CN108430492B - 单链cd27受体激动剂蛋白 - Google Patents

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Abstract

本文提供特异性CD27受体激动剂蛋白，编码该蛋白的核酸，以及治疗患有CD27L相关疾病或疾患的受试者的方法。本文提供的CD27受体激动剂蛋白包括三个可溶性CD27L结构域和Fc片段。CD27受体激动剂蛋白基本上是非聚集的并且适用于治疗、诊断和\或研究应用。

Description

单链CD27受体激动剂蛋白
技术领域
本发明提供了包含三个可溶性CD27L结构域和Fc片段的特异性CD27受体激动剂蛋白，编码CD27受体激动剂蛋白的核酸分子，以及它们的用途。CD27受体激动剂蛋白基本上是非聚集的并且适用于治疗、诊断和/或研究应用。
背景技术
已知TNF超家族(TNFSF)细胞因子的三聚化对于有效的受体结合和活化是必需的。然而，TNF超家族细胞因子的三聚体复合物难以从重组单体单元制备。
WO 01/49866和WO 02/09055公布了包括TNF细胞因子和多聚化组分的重组融合蛋白，特别是来自C1q蛋白家族的蛋白质或胶原凝集素。然而，融合蛋白的缺点是三聚化结构域通常具有很大的分子量和/或三聚化效率相当低。
Schneider等(J Exp Med 187(1989),1205-1213)描述了TNF细胞因子的三聚体通过N末端定位的稳定化基序来稳定。在CD95L中，受体结合结构域三聚体的稳定化可能是由位于细胞质膜附近的N末端氨基酸结构域引起的。
Shiraishi等人(Biochem Biophys Res Commun 322(2004),197-202)描述了CD95L的受体结合结构域可以通过N末端定位的人造α螺旋卷曲螺旋(亮氨酸拉链)基序来稳定。然而已经发现，多肽链彼此之间的取向，如平行取向或反平行取向，是很难预料的。此外，在卷曲螺旋拉链基序中的七价重复序列的最佳数目是很难确定的。另外，卷曲螺旋结构具有在改变pH和/或离子强度之后形成大分子聚集体的倾向。
WO 01/25277涉及结合到细胞受体的细胞外配体结合结构域的单链寡聚多肽，其中该多肽包括至少三个受体结合位点，其中至少一个受体结合位点能够结合到细胞受体的配体结合结构域，并且至少一个受体结合位点不能够有效地结合到细胞受体的配体结合结构域，由此单链寡聚多肽能够结合到受体，但不能够激活受体。例如，单体来源于TNF家族的细胞因子配体，特别是来源于TNF-α。
WO 2005/103077公布了单链融合多肽，其包括TNF家族配体成员中的至少三个单体和将TNF配体家族成员的单体彼此连接的至少两个肽接头。然而，最近的实验显示这些单链融合多肽显示出不希望的聚集。
WO 2010/010051公布了包括三个可溶性TNF家族细胞因子结构域和至少两个肽接头的单链融合多肽。所描述的融合多肽基本上是非聚集的。
最近的研究已经显示，目前在临床上探索的抗CD27-mAb的体内激动性活性取决于Fc-γ-R交联[He,L.Z.,N.Prostak,L.J.Thomas,L.Vitale,J.Weidlick,A.Crocker,C.D.Pilsmaker,S.M.Round,A.Tutt,M.J.Glennie,H.Marsh and T.Keler(2013).“Agonistanti-human CD27 monoclonal antibody induces T cell activation and tumorimmunity in human CD27-transgenic mice.”J Immunol 191(8)：4174-4183]
该领域需要展现出独立于基于Fc-γ-R的体内交联的高生物学活性、高稳定性和允许有效重组制备的新型的CD27受体激动剂。
发明内容
本发明提供了特异性CD27受体激动剂蛋白，其模拟了CD27：CD27L在体内的相互作用，与激动性单克隆抗体相比，其展现了低的蛋白水解降解和更短的体内半衰期。
本发明的CD27受体激动剂蛋白通常包含：(i)第一可溶性CD27L细胞因子结构域；(ii)第一肽接头；(iii)第二可溶性CD27L结构域；(iv)第二肽接头；(v)第三可溶性CD27L结构域；(vi)第三肽接头(例如，铰链接头)和(vii)抗体Fc片段。
在一种实施方式中，抗体Fc片段(vii)位于第一CD27L结构域(i)的N末端，和/或第三CD27L结构域(v)的C末端。在另一实施方式中，抗体Fc片段在C末端上位于第三CD27L结构域(v)。在一种实施方式中，该多肽基本上是非聚集的。在另一实施方式中，第二和/或第三可溶性CD27L结构域是任选地包含氨基酸序列突变的N末端缩短的结构域。
在一种实施方式中，该可溶性CD27L结构域中的至少一个，特别是可溶性CD27L结构域(iii)和(v)中的至少一个是具有N末端序列的可溶性CD27L结构域，其起始于人CD27L的氨基酸Glu51或Asp56，并且其中Glu51可以被中性的氨基酸如Ser或GIy替换。在另一实施方式中，该可溶性CD27L结构域中的至少一个，特别是可溶性CD27L结构域(iii)和(v)中的至少一个是具有选自以下的N末端序列的可溶性CD27L结构域：(a)Glu51–Asp56和(b)(Gly/Ser)51–Glu56。在一种实施方式中，可溶性CD27L结构域以人CD27L的氨基酸Pro193结束，和/或任选地包括在位置W55、N63、R83、R122、R138、R144、H123、H124、H148、N170、R179、D182、E183处的一种或多种突变。在一种实施方式中，可溶性CD27L结构域(i)、(iii)和(v)包括根据SEQ ID NO：01的人CD27L的氨基酸Glu51-Pro193
在一种实施方式中，该可溶性CD27L结构域中的至少一个，特别是至少可溶性CD27L结构域(i)是具有N末端序列的可溶性CD27L结构域，其起始于氨基酸Glu51，并且其中Glu51可以被GIn替换。
在一种实施方式中，第一和第二肽接头(ii)和(iv)独立地具有3-8个氨基酸的长度，特别是3、4、5、6、7或8个氨基酸的长度，并且优选地是甘氨酸/丝氨酸接头，任选地包括可以被糖基化的天冬酰胺残基。在一种实施方式中，第一和第二肽接头(ii)和(iv)由根据SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成。在另一实施方式中，该多肽另外包括例如SEQ ID NO：17的N末端信号肽结构域，其可以包含蛋白酶切割位点，和/或该多肽另外包括C末端元件，该C末端元件可以包括和/或连接至识别/纯化结构域，例如连接至根据SEQ ID NO：18的丝氨酸接头的Strep标签。
在一种实施方式中，抗体Fc片段(vii)通过铰链接头，优选地通过SEQ ID NO：16的铰链接头，融合至可溶性CD27L结构域(i)和/或可溶性CD27L结构域(v)。在另一实施方式中，抗体Fc片段(vii)由如在SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14中所示的氨基酸序列组成。
在一种实施方式中，本发明的单链融合多肽包括选自由SEQ ID NO：15、SEQ IDNO：25-35和SEQ ID NO：43-47组成的组的氨基酸序列。
在一种实施方式中，本发明提供了包含两种单链融合多肽的二聚体的CD27受体激动剂蛋白，每种单链融合多肽具有SEQ ID NO：27中所示的氨基酸序列。在一种实施方式中，两种多肽通过在每种多肽的半胱氨酸残基457、463和466之间形成的三个链间二硫键来共价连接。
在一种实施方式中，一种或多种成熟多肽SEQ ID No：27、28、29、30、34或35的位置149和300处的天冬酰胺残基中的一个或多个是N-糖基化的。在另一实施方式中，在一种或多种多肽的位置149和300处的天冬酰胺残基都是N-糖基化的。
在另一实施方式中，仅成熟多肽SEQ ID NO：31、32、43或47的位置149处的天冬酰胺残基是糖基化的，因为在这些蛋白质中不存在天冬酰胺300。
在另一实施方式中，仅成熟多肽SEQ ID NO：33的位置145处的天冬酰胺残基是糖基化的。
在另一实施方式中，在SEQ ID No：44或46的成熟多肽的位置144和290处的天冬酰胺残基中的一个或多个是N-糖基化的。
在另一实施方式中，仅SEQ ID NO：45的一种或多种成熟多肽的位置144处的天冬酰胺残基是N-糖基化的。
在另一实施方式中，该一种或多种多肽进一步经翻译后修饰。在另一实施方式中，翻译后修饰包括将E51Q突变蛋白的N末端谷氨酰胺修饰为焦谷氨酸。
附图说明
图1包括三个CD27L结构域的单链融合多肽的结构域结构。I、II、III可溶性CD27L结构域。
图2表示CD27L的一般结构的示意图。
■■■细胞膜，位于细胞内的N末端，
1.受体结合结构域(RBD)的反平行β折叠，
2.RBD和细胞膜的界面，
3.蛋白酶切割位点。
图3包括另外Fab抗体片段的单链融合多肽。
图4通过三个二硫桥将两个C末端融合的scFc融合多肽二聚化。
图5使用Tosoh TSK凝胶G3000SWxl柱在1260无限HPLC系统上进行的蛋白A(SEQ IDNO：15)和蛋白X(SEQ ID NO：38)的分析性尺寸排阻层析。该柱载有浓度为0.6mg/ml总体积为20μl的蛋白质。流速设置为0.5ml/min。蛋白A(B部分)在16.39min处观察到单个主峰，蛋白X(A部分)在18.91min处观察到单个主峰。
图6表示本发明的六价单链CD27受体激动剂融合蛋白的示意图。存在于内表面区域上的CH2-碳水化合物(5)在“开放的Fc-构象转变”期间通常在空间位阻上保护CH2亚结构域(2)免受蛋白酶的影响，其中铰链链间二硫键(4)被还原并且共价的链间连接被破坏。这使得CH2-解离并且使内表面区域和上铰链赖氨酸K223(6)暴露于蛋白酶。由于CH3结构域(3)彼此之间的高的亲和力，“开放阶段”中的二聚体缔合(association)保持完整。
(1)scCD27L-RBD；(2)CH2结构域；(3)CH3结构域；(4)铰链半胱氨酸(左侧：氧化成二硫桥；右侧有游离的巯基的还原阶段)；(5)连接至位置N297(EU编号)的CH2碳水化合物；(6)上铰链赖氨酸(K223)
图7蛋白A在非还原态和还原态下的SDS-PAGE结果。在含有作为还原剂的DTT的非还原态(A)或还原态(B)下，将465ng的蛋白A加载到SDS-PAGE 4-12％的Bis-Tris凝胶上。将凝胶在170V下运行60分子，并且随后使用银染色方案染色。人们观察到在A和B中的主带之间的分子量的差异约为80-100kDa。由于这大约是在A中的主带所观察到的分子量的一半，这表明A中的同二聚体被二硫桥共价地连接。在B中的还原态下，该键丢失
图8在还原态(泳道2-8)或非还原态(泳道10-16)下，来自蛋白X的亲和层析的洗脱级分随同柱加载样品和流过样品被加载到SDS-PAGE 4-12％的Bis-Tris凝胶上。DTT被用作还原剂。凝胶在170V下运行60min，并且随后使用银染色方案染色。蛋白X的单键可以在泳道4-6和泳道12-14中看到，这表明所有蛋白质都在级分1至3中从柱中洗脱出来。
所示为：泳道1和泳道9：标志物/泳道17：空白/泳道2-8和泳道10-16：
蛋白X具有：(2)还原的柱加载；(3)还原的柱流过；(4)还原的洗脱级分1；(5)还原的洗脱级分2；(6)还原的洗脱级分3；(7)还原的洗脱级分4；(8)还原的洗脱级分5；(10)非还原的柱加载；(11)非还原的柱流过；(12)非还原的洗脱级分1；(13)非还原的洗脱级分2；(14)非还原的洗脱级分3；(15)非还原的洗脱级分4；(16)非还原的洗脱级分5
图9蛋白A对雌性C57Bl/6N小鼠的皮下同系结肠癌模型MC38-CEA雌性的影响。所示为尸检时的湿肿瘤重量。显示以或1mg/kg(组2)或10mg/kg(组3)施用的蛋白A下相对于其对应的媒介物对照PBS(组1)。示出的数据为平均值±SEM。使用Mann Whitney检验与媒介物对照(组1)相比计算的P值。
图10蛋白A对雌性C57Bl/6N小鼠的皮下同系结肠癌模型MC38-CEA雌性的影响。图描绘了尸检时抗肿瘤的功效(肿瘤体积)。显示以或1mg/kg(组2)或10mg/kg(组3)施用的蛋白A相对于其对应的媒介物对照PBS(组1)。示出的数据为平均值±SEM。使用MannWhitney检验与媒介物对照(组1)相比计算的P值。
图11蛋白A对雌性BALB/c小鼠的皮下同系结肠癌模型CT26雌性的影响。图描绘了尸检时(研究结束时)的湿肿瘤重量。显示以或1mg/kg(组2)或10mg/kg(组3)施用的蛋白A相对于其对应的媒介物对照PBS(组1)。示出的数据为平均值±SEM。使用Mann Whitney检验与媒介物对照(组1)相比计算的P值
图12蛋白A对雌性BALB/c小鼠的皮下同系结肠癌模型CT26雌性的影响。图描绘了在第21天(第10天)的研究结束时的肿瘤体积。显示以或1mg/kg(组2)或10mg/kg(组3)施用的蛋白A相对于其对应的媒介物对照PBS(组1)。示出的数据为平均值±SEM。使用MannWhitney检测与媒介物对照(组1)相比计算的P值
具体实施方式
本发明提供了一种单链融合多肽，包括通过两个肽接头连接的至少三个可溶性CD27L结构域和在N末端和/或C末端上的来源于抗体的二聚化结构域。本发明人已经发现，通过二聚化结构域的两个单链融合多肽的二聚化产生了六价的CD27受体激动剂，其提供了高生物学活性和良好的稳定性。
优选地，单链融合多肽是非聚集的。术语“非聚集的”是指制剂中的单体含量≥50％，优选地≥70％并且更优选地≥90％。单体含量与聚集体含量的比率可以通过使用尺寸排阻层析(SEC)检查聚集体形成的量来确定。关于聚集体的稳定性可以在不同的储存条件下，例如在4℃或25℃下，限定的时间段之后通过SEC来确定，该限定的时间段如从数天到若干天直至数周和数月。对于融合蛋白，为了分类为基本上的非聚集的，优选的是，在4℃或25℃下储存若干天(例如，10天)的时间段之后，更优选地若干周(例如2周、3周或4周)的时间段之后，并且最优选地若干月(例如2个月或3个月)的时间段之后，“单体”含量如上述所限定的。关于FC-融合蛋白情况下的“单体”的限定，两条多肽链的组装是由FC部分驱动，并且所得到的组装蛋白的功能单元由两条链组成。该单元在Fc融合蛋白的情况下被限定为“单体”，这与二聚化单链融合多肽无关。
单链融合多肽可以包括位于其N末端和/或C末端的另外结构域。另外的融合结构域的实例是，例如可以包括蛋白酶切割位点的N末端信号肽结构域，或可以包含和/或连接至识别/纯化结构域的C末端元件。根据优选的实施方式，融合多肽在其C末端处包括经由接头融合的Strep标签。包括短的丝氨酸接头的示例性Strep标签在SEQ ID NO：18中示出。
本发明的CD27受体激动剂蛋白包含来源于CD27L的三个可溶性结构域。优选地，那些可溶性结构域来源于哺乳动物，特别是包括等位基因变体的人CD27L和/或其衍生物。该可溶性结构域包含包括受体结合结构域而无膜定位结构域的CD27L的细胞外部分。像TNF超家族的其他蛋白质一样，CD27L经由15-30个氨基酸的N末端部分，即所谓的茎区来锚定到膜。该茎区有助于三聚化，并且提供了到细胞膜的一定距离。然而，茎区不是受体结合结构域(RBD)的一部分。
重要的是，RBD的特征在于其N末端氨基酸和C末端氨基酸的特定位置。所述氨基酸是紧邻的，并且位于三聚体的轴的中心。RBD的第一N末端氨基酸形成具有RBD的C末端氨基酸的反平行的β-链(图2)。
因此，RBD的反平行β-链与细胞膜形成界面，经由茎区的氨基酸，该界面连接到细胞膜并且锚定在细胞膜内。特别优选的是，CD27受体激动剂蛋白的可溶性CD27L结构域包括缺少来自茎区的任何氨基酸的CD27L的受体结合结构域。否则，需要将可溶性结构域之一的C末端与下一个可溶性结构域的N末端相连接的长接头来补偿该下一个可溶性结构域的N末端茎区，这可能导致不稳定性和/或形成聚集体。
这种可溶性结构域的另一优点是，RBD的N末端氨基酸不可用于任何抗药物抗体。优选地，该单链融合多肽由以下组成：(i)第一可溶性CD27L细胞因子结构域；(ii)第一肽接头；(iii)第二可溶性CD27L结构域；(iv)第二肽接头；(v)第三可溶性CD27L结构域，该单链融合多肽能够形成模拟其天然配对物(counterpart)的三聚体组织的有序结构，从而包括至少一个相应CD27L受体的功能结合位点。因此，包括组分(i)-(v)的单链融合多肽也被称为单链CD27L受体结合结构域(scCD27L-RBD)。
CD27受体激动剂蛋白包含三个功能性CD27受体结合位点，即能够与CD27受体形成复合物的氨基酸序列。因此，可溶性结构域能够结合到对应的CD27受体。在一种实施方式中，可溶性结构域中的至少一个能够受体激活，由此可以影响凋亡和/或增殖活性。在另一实施方式中，可溶性结构域中的一个或多个被选作为不能够受体激活。
可溶性CD27L结构域可以来源于人CD27L，如在SEQ ID NO：1中所示的。优选地，该可溶性CD27L结构域来源于人CD27L，特别是从氨基酸51或氨基酸56起始的，并且特别地包括SEQ ID NO：1的氨基酸51-193或氨基酸56-193。任选地，SEQ ID NO：1的氨基酸Glu51可以被不带荷电的氨基酸，例如Ser或Gly替换，或被谷氨酰胺替换。
表1：野生型人CD27L蛋白的序列
Figure GDA0003553020570000101
如上所示出的，可溶性CD27L结构域可以包括如在SEQ ID NO：1中所示出的野生型序列。然而应注意的是，可能在这些可溶性结构域中的一个或多个中引入突变，例如改变(例如增加或减少)可溶性结构域的结合性质的突变。在一种实施方式中，可以选择不能结合到对应的细胞因子受体的可溶性结构域。
在本发明的另一实施方式中，该可溶性CD27L结构域(i)包含CD27L或其受体结合结构域的突变体，该突变体导致CD27L受体亲和力降低和/或CD27L受体的活化降低。
影响受体结合和/或活性的CD27L突变蛋白
该突变体可以由技术人员已知的任何技术生成。取代可以影响CD27L的至少一个氨基酸，例如如本文所述的人CD27L(例如，SEQ ID No：1)或其受体结合结构域。在这方面优选的取代影响SEQ ID NO：1的人CD27L的以下氨基酸中的至少一种：R83、R122、R138、R144、H123、H124、H148、R179、D182、E183。在优选的实施方式中，R138和/或R179被突变为S或D。
一种或多种氨基酸取代可以对于或在CD27结合或CD27诱导的信号转导方面影响CD27L(例如，人CD27L)的结合和/或活性。CD27的结合和/或活性可以被积极地影响，即更强、更有选择性或更特异性的受体结合和/或更多的受体活化。可替代地，CD27的结合和/或活性可以被消极地影响，即更弱、更少选择性或更少特异性的受体结合和/或受体更少或没有活化。
因此，一种实施方式是如本文所描述的CD27受体激动剂蛋白，其中该可溶性结构域中的至少一个包括CD27L的突变体或其受体结合结构域，其与野生型CD27L相比更小的程度结合和/或激活CD27。
示出了CD27L诱导的受体聚集的降低和/或信号转导的降低的CD27L的突变体的其他实例是R144N和D182S。
具有增强的稳定性/溶解度的CD27L突变蛋白
一种实施方式是如本文所描述的CD27受体激动剂蛋白，其中将至少一个人造N-糖基化共有位点引入到由人CD27L(SEQ ID NO：1)的T172-F185所限定的序列区域中，导致受体聚集的降低和/或信号转导的降低。在该区中导致人造N-糖基化共有位点的CD27L的突变体的实例是D182S。
在本发明的另一实施方式中，该可溶性CD27L结构域(i)、(iii)和(v)中的一个或多个可以包括CD27L突变体或其受体结合结构域，其导致自身聚集的降低和/或体内稳定性的延长。
在这方面优选的取代是S117N、T119N、S137N和R144N。每个CD27L结构域的一种或多种突变可以是相同的或不同的。
本发明的单链融合分子包含三个可溶性CD27L结构域，即组分(i)、(iii)和(v)。如果第二和/或第三可溶性CD27L结构域是任选地包括氨基酸序列突变的N末端缩短的结构域，则单链CD27L融合多肽针对聚集的稳定性增强。因此，优选地，第二和第三可溶性CD27L结构域两者都是N末端缩短的结构域，其任选地包括在N末端区中，优选地在可溶性CD27L结构域的N末端的前五个氨基酸内的氨基酸序列突变。这些突变可以包括用中性氨基酸，特别是丝氨酸或甘氨酸替换碱性氨基酸。
与此相反，第一可溶性CD27L结构域的选择并不重要。在此，可以使用具有全长N末端序列的可溶性结构域。然而应注意的是，第一可溶性CD27L结构域也可以具有N末端缩短的且任选地突变的序列。
在本发明的另一优选的实施方式中，可溶性CD27L结构域(i)、(iii)和(v)是可溶性人CD27L结构域。第一可溶性CD27L结构域(i)可以选自天然的、缩短的和/或突变的序列。因此，第一可溶性CD27L结构域(i)具有可以在人CD27L的氨基酸Glu51或Asp56处起始的N末端序列，并且其中Glu51可以被中性的氨基酸，如被Ser或GIy或被Gln替换，以使在表达期间能够形成焦谷氨酸。第二和第三可溶性CD27L结构域(iii)和(v)具有优选地以人CD27L(SEQID No：1)的氨基酸Ser52或Gly54起始的缩短的N末端序列，并且其中Glu51可以被另一氨基酸，如Ser或Gly替换。
优选地，可溶性CD27L结构域(iii)和(v)的N末端序列选自：
(a)Glu51-Asp56
(b)(Gly/Ser)51–Asp56。
可溶性CD27L结构域优选地以人CD27L的氨基酸P193结束。在某些实施方式中，CD27L结构域可以包括如上文所述的内部突变。
CD27受体激动剂蛋白的组分(ii)和(iv)是分别位于组分(i)和组分(iii)之间的或位于组分(iii)和组分(v)之间的肽接头元件。柔性接头元件具有3-8个氨基酸长度，特别的是3、4、5、6、7或8个氨基酸长度。接头元件优选的是甘氨酸/丝氨酸接头，即基本上由氨基酸甘氨酸和丝氨酸组成的肽接头。在其中可溶性细胞因子结构域以S或G(N末端)起始的情况下，该接头在该S或G之前结束。
应注意的是，接头(ii)和接头(iv)不需要是相同长度的。为了减少潜在的免疫原性，其可以优选使用较短的接头。另外，结果表明，较短的接头导致单链分子具有降低形成聚集体的趋势。然而，比本文公开的接头长得多的接头可以表现出不利的聚集特性。
如果需要的话，该接头可以包括可以形成糖基化位点Asn-Xaa-Ser的天冬酰胺残基。在某些实施方式中，接头之一，例如接头(ii)或接头(iv)包括糖基化位点。在其他实施方式中，接头(iv)两者都包含糖基化位点。为了增加CD27L激动剂蛋白的溶解度和/或为了降低潜在的免疫原性，优选的是，接头(ii)或接头(iv)或它们两者包含糖基化位点。
在表2中示出了优选的接头序列。优选的接头是GSGSGNGS(SEQ ID NO：2)。
表2：示例性接头序列
SEQ ID NO 序列
2 GSGSGNGS
3 GSGSGSGS
4 GGSGSGSG
5 GGSGSG
6 GGSG
7 GGSGNGSG
8 GGNGSGSG
9 GGNGSG
10 GSGSGS
11 GSGS
12 GSG
CD27受体激动剂蛋白另外包括可以位于第一CD27L结构域(i)的N末端和/或第三CD27L结构域(v)的C末端的抗体Fc片段结构域。优选地，抗体Fc片段结构域包括降低的在体内与Fc-γ-R受体相互作用的能力。优选地，抗体Fc片段结构域包括如在SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14中所示的氨基酸序列或由其组成(参见表3)。序列ID NO：13与野生型人IGG1-Fc相比具有N297S突变，并且不结合于Fc-γ-R受体。序列ID NO：14是具有降低的Fc-γ-R结合能力的糖基化的(N297野生型)人IGG1 Fc突变蛋白。
表3：Fc片段结构域的实例
Figure GDA0003553020570000141
糖基化位点的数量和体内稳定性
糖基化位点的总数和三维碳水化合物的单个位置影响CD27受体激动剂蛋白的体内稳定性。此外，碳水化合物识别取决于末端糖的局部密度，碳水化合物树(tree)的分支，以及碳水化合物与其他物质彼此的相对位置。
此外，部分降解的碳水化合物通过凝集素驱动机制降低CD27受体激动剂蛋白在体内的半衰期。通过减少在分子上的糖基化位点的总数，所得到的化合物不易适于这些机制，从而增加半衰期。
为了避免在体内的基于Fc受体的交联和潜在的基于CD27L受体超簇的毒性，减少抗体CH2-结构域碳水化合物是必需的。此外，不需要的Fc驱动的机制如ADCC可能导致有毒事件。因此，在一种实施方式中，本发明的CD27受体激动剂蛋白上的糖基化位点的总数通过CH2糖基化位点，特别是N-糖基化位点的减少而减少，导致包括产生无糖基CH2结构域的SEQID NO:15(蛋白A)(根据EU编号系统)的N297S等效突变的CD27受体激动剂蛋白。在本发明的另一实施方式中，可溶性CD27L结构域(i)、(iii)和(v)中的一个或多个可以包括交换成天冬氨酸、丝氨酸或甘氨酸的N63和/或N170，产生具有糖基化位点数量减少的CD27受体激动性融合蛋白。在优选的实施方式中，N63[D，S，G]和N170[D，S，G]突变限于本发明的激动性CD27受体激动性融合蛋白的可溶性CD27L结构域(iii)和(v)。
通过另外的铰链-半胱氨酸来补偿CH2-结构域去稳定化
存在于内表面区域的CH2(重链恒定结构域2)-糖基化通常在“开放的Fc-构象转变”期间保护亚结构域免受蛋白酶影响，其中，铰链链间二硫键被还原并且共价的链间连接被破坏(图6)。这使得CH2-解离，并将内表面区域暴露于蛋白酶。包括具有SEQ ID NO：15(蛋白A)(根据EU编号系统)的N297S等效突变的Fc-结构域的CD27受体激动剂蛋白产生无糖基化的-CH2，并且因此可能经受蛋白酶消化，并且与具有野生型CH2糖基化的等效结构相比是更不稳定的。在宿主细胞蛋白酶存在并且长期作用该结构的情况下，这将影响在USP/DSP/储存期间的化合物的稳定性。因此，在某些实施方式中，CD27受体激动剂缺少CH2糖基化位点，但在每条多肽链的接头序列(例如，GSGSGNGS，SEQ ID NO：2)中包括糖基化位点。
根据本发明的优选的实施方式，经由铰链接头元件将抗体Fc片段结构域融合。铰链接头元件具有10-30个氨基酸长度，特别是15-25个氨基酸例如22个氨基酸长度。术语“铰链接头”包括足够长以允许铰链接头元件连接的结构域获得生物活性确认的任何接头。铰链接头元件优选地包含免疫球蛋白的铰链区序列，此处指的是“Ig铰链区”。术语“Ig铰链区”是指包括与天然存在的Ig铰链区序列的一部分具有序列同一性或相似性的氨基酸序列的任何多肽，该天然存在的Ig铰链区序列包含一个或多个半胱氨酸残基，例如，两个半胱氨酸残基，在该处二硫键将免疫球蛋白的两个重链连接起来。
铰链区的衍生物和类似物可以通过突变来获得。本文所指的衍生物或类似物是包括与野生型(或天然存在的蛋白质)的全长序列具有序列同一性或相似性的氨基酸序列的多肽，除了其具有归因于删除、插入和/或取代的一个或多个氨基酸序列差异。
在单个CD27受体激动剂蛋白中具有开放的Fc-构象的分子的数目取决于铰链区中存在的链间二硫键的数目。因此，在一种实施方式中，将第三半胱氨酸(根据EU编号系统的C225)引入本发明的CD27受体激动剂蛋白的铰链区，以便改善减少CH2糖基化位点的影响。
在铰链区中将赖氨酸交换成甘氨酸导致增强的蛋白水解稳定性
在一种实施方式中，本发明的CD27受体激动剂蛋白另外包括上铰链赖氨酸(根据EU编号系统的K223)至甘氨酸的突变，以降低在该位点的蛋白水解加工，从而增强融合蛋白的整体稳定性。将上述第三半胱氨酸(根据EU编号系统的C225)的引入与上述在铰链区内的赖氨酸至甘氨酸突变(根据EU编号系统的K233G)组合导致本发明的整体稳定化的CD27受体激动剂蛋白。
包括上述的半胱氨酸(C225)和赖氨酸至甘氨酸的突变(K223G)的特别优选的铰链接头元件包括在SEQ ID NO：16中所示的氨基酸序列或由如在SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列组成(表4)。
内源半胱氨酸干扰铰链二硫化物的形成
稳定六价CD27受体激动剂蛋白的同二聚体(同型二聚体)的铰链区的链间二硫化物连接性也受CD27L子序列的游离巯基的影响。游离巯基基团可以通过表面暴露的二硫桥的还原来产生，例如通过CD27L的C115-C151二硫化物的还原。这还导致上述的开放的FC-构象，这是由于通过在高蛋白浓度下制剂的内源游离巯基自还原该结构的铰链二硫桥。因此，当长时间暴露于氧气和蛋白酶时，包括游离巯基的单链CD27L-FC融合蛋白预期在制造和储存期间不太稳定。
因此，为了可能能够在技术规模上制造六价CD27受体激动剂，C115和C151残基优选地同时被突变为不同的氨基酸(例如S、A或G)。
CD27受体激动剂蛋白可以另外包括N末端信号肽结构域，其允许在合适的宿主细胞中进行处理，例如细胞外分泌。优选地，N末端信号肽结构域包括蛋白酶切割位点，例如信号肽酶切割位点，因此可以在表达之后或表达期间被去除，以获得成熟的蛋白质。特别优选的N末端信号肽结构域包括如在SEQ ID NO：17中所示的氨基酸序列(表4)。
此外，CD27受体激动剂蛋白可以另外包括C末端元件，具有例如1-50个优选地10-30个氨基酸长度，其可以包括或连结至识别/纯化结构域，例如FLAG结构域、Strep标签或Strep标签II结构域和/或聚His结构域。根据优选的实施方式，融合多肽包括经由如在SEQID NO：18中所示的短的丝氨酸接头融合至C末端的Strep标签(表4)。
在表4中示出了优选的铰链接头元件(SEQ ID NO：16、19-24)、优选的N末端信号肽结构域(SEQ ID NO：17)和丝氨酸接头-Strep标签(SEQ ID NO：18)。
表4：示例性结构域和接头
SEQ ID NO 序列
16 GSSSSSSSSGSCDKTHTCPPC
17 METDTLLVFVLLVWVPAGNG
18 SSSSSSAWSHPQFEK
19 GSSSSSSSGSCDKTHTCPPC
20 GSSSSSSGSCDKTHTCPPC
21 GSSSSSGSCDKTHTCPPC
22 GSSSGSCDKTHTCPPC
23 GSSSGSCDKTHTCPPCGS
24 GSSSGSCDKTHTCPPCGSGS
利用铰链接头(SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：19-24)将本发明的受体结合模块融合到优选的Fc结构域(SEQ ID NO：13和14)之一，允许形成单链受体结合多肽的共价连接的二聚体。因此，本发明的一种实施方式提供了包括两种单链融合多肽的二聚体的CD27受体激动剂蛋白，每种单链融合多肽具有SEQ ID NO：27中所示的氨基酸序列，其中两种多肽通过在每种多肽的半胱氨酸残基457、463和466之间形成的三个链间二硫键来共价地连接。作为非限制性实例，可以通过在SEQ ID No：28、29、30和35的位置(457、463和456)处的半胱氨酸的共价连接，形成相同种类的其他多肽二聚体。
对于本领域的技术人员显而易见的是，表5A的CD27受体激动剂蛋白的所有非限制性实例都将允许形成二聚体。因此，本发明的其他实施方式是两个单链融合蛋白的共价连接的二聚体。比如，在半胱氨酸位置453、459和462处连接的SEQ ID No：31、43、47的二聚体，或SEQ ID NO：32的多肽的二聚体(在位置450、456和459处连接的)，或SEQ ID NO：33的多肽的二聚体(在位置436、442和445处连接的)，或SEQ ID NO：34的多肽的二聚体(在位置454、460和463处连接的)，或SEQ ID NO：45的多肽的二聚体(在位置438、444和447处连接的)，或SEQ ID NO：44或46的多肽的二聚体(在位置442、448和451处连接的)。
在本发明一种实施方式中，该融合多肽包括通过SEQ ID NO：2的肽接头元件融合的三个可溶性CD27L结构域。第一可溶性CD27L结构域(i)由根据SEQ ID NO：1的人CD27L的氨基酸51-193组成，并且可溶性CD27L结构域(iii)和(v)由根据SEQ ID NO：1的人CD27L的氨基酸51-193组成。
优选的构象CD27L-Fc
另外，融合多肽包括根据SEQ ID NO：13的抗体Fc片段结构域，通过根据SEQ IDNO：16的铰链接头将其在C末端上融合到可溶性CD27L结构域(v)。本发明人惊讶地发现，对比于二价激动性抗CD27-mAB，该特定的融合多肽提供了改善的生物活性，并且对比于包含位置223中的赖氨酸和CH2结构域中的N297S突变(根据欧盟编号)的相似融合蛋白，其具有延长的稳定性。本发明的CD27受体激动剂蛋白的示例性实施方式的氨基酸序列在SEQ IDNO：27中所示。
此外，融合多肽可以包括N末端信号肽结构域，例如根据SEQ ID NO：17的N末端信号肽结构域。本发明的CD27受体激动剂蛋白的具体实例在SEQ ID NO：25中示出。
根据另一优选的实施方式，融合多肽可另外包括经由如在SEQ ID NO：18中所示的短的丝氨酸接头而被融合到本发明的多肽的C末端的Strep标签。根据本发明的这个方面，Fc片段优选地由如在SEQ ID NO：13或14中所示的氨基酸序列组成。此外，Fc片段可以由较短的Fc片段组成，例如包括SEQ ID NO：13的氨基酸1-217的Fc片段。包括C末端Strep标签的融合多肽的特别优选的实例示于SEQ ID NO：15(蛋白A)中。
在SEQ ID NO：15、25和26中示出的示例性CD27受体激动剂蛋白，各自在每个序列的氨基酸1-20处包括N末端信号肽结构域。在每种情况中，成熟蛋白以氨基酸21起始。在SEQID NO：27-35和43-46中所示了本发明的成熟的示例性CD27受体激动剂蛋白(没有信号肽)。在表5A中示出了上述的示例性CD27受体激动剂蛋白。
根据本发明一种实施方式，该单链CD27L融合多肽结构域包含通过SEQ ID NO：2的肽接头元件融合的三个可溶性CD27L结构域。可溶性CD27L结构域(i)、(iii)和(v)各自由根据SEQ ID NO：1的人CD27L的氨基酸51-193组成，任选地，该可溶性结构域(i)包含E51Q突变。在SEQ ID：36(表5B)中示出了在结构域(i)中包括上述CD27L E51Q突变蛋白的单链CD27L多肽，其非常适合于生成融合蛋白，该融合蛋白具有被融合到或N末端或C末端端部的另外结构域，与野生型相比具有增强的稳定性。
根据本发明另一实施方式，该单链CD27L融合多肽结构域包括通过SEQ ID NO：2的肽接头元件融合的三个可溶性CD27L结构域。可溶性CD27L结构域(i)、(iii)和(v)各自由根据SEQ ID NO：1的人CD27L的氨基酸51-193组成，任选地，可溶性结构域(i)、(iii)和(v)包括N63D和/或N170D突变。示例性地，在SEQ ID：39(表5B)中示出在结构域(i)、(ii)和(v)中包含上述CD27L N63D突变的单链CD27L多肽。在优选的实施方式中，SEQ ID：39的接头(iv)交换成SEQ ID NO：11，得到SEQ ID NO：40(表5B)。
根据本发明再一实施方式，该单链CD27L融合多肽结构域包括通过SEQ ID NO：2的肽接头元件融合的三个可溶性CD27L结构域。可溶性CD27L结构域(i)、(iii)和(v)各自由根据SEQ ID NO：1的人CD27L的氨基酸56-193组成，任选地，可溶性结构域(i)、(iii)和(v)包括N63D和/或N170D突变。示例性地，在SEQ ID：41(表5B)中示出了在结构域(i)、(ii)和(v)中包括上述CD27L N63D突变的单链CD27L多肽。在优选的实施方式中，SEQ ID：41的接头(iv)交换成SEQ ID NO：11，得到SEQ ID NO：42(表5B)。
在优选的实施方式中，通过根据SEQ ID NO：16 16的铰链接头，将根据SEQ ID NO：13的抗体Fc片段结构域在C末端上融合至SEQ ID：36的可溶性CD27L结构域(v)。在SEQ IDNO：30(表5A)中示出了包括在结构域(i)中的E51Q突变蛋白，SEQ ID NO：16的铰链接头和根据SEQ ID NO：13的抗体Fc片段的本发明的CD27受体激动剂蛋白的特定实例：
如在SEQ ID NO：27 27中所示的CD27受体激动剂具有总数减少的糖基化位点(在CH2区中的N297S突变提供了无糖基化的CH2结构域，根据EU编号系统)，在铰链区中数目增加的链间二硫键，以及上铰链赖氨酸至甘氨酸的突变(根据EU编号系统的K223G)。这些改变提供了减少潜在的降解和CD27L受体的超簇(伴随有伴随的毒性)。
如在SEQ ID NO：47中所示的CD27受体激动剂包含与SEQ ID NO：27相同的布局，但具有缩短的第二肽接头(iv)，从而降低了原体解离并增强了蛋白质对蛋白酶的稳定性。
如在SEQ ID NO：30中所示的CD27受体激动剂包含与SEQ ID NO：27相同的布局，但在可溶性CD27L结构域(i)中具有E51Q突变，从而能够形成焦谷氨酸，导致保护了N末端免受氨基肽酶影响，并且随后增强了制造和储存期间的蛋白质的整体稳定性。如在SEQ ID NO：31中所示的CD27受体激动剂包括与SEQ ID NO：30相同的布局，但具有缩短的第二肽接头(iv)，从而降低了原体解离并增强了蛋白质对蛋白酶的稳定性。如在SEQ ID NO：32中所示的CD27受体激动剂包括与SEQ ID NO：31相同的布局，但具有缩短的第三肽接头(vi)，以减少可溶性CD27L结构域(v)和Fc-结构域(Vii)之间的结构域间距离，从而增强了蛋白质对蛋白酶的稳定性。如在SEQ ID NO：33中所示的CD27受体激动剂包括：(i)第一可溶性CD27L细胞因子结构域，其包含来自SEQ ID NO：1的氨基酸55-193，并具有W55Q突变；(ii)是SEQ IDNO：2的第一肽接头；(iii)第二可溶性CD27L结构域，其包含来自SEQ ID NO：1的氨基酸55-193；(iv)具有SEQ ID NO：11的第二肽接头；(V)第三可溶性CD27L结构域，其包含来自SEQID NO：1的氨基酸55-193；(vi)具有SEQ ID NO：21的第三肽接头，以及(vii)具有SEQ IDNO：13的抗体Fc片段。如在SEQ ID NO：34中所示的CD27受体激动剂包括与SEQ ID NO：30相同的布局，但具有缩短的第三肽接头(vi)，以减少可溶性CD27L结构域(v)和Fc-结构域(vii)之间的结构域间距离，从而增强了蛋白质对蛋白酶的稳定性。
如在SEQ ID NO：35中所示的CD27受体激动剂包括与SEQ ID NO：27相同的布局，但在可溶性CD27L结构域(i)、(iii)和(v)中具有N63D突变，以便降低在蛋白质表面上的N-连接的碳水化合物的总数量，从而降低由碳水化合物驱动的化合物在体内的消除。如在SEQID NO：43中所示的CD27受体激动剂将在SEQ ID 35中存在的N63D突变策略与较短的接头(iv)结合。由于较短的接头(SEQ ID 11)缺少糖基化共有序列，N-连接的碳水化合物的总数量进一步减少。本发明的其他特定的CD27受体激动剂融合蛋白具有降低数量的基于N63D突变的N-连接的碳水化合物，并且在SEQ ID NO：44和SEQ ID NO：45(表5A)中所示。在SEQ ID46中，可溶性CD27L结构域(i)、(iii)和(v)中的每个包括减少来自CD27受体激动剂融合蛋白的另外的N-连接的碳水化合物的N63D和N170D突变。
表5A：示例性CD27受体激动剂蛋白
Figure GDA0003553020570000221
Figure GDA0003553020570000231
Figure GDA0003553020570000241
Figure GDA0003553020570000251
Figure GDA0003553020570000261
Figure GDA0003553020570000271
Figure GDA0003553020570000281
Figure GDA0003553020570000291
Figure GDA0003553020570000301
表5B：示例性scCD27L-RBD模块
Figure GDA0003553020570000302
Figure GDA0003553020570000311
此外，已注意到，scCD27L-RBD模块(SEQ ID NO：36和SEQ ID NO：39-42)非常适合于生成具有其他结构域的融合蛋白，该其他结构域采用在表2中所述的接头(SEQ ID NO：2-12)融合到或N末端或C末端端部。
本发明的CD27受体激动剂蛋白的上述实施方式解决了本发明的可溶性受体激动剂蛋白的影响构建原则的稳定性或聚集抗性，或调节受体激动剂蛋白的受体结合和活性。
用于描述在医药制剂中作为活性剂的物质的适用性的另一重要性质是其药物代谢动力学谱(pharmacokinetic profile)(PK谱)。药物代谢动力学是研究药物在身体内的分布并且关注药物血浆浓度的变化。对于任何给定的药物和剂量，血浆浓度将根据吸收、分配和消除的过程而变化。血浆药物浓度以及其从身体的最终消除对时间的依赖性下降主要取决于药物的生物转化和排泄，并且通常以体内半衰期来测量(Pharmacology，4thEdition；Elesevier 2013)。
理解构成针对病原体或肿瘤的免疫应答的事件过程，这允许测定本发明的CD27受体激动剂蛋白的有利的PK谱。针对病原体或确实携带抗原的肿瘤的免疫应答可以分成若干个阶段。每个阶段都显示了特征持续时间，并且事件通常发生在特定的组织中。特别地，启动阶段描述了当在次级淋巴器官中淋巴细胞呈递肿瘤相关抗原时在免疫应答中的早期事件。为了通过其T细胞或B细胞受体识别抗原，T细胞和B细胞分别需要与抗原呈递细胞(APC)形成细胞-细胞缀合物。在成功进行抗原识别的情况下，淋巴细胞也被APC呈递出共刺激分子，诸如CD27L。由于抗原和共刺激分子两者的呈递均发生在APC/淋巴细胞缀合物的界面处，所以这种相互作用相当短暂，因为缀合物在若干分钟或几个小时后分离。在抗原识别和与分子诸如CD27L共刺激之后，淋巴细胞被激活并进入扩增阶段，在扩增阶段期间它们增殖以便产生针对肿瘤的免疫应答。
鉴于APC和淋巴细胞在次级淋巴器官中短的物理相互作用，可以推测由靶向CD27途径的重组生物制剂引发的共刺激信号期望是短寿命的。事实上，长时间暴露于共刺激信号可能会推动淋巴细胞进入高度活化状态，可能导致全身毒性效应。所以，用于靶向免疫系统的共刺激途径的生物制剂的良好PK谱将显示在几小时或可能一天内相对短的终末半衰期。这将与靶向相同途径的抗体形成对比，该抗体通常显示出多天甚至多于一周的终末半衰期。总之，激活免疫系统的共刺激途径的生物制剂具有几个小时的半衰期，这与刺激抗体相比就其时间活性(temporal activity)而言更接近天然配体。这也可以对在用某些免疫刺激抗体治疗期间观察到的可能毒性作用作出积极贡献。
因此，在另一实施方式中，本发明的CD27受体激动剂蛋白具有短的终末半衰期，诸如少于4天、少于三天、少于两天、少于一天。
本发明的另一方面涉及编码本文所述的CD27受体激动剂蛋白的核酸分子。核酸分子可以是DNA分子，例如双链或单链DNA分子，或RNA分子。核酸分子可编码CD27受体激动剂蛋白或其前体，例如CD27受体激动剂蛋白的原形式或前形式，其可包括用于分泌或纯化的信号序列或其他异源氨基酸部分，其优选位于CD27受体激动剂蛋白的N末端和/或C末端。异源氨基酸部分可以通过蛋白酶切割位点，例如因子X3、凝血酶或IgA蛋白酶切割位点连接至第一和/或第二结构域。本发明的核酸序列的具体实例示于表6中为SEQ ID NO：37。该核酸分子包括编码SEQ ID NO：25的融合多肽的开放阅读框。
表6：示例性CD27受体激动剂蛋白的核酸序列
Figure GDA0003553020570000331
Figure GDA0003553020570000341
Figure GDA0003553020570000351
核酸分子可操作性地连接到表达控制序列，例如允许核酸分子在所需宿主细胞中表达的表达控制序列。核酸分子可以位于载体上，例如质粒、细菌噬菌体、病毒载体、染色体整合载体等。合适的表达控制序列和载体的实例描述于例如由Sambrook等人(1989)Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,and Ausubel等人(1989),Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons或其更新的版本。
各种表达载体/宿主细胞系统可用于表达编码本发明的CD27受体激动剂蛋白的核酸序列。合适的宿主细胞包括但不限于原核细胞，诸如细菌，例如大肠杆菌(E.coli)，真核宿主细胞，诸如酵母细胞、昆虫细胞、植物细胞或动物细胞，优选哺乳动物细胞，更优选人细胞。此外，本发明涉及用如上所述的核酸分子转化或转染的非人生物体。这种转基因生物可以通过已知的遗传转移方法产生，包括同源重组。
本发明的另一方面涉及药物或诊断组合物，其包括作为活性剂的至少一种CD27受体激动剂蛋白、编码它们的相应核酸或者转化或转染的细胞，全部如本文所述的。
另一方面，本发明提供一种药物组合物，其包括本文公开的CD27受体激动剂蛋白和一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂和/或佐剂。
另一方面，本发明提供了编码CD27受体激动剂蛋白的核酸分子。在另一种实施方式中，本发明提供了包括核酸分子的表达载体。在另一种实施方式中，本发明提供了包括该核酸分子的细胞。在进一步的实施方式中，该细胞是真核细胞。在另一种实施方式中，该细胞是哺乳动物细胞。在另一种实施方式中，该细胞是中国仓鼠卵巢(CHO-1)细胞。在其他实施方式中，细胞选自由CHO-DBX11、CHO-DG44、CHO-S和CHO-K1细胞组成的组。在其他实施方式中，该细胞选自由Vero、BHK、HeLa、COS、MDCK、HEK-293、NIH-3T3、W138、BT483、Hs578T、HTB2、BT20、T47D、NS0、CRL7030、HsS78Bst、PER.C6、SP2/0-Agl4和杂交瘤细胞。
在另一方面，本发明提供了治疗患有CD27L相关疾病或疾患的受试者的方法，该方法包括向受试者施用有效量的CD27L受体激动剂蛋白。在一种实施方式中，单独施用CD27受体激动剂蛋白。在另一种实施方式中，CD27受体激动剂蛋白在施用第二种剂之前、同时或之后施用。在另一种实施方式中，所述疾病或疾患选自有如下组成的组：肿瘤、传染病、炎性疾病、代谢性疾病、自身免疫性疾病、退行性疾病、凋亡相关的疾病和移植排斥。在一种实施方式中，肿瘤是实体肿瘤。在一种实施方式中，肿瘤来源于由肉瘤、食管癌和胃癌组成的癌症组。在另一种实施方式中，肿瘤源自尤氏文肉瘤(Ewing's sarcoma)或纤维肉瘤。在另一种实施方式中，肿瘤来源于由非小细胞肺癌(NSCLC)、胰腺癌、结直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、头颈癌和小细胞肺癌(SCLC)组成的癌症组。在一种实施方式中，肿瘤是淋巴肿瘤。在一种实施方式中，肿瘤是血液肿瘤。在另一种实施方式中，肿瘤源自非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin'slymphoma)、白血病、急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓细胞白血病(AML)、B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)、慢性髓细胞白血病(CML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)或毛细胞白血病。在另一种实施方式中，自身免疫疾患是类风湿性疾病、关节炎疾病或类风湿性和关节炎疾病。在另一种实施方式中，疾病或疾患是类风湿性关节炎。在另一种实施方式中，退行性疾病是神经退行性疾病。在另一实施方式中，神经退行性疾病是多发性硬化。
在一种实施方式中，第二剂是化疗剂、放射治疗剂或生物剂。在一种实施方式中，第二剂选自由度维利塞(Duvelisib)、伊布替尼(Ibrutinib)、纳维妥拉(Navitoclax)和维奈妥拉(Venetoclax)组成的组。在另一实施方式中，第二剂是凋亡剂。在一种实施方式中，凋亡的第二剂选自由硼替佐米(Bortezomib)、氮杂胞苷(Azacitidine)、达沙替尼(Dasatinib)和吉非替尼(Gefitinib)组成的组。在一种具体实施方式中，通过静脉内或皮下施用将本文公开的药物组合物施用于患者。在其他实施方式中，通过口内、胃肠外、肌内、关节内、支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内、结肠内、子宫颈内、胃内、肝内、心肌内、骨内、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、椎内、滑膜内、胸腔内、子宫内、膀胱内、团注(bolus)、阴道内、直肠内、口腔的、舌下的、鼻内或透皮施用将所公开的药物组合物施用于患者。
在一种实施方式中，CD27受体激动剂蛋白作为单次团注施用。在另一实施方式中，CD27受体激动剂蛋白可以分若干次的剂量施用。CD27受体激动剂蛋白可以约0.1-100mg/kg施用。在一种实施方式中，CD27受体激动剂蛋白可以选自由以下组成的组的剂量施用：约0.1-0.5、0.1-1、0.1-10、0.1-20、0.1-50、0.1-75、1-10、1-15、1-7.5、1.25-15、1.25-7.5、2.5-7.5、2.5-15、5-15、5-7.5、1-20、1-50、7-75、1-100、5-10、5-15、5-20、5-25、5-50、5-75、10-20、10-50、10-75和10-100mg/kg。在其他实施方式中，CD27受体激动剂蛋白以约0.1-100mg/ml存在于药物组合物中。在一种实施方式中，所述CD27受体激动剂蛋白以选自由以下组成的组的量存在于药物组合物中：约0.1-0.5、0.1-1、0.1-10、0.1-20、0.1-50、0.1-75、1-10、1-20、1-50、1-75、1-100、5-10、5-15、5-20、5-25、5-50、5-75、10-20、10-50、10-75或10-100mg/ml。在其他实施方式中，将治疗有效量的CD27受体激动剂蛋白施用于受试者。在另一实施方式中，将预防有效量的CD27受体激动剂蛋白施用于受试者。
本文所用术语“CD27L相关疾病或疾患”是可通过向需要其的受试者施用有效量的CD27L受体激动剂而可以改善的任何疾病或疾患。至少一种CD27受体激动剂蛋白、相对的编码其的核酸或者转化或转染的细胞，全部如本文所述的可用于治疗，例如预防和/或治疗由CD27L功能障碍引起的、与CD27L功能障碍相关的和/或伴随CD27L功能障碍的疾患，特别是增殖性疾病，诸如肿瘤，例如实体肿瘤或淋巴肿瘤；传染病；炎性疾病；代谢性疾病；自身免疫性疾病，例如类风湿性和/或关节炎疾病；退行性疾病，例如神经退行性疾病，诸如多发性硬化；凋亡相关疾病或移植排斥。
本文所用的术语“CD27L功能障碍”应理解为CD27L的任何功能或表达偏离CD27L的正常功能或表达，例如，CD27L基因或蛋白的过度表达、与CD27L的正常生理表达水平相比CD27L基因或蛋白的表达减少或消除、与CD27L正常的生理活性或结合相比，CD27L活性增加、CD27L活性降低或消除、CD27L与任何结合配偶体(例如，受体，特别是CD27L受体或另一细胞因子分子)的结合增强、与任何结合配偶体(例如受体，特别是CD27L受体或另一细胞因子分子)的结合减弱或消除。
在各种实施方式中，提供了一种用于治疗患有可通过靶向CD27受体治疗的疾患的人受试者的方法，所述方法包括向人受试者施用本文公开的CD27受体激动剂蛋白，使得对人受试者中的一种或多种靶标的活性的影响是激动性的，使得一种或多种症状减轻和/或使得治疗实现。本文提供的CD27受体激动剂蛋白可用于治疗患有原发性和转移性癌症的人，包括乳腺癌、结肠癌、直肠癌、肺癌(例如小细胞肺癌“SCLC”和非小细胞肺癌“NSCLC”)、口咽癌、下咽癌、食管癌、胃癌、胰腺癌、肝癌、胆囊和胆管癌、小肠癌、尿道癌(包括肾癌、膀胱癌和尿路上皮癌)、女性生殖道癌(包括宫颈癌、子宫癌和卵巢癌以及绒毛膜癌和妊娠滋养细胞疾病)、男性生殖道癌(包括前列腺癌、精囊癌、睾丸癌和生殖细胞肿瘤)、内分泌腺癌(包括甲状腺癌、肾上腺癌和垂体癌)和皮肤癌，以及血管瘤、黑色素瘤、肉瘤(包括源自骨和软组织的肉瘤以及卡波西肉瘤(Kaposi's sarcoma))、脑肿瘤、神经肿瘤、眼睛肿瘤和脑膜肿瘤(包括星形细胞瘤、胶质瘤、胶质母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、神经瘤、神经母细胞瘤、许旺氏细胞瘤(Schwannomas)和脑膜瘤)、源自造血系统恶性肿瘤、急性白血病、急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓系白血病(AML)、B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)、慢性粒细胞白血病(CML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、毛细胞白血病、霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤(Hodgkin's and non-Hodgkin's lymphomas)、DLBCL、滤泡性淋巴瘤、造血系统恶性肿瘤、卡波西肉瘤(Kaposi's sarcoma)、恶性淋巴瘤、恶性组织细胞增生症、恶性黑色素瘤、多发性骨髓瘤、副肿瘤综合征/恶性高钙血症或实体肿瘤。
提供了包括本文公开的CD27受体激动剂蛋白和药学上可接受的载体的药物组合物。在一些实施方式中，药物组合物包括至少一种用于治疗疾患的另外的治疗剂。例如，另外的剂可以是治疗剂、化疗剂；成像剂、细胞毒性剂、血管生成抑制剂、激酶抑制剂(包括但不限于KDR和TIE-2抑制剂)、共刺激分子调节剂或免疫检查点抑制剂(包括但不限于抗B7.1、抗B7.2、抗B7.3、抗B7.4、抗CD28、抗B7RP1、CTLA4-Ig、抗CTLA-4、抗PD-1、抗PD-L1、抗PD-L2、抗ICOS、抗LAG-3、抗Tim3、抗VISTA、抗HVEM、抗BTLA、LIGHT融合蛋白、抗CD137、抗CD137L、抗OX40、抗OX40L、抗CD70、抗CD27、抗GAL9、抗A2AR、抗KIR、抗IDO-1、抗CD20)、树突状细胞/抗原呈递细胞调节剂(包括但不限于抗CD40抗体、抗CD40L、抗DC-SIGN、抗Dectin-1、抗CD301、抗CD303、抗CD123、抗CD207、抗DNGR1、抗CD205、抗DCIR、抗CD206和抗ILT7)、Toll样受体调节剂(包括但不限于抗TLR-1、抗TLR-2、抗TLR-3、抗TLR-4、抗TLR-4、抗TLR-5、抗TLR-6、抗TLR-7、抗TLR-8、抗TLR-9)、粘附分子阻滞剂(包括但不限于抗LFA-1抗体、抗E/L选择素抗体、小分子抑制剂)、抗细胞因子抗体或其功能片段(包括但不限于抗IL-18、抗TNF或抗IL-6/细胞因子受体抗体)、双特异性重定向T细胞或NK细胞细胞毒性(包括但不限于
Figure GDA0003553020570000401
)、基于嵌合T细胞受体(CAR-T)治疗、基于T细胞受体(TCR)治疗、治疗性癌症疫苗、甲氨蝶呤(methotrexate)、环孢菌素(cyclosporin)、雷帕霉素(rapamycin)、FK506、可检测标记物或报告物、TNF拮抗剂、抗风湿剂、肌肉松弛剂、麻醉剂、非甾体抗炎药(NSAID)、镇痛剂、麻醉剂、镇静剂、局部麻醉剂、神经肌肉阻滞剂、抗菌剂、抗银屑病剂、皮质类固醇、合成代谢类固醇、促红细胞生成素、免疫、免疫球蛋白、免疫抑制剂、生长激素、激素替代药物、放射性药物、抗抑郁药、抗精神病药、兴奋剂、哮喘药物、β激动剂、吸入类固醇、肾上腺素或类似物、细胞因子或细胞因子拮抗剂。
在一种实施方式中，治疗癌症或预防或抑制本文所述肿瘤转移的方法中，一种或多种CD27受体激动剂蛋白可单独使用或与一种或多种另外的剂例如化疗剂、放疗剂或生物剂组合使用。在一些实施方式中，该剂可以包括如下：13-顺式视黄酸(13-cis-RetinoicAcid)；2-CdA；2-氯脱氧腺苷(2-ChlorodeoxyadeNOine)；5-氮杂胞苷(5-Azacitidine)；5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil)；5-FU；6-巯基嘌呤(6-Mercaptopurine)；6-MP；6-TG；6-硫鸟嘌呤(6-Thioguanine)；白蛋白结合型紫杉醇(Abraxane)；
Figure GDA0003553020570000402
Figure GDA0003553020570000403
放线菌素-D(Actinomycin-D)；
Figure GDA0003553020570000404
Figure GDA0003553020570000405
Figure GDA0003553020570000406
阿地白介素(Aldesleukin)：阿仑单抗(Alemtuzumab)；ALIMTA；阿里维A酸(Alitretinoin)；奥卡班
Figure GDA0003553020570000407
Figure GDA0003553020570000408
全反式维甲酸(All-transretinoicAcid)；α干扰素(Alpha Interferon)；六甲蜜胺(Altretamine)；氨甲蝶呤(Amethopterin)；氨磷汀(Amifostine)；氨鲁米特(Aminoglutethimide)；阿那格雷(Anagrelide)；
Figure GDA0003553020570000409
阿那曲唑(Anastrozole)；阿拉伯糖基胞嘧啶(Arabinoylcytosine)；Ara-C
Figure GDA00035530205700004010
(Ara-C
Figure GDA0003553020570000411
Figure GDA0003553020570000412
三氧化二砷(Arsenic Trioxide)；阿泽拉TM(ArzerraTM)；天冬酰胺酶(Asparaginase)；ATRA；
Figure GDA0003553020570000413
Figure GDA0003553020570000414
阿扎胞苷(Azacitidine)；BCG；BCNU；苯达莫司汀(Bendamustine)；贝伐单抗(Bevacizumab)；贝沙罗汀(Bexarotene)；
Figure GDA0003553020570000415
必卡他胺(Bicalutamide)；BiCNU；
Figure GDA0003553020570000416
博来霉素(Bleomycin)；硼替佐米(Bortezomib)；白消安(Busulfan)；
Figure GDA0003553020570000417
Figure GDA0003553020570000418
C225；甲酰四氢叶酸钙(Calcium Leucovorin)；
Figure GDA0003553020570000419
Figure GDA00035530205700004110
喜树碱11(Camptothecin-11)；卡培他滨(Capecitabine)喀拉克TM(CaracTM)；卡铂(Carboplatin)；卡莫司汀(Carmustine)；卡莫司汀膜晶片(Carmustine Wafer)；
Figure GDA00035530205700004111
Figure GDA00035530205700004112
CC-5013；CCI-779；CCNU；CDDP；CeeNU；
Figure GDA00035530205700004113
Figure GDA00035530205700004114
西妥昔单抗(Cetuximab)；苯丁酸氮芥(Chlorambucil)；顺铂(Cisplatin)；嗜橙菌因子(Citrovorum Factor)；克拉屈滨(Cladribine)；可的松(Cortisone)；
Figure GDA00035530205700004115
CPT-11；环磷酰胺(Cyclophosphamide)；
Figure GDA00035530205700004116
阿糖孢苷(Cytarabine)；阿糖孢苷脂质体(Cytarabine Liposomal)；
Figure GDA00035530205700004117
Figure GDA00035530205700004118
达卡巴嗪(Dacarbazine)；达克金(Dacogen)；更生霉素(Dactinomycin)；阿法达贝泊汀(Darbepoetin Alfa)；达沙替尼(Dasatinib)；道诺霉素(Daunomycin)；道诺红菌素(Daunorubicin)；道诺红菌素盐酸盐(Daunorubicin Hydrochloride)；道诺红菌素脂质体(Daunorubicin Liposomal)；
Figure GDA00035530205700004119
地卡特隆(Decadron)；地西他滨(Decitabine)；
Figure GDA00035530205700004120
去氢
Figure GDA00035530205700004121
地尼白介素-毒素连接物(Denileukin Diftitox)；戴破赛TM(DepoCytTM)；地塞米松(Dexamethasone)；地塞米松乙酸盐(Dexamethasone Acetate)；地塞米松钠磷酸盐(Dexamethasone Sodium Phosphate)；戴克赛松(Dexasone)；右雷佐生(Dexrazoxane)；DHAD；DIC；笛奥戴克(Diodex)；多西他赛(Docetaxel)；
Figure GDA0003553020570000421
阿霉素(Doxorubicin)；阿霉素脂质体(Doxorubicin Liposomal)；得罗希亚TM(DroxiaTM)；DTIC；
Figure GDA0003553020570000422
度维里斯(Duvelisib)；
Figure GDA0003553020570000423
艾里咖TM(EligardTM)；意林司TM(EllenceTM)；乐沙定TM(EloxatinTM)；
Figure GDA0003553020570000424
Figure GDA0003553020570000425
表柔比星(Epirubicin)；阿法依泊汀(Epoetin Alfa)；爱必妥(Erbitux)；埃罗替尼(Erlotinib)；欧文氏菌左旋天冬酰胺酶(Erwinia L-asparaginase)；雌莫司汀(Estramustine)；阿米福汀(Ethyol)
Figure GDA0003553020570000426
Figure GDA0003553020570000427
依托泊苷(Etoposide)；磷酸依托泊苷(EtoposidePhosphate)；
Figure GDA0003553020570000428
依维莫司(Everolimus)；
Figure GDA0003553020570000429
Figure GDA00035530205700004210
依西美坦(Exemestane)；
Figure GDA00035530205700004211
Figure GDA00035530205700004212
弗隆
Figure GDA00035530205700004213
非格司亭(Filgrastim)；氟尿苷(Floxuridine)；
Figure GDA00035530205700004214
氟达拉滨(Fludarabine)；
Figure GDA00035530205700004215
Figure GDA00035530205700004216
氟尿嘧啶(Fluorouracil)；氟尿嘧啶乳(膏)(Fluorouracil(cream))；氟甲睾酮(Fluoxymesterone)；氟他胺(Flutamide)；亚叶酸(Folinic Acid)；
Figure GDA00035530205700004217
氟维司群(Fulvestrant)；吉非替尼(Gefitinib)；吉西他滨(Gemcitabine)；吉妥珠单抗奥唑米星(Gemtuzumab ozogamicin)；健择(Gemzar)；格列卫TM(GleevecTM)；
Figure GDA00035530205700004218
(
Figure GDA00035530205700004219
Wafer)；GM-CSF；戈舍瑞林(Goserelin)；粒细胞集落刺激因子(G-CSF)(Granulocyte-Colony Stimulating Factor)；粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(G-MCSF)(Granulocyte Macrophage Colony StimulatingFactor)；
Figure GDA00035530205700004220
Figure GDA00035530205700004221
海赛卓尔(Hexadrol)；
Figure GDA00035530205700004222
Figure GDA00035530205700004223
六甲嘧胺(Hexamethylmelamine)；HMM；
Figure GDA00035530205700004224
Figure GDA00035530205700004225
(Hydrocort
Figure GDA00035530205700004226
)；氢化可的松(Hydrocortisone)；氢化可的松磷酸钠(Hydrocortisone Sodium Phosphate)；氢化可的松琥珀酸钠(Hydrocortisone Sodium Succinate)；磷酸氢化可的松(HydrocortonePhosphate)；羟基脲(Hydroxyurea)；依鲁替尼(Ibrutinib)；替伊莫单抗(Ibritumomab)；替坦异贝莫单抗(Ibritumomab Tiuxetan)；
Figure GDA0003553020570000431
伊达比星(Idarubicin)
Figure GDA0003553020570000432
干扰素α(Interferon-alpha)；干扰素α-2b(PEG缀合物)(Interferon-alpha-2b(PEG Conjugate))；异环磷酰胺(Ifosfamide)；白介素11(IL-11)(Interleukin-11)；白介素2(IL-2)(Interleukin-2)；甲磺酸伊马替尼(Imatinibmesylate)；咪唑甲酰胺(Imidazole Carboxamide)；
Figure GDA0003553020570000433
(Intron
Figure GDA0003553020570000434
)；伊匹单抗(ipilimumab)、
Figure GDA0003553020570000435
伊立替康(Irinotecan)；异维甲酸(Isotretinoin)；伊沙匹隆(Ixabepilone)；伊赛普拉TM(IxempraTM)；
Figure GDA0003553020570000436
凯卓酶(t)(Kidrolase(t))
Figure GDA0003553020570000437
拉帕替尼(Lapatinib)；L-天冬酰胺酶(L-asparaginase)；LCR；来那度胺(Lenalidomide)；来曲唑(Letrozole)；甲酰四氢叶酸(Leucovorin)；留可然(Leukeran)；瘤肯TM(LeukineTM)；亮丙瑞林(Leuprolide)；长春新碱(Leurocristine)；禄斯得停TM(LeustatinTM)；利丽单抗(Lirilumab)；阿糖胞苷脂质体(Liposomal Ara-C)；
Figure GDA0003553020570000438
(Liquid
Figure GDA0003553020570000439
)；罗氮芥(Lomustine)；L-PAM；左旋苯丙氨氮芥(L-Sarcolysin)；
Figure GDA00035530205700004310
Figure GDA00035530205700004311
(Lupron
Figure GDA00035530205700004312
)；
Figure GDA00035530205700004313
马希得克(Maxidex)；双氯乙基甲胺(Mechlorethamine)；盐酸双氯乙基甲胺(Mechlorethamine Hydrochloride)；
Figure GDA00035530205700004314
Figure GDA00035530205700004315
甲地孕酮(Megestrol)；醋酸甲地孕酮(Megestrol Acetate)；MEK抑制剂(MEK inhibitor)；美法仑(Melphalan)；巯基嘌呤(Mercaptopurine)；美司钠(Mesna)；美司那TM(MesnexTM)；甲氨蝶呤(Methotrexate)；甲氨蝶呤钠(Methotrexate Sodium)；甲基强的松龙(Methylprednisolone)；
Figure GDA00035530205700004316
丝裂霉素(Mitomycin)；丝裂霉素C(Mitomycin-C)；米托蒽醌；(Mitoxantrone)M
Figure GDA00035530205700004317
Figure GDA0003553020570000441
MTC；MTX；盐酸氮芥
Figure GDA0003553020570000442
氮芥(Mustine)；
Figure GDA0003553020570000443
麦乐赛尔TM(MylocelTM)；
Figure GDA0003553020570000444
生根粉263(Navitoclax)；
Figure GDA0003553020570000445
奈拉滨(Nelarabine)；
Figure GDA0003553020570000446
倍血添TM(NeulastaTM)；
Figure GDA0003553020570000447
Figure GDA0003553020570000448
Figure GDA0003553020570000449
尼罗替尼(Nilotinib)；尼鲁米特(Nilutamide)；
Figure GDA00035530205700004410
Figure GDA00035530205700004411
氮芥(Nitrogen Mustard)
Figure GDA00035530205700004412
纳武单抗(Nivolumab)；
Figure GDA00035530205700004413
尼普累特(Nplate)；奥曲肽(Octreotide)；醋酸奥曲肽(Octreotide acetate)；奥法木单抗(Ofatumumab)；
Figure GDA00035530205700004414
Figure GDA00035530205700004415
昂克赛尔TM(OnxalTM)；奥普瑞白介素(Oprelvekin)；
Figure GDA00035530205700004416
Figure GDA00035530205700004417
奥沙利铂(Oxaliplatin)；紫杉醇(Paclitaxel)；紫杉醇蛋白结合物(Paclitaxel Protein-bound)；帕米膦酸钠(Pamidronate)；帕尼单抗(Panitumumab)；
Figure GDA00035530205700004418
Figure GDA00035530205700004419
帕唑帕尼(Pazopanib)；
Figure GDA00035530205700004420
PEG干扰素(PEG Interferon)；培加帕加司(Pegaspargase)；培非格司亭(Pegfilgrastim)；PEG-INTRONTM；PEG左旋天冬酰胺酶(PEG-L-asparaginase)；PEMETREXED；派姆单抗(Pembrolizumab)；喷司他丁(Pentostatin)；帕妥珠单抗(Pertuzumab)；苯丙氨酸氮芥(Phenylalanine Mustard)；皮地利珠单抗(Pidilizumab)；
Figure GDA00035530205700004421
普拉汀诺
Figure GDA00035530205700004422
泼尼松龙(Prednisolone)；泼尼松(Prednisone)；
Figure GDA00035530205700004423
甲基苄肼(Procarbazine)；
Figure GDA00035530205700004424
Figure GDA00035530205700004425
聚苯丙生20载卡莫司汀植入剂(Prolifeprospan 20with CarmustineImplant)；
Figure GDA00035530205700004426
BRAF抑制剂(BRAF inhibitor)；雷洛昔芬(Raloxifene)；
Figure GDA00035530205700004427
Figure GDA00035530205700004428
利妥昔单抗(Rituximab)；罗扰素
Figure GDA0003553020570000451
罗米司亭(Romiplostim)；
Figure GDA0003553020570000452
盐酸红比霉素(Rubidomycin hydrochloride)；
Figure GDA0003553020570000453
善得定
Figure GDA0003553020570000454
(Sandostatin
Figure GDA0003553020570000455
)；沙格司亭(Sargramostim)；
Figure GDA0003553020570000456
Figure GDA0003553020570000457
索拉非尼(Sorafenib)；SPRYCELTM；STI-571；STIVAGRATM；链脲菌素(Streptozocin)；SU11248；舒尼替尼(Sunitinib)；
Figure GDA0003553020570000458
它莫西芬(Tamoxifen)
Figure GDA0003553020570000459
Figure GDA00035530205700004510
Figure GDA00035530205700004511
替莫唑胺(Temozolomide)替西罗莫司(Temsirolimus)；替尼泊苷(Teniposide)；TESPA；萨力多胺(Thalidomide)；
Figure GDA00035530205700004512
硫鸟嘌呤(Thioguanine)；
Figure GDA00035530205700004513
(Thioguanine
Figure GDA00035530205700004514
)；三胺硫磷(Thiophosphoamide)；
Figure GDA00035530205700004515
硫替哌(Thiotepa)；
Figure GDA00035530205700004516
Figure GDA00035530205700004517
拓扑替康(Topotecan)；托瑞米芬(Toremifene)；
Figure GDA00035530205700004518
托西莫单抗(Tositumomab)；曲妥珠单抗(Trastuzumab)；
Figure GDA00035530205700004519
曲美木单抗(Tremelimumab)；维甲酸(Tretinoin)；曲克傲TM(TrexallTM)；
Figure GDA00035530205700004520
TSPA；
Figure GDA00035530205700004521
乌瑞鲁单抗(Urelumab)；VCR；维克替比TM(VectibixTM)；
Figure GDA00035530205700004522
万耐托克(Venetoclax)；
Figure GDA00035530205700004523
Figure GDA00035530205700004524
微尔度TM(ViadurTM)；
Figure GDA00035530205700004525
Figure GDA00035530205700004526
长春花碱(Vinblastine)；硫酸长春花碱(Vinblastine Sulfate)；万卡赛
Figure GDA00035530205700004527
(Vincasar
Figure GDA00035530205700004528
)；长春新碱(Vincristine)；长春瑞滨(Vinorelbine)；酒石酸长春瑞滨(Vinorelbine tartrate)；VLB；VM-26；伏立诺他(VoriNOtat)；福退癌(Votrient)；VP-16；
Figure GDA00035530205700004529
Figure GDA00035530205700004530
泽娃灵TM(ZevalinTM)；
Figure GDA00035530205700004531
Figure GDA00035530205700004532
唑来膦酸(Zoledronic acid)；佐林扎(Zolinza)；或
Figure GDA00035530205700004533
和/或本文未具体列出的靶向相似途径的任何其他剂。
当两种或更多种物质或原理用作组合治疗方案的一部分时，它们可以通过相同的施用途径或通过不同的施用途径、在基本上相同的时间或在不同的时间(例如基本上同时、连续或根据替换方案)施用。当物质或原理通过相同的施用途径同时施用时，它们可以作为不同的药物制剂或组合物或组合药物制剂或组合物的一部分施用，这对于本领域技术人员来说是清楚的。
此外，当两种或更多种活性物质或原理用作组合治疗方案的一部分时，每种物质或原理可以以与化合物或原理单独使用时相同的量和根据相同的方案施用，并且这种组合使用可以产生或可以不产生协同效应。然而，当两种或更多种活性物质或原理的组合使用导致协同效应时，也可以减少一种、多于一种或所有待施用的物质或原理的量，而仍然实现期望的治疗作用。当它们以通常的量使用时，这可以例如用于避免、限制或减少与一种或多种物质或原理的使用相关的任何不希望的副作用，同时仍然获得期望的药物或治疗效果。
根据本发明使用的治疗方案的有效性可以以对于所涉及的疾病或疾患本身已知的任何方式来确定和/或遵循，如对于临床医生来说将是清楚的。临床医生还能够在适当的情况下并在个案的基础上改变或修改特定的治疗方案，以便实现期望的治疗效果，避免、限制或减少不期望的副作用，和/或在一方面实现期望的治疗效果与另一方面避免、限制或减少不期望的副作用之间实现适当的平衡。
通常，将遵循治疗方案直到获得期望的治疗效果和/或只要维持期望的治疗效果。同样，这可以由临床医生确定。
在各种实施方式中，本文提供了包括一种或多种CD27受体激动剂蛋白的药物组合物，其是单独的或与预防剂、治疗剂和/或药学上可接受的载体组合的。在各种实施方式中，本文公开的药物组合物的用途的非限制性实例包括诊断、检测和/或监测疾患，预防、治疗、管理和/或改善疾患或其一种或多种症状和/或用于研究。单独的或与预防剂、治疗剂和/或药学上可接受的载体组合的药物组合物的制剂，是本领域技术人员已知的(美国专利公开No.20090311253A1)。
如本文所用，短语“有效量”是指导致与CD27L功能障碍相关的或与CD27L相关的疾病或疾患相关的一个或多个参数的可检测的改善(例如，高于基线至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或更多)的CD27L激动剂蛋白的量。
施用本文提供的治疗剂的方法包括但不限于口服施用、胃肠外施用(例如皮内、肌内、腹膜内、静脉内和皮下)、硬膜外施用、瘤内施用、粘膜施用(例如鼻内和口服途径)和肺部施用(例如，用吸入器或喷雾器施用的雾化化合物)。用于特定施用途径的药物组合物的制剂以及各种施用方法所必需的材料和技术对于本领域技术人员是可获得的和已知的(美国专利公开No.20090311253A1)。
在各种实施方式中，可以调节剂量方案以提供最佳所需应答(例如，治疗或预防应答)。例如，可以单次团注施用，可以随时间施用若干个分开的剂量，或者剂量可以按治疗情况的紧急指示成比例地减少或增加。在一些实施方式中，胃肠外组合物以剂量单位形式配制，以便于施用和剂量的均匀性。术语“剂量单位形式”是指适于作为待治疗的哺乳动物受试者的单一剂量的物理上离散的单位；每个单元含有预定量的活性化合物，所述预定量的活性化合物经计算以产生与所需药物载体相关的所需治疗效果。
本文提供的治疗或预防有效量的CD27受体激动剂蛋白的示例性非限制性范围为约0.1-100mg/kg(例如，约0.1-0.5、0.1-1、0.1-10、0.1-20、0.1-50、0.1-75、1-10、1-15、1-7.5、1.25-15、1.25-7.5、2.5-7.5、2.5-15、5-15、5-7.5、1-20、1-50、7-75、1-100、5-10、5-15、5-20、5-25、5-50、5-75、10-20、10-50、10-75或10-100mg/kg，或中间的任何浓度)。在一些实施方式中，所述CD27受体激动剂蛋白以治疗有效浓度存在于药物组合物中，例如约0.1-100mg/ml的浓度(例如，0.1-0.5、0.1-1、0.1-10、0.1-20、0.1-50、0.1-75、1-10、1-20、1-50、1-75、1-100、5-10、5-15、5-20、5-25、5-50、5-75、10-20、10-50、10-75或10-100mg/ml，或中间的任何浓度)。注意，剂量值可随待缓解病症的类型和/或严重程度而变化。还应当理解，对于任何特定的受试者，可以根据个体需要和/或进行组合物施用或监督组合物施用的人的专业判断随时间调节具体的剂量方案，并且本文所示的剂量范围仅是示例性的，而不旨在限制所要求保护的组合物的范围或实践。
实施例
实施例1.CD27受体激动剂蛋白制备
1.1多肽结构
A)氨基酸Met1–Gly20
Ig-κ-信号肽，在氨基酸GIy20之后假定的信号肽酶切割位点。
B)氨基酸Glu21–Pro163
人CD27L配体的第一可溶性细胞因子结构域(CD27L，SEQ ID NO：1的氨基酸51-193)。
C)氨基酸GIy164–Ser171
SEQ ID NO：2的第一肽接头元件。
D)氨基酸Glu172–Pro314
人CD27L配体的第二可溶性细胞因子结构域(CD27L，SEQ ID NO：1的氨基酸51-193)。
E)氨基酸GIy315–Ser322。
SEQ ID NO：2的第二肽接头元件。
F)氨基酸Glu323–Pro465
人CD27L配体的第三可溶性细胞因子结构域(CD27L，SEQ ID NO：1的氨基酸51-193)。
G)氨基酸Gly466–Cys486
SEQ ID NO：16的铰链接头元件。
H)氨基酸Pro487–Lys704
SEQ ID NO：13的抗体Fc片段结构域。
上述CD27受体激动剂蛋白如SEQ ID NO：25中所示。
所示的接头可由其他优选的接头替换，例如如SEQ ID NO：3-12中所示。
所示的铰链接头元件可由其他优选的铰链接头元件替换，例如如SEQ ID NO：19-24中所示。
应当注意，第一和第二肽接头不需要相同。
信号肽序列(A)可以被任何其他合适的例如哺乳动物信号肽序列替换。
1.2编码该多肽的基因盒
合成基因可以根据用于在合适的宿主细胞例如昆虫细胞或哺乳动物细胞中表达的其密码子使用而优化。优选的核酸序列如SEQ ID NO：37中所示。
实施例2.表达和纯化
2.1融合多肽的克隆、表达和纯化
上述融合蛋白使用下述方法在两种不同的真核宿主细胞中重组表达：小规模表达CD27受体激动剂融合蛋白的方法：
为了对前述CD27受体激动剂融合蛋白进行初步分析，将在补充有10％的FBS，100单位/ml的青霉素和100[mu]g/ml链霉素的DMEM+GlutaMAX(GibCo)中生长的Hek293细胞用含有融合多肽和适当的选择标志物的表达盒的质粒瞬时转染，例如包括杀稻瘟菌素、嘌呤霉素或潮霉素抗性基因的功能性表达盒。在需要多个多肽链以获得最终产物的那些情况下，表达盒将在转染过程中结合在一种质粒上或定位在不同质粒上。在转染后3天收获含有重组融合多肽的细胞培养物上清液，并通过300×g离心澄清，随后通过0.22μm无菌过滤器过滤。
大规模表达和纯化CD27受体激动剂融合蛋白的方法
为了更大规模地表达在体内待用的CD27受体激动剂融合蛋白，将编码上述蛋白质的合成DNA盒插入真核表达载体中，该真核表达载体包括适当的选择标志物(例如，包括杀稻瘟菌素、嘌呤霉素或潮霉素抗性基因的功能表达盒)和适于增加宿主细胞基因组内转录活性插入位点数目的遗传元件。通过电穿孔将序列验证的表达载体导入适合中国仓鼠卵巢细胞(CHO-S，Invitrogen)的悬浮液中。转染后三天将对转染细胞施加合适的选择压力。通过随后在选择压力下培养来回收携带载体来源的抗性基因的存活细胞。当选择的细胞群在化学限定的培养基(PowerCHO2-CD，Lonza)中在37℃和7％CO2气氛中在轨道振荡培养箱(100rpm，50mm震甩)中稳定生长时，通过ELISA测定法检测上述蛋白质来分析单个上清液，并且在蛋白质产生之前在摇动瓶中扩增具有最高比生产率的细胞群(轨道振荡器，100rpm，震甩50mm)。
对于实验室规模的蛋白质生产，在Wave生物反应器20/50EHT(GE-Healthcare)中，在化学限定的培养基(PowerCHO2-CD，Lonza)中在37℃和7％的CO2气氛中培养单个细胞群7-12天。基础培养基为补充有4mM Glutamax的PowerCHO2-CD。Wave培养始于活细胞浓度为0.3×10e6至0.4×10e6个细胞/ml和以下设置(对于五升或十升袋)：振荡频率为18rpm，振荡角度为7°，气流为0.2-0.3L/min，7％的CO2，36.5℃。在Wave运行期间，向细胞培养物补料PowerFeed A(Lonza)两次，通常在第2天(20％补料)和第5天(30％补料)。第二次补料后，振荡频率增加至22rpm，振荡角度增加到8°。
当细胞活力下降到80％以下时，生物反应器通常在第7天至第12天之间收获。首先，使用手动深度过滤系统(Millipore Millistak Pod，MC0HC0.054m2)澄清培养物上清液。对于带Strep标签的蛋白质，添加亲和素至终浓度为0.5mg/L。最后，使用瓶顶过滤器(0.22μm，PES，Corning)将含有CD27受体激动剂融合蛋白的培养物上清液无菌过滤，并储存在2-8℃直至进一步处理。
为了亲和纯化，将链霉素琼脂糖(Streptactin Sepharose)填充至柱(凝胶床2ml)，用15ml缓冲液W(100mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH 8.0)或pH 7.4的PBS平衡，并将细胞培养物上清液施于该柱，流速约为4ml/min。随后，用15ml缓冲液W洗柱，通过加入7×1ml缓冲液E(100mM Tris HCl，150mM NaCl，2.5mM脱硫生物素，pH8.0)逐步洗脱结合的多肽。替换地，含有2.5mM脱硫生物素的pH 7.4PBS可以用于该步骤。
可替换基于链霉素琼脂糖的方法，使用具有固定化蛋白A作为亲和配体的柱和
Figure GDA0003553020570000511
层析系统(GE-Healthcare)进行亲和纯化。选择对融合蛋白的FC结构域具有高亲和力的固相材料：MABSelect SureTM(GE Healthcare)。简而言之，将澄清的细胞培养物上清液加载到在洗涤缓冲液-1(20mM的Pi，95mM的NaCl，pH为7.2)中平衡的HiTrap MabSelectSure柱(CV＝5ml)上，该上清液不超过10mg融合蛋白/ml柱-床的加载。用10倍柱体积(10CV)的上述平衡缓冲液洗涤柱子，接着用四倍柱体积(4CV)的洗涤缓冲液-2(20mM Pi，95mM NaCl，pH8.0)洗涤以去除宿主细胞蛋白和宿主-细胞DNA。然后用洗脱缓冲液(20mM Pi，95mM NaCl，pH 3.5)洗脱柱子，洗脱液以多至10个级分收集，每个级分的体积等于柱床体积(5ml)。用等体积的上述洗涤缓冲液-2中和每个级分。在上述亲和层析法过程中，线速度设定为150cm/h并保持恒定。
定量洗脱液级分的蛋白质量，并通过超滤浓缩峰级分，并通过尺寸排阻层析(SEC)进一步纯化。
在图5中示出了蛋白A(SEQ ID NO：15)和三价对照蛋白质蛋白X(SEQ ID NO：38)的分析性尺寸排阻层析。为了制备对照蛋白，请参考实施例4。使用Tosoh TSK凝胶G3000SWxl柱在1260无限HPLC系统上进行SEC。该柱中载入0.6mg/ml浓度，总体积为20μl的蛋白质。流速设置为0.5ml/min。对于蛋白A(图5：B部分)在16.39分钟处观察到单个主峰，对于蛋白X(图5A部分)在18.91分钟处观察到单个主峰。通过使用内部分子量标准(BioRad SEC标准)，可以从相应的保留时间来内推(intrapolate)蛋白A和蛋白X的分子量。所以，蛋白X具有80.4kDa的表观分子量，蛋白A显示201.8kDA的分子量。这些值与来源于氨基酸序列的理论上的预期值相一致。
采用上述方法，在CHO-S细胞中表达重组CD27受体激动剂融合蛋白(蛋白A，SEQ IDNO：15)，并采用亲和层析和随后的基于SEC的最终精制进行纯化。
图5(B部分)示出了六价scCD27L-RBD-FC(蛋白A，SEQ ID NO：15)融合蛋白的分析性SEC的色谱图。图5(A部分)示出了三价对照蛋白(蛋白X，SEQ ID NO：38)融合蛋白的分析性SEC的色谱图。
为了测定天然条件下纯化的融合多肽的表观分子量，向葡聚糖(Superdex)200柱加载有已知分子量的标准蛋白质。基于标准蛋白质的洗脱体积绘制校准曲线并确定纯化的融合多肽的表观分子量。包括FC结构域的CD27受体激动剂融合蛋白一般从葡聚糖200柱洗脱，表观分子量约为160-180kDa，证实Fc结构域对成熟CD27受体激动剂融合多肽的同源二聚化。
实施例3.从蛋白A表达的二聚体蛋白的SDS-PAGE结果
为了确定蛋白A的同二聚体是否共价连接，
在还原态和非还原态下进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)实验。还原态下的主带的尺寸仅约为在非还原态下观察到的尺寸的一半。这表明同二聚体通过二硫桥被共价地连接(还参见图7)。
实施例4.三价对照蛋白
为了比较六价CD27受体激动剂融合蛋白和用噬菌体RB69-FOLDON稳定的三价CD27之间的相对结合，如前一部分所述在CHO-S细胞中表达并纯化蛋白X(SEQ ID NO：38)。SEC纯化的蛋白在下列实施例中用作对照。在表7中示出了蛋白X(SEQ ID NO：38)的序列。蛋白X的氨基酸1-20代表信号肽，并且成熟蛋白以氨基酸Glu51起始。这种蛋白质由三种相同的多肽组成，每种多肽包含一个可溶性CD27L结构域(SEQ ID NO：1的E51-P193)；通过用柔性接头将噬菌体RB69纤维蛋白(fibritin)的三聚化结构域融合至CD27L的C末端而稳定此组装。
表7：包括信号肽的三价对照蛋白质
Figure GDA0003553020570000531
实施例5：与TCR活化结合的CD27受体激动剂活化鼠T细胞
为了评估CD27受体激动剂蛋白的T细胞活化能力，通过使用磁珠的阴性选择从小鼠脾脏中纯化T细胞。用CFSE标记细胞并与或不与不同量的CD27受体激动剂蛋白一起孵育，并与抗小鼠CD3抗体在37℃下结合2-5天。在流式细胞仪上获取CFSE稀释作为测量细胞分裂的手段的数据。通过使用细胞培养物上清液和用于捕获的抗小鼠IFNγ抗体的ELISA测定来测量IFNγ产生。
当CD27受体激动剂蛋白与抗小鼠CD3抗体一起存在于T细胞培养物中时，人们期望通过CD4+和CD8+T细胞二者观察到IFNγ分泌的清楚的增加。人们期望通过使用流式细胞术测量CFSE稀释来看到更多的T细胞被驱入细胞周期，以及更高的IFNγ产生。这将证明CD27受体激动剂蛋白在T细胞活化中的共刺激作用。
实施例6：CD27受体激动剂蛋白与小鼠免疫细胞的体内结合以及对循环淋巴细胞的作用
为了评估CD27受体激动剂蛋白与免疫细胞的体内结合，采用或不采用单一静脉注射不同浓度的CD27受体激动剂蛋白来处理小鼠。跟踪动物长达20天，并且从注射当天开始每天采集血液样品。将血液样品与荧光抗人Fc抗体一起在冰上孵育，并且随后使用红细胞裂解缓冲液裂解红细胞。然后在流式细胞仪上分析样品。基于它们的侧向和前向散射谱以鉴定来自血液的总淋巴细胞，并将来自注射的小鼠的染色群体与来自未处理的对照动物的细胞进行比较。
人们期望CD27受体激动剂蛋白结合到表达靶受体CD27的循环淋巴细胞的表面。由于靶标介导的药物处置，这种结合可能随着时间而下降，这可能通过激动剂/受体复合物的内化而发生。
另外，评估CD27受体激动剂蛋白对循环淋巴细胞群的作用。为此目的，小鼠接受单一静脉注射不同浓度的CD27受体激动剂蛋白，从注射当天开始20天内每天获取来自小鼠的血液样品(参见上述)。红细胞裂解后，细胞用针对免疫细胞亚群，诸如B细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞或NK细胞的荧光抗体染色。然后在流式细胞仪上分析染色的样品。
人们期望在治疗期间观察到循环免疫细胞亚群的数目没有显著变化。
实施例7：CD27受体激动剂蛋白增强抗原特异性CD8+T细胞的增殖和活化以及小鼠外周血细胞和脾细胞上的五聚体染色
给小鼠静脉内注射1-10mg鸡卵清蛋白以及不同量的CD27受体激动剂蛋白。包括抗小鼠CD27和不相关的人IgG1抗体分别作为阳性和阴性对照。CD27受体激动剂蛋白与卵清蛋白在第0天共同注射，并在第1天单独注射额外量的CD27受体激动剂蛋白。在第7-10天收获外周血细胞和脾细胞。脾细胞和全血用于染色。在Fc-受体阻断之后，细胞用荧光标记的H-2Kb/SIINFEKL(一种与来自卵清蛋白的肽T细胞表位复合的小鼠MHC I类的四聚体复合物)在室温下染色30分钟至1小时，并另外用荧光抗体检测小鼠CD8和小鼠CD27。随后用红细胞裂解缓冲液处理样品以消除红细胞，洗涤并固定。细胞的分析是在流式细胞仪上对CD8+和CD27+T细胞区室内的细胞计数，这些细胞识别MHC I类情况下的SIINFEKL肽，并且因此这些细胞是抗原特异性的。
人们期望观察到由CD27受体激动剂蛋白引发的补充效应，即在免疫应答的情况下激动剂增强抗原特异性CD8+T细胞的扩增。这将证明由CD27受体激动剂蛋白产生明确的共刺激作用。
实施例8.通过限制性蛋白酶消化测定CD27受体激动剂蛋白的体外稳定性
如实施例1中所述的六价Fc融合蛋白一样，将表达并纯化待研究的所有CD27受体激动剂蛋白。该组将包括在CH2结构域中包含N297S突变[根据EU编号系统]和铰链区的CD27受体激动剂蛋白，该铰链区能够形成三个二硫桥并且另外缺少上铰链赖氨酸[K223，根据EU编号系统]，其突变为甘氨酸[K223G]。在有限的蛋白酶消化测定中，将在三个二硫化物发挥铰链功能的情况下同时包括N297S突变和K223G突变的前述CD27受体激动剂蛋白与呈现在两个二硫化物或三个二硫化物实现铰链区的情况下包括N297S突变但具有K223野生型的CD27受体激动剂蛋白进行比较。
此外，具有减少至4个氨基酸的第二接头元件(iv)，并且具有缩短的铰链元件(vi)的CD27受体激动剂蛋白将被研究(例如SEQ ID NO：32和34)。工程化策略(三个二硫化物实现铰链区情况下的N297S与K223G突变结合)和缩短接头元件(iv和vi)二者都对相应分子的稳定性具有潜在影响。
本发明的不同CD27激动性蛋白的稳定性可以通过体外限制的蛋白酶消化解决。对于该分析，将上述CD27受体激动剂蛋白与低浓度蛋白酶(例如胰蛋白酶、V8蛋白酶)在不同温度(例如4℃、25℃、37℃)下一起孵育不同时间。随后可以通过不同的方法，如SDS-PAGE、分析型SEC或本领域已知的分析质谱法(例如Nano-RP-HPLC-ESI-MSMS)来测量特定蛋白水解片段随时间的定量及其出现。由于被研究的蛋白质具有大部分共同的序列，随着时间的推移，来自单个蛋白质的特定蛋白水解片段的更快的出现和数量增加可用于判断它们的相对稳定性并将它们相互排序。关于所研究的上述CD27受体激动剂蛋白的基于蛋白酶的诱饵动力学，关于其蛋白水解稳定性顺序预期如下：
与在铰链区中包括N297S和野生型K223的CD27受体激动剂蛋白相比，包括N297S和K223G以及实现铰链区的三个二硫化物的CD27受体激动剂蛋白同时具有延长的稳定性。与包括SEQ ID NO：16作为铰链接头元件的CD27受体激动剂蛋白相比，包含SEQ ID NO：21作为铰链接头元件的CD27受体激动剂蛋白具有延长的稳定性。
实施例9.半衰期测定
分子蛋白A由通过三个链间二硫键共价连接的两个多肽组成，并且在铰链接头中包括K223G突变以及Fc区的N297S突变(根据EU编号)，导致CH2结构域的无糖基化。检验纯化的蛋白A在小鼠中的半衰期。
雌性CD1小鼠用1.0mg/kg的蛋白A作为单次静脉团注注射施用。全血在应用前(给药前(pre-dose))以及检验项目施用后最长达312小时收集。制备血清并将样品储存在-80℃直至测定血清浓度。
使用检测CD27激动剂的ELISA测定对小鼠血清中的蛋白A浓度进行定量，示于表8中。板用CD27-Fc包被。然后通过使用StrepTactin-HRP的Strep标签来检测特异性结合到其受体CD27的CD27-配体构建体。使用参考蛋白A作为校准和对照样品进行ELISA测定。使用标准浓度的测量数据以创建使用5参数拟合的校准曲线。这使得能够测定相应小鼠血清样品中未知的蛋白A浓度。
使用平均血清浓度和用于非区室药物代谢动力学数据分析(Summit ResearchServices，Montrose，CO)的药物代谢动力学评估程序PK Solutions2.0版来计算药物代谢动力学参数。PK Solutions是基于Excel的自动化应用，其电脑计算来自浓度-时间数据的药物代谢动力学参数，该浓度-时间数据是分析例如静脉内的或血管外的途径施用之后的生物样品而获得的。PK Solutions计算结果而无需假设任何特定的分区模型。
表8中总结了药物代谢动力学评估的结果。
表8：CD1小鼠中探索性PK研究的结果：1mg/kg蛋白A的单次静脉内剂量。
蛋白A
t<sub>最大</sub>(h) 0.083
C<sub>最大</sub>(μg/ml) 9.63
t<sub>最终</sub>(h) 24
C<sub>最大</sub>(μg/ml) 0.288
t<sub>1/2</sub>E(h) 10.42
t<sub>1/2</sub>E(d) 0.43
AUC<sub>0-t</sub>(μg*h/ml) 33
AUC<sub>0-inf</sub>(μg*h/ml) 38
结果表明，蛋白A在小鼠中具有惊人的10.42小时的短的终末半衰期。这种短的半衰期构成了有利的治疗选择，因为需要与CD27受体激动剂蛋白的短的共刺激刺激。
实施例10：稳定性/聚集检验
单体和聚集体的含量通过实施例2中所述的分析性SEC测定。对于特定目的，在生理pH的含有生理盐浓缩物的缓冲液(例如，pH 7.4 0.9％NaCl；pH 7.4PBS)中进行该分析。典型的聚集分析在葡聚糖200柱(GE Healthcare)上进行。该柱分离10至800kDa范围内的蛋白质。
为了测定天然条件下纯化的融合多肽的表观分子量，向葡聚糖200柱加载已知分子量的标准蛋白。基于标准蛋白的洗脱体积绘制校准曲线，并基于洗脱体积计算未知分子量的纯化融合蛋白的表观分子量。
对可溶性非聚集蛋白的SEC分析通常在限定的洗脱体积显示出明显的单一蛋白峰(在280nm或214nm处的OD处测量)。该洗脱体积对应于特定蛋白的表观天然分子量。关于在FC融合蛋白的情况下“单体”的定义，两条多肽链的组装由该蛋白质的FC部分驱动，并且功能单位是由两条链组成的蛋白质。含有两条FC连接的多肽链的该单元在Fc融合蛋白的情况下被定义为“单体”，这与二聚化单链融合多肽无关。
如果发生蛋白质聚集，SEC分析显示出具有较低保留体积的额外蛋白质峰。蛋白寡聚物可能用作聚集种子，并且高含量的寡聚物可能导致蛋白质聚集。大分子量的寡聚物和聚集体在葡聚糖200柱的空隙体积中洗脱，并且不能通过SEC对它们的天然分子量进行分析。
CD27受体激动剂融合蛋白的纯化制剂应优选仅含有限定的单体蛋白和非常少量的寡聚蛋白。特定CD27受体激动剂融合蛋白制剂的聚集/寡聚程度基于SEC分析通过分别计算所限定单体和寡聚物/聚集体级分的OD280图的峰面积来测定。基于总峰面积，限定的单体蛋白的百分比计算如下：
单体含量[％]＝[单体蛋白的峰面积]/[总峰面积]×100)
实施例11：通过QCM分析测定三价和六价CD27受体配体构建体的平衡结合常数
基于用自动生物传感器系统(Attana A100)测定的动力学结合数据(k结合和k解离)，计算三价和六价蛋白X和蛋白A的平衡结合常数(KD)。A100允许基于石英晶体微天平(QCM)技术来实时地研究分子间的相互作用。
为此目的，将人CD27受体固定化至羧基活化的QCM芯片的表面。随后，三价或六价蛋白X或蛋白A分别以不同浓度(例如0.5、1、2、5和10μg/ml)用作分析物，用于分析配体-受体结合(k结合)和解离(k解离)的动力学结合数据。分析是实时进行的，并且可以计算相应的KD：KD＝k解离/k结合。
QCM分析表明，三价蛋白X与相应的固定化CD27受体结合，KD在低nM范围内，预期KD为1-100nm。然而，蛋白A的六价构建体显示出与相应的固定化CD27受体的在pM范围内的较高的结合亲和力，预期KD为1–1000pM。动力学结合数据(k结合和k解离)的共同特征是与三价构建体相比，六价构建体显示更快的k结合。此外，如果与三价配体相比，六价配体通常观察到较慢的解离(k解离)。
实施例12：T细胞增殖测定
使用阴性选择和磁珠从新鲜血沉棕黄层制剂中分离原代人T细胞。将细胞加载染料CFSE，并以每孔2x10e6个细胞接种到24孔板中。将T细胞与抗人CD3抗体(克隆HIT3a，1μg/ml)、抗人CD28抗体(克隆CD28.2，5μg/ml)和不同量的CD27L激动剂(蛋白A)，10-1000ng/ml)一起孵育，或简单地留在培养基中作为对照。在37℃孵育6天后，在guava easyCyte流式细胞仪上评估所有细胞的CFSE荧光。
(表9)观察到，与培养基对照相比，仅用抗CD3和抗CD28抗体孵育的细胞松散了CFSE荧光(几何平均(GeoMean))，这表明了细胞分裂，从而稀释CFSE染料。重要的是，当细胞还与CD27L激动剂(蛋白A)一起孵育时，这种效应甚至更强且有浓度依赖性。使用几何平均(GeoMean)值可得出驱动增殖的细胞的百分比，并且清楚的是，用增殖的CD27L(蛋白A)激动剂孵育的细胞比仅用抗CD3和抗CD28抗体孵育或单独留在培养基中的细胞更强壮。
表9：蛋白A依赖性T细胞增殖测定
刺激 增殖细胞的％ 几何平均(GeoMean)(所有事件)
培养基 0,39 559,94
抗CD3+抗CD28 21,57 292,85
抗CD3+抗CD28+CD27L 10ng/ml 35,64 180,9
抗CD3+抗CD28+CD27L 100ng/ml 44,87 140,92
抗CD3+抗CD28+CD27L 1000ng/ml 50,03 137,17
实施例13：CD27激动剂结合测定
使用阴性选择和磁珠从新鲜血沉棕黄层制剂中分离原代人T细胞。将细胞以每孔2×10e6个细胞接种到24孔板中。将T细胞与抗人CD3抗体(克隆HIT3a，1μg/ml)、抗人CD28抗体(克隆CD28.2，5μg/ml)和不同量的蛋白A(CD27L，10-1000ng/ml)一起孵育，或简单地留在培养基中作为对照。在37℃下3天后，用抗人CD27和抗人CD4或抗人CD8抗体荧光标记细胞。在guava easyCyte流式细胞仪上在CD4+和CD8+T细胞群内评估CD27荧光。
当将与抗CD3和抗CD28抗体一起孵育的T细胞与单独留在培养基中的对照细胞进行比较时(表10)，人们观察到指示受体的活化诱导的下调的CD27的较低荧光信号。重要的是，当细胞与CD27激动剂(蛋白A)共孵育时，这种作用可以更强且是剂量依赖性的，这表明由CD27激动剂(蛋白A)引起的补充作用。由于激动剂模拟天然CD27配体(CD70)的受体结合结构域，所以CD27的较低表面表达可能是由于CD27激动剂(蛋白A)结合后受体内化造成的。这些结果清楚地提示CD27激动剂(蛋白A)与其受体在体外结合。
表10：CD27激动剂结合测定
Figure GDA0003553020570000611
实施例14：蛋白A对雌性C57Bl/6N小鼠的皮下同系结肠癌MC38-CEA的抗肿瘤功效
材料与方法
为了评估皮下植入的同系结肠癌模型MC38-CEA中的蛋白A的抗肿瘤功效，研究由3个实验组组成，每组含有12只5-6周龄的雌性C57B1/6N小鼠。
对所有动物将PBS中的1x106个MCE38-CEA肿瘤细胞皮下植入到动物左侧腹。肿瘤植入后8天，当原发肿瘤体积达到24.5-106.25mm3时，将36只携带肿瘤的动物随机分为3组(n＝12)。在同一天，用10ml/kg媒介物对照(PBS)，1mg/kg和10mg/kg检验化合物蛋白A开始处理。所有组的动物在第8天、12天、15天和19天静脉内(i.v)每周处理两次。该研究在第19天的最后一次施用后24小时(第20天)终止，动物被处死并进行尸检。尸检时，动物被称重并由异氟醚麻醉。通过复苏延髓静脉穿刺收集血液样品用于制备血清。之后，通过颈椎脱臼杀死动物，收集原发性肿瘤并确定湿重和肿瘤体积。此外，还收集脾脏组织用于分析。
结果
所有研究组的平均动物体重在研究过程中或保持稳定或略微增加。没有观察到大的体重减少。
蛋白A显示了原发肿瘤生长的剂量依赖性抑制。尽管1mg/kg剂量的蛋白A的肿瘤生长抑制(25.8％)是显著的，但是不具有统计学显著性。如在第20天体内测量的，10mg/kg剂量的APG 1293产生统计学显著的肿瘤生长抑制(48.2％)。
在尸检期间，切除原发肿瘤并测定肿瘤体积和湿肿瘤重量。与媒介物相比，高剂量组(10mg/kg)的湿肿瘤重量显著(P＝0.0295)降低(图9)。并且，与媒介物组相比，高剂量组的肿瘤体积也显著降低。(图10)。
结论
蛋白A在雌性C57B1/6N小鼠的皮下同系MC38-CEA结肠癌模型中显示了体内剂量依赖性抗肿瘤效力应答。
实施例15：蛋白A对雌性BALB/c小鼠的皮下同系结肠癌CT26的抗肿瘤功效
材料与方法
在雌性BALB/c小鼠的皮下植入的同系结肠癌模型CT26中，评估了蛋白A的抗肿瘤功效，研究由3个实验组组成，每组含有10只5-6周龄的雌性BALB/c小鼠。
对所有动物将细胞培养基(RPMI w/o酚红)中的5.0x105个CT26肿瘤细胞皮下植入到动物右侧腹。在第0天(肿瘤植入后第11天)，当原发肿瘤体积达到23.5mm3到132.7mm3时，将30只携带肿瘤的动物随机分为3组(n＝10)。在同一天，用10ml/kg媒介物对照(组1，PBS)，1mg/kg(组2)检验化合物蛋白A和10mg/kg(组3)检验化合物蛋白A开始处理。所有组的动物在第11天(第0天)、第15天(第4天)和第18天(第7天)静脉内(i.v)每周处理两次。在第18天的最后一次施用后72小时，即第21天(第10天)终止该研究，动物被处死并进行尸检。尸检时，动物被称重并由异氟醚麻醉。收集血液样品用于制备血清。之后，通过颈椎脱臼杀死动物，收集原发性肿瘤并测定湿重。此外，还收集脾脏组织用于分析。
结果
所有研究组的平均动物体重在研究过程中或保持稳定或略微增加(图1)。其不受用蛋白A处理的影响。
在雌性BALB/c的皮下植入的同系结肠癌CT26模型中，与媒介物对照(PBS)相比，任何剂量检验的(1mg/kg和10mg/kg)蛋白A都诱导肿瘤生长抑制。第15天(第4天)之前，在第2次蛋白A施用之后，用1mg/kg和10mg/kg蛋白A的处理对估计的肿瘤体积的作用具有可比性并且显著。如在第20天体内测量的，1mg/kg和10mg/kg剂量的蛋白A产生统计学显著的肿瘤生长抑制作用，分别为84.7％(P<0.001)和73.1％(P<0.001)。
在尸检期间，切除原发肿瘤并确定肿瘤体积和湿肿瘤重量。与媒介物相比，低剂量组(1mg/kg)的湿肿瘤重量显著降低(P＝0,0175)(图12)。并且，与媒介物组相比，高剂量组和低剂量组的肿瘤体积也显著降低(P＝0,0005和P＝0,0002)。(图11)。
结论
在雌性BALB/c的皮下植入的同系结肠癌CT26模型中，与媒介物对照(PBS)相比，1mg/kg和10mg/kg的检验剂量的蛋白A显示了高度显著的肿瘤生长抑制作用。
实施例16：CD27受体激动剂蛋白增强体内鼠抗原特异性CD8阳性T细胞克隆扩增
使用温和MACS Octo解离器(gentleMACS Octo Dissociator)(Miltenyi Biotec)从“供体”OT-1小鼠的脾脏和淋巴结中分离T细胞。将细胞重悬于PBS中并静脉注射入“接受体”C57Bl/6小鼠中。一天后(“第0天”)，给小鼠腹腔内注射5mg的鸡卵清蛋白(OVA蛋白)并静脉注射六价蛋白A(0.1mg/kg、1mg/kg或10mg/kg)、三聚体CD27配体(蛋白X)(10mg/kg)或媒介物对照。在不同的时间点，进行连续的血液收集。在最终的时间点也收集脾脏。
裂解血液和脾脏样品，并用特异性抗体和Kb/OVA四聚体(对OT-1细胞特异性的H-2Kb/SIINFEKL，Biozol-MBL)染色，并用BD Biosciences FACSCelesta BVR12通过流式细胞仪分析。Kb/OVA四聚体是小鼠MHC I类加上与CD8阳性OT-1T细胞以及任何其他OVA特异性CD8阳性T细胞的T细胞受体(TCR)特异性结合的OVA肽的复合物。数据分析使用FlowJo10.1软件(FlowJo，LLC)进行。每个样品记录和检查最少一万个CD8+T细胞，并且每组有三个重复动物。表11中列出了Kb/OVA四聚体阳性细胞(OT-1细胞)占总的CD8阳性细胞的百分比(加上平均偏差)。正如人们所期望的那样，六价CD27受体激动剂但不是三聚体激动剂增强的CD8阳性OT-1T细胞的抗原特异性克隆扩增。这证明了由CD27受体激动剂蛋白产生明确的共刺激作用。
表11：用蛋白A处理后的OVA特异性CD8阳性OT-1T细胞克隆扩增
Figure GDA0003553020570000641
实施例17.CD27受体激动剂的半衰期与N连接的碳水化合物的总数相关
分子蛋白A由通过三个链间二硫键共价连接的两个多肽组成，并且包含铰链接头中的K223G突变以及Fc区的N297S突变(根据EU编号)，导致CH2结构域的糖基化。蛋白B具有与蛋白A相同的Fc结构域布局，但接头元件(iv)更短，并且缺少N连接的糖基化共有位点。蛋白B由SEQ ID NO：47表示，但携带C末端Strep标签。蛋白C具有与蛋白B相同的布局，但在可溶性CD27L结构域(i)、(iii)和(v)中的每个中包括N63D突变。蛋白C由SEQ ID NO：43表示。蛋白D具有与蛋白C相同的布局，在可溶性CD27L结构域(i)、(iii)和(v)中的每个中包括N63D突变，但蛋白D具有N末端缩短的可溶性CD27L结构域。蛋白D由SEQ ID NO：45表示。
因此，由于成熟蛋白由两个共价连接的多肽组成，蛋白A包含16个N连接的碳水化合物，蛋白B包含14个N连接的碳水化合物，且蛋白C和蛋白D两者总共包括8个N连接的碳水化合物。检验纯化的蛋白A、蛋白B、蛋白C和蛋白D关于它们在小鼠中的半衰期。
雌性CD1小鼠用10mg/kg的蛋白A或蛋白B或蛋白C或蛋白D作为单次静脉团注注射施用。在应用前(给药前)收集全血以及检验项目施用后最长达312小时收集。制备血清并将样品储存在-80℃直至测定血清浓度。
使用检测CD27激动剂的ELISA测定对小鼠血清中的蛋白A/蛋白B/蛋白C或蛋白D浓度进行定量，示出于表8中。
板用CD27-Fc包被。然后通过使用StrepTactin-HRP的Strep标签来检测特异性结合到其受体CD27的CD27-配体构建体。使用参考蛋白A、蛋白B、蛋白C或蛋白D作为校准和对照样品进行ELISA测定。使用标准浓度的测量数据以创建使用5参数拟合的校准曲线。这使得能够测定相应小鼠血清样品中未知的蛋白A、蛋白B、蛋白C或蛋白D浓度。
使用平均血清浓度和用于非区室药物代谢动力学数据分析(Summit ResearchServices，Montrose，CO)的药物代谢动力学评估程序PK Solutions2.0版来计算药物代谢动力学参数。PK Solutions是基于Excel的自动化应用程序，其电脑计算来自浓度-时间数据的药物代谢动力学参数，该浓度-时间数据是分析例如静脉内的或血管外的途径施用之后的生物样品而获得的。PK Solutions计算结果时不会假定任何特定的分区模型。
表12中总结了药物代谢动力学评估的结果。
表12：CD1小鼠中探索性PK研究的结果：10mg/kg蛋白A、蛋白B、蛋白C和蛋白D的单次静脉内剂量。
Figure GDA0003553020570000661
结果显示，在小鼠中蛋白A、蛋白B、蛋白C和蛋白D具有14.5小时、20.3小时、26.6小时和31.2小时的不同的半衰期。半衰期与N连接的碳水化合物的总数成负相关。具有8个N连接的碳水化合物但包括N末端缩短的CD27L结构域(i)、(iii)和(v)的CD27受体激动剂(蛋白D)证实了用蛋白C获得的数据。观察到的短暂的半衰期构成了有利的治疗选择，因为需要用CD27受体激动剂蛋白的短暂共刺激刺激。
序列表
<110> 阿珀吉科吉尼科斯股份公司（Apogenix AG）
<120> 单链CD27受体激动剂蛋白
<130> PN18017044P
<160> 47
<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 193
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> CD27配体 (wt)
<400> 1
Met Pro Glu Glu Gly Ser Gly Cys Ser Val Arg Arg Arg Pro Tyr Gly
1 5 10 15
Cys Val Leu Arg Ala Ala Leu Val Pro Leu Val Ala Gly Leu Val Ile
20 25 30
Cys Leu Val Val Cys Ile Gln Arg Phe Ala Gln Ala Gln Gln Gln Leu
35 40 45
Pro Leu Glu Ser Leu Gly Trp Asp Val Ala Glu Leu Gln Leu Asn His
50 55 60
Thr Gly Pro Gln Gln Asp Pro Arg Leu Tyr Trp Gln Gly Gly Pro Ala
65 70 75 80
Leu Gly Arg Ser Phe Leu His Gly Pro Glu Leu Asp Lys Gly Gln Leu
85 90 95
Arg Ile His Arg Asp Gly Ile Tyr Met Val His Ile Gln Val Thr Leu
100 105 110
Ala Ile Cys Ser Ser Thr Thr Ala Ser Arg His His Pro Thr Thr Leu
115 120 125
Ala Val Gly Ile Cys Ser Pro Ala Ser Arg Ser Ile Ser Leu Leu Arg
130 135 140
Leu Ser Phe His Gln Gly Cys Thr Ile Ala Ser Gln Arg Leu Thr Pro
145 150 155 160
Leu Ala Arg Gly Asp Thr Leu Cys Thr Asn Leu Thr Gly Thr Leu Leu
165 170 175
Pro Ser Arg Asn Thr Asp Glu Thr Phe Phe Gly Val Gln Trp Val Arg
180 185 190
Pro
<210> 2
<211> 8
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 接头
<400> 2
Gly Ser Gly Ser Gly Asn Gly Ser
1 5
<210> 3
<211> 8
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 接头
<400> 3
Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser
1 5
<210> 4
<211> 8
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 接头
<400> 4
Gly Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1 5
<210> 5
<211> 6
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 接头
<400> 5
Gly Gly Ser Gly Ser Gly
1 5
<210> 6
<211> 4
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 接头
<400> 6
Gly Gly Ser Gly
1
<210> 7
<211> 8
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 接头
<400> 7
Gly Gly Ser Gly Asn Gly Ser Gly
1 5
<210> 8
<211> 8
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 接头
<400> 8
Gly Gly Asn Gly Ser Gly Ser Gly
1 5
<210> 9
<211> 6
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 接头
<400> 9
Gly Gly Asn Gly Ser Gly
1 5
<210> 10
<211> 6
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 接头
<400> 10
Gly Ser Gly Ser Gly Ser
1 5
<210> 11
<211> 4
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 接头
<400> 11
Gly Ser Gly Ser
1
<210> 12
<211> 3
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 接头
<400> 12
Gly Ser Gly
1
<210> 13
<211> 218
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 人IGG1 Fc N297S
<400> 13
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
1 5 10 15
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
20 25 30
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
35 40 45
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
50 55 60
Glu Gln Tyr Ser Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
65 70 75 80
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
85 90 95
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
100 105 110
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
115 120 125
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
130 135 140
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
145 150 155 160
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
165 170 175
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
180 185 190
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
195 200 205
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215
<210> 14
<211> 217
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 人 IGG1 Fc (wt)
<400> 14
Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
165 170 175
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215
<210> 15
<211> 718
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 蛋白A (融合至去糖基化（deglyco）Fc的CD27L)
<400> 15
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Val Phe Val Leu Leu Val Trp Val Pro
1 5 10 15
Ala Gly Asn Gly Glu Ser Leu Gly Trp Asp Val Ala Glu Leu Gln Leu
20 25 30
Asn His Thr Gly Pro Gln Gln Asp Pro Arg Leu Tyr Trp Gln Gly Gly
35 40 45
Pro Ala Leu Gly Arg Ser Phe Leu His Gly Pro Glu Leu Asp Lys Gly
50 55 60
Gln Leu Arg Ile His Arg Asp Gly Ile Tyr Met Val His Ile Gln Val
65 70 75 80
Thr Leu Ala Ile Cys Ser Ser Thr Thr Ala Ser Arg His His Pro Thr
85 90 95
Thr Leu Ala Val Gly Ile Cys Ser Pro Ala Ser Arg Ser Ile Ser Leu
100 105 110
Leu Arg Leu Ser Phe His Gln Gly Cys Thr Ile Ala Ser Gln Arg Leu
115 120 125
Thr Pro Leu Ala Arg Gly Asp Thr Leu Cys Thr Asn Leu Thr Gly Thr
130 135 140
Leu Leu Pro Ser Arg Asn Thr Asp Glu Thr Phe Phe Gly Val Gln Trp
145 150 155 160
Val Arg Pro Gly Ser Gly Ser Gly Asn Gly Ser Glu Ser Leu Gly Trp
165 170 175
Asp Val Ala Glu Leu Gln Leu Asn His Thr Gly Pro Gln Gln Asp Pro
180 185 190
Arg Leu Tyr Trp Gln Gly Gly Pro Ala Leu Gly Arg Ser Phe Leu His
195 200 205
Gly Pro Glu Leu Asp Lys Gly Gln Leu Arg Ile His Arg Asp Gly Ile
210 215 220
Tyr Met Val His Ile Gln Val Thr Leu Ala Ile Cys Ser Ser Thr Thr
225 230 235 240
Ala Ser Arg His His Pro Thr Thr Leu Ala Val Gly Ile Cys Ser Pro
245 250 255
Ala Ser Arg Ser Ile Ser Leu Leu Arg Leu Ser Phe His Gln Gly Cys
260 265 270
Thr Ile Ala Ser Gln Arg Leu Thr Pro Leu Ala Arg Gly Asp Thr Leu
275 280 285
Cys Thr Asn Leu Thr Gly Thr Leu Leu Pro Ser Arg Asn Thr Asp Glu
290 295 300
Thr Phe Phe Gly Val Gln Trp Val Arg Pro Gly Ser Gly Ser Gly Asn
305 310 315 320
Gly Ser Glu Ser Leu Gly Trp Asp Val Ala Glu Leu Gln Leu Asn His
325 330 335
Thr Gly Pro Gln Gln Asp Pro Arg Leu Tyr Trp Gln Gly Gly Pro Ala
340 345 350
Leu Gly Arg Ser Phe Leu His Gly Pro Glu Leu Asp Lys Gly Gln Leu
355 360 365
Arg Ile His Arg Asp Gly Ile Tyr Met Val His Ile Gln Val Thr Leu
370 375 380
Ala Ile Cys Ser Ser Thr Thr Ala Ser Arg His His Pro Thr Thr Leu
385 390 395 400
Ala Val Gly Ile Cys Ser Pro Ala Ser Arg Ser Ile Ser Leu Leu Arg
405 410 415
Leu Ser Phe His Gln Gly Cys Thr Ile Ala Ser Gln Arg Leu Thr Pro
420 425 430
Leu Ala Arg Gly Asp Thr Leu Cys Thr Asn Leu Thr Gly Thr Leu Leu
435 440 445
Pro Ser Arg Asn Thr Asp Glu Thr Phe Phe Gly Val Gln Trp Val Arg
450 455 460
Pro Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Gly Ser Cys Asp Lys Thr
465 470 475 480
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
485 490 495
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
500 505 510
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
515 520 525
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
530 535 540
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ser Ser Thr Tyr Arg Val Val
545 550 555 560
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
565 570 575
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
580 585 590
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
595 600 605
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
610 615 620
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
625 630 635 640
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
645 650 655
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
660 665 670
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
675 680 685
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Ser
690 695 700
Ser Ser Ser Ser Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
705 710 715
<210> 16
<211> 21
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 铰链接头
<400> 16
Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Gly Ser Cys Asp Lys Thr His
1 5 10 15
Thr Cys Pro Pro Cys
20
<210> 17
<211> 20
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 通用信号肽
<400> 17
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Val Phe Val Leu Leu Val Trp Val Pro
1 5 10 15
Ala Gly Asn Gly
20
<210> 18
<211> 15
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 带有strep标签的丝氨酸接头
<400> 18
Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
1 5 10 15
<210> 19
<211> 20
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 铰链接头
<400> 19
Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Gly Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
1 5 10 15
Cys Pro Pro Cys
20
<210> 20
<211> 19
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 铰链接头
<400> 20
Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser Gly Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
1 5 10 15
Pro Pro Cys
<210> 21
<211> 18
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 铰链接头
<400> 21
Gly Ser Ser Ser Ser Ser Gly Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
1 5 10 15
Pro Cys
<210> 22
<211> 16
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 铰链接头
<400> 22
Gly Ser Ser Ser Gly Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
1 5 10 15
<210> 23
<211> 18
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 铰链接头
<400> 23
Gly Ser Ser Ser Gly Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
1 5 10 15
Gly Ser
<210> 24
<211> 20
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 铰链接头
<400> 24
Gly Ser Ser Ser Gly Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
1 5 10 15
Gly Ser Gly Ser
20
<210> 25
<211> 704
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 蛋白A - 无strep标签
<400> 25
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Val Phe Val Leu Leu Val Trp Val Pro
1 5 10 15
Ala Gly Asn Gly Glu Ser Leu Gly Trp Asp Val Ala Glu Leu Gln Leu
20 25 30
Asn His Thr Gly Pro Gln Gln Asp Pro Arg Leu Tyr Trp Gln Gly Gly
35 40 45
Pro Ala Leu Gly Arg Ser Phe Leu His Gly Pro Glu Leu Asp Lys Gly
50 55 60
Gln Leu Arg Ile His Arg Asp Gly Ile Tyr Met Val His Ile Gln Val
65 70 75 80
Thr Leu Ala Ile Cys Ser Ser Thr Thr Ala Ser Arg His His Pro Thr
85 90 95
Thr Leu Ala Val Gly Ile Cys Ser Pro Ala Ser Arg Ser Ile Ser Leu
100 105 110
Leu Arg Leu Ser Phe His Gln Gly Cys Thr Ile Ala Ser Gln Arg Leu
115 120 125
Thr Pro Leu Ala Arg Gly Asp Thr Leu Cys Thr Asn Leu Thr Gly Thr
130 135 140
Leu Leu Pro Ser Arg Asn Thr Asp Glu Thr Phe Phe Gly Val Gln Trp
145 150 155 160
Val Arg Pro Gly Ser Gly Ser Gly Asn Gly Ser Glu Ser Leu Gly Trp
165 170 175
Asp Val Ala Glu Leu Gln Leu Asn His Thr Gly Pro Gln Gln Asp Pro
180 185 190
Arg Leu Tyr Trp Gln Gly Gly Pro Ala Leu Gly Arg Ser Phe Leu His
195 200 205
Gly Pro Glu Leu Asp Lys Gly Gln Leu Arg Ile His Arg Asp Gly Ile
210 215 220
Tyr Met Val His Ile Gln Val Thr Leu Ala Ile Cys Ser Ser Thr Thr
225 230 235 240
Ala Ser Arg His His Pro Thr Thr Leu Ala Val Gly Ile Cys Ser Pro
245 250 255
Ala Ser Arg Ser Ile Ser Leu Leu Arg Leu Ser Phe His Gln Gly Cys
260 265 270
Thr Ile Ala Ser Gln Arg Leu Thr Pro Leu Ala Arg Gly Asp Thr Leu
275 280 285
Cys Thr Asn Leu Thr Gly Thr Leu Leu Pro Ser Arg Asn Thr Asp Glu
290 295 300
Thr Phe Phe Gly Val Gln Trp Val Arg Pro Gly Ser Gly Ser Gly Asn
305 310 315 320
Gly Ser Glu Ser Leu Gly Trp Asp Val Ala Glu Leu Gln Leu Asn His
325 330 335
Thr Gly Pro Gln Gln Asp Pro Arg Leu Tyr Trp Gln Gly Gly Pro Ala
340 345 350
Leu Gly Arg Ser Phe Leu His Gly Pro Glu Leu Asp Lys Gly Gln Leu
355 360 365
Arg Ile His Arg Asp Gly Ile Tyr Met Val His Ile Gln Val Thr Leu
370 375 380
Ala Ile Cys Ser Ser Thr Thr Ala Ser Arg His His Pro Thr Thr Leu
385 390 395 400
Ala Val Gly Ile Cys Ser Pro Ala Ser Arg Ser Ile Ser Leu Leu Arg
405 410 415
Leu Ser Phe His Gln Gly Cys Thr Ile Ala Ser Gln Arg Leu Thr Pro
420 425 430
Leu Ala Arg Gly Asp Thr Leu Cys Thr Asn Leu Thr Gly Thr Leu Leu
435 440 445
Pro Ser Arg Asn Thr Asp Glu Thr Phe Phe Gly Val Gln Trp Val Arg
450 455 460
Pro Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Gly Ser Cys Asp Lys Thr
465 470 475 480
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
485 490 495
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
500 505 510
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
515 520 525
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
530 535 540
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ser Ser Thr Tyr Arg Val Val
545 550 555 560
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
565 570 575
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
580 585 590
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
595 600 605
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
610 615 620
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
625 630 635 640
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
645 650 655
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
660 665 670
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
675 680 685
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
690 695 700
<210> 26
<211> 703
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 融合至SEQ_14的CD27L-wt
<400> 26
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Val Phe Val Leu Leu Val Trp Val Pro
1 5 10 15
Ala Gly Asn Gly Glu Ser Leu Gly Trp Asp Val Ala Glu Leu Gln Leu
20 25 30
Asn His Thr Gly Pro Gln Gln Asp Pro Arg Leu Tyr Trp Gln Gly Gly
35 40 45
Pro Ala Leu Gly Arg Ser Phe Leu His Gly Pro Glu Leu Asp Lys Gly
50 55 60
Gln Leu Arg Ile His Arg Asp Gly Ile Tyr Met Val His Ile Gln Val
65 70 75 80
Thr Leu Ala Ile Cys Ser Ser Thr Thr Ala Ser Arg His His Pro Thr
85 90 95
Thr Leu Ala Val Gly Ile Cys Ser Pro Ala Ser Arg Ser Ile Ser Leu
100 105 110
Leu Arg Leu Ser Phe His Gln Gly Cys Thr Ile Ala Ser Gln Arg Leu
115 120 125
Thr Pro Leu Ala Arg Gly Asp Thr Leu Cys Thr Asn Leu Thr Gly Thr
130 135 140
Leu Leu Pro Ser Arg Asn Thr Asp Glu Thr Phe Phe Gly Val Gln Trp
145 150 155 160
Val Arg Pro Gly Ser Gly Ser Gly Asn Gly Ser Glu Ser Leu Gly Trp
165 170 175
Asp Val Ala Glu Leu Gln Leu Asn His Thr Gly Pro Gln Gln Asp Pro
180 185 190
Arg Leu Tyr Trp Gln Gly Gly Pro Ala Leu Gly Arg Ser Phe Leu His
195 200 205
Gly Pro Glu Leu Asp Lys Gly Gln Leu Arg Ile His Arg Asp Gly Ile
210 215 220
Tyr Met Val His Ile Gln Val Thr Leu Ala Ile Cys Ser Ser Thr Thr
225 230 235 240
Ala Ser Arg His His Pro Thr Thr Leu Ala Val Gly Ile Cys Ser Pro
245 250 255
Ala Ser Arg Ser Ile Ser Leu Leu Arg Leu Ser Phe His Gln Gly Cys
260 265 270
Thr Ile Ala Ser Gln Arg Leu Thr Pro Leu Ala Arg Gly Asp Thr Leu
275 280 285
Cys Thr Asn Leu Thr Gly Thr Leu Leu Pro Ser Arg Asn Thr Asp Glu
290 295 300
Thr Phe Phe Gly Val Gln Trp Val Arg Pro Gly Ser Gly Ser Gly Asn
305 310 315 320
Gly Ser Glu Ser Leu Gly Trp Asp Val Ala Glu Leu Gln Leu Asn His
325 330 335
Thr Gly Pro Gln Gln Asp Pro Arg Leu Tyr Trp Gln Gly Gly Pro Ala
340 345 350
Leu Gly Arg Ser Phe Leu His Gly Pro Glu Leu Asp Lys Gly Gln Leu
355 360 365
Arg Ile His Arg Asp Gly Ile Tyr Met Val His Ile Gln Val Thr Leu
370 375 380
Ala Ile Cys Ser Ser Thr Thr Ala Ser Arg His His Pro Thr Thr Leu
385 390 395 400
Ala Val Gly Ile Cys Ser Pro Ala Ser Arg Ser Ile Ser Leu Leu Arg
405 410 415
Leu Ser Phe His Gln Gly Cys Thr Ile Ala Ser Gln Arg Leu Thr Pro
420 425 430
Leu Ala Arg Gly Asp Thr Leu Cys Thr Asn Leu Thr Gly Thr Leu Leu
435 440 445
Pro Ser Arg Asn Thr Asp Glu Thr Phe Phe Gly Val Gln Trp Val Arg
450 455 460
Pro Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Gly Ser Cys Asp Lys Thr
465 470 475 480
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val
485 490 495
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
500 505 510
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
515 520 525
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
530 535 540
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
545 550 555 560
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
565 570 575
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
580 585 590
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
595 600 605
Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
610 615 620
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
625 630 635 640
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
645 650 655
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
660 665 670
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
675 680 685
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
690 695 700
<210> 27
<211> 684
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 融合至SEQ_13 的CD27L-wt(无信号肽、无strep标签)
<400> 27
Glu Ser Leu Gly Trp Asp Val Ala Glu Leu Gln Leu Asn His Thr Gly
1 5 10 15
Pro Gln Gln Asp Pro Arg Leu Tyr Trp Gln Gly Gly Pro Ala Leu Gly
20 25 30
Arg Ser Phe Leu His Gly Pro Glu Leu Asp Lys Gly Gln Leu Arg Ile
35 40 45
His Arg Asp Gly Ile Tyr Met Val His Ile Gln Val Thr Leu Ala Ile
50 55 60
Cys Ser Ser Thr Thr Ala Ser Arg His His Pro Thr Thr Leu Ala Val
65 70 75 80
Gly Ile Cys Ser Pro Ala Ser Arg Ser Ile Ser Leu Leu Arg Leu Ser
85 90 95
Phe His Gln Gly Cys Thr Ile Ala Ser Gln Arg Leu Thr Pro Leu Ala
100 105 110
Arg Gly Asp Thr Leu Cys Thr Asn Leu Thr Gly Thr Leu Leu Pro Ser
115 120 125
Arg Asn Thr Asp Glu Thr Phe Phe Gly Val Gln Trp Val Arg Pro Gly
130 135 140
Ser Gly Ser Gly Asn Gly Ser Glu Ser Leu Gly Trp Asp Val Ala Glu
145 150 155 160
Leu Gln Leu Asn His Thr Gly Pro Gln Gln Asp Pro Arg Leu Tyr Trp
165 170 175
Gln Gly Gly Pro Ala Leu Gly Arg Ser Phe Leu His Gly Pro Glu Leu
180 185 190
Asp Lys Gly Gln Leu Arg Ile His Arg Asp Gly Ile Tyr Met Val His
195 200 205
Ile Gln Val Thr Leu Ala Ile Cys Ser Ser Thr Thr Ala Ser Arg His
210 215 220
His Pro Thr Thr Leu Ala Val Gly Ile Cys Ser Pro Ala Ser Arg Ser
225 230 235 240
Ile Ser Leu Leu Arg Leu Ser Phe His Gln Gly Cys Thr Ile Ala Ser
245 250 255
Gln Arg Leu Thr Pro Leu Ala Arg Gly Asp Thr Leu Cys Thr Asn Leu
260 265 270
Thr Gly Thr Leu Leu Pro Ser Arg Asn Thr Asp Glu Thr Phe Phe Gly
275 280 285
Val Gln Trp Val Arg Pro Gly Ser Gly Ser Gly Asn Gly Ser Glu Ser
290 295 300
Leu Gly Trp Asp Val Ala Glu Leu Gln Leu Asn His Thr Gly Pro Gln
305 310 315 320
Gln Asp Pro Arg Leu Tyr Trp Gln Gly Gly Pro Ala Leu Gly Arg Ser
325 330 335
Phe Leu His Gly Pro Glu Leu Asp Lys Gly Gln Leu Arg Ile His Arg
340 345 350
Asp Gly Ile Tyr Met Val His Ile Gln Val Thr Leu Ala Ile Cys Ser
355 360 365
Ser Thr Thr Ala Ser Arg His His Pro Thr Thr Leu Ala Val Gly Ile
370 375 380
Cys Ser Pro Ala Ser Arg Ser Ile Ser Leu Leu Arg Leu Ser Phe His
385 390 395 400
Gln Gly Cys Thr Ile Ala Ser Gln Arg Leu Thr Pro Leu Ala Arg Gly
405 410 415
Asp Thr Leu Cys Thr Asn Leu Thr Gly Thr Leu Leu Pro Ser Arg Asn
420 425 430
Thr Asp Glu Thr Phe Phe Gly Val Gln Trp Val Arg Pro Gly Ser Ser
435 440 445
Ser Ser Ser Ser Ser Ser Gly Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
450 455 460
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
465 470 475 480
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
485 490 495
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
500 505 510
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
515 520 525
Arg Glu Glu Gln Tyr Ser Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
530 535 540
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
545 550 555 560
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
565 570 575
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
580 585 590
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
595 600 605
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
610 615 620
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
625 630 635 640
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
645 650 655
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
660 665 670
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
675 680
<210> 28
<211> 698
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 融合至SEQ_13的CD27L-wt(包括strep标签)
<400> 28
Glu Ser Leu Gly Trp Asp Val Ala Glu Leu Gln Leu Asn His Thr Gly
1 5 10 15
Pro Gln Gln Asp Pro Arg Leu Tyr Trp Gln Gly Gly Pro Ala Leu Gly
20 25 30
Arg Ser Phe Leu His Gly Pro Glu Leu Asp Lys Gly Gln Leu Arg Ile
35 40 45
His Arg Asp Gly Ile Tyr Met Val His Ile Gln Val Thr Leu Ala Ile
50 55 60
Cys Ser Ser Thr Thr Ala Ser Arg His His Pro Thr Thr Leu Ala Val
65 70 75 80
Gly Ile Cys Ser Pro Ala Ser Arg Ser Ile Ser Leu Leu Arg Leu Ser
85 90 95
Phe His Gln Gly Cys Thr Ile Ala Ser Gln Arg Leu Thr Pro Leu Ala
100 105 110
Arg Gly Asp Thr Leu Cys Thr Asn Leu Thr Gly Thr Leu Leu Pro Ser
115 120 125
Arg Asn Thr Asp Glu Thr Phe Phe Gly Val Gln Trp Val Arg Pro Gly
130 135 140
Ser Gly Ser Gly Asn Gly Ser Glu Ser Leu Gly Trp Asp Val Ala Glu
145 150 155 160
Leu Gln Leu Asn His Thr Gly Pro Gln Gln Asp Pro Arg Leu Tyr Trp
165 170 175
Gln Gly Gly Pro Ala Leu Gly Arg Ser Phe Leu His Gly Pro Glu Leu
180 185 190
Asp Lys Gly Gln Leu Arg Ile His Arg Asp Gly Ile Tyr Met Val His
195 200 205
Ile Gln Val Thr Leu Ala Ile Cys Ser Ser Thr Thr Ala Ser Arg His
210 215 220
His Pro Thr Thr Leu Ala Val Gly Ile Cys Ser Pro Ala Ser Arg Ser
225 230 235 240
Ile Ser Leu Leu Arg Leu Ser Phe His Gln Gly Cys Thr Ile Ala Ser
245 250 255
Gln Arg Leu Thr Pro Leu Ala Arg Gly Asp Thr Leu Cys Thr Asn Leu
260 265 270
Thr Gly Thr Leu Leu Pro Ser Arg Asn Thr Asp Glu Thr Phe Phe Gly
275 280 285
Val Gln Trp Val Arg Pro Gly Ser Gly Ser Gly Asn Gly Ser Glu Ser
290 295 300
Leu Gly Trp Asp Val Ala Glu Leu Gln Leu Asn His Thr Gly Pro Gln
305 310 315 320
Gln Asp Pro Arg Leu Tyr Trp Gln Gly Gly Pro Ala Leu Gly Arg Ser
325 330 335
Phe Leu His Gly Pro Glu Leu Asp Lys Gly Gln Leu Arg Ile His Arg
340 345 350
Asp Gly Ile Tyr Met Val His Ile Gln Val Thr Leu Ala Ile Cys Ser
355 360 365
Ser Thr Thr Ala Ser Arg His His Pro Thr Thr Leu Ala Val Gly Ile
370 375 380
Cys Ser Pro Ala Ser Arg Ser Ile Ser Leu Leu Arg Leu Ser Phe His
385 390 395 400
Gln Gly Cys Thr Ile Ala Ser Gln Arg Leu Thr Pro Leu Ala Arg Gly
405 410 415
Asp Thr Leu Cys Thr Asn Leu Thr Gly Thr Leu Leu Pro Ser Arg Asn
420 425 430
Thr Asp Glu Thr Phe Phe Gly Val Gln Trp Val Arg Pro Gly Ser Ser
435 440 445
Ser Ser Ser Ser Ser Ser Gly Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
450 455 460
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
465 470 475 480
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
485 490 495
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
500 505 510
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
515 520 525
Arg Glu Glu Gln Tyr Ser Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
530 535 540
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
545 550 555 560
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
565 570 575
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
580 585 590
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
595 600 605
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
610 615 620
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
625 630 635 640
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
645 650 655
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
660 665 670
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Ser Ser Ser Ser Ser
675 680 685
Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
690 695
<210> 29
<211> 683
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 融合至SEQ_14的CD27L-wt(无信号肽、无strep标签)
<400> 29
Glu Ser Leu Gly Trp Asp Val Ala Glu Leu Gln Leu Asn His Thr Gly
1 5 10 15
Pro Gln Gln Asp Pro Arg Leu Tyr Trp Gln Gly Gly Pro Ala Leu Gly
20 25 30
Arg Ser Phe Leu His Gly Pro Glu Leu Asp Lys Gly Gln Leu Arg Ile
35 40 45
His Arg Asp Gly Ile Tyr Met Val His Ile Gln Val Thr Leu Ala Ile
50 55 60
Cys Ser Ser Thr Thr Ala Ser Arg His His Pro Thr Thr Leu Ala Val
65 70 75 80
Gly Ile Cys Ser Pro Ala Ser Arg Ser Ile Ser Leu Leu Arg Leu Ser
85 90 95
Phe His Gln Gly Cys Thr Ile Ala Ser Gln Arg Leu Thr Pro Leu Ala
100 105 110
Arg Gly Asp Thr Leu Cys Thr Asn Leu Thr Gly Thr Leu Leu Pro Ser
115 120 125
Arg Asn Thr Asp Glu Thr Phe Phe Gly Val Gln Trp Val Arg Pro Gly
130 135 140
Ser Gly Ser Gly Asn Gly Ser Glu Ser Leu Gly Trp Asp Val Ala Glu
145 150 155 160
Leu Gln Leu Asn His Thr Gly Pro Gln Gln Asp Pro Arg Leu Tyr Trp
165 170 175
Gln Gly Gly Pro Ala Leu Gly Arg Ser Phe Leu His Gly Pro Glu Leu
180 185 190
Asp Lys Gly Gln Leu Arg Ile His Arg Asp Gly Ile Tyr Met Val His
195 200 205
Ile Gln Val Thr Leu Ala Ile Cys Ser Ser Thr Thr Ala Ser Arg His
210 215 220
His Pro Thr Thr Leu Ala Val Gly Ile Cys Ser Pro Ala Ser Arg Ser
225 230 235 240
Ile Ser Leu Leu Arg Leu Ser Phe His Gln Gly Cys Thr Ile Ala Ser
245 250 255
Gln Arg Leu Thr Pro Leu Ala Arg Gly Asp Thr Leu Cys Thr Asn Leu
260 265 270
Thr Gly Thr Leu Leu Pro Ser Arg Asn Thr Asp Glu Thr Phe Phe Gly
275 280 285
Val Gln Trp Val Arg Pro Gly Ser Gly Ser Gly Asn Gly Ser Glu Ser
290 295 300
Leu Gly Trp Asp Val Ala Glu Leu Gln Leu Asn His Thr Gly Pro Gln
305 310 315 320
Gln Asp Pro Arg Leu Tyr Trp Gln Gly Gly Pro Ala Leu Gly Arg Ser
325 330 335
Phe Leu His Gly Pro Glu Leu Asp Lys Gly Gln Leu Arg Ile His Arg
340 345 350
Asp Gly Ile Tyr Met Val His Ile Gln Val Thr Leu Ala Ile Cys Ser
355 360 365
Ser Thr Thr Ala Ser Arg His His Pro Thr Thr Leu Ala Val Gly Ile
370 375 380
Cys Ser Pro Ala Ser Arg Ser Ile Ser Leu Leu Arg Leu Ser Phe His
385 390 395 400
Gln Gly Cys Thr Ile Ala Ser Gln Arg Leu Thr Pro Leu Ala Arg Gly
405 410 415
Asp Thr Leu Cys Thr Asn Leu Thr Gly Thr Leu Leu Pro Ser Arg Asn
420 425 430
Thr Asp Glu Thr Phe Phe Gly Val Gln Trp Val Arg Pro Gly Ser Ser
435 440 445
Ser Ser Ser Ser Ser Ser Gly Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
450 455 460
Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
465 470 475 480
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
485 490 495
Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn
500 505 510
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
515 520 525
Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
530 535 540
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
545 550 555 560
Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
565 570 575
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu
580 585 590
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
595 600 605
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
610 615 620
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
625 630 635 640
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
645 650 655
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
660 665 670
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
675 680
<210> 30
<211> 684
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 具有AA交换(SEQ_1的E51Q)的SEQ_27
<400> 30
Gln Ser Leu Gly Trp Asp Val Ala Glu Leu Gln Leu Asn His Thr Gly
1 5 10 15
Pro Gln Gln Asp Pro Arg Leu Tyr Trp Gln Gly Gly Pro Ala Leu Gly
20 25 30
Arg Ser Phe Leu His Gly Pro Glu Leu Asp Lys Gly Gln Leu Arg Ile
35 40 45
His Arg Asp Gly Ile Tyr Met Val His Ile Gln Val Thr Leu Ala Ile
50 55 60
Cys Ser Ser Thr Thr Ala Ser Arg His His Pro Thr Thr Leu Ala Val
65 70 75 80
Gly Ile Cys Ser Pro Ala Ser Arg Ser Ile Ser Leu Leu Arg Leu Ser
85 90 95
Phe His Gln Gly Cys Thr Ile Ala Ser Gln Arg Leu Thr Pro Leu Ala
100 105 110
Arg Gly Asp Thr Leu Cys Thr Asn Leu Thr Gly Thr Leu Leu Pro Ser
115 120 125
Arg Asn Thr Asp Glu Thr Phe Phe Gly Val Gln Trp Val Arg Pro Gly
130 135 140
Ser Gly Ser Gly Asn Gly Ser Glu Ser Leu Gly Trp Asp Val Ala Glu
145 150 155 160
Leu Gln Leu Asn His Thr Gly Pro Gln Gln Asp Pro Arg Leu Tyr Trp
165 170 175
Gln Gly Gly Pro Ala Leu Gly Arg Ser Phe Leu His Gly Pro Glu Leu
180 185 190
Asp Lys Gly Gln Leu Arg Ile His Arg Asp Gly Ile Tyr Met Val His
195 200 205
Ile Gln Val Thr Leu Ala Ile Cys Ser Ser Thr Thr Ala Ser Arg His
210 215 220
His Pro Thr Thr Leu Ala Val Gly Ile Cys Ser Pro Ala Ser Arg Ser
225 230 235 240
Ile Ser Leu Leu Arg Leu Ser Phe His Gln Gly Cys Thr Ile Ala Ser
245 250 255
Gln Arg Leu Thr Pro Leu Ala Arg Gly Asp Thr Leu Cys Thr Asn Leu
260 265 270
Thr Gly Thr Leu Leu Pro Ser Arg Asn Thr Asp Glu Thr Phe Phe Gly
275 280 285
Val Gln Trp Val Arg Pro Gly Ser Gly Ser Gly Asn Gly Ser Glu Ser
290 295 300
Leu Gly Trp Asp Val Ala Glu Leu Gln Leu Asn His Thr Gly Pro Gln
305 310 315 320
Gln Asp Pro Arg Leu Tyr Trp Gln Gly Gly Pro Ala Leu Gly Arg Ser
325 330 335
Phe Leu His Gly Pro Glu Leu Asp Lys Gly Gln Leu Arg Ile His Arg
340 345 350
Asp Gly Ile Tyr Met Val His Ile Gln Val Thr Leu Ala Ile Cys Ser
355 360 365
Ser Thr Thr Ala Ser Arg His His Pro Thr Thr Leu Ala Val Gly Ile
370 375 380
Cys Ser Pro Ala Ser Arg Ser Ile Ser Leu Leu Arg Leu Ser Phe His
385 390 395 400
Gln Gly Cys Thr Ile Ala Ser Gln Arg Leu Thr Pro Leu Ala Arg Gly
405 410 415
Asp Thr Leu Cys Thr Asn Leu Thr Gly Thr Leu Leu Pro Ser Arg Asn
420 425 430
Thr Asp Glu Thr Phe Phe Gly Val Gln Trp Val Arg Pro Gly Ser Ser
435 440 445
Ser Ser Ser Ser Ser Ser Gly Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
450 455 460
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
465 470 475 480
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
485 490 495
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
500 505 510
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
515 520 525
Arg Glu Glu Gln Tyr Ser Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
530 535 540
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
545 550 555 560
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
565 570 575
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
580 585 590
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
595 600 605
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
610 615 620
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
625 630 635 640
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
645 650 655
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
660 665 670
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
675 680
<210> 31
<211> 680
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 具有改变的接头序列的Seq_30
<400> 31
Gln Ser Leu Gly Trp Asp Val Ala Glu Leu Gln Leu Asn His Thr Gly
1 5 10 15
Pro Gln Gln Asp Pro Arg Leu Tyr Trp Gln Gly Gly Pro Ala Leu Gly
20 25 30
Arg Ser Phe Leu His Gly Pro Glu Leu Asp Lys Gly Gln Leu Arg Ile
35 40 45
His Arg Asp Gly Ile Tyr Met Val His Ile Gln Val Thr Leu Ala Ile
50 55 60
Cys Ser Ser Thr Thr Ala Ser Arg His His Pro Thr Thr Leu Ala Val
65 70 75 80
Gly Ile Cys Ser Pro Ala Ser Arg Ser Ile Ser Leu Leu Arg Leu Ser
85 90 95
Phe His Gln Gly Cys Thr Ile Ala Ser Gln Arg Leu Thr Pro Leu Ala
100 105 110
Arg Gly Asp Thr Leu Cys Thr Asn Leu Thr Gly Thr Leu Leu Pro Ser
115 120 125
Arg Asn Thr Asp Glu Thr Phe Phe Gly Val Gln Trp Val Arg Pro Gly
130 135 140
Ser Gly Ser Gly Asn Gly Ser Glu Ser Leu Gly Trp Asp Val Ala Glu
145 150 155 160
Leu Gln Leu Asn His Thr Gly Pro Gln Gln Asp Pro Arg Leu Tyr Trp
165 170 175
Gln Gly Gly Pro Ala Leu Gly Arg Ser Phe Leu His Gly Pro Glu Leu
180 185 190
Asp Lys Gly Gln Leu Arg Ile His Arg Asp Gly Ile Tyr Met Val His
195 200 205
Ile Gln Val Thr Leu Ala Ile Cys Ser Ser Thr Thr Ala Ser Arg His
210 215 220
His Pro Thr Thr Leu Ala Val Gly Ile Cys Ser Pro Ala Ser Arg Ser
225 230 235 240
Ile Ser Leu Leu Arg Leu Ser Phe His Gln Gly Cys Thr Ile Ala Ser
245 250 255
Gln Arg Leu Thr Pro Leu Ala Arg Gly Asp Thr Leu Cys Thr Asn Leu
260 265 270
Thr Gly Thr Leu Leu Pro Ser Arg Asn Thr Asp Glu Thr Phe Phe Gly
275 280 285
Val Gln Trp Val Arg Pro Gly Ser Gly Ser Glu Ser Leu Gly Trp Asp
290 295 300
Val Ala Glu Leu Gln Leu Asn His Thr Gly Pro Gln Gln Asp Pro Arg
305 310 315 320
Leu Tyr Trp Gln Gly Gly Pro Ala Leu Gly Arg Ser Phe Leu His Gly
325 330 335
Pro Glu Leu Asp Lys Gly Gln Leu Arg Ile His Arg Asp Gly Ile Tyr
340 345 350
Met Val His Ile Gln Val Thr Leu Ala Ile Cys Ser Ser Thr Thr Ala
355 360 365
Ser Arg His His Pro Thr Thr Leu Ala Val Gly Ile Cys Ser Pro Ala
370 375 380
Ser Arg Ser Ile Ser Leu Leu Arg Leu Ser Phe His Gln Gly Cys Thr
385 390 395 400
Ile Ala Ser Gln Arg Leu Thr Pro Leu Ala Arg Gly Asp Thr Leu Cys
405 410 415
Thr Asn Leu Thr Gly Thr Leu Leu Pro Ser Arg Asn Thr Asp Glu Thr
420 425 430
Phe Phe Gly Val Gln Trp Val Arg Pro Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser
435 440 445
Ser Ser Gly Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
450 455 460
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
465 470 475 480
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
485 490 495
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
500 505 510
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
515 520 525
Tyr Ser Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
530 535 540
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
545 550 555 560
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
565 570 575
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
580 585 590
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
595 600 605
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
610 615 620
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
625 630 635 640
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
645 650 655
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
660 665 670
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
675 680
<210> 32
<211> 677
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 具有较短的铰链接头的Seq_31
<400> 32
Gln Ser Leu Gly Trp Asp Val Ala Glu Leu Gln Leu Asn His Thr Gly
1 5 10 15
Pro Gln Gln Asp Pro Arg Leu Tyr Trp Gln Gly Gly Pro Ala Leu Gly
20 25 30
Arg Ser Phe Leu His Gly Pro Glu Leu Asp Lys Gly Gln Leu Arg Ile
35 40 45
His Arg Asp Gly Ile Tyr Met Val His Ile Gln Val Thr Leu Ala Ile
50 55 60
Cys Ser Ser Thr Thr Ala Ser Arg His His Pro Thr Thr Leu Ala Val
65 70 75 80
Gly Ile Cys Ser Pro Ala Ser Arg Ser Ile Ser Leu Leu Arg Leu Ser
85 90 95
Phe His Gln Gly Cys Thr Ile Ala Ser Gln Arg Leu Thr Pro Leu Ala
100 105 110
Arg Gly Asp Thr Leu Cys Thr Asn Leu Thr Gly Thr Leu Leu Pro Ser
115 120 125
Arg Asn Thr Asp Glu Thr Phe Phe Gly Val Gln Trp Val Arg Pro Gly
130 135 140
Ser Gly Ser Gly Asn Gly Ser Glu Ser Leu Gly Trp Asp Val Ala Glu
145 150 155 160
Leu Gln Leu Asn His Thr Gly Pro Gln Gln Asp Pro Arg Leu Tyr Trp
165 170 175
Gln Gly Gly Pro Ala Leu Gly Arg Ser Phe Leu His Gly Pro Glu Leu
180 185 190
Asp Lys Gly Gln Leu Arg Ile His Arg Asp Gly Ile Tyr Met Val His
195 200 205
Ile Gln Val Thr Leu Ala Ile Cys Ser Ser Thr Thr Ala Ser Arg His
210 215 220
His Pro Thr Thr Leu Ala Val Gly Ile Cys Ser Pro Ala Ser Arg Ser
225 230 235 240
Ile Ser Leu Leu Arg Leu Ser Phe His Gln Gly Cys Thr Ile Ala Ser
245 250 255
Gln Arg Leu Thr Pro Leu Ala Arg Gly Asp Thr Leu Cys Thr Asn Leu
260 265 270
Thr Gly Thr Leu Leu Pro Ser Arg Asn Thr Asp Glu Thr Phe Phe Gly
275 280 285
Val Gln Trp Val Arg Pro Gly Ser Gly Ser Glu Ser Leu Gly Trp Asp
290 295 300
Val Ala Glu Leu Gln Leu Asn His Thr Gly Pro Gln Gln Asp Pro Arg
305 310 315 320
Leu Tyr Trp Gln Gly Gly Pro Ala Leu Gly Arg Ser Phe Leu His Gly
325 330 335
Pro Glu Leu Asp Lys Gly Gln Leu Arg Ile His Arg Asp Gly Ile Tyr
340 345 350
Met Val His Ile Gln Val Thr Leu Ala Ile Cys Ser Ser Thr Thr Ala
355 360 365
Ser Arg His His Pro Thr Thr Leu Ala Val Gly Ile Cys Ser Pro Ala
370 375 380
Ser Arg Ser Ile Ser Leu Leu Arg Leu Ser Phe His Gln Gly Cys Thr
385 390 395 400
Ile Ala Ser Gln Arg Leu Thr Pro Leu Ala Arg Gly Asp Thr Leu Cys
405 410 415
Thr Asn Leu Thr Gly Thr Leu Leu Pro Ser Arg Asn Thr Asp Glu Thr
420 425 430
Phe Phe Gly Val Gln Trp Val Arg Pro Gly Ser Ser Ser Ser Ser Gly
435 440 445
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
450 455 460
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
465 470 475 480
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
485 490 495
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
500 505 510
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ser Ser
515 520 525
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
530 535 540
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
545 550 555 560
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
565 570 575
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
580 585 590
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
595 600 605
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
610 615 620
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
625 630 635 640
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
645 650 655
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
660 665 670
Leu Ser Pro Gly Lys
675
<210> 33
<211> 663
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 具有N末端缩短的RBD模块的实例
<400> 33
Gln Asp Val Ala Glu Leu Gln Leu Asn His Thr Gly Pro Gln Gln Asp
1 5 10 15
Pro Arg Leu Tyr Trp Gln Gly Gly Pro Ala Leu Gly Arg Ser Phe Leu
20 25 30
His Gly Pro Glu Leu Asp Lys Gly Gln Leu Arg Ile His Arg Asp Gly
35 40 45
Ile Tyr Met Val His Ile Gln Val Thr Leu Ala Ile Cys Ser Ser Thr
50 55 60
Thr Ala Ser Arg His His Pro Thr Thr Leu Ala Val Gly Ile Cys Ser
65 70 75 80
Pro Ala Ser Arg Ser Ile Ser Leu Leu Arg Leu Ser Phe His Gln Gly
85 90 95
Cys Thr Ile Ala Ser Gln Arg Leu Thr Pro Leu Ala Arg Gly Asp Thr
100 105 110
Leu Cys Thr Asn Leu Thr Gly Thr Leu Leu Pro Ser Arg Asn Thr Asp
115 120 125
Glu Thr Phe Phe Gly Val Gln Trp Val Arg Pro Gly Ser Gly Ser Gly
130 135 140
Asn Gly Ser Asp Val Ala Glu Leu Gln Leu Asn His Thr Gly Pro Gln
145 150 155 160
Gln Asp Pro Arg Leu Tyr Trp Gln Gly Gly Pro Ala Leu Gly Arg Ser
165 170 175
Phe Leu His Gly Pro Glu Leu Asp Lys Gly Gln Leu Arg Ile His Arg
180 185 190
Asp Gly Ile Tyr Met Val His Ile Gln Val Thr Leu Ala Ile Cys Ser
195 200 205
Ser Thr Thr Ala Ser Arg His His Pro Thr Thr Leu Ala Val Gly Ile
210 215 220
Cys Ser Pro Ala Ser Arg Ser Ile Ser Leu Leu Arg Leu Ser Phe His
225 230 235 240
Gln Gly Cys Thr Ile Ala Ser Gln Arg Leu Thr Pro Leu Ala Arg Gly
245 250 255
Asp Thr Leu Cys Thr Asn Leu Thr Gly Thr Leu Leu Pro Ser Arg Asn
260 265 270
Thr Asp Glu Thr Phe Phe Gly Val Gln Trp Val Arg Pro Gly Ser Gly
275 280 285
Ser Asp Val Ala Glu Leu Gln Leu Asn His Thr Gly Pro Gln Gln Asp
290 295 300
Pro Arg Leu Tyr Trp Gln Gly Gly Pro Ala Leu Gly Arg Ser Phe Leu
305 310 315 320
His Gly Pro Glu Leu Asp Lys Gly Gln Leu Arg Ile His Arg Asp Gly
325 330 335
Ile Tyr Met Val His Ile Gln Val Thr Leu Ala Ile Cys Ser Ser Thr
340 345 350
Thr Ala Ser Arg His His Pro Thr Thr Leu Ala Val Gly Ile Cys Ser
355 360 365
Pro Ala Ser Arg Ser Ile Ser Leu Leu Arg Leu Ser Phe His Gln Gly
370 375 380
Cys Thr Ile Ala Ser Gln Arg Leu Thr Pro Leu Ala Arg Gly Asp Thr
385 390 395 400
Leu Cys Thr Asn Leu Thr Gly Thr Leu Leu Pro Ser Arg Asn Thr Asp
405 410 415
Glu Thr Phe Phe Gly Val Gln Trp Val Arg Pro Gly Ser Ser Ser Ser
420 425 430
Ser Gly Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
435 440 445
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
450 455 460
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
465 470 475 480
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
485 490 495
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
500 505 510
Ser Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
515 520 525
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
530 535 540
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
545 550 555 560
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys
565 570 575
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
580 585 590
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
595 600 605
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
610 615 620
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
625 630 635 640
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
645 650 655
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
660
<210> 34
<211> 681
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 实例
<400> 34
Gln Ser Leu Gly Trp Asp Val Ala Glu Leu Gln Leu Asn His Thr Gly
1 5 10 15
Pro Gln Gln Asp Pro Arg Leu Tyr Trp Gln Gly Gly Pro Ala Leu Gly
20 25 30
Arg Ser Phe Leu His Gly Pro Glu Leu Asp Lys Gly Gln Leu Arg Ile
35 40 45
His Arg Asp Gly Ile Tyr Met Val His Ile Gln Val Thr Leu Ala Ile
50 55 60
Cys Ser Ser Thr Thr Ala Ser Arg His His Pro Thr Thr Leu Ala Val
65 70 75 80
Gly Ile Cys Ser Pro Ala Ser Arg Ser Ile Ser Leu Leu Arg Leu Ser
85 90 95
Phe His Gln Gly Cys Thr Ile Ala Ser Gln Arg Leu Thr Pro Leu Ala
100 105 110
Arg Gly Asp Thr Leu Cys Thr Asn Leu Thr Gly Thr Leu Leu Pro Ser
115 120 125
Arg Asn Thr Asp Glu Thr Phe Phe Gly Val Gln Trp Val Arg Pro Gly
130 135 140
Ser Gly Ser Gly Asn Gly Ser Glu Ser Leu Gly Trp Asp Val Ala Glu
145 150 155 160
Leu Gln Leu Asn His Thr Gly Pro Gln Gln Asp Pro Arg Leu Tyr Trp
165 170 175
Gln Gly Gly Pro Ala Leu Gly Arg Ser Phe Leu His Gly Pro Glu Leu
180 185 190
Asp Lys Gly Gln Leu Arg Ile His Arg Asp Gly Ile Tyr Met Val His
195 200 205
Ile Gln Val Thr Leu Ala Ile Cys Ser Ser Thr Thr Ala Ser Arg His
210 215 220
His Pro Thr Thr Leu Ala Val Gly Ile Cys Ser Pro Ala Ser Arg Ser
225 230 235 240
Ile Ser Leu Leu Arg Leu Ser Phe His Gln Gly Cys Thr Ile Ala Ser
245 250 255
Gln Arg Leu Thr Pro Leu Ala Arg Gly Asp Thr Leu Cys Thr Asn Leu
260 265 270
Thr Gly Thr Leu Leu Pro Ser Arg Asn Thr Asp Glu Thr Phe Phe Gly
275 280 285
Val Gln Trp Val Arg Pro Gly Ser Gly Ser Gly Asn Gly Ser Glu Ser
290 295 300
Leu Gly Trp Asp Val Ala Glu Leu Gln Leu Asn His Thr Gly Pro Gln
305 310 315 320
Gln Asp Pro Arg Leu Tyr Trp Gln Gly Gly Pro Ala Leu Gly Arg Ser
325 330 335
Phe Leu His Gly Pro Glu Leu Asp Lys Gly Gln Leu Arg Ile His Arg
340 345 350
Asp Gly Ile Tyr Met Val His Ile Gln Val Thr Leu Ala Ile Cys Ser
355 360 365
Ser Thr Thr Ala Ser Arg His His Pro Thr Thr Leu Ala Val Gly Ile
370 375 380
Cys Ser Pro Ala Ser Arg Ser Ile Ser Leu Leu Arg Leu Ser Phe His
385 390 395 400
Gln Gly Cys Thr Ile Ala Ser Gln Arg Leu Thr Pro Leu Ala Arg Gly
405 410 415
Asp Thr Leu Cys Thr Asn Leu Thr Gly Thr Leu Leu Pro Ser Arg Asn
420 425 430
Thr Asp Glu Thr Phe Phe Gly Val Gln Trp Val Arg Pro Gly Ser Ser
435 440 445
Ser Ser Ser Gly Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
450 455 460
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
465 470 475 480
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
485 490 495
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
500 505 510
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
515 520 525
Gln Tyr Ser Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
530 535 540
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
545 550 555 560
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
565 570 575
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
580 585 590
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
595 600 605
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
610 615 620
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
625 630 635 640
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
645 650 655
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
660 665 670
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
675 680
<210> 35
<211> 684
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> SEQ39+SEQ16+SEQ13
<400> 35
Glu Ser Leu Gly Trp Asp Val Ala Glu Leu Gln Leu Asp His Thr Gly
1 5 10 15
Pro Gln Gln Asp Pro Arg Leu Tyr Trp Gln Gly Gly Pro Ala Leu Gly
20 25 30
Arg Ser Phe Leu His Gly Pro Glu Leu Asp Lys Gly Gln Leu Arg Ile
35 40 45
His Arg Asp Gly Ile Tyr Met Val His Ile Gln Val Thr Leu Ala Ile
50 55 60
Cys Ser Ser Thr Thr Ala Ser Arg His His Pro Thr Thr Leu Ala Val
65 70 75 80
Gly Ile Cys Ser Pro Ala Ser Arg Ser Ile Ser Leu Leu Arg Leu Ser
85 90 95
Phe His Gln Gly Cys Thr Ile Ala Ser Gln Arg Leu Thr Pro Leu Ala
100 105 110
Arg Gly Asp Thr Leu Cys Thr Asn Leu Thr Gly Thr Leu Leu Pro Ser
115 120 125
Arg Asn Thr Asp Glu Thr Phe Phe Gly Val Gln Trp Val Arg Pro Gly
130 135 140
Ser Gly Ser Gly Asn Gly Ser Glu Ser Leu Gly Trp Asp Val Ala Glu
145 150 155 160
Leu Gln Leu Asp His Thr Gly Pro Gln Gln Asp Pro Arg Leu Tyr Trp
165 170 175
Gln Gly Gly Pro Ala Leu Gly Arg Ser Phe Leu His Gly Pro Glu Leu
180 185 190
Asp Lys Gly Gln Leu Arg Ile His Arg Asp Gly Ile Tyr Met Val His
195 200 205
Ile Gln Val Thr Leu Ala Ile Cys Ser Ser Thr Thr Ala Ser Arg His
210 215 220
His Pro Thr Thr Leu Ala Val Gly Ile Cys Ser Pro Ala Ser Arg Ser
225 230 235 240
Ile Ser Leu Leu Arg Leu Ser Phe His Gln Gly Cys Thr Ile Ala Ser
245 250 255
Gln Arg Leu Thr Pro Leu Ala Arg Gly Asp Thr Leu Cys Thr Asn Leu
260 265 270
Thr Gly Thr Leu Leu Pro Ser Arg Asn Thr Asp Glu Thr Phe Phe Gly
275 280 285
Val Gln Trp Val Arg Pro Gly Ser Gly Ser Gly Asn Gly Ser Glu Ser
290 295 300
Leu Gly Trp Asp Val Ala Glu Leu Gln Leu Asp His Thr Gly Pro Gln
305 310 315 320
Gln Asp Pro Arg Leu Tyr Trp Gln Gly Gly Pro Ala Leu Gly Arg Ser
325 330 335
Phe Leu His Gly Pro Glu Leu Asp Lys Gly Gln Leu Arg Ile His Arg
340 345 350
Asp Gly Ile Tyr Met Val His Ile Gln Val Thr Leu Ala Ile Cys Ser
355 360 365
Ser Thr Thr Ala Ser Arg His His Pro Thr Thr Leu Ala Val Gly Ile
370 375 380
Cys Ser Pro Ala Ser Arg Ser Ile Ser Leu Leu Arg Leu Ser Phe His
385 390 395 400
Gln Gly Cys Thr Ile Ala Ser Gln Arg Leu Thr Pro Leu Ala Arg Gly
405 410 415
Asp Thr Leu Cys Thr Asn Leu Thr Gly Thr Leu Leu Pro Ser Arg Asn
420 425 430
Thr Asp Glu Thr Phe Phe Gly Val Gln Trp Val Arg Pro Gly Ser Ser
435 440 445
Ser Ser Ser Ser Ser Ser Gly Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
450 455 460
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
465 470 475 480
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
485 490 495
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
500 505 510
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
515 520 525
Arg Glu Glu Gln Tyr Ser Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
530 535 540
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
545 550 555 560
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
565 570 575
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
580 585 590
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
595 600 605
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
610 615 620
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
625 630 635 640
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
645 650 655
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
660 665 670
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
675 680
<210> 36
<211> 446
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 示例性的scCD27L-RBD模块
<400> 36
Gln Ser Leu Gly Trp Asp Val Ala Glu Leu Gln Leu Asn His Thr Gly
1 5 10 15
Pro Gln Gln Asp Pro Arg Leu Tyr Trp Gln Gly Gly Pro Ala Leu Gly
20 25 30
Arg Ser Phe Leu His Gly Pro Glu Leu Asp Lys Gly Gln Leu Arg Ile
35 40 45
His Arg Asp Gly Ile Tyr Met Val His Ile Gln Val Thr Leu Ala Ile
50 55 60
Cys Ser Ser Thr Thr Ala Ser Arg His His Pro Thr Thr Leu Ala Val
65 70 75 80
Gly Ile Cys Ser Pro Ala Ser Arg Ser Ile Ser Leu Leu Arg Leu Ser
85 90 95
Phe His Gln Gly Cys Thr Ile Ala Ser Gln Arg Leu Thr Pro Leu Ala
100 105 110
Arg Gly Asp Thr Leu Cys Thr Asn Leu Thr Gly Thr Leu Leu Pro Ser
115 120 125
Arg Asn Thr Asp Glu Thr Phe Phe Gly Val Gln Trp Val Arg Pro Gly
130 135 140
Ser Gly Ser Gly Asn Gly Ser Glu Ser Leu Gly Trp Asp Val Ala Glu
145 150 155 160
Leu Gln Leu Asn His Thr Gly Pro Gln Gln Asp Pro Arg Leu Tyr Trp
165 170 175
Gln Gly Gly Pro Ala Leu Gly Arg Ser Phe Leu His Gly Pro Glu Leu
180 185 190
Asp Lys Gly Gln Leu Arg Ile His Arg Asp Gly Ile Tyr Met Val His
195 200 205
Ile Gln Val Thr Leu Ala Ile Cys Ser Ser Thr Thr Ala Ser Arg His
210 215 220
His Pro Thr Thr Leu Ala Val Gly Ile Cys Ser Pro Ala Ser Arg Ser
225 230 235 240
Ile Ser Leu Leu Arg Leu Ser Phe His Gln Gly Cys Thr Ile Ala Ser
245 250 255
Gln Arg Leu Thr Pro Leu Ala Arg Gly Asp Thr Leu Cys Thr Asn Leu
260 265 270
Thr Gly Thr Leu Leu Pro Ser Arg Asn Thr Asp Glu Thr Phe Phe Gly
275 280 285
Val Gln Trp Val Arg Pro Gly Ser Gly Ser Gly Asn Gly Ser Glu Ser
290 295 300
Leu Gly Trp Asp Val Ala Glu Leu Gln Leu Asn His Thr Gly Pro Gln
305 310 315 320
Gln Asp Pro Arg Leu Tyr Trp Gln Gly Gly Pro Ala Leu Gly Arg Ser
325 330 335
Phe Leu His Gly Pro Glu Leu Asp Lys Gly Gln Leu Arg Ile His Arg
340 345 350
Asp Gly Ile Tyr Met Val His Ile Gln Val Thr Leu Ala Ile Cys Ser
355 360 365
Ser Thr Thr Ala Ser Arg His His Pro Thr Thr Leu Ala Val Gly Ile
370 375 380
Cys Ser Pro Ala Ser Arg Ser Ile Ser Leu Leu Arg Leu Ser Phe His
385 390 395 400
Gln Gly Cys Thr Ile Ala Ser Gln Arg Leu Thr Pro Leu Ala Arg Gly
405 410 415
Asp Thr Leu Cys Thr Asn Leu Thr Gly Thr Leu Leu Pro Ser Arg Asn
420 425 430
Thr Asp Glu Thr Phe Phe Gly Val Gln Trp Val Arg Pro Gly
435 440 445
<210> 37
<211> 2159
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 编码EQ_25的DNA序列
<400> 37
aagctttagg gataacaggg taatagccgc caccatggag actgacaccc tgctggtgtt 60
cgtgctgctg gtctgggtgc ctgcaggaaa tggagagagc ctgggatggg atgtggccga 120
actccagctg aaccacacag gccctcagca agaccctagg ctctactggc agggcggccc 180
tgctctggga aggagctttc tgcatggccc tgaactggat aaaggccaac tgcgtattca 240
tcgggatggc atttacatgg tccatatcca ggtgaccctc gccatctgct ccagcaccac 300
cgctagcagg catcatccca ccaccctggc cgtgggcatt tgttcccctg ccagccggtc 360
catctccctg ctgaggctga gctttcatca gggctgcacc atcgcctccc aaaggctgac 420
ccctctggcc aggggcgata cactgtgtac caatctgacc ggcaccctgc tccctagcag 480
gaacaccgat gaaacctttt tcggagtgca gtgggtgcgg cctggttccg gaagcggcaa 540
tggctccgaa agcctcggct gggacgtggc cgagctccaa ctgaaccaca ccggccctca 600
acaagatcct cggctctatt ggcaaggcgg acctgctctc ggccggagct tcctgcatgg 660
ccctgagctg gacaagggcc agctgcgtat tcatcgggat ggaatctata tggtgcacat 720
ccaagtgaca ctggccattt gcagcagcac caccgctagc cggcaccatc ctaccaccct 780
ggctgtgggc atctgttccc ccgctagccg gtccatctcc ctgctgaggc tgagcttcca 840
ccagggctgt accatcgcca gccagaggct gacccctctg gctaggggcg acaccctgtg 900
taccaacctg accggaaccc tgctgcctag caggaatacc gatgagacct tcttcggagt 960
gcaatgggtg aggcctggct ctggttctgg taacggttct gagagcctcg gctgggacgt 1020
cgctgaactg cagctgaatc acacaggccc ccagcaggac cctaggctgt actggcaggg 1080
aggccctgct ctcggaagga gctttctgca cggccctgaa ctggataagg gacagctccg 1140
tattcatcgg gatggcatct acatggtgca tatccaggtc accctggcca tctgcagctc 1200
caccaccgcc tccaggcacc accctaccac cctggctgtg ggcatctgct cccctgcctc 1260
ccggagcatc agcctgctga ggctgtcctt ccaccaaggc tgcaccatcg ctagccaaag 1320
gctgacccct ctggctaggg gcgataccct gtgcaccaac ctgaccggaa ccctgctgcc 1380
ttcccggaac accgacgaga cctttttcgg cgtgcagtgg gtcaggcccg gatcctcgag 1440
ttcatcgtcc tcatccggct catgtgataa gacccacacc tgccctccct gtcctgcccc 1500
tgagctgctg ggcggacctt ctgtgttcct gttccccccc aagcctaagg acaccctgat 1560
gatctccagg acccctgagg tgacctgtgt ggtggtggac gtgtctcacg aagatcccga 1620
ggtgaagttc aactggtacg tggacggcgt ggaggtccac aacgccaaga ccaagcctag 1680
ggaggagcag tacagctcca cctaccgggt ggtgtctgtg ctgaccgtgc tgcaccagga 1740
ttggctgaac ggaaaggagt ataagtgtaa ggtctccaac aaggccctgc ctgcccccat 1800
cgagaaaacc atctccaagg ccaagggcca gcctcgggag cctcaggtgt acaccctgcc 1860
tcctagcagg gaggagatga ccaagaacca ggtgtccctg acctgtctgg tgaagggctt 1920
ctacccttcc gatatcgccg tggagtggga gtctaatggc cagcccgaga acaactacaa 1980
gaccacccct cctgtgctgg actctgacgg ctccttcttc ctgtactcca agctgaccgt 2040
ggacaagtcc agatggcagc agggcaacgt gttctcctgc tccgtgatgc acgaggccct 2100
gcacaatcac tacacccaga agtccctgtc tctgagtccg ggcaagtaat aggcgcgcc 2159
<210> 38
<211> 220
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 融合至RB69-Foldon的CD27L RBD
<400> 38
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Val Phe Val Leu Leu Val Trp Val Pro
1 5 10 15
Ala Gly Asn Gly Glu Ser Leu Gly Trp Asp Val Ala Glu Leu Gln Leu
20 25 30
Asn His Thr Gly Pro Gln Gln Asp Pro Arg Leu Tyr Trp Gln Gly Gly
35 40 45
Pro Ala Leu Gly Arg Ser Phe Leu His Gly Pro Glu Leu Asp Lys Gly
50 55 60
Gln Leu Arg Ile His Arg Asp Gly Ile Tyr Met Val His Ile Gln Val
65 70 75 80
Thr Leu Ala Ile Cys Ser Ser Thr Thr Ala Ser Arg His His Pro Thr
85 90 95
Thr Leu Ala Val Gly Ile Cys Ser Pro Ala Ser Arg Ser Ile Ser Leu
100 105 110
Leu Arg Leu Ser Phe His Gln Gly Cys Thr Ile Ala Ser Gln Arg Leu
115 120 125
Thr Pro Leu Ala Arg Gly Asp Thr Leu Cys Thr Asn Leu Thr Gly Thr
130 135 140
Leu Leu Pro Ser Arg Asn Thr Asp Glu Thr Phe Phe Gly Val Gln Trp
145 150 155 160
Val Arg Pro Gly Ser Gly Ser Ser Gly Ser Ser Gly Ser Ser Gly Ser
165 170 175
Gly Tyr Ile Glu Asp Ala Pro Ser Asp Gly Lys Phe Tyr Val Arg Lys
180 185 190
Asp Gly Ala Trp Val Glu Leu Pro Thr Ala Ser Gly Pro Ser Ser Ser
195 200 205
Ser Ser Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
210 215 220
<210> 39
<211> 445
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 示例性的scCD27L-RBD模块
<400> 39
Glu Ser Leu Gly Trp Asp Val Ala Glu Leu Gln Leu Asp His Thr Gly
1 5 10 15
Pro Gln Gln Asp Pro Arg Leu Tyr Trp Gln Gly Gly Pro Ala Leu Gly
20 25 30
Arg Ser Phe Leu His Gly Pro Glu Leu Asp Lys Gly Gln Leu Arg Ile
35 40 45
His Arg Asp Gly Ile Tyr Met Val His Ile Gln Val Thr Leu Ala Ile
50 55 60
Cys Ser Ser Thr Thr Ala Ser Arg His His Pro Thr Thr Leu Ala Val
65 70 75 80
Gly Ile Cys Ser Pro Ala Ser Arg Ser Ile Ser Leu Leu Arg Leu Ser
85 90 95
Phe His Gln Gly Cys Thr Ile Ala Ser Gln Arg Leu Thr Pro Leu Ala
100 105 110
Arg Gly Asp Thr Leu Cys Thr Asn Leu Thr Gly Thr Leu Leu Pro Ser
115 120 125
Arg Asn Thr Asp Glu Thr Phe Phe Gly Val Gln Trp Val Arg Pro Gly
130 135 140
Ser Gly Ser Gly Asn Gly Ser Glu Ser Leu Gly Trp Asp Val Ala Glu
145 150 155 160
Leu Gln Leu Asp His Thr Gly Pro Gln Gln Asp Pro Arg Leu Tyr Trp
165 170 175
Gln Gly Gly Pro Ala Leu Gly Arg Ser Phe Leu His Gly Pro Glu Leu
180 185 190
Asp Lys Gly Gln Leu Arg Ile His Arg Asp Gly Ile Tyr Met Val His
195 200 205
Ile Gln Val Thr Leu Ala Ile Cys Ser Ser Thr Thr Ala Ser Arg His
210 215 220
His Pro Thr Thr Leu Ala Val Gly Ile Cys Ser Pro Ala Ser Arg Ser
225 230 235 240
Ile Ser Leu Leu Arg Leu Ser Phe His Gln Gly Cys Thr Ile Ala Ser
245 250 255
Gln Arg Leu Thr Pro Leu Ala Arg Gly Asp Thr Leu Cys Thr Asn Leu
260 265 270
Thr Gly Thr Leu Leu Pro Ser Arg Asn Thr Asp Glu Thr Phe Phe Gly
275 280 285
Val Gln Trp Val Arg Pro Gly Ser Gly Ser Gly Asn Gly Ser Glu Ser
290 295 300
Leu Gly Trp Asp Val Ala Glu Leu Gln Leu Asp His Thr Gly Pro Gln
305 310 315 320
Gln Asp Pro Arg Leu Tyr Trp Gln Gly Gly Pro Ala Leu Gly Arg Ser
325 330 335
Phe Leu His Gly Pro Glu Leu Asp Lys Gly Gln Leu Arg Ile His Arg
340 345 350
Asp Gly Ile Tyr Met Val His Ile Gln Val Thr Leu Ala Ile Cys Ser
355 360 365
Ser Thr Thr Ala Ser Arg His His Pro Thr Thr Leu Ala Val Gly Ile
370 375 380
Cys Ser Pro Ala Ser Arg Ser Ile Ser Leu Leu Arg Leu Ser Phe His
385 390 395 400
Gln Gly Cys Thr Ile Ala Ser Gln Arg Leu Thr Pro Leu Ala Arg Gly
405 410 415
Asp Thr Leu Cys Thr Asn Leu Thr Gly Thr Leu Leu Pro Ser Arg Asn
420 425 430
Thr Asp Glu Thr Phe Phe Gly Val Gln Trp Val Arg Pro
435 440 445
<210> 40
<211> 441
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 示例性scCD27L-RBD 模块
<400> 40
Glu Ser Leu Gly Trp Asp Val Ala Glu Leu Gln Leu Asp His Thr Gly
1 5 10 15
Pro Gln Gln Asp Pro Arg Leu Tyr Trp Gln Gly Gly Pro Ala Leu Gly
20 25 30
Arg Ser Phe Leu His Gly Pro Glu Leu Asp Lys Gly Gln Leu Arg Ile
35 40 45
His Arg Asp Gly Ile Tyr Met Val His Ile Gln Val Thr Leu Ala Ile
50 55 60
Cys Ser Ser Thr Thr Ala Ser Arg His His Pro Thr Thr Leu Ala Val
65 70 75 80
Gly Ile Cys Ser Pro Ala Ser Arg Ser Ile Ser Leu Leu Arg Leu Ser
85 90 95
Phe His Gln Gly Cys Thr Ile Ala Ser Gln Arg Leu Thr Pro Leu Ala
100 105 110
Arg Gly Asp Thr Leu Cys Thr Asn Leu Thr Gly Thr Leu Leu Pro Ser
115 120 125
Arg Asn Thr Asp Glu Thr Phe Phe Gly Val Gln Trp Val Arg Pro Gly
130 135 140
Ser Gly Ser Gly Asn Gly Ser Glu Ser Leu Gly Trp Asp Val Ala Glu
145 150 155 160
Leu Gln Leu Asp His Thr Gly Pro Gln Gln Asp Pro Arg Leu Tyr Trp
165 170 175
Gln Gly Gly Pro Ala Leu Gly Arg Ser Phe Leu His Gly Pro Glu Leu
180 185 190
Asp Lys Gly Gln Leu Arg Ile His Arg Asp Gly Ile Tyr Met Val His
195 200 205
Ile Gln Val Thr Leu Ala Ile Cys Ser Ser Thr Thr Ala Ser Arg His
210 215 220
His Pro Thr Thr Leu Ala Val Gly Ile Cys Ser Pro Ala Ser Arg Ser
225 230 235 240
Ile Ser Leu Leu Arg Leu Ser Phe His Gln Gly Cys Thr Ile Ala Ser
245 250 255
Gln Arg Leu Thr Pro Leu Ala Arg Gly Asp Thr Leu Cys Thr Asn Leu
260 265 270
Thr Gly Thr Leu Leu Pro Ser Arg Asn Thr Asp Glu Thr Phe Phe Gly
275 280 285
Val Gln Trp Val Arg Pro Gly Ser Gly Ser Glu Ser Leu Gly Trp Asp
290 295 300
Val Ala Glu Leu Gln Leu Asp His Thr Gly Pro Gln Gln Asp Pro Arg
305 310 315 320
Leu Tyr Trp Gln Gly Gly Pro Ala Leu Gly Arg Ser Phe Leu His Gly
325 330 335
Pro Glu Leu Asp Lys Gly Gln Leu Arg Ile His Arg Asp Gly Ile Tyr
340 345 350
Met Val His Ile Gln Val Thr Leu Ala Ile Cys Ser Ser Thr Thr Ala
355 360 365
Ser Arg His His Pro Thr Thr Leu Ala Val Gly Ile Cys Ser Pro Ala
370 375 380
Ser Arg Ser Ile Ser Leu Leu Arg Leu Ser Phe His Gln Gly Cys Thr
385 390 395 400
Ile Ala Ser Gln Arg Leu Thr Pro Leu Ala Arg Gly Asp Thr Leu Cys
405 410 415
Thr Asn Leu Thr Gly Thr Leu Leu Pro Ser Arg Asn Thr Asp Glu Thr
420 425 430
Phe Phe Gly Val Gln Trp Val Arg Pro
435 440
<210> 41
<211> 430
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 示例性的scCD27L-RBD模块
<400> 41
Asp Val Ala Glu Leu Gln Leu Asp His Thr Gly Pro Gln Gln Asp Pro
1 5 10 15
Arg Leu Tyr Trp Gln Gly Gly Pro Ala Leu Gly Arg Ser Phe Leu His
20 25 30
Gly Pro Glu Leu Asp Lys Gly Gln Leu Arg Ile His Arg Asp Gly Ile
35 40 45
Tyr Met Val His Ile Gln Val Thr Leu Ala Ile Cys Ser Ser Thr Thr
50 55 60
Ala Ser Arg His His Pro Thr Thr Leu Ala Val Gly Ile Cys Ser Pro
65 70 75 80
Ala Ser Arg Ser Ile Ser Leu Leu Arg Leu Ser Phe His Gln Gly Cys
85 90 95
Thr Ile Ala Ser Gln Arg Leu Thr Pro Leu Ala Arg Gly Asp Thr Leu
100 105 110
Cys Thr Asn Leu Thr Gly Thr Leu Leu Pro Ser Arg Asn Thr Asp Glu
115 120 125
Thr Phe Phe Gly Val Gln Trp Val Arg Pro Gly Ser Gly Ser Gly Asn
130 135 140
Gly Ser Asp Val Ala Glu Leu Gln Leu Asp His Thr Gly Pro Gln Gln
145 150 155 160
Asp Pro Arg Leu Tyr Trp Gln Gly Gly Pro Ala Leu Gly Arg Ser Phe
165 170 175
Leu His Gly Pro Glu Leu Asp Lys Gly Gln Leu Arg Ile His Arg Asp
180 185 190
Gly Ile Tyr Met Val His Ile Gln Val Thr Leu Ala Ile Cys Ser Ser
195 200 205
Thr Thr Ala Ser Arg His His Pro Thr Thr Leu Ala Val Gly Ile Cys
210 215 220
Ser Pro Ala Ser Arg Ser Ile Ser Leu Leu Arg Leu Ser Phe His Gln
225 230 235 240
Gly Cys Thr Ile Ala Ser Gln Arg Leu Thr Pro Leu Ala Arg Gly Asp
245 250 255
Thr Leu Cys Thr Asn Leu Thr Gly Thr Leu Leu Pro Ser Arg Asn Thr
260 265 270
Asp Glu Thr Phe Phe Gly Val Gln Trp Val Arg Pro Gly Ser Gly Ser
275 280 285
Gly Asn Gly Ser Asp Val Ala Glu Leu Gln Leu Asp His Thr Gly Pro
290 295 300
Gln Gln Asp Pro Arg Leu Tyr Trp Gln Gly Gly Pro Ala Leu Gly Arg
305 310 315 320
Ser Phe Leu His Gly Pro Glu Leu Asp Lys Gly Gln Leu Arg Ile His
325 330 335
Arg Asp Gly Ile Tyr Met Val His Ile Gln Val Thr Leu Ala Ile Cys
340 345 350
Ser Ser Thr Thr Ala Ser Arg His His Pro Thr Thr Leu Ala Val Gly
355 360 365
Ile Cys Ser Pro Ala Ser Arg Ser Ile Ser Leu Leu Arg Leu Ser Phe
370 375 380
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Gly Asp Thr Leu Cys Thr Asn Leu Thr Gly Thr Leu Leu Pro Ser Arg
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<211> 426
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<213> 人造序列
<220>
<223> 示例性的scCD27L-RBD模块
<400> 42
Asp Val Ala Glu Leu Gln Leu Asp His Thr Gly Pro Gln Gln Asp Pro
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Arg Leu Tyr Trp Gln Gly Gly Pro Ala Leu Gly Arg Ser Phe Leu His
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Gly Pro Glu Leu Asp Lys Gly Gln Leu Arg Ile His Arg Asp Gly Ile
35 40 45
Tyr Met Val His Ile Gln Val Thr Leu Ala Ile Cys Ser Ser Thr Thr
50 55 60
Ala Ser Arg His His Pro Thr Thr Leu Ala Val Gly Ile Cys Ser Pro
65 70 75 80
Ala Ser Arg Ser Ile Ser Leu Leu Arg Leu Ser Phe His Gln Gly Cys
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Thr Phe Phe Gly Val Gln Trp Val Arg Pro Gly Ser Gly Ser Gly Asn
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Gly Ser Asp Val Ala Glu Leu Gln Leu Asp His Thr Gly Pro Gln Gln
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Asp Pro Arg Leu Tyr Trp Gln Gly Gly Pro Ala Leu Gly Arg Ser Phe
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Leu His Gly Pro Glu Leu Asp Lys Gly Gln Leu Arg Ile His Arg Asp
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Gly Ile Tyr Met Val His Ile Gln Val Thr Leu Ala Ile Cys Ser Ser
195 200 205
Thr Thr Ala Ser Arg His His Pro Thr Thr Leu Ala Val Gly Ile Cys
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Ser Pro Ala Ser Arg Ser Ile Ser Leu Leu Arg Leu Ser Phe His Gln
225 230 235 240
Gly Cys Thr Ile Ala Ser Gln Arg Leu Thr Pro Leu Ala Arg Gly Asp
245 250 255
Thr Leu Cys Thr Asn Leu Thr Gly Thr Leu Leu Pro Ser Arg Asn Thr
260 265 270
Asp Glu Thr Phe Phe Gly Val Gln Trp Val Arg Pro Gly Ser Gly Ser
275 280 285
Asp Val Ala Glu Leu Gln Leu Asp His Thr Gly Pro Gln Gln Asp Pro
290 295 300
Arg Leu Tyr Trp Gln Gly Gly Pro Ala Leu Gly Arg Ser Phe Leu His
305 310 315 320
Gly Pro Glu Leu Asp Lys Gly Gln Leu Arg Ile His Arg Asp Gly Ile
325 330 335
Tyr Met Val His Ile Gln Val Thr Leu Ala Ile Cys Ser Ser Thr Thr
340 345 350
Ala Ser Arg His His Pro Thr Thr Leu Ala Val Gly Ile Cys Ser Pro
355 360 365
Ala Ser Arg Ser Ile Ser Leu Leu Arg Leu Ser Phe His Gln Gly Cys
370 375 380
Thr Ile Ala Ser Gln Arg Leu Thr Pro Leu Ala Arg Gly Asp Thr Leu
385 390 395 400
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405 410 415
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<400> 43
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20 25 30
Arg Ser Phe Leu His Gly Pro Glu Leu Asp Lys Gly Gln Leu Arg Ile
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Gly Ile Cys Ser Pro Ala Ser Arg Ser Ile Ser Leu Leu Arg Leu Ser
85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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Leu Gln Leu Asp His Thr Gly Pro Gln Gln Asp Pro Arg Leu Tyr Trp
165 170 175
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180 185 190
Asp Lys Gly Gln Leu Arg Ile His Arg Asp Gly Ile Tyr Met Val His
195 200 205
Ile Gln Val Thr Leu Ala Ile Cys Ser Ser Thr Thr Ala Ser Arg His
210 215 220
His Pro Thr Thr Leu Ala Val Gly Ile Cys Ser Pro Ala Ser Arg Ser
225 230 235 240
Ile Ser Leu Leu Arg Leu Ser Phe His Gln Gly Cys Thr Ile Ala Ser
245 250 255
Gln Arg Leu Thr Pro Leu Ala Arg Gly Asp Thr Leu Cys Thr Asn Leu
260 265 270
Thr Gly Thr Leu Leu Pro Ser Arg Asn Thr Asp Glu Thr Phe Phe Gly
275 280 285
Val Gln Trp Val Arg Pro Gly Ser Gly Ser Glu Ser Leu Gly Trp Asp
290 295 300
Val Ala Glu Leu Gln Leu Asp His Thr Gly Pro Gln Gln Asp Pro Arg
305 310 315 320
Leu Tyr Trp Gln Gly Gly Pro Ala Leu Gly Arg Ser Phe Leu His Gly
325 330 335
Pro Glu Leu Asp Lys Gly Gln Leu Arg Ile His Arg Asp Gly Ile Tyr
340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
Ser Arg Ser Ile Ser Leu Leu Arg Leu Ser Phe His Gln Gly Cys Thr
385 390 395 400
Ile Ala Ser Gln Arg Leu Thr Pro Leu Ala Arg Gly Asp Thr Leu Cys
405 410 415
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Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
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Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
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Tyr Met Val His Ile Gln Val Thr Leu Ala Ile Cys Ser Ser Thr Thr
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Asp Pro Arg Leu Tyr Trp Gln Gly Gly Pro Ala Leu Gly Arg Ser Phe
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Leu His Gly Pro Glu Leu Asp Lys Gly Gln Leu Arg Ile His Arg Asp
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275 280 285
Gly Asn Gly Ser Asp Val Ala Glu Leu Gln Leu Asp His Thr Gly Pro
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Gln Gln Asp Pro Arg Leu Tyr Trp Gln Gly Gly Pro Ala Leu Gly Arg
305 310 315 320
Ser Phe Leu His Gly Pro Glu Leu Asp Lys Gly Gln Leu Arg Ile His
325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
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Gly Asp Thr Leu Cys Thr Asn Leu Thr Gly Thr Leu Leu Pro Ser Arg
405 410 415
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<213> 人造序列
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Asp Val Ala Glu Leu Gln Leu Asp His Thr Gly Pro Gln Gln Asp Pro
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Gly Pro Glu Leu Asp Lys Gly Gln Leu Arg Ile His Arg Asp Gly Ile
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Ala Ser Arg Ser Ile Ser Leu Leu Arg Leu Ser Phe His Gln Gly Cys
85 90 95
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Gly Ser Asp Val Ala Glu Leu Gln Leu Asp His Thr Gly Pro Gln Gln
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Asp Pro Arg Leu Tyr Trp Gln Gly Gly Pro Ala Leu Gly Arg Ser Phe
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Ser Pro Ala Ser Arg Ser Ile Ser Leu Leu Arg Leu Ser Phe His Gln
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Gly Pro Glu Leu Asp Lys Gly Gln Leu Arg Ile His Arg Asp Gly Ile
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485 490 495
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500 505 510
Gln Tyr Ser Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
515 520 525
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
530 535 540
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545 550 555 560
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
565 570 575
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
580 585 590
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
595 600 605
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
610 615 620
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
625 630 635 640
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
645 650 655
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
660 665
<210> 46
<211> 669
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 具有N170D突变蛋白的Seq44
<400> 46
Asp Val Ala Glu Leu Gln Leu Asp His Thr Gly Pro Gln Gln Asp Pro
1 5 10 15
Arg Leu Tyr Trp Gln Gly Gly Pro Ala Leu Gly Arg Ser Phe Leu His
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Gly Pro Glu Leu Asp Lys Gly Gln Leu Arg Ile His Arg Asp Gly Ile
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100 105 110
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Gly Ser Asp Val Ala Glu Leu Gln Leu Asp His Thr Gly Pro Gln Gln
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Asp Pro Arg Leu Tyr Trp Gln Gly Gly Pro Ala Leu Gly Arg Ser Phe
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Leu His Gly Pro Glu Leu Asp Lys Gly Gln Leu Arg Ile His Arg Asp
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Gly Ile Tyr Met Val His Ile Gln Val Thr Leu Ala Ile Cys Ser Ser
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Ser Pro Ala Ser Arg Ser Ile Ser Leu Leu Arg Leu Ser Phe His Gln
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Gly Cys Thr Ile Ala Ser Gln Arg Leu Thr Pro Leu Ala Arg Gly Asp
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Gly Asn Gly Ser Asp Val Ala Glu Leu Gln Leu Asp His Thr Gly Pro
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Gln Gln Asp Pro Arg Leu Tyr Trp Gln Gly Gly Pro Ala Leu Gly Arg
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Ser Phe Leu His Gly Pro Glu Leu Asp Lys Gly Gln Leu Arg Ile His
325 330 335
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355 360 365
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370 375 380
His Gln Gly Cys Thr Ile Ala Ser Gln Arg Leu Thr Pro Leu Ala Arg
385 390 395 400
Gly Asp Thr Leu Cys Thr Asp Leu Thr Gly Thr Leu Leu Pro Ser Arg
405 410 415
Asn Thr Asp Glu Thr Phe Phe Gly Val Gln Trp Val Arg Pro Gly Ser
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Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Gly Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
435 440 445
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
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Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
485 490 495
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
500 505 510
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515 520 525
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565 570 575
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580 585 590
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595 600 605
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Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
645 650 655
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
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<211> 680
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 在模块（i）中没有E51Q突变的Seq31
<400> 47
Glu Ser Leu Gly Trp Asp Val Ala Glu Leu Gln Leu Asn His Thr Gly
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Pro Gln Gln Asp Pro Arg Leu Tyr Trp Gln Gly Gly Pro Ala Leu Gly
20 25 30
Arg Ser Phe Leu His Gly Pro Glu Leu Asp Lys Gly Gln Leu Arg Ile
35 40 45
His Arg Asp Gly Ile Tyr Met Val His Ile Gln Val Thr Leu Ala Ile
50 55 60
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65 70 75 80
Gly Ile Cys Ser Pro Ala Ser Arg Ser Ile Ser Leu Leu Arg Leu Ser
85 90 95
Phe His Gln Gly Cys Thr Ile Ala Ser Gln Arg Leu Thr Pro Leu Ala
100 105 110
Arg Gly Asp Thr Leu Cys Thr Asn Leu Thr Gly Thr Leu Leu Pro Ser
115 120 125
Arg Asn Thr Asp Glu Thr Phe Phe Gly Val Gln Trp Val Arg Pro Gly
130 135 140
Ser Gly Ser Gly Asn Gly Ser Glu Ser Leu Gly Trp Asp Val Ala Glu
145 150 155 160
Leu Gln Leu Asn His Thr Gly Pro Gln Gln Asp Pro Arg Leu Tyr Trp
165 170 175
Gln Gly Gly Pro Ala Leu Gly Arg Ser Phe Leu His Gly Pro Glu Leu
180 185 190
Asp Lys Gly Gln Leu Arg Ile His Arg Asp Gly Ile Tyr Met Val His
195 200 205
Ile Gln Val Thr Leu Ala Ile Cys Ser Ser Thr Thr Ala Ser Arg His
210 215 220
His Pro Thr Thr Leu Ala Val Gly Ile Cys Ser Pro Ala Ser Arg Ser
225 230 235 240
Ile Ser Leu Leu Arg Leu Ser Phe His Gln Gly Cys Thr Ile Ala Ser
245 250 255
Gln Arg Leu Thr Pro Leu Ala Arg Gly Asp Thr Leu Cys Thr Asn Leu
260 265 270
Thr Gly Thr Leu Leu Pro Ser Arg Asn Thr Asp Glu Thr Phe Phe Gly
275 280 285
Val Gln Trp Val Arg Pro Gly Ser Gly Ser Glu Ser Leu Gly Trp Asp
290 295 300
Val Ala Glu Leu Gln Leu Asn His Thr Gly Pro Gln Gln Asp Pro Arg
305 310 315 320
Leu Tyr Trp Gln Gly Gly Pro Ala Leu Gly Arg Ser Phe Leu His Gly
325 330 335
Pro Glu Leu Asp Lys Gly Gln Leu Arg Ile His Arg Asp Gly Ile Tyr
340 345 350
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355 360 365
Ser Arg His His Pro Thr Thr Leu Ala Val Gly Ile Cys Ser Pro Ala
370 375 380
Ser Arg Ser Ile Ser Leu Leu Arg Leu Ser Phe His Gln Gly Cys Thr
385 390 395 400
Ile Ala Ser Gln Arg Leu Thr Pro Leu Ala Arg Gly Asp Thr Leu Cys
405 410 415
Thr Asn Leu Thr Gly Thr Leu Leu Pro Ser Arg Asn Thr Asp Glu Thr
420 425 430
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435 440 445
Ser Ser Gly Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
450 455 460
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
465 470 475 480
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
485 490 495
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
500 505 510
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
515 520 525
Tyr Ser Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
530 535 540
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
545 550 555 560
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
565 570 575
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
580 585 590
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
595 600 605
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
610 615 620
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
625 630 635 640
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
645 650 655
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
660 665 670
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
675 680

Claims (25)

1.一种包括单链融合多肽的CD27受体激动剂蛋白，包括：
(i)第一可溶性CD27L结构域，
(ii)第一肽接头，
(iii)第二可溶性CD27L结构域，
(iv)第二肽接头，以及
(v)第三可溶性CD27L结构域，以及
(vi)铰链接头，选自由SEQ ID NO：16和19-24组成的组，以及
(vii)抗体Fc片段，其中所述抗体Fc片段(vii)由SEQ ID NO：13中所示的氨基酸序列或SEQ ID NO：13的氨基酸1-217组成，
其中可溶性CD27L结构域各包括无茎CD27受体结合位点，
其中所述抗体Fc片段(vii)通过所述铰链接头(vi)融合至第三CD27L结构域(v)的C末端端部，
其中，第一可溶性CD27L结构域的氨基酸序列由根据SEQ ID NO：1的人CD27L的氨基酸51至193的序列组成，第二可溶性CD27L结构域的氨基酸序列由根据SEQ ID NO：1的人CD27L的氨基酸51至193的序列组成，第三可溶性CD27L结构域的氨基酸序列由根据SEQ ID NO：1的人CD27L的氨基酸51至193的序列组成，
其中，所述第一和第二肽接头(ii)和(iv)独立地具有3-8个氨基酸的长度，
其中，所述第一和所述第二肽接头(ii)和(iv)是甘氨酸/丝氨酸接头，
第一可溶性CD27L结构域、第二可溶性CD27L结构域和第三可溶性CD27L结构域不具有突变或具有N63D突变。
2.根据权利要求1所述的CD27受体激动剂蛋白，其中，所述第一和所述第二肽接头(ii)和(iv)独立地具有3、4、5、6、7或8个氨基酸的长度。
3.根据权利要求1所述的CD27受体激动剂蛋白，其中，所述第一和所述第二肽接头(ii)和(iv)包括可以糖基化的天冬酰胺残基。
4.根据权利要求1所述的CD27受体激动剂蛋白，其中，所述第一和所述第二肽接头(ii)和(iv)由根据SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成。
5.根据权利要求1所述的CD27受体激动剂蛋白，其另外包括N末端信号肽结构域，其包括蛋白酶切割位点，和/或其另外包括C末端元件，所述C末端元件包括和/或连接至识别/纯化结构域。
6.根据权利要求5所述的CD27受体激动剂蛋白，其中，所述N末端信号肽结构域是SEQID NO:17的N末端信号肽结构域，以及所述识别/纯化结构域是根据SEQ ID NO:18的Strep标签。
7.根据权利要求1所述的CD27受体激动剂蛋白，包括SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：25、27、28、30-35和/或SEQ ID NO：43-47中任一者的氨基酸序列。
8.根据权利要求1所述的CD27受体激动剂蛋白，包括两种多肽，每种多肽具有如SEQ IDNO：27、30-35和/或43-47中任一者所示的氨基酸序列。
9.根据权利要求8所述的CD27受体激动剂蛋白，其中，所述两种多肽通过在以下位置处形成的三个链间二硫键而共价连接：
a)SEQ ID No：27、29、30、35的位置457、463和466，或
b)SEQ ID No：31、43、47的位置453、459和462，或
c)SEQ ID NO：32的位置450、456和459，或
d)SEQ ID NO：33的位置436、442和445，或
e)SEQ ID NO：34的位置454、460和463，或
f)SEQ ID NO：44、46的位置442、448和451，或
g)SEQ ID NO：45的位置438、444和447。
10.根据权利要求8或9所述的CD27受体激动剂蛋白，包括选自SEQ ID NO：27、29、30、34、35的N149和N300，或SEQ ID NO：31、32、43、47的N149，或SEQ ID NO：33的N145，或SEQ IDNO：44、46的N144和N290，或SEQ ID NO：45的N144的列表的一种或多种N-糖基化的天冬酰胺残基。
11.根据权利要求1所述的CD27受体激动剂蛋白，其中，所述一种或多种多肽进一步翻译后修饰。
12.根据权利要求11所述的CD27受体激动剂蛋白，其中，所述翻译后修饰包括N末端谷氨酰胺至焦谷氨酸的修饰。
13.一种核酸分子，编码权利要求1-12中任一项所述的CD27受体激动剂蛋白。
14.根据权利要求13所述的核酸分子，其与表达控制序列可操作性连接。
15.一种表达载体，包括根据权利要求13或14所述的核酸分子。
16.一种分离的细胞，用权利要求13或14所述的核酸分子或权利要求15所述的载体转化或转染，其中，所述分离的细胞是原核细胞、酵母细胞、昆虫细胞或动物细胞。
17.根据权利要求16所述的分离的细胞，其中，所述分离的细胞是哺乳动物细胞。
18.根据权利要求16所述的分离的细胞，其中，所述分离的细胞是人细胞或中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
19.一种药物或诊断组合物，包括作为活性剂的权利要求1-12中任一项所述的CD27受体激动剂蛋白、权利要求13或14所述的核酸分子或权利要求15所述的载体。
20.根据权利要求19所述的药物或诊断组合物，还包括一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂和/或佐剂。
21.根据权利要求19或20所述的药物组合物在制备用于治疗由CD27L功能障碍引起的、与CD27L功能障碍相关的和/或伴随CD27L功能障碍的疾患的药物中的用途。
22.根据权利要求21所述的用途，其中，所述治疗是预防和/或治疗。
23.根据权利要求21所述的用途，其中，所述疾患选自增殖性疾患、传染病、炎性疾病、代谢性疾病、自身免疫性疾病、退行性疾病、凋亡相关疾病和移植排斥。
24.根据权利要求23所述的用途，其中，所述增殖性疾患是肿瘤；所述自身免疫性疾病是类风湿性和/或关节炎疾病；以及，所述退行性疾病是神经退行性疾病。
25.根据权利要求24所述的用途，其中，所述肿瘤是实体肿瘤或淋巴肿瘤；以及，所述神经退行性疾病是多发性硬化。
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