CN104114186B - 识别流行性感冒血凝素的受体‑结合袋状结构的广泛中和人类抗体 - Google Patents

Abstract

本发明的特征为与流行性感冒凝血素特异性地结合，并且减少或抑制凝血素与唾液酸结合的新颖流行性感冒抗体。本发明亦提供特征为新颖抗体和其用于预防或治疗流行性感冒感染的方法、组合物以及试剂盒。

Description

识别流行性感冒血凝素的受体-结合袋状结构的广泛中和人 类抗体

相关申请案的对照参考

本申请案主张于2011年8月3日提出申请的美国临时专利申请案第61/514,662号的优先权，其内容以参考方式全部并入本文。

美国联邦赞助的研究下进行的发明的权利声明

此研究成果是由来自美国国家卫生院的补助款第U19AI067854号和第P01GM62580号支持。美国政府对于本发明有特定权利。

背景技术

流行性感冒病毒抗原性的周知季节性漂移说明了在先前感染的个体中缺乏长期免疫保护。血凝素(HA)是一种结合病毒受体、促进融合以及从低pH核内体穿透的三聚体表面碳水化合物蛋白，而且为流行性感冒病毒粒子的主表面抗原。HA呈现保守以及可变表位，但针对后者的中和抗体主宰对免疫接种和感染的反应。

从而，对于发展可有效地治疗或预防流行性感冒的漂移株的广泛中和治疗剂有需求。

发明内容

如下述，本发明是基于广泛中和流行性感冒抗原变异体的新颖抗体的发现。本发明的特征为含有新颖抗体的组合物和试剂盒、以及使用此等新颖治疗分子治疗或预防流行性感冒病毒感染的方法。

于方面中，本发明提供与流行性感冒血凝素(HA)的表位特异性地结合的单离的抗流行性感冒抗体或抗体片段。抗体或抗体片段与流行性感冒HA表位的结合减少或抑制流行性感冒HA与唾液酸的结合。

于具体实施例中，流行性感冒HA的表位包括唾液酸结合结构域。于具体实施例中，HA为H1HA、H2HA、H3HA或H5HA(来自适应人类的H5病毒株的HA)。

于相关具体实施例中，流行性感冒HA表位包括对应于来自A/Solomon Islands/3/2006的CDR H1残基158；CDR H2残基158至160；CDR H3残基135至136、190至195以及226；CDRLl残基222、225以及227；以及CDR L3残基187和189的氨基酸

于相关具体实施例中，流行性感冒HA表位包括SEQ ID NO：17至44中任一者所表示的氨基酸。

于相关具体实施例中，流行性感冒HA表位包括SEQ ID NO：17至44中任一者中的CH65至CH67结合残基(例如，图15中辨识的CH65至CH67结合残基)。

于具体实施例中，抗流行性感冒抗体或抗体片段包括可变重(V_H)链，而且其中V_H链包括SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12中所表示的氨基酸序列。

于具体实施例中，抗流行性感冒抗体或抗体片段包括一个或多个存在于SEQ IDNO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12的可变重(V_H)链氨基酸序列中的重链CDR区。于相关具体实施例中，一个或多个重链CDR区包括存在于SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12的可变重(V_H)链氨基酸序列中的CDR3区。

于具体实施例中，抗流行性感冒抗体或抗体片段包括可变轻(V_L)链，而且其中V_L链包括SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：16所表示的氨基酸序列。

于具体实施例中，抗流行性感冒抗体或抗体片段包括一个或多个存在于SEQIDNO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：16的可变轻(V_L)链氨基酸序列中的轻链CDR区。于相关具体实施例中，一个或多个轻链CDR区包括存在于SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：16的可变重(V_L)链氨基酸序列中的CDR3区。

于具体实施例中，抗流行性感冒抗体或抗体片段包括i)可变重(V_H)链氨基，其包括SEQ ID NO：10所表示的氨基酸序列，以及ii)可变轻(V_L)链，其包括SEQ IDNO：14所表示的氨基酸序列。

于具体实施例中，抗流行性感冒抗体或抗体片段包括可变重(V_H)链，其中V_H链的CDR3区包括Arg104、Ser105、Va1106、Asp107、Tyr109、Tyr110、Tyr112或其组合。

于具体实施例中，抗流行性感冒抗体为单克隆抗体或其抗体片段。

于具体实施例中，抗流行性感冒抗体为人源化抗体。

于具体实施例中，抗体片段为Fab片段、Fab'片段、Fd片段、Fd'片段、Fv片段、dAb片段、F(ab')₂片段、单链片段、双链抗体或线性抗体。

于具体实施例中，抗流行性感冒抗体或抗体片段进一步包括与抗流行性感冒抗体或其抗体片段偶联的剂。于相关具体实施例中，与抗体或其抗体片段偶联的剂是治疗剂或可检测的标记。

治疗剂可为任何适合与新颖抗体共享的治疗剂。此剂为本领域中周知，而且包含小分子、纳米粒子、多肽、放射性同位素、抑制性核酸等。于具体实施例中，治疗剂为抗病毒剂或毒素。于具体实施例中，治疗剂为减少流行性感冒病毒生产的siRNA、shRNA或反义核酸分子。

可检测的标记可为适合与新颖抗体共享的任何可检测的标记。此标记为本领域中周知，而且包含可由光谱、光化学、生化、免疫化学、物理或化学手段检测的标记。于具体实施例中，可检测的标记为已制成可检测的酶、荧光分子、颗粒标记、电子致密试剂、放射性标记、微泡、生物素、地高辛或半抗原或蛋白质。

于方面中，本发明提供含有本文所述的至少一种抗流行性感冒抗体或抗体片段的医药组合物。于具体实施例中，医药组合物含有医药可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

于方面中，本发明提供编码本文所述抗流行性感冒抗体或抗体片段的单离的多核苷酸。于相关方面中，本发明提供包括此单离的多核苷酸的表达载体。于进一步相关方面中，本发明提供包括此表达载体的宿主细胞。

于方面中，本发明提供治疗或预防有需要的受试者的流行性感冒病毒感染的方法。所述方法涉及对受试者给药有效量的本文所述抗流行性感冒抗体或抗体片段或含有所述抗体或抗体片段的医药组合物。所述方法治疗或预防受试者的流行性感冒病毒感染，包含减少或缓和与感染相关的症状。

于方面中，本发明提供中和有需要的受试者中的流行性感冒病毒的方法。所述方法涉及对受试者给药有效量的本文所述抗流行性感冒抗体或抗体片段或含有所述抗体或抗体片段的医药组合物。所述方法中和受试者中的流行性感冒病毒，从而治疗或预防受试者的流行性感冒病毒感染，包含减少或缓和与感染相关的症状。

于方面中，本发明提供在有需要的受试者中建立流行性感冒病毒感染的方法。所述方法涉及对受试者给药有效量的本文所述抗流行性感冒抗体或抗体片段或含有所述抗体或抗体片段的医药组合物。所述方法抑制在受试者中建立流行性感冒病毒感染，从而预防与感染相关的症状。

于方面中，本发明提供抑制有需要的受试者的流行性感冒病毒感染的散播的方法。所述方法涉及对受试者给药有效量的本文所述抗流行性感冒抗体或抗体片段或含有所述抗体或抗体片段的医药组合物。所述方法抑制受试者中的流行性感冒病毒感染的散播，从而减少或缓和与感染相关的症状。

于方面中，本发明提供抑制流行性感冒病毒进入受试者中的细胞的方法。所述方法涉及对受试者给药有效量的本文所述抗流行性感冒抗体或抗体片段或含有所述抗体或抗体片段的医药组合物。所述方法抑制流行性感冒病毒进入受试者中的细胞，从而预防与感染相关的症状或减少或缓和与感染相关的症状。

于方面中，本发明提供抑制流行性感冒病毒进入细胞的方法。所述方法涉及使具有流行性感冒病毒感染或有发展流行性感冒病毒感染的风险的细胞接触抗本文所述流行性感冒抗体或抗体片段或含有所述抗体或抗体片段的医药组合物。所述方法抑制流行性感冒病毒进入细胞。

于以上任何方面中，受试者具有流行性感冒感染或有发展流行性感冒感染的风险。于相关具体实施例中，受试者为哺乳动物(例如，人类)。于相关具体实施例中，受试者易受病毒感染(例如，怀孕女性、年轻受试者或婴儿受试者、老年受试者)。

于以上方面和具体实施例中任一者中，抗流行性感冒抗体或抗体片段或医药组合物是通过肌内注射、静脉注射、皮下注射或吸入而给药。

于方面中，本发明提供治疗或预防流行性感冒病毒感染的试剂盒；中和流行性感冒病毒的试剂盒；抑制流行性感冒病毒感染的建立的试剂盒；抑制流行性感冒病毒感染的散播的试剂盒；以及抑制流行性感冒病毒进入细胞的试剂盒。

于具体实施例中，试剂盒含有本文所述抗流行性感冒抗体或抗体片段。

于具体实施例中，试剂盒也含有治疗剂。于相关具体实施例中，治疗剂抑制流行性感冒感染。

于具体实施例中，试剂盒也含有在本文所述任何方法中使用试剂盒的指示。

于以上任何具体实施例中，流行性感冒可为H1N1、H2N2、H3N2或人类适应H5流行性感冒病毒株(即，已获得人类受体特异性的H5流行性感冒；参阅图14D的例示性病毒株)。

本发明的另外目的和优点将部分在以下描述中阐明，部分将自该描述显而易见，或可从本发明的实施得知。本发明的目的和优点将通过本文揭露的组件和组合的方式实践和实现，包含在附加的权利要求中指出的。应了解前述一般叙述和以下实施方式皆仅为例示性和说明性，而且并非限制请求保护的发明。附图是并入本文和构成本说明书的一部分且说明本发明的许多具体实施例，以及所述附图与描述内容共同解释本发明的原则。

定义

一些术语和短语定义如下，以促进本发明的了解。

如本文所使用，单数"一(a)"、"一(an)"以及"所述(the)"包含复数形式，除非语境清楚指出。因此，例如，关于"一种流行性感冒抗体"包含关于超过一种流行性感冒抗体。

如本文所使用，术语"或"应了解为包含前后两者，除非具体注明或从语境显而易见。

如本文所使用，术语"包括(comprises)"、"包括(comprising)"、"含有(conaining)"、"具有(having)"等可具有所述术语归于美国专利法所规定的含义，而且可表示"包含(includes)""包含(including)"等；"基本上由…组成(consistingessentially of)"或"基本上由…组成(consists essentially)"同样地具有归于美国专利法所规定的含义，而且所述术语是开放式的，允许存在超过所述者，只要叙述的基本或新颖特征未因超过叙述者而改变，但排除先前技术的具体实施例。

术语“抗体”表示通过所具可变区内的至少一种抗原辨识位点辨识目标且与其特异性地结合的免疫球蛋白分子，所述目标为蛋白质、多肽、肽、碳水化合物、多核苷酸、脂质或前述者的组合。如本文所使用，术语"抗体"涵盖完好的多克隆抗体、完好的单克隆抗体、抗体片段(诸如，Fab、Fab'、F(ab')2以及Fv片段)、单链Fv(scFv)突变体、多特异性抗体诸如从至少两种完好抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人类抗体、包括抗体的抗原决定部分的融合蛋白质、以及包括抗原辨识位点的任何其它改性的免疫球蛋白分子产生的双特异性抗体，只要抗体展现期望的生物活性。抗体可为五种主要类别的免疫球蛋白分子：IgA、IgD、IgE、IgG以及IgM，或其子类(同种型)(例如，IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl以及IgA2)中的任何一种，其是基于分别称为α、Δ、ε、γ以及μ的免疫球蛋白分子的重链恒定结构域的识别性。不同类别的免疫球蛋白分子具有不同且周知的亚单元结构和三维构形。抗体可为无改性或与其它分子诸如毒素、放射性同位素等偶联。

基本的四链抗体单元为由两个相同轻(L)链和两个相同重(H)链所组成的异源四聚体糖蛋白。IgM抗体是由5个基本的异源四聚体单元与称为J链的另外多肽所组成，而且因此含有抗原结合位点，同时分泌的IgA抗体可聚合以形成包括2至5个基本的4链单元与J链的多价集合。IgG的情况下，4链单元通常约150,000道尔顿。取决于H链的同种型，各L链以一个共价双硫键链接H链，同时两个H链一个或多个双硫键彼此链接。各H和L链也具有规律分隔的链内双硫桥。各H链在N端具有可变结构域(VH)，接着各α和γ链具有三个恒定结构域(C_H)，以及μ和ε同种型具有四个C_H结构域。各L链在N端具有可变结构域(V_L)，接着在其它端具有恒定结构域(C_L)。V_L与V_H对齐，而且C_L与重链(C_H1)的第一个恒定结构域对齐。据信，特别氨基酸残基在轻链和重链可变结构域之间形成界面。V_H和V_L的配对共同形成单一抗原结合位点。至于不同类别的抗体的结构和性质，参阅，例如，Basic and Clinical Immunology,8th edition,Daniel P.Stites,Abba I.Terr and Tristram G.Parslow(eds.),Appleton&Lange,Norwalk,Conn.,1994，第71页和第6章。

"单离的抗体"为已与其自然环境的组分分离者及/或已自其自然环境的组分回收者。其自然环境的污染物组分为会干扰抗体的诊断或治疗用途的物料，而且可包含酶、激素以及其它蛋白质或非蛋白质溶质。于具体实施例中，抗体是纯化成：(1)以罗式法(Lowrymethod)所测定为80重量%、85重量%、90重量%、95重量%、99重量%或更高重量%的抗体；(2)通过使用旋转杯测序仪，而达成足以获得N端或内氨基酸序列的至少15个残基的程度；或(3)使用考马斯亮蓝、银染等在还原或非还原的条件下用SDS-PAGE而得的均质性。单离的抗体包含重组细胞内的原位抗体，因为抗体的自然环境的至少一种组分将不存在。于具体实施例中，单离的抗体将以至少一个纯化步骤制备。

术语"抗体片段"指完好抗体的一部分，而且指完好抗体的抗原决定可变区。抗体片段的实例，包含，但非限于：Fab、Fab'、F(ab')2以及Fv片段、线性抗体、单链抗体以及形成自抗体片段的多特异性抗体。

抗体的木瓜蛋白酶消化产生两种相同抗原结合片段，称为"Fab"片段和残留"Fe"片段，其是反映容易结晶的能力的指称。Fab片段是由整个L链与H链(V_H)的可变区结构域和一个重链(C_H1)的第一个恒定结构域所组成。各Fab片段的抗原结合方面是单价，即，Fab片段具有单抗原结合位点。抗体的胃蛋白酶处理产生单一大F(ab')₂片段，其大致对应于具有二价抗原结合活性和仍能交联抗原的两种双硫化物链接的Fab片段。Fab'片段不同于Fab片段，因为在C_H1结构域的羧基端具有另外的几个残基，包含来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。本文的Fab'-SH为其中恒定结构域的半胱氨酸残基具有游离硫醇基的Fab'的指称。F(ab')₂抗体片段原本产生为彼此之间具有铰链半胱氨酸的Fab'片段对。亦已知其它化学耦合的抗体片段。

"Fc"片段包括双硫化物维持的两个H链的羧基端部分。Fc区亦为某些类型的细胞上发现的Fc受体(FcR)辨识的部分，而且抗体的效应物功能是由所述Fc区中的序列测定。

"Fv抗体"是指含有完整抗原辨识和结合位点的最小抗体片段，其是其中一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域形成非共价二聚体的两个链，或其中一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域以柔性肽接头序列共价链接以便使两个链以相似的二聚体结构相关联的单链(scFv或sFv)。于此构形中，各可变结构域的互补决定区(CDR)交互作用，以定义Fv二聚体的抗原结合特异性。或者，单一可变结构域(或一半的Fv)可用以辨识和结合抗原，虽然通常以较低的亲和力结合。

术语"双链抗体"是指由以下述方法制备而成的小抗体片段：以V_H和V_L结构域之间的短接头序列(约5个残基)构筑sFy片段(参阅前段)，以致达成V结构域的链间(但非链内)配对，造成二价片段，即，具有两种抗原结合位点的片段。双特异性双链抗体为两个"交叠"sFy片段的异质二聚体，其中两个抗体的V_H和V_L结构域存在于不同多肽链上。双链抗体更详述于，例如，EP404,097；WO93/11161；以及Hollinger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90：6444-6448(1993)。

"单克隆抗体"指涉及高度特异性辨识和与单一抗原决定簇或表位的结合的同质抗体群体。此单克隆抗体不同于典型包含不同抗体以针对对抗不同抗原决定簇的多克隆抗体。术语"单克隆抗体"涵盖皆为完好和全长的单克隆抗体以及抗体片段(诸如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)、单链(scFv)突变体、包括抗体部分的融合蛋白质，以及包括抗原辨识位点的任何其它改性免疫球蛋白分子。此外，"单克隆抗体"是指此以任何数量的方式制造的抗体，所述方式包含，但非限于，杂交瘤、噬菌体选殖、重组表达以及转基因动物。

术语"人源化抗体"是指含有最小非人类(例如，鼠类)序列的特异性免疫球蛋白链、嵌合免疫球蛋白分子或其片段的非人类(例如，鼠类)抗体的形式。典型地，人源化抗体为人类免疫球蛋白分子，所述人类免疫球蛋白分子中来自互补决定区(CDR)的残基被来自非人类物种(例如，小鼠、大鼠、兔子、仓鼠等)的具有期望的特异性、亲和力、以及能力的CDR的残基置换(Jones et al.,1986,Nature,321：522-525；Riechmann et al.,1988,Nature,332：323-327；Verhoeyen et al.,1988,Science,239：1534-1536)。于某些情况下，人类免疫球蛋白的Fv骨架区(FR)残基以来自非人类物种的抗体中的具有期望的特异性、亲和力以及能力的对应的残基置换。人源化抗体可进一步通过以下方式改性：取代Fv骨架区中及/或被置换的非人类残基内的另外的残基，以细化和最优化抗体特异性、亲和力及/或能力。通常，人源化抗体将包括实质上全部含有对应于非人类免疫球蛋白的所有或实质上全部的CDR区的至少一种以及典型两种或三种的可变结构域，反观所有或实质上全部的FR区为那些人类免疫球蛋白共有序列所具者。人源化抗体亦可包括至少一部分的免疫球蛋白恒定区或结构域(Fc)，其典型为人类免疫球蛋白所具者。用以产生人源化抗体的方法实例描述于US5,225,539。

术语"人类抗体"表示由人类产生的抗体或使用本领域中已知的任何技术制造的具有对应于人类产生的抗体的氨基酸序列的抗体。此人类抗体的定义包含完好或全长的抗体、其片段、及/或包括至少一个人类重链及/或轻链多肽的抗体，诸如，例如，包括鼠类轻链和人类重链多肽的抗体。

"杂交抗体"为其中来自具有不同抗原决定簇区的重链和轻链对共同组合以便使两种不同表位或两种不同抗原可被辨识和与所产生的四聚体结合的免疫球蛋白分子。

术语"嵌合抗体"是指其中免疫球蛋白分子的氨基酸序列源自两种或更多种物种的抗体。典型地，轻链和重链两者的可变区对应于源自哺乳动物(例如，小鼠、大鼠、兔子等)中的一种物种的抗体的具有期望的特异性、亲和力以及能力的可变区，同时恒定区与源自另一种物种(通常为人类)的抗体的序列同源，以避免在所述物种中引发免疫反应。

抗体的"可变区"是指单独的抗体轻链的可变区或抗体重链的可变区，或其组合。重链和轻链的可变区各由以三个互补决定区(CDR)(亦已知为高度可变区)连接的四个骨架区(FR)所组成。各链中的CDR是由FR维持紧密靠近，而且与来自另一个链的CDR贡献于抗体的抗原结合位点的形成。有至少两种测定CDR的技术：(1)基于跨物种序列变异性的方法(参阅Kabat et al.,Sequences of Poteins of Immunological Interest(5th ed.,1991,美国国家卫生院,Bethesda Md.))；以及(2)基于抗原抗体复合物的结晶研究的方法(参阅Al-lazikani et al.J.Molec.Biol.273：927-948(1997))。此外，本领域中有时使用此两种方法的组合以测定CDR。

本文定义"给药"为以造成剂在受试者的身体内，从而将所述剂或含有所述剂的组合物提供给所述受试者的方式。此给药可为任何路径，包含，但无限制于，口服、经皮(例如，阴道、直肠、口腔粘膜)，通过注射(例如，皮下、静脉内、肠道外、腹膜内、鞘内)、或通过吸入(例如，经口或鼻)。医药制剂当然是由适合各给药路径的形式给定。

所谓”剂"表示任何小分子化学化合物、抗体、核酸分子或多肽或其片段。

所谓”类似物"表示非相同，但具有类似的功能或结构特征的分子。例如，流行性感冒抗体的酰胺、酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、酰脲或磷酸酯类似物是具有以下特性的分子：1)不会破坏流行性感冒抗体的生物活性，而且赋予流行性感冒抗体有利的体内性质，诸如，吸收、作用的持续时间或作用的开始；或2)本身为生物不起作用，但在体内转化成生物活性化合物。类似物包含前药形式的流行性感冒抗体。此前药为当对生物系统给药时因自发性化学反应、酶催化的化学反应及/或代谢化学反应的结果而产生流行性感冒抗体的任何化合物。

所谓”对照组"是表示标准品或参考条件。

术语"衍生物"是表示与给定剂(例如，流行性感冒抗体)有相等或接近相等的生理功能性的医药活性化合物。如本文使用，术语"衍生物"包含任何医药可接受的盐、醚、酯、前药、溶剂合物、包含对映异构物、非对映异构物或立体异构地富集或外消旋混合物的立体异构物以及给药接受者时能(直接或间接)提供化合物或抗病毒活性代谢物或其残基的任何其它化合物。

所谓”疾病"是表示破坏或干扰细胞、组织或器官的正常功能的任何状态或病症。

术语"表位"或"抗原决定簇"在本文中互相交替使用，而且意指能被特别抗体辨识和特异性地结合的抗原的部分。当抗原为多肽时，表位皆可形成自通过蛋白质的三级折叠而并排的邻接的氨基酸和非邻接的氨基酸。形成自邻接的氨基酸的表位通常在蛋白质变性时保留，反观以三级折叠形成的表位通常在蛋白质变性时流失。表位典型包含至少3个，更常为至少5或8个氨基酸形成独特空间构形。

抗体之间的竞争是以其中测试的免疫球蛋白抑制参考抗体与一般抗原的特异性结合的检测法测定。已知有许多类型的竞争结合检测法，例如：固相直接或间接放射性免疫检测法(RIA)、固相直接或间接酶免疫检测法(EIA)、三明治竞争检测法(参阅Stahli etal.,Methods in Enzymology9：242-253(1983))；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(参阅Kirkland et al.,J.Immunol.137：3614-3619(1986))；固相直接标示检测法、固相直接标示的三明治检测法(参阅Harlow and Lane,"Antibodies,A Laboratory Manual,"ColdSpring Harbor Press(1988))；使用I-125标记的固相直接标记RIA(参阅Morel et al.,Molec.Immunol.25(1)：7-(1988))；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(Cheung et al.,Virology176：546-552(1990))；以及直接标示的RIA(Moldenhauer et al.,Scand.J.Immunol.32：77-82(1990))。典型地，此检测法涉及使用与固体表面或具有未标示的测试免疫球蛋白或标示的参考免疫球蛋白的细胞结合的纯化抗原。竞争抑制是通过在测试的免疫球蛋白的存在下，测定与固体表面或细胞结合的标记量而测量。通常，测试的免疫球蛋白存在过量。通过竞争检测法(竞争抗体)辨识的抗体包含与参考抗体结合相同表位的抗体和与足够接近结合所述表位的所述参考抗体的相邻的表位结合的抗体，进而造成位阻发生。当竞争抗体存在过量时，将抑制参考抗体与一般抗原的特异性地结合至少25%、50、75%或更高。

所谓”加强"或"增加"表示相对于参考物，至少约10%、25%、50%、75%或100%的正向变化。

所谓”片段"是表示多肽或核酸分子的一部分。此部分含有参考核酸分子或多肽的整个长度的至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%。ㄧ个片段可含有10、20、30、40、50、60、70、80、90或100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000个核苷酸或氨基酸。

"杂交"表示氢键结，其可为互补核碱基之间的瓦生-克里克(Watson-Crick)、胡思町(Hoogsteen)或反向胡思町氢键结。例如，腺嘌呤和胞腺嘧啶是通过氢键的形成而配对的互补核碱基。

所谓”单离的多核苷酸"是表示不含基因的核酸(例如，DNA)，所述核酸在其中衍生本发明的核酸分子的生物体的天然存在基因组中在所述基因的侧翼。所述术语因此包含，例如，并入载体的重组DNA；并入自主地复制的质体或病毒；或并入原核生物或真核生物的基因组DNA；或存在为与无关其它序列无关的个别分子(例如，由PCR或限制性内切核酸酶消化产生的cDNA或基因组或cDNA片段)。此外，所述术语包含自DNA分子转录的RNA分子，以及为编码另外的多肽序列的杂交基因的一部分的重组DNA。

所谓"单离的多肽"是表示已从自然伴随它的组分单离的本发明的多肽。典型地，当多肽为至少60重量%时是单离的，而且不含与其自然相关的蛋白质和天然存在的有机分子。于具体实施例中，制备至少75重量%,至少90重量%或至少99重量%的本发明的多肽。本发明的单离的多肽可通过，例如，从天然来源萃取而获得，通过表达编码此多肽的重组核酸；或通过化学地合成蛋白质。纯度可通过任何适当方法，例如，柱色谱法、聚丙烯酰胺凝胶电泳、HPLC分析等测量。

于两种或更多种核酸或多肽的语境中，术语"同一性"或"同一性百分率"是指当比较和比对(若需要，引入空位)最大对应，但不考虑任何保守氨基酸取代为序列同一性的一部分时，相同或具有特定百分率的相同核苷酸或氨基酸残基的两个或更多个的序列或子序列。同一性百分率可使用序列比较软件或算法测量或目测测量。本领域中已知有多种算法和软件，而且其可用以获得氨基酸或核苷酸序列的比对。序列比对算法的一个非限制性实例是描述于Karlin et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,87：2264-2268(1990)，由Karlin etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.,90：5873-5877(1993)所修改的算法，以及并入NBLAST和XBLAST程序(Altschul et al.,Nucleic Acids Res.,25：3389-3402(1991))。于某些具体实施例中，有空位的BLAST可如Altschul et al.,Nucleic Res.25：3389-3402(1997)中所述使用。BLAST-2、WU-BLAST-2(Altschul et al.,Methods in Enzymology,266：460-480(1996))、ALIGN、ALIGN-2(Genentech,South San Francisco,California)或Megalign(DNASTAR)为可用以比对序列的可公开取得的另外的软件程序。于某些具体实施例中，两个核苷酸序列之间的同一性百分率是使用GCG软件中的GAP程序测定(例如，使用NWSgapdna.CMP matrix和40、50、60、70或90的空位重量和1、2、3、4、5或6的长度重量)。于某些具体实施例中，GCG套装软件中的GAP程序并入可用以测定两个氨基酸序列之间的同一性百分率(例如，使用Blossum62矩阵或PAM250矩阵和16、14、12、10、8、6或4的空位重量和1、2、3、4、5的长度重量)的Needleman and Wunsch的算法(J.Mol.Biol.(48)：444-453(1970))。于某些具体实施例中，核苷酸或氨基酸序列之间的同一性百分率是使用Myers and Miller(CABIOS,4：11-17(1989))的算法测定。例如，同一性百分率可使用ALIGN程序(2.0版)测定，并且使用具有残基表的PAM1，空位长度罚分为12和空位罚分为4。特别比对软件的最大比对的适当参数可由本领域的技术人员测定。于某些具体实施例中，使用比对软件的预设参数。于某些具体实施例中，第一氨基酸序列与第二序列氨基酸的同一性百分率"X"是计算为100x(Y/Z)，其Y为氨基酸残基的数目(其计数为第一个和第二序列的比对中的相同配对)(如通过目测或特别序列比对程序而比对)，而且Z为第二序列中的残基总数。若第一序列的长度比第二序列更长，则第一个序列与第二序列的同一性百分率将比第二序列与第一个序列的同一性百分率更长。

作为非限制性实例，任何特别多核苷酸是否与参考序列具有特定序列同一性百分率(例如，至少80%同一性、至少85%同一性、至少90%同一性，以及于一些具体实施例中，至少95%、96%、97%、98%或99%同一性)可于某些具体实施例中使用最佳适配(Bestfit)程序(Wisconsin序列分析套组,Version8for Unix,Genetics Computer Group,UniversityResearchPark,575Science Drive,Madison,WI53711)测定。最佳适配使用Smith andWaterman,Advances in Applied Mathematics2：482489(1981)的局部同源性算法，得到两种序列之间的同源性的最佳区段。当使用最佳适配或任何其它序列比对程序测定特别序列是否为，例如，与根据本发明的参考序列为95%同一性时，参数设定成计算参考核苷酸序列全长的同一性百分率，而且允许同源性的空位为高达参考序列的核苷酸总数的5%。

于一些具体实施例中，当比较和比对最大对应时，如使用序列比较算法或目测测量时，本发明的两个核酸或多肽为实质上相同，表示它们具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%，以及于一些具体实施例中，至少95%、96%、97%、98%、99%的核苷酸或氨基酸残基同一性。同一性可存在于长度或其间的任何积分值为至少约5、至少约10、约20、约40至60个残基的序列区，或超过60至80个残基，至少约90至100的残基的更长区，或与比较的序列的全长相比实质同一性的序列。

"保守氨基酸取代"为其中一个氨基酸残基被具有相似的侧链的另一个氨基酸残基置换者。具有相似的侧链的氨基酸残基家族已于本领域中定义，包含碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、无电荷极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯基丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-支链侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及芳族侧链(例如，酪氨酸、苯基丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。例如，以酪氨酸对苯基丙氨酸进行的取代为保守取代。优选地，本发明的多肽和抗体序列上的保守取代不会废除含有氨基酸序列的多肽或抗体与抗原的结合。不会消除抗原结合的辨识核苷酸和氨基酸保守取代的方法为本领域中周知者(参阅，例如，Brummell et al.,Biochem.32：1180-1187(1993)；Kobayashi et al.Protein Eng.12(10)：879-884(1999)；以及Burks et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA94：.412-417(1997))。

"医药可接受"是指美国联邦或州政府的监管机关已核准或可核准者，或列于美国药典者，或以于动物(包含，人类)的其它通常认可的药典。

"医药可接受的赋形剂、载体或稀释剂"是指可与剂共同给药受试者的赋形剂、载体或稀释剂，所述赋形剂、载体或稀释剂不会破坏剂的药理活性，而且当以足以递送治疗量的剂给予剂量时是无毒的。

本文所述流行性感冒抗体的"医药可接受的盐"为本领域中通常被认为适合接触人类或动物的组织，但无过度毒性、刺激、过敏反应或其它问题或并发症的酸或碱盐。此盐包含碱性残基的无机和有机酸盐诸如胺类，以及酸性残基的碱或有机盐的诸如羧酸。具体医药盐包含，但非限于，下述酸的盐类，诸如盐酸、磷酸、氢溴酸、苹果酸、乙醇酸、反丁烯二酸、硫酸、氨基磺酸、对氨基苯磺酸、甲酸、甲苯磺酸、甲磺酸、苯磺酸、乙二磺酸、2-羟基乙磺酸、硝酸、苯甲酸、2-乙酰氧基苯甲酸、柠檬酸、酒石酸、乳酸、硬脂酸、水杨酸、谷氨酸、抗坏血酸、扑酸、琥珀酸、反丁烯二酸、顺丁烯二酸、丙酸、羟基顺丁烯二酸、氢碘酸、苯基乙酸、烷酸诸如乙酸，HOOC-(CH₂)_n-COOH，其中n是0至4等。同样地，医药可接受的阳离子包含，但非限于，钠、钾、钙、铝、锂以及铵。具有本领域一般知识者将辨识进一步用于本文提供的抗体的医药可接受的盐，包含Remington’s Pharmaceutical Sciences,17th ed.,MackPublishing Company,Easton,PA,p.1418(1985)中所列者。通常，医药可接受的酸或碱盐可通过任何传统化学方法从含有碱性或酸性部分的母体化合物合成。简要地，此盐可通过使此等化合物的游离酸或碱形式与化学计量含量的适当碱或酸在适当溶剂中反应而制备。

术语"病人"或"受试者"是指治疗、观察或实验的目标动物。通过例举的方式可知，受试者仅包含，但非限于，哺乳动物，包含，但非限于，人类或非人类哺乳动物，诸如非人类灵长类、牛、马、犬、羊或猫。

如本文所使用，术语"预防(prevent)"、"预防(preventing)"、"预防(prevention)"或"预防性(prophylactic)治疗"等是指减少在不会具有疾病或适应症但有易于发展疾病或适应症的风险的受试者中发展疾病或适应症的概率。

所谓”减少"是表示相对于参考物，至少约10%、25%、50%、75%或100%地负向变化。

所谓”参考"是表示标准品或对照状态。

所谓”特异性地结合"是表示识别和结合本发明的多肽，但不会实质上辨识和结合样本(例如，生物样本)中的其它分子(其自然包含本发明的多肽)的化合物或抗体，。

抗体与表位或蛋白质"特异性地结合"，表示抗体较另外物质(包含不相关的蛋白质)更频繁、更快速、以更大持续时间、以更大亲和力或一些以上者的组合，而与表位或蛋白质反应或相关联。于某些具体实施例中，"特异性地结合"表示，例如，抗体以约0.1mM更少的K_D与蛋白质结合，但在其它时后更常少以约1μM的K_D与蛋白质结合。于某些具体实施例中，"特异性地结合"表示抗体有时以至少约0.1μM更少的K_D与蛋白质结合，而在其它时间以至少约0.01μM或更少的K_D与蛋白质结合。因为不同物种中的同源蛋白质之间的序列同一性，特异性地结合可在超过一种物种中包含识别特别蛋白质的抗体。应理解与第一个目标特异性地结合的抗体或结合部分可或可不与第二目标特异性地结合。因此，"特异性地结合"不会一定需要(虽然其可包含)排除性结合，即，与单一目标结合。一般，但非必需，关于结合是意指特异性地结合。

如本文所使用，"实质上纯"是指物料为至少50%纯(即，不含污染物)，更优选为至少90%纯，更优选为至少95%纯，更优选为至少98%纯，更优选为至少99%纯。

如本文所使用，术语"治疗(treat)"、治疗(treating)"、"治疗(treatment)"等是指减少或改善与其相关联的病症及/或症状。所谓”改善"，是表示减少、阻抑、衰减、递减、阻止、或稳定疾病的发展或进展。应理解，虽然非排除，但治疗病症或适应症不会需要将与其相关联的病症、适应症或症状完全消除。

术语"治疗功效"是指一定程度上缓解病症的一个或多个症状或其相关病理。所述术语是指治疗处理和预防或预防措施两者，其中目的为预防针对的病理状态或病症或使其变慢(减少)。需要治疗者包含已具有病症者以及易于具有病症者或那些待预防病症者。若根据本发明的方法接受治疗量的抗体之后，对于下列情况的一个或多个，病人显示可观察的及/或可测量的减少或没有，则受试者或哺乳动物的感染被成功地"治疗"：减少感染细胞的数目或没有感染细胞；减少感染总细胞的百分率；缓解一个或多个与特异性感染相关的症状(例如，与流行性感冒感染相关的症状)至一定程度；减少发病率和死亡率，以及的改善生活质量问题。可容易地以医师熟悉的常规步骤测量用于评估成功的疾病治疗和改善的以上参数。

"治疗有效量"意欲定性需要达成治疗功效的含量。本领域中具有通常知识的医师或兽医可容易测定和规定需要的医药组合物的"治疗有效量"(例如，ED₅₀)。例如，医师或兽医会在医药组合物中以低于达成期望的治疗功效所需的剂量采用本发明的化合物而开始，然后缓慢地增加剂量直到达成期望的功效。

短语"组合治疗"采用流行性感冒抗体和第二治疗剂的给药，以作为意欲由此等治疗剂的共同作用提供有益功效的特定治疗养生法的一部分。组合的有益功效包含，但非限于，由组合的治疗剂所造成的药物动力或药效共同作用。此等治疗剂的组合给药典型是于定义时期(取决于选择的组合，通常为分钟、小时、天或周)进行。"组合治疗"通常非意欲涵盖两种或更多种此等治疗剂的给药作为顺便地和任意地造成本发明的组合物的个别单一治疗养生法的一部分。"组合治疗"意欲以依序的给药方式采用此等治疗剂，其中各治疗剂是于不同时间给药，以及此等治疗剂或至少两种的治疗剂是以实质上同时方式给药。实质上同时给药可通过例如对受试者给药具有固定比率的各治疗剂的单一胶囊，或各治疗剂的多个单一胶囊而实现。例如，本发明的一种组合在相同或不同时间包括流行性感冒抗体和至少一种另外的治疗剂(例如，抗病毒剂，包含抗流行性感冒剂)，或其可调配成单一共同调配的包括两种化合物的医药组合物。作为另一个实例，本发明的组合(例如，流行性感冒抗体和至少一种另外的治疗剂，诸如抗病毒剂)调配成可在相同或不同时间给药的个别医药组合物。各治疗剂的依序或实质上同时给药可以任何适当路径包含，但非限于，口路径、静脉内路径、肌内路径以及直接吸收通过粘膜组织(例如，鼻、口、阴道以及直肠)而起效。治疗剂可通过相同路径或不同路径给药。例如，特别组合的一个组分可通过静脉内注射而给药，同时组合的其它组分可口服给药。组分可以任何治疗有效的序列给药。

短语"组合"采用有用为组合物治疗的一部分的化合物或非药物治疗的群组。

术语"载体"表示能在宿主细胞中递送和表达感兴趣的一个或多个基因或序列的构筑物。载体的实例包含，但非限于，病毒载体、无改性的DNA或RNA表达载体、质体、粘粒或噬菌体载体、与阳离子性缩合剂相关的DNA或RNA表达载体、包囊于脂质体的DNA或RNA表达载体以及某些真核细胞诸如生产细胞。

除非具体注明或从语境显而易见，如本文所使用，术语"约"应理解为本领域中的正常公差范围内，例如均值的2标准差内。可理解为注明值的10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%或0.01%内。除非从语境指出清楚，本文提供的所有数值是以术语"约"修改。

本文提供的范围应理解为范围内的所有值的略写。例如，1至50的范围应理解为包含由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50所组成组的任何数字、数字的组合、或子范围。

本文的变量的任何定义中化学基团列表的叙述包含所述变量为任何单一基团或所列基团的组合的定义。本文变量或方面的具体实施例的叙述包含以任何单一具体实施例或与任何其它具体实施例或其部分组合的方式的具体实施例。

本文提供的任何组合物或方法提供可为与本文提供的一个或多个的任何其它组合物和方法合并。

附图说明

图1.(A)克隆860的推测谱系。左图：从供体单离的三个抗体的未突变的一般原始种型(UCA)(以其数字显示，右图)。(B)谱系中的重链(顶图)和轻链(底图)的序列比对。(C)来自CH65的与HAL接触的Fab。重链为深蓝色；轻链为浅蓝色；(B)中标示CDR为有颜色者；HA为红色，而原子表面显示为部分透明覆盖。从UCA突变的残基为绿色棒状物表示。

图2.(A)具有结合的CH65Fab的HA三聚体。一个HA链为红色(HA1)和绿色(HA2)；其它两个链为灰色；聚糖为黄色。结合有颜色的HA链的Fab为深蓝色(重链)和浅蓝色(轻链)，而接触的CDR为图1B标示为有颜色者。(B)Fv区及其与HAI接触的放大图。颜色与图1相同。注意重链CDR3(洋红色)伸入HAI上的受体结合袋状结构，同时剩余的CDR具有更受限制的表面接触。(C)和(D)为FabCH65和HAI之间的接触的表面表示图，如箭头所示处打开。一个HA亚单元上的唾液酸袋状结构为深红色；剩余的亚单元为暗红色；剩余的两种亚单元为灰色；聚糖为黄色。

图3.CH65(A)和α-2,6-唾液基乳糖(B)的交互作用的比较。

图4.CH65-CH67谱系成员与H1和H3流行性感冒病毒株的反应性的酶链接免疫吸附检测法(ELISA)。293T细胞以来自病毒株X31(H3)的全长度HA转染(顶格，A至C)或以来自A/Solomon Islands/3/2006[H1]的表达在细胞表面的球状头转染(底格，E至G)。将细胞以甲醛固定，并且以CH65Fab(b和f)或CH66全长抗体(C和G)针探(probed)，接着以对人类Fab有特异性的FITC-偶联的第二抗体特异性针探。细胞以FITC发射(532nm)成像。至于对照组，转染细胞仅以第二抗体针探(A和E)。

图5.CH65的VDJ重组位点的序列。基码(key)表示重链编码区段(V、D、J以及n-核苷酸)的原点。

图6.CH65-CH67HA抗体的重链DNA序列。

图7.CH65-CH67HA抗体的轻链DNA序列。

图8.CH65-CH67HA抗体的重链氨基酸序列。

图9.CH65-CH67HA抗体的轻链氨基酸序列。

图10.CL860UCA、CH65、CH66以及CH67的VH DNA序列的比对。

图11.CL860UCA、CH65、CH66以及CH67的VL DNA序列的比对。

图12.CL860UCA、CH65、CH66以及CH67的VH氨基酸序列的比对。

图13.CL860UCA、CH65、CH66以及CH67的VL氨基酸序列的比对。

图14.来自H1(A)、H2(B)、H3(C)以及H5(D)血凝素的代表性受体结合结构域。CH65-CH67抗体结合表位是加底线。

图15.来自H1、H2、H3以及H5血凝素的代表性受体结合结构域的序列比对。与CH65-CH67抗体交互作用的氨基酸残基是加底线。

具体实施方式

本发明的特征为广泛中和流行性感冒抗原变异体的新颖抗体。本发明亦提供含有新颖抗体的组合物和试剂盒、以及使用此等新颖治疗分子治疗或预防(例如，疫苗接种)流行性感冒感染的方法。

受体流行性感冒病毒的受体为唾液酸，由α-2,3或α-2,6端链接附接至糖蛋白质或糖脂质上的聚糖(Wiley,D.C.and Skehel,J.J.Annu.Rev.Biochem.56：365-394(1987)中评论)。大部分的中和抗体阻挡细胞附接，因为其足迹与受体结合位点重叠或因为当在HA表面上的别处结合时发挥立体干扰(Knossow,M.and Skehel,J.J.Immunology119：1-7(2006))。已测定Fab：HA复合物的结构的两种小鼠单克隆中和抗体具有伸入HA上的唾液酸结合袋状结构的环，而且在唾液酸羧酸酯大致所在处呈现天冬氨酸侧链(Fleury,D.et al.,Nat.Struct.Biol.5：119-123(1998)；以及Barbey-Martin,C.et al.,Virology294：70-74(2002))。但此等抗体皆亦与其中逃逸突变会较受体位点更容易发生的其它表面区有广泛接触，。

本发明至少部分基于在受体袋状物中发现具有主要接触的新颖抗体。一种此抗体被指定为CH65，而且其发现是通过从已接受2007三价疫苗的受试者获得的分选的单一浆细胞单离重排的重键和轻链基因。CH65中和非常广泛范围的跨越超过三十年H1季节性单离物。其19个残基重链互补性测定区3(CDR-H3)插置入受体袋状结构，仿真以唾液酸进行的许多交互作用。重链和轻链CDR两者参与和HA1的朝外表面的更为限制的另外接触。CH65的推测且未突变的原始种型与成熟亲和力的抗体在重链可变结构域中的12个位置和在轻链可变结构域中的6个位置有所不同。因此，人类B-细胞库(repertiore)包含产生主要针对受体结合位点的抗体的可能性。大量季节性H1病毒是由抗体CH65中和，暗示此反应平常太少见以致无法选择抗性，或抗性造成不适合的代价太高(其为若潜在的逃逸突变损害受体结合会发生的情况)。因此，令人惊奇的是，发明者已发现广泛中和流行性感冒病毒的可通过仿真那些受体所具者的接触的抗体而达成。从而，本发明提供模拟流行性感冒HA和唾液酸受体之间的接触的新颖抗体。此等新颖抗体可有效地治疗及/或预防流行性感冒感染的漂移株。因此，本发明的特征为含有新颖抗体的组合物和试剂盒、以及使用此等治疗分子治疗及/或预防流行性感冒感染的方法。本发明亦有关包含新颖抗体的组合物治疗。

CH65-CH67血凝素抗体

本发明提供与流行性感冒血凝素(HA)的表位特异性地结合的新颖抗流行性感冒抗体。抗体与HA的结合减少或抑制流行性感冒血凝素与唾液酸的结合。

于具体实施例中，流行性感冒HA的表位包括唾液酸结合结构域。

于具体实施例中，HA为H1HA、H2HA、H3HA或H5HA(来自适应人类的H5病毒株的HA)。

于相关具体实施例中，流行性感冒HA表位包括对应于来自A/Solomon Islands/3/2006的CDR H1残基158；CDR H2残基158至160；CDR H3残基135至136、190至195以及226；CDRLl残基222、225以及227；以及CDR L3残基187和189的氨基酸。

于相关具体实施例中，流行性感冒HA表位包括SEQ ID NO：17至44中任一者所表示的氨基酸。

于相关具体实施例中，流行性感冒HA表位包括SEQ ID NO：17至44中任一者中的CH65-CH67结合残基(例如，图15中辨识的CH65-CH67结合残基)。

于具体实施例中，抗流行性感冒抗体或抗体片段包括可变重(VH)链，其中V_H链包括SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12中所表示的氨基酸序列。

于具体实施例中，抗流行性感冒抗体或抗体片段包括一个或多个存在于SEQ IDNO：9、SEQ ID NO：10,SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12的可变重(V_H)链氨基酸序列中的重链CDR区。于相关具体实施例中，一个或多个重链CDR区包括存在于SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12的可变重(V_H)链氨基酸序列中的CDR3区。

于具体实施例中，抗流行性感冒抗体或抗体片段包括可变轻(V_L)链，其中V_L链包括SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：16所表示的氨基酸序列。

于具体实施例中，抗流行性感冒抗体或抗体片段包括一个或多个包括存在于SEQID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：16的可变轻(V_L)链氨基酸序列中的轻链CDR区。于相关具体实施例中，一个或多个轻链CDR区包括存在于SEQ ID NO：13、SEQ IDNO：14、SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：16的可变重(V_L)链氨基酸序列中的CDR3区的。

于具体实施例中，抗流行性感冒抗体或抗体片段包括i)包括SEQ ID NO：10所表示的氨基酸序列的可变重(V_H)链氨基，以及ii)包括SEQ ID NO：14所表示的氨基酸序列的可变轻(V_L)链。

于具体实施例中，抗流行性感冒抗体或抗体片段包括可变重(V_H)链，其中V_H链的CDR3区包括Arg104、Ser105、Va1106、Asp107、Tyr109、Tyr110、Tyr112或其组合。

于具体实施例中，抗流行性感冒抗体为其单克隆抗体或抗体片段。

于具体实施例中，抗流行性感冒抗体为人源化抗体。

于具体实施例中，抗体片段为Fab片段、Fab'片段、Fd片段、Fd'片段、Fv片段、dAb片段、F(ab')2片段、单链片段、双链抗体或线性抗体。

于具体实施例中，抗流行性感冒抗体或抗体片段进一步包括与抗流行性感冒抗体或其抗体片段偶联的剂。于相关具体实施例中，与抗体或其抗体片段偶联的剂为治疗剂或可检测的标记。

治疗剂可为适合与新颖抗体共享的任何治疗剂。此剂为本领域中周知者，而且包含小分子、纳米粒子、多肽、放射性同位素、抑制性核酸等。于具体实施例中，治疗剂为抗病毒剂或毒素。于具体实施例中，治疗剂为减少流行性感冒病毒产生的siRNA、shRNA或反义核酸分子。

可检测的标记可为适合与新颖抗体共享的任何可检测的标记。此标记为本领域周知者，而且包含可以光谱、光化学、生化、免疫化学、物理或化学方式检测的标记。于具体实施例中，可检测的标记为已制成可检测的酶、荧光分子、颗粒标记、电子致密试剂、放射性标记、微泡、生物素、地高辛或半抗原或蛋白质。

于任何以上具体实施例中，流行性感冒可为H1N1、H2N2、H3N2或适应人类的H5病毒株。

本发明的抗体可通过任何本领域中已知的传统工具制备。例如，多克隆抗体可通过以多重皮下或腹膜内注射视需要地偶联适合半抗原(例如，钥孔血蓝蛋白(KLH)、血清白蛋白等)的相关抗原(例如，纯化肽片段、全长重组蛋白质、融合蛋白质等)，而免疫接种动物(例如，兔子、大鼠、小鼠、驴、山羊、仓鼠、豚鼠、绵羊、有蹄类动物、牛、骆驼、禽、鸡等)而制备。抗原可以任何适合载液(例如，无菌食盐水)稀释，并且与佐剂(例如，完整或不完整的弗氏佐剂(Freund’sAdjuvant))合并以形成乳剂。接着，自因此免疫接种的动物的血液、腹水等回收多克隆抗体。使采集的血液凝固，并且将血清倒出，通过离心而变清澈，以及检测抗体的效价。多克隆抗体可根据本领域中的标准方法，包含亲和力色谱法、离子交换色谱法、凝胶电泳、透析等，从血清或腹水纯化。

单克隆抗体可使用杂交瘤方法如Kohler and Milstein,Nature256：495(1975)中描述的那些方法制备。使用杂交瘤方法，将适当宿主动物如上述免疫接种，以引发淋巴细胞产生将与免疫接种抗原特异性地结合的抗体的。淋巴细胞亦可体外免疫接种。免疫接种以后，将淋巴细胞单离，并且使用例如聚乙二醇与适合的骨髓瘤细胞系融合，以形成可接着从未融合的淋巴细胞和骨髓瘤细胞单离的杂交瘤细胞。免疫沉淀、免疫印迹法或体外结合检测法(例如，放射性免疫检测法(RIA)、酶链接免疫吸附检测法(ELISA)等)测定的产生特异性地针对所选的抗原的单克隆抗体的杂交瘤可接着使用标准方法而以体外培养物传播(参阅Goding,Monoclonal Antibodies：Principles and Practice,Academic Press,1986)或以在动物中的腹水肿瘤方式而体内传播。如以上所述关于多克隆抗体者，单克隆抗体可接着从培养基或腹水液体纯化。

或者，单克隆抗体亦可使用美国专利US4,816,567中所述重组DNA方法进行。编码单克隆抗体的多核苷酸是通过诸如使用具体扩增编码抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸引物的RT-PCR，而从成熟B-细胞或杂交瘤细胞单离，而且其序列是使用传统程序测定。接着，编码重链和轻链的单离的多核苷酸(包含本文所述单离的多核苷酸)克隆化入适合的表达载体，当所述表达载体转染入宿主细胞诸如大肠杆菌(E.coli)细胞、猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或不会产生免疫球蛋白蛋白质的骨髓瘤细胞时，所述宿主细胞产生单克隆抗体。另，如所述，期望的物种的重组单克隆抗体或其片段可从表达期望的物种的CDR的噬菌体展示库单离(参阅McCafferty et al.,1990,Nature,348：552-554；Clackson etal.,1991,Nature,352：624-628；以及Marks et al.,1991,J.Mol.Biol.,222：581-597)。

编码单克隆抗体的多核苷酸可进一步以一些使用重组DNA技术的不同方式改性以产生另外的抗体。于一些具体实施例中，例如，小鼠单克隆抗体的轻链和重链的恒定结构域可以下列者取代：1)例如，人类抗体的那些区以产生嵌合抗体，或2)非免疫球蛋白多肽以产生融合抗体。于一些具体实施例中，将恒定区截短或移除，以产生单克隆抗体的期望的抗体片段。可变区的位点引导或高密度突变可用以最优化单克隆抗体的特异性、亲和力等。

于本发明的一些具体实施例中，单克隆抗体为人源化抗体。人源化抗体为含有来自非人类(例如，啮齿动物)抗体的最小序列，所述非人类抗体在包括各抗体链内有三个互补决定区(CDR)的抗原决定或高度可变区内。治疗地使用此抗体以减少当给药人类受试者时的抗原性和HAMA(人类抗小鼠抗体)反应。实务上，人源化抗体为典型具有最小至实际上无非人类序列的人类抗体。人类抗体为人类产生的抗体或具有对应于人类所产生的抗体的氨基酸的抗体。

人源化抗体可使用多种本领域中已知的技术产生。抗体可通过以那些具有期望的特异性、亲和力以及能力的非人类抗体(例如，小鼠、大鼠、兔子、仓鼠等)的CDR取代人类抗体的CDR而人源化(参阅,例如，Jones et al.,Nature321：522-5(1986)；Riechmann etal.,Nature332：323-327(1988)；以及Verhoeyen et al.,Science239：1534-1536(1988)的方法。人源化抗体可通过可变人类骨架区中及/或置换的非人类残基内的另外的残基的取代而进一步改性，以细化和最优化抗体特异性、亲和力及/或能力。

选择用于制造人源化抗体的人类重链及/或轻链可变结构域对于减少抗原性而言可为重要的。根据"最佳适配"方法，针对已知人类可变结构域氨基酸序列的整个库筛选非人类抗体的可变结构域的序列。因此，于某些具体实施例中，与从其中取CDR的非人类抗体的氨基酸序列最同源的人类氨基酸序列是用作人源化抗体的人类骨架区(FR)(参阅Simset al.,J.Immunol.151：2296(1993)；Chothia et al.,J.Mol.Biol.196：901(1987))。另一个方法使用衍生自特别轻链或重链子群的所有人类抗体的共有序列的特别FR，而且可使用于许多不同的人源化抗体(参阅Carter et al.,PNAS89；4285(1992)；Presta et al.,J.Immunol.151：2623(1993))。于具体实施例中，使用一组方法以挑出用于产生人源化抗体的人类可变FR。

应进一步理解待人源化的抗体必须保留与抗原的高亲和力以及其它有利的生物性质。为了达成此目标，人源化抗体可通过分析来自待人源化的非人类抗体的亲本序列和的多个候选人源化序列的过程而制备。那些本领域技术人员可用和熟悉三维免疫球蛋白模型。计算机程序可用以说明和展示选择的候选抗体序列的可能三维构形结构。使用此等模型允许对残基在待人源化的抗体的功能中的可能角色进行分析，即，分析影响候选抗体与其抗原结合的能力的残基。以此方式，可从亲本抗体选择FR残基，并将其与接受者人源化抗体合并以便达成期望的抗体特征。通常，人源化抗体中的亲本抗体(例如，具有期望的抗原结合性质的非人类抗体)保留抗原决定区(或高度可变区)的CDR中的残基，以进行抗原结合。于某些具体实施例中，人源化抗体中的亲本抗体保留可变FR内的至少一个另外的残基。于某些具体实施例中，人源化抗体中的亲本抗体保留可变FR内的最多六个另外的残基。

来自免疫球蛋白分子的成熟重链和轻链的可变区的氨基酸分别指定为Hx和Lx，其中x为根据美国卫生部门和人类服务(U.S.Department of Health and Human Services)，1987,1991，免疫学感兴趣的蛋白质序列(Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest)Kabat的方案所指定的氨基酸位置数目。Kabat针对各子群列出抗体的许多氨基酸序列，并且针对所述子群中各残基位置列出最常出现的氨基酸以产生共有序列。Kabat使用一种对列表序列中的各氨基酸分配残基数的方法，而且此分配残基数的方法已成为本领域中的标准。Kabat的方案扩展至不包含于他的概要中的其它抗体，通过以参考保守氨基酸的方式而比对有疑问的抗体与Kabat中的共有序列之一。Kabat编号系统的使用容易辨识在不同抗体中的相等位置的氨基酸。例如，在人类抗体的L50位置的氨基酸占据小鼠抗体的L50氨基酸位置的相等位置。再者，通过使用Kabat编号系统以便将一个抗体序列中的各氨基酸与具有相同Kabat数字的其它序列中的氨基酸对齐，而使任何两种抗体序列可独特地对齐，例如，以测定同一性百分率。比对之后，若受试者抗体区(例如，重链或轻链的整个成熟可变区)与参考抗体的相同区比较，则受试者和参考抗体区之间的序列同一性百分率为受试者和参考抗体区两者中相同氨基酸占据的位置数除以两区的总比对位置数(不算空位)，并且乘以100以换算成百分率。

除了人源化抗体之外，完整人类抗体可直接使用本领域中的已知多种技术制备。可产生体外免疫接种的永生化人类B淋巴细胞或从针对目标抗原产生抗体的免疫接种的个体单离的永生化人类B淋巴细胞(参阅,例如，Cole et al.,Monoclonal Antibodies andCancerTherapy,Alan R.Liss,p.77(1985)；Boemer et al.,J.Immunol.147：86-95(1991)；以及美国专利US5,750,373)。另，人类抗体可为选自噬菌体库，其中所述噬菌体库表达人类抗体(参阅Vaughan et al.,Nat.Biotech.14：309-314(1996)；Sheets et al.,Proc.Nat'l.Acad.Sci.95：6157-6162(1998)；Hoogenboom and Winter,J.Mol.Biol.227：381(1991)；以及Marks et al.,J.Mol.Biol.222：581(1991))。人类抗体亦可在含有人类免疫球蛋白基因座的转基因小鼠中制造，所述基因座能在免疫接种时于缺乏内源免疫球蛋白产生下产生完整库的人类抗体。此方法描述于美国专利第5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；以及5,661,016号。

本发明亦涵盖双特异性抗体。双特异性抗体为能特异性地识别和结合至少两种不同表位的抗体。不同表位可在相同分子内(例如，流行性感冒HA)或在不同分子上，致使双特异性抗体可特异性地辨识和结合感兴趣的抗原中的表位(例如，流行性感冒HA)以及，例如，另一种病毒蛋白质(例如，神经氨酸酶、M2等)。双特异性抗体可为完好抗体或抗体片段。制造双特异性抗体的技术为本领域中常见者(参阅Millstein et al.,Nature305：537-539(1983)；Brennan et al.,Science229：81(1985)；Suresh et al,Methods inEnzymol.121：1(1986)；Traunecker et al.,EMBO J.10：3655-3659(1991)；Shalaby etal.,J.Exp.Med.175：217-2(1992)；Kostelny etal.,J.Immunol.148：1547-1553(1992)；Gruber et al.,J.Immunol.152：5368(1994)；以及美国专利第5,731,168号)。亦预期具有超过两个配价的抗体。例如，可制备三特异性抗体(参阅Tutt et al.,J.Immunol.147：60(1991))。

于具体实施例中，本发明的抗体为抗体片段。已知有多种产生抗体片段的技术：传统上，此等片段经由蛋白水解消化完好抗体而衍生(参阅，例如，Morimoto et al.,Journalof Biochemical and Biophysical Methods24：107-117(1993)；以及Brennan et al.,Science229：81(1985))。抗体片段亦可重组地产生。Fab、Fv以及scFv抗体片段皆可于大肠杆菌或其它宿主细胞中表达或从其分泌，因此允许生产大量的此等片段。此抗体片段亦可从上述的抗体噬菌体库分离。抗体片段亦可为，例如，美国专利第5,641,870号中描述的线性抗体，而且可为单特异性或双特异性。其它生产的抗体片段的技术将对本领域技术人员而言是容易显而易见的。

根据本发明，可修改技术以生产对本发明的多肽有特异性的单链抗体(参阅美国专利第4,946,778号)。此外，可修改方法以构筑Fab表达库(参阅Huse et al.,Science246：1275-1281(1989))，以允许快速和有效辨识对流行性感冒HA有期望的特异性的单克隆Fab片段。可通过本领域中的技术产生含有本发明的多肽的独特型的抗体片段，所述抗体片段包含，但非限于：(a)通过胃蛋白酶消化抗体分子而产生的F(ab')2片段；(b)通过还原F(ab')2片段的双硫桥而产生的Fab片段；(c)通过以木瓜蛋白酶和还原剂处理抗体分子而产生的Fab片段；以及(d)Fv片段。

可进一步期望，尤其是在抗体片段的情况下，改性抗体以增加其血清半衰期。这可通过，例如，将补救受体结合表位以使抗体片段中的适当区突变的方式并入抗体片段，或将表位并入接着以端或中间点融合抗体片段(例如，通过DNA或肽合成)的肽标记而达成。

异种偶联抗体亦落入本发明的范畴。异种偶联抗体是由两个共价连结抗体所组成。已提议用此抗体以例如使免疫细胞以无用细胞为目标(美国专利第4,676,980号)。预期抗体可使用已知的合成蛋白质化学的方法体外制备，包含那些涉及交联剂的方法。例如，免疫毒素可使用双硫化物交换反应或通过形成硫醚键而构筑。用于此目的适合试剂的实例包含亚氨基硫醇酯和甲基-4-巯基丁酰亚氨酸酯。

本发明预期的另一个变化为重链和轻链两者中的可变结构域以一个或多个CDR的至少部分置换而改变，而且若需要，通过部分骨架区置换和序列改变而改变。虽然CDR可衍生自与从其中衍生骨架区的抗体属于相同类别或甚至子类的抗体，预知CDR将衍生自不同类别的抗体和优选地衍生自不同物种的抗体。可能不需要以来自供体可变区的完整CDR置换所有CDR以将一个可变结构域的抗原结合能力转移成另一者。而是，可能只需要将那些需要维持抗原结合位点的活性的残基者转移。有鉴于美国专利第5,585,089、5,693,761以及5,693,762号所载说明，进行常规实验或通过尝试错误试验而获得具有获得减少免疫原性的功能抗体将在那些本领域技术人员的能力范围内。

虽然可变区有变化，那些本领域技术人员将意识到本发明的改性抗体可包括抗体或其免疫反应性片段，其中当与具有包括天然或未变化的恒定区的大约相同免疫原性的抗体比较时，一个或多个恒定区结构域的至少小部分已缺失或变化以便提供期望的生化的特征，诸如，增加肿瘤局部化或减少血清半衰期。于一些具体实施例中，改性抗体的恒定区将包括人类恒定区。与本发明兼容的恒定区的改性包括一个或多个结构域中的一个或多个氨基酸的添加、缺失或取代。亦即，本文揭露的改性抗体可包括三个重链恒定结构域(CH1、CH2或CH3)及/或轻链恒定结构域(CL)的一者或多者的变化或改性。于本发明的一些具体实施例中，预期其中一个或多个结构域部分地或全部地缺失的改性恒定区。于一些具体实施例中，改性抗体将包括结构域缺失的构筑物或变异体，其中整个CH2结构域已被移除(ΔCH2构筑物)。于一些具体实施例中，省略的恒定区结构域将以提供一些典型由缺乏恒定区展现的分子柔度的短氨基酸间隔物(例如，10个残基)置换。

本发明进一步采用实质上与本文表示的嵌合、人源化以及人类抗体或其抗体片段实质上同源的变异体和相等者。这些可含有，例如，保守取代突变，亦即，以相似的氨基酸取代一个或多个氨基酸。例如，保守取意指以相同一般类别内的其它者取代的氨基酸，诸如，例如，一个酸性氨基酸以另一个酸性氨基酸取代，一个碱性氨基酸以另一个碱性氨基酸取代，或一个中性氨基酸以另一个中性氨基酸取代。所谓保守氨基酸取代的含义为本领域中周知者。

可以本领域中已知的任何方法检测本发明的抗体的免疫特异性结合。可使用的免疫检测法包含，但非限于，使用技术诸如BIAcore分析、FACS分析、免疫荧光、免疫细胞化学、免疫印迹法、放射性免疫检测法、ELISA、"三明治"免疫检测法、免疫沉淀检测法、沉淀素反应、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩散检测法、凝集检测法、补体固定检测法、免疫放射分析检测法、荧光免疫检测法、蛋白质A免疫检测法等的竞争和非竞争检测法系统。此检测法为常规而且为本领域中周知者(参阅，例如，Ausubel et al,eds,1994,Current Protocols inMolecularBiology,Vol.1,John Wiley&Sons,Inc.,New York，其是以参考方式全部并入本文)。

于具体实施例中，针对流行性感冒HA的抗体的免疫特异性是使用ELISA测定。ELISA检测法包括制备抗原，以抗原涂布微孔板的孔、在孔中添加与抗体偶联的可检测的化合物诸如酶物质(例如，辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)，培养一段时期以及检测抗原的存在。于一些具体实施例中，抗体非与可检测化合物偶联，但而是在孔中添加识别针对流行性感冒HA抗原的抗体的第二偶联抗体。于一些具体实施例中，不是以抗原涂布孔，而是可涂布抗体，而且可在涂布的孔中添加抗原后，添加与可检测的化合物偶联的第二抗体。本领域中技术人员会了解可修改参数以增加侦测的信号以及其它本领域中已知的ELISA变化(参阅例如，Ausubel et al,eds,1994,Current Protocols in Molecular Biology,Vol.1,JohnWiley&Sons,Inc.,New York at11.2.1)。

抗体与流行性感冒HA的结合亲和力和抗体-抗原交互作用的解离速率可通过竞争结合检测法测定。竞争结合检测法的一个实例为放射性免疫检测法，其包括在增加量的未标示的抗原的存在下，培养标示的抗原(例如，³H或¹²⁵I)或其片段或变异体与感兴趣的抗体，接着侦测与标示的抗原结合的抗体。抗体与抗原的亲和力和结合解离速率可从斯卡查德(scatchard)图分析的数据测定。于一些具体实施例中，BIAcore动力分析是用以测定抗体与癌症干细胞标记物的结合和解离速率。BIAcore动力分析包括分析抗体与在其表面上有固相化癌症干细胞标记物抗原的芯片的结合与分离。

流行性感冒血凝素抗体多肽和多核苷酸

本发明亦涵盖单离的多核苷酸，其编码包括流行性感冒血凝素(HA)抗体或其片段的多肽。

术语"编码多肽的多核苷酸"涵盖仅包含多核苷酸的编码序列以及包含另外的编码及/或非编码序列的多核苷酸。本发明的多核苷酸可为RNA形式或DNA形式。DNA包含cDNA、基因组DNA以及合成DNA；以及可为双链或单链，以及若为单链，则可为编码链或非编码(反义)链。

本发明进一步有关多核苷酸的变异体，例如，片段、类似物以及衍生物。多核苷酸的变异体可为多核苷酸的天然存在的等位基因变异体或多核苷酸的非天然存在的变异体。于某些具体实施例中，多核苷酸可具有为揭露的多肽的编码序列的天然存在的等位基因变异体的编码序列。如本领域中已知，等位基因变异体为具有，例如，一个或多个核苷酸的取代、缺失或添加的多核苷酸序列的替代的形式，而且不会实质上改变编码的多肽的功能。

于具体实施例中，多核苷酸可包括与协助例如多肽的表达和其从宿主细胞分泌(例如，作用为控制多肽从细胞传送的分泌序列的前导序列)的多核苷酸以相同阅读框融合的成熟多肽的编码序列。多肽具有为前蛋白的前导序列，且所述前导序列可被宿主切断细胞以形成成熟形式的多肽。多核苷酸亦可编码为成熟蛋白质加上另外的5'氨基酸残基的原蛋白。具有的原序列的成熟蛋白质为原蛋白，为且失活形式的蛋白质。一旦原序列被断裂，则剩下活性成熟蛋白质。

于具体实施例中，多核苷酸可包括与允许例如纯化编码的多肽的标记物序列以相同阅读框融合的成熟多肽的编码序列。例如，标记物序列可为由pQE-9载体所供应的六组氨酸标记，以在细菌宿主的情况下提供与标记物融合的成熟多肽的纯化，或当使用哺乳动物宿主(例如，COS-7细胞)时标记物序列可为衍生自流行性感冒血凝素蛋白质的血凝素(HA)标记。另外的标记包含，但非限于，Calmodulin标记、FLAG标记、Myc标记、S标记、SBP标记、软标记(Softage)1、软标记3、V5标记、Xpress标记、Isopep标记、Spy标记、生物素、羧基载体蛋白质(BCCP)标记、GST标记、荧光蛋白质标记(例如，绿色荧光蛋白质标记)、麦芽糖结合蛋白质标记、Nus标记、Strep-标记、硫氧还蛋白标记、TC标记、Ty标记等。

于具体实施例中，本发明提供单离的核酸分子，其具有与编码包括本发明的流行性感冒HA抗体或抗体片段的多肽的多核苷酸具有为至少80%同一性，至少85%同一性，至少90%同一性，至少95%同一性，或至少96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列。

所谓多核苷酸具有，例如，与参考核苷酸序列具有为至少95%"同一性"的核苷酸序列意指多核苷酸的核苷酸序列与参考序列相同，但针对参考核苷酸序列的每各100核苷酸，所述多核苷酸序列可包含最多五个点突变。换句话说，为了获得具有与参考核苷酸序列具有为至少95%同一性的核苷酸序列的多核苷酸，参考序列中高达5%核苷酸可缺失或以其它核苷酸取代，或参考序列中可插入所述参考序列中高达5%总核苷酸的一些核苷酸。参考序列的此等突变可发生在参考核苷酸序列的氨基或羧基端位置或在那些端位置之间的随处，所述突变是在参考序列中的核苷酸之间个别穿插或在参考序列内的一个或多个邻接的基团中穿插。

作为一个实际的问题，可传统上使用已知计算机程序测定，诸如最佳适配程序(Wisconsin Sequence Analysis Package,Version8for Unix,Genetics Group,University Research Park,575Science Drive,Madison,WI53711)任何特别核酸分子是否与参考序列为具有至少80%同一性、至少85%同一性、至少90%同一性，以及于一些具体实施例中，至少95%、96%、97%、98%或99%同一性。最佳适配使用Smith and Waterman,Advancesin Applied Mathematics2：482489(1981)的局部同源性算法，以得到两个序列之间的同源性的最佳区段。当使用最佳适配或任何其它序列比对程序测定特别序列是否与根据本发明的参考序列具有，例如，95%同一性时，参数是设定成计算参考核苷酸序列的全长的同一性百分率，并且允许同源性中的空位为高达5%的参考序列中的核苷酸总数。

多核苷酸变异体可含有编码区、非编码区或两者中的变化。于一些具体实施例中，多核苷酸变异体含有产生静止取代(silent substitution)、添加或缺失的变化，但不会改变编码多肽的性质或活性。于一些具体实施例中，由于遗传密码的简并性，核苷酸变异体是由静止取代产生。多核苷酸变异体可因各种原因产生，例如，最优化特别宿主的密码子表达(将人类mRNA中的密码子改成那些细菌宿主诸如大肠杆菌者首选者)。

本发明的多肽可为对抗流行性感冒HA的重组多肽、天然多肽、或包括抗体的合成多肽或其片段，本领域将识别本发明的一些氨基酸序列可变异，但对蛋白质的结构或功能无显着效果。因此，本发明进一步包含显示对流行性感冒HA有实质活性或包含人源化抗体或其片段的多肽的变异。此突变体包含缺失、插入、倒位、重复和类型取代。

多肽和类似物可进一步改性以含有通常并非蛋白质的一部分的另外的化学部分。那些衍生的部分可改善蛋白质的溶解度、生物半衰期或吸收。所述部分亦可减少或消除蛋白质等的任何期望副作用。Remington’s Pharmaceutical Sciences,Sciences,20^th ed.,Mack Publishing Co.,Easton,PA(2000)中可找到那些部分的概观。

本文中的单离的多肽可描述为由任何本领域中已知的适合方法产生。此方法的范围是从直接蛋白质合成方法至构筑编码单离的多肽序列的DNA序列和在适合的转化宿主中表达那些序列的方法。于一些具体实施例中，通过单离或合成编码感兴趣的野生型蛋白质的DNA序列，而使用重组技术构筑DNA序列。视需要地，序列可通过位点特异性突变诱变，以提供其功能类似物。参阅,例如，Zoeller et al.,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA81：5662-5066(1984)和美国专利第4,588,585号。

于具体实施例中，编码感兴趣的多肽的DNA序列会通过使用寡核苷酸合成器进行化学合成而构筑。此寡核苷酸可基于期望多肽的氨基酸序列而设计，并且选择在其中将产生感兴趣的重组多肽的宿主细胞中有利的那些密码子。可应用标准方法以合成编码感兴趣的单离的多肽的单离的多核苷酸序列。例如，完整氨基酸序列可用以构筑回译基因。又，可合成含有编码特别的单离的多肽的核苷酸序列的DNA寡聚体。例如，可合成编码期望的多肽的小部分的许多小寡核苷酸，接着将其连接。个别的寡核苷酸典型含有5'或3'单链突出(overhang)端以进行互补组装。

一旦组装(例如，通过合成、位点引导突变或其它方法)，编码单离的特别感兴趣的多肽的多核苷酸序列将插置入表达载体，并且视需要地与适合在期望的宿主中表达蛋白质的表达控制序列操作链接。适当组装可通过核苷酸定序、限制性酶切作图以及在适合宿主中表达生物活性多肽而确认。如本领域中周知，为了在宿主中获得高表达水平的转染基因，基因可与在选择的表达宿主中有功能性的转录和翻译表达控制序列。

重组表达载体用以扩增和表达编码流行性感冒HA抗体的DNA。重组表达载体为具有编码流行性感冒HA抗体的合成或衍生自cDNA的DNA片段或生物相等类似物的可复制DNA构筑物，所述生物相等类似物操作链接衍生自哺乳动物、微生物、病毒或病毒基因的适合转录或翻译的调节组件。转录单元通常包括以下者的组合：(1)基因组件或在基因表达中具有调节角色的组件，例如，转录启动子或增强子，(2)转录成mRNA和翻译成蛋白质的结构或编码序列，以及(3)适当的转录和翻译起始和终止序列，如以下详述。此调节组件可包含控制转录的操作子或序列。在宿主中复制的能力通常是由复制的原点所赋予，而且可另外并入促进转化体的辨识的选择基因。当DNA区彼此功能性相关时，是操作链接的。例如，若信号肽(分泌前导物)的DNA表达为参与多肽的分泌的前驱体时，则其与多肽的DNA操作链接；若启动子控制序列的转录，则其与编码序列操作链接；或若核糖体结合位点定位成以允许翻译，则其与编码序列操作链接。一般，操作链接表示邻近，而且在分泌前导物的情况下，表示邻接且在阅读框中。意欲用于酵母表达系统的结构组件包含前导序列，使得宿主细胞能细胞外分泌翻译的蛋白质。或者，当表达重组蛋白质，但无前导或传送序列时，其可包含N-端甲硫氨酸残基。后来，此残基可视需要地从表达的重组蛋白质断裂，以提供最终产物。

表达控制序列和表达载体的选择将取决于宿主的选择。可采用广泛多种的表达宿主/载体组合。真核宿主的有用表达载体包含，例如，包括来自SV40、牛乳突病毒、腺病毒以及巨细胞病毒的表达控制序列的载体。细菌宿主的有用表达载体包含已知细菌质体，诸如来自大肠杆菌的质体，包含pCR1、pBR322、pMB9以及其衍生物、更广的宿主范围质体，诸如，M13和丝状单链DNA噬菌体。

表达多肽的适合宿主细胞包含在适当启动子的控制下的原核生物、酵母、昆虫或更高真核细胞。原核生物包含格兰氏阴性或格兰氏阳性生物体，例如，大肠杆菌或杆菌(Bacilli)。更高真核细胞包含哺乳动物来源的已建立的细胞系。亦采用不含细胞的翻译系统。适合与细菌、真菌、酵母以及哺乳动物细胞宿主共享的克隆化和表达载体为本领域中周知(参阅Pouwels et al.,Cloning Vectors：A Laboratory Manual,Elsevier,N.Y.,1985)。

亦有利地采用多种哺乳动物或病毒细胞培养系统以表达重组蛋白质。可进行重组蛋白质在哺乳动物细胞中的表达，因为此蛋白质通常正确折叠，适当地改性以及完全作用。适合哺乳动物宿主细胞系的实例包含Gluzman(Cell23：175,1981)描述的猴肾细胞的COS-7系和其它能表达适当载体的细胞系，包含，例如，L细胞、C127、3T3、中国仓鼠卵巢(CHO)、HeLa以及BHK细胞系。哺乳动物表达载体可包括非转录组件诸如复制的原点、适合启动子以及与待表达的基因链接的增强子以及其它5'或3'侧翼非转录序列、以及5'或3'非翻译的序列诸如需要的核糖体结合位点、多聚腺苷化位点、剪切供体以及受体位点、以及转录终止序列。用于在昆虫细胞中产生异源蛋白质的杆状病毒系统是由Luckow and Summers,Bio/Technology6：47(1988)评论。

由转化的宿主产生的蛋白质可根据任何适合方法纯化。此标准方法包含色谱法(例如，离子交换、亲和力以及尺寸筛分柱色谱法等)、离心、差异溶解度，或通过蛋白质纯化用的任何其它标准技术。亲和力标记诸如六组氨酸、麦芽糖结合结构域、流行性感冒病毒膜序列、谷胱甘肽S-转移酶等可附接至蛋白质，以允许通过穿过适当亲和力柱而容易纯化。单离的蛋白质亦可使用蛋白质水解、核磁共振以及X射线结晶学等技术而物理地特性化。

例如，来自分泌重组蛋白质入培养基的系统的上清液可使用商业可用蛋白质浓缩过滤器，例如，Amicon或Millipore Pellicon超过滤单元先浓缩。此浓缩步骤之后，浓缩物可施加于适合的纯化基质。或者，可采用阴离子交换树脂，例如，具有侧二乙基氨基乙基(DEAE)的基质或物质。基质可为丙烯酰胺、琼脂糖、葡聚糖、纤维素或其它常在蛋白质纯化中采用的类型。或者，可采用阳离子交换步骤。适合的阳离子交换剂包含包括磺酸丙基或羧基甲基的多种不溶基质。最后，可采用疏水性RP-HPLC介质，例如，具有侧甲基或其它脂族基的二氧化硅凝胶，的一个或多个反相高效液相色谱法(RP-HPLC)步骤，以进一步纯化癌症干细胞蛋白质-Fc组合物。亦可采用一些或所有的前述纯化步骤的多种组合以提供均质重组蛋白质。

细菌培养中产生的重组蛋白质可通过，例如，从细胞团块进行最初萃取，接着进行浓缩、盐析、水性离子交换或尺寸排阻色谱法步骤的一者或多者而分离。可采用高效液相色谱法(HPLC)进行最终纯化步骤。重组蛋白质的表达中采用的微生物细胞可通过任何便利方法破坏，包含冻融循环、超声处理、机械破坏，或使用细胞溶解剂。

治疗方法

本发明提供治疗或预防流行性感冒感染的方法。

于方面中，本发明提供治疗或预防有需要的受试者的流行性病毒感染的方法。所述方法涉及对受试者给药有效量的本文所述的抗流行性感冒抗体或抗体片段，或含有所述抗体或抗体片段的医药组合物。所述治疗或预防受试者的流行性感冒病毒感染的方法，包含减少或缓和与感染相关的症状。

于方面中，本发明提供中和有需要的受试者的流行性感冒病毒的方法。所述方法涉及对受试者给药有效量的本文所述的抗流行性感冒抗体或抗体片段，或含有所述抗体或抗体片段的医药组合物。所述方法中和受试者的流行性感冒病毒，从而治疗或预防受试者的流行性感冒病毒感染，包含减少或缓和与感染相关的症状。

于方面中，本发明提供在有需要的受试者中建立流行性感冒病毒感染的方法。所述方法涉及对受试者给药有效量的本文所述的抗流行性感冒抗体或抗体片段，或含有所述抗体或抗体片段的医药组合物。所述方法在受试者中抑制流行性感冒病毒感染的建立，从而预防与感染相关的症状。

于方面中，本发明提供在抑制有需要的受试者的流行性感冒病毒感染的散播的方法。所述方法涉及对受试者给药有效量的本文所述的抗流行性感冒抗体或抗体片段，或所述含有抗体或抗体片段的医药组合物。所述方法抑制受试者的流行性感冒病毒感染的散播，从而减少或缓和与感染相关的症状。

于方面中，本发明提供抑制流行性感冒病毒进入受试者中的细胞的方法。所述方法涉及对受试者给药有效量的本文所述的抗流行性感冒抗体或抗体片段，或所述含有抗体或抗体片段的医药组合物。所述方法抑制流行性感冒病毒进入受试者中的细胞，从而预防与感染相关的症状或减少或缓和与感染相关的症状。

于方面中，本发明提供抑制流行性感冒病毒进入细胞的方法。所述方法涉及使具有流行性感冒病毒感染或有发展流行性感冒病毒感染的风险的细胞与本文所述的抗流行性感冒抗体或抗体片段或含有所述抗体或抗体片段的医药组合物接触。所述方法抑制流行性感冒病毒进入细胞。

于任何以上方面，流行性感冒可为H1N1、H2N2、H3N2或适应人类的H5病毒株。

于以上方面中任一者，受试者具有流行性感冒感染或有发展流行性感冒感染的风险。于相关具体实施例中，受试者为哺乳动物(例如，人类)。于相关具体实施例中，受试者易受病毒感染(例如，怀孕女性、年轻受试者或婴儿受试者、老年受试者)。

于任何以上方面和具体实施例中，抗流行性感冒抗体或抗体片段或医药组合物是通过肌内注射、静脉内注射、皮下注射、或吸入而给药。

医药组合物

本发明提供含有本文所述的新颖流行性感冒HA抗体的医药组合物。于具体实施例中，医药组合物含有医药可接受的载体、赋形剂或稀释剂，而且包含本身不会对接受组合物的受试者诱发有害的免疫反应的产生的任何医药剂，以及可在无过度毒性的情况下给药。如本文所使用，术语"医药可接受的"表示美国联邦或州政府的监管机关核准或美国药典、欧洲药典或其它通常认可的药典中所列用于哺乳动物，更特别于人类者。此等组合物可有用于治疗及/或预防流行性感冒感染。

Remington’s Pharmaceutical Sciences(17th ed.,Mack Publishing Company)和Remington：The Science and Practice of Pharmacy(21st ed.,LippincottWilliams&Wilkins)中呈现医药可接受的载体、稀释剂以及其它赋形剂的深入探讨，其特此以参考方式并入。医药组合物的配方应适合给药的模式。于具体实施例中，医药组合物适合对人类给药，而且可为无菌、非颗粒及/或无致热源。

医药可接受的载体、赋形剂或稀释剂包含，但非限于，食盐水、缓冲盐水、葡萄糖、水、甘油、乙醇、无菌等渗水性缓冲液以及其组合。

组合物中亦可存在湿润剂、乳化剂以及润滑剂诸如十二烷基硫酸钠和硬脂酸镁，以及着色剂、脱模剂、涂布剂、甜味剂、调味剂以及芳香剂、防腐剂以及抗氧化剂。

医药可接受的抗氧化剂的实例包含，但非限于：(1)水溶性抗氧化剂，诸如，抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、硫酸氢钠、偏硫代硫酸钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂、诸如，抗坏血酸棕榈酸酯、丁基化羟基茴香醚(BHA)、丁基化羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、羟乙酸丙酯、α-生育酚等；以及(3)金属螯合剂，诸如，柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。

于具体实施例中，医药组合物是以固体形式提供，诸如，适合复水的冻干粉剂、液体溶液、悬浮液、乳剂、片剂、丸剂、胶囊、缓释型配方或粉剂。

于具体实施例中，医药组合物是以液体形式提供，例如，在表示医药组合物中的活性成分的含量和浓度的密封容器中。于相关具体实施例中，医药组合物的液体形式是以密封的容器提供。

调配本发明的医药组合物的方法为传统和本领域中周知者(参阅RemingtonandRemington’s)。本领域技术人员可容易调配具有期望特性(例如，给药路径、生物安全性以及释放外廓线)的医药组合物。

制备医药组合物的方法包含使活性成分与医药可接受的载体和视需要地一种或多种次要成分相关联的步骤。医药组合物的制备可通过使活性成分与液体载体或微细固体载体或两者均匀地和直接地相关联，接着，若需要，使产物成型。制备医药组合物的另外的方法包含多层剂量形式的制备在Ansel’s Pharmaceutical Dosage Forms and DrugDelivery Systems(9th ed.,Lippincott Williams&Wilkins)中描述，其特此以参考方式并入。

递送方法

本发明的医药组合物可通过口服和非经口的方式(例如，局部地、经皮地、或通过注射)而对受试者给药。此给药的模式和制备在其中使用的适当医药组合物的方法在Gibaldi’s Drug Delivery Systems in Pharmaceutical Care(1st ed.,AmericanSociety’s Health-System Pharmacists)中描述，其特此以参考方式并入。

于具体实施例中，医药组合物是以固体形式口服给药。

适合口服给药的医药组合物可为胶囊、扁囊剂、丸剂、片剂、菱形锭剂(使用矫味的基底，通常为蔗糖和阿拉伯树胶或黄蓍胶)、粉剂、粒剂的形式，或作为水性或非水性液体的溶液或悬浮液，或作为水包油或油包水的液体乳剂，或作为酏剂或糖浆剂，或作为锭剂(使用惰性基底，诸如，明胶和甘油、或蔗糖和阿拉伯树胶)及/或作为漱口水等，各含有预测定量的本文所述的化合物、其衍生物或医药可接受的盐或其前药作为活性成分。活性成分亦可以团状物、冲剂或糊剂的方式给药。

于口服给药的固体剂量形式(例如，胶囊、片剂、丸剂、糖衣丸剂、粉剂、粒剂等)中，活性成分与一种或多种医药可接受的载体、赋形剂或稀释剂，诸如，柠檬酸钠或磷酸氢钙及/或以下任一者混合：(1)填料或增量剂，诸如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇及/或硅酸；(2)粘合剂，诸如，例如，羧基甲基纤维素、海藻酸酯、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖及/或阿拉伯树胶；(3)保湿剂，诸如，甘油；(4)崩解剂，诸如，琼脂-琼脂、碳酸钙、土豆或木薯淀粉、海藻酸、某些硅酸盐以及碳酸钠；(5)溶液缓聚剂，诸如，石蜡；(6)吸收加速剂，诸如，四级铵化合物；(7)湿润剂，诸如，例如，乙酰醇和单硬脂酸甘油酯；(8)吸收剂，诸如，高岭土和膨润土；(9)润滑剂，诸如，滑石，硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠、以及其混合物；以及(10)着色剂。胶囊、片剂以及丸剂的情况下，医药组合物亦可包括缓冲剂。相似的类型的固体组合物的亦可在夹心软和夹心硬明胶胶囊中使用填料、以及赋形剂诸如乳糖或乳糖、以及高分子重量聚乙二醇等制备。

片剂可通过视需要地与一种或多种次要成分压缩或模塑而制造。压缩片剂可通过使用粘合剂(例如，明胶或羟基丙基甲基纤维素)、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、崩解剂(例如，糖化钠淀粉或交联羧基甲基纤维素钠)、表面活化剂、及/或分散剂而制备。模塑片剂可通过在适合机器中将濡惰性液体稀释剂的粉状活性成分的混合物模塑而制成。

片剂和其它固体剂量形式，诸如，糖衣丸剂、胶囊、丸剂以及粒剂、可视需要地刻痕(score)或与涂层和外壳制备，诸如肠涂层和其它本领域中周知的涂层。

亦可调配医药组合物以便提供活性成分的缓慢、延长或控释，所述活性成分中使用，例如，不同比例的羟基丙基甲基纤维素以提供期望的释放外廓线、其它聚合体基质、脂质体及/或微球体。医药组合物亦可视需要地含有乳浊剂和可为视需要地，以延迟的方式，于胃肠道的某些部分，仅释放或优先释放活性成分的组合物。包埋组合物的实例包含聚合体物质和蜡。若适当，活性成分亦可为与本领域中周知的一种或多种医药可接受的载体、赋形剂或稀释剂成为微包囊形式(参阅,例如，Remington and Remington’s)。

医药组合物可通过，例如，过滤通过使细菌留存的过滤器，或并入可溶解于无菌水的无菌固体组合物形式的灭菌剂，或在使用前即并入一些其它无菌可注射介质而灭菌。

于具体实施例中，医药组合物是以液体形式口服给药。

口服给药活性成分的液体剂量形式包含医药可接受的乳剂、微乳剂、溶液、悬浮液、糖浆剂以及酏剂。除了活性成分之外，液体剂量形式还可含有本领域中常用的惰性稀释剂，诸如，例如，水或其它溶剂、增溶剂以及乳化剂，诸如，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苯甲酯、丙二醇、1,3-丁二醇、油(特别为棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油以及芝麻油)、甘油、四氢呋喃醇、聚乙二醇以及山梨聚糖的脂肪酸酯以及其混合物。除了惰性稀释剂之外，液体医药组合物还可包含佐剂，诸如，湿润剂、乳化剂、悬浮剂、甜味剂、调味剂、着色剂、芳香剂以及防腐剂等。

除了活性成分之外，悬浮液还可含有悬浮剂，诸如，但非限于，乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨糖醇以及山梨聚糖酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂-琼脂以及黄蓍胶、以及其混合物。

于具体实施例中，医药组合物是通过非经口的方式给药，诸如，通过局部施用、经皮施用、注射等。于相关具体实施例中，医药组合物通过注射、注入或植入(例如，静脉内、肌内、关节内、皮下等)肠道外给药。

非肠道使用的组合物可以单元剂量形式呈现，例如，含有许多剂量的安瓿或小玻璃瓶，而且可在其中添加适合的防腐剂。此组合物可为溶液、悬浮液、乳剂、注入器件、植入用递送器件的形式，或其可呈现为待使用之前以水或其它适合载液复水的干粉剂。亦可采用一种或多种共同载液，诸如乙醇。除了活性成分之外，组合物还可含有可并入微球体、微胶囊、纳米粒子、脂质体等进行控释的适合的肠道外可接受的载体及/或赋形剂或活性成分。此外，组合物亦可含有悬浮剂、增溶剂、稳定剂、pH调整剂及/或分散剂。

医药组合物可为无菌注射的形式。活性成分溶解或悬浮于肠道外可接受的液体载液，以制备此组合物。例示性载液和溶剂包含，但非限于，水、通过添加适当量的盐酸、氢氧化钠或适合的缓冲液而调整至适合的pH的水、1,3-丁二醇、林格溶液(Ringer’s solution)以及等渗氯化钠溶液。医药组合物亦可含有一种或多种防腐剂，例如，对羟苯甲酸甲酯、对羟苯甲酸乙酯或对羟苯甲酸正丙酯。可添加溶解作用增强或增溶剂，或溶剂可含有10至60%重量/重量的丙二醇等，以改善溶解度。

医药组合物可含有一种或多种医药可接受的无菌等渗水性或非水性溶液、分散液、悬浮液或乳剂或可在使用前即复水成无菌可注射溶液或分散液的无菌粉剂。此医药组合物可含有抗氧化剂；缓冲液；抑菌剂；用意欲接受者的血液使配方为等渗的溶质；悬浮剂；增稠剂；防腐剂；等。

本发明的医药组合物中可采用的适合的水性和非水性载体的实例包含水、乙醇、多元醇(诸如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)和其适合的混合物、植物油诸如橄榄油、以及可注射的有机酯诸如油酸乙酯。适当流动性可通过，例如，使用涂布物料诸如卵磷脂而维持，通过在分散液的情况下维持所需颗粒的尺寸而维持，以及通过使用表面活性剂而维持。

于一些具体实施例中，期望减慢对来自皮下或肌内注射的化合物的吸收，以延长活性成分的功效。这可通过使用具有差水溶解度的晶质或非晶质物料的液体悬浮液而完成。接着，活性成分的吸收速率是取决于其溶解速率，顺次，可取决于结晶尺寸和晶质形式。或者，肠道外给药的活性成分的延迟吸收是通过将化合物溶解或悬浮于油载液而完成。此外，可注射的医药形式的延长吸收可由包含延迟吸收的剂诸如单硬脂酸铝和明胶而导致。.

控释的非肠道组合物可为水性悬浮液、微球体、微胶囊、磁性微球体、油溶液、油悬浮液、乳剂的形式，或活性成分可并入生物兼容性载体、脂质体、纳米粒子、植入物或注入器件。

用于制备微球体及/或微胶囊的物料包含生物可降解/生物可腐蚀聚合体诸如，聚交酯、聚(氰丙烯酸异丁酯)、聚(2-羟基乙基-L-谷氨酰胺)以及聚(乳酸)。

当调配控释的非肠道配方时可使用的生物兼容性载体包含碳水化合物诸如，葡聚糖、蛋白质诸如白蛋白、脂蛋白或抗体。

用于植入物的物料可为非生物可降解，例如，聚二甲基硅氧烷，或生物可降解诸如，例如，聚(己内酯)、聚(乳酸)、聚(乙醇酸)或聚(原酸酯)。

于具体实施例中，活性成分通过气溶胶给药。通过制备水性气溶胶、脂质体制剂、或含有所述化合物的固体颗粒而完成。可使用非水性(例如，氟碳推进剂)悬浮液。医药组合物亦可使用声波喷雾器给药，所述声波喷雾器会使剂暴露于剪力最小化，可造成化合物的降解。

平常，通过共同调配活性成分的水性溶液或悬浮液的与传统医药可接受的载体和稳定剂而制造水性气溶胶。载体和稳定剂随着特别化合物的需求而改变，但典型包含非离子性表面活性剂(Tweens,Pluronics，或聚乙二醇)、无害蛋白质诸如血清白蛋白、山梨聚糖酯、油酸、卵磷脂、氨基酸诸如甘氨酸、缓冲液、盐、糖或糖醇。气溶胶通常从等渗溶液制备。

局部或经皮给药活性成分的剂量形式包含粉剂、喷雾剂、软膏剂、糊剂、霜剂、洗剂、凝胶、溶液、贴剂以及吸入剂。适当时，活性成分可在无菌条件下与医药可接受的载体、及与任何防腐剂、缓冲液或推进剂混合。

适合用于本发明的经皮贴剂揭露于Transdermal Drug Delivery:DevelopmentalIssues and Research Initiatives(Marcel Dekker Inc.,1989)和美国专利第4,743,249、4,906,169、5,198,223、4,816,540、5,422,119、5,023,084号，其特此以参考方式并入。经皮贴剂亦可为本领域中周知的任何经皮贴剂，包含经阴囊贴剂。此经皮贴剂中的医药组合物可含有一种或多种本领域中周知的吸收增强剂或皮肤渗透增强剂(参阅，例如，美国专利第4,379,454和4,973,468号，其特此以参考方式并入)。用于本发明经的皮治疗系统可基于离子透入、扩散、或此两种效果的组合。

经皮贴剂具有对活性成分提供控制递送至身体的增加的优点。此剂量形式可通过在适当介质中溶解或分散活性成分而进行。吸收增强子亦可用以增加活性成分横跨皮肤的通量。此通量的速率可通过提供速率控制膜片或将活性成分分散于聚合体矩阵或凝胶剂中而控制。

此医药组合物可为霜剂、软膏剂、洗剂、搽剂、凝胶、水凝胶、溶液、悬浮液、粘着剂、喷雾剂、糊剂、硬膏剂以及其它种类的经皮药物递送系统的形式。组合物亦可包含医药可接受的载体或赋形剂诸如乳化剂、抗氧化剂、缓冲剂、防腐剂、保湿剂、穿透增强剂、螯合剂、凝胶形成剂、软膏剂基底、香料以及皮肤保护剂。

乳化剂的实例包含，但非限于，天然存在的胶，例如，阿拉伯树胶或黄蓍胶、天然存在的磷脂酸，例如，黄豆卵磷脂以及山梨聚糖单油酸酯衍生物。

抗氧化剂的实例包含，但非限于，丁基化羟基茴香醚(BHA)、抗坏血酸以及其衍生物、生育酚以及其衍生物、以及半胱氨酸。

防腐剂的实例包含，但非限于，对羟基苯甲酸酯，诸如，对羟苯甲酸甲酯或对羟苯甲酸丙酯以及氯化芐二甲烃铵。

保湿剂的实例包含，但非限于，甘醇、丙二醇、山梨糖醇以及脲。

穿透增强剂的实例包含，但非限于，丙二醇、DMSO、三乙醇胺、N,N-二甲基乙酰胺、N,N-二甲基甲酰胺、2-吡咯啶酮以及其衍生物、四氢糠醇、丙二醇、具有丙二醇单月桂酸酯或月桂酸甲酯的二乙二醇单乙基醚或二乙二醇单甲基醚、桉油精、卵磷脂、还氧二元醇以及阿佐恩(商品名)

螯合剂的实例包含，但非限于，EDTA钠、柠檬酸以及磷酸。

凝胶形成剂的实例包含，但非限于，卡波普、纤维素衍生物、膨润土、海藻酸酯、糖浆剂以及聚乙烯吡咯啶酮。

除了活性成分之外，本发明的软膏剂、糊剂、霜剂以及凝胶还可含有赋形剂，诸如，动物和植物脂肪、油、蜡、石蜡、淀粉、黄蓍胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、聚硅氧烷、膨润土、硅酸、滑石以及氧化锌或其混合物。

粉剂和喷雾剂可含有赋形剂，诸如，乳糖、滑石、硅酸、氢氧化铝、硅酸钙以及聚酰胺粉剂或此等物质的混合物。喷雾剂可另外含有惯用推进剂，诸如，氯氟烃和挥发性未经取代的烃诸如丙烷和丙烷。

可注射的补给形式是通过在生物可降解聚合体中形成本发明的化合物的微包覆基质而形成，诸如，聚交酯-聚乙醇酸交酯。取决于化合物与聚合体的比率和采用的特别聚合体的本质，可控制释放的化合物的速率。其它生物可降解聚合体的实例包含聚(原酸酯)和聚(酐)。补给可注射的配方亦可通过以与身体组织兼容的脂质体或微乳剂包埋药物而制备。

皮下植入物为本领域中周知者，而且适合用于本发明。皮下植入方法优选为非刺激性和有机械弹性。植入物可为基质类型、储存槽类型或其杂合体。于基质类型器件中，载体物料可为多孔或非多孔、固体或半固体，以及可透或不可透活性化合物或化合物。给药之后，载体物料可为生物可降解，或可缓慢腐蚀。于某些情况下，基质是非可降减，且反而是仰赖于活性化合物扩散通过基质以使载体物料降解。另外的皮下植入方法利用储存槽器件，其中活性化合物或化合物是由速率控制膜片包围，例如，与组分浓缩无关的膜片(具有零级动力学)。亦适合使用由速率控制膜片包围所组成的的基质器件。

储存槽和基质类型器件皆可含有诸如聚二甲基硅氧烷，诸如硅橡胶(商标名)(Silastic^TM,)或其它聚硅氧橡胶等物料。基质物料可为不溶性聚丙烯、聚乙烯、聚氯乙烯、乙酸乙基乙烯酯、聚苯乙烯以及聚丙烯酸酯、以及棕榈酸硬脂酸甘油酯、硬脂酸甘油酯以及廿二酸甘油酯类型的甘油酯。物料可为疏水性或亲水性聚合体和视需要地含有增溶剂。

皮下植入物器件可为以任何适合聚合体，例如，描述于美国专利第5,035,891和4,210,644号者(其特此以参考方式并入)，而制成缓释胶囊。

大体上，可应用至少四种不同方法，以对药物化合物的释放和经皮释放提供速率的控制。此等方法为调节膜片的系统、控制粘性扩散的系统、基质分散类型系统以及微储存槽系统。应理解可通过使用此等方法的适合混合，而获得控释的经皮及/或局部组合物。

于膜片调节系统中，活性成分存在储存槽中，所述储存槽完全包囊于从不可透药物的层压板(诸如，金属塑料层压板)和速率控制聚合体膜片(诸如微多孔或非多孔的聚合体膜片(例如，乙烯-乙酸乙烯酯共聚体))模塑的浅隔室。活性成分释放通过速率控制聚合体膜片。于药物储存槽中，活性成分可分散于固体聚合体基质中或悬浮于不可淋溶、粘性液体介质诸如聚硅氧液体。于聚合体膜片的外表面上，施用粘性聚合体薄层以达成经皮系统与皮肤表面的直接接触。粘性聚合体优选为低敏感性，而且与活性药物物质兼容的聚合体。

于控制粘性扩散的系统中，活性成分的储存槽的形成是通过直接分散活性成分于粘性聚合体中，接着通过如溶剂浇铸在实质上不可透药物的金属塑料背衬平片材上扩散含有活性成分的粘合剂以形成药物储存槽薄层。

基质分散类型系统的特征为活性成分的储存槽是通过实质上均质分散活性成分于亲水性或亲脂性聚合体基质而形成。接着，含有药物的聚合体模塑入具有实质上良好定义的表面面积和控制厚度的圆盘。粘性聚合体沿着周长散布，以形成围绕圆盘的粘性条带。

微储存槽系统可被认为是储存槽和基质分散类型系统的组合。于此情况下，活性物质的储存槽的形成是通过首先悬浮药物固体于水溶性聚合体的水性溶液，以及接着分散药物悬浮液于亲脂性聚合体中以形成多重不可淋溶、显微球状的药物储存槽。

任何上述控释、延长的释放以及持续释放的组合物可调配成在约30分钟至约1周、约30分钟至约72小时、约30分钟至24小时、约30分钟至12小时、约30分钟至6小时、约30分钟至4小时、以及约3小时至10小时后释放活性成分。于具体实施例中，对受试者给药医药组合物之后，在受试者中活性成分的有效浓缩持续4小时、6小时、8小时、10小时、12小时、16小时、24小时、48小时、72小时或更久。

剂量

当本文所述的剂作为医药剂而对人类和动物给药时，其可直接给药或作为含有活性成分与医药可接受的载体、赋形剂或稀释剂的组合的医药组合物给药。

本发明的医药组合物中的活性成分的实际剂量水平和时程可改变，以便获得于针对特别病人、组合物以及给药的模式达成期望的治疗反应是有效的，但对病人是无毒性的活性成分的含量。一般，本发明的剂或医药组合物的是以足够减少或消除症状与流行性感冒感染相关的含量给药。例示性剂量范围包含每天0.01mg至250mg，每天0.01mg至100mg，每天1mg至100mg，每天10mg至100mg，每天1mg至10mg，以及每天0.01mg至10mg。优选剂量的剂为病人可容忍和不发展严重或不可接受的副作用的最大剂量。于具体实施例中，以每天每公斤的体重约10公克(g)至约100mg，每天约0.1至约10mg/kg，或每天约1.0mg至约10mg/kg的体重的浓度给药剂。

于具体实施例中，医药组合物包括含量范围为1和10mg之间的剂，诸如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10mg。

于具体实施例中，产生剂的血清浓度的治疗有效剂量为约0.1ng/ml至约50至100μg/ml。医药组合物典型应提供每天每公斤体重约0.001mg至约2000mg的化合物的剂量。例如，对人类病人全身给药的剂量可为1至10_μg/kg、20至80μg/kg、5至50μg/kg、75至150μg/kg、100至500μg/kg、250至750μg/kg、500至1000μg/kg、1至10mg/kg、5至50mg/kg、25至75mg/kg、50至100mg/kg、100至250mg/kg、50至100mg/kg、250至500mg/kg、500至750mg/kg、750至1000mg/kg、1000至1500mg/kg、1500至2000mg/kg、5mg/kg、20mg/kg、50mg/kg、100mg/kg、500mg/kg、1000mg/kg、1500mg/kg或2000mg/kg。医药剂量单元形式是制备成每剂量单元形式提供约1mg至约5000mg，例如约100至约2500mg的化合物或必要成分的组合。

于具体实施例中，对受试者给药约50nM至约lμM的剂。于相关具体实施例中，对受试者给药约50至100nM、50至250nM、100至500nM、250至500nM、250至750nM、500至750nM、500nM至1μM,或750nM至1μM的剂。

有效量的测定孔是在那些本领域技术人员的充分能力内，尤其是有鉴于本文详细揭示的内容。一般，有效的或有效量的剂的测定是通过首先给药低剂量的剂，以及接着递增给药剂量或多种剂量直到在治疗的受试者中观察到期望的功效(例如，减少与流行性感冒感染相关的症状)和最小或可接受的毒性副作用。可应用测定给药本发明的医药组合物的适当剂量和用剂时间表的方法描述于，例如，Goodman and Gilman’s The PharmaceuticalBasis of Therapeutics,Goodman et al.,eds.,11th Edition,McGraw-Hill2005,andRemington：The Science and Practice of Pharmacy,20th and21st Editions,Gennaroand University of the Sciences in Philadelphia,Eds.,Lippencott Williams&Wilkins(2003and2005)，各特此以参考方式并入。

组合物治疗

本文所述的药剂和医药组合物亦可与其它治疗分子组合给药。治疗分子可为任何用以治疗流行性感冒感染的化合物。此等化合物的实例包含，但非限于，减少流行性感冒病毒生产的抑制性核酸、抗病毒剂(例如，金刚烷胺、金刚乙胺、扎那米韦、奥司他韦等)、毒素以及减少与流行性感冒感染相关的症状的剂(例如，抗发炎剂)。

流行性感冒HA抗体可在给药之前、期间或给药另外的治疗剂之后给药。于具体实施例中，在首次给药另外的治疗剂之后给药抗体。于具体实施例中，在首次给药另外的治疗剂(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14天或更多天)之后给药抗体。于具体实施例中，抗体与首先给药另外的治疗剂同时给药。

对受试者给药治疗剂的含量可由主治医师或兽医容易地测定。一般，有效的或有效量的抗体和另外的治疗的测定是通过首次给药低剂量的一种或两种活性剂，接着递增给药剂量或多种剂量直到观察到期望的功效(例如，减少流行性感冒感染症状)和最小或无毒性副作用。可应用以测定给药本发明的组合物的适当剂量和用剂时间表的方法描述于，例如，Goodman and Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics,11thEdition.以上，以及于Remington：The Science and Practice of Pharmacy,20thand21st Editions以上。

试剂盒

本发明提供预防或治疗流行性感冒感染的试剂盒；中和流行性感冒病毒；抑制流行性感冒病毒感染的建立；抑制流行性感冒病毒感染的散播；以及抑制流行性感冒病毒进入细胞。于具体实施例中，试剂盒含有本文所述的一种或多种剂或医药组合物。于具体实施例中，试剂盒提供使用的指示。使用的指示可关于本文所述的任何方法。于相关具体实施例中，指示关于使用治疗或预防流行性感冒感染的剂或医药组合物。根据本发明的此方面的试剂盒可包括载体工具，诸如盒、箱、管等，于其中一个或多个容器工具，诸如小玻璃瓶、管、安瓿瓶等密闭空间者。于具体实施例中，试剂盒提供调控医药或生物产物的生产、使用或贩卖的政府机构规定的形式的通知，所述通知反映用于人类给药的试剂盒和其中组分的生产、使用或贩卖的机构的批准。

实施例

应理解本发明不应被解释为限制至现在描述的实施例；而是，本发明应被解释为包含本文提供的任何和所有应用，而且所有相等的变异是在普通技术人员的技能内。

实施例1：广泛中和抗体的克隆谱系

重排的Ig V_H和V_L基因是通过RT/PCR而从外周血单核细胞分离，并且于疫苗接种2007三价灭活疫苗(TIV)后一周自受试者采集(Liao,H.X.et al.J.Virol.Methods158：171-179(2009))。如图1A所示，通过定序重排的基因而检测的克隆谱系有三段克隆(mAbsCH65,CH66以及CH67)。抗体CH65、CH66以及CH67的克隆谱系的未突变的一般原始种型(UCA)的推测序列是明显的，除了在位置99的重链可为甘氨酸或丙氨酸。图1B显示各抗体的氨基酸序列与UCA的比对。所有三个成熟抗体与存在于疫苗(A/Solomon Islands/3/2006)中的H1血凝素(HA)以相同亲和力结合；UCA的结合更弱。

实施例2：中和活性的广度

CH65的重链与UCA在可变结构域中的位置12以及其轻链的位置6有所不同；CH65IgG1和其Fab是通过如下述的瞬时转染和纯化而于293T细胞中表达。针对大组的来自过去30年的H1单离物，包含来自1977、1991以及1995的疫苗病毒株，测试中和并且观察到惊人的广泛潜力(表1)。亦针对此组的子集测试CH67(表1)。

表1.季节性流行性感冒病毒株A/H1N1以人类MAb CH65和CH67的广泛中和

^**季节性疫苗中包含 的病毒株。

⁺受试者接受的疫苗的H1组分。

^#原来公布为对mAb CH65不敏感。

抗体中和的H1N1病毒株最早于1986年单离，涵盖21年的抗原漂移。如所期望，其中和2007疫苗的H1组分A/Solomon Islands/3/2006。测试的36个病毒株中，仅六个没有中和，包含2009大流行病毒株A/Texas/36/1991和A/U55R190/1977。CH67抗体具有相似的广度；亦(微弱)中和2009大流行病毒株。亦有证据显示CH66(和可能的CH65)与衍生自1968大流行H3病毒(X31，为实验室病毒株)的HA结合。太少的HA引导的人类单克隆抗体已被特性化以进行有系统的比较，但通过血清样本的中和不会平常展现此程度的广度。

实施例3：CH65：HA的结构

使mAb CH65Fab与来自A/Solomon Islands/03/2006(HA^sI)的HA胞外域的复合物结晶化，记录衍射至最小布拉格间隔(Bragg spacing)的(表2)，而且如下述以分子置换测定结构。

表2：结晶统计

结晶的不对称单元含有具有三个结合的Fab的HA三聚体的单一复制体(图2A至2D)。最终模型包含表达的蛋白质中的所有HA1和HA2残基，除了在HA1的C端的四个失序残基。电子密度图显示在各单体上的所有八个潜在的位点有N-链接的糖基化的证据，而且在这些位置中其中五个位置的一个或多个糖残基可被建模。Fab良好排序，除了在轻链的残基1和在重链的残基141至147以外；此等残基皆远离结合位点。

发明者了解A/Solomon Islands/03/2006(此研究成果)和A/Puerto Rico/8/1934(Gamblin,S.J.et al.,Science303：1838-1842(2004))为其HA的结构已被测定的唯二季节性H1N1病毒株；其它者为大流行病毒株或动物流行性感冒病毒株。相较之下，使用程序DALI显示HA^SI与其它H1N1HA类似，诸如那些来自2009的大流行单离物(CαRMSD0.9A超过495个比对的残基，79%序列同一性；PDB IDs3LZG(Xu,R.et al.,Science328：357-360(2010))以及3LYJ(Zhang,W.et al.,ProteinCell1：459-467(2010)))以及1918(CαRMSD1.5A超过495个比对的残基，85%序列同一性；PDB IDs3LZF(Xu,R.et al.,Science328：357-360(2010))和1RUZ(Gamblin,S.J.et al.,Science303：1838-1842(2004)))以及来自1934的季节性单离物(CαRMSD1.5A超过482个比对的残基，86%序列同一性；PDB ID1RVZ(Gamblin,S.J.et al.,Science303：1838-1842(2004)))。HA^SI的痕迹酯酶结构域比1918和1934年的HA所具者更接近2009HA的痕迹酯酶结构域。

MAb CH65与HA三聚体的球状头结合(图1C和2A)。表位包含受体位点和在H1序列的早期分析中指定为Sb的抗原位点(Caton,A.J.et al.,Cell31：417-427(1982))。此接触在抗体上埋藏和HA1上埋藏重链的所有三个CDR以及轻链的CDR-L1和L3参与界面(图1C和2B至D)。CDR-H3插置入受体位点。十九个残基中的七个贡献的埋藏表面面积或完整界面的47%。其它CDR形成侧翼交互作用。CDR-L3在受体袋状结构的边缘接触短α-螺旋的N-端位点Sb，以及CDR-H1和-H2接触从与短α-螺旋的C-端相邻的HA1突出的环。

表3和4概述抗体和HA之间的许多重要交互作用。

表3：与HA接触的CH65的CDR H3中的残基

Arg104*

Ser105

Val106Asp107Tyr109Tyr110

Tyr112

*对于一些流行性感冒病毒株(非Solomon Islands)而言，Arg104可与HA接触。

表4：与CH65接触的HA中的残基

实施例4：与受体比较的mAb CH65的CDR-H3

因为CDR-H3插置入受体位点，此结构与结合1934HA的人类受体类似物LSTc(唾液酸-α-2,6-半乳糖-β1,4-N-乙酰葡萄糖胺)(PDB ID1RVZ)；参考(Gamblin,S.J.et al.,Science303：1838-1842(2004)))相比(图3A和3B)。于CH65中，在CDR-H3的顶部的Asp107接受来自HA1A1a137的主链酰胺、Ser136的侧链羟基、以及Arg226的侧链Nε的氢键。(精氨酸仅少见于位置226；谷氨酰胺更常见。于结晶结构中，Arg226采取扭折构形；谷氨酰胺会容易配合，而其Nε与精氨酸侧链的对应原子有相同位置)。抗体中的Va1106的主链酰胺给予HA1上的HA1Va1135羧基氧氢键，而且Va1106的非极性侧链是与HA1Trp153和Leu194有范德华接触。于受体类似物LSTc中，唾液酸的羧酸酯基与Asp107的(化学类似的)侧链和HA1具有相同接触，而且与N-乙酰基与HA以刚描述的Va1106的酰胺和侧链的相同方式进行交互作用。简言之，mAb CH65模拟人类受体上与HA交互作用的大部分的化学基团。

实施例5：糖基化

抗原位点的糖基化为流行性感冒病毒逃避免疫的重要机制(Knossow,M.andSkehel,J.J.免疫logy119：1-7(2006)；Wiley,D.C.and Skehel,J.J.Annu.Rev.Biochem.56：365-394(1987)；以及Wei,C.J.et al.,Sci.Transl.Med.2：24ra21(2010))。于HA^SI中，糖基化离开暴露的位点Sb和Cb，部分地隐藏位点Ca，以及全部地遮蔽抗原位点Sa。位点Sa为抗体2D1所辨识的表位，所述抗体2D1为1918年疫情的存活者中的2009H1N1的Ig-媒介的免疫性的原型(Xu,R.et al.,Science328：357-360(2010))。与2D1接触的侧链中，7/16在HA^SI和1918HA之间不同；相较而言，仅3/16在2009年大流行HA和1918HA之间不同。因为A/Solomon Islands/03/2006的HA在位点Sa糖基化，故以TIV-2007疫苗接种和先前以A/Solomon Islands/03/2006状病毒株感染都不会具有引发2D1状免疫反应。

实施例6：亲和力成熟

CH65的氨基酸序列是其UCA的亲和力成熟的结果。有鉴于其克隆谱系的结构(图1B)的分析显示抗体与HA的中央交互作用经过亲和力成熟后已维持未改变。CDR-H3已未突变且轻链CDR-L3和短α-螺旋的N-端(即，位点Sb)的接触也未改变。(CDR-L3的Ser93为谱系成员CH67中的Asp；取代成Asp可允许CH67接受来自HA Asn187的氢键)。抗体的交互作用表面的上的别处改变成两个残基在抗和HA^SI之间创制另外的氢键。CDR-L1中的轻链残基Asp26和Arg29已从其各别性细胞系对应处Asn和Ser突变。Asp26接受来自HA Lys222的氢键。Arg29被定位成给予HA Asp225两个氢键。其它变化，包含那些在位置31(Gly变成Asp)和位置33至35(Trp-Met-His变成His-Ile-Asn)者，可对CDR-H3的构形发挥微妙的功效。

实施例7：对不同流行性感冒病毒株的CH65-CH67谱系反应性

评估CH65-CH67与其它流行性感冒病毒株反应的能力。293T细胞以来自病毒株X31(H3流行性感冒病毒株)的全长HA转染(图4A至4C，顶格)，或以来自A/Solomon Islands/3/2006(H1流行性感冒病毒株)的在细胞表面表达的球状头转染(图4E至4G，底格)。将细胞以固定甲醛，并且以CH65Fab针探(图4B and4F)或以CH66全长抗体(图4C和4G)针探，接着以来自人类Fab的偶联FITC的第二抗体特异性针探。细胞是以FITC发射(532nm)成像。作为对照组，将转染的细胞仅以第二抗体针探(图4A和4E)。此等结果表示CH65-CH67抗体(例如，CH66)亦与其它流行性感冒血清型(例如，H3)结合。

如以上实施例所详述，来自美国的成人受试者的CH65在捐血浆样本之前一周接受2007TIV。假设为受试者在过去已暴露于H1N1流行性感冒病毒株，以便使抗体通过以一组来自第二反应的重组血凝素(rHAs)筛选而获得。的确，原初暴露仅一周内，不容易发生太大的突变数目(整体频率约5%)。于TIV的设定中，于疫苗接种后一周分泌浆细胞的大部分的循环抗体有流行性感冒特异性(Wrammert,J.etal.,Nature453：667-671(2008))。不同于用于人类B细胞反应的高产量分析其它方法(例如，噬菌体展示)，本文所述的单离CH65的过程检测成对的重排的VH和V_L区，因此重建天然抗体的完整抗原结合位点(Liao,H.X.etal.J.Virol.Methods158：171-179(2009))。

CH65抗体属于可检测序列的相对小克隆谱系，但想必其它成员未在表达的抗体中呈现。因为浆细胞可能衍生自疫苗刺激的记忆细胞，而将浆细胞与UA分离的大部分突变可能在较早原初反应的期间发生。以CH65进行的感染力中和的广度意味着可能CH65可能已经来自2007年以前的二十年间的几乎任何季节性爆发，因为第二反应的期间仅小突变数目可能已经从具有略低亲和力者产生非常紧密结合的抗体。

CH65的抗原结合位点无明显的非典型结构特征。所述结构特征是由V_H1～2、D_H1～1以及JH6以及Vκ1～2以及Jκ2所贡献(表5)。

表5.CH65中使用的基因

19个残基重链CDR3具有大致平均的长度(Volpe,J.M.and Kepler,T.B.,ImmunomeRes.4：3(2008))。其在成熟抗体中的序列是与UCA中相同。引起UCA的编码序列的VDJ重组包含17个n-核苷酸(图5)，以便使十四个CDR3残基中的六个是由不准确连接所产生的随机插置编码。此等六个残基包含Va1106和Asp107，其在唾液酸袋状结构内共同进行最重要的接触。预期的n-核苷酸添加略少于在V-D端接的平均数，而且略大于在D-J端接的平均数(Volpe,J.M.and Kepler,T.B.,Innumome Res.4：3(2008))。

CH65重链CDR3的顶部惊人地忠实模拟与HA接触的唾液酸表面。流行性感冒病毒抗原变异的早期成果导致讨论从中和逃逸和暴露的受体结合位点的保守之间的明显矛盾。HA结构通过以下方式解决问题：显示唾液酸结合位点小于典型抗体的足迹，因此受体袋状结构的周围的突变可干扰中和，但不会阻挡受体附接(Wiley,D.C.et al.,Nature289：373-378(1981)；以及Wilson,I.A.et al.,Nature289：366-373(1981))。的确，影响以Ab CH65中和的易受性的变异映像在受体袋状结构侧翼的位点，但避免任何直接受体接触。

与H3HA结合的鼠类mAb的两种公布的结构显示，于两个情况下，通过重链CDR3而某种程度穿透入受体位点。mAb没有和CH65一样广泛地模拟唾液酸交互作用。于一者中(PDBID1KEN(Barbey-Martin,C.et al.,Virology294：70-74(2002)))，天冬氨酸侧链接近唾液酸羧酸酯的位置，但具有只可接受来自Ser136的羟基的氢键(但非来自Asn137的主链NH的氢键)的分子配向。于其它者中(2VIR(Fleury,D.et al.,Nat.Struct.Biol.5：119-123(1998)))，在CDR3的顶部的Tyr-Asp对具有与吾等CH65：HA复合物中的Val-Asp对相关的分子配向，而且天冬氨酸侧链具有相同氢键结图案，但所述仿真不会延伸至受体N-乙酰基的任何交互作用。H3HA具有亮氨酸，而不是在位置226上的谷氨酰胺或精氨酸，以便无法进行另外的极性接触。

于HA中的天然存在、季节性抗原变异体中的突变位点主要在HA1的朝外的表面上。沿着HA的"柄部"结合保守位点的一些相对罕见抗体已来自不相关、重排的人类V_H基因(皆来自V_H1-69)的噬菌体展示库。CH65的结构和特征显示亦可能引发广泛中和、受体结合位点抗体。可从针对HIV-1的广泛中和、受体位点抗体取出对照者(例如，抗体VRC01)，其为功能性受体CD4的合理相近的模拟者(Zhou T.et al.,Science329：811-817(2010))。

具有引发类CH65反应的增强的概率的免疫原可保护对抗一系列的季节性病毒株。设计此免疫原的策略是基于结构和谱系两者的分析，而且可包含(除了天然HA之外)组分以诱发类UCA原初反应。CH65和其UCA之间的差异的检测暗示影响亲和力的主要改变为轻链CDR1，其中在位置26和29的突变已在HA中导入盐桥(表6)。

表6：已从UCA改变的CH65中的残基的潜在影响

改性HA(其中相同接触反而是从抗原中的突变得到稳定性)可具有期望的性质。

测试的许多病毒株之间缺乏共同抗性突变暗示Ab CH65将为治疗抗体的有用模板。奥司他韦抗性的H1N1从2007和2008年开始快速涌现，而且已成为季节性流行性感冒的优势病毒株，以及严重感染的管理会从广泛反应、以免疫为主的治疗受益(Dharan,N.J.etal.JAMA301：1034-1041(2009))。以H5N1的球状头为目标的人类mAb进行的先前研究表示CH65的有效中和浓度将有体内保护性(Simmons,C.P.et al.PLoS Med.4：e178(2007))。

据此，本文所述者为对治疗和预防流行性感冒感染将极其有效的新颖流行性感冒HA抗体。循环流行性感冒病毒的季节性抗原漂移导致疫苗组合物的频繁变化的需要(因为暴露或疫苗接种引发人类抗体对漂移株有限制的交叉中和)，对于可广泛中和流行性感冒漂移株的有效治疗有明显未满足的需求。以上结果清楚论证新颖抗体的使用提供此未满足的需求解决方案。因此，以本文所述的新颖抗体进行的是治疗患了流行性感冒感染的病人的治疗中的明显进步。

本文公布的结果是使用以下方法和物料获得。

临床样本

在Duke Institutional Board核准人类受试者的实验计划下，从疫苗接种2007TIV MAb的受试者获得MAbs CH65、CH66以及CH67。受试者接受含有A/SolomonIslands/3/2006(H1N1)、A/Wisconsin/67/2005(H3N2)以及B/Malaysia/2506/2004的2007至2008(Sanofi Pasteur,Swift水,PA)。在疫苗接种后第7天抽血，并且在同一天单离PBMC并且将其冷冻保存。使用所述的一组抗体，将单浆母细胞分选入96孔盘(Moody MA,etal.,PLoS One6：e25797(2011))。进行单细胞RT/PCR以获得定序用DNA(Liao,H.X.etal.J.Virol.Methods158：171-179(2009))，定序是在ABI3700上使用定序试剂盒于顺向和反向两个方向完成(Ewing,B.etal.,Genome Res.8：175-185(1998))，以及与基于在各位置的质量分数的方法组合(Kepler,T.B.et al.BMC Genomics11：444(2010))。Ig同种型是通过与已知序列局部比对而测定；V、D以及J区基因、CDR3环长度以及突变频率是通过与推测的未突变原始种型比较而测定。

谱系分析

UCA使用贝叶斯方法(Bayesian method)而推测，其是首先使用DNAML以最大可能性(maximum likelihood)测定克隆树形图(Felsenstein,J.J.Mol.Evol.17：368-376(1981))，接着计算有限制的推测的ML树形图上的基因区段和重组位点的后验联合分布(posterior joint distribution)。接着，在各位置的核苷酸上直接获得后验概率质量函数(posterior probability mass function)。

IgG和Fab的表达和纯化

如上述，免疫球蛋白重链和轻链基因的可变区是通过RT/PC而从单浆细胞分离(Liao,H.X.et al.J.Virol.Methods158：171-179(2009))。将CH65、CH66以及CH67的V_H和V_κ基因克隆化入含有人类IgG1恒定区基因或κ链恒定区基因的pcDNA3.1表达载体，以生产纯化的全长IgG抗体(Liao,H.X.et al.J.Virol.MEthods158：171-179(2009))。为了产生CH65Fab，将5'引物HV13274-F1(5'-AAGCTTACCATGCCGATGGGCTCC-3')设计成含有限制性酶切位点(Hind III)和序列以与Ig信号肽的5'序列粘合，将3'引物HV13221H-R474(5'-GAGCCCAAATCTTGTGACAAATGATCTAGA-3')设计成含有限制性酶切位点(XbaI)，以及刚在人类IgG1恒定区的铰链之前和在编码氨基酸残基SCDK的序列(5'TCTTGTGACAAA3')之后导入终止密码子。PCR扩增使用此等引物和全长IgG1重链基因作为模板产生Fab基因，将所述Fab基因克隆化入pcDNA3.1/hygro(Nicely,N.I.et al.,Nat.Struct.Mol.Biol.17：1492-1494(2010))。通过与编码重链和轻链的基因共转染，而在重组、完好的CH65IgG1和其Fab中产生293T细胞。完好抗体是使用抗人类IgG珠纯化(Sigma,St.Louis,MO)；Fab使用抗L链珠(Sigma,St.Louis,MO)，接着FPLC凝胶过滤而纯化(Liao,H.X.et al.J.Virol.Methods158：171-179(2009)；以及Nicely,N.I.et al.,Nat.Struct.Mol.Biol.17：1492-1494(2010))。

感染力中和

感染力中和是基于在美国疾病预防和控制中心(CDC)的流行性感冒参考实验室的方法，而在微中和检测法中分析(Hancock,K.et al.,N.Engl.J.Med.361：1945-1952(2009))。Vladimir Lugovtsev提供H1N1历史病毒存量(Div.of Viral Products CBER,FDA)。所有病毒在MDCK细胞上滴定，并且以每孔100TCID₅₀使用(以三重复计)。从100μg/ml开始进行mAb CH65的两倍连续稀释，在添加至MDCK细胞单层之前与病毒存量混合。表1公布完整抑制病毒复制的最小浓度(EC₉₉)。

HA表达和纯化

HA A/Solomon Islands/03/2006的胞外域的密码子最优化的cDNA是以GeneArt合成，并且亚克隆化入被改性以进行与连接无关的克隆化(LIC)的pET载体。合成基因编码在N端的分泌信号，并且以凝血酶切割位点、促进适当三聚体化的T4-纤维蛋白"折叠子"以及在C端的His6标记取代跨膜结构域。以重组杆状病毒感染粉纹夜蛾(Hi-5)细胞。感染后48小时以离心采集上清液，浓缩，以及以40mM咪唑相对于磷酸盐-缓冲盐水渗滤，以及装上Ni-NTA树脂。将蛋白质淋洗，透析，以及与以TPCK处理的胰蛋白酶以1：500的质量比率培养隔夜以移除三聚体化和His6标记，以及切割HAO前驱体肽。蛋白质在Superdex200上以凝胶过滤色谱法进一步纯化(GE Healthcare)。

结晶

将CH65Fab与A/Solomon Islands/03/2006HA以4.5：1的摩尔比率培养，而且在Superdex200上，于10mM Hepes pH7.5,150mM NaCl中，以凝胶过滤色谱法从过量的Fab分离产生的3：1复合物。复合物于280nm浓缩至吸光度10(大约6mg/mL)。于18℃，在含有2.2M硫酸铵、100mM Tris pH7.5以及5%PEG-400的储存槽中悬滴成长成结晶。结晶是通过微种植而改善。3至14天之后，通过对所述滴添加补充15%甘油的储存槽溶液而冷冻保护结晶，接着采集结晶及于将其于液态氮急速冷却。

结构测定和改良

于先进光子来源，于光束线24-ID-E进行饶射实验。自单一约50x50x300μm杆于分辨率采集数据组，并且使用HKL2000处理(表2)。以PHASER进行分子替换(MR)计算(McCoy,A.J.et al.,J.Appl.Crystallogr.40：658-674(2007))，使用1934H1HA(PDBID1RVZ(Gamblin,S.J.et al.,Science303：1838-1842(2004)))作为起使模型。使用Fab结构的库。来自MR最初相能通过在MOLREP中的定相分子替换而进行Fab分子的检索。在CNS中细化模型(Brunger,A.T.,Nat.Protoc.2：2728-2733(2007))，其是通过使用可变形的弹性网络限制而仿真粘合，并且于COOT中重建(Emsley,P.and Cowtan,K.,ActaCrystallogr.D.Biol.Crystallogr.60：2126-2132(2004))。适当时，来自高分辨率结构的N-链接的聚糖套入实验电子密度图。整个细化期间，将3倍强的非结晶对称约束应用于HA和Fab的各结构域，允许Fab的保守结构域和可变结构域之间的角度变化。最后，于PHENIX中进行3个循环的个别位置和B因子的细化(Adams,P.D.et al.,ActaCrystallogr.D.Biol.Crystallogr.58：1948-1954(2002))，造成模型与观察的强度有良好吻合性(R/Rfree=21.1/24.8%)(表2)。已向PDB提交坐标和饶射数据，登录号为35M5。

其它具体实施例

从前述叙述将明显得知，可对本文所述的发明进行改变和修饰以将其采用于多种利用和情况。此具体实施例亦在以下权利要求的范畴内。

本文的变量的任何定义中的所列元素的叙述包含所述变量为任何单一元素或所列元素的组合(或子组合)的定义。本文的具体实施例的叙述包含所述具体实施例为任何单一具体实施例与任何其它具体实施例或其部分的组合。

以参考方式并入

若各独立专利和刊物具体地和个别地注明以参考方式并入，则本说明书中所述的所有专利和刊物是以参考相同程度的方式而并入本文。

Claims (47)

1.一种单离的抗流行性感冒抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段与流行性感冒血凝素特异性地结合于所述血凝素多肽序列的残基136、137和226，从而减少或抑制与唾液酸结合的流行性感冒血凝素；所述抗流行性感冒抗体或抗体片段包括可变重链和可变轻链，所述可变重链包括SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12中所表示的氨基酸序列，且所述可变轻链包括SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：16中所表示的氨基酸序列。

2.一种单离的抗流行性感冒抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段与流行性感冒血凝素特异性地结合于所述血凝素多肽序列的残基136、137和226，从而减少或抑制与唾液酸结合的流行性感冒血凝素；所述抗流行性感冒抗体或抗体片段包括一个或多个重链CDR区和一个或多个轻链CDR区，所述重链CDR区存在于SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所表示的可变重链氨基酸序列中，且所述轻链CDR区存在于SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：16所表示的可变轻链氨基酸序列中。

3.根据权利要求1所述的抗流行性感冒抗体或抗体片段，其中所述抗流行性感冒抗体或抗体片段包括：i)包括SEQ ID NO：10所表示的氨基酸序列的可变重链氨基，以及ii)包括SEQ ID NO：14所表示的氨基酸序列的可变轻链。

4.根据权利要求2所述的抗流行性感冒抗体或抗体片段，其中所述一个或多个重链CDR区包括存在于SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12的可变重链氨基酸序列中的CDR3区。

5.根据权利要求4所述的抗流行性感冒抗体或抗体片段，其中所述一个或多个轻链CDR区包括存在于SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：16的可变轻链氨基酸序列中的CDR3区。

6.根据权利要求4所述的抗流行性感冒抗体或抗体片段，其中所述抗流行性感冒抗体或抗体片段包括可变重链，其中所述可变重链的所述CDR3区包括Arg104、Ser105、Val 106、Asp 107、Tyr109、Tyr110、Tyr112或其组合；或

其中所述抗流行性感冒抗体或抗体片段与血凝素结合于一个或多个选自由下列所组成组的血凝素残基：血凝素残基158至160；血凝素残基190至195；血凝素残基222、225和227；以及A/Solomon Islands/3/2006血凝素残基187和189；或

其中所述抗体或抗体片段还与选自由血凝素残基190至195所组成组的血凝素残基接触；或

其中所述抗体或抗体片段CDR H1区与血凝素残基158接触；所述CDR H2区与血凝素残基158至160接触；所述CDR H3区与血凝素残基135至136、190至195和226接触；所述CDR L1区与血凝素残基222、225和227接触；或所述CDR L3区与血凝素残基187和189；或

其中所述抗体或抗体片段是衍生自可改善所述抗体或抗体片段的溶解度、生物半衰期或吸收的部分；或

其中所述抗体或抗体片段还与流行性感冒血凝素特异性地结合于所述血凝素多肽序列的残基153和194；或

其中所述抗体或抗体片段与流行性感冒血凝素特异性地结合于下列残基：(a)一个或多个选自由血凝素残基158至160所组成组的残基；(b)一个或多个选自由血凝素残基135至136所组成组的残基；(c)一个或多个选自由血凝素残基190至195所组成组的残基；以及(d)血凝素残基226。

7.根据权利要求1所述的抗流行性感冒抗体或抗体片段，其中所述抗流行性感冒抗体或抗体片段与流行性感冒血凝素特异性地结合于下列残基：(a)一个或多个选自由血凝素残基158至160所组成组的残基；(b)一个或多个选自由血凝素残基135至136所组成组的残基；(c)一个或多个选自由血凝素残基190至195所组成组的残基；以及(d)血凝素残基226，还特异性地结合于一个或多个选自由下列所组成组的血凝素残基：(e)一个或多个选自由残基222、225和227所组成组的残基；以及(f)一个或多个选自由残基187和189所组成组的残基。

8.根据权利要求1或2所述的抗流行性感冒抗体或抗体片段，其中所述抗流行性感冒抗体或抗体片段为单克隆抗体或其抗体片段。

9.根据权利要求1或2所述的抗流行性感冒抗体或抗体片段，其中所述血凝素多肽序列是选自由SEQ ID NO:17至44所组成组；或其中所述血凝素是选自由H1血凝素、H2血凝素、H3血凝素和H5血凝素所组成组。

10.根据权利要求1或2所述的抗流行性感冒抗体或抗体片段，其中所述抗体片段为Fab片段、Fab'片段、Fd片段、Fd'片段、Fv片段、dAb片段、F(ab')₂片段、单链片段、双链抗体或线性抗体。

11.根据权利要求1或2所述的抗流行性感冒抗体或抗体片段，其还包括偶联所述抗流行性感冒抗体或抗体片段的剂。

12.根据权利要求11所述的抗流行性感冒抗体或抗体片段，其中偶联所述抗体或抗体片段的所述剂为治疗剂或可检测的标记。

13.根据权利要求12所述的抗流行性感冒抗体或抗体片段，其中所述治疗剂为小分子、纳米粒子、多肽、放射性同位素或抑制性核酸。

14.根据权利要求13所述的抗流行性感冒抗体或抗体片段，其中所述治疗剂为抗病毒剂或毒素。

15.根据权利要求13所述的抗流行性感冒抗体或抗体片段，其中所述治疗剂为减少流行性感冒病毒产生的siRNA、shRNA或反义核酸分子。

16.根据权利要求11所述的抗流行性感冒抗体或抗体片段，其中所述可检测的标记可通过光谱、光化学、生化、免疫化学、物理或化学工具检测。

17.根据权利要求11所述的抗流行性感冒抗体或抗体片段，其中所述可检测标记为已制成可检测的酶、荧光分子、颗粒标记、电子致密试剂、放射性标记、微泡、生物素、地高辛或半抗原或蛋白质。

18.根据权利要求1或2所述的抗流行性感冒抗体或抗体片段，其中所述流行性感冒为H1N1、H2N2、H3N2或适应人类的H5病毒株。

19.一种医药组合物，包括根据权利要求1至18中任一项所述的抗流行性感冒抗体或抗体片段。

20.根据权利要求19所述的医药组合物，其中所述医药组合物包括医药可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

21.一种单离的多核苷酸，所述多核苷酸编码根据权利要求1至10中任一项所述的抗流行性感冒抗体或抗体片段。

22.一种表达载体，所述载体包括根据权利要求21所述的单离的多核苷酸。

23.一种宿主细胞，所述宿主细胞包括根据权利要求22所述的表达载体。

24.一种根据权利要求1至18中任一项所述的抗流行性感冒抗体或抗体片段的用途，用在制备治疗或预防有需要的受试者的流行性感冒病毒感染的药物。

25.一种根据权利要求1至18中任一项所述的抗流行性感冒抗体或抗体片段的用途，用在制备中和有需要的受试者中的流行性感冒病毒的药物。

26.一种根据权利要求1至18中任一项所述的抗流行性感冒抗体或抗体片段的用途，用在制备抑制有需要的受试者的流行性感冒病毒感染的建立的药物。

27.一种根据权利要求1至18中任一项所述的抗流行性感冒抗体或抗体片段的用途，用在制备抑制有需要的受试者的流行性感冒病毒感染散播的药物。

28.一种根据权利要求1至18中任一项所述的抗流行性感冒抗体或抗体片段的用途，用在制备抑制流行性感冒病毒进入细胞的药物。

29.根据权利要求24至28中任一项所述的用途，其中所述流行性感冒为H1N1、H2N2、H3N2,或适应人类的H5病毒株。

30.根据权利要求24至28中任一项所述的用途，其中所述受试者具有流行性感冒感染或发展流行性感冒感染的风险。

31.根据权利要求30所述的用途，其中所述受试者为哺乳动物。

32.根据权利要求31所述的用途，其中所述受试者为人类。

33.根据权利要求30或31所述的用途，其中所述受试者易受病毒感染。

34.根据权利要求33所述的用途，其中所述受试者为怀孕女性。

35.根据权利要求33所述的用途，其中所述受试者为年轻受试者或婴儿受试者。

36.根据权利要求33所述的用途，其中所述受试者为老年受试者。

37.一种在活体外抑制流行性感冒病毒进入细胞的方法，其中所述方法包括使具有流行性感冒病毒感染或有发展流行性感冒病毒感染的风险的细胞与i)根据权利要求1至18中任一项所述的抗流行性感冒抗体或抗体片段，或ii)根据权利要求19或20所述的医药组合物接触，从而抑制流行性感冒病毒进入所述细胞。

38.根据权利要求37所述的方法，其中所述流行性感冒为H1N1、H2N2、或H3N2。

39.一种治疗或预防流行性感冒病毒感染的试剂盒，其中所述试剂盒包括有效量的i)根据权利要求1至18中任一项所述的抗流行性感冒抗体或抗体片段，或ii)根据权利要求19或20所述的医药组合物。

40.一种中和流行性感冒病毒的试剂盒，其中所述试剂盒包括有效量的i)根据权利要求1至18中任一项所述的抗流行性感冒抗体或抗体片段，或ii)根据权利要求19或20所述的医药组合物。

41.一种抑制流行性感冒病毒感染的建立的试剂盒，其中所述试剂盒包括有效量的i)根据权利要求1至18中任一项所述的抗流行性感冒抗体或抗体片段，或ii)根据权利要求19或20所述的医药组合物。

42.一种抑制流行性感冒病毒感染的散播的试剂盒，其中所述试剂盒包括有效量的i)根据权利要求1至18中任一项所述的抗流行性感冒抗体或抗体片段，或ii)根据权利要求19或20所述的医药组合物。

43.一种抑制流行性感冒病毒进入细胞的试剂盒，其中所述试剂盒包括有效量的i)根据权利要求1至18中任一项所述的抗流行性感冒抗体或抗体片段，或ii)根据权利要求19或20所述的医药组合物。

44.根据权利要求39至43中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包括治疗剂。

45.根据权利要求44所述的试剂盒，其中所述治疗剂抑制流行性感冒感染。

46.根据权利要求39至43中任一项试剂盒的试剂盒，还包括在根据权利要求24至36中任一项所述的用途中和根据权利要求37至38中任一项所述的方法中使用所述试剂盒的指示。

47.根据权利要求39至43中任一项试剂盒的试剂盒，其中所述流行性感冒为H1N1、H2N2、或H3N2。