миниантитела. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения в композиции миниантитела наблюдается менее 20% агрегации миниантитела. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения в композиции миниантитела наблюдается менее 10% агрегации миниантитела. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения в композиции миниантитела наблюдается менее 5% агрегации миниантитела. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения в композиции миниантитела наблюдается менее 1% агрегации миниантитела.

[0253] Если миниантитело остается в сосудистом русле in vivo в виде димера, клиренс белка, как прогнозируют, будет осуществляться преимущественно через печень. Напротив, если присутствует полумолекула, ее клиренс будет осуществляться через почки. Таким образом, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вышеуказанные аспекты клиренса являются способом характеризации количества полученных в результате полумолекул, присутствующих у субъекта in vivo, что позволяет определить, остается ли целая введенная молекула целой молекулой in vivo либо расщепляется на полумолекулы. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения композиция миниантитела является таковой, в которой уровень клиренса через печень является относительно высоким по сравнению с клиренсом через почки, и поглощение миниантител опухолью является относительно высоким. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения соотношение клиренса через почки к клиренсу через печень составляет менее 1. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения через печень осуществляется по меньшей мере на 1% больше поглощения, чем через почки, например, по меньшей мере на 1, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 80, 90, 100 или более поглощения осуществляется через печень, чем через почки. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения соотношение поглощения через почки к поглощению через печень составляет 0,9:1, 1:10, 1:100, 1:000, 1:10000 и т.д. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения различные шарнирные конструкции, описанные в настоящем документе, характеризуются меньшим уровнем клиренса через почки, чем шарнир ЕН1 из IgG1.

[0254] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения мутация первого цистеина шарнира на серин в шарнирной области IgG1 (ЕН2 γ1) для предотвращения нежелательного взаимодействия с другим неспаренным цистеином позволяет получить белок с лучшим профилем in vitro. Однако высокий уровень клиренса через почки по сравнению с печенью может свидетельствовать о нестабильности белка и диссоциации на полумолекулы in vivo. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложены миниантитела, содержащие шарнир IgG2, в которых первый цистеин шарнира мутирован на серин (ЕН2 γ2 и другие) и которые обладают свойством выводиться через печень, что, согласно прогнозу, соответствует белкам с молекулярной массой приблизительно 80 кДа. Это свидетельствует, что молекула остается интактной in vivo. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения молекула остается интактной в течение 48 часов или дольше.

[0255] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения конструкция шарнира, описанная в настоящем документе, содержит менее 9% полумолекул, присутствующих в связи с неспаренным первым цистеином шарнира. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения шарнир IgG2 с первым цистеином, замененным на серин, содержит более 99% интактного димера белка, такой как таковой с ЕН2 γ2. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вариант шарнира γ2 приводит к меньшему уровню поглощения почками. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения МА, сконструированное с шарниром huIgG1 (ЕН1 γ1), быстро выводится через почки с получением низкого уровня нацеливания на опухоль. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения МА, сконструированное с вариантами шарнира huIgG2, удлиненным шарниром (ЕН2 γ2) или природным шарниром (NH1 γ2), демонстрирует большую стабильность in vivo с высоким уровнем нацеливания на опухоль и меньшим уровнем почечного клиренса.

[0256] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения миниантитела γ1 с шарниром ЕН2 надлежащим образом собираются в интактные димерные молекулы, но добавление всего 2 цистеинов приводит к получению белка с высоким количеством полумолекул. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения миниантитела γ1 с шарниром ЕН3 надлежащим образом собираются в интактные димерные молекулы, и добавление 3^его цистеина на цепь приводит к получению белка с очень низкими уровнями полумолекул. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения уровень полумолекул составляет менее 15%, например, присутствует менее 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или менее 1% полумолекул.

[0257] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения даже если шарнирная область была изменена и отличается от таковой, описанной ранее, CDR, V_H/V_L или полные аминокислотные последовательности миниантител все еще связываются с молекулой-мишенью с той же аффинностью, что и антитело (такое как миниантитело) с предыдущим типом шарнира. Таким образом, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения присутствие шарнира, описанного в настоящем документе, не изменяет или отрицательно не влияет на аффинность связывания антигенсвязывающей конструкции, все еще обеспечивая одно или более преимуществ и/или структур, описанных в настоящем документе.

[0258] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложено миниантитело, содержащее последовательность X_n1CX_n2X_n3CX_n4X_n5C (SEQ ID NO: 3). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения SEQ ID NO: 3 расположена в виде основной шарнирной области миниантитела. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения X_n1 может представлять собой любую аминокислоту или отсутствие аминокислоты, X_n2 может представлять собой любую аминокислоту, X_n3 может представлять собой любую аминокислоту, X_n4 может представлять собой любую аминокислоту, и X_n5 может представлять собой любую аминокислоту. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения X_n1 не может представлять собой цистеин, X_n2 не может представлять собой цистеин, X_n3 не может представлять собой цистеин, X_n4 не может представлять собой цистеин, и/или X_n5 не может представлять собой цистеин (SEQ ID NO: 251). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения X_n1 представляет собой любую аминокислоту, отличную от цистеина (SEQ ID NO: 229). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения X_n1 представляет собой серин (SEQ ID NO: 230).

[0259] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложено миниантитело, содержащее последовательность X_n1CX_n2X_n3CX_n4X_n5CX_n6 (SEQ ID NO: 4). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения SEQ ID NO: 4 расположена в виде основной шарнирной области миниантитела. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения X_n1 может представлять собой любую аминокислоту или отсутствие аминокислоты, X_n2 может представлять собой любую аминокислоту, X_n3 может представлять собой любую аминокислоту, X_n4 может представлять собой любую аминокислоту, и X_n5 может представлять собой любую аминокислоту (SEQ ID NO: 252). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения X_n1 не может представлять собой цистеин, X_n2 не может представлять собой цистеин, X_n3 не может представлять собой цистеин, X_n4 не может представлять собой цистеин, и/или X_n5 не может представлять собой цистеин (SEQ ID NO: 253). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения X_n1 представляет собой любую аминокислоту, отличную от цистеина (SEQ ID NO: 254). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения X_n1 представляет собой серин (SEQ ID NO: 255). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения X_n6 может представлять собой любую аминокислоту, отсутствие аминокислоты или Р (SEQ ID NO: 256).

[0260] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения любые из аминокислотных шарнирных областей или полных шарниров, описанных в настоящем документе, находятся в антителе. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения любые из аминокислотных шарнирных областей или полных шарниров, описанных в настоящем документе, находятся в связывающем фрагменте антитела. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения любые из аминокислотных шарнирных областей или полных шарниров, описанных в настоящем документе, находятся в миниантителе.

[0261] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения любые из аминокислотных шарнирных областей или полных шарниров, описанных в настоящем документе, находятся в моноспецифичном антителе.

[0262] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения любые из аминокислотных шарнирных областей или полных шарниров, описанных в настоящем документе, находятся в биспецифичном антителе. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения любые из аминокислотных шарнирных областей или полных шарниров, описанных в настоящем документе, сконструированы в соотношении 1:1. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения любые из аминокислотных шарнирных областей или полных шарниров, описанных в настоящем документе, являются частью фрагмента антитела, которое является биспецифичной конструкцией. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения биспецифичное антитело представляет собой миниантитело.

Специфичные антигенсвязывающие конструкции

[0263] В настоящем документе описаны антигенсвязывающие конструкции, которые связываются с мишенью. Антигенсвязывающая конструкция представляет собой молекулу, которая содержит одну или более частей иммуноглобулина или родственной иммуноглобулину молекулы, которая специфично связывается с молекулой-мишенью или является иммунологически реактивной с молекулой-мишенью. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения любые варианты реализации шарнира, описанные в настоящем документе, можно применять в отношении любой целевой антигенсвязывающей конструкции. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения любые варианты реализации шарнира, описанные в настоящем документе, можно применять в отношении миниантитела. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения любые варианты реализации шарнира, описанные в настоящем документе, можно применять в отношении миниантитела, которое связывается с CD8, CD3, 5Т4, АСКП или ПСМА. Неограничивающий вариант реализации антигена ПСМА представлен на ФИГ. 70. Неограничивающий вариант реализации антигена АСКП представлен на ФИГ. 71. Неограничивающий вариант реализации антигена 5Т4 представлен на ФИГ. 72. Некоторые неограничивающие варианты реализации антигена CD8 представлены на ФИГ. 73 и 74. Некоторые неограничивающие варианты реализации антигена CD3 представлены на ФИГ. 75-78. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения любые варианты реализации шарнира, описанные в настоящем документе, можно применять в отношении миниантитела, которое специфично и/или селективно связывается с CD8, CD3, 5Т4, АСКП или ПСМА. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения любые варианты реализации шарнира, представленные в таблицах 1 или 7, можно применять в отношении миниантитела, которое связывается с CD8, CD3, 5Т4, АСКП или ПСМА. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения любые из вариантов реализации полного шарнира можно применять в отношении миниантитела, которое связывается с CD8, CD3, 5Т4, АСКП или ПСМА. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения любые из вариантов реализации верхнего шарнира можно применять в отношении миниантитела, которое связывается с CD8, CD3, 5Т4, АСКП или ПСМА. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения любые из вариантов реализации основного шарнира можно применять в отношении миниантитела, которое связывается с CD8, CD3, 5Т4, АСКП или ПСМА. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения любые из вариантов реализации нижнего шарнира можно применять в отношении миниантитела, которое связывается с CD8, CD3, 5Т4, АСКП или ПСМА. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения любые из вариантов реализации верхнего и основного шарнира можно применять в отношении миниантитела, которое связывается с CD8, CD3, 5Т4, АСКП или ПСМА. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения любые из вариантов реализации основного и нижнего шарнира можно применять в отношении миниантитела, которое связывается с CD8, CD3, 5Т4, АСКП или ПСМА. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения любые из вариантов реализации верхнего и нижнего шарнира можно применять в отношении миниантитела, которое связывается с CD8, CD3 5Т4, АСКП или ПСМА.

[0264] Дополнительные фрагменты антитела, такие как миниантитела, приведены ниже. Фрагменты антитела можно применять, например, для визуализации или терапевтических целей. Схематическое представление иллюстративных миниантител изображено на фигурах и/или представлено в таблице 2 ниже (в ориентации М1 или ориентации М2).

[0265] В таблице 2 представлена компоновка последовательностей для мономеров, которую можно применять в миниантителах (таблица 2). Каждая строка таблицы представляет последовательность мономерной конструкции с изложением слева направо от N-конца к С-концу. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения представленные последовательности каждой мономерной конструкции напрямую присоединены друг к другу. Таким образом, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения конструкция может содержать любую из конструкций, представленных в одной строке в таблице 2. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения конструкции могут содержать любую комбинацию из таблицы 2. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, например, первый элемент в первой строке, столбец 3, можно объединить с первой строкой, столбец 4, с первой строкой, столбец 5, с первой строкой, столбец 6-8, с первой строкой, столбец 9. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения столбец 3 и столбец 5 можно поменять местами друг с другом. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первый элемент в первой строке, столбец 3, можно объединить с первой строкой, столбец 4, со второй строкой, столбец 5, со второй строкой, столбец 6-8, со второй строкой, столбец 9. Таким образом, в таблицах представлены все возможные комбинации как в пределах одной строки, так и среди различных строк (и со столбцами, поменянными местами).

[0266] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антигенсвязывающая конструкция против CD8 содержит CDR1 тяжелой цепи (HCDR1) согласно HCDR 1 в SEQ ID NO: 75; CDR2 тяжелой цепи (HCDR2) согласно HCDR2 в SEQ ID NO: 76; CDR3 тяжелой цепи (HCDR3) согласно HCDR3 в SEQ ID NO: 77; CDR1 легкой цепи (LCDR1) согласно LCDR1 в SEQ ID NO: 78; CDR2 легкой цепи (LCDR2) согласно LCDR2 в SEQ ID NO: 79; и/или CDR3 легкой цепи (LCDR3) согласно LCDR3 в SEQ ID NO: 80. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антигенсвязывающая конструкция против ПСМА содержит CDR1 тяжелой цепи (HCDR1) согласно HCDR 1 в SEQ ID NO: 81; CDR2 тяжелой цепи (HCDR2) согласно HCDR2 в SEQ ID NO: 82; CDR3 тяжелой цепи (HCDR3) согласно HCDR3 в SEQ ID NO: 83; CDR1 легкой цепи (LCDR1) согласно LCDR1 в SEQ ID NO: 84; CDR2 легкой цепи (LCDR2) согласно LCDR2 в SEQ ID NO: 85; и/или CDR3 легкой цепи (LCDR3) согласно LCDR3 в SEQ ID NO: 86. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антигенсвязывающая конструкция против 5Т4 содержит CDR1 тяжелой цепи (HCDR1) согласно HCDR 1 в SEQ ID NO: 87; CDR2 тяжелой цепи (HCDR2) согласно HCDR2 в SEQ ID NO: 88; CDR3 тяжелой цепи (HCDR3) согласно HCDR3 в SEQ ID NO: 89; CDR1 легкой цепи (LCDR1) согласно LCDR1 в SEQ ID NO: 90; CDR2 легкой цепи (LCDR2) согласно LCDR2 в SEQ ID NO: 91; и/или CDR3 легкой цепи (LCDR3) согласно LCDR3 в SEQ ID NO: 92. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антигенсвязывающая конструкция против АСКП содержит CDR1 тяжелой цепи (HCDR1) согласно HCDR1 в SEQ ID NO: 93; CDR2 тяжелой цепи (HCDR2) согласно HCDR2 в SEQ ID NO: 94; CDR3 тяжелой цепи (HCDR3) согласно HCDR3 в SEQ ID NO: 95; CDR1 легкой цепи (LCDR1) согласно LCDR1 в SEQ ID NO: 96; CDR2 легкой цепи (LCDR2) согласно LCDR2 в SEQ ID NO: 97; и/или CDR3 легкой цепи (LCDR3) согласно LCDR3 в SEQ ID NO: 98. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антигенсвязывающая конструкция против CD3 содержит CDR1 тяжелой цепи (HCDR1) согласно HCDR1 на ФИГ. 65В или 65С; CDR2 тяжелой цепи (HCDR2) согласно HCDR2 на ФИГ. 65В или 65С; CDR3 тяжелой цепи (HCDR3) согласно HCDR3 на ФИГ. 65В или 65С; CDR1 легкой цепи (LCDR1) согласно LCDR1 на ФИГ. 65В или 65С; CDR2 легкой цепи (LCDR2) согласно LCDR2 на ФИГ. 65В или 65С; и/или CDR3 легкой цепи (LCDR3) согласно LCDR3 на ФИГ. 65В или 65С. Некоторые варианты реализации последовательностей CDR, которые можно применять с любой одной или несколькими последовательностями шарнира, описанными в настоящем документе, представлены в таблице 3.

[0267] Данные конструкции могут находиться в любой из форм, описанных в настоящем документе, включая миниантитела, scFv и т.д. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антигенсвязывающая конструкция содержит 6, 5, 4, 3, 2 или 1 вышеуказанный CDR (некоторые варианты реализации CDR представлены на ФИГ. 41, 48, 55, 61, 65В или 65С). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения любые участки шарнира, описанные в настоящем документе, можно объединить с любыми из CDR, описанными в настоящем документе. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения любые участки верхнего шарнира, описанные в настоящем документе, можно объединить с любыми из CDR, описанными в настоящем документе. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения любые из основных шарнирных областей, описанных в настоящем документе, можно объединить с любыми из CDR, описанных в настоящем документе. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения любые из участков нижнего шарнира, описанных в настоящем документе, можно объединить с любыми из CDR, описанных в настоящем документе. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения любые из участков полного шарнира, описанных в настоящем документе, можно объединить с любыми из CDR, описанных в настоящем документе. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения любые участки верхнего и основного шарнира, описанные в настоящем документе, можно объединить с любыми из CDR, описанных в настоящем документе. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения любые из участков центрального и нижнего шарнира, описанных в настоящем документе, можно объединить с любыми из CDR, описанных в настоящем документе. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения любые из данных вариантов реализации на основе CDR могут являться частью миниантитела. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антигенсвязывающая конструкция содержит CDR3 тяжелой цепи (HCDR3). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антигенсвязывающая конструкция специфично связывается с молекулой-мишенью. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антигенсвязывающая конструкция конкурирует за связывание с одним или несколькими антителами, содержащими представленные в настоящем документе CDR. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антигенсвязывающая конструкция содержит по меньшей мере 3 CDR тяжелой цепи, указанные в настоящем документе. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антигенсвязывающая конструкция содержит CDR3 тяжелой цепи. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антигенсвязывающая конструкция дополнительно содержит любую из последовательностей CDR2 тяжелой цепи, описанных в настоящем документе. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения любые из данных вариантов реализации можно применять в отношении миниантитела, которое связывается с CD8, CD3, 5Т4, АСКП или ПСМА.

[0268] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антигенсвязывающая конструкция является человеческой или гуманизированной. В контексте миниантитела термин «человеческая» не означает, что конструкция идентична таковой, обнаруженной в природе у людей, но означает, что данная конструкция содержит последовательности, которые являются человеческими. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антигенсвязывающая конструкция содержит по меньшей мере один каркасный участок человека (например, те участки, находящиеся перед, между и после CDR, представленных на ФИГ. 41, 48, 55, 61, 65В или 65С), или каркасный участок с идентичностью последовательности по меньшей мере приблизительно 80%, например, с идентичностью по меньшей мере приблизительно 80%, 85%, 90%, 93%, 95%, 97% или 99% с каркасным участком человека. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антигенсвязывающая конструкция содержит 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 из перечисленных FR. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения любые участки шарнира, описанные в настоящем документе, можно объединить с любыми из FR, описанных в настоящем документе. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения любые участки верхнего шарнира, описанные в настоящем документе, можно объединить с любым из FR, описанных в настоящем документе. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения любые из участков центрального шарнира, описанных в настоящем документе, можно объединить с любым из FR, описанных в настоящем документе. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения любые из участков нижнего шарнира, описанных в настоящем документе, можно объединить с любым из FR, описанных в настоящем документе. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения любые из участков полного шарнира, описанных в настоящем документе, можно объединить с любым из FR, описанных в настоящем документе. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения любые участки верхнего и центрального шарнира, описанные в настоящем документе, можно объединить с любым из FR, описанных в настоящем документе. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения любой из участков центрального и нижнего шарнира, описанный в настоящем документе, можно объединить с любым из FR, описанных в настоящем документе. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения любой из данных вариантов реализации на основе FR. может являться частью миниантитела. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения любой из данных вариантов реализации можно применять в отношении миниантитела, которое связывается с CD8, CD3, 5Т4, АСКП или ПСМА.

[0269] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антигенсвязывающая конструкция содержит вариабельную область тяжелой цепи согласно вариабельной области тяжелой цепи в SEQ ID NO: 14 (ПСМА), 16 или 99 (CD8), 18 или 102 (5Т4), 68 (АСКП) либо 20 или 104 (или ФИГ. 65В и 65С) (CD3). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антигенсвязывающая конструкция содержит вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит последовательность с идентичностью по меньшей мере приблизительно 80%, например, с идентичностью по меньшей мере приблизительно 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% с SEQ ID NO: 14 (ПСМА), 16 или 99 (CD8), 18 или 102 (5Т4), 68 (АСКП) либо 20 или 104 (или ФИГ. 65В и 65С) (CD3). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антигенсвязывающая конструкция содержит вариабельную область легкой цепи, которая содержит SEQ ID NO: 13 (ПСМА), 15 (CD8), 17 или 100 или 101 (5Т4), 67 (АСКП) либо 19 или 103 (или ФИГ. 65В и 65С) (CD3). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антигенсвязывающая конструкция содержит вариабельную область легкой цепи, которая содержит последовательность с идентичностью по меньшей мере приблизительно 80%, например, с идентичностью по меньшей мере приблизительно 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% с SEQ ID NO: 13 (ПСМА), 15 (CD8), 17 или 100 или 101 (5Т4), 67 (АСКП) либо 19 или 103 (или ФИГ. 65В и 65С) (CD3). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антигенсвязывающая конструкция представляет собой антигенсвязывающую конструкцию человека и содержит вариабельную область тяжелой цепи, вариабельную область легкой цепи или тяжелую и легкую цепи, которые являются по меньшей мере такими же идентичными, как и по меньшей мере последовательности вариабельной области тяжелой и/или легкой цепей, представленные выше. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения любой из вышеуказанных вариантов реализации объединен с любым из вариантов реализации шарниров, описанных в настоящем документе, включая, например, в контексте миниантитела. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения любые участки шарнира, описанные в настоящем документе, можно объединить с любыми из спариваний V_H и V_L, описанными в настоящем документе. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения любые участки верхнего шарнира, описанные в настоящем документе, можно объединить с любыми из спариваний V_H и V_L, описанных в настоящем документе. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения любые из участков центрального шарнира, описанных в настоящем документе, можно объединить с любыми из спариваний V_H и V_L, описанных в настоящем документе. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения любые из участков нижнего шарнира, описанных в настоящем документе, можно объединить с любыми из спариваний V_H и V_L, описанных в настоящем документе. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения любые из участков полного шарнира, описанных в настоящем документе, можно объединить с любыми из спариваний V_H и V_L, описанных в настоящем документе. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения любые участки верхнего и центрального шарнира, описанные в настоящем документе, можно объединить с любыми из спариваний V_H и V_L, описанных в настоящем документе. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения любые из участков центрального и нижнего шарнира, описанных в настоящем документе, можно объединить с любыми из спариваний V_H и V_L, описанных в настоящем документе. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения любые из данных вариантов реализации на основе спариваний V_H и V_L могут являться частью миниантитела. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения любой из данных вариантов реализации можно применять в отношении миниантитела, которое связывается с CD8, CD3, 5Т4, АСКП или ПСМА.

[0270] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антигенсвязывающая конструкция содержит поддающийся обнаружению маркер. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антигенсвязывающая конструкция содержит терапевтическое средство.

[0271] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антигенсвязывающая конструкция является бивалентной. Бивалентная антигенсвязывающая конструкция может содержать по меньшей мере первый антигенсвязывающий домен, например, первый scFv, и по меньшей мере второй антигенсвязывающий домен, например, второй scFv. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения бивалентная антигенсвязывающая конструкция представляет собой мультимер, который содержит по меньшей мере два мономера, например, по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 мономеров, каждый из которых содержит антигенсвязывающий домен. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антигенсвязывающая конструкция представляет собой миниантитело. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения одна или более частей шарниров, описанных в настоящем документе, включены в бивалентную конструкцию. Миниантитело может содержать любой из вариантов реализации CDR и вариабельной области тяжелой цепи и/или вариабельной области легкой цепи, описанных в настоящем документе (например, последовательности CDR, представленные на ФИГ. 41, 48, 55, 61, 65В или 65С). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антигенсвязывающая конструкция представляет собой моновалентный scFv. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложен моновалентный scFv, который содержит CDR1 тяжелой цепи (HCDR1) в HCDR1 согласно ФИГ. 41, 48, 55, 61, 65В или 65С, CDR2 тяжелой цепи (HCDR2) в HCDR2 согласно ФИГ. 41, 48, 55, 61, 65В или 65С, HCDR3 в HCDR3 согласно ФИГ. 41, 48, 55, 61, 65В или 65С, CDR1 легкой цепи (LCDR1) в LCDR1 согласно ФИГ. 41, 48, 55, 61, 65В или 65С, CDR2 легкой цепи (LCDR2) в LCDR2 согласно ФИГ. 41, 48, 55, 61, 65В или 65С, и CDR3 легкой цепи (LCDR3) в LCDR3 согласно ФИГ. 41, 48, 55, 61, 65В или 65С. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения моновалентный scFv содержит вариабельную область тяжелой цепи согласно вариабельной области тяжелой цепи на ФИГ. 36А, 36В, 36С, 36D, 36Е, 65В или 65С. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения моновалентный scFv содержит вариабельную область легкой цепи согласно вариабельной области легкой цепи на ФИГ. 36А, 36В, 36С, 36D, 36Е, 65В или 65С. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения моновалентный scFv содержит вариабельную область тяжелой цепи согласно вариабельной области тяжелой цепи на ФИГ. 66, 68 или 69, и вариабельную область легкой цепи согласно вариабельной области легкой цепи на ФИГ. 67 или 69.

[0272] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антигенсвязывающая конструкция является биспецифичной. Биспецифичные конструкции могут содержать по меньшей мере первый связывающий домен, например, scFv, который специфично связывается с первым эпитопом, и по меньшей мере второй связывающий домен, например, scFv, который специфично связывается со вторым эпитопом. Таким образом, биспецифичные антигенсвязывающие конструкции могут связываться с двумя или более эпитопами. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первый эпитоп и второй эпитоп являются частью одного антигена, и биспецифичная антигенсвязывающая конструкция может, таким образом, связываться с двумя эпитопами одного антигена. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первый эпитоп является частью первого антигена, и второй эпитоп является частью второго антигена, и биспецифичная антигенсвязывающая конструкция может, таким образом, связываться с двумя различными антигенами. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антигенсвязывающая конструкция связывается с двумя эпитопами одновременно.

[0273] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антигенсвязывающая конструкция содержит вариабельную область тяжелой цепи согласно вариабельной области тяжелой цепи в SEQ ID NO: 14, 16, 18, 20, 68, 99, 102 или 104 и/или согласно последовательностям на ФИГ. 65В и 65С. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антигенсвязывающая конструкция содержит вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит последовательность с идентичностью по меньшей мере приблизительно 80%, например, с идентичностью по меньшей мере приблизительно 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% с SEQ ID NO: 14, 16, 18, 20, 68, 99, 102 или 104 и/или с последовательностями на ФИГ. 65В и 65С. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антигенсвязывающая конструкция содержит вариабельную область легкой цепи, которая содержит SEQ ID NO: 13, 15, 17, 19, 67, 100, 101 или 103 и/или последовательности на ФИГ. 65В и 65С. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антигенсвязывающая конструкция содержит вариабельную область легкой цепи, которая содержит последовательность с идентичностью по меньшей мере приблизительно 80%, например, с идентичностью по меньшей мере приблизительно 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% с SEQ ID NO: 13, 15, 17, 19, 67, 100, 101 или 103 и/или последовательности на ФИГ. 65В и 65С. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антигенсвязывающая конструкция представляет собой антигенсвязывающую конструкцию человека и содержит вариабельную область тяжелой цепи, вариабельную область легкой цепи или тяжелую и легкую цепи, которые являются по меньшей мере такими же идентичными, как и по меньшей мере последовательности вариабельной области тяжелой и/или легкой цепей, представленные выше.

[0274] Некоторые варианты реализации, описанные в настоящем документе, включают антигенсвязывающую конструкцию, которая конкурирует за связывание с молекулой-мишенью с одной или несколькими антигенсвязывающими конструкциями, описанными в настоящем документе, и содержит одну или более частей шарнира, описанного в настоящем документе (например, в таблице 1). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения конкурирующая антигенсвязывающая конструкция связывается с тем же эпитопом на молекуле-мишени, что и эталонная антигенсвязывающая конструкция. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения эталонная антигенсвязывающая конструкция связывается с первым эпитопом молекулы-мишени, и конкурирующая антигенсвязывающая конструкция связывается со вторым эпитопом молекулы-мишени, но препятствует связыванию эталонной антигенсвязывающей конструкции с молекулой-мишенью, например, в результате пространственного блокирования связывания эталонной антигенсвязывающей конструкции или в результате индукции конформационного изменения в молекуле-мишени. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первый эпитоп перекрывается со вторым эпитопом.

[0275] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения форматы scFv и/или миниантитела обладают благоприятными фармакокинетическими характеристиками для диагностической визуализации и определенных терапевтических применений при сохранении высокой аффинности связывания и специфичности родительского антитела. По сравнению с визуализацией с помощью полноразмерного родительского антитела фармакокинетика данных фрагментов является более благоприятной, поскольку данные фрагменты способны нацеливаться на антиген, а затем быстро выводиться из системы для быстрой высококонтрастной визуализации. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения более короткие периоды полужизни циркуляции миниантитела обеспечивают оптимальную визуализацию в течение диапазона времени от приблизительно 6-48 до 72 часов (в зависимости от клиренса и уровня «поглощения» антигена и периода полужизни изотопа, хелатированного с МА) после инъекции миниантитела. Быстрый клиренс из крови наряду с лучшим проникновением через ткань может позволить проводить визуализацию в тот же день, что может обеспечить значительное преимущество в клинической практике при управлении оказанием медицинского ухода за пациентом.

[0276] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения фрагменты антитела могут содержать один, два или три CDR. вариабельной области легкой цепи и/или один, два или три CDR вариабельной области тяжелой цепи из антитела против АСКП, 5Т4, ПСМА, CD3 или CD8. Например, фрагмент антитела может содержать один, два или три CDR вариабельной области и/или один, два или три CDR вариабельной области тяжелой цепи версий антитела мыши против АСКП, 5Т4, ПСМА, CD3 или CD8. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения фрагмент антитела содержит один или более участков CDR из вариабельных областей тяжелой цепи или легкой цепи гуманизированного антитела против АСКП, 5Т4, ПСМА, CD3 или CD8.

[0277] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антигенсвязывающие конструкции, которые связываются с антигеном АСКП, могут представлять собой антитела, миниантитела и/или их фрагменты, такие как scFv. Некоторые неограничивающие варианты реализации антигенсвязывающих конструкций против АСКП представлены на ФИГ. 29В-29D, 36Е, 60 (SEQ ID NO: 125 и 126), 61 (SEQ ID NO: 126), 62 (SEQ ID NO: 127), 63 (SEQ ID NO: 128), 64 (SEQ ID NO: 129), 65А (SEQ ID NO: 130). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антигенсвязывающие конструкции, которые связываются с антигеном 5Т4, могут представлять собой антитела, миниантитела и/или их фрагменты, такие как scFv. Некоторые неограничивающие варианты реализации антигенсвязывающих конструкций против 5Т4 представлены на ФИГ. 28В-28Е, 32, 36С, 54 (SEQ ID NO: 119 и 120), 55 (SEQ ID NO: 120), 56 (SEQ ID NO: 121), 57 (SEQ ID NO: 122), 58 (SEQ ID NO: 123), 59 (SEQ ID NO: 124), 67, 68. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антигенсвязывающие конструкции, которые связываются с антигеном ПСМА, могут представлять собой антитела, миниантитела и/или их фрагменты, такие как scFv. Некоторые неограничивающие варианты реализации антигенсвязывающих конструкций против ПСМА представлены на ФИГ. 5В-5Е, 7С-7Е, 21В-21Е, 34А-34F, 35А-35С, 36А, 47 (SEQ ID NO: 112 и 113), 48 (SEQ ID NO: 113), 49 (SEQ ID NO: 114), 50 (SEQ ID NO: 115), 51 (SEQ ID NO: 116), 52 (SEQ ID NO: 117), 53 (SEQ ID NO: 118). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антигенсвязывающие конструкции, которые связываются с антигеном CD3, могут представлять собой антитела, миниантитела и/или их фрагменты, такие как scFv. Некоторые неограничивающие варианты реализации антигенсвязывающих конструкций против CD3 представлены на ФИГ. 33, 36D, 69, 65В и 65С. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антигенсвязывающие конструкции, которые связываются с антигеном CD8, могут представлять собой антитела, миниантитела и/или их фрагменты, такие как scFv. Некоторые неограничивающие варианты реализации антигенсвязывающих конструкций против CD8 представлены на ФИГ. 14В, 15В, 16В-16D, 20С-20G, 22В, 36В, 40 (SEQ ID NO: 105 и 106), 41 (SEQ ID NO: 106), 42 (SEQ ID NO: 107), 43 (SEQ ID NO: 108), 44 (SEQ ID NO: 109), 45 (SEQ ID NO: 110), 46 (SEQ ID NO: 111) и 66.

Варианты линкера

[0278] Согласно некоторым вариантам реализации отдельных антигенсвязывающих конструкций вариабельные домены тяжелой и легкой цепей могут быть связаны различными способами. По этой причине применение различных длин линкера между доменами V_H и V_L обеспечивает конформационную гибкость и диапазон движения для обеспечения образования дисульфидных связей.

[0279] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения длины двух линкеров могут находиться в диапазоне где-либо между (и включая) приблизительно от 1 до 50 аминокислот, например, от 2 до 15, от 2 до 14, от 3 до 13, от 4 до 10 или от 5 аминокислот до 8 аминокислот. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения каждый линкер в паре для миниантитела может иметь одинаковую длину. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения каждый линкер в паре может иметь разную длину. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения можно применять любую комбинацию пар длин линкера, при условии, что они обеспечивают целевую комбинацию и/или способствуют ей. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения можно применять модифицированную аминокислоту.

[0280] В таблице 2 представлены варианты миниантитела. Получение и исследование экспрессии и связывания вариантов обеспечивает идентификацию целевого формата для получения белка для каждого нового миниантитела.

[0281] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения линкер представляет собой линкер GlySer. Линкер GlySer может представлять собой полипептид, обогащенный остатками Gly и/или Ser. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения по меньшей мере приблизительно 40% остатков аминокислот линкера GlySer представляют собой Gly, Ser или комбинацию Gly и Ser, например, по меньшей мере приблизительно 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90%. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения линкер GlySer составляет по меньшей мере приблизительно 2 аминокислоты в длину, например, по меньшей мере приблизительно 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35 или 40 аминокислот в длину. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения мотив линкера может представлять собой (G₃)S_n или (G₄)S_n (n может представлять собой любое количество S; и согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения представляет собой 1 или 2). Например, а) GGGGS 5 АК, (SEQ ID NO: 66); B) GGGGSGGGGS 10 АК, (SEQ ID NO: 65); с) GGGGSGGGGSGGGGS 15 АК, (SEQ ID NO: 64); d) GSTSGGGSGGGS 12 АК, (SEQ ID NO: 63); или е) GSTSGGGSGGGSGGGGSS 18 АК (SEQ ID NO: 62). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения линкер содержит по меньшей мере один треонин.

[0282] В таблицах 1 и 2 представлены различные необязательные последовательности, которые можно применять согласно некоторым вариантам реализации scFv и/или миниантитела. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения scFv может представлять собой любой из таковых, описанных в настоящем документе, но с любой из последовательностей, представленных в таблице 1. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения миниантитело может представлять собой любое из таковых, описанных в настоящем документе, но с любой из последовательностей, представленных в полной строке в таблице 1. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения любая из антигенсвязывающих конструкций, описанных в настоящем документе, может содержать любую из частей последовательности шарнира, представленных в таблице 1.

[0283] «Миниантитело», описанное в настоящем документе, включает гомодимер, в котором каждый мономер представляет собой одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv), присоединенный к домену C_H3 человека с помощью последовательности шарнира. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения последовательность шарнира представляет собой последовательность шарнира IgG1 человека. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения последовательность шарнира представляет собой любую одну или более последовательностей шарнира, описанных в настоящем документе, например, любую из таковых, описанных в настоящем документе и/или в таблице 1 (включая любую часть или комбинацию их частей).

[0284] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения последовательность шарнира представляет собой искусственную последовательность шарнира. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения последовательность шарнира может представлять собой природный или искусственный шарнир IgG или часть либо комбинацию его частей из любого одного или нескольких из четырех классов шарниров IgG.

[0285] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения последовательность миниантитела может содержать CDR и/или FR, и/или последовательности вариабельной области, которые аналогичны последовательности, описанной в настоящем документе (например, представленной на фигурах или в таблице 2). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения миниантитело содержит последовательность (один CDR, несколько CDR, полный набор из 6 CDR, вариабельную область тяжелой цепи, вариабельную область легкой цепи, вариабельную область тяжелой и легкой цепей и т.д.), которые являются идентичными scFV миниантитела, описанного в настоящем документе.

[0286] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептид мономера содержит последовательности, представленные в таблице 2. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептид мономера содержит последовательность с идентичностью по меньшей мере приблизительно 80%, например, с идентичностью по меньшей мере приблизительно 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% с последовательностью V_LV_H мономера миниантитела, представленной в таблице 2.

[0287] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения миниантитело содержит вариабельную область цепи (вариабельную область тяжелой, легкой или тяжелой и легкой цепей), которая по меньшей мере приблизительно на 80% идентична последовательности тяжелой цепи в SEQ ID NO: 14, 16, 18, 20, 68, 99, 102 или 104 (и/или соответствующим последовательностям на ФИГ. 65В или 65С) и/или последовательности легкой цепи в SEQ ID NO): 13, 15, 17, 19, 67, 100, 101 или 103 (и/или последовательностям на ФИГ. 65В или 65С), например, с идентичностью по меньшей мере приблизительно 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93, 94, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%.

[0288] scFv могут иметь ориентацию V_HV_L или V_LV_H. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения V_H и V_L присоединены друг к другу аминокислотной линкерной последовательностью. Аминокислотный линкер может представлять собой линкер, описанный в настоящем документе. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения линкер обогащен GlySer и составляет приблизительно 15-20 аминокислот в длину. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения линкер обогащен GlySer и составляет 18 аминокислот в длину. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения длина линкера варьирует от (и включая) приблизительно 1 до 50 аминокислот, например, от 2 до 30, от 3 до 20, от 4 до 15 или от 5 аминокислот до 8 аминокислот. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения линкер представляет собой GSTSGGGSGGGSGGGGSS (SEQ ID NO. 62). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения миниантитело scFv содержит последовательность, которая по меньшей мере приблизительно на 80% идентична scFv, описанному в настоящем документе, например, идентична по меньшей мере приблизительно на 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93, 94, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%. scFv может иметь V_HV_L или V_LV_H ориентацию.

[0289] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения каждый мономер миниантитела от N-конца к С-концу содержит следующие элементы: (а) последовательность scFv, которая содержит домен V_H, присоединенный к домену V_L, и которая связывается с молекулой-мишенью, (b) шарнирный домен (например, верхняя и центральная шарнирные области, объединенные с нижней шарнирной областью и/или удлиняющей областью), и (с) последовательность C_H3 IgG человека. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения каждый мономер миниантитела содержит домен CH3 IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения миниантитело кодируется нуклеиновой кислотой, может экспрессироваться клеткой, линией клеток или другой подходящей системой экспрессии, описанной в настоящем документе. Таким образом, сигнальная последовательность может быть слита с N-концом scFV для обеспечения секреции миниантитела при экспрессии в клетке или линии клеток. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения можно применять другие сигнальные последовательности, например, сывороточного альбумина человека (SEQ ID NO: 70). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения различные сигнальные последовательности могут улучшать секрецию в зависимости от контекста и линии клеток, применяемой для экспрессии. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения сигнальную последовательность легкой цепи каппа иммуноглобулина человека (SEQ ID NO: 69) можно применять и/или вводить в нуклеиновую кислоту, кодирующую аминокислотную последовательность, описанную в настоящем документе. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения можно выбрать единичную последовательность из перечня, представленного в таблице 4, в зависимости от контекста и линии клеток, применяемой для экспрессии.

[0290] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложено химерное миниантитело, которое связывается с молекулой-мишенью. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения химерное миниантитело содержит мономер в формате V_LV_H и содержит последовательность вариабельной области легкой цепи, которая содержит SEQ ID NO: 13, 15, 17, 19, 67, 100, 101 или 103 (и/или соответствующие последовательности на ФИГ. 65В или 65С), и последовательность вариабельной области тяжелой цепи, которая содержит SEQ ID NO: 14, 16, 18, 20, 68, 99, 102 или 104 (и/или последовательности на ФИГ. 65В или 65С), или мономер, представленный в таблице 2, или последовательность, которая характеризуется идентичностью по меньшей мере приблизительно 80% с указанным мономером, например, идентичностью по меньшей мере приблизительно 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% с указанным мономером. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения химерное миниантитело содержит мономер в формате V_HV_L и содержит последовательность вариабельной области легкой цепи, которая содержит SEQ ID NO: 13, 15, 17, 19, 67, 100, 101 или 103 (и/или соответствующие последовательности на ФИГ. 65В или 65С), и последовательность вариабельной области тяжелой цепи, которая содержит SEQ ID NO: 14, 16, 18, 20, 68, 99,102 или 104 (и/или соответствующие последовательности на ФИГ. 65В или 65С), или мономер, представленный в таблице 2, или последовательность, которая характеризуется идентичностью по меньшей мере приблизительно 80% с указанным мономером, например, идентичностью по меньшей мере приблизительно 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% с указанным мономером. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения миниантитело содержит один или более CDR, представленных на ФИГ. 41, 48, 55, 61, 65В или 65С. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения миниантитело содержит одну или более вариабельных областей, представленных на ФИГ. 36А, 36В, 36С, 36D, 36Е, 66, 67, 68, 69, 65В или 65С или в таблице 2.

[0291] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения миниантитело содержит вариабельную область тяжелой цепи, представленную на ФИГ. 36А, 36В, 36С, 36D, 36Е, 66, 68, 69, 65В или 65С. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения миниантитело содержит вариабельную область легкой цепи, представленную на ФИГ. 36А, 36В, 36С, 36D, 36Е, 67, 69, 65В или 65С.

[0292] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения миниантитело содержит один или более CDR, представленных в CDR. на ФИГ. 41, 48, 55, 61, 65В или 65С.

Нуклеиновые кислоты

[0293] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептиды антигенсвязывающих конструкций могут кодироваться нуклеиновыми кислотами и экспрессироваться in vivo или in vitro либо данные пептиды можно синтезировать химическим способом. Таким образом, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложена нуклеиновая кислота, кодирующая антигенсвязывающую конструкцию. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения нуклеиновая кислота кодирует одну часть или мономер миниантитела или другой антигенсвязывающей конструкции. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения нуклеиновая кислота кодирует два или более мономеров, например, по меньшей мере 2 мономера. Нуклеиновые кислоты, кодирующие несколько мономеров, могут содержать сайты расщепления нуклеиновой кислоты между по меньшей мере двумя мономерами, могут кодировать сайт начала транскрипции или трансляции между двумя или более мономерами и/или могут кодировать протеолитические сайты-мишени между двумя или более мономерами.

[0294] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вектор экспрессии содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую антигенсвязывающую конструкцию, раскрытую в настоящем документе. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вектор экспрессии содержит версию А вектора pcDNA3.1™/myc-His (-) для экспрессии в млекопитающих (Invitrogen, Inc.) или его вариант. Вектор экспрессии pcDNA3.1 содержит промотор CMV для экспрессии в млекопитающих и селективные маркеры млекопитающих (неомицин) и бактерий (ампициллин). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вектор экспрессии включает плазмиду. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вектор включает вирусный вектор, например, ретровирусный или аденовирусный вектор. Согласно вариантам реализации настоящего изобретения вектор включает космиду, YAC или ВАС.

[0295] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения нуклеотидная последовательность, кодирующая по меньшей мере один из мономеров миниантитела, содержит по меньшей мере одну аминокислоту из SEQ ID NO, описанных в настоящем документе, включая таковые, раскрытые в настоящем документе для связывания с CD3, CD8, 5Т4, ПСМА и АСКП, или последовательность, которая характеризуется идентичностью по меньшей мере приблизительно 80%, например, идентичностью приблизительно 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93, 94, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или большей идентичностью с указанной последовательностью.

Линии клеток

[0296] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложена линия клеток, которая экспрессирует по меньшей мере одну из антигенсвязывающих конструкций, описанных в настоящем документе (которая может содержать по меньшей мере часть шарнира, описанного в настоящем документе). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения линия клеток млекопитающих (например, линия клеток CHO-K1) является системой экспрессии для получения миниантител, scFv или других антител, описанных в настоящем документе. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения миниантитела, scFv и другие антитела или фрагменты антитела, описанные в настоящем документе, являются негликозилированными, и система экспрессии млекопитающих не требуется, поскольку посттрансляционные модификации не нужны. Таким образом, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения для получения антигенсвязывающих конструкций, раскрытых в настоящем документе (например, миниантител), применяют одну или более из широкого множества систем экспрессии млекопитающих или отличных от млекопитающих, включая, без ограничения, системы экспрессии млекопитающих (например, клетки CHO-K1), системы экспрессии бактерий (например, Е. coli, В. subtilis), системы экспрессии дрожжей (например, Pichia, S. cerevisiae) или любую другую известную систему экспрессии. Другие системы могут включать клетки насекомых и/или клетки растений.

Модификации антигенсвязывающей конструкции

[0297] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антигенсвязывающая конструкция содержит по меньшей мере одну модификацию. Иллюстративные модификации включают, без ограничения, антигенсвязывающие конструкции, которые были модифицированы посредством гликозилирования, ацетилирования, ПЭГилирования, фосфорилирования, амидирования, дериватизации известными защитными/блокирующими группами, протеолитического расщепления и связывания с лигандом клетки или другим белком. Любую из множества химических модификаций можно осуществить с применением известных методик, включая, без ограничения, специфичное химическое расщепление, ацетилирование и метаболический синтез туникамицина. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения производное может содержать одну или более неприродных аминокислот.

[0298] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антигенсвязывающая конструкция конъюгирована с другим веществом с образованием конъюгата против мишени. Конъюгаты, описанные в настоящем документе, можно получить известными способами связывания антигенсвязывающих конструкций с липидами, углеводами, белками или другими атомами и молекулами. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения конъюгат образован в результате сайт-специфичной конъюгации с применением подходящего соединения или связи. Сайт-специфичная конъюгация, наиболее вероятно, сохраняет активность связывания антигенсвязывающей конструкции. Вещество может быть конъюгировано или присоединено к шарнирной области восстановленной антигенсвязывающей конструкции посредством образования тиоэфирной связи. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения можно применять конъюгацию на основе тирозина. Другие соединения или связи, применяемые для образования конъюгата, могут включать, без ограничения, ковалентную связь, нековалентную связь, дисульфидную связь, гидразоновую связь, сложноэфирную связь, амидную связь и аминную связь, иминную связь, тиосемикарбазоновую связь, семикарбазоновую связь, оксимную связь и углерод-углеродную связь. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения в антигенсвязывающую конструкцию не должен быть добавлен цистеин или другой линкерный аспект.

Поддающиеся обнаружению маркеры

[0299] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения модифицированная антигенсвязывающая конструкция конъюгирована с поддающимся обнаружению маркером. В настоящем документе «поддающийся обнаружению маркер» включает атом, молекулу или соединение, которые являются подходящими для диагностики, обнаружения или визуализации расположения и/или количества молекулы-, клетки-, ткани-, органа-мишени и т.п. Поддающиеся обнаружению маркеры, которые можно применять согласно вариантам реализации, представленным в настоящем документе, включают, без ограничения, радиоактивные вещества (например, радиоактивные изотопы, радионуклиды, радиоактивные метки или радиоактивные индикаторы), красители, контрастные средства, флуоресцентные соединения или молекулы, биолюминесцентные соединения или молекулы, ферменты и усиливающие средства (например, парамагнитные ионы). Помимо этого, некоторые наночастицы, например, квантовые точки и наночастицы металла (описанные ниже), могут быть подходящими для применения в качестве средства для обнаружения. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения поддающийся обнаружению маркер представляет собой индоцианин зеленый (IndoCyanine Green, ICG), Цирконий-89, IR800 и/или другой краситель, поглощающий в ближней инфракрасной области.

[0300] Иллюстративные радиоактивные вещества, которые можно применять в качестве поддающихся обнаружению маркеров согласно вариантам реализации, представленным в настоящем документе, включают, без ограничения, ¹⁸F, ¹⁸F-FAC, ³²P, ³³P, ⁴⁵Ti, ⁴⁷Sc, ⁵²Fe, ⁵⁹Fe, ⁶²Cu, ⁶⁴Cu, ⁶⁷Cu, ⁶⁷Ga, ⁶⁸Ga, ⁷⁵Sc, ⁷⁷As, ⁸⁶Y, ⁹⁰Y, ⁸⁹Sr, ⁸⁹Zr, ⁹⁴Tc, ⁹⁴Tc, ⁹⁹mTc, ⁹⁹Mo, ¹⁰⁵Pd, ¹⁰⁵Rh, ¹¹¹Ag, ¹¹¹In, ¹²³I, ¹²⁴I, ¹²⁵I, ¹³¹I, ¹⁴²Pr, ¹⁴³Pr, ¹⁴⁹Pm, ¹⁵³Sm, ^154-158Gd, ¹⁶¹Tb, ¹⁶⁶Dy, ¹⁶⁶Ho, ¹⁶⁹Er, ¹⁷⁵Lu, ¹⁷⁷Lu, ¹⁸⁶Re, ¹⁸⁸Re, ¹⁸⁹Re, ¹⁹⁴Ir, ¹⁹⁸Au, ¹⁹⁹Au, ²¹¹At, ²¹¹Pb, ²¹²Bi, ²¹²Pb, ²¹³Bi, ²²³Ra и ²²⁵Ac. Иллюстративные вещества-парамагнитные ионы, которые можно применять в качестве поддающихся обнаружению маркеров, включают, без ограничения, ионы переходных металлов и металлов лантаноидного ряда (например, металлов с атомными номерами от 6 до 9, 21-29, 42, 43, 44 или 57-71). Данные металлы включают ионы Cr, V, Mn, Fe, Со, Ni, Cu, La, Се, Pr, Nd, Pm, Sm, Eu Gd, Tb, Dy, Но, Er, Tm, Yb и Lu.

[0301] Если поддающийся обнаружению маркер представляет собой радиоактивный металл или парамагнитный ион, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения маркер может вступать в реакцию с реактивом, содержащим длинный «хвост» с одной или несколькими хелатирующими группами, присоединенными к длинному «хвосту» для связывания данных ионов. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения реактив может нести реактивную группу, разработанную для ковалентного связывания цепей фрагмента антитела. Длинный «хвост» может представлять собой полимер, такой как полилизин, полисахарид, полиэтиленгликоль (ПЭГ) или другую дериватизированную или поддающуюся дериватизации цепь, содержащую боковые группы, к которым может быть присоединена хелатирующая группа для связывания с ионами. Примеры хелатирующих групп, которые можно применять согласно вариантам реализации, представленным в настоящем документе, включают, без ограничения, этилендиаминтетрауксусную кислоту (EDTA), диэтилентриаминпентауксусную кислоту (DTPA), DOTA, NOTA, NODAGA, NETA, дефероксамин (Df который может также называться DFO), порфирины, полиамины, краун-эфиры, бис-тиосемикарбазоны, полиоксимы и подобные группы. Те же хелаты при комплексовании с нерадиоактивными металлами, такими как марганец, железо и гадолиний, являются подходящими для МРТ (магнитно-резонансной томографии) при применении с антигенсвязывающими конструкциями и носителями, описанными в настоящем документе. Макроциклические хелаты, такие как NOTA, NODAGA, DOTA и ТЕТА, являются подходящими в сочетании с множеством металлов и радиометаллов, включая, без ограничения, радионуклиды галлия, иттрия и меди, соответственно. Можно применять другие хелаты кольцевого типа, такие как макроциклические полиэфиры, которые представляют интерес для стабильного связывания с радионуклидами, такими как Радий-223 для RAIT. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения хелатирующие группы можно применять для присоединения средства для визуализации ПЭТ, такого как комплекс Алюминий-¹⁸F или Цирконий-89, для нацеливания молекулы с целью применения в анализе методом ПЭТ.

[0302] Иллюстративные контрастные средства, которые можно применять в качестве поддающихся обнаружению маркеров согласно вариантам реализации настоящего изобретения, включают, без ограничения, барий, диатризоат, этиодизированное масло, цитрат галлия, йокармиковую кислоту, йоцетамовую кислоту, иодамид, иодипамид, иодоксамовую кислоту, иогуламид, иогексил, иопамидол, иопаноевую кислоту, иопроцеминовую кислоту, иосефамовую кислоту, иосериновую кислоту, иосуламид-меглумин, иосеметовую кислоту, иотасул, иотетриновую кислоту, иоталамовую кислоту, иотроксиновую кислоту, иоксаглиновую кислоту, иоксотризоевую кислоту, иподат, меглумин, метризамид, метризоат, пропилиодон, хлорид таллия или комбинации указанных соединений.

[0303] Биолюминесцентные и флуоресцентные соединения или молекулы и красители, которые можно применять в качестве поддающихся обнаружению маркеров согласно вариантам реализации настоящего изобретения, включают, без ограничения, флуоресцеин, флуоресцеина изотиоцианат (ФИТЦ), OREGON GREEN™, родамин, техасский красный, тетрародимина изотиоцианат (ТРИТЦ), Cy3, Cy5 и т.п., флуоресцентные маркеры (например, зеленый флуоресцентный белок (green fluorescent protein, GFP), фикоэритрин и т.п.), самозатухающие флуоресцентные соединения, которые активируются опухоль-ассоциированными протеазами, ферменты (например, люциферазу, пероксидазу хрена, щелочную фосфатазу и т.п.), наночастицы, биотин, дигоксигенин или комбинации указанных соединений.

[0304] Ферменты, которые можно применять в качестве поддающихся обнаружению маркеров согласно вариантам реализации настоящего изобретения, включают, без ограничения, пероксидазу хрена, щелочную фосфатазу, кислую фосфатазу, глюкозооксидазу, β-галактозидазу, β-глюкоронидазу или β-лактамазу. Такие ферменты можно применять в комбинации с хромогеном, флуорогенным соединением или люминогенным соединением для получения поддающегося обнаружению сигнала.

[0305] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антигенсвязывающая конструкция конъюгирована с наночастицей. Термин «наночастица» означает микроскопическую частицу, размер которой измеряется в нанометрах, например, частицу с по меньшей мере одним измерением, составляющим менее приблизительно 100 нм. Наночастицы можно применять в качестве поддающихся обнаружению веществ, поскольку они являются достаточно малыми, чтобы рассеивать видимый свет, а не поглощать его. Например, наночастицы золота в значительной степени обладают свойствами гасить видимый свет и в растворе принимают окраску от глубокого красного до черного цвета. В результате композиции, содержащие антигенсвязывающие конструкции, конъюгированные с наночастицами, можно применять для визуализации Т-клеток у субъекта in vivo. В нижнем сегменте диапазона размера наночастицы часто называют кластерами. Были созданы металлические, диэлектрические и полупроводниковые наночастицы, а также гибридные структуры (например, наночастицы типа ядро/оболочка). Наносферы, наностержни и наноцилиндры представляют собой лишь несколько выращенных форм. Полупроводниковые квантовые точки и нанокристаллы являются примерами дополнительных типов наночастиц. Такие наноразмерные частицы после конъюгации с антигенсвязывающей конструкцией можно применять в качестве визуализирующих средств для обнаружения Т-клеток in vivo, как описано в настоящем документе.

[0306] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения наличие стабильного шарнира обеспечивает стабильность нацеленно воздействующего средства. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения это приводит к лучшему биораспределению, более высокой чувствительности и/или сниженному почечному клиренсу. Вследствие этого данные конструкции могут являться более подходящими для обеспечения большей степени специфической активности. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения данный подход обеспечивает по существу улучшенную чувствительность без воздействия высокой дозы на почки, которые являются радиочувствительным органом. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения данные конструкции являются более подходящими для РИТ (радиоиммунотерапии) по той же причине - благодаря низкому уровню почечного поглощения. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения теперь можно применять сайт-специфичную конъюгацию с цистеинами, поскольку химическое восстановление в мягких условиях расщепляет 1 или 2 дисульфидные связи для применения их в качестве основы, но сохраняет остающиеся дисульфиды в неизменном состоянии. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения данный подход позволит сохранить целостность конъюгата миниантитела.

Терапевтические средства и композиции

[0307] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения фармацевтическая композиция может также содержать фармацевтически приемлемый носитель. Фармацевтически приемлемый носитель может представлять собой фармацевтически приемлемый материал, композицию или наполнитель, который вовлечен в перенос или транспортирование соединения, представляющего интерес, из одной ткани, органа или части тела в другую ткань, орган или часть тела. Например, носитель может представлять собой жидкий или твердый наполнитель, разбавитель, вспомогательное вещество, растворитель или инкапсулирующее вещество либо некоторую комбинацию указанных веществ. Каждый компонент носителя является «фармацевтически приемлемым» в том смысле, что он является совместимым с другими компонентами состава. Носитель также должен быть подходящим для осуществления контакта с любой тканью, органом или частью тела, с которыми он может сталкиваться; это означает, что в идеальном случае носитель не будет нести риска токсичности, раздражения, аллергического ответа, иммуногенности или любого другого осложнения, которое чрезмерно превышает его терапевтическую пользу.

[0308] Фармацевтические композиции, описанные в настоящем документе, можно вводить посредством любого подходящего пути введения. Путь введения может означать любой путь введения, известный в данной области техники, включая, без ограничения, аэрозоль, энтеральный, назальный, офтальмический, пероральный, парентеральный, ректальный, трансдермальный (например, крем или мазь для местного применения, пластырь) или вагинальный. «Трансдермальное» введение можно осуществить с применением крема или мази для местного применения или посредством трансдермального пластыря. «Парентеральный» означает путь введения, который, как правило, связан с инъекцией, включая инфраорбитальную, инфузию, внутриартериальную, внутрикапсульную, внутрисердечную, внутрикожную, внутримышечную, интраперитонеальную, внутрилегочную, внутриспинальную, интрастернальную, интратекальную, внутриматочную, внутривенную, субарахноидальную, субкапсулярную, подкожную, чресслизистую или транстрахеальную. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антигенсвязывающую конструкцию можно доставить интраоперационным способом в виде местного введения в течение хирургического вмешательства или резекции.

[0309] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антигенсвязывающая конструкция конъюгирована с терапевтическим средством. «Терапевтическое средство» в настоящем документе представляет собой атом, молекулу или соединение, которые являются подходящими для лечения нарушения, связанного с молекулой-мишенью. Примеры терапевтических средств включают, без ограничения, лекарственные средства, химиотерапевтические средства, терапевтические антитела и фрагменты антител, токсины, радиоактивные изотопы, ферменты (например, ферменты для расщепления пролекарств на цитотоксическое средство в участке связывания антигенсвязывающей конструкции), нуклеазы, гормоны, иммуномодуляторы, антисмысловые олигонуклеотиды, хелаторы, соединения бора, фотоактивные средства и красители, и наночастицы. Примеры нарушений включают таковые, связанные с одной или несколькими молекулами-мишенями Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения молекулы-мишени могут представлять собой одну или более молекул из: CD8, CD3, ПСМА, АСКП и 5Т4.

[0310] Химиотерапевтические средства в природе часто являются цитотоксическими или цитостатическими и могут включать алкилирующие средства, антиметаболиты, противоопухолевые антибиотики, ингибиторы топоизомеразы, ингибиторы митоза, гормональную терапию, таргетные терапевтические средства и иммунотерапевтические средства. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения химиотерапевтические средства, которые можно применять в качестве поддающихся обнаружению маркеров согласно вариантам реализации настоящего изобретения, включают, без ограничения, 13-цис-ретиноевую кислоту, 2-хлордезоксиаденозин, 5-азацитидин, 5-фторурацил, 6-меркаптопурин, 6-тиогуанин, актиномицин-D, адриамицин, алдеслейкин, алемтузумаб, алитретиноин, полностью трансретиноевую кислоту, альфа-интерферон, алтретамин, аметоптерин, амифостин, анагрелид, анастрозол, арабинозилцитозин, триоксид мышьяка, амсакрин, аминокампотецин, аминоглутетимид, аспарагиназу, азацитидин, бациллу Кальмета-Герена (bacillus calmetteguerin, BCG), бендамустин, бевацизумаб, бексаротен, бикалутамид, бортезомиб, блеомицин, бусульфан, кальций-лейковорин, цитроворум фактор, капецитабин, канертиниб, карбоплатин, кармустин, цетуксимаб, хлорамбуцил, цисплатин, кладрибин, кортизон, циклофосфамид, цитарабин, дарбэпоэтин альфа, дасатиниб, дауномицин, децитабин, денилейкин дифтитокс, дексаметазон, дексазон, декстразоксан, дактиномицин, даунорубицин, декарбазин, доцетаксел, доксорубицин, доксифлуридин, энилурацил, эпирубицин, эпоэтин альфа, эрлотиниб, эверолимус, эксеместан, эстрамустин, этопозид, филграстим, флуоксиместерон, фулвестрант, флавопиридол, флоксуридин, флударабин, фторурацил, флутамид, гефитиниб, гемцитабин, гемтузумаб озогамицин, госерелин, колониестимулирующий фактор гранулоцитов, колониестимулирующий фактор гранулоцитов-макрофагов, гексаметилмеламин, гидрокортизона гидроксимочевину, ибритумомаб, интерферон альфа, интерлейкин-2, интерлейкин-11, изотретинион, иксабепилон, идарубицин, иматиниба мезилат, ифосфамид, иринотекан, лапатиниб, леналидомид, летрозол, лейковорин, лейпролид, липосомный Ara-С, ломустин, мехлорэтамин, мегестрол, мелфалан, меркаптопурин, месну, метотрексат, метилпреднизолон, митомицин С, митотан, митоксантрон, неларабин, нилутамид, октреотид, опрелвекин, оксалиплатин, паклитаксел, памидронат, пеметрексед, панитумумаб, ПЭГ-интерферон, ПЭГ-аспаргазу, ПЭГ-филграстим, ПЭГ-L-аспарагиназу, пентостатин, пликамицин, преднизолон, преднизон, прокарбазин, ралоксифен, ритуксимаб, ромиплостим, ралитрексед, сапацитабин, сарграмостин, сатраплатин, сорафениб, сунитиниб, семустин, стрептозоцин, тамоксифен, тегафур, тегафур-урацил, темсиролимус, темозоломид, тенипозид, талидомид, тиогуанин, тиотепу, топотекан, торемифен, тозитумомаб, трастузумаб, третиноин, тримитрексат, алрубицин, винкристин, винбластин, виндестин, винорелбин, вориностат или золедроновую кислоту.

[0311] Токсины, которые можно применять согласно вариантам реализации настоящего изобретения, включают, без ограничения, ауристатин Е, ауристатин F, доластатин 10, доластатин 15, комбретастатин и их аналоги, майтанзиноид, калихеамицин, альфа-аманитин, димеры пирролобензодиазепина, эпотилоны, дуокармицин и его аналоги, тубулизин D, базиллистатины, рицин, абрин, рибонуклеазу (РНКазу), ДНКазу I, стафилококковый энтеротоксин-А, антивирусный белок фитолакки, гелонин, дифтерийный токсин, экзотоксин Pseudomonas и эндотоксин Pseudomonas.

[0312] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения наночастицы применяют в терапевтических применениях в качестве носителей лекарственных средств, которые при конъюгации с антигенсвязывающей конструкцией доставляют химиотерапевтические средства, гормональные терапевтические средства, радиотерапевтические средства, токсины или любое другое цитотоксическое или противораковое средство, известное в данной области техники, к раковым клеткам, которые сверхэкспрессируют мишени на поверхности клетки.

[0313] Затем любую из антигенсвязывающих конструкций, описанных в настоящем документе, можно конъюгировать с одним или несколькими дополнительными терапевтическими средствами, поддающимися обнаружению маркерами, наночастицами, носителями или с комбинацией указанных средств. Например, антигенсвязывающую конструкцию можно пометить радиоактивным изотопом Иодом-131 и конъюгировать с липидным носителем, в результате чего липидный конъюгат против молекулы-мишени образует мицеллу. В мицеллу можно ввести одно или более терапевтических средств или поддающихся обнаружению маркеров. В качестве альтернативы, помимо носителя антигенсвязывающую конструкцию можно пометить радиоактивным изотопом Иодом-131 I (например, по остатку тирозина) и конъюгировать с лекарственным средством (например, по эпсилон-аминогруппе остатка лизина), и в носитель можно ввести дополнительное терапевтическое средство или поддающийся обнаружению маркер.

[0314] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антигенсвязывающие конструкции конъюгировали с терапевтическим средством. Несмотря на то, что данные антигенсвязывающие конструкции могут характеризоваться более коротким периодом полужизни в сосудистом русле по сравнению с полноразмерным антителом, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения данные форматы могут демонстрировать улучшенное проникновение в опухоль благодаря их меньшему размеру и могут являться терапевтически эффективными при соответствующем оснащении цитотоксическим лекарственным средством или радиоактивным изотопом. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения можно применять подход на основе конъюгата антитела с лекарственным средством. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения терапевтический подход включает радиоиммунотерапию посредством применения соответствующей радиоактивной метки, такой как Иод-131, бета-излучателя, такого как Иттрий-90, Лютеций-177, Медь-67, Астатин-211, Свинец-212/Бисмут-212, Актиний-225/Бисмут-213 и Торий, которые могут обеспечивать повреждение и гибель клеток в ткани-мишени. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лечение данными фрагментами, оснащенными цитотоксическим лекарственным средством или радионуклидом, приводит к меньшей неспецифичной токсичности, поскольку они будут быстрее выводиться из организма.

[0315] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антигенсвязывающую конструкцию можно присоединить к терапевтическому средству против нарушения, связанного с экспрессией молекулы-мишени.

[0316] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антигенсвязывающие конструкции против молекулы-мишени применяют в качестве самостоятельного медицинского средства (например, антигенсвязывающая конструкция при отсутствии терапевтического средства) при лечении нарушения, связанного с экспрессией молекулы-мишени.

[0317] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложена фармацевтическая композиция, содержащая аминокислотную шарнирную область любого из вариантов реализации, описанных в настоящем документе. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения в композиции наблюдается менее 30% агрегации (или высокомолекулярной конструкции) миниантитела, например, менее 20, 10, 5 или 1% агрегации.

[0318] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложена фармацевтическая композиция, содержащая аминокислотную шарнирную область любой из конструкций, описанных в настоящем документе. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения можно применять количество от 1 микрограмма до 100 мг. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения такая композиция может характеризоваться сниженным уровнем агрегации по сравнению с конструкциями без указанной структуры шарнира.

[0319] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения нарушение представляет собой таковое, связанное с 5Т4, CD8, CD3, АСКП или ПСМА. Однако различные шарниры, раскрытые в настоящем документе, можно применять в отношении любой молекулы-мишени или антигенсвязывающей конструкции, которая содержит шарнир.

Наборы

[0320] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложены наборы. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения набор содержит антигенсвязывающую конструкцию, описанную в настоящем документе. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения набор содержит нуклеиновую кислоту, которая кодирует антигенсвязывающую конструкцию, описанную в настоящем документе. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения набор содержит линию клеток, которая продуцирует антигенсвязывающую конструкцию, описанную в настоящем документе. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения набор содержит поддающийся обнаружению маркер, описанный в настоящем документе. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения набор содержит терапевтическое средство, описанное в настоящем документе. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения набор содержит буферы. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения набор содержит положительные контроли, например, мишень-специфичные клетки или их фрагменты. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения набор содержит отрицательные контроли, например, поверхность или раствор, которые по существу не содержат мишени. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения набор содержит упаковку. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения набор содержит инструкции.

Способы обнаружения присутствия или отсутствия молекулы-мишени

[0321] Антигенсвязывающие конструкции можно применять для обнаружения присутствия или отсутствия молекулы-мишени in vivo и/или in vitro. Соответственно, некоторые варианты реализации настоящего изобретения включают способы обнаружения присутствия или отсутствия мишени. Способ может включать применение антигенсвязывающей конструкции в отношении образца. Способ может включать обнаружение связывания или отсутствия связывания антигенсвязывающей конструкции с молекулой-мишенью. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения любую молекулу-мишень можно обнаружить с применением возможностей, описанных в настоящем документе. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения молекула-мишень, подлежащая обнаружению, представляет собой одну или более молекул из 5Т4, CD8, CD3, АСКП или ПСМА. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения молекулу-мишень обнаруживают с применением одной или нескольких структур миниантитела, представленных на фигурах и/или в таблицах, таких как таблица 2 (или по меньшей мере с применением структуры шарнира, представленной в таблице 1).

[0322] В настоящем изобретения предложены способы обнаружения присутствия или отсутствия молекулы-мишени. Следует понимать, что процессы, описанные ниже, можно осуществить в любой последовательности и/или можно необязательно повторить и/или исключить, и что в способ можно необязательно добавить дополнительные этапы. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антигенсвязывающую конструкцию, описанную в настоящем документе, можно применять в отношении образца. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения можно осуществить необязательную промывку. Необязательно, в отношении образца можно применять вторичную антигенсвязывающую конструкцию. Можно осуществить необязательную промывку. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения можно обнаружить связывание или отсутствие связывания антигенсвязывающей конструкции с молекулой-мишенью.

[0323] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антигенсвязывающую конструкцию, описанную в настоящем документе, применяют в отношении образца in vivo. Антигенсвязывающую конструкцию можно вводить субъекту. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения субъект представляет собой человека. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения субъект представляет собой млекопитающее, отличное от человека, например, крысу, мышь, морскую свинку, хомяка, кролика, собаку, кошку, корову, лошадь, козу, овцу, осла, свинью, обезьяну или человекообразного примата. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антигенсвязывающую конструкцию вводят субъекту посредством инфузии. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения инфузия является внутривенной. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения инфузия является интраперитонеальной. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антигенсвязывающую конструкцию применяют у субъекта наружно или местно (как в случае интервенционного или интраоперационного применения). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения в отношении субъекта применяют капсулу, содержащую антигенсвязывающую конструкцию, например, пероральным или интраперитонеальным путем. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антигенсвязывающую конструкцию выбирают для снижения риска иммунологического ответа субъекта. Например, антигенсвязывающую конструкцию для субъекта-человека можно гуманизировать, как описано в настоящем документе. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения после применения антигенсвязывающей конструкции in vivo от хозяина отбирают образец или часть образца. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антигенсвязывающую конструкцию применяют in vivo, инкубируют in vivo в течение периода времени, как описано в настоящем документе, и образец отбирают для анализа in vitro, например, для обнаружения in vitro антигенсвязывающей конструкции, связанной с молекулой-мишенью, или ее отсутствия, как описано в настоящем документе.

[0324] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антигенсвязывающую конструкцию применяют в отношении образца in vitro. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения образец является свежеотобранным от субъекта, например, представляет собой биопсию. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения образец инкубируют после забора от субъекта. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения образец фиксируют. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения образец включает целый орган и/или ткань. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения образец включает одну или более целых клеток. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения образец получен из экстрактов клеток, например, лизатов. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антигенсвязывающую конструкцию в растворе добавляют в раствор в образце. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антигенсвязывающую конструкцию в растворе добавляют в образец, который не содержит раствора, например, в лиофилизированный образец, таким образом, восстанавливая образец. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лиофилизованную антигенсвязывающую конструкцию добавляют в образец, который содержит раствор, таким образом, восстанавливая антигенсвязывающую конструкцию.

[0325] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антигенсвязывающую конструкцию необязательно инкубируют с образцом. Антигенсвязывающую конструкцию можно инкубировать в течение не более приблизительно 14 дней, например, не более приблизительно 14 дней, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 дня, или не более приблизительно 23 часов, например, не более приблизительно 23 часов, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 0,75, 0,5, 0,25 или 0,1 часа, включая диапазоны между любыми двумя из перечисленных значений. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения инкубацию проводят в субъекте, которому была введена антигенсвязывающая конструкция. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения инкубацию проводят в инкубаторе. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения инкубатор поддерживают при постоянной температуре, например, приблизительно 21°С, при комнатной температуре, 25°С, 29°С, 34°С, 37°С или 40°С.

[0326] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антигенсвязывающую конструкцию, которая не связалась с мишенью, необязательно удаляют из образца. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения образец промывают. Промывка образца может включать удаление раствора, который содержит несвязавшуюся антигенсвязывающую конструкцию, и добавление раствора, который не содержит антигенсвязывающей конструкции, например, буферного раствора. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения образец in vitro промывают, например, посредством отсасывания, пипетирования, откачивания или сцеживания раствора, который содержит несвязавшуюся антигенсвязывающую конструкцию, и добавления раствора, который не содержат антигенсвязывающей конструкции. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения образец in vivo промывают, например, посредством введения субъекту раствора, который не содержит антигенсвязывающей конструкции, или посредством промывки участка наружного введения антигенсвязывающей конструкции. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения промывку проводят по меньшей мере два раза, например, по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 или 20 раз. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения после промывки или промывок из образца удаляют по меньшей мере приблизительно 50% несвязавшегося антитела, например, по меньшей мере приблизительно 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% или более.

[0327] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения из образца удаляют несвязавшуюся антигенсвязывающую конструкцию. После применения антигенсвязывающей конструкции в отношении образца антигенсвязывающая конструкция, связавшаяся с мишенью, достигает равновесия с антигенсвязывающей конструкцией, не связавшейся с мишенью, в результате чего в определенный момент времени после применения антигенсвязывающей конструкции количество антигенсвязывающей конструкции, связанной с мишенью, по существу не увеличивается. После этого можно удалить по меньшей мере часть количества антигенсвязывающей конструкции, которая не связалась с мишенью. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения несвязавшуюся антигенсвязывающую конструкцию удаляют посредством метаболических или других физических процессов субъекта, которому было введено антитело или фрагмент. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения несвязавшуюся антигенсвязывающую конструкцию удаляют посредством добавления средства, которое разрушает или дестабилизирует несвязавшуюся антигенсвязывающую конструкцию, например, протеазы или нейтрализующего антитела. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения через 1 день после применения антигенсвязывающей конструкции по меньшей мере приблизительно 30% антигенсвязывающей конструкции, которую применяли, было устранено, например, по меньшей мере приблизительно 30%, 40%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% или 99,9%. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения через 2 дня после применения антигенсвязывающей конструкции по меньшей мере приблизительно 40% антигенсвязывающей конструкции, которую применяли, было устранено, например, по меньшей мере приблизительно 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% или 99,9%.

[0328] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения обнаруживают присутствие или отсутствие молекулы-мишени. Присутствие или отсутствие мишени можно обнаружить на основании присутствия или отсутствия антигенсвязывающей конструкции в образце. После удаления и/или устранения антигенсвязывающей конструкции из образца, например, посредством промывки и/или метаболического устранения, оставшаяся в образце антигенсвязывающая конструкция может свидетельствовать о присутствии мишени, тогда как отсутствие антигенсвязывающей конструкции в образце может свидетельствовать об отсутствии мишени.

[0329] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антигенсвязывающая конструкция содержит поддающийся обнаружению маркер, описанный в настоящем документе. Таким образом, о присутствии антигенсвязывающей конструкции можно заключить на основании обнаружения поддающегося обнаружению маркера.

[0330] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вторичную антигенсвязывающую конструкцию применяют для обнаружения антигенсвязывающей конструкции. Вторичная антигенсвязывающая конструкция может специфично связываться с антигенсвязывающей конструкцией. Например, вторичная антигенсвязывающая конструкция может содержать поликлональное или моноклональное антитело, диатело, миниантитело и т.д. против антитела типа хозяина или против антигенсвязывающей конструкции самой по себе. Вторичную антигенсвязывающую конструкцию можно конъюгировать с поддающимся обнаружению маркером, как описано в настоящем документе. Вторичную антигенсвязывающую конструкцию можно применять в отношении образца. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вторичную антигенсвязывающую конструкцию применяют в отношении образца по существу тем же способом, что и антигенсвязывающую конструкцию. Например, если антигенсвязывающую конструкцию вводили субъекту посредством инфузии, вторичную антигенсвязывающую конструкцию также можно вводить субъекту посредством инфузии.

[0331] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения связывание или отсутствие связывания антигенсвязывающей конструкции обнаруживают посредством по меньшей мере одного из следующих методов: позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ), однофотонной эмиссионной компьютерной томографии (ОЭКТ), магнитно-резонансной визуализации (ЯМР) или обнаружения испускания флуоресценции. ПЭТ может включать, без ограничения, визуализацию ПЭТ мелких животных. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения связывание или отсутствие связывания антигенсвязывающей конструкции обнаруживают посредством двух или более форм визуализации. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения обнаружение можно осуществлять посредством близкого инфракрасного (БИК) излучения и/или излучения Черенкова.

[0332] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения возможна любая комбинация способов визуализации, включая, в качестве примера, ПЭТ + БИК, ПЭТ + ОЭКТ и т.д.

Способы нацеливания терапевтического средства на клетку

[0333] Антигенсвязывающие конструкции можно применять для нацеливания терапевтической молекулы, например, цитотоксина, на мишень-положительную клетку, такую как клетка, экспрессирующая молекулу-мишень. Таким образом, некоторые варианты реализации настоящего изобретения включают способы нацеливания терапевтического средства на мишень-положительную клетку. Способ может включать введение субъекту антигенсвязывающей конструкции, описанной в настоящем документе. Субъект может представлять собой субъекта, который нуждается, например, субъекта, который нуждается в устранении или нейтрализации по меньшей мере некоторых мишень-положительных клеток. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антигенсвязывающая конструкция содержит по меньшей мере одно терапевтическое средство, описанное в настоящем документе. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения терапевтическое средство может быть напрямую конъюгировано с антигенсвязывающей конструкцией посредством ковалентной связи, такой как дисульфидная связь. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения субъект может получить пользу от локализации клетки, положительной в отношении молекулы-мишени, к другой клетке или средству.

[0334] Необязательно, перед и/или после введения антигенсвязывающей конструкции, которая содержит по меньшей мере одно терапевтическое средство, определяют количество и/или локализацию мишень-положительных клеток пациента. Например, определение количества и/или локализации мишень-положительных клеток до введения может свидетельствовать, получит ли пациент вероятную пользу от нейтрализации и/или устранения мишень-положительных клеток. Определение количества и/или локализации мишень-положительных клеток после введения может свидетельствовать о том, были ли устранены мишень-положительные клетки у пациента.

[0335] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антигенсвязывающую конструкцию можно применять в качестве терапевтического средства в качестве самостоятельной конструкции (например, без токсина, конъюгированного с ней). Несмотря на то, что фрагменты характеризуются более коротким периодом полужизни по сравнению с интактным антителом, которое будет менее оптимальным для терапии, данные форматы могут демонстрировать улучшенное проникновение в опухоль благодаря их меньшему размеру и могут являться терапевтически эффективными при соответствующем оснащении цитотоксическим лекарственным средством или радиоактивным изотопом.

[0336] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения другой терапевтический подход представляет собой радиоиммунотерапию посредством присоединения соответствующей радиоактивной метки, такой как Иод-131, бета-излучателя, такого как Иттрий-90, Лютеций-177, Медь-67, Астатин-211, Свинец-212/Бисмут-212, Актиний-225/Бисмут-213 и Торий, которые могут обеспечивать повреждение и гибель клетки.

[0337] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антигенсвязывающую конструкцию применяют для нацеливания на клетки, экспрессирующие молекулу-мишень. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения терапевтическое средство является соответствующим для одного или нескольких нарушений, связанных с по меньшей мере одной из следующих молекул: CD8, CD3, ПСМА, АСКП или 5Т4, например. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения терапевтическое средство является соответствующим для лечения одного или нескольких из следующих нарушений:

Специфичные мишени/конструкции

[0338] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения любые из композиций, способов (например, способов лечения, способов получения, способов обнаружения и т.д.), наборов, средств, модификаций антигенсвязывающей конструкции, линий клеток, нуклеиновых кислот и т.д., описанных в настоящем документе, можно применять в отношении любой молекулы-мишени. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения молекула-мишень может являться таковой, связанной с иммунотерапией рака. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения молекула-мишень может являться одной или несколькими молекулами из CD8, CD3, 5Т4, АСКП или ПСМА, включая их варианты.

[0339] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения одну или более антигенсвязывающих конструкций, таких как миниантитело, можно применять для лечения субъекта, страдающего от нарушения, связанного с молекулой-мишенью. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения молекула-мишень может представлять собой любую молекулу-мишень, для которой существует антигенсвязывающая конструкция, которая будет с ней связываться. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения молекула-мишень может представлять собой по меньшей мере одну из следующих молекул: CD8, CD3, ПСМА, АСКП или 5Т4, и, таким образом, нарушение, лечение которого проводят, может представлять собой таковое, связанное с по меньшей мере одной из следующих молекул: CD8, CD3, ПСМА, АСКП или 5Т4. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения одну или более антигенсвязывающих конструкций, таких как миниантитело, можно применять для диагностики субъекта относительно того, страдает ли он или не страдает от связанного с молекулой-мишенью нарушения.

[0340] В настоящем документе термин «субъект» означает любое животное (например, млекопитающее), включая, без ограничения, людей, нечеловекообразных приматов, грызунов, собак, свиней и т.п.

[0341] В каждом из разделов ниже представлены различные варианты реализации различных антигенсвязывающих конструкций, описанных в настоящем документе. Все из данных вариантов реализации представлены в виде различных форм антигенсвязывающих конструкций, включая миниантитела и scFv. Разделы ниже в явном виде представлены для мишень-специфичных вариантов реализации; однако они предусмотрены как аспекты, которые являются совместимыми с любым из соответствующих вариантов, представленных в настоящем описании в другом месте. Таким образом, варианты реализации настоящего изобретения не исключают других вариантов реализации, но вместо этого представляют собой варианты, которые можно объединить с любым из других вариантов реализации, описанных в настоящем документе. Например, любые из структур шарнира, описанных в настоящем документе, можно применять в любой одной или нескольких из указанных конструкций и/или способов. Аналогично, различные варианты реализации, представленные ниже в отношении любой из пяти мишеней CD8, CD3, ПСМА, АСКП или 5Т4, можно также поменять с другими указанными мишенями. Таким образом, несмотря на то, что обсуждение АСКП направлено на АСКП, следует понимать, что данные варианты реализации можно также применять в отношении конструкций CD8, CD3, ПСМА или 5Т4. Аналогично, описания в отношении CD8 можно также применять, например, в отношении CD3, ПСМА, АСКП или 5Т4.

[0342] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения с любой одной или несколькими из конструкций против CD8, CD3, ПСМА, АСКП или 5Т4, описанных в настоящем документе, можно применять химиотерапевтические средства. Химиотерапевтические средства в природе часто являются цитотоксическими или цитостатическими и могут включать алкилирующие средства, антиметаболиты, противоопухолевые антибиотики, ингибиторы топоизомеразы, ингибиторы митоза, гормональную терапию, таргетные терапевтические средства и иммунотерапевтические средства. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения химиотерапевтические средства, которые можно применять в качестве поддающихся обнаружению маркеров согласно вариантам реализации настоящего изобретения, включают, без ограничения, 13-цис-ретиноевую кислоту, 2-хлордезоксиаденозин, 5-азацитидин, 5-фторурацил, 6-меркаптопурин, 6-тиогуанин, актиномицин-D, адриамицин, алдеслейкин, алемтузумаб, алитретиноин, полностью трансретиноевую кислоту, альфа-интерферон, алтретамин, аметоптерин, амифостин, анагрелид, анастрозол, арабинозилцитозин, триоксид мышьяка, амсакрин, аминокампотецин, аминоглутетимид, аспарагиназу, азацитидин, бациллу Кальмета-Герена (BCG), бендамустин, бевацизумаб, бексаротен, бикалутамид, бортезомиб, блеомицин, бусульфан, кальций-лейковорин, цитроворум фактор, капецитабин, канертиниб, карбоплатин, кармустин, цетуксимаб, хлорамбуцил, цисплатин, кладрибин, кортизон, циклофосфамид, цитарабин, дарбэпоэтин альфа, дасатиниб, дауномицин, децитабин, денилейкин дифтитокс, дексаметазон, дексазон, декстразоксан, дактиномицин, даунорубицин, декарбазин, доцетаксел, доксорубицин, доксифлуридин, энилурацил, эпирубицин, эпоэтин альфа, эрлотиниб, эверолимус, эксеместан, эстрамустин, этопозид, филграстим, флуоксиместерон, фулвестрант, флавопиридол, флоксуридин, флударабин, фторурацил, флутамид, гефитиниб, гемцитабин, гемтузумаб озогамицин, госерелин, колониестимулирующий фактор гранулоцитов, колониестимулирующий фактор гранулоцитов-макрофагов, гексаметилмеламин, гидрокортизона гидроксимочевину, ибритумомаб, интерферон альфа, интерлейкин-2, интерлейкин-11, изотретинион, иксабепилон, идарубицин, иматиниба мезилат, ифосфамид, иринотекан, лапатиниб, леналидомид, летрозол, лейковорин, лейпролид, липосомный Ara-С, ломустин, мехлорэтамин, мегестрол, мелфалан, меркаптопурин, месну, метотрексат, метилпреднизолон, митомицин С, митотан, митоксантрон, неларабин, нилутамид, октреотид, опрелвекин, оксалиплатин, паклитаксел, памидронат, пеметрексед, панитумумаб, ПЭГ-интерферон, ПЭГ-аспаргазу, ПЭГ-филграстим, ПЭГ-L-аспарагиназу, пентостатин, пликамицин, преднизолон, преднизон, прокарбазин, ралоксифен, ритуксимаб, ромиплостим, ралитрексед, сапацитабин, сарграмостин, сатраплатин, сорафениб, сунитиниб, семустин, стрептозоцин, тамоксифен, тегафур, тегафур-урацил, темсиролимус, темозоломид, тенипозид, талидомид, тиогуанин, тиотепу, топотекан, торемифен, тозитумомаб, трастузумаб, третиноин, тримитрексат, алрубицин, винкристин, винбластин, виндестин, винорелбин, вориностат или золедроновую кислоту.

[0343] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения любую одну или более из конструкций, например, антигенсвязывающих конструкций против CD8, CD3, ПСМА, АСКП или 5Т4, можно связать посредством одного или нескольких цистеинов в шарнире с хелаторами, лекарственным средством или любыми из других компонентов, описанных в настоящем документе.

АСКП-1АВ1М

[0344] Антиген стволовых клеток предстательной железы (АСКП) представляет собой гликопротеин поверхности клетки, который экспрессируется в нормальной предстательной железе и мочевом пузыре человека и сверхэкспрессируется в типах рака предстательной железы (40% первичных опухолей и 60 - 100% метастазов в лимфатический узел и костный мозг). АСКП также в высокой степени экспрессируется в переходных карциномах мочевого пузыря и в карциноме поджелудочной железы. Пример белка АСКП представлен в SEQ ID NO: 132. IG8, моноклональное антитело мыши против АСКП, специфичное к АСКП, продемонстрировало противоопухолевую нацеливающую активность in vivo (Gu, Z. et al., "Anti-prostate stem cell antigen monoclonal antibody 1G8 induces cell death in vitro and inhibits tumor growth in vivo via a Fc-independent mechanism," Cancer Res., Vol. 65, No. 20, pp. 9495-9500, 2005). Данное антитело гуманизировали посредством переноса в каркасный участок человека (Трастузумаб) и назвали 2 В3 (Olafsen, Т. et al., "Targeting, imaging, and therapy using a humanized antiprostate stem cell antigen (PSCA) antibody," Immunotherapy, Vol. 30, No. 4, pp. 396-405, 2007).

[0345] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения варианты реализации, включающие антигенсвязывающие конструкции против АСКП, могут обеспечить средства, которые обладают соответствующими фармакодинамическими свойствами для нацеливания и визуализации опухолей, которые экспрессируют АСКП. В данной области большое значение имеют обладающие чувствительностью и специфичностью эффективные средства для визуализации типов рака, в особенности, ранних стадий опухолей или таковых с ранними метастазами, не поддающимися визуализации традиционными способами. Поскольку АСКП на высоком уровне экспрессируется большинством опухолей предстательной железы, мочевого пузыря и поджелудочной железы, АСКП является ценной мишенью при обнаружении, диагностике, прогнозировании и лечении данных типов рака. Некоторые варианты реализации, описанные в настоящем документе, обеспечивают конструкции, обладающие характеристиками визуализации и нацеливания на опухоли. Данные конструкции также можно применять для нацеливания генотерапии на опухоль, для радиоактивной терапии, и данные конструкции могут обладать терапевтической применимостью сами по себе.

[0346] В настоящем изобретения предложены генно-инженерные антигенсвязывающие конструкции, которые с высокой аффинностью распознают новый маркер поверхности клетки в предстательной железе и других типах рака. Данные генно-инженерные антигенсвязывающие конструкции можно специфично приспособить для применения in vivo для нацеливания и обнаружения. АСКП на высоком уровне экспрессируется большинством опухолей предстательной железы, мочевого пузыря и поджелудочной железы и является перспективной мишенью. Варианты реализации, описанные в настоящем документе, описывают инновационную молекулу с оптимальными характеристиками для визуализации опухоли. Данную молекулу также можно применять для нацеливания генотерапии, радиоактивности на опухоль, или данная молекула может обладать терапевтической применимостью сама по себе.

[0347] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения АСКП, на который нацелено антитело против АСКП, представляет собой АСКП человека. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения иммуноконъюгат можно применять для нацеливания эффекторной группы на АСКП-положительную клетку, в особенности, на клетки, которые сверхэкспрессируют белок АСКП. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения АСКП, на который нацелено миниантитело против АСКП, представляет собой АСКП человека.

[0348] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения конструкции, описанные в настоящем документе, могут обеспечить средства, которые обладают соответствующими фармакодинамическими свойствами для нацеливания и визуализации опухолей, которые экспрессируют АСКП. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения миниантитело обеспечивает эффективное средство для визуализации типов рака, обладающее чувствительностью и специфичностью, в особенности, ранних стадий опухолей или таковых с ранними метастазами, не поддающимися визуализации традиционными способами.

[0349] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антигенсвязывающие конструкции, которые связываются с антигеном АСКП, могут представлять собой антитела, миниантитела и/или другие фрагменты антител, такие как scFv. Некоторые неограничивающие варианты реализации антигенсвязывающих конструкций против АСКП представлены на ФИГ. 29В-29D, 36Е, 60 (SEQ ID NO: 125 и 126), 61 (SEQ ID NO: 126), 62 (SEQ ID NO: 127), 63 (SEQ ID NO: 128), 64 (SEQ ID NO: 129) и 65A (SEQ ID NO: 130).

[0350] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения конструкция обеспечивает визуализацию рака при ранней диагностике или диагностике метастазирующего заболевания. В частности, большое значение имеют лучшие средства для визуализации рака предстательной железы для обнаружения и определения стадии. Визуализация с применением антигенсвязывающей конструкции против АСКП будет весьма подходящей для визуализации метастазов в кости и для оценки ответа на лечение. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложен способ обнаружения рака поджелудочной железы. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения высокоаффинное, высокоспецифичное сконструированное миниантитело приспособлено для нацеливания и обнаружения АСКП in vivo у пациентов, страдающих от рака предстательной железы, рака мочевого пузыря и рака поджелудочной железы. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения «АСКП-зависимое нарушение» может включать опухоль предстательной железы, рак предстательной железы, опухоль мочевого пузыря, переходную карциному мочевого пузыря, опухоль поджелудочной железы, карциному поджелудочной железы, любую опухоль, связанную с экспрессией АСКП, любой рак, связанный с экспрессией АСКП, или любое нарушение, связанное с экспрессией АСКП.

[0351] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложена высокоаффинная антигенсвязывающая конструкция против АСКП, которую можно применять при лечении и обнаружении типов рака, которые сверхэкспрессируют АСКП.

[0352] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антигенсвязывающую конструкцию можно также присоединить к терапевтическим средствам или поддающимся обнаружению маркерам. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения терапевтическое средство представляет собой цитотоксическое средство. Например, средство может представлять собой рицин, А-цепь рицина, доксорубицин, даунорубицин, таксол, бромид этидия, митомицин, этопозид, тенопозид, винкристин, винбластин, колхицин, дигидроксиантрациндион, актиномицин D, дифтерийный токсин, экзотоксин Pseudomonas (РЕ) А, РЕ40, абрин, цепь А абрина, цепь А модекцина, альфа-сарцин, гелонин митогеллин, ретстриктоцин, феномицин, эномицин, курицин, кротин, калихеамицин, ингибитор Saponaria officinalis, майтанзиноиды или глюкокортикоидрицин. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения терапевтическое средство представляет собой радиоактивный изотоп. Радиоактивный изотоп можно выбрать, например, из группы, состоящей из ²¹²Bi, ¹³¹I, ¹¹¹In, ⁹⁰Y и ¹⁸⁶Re. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения конструкция присоединена к ферменту, активирующему противораковое пролекарство, способному преобразовать пролекарство в его активную форму.

[0353] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения конструкция против АСКП помечена поддающимся обнаружению маркером. Маркер может представлять собой, например, радиоактивный изотоп, флуоресцентное соединение, биолюминесцентное соединение, хемилюминесцентное соединение, хелатор металла или фермент. В качестве визуализирующих меток можно применять множество радионуклидов, включая, без ограничения, ¹²⁴I, ⁸⁶Y, ¹⁸F, ^94mTc и т.п. Специалисту в данной области техники известны другие радионуклиды, в особенности хорошо подходящие для применения в данном варианте реализации. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения способ может уничтожать раковую клетку. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения конструкция распознает и связывается с белком АСКП, как показано ниже, начиная с лейцина в положении аминокислоты 22 и заканчивая аланином в положении аминокислоты 99. Согласно дополнительным вариантам реализации настоящего изобретения способ также включает введение химиотерапевтического лекарственного средства, лучевой терапии. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения субъект также получает лечение гормон-подавляющей терапией или терапией антагонистом гормона.

[0354] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения варианты лечения могут быть введены пациенту или субъекту внутривенным, интраперитонеальным, внутримышечным, внутриопухолевым или внутрикожным путем. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения осуществление контакта включает введение конструкции напрямую в рак предстательной железы, рак мочевого пузыря, рак поджелудочной железы или его метастазы.

[0355] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложены способы обнаружения раковой клетки у субъекта посредством осуществления контакта раковой клетки с конструкцией, которая несет поддающийся обнаружению маркер. Способы можно применять при проведении скрининга пациентов, подверженных повышенному риску рака, или для контроля над ответом на терапию либо для составления прогноза рака (например, типов рака предстательной железы, мочевого пузыря или поджелудочной железы). Способы обеспечивают особенные преимузества при обнаружении метастазов рака. В настояще документе предложены минифрагменты антитела со способностью нацеливания/визуализации опухоли. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения в отношении конструкций, описанных в настоящем документе, существует оговорка, что конструкция содержит домен VH или VL, который не идентичен соответствующему домену или антителу 2В3.

[0356] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антигенсвязывающая конструкция конъюгирована с «эффекторной» молекулой. Эффекторная молекула может представлять собой любое количество молекул, включая молекулы-метки, такие как радиоактивные метки или флуоресцентные метки, или может представлять собой терапевтическую молекулу. Согласно одному аспекту антитело модулирует активность белка. Такие эффекторные молекулы включают, без ограничения, противоопухолевое лекарственное средство, токсин, радиоактивное средство, цитокин, второе антитело или фермент. Также в настоящем документе описаны варианты реализации, в которых антигенсвязывающая конструкция присоединена к ферменту, который преобразует пролекарство в цитотоксическое средство. Примеры цитотоксических средств включают, без ограничения, рицин, доксорубицин, даунорубицин, таксол, бромид этидия, митомицин, этопозид, тенопозид, винкристин, винбластин, колхицин, дигидроксиантрациндион, актиномицин D, дифтерийный токсин, экзотоксин Pseudomonas (РЕ) А, РЕ40, абрин и глюкокортикоид и другие химиотерапевтические средства, а также радиоактивные изотопы. Подходящие поддающиеся обнаружению маркеры включают, без ограничения, радиоактивный изотоп, флуоресцентное соединение, биолюминесцентное соединение, хемилюминесцентное соединение, хелатор металла или фермент.

[0357] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антигенсвязывающие белковые конструкции можно применять для системного лечения рака сами по себе или при конъюгации с эффекторной молекулой. Нацеленные на АСКП конструкции, конъюгированные с токсическими средствами, такими как рицин, а также неконъюгированные антитела могут быть подходящими терапевтическими средствами, от природы нацеленными на раковые клетки, несущие АСКП. Такие конструкции могут быть подходящими для блокировки инвазивности.

[0358] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антигенсвязывающие белковые конструкции можно применять для лечения рака. В данной ситуации конструкцию присоединяют к по меньшей мере функционально активной части второго белка или токсичной молекулы, обладающей терапевтической активностью. Второй белок может содержать, без ограничения, фермент, лимфокин, онкостатин или токсин. Подходящие токсины включают доксорубицин, даунорубицин, таксол, бромид этидия, митомицин, этопозид, тенопозид, винкристин, винбластин, колхицин, дигидроксиантрациндион, актиномицин D, дифтерийный токсин, экзотоксин Pseudomonas (РЕ) А, РЕ40, рицин, абрин, глюкокортикоид и радиоактивные изотопы.

[0359] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лечение, как правило, будет включать повторное введение конструкций и их иммуноконъюгатов посредством подходящего пути введения, такого как внутривенная инъекция (N), в эффективной дозе. Дозы будут зависеть от различных факторов, как правило, принимаемых во внимание специалистами в данной области техники, включая, без ограничения, тип и тяжесть рака, степень или стадию рака, аффинность связывания и период полужизни применяемых средств, целевой уровень равновесной концентрации антитела, частоту лечения и влияние химиотерапевтических средств, применяемых в комбинации со способом лечения согласно вариантам реализации, описанным в настоящем изобретении. Обычные дневные дозы могут варьировать от приблизительно 0,1 до 100 мг/кг. Дозы в диапазоне 10-500 мг конструкций или их иммуноконъюгатов в неделю могут быть эффективными и хорошо переносимыми, хотя даже более высокие еженедельные дозы могут являться соответствующими и/или хорошо переносимыми. Принципиальным определяющим фактором при определении соответствующей дозы является количество конкретного средства, необходимое для того, чтобы являться терапевтически эффективным в конкретном контексте. Повторные введения могут быть необходимы для достижения ингибирования или регрессии опухоли. Начальные нагрузочные дозы могут являться более высокими. Начальную нагрузочную дозу можно вводить в виде инфузии. Периодические поддерживающие дозы можно вводить аналогичным способом, при условии, что начальная доза является хорошо переносимой.

[0360] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения также возможно прямое введение конструкции, которое может характеризоваться преимуществами в определенных контекстах. Например, для лечения карциномы мочевого пузыря можно инъецировать средства напрямую в мочевой пузырь.

[0361] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения композиции можно вводить для терапевтических или профилактических вариантов лечения. При терапевтических применениях композиции вводят пациенту, страдающему от заболевания (например, рака), в «терапевтически эффективной дозе». Количества, эффективные для данного применения, будут зависеть от тяжести заболевания и общего состояния здоровья пациента. Однократные или многократные введения композиций можно проводить в зависимости от дозы и частоты, которые требуются и переносятся пациентом. Другие известные варианты терапии рака можно применять в комбинации со способами, описанными в настоящем документе. Например, композиции, описанные в настоящем документе, можно также применять для нацеливания или сенсибилизации клетки к другим противораковым терапевтическим средствам, таким как 5FU, винбластин, актиномицин D, цисплатин, метотрексат и т.п.

[0362] Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения способы можно реализовать на практике вместе с другими вариантами терапии рака (например, радикальной простатэктомией), с лучевой терапией (внешним пучком или близкофокусной лучевой терапией), гормональной терапией (например, орхиэктомия, терапия аналогами РФЛГ (рилизинг-фактор лютеинизирующего гормона) для подавления наработки тестостерона, антиандрогеновая терапия), или химиотерапией.

[0363] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложены способы визуализации раковых клеток или опухолей in vivo посредством введения антител, таких как миниантитела, описанные в настоящем документе. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения предложен способ визуализации раковой клетки in vivo, причем указанный способ включает введение млекопитающему меченного антитела против АСКП и визуализацию антитела in vivo. Способы можно применять для визуализации раковой клетки в млекопитающем, включая, без ограничения, мышь, крысу, хомяка, кролика, свинью, человека и т.п.

[0364] Согласно некоторым вариантам реализации в настоящем изобретения предложены способы лечения субъекта, страдающего от рака, или способы ингибирования роста клетки рака предстательной железы, экспрессирующей белок антиген стволовых клеток предстательной железы (АСКП), причем указанный способ включает осуществление контакта раковой клетки (например, клетки рака предстательной железы, мочевого пузыря, поджелудочной железы) с конструкцией, описанной в настоящем изобретении, в количестве, эффективном для ингибирования роста раковой клетки. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения способы находят конкретное применение в диагностике, прогнозировании и лечении типов рака, которые сверхэкспрессируют АСКП, например, типов рака предстательной железы, поджелудочной железы и мочевого пузыря. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения способы применяют в отношении трудноподдающихся гормонотерапии или резистентных к терапии типов рака. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения способы применяют в отношении метастатических типов рака.

[0365] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложено миниантитело, которое связывается с АСКП. Миниантитело содержит полипептид, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv), который связывается с АСКП, причем scFv содержит вариабельный домен тяжелой цепи (V_H), соединенный с вариабельным доменом легкой цепи (V_L); и вариант шарнирной области, содержащий по меньшей мере три цистеина на каждой цепи шарнира. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения миниантитело дополнительно содержит последовательность C_H3 IgG человека. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения миниантитело дополнительно содержит поддающийся обнаружению маркер, который выбран из группы, состоящей из радиоактивного вещества, красителя, контрастного вещества, флуоресцентного соединения, биолюминесцентного соединения, фермента, усиливающего средства и наночастицы.

[0366] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения миниантитело согласно настоящему документу содержит: HCDR1 согласно HCDR1 в SEQ ID NO: 93; HCDR2 согласно HCDR2 в SEQ ID NO: 94; HCDR3 согласно HCDR3 в SEQ ID NO: 95; LCDR1 согласно LCDR1 в SEQ ID NO: 96; LCDR2 согласно LCDR2 в SEQ ID NO: 97; и LCDR3 согласно LCDR3 в SEQ ID NO: 98. Согласно некоторым вариантам реализации миниантитела, описанного в настоящем документе, вариабельный домен тяжелой цепи (V_H) и вариабельный домен легкой цепи (V_L) представляют собой последовательности человека.

[0367] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложена нуклеиновая кислота, кодирующая антитело согласно любому из вариантов реализации, описанных в настоящем документе. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложена линия клеток, продуцирующая любой из вариантов реализации миниантитела, описанных в настоящем документе. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложен набор, содержащий любой из вариантов реализации миниантитела, описанных в настоящем документе, и поддающийся обнаружению маркер.

[0368] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложен способ обнаружения присутствия или отсутствия АСКП. Способ включает применение любого из вариантов реализации миниантитела, описанных в настоящем документе, в отношении образца, и обнаружение связывания или отсутствия связывания антигенсвязывающей конструкции с АСКП. Согласно некоторым вариантам реализации способа миниантитело содержит поддающийся обнаружению маркер, который выбран из группы, состоящей из радиоактивного вещества, красителя, контрастного вещества, флуоресцентного соединения, биолюминесцентного соединения, фермента, усиливающего средства и наночастицы. Согласно некоторым вариантам реализации способа применение миниантитела включает введение миниантитела субъекту. Согласно некоторым вариантам реализации способа обнаружение связывания или отсутствия связывания миниантитела с антигеном-мишенью включает позитронно-эмиссионную томографию. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения способ также включает применение вторичного антитела или его фрагмента в отношении образца, причем вторичное антитело или его фрагмент специфично связывается с миниантителом. Согласно некоторым вариантам реализации способа миниантитело инкубируют с образцом в течение не более 1 часа.

[0369] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложен способ нацеливания терапевтического средства на АСКП. Способ включает введение субъекту любого из вариантов реализации миниантитела, описанных в настоящем документе, причем миниантитело конъюгировано с терапевтическим средством.

[0370] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложен способ нацеливания на АСКП у субъекта, который нуждается в таком нацеливании. Способ включает введение субъекту миниантитела согласно любому из вариантов реализации, описанных в настоящем документе. Согласно некоторым вариантам реализации способа субъект страдает от по меньшей мере одного или нескольких состояний из опухоли предстательной железы, рака предстательной железы, опухоли мочевого пузыря, переходной карциномы мочевого пузыря, опухоли поджелудочной железы, карциномы поджелудочной железы, любой опухоли, связанной с экспрессией АСКП, любого рака, связанного с экспрессией АСКП, или любого нарушения, связанного с экспрессией АСКП.

[0371] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложена антигенсвязывающая конструкция (такая как миниантитело или scFv), которая связывается с АСКП, антигенсвязывающая конструкция (такая как миниантитело или scFv), содержащая шарнирную область, причем шарнирная область содержит по меньшей мере одну последовательность из следующих: а) пептидную последовательность согласно SEQ ID NO: 1 (X_n1CX_n2X_n3CX_n4X_n5C), где X_n1 может представлять собой любую аминокислоту, которая не образует ковалентной перекрестно-сшивающей связи, где X_n2 представляет собой одну аминокислоту из: A, R, N, D, Е, Q, G, Н, I, L, K, М, F, Р, S, Т, W, Y или V, где X_n3 может представлять собой любую аминокислоту, где X_n4 может представлять собой любую аминокислоту, и где X_n5 может представлять собой любую аминокислоту; b) пептидную последовательность согласно SEQ ID NO: 2 (X_n1X_n2X_n3X_n4X_n5 X_n6CX_n7X_n8CX_n9X_n10C), где X_n1 может представлять собой любую аминокислоту, которая не образует ковалентной перекрестно-сшивающей связи с другой идентичной аминокислотой, где X_n2 может представлять собой любую аминокислоту, где X_n3 может представлять собой любую аминокислоту, где X_n4 может представлять собой любую аминокислоту, где X_n5 может представлять собой любую аминокислоту, где X_n6 может представлять собой любую аминокислоту, где X_n7 может представлять собой любую аминокислоту, где X_n8 может представлять собой любую аминокислоту, где X_n9 может представлять собой любую аминокислоту, и где X_n10 может представлять собой любую аминокислоту (SEQ ID NO: 208); с) центральную шарнирную последовательность, имеющую по меньшей мере одной последовательность из: CVECPPCP (SEQ ID NO: 57), СРРСРРС (SEQ ID NO: 52) или CPPCPPCPPC (SEQ ID NO: 54), присоединенную к последовательности верхнего шарнира ELKTPLGDTTHT (SEQ ID NO: 48); или d) верхнюю шарнирную область, которая не содержит аминокислот, способных к перекрестному сшиванию с соответствующей аминокислотой, и центральную шарнирную область, присоединенную к С-концу верхней шарнирной области, причем центральная шарнирная область содержит по меньшей мере три цистеина. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антигенсвязывающая конструкция представляет собой полноразмерное антитело. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитело представляет собой миниантитело. Согласно некоторым вариантам реализации антигенсвязывающей конструкции (такой как миниантитело или scFv) помимо шарнирной области антигенсвязывающая конструкция (такая как миниантитело или scFv) содержит гуманизированную аминокислотную последовательность. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антигенсвязывающая конструкция (такая как миниантитело или scFv) содержит: HCDR1 согласно HCDR1 в SEQ ID NO: 93; HCDR2 согласно HCDR2 в SEQ ID NO: 94; HCDR3 согласно HCDR3 в SEQ ID NO: 95; LCDR1 согласно LCDR1 в SEQ ID NO: 96; LCDR2 согласно LCDR2 в SEQ ID NO: 97; и LCDR3 согласно LCDR3 в SEQ ID NO: 98.

[0372] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложена нуклеиновая кислота, кодирующая шарнирную область любого из вариантов реализации антигенсвязывающих конструкций (таких как миниантитело или scFv), описанных в настоящем документе. Согласно некоторым вариантам реализации нуклеиновой кислоты помимо последовательности, кодирующей шарнирную область, нуклеиновая кислота содержит последовательность человека. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложена линия клеток, экспрессирующих антигенсвязывающую конструкцию (такую как миниантитело или scFv), кодируемую нуклеиновой кислотой.

[0373] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложен способ получения антигенсвязывающей конструкции (такой как миниантитело или scFv) согласно любому из вариантов реализации, описанных в настоящем документе, причем указанный способ включает экспрессию антитела в линии клеток.

[0374] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложен способ лечения состояния у субъекта, который нуждается в таком лечении, причем указанный способ включает введение субъекту антитела согласно любому из вариантов реализации, описанных в настоящем документе.

ПСМЛ-IAB2M

[0375] Были разработаны полноразмерные антитела, нацеленные на ПСМА, некоторые из которых находятся на различных стадиях доклинической и клинической разработки. ПСМА изначально был определен с помощью антитела мыши (MAT) 7Е11, которое распознает внутриклеточный эпитоп ПСМА (Olson, W. С. et al., "Clinical trials of cancer therapies targeting prostate-specific membrane antigen," Rev. Recent Clin. Trials, Vol. 2, No. 3, pp. 182-190, 2007). Позже на основе MAT 7E11 было разработано одобренное FDA (Food and Drug Administration, Управлением США по контролю над продуктами питания и лекарственными средствами) средство для визуализации методом ОЭКТ, названное Простасцинт (Prostascint), для обнаружения и визуализации рака предстательной железы в мягких тканях. Однако, поскольку 7Е11 распознает внутриклеточный эпитоп, Простасцинт является относительно слабым средством для визуализации, которое ограничено обнаружением некротической опухолевой ткани (Olson, W.С. et al., 2007). Поскольку Простасцинт обладает фармакокинетическими свойствами полноразмерного антитела, для него также требуется длительный период времени между инъекцией и визуализацией. Более того, Простасцинт является антителом мыши, вызывающим сильные иммунные ответы, которые препятствуют многократному введению доз (Olson, W. С. et al., 2007).

[0376] Другое полноразмерное антитело, нацеленное на ПСМА, J591, было обнаружено и впоследствии деиммунизировано; деиммунизированная версия известна как huJ591 (Liu, Н. et al., "Monoclonal antibodies to the extracellular domain of prostate-specific membrane antigen also react with tumor vascular endothelium", Cancer Research, Vol. 57, No. 17, pp. 3629-3634, 1997; Bander, N. H. et al., "Targeting Metastatic Prostate Cancer with Radiolabeled Monoclonal Antibody J591 to the Extracellular Domain of Prostate Specific Membrane Antigen," J. Urol, Vol. 170, No. 5, pp. 1717-1721, 2003). Деиммунизированное huJ591 представляет собой антитело против ПСМА человека, которое распознает и связывается с внеклеточным эпитопом на ПСМА (Bander, N. Н. et al., 2003). Проводится разработка антитела huJ591 как потенциального радиоиммунотерапевтического средства против рака предстательной железы. В исследованиях фазы I конъюгированное с DOTA антитело huJ591, меченное гамма-испускающими изотопами Индием-111 и Лютецием-177, продемонстрировало превосходное нацеливание на метастатические участки, отсутствие иммуногенности, и многократные дозы являлись хорошо переносимыми (Bander, N.Н. et al., 2003, Milowsky, М.I. et al., "Phase I Trial of yttrium-90-labeled anti-prostate-specific membrane antigen monoclonal antibody J591 for androgen-independent prostate cancer," J. Clin. Oncol., Vol. 22, No. 13, pp. 2522-2531, 2004; Bander, N.H. et al., "Phase I trial of 177 Lutetium-labeled J591, a monoclonal antibody to prostate-specific membrane antigen, in patients with androgen-independent prostate cancer," J. Clin. Oncol., Vol.23, No. 21, pp.4591-4601,2005; Olson, W. C. et al., 2007). Помимо рака предстательной железы, исследования I фазы с ¹¹¹In-DOTA huJ591 продемонстрировали специфичное нацеливание на новообразованные сосуды опухоли солидных опухолей на поздних стадиях (Milowsky, М.I. et al., "Vascular targeted therapy with anti-prostate-specific membrane antigen monoclonal antibody J591 in advanced solid tumors," J. Clin. Oncol., Vol. 25, No. 5, pp. 540-547, 2007).

[0377] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антигенсвязывающие конструкции, которые связываются с антигеном ПСМА, могут представлять собой антитела, миниантитела и/или другие фрагменты антител, такие как scFv. Некоторые неограничивающие варианты реализации антигенсвязывающих конструкций против ПСМА представлены на ФИГ. 5В-5Е, 7С-7Е, 21В-21Е, 34А-34F, 35А-35С, 36А, 47 (SEQ ID NO: 112 и 113), 48 (SEQ ID NO: 113), 49 (SEQ ID NO: 114), 50 (SEQ ID NO: 115), 51 (SEQ ID NO: 116), 52 (SEQ ID NO: 117), 53 (SEQ ID NO: 118).

[0378] Простатический специфический мембранный антиген (ПСМА), биомаркер поверхности клетки, связанный с раком предстательной железы (Slovin, S. F., "Targeting novel antigens for prostate cancer treatment: focus on prostate-specific membrane antigen," Expert Opin. Ther. Targets, Vol. 9, No. 3, pp. 561-570, 2005), представляет собой одноканальный трансмембранный белок типа II, обладающий глутаматкарбоксипептидазной активностью, несмотря на то, что функциональная роль ПСМА еще полностью не ясна (Olson, W.С. et al., 2007). Экспрессия ПСМА относительно ограничена в нормальных тканях за пределами предстательной железы, включая головной мозг, тонкий кишечник, печень, проксимальные канальцы почек и слюнные железы (Olson, W.С. et al., 2007). Пример белка ПСМА представлен в SEQ ID NO: 131.

[0379] Согласно некоторым вариантам реализации в настоящем изобретения предложены антигенсвязывающие конструкции, такие как миниантитела, нацеленные на простатический специфический мембранный антиген (ПСМА). Антигенсвязывающую конструкцию против ПСМА можно конъюгировать с веществом, таким как диагностическое средство, терапевтическое средство или наночастица, с образованием конъюгата против ПСМА. Также раскрыты способы, включающие применение конструкции, связывающей антиген ПСМА, или конъюгата против ПСМА для диагностики, визуализации, мониторинга или лечения рака или других состояний, связанных со сверхэкспрессией ПСМА.

[0380] В настоящем изобретения предложены антигенсвязывающие конструкции против ПСМА согласно вариантам реализации, описанным в настоящем документе. Антигенсвязывающая конструкция против ПСМА представляет собой молекулу, которая содержит одну или более частей иммуноглобулина или родственной иммуноглобулину молекулы, которая специфично связывается с ПСМА или является иммунологически реактивной с ПСМА.

[0381] Антигенсвязывающую конструкцию против ПСМА или конъюгат против ПСМА можно применять для нацеливания на ПСМА-положительную клетку, такую как раковые клетки, которые сверхэкспрессируют ПСМА.

[0382] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложен способ диагностики рака, связанного с экспрессией ПСМА, у субъекта. Такой способ включает введение субъекту, страдающему от рака, связанного с экспрессией ПСМА, или который, как предполагают, страдает от рака, связанного с экспрессией ПСМА, миниантитела против ПСМА, конъюгированного с диагностическим средством; осуществление способа визуализации у субъекта для визуализации меченного миниантитела in vivo; и определение того, что субъект страдает от рака, связанного с экспрессией ПСМА, если меченное миниантитело локализуется в участке опухоли.

[0383] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложен способ лечения рака, связанного с экспрессией ПСМА, у субъекта.

Некоторые варианты реализации настоящего изобретения включают введение субъекту терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, причем указанная композиция содержит миниантитело против ПСМА. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения миниантитело против ПСМА конъюгировано с терапевтическим средством.

[0384] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения конъюгат против ПСМА может содержать антигенсвязывающую конструкцию против ПСМА (такую как миниантитело или scFv), конъюгированную с терапевтическим средством. «Терапевтическое средство» в настоящем документе представляет собой атом, молекулу или соединение, которые являются подходящими для лечения рака или других состояний, связанных с ПСМА. Примеры терапевтических средств включают, без ограничения, лекарственные средства, химиотерапевтические средства, терапевтические антигенсвязывающие конструкции, токсины, радиоактивные изотопы, ферменты (например, ферменты для расщепления пролекарств на цитотоксическое средство в участке опухоли), нуклеазы, гормоны, иммуномодуляторы, антисмысловые олигонуклеотиды, хелаторы, соединения бора, фотоактивные средства и красители.

[0385] Химиотерапевтические средства в природе часто являются цитотоксическими или цитостатическими и могут включать алкилирующие средства, антиметаболиты, противоопухолевые антибиотики, ингибиторы топоизомеразы, ингибиторы митоза, гормональную терапию, таргетные терапевтические средства и иммунотерапевтические средства. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения химиотерапевтические средства, которые можно применять в качестве диагностических средств согласно вариантам реализации настоящего изобретения, включают, без ограничения, 13-цис-ретиноевую кислоту, 2-хлордезоксиаденозин, 5-азацитидин, 5-фторурацил, 6-меркаптопурин, 6-тиогуанин, актиномицин-D, адриамицин, алдеслейкин, алемтузумаб, алитретиноин, полностью трансретиноевую кислоту, альфа-интерферон, алтретамин, аметоптерин, амифостин, анагрелид, анастрозол, арабинозилцитозин, триоксид мышьяка, амсакрин, аминокампотецин, аминоглутетимид, аспарагиназу, азацитидин, бациллу Кальмета-Герена (BCG), бендамустин, бевацизумаб, бексаротен, бикалутамид, бортезомиб, блеомицин, бусульфан, кальций-лейковорин, цитроворум фактор, капецитабин, канертиниб, карбоплатин, кармустин, цетуксимаб, хлорамбуцил, цисплатин, кладрибин, кортизон, циклофосфамид, цитарабин, дарбэпоэтин альфа, дасатиниб, дауномицин, децитабин, денилейкин дифтитокс, дексаметазон, дексазон, декстразоксан, дактиномицин, даунорубицин, декарбазин, доцетаксел, доксорубицин, доксифлуридин, энилурацил, эпирубицин, эпоэтин альфа, эрлотиниб, эверолимус, эксеместан, эстрамустин, этопозид, филграстим, флуоксиместерон, фулвестрант, флавопиридол, флоксуридин, флударабин, фторурацил, флутамид, гефитиниб, гемцитабин, гемтузумаб озогамицин, госерелин, колониестимулирующий фактор гранулоцитов, колониестимулирующий фактор гранулоцитов-макрофагов, гексаметилмеламин, гидрокортизона гидроксимочевину, ибритумомаб, интерферон альфа, интерлейкин-2, интерлейкин-11, изотретинион, иксабепилон, идарубицин, иматиниба мезилат, ифосфамид, иринотекан, лапатиниб, леналидомид, летрозол, лейковорин, лейпролид, липосомный Ara-С, ломустин, мехлорэтамин, мегестрол, мелфалан, меркаптопурин, месну, метотрексат, метилпреднизолон, митомицин С, митотан, митоксантрон, неларабин, нилутамид, октреотид, опрелвекин, оксалиплатин, паклитаксел, памидронат, пеметрексед, панитумумаб, ПЭГ-интерферон, ПЭГ-аспаргазу, ПЭГ-филграстим, ПЭГ-L-аспарагиназу, пентостатин, пликамицин, преднизолон, преднизон, прокарбазин, ралоксифен, ритуксимаб, ромиплостим, ралитрексед, сапацитабин, сарграмостин, сатраплатин, сорафениб, сунитиниб, семустин, стрептозоцин, тамоксифен, тегафур, тегафур-урацил, темсиролимус, темозоломид, тенипозид, талидомид, тиогуанин, тиотепу, топотекан, торемифен, тозитумомаб, трастузумаб, третиноин, тримитрексат, алрубицин, винкристин, винбластин, виндестин, винорелбин, вориностат или золедроновую кислоту.

[0386] Терапевтические антитела и их функциональные фрагменты, которые можно применять в качестве диагностических средств согласно вариантам реализации настоящего изобретения, включают, без ограничения, алемтузумаб, бевацизумаб, цетуксимаб, эдреколомаб, гемтузумаб, ибритутомаб тиуксетан, панитумумаб, ритуксимаб, тозитумомаб и трастузумаб.

[0387] Антигенсвязывающую конструкцию против ПСМА или конъюгат против ПСМА можно применять для нацеливания на ПСМА-положительную клетку, такую как раковые клетки, которые сверхэкспрессируют ПСМА. Вследствие этого способы диагностики, обнаружения, визуализации, мониторинга или лечения рака или другого состояния, связанного с экспрессией ПСМА, могут включать введение субъекту, страдающему от рака или другого состояния, связанного с экспрессией ПСМА, или который, как предполагают, страдает от рака или другого состояния, связанного с экспрессией ПСМА, антигенсвязывающей конструкции против ПСМА или конъюгата против ПСМА.

[0388] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложены способы лечения рака или другого состояния, связанного со сверхэкспрессией ПСМА. Такие способы включают введение субъекту терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, которая содержит антигенсвязывающую конструкцию против ПСМА, описанную в настоящем документе. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения антигенсвязывающая конструкция против ПСМА представляет собой миниантитело, полученное из антитела J591, такое как такие миниантитела J591, описанные в настоящем документе.

[0389] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения фармацевтическая композиция может содержать терапевтический конъюгат против ПСМА, причем конъюгат содержит антигенсвязывающую конструкцию против ПСМА, конъюгированную с одним или несколькими терапевтическими средствами, описанными в настоящем документе. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антигенсвязывающая конструкция против ПСМА получена из антитела J591, такого как такие миниантитела J591, описанные в настоящем документе. Например, миниантитела J591, описанные в настоящем документе, можно применять в подходе радиоиммунотерапии, в котором одно или более миниантител J591 метят радиоактивным изотопом с соответствующей бета-испускающей радиоактивной меткой, такой как Иттрий-90. Меченное радиоактивным изотопом миниантитело или миниантитела J591 можно применять для обеспечения повреждения и гибели клетки в локальной раковой ткани, которая экспрессирует ПСМА. Также применение меченных радиоактивным изотопом миниантител J591, вероятно, будет спровождаться улучшенным проникновением в опухоль по сравнению с меченным радиоактивным изотопом полноразмерным родительским антителом huJ591.

[0390] Терапевтический конъюгат против ПСМА можно конъюгировать или связать с одним или несколькими дополнительными веществами, описанными в настоящем документе, такими как диагностические конъюгаты против ПСМА (описанные в настоящем документе), неконъюгированные диагностические средства, контрастные растворы, липидные носители или наночастицы.

[0391] Экспрессия ПСМА в раке предстательной железы повышается с увеличением агрессивности опухоли и является наивысшей в опухолях высокой степени злокачественности, метастатических поражениях и андроген-независимом заболевании (Olson, W.С. et al., 2007). Вследствие этого ПСМА представляет собой биомаркер рака, который является хорошим кандидатом для нацеливания посредством средства визуализации. Экспрессия ПСМА также повышающе регулируется в новообразованных сосудах множества солидных опухолей, отличных от опухолей предстательной железы, включая карциному легких, толстой кишки, молочной железы, почек, печени и поджелудочной железы, а также саркомы и меланомы (Olson, W.С. et al., 2007).

[0392] Рак, связанный с экспрессией ПСМА у субъекта, может представлять собой рак легких, рак толстой и прямой кишок, рак молочной железы, рак почек, рак печени, рак мочевого пузыря, рак поджелудочной железы или меланому. Таким образом, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения «ПСМА-зависимое нарушение» может включать: рак легких, рак толстой и прямой кишок, рак молочной железы, рак почек, рак печени, рак мочевого пузыря, рак поджелудочной железы или меланому.

[0393] Более того, «ПСМА-зависимое нарушение» может также включать те типы рака, которые связаны с экспрессией ПСМА, включая таковые, которые содержат раковую опухолевую ткань, сверхэкспрессирующую ПСМА (например, рак предстательной железы), или таковые, которые содержат новообразованные сосуды солидной опухоли, сверхэкспрессирующие ПСМА (например, рак предстательной железы, рак легких, рак толстой кишки (или толстой и прямой кишок), молочной железы, рак почек, рак печени, рак мочевого пузыря и рак поджелудочной железы, а также саркомы и меланомы). Большинство новообразованных сосудов солидной опухоли экспрессируют ПСМА, что делает ПСМА биомаркером новообразованных сосудов. Таким образом, помимо раковых клеток, экспрессирующих ПСМА, рак, который связан с экспрессией ПСМА, может включать любую раковую ткань с новообразованными сосудами, включая, без ограничения, карциномы, такие как рак предстательной железы, рак легких, рак толстой кишки (или толстой и прямой кишок), рак молочной железы, рак почек, рак печени, рак мочевого пузыря и рак поджелудочной железы, а также саркомы и меланомы.

[0394] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложено миниантитело, которое связывается с ПСМА. Миниантитело содержит полипептид, который содержит одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv), который связывается с ПСМА, scFv, содержащий вариабельный домен тяжелой цепи (V_H), соединенный с вариабельным доменом легкой цепи (V_L); и вариант шарнирной области, содержащий по меньшей мере три цистеина на каждой цепи шарнира. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения миниантитело дополнительно содержит последовательность C_H3 IgG человека. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения миниантитело дополнительно содержит поддающийся обнаружению маркер, который выбран из группы, состоящей из радиоактивного вещества, красителя, контрастного вещества, флуоресцентного соединения, биолюминесцентного соединения, фермента, усиливающего средства и наночастицы.

[0395] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения миниантитело согласно настоящему документу содержит: HCDR1 согласно HCDR1 в SEQ ID NO: 81; HCDR2 согласно HCDR2 в SEQ ID NO: 82; HCDR3 согласно HCDR3 в SEQ ID NO: 83; LCDR1 согласно LCDR1 в SEQ ID NO: 84; LCDR2 согласно LCDR2 в SEQ ID NO: 85; и LCDR3 согласно LCDR3 в SEQ ID NO: 86. Согласно некоторым вариантам реализации миниантитела, описанного в настоящем документе, вариабельный домен тяжелой цепи (V_H) и вариабельный домен легкой цепи (V_L) представляют собой последовательности человека.

[0396] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложена нуклеиновая кислота, кодирующая антитело согласно любому из вариантов реализации, описанных в настоящем документе. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложена линия клеток, продуцирующая любые из вариантов реализации миниантитела, описанных в настоящем документе. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложен набор, содержащий любой из вариантов реализации миниантитела, описанных в настоящем документе, и поддающийся обнаружению маркер.

[0397] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложен способ обнаружения присутствия или отсутствия ПСМА. Указанный способ включает: применение любого из вариантов реализации миниантитела, описанных в настоящем документе, в отношении образца; и обнаружение связывания или отсутствия связывания антигенсвязывающей конструкции с ПСМА. Согласно некоторым вариантам реализации способа миниантитело содержит поддающийся обнаружению маркер, который выбран из группы, состоящей из радиоактивного вещества, красителя, контрастного вещества, флуоресцентного соединения, биолюминесцентного соединения, фермента, усиливающего средства и наночастицы. Согласно некоторым вариантам реализации способа применение миниантитела включает введение миниантитела субъекту. Согласно некоторым вариантам реализации способа обнаружение связывания или отсутствия связывания миниантитела с антигеном-мишенью включает позитронно-эмиссионную томографию. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения способ также включает применение вторичного антитела или его фрагмента в отношении образца, причем вторичное антитело или его фрагмент специфично связывается с миниантителом. Согласно некоторым вариантам реализации способа миниантитело инкубируют с образцом в течение не более 1 часа.

[0398] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложен способ нацеливания терапевтического средства на ПСМА. Способ включает введение субъекту любого из вариантов реализации миниантитела, описанных в настоящем документе, причем миниантитело конъюгировано с терапевтическим средством.

[0399] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложен способ нацеливания на ПСМА у субъекта, который нуждается в таком нацеливании. Способ включает введение субъекту миниантитела согласно любому из вариантов реализации, описанных в настоящем документе. Согласно некоторым вариантам реализации способа субъект страдает от по меньшей мере одной из опухолей или рака, или нарушения функции предстательной железы, головного мозга, тонкого кишечника, печени, проксимальных канальцев почек, слюнных желез. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложен способ нацеливания на ПСМА в новообразованных сосудах солидной опухоли на поздней стадии.

[0400] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложено антитело, которое связывается с ПСМА. Антитело содержит шарнирную область, причем шарнирная область содержит по меньшей мере одну последовательность из следующих: а) пептидную последовательность согласно SEQ ID NO: 1 (X_n1CX_n2X_n3CX_n4X_n5C), где X_n1 может представлять собой любую аминокислоту, которая не образует ковалентной перекрестно-сшивающей связи, где X_n2 представляет собой одну аминокислоту из: A, R, N, D, Е, Q, G, Н, I, L, K, М, F, Р, S, Т, W, Y или V, где X_n3 может представлять собой любую аминокислоту, где X_n4 может представлять собой любую аминокислоту, и где X_n5 может представлять собой любую аминокислоту; b) пептидную последовательность согласно SEQ ID NO: 2 (X_n1X_n2X_n3X_n4X_n5X_n6CX_n7X_n8CX_n9X_n10C), где X_n1 может представлять собой любую аминокислоту, которая не образует ковалентной перекрестно-сшивающей связи с другой идентичной аминокислотой, где X_n2 может представлять собой любую аминокислоту, где X_n3 может представлять собой любую аминокислоту, где X_n4 может представлять собой любую аминокислоту, где X_n5 может представлять собой любую аминокислоту, где X_n6 может представлять собой любую аминокислоту, где X_n7 может представлять собой любую аминокислоту, где X_n8 может представлять собой любую аминокислоту, где X_n9 может представлять собой любую аминокислоту, и где X_n10 может представлять собой любую аминокислоту (SEQ ID NO: 208); с) центральную шарнирную последовательность, имеющую по меньшей мере одной последовательность из: CVECPPCP (SEQ ID NO: 57), СРРСРРС (SEQ ID NO: 52) или CPPCPPCPPC (SEQ ID NO: 54), присоединенную к последовательности верхнего шарнира согласно ELKTPLGDTTHT (SEQ ID NO: 48); или d) верхнюю шарнирную область, которая не содержит аминокислот, способных к перекрестному сшиванию с соответствующей аминокислотой, и центральную шарнирную область, присоединенную к С-концу верхней шарнирной области, причем центральная шарнирная область содержит по меньшей мере три цистеина. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитело представляет собой полноразмерное антитело. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитело представляет собой миниантитело. Согласно некоторым вариантам реализации антитела помимо шарнирной области антитело содержит гуманизированную аминокислотную последовательность. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитело содержит: HCDR1 согласно HCDR1 в SEQ ID NO: 81; HCDR2 согласно HCDR2 в SEQ ID NO: 82; HCDR3 согласно HCDR3 в SEQ ID NO: 83; LCDR1 согласно LCDR1 в SEQ ID NO: 84; LCDR2 согласно LCDR2 в SEQ ID NO: 85; и LCDR3 согласно LCDR3 в SEQ ID NO: 86.

[0401] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложена нуклеиновая кислота, кодирующая шарнирную область любого из вариантов реализации антитела, описанных в настоящем документе. Согласно некоторым вариантам реализации нуклеиновой кислоты помимо последовательности, кодирующей шарнирную область, нуклеиновая кислота содержит последовательность человека. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложена линия клеток, экспрессирующих антитело, кодируемое нуклеиновой кислотой.

[0402] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложен способ получения антитела согласно любому из вариантов реализации, описанных в настоящем документе, причем указанный способ включает экспрессию антитела в линии клеток.

[0403] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложен способ лечения состояния у субъекта, который нуждается в таком лечении, причем указанный способ включает введение субъекту антитела согласно любому из вариантов реализации, описанных в настоящем документе.

CD8-IAB22M

[0404] CD8 (кластер дифференциации, cluster of differentiation 8) представляет собой трансмембранный гликопротеин, который является специфичным маркером подкласса Т-клеток, включая цитотоксичные Т-клетки. Экспрессия CD8 также присутствует на некоторых природных киллерах и дендритных клетках, а также на субпопуляции Т-клеточных лимфом. CD8 собирается в гетеродимер субъединиц CD8 альфа и CD8 бета или гомодимер CD8 альфа. Собранный димерный комплекс CD8 выступает в качестве корецептора вместе с Т-клеточным рецептором (T-cell receptor, TCR) для распознавания презентации антигена клетками МНС класса I. CD8 играет роль в развитии Т-клеток и активации зрелых Т-клеток. Изменения в локализации Т-клеток могут отражать прогрессирование иммунного ответа и могут возникать со временем. Примеры субъединиц CD8 представлены в SEQ ID NO: 134 и 135.

[0405] В настоящем документе описаны антигенсвязывающие конструкции, включая антитела и их фрагменты, такие как миниантитела, которые связываются с молекулой-мишенью, CD8. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антигенсвязывающие конструкции, которые связываются с антигеном CD8, могут представлять собой антитела, миниантитела и/или другие фрагменты антител, такие как scFv. Некоторые варианты реализации антигенсвязывающих конструкций против CD8 представлены на ФИГ. 14Е, 15D, 16В-16D, 20С-20G, 22В, 36В, 40 (SEQ ID NO: 105 и 106), 41 (SEQ ID NO: 106), 42 (SEQ ID NO: 107), 43 (SEQ ID NO: 108), 44 (SEQ ID NO: 109), 45 (SEQ ID NO: 110), 46 (SEQ ID NO: 111), 66.

[0406] Некоторые варианты реализации, описанные в настоящем документе, относятся к способу нацеливания терапевтического средства на CD8. Способ может включать введение субъекту антигенсвязывающей конструкции, описанной в настоящем документе, например, антигенсвязывающей конструкции против CD8. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антигенсвязывающая конструкция конъюгирована с терапевтическим средством.

[0407] Антигенсвязывающие конструкции могут быть подходящими для обнаружения присутствия, локализации и/или количеств молекулы-мишени (CD8 и/или CD8 + клеток, например, определенных классов Т-клеток). Такие антигенсвязывающие конструкции могут также быть подходящими для нацеливания терапевтических средств на клетки, которые экспрессируют молекулу-мишень. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложены способы обнаружения присутствия или отсутствия молекулы-мишени (или «мишени») с применением антигенсвязывающих конструкций (включая антитела и конструкции, такие как миниантитела). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложены способы применения антигенсвязывающих конструкций для терапевтических целей.

[0408] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антигенсвязывающие конструкции обеспечивают обнаружение CD8 человека, который является специфичным биомаркером, обнаруженным на субпопуляции Т-клеток, для диагностической визуализации иммунной системы. Визуализация CD8 обеспечивает обнаружение локализации Т-клеток in vivo. Изменения локализации Т-клеток могут отражать прогрессирование иммунного ответа и могут возникать со временем в результате различных терапевтических вариантов лечения или даже состояний заболевания.

[0409] Помимо этого, CD8 играет роль в активации расположенных ниже путей передачи сигналов, которые являются важными для активации цитолитических Т-клеток, которые функционируют для избавления от вирусных патогенов и обеспечения иммунитета против опухолей. CDS-положительные Т-клетки могут распознавать короткие пептиды, презентированные белком MHCI антиген-презентирующих клеток. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения сконструированные фрагменты, направленные на CD8, могут усиливать передачу сигналов через Т-клеточный рецептор и усиливать способность субъекта избавляться от вирусных патогенов и отвечать на антигены опухоли. Таким образом, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антигенсвязывающие конструкции, описанные в настоящем документе, могут представлять собой агонисты и могут активировать мишень CD8.

[0410] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения обнаруживают присутствие или отсутствие мишени, CD8. Присутствие или отсутствие мишени можно обнаружить на основании присутствия или отсутствия антигенсвязывающей конструкции в образце. После удаления и/или устранения антигенсвязывающей конструкции из образца, например, посредством промывки и/или метаболического устранения, оставшаяся в образце антигенсвязывающая конструкция может свидетельствовать о присутствии мишени, тогда как отсутствие антигенсвязывающей конструкции в образце может свидетельствовать об отсутствии мишени.

[0411] Некоторые варианты реализации включают обнаружение CD8 человека, который является специфичным биомаркером, обнаруженным на субпопуляции Т-клеток, для диагностической визуализации иммунной системы. Визуализация молекулы-мишени может обеспечить обнаружение локализации Т-клеток in vivo. Изменения локализации Т-клеток могут отражать прогрессирование иммунного ответа и могут возникать со временем в результате различных терапевтических вариантов лечения или даже состояний заболевания. Например, визуализация локализации Т-клеток может быть подходящей в иммунотерапии. Адоптивная иммунотерапия представляет собой форму терапии, в которой с собственными Т-клетками пациента манипулируют in vitro и повторно вводят пациенту. При данной форме лечения визуализация Т-клеток может быть подходящей для мониторинга и/или определения статуса лечения. Таким образом, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения мониторинг локализации молекулы-мишени может являться подходящим для анализа механизма действия, эффективности и/или безопасности при разработке лекарственных средств и/или может способствовать клиническому ведению заболевания.

[0412] Некоторые варианты реализации, описанные в настоящем документе, относятся к способу нацеливания терапевтического средства на CD8. Способ может включать введение субъекту антигенсвязывающей конструкции, описанной в настоящем документе, например, антигенсвязывающей конструкции против CD8. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антигенсвязывающая конструкция конъюгирована с терапевтическим средством.

[0413] Токсины, которые можно применять в качестве поддающихся обнаружению маркеров согласно вариантам реализации настоящего изобретения, включают, без ограничения, рицин, абрин, рибонуклеазу (РНКазу), ДНКазу I, стафилококковый энтеротоксин А, антивирусный белок фитолакки, гелонин, дифтерийный токсин, экзотоксин Pseudomonas и эндотоксин Pseudomonas.

[0414] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения наночастицы применяют в терапевтических применениях в качестве носителей лекарственных средств, которые при конъюгации с антигенсвязывающей конструкцией доставляют химиотерапевтические средства, гормональные терапевтические средства, радиотерапевтические средства, токсины или любое другое цитотоксическое или противораковое средство, известное в данной области техники, к раковым клеткам, которые сверхэкспрессируют мишени на поверхности клетки.

[0415] Антигенсвязывающие конструкции можно применять для нацеливания терапевтической молекулы, например, цитотоксина, на мишень-положительную клетку, такую как клетка, экспрессирующая CD8. Таким образом, некоторые варианты реализации настоящего изобретения включают способы нацеливания терапевтического средства на мишень-положительную клетку. Способ может включать введение субъекту антигенсвязывающей конструкции, описанной в настоящем документе. Субъект может представлять собой субъекта, который нуждается, например, субъекта, который нуждается в устранении или нейтрализации по меньшей мере некоторых мишень-положительных клеток. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антигенсвязывающая конструкция содержит по меньшей мере одно терапевтическое средство, описанное в настоящем документе. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения терапевтическое средство может быть напрямую конъюгировано с антигенсвязывающей конструкцией посредством ковалентной связи, такой как дисульфидная связь. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения субъект может получить пользу от локализации CD8-положительной клетки к другой клетке или средству.

[0416] Необязательно, перед и/или после введения антигенсвязывающей конструкции, которая содержит по меньшей мере одно терапевтическое средство, определяют количество и/или локализацию мишень-положительных клеток пациента. Например, определение количества и/или локализации мишень-положительных клеток до введения может свидетельствовать, получит ли пациент вероятную пользу от нейтрализации и/или устранения мишень-положительных клеток. Определение количества и/или локализации мишень-положительных клеток после введения может свидетельствовать о том, были ли мишень-положительные клетки устранены у пациента.

[0417] Термин «С08-зависимое нарушение» включает типы рака, для которых существует иммунологический компонент (включая ответ на иммунотерапию рака), аутоиммунные нарушения, воспалительные нарушения и т.д.

[0418] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложено миниантитело, которое связывается с CD8. Миниантитело содержит полипептид, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv), который связывается с CD8, причем scFv содержит вариабельный домен тяжелой цепи (V_H), соединенный с вариабельным доменом легкой цепи (V_L); и вариант шарнирной области, содержащий по меньшей мере три цистеина на каждой цепи шарнира. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения миниантитело дополнительно содержит последовательность C_H3 IgG человека. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения миниантитело дополнительно содержит поддающийся обнаружению маркер, который выбран из группы, состоящей из радиоактивного вещества, красителя, контрастного вещества, флуоресцентного соединения, биолюминесцентного соединения, фермента, усиливающего средства и наночастицы.

[0419] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения миниантитело согласно настоящему документу содержит: HCDR1 согласно HCDR1 в SEQ ID NO: 75; HCDR2 согласно HCDR2 в SEQ ID NO: 76; HCDR3 согласно HCDR3 в SEQ ID NO: 77; LCDR1 согласно LCDR1 в SEQ ID NO: 78; LCDR2 согласно LCDR2 в SEQ ID NO: 79; и LCDR3 согласно LCDR3 в SEQ ID NO: 80. Согласно некоторым вариантам реализации миниантитела, описанного в настоящем документе, вариабельный домен тяжелой цепи (V_H) и вариабельный домен легкой цепи (V_L) представляют собой последовательности человека.

[0420] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложена нуклеиновая кислота, кодирующая антитело согласно любому из вариантов реализации, описанных в настоящем документе. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложена линия клеток, продуцирующая любые из вариантов реализации миниантитела, описанных в настоящем документе. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложен набор, содержащий любой из вариантов реализации миниантитела, описанных в настоящем документе, и поддающийся обнаружению маркер.

[0421] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложен способ обнаружения присутствия или отсутствия CD8. Указанный способ включает применение любого из вариантов реализации миниантитела, описанных в настоящем документе, в отношении образца; и обнаружение связывания или отсутствия связывания антигенсвязывающей конструкции с CD8. Согласно некоторым вариантам реализации способа миниантитело содержит поддающийся обнаружению маркер, который выбран из группы, состоящей из радиоактивного вещества, красителя, контрастного вещества, флуоресцентного соединения, биолюминесцентного соединения, фермента, усиливающего средства и наночастицы. Согласно некоторым вариантам реализации способа применение миниантитела включает введение миниантитела субъекту. Согласно некоторым вариантам реализации способа обнаружение связывания или отсутствия связывания миниантитела с CD8 включает позитронно-эмиссионную томографию. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения способ также включает применение вторичного антитела или его фрагмента в отношении образца, причем вторичное антитело или его фрагмент специфично связывается с миниантителом. Согласно некоторым вариантам реализации способа миниантитело инкубируют с образцом в течение не более 1 часа.

[0422] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложен способ нацеливания терапевтического средства на CD8. Способ включает введение субъекту любого из вариантов реализации миниантитела, описанных в настоящем документе, причем миниантитело конъюгировано с терапевтическим средством.

[0423] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложен способ нацеливания на клетку Т-лимфоцит, экспрессирующую CD8, у субъекта, который нуждается в таком нацеливании. Способ включает введение субъекту миниантитела согласно любому из вариантов реализации, описанных в настоящем документе. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложен способ нейтрализации клетки Т-лимфоцита, экспрессирующей CD8. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения субъект содержит по меньшей мере одну из следующих клеток: CD8 Т-клетки с подавленным иммунитетом, CD8 Т-клетки с нарушенной функцией, аутореактивные CD8 Т-клетки, сверхреактивные CD8 Т-клетки, ингибиторные CD8 Т-клетки, CD8 Т-клетки с нарушенной локализацией или CD8 Т-клеточную лимфому. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения субъект содержит CD8 Т-клетки, связанные по меньшей мере с одним заболеванием из ревматоидного артрита, множественного склероза, диабета, системной красной волчанки, аутоиммунного заболевания, воспалительного состояния, дефекта передачи сигналов или костимуляторного дефекта.

[0424] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложено антитело, которое связывается с CD8. Антитело содержит шарнирную область, причем шарнирная область содержит по меньшей мере одну последовательность из следующих: а) пептидную последовательность согласно SEQ ID NO: 1 (X_n1CX_n2X_n3CX_n4X_n5C), где X_n1 может представлять собой любую аминокислоту, которая не образует ковалентной перекрестно-сшивающей связи, где X_n2 представляет собой одну аминокислоту из: A, R, N, D, Е, Q, G, Н, I, L, K, М, F, Р, S, Т, W, Y или V, где X_n3 может представлять собой любую аминокислоту, где X_n4 может представлять собой любую аминокислоту, и где X_n5 может представлять собой любую аминокислоту; b) пептидную последовательность согласно SEQ ID NO: 2 (X_n1X_n2X_n3X_n4X_n5 X_n6CX_n7X_n8CX_n9X_n10C), где X_n1 может представлять собой любую аминокислоту, которая не образует ковалентной перекрестно-сшивающей связи с другой идентичной аминокислотой, где X_n2 может представлять собой любую аминокислоту, где X_n3 может представлять собой любую аминокислоту, где X_n4 может представлять собой любую аминокислоту, где X_n5 может представлять собой любую аминокислоту, где X_n6 может представлять собой любую аминокислоту, где X_n7 может представлять собой любую аминокислоту, где X_n8 может представлять собой любую аминокислоту, где X_n9 может представлять собой любую аминокислоту, и где X_n10 может представлять собой любую аминокислоту (SEQ ID NO: 208); с) центральную шарнирную последовательность, имеющую по меньшей мере одной последовательность из: CVECPPCP (SEQ IDNO: 57), СРРСРРС (SEQ ID NO: 52) или СРРСРРСРРС (SEQ ID NO: 54), присоединенную к последовательности верхнего шарнира согласно ELKTPLGDTTHT (SEQ ID NO: 48);

или d) верхнюю шарнирную область, которая не содержит аминокислот, способных к перекрестному сшиванию с соответствующей аминокислотой, и центральную шарнирную область, присоединенную к С-концу верхней шарнирной области, причем центральная шарнирная область содержит по меньшей мере три цистеина. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитело представляет собой полноразмерное антитело. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитело представляет собой миниантитело. Согласно некоторым вариантам реализации антитела помимо шарнирной области антитело содержит гуманизированную аминокислотную последовательность. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитело содержит: HCDR1 согласно HCDR1 в SEQ ID NO: 75; HCDR2 согласно HCDR2 в SEQ ID NO: 76; HCDR3 согласно HCDR3 в SEQ ID NO: 77; LCDR1 согласно LCDR1 в SEQ ID NO: 78; LCDR2 согласно LCDR2 в SEQ ID NO: 79; и LCDR3 согласно LCDR3 в SEQ ID NO: 80.

[0425] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложена нуклеиновая кислота, кодирующая шарнирную область любого из вариантов реализации антитела, описанных в настоящем документе. Согласно некоторым вариантам реализации нуклеиновой кислоты помимо последовательности, кодирующей шарнирную область, нуклеиновая кислота содержит последовательность человека. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложена линия клеток, экспрессирующих антитело, кодируемое нуклеиновой кислотой.

[0426] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложен способ получения антитела согласно любому из вариантов реализации, описанных в настоящем документе, причем указанный способ включает экспрессию антитела в линии клеток.

[0427] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложен способ лечения состояния у субъекта, который нуждается в таком лечении, причем указанный способ включает введение субъекту антитела согласно любому из вариантов реализации, описанных в настоящем документе.

5T4-IAB20M

[0428] 5Т4 представляет собой онкофетальный гликопротеин, который характеризуется слабой экспрессией в немногих тканях взрослых, но мощной экспрессией в различных типах карцином, включая рак толстой и прямой кишок, почек, молочной железы, яичников, желудка, легких и предстательной железы. Экспрессия 5Т4 обнаружена в первичных и метастатических типах рака, и уровень экспрессии коррелирует с прогрессированием заболевания, что делает 5Т4 весьма перспективным биомаркером. Пример белка 5Т4 представлен в SEQ ID NO: 133.

[0429] 5Т4-специфичное визуализирующее средство может обеспечить значительное преимущество с точки зрения специфичности по сравнению с другими визуализирующими средствами, такими как ФДГ (фтордезоксиглюкоза), в основе работы которых лежит обнаружение изменений метаболизма. Более того, визуализирующие средства, которые специфично нацелены на 5Т4, могут представлять собой ценный инструмент при разработке вариантов терапии, нацеленных на 5Т4. Например, визуализирующее средство можно применять для мониторинга пациентов после лечения терапией, нацеленной на 5Т4. В случае рака предстательной железы на рынке представлено одобренное FDA средство для визуализации методом ОЭКТ, названное Простасцинт, однако данное средство характеризуется значительными ограничениями, поскольку является интактным антителом мыши (проблема с иммуногенностью при повторном введении), а эпитоп является внутренним эпитопом биомаркера ПСМА (что ограничивает точность). Антигенсвязывающие конструкции против 5Т4 согласно настоящему изобретению могут обладать значительными преимуществами по сравнению с Простасцинтом, поскольку они могут связываться с внеклеточным эпитопом 5Т4, характеризуются оптимизированной фармакокинетикой для визуализации и являются гуманизированными.

[0430] Белок 5Т4 также известен как трофобластный гликопротеин, или TPBG. Примеры белков 5Т4 известны в данной области техники и включают, например, белок 5Т4 согласно SEQ ID NO: 133.

[0431] Терапевтические антитела и слитые белки антител против мишени 5Т4 человека находились в разработке, включая антитело мыши «Н8». Также на сегодняшний день компания Oxford Biomedica проводит клиническую разработку противораковой вакцины под названием Trovax против антигена 5Т4.

[0432] 5Т4-специфичное визуализирующее средство может обеспечить значительное преимущество с точки зрения специфичности по сравнению с другими визуализирующими средствами, такими как ФДГ, в основе работы которых лежит обнаружение изменений метаболизма. Более того, визуализирующие средства, которые специфично нацелены на 5Т4, могут представлять собой ценный инструмент при разработке вариантов терапии, нацеленных на 5Т4. Например, визуализирующее средство можно применять для мониторинга пациентов после лечения терапией, нацеленной на 5Т4. В случае рака предстательной железы на рынке представлено одобренное FDA средство для визуализации методом ОЭКТ, названное Простасцинт, однако данное средство характеризуется значительными ограничениями, поскольку является интактным антителом мыши (проблема с иммуногенностью при повторном введении), а эпитоп является внутренним эпитопом биомаркера ПСМА (что ограничивает точность). Антигенсвязывающие конструкции против 5Т4 согласно настоящему изобретению могут обладать значительными преимуществами по сравнению с Простасцинтом, поскольку они могут связываться с внеклеточным эпитопом 5Т4, характеризуются оптимизированной фармакокинетикой для визуализации и являются гуманизированными.

[0433] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антигенсвязывающие конструкции, которые связываются с антигеном 5Т4, могут представлять собой антитела, миниантитела и/или другие фрагменты антител, такие как scFv. Некоторые неограничивающие варианты реализации антигенсвязывающих конструкций против 5Т4 представлены на ФИГ. 28В-28Е, 32, 36С, 54 (SEQ ID NO: 119 и 120), 55 (SEQ ID NO: 120), 56 (SEQ ID NO: 121), 57 (SEQ ID NO: 122), 58 (SEQ ID NO: 123), 59 (SEQ ID NO: 124), 67, 68.

[0434] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антигенсвязывающую конструкцию можно присоединить к терапевтическому средству для лечения формы рака, включая, без ограничения: рак толстой и прямой кишок, почек, молочной железы, яичников, желудка, легких и/или предстательной железы.

[0435] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антигенсвязывающую конструкцию против 5Т4 можно применять в качестве терапевтического средства в качестве самостоятельной конструкции (например, без токсина, конъюгированного с ней). Несмотря на то, что фрагменты характеризуются более коротким периодом полужизни по сравнению с интактным антителом, которое будет менее оптимальным для терапии, данные форматы могут демонстрировать улучшенное проникновение в опухоль благодаря их меньшему размеру и могут являться терапевтически эффективными при соответствующем оснащении цитотоксическим лекарственным средством или радиоактивным изотопом.

[0436] 5Т4 представляет собой быстро интернализирующийся антиген, что может сделать его подходящим для подходов на основе конъюгата антитела с лекарственным средством. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения другой терапевтический подход представляет собой радиоиммунотерапию посредством присоединения соответствующей радиоактивной метки, такой как бета-излучатель Иттрий-90, которая может обеспечивать повреждение и гибель клетки в локальной раковой ткани.

[0437] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антигенсвязывающую конструкцию применяют для нацеливания на клетки, экспрессирующие антиген 5Т4, включая, например, клетки рака толстой и прямой кишок, почек, молочной железы, яичников, желудка, легких и/или предстательной железы.

[0438] Способность визуализации всего тела пациента для обнаружения присутствия мишени антитела до и в течение лечения обеспечивает ценную информацию для персонализированного ведения пациента. В течение исследования безопасности и эффективности терапии антителом полезно иметь возможность выбрать и исследовать лечение на пациентах, у которых экспрессируется мишень антитела как часть прогрессирования их заболевания.

[0439] 5Т4 сверхэкспрессируется во многих различных карциномах, включая карциному толстой и прямой кишок, почек, молочной железы, яичников, желудка, легких и предстательной железы. Визуализирующие средства, такие как ФДГ-ПЭТ (ПЭТ с применением фтордезоксиглюкозы), показали себя вполне эффективными для обнаружения многих из данных типов рака, но применяемые на сегодняшний день подходы визуализации являются не достаточно точными в случае рака яичников и предстательной железы. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения любое из данных нарушений можно диагностировать и/или лечить различными конструкциями против 5Т4, описанными в настоящем документе.

[0440] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антигенсвязывающие конструкции могут представлять собой клинические визуализирующие средства (ПЭТ/ОЭКТ) у людей. Поскольку 5Т4 сверхэкспрессируется во многих типах рака (включая рак толстой и прямой кишок, почек, молочной железы, яичников, желудка, легких и предстательной железы), данные антигенсвязывающие конструкции против 5Т4 можно применять для прицельного диагностического обнаружения данных типов рака. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения данные конструкции можно применять для обнаружения рака яичников и/или предстательной железы.

[0441] Термин «5Т4-зависимое нарушение» включает любое нарушение, при котором 5Т4 играет роль в нарушении сам по себе. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения это означает сверхэкспрессию 5Т4. Примеры нарушений включают множество типов рака, таких как, например, рак толстой и прямой кишок, почек, молочной железы, яичников, желудка, легких и предстательной железы.

[0442] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложено миниантитело, которое связывается с 5Т4. Миниантитело содержит полипептид, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv), который связывается с 5Т4, причем scFv содержит вариабельный домен тяжелой цепи (V_H), соединенный с вариабельным доменом легкой цепи (V_L); и вариант шарнирной области, содержащий по меньшей мере три цистеина на каждой цепи шарнира. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения миниантитело дополнительно содержит последовательность C_H3 IgG человека. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения миниантитело дополнительно содержит поддающийся обнаружению маркер, который выбран из группы, состоящей из радиоактивного вещества, красителя, контрастного вещества, флуоресцентного соединения, биолюминесцентного соединения, фермента, усиливающего средства и наночастицы.

[0443] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения миниантитело согласно настоящему документу содержит: HCDR1 согласно HCDR1 в SEQ ID NO: 87; HCDR2 согласно HCDR2 в SEQ ID NO: 88; HCDR3 согласно HCDR3 в SEQ ID NO: 89; LCDR1 согласно LCDR1 в SEQ ID NO: 90; LCDR2 согласно LCDR2 в SEQ ID NO: 91; и LCDR3 согласно LCDR3 в SEQ ID NO: 92. Согласно некоторым вариантам реализации миниантитела, описанного в настоящем документе, вариабельный домен тяжелой цепи (V_H) и вариабельный домен легкой цепи (V_L) представляют собой последовательности человека.

[0444] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложена нуклеиновая кислота, кодирующая антитело согласно любому из вариантов реализации, описанных в настоящем документе. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложена линия клеток, продуцирующая любой из вариантов реализации миниантитела, описанных в настоящем документе. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложен набор, содержащий любой из вариантов реализации миниантитела, описанных в настоящем документе, и поддающийся обнаружению маркер.

[0445] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложен способ обнаружения присутствия или отсутствия 5Т4. Указанный способ включает применение любого из вариантов реализации миниантитела, описанных в настоящем документе, в отношении образца; и обнаружение связывания или отсутствия связывания антигенсвязывающей конструкции с 5Т4. Согласно некоторым вариантам реализации способа миниантитело содержит поддающийся обнаружению маркер, который выбран из группы, состоящей из радиоактивного вещества, красителя, контрастного вещества, флуоресцентного соединения, биолюминесцентного соединения, фермента, усиливающего средства и наночастицы. Согласно некоторым вариантам реализации способа применение миниантитела включает введение миниантитела субъекту. Согласно некоторым вариантам реализации способа обнаружение связывания или отсутствия связывания миниантитела с антигеном-мишенью включает позитронно-эмиссионную томографию. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения способ также включает применение вторичного антитела или его фрагмента в отношении образца, причем вторичное антитело или его фрагмент специфично связывается с миниантителом. Согласно некоторым вариантам реализации способа миниантитело инкубируют с образцом в течение не более 1 часа.

[0446] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложен способ нацеливания терапевтического средства на 5Т4. Способ включает введение субъекту любого из вариантов реализации миниантитела, описанных в настоящем документе, причем миниантитело конъюгировано с терапевтическим средством.

[0447] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложен способ нацеливания на 5Т4 у субъекта, который нуждается в таком нацеливании. Способ включает введение субъекту миниантитела согласно любому из вариантов реализации, описанных в настоящем документе. Согласно некоторым вариантам реализации способа субъект страдает от по меньшей мере одного из следующих состояний: раковой опухоли или рака толстой и прямой кишок, почек, молочной железы, яичников, желудка, легких или предстательной железы. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения субъект страдает от по меньшей мере одного из первичного рака или метастатического рака. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения субъект страдает от ранней стадии нарушения. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения субъект страдает от средней стадии нарушения. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения субъект страдает от поздней стадии нарушения.

[0448] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложено антитело, которое связывается с 5Т4. Антитело содержит шарнирную область, причем шарнирная область содержит по меньшей мере одну последовательность из следующих: а) пептидную последовательность согласно SEQ ID NO: 1 (X_n1CX_n2X_n3CX_n4X_n5C), где X_n1 может представлять собой любую аминокислоту, которая не образует ковалентной перекрестно-сшивающей связи, где X_n2 представляет собой одну аминокислоту из: A, R, N, D, Е, Q, G, Н, I, L, K, М, F, Р, S, Т, W, Y или V, где X_n3 может представлять собой любую аминокислоту, где X_n4 может представлять собой любую аминокислоту, и где X_n5 может представлять собой любую аминокислоту; b) пептидную последовательность согласно SEQ ID NO: 2 (X_n1X_n2X_n3X_n4X_n5X_n6CX_n7X_n8CX_n9X_n10C), где X_n1 может представлять собой любую аминокислоту, которая не образует ковалентной перекрестно-сшивающей связи с другой идентичной аминокислотой, где X_n2 может представлять собой любую аминокислоту, где X_n3 может представлять собой любую аминокислоту, где X_n4 может представлять собой любую аминокислоту, где X_n5 может представлять собой любую аминокислоту, где X_n6 может представлять собой любую аминокислоту, где X_n7 может представлять собой любую аминокислоту, где X_n8 может представлять собой любую аминокислоту, где X_n9 может представлять собой любую аминокислоту, и где X_n10 может представлять собой любую аминокислоту (SEQ ID NO: 208); с) центральную шарнирную последовательность, имеющую по меньшей мере одной последовательность из: CVECPPCP (SEQ IDNO: 57), СРРСРРС (SEQ ID NO: 52) или СРРСРРСРРС (SEQ ID NO: 54), присоединенную к последовательности верхнего шарнира согласно ELKTPLGDTTHT (SEQ ID NO: 48); или d) верхнюю шарнирную область, которая не содержит аминокислот, способных к перекрестному сшиванию с соответствующей аминокислотой, и центральную шарнирную область, присоединенную к С-концу верхней шарнирной области, причем центральная шарнирная область содержит по меньшей мере три цистеина. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитело представляет собой полноразмерное антитело. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитело представляет собой миниантитело. Согласно некоторым вариантам реализации антитела помимо шарнирной области антитело содержит гуманизированную аминокислотную последовательность.

[0449] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитело содержит: HCDR1 согласно HCDR1 в SEQ ID NO: 87; HCDR2 согласно HCDR2 в SEQ ID NO: 88; HCDR3 согласно HCDR3 в SEQ ID NO: 89; LCDR1 согласно LCDR1 в SEQ ID NO: 90; LCDR2 согласно LCDR2 в SEQ ID NO: 91; и LCDR3 согласно LCDR3 в SEQ ID NO: 92.

[0450] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложена нуклеиновая кислота, кодирующая шарнирную область любых из вариантов реализации антитела, описанных в настоящем документе. Согласно некоторым вариантам реализации нуклеиновой кислоты помимо последовательности, кодирующей шарнирную область, нуклеиновая кислота содержит последовательность человека. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложена линия клеток, экспрессирующих антитело, кодируемое нуклеиновой кислотой.

[0451] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложен способ получения антитела согласно любому из вариантов реализации, описанных в настоящем документе. Способ включает экспрессию антитела в линии клеток.

[0452] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложен способ лечения состояния у субъекта, который нуждается в таком лечении, причем способ включает введение субъекту антитела согласно любому из вариантов реализации, описанных в настоящем документе.

CD3-IAB25M

[0453] CD3 (кластер дифференциации 3) был обнаружен одновременно с моноклональным антителом OKT3. Изначально было обнаружено, что OKT3 связывается со всеми зрелыми периферическими Т-клетками, а позже было определено, что эпсилон-субъединица CD3 как часть комплекса TCR-CD3 является антигеном поверхности клетки, с которым связывается OKT3. (Kung, P. et al., "Monoclonal antibodies defining distinctive human T cell surface antigens," Science, Vol. 206, No. 4416, pp. 347-349, 1979). Примеры субъединиц CD3 представлены SEQ ID NO: 136-139. Затем проводили исследование OKT3 в качестве иммуносупрессанта отторжения трансплантата, причем в начальном исследовании изучали острое отторжение трансплантата почки (Cosimi, А. В. et al., "Treatment of acute renal allograft rejection with OKT3 monoclonal antibody," Transplantation, Vol. 32, No. 6, pp. 535-539, 1981).

[0454] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложены антигенсвязывающие конструкции, включая антитела и их фрагменты, такие как миниантитела, которые связываются с молекулой-мишенью, CD3. Такие антигенсвязывающие конструкции могут быть подходящими для обнаружения присутствия, локализации и/или количеств молекулы-мишени (CD3 и/или CD3 + клеток). Такие антигенсвязывающие конструкции могут также быть подходящими для модулирования биологической активности, связанной с экспрессией CD3 на иммунных клетках, и для нацеливания терапевтических средств на клетки, которые экспрессируют белок CD3. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложены способы обнаружения присутствия или отсутствия молекулы-мишени (или «мишени») с применением антигенсвязывающих конструкций (включая антитела и конструкции, такие как миниантитела). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложены способы применения антигенсвязывающих конструкций для терапевтических целей.

[0455] Некоторые варианты реализации миниантител против CD3, раскрытых в настоящем документе, можно также применять в качестве терапевтического миниантитела, например, для модулирования реакции иммунной системы с помощью нейтрализации Т-клеток посредством эпсилон-домена CD3 комплекса TCR и с помощью повышающей регуляции Т-регуляторных клеток посредством повышающей регуляции FOXP3 (Saruta, М. et al., "Characterization of FOXP3 + CD4 + regulatory T cells in Crohn's disease," Clin. Immunol., Vol. 125, No. 3, pp. 281-290, 2007). Такие терапевтические средства находят применение при лечении не только аллотрансплантатов ткани/органа, но также аутоиммунных заболеваний, таких как, среди прочих, ревматоидный артрит, множественный склероз, диабет 1 типа и красная волчанка.

[0456] Начальный экспериментальный вариант доклинической визуализации был осуществлен с применением гуманизированного антитела против CD3, визилизумаба, которое не было получено из OKT3 (Malviya, G. et al., "Radiolabeled humanized anti-CD3 monoclonal antibody Visilizumab for imaging human T-lymphocytes," Vol. 50, No. 10, pp. 1683-1691, 2009). Визуализация CD3 + Т-клеток является подходящей для терапии против CD3, поскольку лечение является эффективным, если орган, представляющий интерес, был полностью инфильтрован CD3 + Т-клетками. Потенциальное средство, визуализирующее CD3, будет обеспечивать выбор пациента, а также способ мониторинга лечения. При визуализации с помощью полноразмерного антитела, как правило, для оптимальной визуализации требуется более длительное время после инъекции, чем при визуализации с помощью фрагментов, описанных в настоящем документе.

[0457] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложены антигенсвязывающие конструкции против CD3, такие как миниантитела. Антигенсвязывающие конструкции можно применять, например, для визуализации и для лечения множества нарушений, в которые вовлечена иммунная система.

[0458] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антигенсвязывающие конструкции, которые связываются с антигеном CD3, могут представлять собой антитела, миниантитела и/или другие фрагменты антител, такие как scFv. Некоторые неограничивающие варианты реализации антигенсвязывающих конструкций против CD3 представлены на ФИГ. 33, 36D, 69.

[0459] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антигенсвязывающую конструкцию можно применять в качестве терапевтического средства без присоединения к другой молекуле, такой как токсин (см., например, публикацию Chatenoud, L. et al., "CD3-specific antibodies: a portal to the treatment of autoimmunity," Nat. Rev. Immunol., Vol. 7, No. 8, pp. 622-632, 2007). Такие антигенсвязывающие конструкции могут также быть подходящими для модулирования биологической активности, связанной с экспрессией CD3 на иммунных клетках, для лечения множества заболеваний, включая рак, диабет, аутоиммунные и воспалительные состояния. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антигенсвязывающую конструкцию саму по себе можно применять в качестве иммунодепрессанта, и она демонстрирует активность по ингибированию передачи сигналов посредством CD3.

[0460] Антигенсвязывающие конструкции против CD3, раскрытые в настоящем документе, можно также применять в качестве терапевтической антигенсвязывающей конструкции, например, для модулирования реакции иммунной системы с помощью нейтрализации Т-клеток посредством эпсилон-домена CD3 комплекса TCR и с помощью повышающей регуляции Т-регуляторных клеток посредством повышающей регуляции FOXP3 (Saruta, М. et al., 2007). Такие терапевтические средства находят применение при лечении не только аллотрансплантатов ткани/органа, но также аутоиммунных заболеваний, таких как, среди прочих, ревматоидный артрит, множественный склероз, диабет 1 типа и красная волчанка.

[0461] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антигенсвязывающая конструкция, такая как миниантитело, может содержать один или более CDR из вариабельной области тяжелой или легкой цепи теплизумаба.

[0462] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения одну или более антигенсвязывающих конструкций, описанных в настоящем документе, можно объединить с другими средствами, нацеленными на иммунные клетки, такими как антитела, направленные на ОХ40, CD134, CD40, CD154, CD80, CD86, ICOS, CD137, и/или антагонисты рецептора ИЛ-1. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения миниантитело, направленное на CD3, снижает иммунный ответ, и необходимость конъюгации дополнительного терапевтического средства с антигенсвязывающей конструкцией отсутствует. Таким образом, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложены миниантитела для лечения аутоиммунного диабета или других аутоиммунных состояний, в которые вовлечены Т-клетки, которые не конъюгированы с терапевтическим средством или не содержат терапевтического средства.

[0463] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антигенсвязывающие конструкции против CD3 можно применять в качестве терапевтической антигенсвязывающей конструкции для модулирования реакции иммунной системы посредством стимуляции и вызова толерантности Т-клеток посредством эпсилон-домена CD3 комплекса TCR и/или с помощью повышающей регуляции Т-регуляторных клеток посредством повышающей регуляции FOXP3 (Saruta, М. et al., 2007). Такие терапевтические средства находят применение при лечении не только аллотрансплантатов ткани/органа, но также аутоиммунных заболеваний, таких как, среди прочих, ревматоидный артрит, множественный склероз, диабет 1 типа и красная волчанка.

[0464] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антигенсвязывающую конструкцию можно применять в качестве терапевтического средства без присоединения к другой молекуле, такой как токсин (см., например, Chatenoud, L. et al., 2007). Такие антигенсвязывающие конструкции могут также быть подходящими для модулирования биологической активности, связанной с экспрессией CD3 на иммунных клетках, для лечения множества заболеваний, включая рак, диабет, аутоиммунные и воспалительные состояния. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антигенсвязывающую конструкцию саму по себе можно применять в качестве иммунодепрессанта, и она демонстрирует активность по ингибированию передачи сигналов посредством CD3.

[0465] Без ограничения какой-либо теорией согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения биспецифичная антигенсвязывающая конструкция связывается с мишенью на мишень-положительной клетке и связывается с первым антигеном (который может быть отличным от CD3) на первой клетке, и таким образом приводит мишень-положительную клетку в непосредственную близость с первой клеткой. Например, CD3+ клетку можно привести в непосредственную близость с раковой клеткой и можно стимулировать иммунный ответ против данной раковой клетки.

[0466] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения миниантитело можно конъюгировать с терапевтическим средством для лечения CD3-зависимого нарушения.

[0467] Субъект может страдать от любого количества CD3-зависимых нарушений, которые, например, могут представлять собой ревматоидный артрит, множественный склероз, диабет 1 типа или красную волчанку.

[0468] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антигенсвязывающая конструкция, описанная в настоящем документе, обеспечивает значительное снижение нежелательных побочных эффектов, включая, без ограничения, высвобождение провоспалительных цитокинов, активацию Т-клеток и/или пролиферацию клеток.

[0469] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложен способ лечения, посредством которого субъект может получить пользу от применения CD3-направленных антигенсвязывающих конструкций, но вместо полноразмерной конструкции вводят миниантитело, что приводит к меньшей стимуляции активации иммунных клеток после связывания антигенсвязывающей конструкции с CD3 in vivo.

[0470] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения количество миниантитела в фармацевтической композиции является большим, чем количество, которое можно в противном случае ввести в случае полноразмерной конструкции (например, полноразмерного OKT3). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения введенное количество вызовет цитокиновый шторм у субъекта, если количество было введено в форме полноразмерной конструкции. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения количество, которое можно вводить, не вызывая цитокинового шторма или синдрома высвобождения цитокинов (СВЦ), составляет по меньшей мере 10 микрограмм/м², например, по меньшей мере 10, 17, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, либо можно вводить по меньшей мере 1000 микрограмм/м² формата миниантитела. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения данное количество не приведет к синдрому высвобождения цитокинов. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения данное количество не приведет к синдрому высвобождения цитокинов 1 степени и/или 2 степени. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения данное количество не приведет к одному или нескольким из следующих симптомов: сыпь, головная боль, тошнота, рвота и/или дрожь/озноб/лихорадка. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения данные симптомы, которые в норме возникнут в день 1 или день 5, или 6 введения доз, если применяют полноразмерное антитело, не будут возникать при применении миниантитела.

[0471] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложен способ лечения индивидуума, который нуждается в блокирующей терапии CD3, причем индивидуум также подвержен риску развития и/или испытывает цитокиновый шторм. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения способ включает введение субъекту, подверженному риску возникновения цитокинового шторма, конструкции миниантитела полноразмерного антитела; однако формат миниантитела обеспечит снижение интенсивности какой-либо активации иммунных клеток, которая возникла бы в противном случае, если бы субъекту ввели полноразмерное антитело. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения миниантитело может содержать те же CDR (или аналогичные CDR) и/или те же вариабельные области тяжелой и легкой цепей (или аналогичные вариабельные области тяжелой и легкой цепей). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения введение миниантитела обеспечивает меньший уровень стимуляции активации иммунных клеток после связывания с CD3. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения введение миниантитела обеспечивает снижение уровня высвобождения цитокинов после связывания с CD3. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения введение миниантитела обеспечивает меньшие количества активации, возникающей после связывания с CD3, чем при применении полноразмерной конструкции.

[0472] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения терапию CD3 можно вводить без введения противодействующей терапии, где противодействующая терапия будет разработана для снижения или блокировки цитокинового шторма. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения данный подход включает введение субъекту антигенсвязывающей конструкции миниантитела вместо полноразмерной конструкции.

[0473] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложен способ снижения интенсивности и/или вероятности цитокинового шторма, причем указанный способ может включать идентификацию субъекта, который должен получать антигенсвязывающую конструкцию, которая должна связаться с CD3, и введение субъекту эффективного количества миниантитела, которое связывается с CD3. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения конструкция представляет собой одну или более из таковых, описанных в настоящем документе.

[0474] Как описано в настоящем документе, способность к снижению и/или предотвращению цитокинового шторма (или другой аспект, такой как снижение активации и/или пролиферации) может в особенности относиться к антигеневязывающим конструкциям, которые связываются с CD3. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения процесс (например, с применением формата миниантитела) для предотвращения таких проблем можно применять для других белков-мишеней, например, любого белка-мишени, для которого связывание антитела с мишенью приводит к цитокиновому шторму или активации/пролиферации. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения способ можно применять для обеспечения предотвращения несоответствующей и/или пагубной активации у субъекта, у которого активация возникает в ответ на бивалентный антигенсвязывающий белок. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вместо антигенсвязывающего белка против CD3 можно применять антигенсвязывающий белок против CD28 (например, миниантитело), который связывается с CD28).

[0475] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения применение миниантитела против CD3 обеспечивает субъекту получение надлежащих уровней антигенсвязывающей конструкции для обеспечения лечения CD3-зависимого нарушения. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения субъект может получать CD3-связывающие молекулы без дополнительной и/или последующей необходимости получать инъекции инсулина. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения применение конструкции миниантитела против CD3 обеспечивает ослабление запускаемого CD3 ответа без разрушения слишком большого количества В-клеток в процессе. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения активация/пролиферация, которая уменьшена, включает активацию и/или пролиферацию Т-клеток и/или клеток-природных киллеров (Natural Killer, NK).

[0476] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения введелие антигенсвязывающей конструкции субъекту, который нуждается, включает введение эффективного количества антигенсвязывающей конструкции против CD3, причем указанная антигенсвязывающая конструкция связывается с CD3, но не приводит к значительному повышению уровня по меньшей мере одного последствия из: высвобождения цитокинов, активации или пролиферации.

[0477] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложен способ введения терапевтического средства, которое связывается с CD3 на иммунной клетке. Способ включает введение антигенсвязывающей конструкции, описанной в настоящем изобретении (например, любого из миниантител против CD3), субъекту, который нуждается в снижении количества CD3. Антигенсвязывающая конструкция связывается с CD3; однако, как подтверждают данные, представленные в настоящем изобретении, антигенсвязывающая конструкция не приводит к значительному повышению уровня по меньшей мере одного последствия из: высвобождения цитокинов, активации или пролиферации. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения снижение уровня CD3 означает снижение количества свободного доступного белка CD3. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения снижение уровня CD3 означает снижение уровня клеток, экспрессирующих белок CD3.

[0478] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения конструкция не приводит к цитокиновому шторму на уровне, который будет неприемлемо пагубным для субъекта.

[0479] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложен способ лечения субъекта, страдающего от CD3-зависимого нарушения. Способ включает введение субъекту эффективного количества антигенсвязывающей конструкции. Антигенсвязывающая конструкция представляет собой миниантитело, которое связывается с CD3. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антигенсвязывающая конструкция конъюгирована с терапевтическим средством. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антигенсвязывающая конструкция содержит бивалентную структуру, содержащую первый участок связывания и второй участок связывания, причем первый участок связывания связывается с CD3, и причем второй участок связывания связывается с CD3. Эффективное количество представляет собой молярное количество, которое, если бы антигенсвязывающая конструкция была введена в другом формате - в частности, в формате полного антитела (например, OKT3), молярное количество вызвало бы цитокиновый шторм, интенсивность которого привела бы к неприемлемости применения указанного формата для терапевтических целей. Однако когда антигенсвязывающая конструкция представляет собой миниантитело, такое же молярное количество все еще является эффективным для терапии на основе CD3, но не вызывает цитокинового шторма на неприемлемых уровнях.

[0480] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, поскольку конструкции согласно настоящему изобретению можно применять для вариантов терапии, даже если данные конструкции являются бивалентными и связываются с CD3, можно применять терапевтические конструкции антигенсвязывающих конструкций против CD3. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложена антигенсвязывающая конструкция, которая связывается с CD3 in vivo, но не приводит к значительному уровню по меньшей мере одного последствия из: высвобождения цитокинов, активации или пролиферации.

[0481] Термин «CD3-зависимое нарушение» включает ревматоидный артрит, множественный склероз, диабет 1 типа, красную волчанку, воспалительное заболевание кишечника, диабет, отторжение трансплантата органа, аутоиммунные заболевания, аллергии и другие нарушения, при которых роль в патологии играют Т-клетки и/или природные киллеры (NK).

[0482] «Цитокиновый шторм», также известный как «цитокиновый каскад» или «гиперцитокинемия», представляет собой потенциально смертельную иммунную реакцию, которая включает в себя петлю положительной обратной связи между цитокинами и иммунными клетками, с в высокой степени повышенными уровнями различных цитокинов. Симптомы цитокинового шторма представляют собой высокую лихорадку, отек и покраснение, чрезмерную усталость и тошноту. В некоторых случаях иммунная реакция может быть смертельной. Как правило, некоторый уровень высвобождения цитокинов является приемлемым и необходимым, например, при борьбе с инфекцией. Когда субъект испытывает лихорадку и озноб, связанные с простудой, такие симптомы являются результатом борьбы иммунной системы с вирусом, и вследствие этого такие уровни являются приемлемыми и не являются «цитокиновым штормом». Однако когда плечо активации сверхстимулировано и не сбалансировано ингибиторными сигналами, данные цитокины могут привести к повреждению органа и ткани и, в конечном итоге, к смерти. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения конструкции, описанные в настоящем документе, могут быть подходящими для предотвращения и/или минимизации синдрома высвобождения цитокинов и, таким образом, данные конструкции можно применять в ситуациях, в которых в противном случае можно применять полноразмерные антитела против Т-клеток. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения любые из способов, описанных в настоящем документе, направленных на цитокиновые штормы, можно также применять в отношении синдрома высвобождения цитокинов.

[0483] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения субъект страдает от воспалительного и/или аутоиммунного состояния. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения состояние выбирают из по меньшей мере одного состояния из ревматоидного артрита, множественного склероза, диабета 1 типа или красной волчанки.

[0484] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения цитокины являются таковыми, которые вовлечены в цитокиновые штормы, вызванные введением полноразмерного антитела OKT3. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения цитокины включают по меньшей мере один из ИФНγ, ИЛ-2, ФНО-α или ИЛ-17.

[0485] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложено миниантитело, которое связывается с CD3. Миниантитело содержит полипептид, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv), который связывается с CD3, причем scFv содержит вариабельный домен тяжелой цепи (V_H), соединенный с вариабельным доменом легкой цепи (V_L); и вариант шарнирной области, содержащий по меньшей мере три цистеина на каждой цепи шарнира. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения миниантитело дополнительно содержит последовательность C_H3 IgG человека. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения миниантитело дополнительно содержит поддающийся обнаружению маркер, который выбран из группы, состоящей из радиоактивного вещества, красителя, контрастного вещества, флуоресцентного соединения, биолюминесцентного соединения, фермента, усиливающего средства и наночастицы.

[0486] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложена нуклеиновая кислота, кодирующая антитело согласно любому из вариантов реализации, описанных в настоящем документе. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложена линия клеток, продуцирующая любой из вариантов реализации миниантитела, описанных в настоящем документе. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложен набор, содержащий любой из вариантов реализации миниантитела, описанных в настоящем документе, и поддающийся обнаружению маркер.

[0487] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложен способ обнаружения присутствия или отсутствия CD3. Способ включает: применение любого из вариантов реализации миниантитела, описанных в настоящем документе, в отношении образца; и обнаружение связывания или отсутствия связывания антигенсвязывающей конструкции с CD3. Согласно некоторым вариантам реализации способа миниантитело содержит поддающийся обнаружению маркер, который выбран из группы, состоящей из радиоактивного вещества, красителя, контрастного вещества, флуоресцентного соединения, биолюминесцентного соединения, фермента, усиливающего средства и наночастицы. Согласно некоторым вариантам реализации способа применение миниантитела включает введение миниантитела субъекту. Согласно некоторым вариантам реализации способа обнаружение связывания или отсутствия связывания миниантитела с антигеном-мишенью включает позитронно-эмиссионную томографию. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения способ также включает применение вторичного антитела или его фрагмента в отношении образца, причем вторичное антитело или его фрагмент специфично связывается с миниантителом. Согласно некоторым вариантам реализации способа миниантитело инкубируют с образцом в течение не более 1 часа.

[0488] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложен способ нацеливания терапевтического средства на CD3. Способ включает введение субъекту любого из вариантов реализации миниантитела, описанных в настоящем документе, причем миниантитело конъюгировано с терапевтическим средством.

[0489] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложен способ нацеливания на клетку Т-лимфоцит, экспрессирующую CD3, у субъекта, который нуждается в таком нацеливании. Способ включает введение субъекту миниантитела согласно любому из вариантов реализации, описанных в настоящем документе. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложен способ нейтрализации клетки Т-лимфоцита, экспрессирующей CD3. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения субъект содержит по меньшей мере одну из следующих клеток: CD3 Т-клетки с подавленным иммунитетом, CD3 Т-клетки с нарушенной функцией, аутореактивные CD3 Т-клетки, сверхреактивные CD3 Т-клетки, ингибиторные CD3 Т-клетки, CD3 Т-клетки с нарушенной локализацией или CD3 Т-клеточную лимфому. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения субъект содержит CD3 Т-клетки, связанные по меньшей мере с одним заболеванием из ревматоидного артрита, множественного склероза, диабета, системной красной волчанки, аутоиммунного, воспалительного состояния, дефекта передачи сигналов или костимуляторного дефекта.

[0490] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложено антитело, которое связывается с CD3. Антитело содержит шарнирную область, причем шарнирная область содержит по меньшей мере одну последовательность из следующих: а) пептидную последовательность согласно SEQ ID NO: 1 (X_n1CX_n2X_n3CX_n4X_n5C), где X_n1 может представлять собой любую аминокислоту, которая не образует ковалентной перекрестно-сшивающей связи, где X_n2 представляет собой одну аминокислоту из: A, R, N, D, Е, Q, G, Н, I, L, K, М, F, Р, S, Т, W, Y или V, где X_n3 может представлять собой любую аминокислоту, где X_n4 может представлять собой любую аминокислоту, и где X_n5 может представлять собой любую аминокислоту; b) пептидную последовательность согласно SEQ ID NO: 2 (X_n1X_n2X_n3X_n4X_n5X_n6CX_n7X_n8CX_n9X_n10C), где X_n1 может представлять собой любую аминокислоту, которая не образует ковалентной перекрестно-сшивающей связи с другой идентичной аминокислотой, где X_n2 может представлять собой любую аминокислоту, где X_n3 может представлять собой любую аминокислоту, где X_n4 может представлять собой любую аминокислоту, где X_n5 может представлять собой любую аминокислоту, где X_n6 может представлять собой любую аминокислоту, где X_n7 может представлять собой любую аминокислоту, где X_n8 может представлять собой любую аминокислоту, где X_n9 может представлять собой любую аминокислоту, и где X_n10 может представлять собой любую аминокислоту (SEQ ID NO: 208); с) центральную шарнирную последовательность, имеющую по меньшей мере одной последовательность из: CVECPPCP (SEQ ID NO: 57), СРРСРРС (SEQ ID NO: 52) или CPPCPPCPPC (SEQ ID NO: 54), присоединенную к верхней шарнирной последовательность согласно ELKTPLGDTTHT (SEQ ID NO: 48); или d) верхнюю шарнирную область, которая не содержит аминокислот, способных к перекрестному сшиванию с соответствующей аминокислотой, и центральную шарнирную область, присоединенную к С-концу верхней шарнирной области, причем центральная шарнирная область содержит по меньшей мере три цистеина. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитело представляет собой полноразмерное антитело. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитело представляет собой миниантитело. Согласно некоторым вариантам реализации антитела помимо шарнирной области антитело содержит гуманизированную аминокислотную последовательность.

[0491] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитело содержит: HCDR1 согласно HCDR1 в таблице 3, SEQ ID NO: 174; HCDR2 согласно HCDR2 в таблице 3, SEQ ID NO: 175; HCDR3 согласно HCDR3 в таблице 3, SEQ ID NO: 176; LCDR1 согласно LCDR1 в таблице 3, SEQ ID NO: 177; LCDR2 согласно LCDR2 в таблице 3, SEQ ID NO: 97; и LCDR3 согласно LCDR3 в таблице 3, SEQ ID NO: 178, для CD3.

[0492] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитело содержит: HCDR1 согласно HCDR1 на ФИГ. 65В или 65С; HCDR2 согласно HCDR2 на ФИГ. 65В или 65С; HCDR3 согласно HCDR3 на ФИГ. 65В или 65С; LCDR1 согласно LCDR1 на ФИГ. 65В или 65С; LCDR2 согласно LCDR2 на ФИГ. 65В или 65С; и LCDR3 согласно LCDR3 на ФИГ. 65В или 65С.

[0493] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антигенсвязывающие конструкции, которые связываются с антигеном CD3, могут представлять собой антитела, миниантитела и/или другие фрагменты антител, такие как scFv. Некоторые неограничивающие варианты реализации антигенсвязывающих конструкций против CD3 представлены на ФИГ. 65В и 65С.

[0494] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения миниантитело содержит: HCDR1 согласно HCDR1 на ФИГ. 65В или 65С; HCDR2 согласно HCDR2 на ФИГ. 65В или 65С; HCDR3 согласно HCDR3 на ФИГ. 65В или 65С; LCDR1 согласно LCDR1 на ФИГ. 65В или 65С; LCDR2 согласно LCDR2 на ФИГ. 65В или 65С; и LCDR3 согласно LCDR3 на ФИГ. 65В или 65С. Согласно некоторым вариантам реализации миниантитела, описанного в настоящем документе, вариабельный домен тяжелой цепи (V_H) и вариабельный домен легкой цепи (V_L) представляют собой последовательности человека.

[0495] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложена нуклеиновая кислота, кодирующая шарнирную область любого из вариантов реализации антитела, описанных в настоящем документе. Согласно некоторым вариантам реализации нуклеиновой кислоты помимо последовательности, кодирующей шарнирную область, нуклеиновая кислота содержит последовательность человека. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложена линия клеток, экспрессирующих антитело, кодируемое нуклеиновой кислотой.

[0496] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложен способ получения антитела согласно любому из вариантов реализации, описанных в настоящем документе. Способ включает экспрессию антитела в линии клеток.

[0497] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложен способ лечения состояния у субъекта, который нуждается в таком лечении, причем указанный способ включает введение субъекту антитела согласно любому из вариантов реализации, описанных в настоящем документе.

Дополнительные варианты реализации

[0498] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения scFv или миниантитело обладают превосходящими фармакокинетическими свойствами для диагностической визуализации. В применяемой на сегодняшний день технологии используют визуализацию с помощью полноразмерных антител, для которой часто требуется более длительное время (~7-8 дней после инъекции) для получения высококонтрастных изображений в связи с медленным клиренсом полноразмерных антител в сыворотке. Миниантитело обеспечивает возможность визуализации в тот же день или на следующий день. Каждый день является жизненно важным для пациентов с агрессивно прогрессирующим заболеванием, и возможность идентифицировать надлежащий терапевтический подход в более раннюю временную точку способна улучшить выживаемость пациента. Визуализация в тот же день или на следующий день также обеспечивает решение логистической проблемы, с которой сталкивается множество пациентов, которые преодолевают большие расстояния для получения лечения/диагностики, поскольку длительное пребывание в поездке или необходимость вернуться через неделю будет отсутствовать при визуализации с применением миниантител по сравнению с полноразмерными антителами. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения воздействие более низких доз облучения обеспечивает визуализацию, проводимую несколько раз, и отслеживание прогрессирования заболевания в течение времени.

[0499] Помимо этого согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения компоненты-мономеры миниантитела содержат в шарнире остатки цистеина, которые образуют дисульфидные связи. Данные ковалентно связанные остатки цистеина можно открыть посредством мягкого химического восстановления для обеспечения активных тиольных групп для цистеин-специфичной конъюгации при сохранении целостности димерной молекулы миниантитела. Применяемые на сегодняшний день способы химической конъюгации включают следующие сайт-специфичные платформы: введение цистеина в F(ab)'2-область антитела, например, Thio-Mabs (Roche); цистеин в положении 239 в Fc (DISH-Mab, Seattle Genetics), неприродные аминокислоты, такие как кето-фенилаланин (Ambrx) для образования алкоксиаминового линкера, фенилаланиназидометан (Sutro) для клик-циклоприсоединения, глутамин в Fc-области для трансглутаминаза-зависимой конъюгации (Rinat-Pfizer). Цистеины шарнира в МАТ обеспечивают химическую основу для сайт-неспецифичной тиольной конъюгации. Конъюгация с лизинами также является сайт-неспецифичной или случайной и приводит к наивысшей степени гетерогенности. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения можно ввести сайт-специфичный цистеин в scFv, каркасный участок или другую часть антигенсвязывающей конструкции, описанной в настоящем изобретении.

[0500] Способность визуализации всего тела пациента для определения присутствия мишени антитела до и в течение лечения обеспечивает ценную информацию для персонализированного ведения пациента. В течение исследования безопасности и эффективности терапии антителом полезно иметь возможность выбрать и исследовать лечение на пациентах, у которых экспрессируется мишень антитела как часть прогрессирования их заболевания.

[0501] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения scFv или диагностические фрагменты миниантитела, соответствующие доступным вариантам терапии антителом, обеспечивают соответствие состояния заболевания пациента подходящей терапии антителом.

[0502] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложен способ нацеливания первого антигена на клетку, положительную в отношении молекулы-мишени. Способ может включать применение биспецифичной антигенсвязывающей конструкции в отношении образца. Биспецифичная антигенсвязывающая конструкция может содержать антигенсвязывающую конструкцию, описанную в настоящем документе. Биспецифичное антитело или его фрагмент может содержать антигенсвязывающую конструкцию, которая связывается с первым антигеном, например, 1, 2, 3, 4, 5 или 6 CDR, scFv или мономер миниантитела. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения биспецифичное антитело содержит 1, 2 или 3 HCDR антигенсвязывающей конструкции, описанной в настоящем документе, и/или 1, 2 или 3 LCDR антигенсвязывающей конструкции, описанной в настоящем документе. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения биспецифичная антигенсвязывающая конструкция содержит scFv антигенсвязывающей конструкции, описанной в настоящем документе. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения биспецифичная антигенсвязывающая конструкция содержит последовательность V_H или V_L, описанную в настоящем документе. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения биспецифичная антигенсвязывающая конструкция содержит мономер миниантитела, описанного в настоящем документе. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения биспецифичную антигенсвязывающую конструкцию применяют в отношении образца in vivo, например, органа или ткани субъекта. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения биспецифичную антигенсвязывающую конструкцию применяют в отношении образца in vitro. Без ограничения какой-либо теорией согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения биспецифичная антигенсвязывающая конструкция связывается с мишенью на мишень-положительной клетке и связывается с первым антигеном (который может быть отличным от первой молекулы-мишени) на первой клетке, и таким образом приводит мишень-положительную клетку в непосредственную близость с первой клеткой. Например, первую клетку, положительную в отношении молекулы-мишени, можно привести в непосредственную близость с раковой клеткой, и она может стимулировать иммунный ответ против данной раковой клетки. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения биспецифичная антигенсвязывающая конструкция содержит фрагмент первой молекулы-мишени и второй молекулы-мишени, которые могут привести цитотоксичную Т-клетку в непосредственную близость с активированной иммунной клеткой, экспрессирующей первую молекулу-мишень, или с опухолевой клеткой, экспрессирующей первую молекулу-мишень, чтобы привести к уничтожению клетки-мишени. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения можно нацеливаться на любые иммунные клетки (NK или В-клетку, или дендритную клетку) и соединить их с антиген-экспрессирующей клеткой, как определено специфичностью второго scFv.

[0503] Конструкции миниантитела содержат антигенсвязывающие scFv с варьирующими длинами линкера, которые могут находиться в V_L-V_H или V_H-V_L ориентации. scFv могут быть присоединены к любой из 12 последовательностей шарнира, описанных в таблице 1. scFv и соответствующие шарниры могут быть связаны с доменами C_H3 из антител IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первый цистеин шарнира, который обычно образует пару с легкой цепью в нативных антителах IgG1, IgG2 и IgG3, должен быть мутирован на серии или аланин или другую соответствующую аминокислоту для предотвращения перестановок дисульфидов и/или конкатемеризации. Для снижения присутствия или снижения образования полумолекул и усиления стабильности in vivo шарнирная область должна содержать по меньшей мере три цистеина для образования по меньшей мере трех дисульфидных связей с другим мономером. Три цистеина на цепь в шарнире, расположенные на соответствующих расстояниях друг от друга, являются подходящими для обеспечения надлежащего образования дисульфидных связей (таблица 7). Три дисульфидные связи в шарнире в миниантителе, расположенные на соответствующих расстояниях друг от друга, являются подходящими для стабильности белка in vivo и клиренса через печень вместо почечного клиренса. По меньшей мере три дисульфида (или более) в шарнире являются благоприятными для сайт-специфичной конъюгации лекарственных средств, хелаторов или флуоресцентных красителей. МА, сконструированные, как описано выше, сохраняли аналогичную аффинность родительских антител. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, включающим конструкцию IgG1, первый цистеин можно оставить интактным, и его не считают слишком пагубным.

[0504] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения шарнир миниантитела или биспецифичного миниантитела, содержащий верхний шарнир, центральный шарнир и нижний шарнир, можно получить посредством объединения последовательностей любого верхнего шарнира, любого центрального шарнира и любого нижнего шарнира, представленных в таблице 7.

[0505] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первый остаток цистеина в шарнире можно заменить любой аминокислотой. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения один остаток цистеина в верхнем шарнире можно заменить любой аминокислотой. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения один остаток цистеина в центральном шарнире можно заменить любой аминокислотой. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения два остатка цистеина в центральном шарнире можно заменить любой аминокислотой. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения один остаток цистеина в верхнем шарнире и один остаток цистеина в центральном шарнире можно заменить любой аминокислотой. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения один цистеин в верхнем шарнире и два остатка цистеина в центральном шарнире можно заменить любой аминокислотой.

[0506] Последовательности конструкций для примеров обсуждаются в разделе примеров ниже как соответствующие, а также представлены в таблице 2.

ПРИМЕР 1 - СТРУКТУРА МИНИАНТИТЕЛА

[0507] Миниантитело представляет собой бивалентный ковалентно связанный гомодимер молекулярной массой ~80 кДа. Каждый мономер (полумолекула) состоит из вариабельного домена тяжелой цепи (V_H), присоединенного к соответствующему вариабельному домену легкой цепи (V_L) посредством линкерной последовательности, обогащенной Gly-Ser, размером приблизительно 15-18 аминокислот. Каждый одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv) присоединен к домену C_H3 IgG человека последовательностью шарнира.

[0508] Последовательности, содержащие дисульфидные связи шарнира, являются важными и были разработаны для предотвращения нежелательных перестановок дисульфидов с остатками цистеина, присутствующими в других областях белка, а также содержат достаточные количества пар цистеинов для поддержания целостности димера in vivo, а также в качестве возможного участка для сайт-специфичной конъюгации.

[0509] На сегодняшний день большинство миниантител было сконструировано с применением нативных верхней и центральной шарнирных областей IgG1 человека с удлиняющей последовательностью, присоединенной к домену C_H3 IgG1 человека, как показано на ФИГ. 1. Как показано в следующих примерах, варианты scFv с обеими ориентациями - V_L-V_H (M1) и V_H-V_L (М2) - часто оценивали в отношении различных молекул-мишеней.

Конструирование на основе IgG1 человека

[0510] В предшествующих шарнирах (например, ЕН1 γ1) первый цистеин в шарнире (ФИГ. 2 сверху) создавал проблемы, которые приводили к гетерогенности белка, как продемонстрировано результатами анализа интактной массы с применением ЖХ/МС. Несмотря на очевидную важность цистеинов в шарнирной области, было принято решение мутировать данный цистеин на серии с получением шарнира ЕН2 γ1 (ФИГ. 2 снизу). Однако было определено, что данная конструкция шарнира не обеспечивает определенных требуемых аспектов, поскольку оказалось, что двух дисульфидных связей, которые образовались между двумя оставшимися остатками цистеина в центральном шарнире (ФИГ. 2 снизу), было недостаточно для поддержания стабильности димера in vivo.

MA IgG2 для преодоления проблем с последовательностью шарнира IgG1

[0511] Для решения новых аспектов, представленных выше, дополнительно конструировали миниантитела. Сконструированные миниантитела на основе huIgG2 с удлиняющей последовательностью обеспечивали третий цистеин в центральном шарнире (дополнительный цистеин в нативном центральном шарнире IgG1) для увеличения уровня образования дисульфидных связей и увеличения стабильности белка. Миниантитела на основе huIgG2, IAB2M и IAB22M конструировали с применением последовательности шарнира IgG2 человека (huIgG2), присоединенной к домену IgG2 huCH3.

[0512] При объединении последовательностей верхнего и центрального шарнира нативного IgG2 с удлиняющей последовательностью в качестве нижнего шарнира (ЕН1 γ2) наблюдалось увеличение агрегации. Реактивный цистеин (ФИГ. 3 сверху; первый цистеин шарнира) отвечал за образование конкатемеров в формате IAB2M-ЕН1 γ2 с нативным шарниром huIgG2 (ФИГ. 3 сверху), что наблюдали в результате анализа методом ДСН-ПААГ, как представлено на ФИГ. 5А.

[0513] Таким образом, аналогично тому, что было сделано в отношении шарнира IgG1 (ЕН1 γ1), первый цистеин в шарнире (который образует пару с легкой цепью) мутировали на серии с получением ЕН2 IgG2 (ЕН2 γ2) (ФИГ. 3 снизу). Антигенсвязывающие конструкции с данным шарниром (ЕН2 γ2) хорошо экспрессировались и характеризовались хорошей стабильностью in vivo. Все три дисульфидные связи в центральном шарнире были образованы надлежащим образом, что было подтверждено методом масс-спектрометрии. Для конструкций IAB2M и IAB22M с ЕН2 γ2 была продемонстрирована стабильность.

[0514] Оценивали дополнительные сконструированные миниантитела huIgG2 с первым цистеином, измененным на серии, и нативной последовательностью верхнего и нижнего шарнира (NH2 γ2); было установлено, что белки являются стабильными in vivo (ФИГ. 4 снизу).

ПРИМЕР 2 - ДАННЫЕ ДЛЯ IAB2M IN VITRO

[0515] В таблице 5 представлен обзор вариантов IAB2M (SEQ ID NO представлены на ФИГ. 5В-5Е). Дополнительные варианты реализации вариантов IAB2M представлены на ФИГ. 47-53.

[0516] Анализ IAB2M с вариантами шарнира ЕН1 γ1, ЕН2 γ1 и ЕН1 γ2 и ЕН2 γ2 методом ДСН-ПААГ (ФИГ. 5А) продемонстрировал, что соотношения полумолекулы к димеру являлись в высокой степени улучшенными (уровень полумолекул можно снизить с 20-30% до менее 1%) при мутации первого цистеина шарнира в вариантах ЕН2. Версия ЕН2 γ2 характеризовалась надлежащим образованием дисульфидной связи и отсутствием конкатемеров по сравнению с ЕН1 γ2 (SEQ ID NO. на ФИГ. 5В-5Е). В связи с присутствием дополнительного цистеина в центральном шарнире (3 вместо 2) вариант шарнира ЕН2 γ2 продемонстрировал улучшенную стабильность и содержал меньше полумолекул по сравнению с вариантом шарнира ЕН2 γ1.

[0517] Подтверждение присутствия полумолекул проводили посредством анализа интактной массы. Образцы белка разделяли в условиях обращенной фазы с применением колонки TSKgel Phenyl-5PW (2×75 мм, Tosoh Biosciences) при температуре 60°С и анализировали на приборе Agilent ESI-QTOF, модель 6538. На ФИГ. 6А представлен анализ интактной массы варианта IAB2M ЕН1 γ1. Полные ионные хроматограммы разделенных полумолекулы и полноразмерной молекулы представлены на верхнем чертеже. Кривую при УФ280 (не показана) использовали для количественного определения процента полумолекул, присутствующих в варианте миниантитела, посредством интегрирования пиков. Деконволированные массы использовали для соотнесения и подтверждали идентичность полумолекул (средний чертеж) и полноразмерных масс (нижний чертеж). На ФИГ. 6В представлен анализ интактной массы варианта IAB2M ЕН1 γ2. На верхнем чертеже представлена полная ионная хроматограмма в условиях обращенной фазы. На среднем чертеже представлены деконволированные интактные массы, подтверждающие присутствие полумолекул, и на нижнем чертеже представлены полноразмерные молекулярные массы, которые были идентифицированы. На ФИГ. 6С представлен анализ интактной массы варианта IAB2M ЕН2 γ1. На верхнем чертеже представлена полная ионная хроматограмма в условиях обращенной фазы. На среднем чертеже представлены деконволированные интактные массы, подтверждающие присутствие полумолекул, и на нижнем чертеже представлены полноразмерные молекулярные массы, которые были идентифицированы. На ФИГ. 6D представлен анализ интактной массы варианта IAB2M ЕН2 γ2. На верхнем чертеже представлена полная ионная хроматограмма. На нижнем чертеже представлены деконволированные интактные массы, подтверждающие присутствие молекул с полноразмерной массой. Полумолекулы не были обнаружены.

[0518] Анализ вариантов IAB2M методом FAC (ФИГ. 7А и 7В) продемонстрировал, что замена шарнира по сравнению с ранее использованным стандартным шарниром, ЕН1 γ1, не влияет на аффинность связывания с антигеном-мишенью, экспрессированным на клетках LNCap-AR (ФИГ. 5В, 5С, 5D) или клетках С4-2 XCL (ФИГ. 5В, 5С, 5Е, 7С).

[0519] Образцы для дисульфидного картирования с целью понимания образования полумолекулы получали посредством денатурации белка с помощью 6 М гуанидина-HCl в Tris рН 7,5. Для этого добавляли 4-винилпиридин до концентрации 30 мМ с последующей инкубацией в течение 1 ч в темноте для кэпирования свободного цистеина. Раствор разводили для доведения концентрации гуанидина до 1 М с последующим расщеплением с применением трипсина/Lys-C. Расщепление оставляли осуществляться в течение ночи при температуре 37°С. Образцы замораживали и полностью высушивали перед разделением. Затем проводили анализ методом ЖХ/МС, в котором смесь пептидов разделяли в 0,05% водной ТФК (трифторуксусной кислоте) в градиенте 0,05% ТФК в 90% ацетонитриле с применением градиента на колонке Waters Xbridge ВЕН130 С18 4,6×150 мм, и массы идентифицировали с применением масс-спектрометра ESI-QTOT 6538 (Agilent) в режиме определения положительных ионов и деконволировали с применением программного обеспечения Agilent Mass Hunter. Содержащие дисульфид пептиды, идентифицированные в димере IAB2M ЕН1 γ1, представлены на ФИГ. 8.

[0520] Дисульфидное картирование IAB2M ЕН1 γ1 продемонстрировало присутствие надлежащим образом образованных, например, ожидаемых дисульфидов в шарнирной области, а также обнаружило перестановки дисульфидов. На ФИГ. 8 представлена таблица идентифицированных дисульфидов, а на ФИГ. 9 представлена иллюстрация результатов. Дисульфиды (ФИГ. 8) образовались между ожидаемыми остатками цистеина (цистеинами SEQ ID NO: 183 и SEQ ID NO: 184; цистеинами SEQ ID NO: 183 и SEQ ID NO: 185; SEQ ID NO: 186) и между неожиданными остатками цистеина, присутствующими в других доменах белка. Было высказано предположение, что неспаренный цистеин в шарнире может вызвать перестановки дисульфидов, что препятствовало обычному образованию дисульфида (сплошные линии) (ФИГ. 9). Более того, дисульфиды V_H не наблюдались (пунктирные линии), предположительно, в связи с тем, что связанный дисульфидными связями триптический пептид не ионизировался (и вследствие этого не обнаруживался) в масс-спектрометре (ФИГ. 9).

[0521] Преобразование формата в ЕН1 huIgG2 (ЕН1 γ2) не улучшило стабильность IAB2M. На ФИГ. 10 приведено графическое представление идентифицированных дисульфидов. Значительная степень образования конкатемеров была установлена для ЕН1 γ2 методом ДСН-ПААГ (ФИГ. 5А). Как в случае IAB2M ЕН1 γ1, дисульфиды V_H не наблюдались (пунктирные линии), предположительно, в связи с тем, что связанный дисульфидными связями триптический пептид эффективно не ионизировался и вследствие этого не обнаруживался в масс-спектрометре. IAB2M ЕН1 γ2 (ФИГ. 5D) продемонстрировал >10% полумолекул (39469,5 Да методом ЖХ/МС) (ФИГ. 10 и ФИГ. 6В). Доминантная полумолекула (пик 1) наблюдалась на хроматограммах, как показано на чертеже (А) и (В) на ФИГ. 10. На ФИГ. 6А (верхний чертеж) представлена хроматограмма суммарного ионного тока (СИТ) IAB2M ЕН1 γ1, где пики 1 и 2 представляют собой полумолекулу и полноразмерную молекулу, соответственно. На ФИГ. 6А, средний чертеж представлен канал УФ280 с интегрировавнием пиков, позволяющим определить процент полумолекул, 11,1%. На ФИГ. 6А (нижний чертеж) представлены молекулярные массы, содержащие пик 2.

ПРИМЕР 3 - ДАННЫЕ ДЛЯ IAB2M IN VIVO

[0522] Проводили анализ ПЭТ/КТ и биораспределения ⁸⁹Zr-Df-IAB2M-EHl γ1 (ФИГ. 5В) у бестимусных мышей. Изображения ПМИ (проекции максимальной интенсивности) ПЭТ/КТ бестимусной мыши, несущей на правом плече ПСМА-положительный ксенотрансплантат 22Rv1, после введения ⁸⁹Zr-Df-IAB2M-γ1-EH1 в моменты времени 24 ч и 48 ч, представлены на ФИГ. 11А. Средние уровни радиоактивного поглощения в тканях от 3 мышей в момент времени 48 ч представлены в виде процента инъецированной дозы на грамм (ИД/г) (ФИГ. 11В). Уровень поглощения опухолью являлся относительно низким (6,1±1,2% ИД/г), и уровень поглощения почками являлся высоким (23,3±6,2% ИД/г); почти в 2 раза большим, чем поглощение печенью (14,1±1,6% ИД/г). Если бы миниантитело оставалось в форме димера in vivo, тогда можно было бы ожидать, что клиренс белка будет осуществляться через печень. Сигналы от почек, которые превышают сигналы от печени, свидетельствуют о нестабильности и об образовании полумолекул in vivo.

[0523] Проводили анализ ПЭТ/КТ и биораспределения ⁸⁹Zr-Df-IAB2M-EH2 γ1 (ФИГ. 5С) у бестимусных мышей. Изображения ПМИ ПЭТ/КТ бестимусной мыши, несущей на правом плече ПСМА-положительный ксенотрансплантат 22Rv1, после введения ⁸⁹Zr-Df-IAB2M-EH2 γ1 в моменты времени 24 ч и 47 ч представлены на ФИГ. 12А. Радиоактивные поглощения в тканях от 2 мышей в момент времени 47 ч представлены в виде процента инъецированной дозы на грамм (ИД/г) (ФИГ. 12В). В почках вновь наблюдалось в 2-3 раза большее радиоактивное поглощение. Как указано выше, сигналы от почек, которые превышают сигналы от печени, свидетельствуют о нестабильности и образовании полумолекул in vivo.

[0524] Проводили анализ ПЭТ/КТ и биораспределения ⁸⁹Zr-Df-IAB2M-EH2 γ2 (ФИГ. 5D) у бестимусных мышей. Изображения ПМИ ПЭТ/КТ бестимусной мыши, несущей на правом плече ПСМА-положительный ксенотрансплантат 22Rv1, после введения ⁸⁹Zr-Df-IAB2M-EH2 γ2 в моменты времени 24 ч и 47 ч представлены на ФИГ. 13А. Радиоактивные поглощения в тканях от 2 мышей в момент времени 47 ч представлены в виде процента инъецированной дозы на грамм (ИД/г) (ФИГ. 13В). Был получен низкий уровень поглощения почками наряду с соотношениями поглощения почками к поглощению печенью <1; это свидетельствует, что ЕН2 γ1 являлся стабильным белком.

ПРИМЕР 4 - КРАТКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ИССЛЕДОВАНИЙ LAB2M IN VIVO (ТАБЛИЦА 6)

[0525] Миниантитела, полученные с последовательностями шарнира, которые были получены из шарнирной области IgG1, продемонстрировали высокий уровень клиренса через почки, который свидетельствует о нестабильности белка и диссоциации на полумолекулы in vivo (ФИГ. 11).

[0526] Мутация первого цистеина шарнира на серии в шарнирной области IgG1 (ЕН2 γ1) (ФИГ. 5С) для предотвращения нежелательного взаимодействия с другим неспаренным цистеином позволила получить белок с лучшим профилем in vitro (например, данные ДСН-ПААГ на ФИГ. 5). Однако высокий уровень клиренса через почки свидетельствовал о нестабильности белка и диссоциации на полумолекулы in vivo (ФИГ. 12).

[0527] Миниантитела, сконструированные с шарниром IgG2, в котором первый цистеин шарнира был мутирован на серии (ЕН2 γ2 (ФИГ. 5D) и другие (таблица 7, представлена краткая характеристика шарнирных областей)), выводились через печень, как прогнозировали для белков молекулярной массой ~80 кДа; это свидетельствует, что молекула оставалась интактной in vivo (ФИГ. 13А и 13В). Результаты также представлены в таблице 6.

ПРИМЕР 5 - ДАННЫЕ ДЛЯ МИНИАНТИТЕЛ IAB22M IGG2 IN VITRO

[0528] Анализ интактной массы (ФИГ. 14А) варианта IAB22M-EH1 γ2 (ФИГ. 14В) проводили методом масс-спектрометрии. IAB22M с шарниром ЕН1 γ2 содержал потенциальный неспаренный первый цистеин шарнира, который приводил к получению ~9,2% полумолекул (ФИГ. 20В). Для анализа интактной массы образцы IAB22M ЕН1 γ2 разделяли на колонке для обращенно-фазовой хроматографии (TSKgel Phenyl-5PW (Tosoh, 2×75 мм) при температуре 60°С и анализировали с помощью масс-спектрометра Agilent ESI-QTOF. На ФИГ. 14А на верхнем чертеже представлены полные ионные хроматограммы разделенной полумолекулы и полноразмерной молекулы. Кривую при УФ280 (не показана) использовали для количественного определения процента полумолекул, присутствующих в варианте миниантитела, посредством интегрирования пиков. Деконволированные массы использовали для соотнесения и подтверждали идентичности полумолекул (средний чертеж) и полноразмерных масс (нижний чертеж).

[0529] Однако анализ интактной массы (ФИГ. 15А) варианта IAB22M1-EH2 γ2 (ФИГ. 15В) с первым цистеином в шарнире IgG2, мутированным на серии, продемонстрировал более 99% интактного димерного белка с ЕН2 γ2 (теоретическая ММ (молекулярная масса) = 79051,2; полученная ММ 79052). Для анализа интактной массы IAB22M1 ЕН2 γ2 образец белка анализировали методом ЖХ/МС с применением следующего оборудования: системы Waters Synapt G2 HDMS, оснащенной источником наноИЭР (ионизации наноэлектроспреем) Trizaic в сочетании с колонкой Waters nanoAcquity UPLC. Белок разделяли с применением колонки с обращенной фазой С4 nanotile (внутренний диаметр 150 мкм × 50 мм, Waters) при скорости потока 3 мкл/мин. с 0,1% муравьиной кислотой в воде и 0,1% муравьиной кислотой в ацетонитриле в качестве подвижных фаз. На ФИГ. 15А, верхний чертеж представлено сканирование в полном диапазоне, демонстрирующее единичную доминантную молекулярную массу полноразмерного миниантитела. На ФИГ. 15А, средний чертеж представлена увеличенная область димеров, например, полноразмерного белка. На ФИГ. 15А, нижний чертеж представлена увеличенная область полумолекул. Полумолекулу обнаруживали, но ее относительная распространенность была на 3 порядка ниже, чем полноразмерного белка.

ПРИМЕР 6 - ДАННЫЕ ДЛЯ MA IAB22M IGG2 IN VIVO

[0530] Сравнение MA IAB22M с последовательностями шарнира, полученными из huIgG1 и huIgG2, проводили посредством ПЭТУКТ вариантов ⁸⁹Zr-Df-IAB22M. Изображения ИМИ ПЭТ/КТ мышей NOD-SCID, несущих на левом плече CD8-положительные ксенотрансплантаты HPB-ALL, после введения вариантов ⁸⁹Zr-Df-IAB22M-γ1-EH1 (ФИГ. 16В), -NH1 γ2 (ФИГ. 16С) и -ЕН2 γ2 (ФИГ. 15В) представлены на ФИГ. 16А. Варианты шарнира γ2 приводили к меньшему уровню поглощения почками.

[0531] MA IAB22M, полученное на основе шарнира huIgG1 (ЕН1 γ1) (ФИГ. 16В), быстро выводилось через почки с получением низкого уровня нацеливания на опухоль. MA IAB22M, полученные на основе вариантов шарнира huIgG2 или удлиненного шарнира (ЕН2 γ2) (ФИГ. 15В), или природного шарнира (NH1 γ2) (ФИГ. 16С), продемонстрировали большую стабильность in vivo с высоким уровнем нацеливания на опухоль и меньшим почечным клиренсом (ФИГ. 16А).

[0532] ПЭТ/КТ опухолей HPB-ALL проводили для ⁸⁹Zr-Df-IAB22M-EH1 γ1 (ФИГ. 16В). Серийные корональные изображения одной мыши с антиген-положительной опухолью HPB-ALL в моменты времени 4, 24 и 41 ч представлены на ФИГ. 17. Радиоактивное поглощение четко наблюдалось в опухоли в моменты времени 24 и 41 ч. Некоторая фоновая активность также наблюдалась в антиген-отрицательной опухоли Дауди. В брюшной области наблюдалась высокая фоновая активность, которая свидетельствует о нежелательном клиренсе через почки.

[0533] Анализ биораспределения проводили для ⁸⁹Zr-Df-IAb22M-EH1 γ1 (ФИГ. 16В) в опухоли HPB-ALL (ФИГ. 18). Поглощение опухоли в HPB-ALL являлось в ~6 раз большим по сравнению с Дауди (опухоль Дауди не экспрессирует антиген-мишень). Соотношение биораспределения между опухолью HPB-ALL и кровью составило 13,5, и соотношение биораспределения между опухолью Дауди и кровью составило 3,5. Сигнал от почек превышал сигнал от печени, что свидетельствует о более высоком уровне клиренса через почки (ФИГ. 18) и менее стабильной конструкции in vivo.

Выводы, полученные после применения начальных конструкций, которые использовали для конструирования оптимизированных миниантител

[0534] Представленные выше результаты продемонстрировали, что было важно мутировать первый цистеин шарнира для предотвращения неправильного спаривания цистеинов. Однако более 2 остатков цистеина являются благоприятными в шарнирной области для поддержания структурной целостности белка. Применение шарнира IgG2 обеспечивает решение для увеличения стабильности in vivo. Мутация концевого лизина (К) в конструкциях МА не влияет на экспрессию белка, но позволяет получить белок с более однородным зарядом.

[0535] Дополнительные варианты МА оценивали на основе IgG3 и модификации последовательностей шарнира IgG1, в которых мутировали первый цистеин шарнира, и в шарнирной области присутствовали по меньшей мере 3 остатка цистеина. В таблице 7 представлен перечень вариантов шарнира. Первый нативный цистеин в последовательности шарнира можно мутировать на серии или аланин, или любую другую аминокислоту. Нижняя шарнирная последовательность может представлять собой удлиняющую последовательность (8-25 аминокислот) или нативный нижний шарнир из γ1, γ2, γ3 или γ4. Домен C_H3 для любой конструкции может быть получен из γ1, γ2 или γ3, или γ4 и их любого встречающегося в природе аллеля. Иллюстрация некоторых вариантов шарнира представлена на ФИГ. 19. Оценивали конструкции IAB2M, IAB22M, IAB20M и IAB1M, чтобы продемонстрировать универсальность результатов.

ПРИМЕР 7 - ДАННЫЕ ДЛЯ ВАРИАНТОВ ШАРНИРА IAB2M, IAB22M, IAB20M И IAB1M IN VITRO

[0536] Анализ интактной массы проводили на вариантах шарнира (ФИГ. 5В, 5С, 7С, 5Е, 5D) IAB2M (ФИГ. 20А). Анализ интактной массы также проводили на вариантах шарнира (ФИГ. 14В, 15В, 20С, 20D, 20Е, 20F, 20G) IAB22M (ФИГ. 20В). Экспрессированные миниантитела со сконструированными шарнирами (ЕН) анализировали для определения интактной массы и количества полумолекул (ФИГ. 20А и 20В) методом ЖХ/МС с применением системы Waters Synapt G2 HDMS, оснащенной источником наноИЭР Trizaic в сочетании с колонкой Waters nanoAcquity UPLC Waters C4 nanotile (внутренний диаметр 150 мкм x длина 50 мм) при скорости потока 3 мкл/мин. с 0,1% муравьиной кислотой в воде и 0,1% муравьиной кислотой в ацетонитриле в качестве буферов. Для некоторых молекул образцы разделяли на колонке для обращенно-фазовой хроматографии (TSKgel Phenyl-5PW (Tosoh, 2×75 мм)) и анализировали с помощью масс-спектрометра Agilent ESI-QTOF.

[0537] Проводили анализ методом ДСН-ПААГ вариантов МА с шарниром IAB2M (ФИГ. 5С, 1С, 21В, 21С, 21D, 21Е) и вариантов МА с шарниром IAB22M (ФИГ. 16В, 15В, 20С, 20D, 20Е, 20F, 20G). Полученные в результате данные представлены на ФИГ. 21А и 22А.

[0538] Проводили анализ методом масс-спектрометрии с целью получения данных для подтверждения результатов анализа ДСН-ПААГ, представленных на ФИГ. 21А и 22А. Оценивали две конструкции IAB22M с применением масс-спектрометрии для подтверждения точной молекулярной массы, количества полумолекул и посттрансляционной модификации, например, С-концевого отсечения лизина. Конструкции белка включали миниантитела со сконструированными шарнирами ЕН2, ЕН3, полученными из последовательности IgG1 (ЕН2 γ1 (ФИГ. 22В) и ЕН3 γ1 (ФИГ. 20С)). Миниантитела γ1 с шарниром ЕН2 собирались надлежащим образом в интактные димерные молекулы, но добавление всего двух цистеинов приводило к получению белка с высоким количеством полумолекул. Миниантитела γ1 с шарниром ЕН3 надлежащим образом собирались в интактные димерные молекулы, и добавление третьего цистеина приводило к получению белка с очень низкими уровнями полумолекул.

[0539] Анализ интактной массы IAB22M-EH1 γ1 (ФИГ. 16В) методом масс-спектрометрии представлен на ФИГ. 23. Полученные молекулярные массы свидетельствовали о С-концевом отсечении. Из 3 представленных молекул (ММ 79318,9, 79450,1 и 79575,1) лишь одна соответствовала прогнозированной ММ 79576. Полученные молекулярные массы свидетельствовали о С-концевом отсечении. Из 3 представленных молекул (ММ 79318,9, 79450,1 и 79575,1) лишь одна соответствовала прогнозированной ММ 79576. Оставшаяся часть представляла собой миниантитело с 1 или обоими отсеченными С-концевыми лизинами. МА, сконструированные лишь с 2 дисульфидами в шарнире, образовывали высокие уровни полумолекул (~15%). Для анализа интактной массы IAB22M ЕН1 γ1 образцы разделяли на колонке для обращенно-фазовой хроматографии (TSKgel Phenyl-5PW (Tosoh, 2×75 мм)) и анализировали с применением масс-спектрометра Agilent ESI-QTOF. На ФИГ. 23 представлены полные ионные хроматограммы разделенных полумолекулы и полноразмерной молекулы (верхний чертеж). Кривую при УФ280 (не показана) использовали для количественного определения процента полумолекул, присутствующих в варианте миниантитела, посредством интегрирования пиков. Деконволированные массы использовали для соотнесения и подтверждали идентичности полумолекул (средний чертеж) и полноразмерных масс (нижний чертеж).

[0540] Анализ интактной массы варианта IAB22M-EH3 γ1 (ФИГ. 20С) методом масс-спектрометрии представлен на ФИГ. 24. Теоретическая ММ составила 79946, чему соответствовала полученная ММ 79946. Модифицированный шарнир IgG1, сконструированный с тремя дисульфидными связями в шарнире, позволил получить миниантитело с более 99% полноразмерного белка. Для анализа интактной массы образец белка в ацетатном буфере анализировали методом ЖХ/МС с применением следующего оборудования: системы Waters Synapt G2 HDMS, оснащенной источником наноИЭР Trizaic в сочетании с колонкой Waters nanoAcquity UPLC. Белок разделяли с применением колонки с обращенной фазой С4 nanotile (внутренний диаметр 150 мкм × 50 мм, Waters) при скорости потока 3 мкл/мин. с 0,1% муравьиной кислотой в воде и 0,1% муравьиной кислотой в ацетонитриле в качестве подвижных фаз. На ФИГ. 24 (верхний чертеж) представлен скан в полном диапазоне массы. На среднем чертеже представлена увеличенная область, демонстрирующая интактную молекулярную массу. На нижнем чертеже представлена увеличенная область, демонстрирующая полумолекулу.

[0541] В таблице 8 представлен перечень, в котором обобщены теоретическая предсказанная молекулярная масса (ММ) и ММ, полученная посредством анализа интактной массы пяти вариантов шарнира IAB2M (сверху; ФИГ. 5В-5Е, 7С) и семи вариантов шарнира IAB22M (снизу; ФИГ. 14В, 15В, 20С, 20D; 20Е, 43, 44), и соответствующее содержание полумолекул. Фактические массы белков соответствовали их теоретически рассчитанным молекулярным массам за исключением случаев, когда С-концевые остатки лизина были отсечены, что приводило к гетерогенности ММ (ФИГ. 6, 14А, 15А, 23 и 24).

[0542] Анализ методом FAC проводили для вариантов шарнира IAB2M (ФИГ. 5Е, 1С, 1D, 21В, 21С, 21D, 21Е). Все варианты шарнира миниантитела связывались с антигеном-мишенью, экспрессированным на клетках С4-2 XCL, с аналогичной аффинностью (ФИГ. 26).

[0543] Анализ методом FAC проводили для вариантов шарнира IAB22M (ФИГ. 15В, 20С, 20D, 20Е, 20F и 20G). Все миниантитела, полученные с одним и тем же scFv и доменом C_H3, но с различными шарнирами, связывались с CD8 поверхности клетки на клетке HPB-ALL с аналогичной аффинностью (ФИГ. 27).

[0544] Проводили анализ вариантов МА с шарниром IAB20M (ФИГ. 28В-28Е) методом ДСН-ПААГ (ФИГ. 28А), который дополнительно подтвердил, что аспекты шарнирной области, указанные в настоящем документе, можно применять в пределах широкого диапазона молекул-мишеней (например, что данный подход справедлив для множества миниантител, направленных на различные молекулы-мишени). Дополнительные варианты реализации вариантов IAB20M представлены на ФИГ. 54-59.

[0545] Проводили анализ вариантов МА с шарниром IAB1M (ФИГ. 29В-29D) методом ДСН-ПААГ (ФИГ. 29А), который дополнительно подтвердил, что аспекты шарнирной области, указанные в настоящем документе, можно применять в пределах широкого диапазона молекул-мишеней (например, что данный подход справедлив для множества миниантител, направленных на различные молекулы-мишени). Дополнительные варианты реализации вариантов IAB1M представлены на ФИГ. 60-65А, 65В и 65С.

ПРИМЕР 8 - ДАННЫЕ ДЛЯ ВАРИАНТОВ ШАРНИРА IAB22M IN VIVO

[0546] Проводили анализ ПЭТ/КТ меченных радиоактивным изотопом ⁸⁹Zr МА IAB22 с различными последовательностями шарнира (ФИГ. 15В, 20С, 20D, 20F, 20G) на мышах NOD-SCID. Изображения ПМИ ПЭТ/КТ мышей NOD-SCID, несущих на левом плече CD8-положительные ксенотрансплантаты HPB-ALL, после введения меченных ⁸⁹Zr вариантов шарнира Df-IAB22M в момент времени 24 ч представлены на ФИГ. 30. Все новые варианты шарнира приводили к меньшему уровню поглощения почками. Со всеми вариантами шарнира было получено хорошее нацеливание на опухоль, которое варьировало от 17 до 28% ИД/г. В целом, сигнал от печени являлся аналогичным сигналу от почек.

[0547] Анализ биораспределения (ФИГ. 31) проводили для меченных радиоактивным изотопом 89Zr МА IAB22 с различными вариантами шарнира ФИГ. 30. Для вариантов шарнира IAB22M наблюдалось аналогичное биораспределение. По сравнению с ЕН1 γ1 было установлено превосходное нацеливание на опухоль и поглощение. Наблюдался высокий уровень клиренса через печень, как и прогнозировали на основе данных, представленных в настоящем изобретении, для МА, который остается димером.

ПРИМЕР 9

[0548] Миниантитело против АСКП из таблицы 2 конъюгировали с соответствующим хелатирующим средством посредством остатков цистеина на миниантителе, а затем метили радиоактивным изотопом In-111 (или, в качестве альтернативы, Цирконием-89 или Медью-64). В качестве альтернативы, миниантитело можно пометить радиоактивным изотопом посредством прямого мечения радиоактивным изотопом иода по остатку тирозина.

[0549] Миниантитело вводили посредством внутривенной инфузии здоровому субъекту-человеку. Миниантитело инкубировали в субъекте-человеке в течение 10 минут после инфузии. В день инкубации локализацию миниантитела обнаруживали посредством сканирования ПЭТ или внешней сцинтиляционной системы.

[0550] Локализацию миниантитела применяли для определения локализации повышенных уровней АСКП у субъекта.

ПРИМЕР 10

[0551] Миниантитело против ПСМА из таблицы 2 конъюгировали с соответствующим хелатирующим средством посредством остатков цистеина на миниантителе, а затем метили радиоактивным изотопом In-111 (или, в качестве альтернативы, Цирконием-89 или Медью-64). В качестве альтернативы, миниантитело можно пометить радиоактивным изотопом посредством прямого мечения радиоактивным изотопом иода по остатку тирозина.

[0552] Миниантитело вводили посредством внутривенной инфузии здоровому субъекту-человеку. Миниантитело инкубировали в субъекте-человеке в течение 10 минут после инфузии. В день инкубации локализацию миниантитела обнаруживали посредством сканирования ПЭТ или внешней сцинтиляционной системы.

[0553] Локализацию миниантитела применяли для определения локализации повышенных уровней ПСМА у субъекта.

ПРИМЕР 11

[0554] После успешной визуализации ПСМА-положительных опухолей посредством миниантитела против ПСМА из таблицы 2 можно исследовать биораспределение миниантитела согласно вариантам реализации настоящего изобретения. В данных исследованиях биораспределения можно исследовать локализацию миниантитела в участке опухоли по сравнению с другими выбранными тканями в течение времени после инъекции. Данные исследования можно применять, чтобы продемонстрировать высокие соотношения сигналов от опухоли и от фона. Применение миниантител, вероятно, приведет к высокому соотношению сигналов от опухоли и от фона при визуализации опухоли, которая сверхэкспрессирует ПСМА, такой как рак предстательной железы. Положительные результаты данных экспериментов визуализации и биораспределения могут привести к токсикологическим экспериментам при подготовке к клиническим исследованиям.

[0555] Затем исследования способности миниантитела нацеливаться на ПСМА человека in vivo посредством ПЭТ-визуализации можно продемонстрировать в ходе клинических исследований на пациентах, страдающих от рака. Вкратце, меченное радиоактивным изотопом миниантитело можно внутривенно инъецировать пациентам, страдающим от рака, форма рака которых, как известно, сверхэкспрессирует ПСМА. В конкретные временные точки после инъекции можно проводить серийное сканирование каждого пациента методом ПЭТ. После итогового сканирования пациентов можно сканировать методом КТ для получения анатомического эталона. Затем изображения ПЭТ и КТ для каждого пациента можно проанализировать для оценки нацеливания на опухоль и специфичности.

ПРИМЕР 12

[0556] Миниантитело против 5Т4 из таблицы 2 конъюгировали с соответствующим хелатирующим средством посредством остатков цистеина на миниантителе, а затем метили радиоактивным изотопом In-111 (или, в качестве альтернативы, Цирконием-89 или Медью-64). В качестве альтернативы, миниантитело можно пометить радиоактивным изотопом посредством прямого мечения радиоактивным изотопом иода по остатку тирозина.

[0557] Миниантитело вводили посредством внутривенной инфузии здоровому субъекту-человеку. Миниантитело инкубировали в субъекте-человеке в течение 10 минут после инфузии. В день инкубации локализацию миниантитела обнаруживали посредством сканирования ПЭТ или внешней сцинтиляционной системы.

[0558] Локализацию миниантитела применяли для определения локализации повышенных уровней 5Т4 у субъекта.

ПРИМЕР 13

[0559] Вводят миниантитело против 5Т4 из таблицы 2. Миниантитело вводили посредством внутривенной инфузии субъекту, который страдает от рака толстой и прямой кишок, почек, молочной железы, яичников, желудка, легких и/или предстательной железы, в количестве, достаточном для связывания с достаточными уровнями 5Т4 у субъекта, для обеспечения снижения симптомов рака толстой и прямой кишок, почек, молочной железы, яичников, желудка, легких и/или предстательной железы у субъекта.

ПРИМЕР 14

[0560] Миниантитело против CD8 из таблицы 2 конъюгировали с соответствующим хелатором посредством остатков цистеина на миниантителе, а затем метили радиоактивным изотопом In-111 (или, в качестве альтернативы, Цирконием-89 или Медью-64). В качестве альтернативы, миниантитело можно пометить радиоактивным изотопом посредством прямого мечения радиоактивным изотопом иода по остатку тирозина.

[0561] Миниантитело вводили посредством внутривенной инфузии здоровому субъекту-человеку. Миниантитело инкубировали в субъекте-человеке в течение 10 минут после инфузии. В день инкубации локализацию миниантитела обнаруживали посредством сканирования ПЭТ или внешней сцинтиляционной системы.

[0562] Локализацию миниантитела применяли для определения локализации CD8 у субъекта.

ПРИМЕР 15

[0563] Вводят миниантитело против CD8 из таблицы 2. Миниантитело вводили посредством внутривенной инфузии здоровому субъекту-человеку.

[0564] Миниантитело инкубировали в субъекте-человеке в течение 1 часа после инфузии. Вводят вторичное антитело, гуманизированное миниантитело, которое специфично связывается с миниантителом против CD8 и является конъюгированным с ³³Р. В день инкубации вторичное антитело вводили субъекту посредством инфузии. Вторичное антитело инкубировали в течение одного часа. Локализацию миниантитела обнаруживали посредством ПЭТ-визуализации с помощью маркера на вторичном антителе.

[0565] Локализацию миниантитела применяли для определения локализации CD8 у субъекта.

ПРИМЕР 16

[0566] Вводят миниантитело против CD8 из таблицы 2. Миниантитело вводили посредством внутривенной инфузии субъекту, страдающему от нарушения, связанного с CD8, в количестве, достаточном для связывания с достаточными уровнями CD8 в субъекте, для обеспечения снижения симптомов нарушения, связанного с CD8. Миниантитело конъюгировали с Иттрием-90.

ПРИМЕР 17

[0567] Вводят миниантитело против CD8 из таблицы 2. Миниантитело инъецировали пациенту, которого вакцинировали антигеном инфекционного заболевания или опухоль-ассоциированным антигеном. Направленные на CD8 фрагменты увеличивали иммунный ответ и усиливали цитолитическую активность CD8-экспрессирующих Т-клеток.

ПРИМЕР 18

[0568] Вводят миниантитело против CD8 из таблицы 2. Миниантитело вводили посредством внутривенной инфузии субъекту, страдающему от нарушения, связанного с CD8, в количестве, достаточном для связывания CD8 на достаточных уровнях в субъекте, для обеспечения снижения симптомов нарушения, связанного с CD8. Миниантитело конъюгировали с Lu-177. Миниантитело против CD8 связывается с клеткой, экспрессирующей CD8, и Lu-177 приводит к уничтожению клетки.

[0569] Результаты свидетельствуют, что конструкции все еще связываются с клеточным CD8 человека.

ПРИМЕР 19

[0570] Миниантитело против CD3 из таблицы 2 конъюгировали с соответствующим хелатирующим средством посредством остатков цистеина на миниантителе, а затем метили радиоактивным изотопом In-111 (или, в качестве альтернативы, Цирконием-89 или Медыо-64). В качестве альтернативы, миниантитело можно пометить радиоактивным изотопом посредством прямого мечения радиоактивным изотопом иода по остатку тирозина.

[0571] Миниантитело вводили посредством внутривенной инфузии здоровому субъекту-человеку. Миниантитело инкубировали в субъекте-человеке в течение 10 минут после инфузии. В день инкубации локализацию миниантитела обнаруживали посредством сканирования ПЭТ или внешней сцинтиляционной системы.

[0572] Локализацию миниантитела применяли для определения локализации повышенных уровней CD3 у субъекта.

ПРИМЕР 20

[0573] Вводят миниантитело против CD3 из таблицы 2. Миниантитело вводили посредством внутривенной инфузии субъекту, страдающему от ревматоидного артрита, в количестве, достаточном для связывания CD3 на достаточных уровнях в субъекте, для обеспечения снижения симптомов ревматоидного артрита у субъекта.

ПРИМЕР 21

[0574] Идентифицировали субъекта, подверженного риску развития неприемлемо интенсивного цитокинового шторма в результате введения OKT3. Субъект испытывал потребность в снижении уровня белков CD3 в его системе, поскольку субъект страдал от CD3-зависимого нарушения. Одно из миниантител против CD3, описанных в настоящем документе, выбирали и вводили субъекту на уровне, который является эффективным для надлежащего связывания с CD3, без возникновения цитокинового шторма.

ПРИМЕР 22

[0575] Вводят гуманизированное миниантитело против CD3 из таблицы 2. Миниантитело вводили посредством внутривенной инфузии здоровому субъекту-человеку. Миниантитело инкубировали в субъекте-человеке в течение 1 часа после инфузии. Вводят вторичное антитело, гуманизированное миниантитело, которое специфично связывается с миниантителом CD3 и является конъюгированным с ³³Р. Немедленно после одного часа инкубации субъекту посредством инфузии вводили вторичное антитело. Вторичное антитело инкубировали в течение одного часа. Немедленно после инкубации вторичного антитела в течение одного часа обнаруживали локализацию миниантитела посредством ПЭТ-визуализации.

[0576] Локализацию миниантитела применяли для определения локализации CD3 у субъекта.

ПРИМЕР 23

[0577] Идентифицировали субъекта, подверженного риску развития неприемлемо интенсивного цитокинового шторма в результате введения OKT3. Субъект испытывал потребность в снижении уровня белков CD3 в его системе, поскольку субъект страдал от CD3-зависимого нарушения. Одно из миниантител против CD3, описанных в настоящем документе, выбирали и вводили субъекту на уровне, который является эффективным для надлежащего связывания с CD3, без возникновения цитокинового шторма.

[0578] В случае необходимости миниантитело или миниантитела можно конъюгировать с терапевтическим средством для лечения CD3-зависимого нарушения.

[0579] Субъект может страдать от любого количества конкретных CD3-зависимых нарушений, каждое из которых, в качестве альтернативы, может представлять собой ревматоидный артрит, множественный склероз, диабет 1 типа или красную волчанку.

ПРИМЕР 24

[0580] Вводят миниантитело против АСКП из таблицы 2. Миниантитело вводили посредством внутривенной инфузии субъекту, страдающему от нарушения, связанного с АСКП, в количестве, достаточном для связывания на достаточных уровнях АСКП в субъекте, для обеспечения снижения симптомов нарушения, связанного с АСКП. Миниантитело конъюгировали с Иттрием-90.

ПРИМЕР 25

[0581] Вводят миниантитело против ПСМА из таблицы 2. Миниантитело вводили посредством внутривенной инфузии субъекту, страдающему от нарушения, связанного с ПСМА, в количестве, достаточном для связывания на достаточных уровнях ПСМА в субъекте, для обеспечения снижения симптомов нарушения, связанного с ПСМА. Миниантитело конъюгировали с Иттрием-90.

[0582] В настоящей заявке использование единственного числа может включать множественное число, если конкретно не указано обратное или если, как в свете настоящего изобретения понимает специалист в данной области техники, единственное число является единственным функциональным вариантом реализации. Таким образом, например, объект в единственном числе может означать более чем один объект, и «один вариант реализации» может означать, что описание относится к нескольким вариантам реализации.

[0583] Все источники, ссылки на которые приводятся в настоящем документе, включая патенты, заявки на патент, статьи, пособия и т.п., и источники, ссылки на которые приводятся в данных источниках, в такой степени, в какой они уже не представлены, полностью включены посредством ссылки. В случае если один или более из включенных литературных и аналогичных материалов отличается от настоящей заявки или противоречит настоящей заявке, включая, без ограничения, определенные термины, использование терминов, описание методик или т.п., настоящая заявка имеет определяющее значение.

[0584] Приведенное выше описание и примеры детализируют определенные варианты реализации. Следует понимать, однако, что вне зависимости от того, насколько подробно вышеуказанное описание может быть представлено в тексте, настоящее изобретение можно реализовать на практике множеством способов, и настоящее изобретение должно быть истолковано согласно прилагаемой формуле изобретения и ее любым эквивалентам.

Claims

1. Аминокислотная шарнирная область для применения в антигенсвязывающей конструкции, содержащая EPKSSDKTHTCPPCPPC,

причем указанная шарнирная область находится в мини-антителе.

2. Аминокислотная шарнирная область по п. 1, дополнительно содержащая удлиняющую последовательность или нижнюю шарнирную последовательность, C-концевую относительно последнего цистеина в EPKSSDKTHTCPPCPPC.

3. Аминокислотная шарнирная область по п. 2, характеризующаяся тем, что указанная удлиняющая последовательность или нижняя шарнирная последовательность содержит по меньшей мере одну аминокислоту из S, G, A, P или V.

4. Аминокислотная шарнирная область по любому из пп. 2, 3, характеризующаяся тем, что указанная удлиняющая последовательность содержит по меньшей мере GGGSSGGGSG (SEQ ID NO: 59).

5. Аминокислотная шарнирная область по любому из пп. 1-4, содержащая линкерную последовательность, которая содержит по меньшей мере APPVAGP (SEQ ID NO: 60).

6. Аминокислотная шарнирная область по любому из пп. 1-5, дополнительно содержащая нижнюю шарнирную область или удлиняющую область, примыкающую к центральной шарнирной области.

7. Аминокислотная шарнирная область по любому из пп. 1-6, характеризующаяся тем, что указанная аминокислотная шарнирная область содержит по меньшей мере одну из следующих последовательностей: EPKSSDKTHTCPPCPPCGGGSSGGGSG (SEQ ID NO: 26) или EPKSSDKTHTCPPCPPCAPELLGGP (SEQ ID NO: 25).

8. Аминокислотная шарнирная область для применения в антигенсвязывающей конструкции, содержащая: центральную шарнирную последовательность, имеющую одну последовательность из: CPPCPPC (SEQ ID NO: 52) или CPPCPPCPPC (SEQ ID NO: 54), присоединенную к верхней шарнирной последовательности ELKTPLGDTTHT (SEQ ID NO: 48) или EPKSSDKTHT (SEQ ID NO: 46),

9. Аминокислотная шарнирная область по п. 8, характеризующаяся тем, что верхняя шарнирная последовательность представляет собой EPKSSDKTHT (SEQ ID NO: 46).

10. Аминокислотная шарнирная область по любому из пп. 8, 9, характеризующаяся тем, что указанная аминокислотная шарнирная область дополнительно содержит нижнюю шарнирную область или удлиняющую область, присоединенную с С-конца к центральной шарнирной области.

11. Аминокислотная шарнирная область по п. 10, характеризующаяся тем, что указанная нижняя шарнирная область или удлиняющая область содержит по меньшей мере одну последовательность из: GGGSSGGGSG (SEQ ID NO: 59), или APPVAGP (SEQ ID NO: 60), или APELLGGP (SEQ ID NO: 58).

12. Аминокислотная шарнирная область по любому из пп. 1-11, характеризующаяся тем, что указанная шарнирная область содержит по меньшей мере четыре цистеина на цепь.

13. Аминокислотная шарнирная область по любому из пп. 1-11, характеризующаяся тем, что указанная шарнирная область содержит по меньшей мере пять цистеинов на цепь.

14. Аминокислотная шарнирная область по любому из пп. 1-13, характеризующаяся тем, что цистеины распределены на протяжении указанной аминокислотной шарнирной области в повторяющемся мотиве CXX или CXY.

15. Аминокислотная шарнирная область по любому из пп. 1-14, отличающаяся тем, что указанная шарнирная область находится в моноспецифичном антителе.

16. Аминокислотная шарнирная область по любому из пп. 1-14, характеризующаяся тем, что указанная шарнирная область находится в биспецифичном антителе.

17. Аминокислотная шарнирная область по п. 16, характеризующаяся тем, что указанное биспецифичное антитело собрано в соотношении 1:1.

18. Фармацевтическая композиция, содержащая мини-антитело, содержащее аминокислотную шарнирную область по любому из пп. 1-17, и

поддающийся обнаружению маркер.

19. Фармацевтическая композиция по п. 18, характеризующаяся тем, что в указанной композиции наблюдается менее 5% агрегации мини-антитела и при этом присутствует по меньшей мере 1 мкг мини-антитела на 100 мг.

20. Фармацевтическая композиция, содержащая мини-антитело, содержащее аминокислотную шарнирную область по любому из пп. 1-17, и

терапевтическое средство.

21. Мини-антитело, содержащее

scFv;

CH3 и

аминокислотную шарнирную область по любому из пп. 1-17,

где указанная аминокислотная шарнирная область присоединяет scFv к CH3 и при этом указанное мини-антитело связывает одну или более молекул-мишеней.

22. Мини-антитело, содержащее:

scFv;

CH3 и

аминокислотную шарнирную область, содержащую EPKSSDKTHTCPPCPPC;

23. Мини-антитело по п. 22, где аминокислотная шарнирная область содержит EPKSSDKTHTCPPCPPCGGGSSGGGSG (SEQ ID NO: 26).

24. Мини-антитело по любому из пп. 21-23, где указанные одна или более молекул-мишеней связаны с нарушением, с иммунотерапией и/или прогрессированием иммунного ответа на нарушение и/или иммунотерапию.

25. Мини-антитело по любому из пп. 21-23, где указанная одна или более молекул-мишеней представляет собой по меньшей мере одну из CD8, CD3, 5T4, АСКП и/или ПСМА.