KR20160075107A - 페길화된 vegf 트랩 및 이의 제조방법 - Google Patents

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KR20160075107A
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Abstract

본 발명은 페길화된 VEGF 트랩 및 이의 제조방법에 관한 것으로, VEGF 트랩의 C-말단에 티올기를 도입 후 페길화하여 반감기 및 항암 효과가 증진된 SEG-VEGF 트랩 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 페길화된 VEGF 트랩은 C-말단을 티올기를 갖는 시스테인으로 치환한 후 위치 특이적 페길화를 통하여, 기존의 VEGF 트랩보다 반감기가 증가되고 항암 효과 역시 증진된 항암 치료제로 유용하다.

Description

페길화된 VEGF 트랩 및 이의 제조방법 {PEGylated VEGF-Trap and Method for Preparation Thereof}
본 발명은 페길화된 VEGF 트랩 및 이의 제조방법에 관한 것으로, VEGF 트랩의 C-말단에 티올기를 도입 후 페길화하여 반감기 및 항암 효과가 증진된 SEG-VEGF 트랩 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
암세포가 증식 및 성장하기 위해서는 산소와 영양을 공급하는 새로운 혈관이 필요하게 된다. 새로운 혈관 형성에는 여러 인자들이 관여하지만 그 중에서 가장 중추적인 조절인자로서 역할을 하는 것이 혈관내피세포 성장인자(VEGF; vascular endothelial growth factor)로 알려져 있다(Ferrara and Davis-Smyth, Endocrine Rev. 18: 4-25, 1997; Ferrara et al., J. Mol. Med. 77:527-543, 1999). 포유동물에서는 현재 다섯 종류의 VEGF들(VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, PLGF)이 밝혀져 있으며, 이들은 VEGF 수용체(VEGFR) -1, -2, -3 라고 알려진 세 개의 수용체에 결합한다. 마우스에서의 표적 유전자 불활성화 연구를 통해 VEGF가 혈관 신생의 초기 단계에 필요한 인자임이 밝혀졌으며, VEGF 분자는 종양 세포에서 상향조절되고 그의 수용체는 종양 침윤 혈관 내피세포에서 상향조절되지만, VEGF 및 그의 수용체의 발현은 혈관신생에 관련되지 않은 정상 세포에서 낮게 유지된다는 것이 밝혀짐에 따라 (Brown et al., Cancer Res. 53: 4727-4735, 1993; Mattern et al., Brit. J. Cancer. 73: 931-934, 1996), 새로운 혈관 형성을 촉진하는 VEGF가 암의 치료 및 예방의 타겟으로서 주목받고 있다.
따라서, 최근에는 암세포 자체보다는 암세포에 영양을 공급하는 혈관의 생성을 차단하는 새로운 항암 치료법이 개발되고 있으며(Siemeister et al. Cancer Metastasis Rev. 17: 241-248, 1998), 항-VEGF 중화 항체는 누드 마우스에서 다양한 인간 종양 세포주의 성장을 억제하는 것으로 밝혀졌다 (Warren et al., J. Clin. Invest. 95: 1789-1797, 1995; Borgstrom et al. Cancer Res. 56: 4032-4039, 1996; Melnyk et al. Cancer Res. 56: 921-924, 1996). VEGF에 대한 인간화 항체로서 "VEGF 트랩"이라 불리는 가용성 VEGF-특이적 융합 단백질 길항제가 개시되었고(Kim et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:11399-404, 2002; Holash et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:11393-8, 2002), 실제로 베바시주마브(Bevacizumab, 상품명: 아바스틴(Avastin))가 상품화되어 있다. 그러나, 이러한 단백질을 치료용으로 투여할 경우, 혈액 및 조직에서 그 체내 반감기(half-life)가 짧으면 생체 내 약효 지속성과 안정성이 떨어지는 문제점이 있다.
이러한 문제점을 해결하기 위하여, 최근 10년간 생체적합성 고분자인 폴리에틸렌글리콜(polyethyleneglycol;PEG)을 단백질 또는 펩타이드 물질에 접합시키려는 시도가 계속해서 이어져 왔다 (G.Pasut & F. M. Veronese Prog. Polym. Sci. 32, 933, 2007; F. M. Veronese et al., Biomaterials 22, 405.2001; P.Bailon et al., Pharm. Sci. Tech. Today 1, 352, 1998). 폴리에틸렌글리콜(PEG)은 생체 내에서 면역반응을 일으키지 않는 생체적합성이 뛰어난 고분자로서 미국식품의약안정청(FDA)이 승인한 합성 고분자중의 하나이며, 폴리에틸렌글리콜의 스텔스 작용(stealth effect)을 통하여 생체 내의 단백질 효소들에 의한 분해를 억제하는 효과를 나타냄으로써, 궁극적으로 생체 내에서의 반감기 및 안정성을 증가시키게 된다.
그러나, 단백질 약물의 체내 안정성 및 지속성 향상을 위하여 폴리에틸렌글리콜을 사용할 때, 폴리에틸렌글리콜이 단백질 약물이 가지고 있는 복수개의 결합부위와 반응함으로써, 결과적으로 생성되는 산물이 불균일한 다중 접합체 혼합물(a mixture of multi-PEGylated species)이 되는 문제점이 있다. 한편, 조건을 엄격하게 조절하여 일분자의 폴리에틸렌글리콜이 결합된 (mono-PEGylated) 접합체를 제조한다 할지라도, 그 결합부위에 따라 약물의 생물학적 또는 체내 활성도가 현격히 영향을 받는다는 점이 문제이다. 이를 해결하기 위하여, 대부분의 치료용 단백질은 활성 부위(active site)가 N-말단 (N-terminal)의 인접부위에 위치해 있지 않으므로, 단백질 또는 펩타이드의 N-말단에 PEG를 결합시켜 페길화 반응의 가장 큰 단점인 단백질 활성화 저하를 최소화하려는 시도가 있어왔다. 본 발명자들 또한, 카테콜을 갖는 화합물이 결합된 PEG 유도체를 이용하여 단백질 또는 펩타이드의 N-말단의 1차 아민 (primary amine)에 위치 특이적 (site-specific)으로 단일-PEG (mono-PEGylated)가 접합된 접합체를 제조한 바 있다(대한민국 등록특허 10-1042965).
하지만, VEGF 트랩과 같은 항체 단백질은 N-말단에 활성부위가 존재하므로, N-말단을 페길화하는 기존의 방법으로는 단백질 고유의 효능을 나타내기 어렵다.
이에, 본 발명자들은 항암 효과가 더욱 증진된 VEGF 트랩 약물을 개발하고자 예의 노력한 결과, 아민보다 카테콜 그룹이 더 잘 반응하는 티올(Thiol, -SH)기를 C-말단에 도입하여 C-말단 위치 특이적 페길화 방법을 고안하고, PEG-카테콜이 VEGF 트랩의 C-말단에 접합하여 페길화되므로써 반감기 및 항암 효과가 증가하는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 C-말단에 티올(thiol,-SH)기가 도입된 VEGF 트랩 단백질 및 상기 단백질의 티올기에 카테콜이 결합된 폴리에틸렌글리콜(PEG-CT)를 접합시킨 페길화된 VEGF 트랩 단백질을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 페길화된 VEGF 트랩 단백질을 유효성분으로 포함하는 혈관신생 억제용 조성물 또는 항암 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 VEGF 트랩 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터 및 상기 발현벡터를 포함하는 혈질전환 세포를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 VEGF 트랩 단백질의 제조방법 및 페길화 방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본발명은 C-말단에 티올(thiol,-SH)기가 도입된 VEGF 트랩 단백질을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 VEGF 트랩 단백질의 티올기에 카테콜이 결합된 폴리에틸렌글리콜(PEG-CT)를 접합시켜 페길화된 VEGF 트랩 단백질을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 페길화된 VEGF 트랩 단백질을 유효성분으로 포함하는 혈관신생 억제용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 페길화된 VEGF 트랩 단백질을 유효성분으로 포함하는 항암 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 ,상기 VEGF 트랩 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 발현벡터를 포함하는 형질전환 세포를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 세포를 배양하는 것을 특징으로 하는 VEGF 트랩 단백질의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 방법에 의해 제조된 VEGF 트랩 단백질과 카테콜이 결합된 폴리에틸렌글리콜(PEG-CT)을 접합시키는 것을 특징으로 하는 VEGF 트랩 단백질의 페길화 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 페길화된 VEGF 트랩은 C-말단을 티올기를 갖는 시스테인으로 치환한 후 위치 특이적 페길화를 통하여, 기존의 VEGF 트랩보다 반감기가 증가되고 항암 효과 역시 증진된 항암 치료제로 유용하다.
도 1은 VEGF 트랩 변이체 단백질 C-말단의 페길화를 나타낸 도식도이다.
도 2는 VEGF 트랩 단백질의 구조를 나타낸 것이다.
도 3은 VEGF 트랩 변이체 단백질의 PCR 산물을 확인한 결과이다 (Lane 1: 1kb DNA ladder, Lane 2: VEGF-Trap(Cys#1), Lane 3: VEGF-Trap(Cys#2), Lane 4: VEGF-Trap(Cys#3)).
도 4는 VEGF 트랩의 제한효소 지도 도식도이다.
도 5는 VEGF 트랩의 염기서열을 확인한 결과이다.
도 6은 VEGF 트랩의 C-말단 마지막 1번째 위치가 시스테인으로 치환된 돌연변이체를 코딩하는 핵산분자가 도입된 벡터(Cys#1-VEGF-Trap)를 나탄낸 것이다.
도 7은 VEGF 트랩의 C-말단 마지막 2번째 위치가 시스테인으로 치환된 돌연변이체를 코딩하는 핵산분자가 도입된 벡터(Cys#2-VEGF-Trap)를 나탄낸 것이다.
도 8은 VEGF 트랩의 C-말단 마지막 3번째 위치가 시스테인으로 치환된 돌연변이체를 코딩하는 핵산분자가 도입된 벡터(Cys#3-VEGF-Trap)를 나탄낸 것이다.
도 9는 VEGF 트랩을 이용한 세포주 개발의 도식도이다.
도 10은 VEGF 트랩 재조합 단백질을 확인하기 위한 ELISA 도식도이다.
도 11은 각각의 VEGF 트랩 변이체가 도입된 세포의 부착 상태(ad-CHO)와 부유 상태(SFM-CHO)에서의 성장 속도를 비교한 결과이다.
도 12는 각각의 VEGF 트랩 변이체가 도입된 세포의 부유상태(SFM-CHO)에서 재조합 단백질 발현양을 측정한 결과이다.
도 13은 VEGF 트랩 변이체가 도입된 부유상태의 세포(SFM-CHO)에서 재조합 단백질의 생산량을 비교한 결과이다(a: Cys#1-VEGF-Trap, b: Cys#2-VEGF-Trap, c: Cys#3-VEGF-Trap).
도 14는 pool 시스템에서 부유배양 적응의 VEGF 트랩 변이체(Cys#1, Cys#2, Cys#3-VEGF-Trap) 재조합 단백질의 발현양을 나타낸 것이다(a: 생존 세포수, b: 세포 생존률, c: VEGF 트랩 재조합 단백질 양).
도 15는 Stirred 탱크 리액터와 퍼퓨전법을 이용한 세포 대량배양 공정의 도식도이다.
도 16은 스피너 플라스크를 이용한 부유세포의 재조합 단백질 생산을 나타낸 도식도이다.
도 17은 Cys#1-VEGF 트랩 변이체가 도입된 부유상태의 세포를 스피너 플라스크에서 8일간 배양하여 재조합 단백질 발현양을 측정한 결과이다(a: 단백질 발현양, b: 단백질 생산능).
도 18은 스피너 플라스크에서 배양 시스템에서 한 회분(batch)당 Cys#1-VEGF 트랩 재조합 단백질의 발현양을 측정한 결과이다.
도 19는 기존의 VEGF 트랩과 VEGF 트랩 변이체를 비교한 SDS-PAGE 결과이다.
도 20은 한계희석배양 시스템을 통한 VEGF 트랩 세포주 생성과정을 나타낸 도식도이다.
도 21은 Cys#1-VEGF 트랩 세포주의 한계희석배양 결과를 나타낸 것이다.
도 22는 한계희석을 통한 단일클론 Cys#1-VEGF 트랩 세포주의 선택을 나타낸 결과이다.
도 23은 단일클론 Cys#1-VEGF 트랩 세포주 중 단백질 발현양이 높은 단일클론을 무혈청 배지에서 배양한 결과이다.
도 24는 한계희석배양 시스템에서 부유배양 적응의 단일클론 Cys#1-VEGF 트랩 (A3, B1, C2) 재조합 단백질의 발현양을 나타낸 것이다(a: 생존 세포수, b: 세포 생존률, c: VEGF 트랩 재조합 단백질 양).
도 25는 Cys#1-VEGF 트랩 단일클론 A3와 B1의 단백질 발현을 비교한 결과이다.
도 26은 아바스틴(양성 대조군), 단일클론 B1-VEGF 트랩 및 pool 시스템 VEGF 트랩의 hVEGF-A 165 결합력을 비교한 결과이다.
도 27은 VEGF 트랩의 돌연변이 부위에 PEG-카테콜을 접합하여 페길화시킨, SEG-VEGF 트랩을 합성한 결과이다.
도 28은 SEG-VEGF 트랩의 MALDI-TOF 결과를 나타낸 것이다.
도 29는 반감기를 비교한 결과이다.
도 30은 약물 투여 후 종양(tumor) 부피를 측정하여 비교한 결과이다.
도 31은 적혈구 용적(Hematocrit)을 측정하여 비교한 결과이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서는, VEGF 트랩 단백질의 C-말단을 시스테인으로 치환시켜 티올기가 도입된 VEGF 트랩 단백질을 제조하고, C-말단에 카테콜이 결합된 폴리에틸렌글리콜(PEG-CT)을 접합시켜 VEGF 트랩 단백질을 페길화시켰으며, 페길화된 VEGF 트랩 단백질의 증가된 반감기 및 우수한 항암 효과를 규명하였다.
따라서, 본 발명은 일관점에서 C-말단에 티올(thiol, -SH)기가 도입된 VEGF 트랩 단백질에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 C-말단에 티올(thiol, -SH)기의 도입은 VEGF 트랩 단백질의 C-말단 아미노산을 시스테인(Cystein)으로 치환하는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 상기 시스테인의 위치가 C-말단 아미노산 마지막 1번째 내지 5번째로 구성된 군에서 선택된 어느 하나인 것이며, 가장 바람직하게는 시스테인의 위치가 C-말단 아미노산 마지막 1번째인 것이나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 다른 관점에서, VEGF 트랩 단백질의 티올기에 카테콜이 결합된 폴리에틸렌글리콜(PEG-CT)을 접합시킨 페길화된 VEGF 트랩 단백질에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 PEG-CT는 VEGF 트랩 단백질의 C-말단에 접합되는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 VEGF 트랩 단백질의 C-말단 시스테인에 단일 접합되는 것이나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 페길화된 VEGF 트랩 단백질을 유효성분으로 함유하는 혈관신생 억제용 조성물 및 항암 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 용어, "항암"이란 "예방" 및 "치료"를 포함하며, 여기서 "예방"이란 본 발명의 항체 단백질을 포함하는 조성물 투여에 의해 암이 억제되거나 지연되는 모든 행위를 의미하고, "치료"란 본 발명의 항체 단백질을 포함하는 조성물 투여에 의해 암의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 조성물로 치료할 수 있는 암 또는 암종은 특별히 제한두지 않으며, 고형암 및 혈액암을 포함한다. 바람직하게 위암, 유방암, 폐암, 난소암, 간암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 췌장암, 방광암, 대장암, 결장암, 자궁경부암, 뇌암, 전립선암, 골암, 피부암, 갑상선암, 신장암, 식도암, 담도암, 고환암, 직장암, 두경부암, 경추암, 요관암, 골육종, 신경아세포종, 흑색종, 섬유육종, 횡문근육종, 성상세포종, 신경모세포종 또는 신경교중 등을 포함한다. 더욱 바람직하게는 VEGF가 발현되는 모든 암을 포함한다.
본 발명의 페길화된 VEGF 트랩 단백질을 함유하는 조성물은 통상의 방법에 따른 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가적으로 포함할 수 있다. 화합물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전문, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
본 발명의 페길화된 VEGF 트랩 단백질을 함유하는 조성물은 통상의 방법에 따라 산제, 환제, 과립제, 캡슐제, 현탁액, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수용액제, 현탁액, 동결 건조제 및 좌제로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있다.
제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 중량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌 글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 60, 카카오지, 라우린지, 글리세롤 제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 조성물은 1일 0.001~100 mg/kg으로 바람직하게는 0.01~10mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 경구 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 본 발명에서 "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 개체에 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 항체 단백질을 포함하는 조성물의 투여 졍로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 바람직하게는 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여 될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 암의 예방 또는 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, VEGF 트랩 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터 및 상기 발현벡터를 포함하는 형질전화 세포에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 C-말단이 서열번호 7 내지 9로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 서열로 치환되는 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 세포는 동물세포, 식물세포, 효모, 대장균, 곤충세포 또는 동물세포인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 대장균이나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 동물세포는 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포인 것이 바람직하나, 이 또한 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 벡터 시스템은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)에 개시되어 있다. 본 발명의 용어 "벡터"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환 되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 플라스미드 및 벡터는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 본 발명의 목적상, 플라스미드 벡터를 이용하는 게 바람직하다. 이러한 목적에 사용될 수 있는 전형적인 플라스미드 벡터는 (a) 숙주세포당 수백 개의 플라스미드 벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록 하는 복제 개시점, (b) 플라스미드 벡터로 형질전환된 숙주세포가 선발될 수 있도록 하는 항생제 내성 유전자 및 (c) 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 지니고 있다. 적절한 체한효소 절단부위가 존재하지 않을지라도, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터 또는 링커를 사용하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션할 수 있다. 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예컨대, tac 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, pLλ 프로모터, pRλ 프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로머터, trp 프로모터 및 T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주 세포로서 E. coli가 이용되는 경우, E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위 (Yanofsky, C., J. Bacteriol., 158:1018-1024(1984)) 그리고 파아지의 좌향 프로모터 (pLλ 프로모터, Herskowitz, I. and Hagen, D., Ann.Rev. Genet., 14:399-445(1980))가 조절 부위로서 이용될 수 있다. 본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예: pSC101, ColE1, pBR322, pUC8/9, pHC79, pUC19, pET 등), 파지 (예: λgt4λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스 (예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다. 한편, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터 (예: 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다. 본 발명의 발현 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함할 수 있으며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 백터는 pCMV인 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
라이게이션 후에, 벡터는 적절한 숙주세포로 형질전환 되어야 한다. 형질전환은 Sambrook, et al., supra의 1.82 섹션에 기술된 칼슘 클로라이드 방법을 사용해서 용이하게 달성될 수 있다. 선택적으로, 전기천공법(Neumann, et al., EMBO J., 1:841, 1982) 또한 이러한 세포들의 형질전환에 사용될 수 있다.
당업계에 주지된 바와 같이, 숙주세포에서 형질감염 유전자의 발현수준을 높이기 위해서는, 해당 유전자가 선택된 발현 숙주 내에서 기능을 발휘하는 전사 및 해독 발현 조절 서열에 작동 가능하도록 연결되어야만 한다. 바람직하게는 발현 조절서열 및 해당 유전자는 세균 선택 마커 및 복제 개시점을 같이 포함하고 있는 하나의 재조합벡터 내에 포함되게 된다.
상술한 재조합 벡터에 의해 형질전환된 숙주세포는 본 발명의 또 다른 측면을 구성한다. 본원 명세서에 사용된 용어 "형질전환"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체 외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제가능하게 되는 것을 의미한다. 물론 모든 벡터가 본 발명의 DNA 서열을 발현하는데 모두 동등하게 기능을 발휘하지는 않는다는 것을 이해하여야만 한다. 마찬가지로 모든 숙주가 동일한 발현 시스템에 대해 동일하게 기능을 발휘하지는 않는다. 그러나, 당업자라면 과도한 실험적 부담 없이 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 채로 여러 벡터, 발현 조절 서열 및 숙주 중에서 적절한 선택을 할 수 있다. 예를 들어, 벡터를 선택함에 있어서는 숙주를 고려하여야 하는데, 이는 벡터가 그 안에서 복제되어야만 하기 때문이다. 벡터의 복제 수, 복제 수를 조절할 수 있는 능력 및 당해 벡터에 의해 코딩되는 다른 단백질, 예를 들어 항생제 마커의 발현도 또한 고려되어야만 한다.
본 발명의 형질전화 세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 동물세포, 식물세포, 효모, 대장균 또는 곤충세포인 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예컨데, 대장균으로는 E. coli JM109, E. coli BL21(DE3), E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110 등을 사용할 수 있으며, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다. 또한, 본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주 세포로서, 이스트 (Saccharomyce cerevisiae), 곤충 세포 및 동물 세포 (예컨대, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 등이 이용될 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 세포를 메토트렉세이트(MTX; methotrexate)가 포함된 배지에서 반복 계대 배양하는 단계; 상기 배양된 부착상태 세포를 부유상태로 만들기 위해 부유적응을 수행하는 단계; 및 VEGF 트랩 단백질 생산이 우수한 세포를 선별하는 단계를 포함하는 VEGF 트랩 단백질을 생산하는 세포주의 제조방법 및 상기 방법에 의해 제조된 VEGF 트랩 단백질을 생산하는 세포주에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, VEGF 트랩 단백질을 생산하는 세포주 또는 발현벡터를 포함하는 형질전화 세포를 배양하는 것을 특징으로 하는 VEGF 트랩 단백질의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 배양은 교반 탱크 반응기(stirred tank reactor), 스피너 플라스크(spinner flask), 한계희석배양 시스템 및 디스포저블 바이오리액터(disposable bioreactor)로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상을 이용하여 배양하는 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 또 다른 관점에서, VEGF 트랩 단백질과 카테콜이 결합된 폴리에틸렌글리콜(PEG-CT)을 접합시키는 것을 특징으로 하는 VEGF 트랩 단백질의 페길화 방법에 관한 것이다.
본 발명의 페길화된 VEGF 트랩 단백질에서, 상기 PEG-CT를 결합시키는 페길화 방법은 당업계에 반적인 방법으로 수행될 수 있다(M.J. Roberts et al., Advanced Drug Delivery Reviews; 54:459476, 2002; Francesco et al., Veronese Biomaterials; 22:405-417, 2001).
본 발명의 VEGF 트랩 단백질에 결합되는 PEG-CT는 분자량이 5-100kDa인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 30kDa인 것이나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 용어, "혈관신생"은 혈관 내피세포가 증식하고 재구성되어 기존에 존재하는 혈관 네트워크로부터 새로운 혈관을 형성하는 세포 현상을 의미한다. 이러한 혈관신생에는 혈관 신생, 내피세포 성장, 혈관 안정성 및 혈관 형성을 촉진하는 혈관신생 인자가 관여한다. 상기 혈관신생 인자는 예를 들어 VEGF 및 VEGF 패밀리, PIGF(placental growth factor), PDGF(platelet-derived growth factor) 패밀리의 멤버, 섬유아세포 성장 인자 패밀리(FGF), TIE 리간드(앤지오포이에틴), 에프린, Del-1, 섬유아세포 성장 인자(산성(aFGF) 및 염기성 (bFGF)), 폴리스타틴, 과립구 콜로니-자극 인자(G-CSF), 간세포 성장 인자(HGF)/산란 인자(SF), 인터루킨-8(IL-8), 렙틴, 미드카인, 태반 성장 인자, 혈소판 유래 내피세포 성장 인자(PD-ECGF), 혈소판 유래 성장 인자, 특히 PDGF-BB 또는 PDGFR-베타, 플레이오트로핀(PTN), 프로그라뉼린, 프로리페린, 형질전환 성장인자-알파(TGF-알파), 형질전환 성장 인자-베타(TGF-베타), 종양 괴사 인자-알파(TNF-알파), 혈관 내피 성장 인자(VEGF)/혈관 투과 인자(VPF) 등이 포함되며, 특별히 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서의 용어, "혈관신생 억제제"는 혈관신생, 혈관형성, 또는 바람직하지 않은 혈관 투과성을 직접 또는 간접적으로 억제하는 저분자량 물질, 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 단리된 단백질, 재조합 단백질, 항체, 또는 이들의 컨쥬게이트 또는 융합 단백질을 의미한다. 또한 상기 혈관신생 억제제는 혈관신생 인자 또는 그의 수용체에 결합하여 혈관신생 활성을 차단하는 물질을 포함한다. 예를 들어, 혈관신생 억제제는 혈관형성제에 대한 항체 또는 다른 길항제, 예를 들어 VEGF-A 또는 VEGF-A 수용체(예를 들어, KDR 수용체 또는 Flt-1 수용체)에 대한 항체, VEGF-트랩, 앤지오포에이틴(Angiopoietin) 2를 포함한다.
바람직하게, 본 발명에 따른 항체 단백질에는 혈관신생 억제제로서 VEGF 트랩이 사용된다. 본 발명에서 VEGF 트랩은 VEGF에 결합할 수 있는 다중 결합 단백질을 의미하며 VEGF의 제거, 억제 또는 감소에 의해 향상, 경감, 또는 억제되는 VEGF-관련 상태 및 질병을 치료하는데 유용한 물질을 의미한다. 본 발명에 따른 VEGF 트랩은 C-말단에 티올(thiol, -SH)기가 도입된 VEGF 트랩 단백질에 카테콜이 결합된 폴리에틸렌글리콜(PEG-CT)을 접합시킨 페길화된 VEGF 트랩 단백질인 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
[실시예]
이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 이에 의해 본 발명의 기술적 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명 할 것이다.
실시예 1: VEGF 트랩 바이오베터 단백질 디자인
VEGF 트랩을 페길화 효율이 높아 공정수율을 높일 수 있는 VEGF 트랩 베터 단백질로 디자인하였다(도 1). VEGF 트랩과 같은 항체 단백질은 N-말단에 활성부위가 존재하므로, N-말단을 페길화하는 기존의 방법이 아닌 C-말단 위치 특이적 페길화 방법을 도입하기 위해, C-말단을 돌연변이시켰다.
1-1: VEGF 트랩의 C-말단 위치 특이적 돌연변이
VEGF 트랩의 C-말단에 티올(Thiol)기를 도입하여 카테콜 그룹과 잘 반응하게 하기 위해, C-말단에 위치한 아미노산을 티올기를 가지는 시스테인으로 치환하였다. 시스템 바이올로지 기술로 최적화된 코돈을 디자인한 후, 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하였다. 시스테인의 위치에 따라 제작된 3가지 프라이머 세트(서열번호 1/2; 서열번호 1/3; 서열번호 1/4)를 이용하여, 표 1 및 표 2의 조건으로 반응시켰다.
[프라이머]
Forward: 5'-CAAAAGCTGGAGCTCCACC-3' (서열번호 1)
Reverse:
Cys#1 5'-TCTCCCTGTCTCCGGGTtgtCTCGAGCATGCA-3' (서열번호 2)
Cys#2 5'-GCCTCTCCCTGTCTCCGtgtAAACTCGAGCATGCA-3' (서열번호 3)
Cys#3 5'-GAAGAGCCTCTCCCTGTCTtgcGGTAAACTCGAGCATGCA-3' (서열번호 4)
PCR을 위한 샘플 준비 조건
PCR reaction mixture
2X i-pfu premix sol. (Intron) 10 ㎕
Template DNA (VEGF-Trap) 1 ㎕
Primer (F :10μM) 1 ㎕
Primer (R :10μM) 1 ㎕
Distilled Water 7 ㎕
Total reaction Vol. 20 ㎕
PCR 반응 프로그램
PCR cycle Temp. (℃) Time
Initial denaturation 95 3 min

34 cycles
 Denaturation 95 30 sec
Annealing 60 30 sec
Extention 72 2 min
Final Extention 72 10 min
Storage 4 ∞
PCR을 수행하여 얻은 PCR 산물 1㎕를 1.5% agarose gel에서 130V로 20분간 전기영동하여 PCR 조건의 최적화 및 VEGF 트랩의 분자량 약 1.4kb를 확인하였다(도 3).
1-2: VEGF 트랩 돌연변이의 클로닝
VEGF 트랩 PCR 산물을 pCMV 벡터에 클로닝하기 위해, VEGF 트랩 PCR 산물 및 pCMV 벡터에 모두 존재하는 Not I과 Xho I 제한효소로 절단하였다. 도 4는 VEGF 트랩의 제한효소 절단부위 지도이다. 절단반응 조건은 표 3과 같으며, VEGF 트랩 PCR 산물 및 pCMV 벡터를 37℃에서 2시간 반응시킨 후 PCR purification kit(Intron)로 정제하였다.
절단반응 조건
Enzyme Digetion
a: amplicon means VEGF-Trap.
(Added 5.6㎕of Cys#1,
2.9㎕of Cys#2 and
3.8㎕of Cys#3)


b: Filled up final 20㎕ vol.
Not I 1 ㎕
Xho I 1 ㎕
NEB buffer 2 ㎕
10X BSA 2 ㎕
Vector 1 ㎕
Amplicona X ㎕
Waterb X ㎕
Total reaction Vol. 20 ㎕
정제된 클로닝 산물(VEGF 트랩 및 pCMV 벡터)에 3㎕ T4 라이게이즈 버퍼(solgent)와 1㎕ T4 라이게이즈를 첨가하여 16℃에서 overnight 반응시켜, pCMV-VEGF 트랩 벡터를 제작하였다(도 6, 7, 8).
10㎕ pCMV-VEGF 트랩 벡터는 대장균(E. coli :c2984 competent 세포)과 혼합하여 ice에서 30분간 반응 후, 42℃ 항온수조에서 45초간 열 충격(heat shock)을 주고 다시 ice에 2분간 보존하는 방법으로 형질전환을 수행하였다. 반응물에 1ml의 SOC(super optimal broth with catabolite repression) 배지를 넣고 37℃ 배양기에서 1시간 배양 후, 100㎕를 암피실린 할생제가 포함된 LB 한천배지에 도말하여 37℃ 배양기에서 24시간 배양하였다.
1-3: VEGF 트랩 변이체의 확인
pCMV-VEGF 트랩 벡터가 대장균에 형질전화된 것을 확인하기 위하여, 각각의 LB 플레이트에 생성된 16개의 콜로니를 서열번호 5/6의 프라이머를 사용하여 표 4 및 표 5의 조건으로 콜로니 PCR을 수행하였다.
[프라이머]
Forward: 5'-ATCAGCGAGCTCTAGCATTTAG-3' (서열번호 5)
Reverse: 5'-ATCCGCTAGCGATTACGC-3' (서열번호 6)
콜로니 PCR 샘플 준비 조건
PCR reaction mixture
2X i-Taq premix sol. 10 ㎕
Template (colony sample) 1 ㎕
Primer (F :10μM) 1 ㎕
Primer (R :10μM) 1 ㎕
Distilled Water 7 ㎕
Total reaction Vol. 20 ㎕
콜로니 PCR 반응 프로그램
PCR cycle Temp. (℃) Time
Initial denaturation 95 3 min

34 cycles
 Denaturation 95 30 sec
Annealing 60 30 sec
Extention 72 2 min
Final Extention 72 10 min
Storage 4 ∞
콜로니 PCR을 수행하여 얻은 PCR 산물은 아가로즈 젤로 전기영동하여 PCR 조건 최적화 및 분자량 약 8.5kb의 pCMV-VEGF 트랩을 확인하였다.
각각의 콜로니는 플라스미드 추출 키트(Intron)를 이용하여 추출 후, 염기서열을 분석(Marcrogen)하였다. 그 결과, VEGF 트랩의 C-말단이 시스테인으로 치환된 3가지 돌연변이 Cys#1-VEGF 트랩, Cys#2-VEGF 트랩 및 Cys#3-VEGF 트랩을 수득하였다. Cys#1-VEGF 트랩은 VEGF 트랩의 C-말단의 CCGGGTAAA 부위가 CCGGGTTGT(서열번호 7)로, Cys#2-VEGF 트랩은 CCGTGTAAA(서열번호 8)로, Cys#3-VEGF 트랩은 TGCGGTAAA(서열번호 9)로 치환되었다(도 5).
실시예 2: VEGF 트랩 발현 세포주 개발
실시예 1에서 수득한 3개의 pCMV-VEGF 트랩을 이용한 세포주를 개발하기 위하여, CHO-DG44 세포를 사용하였다.
2-1: 안정화된 세포주 개발
CHO-DG44 세포는 형질주입(transfection) 하루 전에, 10% dialyzed FBS 및 1X hypoxanthine-thymidine을 포함하는 Iscoves Modified Dulbeccos 배지(IMDM)로 T-25 플라스크에 1 X 105cell/ml로 계대배양하였다. 형질주입은 Lipofectamine 2000 kit(Invitrogen)를 사용하였으며, Opti-MEM 0.5ml에 각각의 pCMV-VEGF 트랩 벡터 0.8㎍과 리포펙타민 20㎕를 혼합하여 상온에서 20분간 반응시켰다. 반응 후, 10% FBS, hypoxanthine-thymidine, G418(600㎍/ml) 및 5nM Methotrexate(MTX)을 포함하는 IMDM 배지로 37℃에서 24시간 배양하고, 배지 제거 후 동일한 새 배지로 교체하여 배양하였다(도 9).
안정화된 세포주를 제조하기 위하여, 3번의 계대배양 후 4번째 계대배양 시 세포를 원심분리하여 상등액과 침전물을 분리하여 -70℃에 보관하였다. 5번째 계대배양 시에는 G418(600㎍/ml) 및 5nM에서 농도를 점차적으로 증가시킨 Methotrexate(MTX)을 배지에 첨가하여 배양 후, 4번째 계대배양 시와 동일하게 MTX 농도가 다른 각각의 세포를 원심분리하여 상등액과 침전물을 분리하여 -70℃에 보관하였다.
SDS-PAGE와 웨스턴블롯으로 가장 안정화된 세포주를 확인한 결과, 1μM의 MTX로 배양할 경우 가장 안정화된 세포주를 수득할 수 있었다.
2-2: 생산성이 우수한 세포주 선택
세포주의 대량배양을 위해, 부착상태의 세포를 부유상태의 세포로 만드는 부유배양 적응(suspension adaptation)을 수행하였다. 무혈청 배지에 5 x 105 cells/mL, 3 x 105 cells/mL, 2 x 105 cells/mL 순서의 농도로 접종하여 최종적으로 2 x 105 cells/mL의 접종 농도에서 세포가 부유배양 적응되도록 진행하여 3일째 1 x 106 cells/mL이 되도록 하였다. 또한, 무혈청 배지 상태에서 2 x 105 cells/mL의 접종 농도에 세포가 적응하는 시간을 알아보기 위해, 세포 생존능 및 단백질 생산능을 확인하였다. 생산능은 세포 생존능이 50% 이하로 감소할 때까지 진행하였으며, 샌드위치 ELISA로 분석하였다(도 10).
인간 IgG1(capture Ab)으로 VEGF 트랩 재조합 단백질의 반응을 확인한 결과, 3가지 종류 세포주들의 세포수가 부착상태보다 부유상태에서 20배 이상 증가한 것으로 나타나 부유배양 적응을 잘 하는 것으로 확인되었다(도 11).
3가지 종류 세포주(Cys#1-VEGF 트랩, Cys#2-VEGF 트랩 및 Cys#3-VEGF 트랩)의 부유상태에서의 재조합 단백질 발현양 및 생산능을 비교한 결과, Cys#2-VEGF 트랩은 생장속도가 빠른 것에 비해 단백질 발현이 적게 나타나며, Cys#1-VEGF 트랩과 Cys#3-VEGF 트랩은 생장속도는 비슷하나 Cys#1-VEGF 트랩의 단백질 발현양이 우수하였다(도 12, 13 및 14). 따라서, Cys#1-VEGF 트랩 세포주가 다른 세포주에 비해 적은 세포 상태에서 많은 재조합 단백질을 발현하는 것으로 확인되었다.
실시예 3: VEGF 트랩 바이오베터 단백질의 대량생산 시스템
3-1: 대량배양(scale-up) 공정
부유상태로 배양이 가능하도록 만들어진 세포주 (CHO-DG44 cell)을 이용하여 회분식 세포배양법의 일종인 Stirred Tank Reactor(의료용 단백질 대량배양시 주로 사용 되어짐)를 이용하여 세포주의 대량배양을 수행하였다. 최대 용량은 20L 이며, 부드러운 교반을 위한 baffle의 형태, 낮은 rpm에서도 혼합을 좋게 하기 위한 둥근 형태의 바닥면, 온도 조절을 쉽게 하기 위한 water-jacket 등을 고려하였다. 대량배양 시 세포손상의 주원인이 eddy의 형성과 공기방울의 터짐인데, 공기방울에 의한 세포손상을 줄이기 위하여 세포 보호제나 shear 보호제 (Pluronic F26)를 배지에 첨가하여 배양하였다. 또한 대량세포배양 시 세포손상을 주지 않고 산소를 공급해 주기 위하여 gas sparging을 해주었다.
배지공급방식은 유가식(fed-batch), 연속식(continuous), 배지교환식(perfusion) 등의 공정이 개발 되었으나, perfusion 방법이 세포를 고농도로 유지하여 생산성을 높이고 단백질을 용이하게 회수할 수 있었으며(도 15), VEGF 트랩 단백질의 정제는 Protein A sepharose affinity chromatography 방법을 변형하여 수행하였다.
3-2: 스피너 플라스크를 이용한 집단배양(pool culture) 시스템
재조합 단백질의 생산능이 낮으면 Stirred Tank Reactor보다 오염도 적게 되고 비용이 저렴한 스피너 플라스크 배양 시스템을 이용하여 세포들을 집단적으로 배양을 수행하고, 재조합 단백질을 batch 별로 모았다(도 16).
세포주 배양 8일 동안 재조합 단백질의 양이 많이 발현되는 배양시간을 조사하기 위하여 샌드위치 ELISA로 확인한 결과, 배양 5일째 가장 많은 양의 단백질을 발현하는 것으로 확인되어(도 17) 스피너 플라스크를 이용하여 5일째까지 배양 한 후 단백질 정제를 실시하였다.
또한, 스피너 플라스크 배양 시스템에서 한 회분당 발현된 VEGF 트랩 재조합 단백질을 ELISA로 비교하고(도 18), 점 돌연변이가 일어난 Cys#1-VEGF 트랩과 기존의 VEGF 트랩의 분자량을 SDS-PAGE를 이용하여 비교하였다(도 19). 이에, Cys#1-VEGF 트랩과 기존의 VEGF 트랩은 비슷한 분자량을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
3-3: 한계희석배양 시스템
집단배양(pool culture) 시스템과 더불어 재조합 단백질의 생산능을 높이기 위하여, 세포들을 단일클론으로 배양하여 단백질을 발현시키는 한계희석배양 시스템(도 20)을 이용한 단백질 생산 공정을 개발하였다.
Cys#1-VEGF 트랩의 생산능을 높이기 위하여 한계희석 과정을 이용하여 Cys#1-VEGF 트랩 세포주들을 배양한 후(도 21), 단일클론을 선택하여 Cys#1-VEGF 트랩을 배양하였다. 재조합 단백질 생산능은 ELISA를 이용하여 확인하였다(도 22).
그 결과, Cys#1-VEGF 트랩 세포주의 단백질 발현양이 높은 단일클론 A3, B1, C2를 선택하여, 무혈청 배지에서 배양하였다(도 23).
Cys#1-VEGF 트랩 단일클론 A3와 B1을 4일 동안 배양한 후, 발현되는 재조합 단백질 VEGF 트랩 발현양을 비교한 결과, 단일클론 B1이 A3보다 많이 발현되므로 단일클론 B1-VEGF 트랩을 선택하였다(도24, 25).
마지막으로, 아바스틴, 단일클론 B1-VEGF 트랩 및 pool 시스템 VEGF 트랩의 hVEGF-A 165 결합력을 비교하여 분석한 결과, 단일클론 B1-VEGF 트랩에 비해 아바스틴의 결합력이 더 우수한 것으로 확인되었다(도 26).
실시예 4: VEGF 트랩 바이오베터 단백질의 페길화
기존의 VEGF 트랩의 반감기를 증가시키기 위해, 상기 실시예에서 제작한 점 돌연변이시킨 VEGF 트랩을 위치 특이적으로 페길화시켰다. VEGF 트랩 변이체는 카테콜 그룹이 잘 반응하는 티올(thiol)기를 가진 시스테인을 C-말단에 도입하여, PEG-CT(카테콜)을 C-말단에 결합시켜 페길화하였다. PEG(폴리에틸렌글리콜)에 CT(카테콜)이 결합된 PEG-CT는 대한민국 등록특허 10-1042965에 따른 것을 사용하여 페길화를 수행하였다.
VEGF 트랩에 30kDa의 PEG-CT(카테콜)를 접합시켜 페길화된 VEGF 트랩을 GPC 220nm, 280nm에서 흡광도를 측정한 결과, 페길화된 SEG-VEGF 트랩이 합성된 것을 확인하였다(도 27).
또한, MALDI-TOF 결과 SEG-VEGF 트랩은 120kDa VEGF 트랩과 30kDa PEG-CT가 결합하여 합성되어 150kDa의 분자량을 가지는 것을 알 수 있었다(도 28).
실시예 5: 페길화된 VEGF 트랩의 성능 평가
5-1: 반감기 테스트
C57BL/6 마우스의 꼬리 정맥에 아바스틴, 기존의 VEGF 트랩 및 SEG-VEGF 트랩 6 ㎍을 주사하여 반감기를 테스트하였다.
그 결과, SEG-VEGF 트랩의 경우, Avastin 혹은 VEGF 트랩보다 반감기가 길어지는 것을 알 수 있었으며(도 29), 반감기로부터 투여량(Dosage)의 개선이 가능하다. Avastin의 경우 20 시간의 반감기를 가지며, SEG-VEGF 트랩의 경우 40 시간의 반감기를 나타내므로, Avastin의 투여량(Dosage)은 1회/14일이며, SEG-VEGF 트랩은 Avastin과 비교하였을 때 1회/28일의 투여량(Dosage)을 가질 것으로 예상할 수 있다.
5-2: 약효 테스트
Lewis lung carcinoma(LLC) 세포를 1.0 x 106 cell/마우스의 농도로 C57BL/6 마우스의 오른쪽 옆구리에 피하주사 (SC: Subcutaneous injection)하여 이식하였다. 종양세포 이식 7일 후부터 약물(아바스틴, VEGF 트랩 및 SEG-VEGF 트랩) 25 mg/kg을 이틀 간격으로 마우스의 목 뒷부분에 피하 주사하였다. 2주가 지난 후, 실험동물을 희생하고 종양의 크기를 측정(종양부피 = (4/3)π(length/2)(width/2)((length+width)/4)한 결과, VEGF 트랩을 처리한 군의 종양 크기가 많이 줄어드는 것을 확인함으로써, 약효시험(종양성장 억제) 동물모델로 확정하였다.
셋업한 동물 모델에 아바스틴(양성 대조군), 기존의 VEGF 트랩, SEG-VEGF 트랩 및 Fc 단백질(음성 대조군)을 주입하여 약효시험을 진행하였으며, 시험조건은 표 6에 나타냈다.
실험군 및 조건
C57BL/6J Miouse (n=5) 1회 투여량 Time
Fc Protein (Negative control) 0.625 mg/ 25 g 암 생성 7일후부터 3일 간격, 5회
Conventional VEGF-Trap 0.625 mg/ 25 g 암 생성 7일후부터 3일 간격, 5회
SEG VEGF-Trap 0.625 mg/ 25 g 암 생성 7일후부터 3일 간격, 5회
Avastin (Positive control) 0.625 mg/ 25 g 암 생성 7일후부터 3일 간격, 5회
약효시험 결과, 약물(아바스틴, VEGF 트랩 및 SEG-VEGF 트랩) 주입을 한 실험동물의 경우, Fc 단백질 (음성 대조군) 그룹에 비해 종양의 생성이 억제되는 것으로 확인되었다(도 30). 또한, 기존의 VEGF 트랩 보다 SEG VEGF 트랩은 종양의 생성을 억제하는데 효과적이며, SEG VEGF 트랩은 양성 대조군으로 사용한 Avastin과 동등 이상의 성능을 나타내는 것으로 확인되었다.
5-3: Hematoctit 테스트
C57BL/6 마우스를 이용하여 1mg/kg의 약물(아바스틴, VEGF 트랩 및 SEG-VEGF 트랩)을 정맥 주사 한 후, 4일에 한번 적혈구 용적량(Hematocrit)의 변화를 측정하였다.
측정결과 SEG-VEGF 트랩과 Avastin의 경우, 20일까지도 체내에서 활성을 유지하는 것을 확인하였다(도 31).
이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다. 본 발명의 단순한 변형 내지 변경은 이 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의하여 용이하게 이용될 수 있으며, 이러한 변형이나 변경은 모두 본 발명의 영역에 포함되는 것으로 볼 수 있다.
<110> InnoTherapy Inc. <120> PEGylated VEGF-Trap and Method for Preparation Thereof <130> P14-B353 <160> 9 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYS-F <400> 1 caaaagctgg agctccacc 19 <210> 2 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYS#1-R <400> 2 tctccctgtc tccgggttgt ctcgagcatg ca 32 <210> 3 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYS#2-R <400> 3 gcctctccct gtctccgtgt aaactcgagc atgca 35 <210> 4 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYS#3-R <400> 4 gaagagcctc tccctgtctt gcggtaaact cgagcatgca 40 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P5-F <400> 5 atcagcgagc tctagcattt ag 22 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P6-R <400> 6 atccgctagc gattacgc 18 <210> 7 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P7 <400> 7 ccgggttgt 9 <210> 8 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P8 <400> 8 ccgtgtaaa 9 <210> 9 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P9 <400> 9 tgcggtaaa 9

Claims (16)

  1. C-말단에 티올(thiol, -SH)기가 도입된 VEGF 트랩 단백질.
  2. 제1항에 있어서, C-말단이 티올기를 포함하는 아미노산 시스테인(Cystein)으로 치환된 것을 특징으로 하는 VEGF 트랩 단백질.
  3. 제2항에 있어서, 상기 시스테인의 위치는 C-말단 아미노산 마지막 1번째 내지 5번째로 구성된 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 VEGF 트랩 단백질.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 단백질의 티올기에 카테콜이 결합된 폴리에틸렌글리콜(PEG-CT)을 접합시켜 페길화된 VEGF 트랩 단백질.
  5. 제4항에 있어서, 상기 PEG-CT는 VEGF 항체 단백질의 C-말단 시스테인에 단일 접합되는 것을 특징으로 하는 페길화된 VEGF 트랩 단백질.
  6. 제4항의 페길화된 VEGF 트랩 단백질을 유효성분으로 포함하는 혈관신생 억제용 조성물.
  7. 제4항의 페길화된 VEGF 트랩 단백질을 유효성분으로 포함하는 항암 조성물.
  8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 VEGF 트랩 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  9. 제8항에 있어서, C-말단이 서열번호 7 내지 9로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 서열로 치환된 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  10. 제8항 내지 제9항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터.
  11. 제10항의 발현벡터를 포함하는 형질전환 세포.
  12. 제11항에 있어서, 상기 세포는 동물세포, 식물세포, 효모, 대장균 및 곤충세포로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 형질전환 세포.
  13. 제12항에 있어서, 상기 동물세포는 차이니즈 햄스터 난소(CHO: chinese hamster ovary) 세포, W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 형질전환 세포.
  14. 제11항 내지 제13항의 세포를 배양하는 것을 특징으로하는 VEGF 트랩 단백질의 제조방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 배양은 교반 탱크 반응기(stirred tank reactor), 스피너 플라스크(spinner flask), 한계희석배양 시스템 및 디스포저블 바이오리액터(disposable bioreactor)로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상을 이용하여 배양하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  16. 제1항 내지 제3항의 VEGF 트랩 단백질 및 제14항의 방법에 의해 제조된 VEGF 트랩 단백질로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상과 카테콜이 결합된 폴리에틸렌글리콜(PEG-CT)을 접합시키는 것을 특징으로 하는 VEGF 트랩 단백질의 페길화 방법.









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CN111110857A (zh) * 2020-03-05 2020-05-08 福建齐衡科技有限公司 一种长效缓释的聚乙二醇修饰抗肿瘤药物及其制备方法

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1946417A (zh) * 2003-12-05 2007-04-11 阿德内克休斯治疗公司 2型血管内皮生长因子受体的抑制剂
TWI468417B (zh) * 2007-11-30 2015-01-11 Genentech Inc 抗－ｖｅｇｆ抗體
KR101042965B1 (ko) * 2009-10-29 2011-06-20 한국과학기술원 카테콜 폴리에틸렌글리콜 유도체와 단백질 또는 펩타이드의 접합체 및 이의 제조방법
AR081361A1 (es) * 2010-04-30 2012-08-29 Molecular Partners Ag Proteinas de union modificadas que inhiben la interaccion de receptor del factor de crecimiento endotelial vascular de glicoproteina a vegf-a
KR101397088B1 (ko) * 2011-06-10 2014-05-19 강원대학교산학협력단 암세포 증식 억제와 혈관신생 억제를 위한 융합 단백질 및 이를 포함한 항암 조성물

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111110857A (zh) * 2020-03-05 2020-05-08 福建齐衡科技有限公司 一种长效缓释的聚乙二醇修饰抗肿瘤药物及其制备方法

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