CN118251409A - 分子开关调控型嵌合抗原受体细胞和抗体的组合及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及分子开关调控型嵌合抗原受体多肽,其包含人源化抗P329G突变scFv序列、铰链区/间隔区、跨膜区、共刺激信号结构域和刺激信号结构域;经工程化以表达所述分子开关调控型嵌合抗原受体多肽的免疫效应细胞;以及制备所述免疫效应细胞的方法。本发明还涉及能够特异性结合CLDN18.2分子的P329G突变抗体以及制备所属P329G突变抗体的方法。包含所述免疫效应细胞和所述P329G突变抗体的药物组合能够用于治疗与CLDN18.2相关的疾病,例如表达或过表达CLDN18.2的癌症。
Description
本发明总体上涉及经工程化以表达分子开关调控型嵌合抗原受体的免疫效应细胞(例如,T细胞)与抗体的组合,并涉及所述组合用于治疗与CLDN18.2相关的疾病,例如表达或过表达CLDN 18.2的癌症。
传统嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)是通过T细胞上的嵌合抗原受体(CAR)分子直接靶向肿瘤细胞的表面抗原,从而达到识别和杀伤肿瘤的目的,其中所述嵌合抗原受体的N端包含识别抗原的抗原结合结构域,例如,针对抗原的单链抗体片段(scFv)。传统嵌合抗原受体T细胞的缺陷在于,所述CAR-T细胞的活性缺乏控制,只要所述CAR-T细胞针对的抗原阳性细胞存在,则CAR-T细胞就会持续识别并杀伤这些抗原阳性细胞。
由于CAR-T细胞靶向的绝大部分肿瘤抗原不具有肿瘤特异性,这些肿瘤抗原除了在肿瘤细胞上表达之外,在很多正常组织尤其是重要组织器官往往也存在低水平表达,CAR-T细胞对于所述正常组织的识别杀伤导致“在靶/脱肿瘤(On-target/off tumor)”毒性,这可能引起严重的毒副效应。例如,靶向HER2的CAR-T细胞由于识别表达低水平HER2的肺表皮细胞,所述CAR-T细胞在回输入体内后快速引起肺水肿、呼吸窘迫,继发多器官功能衰竭,导致患者死亡(Morgan RA,Yang JC,Kitano M,等人,Case report of a serious adverse event following the administration of T cells transduced with a chimeric antigen receptor recognizing ERBB2[J]Mol Ther.2010;18(4):843–851.doi:10.1038/mt.2010.24)。在靶向CEA、EGFRviii等靶点的CAR-T细胞临床试验中同样报道了类似的肺毒副效应。又例如,临床使用靶向CD19的CAR-T细胞治疗CD19阳性血液肿瘤,由于所述CAR-T细胞持续存在于体内,这导致患者即使在肿瘤细胞清除后其正常B细胞(表达CD19)及其相关体液免疫功能仍持续缺失。
为了降低CAR-T细胞存在的“在靶/脱肿瘤(On-target/off tumor)”毒性,现有技术中通常采用以下策略。一种策略是在CAR设计时,将CAR中包含的抗原结合结构域设计为靶向肿瘤表面高表达而正常组织不表达或低表达的靶抗原。另一种策略是,严格控制施用的T细胞剂量,因为过多的CAR-T细胞受抗原刺激后会呈指数级递增,更易引起在靶/脱肿瘤效应。还有一种策略是,在构建CAR时引入诱导型自杀基因,如诱导型Caspase-9”(iCasp9)自杀基因,当观察到患者发生在靶/脱肿瘤毒性时,施用AP1903(一种能够激活iCasp9的二聚化化学诱导剂)使CAR-T细胞发生凋亡,减轻毒性(张慧慧等人,自杀基因作为一种“安全性开关”控制CAR-T细胞毒性的临床前研究,中国肿瘤生物治疗杂志,2021,28(3):225-231);也有利用单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)基因作为自杀基因,通过施用更昔洛韦治疗诱导CAR-T细胞发生凋亡的报导。另外,也有报导使用电穿孔转染方法使T细胞瞬时表达CAR, 通过一过性杀伤功能来发挥治疗作用(Kenderian SS等人,CD33-specific chimeric antigen receptor T cells exhibit potent preclinical activity against human acute myeloid leukemia[J]Leukemia.2015;29(8):1637–1647)。
对于现有技术中报导的使用自杀基因作为“开关”控制CAR-T“在靶/脱肿瘤(On-target/off tumor)”毒性的方案,在将iCasp9导入CAR-T细胞的情形,AP1903属于实验药品,实验人员必须签署协议,才能通过供应商获得;在将HSV-TK基因导入CAR-T细胞的情形,虽然更昔洛韦已用于控制干细胞移植中的移植物抗宿主病,而且临床上获得一定成效,但药物自身有免疫原性,导致清除靶细胞以外的细胞(Traversari C等人,The potential immunogenicity of the TK suicide gene does not prevent full clinical benefit associated with the use of TK-transduced donor lymphocytes in HSCT for hematologic malignancies[J]Blood.2007;109(11):4708–4715),此外,TK作用的机制是细胞有丝分裂时干扰DNA合成,仅作用于分裂细胞,需要几天甚至几周才能达到预期效果。因此,本领域仍有开发其他分子开关调控型嵌合抗原受体细胞用于治疗癌症的迫切需要。
发明概述
本发明人通过研究,开发了一组新型分子开关调控型嵌合抗原受体细胞,通过将Pro329Gly(抗体Fc段根据EU编号的第329位脯氨酸突变为甘氨酸,简写为P329G)突变抗体作为“分子开关”或适体(adaptor),构建了这样的CAR分子,其能够特异结合包含P329G突变Fc结构域的抗体而不结合不包含P329G突变Fc结构域的抗体(本文中也称为“野生型抗体”),由此,通过将表达所述CAR的免疫效应细胞(例如,T细胞)与作为“分子开关”抗体组合,用于治疗与CLDN18.2相关的疾病,例如表达或过表达CLDN 18.2的癌症,所述癌症是例如CLDN18.2阳性实体瘤。
因此,在第一方面,本发明提供了分子开关调控型嵌合抗原受体(CAR)多肽,其包含
(1)人源化抗P329G突变scFv序列,其中所述scFv序列包含能够特异性结合包含P329G突变的抗体Fc结构域,但不能特异性结合未突变的亲本抗体Fc结构域的如下序列:
(i)重链可变区,其包含根据Kabat编号的
(a)氨基酸序列RYWMN(SEQ ID NO:54)所示的重链互补决定区CDR H1、或所述CDR H1的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体;
(b)氨基酸序列EITPDSSTINYAPSLKG(SEQ ID NO:55)所示的CDR H2、或所述CDR H2的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体;和
(c)氨基酸序列PYDYGAWFAS(SEQ ID NO:56)所示的CDR H3、或所述CDR H3的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体;和
(ii)轻链可变区,其包含根据Kabat编号的
(d)氨基酸序列RSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO:57)所示的轻链互补决定区(CDR L)1、或所述CDR L1的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体;
(e)氨基酸序列GTNKRAP(SEQ ID NO:58)所示的CDR L2、或所述CDR L2的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体;和
(f)氨基酸序列ALWYSNHWV(SEQ ID NO:59)所示的CDR L3、或所述CDR L3的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体;
其中所述氨基酸变化是氨基酸的添加、缺失或取代
(2)铰链区/间隔区,其选自
(i)(G
4S)
n、(SG
4)
n或G
4(SG
4)
n肽接头,其中“n”是1至10的整数,例如2至4的整数,例如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5所示的序列;
(ii)IgG4间隔区(SEQ ID NO 6;ESKYGPPCPPCP),或其具有至少80%的序列同一性的间隔区;
(iii)CD28铰链区(SEQ ID NO 7;IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP),或其具有至少80%的序列同一性的间隔区。
(3)跨膜区(TM),其选自
(i)CD28跨膜结构域或其具有1-5个氨基酸修饰的变体,例如,SEQ ID NO:8所示的序列或其具有1-2个氨基酸修饰的变体;
(ii)CD8跨膜结构域或其具有1-5个氨基酸修饰的变体,例如,SEQ ID NO:9所示的序列或其具有1-2个氨基酸修饰的变体;
(4)共刺激信号结构域(CSD)其选自:
(i)4-1BB共刺激结构域或其具有1-5个氨基酸修饰的变体,例如,SEQ ID NO:11所示的序列或其具有1-2个氨基酸修饰的变体;
(ii)CD28共刺激结构域或其具有1-5个氨基酸修饰的变体,例如,SEQ ID NO:10所示的序列或其具有1-2个氨基酸修饰的变体,例如,SEQ ID NO:12所示的序列;
(5)刺激信号结构域(SSD),为CD3ζ信号传导结构域或其具有1-10个氨基酸修饰的变体,例如,SEQ ID NO:13所示的序列或其具有1-10个、1-5个氨基酸修饰的变体;
其中所述氨基酸修饰是氨基酸的添加、缺失或取代。
在一些实施方案中,本发明提供了分子开关调控型嵌合抗原受体(CAR)多肽,其包含
(1)人源化抗P329G突变scFv序列,其中所述scFv序列包含能够特异性结合包含P329G突变的抗体Fc结构域,但不能特异性结合未突变的亲本抗体Fc结构域的如下序列:
(i)重链可变区,其包含根据Kabat编号的
(a)氨基酸序列RYWMN(SEQ ID NO:54)所示的CDR H1;
(b)氨基酸序列EITPDSSTINYAPSLKG(SEQ ID NO:55)所示的CDR H2;和
(c)氨基酸序列PYDYGAWFAS(SEQ ID NO:56)所示的CDR H3;和
(ii)轻链可变区,其包含根据Kabat编号的
(d)氨基酸序列RSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO:57)所示的CDR L1;
(e)氨基酸序列GTNKRAP(SEQ ID NO:58)所示的CDR L2;和
(f)氨基酸序列ALWYSNHWV(SEQ ID NO:59)所示的CDR L3;
例如,(i)重链可变区,其包含SEQ ID NO:2的序列或与其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列,和
(ii)轻链可变区,其包含SEQ ID NO:3的序列或与其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列;
例如,(i)重链可变区,其包含SEQ ID NO:2的序列,和
(ii)轻链可变区,其包含SEQ ID NO:3的序列;
(2)铰链区/间隔区,其选自
(i)(G
4S)
n、(SG
4)
n或G
4(SG
4)
n肽接头,其中“n”是1至10的整数,例如2至4的整数,例如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5所示的序列;
(ii)IgG4间隔区(SEQ ID NO 6;ESKYGPPCPPCP),或其具有至少90%的序列同一性的间隔区;
(iii)CD28铰链区(SEQ ID NO 7;IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP),或其具有至少90%、至少95%的序列同一性的间隔区。
(3)跨膜区(TM),其选自
(i)SEQ ID NO:8所示的CD28跨膜结构域或其具有1个氨基酸修饰的变体;
(ii)SEQ ID NO:9所示的CD8跨膜结构域或其具有1个氨基酸修饰的变体;
(4)共刺激信号结构域(CSD)其选自:
(i)SEQ ID NO:11所示的4-1BB共刺激结构域或其具有1个氨基酸修饰的变体;
(ii)SEQ ID NO:10所示的CD28共刺激结构域或其具有1个氨基酸修饰的变体,例如,SEQ ID NO:12所示的序列;
(5)刺激信号结构域(SSD),为SEQ ID NO:13所示的CD3ζ信号传导结构域或其具有1个氨基酸修饰的变体;
其中所述氨基酸修饰是氨基酸的添加、缺失或取代。
在一些实施方案中,本发明的分子开关调控型CAR多肽还包含位于N端的信号肽序列,例如,SEQ ID NO:1所示的信号肽序列,
在一些实施方案中,本发明的分子开关调控型CAR多肽具有SEQ ID NO:21、23或25所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中,本发明的分子开关调控型CAR多肽还包含位于跨膜区(TM)和共刺激信号结构域(CSD)之间的近膜胞内结构域,例如,CD3ε链的近膜胞内信号结构域,例如,CD3ε链的如SEQ ID NO:14所示的近膜胞内信号结构域。
在第二方面,本发明提供了编码如本文所述的分子开关调控型CAR多肽的核酸、包含编码本文所述CAR多肽的核酸的载体、和包含本文所述CAR核酸分子或载体的细胞、或表达 本文所述CAR多肽的细胞,优选地,所述细胞是自体T细胞或同种异体T细胞。
在一些实施方案中,编码本发明的分子开关调控型CAR多肽的核酸分子包含SEQ ID NO:22、24或26所示的核苷酸序列。
在一个实施方案中,本发明采用人PBMC制备了原代P329G CAR-T细胞。用本发明的CAR分子转导的CAR-T细胞具有体外效应功能,在体外具有持续杀伤靶细胞的活性。
在第三方面,本发明提供了一种产生细胞、例如免疫效应细胞的方法,所述方法包括将编码本文所述CAR多肽的核酸分子(例如,RNA分子,例如mRNA分子),或包含编码本文所述CAR多肽的核酸分子的载体引入(例如转导)免疫效应细胞。
在一些实施方案中,所述免疫效应细胞是T细胞,例如,所述T细胞是自体T细胞或同种异体T细胞,例如,所述免疫效应细胞是自人PBMC分离T细胞后制备的。
在第四方面,本发明提供了药物组合,其包含(i)选自表达本发明第一方面所述CAR多肽的免疫效应细胞(例如,T细胞、NK细胞)、第二方面的编码所述CAR多肽的核酸分子、载体和它们的任意组合,以及(ii)包含P329G突变的特异性结合CLDN18.2分子的抗体或抗原结合片段(也称为“P329G突变抗体”、“PG抗体”、“PG Ab”),例如,所述P329G突变抗体包含突变Fc结构域,其中根据EU编号的P329位置处的氨基酸突变为甘氨酸(G),与未突变的亲本抗体Fc结构域的Fcγ受体结合相比,突变Fc结构域的Fcγ受体结合降低;以及任选地可药用辅料。
在一些实施方案中,本发明所述特异性结合CLDN18.2分子的抗体或抗原结合片段,其包含重链可变区和轻链可变区,其中:
(a)所述重链可变区包含根据Kabat编号的氨基酸序列SYVMS(SEQ ID NO:60)所示的CDR H1、或所述CDR H1的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体;氨基酸序列TISHSGGSTYYADSVKG(SEQ ID NO:61)所示的CDR H2、或所述CDR H2的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体;和氨基酸序列DAPYYDILTGYRY(SEQ ID NO:62)所示的CDR H3、或所述CDR H3的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体;所述轻链可变区包含根据Kabat编号的氨基酸序列RASQSISSWLA(SEQ ID NO:63)所示的CDR L1、或所述CDR L1的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体;氨基酸序列KASSLES(SEQ ID NO:64)所示的CDR L2、或所述CDR L2的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体;和氨基酸序列QQYNSYSYT(SEQ ID NO:65)所示的CDR L3、或所述CDR L3的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体;
(b)所述重链可变区包含根据Kabat编号的氨基酸序列SYNIH(SEQ ID NO:66)所示的CDR H1、或所述CDR H1的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体;氨基酸序列YIAPFQGDSRYNQKFKG(SEQ ID NO:67)所示的CDR H2、或所述CDR H2的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体;和氨基酸序列LNRGNSLDY(SEQ ID NO:68)所示的CDR H3、或所述CDR H3的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体;所述轻链可变区包含根据Kabat编号的氨基酸序列KSSQSLFNSGNQRNYLT(SEQ ID NO:69) 所示的CDR L1、或所述CDR L1的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体;氨基酸序列WASTRES(SEQ ID NO:70)所示的CDR L2、或所述CDR L2的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体;和氨基酸序列QNNYIYPLT(SEQ ID NO:71)所示的CDR L3、或所述CDR L3的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体;
(c)所述重链可变区包含根据Kabat编号的氨基酸序列SYNIH(SEQ ID NO:72)所示的CDR H1、或所述CDR H1的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体;氨基酸序列YIAPFQGDARYNQKFKG(SEQ ID NO:73)所示的CDR H2、或所述CDR H2的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体;和氨基酸序列LNRGQSLDY(SEQ ID NO:74)所示的CDR H3、或所述CDR H3的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体;所述轻链可变区包含根据Kabat编号的氨基酸序列KSSQSLFNAGNQRNYLT(SEQ ID NO:75)所示的CDR L1、或所述CDR L1的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体;氨基酸序列WASTRES(SEQ ID NO:76)所示的CDR L2、或所述CDR L2的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体;和氨基酸序列QNNYIYPLT(SEQ ID NO:77)所示的CDR L3、或所述CDR L3的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体;
(d)所述重链可变区包含根据Kabat编号的氨基酸序列SYNIH(SEQ ID NO:78)所示的CDR H1、或所述CDR H1的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体;氨基酸序列YIAPFQGDARYNQKFKG(SEQ ID NO:79)所示的CDR H2、或所述CDR H2的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体;和氨基酸序列LNRGNALDY(SEQ ID NO:80)所示的CDR H3、或所述CDR H3的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体;所述轻链可变区包含根据Kabat编号的氨基酸序列KSSQSLFQSGNQRNYLT(SEQ ID NO:81)所示的CDR L1、或所述CDR L1的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体;氨基酸序列WASTRES(SEQ ID NO:82)所示的CDR L2、或所述CDR L2的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体;和氨基酸序列QNNYIYPLT(SEQ ID NO:83)所示的CDR L3、或所述CDR L3的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体;
(e)所述重链可变区包含根据Kabat编号的氨基酸序列SYNIS(SEQ ID NO:84)所示的CDR H1、或所述CDR H1的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体;氨基酸序列YIAPFQGDARYNQKFKG(SEQ ID NO:85)所示的CDR H2、或所述CDR H2的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体;和氨基酸序列LNRGNSLDY(SEQ ID NO:86)所示的CDR H3、或所述CDR H3的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体;所述轻链可变区包含根据Kabat编号的氨基酸序列KSSQSLFNSGNQRNYLT(SEQ ID NO:87)所示的CDR L1、或所述CDR L1的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体;氨基酸序列WASTRES(SEQ ID NO:88)所示的CDR L2、或所述CDR L2的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体;和氨基酸序列QNNYIYPLT(SEQ ID NO:89)所示的CDR L3、或所述CDR L3的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体;或
(f)所述重链可变区包含根据Kabat编号的氨基酸序列TYWMH(SEQ ID NO:90)所示的 CDR H1、或所述CDR H1的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体;氨基酸序列LIDPSDSETRLNQKFKD(SEQ ID NO:91)所示的CDR H2、或所述CDR H2的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体;和氨基酸序列WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:92)所示的CDR H3、或所述CDR H3的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体;所述轻链可变区包含根据Kabat编号的氨基酸序列KSSQSLLNSGNQKNYLT(SEQ ID NO:93)所示的CDR L1、或所述CDR L1的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体;氨基酸序列WASTRES(SEQ ID NO:94)所示的CDR L2、或所述CDR L2的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体;和氨基酸序列QNDYSYPLT(SEQ ID NO:95)所示的CDR L3、或所述CDR L3的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体;
其中所述氨基酸变化是氨基酸的添加、缺失或取代。
在一些实施方案中,本发明提供了特异性结合CLDN18.2分子的抗体或抗原结合片段,其包含重链可变区和轻链可变区,其中:
(a)所述重链可变区包含根据Kabat编号的氨基酸序列SYVMS(SEQ ID NO:60)所示的CDR H1;氨基酸序列TISHSGGSTYYADSVKG(SEQ ID NO:61)所示的CDR H2;和氨基酸序列DAPYYDILTGYRY(SEQ ID NO:62)所示的CDR H3;所述轻链可变区包含根据Kabat编号的氨基酸序列RASQSISSWLA(SEQ ID NO:63)所示的CDR L1;氨基酸序列KASSLES(SEQ ID NO:64)所示的CDR L2;和氨基酸序列QQYNSYSYT(SEQ ID NO:65)所示的CDR L3;
(b)所述重链可变区包含根据Kabat编号的氨基酸序列SYNIH(SEQ ID NO:66)所示的CDR H1;氨基酸序列YIAPFQGDSRYNQKFKG(SEQ ID NO:67)所示的CDR H2;和氨基酸序列LNRGNSLDY(SEQ ID NO:68)所示的CDR H3;所述轻链可变区包含根据Kabat编号的氨基酸序列KSSQSLFNSGNQRNYLT(SEQ ID NO:69)所示的CDR L1;氨基酸序列WASTRES(SEQ ID NO:70)所示的CDR L2;和氨基酸序列QNNYIYPLT(SEQ ID NO:71)所示的CDR L3;
(c)所述重链可变区包含根据Kabat编号的氨基酸序列SYNIH(SEQ ID NO:72)所示的CDR H1;氨基酸序列YIAPFQGDARYNQKFKG(SEQ ID NO:73)所示的CDR H2;和氨基酸序列LNRGQSLDY(SEQ ID NO:74)所示的CDR H3;所述轻链可变区包含根据Kabat编号的氨基酸序列KSSQSLFNAGNQRNYLT(SEQ ID NO:75)所示的CDR L1;氨基酸序列WASTRES(SEQ ID NO:76)所示的CDR L2;和氨基酸序列QNNYIYPLT(SEQ ID NO:77)所示的CDR L3;
(d)所述重链可变区包含根据Kabat编号的氨基酸序列SYNIH(SEQ ID NO:78)所示的CDR H1;氨基酸序列YIAPFQGDARYNQKFKG(SEQ ID NO:79)所示的CDR H2;和氨基酸序列LNRGNALDY(SEQ ID NO:80)所示的CDR H3;所述轻链可变区包含根据Kabat编号的氨基酸序列KSSQSLFQSGNQRNYLT(SEQ ID NO:81)所示的CDR L1;氨基酸序列WASTRES(SEQ ID NO:82)所示的CDR L2;和氨基酸序列QNNYIYPLT(SEQ ID NO:83)所示的CDR L3;
(e)所述重链可变区包含根据Kabat编号的氨基酸序列SYNIS(SEQ ID NO:84)所示的CDR H1;氨基酸序列YIAPFQGDARYNQKFKG(SEQ ID NO:85)所示的CDR H2;和氨基酸序列LNRGNSLDY(SEQ ID NO:86)所示的CDR H3;所述轻链可变区包含根据Kabat编号的氨基酸序列KSSQSLFNSGNQRNYLT(SEQ ID NO:87)所示的CDR L1;氨基酸序列WASTRES(SEQ ID NO:88)所示的CDR L2;和氨基酸序列QNNYIYPLT(SEQ ID NO:89)所示的CDR L3;或
(f)所述重链可变区包含根据Kabat编号的氨基酸序列TYWMH(SEQ ID NO:90)所示的CDR H1;氨基酸序列LIDPSDSETRLNQKFKD(SEQ ID NO:91)所示的CDR H2;和氨基酸序列NRWLLG(SEQ ID NO:92)所示的CDR H3;所述轻链可变区包含根据Kabat编号的氨基酸序列KSSQSLLNSGNQKNYLT(SEQ ID NO:93)所示的CDR L1;氨基酸序列WASTRES(SEQ ID NO:94)所示的CDR L2;和氨基酸序列QNDYSYPLT(SEQ ID NO:95)所示的CDR L3。
在一些实施方案中,本发明获得了特异性结合CLDN18.2分子的抗体或抗原结合片段,其包含重链可变区和轻链可变区,其中:
(a)重链可变区包含SEQ ID NO:34的序列或与其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列,且轻链可变区包含SEQ ID NO:35的序列或与其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列;
(b)重链可变区包含SEQ ID NO:36的序列或与其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列,且轻链可变区包含SEQ ID NO:37的序列或与其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列;
(c)重链可变区包含SEQ ID NO:44的序列或与其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列,且轻链可变区包含SEQ ID NO:45的序列或与其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列;
(d)重链可变区包含SEQ ID NO:46的序列或与其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列,且轻链可变区包含SEQ ID NO:47的序列或与其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列;
(e)重链可变区包含SEQ ID NO:48的序列或与其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列,且轻链可变区包含SEQ ID NO:49的序列或与其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列;或
(f)重链可变区包含SEQ ID NO:42的序列或与其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列,且轻链可变区包含SEQ ID NO:43的序列或与其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列。
在一些实施方案中,本发明获得了特异性结合CLDN18.2分子的抗体或抗原结合片段,其包含重链可变区和轻链可变区,其中:
(a)重链可变区包含SEQ ID NO:34的序列,且轻链可变区包含SEQ ID NO:35的序列;
(b)重链可变区包含SEQ ID NO:36的序列,且轻链可变区包含SEQ ID NO:37的序列;
(c)重链可变区包含SEQ ID NO:44的序列,且轻链可变区包含SEQ ID NO:45的序列;
(d)重链可变区包含SEQ ID NO:46的序列,且轻链可变区包含SEQ ID NO:47的序列;
(e)重链可变区包含SEQ ID NO:48的序列,且轻链可变区包含SEQ ID NO:49的序列;或
(f)重链可变区包含SEQ ID NO:42的序列,且轻链可变区包含SEQ ID NO:43的序列;
在一些实施方案中,本发明的特异性结合CLDN18.2分子的抗体是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体;优选地,其是IgG1或IgG4抗体;更优选地,其是IgG1抗体。
在一些实施方案中,本发明的特异性结合CLDN18.2分子的抗体的抗原结合片段是Fab、Fab’、F(ab’)
2、Fv、单链Fv、单链Fab、双体抗体(diabody)。
对于所述特异性结合CLDN18.2分子的抗体或抗原结合片段,通过将根据EU编号的P329位置处的氨基酸突变为甘氨酸(G)获得了具有突变Fc结构域的抗体,其中,与未突变的亲本抗体Fc结构域的Fcγ受体结合相比,突变Fc结构域的Fcγ受体结合降低。
在一些实施方案中,所述突变Fc结构域是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体的突变Fc结构域,优选地,所述突变Fc结构域是IgG1或IgG4抗体的突变Fc结构域;更优选地,所述突变Fc结构域是IgG1抗体的突变Fc结构域;
在一些实施方案中,特异性结合CLDN18.2分子的抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO:39所示的重链恒定区序列或与其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列且其中根据EU编号的P329位置处的氨基酸突变为G;
例如,所述抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO:39所示的重链恒定区序列或与其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列且其中根据EU编号的P329位置处的氨基酸突变为G;和SEQ ID NO:40所示的轻链恒定区序列或与其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列。
在一些实施例方案中,(i)所述免疫效应细胞是自体T细胞或同种异体T细胞制备的表达本发明第一方面所述的分子开关调控型CAR多肽的T细胞,例如,所述免疫效应细胞是自人PBMC分离的T细胞制备的表达本发明第一方面所述的分子开关调控型CAR多肽的T细胞;(ii)所述P329G突变抗体是HB37A6 PG Ab(本文中也简称为“A6 PG Ab”、“A6 PG抗体”、“P329G A6抗体”)、Hz69H9 PG Ab(本文中也简称为“H9 PG Ab”、“H9 PG抗体”)、Hz69H9-1.2 PG Ab(本文中也简称为“H9-1.2 PG Ab”、“H9-1.2 PG抗体”)、Hz69H9-2.1 PG Ab(本文中也简称为“H9-2.1 PG Ab”、“H9-2.1 PG抗体”)、Hz69H9-SA PG Ab(本文中也简称为“H9-SA PG Ab”、“H9-SA PG抗体”)、和/或Hz3G3 PG Ab(本文中也简称为“G3 PG Ab”、“G3 PG抗体”)。
在一个实施方案中,本发明利用人PBMC制备的原代P329G CAR-T细胞,并利用P329G突变的抗CLDN18.2人源化抗体,在体外共培养体系中评价了P329G CAR-T细胞针对Claudin18.2(也称为CLDN18.2)肿瘤细胞抗原通过抗体依赖发挥的效应功能,由此,P329G突 变的抗CLDN18.2抗体能够作为“分子开关”调节P329G CAR-T细胞对CLDN18.2阳性肿瘤细胞的识别及杀伤活性,该体外效应功能与直接靶向CLDN18.2阳性肿瘤细胞的传统CAR-T细胞相当,但传统CAR-T细胞的活性不依赖P329G突变抗体。
又在一些实施方案中,本发明在接种CLDN18.2表达阳性的人肿瘤细胞系来源肿瘤的免疫缺陷小鼠体内验证了P329G CAR-T细胞联合P329G突变抗体的抗肿瘤效应,并对抗体给药剂量、间隔等进行了探索;其中,尽管提高一些P329G突变抗体剂量诱导了毒性反应,但小鼠能够耐受这一毒性反应,在停止抗体给药后,小鼠体重恢复正常;而相应的传统CAR-T细胞在同等剂量细胞回输情况下诱导了严重的毒副反应,小鼠在1周内死亡。
又在一些实施方案中,本发明在接种CLDN18.2表达阳性的人肿瘤细胞系来源肿瘤的免疫缺陷小鼠体内,通过流式细胞术监测了P329G CAR-T细胞体内持续情况。P329G CAR-T细胞联合P329G突变抗体的本发明药物组合能够显著地体内扩增P329G CAR-T细胞,并呈现轻微的抗体剂量依赖性。
在一些实施方案中,表达本发明CAR分子(例如,HuR968B CAR、HuR9684M CAR)的原代CAR-T细胞与P329G突变的抗CLDN18.2人源化抗体的组合在体外反复杀伤实验中表现出显著好于现有技术中的CAR分子,表达本发明CAR分子(例如,HuR968B CAR、HuR9684M CAR)的原代CAR-T细胞具备持续杀伤肿瘤细胞的能力,并且维持了CAR分子的特异性,本发明的CAR-T细胞在与肿瘤细胞的共培养实验中,只有在P329G突变抗体存在情况下CAR-T细胞才能被激活、增殖、分泌效应细胞因子并对肿瘤细胞产生杀伤效应,而未携带P329G突变的WT抗体不能激发P329G CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤效应功能。
在一些实施方案中,本发明的药物组合中使用了亲和力不同的P329G突变抗体分子,通过检测P329G CAR-T细胞的功能,发现了P329G突变抗体亲和力能够影响P329G CAR-T细胞的特异性识别效应和“在靶/脱肿瘤”效应。
在一些实施方案中,本发明的药物组合中使用亲和力降低的抗CLDN18.2抗体能够在维持抗肿瘤效应同时降低由CAR-T细胞“在靶/脱肿瘤”识别导致的毒副效应。
在一些实施方案中,本发明的药物组合中的(i)以1×10
6个细胞-1×10
12个免疫效应细胞、优选地为5×10
6个细胞-1×10
11个、更优选地为1×10
7个细胞-1×10
10个免疫效应细胞、例如5×10
7个细胞、2.5×10
8个细胞、7.5×10
8个细胞、1.25×10
9个免疫效应细胞的剂量以单次或多次静脉内施用;和
(ii)为0.1-10mg/kg、优选地为0.3mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg、3mg/kg、5mg/kg、7mg/kg或9mg/kg的剂量单元的形式,优选为胃肠外、更优选静脉内施用剂型。
在一些实施方案中,本发明的药物组合中的(i)和(ii)分开、同时或依次施用。
在一些实施方案中,本发明的药物组合中的(i)和(ii)分开施用,例如,第一天静脉内施用(i),第二天施用(ii),然后按照一定频率多次施用(ii),同时通过监测(i)的体内浓度和期望的治疗功效终点,确定是否多次施用(i);或者第一天施用(ii),第二天静脉内施用(i),然后按照一 定频率多次施用(ii),同时通过监测(i)的体内浓度和期望的治疗功效终点,确定是否多次施用(i)。
在一些实施方案中,将本发明的药物组合中的(i)和(ii)各施用一次,然后按照每3-4天一次、每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次的给药频率多次施用(ii),同时通过检测(i)的体内浓度和期望的治疗功效终点,确定是否多次施用(i)。
在第五方面,本发明提供了本发明的药物组合的用途,用于在受试者中治疗与CLDN18.2相关的疾病,包括向受试者施用治疗有效量的前述第四方面所定义的药物组合,其中所述与CLDN18.2相关的疾病是例如表达或过表达CLDN 18.2的癌症,所述癌症例如是CLDN18.2阳性实体瘤。
在第六方面,本发明提供了本发明的药物组合在制备用于治疗与CLDN18.2相关的疾病的药物中的用途,所述与CLDN18.2相关的疾病是例如表达或过表达CLDN 18.2的癌症,所述癌症例如是CLDN18.2阳性实体瘤。
在第七方面,本发明提供了用于治疗与CLDN18.2相关的疾病的方法,所述方法包括向受试者施用治疗有效量的本发明的药物组合,其中所述与CLDN18.2相关的疾病是例如表达或过表达CLDN 18.2的癌症,所述癌症例如是CLDN18.2阳性实体瘤。
在第八方面,本发明提供了成套药盒,其包含如前述第四方面所定义的药物组合,优选地所述药盒为药物剂量单元形式。
第九方面,本发明提供了一种药物复合物,其是一种由
(i)包含表达本发明第一方面所述的分子开关调控型CAR多肽的免疫效应细胞(例如,T细胞);和
(ii)包含P329G突变的特异性结合CLDN18.2分子的抗体或抗原结合片段(也称为P329G突变抗体),例如,所述P329G突变抗体包含突变Fc结构域,其中根据EU编号的P329位置处的氨基酸突变为甘氨酸(G),与未突变的亲本抗体Fc结构域的Fcγ受体结合相比,突变Fc结构域的Fcγ受体结合降低。
免疫效应细胞通过CAR多肽的胞外结构域中的人源化抗P329G突变scFv序列与P329G突变抗体的Fc结构域结合而产生的复合物;
例如,其中所述免疫效应细胞是自自体T细胞或同种异体T细胞制备的表达本发明第一方面所述的分子开关调控型CAR多肽的T细胞,例如,所述免疫效应细胞是自人PBMC分离的T细胞制备的表达本发明第一方面所述的分子开关调控型CAR多肽的T细胞;
例如,其中P329G突变抗体是HB37A6 PG Ab、Hz69H9 PG Ab、Hz69H9-1.2 PG Ab、Hz69H9-2.1 PG Ab、Hz69H9-SA PG Ab、和/或Hz3G3 PG Ab。
本发明还提供了所述药物复合物的用途,用于在受试者中治疗与CLDN18.2相关的疾病,优选地,所述与CLDN18.2相关的疾病是例如表达或过表达CLDN 18.2的癌症,所述癌症例如是CLDN18.2阳性实体瘤。
由此,本发明首次证实了本发明的药物组合和药物复合物适用于原代CAR-T细胞并进而 能够在体内外调节CAR-T细胞功能;明确了本发明的药物组合和药物复合物能够赋予CAR-T细胞最佳体内外功能;证实了本发明的药物组合和药物复合物适用于靶向治疗性靶点CLDN18.2而治疗疾病;获得了作为“分子开关”的P329G突变抗体分子的特点(例如,亲和力)对CAR-T细胞功能的影响。
附图简述
结合以下附图一起阅读时,将更好地理解以下详细描述的本发明的优选实施方案。出于说明本发明的目的,图中显示了目前优选的实施方案。然而,应当理解本发明不限于图中所示实施方案的精确安排和手段。
图1显示了4种CAR构建体的结构。图中,“SP”表示信号肽(signal peptide);“TMD”表示跨膜结构域(transmembrane domain);“ICD”表示胞内结构域(intracellular domain);“CSD”表示共刺激信号结构域(costimulatory domain);“SSD”表示刺激信号结构域(stimulatory signaling domain)。在所述构建体中,胞外结构域包含能够特异性结合含有P329G突变的突变Fc结构域的抗原结合部分,且所述抗原结合部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VH)。
图2显示了pRK慢病毒表达载体的图谱。
图3显示了分别插入各CAR构建体后的慢病毒表达载体经限制性内切酶酶切并进行电泳鉴定的图。
图4A显示了分别用7种CAR转导T细胞后,流式细胞术检测CD3
+细胞、CD8
-(CD4
+)T、CD8
+T细胞亚群中CAR的表达。
图4B显示了分别用7种CAR转导T细胞后,通过流式细胞术检测CAR-T细胞的CD45RA、CCR7表达。
图4C显示了分别用7种CAR转导T细胞后,通过流式细胞术检测CAR-T细胞的CD27、CD28表达。
图5显示了通过流式细胞术检测AGS、SNU601、SNU620、NUGC4胃癌细胞系和稳定转染表达CLDN18.2的DAN-G18.2人胰腺癌细胞系细胞上CLDN18.2的表达。
图6A显示了A6抗体(即,HB37A6抗体)、H9抗体(即,Hz69H9抗体)和Zmab抗体分别与稳定表达人、恒河猴、小鼠及大鼠CLDN18.1和CLDN18.2的CHO-GS细胞结合能力;显示了不同浓度WT和P329G突变的A6、H9和Zmab抗体与CLDN18.2表达阳性肿瘤细胞SUN601、NUGC4、DAN-G18.2的结合能力。图中,Con IgG表示对照IgG,为不结合CLDN18.2分子,也不结合CLDN18.1分子的IgG。
图6B显示了WT A6抗体(即,HB37A6抗体)和P329G突变的A6抗体(即,HB37A6 PG抗体)与P329G CAR-T细胞的结合情况。
图6C显示了WT A6抗体(即,HB37A6抗体)和P329G突变A6抗体(即,HB37A6 PG抗体)是否介导PBMC通过ADCC发挥细胞杀伤功能
图6D显示了WT A6抗体(即,HB37A6抗体)和P329G突变A6抗体(即,HB37A6 PG抗 体)是否介导补体通过CDC发挥细胞杀伤功能。
图7A显示了来自供者3(PCH20201100004:allcells,cat:PB004F-C,39岁女性)制备的HuR968B、HuR9684M、Hu28HR968CAR-T细胞在E:T比例1:5情况下反复杀伤SNU601细胞的实验结果。
图7B显示了来自供者3(PCH20201100004:allcells,cat:PB004F-C,39岁女性)制备的HuR968B、HuR9684M、Hu28HR968CAR-T细胞在E:T比例1:10情况下反复杀伤SNU601细胞的实验结果。
图8A显示了来自供者3(PCH20201100004:allcells,cat:PB004F-C,39岁女性)制备的HuR968B、HuR9684M CAR-T细胞对DAN-G18.2肿瘤细胞杀伤效应。
图8B-图8D分别显示了来自供者3(PCH20201100004:allcells,cat:PB004F-C,39岁女性)的HuR968B、HuR9684M CAR-T细胞与肿瘤细胞共培养后效应细胞因子IFN-γ、IL-2、TNF-α的释放结果。
图8E显示了HuR968B CAR-T细胞在不同P329G A6抗体浓度情况下对DAN-G18.2、SNU601肿瘤细胞的杀伤效应。
图8F显示了HuR9684M CAR-T细胞受板包被的WT或P329G A6抗体刺激后的增殖情况。
图8G显示了HuR968B CAR-T细胞受板包被的WT或P329G A6抗体刺激后的增殖情况。
图9A显示了在小鼠中A6抗体药代动力学实验取样时间点及A6抗体ELISA检测示意图。
图9B显示了小鼠中A6抗体的药代动力学实验结果。
图10A显示了在接种人DAN-G18.2肿瘤细胞的免疫缺陷荷瘤小鼠中HuR968B、HuR9684M CAR-T细胞的治疗效应。
图10B显示了在接种人DAN-G18.2肿瘤细胞的免疫缺陷荷瘤小鼠中HuR968B、HuR9684M CAR-T细胞引起的小鼠体重变化。
图10C显示了在接种人DAN-G18.2肿瘤细胞的免疫缺陷荷瘤小鼠中,HuR968B、HuR9684M CAR-T细胞在小鼠体内的扩增情况。
图11A显示了在接种人DAN-G18.2肿瘤细胞的免疫缺陷荷瘤小鼠中HuR968B CAR-T细胞联合不同剂量P329G A6抗体的治疗效应。
图11B显示了在接种人DAN-G18.2肿瘤细胞的免疫缺陷荷瘤小鼠中HuR968B CAR-T细胞联合不同剂量P329G A6抗体的小鼠体重变化。
图11C显示了在接种人DAN-G18.2肿瘤细胞的免疫缺陷荷瘤小鼠中HuR968B CAR-T细胞联合不同剂量P329G A6抗体引起的HuR968B CAR-T细胞在小鼠体内扩增情况。
图12A显示了在接种人DAN-G18.2肿瘤细胞的免疫缺陷荷瘤小鼠中HuR968B CAR-T细胞联合多个剂量P329G抗体的治疗效应。
图12B显示了在接种人DAN-G18.2肿瘤细胞的免疫缺陷荷瘤小鼠中HuR968B CAR-T细胞联合多个剂量P329G抗体引起的小鼠体重变化。
图13A-图13B显示了在接种人DAN-G18.2肿瘤细胞的免疫缺陷荷瘤小鼠中不同HuR968B CAR-T细胞和P329G A6抗体给药顺序产生的抗肿瘤效应。
图14A显示了基于细胞学实验的7个不同抗CLDN18.2抗体与CLDN18.2的结合能力。
图14B展示了采用表面等离子共振法(SPR)测定6个抗体与重组人CLDN18.2蛋白的亲合力图谱。
图15A-图15C分别显示在与DAN-G18.2或SNU601肿瘤细胞共培养的实验中,7个不同抗体诱导HuR968B CAR-T细胞释放效应细胞因子IL-2、IFN-γ、TNF-α的结果。
图15D显示了7个不同抗体诱导HuR968B CAR-T细胞对DAN-G18.2肿瘤细胞的杀伤效应。
图15E显示了采用动态杀伤实验比较高或低亲合力抗体诱导HuR968B CAR-T细胞对CLDN18.2高表达肿瘤细胞的杀伤效应。
图15F显示了采用动态杀伤实验比较高或低亲合力抗体诱导HuR968B CAR-T细胞对CLDN18.2低表达肿瘤细胞的杀伤效应。
图16A显示了在接种人DAN-G18.2肿瘤细胞的免疫缺陷荷瘤小鼠中HuR968B CAR-T细胞联合不同CLDN18.2抗体的治疗效应。
图16B显示了在接种人DAN-G18.2肿瘤细胞的免疫缺陷荷瘤小鼠中HuR968B CAR-T细胞联合不同CLDN18.2抗体引起的小鼠体重变化。
图17A显示了膜蛋白组阵列(Membrane Proteome Array,MPA)研究的流程图。
图17B显示了用于MPA研究的待测试PG-Fc融合蛋白的结构示意图。
图17C显示了待测试PG-Fc融合蛋白与膜蛋白结合的第一轮高通量筛选结果。
图17D显示了待测试PG-Fc融合蛋白与GALNT1和GPR149蛋白结合的第二轮实验结果。
图17E显示了采用IHC在过表达脱靶基因的CHO GS细胞中检测到GALNT1和GPR149蛋白表达,GALNT1以胞浆表达为主,GPR149以胞膜表达为主。
图17F显示了采用IHC在过表达脱靶基因的293T细胞中检测到GALNT1和GPR149蛋白表达,GALNT1以胞浆表达为主,GPR149以胞膜表达为主。
图17G显示了流式细胞术检测的脱靶基因表达,CH2-PG表达细胞作为阳性对照。
图17H显示了HuR968B CAR-T细胞对不同靶细胞的激活效应。
图17I显示了P329G CAR-T细胞与不同靶细胞共培养后效应细胞因子IL-2、TNF-α、IFN-γ释放结果。
图17J显示了P329G CAR-T细胞在E:T比例分别为6.7:1、13:1和20:1情况下对不同靶细胞的持续杀伤结果。
发明详述
除非另外限定,否则本文中所用的全部技术与科学术语具有如本发明所属领域的普通技 术人员通常理解的相同含义。本文所提及的全部出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用的方式完整地并入。此外,本文中所述的材料、方法和例子仅是说明性的并且不意在是限制性的。本发明的其他特征、目的和优点将从本说明书及附图并且从后附的权利要求书中显而易见。
I.定义
为了解释本说明书,将使用以下定义,并且只要适当,以单数形式使用的术语也可以包括复数,并且反之亦然。要理解,本文所用的术语仅是为了描述具体的实施方案,并且不意欲是限制性的。
术语“约”在与数字数值联合使用时意为涵盖具有比指定数字数值小5%的下限和比指定数字数值大5%的上限的范围内的数字数值。
如本文所用,术语“和/或”意指可选项中的任一项或可选项的两项或多项。
在本文中,当使用术语“包含”或“包括”时,除非另有指明,否则也涵盖由所述及的要素、整数或步骤组成的情形。例如,当提及“包含”某个具体序列的抗体可变区时,也旨在涵盖由该具体序列组成的抗体可变区。
术语“Claudins”是一类存在于上皮和内皮紧密连接中的整合素膜蛋白,是紧密连接的重要组成部分,1998年由Shoichiro Tsukita等人发现。该家族有24个成员。人类Claudin 18基因有两个可供选择的1号外显子,因而产生Claudin 18.1(本文中也称为“CLDN18.1”)和Claudin 18.2(本文中也称为“CLDN18.2”)两种蛋白亚型,两者在第1个胞外结构域约50个氨基酸的序列上只有7个氨基酸残基的差异。
Claudin 18.2在癌组织和正常组织的表达上存在显著差异性,这可能源于Claudin 18.2启动子区域CREB结合位点在正常组织中CpG高度甲基化,而在细胞癌变过程中CpG甲基化水平降低,进而CREB参与激活Claudin18.2的转录。
如本文所用的术语“CLDN18.2抗体”、“针对CLDN18.2的抗体”、“特异性结合CLDN18.2的抗体”、“特异性靶向CLDN18.2的抗体”、“特异性识别CLDN18.2的抗体”可互换地使用,意指能够与Claudin蛋白CLDN18.2特异性结合的抗体。特别地,在一些具体实施方案中,意指与人CLDN18.2特异性结合的抗体,特别是与人CLDN18.2特异性结合而不与人CLDN18.1特异性结合的抗体。
术语“抗体”在本文中以最广意义使用,指包含抗原结合位点的蛋白质,涵盖各种结构的天然抗体和人工抗体,包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如,双特异性抗体)、单链抗体、完整抗体和抗体片段。优选地,本发明的抗体是单结构域抗体或重链抗体。
“抗体片段”或“抗原结合片段”在本文中可互换地使用,指与完整抗体不同的分子,其包含完整抗体的一部分且结合完整抗体所结合的抗原。抗体片段的例子包括但不限于Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、单链Fv、单链Fab、双体抗体(diabody)。
术语“scFv”指一种融合蛋白,其包含至少一个包含轻链可变区的抗体片段和至少一个包 含重链可变区的抗体片段,其中轻链可变区和重链可变区任选地借助柔性短多肽接头连续地连接,并且能够表达为单链多肽,并且其中scFv保留衍生它的完整抗体的特异性。除非另外指出,否则如本文所用,scFv可以具有按任何顺序(例如,相对于多肽的N末端和C末端)的VL可变区和VH可变区,scFv可以包含VL-接头-VH或可以包含VH-接头-VL。
“互补决定区”或“CDR区”或“CDR”或“高变区”是抗体可变结构域中在序列上高变并且形成在结构上确定的环(“超变环”)和/或含有抗原接触残基(“抗原接触点”)的区域。CDR主要负责与抗原表位结合。重链和轻链的CDR通常被称作CDR1、CDR2和CDR3,从N-端开始顺序编号。位于抗体重链可变结构域内的CDR被称作CDR H1、CDR H2和CDR H3,而位于抗体轻链可变结构域内的CDR被称作CDR L1、CDR L2和CDR L3。在一个给定的轻链可变区或重链可变区氨基酸序列中,各CDR的精确氨基酸序列边界可以使用许多公知的抗体CDR指派系统的任一种或其组合确定,所述指派系统包括例如:基于抗体的三维结构和CDR环的拓扑学的Chothia(Chothia等人.(1989)Nature 342:877-883,Al-Lazikani等人,“Standard conformations for the canonical structures of immunoglobulins”,Journal of Molecular Biology,273,927-948(1997)),基于抗体序列可变性的Kabat(Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第4版,U.S.Department of Health and Human Services,National Institutes of Health(1987)),AbM(University of Bath),Contact(University College London),国际ImMunoGeneTics database(IMGT)(万维网imgt.cines.fr/),以及基于利用大量晶体结构的近邻传播聚类(affinity propagation clustering)的North CDR定义。
除非另有说明,否则在本发明中,术语“CDR”或“CDR序列”涵盖以上述任一种方式确定的CDR序列。
CDR也可以基于与参考CDR序列(例如本发明示例的CDR之任一)具有相同的Kabat编号位置而确定。在本发明中,当提及抗体可变区和具体CDR序列(包括重链可变区残基)时,是指根据Kabat编号系统的编号位置。
尽管CDR在抗体与抗体之间是不同的,但是CDR内只有有限数量的氨基酸位置直接参与抗原结合。使用Kabat,Chothia,AbM和Contact方法中的至少两种,可以确定最小重叠区域,从而提供用于抗原结合的“最小结合单位”。最小结合单位可以是CDR的一个子部分。正如本领域技术人员明了,通过抗体的结构和蛋白折叠,可以确定CDR序列其余部分的残基。因此,本发明也考虑本文所给出的任何CDR的变体。例如,在一个CDR的变体中,最小结合单位的氨基酸残基可以保持不变,而根据Kabat或Chothia或AbM定义的其余CDR残基可以被保守氨基酸残基替代。
术语“嵌合抗体”是这样的抗体分子,其中(a)将恒定区或其部分改变、替换或交换,从而抗原结合位点与不同的或改变的类别和/或物种的恒定区或赋予嵌合抗体新性能的完全不同的分子(例如,酶、毒素、激素、生长因子、药物)等连接;或(b)将可变区或其部分用具有不同或改变的抗原特异性的可变区改变、替换或交换。例如,鼠抗体可以通过将其恒定区更换为来自人免疫球蛋白的恒定区进行修饰。由于更换为人类恒定区,该嵌合抗体可以保留其在 识别抗原方面的特异性,同时如与原始鼠抗体相比,具有在人类中降低的抗原性。
“人源化”抗体是指包含来自非人CDR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在一些实施方案中,人源化抗体中的所有或基本上所有的CDR(例如,CDR)对应于非人抗体的那些,并且所有或基本上所有的FR对应于人抗体的那些。人源化抗体任选可以包含至少一部分的来源于人抗体的抗体恒定区。抗体(例如非人抗体)的“人源化形式”是指已经进行了人源化的抗体。
“人抗体”指具有这样的氨基酸序列的抗体,所述氨基酸序列对应于下述抗体的氨基酸序列,所述抗体由人或人细胞生成或来源于非人来源,其利用人抗体库或其它人抗体编码序列。人抗体的这种定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
术语“Fc区”在本文中用于定义免疫球蛋白重链的C端区域,所述区域包含至少一部分的恒定区。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在某些实施方案中,人IgG重链Fc区从Cys226或Pro230延伸至重链的羰基端。然而,Fc区的C端赖氨酸(Lys447)可以存在或者可以不存在。除非另外说明,Fc区或恒定区中的氨基酸残基的编号是根据EU编号系统,其也被称为EU索引,如在Kabat等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991中所述。
术语“效应功能”指随免疫球蛋白同种型变动的归因于免疫球蛋白Fc区的那些生物学活性。免疫球蛋白效应子功能的例子包括:C1q结合和补体依赖的细胞毒性(CDC)、Fc受体结合作用、抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖的细胞吞噬作用(ADCP)、细胞因子分泌、免疫复合物介导的抗原呈递细胞摄取抗原、下调细胞表面受体(例如B细胞受体)和B细胞活化。
术语“抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)”是某些细胞毒性效应细胞(例如天然杀伤(NK)细胞)介导对靶细胞和外来宿主细胞杀伤的主要机制之一。在一些实施方案中,通过抗体的Fc区与表达在例如NK细胞上的Fc受体FcγRIIIA(即,CD16a)结合后来激活NK细胞发挥ADCC作用。CD16a属于免疫球蛋白超家族跨膜受体成员,根据其N端158位的等位基因多态性差异,CD16a存在158位缬氨酸或苯丙氨酸差异性表达,使得人群中存在CD16a-158V/V(约占15%)、CD16a-158V/F(约占25%)和CD16a-158F/F(约占60%)亚型。又在一些实施方案中,本发明的嵌合抗原受体提供T淋巴细胞的抗体依赖性细胞毒作用、增强NK细胞的抗体依赖性细胞毒作用。本发明的嵌合抗原受体通过与结合肿瘤细胞的抗体(或包含Fc部分的其他抗肿瘤分子)结合,诱发表达该嵌合抗原受体的T细胞活化、持续增殖和发挥经该抗体(或包含Fc部分的其他抗肿瘤分子)介导的对目的癌细胞的特异性细胞毒性。
术语“补体依赖的细胞毒性作用(CDC)”是指在补体存在下靶细胞的裂解。经典补体途径的激活由补体系统的第一组分(C1q)与结合其同源抗原的抗体(适当的亚类)结合而启动。为了评估补体活化,可以执行CDC测定法,通过例如Gazzano-Santoro等人,J.Immunol.Methods 202:163(1996)中所述的方法。
术语“可变区”或“可变结构域”是指参与抗体与抗原结合的抗体重链或轻链的结构域。天 然抗体的重链和轻链的可变结构域通常具有相似的结构,其中每个结构域包含四个保守的构架区(FR)和三个互补决定区(CDR)。(参见,例如,Kindt等Kuby Immunology,6
th ed.,W.H.Freeman and Co.91页(2007))。单个VH或VL结构域可以足以给予抗原结合特异性。
如本文所用,术语“结合”或“特异性结合”意指结合作用对抗原是选择性的并且可以与不想要的或非特异的相互作用区别。抗体与特定抗原结合的能力可以通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)、SPR或生物膜层干涉技术或本领域已知的其他常规结合测定法测定。
术语“刺激”指由刺激分子(例如,TCR/CD3复合体)与其相应配体的结合所诱导的初次应答,所述初次应答因而介导信号转导事件,例如但不限于借助TCR/CD3复合体的信号转导。刺激可以介导某些分子改变的表达,如下调TGF-β和/或细胞骨架结构的再组织等。
术语“刺激分子”指由提供初级胞质信号传导序列的T细胞表达的分子,所述的初级胞质信号传导序列在T细胞信号传导途径的至少某个方面以刺激性方式调节TCR复合体的初级活化。在一个实施方案中,初级信号例如通过TCR/CD3复合体与载有肽的MHC分子的结合引发并且导致介导T细胞反应,包括但不限于增殖、活化、分化等。在本发明的具体CAR中,本发明的任一种或多种CAR中的胞内信号结构域包含胞内信号传导序列,例如,CD3ζ的初级信号传导序列。
术语“CD3ζ”定义为GenBan登录号BAG36664.1提供的蛋白质或其等同物,并且“CD3ζ刺激信号结构域”定义为来自CD3ζ链胞质结构域的氨基酸残基,所述氨基酸残基足以在功能上传播T细胞活化必需的初始信号。在一个实施方案中,CD3ζ的胞质结构域包含GenBank登录号BAG36664.1的残基52至残基164或作为其功能直向同源物的来自非人类物种(例如,小鼠、啮齿类、猴、猿等)的等同残基。在一个实施方案中,“CD3ζ刺激信号结构域”是在SEQ ID NO:13中提供的序列或其变体。
术语“共刺激分子”是指细胞上的与共刺激配体特异性结合从而介导细胞的共刺激反应(例如但不限于增殖)的相应结合配偶体。共刺激分子是除抗原受体或其配体之外的有助于有效免疫应答的细胞表面分子。共刺激分子包括但不限于MHC I类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整联蛋白、信号传导淋巴细胞活化分子(SLAM蛋白)、激活NK细胞受体、OX40、CD40、GITR、4-1BB(即CD137)、CD27和CD28。在一些实施方案中,“共刺激分子”是CD28、4-1BB(即CD137)。共刺激信号结构域是指共刺激分子的胞内部分。
术语“4-1BB”指TNFR超家族成员,所述成员具有作为GenBank登录号AAA62478.2提供的氨基酸序列或来自非人类物种(例如,小鼠、啮齿类、猴、猿等)的等同残基;并且“4-1BB共刺激信号结构域”定义为GenBank登录号AAA62478.2的氨基酸残基214-255或来自非人类物种(例如,小鼠、啮齿类、猴、猿等)的等同残基。在一个实施方案中,“4-1BB共刺激结构域”是作为SEQ ID NO:11提供的序列或来自非人类物种(例如,小鼠、啮齿类、猴、猿等)的等同残基。
术语“信号传导途径”指在从细胞一个部分传播信号至细胞的另一个部分中发挥作用的多种信号传导分子之间的生物化学关系。
术语“细胞因子”是由一种细胞群释放,作为细胞间介质作用于另一细胞的蛋白质的通称。此类细胞因子的例子有淋巴因子、单核因子、白介素(IL),诸如IL-1,IL-1α,IL-2,IL-3,IL-4,IL-5,IL-6,IL-7,IL-8,IL-9,IL-11,IL-12,IL-15;肿瘤坏死因子,诸如TNF-α或TNF-β;及其它多肽因子,包括γ-干扰素。
“分离的”抗体是指已经与其天然环境的组分分离。在一些实施方案中,将本发明的抗体纯化至超过95%或99%纯度,如通过例如电泳(例如,SDS-PAGE,等电聚焦(IEF),毛细管电泳)或层析(例如,离子交换或反相HPLC)确定的。对于用于评估抗体纯度的方法的综述,参见,例如,Flatman等,J.Chromatogr.B848:79-87(2007)。
“分离的”核酸是指这样的核酸分子,其已经与其天然环境的组分分离。分离的核酸包括包含在通常包含该核酸分子的细胞中的核酸分子,但是该核酸分子存在于染色体外或在不同于其天然染色体位置的染色体位置处。“分离的编码本发明抗体的核酸”是指一个或多个核酸分子,其编码本发明抗体的链或其片段,包括在单一载体或分开的载体中的这样的核酸分子,以及存在于宿主细胞中的一个或多个位置处的这样的核酸分子。
如下进行序列之间序列同一性的计算。
为确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的同一性百分数,将所述序列出于最佳比较目的比对(例如,可以为了最佳比对而在第一和第二氨基酸序列或核酸序列之一或二者中引入空位或可以为比较目的而抛弃非同源序列)。在一个优选实施方案中,为比较目的,所比对的参考序列的长度是至少30%、优选地至少40%、更优选地至少50%、60%和甚至更优选地至少70%、80%、90%、100%的参考序列长度。随后比较在对应氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置由第二序列中对应位置处的相同氨基酸残基或核苷酸占据时,则所述分子在这个位置处是相同的。
可以利用数学算法实现两个序列间的序列比较和同一性百分数的计算。在一个优选实施方案中,使用已经集成至GCG软件包的GAP程序中的Needlema和Wunsch((1970)J.Mol.Biol.48:444-453)算法(在http://www.gcg.com可获得),使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵和空位权重16、14、12、10、8、6或4和长度权重1、2、3、4、5或6,确定两个氨基酸序列之间的同一性百分数。在又一个优选的实施方案中,使用GCG软件包中的GAP程序(在http://www.gcg.com可获得),使用NWSgapdna.CMP矩阵和空位权重40、50、60、70或80和长度权重1、2、3、4、5或6,确定两个核苷酸序列之间的同一性百分数。特别优选的参数集合(和除非另外说明否则应当使用的一个参数集合)是采用空位罚分12、空位延伸罚分4和移码空位罚分5的Blossum 62评分矩阵。
还可以使用PAM120加权余数表、空位长度罚分12,空位罚分4),利用已经并入ALIGN程序(2.0版)的E.Meyers和W.Miller算法,((1989)CABIOS,4:11-17)确定两个氨基酸序列或核苷酸序列之间的同一性百分数。
额外地或备选地,可以进一步使用本文所述的核酸序列和蛋白质序列作为“查询序列”以针对公共数据库执行检索,以例如鉴定其他家族成员序列或相关序列。
术语“氨基酸变化”和“氨基酸修饰”可互换地使用,是指氨基酸的添加、缺失、取代和其他修饰。可以进行氨基酸的添加、缺失、取代和其他修饰的任意组合,条件是最终的多肽序列具有所需的特性。在一些实施方案中,对抗体的氨基酸取代导致抗体与Fc受体的结合降低。为了改变例如Fc区结合特征的目的,特别优选非保守氨基酸取代,即用具有不同结构和/或化学性质的另一种氨基酸取代一种氨基酸。氨基酸取代包括用非天然存在的氨基酸或二十种标准氨基酸的天然存在的氨基酸衍生物(例如、4-羟基脯氨酸、3-甲基组氨酸、鸟氨酸、高丝氨酸、5-羟基赖氨酸)的取代。可以使用本领域公知的遗传或化学方法产生氨基酸变化。遗传方法可包括定点诱变、PCR、基因合成等。通过除基因工程化之外的方法(如化学修饰)改变氨基酸侧链基团的方法可能是有用的。本文可使用多种名称来表示相同的氨基酸变化。例如,从Fc结构域的329位的脯氨酸到甘氨酸的取代可以表示为329G、G329、G
329、P329G Pro329Gly、或简称为“PG”。
术语“保守序列修饰”、“保守序列变化”指未显著影响或改变含有氨基酸序列的抗体或抗体片段的结合特征的氨基酸修饰或变化。这类种保守修饰包括氨基酸取代、添加和缺失。可以通过本领域已知的标准技术,如位点定向诱变和PCR介导的诱变向本发明的抗体或抗体片段引入修饰。保守性取代是氨基酸残基由具有相似侧链的氨基酸残基替换的氨基酸取代。已经在本领域中定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如,赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如,天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷极性侧链(例如,甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如,丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸)、β-侧链(例如,苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如,酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因而,可以将本发明CAR内部的一个或多个氨基酸残基替换为来自相同侧链家族的其他氨基酸残基,并且可以使用本文所述的功能测定法测试改变的CAR。
术语“自体的”指这样的任何物质,所述物质从稍后将向个体再次引入所述物质的相同个体衍生。
术语“同种异体的”指这样的任何物质,所述物质从与引入所述物质的个体相同的物种的不同动物衍生。当一个或多个基因座处的基因不相同时,两位或更多位个体据称彼此是同种异体的。在一些方面,来自相同物种的个体的同种异体物质可以在遗传上足够地不相似以发生抗原性相互作用。
术语“异种的”指从不同物种的动物衍生的移植物。
如本文所用的术语“单采血液成分术”指本领域认可的体外方法,借助所述方法,供体或患者的血液从供体或患者取出并且穿过这样的装置,所述装置分离选择的特定组分并将剩余部分返回供体或患者的循环,例如,通过再输血。因此,在“单采样品”的语境中,指使用单采血液成分术获得的样品。
术语“免疫效应细胞”指参与免疫应答,例如参与促进免疫效应反应的细胞。免疫效应细胞的例子包括T细胞,例如,α/βT细胞和γ/δT细胞、B细胞、天然杀伤(NK)细胞、天然杀伤 T(NKT)细胞、肥大细胞、和髓细胞衍生的吞噬细胞。
“免疫效应功能”、“免疫效应应答”或“免疫效应反应”指例如免疫效应细胞的增强或促进免疫攻击靶细胞的功能或应答。例如,免疫效应功能或应答指促进杀伤靶细胞或抑制靶细胞生长或增殖的T细胞或NK细胞特性。在T细胞的情况下,初级刺激和共刺激是免疫效应功能或应答的例子。
术语“效应功能”指细胞的特化功能。T细胞的效应功能例如可以是溶细胞活性或辅助活性,包括分泌细胞因子。
术语“T细胞激活”是指T淋巴细胞,特别是细胞毒性T淋巴细胞的一种或多种细胞应答,选自:增殖、分化、细胞因子分泌、细胞毒性效应分子释放、细胞毒活性和活化标志物的表达。本发明的嵌合抗原受体能够诱导T细胞激活。用于测量T细胞激活的合适测定法在实施例中描述,并是本领域中已知的。
术语“慢病毒”指逆转录病毒科(Retroviridae)的一个属。慢病毒在逆转录病毒当中的独特之处在于能够感染非分裂性细胞;它们可以递送显著量的遗传信息至宿主细胞,从而它们是基因递送载体的最高效方法之一。HIV、SIV和FIV均是慢病毒的例子。
术语“慢病毒载体”指从慢病毒基因组的至少一部分衍生的载体,尤其包括如Milone等人,Mol.Ther.17(8):1453–1464(2009)中提供的自我失活慢病毒载体。可以在临床使用的慢病毒载体的其他例子例如包括但不限于来自Oxford BioMedica的
基因递送技术、来自Lentigen的LENTIMAX
TM载体系统等。非临床类型的慢病毒载体也是可获得的并且是本领域技术人员已知的。
术语“与CLDN18.2相关的疾病”是指由CLDN18.2(如人CLDN18.2)的增加的表达或活性引起、加重或以其它方式与其相关的任何病症。
术语“个体”或“受试者”可互换地使用,包括哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯化动物(例如,牛、羊、猫、犬和马)、灵长类(例如,人和非人灵长类如猴)、兔和啮齿类(例如,小鼠和大鼠)。特别地,个体或受试者是人。
术语“肿瘤”和“癌症”在本文中互换地使用,涵盖实体瘤和液体肿瘤。
术语“癌症”和“癌性”是指哺乳动物中细胞生长不受调节的生理疾患。
术语“肿瘤”指所有赘生性(neoplastic)细胞生长和增殖,无论是恶性的还是良性的,及所有癌前(pre-cancerous)和癌性细胞和组织。术语“癌症”、“癌性”和“肿瘤”在本文中提到时并不互相排斥。
“肿瘤免疫逃逸”指肿瘤逃避免疫识别和清除的过程。如此,作为治疗概念,肿瘤免疫在此类逃避减弱时得到“治疗”,并且肿瘤被免疫系统识别并攻击。肿瘤识别的例子包括肿瘤结合,肿瘤收缩和肿瘤清除。
术语“半数有效浓度(EC
50)”是指在特定的暴露时间后诱导在基线和最大值之间的50%的应答的药物、抗体或毒剂的浓度。
术语“荧光激活细胞分选”或“FACS”是指专门类型的流式细胞术。它提供了根据每个 细胞的特定光散射和荧光特征,将生物细胞的异质混合物以每次一个细胞分拣到两个或更多个容器中的方法(FlowMetric.“Sorting Out Fluorescence Activated Cell Sorting”.2017-11-09)。用于进行FACS的仪器是本领域技术人员已知的并且对于公众是可商购获得的。这种仪器的实例包括Becton Dickinson(Foster City,CA)的FACS Star Plus、FACScan和FACSort仪器、来自Coulter Epics Division(Hialeah,FL)的Epics C和来自Cytomation(Colorado Springs,Colorado)的MoFlo。
术语“可药用辅料”指与活性物质一起施用的稀释剂、佐剂(例如弗氏佐剂(完全和不完全的))、赋形剂、缓冲剂或稳定剂等。
用于本文时,“治疗”指减缓、中断、阻滞、缓解、停止、降低、或逆转已存在的症状、病症、病况或疾病的进展或严重性。想要的治疗效果包括但不限于防止疾病出现或复发、减轻症状、减小疾病的任何直接或间接病理学后果、防止转移、降低病情进展速率、改善或缓和疾病状态,以及缓解或改善预后。在一些实施方案中,本发明的抗体分子用来延缓疾病发展或用来减慢疾病的进展。
术语“有效量”指本发明的抗体或组合物的这样的量或剂量,其以单一或多次剂量施用患者后,在需要治疗或预防的患者中产生预期效果。有效量可以由作为本领域技术人员的主治医师通过考虑以下多种因素来容易地确定:诸如哺乳动物的物种;体重、年龄和一般健康状况;涉及的具体疾病;疾病的程度或严重性;个体患者的应答;施用的具体抗体;施用模式;施用制剂的生物利用率特征;选择的给药方案;和任何伴随疗法的使用。
“治疗有效量”指以需要的剂量并持续需要的时间段,有效实现所需治疗结果的量。抗体或抗体片段或其组合物的治疗有效量可以根据多种因素如疾病状态、个体的年龄、性别和重量和抗体或抗体部分在个体中激发所需反应的能力而变动。治疗有效量也是这样的一个量,其中抗体或抗体片段或其组合物的任何有毒或有害作用不及治疗有益作用。相对于未治疗的对象,“治疗有效量”优选地抑制可度量参数(例如肿瘤生长率、肿瘤体积等)至少约20%、更优选地至少约40%、甚至更优选地至少约50%、60%或70%和仍更优选地至少约80%或90%。可以在预示人肿瘤中的功效的动物模型系统中评价化合物抑制可度量参数(例如,癌症)的能力。
术语“药物组合”是指非固定组合产品或固定组合产品,包括但不限于药盒、药物组合物。术语“非固定组合”意指活性成分(例如,(i)P329G CAR-T细胞、以及(ii)针对CLDN18.2 P329G突变抗体)以分开的实体被同时、无特定时间限制或以相同或不同的时间间隔、依次地施用于受试者,其中这类施用在受试者体内提供有效治疗。术语“固定组合”是指本发明的针对CLDN18.2 P329G突变抗体和P329G CAR-T细胞的组合各自以特定的单一剂量的形式同时施用于患者。术语“非固定组合”意指本发明的针对CLDN18.2 P329G突变抗体和P329G CAR-T细胞的组合作为分开的实体同时、并行或依次施用于患者,没有特定的剂量和时间限制,其中这样的施用提供了患者体内本发明药物组合的治疗有效水平。在一个优选的实施方案中,药物组合是非固定组合。
术语“组合疗法”或“联合疗法”是指施用两种或更多种组分以治疗如本公开所述的癌症。这种施用包括以基本上同时的方式共同施用这些组分。或者,这种施用包括对于各个活性成分在多种或在分开的容器(例如,胶囊、粉末和液体)中的共同施用或分开施用或依次施用。粉末和/或液体可以在施用前重构或稀释至所需剂量。在一些实施方案中,施用还包括以大致相同的时间,或在不同的时间以顺序的方式,使用本发明的针对CLDN18.2 P329G突变抗体和P329G CAR-T细胞。在任一情况下,治疗方案将提供药物组合在治疗本文所述的病症或病状中的有益作用。
在本文中当谈及核酸时使用的术语“载体(vector)”是指能够增殖与其相连的另一个核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体以及结合到已经引入其的宿主细胞的基因组中的载体。一些载体能够指导与其有效相连的核酸的表达。这样的载体在本文中被称为“表达载体”。
术语“宿主细胞”指已经向其中引入外源多核苷酸的细胞,包括这类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化的细胞”,这包括原代转化的细胞和从其衍生的后代,而不考虑传代的数目。后代在核酸内容上可能与亲本细胞不完全相同,而是可以包含突变。本文中包括在最初转化的细胞中筛选或选择的具有相同功能或生物学活性的突变体后代。宿主细胞是可以用来产生本发明抗体分子的任何类型的细胞系统,包括真核细胞,例如,哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞;和原核细胞,例如,大肠杆菌细胞。宿主细胞包括培养的细胞,也包括转基因动物、转基因植物或培养的植物组织或动物组织内部的细胞。
“受试者/患者样品”指从患者或受试者得到的细胞、组织或体液的集合。组织或细胞样品的来源可以是实体组织,像来自新鲜的、冷冻的和/或保存的器官或组织样品或活检样品或穿刺样品;血液或任何血液组分;体液,诸如脑脊液、羊膜液(羊水)、腹膜液(腹水)、或间隙液;来自受试者的妊娠或发育任何时间的细胞。组织样品可能包含在自然界中天然不与组织混杂的化合物,诸如防腐剂、抗凝剂、缓冲剂、固定剂、营养物、抗生素、等等。肿瘤样品的例子在本文中包括但不限于肿瘤活检、细针吸出物、支气管灌洗液、胸膜液(胸水)、痰液、尿液、手术标本、循环中的肿瘤细胞、血清、血浆、循环中的血浆蛋白质、腹水、衍生自肿瘤或展现出肿瘤样特性的原代细胞培养物或细胞系,以及保存的肿瘤样品,诸如福尔马林固定的、石蜡包埋的肿瘤样品或冷冻的肿瘤样品。
在谈及疾病时,术语“治疗”是指减轻所述疾病(即,减缓或阻止或减少所述疾病或其至少一个临床症状的发展)、防止或延迟所述疾病的发作或发展或进展。
II.本发明的分子开关调控型嵌合抗原受体(CAR)
本发明涉及能够特异性结合针对CLDN18.2分子的抗体的突变Fc结构域的嵌合抗原受体多肽。具体地,本发明的嵌合抗原受体包含人源化抗P329G突变scFv序列,且所述scFv序列能够特异性结合包含P329G突变的抗体Fc结构域,但不能特异性结合未突变的亲本抗体Fc结构域。与未突变的亲本抗体Fc结构域对Fc受体的结合相比较,包含P329G突变的抗体Fc结构域对Fc受体(例如,Fcγ受体)的结合降低。
本发明的重组CAR构建体包含编码CAR的序列,其中CAR包含人源化抗P329G突变scFv序列,所述scFv序列特异性结合P329G突变的抗体Fc结构域。
在一个实施方案中,本发明的CAR构建体中的scFv序列包含如下序列:
(i)重链可变区,其包含根据Kabat编号的
(a)氨基酸序列RYWMN(SEQ ID NO:54)所示的重链互补决定区(CDR H)1、或所述CDR H1的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体;
(b)氨基酸序列EITPDSSTINYAPSLKG(SEQ ID NO:55)所示的CDR H2、或所述CDR H2的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体;和
(c)氨基酸序列PYDYGAWFAS(SEQ ID NO:56)所示的CDR H3、或所述CDR H3的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体;和
(ii)轻链可变区,其包含根据Kabat编号的
(d)氨基酸序列RSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO:57)所示的轻链互补决定区(CDR L)1、或所述CDR L1的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体;
(e)氨基酸序列GTNKRAP(SEQ ID NO:58)所示的CDR L2、或所述CDR L2的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体;和
(f)氨基酸序列ALWYSNHWV(SEQ ID NO:59)所示的CDR L3、或所述CDR L3的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体
其中scFv可以在N端连接有信号肽序列,例如,SEQ ID NO:1所示的信号肽序列,并且scFv可以在C端连接有如SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7中提供的任选铰链区/间隔区序列、如SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9中提供的跨膜区、如SEQ ID NO:14中提供的任选近膜胞内信号结构域、如SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12的共刺激信号结构域和包含SEQ ID NO:13或其变体的胞内刺激信号结构域,例如,其中各个结构域彼此邻接并处于相同的可读框以形成单个融合蛋白。
在一些实施方案中,scFv结构域包含(i)重链可变区,其包含SEQ ID NO:2的序列或与其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列,和(ii)轻链可变区,其包含SEQ ID NO:3的序列或与其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列;
在一些实施方案中,scFv结构域包含(i)SEQ ID NO:2所示的重链可变区和(ii)SEQ ID NO:3所示的轻链可变区。在一个实施方案中,scFv结构域还包含(Gly4-Ser)n接头,其中n是1、2、3、4、5或6、优选地3或4。scFv的轻链可变区和重链可变区可以例如处于以下任何取向:轻链可变区-接头-重链可变区或重链可变区-接头-轻链可变区。
在一些实施方案中,本发明的示例性CAR构建体包含信号肽序列、人源化抗P329G突变scFv序列、铰链区/间隔区、跨膜结构域、胞内共刺激信号结构域和胞内刺激信号结构域。
在一些实施方案中,本发明的示例性CAR构建体包含信号肽序列、人源化抗P329G突变scFv序列、铰链区/间隔区、跨膜结构域、近膜胞内结构域、胞内共刺激信号结构域和胞内刺激信号结构域。
在一些实施方案中,本发明将全长CAR多肽的氨基酸序列作为SEQ ID NO:21、23或25提供,如序列表中所示。
在一些实施方案中,本发明将示例性信号肽序列作为SEQ ID NO:1提供;将示例性铰链区/间隔区序列作为SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7提供;将示例性跨膜结构域序列作为SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9提供;将示例性近膜胞内信号结构域作为SEQ ID NO:14提供;将示例性胞内共刺激信号结构域作为SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12提供;将示例性胞内刺激信号结构域作为SEQ ID NO:13或其变体提供。
在一些实施方案中,本发明提供了重组核酸构建体,其包含编码本发明的CAR的核酸分子。例如,本发明CAR构建体的核酸序列选自SEQ ID NO:22、24或26。可以使用本领域公知的重组方法获得编码本发明CAR构建体的。备选地,可以合成地产生目的核酸,而非通过基因重组方法产生目的核酸。
本发明包括表达可以直接转导入细胞中的CAR的逆转录病毒载体构建体和慢病毒载体构建体。
在一些实施方案中,将本发明CAR构建体的核酸序列克隆至慢病毒载体中以在单个编码框中产生全长CAR构建体,并用EF1α启动子用于表达。
本领域普通技术人员将理解,本发明的CAR多肽还可以进行修饰,从而在氨基酸序列上变动,但是在所需的活性方面不变动。例如,可以对CAR多肽进行导致“非必需”氨基酸残基处氨基酸置换的额外核苷酸置换。例如,可以将分子中的非必需氨基酸残基替换为来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基。在另一个实施方案中,可以将一个氨基酸片段替换为结构上相似的片段,所述的片段在侧链家族成员的顺序和组成方面中不同,例如,可以进行保守性置换,其中将氨基酸残基替换为具有相似侧链的氨基酸残基。
本领域中已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族,所述侧链包括碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如,天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷极性侧链(例如,甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如,丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)、β分枝侧链(例如,苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如,酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。
在一些实施方案中,本发明构思了产生功能上等同的CAR多肽分子,例如,可以修饰CAR中包含的人源化抗P329G突变scFv序列的VH或VL,获得与SEQ ID NO:2具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的VH和与SEQ ID NO:3具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的VL。
本发明的CAR中包含的跨膜结构域是锚定的跨膜结构域,其是能够整合在细胞膜中的多肽链的组成部分。跨膜结构域可以与其他胞外和/或胞内多肽结构域融合,其中这些胞外和/ 或胞内多肽结构域也将被限制在细胞膜上。在本发明的嵌合抗原受体(CAR)多肽中,跨膜结构域赋予本发明的CAR多肽的膜附着。本发明的CAR多肽包含至少一个跨膜结构域,其可以衍生自天然来源或重组来源,包含优势疏水的残基如亮氨酸和缬氨酸。在来源是天然的情况下,结构域可以衍生自膜结合蛋白或跨膜蛋白例如CD28、CD8(例如,CD8α,CD8β)的跨膜结构域。在一个实施方案中,跨膜结构域包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列。在一个实施方案中,跨膜结构域包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列,其中苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸三联体在该跨膜结构域的两个末端均存在。
在一些实施方案中,本发明的CAR中的跨膜结构域借助铰链区/间隔区与CAR的胞外区(即,人源化抗P329G突变scFv序列)连接。例如,在一个实施方案中,铰链可以是人Ig(免疫球蛋白)铰链区,例如,IgG4铰链区,也可以是CD8a铰链区、CD28的铰链区。在一些实施方案中,铰链区或间隔区序列包含SEQ ID NO:6或7的氨基酸序列。
另外,甘氨酸-丝氨酸双联体也提供特别合适的接头作为铰链区/间隔区。例如,在一个实施方案中,接头包含GGGGS的氨基酸序列(SEQ ID NO:5)。
本发明的CAR中包含的胞质结构域包含胞内信号结构域。胞内信号结构域能够活化引入了本发明CAR的免疫细胞的至少一个效应功能。
用于本发明CAR中的胞内信号结构域的例子包括协同发挥作用以在胞外结构域结合P329G突变的抗体Fc结构域后启动信号转导的T细胞受体(TCR)和共受体的胞质序列,以及这些序列的任何衍生物或变体和具有相同功能性能力的任何重组序列。
考虑到仅通过TCR生成的信号尚不足以完全活化T细胞,因此本发明的CAR还设计了能够产生共刺激信号的共刺激信号结构域(CSD)。T细胞的活化由两类不同的胞质信号传导序列介导:通过TCR启动抗原依赖性初级活化的那些序列(初级胞内信号结构域)和以抗原非依赖性方式发挥作用以提供共刺激信号的那些序列(次级胞质结构域,例如,共刺激结构域)。
在一个实施方案中,本发明的CAR包含初级胞内信号结构域,例如,CD3ε链的近膜胞内信号结构域,例如,CD3ε链的如SEQ ID NO:14所示的近膜胞内信号结构域;CD3ζ的初级信号结构域,例如,SEQ ID NO:13所示的CD3ζ信号传导结构域。
本发明CAR中的胞内信号结构域还包次级信号结构域(即,共刺激信号结构域)。共刺激信号结构域指包含共刺激分子的胞内结构域的CAR部分。共刺激分子是除抗原受体或其配体之外淋巴细胞对抗原作出有效反应所需要的细胞表面分子。在一些实施方案中,共刺激分子包括但不限于CD28、4-1BB(CD137),其引起的共刺激作用在体外增强人CART细胞的增殖、效应功能和存活并且在体内增进人T细胞的抗肿瘤活性。
在本发明CAR的胞内信号传导序列可以彼此按随机顺序或按指定的顺序连接。任选地,短寡肽接头或多肽接头可以在胞内信号传导序列之间形成键接。在一个实施方案中,甘氨酸-丝氨酸双联体可以用作合适的接头。在一个实施方案中,单个氨基酸,例如,丙氨酸、甘氨酸,可以用作合适的接头。
在一个实施方案中,本发明CAR的胞内信号结构域设计成包含CD28的共刺激信号结构域和CD3ζ的刺激信号结构域。又在一个实施方案中,胞内信号结构域设计成包含4-1BB的共刺激信号结构域和CD3ζ的刺激信号结构域。又在一个实施方案中,胞内信号结构域设计成还包含CD3ε链的近膜胞内信号结构域。
III.编码本发明的CAR的核酸分子、载体和表达本发明CAR的细胞
本发明提供了编码本文所述的CAR构建体的核酸分子。在一个实施方案中,核酸分子作为DNA构建体提供。
在一些实施方案中,CAR构建体包含SEQ ID NO:22、24或26所示的核苷酸序列。
本发明还提供了插入有本发明CAR构建体的载体。通过将编码CAR多肽的核酸有效连接至启动子并将构建体并入表达载体中,实现编码CAR的天然或合成的核酸的表达。载体可以适合在真核生物中复制和整合。常见的克隆载体含有用于调节所需核酸序列的表达的转录和翻译终止子、起始序列和启动子。
已经开发了众多基于病毒的系统用于转移基因至哺乳动物细胞中。例如,逆转录病毒提供了用于基因递送系统的便利平台。可以使用本领域已知的技术,将选择的基因插入载体并且包装在逆转录病毒粒子中。随后可以分离重组病毒并将其在体内或离体递送至受试者的细胞。众多逆转录病毒系统是本领域已知的。在一些实施方案中,使用慢病毒载体。
衍生自逆转录病毒(如慢病毒)的载体是实现长期基因转移的合适工具,因为它们允许转基因的长期、稳定整合和其在子代细胞中增殖。慢病毒载体具有胜过衍生自癌-逆转录病毒(如鼠白血病病毒)的载体的额外优点,因为它们可以转导非增殖性细胞,如肝细胞。它们还具有额外的低免疫原性优点。逆转录病毒载体也可以例如是γ逆转录病毒载体。γ逆转录病毒载体可以例如包含启动子、包装信号(ψ)、引物结合位点(PBS)、一个或多个(例如,两个)长末端重复序列(LTR)和目的转基因,例如,编码CAR的基因。γ逆转录病毒载体可以缺少病毒结构性基因如gag、pol和env。
能够在哺乳动物T细胞中表达CAR转基因的启动子的例子是EF1a启动子。天然EF1a启动子驱动延伸因子-1复合体的α亚基表达,所述α亚基负责酶促递送氨酰基tRNA至核糖体。已经在哺乳动物表达质粒中广泛使用了EF1a启动子并且已经显示有效驱动从克隆至慢病毒载体中的转基因表达CAR。参见,例如,Milone等人,Mol.Ther.17(8):1453–1464(2009)。
启动子的另一个例子是立即早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。这个启动子序列是能够驱动与之有效连接的任何多核苷酸序列高水平表达的组成型强启动子序列。但是,也可以使用其他组成型启动子序列,所述其他组成型启动子序列包括但不限于猴病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复序列(LTR)启动子、MoMuLV启动子、鸟类白血病病毒启动子、埃巴病毒立即早期启动子、劳斯肉瘤病毒启动子以及人基因启动子,如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、延伸因子-1α启动子、血红蛋白启动子和肌酸激酶启动子。另外,本发明不应当限于使用组成型启动子。还构思了诱导型启动子作为本发明的部分。
在一些实施方案中,本发明提供了在哺乳动物免疫效应细胞(例如哺乳动物T细胞)中表达本发明的CAR构建体的方法和由此产生的免疫效应细胞。
从受试者获得细胞来源(例如,免疫效应细胞,例如,T细胞)。术语“受试者”意在包括可以激发免疫应答的活生物(例如,哺乳动物)。可以从众多来源获得T细胞,包括外周血单个核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤。
可以使用本领域技术人员已知的任何技术(如Ficoll
TM分离法),从采集自受试者的血液成分中获得T细胞。在一个优选的方面,通过单采血液成分术获得来自个体循环血液的细胞。单采产物一般含有淋巴细胞,包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其他有核的白细胞、红细胞和血小板。在一个实施方案中,可以洗涤通过单采血液成分术采集的细胞,以除去血浆级分并且以在用于后续加工步骤的适宜缓冲液或培养基中放置细胞。在本发明的一个方面,用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞。
可以通过正向或负向选择技术进一步分离特定的T细胞亚群,如CD3+、CD28+、CD4+、CD8+、CD45RA+和CD45RO+T细胞。例如,在一个实施方案中,通过与抗CD3/抗CD28缀合的珠(如
M-450CD3/CD28T)温育一段足够正向选择所需T细胞的时间,分离T细胞。在一些实施方案中,该时间段是约30分钟至36小时之间或更长时间。较长的温育时间可以用来在存在少量T细胞的任何情况下分离T细胞,如用于从肿瘤组织或从免疫受损个体分离肿瘤浸润型淋巴细胞(TIL)。另外,使用较长的温育时间可以增加捕获CD8+T细胞的效率。因此,通过简单地缩短或延长该时间,允许T细胞与CD3/CD28珠结合和/或通过增加或减少珠对T细胞的比率,可以在培养伊始或在培养过程期间的其他时间点偏好地选择T细胞亚群。
可以用抗体的组合,通过负选择过程完成T细胞群体的富集,其中所述抗体针对负向选择的细胞独有的表面标志物。一种方法是借助负向磁力免疫粘附法或流式细胞术分选和/或选择细胞,所述负向磁力免疫粘附法或流式细胞术使用针对负向选择的细胞上存在的细胞表面标志物的单克隆抗体混合物。
在一些实施方案中,免疫效应细胞可以是同种异体免疫效应细胞,例如,T细胞。例如,细胞可以是同种异体T细胞,例如,缺少功能性T细胞受体(TCR)和/或人白细胞抗原(HLA)(例如,HLA I类和/或HLA II类)表达的同种异体T细胞。
缺少功能性TCR的T细胞可以例如经工程化,从而它在其表面上不表达任何功能性TCR;经工程化,从而它不表达构成功能性TCR的一个或多个亚基(例如,经工程化,从而它不表达或显示出减少表达的TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、TCRε和/或TCRζ);或经工程化,从而它在其表面上产生非常少的功能性TCR。
本文所述的T细胞例如可以如此工程化,从而它不在其表面上表达功能性HLA。例如,本文所述的T细胞可以如此工程化,从而HLA(例如,HLA I类和/或HLA II类)的细胞表面表达下调。在一些方面,可以通过减少或消除β-2微球蛋白(B2M)表达实现HLA的下调。
在一些实施方案中,T细胞可以缺少功能性TCR和功能性HLA,例如,HLA I类和/或HLA II类。
在一个实施方案中,对编码本发明所述的CAR的核酸转导的细胞进行增殖,例如,将细胞在培养下增殖2小时至约14天。
对经体外增殖后获得的表达CAR的免疫效应细胞可以如实施例中所述进行效应功能的检测。
IV.特异性结合CLDN18.2分子的抗体和其包含突变Fc结构域的抗体
CLDN18属于Claudins蛋白家族成员,其是构成上皮细胞紧密连接的重要分子,决定了上皮细胞的渗透性,也起到阻挡细胞膜表面蛋白和脂质扩散的作用(Gunzel,D.和A.S.Yu(2013)."Claudins and the modulation of tight junction permeability."Physiol Rev 93(2):525-569)。人的CLDN18基因具有两个不同的1号外显子,转录后经过可变剪接最终生成仅在N端具有不同序列的两个蛋白亚型CLDN18.1和CLDN18.2。这两种CLDN18亚型蛋白均由261个氨基酸组成,具有四个跨膜结构域,但是两者分布于不同的组织,CLDN18.1主要表达在肺组织中,CLDN18.2仅表达在分化的胃粘膜上表皮细胞上,不表达在胃干细胞上(Sahin,Ugur等人,"Claudin-18 splice variant 2 is a pan-cancer target suitable for therapeutic antibody development."ClinicalCancer Research14.23(2008):7624-7634)。
CLDN18.2在多种肿瘤组织中高度表达,比如非小细胞肺癌(25%)、胃癌(70%)、胰腺癌(50%)和食道癌(30%),但是在正常组织中几乎没有表达(Kumar,V.等人,(2018)"Emerging Therapies in the Management of Advanced-Stage Gastric Cancer."Front Pharmacol 9:404),由于其在肿瘤细胞和正常组织中的表达差异性,目前已经成为非常有潜力的一个抗肿瘤药物作用靶点。
现有技术中,以CLDN18.2为靶点的抗体药物中进展最快的是德国Ganymed公司研制的Zolbetuximab(本文中也简称为“Zmab”),Zolbetuximab是一种特异靶向CLDN18.2的人鼠嵌合IgG1单抗,其与肿瘤细胞上表达的CLDN18.2第1个胞外区结合,通过抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)来诱导肿瘤细胞死亡。Zolbetuximab在胃癌二期试验中比标准化疗显著延长患者生存期(标准化疗的生存期为8.4个月;而Zmab治疗的生存期为13.2个月),Zmab的治疗效果在Claudin18.2高表达患者中的优势更明显。
虽然目前已有靶向CLDN18.2靶点的临床在研单克隆抗体药物,但单克隆抗体对抗原的亲和力不同,本发明人开发了一类具有合适亲和力的特异性识别CLDN18.2的抗CLDN18.2抗体,其包含重链可变区和轻链可变区,其中:
(a)所述重链可变区包含根据Kabat编号的氨基酸序列SYVMS(SEQ ID NO:60)所示的CDR H1、或所述CDR H1的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体;氨基酸序列TISHSGGSTYYADSVKG(SEQ ID NO:61)所示的CDR H2、或所述CDR H2的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体;和氨基酸序列DAPYYDILTGYRY(SEQ ID NO:62)所示的CDR H3、或所述CDR H3的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变 体;所述轻链可变区包含根据Kabat编号的氨基酸序列RASQSISSWLA(SEQ ID NO:63)所示的CDR L1、或所述CDR L1的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体;氨基酸序列KASSLES(SEQ ID NO:64)所示的CDR L2、或所述CDR L2的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体;和氨基酸序列QQYNSYSYT(SEQ ID NO:65)所示的CDR L3、或所述CDR L3的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体;
(b)所述重链可变区包含根据Kabat编号的氨基酸序列SYNIH(SEQ ID NO:66)所示的CDR H1、或所述CDR H1的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体;氨基酸序列YIAPFQGDSRYNQKFKG(SEQ ID NO:67)所示的CDR H2、或所述CDR H2的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体;和氨基酸序列LNRGNSLDY(SEQ ID NO:68)所示的CDR H3、或所述CDR H3的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体;所述轻链可变区包含根据Kabat编号的氨基酸序列KSSQSLFNSGNQRNYLT(SEQ ID NO:69)所示的CDR L1、或所述CDR L1的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体;氨基酸序列WASTRES(SEQ ID NO:70)所示的CDR L2、或所述CDR L2的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体;和氨基酸序列QNNYIYPLT(SEQ ID NO:71)所示的CDR L3、或所述CDR L3的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体;
(c)所述重链可变区包含根据Kabat编号的氨基酸序列SYNIH(SEQ ID NO:72)所示的CDR H1、或所述CDR H1的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体;氨基酸序列YIAPFQGDARYNQKFKG(SEQ ID NO:73)所示的CDR H2、或所述CDR H2的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体;和氨基酸序列LNRGQSLDY(SEQ ID NO:74)所示的CDR H3、或所述CDR H3的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体;所述轻链可变区包含根据Kabat编号的氨基酸序列KSSQSLFNAGNQRNYLT(SEQ ID NO:75)所示的CDR L1、或所述CDR L1的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体;氨基酸序列WASTRES(SEQ ID NO:76)所示的CDR L2、或所述CDR L2的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体;和氨基酸序列QNNYIYPLT(SEQ ID NO:77)所示的CDR L3、或所述CDR L3的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体;
(d)所述重链可变区包含根据Kabat编号的氨基酸序列SYNIH(SEQ ID NO:78)所示的CDR H1、或所述CDR H1的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体;氨基酸序列YIAPFQGDARYNQKFKG(SEQ ID NO:79)所示的CDR H2、或所述CDR H2的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体;和氨基酸序列LNRGNALDY(SEQ ID NO:80)所示的CDR H3、或所述CDR H3的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体;所述轻链可变区包含根据Kabat编号的氨基酸序列KSSQSLFQSGNQRNYLT(SEQ ID NO:81)所示的CDR L1、或所述CDR L1的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体;氨基酸序列WASTRES(SEQ ID NO:82)所示的CDR L2、或所述CDR L2的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体;和氨基酸序列QNNYIYPLT(SEQ ID NO:83)所示的CDR L3、或所述CDR L3的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体;
(e)所述重链可变区包含根据Kabat编号的氨基酸序列SYNIS(SEQ ID NO:84)所示的CDR H1、或所述CDR H1的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体;氨基酸序列YIAPFQGDARYNQKFKG(SEQ ID NO:85)所示的CDR H2、或所述CDR H2的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体;和氨基酸序列LNRGNSLDY(SEQ ID NO:86)所示的CDR H3、或所述CDR H3的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体;所述轻链可变区包含根据Kabat编号的氨基酸序列KSSQSLFNSGNQRNYLT(SEQ ID NO:87)所示的CDR L1、或所述CDR L1的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体;氨基酸序列WASTRES(SEQ ID NO:88)所示的CDR L2、或所述CDR L2的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体;和氨基酸序列QNNYIYPLT(SEQ ID NO:89)所示的CDR L3、或所述CDR L3的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体;或
(f)所述重链可变区包含根据Kabat编号的氨基酸序列TYWMH(SEQ ID NO:90)所示的CDR H1、或所述CDR H1的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体;氨基酸序列LIDPSDSETRLNQKFKD(SEQ ID NO:91)所示的CDR H2、或所述CDR H2的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体;和氨基酸序列WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:92)所示的CDR H3、或所述CDR H3的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体;所述轻链可变区包含根据Kabat编号的氨基酸序列KSSQSLLNSGNQKNYLT(SEQ ID NO:93)所示的CDR L1、或所述CDR L1的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体;氨基酸序列WASTRES(SEQ ID NO:94)所示的CDR L2、或所述CDR L2的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体;和氨基酸序列QNDYSYPLT(SEQ ID NO:95)所示的CDR L3、或所述CDR L3的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体;
其中所述氨基酸变化是氨基酸的添加、缺失或保守氨基酸取代。
在一些实施方案中,本发明的结合CLDN18.2分子的抗体结合哺乳动物CLDN18.2,例如人CLDN18.2。
在一些实施方案中,本发明的结合CLDN18.2分子的抗体具有以下一个或多个特性:
(1)特异性结合CLDN18.2,且不结合CLDN18.1;
(2)在不包含突变Fc结构域,例如,在具有未突变的亲本抗体Fc结构域的情形,通过抗体依赖性细胞毒性和/或补体依赖性细胞毒性作用杀死CLDN18.2-阳性癌症细胞。
在一些实施方案中,本发明的结合CLDN18.2分子的抗体包含特异性结合CLDN18.2而不结合或基本不结合CLDN18.1的重链可变区和轻链可变区,其中:
(a)重链可变区包含SEQ ID NO:34的序列或与其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列,且轻链可变区包含SEQ ID NO:35的序列或与其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列;
(b)重链可变区包含SEQ ID NO:36的序列或与其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列,且轻链可变区包含SEQ ID NO:37的序列或与其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列;
(c)重链可变区包含SEQ ID NO:44的序列或与其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列,且轻链可变区包含SEQ ID NO:45的序列或与其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列;
(d)重链可变区包含SEQ ID NO:46的序列或与其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列,且轻链可变区包含SEQ ID NO:47的序列或与其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列;
(e)重链可变区包含SEQ ID NO:48的序列或与其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列,且轻链可变区包含SEQ ID NO:49的序列或与其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列;或
(f)重链可变区包含SEQ ID NO:42的序列或与其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列,且轻链可变区包含SEQ ID NO:43的序列或与其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列;
其中所述至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列中的氨基酸变化优选氨基酸取代,更优选氨基酸保守取代,优选地,所述氨基酸变化不发生在CDR区中。
在一些实施方案中,本发明的结合CLDN18.2分子的抗体是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体;优选地,其是IgG1或IgG4抗体;更优选地,其是IgG1抗体,例如,人IgG1抗体。
在一些实施方案中,本文中所提供的结合CLDN18.2分子的抗体包含突变Fc结构域,其中根据EU编号的P329位置处的氨基酸突变为甘氨酸(G),与未突变的亲本抗体Fc结构域的Fcγ受体结合相比,突变Fc结构域的Fcγ受体结合降低;例如,所述突变Fc结构域是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体的突变Fc结构域,优选地,所述突变Fc结构域是IgG1或IgG4抗体的突变Fc结构域;更优选地,所述突变Fc结构域是IgG1抗体的突变Fc结构域,例如,所述突变Fc结构域是人IgG1抗体的突变Fc结构域。
包含P329G突变Fc结构域的结合CLDN18.2分子的抗体不能通过与Fcγ受体结合来发挥抗体依赖性细胞毒性,也不能发挥补体依赖性细胞毒性作用,因此不能杀死CLDN18.2-阳性癌症细胞。
在一些实施方案中,本发明提供了编码以上任何结合CLDN18.2分子的抗体或其片段或其任一条链的核酸。在一个实施方案中,提供包含所述核酸的载体。在一个实施方案中,载体是表达载体。在一个实施方案中,提供包含所述核酸或所述载体的宿主细胞。在一个实施方案中,宿主细胞是真核的。在另一个实施方案中,宿主细胞选自酵母细胞、哺乳动物细胞(例如CHO细胞或293细胞)或适用于制备抗体或其抗原结合片段的其它细胞。在另一个实施方案中,宿主细胞是原核的。
例如,本发明的核酸包含编码本发明的结合CLDN18.2分子的抗体的核酸。在一些实施方案中,提供包含所述核酸的一个或多个载体。在一个实施方案中,载体是表达载体,例如 真核表达载体。载体包括但不限于病毒、质粒、粘粒、λ噬菌体或酵母人工染色体(YAC)。在一个实施方案中,载体是pcDNA3.4表达载体。
一旦已经制备了用于表达的表达载体或DNA序列,则可以将表达载体转染或引入适宜的宿主细胞中。多种技术可以用来实现这个目的,例如,原生质体融合、磷酸钙沉淀、电穿孔、逆转录病毒的转导、病毒转染、基因枪、基于脂质的转染或其他常规技术。在原生质体融合的情况下,将细胞在培养基中培育并且筛选适宜的活性。用于培养所产生的转染细胞和用于回收产生的抗体分子的方法和条件是本领域技术人员已知的并且可以基于本说明书和现有技术已知的方法,根据使用的特定表达载体和哺乳动物宿主细胞变动或优化。
另外,可以通过引入允许选择已转染的宿主细胞的一个或多个标记物,选出已经稳定将DNA掺入至其染色体中的细胞。标记物可以例如向营养缺陷型宿主提供原养型、杀生物抗性(例如,抗生素)或重金属(如铜)抗性等。可选择标记基因可以与待表达的DNA序列直接连接或通过共转化引入相同的细胞中。也可能需要额外元件以便最佳合成mRNA。这些元件可以包括剪接信号,以及转录启动子、增强子和终止信号。
在一个实施方案中,提供了包含本发明多核苷酸的宿主细胞。在一些实施方案中,提供了包含本发明表达载体的宿主细胞。在一些实施方案中,宿主细胞选自酵母细胞、哺乳动物细胞或适用于制备抗体的其它细胞。合适的宿主细胞包括原核微生物,如大肠杆菌。宿主细胞还可以是真核微生物如丝状真菌或酵母,或各种真核细胞,例如昆虫细胞等。也可以将脊椎动物细胞用作宿主。例如,可以使用被改造以适合于悬浮生长的哺乳动物细胞系。有用的哺乳动物宿主细胞系的例子包括SV40转化的猴肾CV1系(COS-7);人胚肾系(HEK293或293F细胞)、293细胞、幼仓鼠肾细胞(BHK)、猴肾细胞(CV1)、非洲绿猴肾细胞(VERO-76)、人宫颈癌细胞(HELA)、犬肾细胞(MDCK)、布法罗大鼠肝脏细胞(BRL 3A)、人肺细胞(W138)、人肝脏细胞(HepG2)、中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)、CHO-S细胞、NSO细胞、骨髓瘤细胞系如Y0、NS0、P3X63和Sp2/0等。适于产生蛋白质的哺乳动物宿主细胞系的综述参见例如Yazaki和Wu,Methods in Molecular Biology,第248卷(B.K.C.Lo编著,Humana Press,Totowa,NJ),第255-268页(2003)。在一个优选的实施方案中,所述宿主细胞是CHO细胞或HEK293细胞。
在一个实施方案中,本发明提供了制备结合CLDN18.2分子的抗体(包括P329G突变抗体)的方法,其中所述方法包括在适于表达编码所述结合CLDN18.2分子的抗体(包括P329G突变抗体)的核酸的条件下培养包含编码所述结合CLDN18.2分子的抗体(包括P329G突变抗体)的核酸或包含所述核酸的表达载体的宿主细胞,以及任选地分离所述结合CLDN18.2分子的抗体(包括P329G突变抗体)。在某个实施方案中,所述方法还包括从所述宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收结合CLDN18.2分子的抗体(包括P329G突变抗体)。
如本文所述制备的本发明的结合CLDN18.2分子的抗体(包括P329G突变抗体)可以通过已知的现有技术如高效液相色谱、离子交换层析、凝胶电泳、亲和层析、大小排阻层析等纯化。用来纯化特定蛋白质的实际条件还取决于净电荷、疏水性、亲水性等因素,并且这些对 本领域技术人员是显而易见的。可以通过多种熟知分析方法中的任一种方法确定本发明的结合CLDN18.2分子的抗体(包括P329G突变抗体)的纯度,所述熟知分析方法包括大小排阻层析、凝胶电泳、高效液相色谱等。
可以通过本领域中已知的多种测定法对本文中提供的结合CLDN18.2分子的抗体(包括P329G突变抗体)鉴定、筛选或表征其物理/化学特性和/或生物学活性。一方面,对本发明的结合CLDN18.2分子的抗体(包括P329G突变抗体)测试其抗原结合活性,例如通过已知的方法诸如FACS、ELISA或Western印迹等来进行。可使用本领域已知方法来测定对CLDN18.2的结合,本文中公开了例示性方法。在一些实施方案中,使用FACS测定本发明的结合CLDN18.2分子的抗体(包括P329G突变抗体)对细胞表面CLDN18.2(例如人CLDN18.2)的结合。
本发明还提供了用于鉴定具有生物学活性的结合CLDN18.2分子的抗体(包括P329G突变抗体)的测定法。生物学活性可以包括例如ADCC作用、CDC作用等。
供任何上述体外测定法使用的细胞包括天然表达CLDN18.2或经改造而表达CLDN18.2细胞系。所述经改造而表达CLDN18.2细胞系是正常情况下不表达CLDN18.2的、将编码CLDN18.2的DNA转染入细胞之后表达CLDN18.2的细胞系。
V.本发明的药物组合
对于优化CAR疗法的安全性和疗效而言,本发明的分子开关调控型嵌合抗原受体是可以控制CAR活性的可调控型CAR。本发明使用将Pro329Gly(抗体Fc段根据EU编号的第329位脯氨酸突变为甘氨酸,简写为P329G)突变抗体作为本发明CAR治疗中的安全开关。在所述P329G突变抗体不存在时,本发明的CAR活性关闭;在所述P329G突变抗体存在时,本发明的CAR活性开启;由此,本发明的CAR分子活性的开启和关闭受到P329G突变抗体的调控。
在一些实施方案中,本发明提供了药物组合,其包含(i)表达本发明的分子开关调控型CAR多肽的免疫效应细胞(例如,T细胞);和(ii)特异性结合CLDN18.2分子的P329G突变抗体。例如,所述免疫效应细胞是自自体T细胞或同种异体T细胞制备的表达本发明的分子开关调控型CAR多肽的T细胞,例如,所述免疫效应细胞是自人PBMC分离的T细胞制备的表达本发明的分子开关调控型CAR多肽的T细胞。在一些实施方案中,所述P329G突变抗体是HB37A6 PG Ab、Hz69H9 PG Ab、Hz69H9-1.2 PG Ab、Hz69H9-2.1 PG Ab、Hz69H9-SA PG Ab、和/或Hz3G3 PG Ab。
在一些实施方案中,本发明提供了药物组合,其包含(i)编码本发明的分子开关调控型CAR多肽的核酸分子或包含所述核酸组分的载体;和(ii)特异性结合CLDN18.2分子的P329G突变抗体。
在一些实施方案中,本发明的药物组合任选地进一步包含合适制剂的可药用辅料。例如,所述药物组合中的(ii)可根据常规方法制剂化(例如Remington’s Pharmaceutical Science,最新版,Mark Publishing Company,Easton,U.S.A)。可药用辅料可以例示例如表面活性剂、赋形剂、着色料、香料、防腐剂、稳定剂、缓冲剂、悬浮剂、等张剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、流 动促进剂、矫味剂等。进一步地,也可合适地使用其他常用的载剂,例如,轻质无水硅酸、乳糖、结晶纤维素、甘露醇、淀粉、羧甲基纤维素钙、羧甲基纤维素钠、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯缩醛二乙氨基乙酸酯、聚乙烯吡咯啶酮、明胶、中链脂肪酸三甘油酯、聚氧乙烯硬化蓖麻油60、白砂糖、羧甲基纤维素、玉米淀粉、无机盐类等作为载剂,但不限于此。
在一些实施方案中,本发明的药物组合用于治疗与CLDN18.2相关的疾病,例如表达或过表达CLDN 18.2的癌症,所述癌症是例如CLDN18.2阳性实体瘤。
VI.本发明的药物组合的用途和使用本发明的药物组合的治疗方法
本发明提供了前述本发明的药物组合,其用于在受试者中治疗与CLDN18.2相关的疾病,其中所述与CLDN18.2相关的疾病例如是表达或过表达CLDN 18.2的癌症,所述癌症例如是CLDN18.2阳性实体瘤。
在一个实施方案中,本发明的药物组合用于在受试者中治疗表达或过表达CLDN 18.2的癌症(例如,CLDN18.2阳性实体瘤),并且能够减轻癌症的至少一种症状或指征的严重性或抑制癌细胞生长。
本发明提供了在受试者中治疗与CLDN18.2相关的疾病(例如,表达或过表达CLDN 18.2的癌症,例如,癌症是CLDN18.2阳性实体瘤)的方法,其包括向有需要的个体施用治疗有效量的本发明的药物组合。
本发明提供了前述本发明的药物组合在制备用于治疗与CLDN18.2相关的疾病(例如,表达或过表达CLDN 18.2的癌症,例如,癌症是CLDN18.2阳性实体瘤)的药物中的用途。
本发明的药物组合也可以施用于已经用一种或多种先前疗法治疗癌症但随后复发或转移的个体。
在一些实施方案中,本发明的药物组合中的(i)表达本发明的分子开关调控型CAR多肽的免疫效应细胞(例如,T细胞)和(ii)特异性结合CLDN18.2分子的P329G突变抗体用于胃肠外、经皮、腔内、动脉内、静脉内、鞘内施用,或直接注入组织或肿瘤中。在一些实施方案中,本发明的药物组合中的(ii)特异性结合CLDN18.2分子的P329G突变抗体在(i)表达本发明的分子开关调控型CAR多肽的免疫效应细胞(例如,T细胞)之前、同时或之后施用。
在一些实施方案中,本发明的药物组合中的(i)表达本发明的分子开关调控型CAR多肽的免疫效应细胞是自自体T细胞或同种异体T细胞制备的表达本发明CAR多肽的T细胞;本发明的药物组合中的(ii)特异性结合CLDN18.2分子的P329G突变抗体是任何特异性结合CLDN18.2分子的抗体,其包含P329G突变。优选地,所述P329G突变抗体是HB37A6 PG Ab、Hz69H9 PG Ab、Hz69H9-1.2 PG Ab、Hz69H9-2.1 PG Ab、Hz69H9-SA PG Ab、和/或Hz3G3 PG Ab。
当本发明的药物组合中的组分(i)是表达本发明的分子开关调控型CAR多肽的免疫效应细胞(例如,T细胞)时,本发明不限制本发明的药物组合中的组分(i)和组分(ii)向受试者施用的顺序,也不限制向受试者施用本发明的药物组合中的组分(i)和组分(ii)之间的时间安排。因 此,本发明的药物组合中的(i)和(ii)可以分开、同时或依次施用。当两种组分没有同时施用时,这两种组分的施用可以间隔1分钟、5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时或72小时,或间隔本领域技术人员容易确定的任何合适的时间差。例如,第一天静脉内施用(i),第二天施用(ii),然后按照一定频率多次施用(ii),同时通过监测(i)的体内浓度和期望的治疗功效终点,确定是否多次施用(i);或者第一天施用(ii),第二天静脉内施用(i),然后按照一定频率多次施用(ii),同时通过监测(i)的体内浓度和期望的治疗功效终点,确定是否多次施用(i)。
在一些实施方案中,将本发明的药物组合中的(i)和(ii)各施用一次,然后按照每3-4天一次、每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次的给药频率多次施用(ii),同时通过检测(i)的体内浓度和期望的治疗功效终点,确定是否多次施用(i)。
在一些实施方案中,本发明的药物组合中的组分(i)是表达本发明的分子开关调控型CAR多肽的免疫效应细胞(例如,T细胞)时,还包括将所述组分(i)和组分(ii)在施用于受试者之前预先一起孵育的情况。因此,可以在施用前预先孵育这两种组分1分钟、5分钟、10分钟、15分钟、30分钟、45分钟或1小时,或本领域技术人员容易确定的任何合适时间。
本发明的药物组合可以以合适的剂量施用于受试者。剂量方案将由主治医生和临床因素决定。如医学领域中公知的,用于任何一名患者的剂量取决于许多因素,包括患者的体重、身体表面积、年龄、待施用的特定化合物、性别、施用时间和途径、一般健康状况、和待并行施用的其他药物。
在一些实施方案中,本发明的药物组合中的组分(i)是表达本发明的分子开关调控型CAR多肽的免疫效应细胞(例如,T细胞)时,将组分(i)以1×10
6个细胞-1×10
12个免疫效应细胞、优选地为5×10
6个细胞-1×10
11个、更优选地为1×10
7个细胞-1×10
10个免疫效应细胞、例如5×10
7个细胞、2.5×10
8个细胞、7.5×10
8个细胞、1.25×10
9个免疫效应细胞的剂量以单次或多次静脉内施用;并将组分(ii)以0.1-10mg/kg、优选地0.3mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg、3mg/kg、5mg/kg、7mg/kg或9mg/kg的剂量单元的形式,优选为胃肠外、更优选静脉内施用。
在一些实施方案中,向患有癌症的个体施用本发明的药物组合导致肿瘤的完全消失。在一些实施方案中,向患有癌症的个体施用本发明的药物组合导致肿瘤细胞或肿瘤大小减少至少85%或更多。可以通过本领域已知的任何方法测量肿瘤的减少,例如X-线、正电子发射断层扫描(PET)、计算机断层扫描(CT)、磁共振成像(MRI)、细胞学、组织学或分子遗传分析。
在一些实施方案中,本发明的药物组合可以降低CAR-T细胞存在的“在靶/脱肿瘤(On-target/off tumor)”毒性。
VII.本发明的药盒
本发明提供了一种成套药盒,其包含本发明的药物组合,优选地所述药盒为药物剂量单元形式。由此可以依据给药方案或药物施用间隔提供剂量单元。
在一个实施方案中,本发明的成套药盒在同一包装内包含:
(i)选自表达本发明的分子开关调控型CAR多肽的免疫效应细胞(例如,T细胞)、编码本 发明的分子开关调控型CAR多肽的核酸分子、包含所述核酸的载体、和它们的任意组合;
(ii)特异性结合CLDN18.2分子的P329G突变抗体。
本发明所述的各个实施方案/技术方案以及各个实施方案/技术方案中的特征应当被理解为可以任意进行相互组合,这些相互组合得到的各个方案均包括在本发明的范围内,就如同在本文中具体地且逐一地列出了这些相互组合而得到的方案一样,除非上下文清楚地显示并非如此。
描述以下实施例以辅助对本发明的理解。不意在且不应当以任何方式将实施例解释成对本发明的保护范围的限制。
实施例1、CAR基因合成及病毒表达载体构建
人工合成SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26所示的DNA片段,这些DNA片段分别编码SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列,它们分别对应图1所示的HuR968C、HuR9684M、HuCD28HR968、HuR968B这4个不同的CAR构建体。
这些CAR构建体(下文中有时也称为P329 CAR;P329G CAR;PG CAR)包含相同的氨基端(N端)信号肽序列(SEQ ID NO:1)、抗P329G突变抗体重链可变区VH序列(SEQ ID NO:2)、接头序列(SEQ ID NO:4)、抗P329G突变抗体轻链可变区VL(SEQ ID NO:3)。
在所述抗P329G突变抗体轻链可变区VL的C端,CAR构建体HuR968C、HuR968B构建体含有G4S铰链区序列(SEQ ID NO:5)、HuR9684M构建体含有源自IgG4的突变铰链区序列(SEQ ID NO:6)、HuCD28HR968含有源自CD28分子的铰链区序列(SEQ ID NO:7);HuR968C、HuR9684M、HuCD28HR968含有源自CD28分子的跨膜区序列(SEQ ID NO:8)、HuR968B含有源自CD8分子的跨膜区序列(SEQ ID NO:9);HuR968C缺少胞内信号序列,HuR9684M、HuCD28HR968含有源自CD28分子的共刺激信号序列(SEQ ID NO:10)、HuR968B含有源自4-1BB分子的共刺激信号序列(SEQ ID NO:11);除了HuR968C之外,其他所有CAR构建体含有源自CD3ζ链(CD247)胞内刺激信号结构域(SEQ ID NO:13)。
另外,人工合成直接靶向CLDN18.2分子的8E5 CAR(SEQ ID NO:31),用作CAR-T细胞对表达CLDN18.2分子的肿瘤细胞直接杀伤的阳性对照。8E5 CAR从N端到C端含有信号肽、抗CLDN18.2 scFv、CD8α分子的铰链区(SEQ ID NO:18)、CD28分子跨膜区(SEQ ID NO:8)及CD28共刺激信号结构域(SEQ ID NO:10)以及CD3ζ链胞内激活结构域(SEQ ID NO:17)。
还构建了靶向结合抗体Fc段的CD16-158V CAR(SEQ ID NO:32)。CD16-158V CAR从N端到C端含有信号肽、CD16分子胞外段(158V)、CD28分子跨膜区(SEQ ID NO:8)及CD28共刺激信号结构域(SEQ ID NO:10)以及CD3ζ链胞内激活结构域(SEQ ID NO:13)。高亲和力CD16 158V变体与野生型和Fc工程化抗体结合,能够强烈促进CD16-158V CAR T细胞活 性。CD16-158V CAR用作与抗体组合发挥作用的阳性对照。
另外,构建了靶向BCMA的Blue21 CAR(SEQ ID NO:33),用作阴性对照。Blue21 CAR从N端到C端含有信号肽、抗BCMA单链抗体(来自11D53克隆)、CD8α分子的铰链区(SEQ ID NO:18)及CD8α分子跨膜区(SEQ ID NO:9)、4-1BB共刺激信号结构域(SEQ ID NO:11)以及CD3ζ链胞内激活结构域(SEQ ID NO:13)。
pRK慢病毒表达载体的各元件如图2所示。分别将上述编码CAR多肽的DNA片段插入pRK慢病毒表达载体(由pRRLSIN.cPPT.PGK-GFP.WPRE载体(Addgene,12252,购自生物风)通过替换启动子和抗性基因改构而成)的EF1α启动子下游,替换载体中的EGFR序列,获得了靶向P329G突变或各对照的CAR表达质粒(pRK-HuR968C、pRK-HuR9684M、pRK-HuCD28HR968、pRK-HuR968B、pRK-8E5、pRK-CD16、pRK-Blue21)。
将用于表达CAR的慢病毒表达载体经限制性内切酶酶切,并电泳鉴定,结果如图3所示,表明正确构建了用于表达CAR的慢病毒表达载体。
实施例2、CAR-T细胞制备、CAR表达检测及表型检测
(2-1)慢病毒浓缩液的制备
将实施例1制备的CAR表达质粒与结构质粒pMDLg/pRRE(Addgene,12251,购自生物风)、调节质粒pRSV-rev(Addgene,12253,购自生物风)及包膜质粒pMD2G(Addgene,12259,购自生物风)以3:3:2:2的质量比例用PEI转染法转染Lenti-X-293T细胞(Takara公司),转染16小时后,更换为含有2%胎牛血清(FBS)的新鲜DEME培养基,继续培养48小时后,收集细胞上清,离心去细胞碎片,加入PEG8000 4℃孵育16-64小时进行慢病毒浓缩,再次离心后去上清,采用T细胞培养基重悬慢病毒沉淀物,获得慢病毒浓缩液,分装后-80℃冻存。
(2-2)慢病毒滴度检测
消化Lenti-X-293T细胞(Takara公司)并用含有8μg/ml Polybrene(Sigma,H9268-5G)的DMEM培养基重悬细胞,将细胞悬液加入到24孔板中,加入不同体积的自实施例2-1获得的慢病毒浓缩液,培养72小时,进行293T细胞的转导。
将慢病毒浓缩液转导后的293T细胞消化,用生物素-SP-缀合的抗人IgG,F(ab’)
2-特异的(Biotin-SP-conjugated anti-Human IgG,F(ab’)
2-specific)(Jackson ImmunoResearch,109-066-006)以及APC-Streptadvidin(BioLegend,405207)进行染色,并采用细胞流式术检测APC阳性细胞的比例。通过起始细胞量、病毒体积和阳性细胞比例计算出病毒滴度(TU/ml)。
(2-3)T细胞分选、感染及CAR-T扩增培养
添加注射用重组人白介素-2(国药准字S20040020)至TexMACS GMP Medium(Miltenyi Biotec,170-076-309)中,配制成IL-2浓度为200IU/ml的T细胞培养基。
第0天使用Pan T Cell Isolation Kit(human)(Miltenyi,130-096-535)对复苏后的PBMC进行分选,获得T细胞,使用T细胞培养基将T细胞重悬至一定的密度并添加TransAct(Miltenyi,130-111-160)进行激活。
第1天分出一定量T细胞不添加慢病毒继续培养,该部分细胞为未转导细胞(UNT,un-transduced T cells),剩余的细胞按MOI=1~5添加不同种类的自实施例2-1获得的慢病毒浓缩液并将T细胞吹打均匀;第2天离心去除病毒上清,重悬细胞至新鲜T细胞培养基。UNT细胞无任何操作;第3天将所有细胞转移至G-Rex(WILSONWOLF,货号80040S)中,并添加适量新鲜T细胞培养基,放置于37℃CO
2培养箱中静置培养;每隔2~3天,将细胞以培养基的半量更换为新鲜培养基或直接补加IL-2,其中,添加IL-2至细胞培养基浓度中IL-2浓度为200IU/ml。当细胞数量扩增至约为20-80倍时,满足需求后(一般达到2~8x10
8个细胞)进行细胞收获。离心去除培养基后CAR-T细胞采用
CS10(Stemcell,07930)重悬后分装,程序降温至-80℃进行冻存。
(2-4)CAR表达检测
取适量自上述实施例2-3获得的CAR-T细胞,FACS缓冲液(PBS+2%FBS)洗涤一次,重悬后加入含LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain(Thermo,L34963)的FACS缓冲液,室温染色10-15min,洗涤两次,加入PerCP-Cy5.5-CD3(BD,560835)、BUV805-CD8(BD,749366)、生物素-F(ab')
2片段山羊抗人IgG(Biotin-F(ab')
2Fragment Goat Anti-Human IgG)(Jackson ImmunoResearch,109-066-006)抗体组合,对于Blue 21 CAR检测,采用生物素-F(ab')
2片段山羊抗小鼠IgG(Biotin-F(ab')
2Fragment Goat Anti-Mouse IgG)(Jackson ImmunoResearch,115-066-006)抗体代替,洗涤两次后再加入APC-链亲和素,4℃染色30~45min;对于CD16(158V)CAR检测,直接加入PerCP-Cy5.5-CD3(BD,560835)、BUV805-CD8(BD,749366)、别藻蓝蛋白(APC)-片段山羊抗人IgG(Allophycocyanin(APC)-Fragment Goat Anti-Human IgG)(Jackson ImmunoResearch,109-136-098)抗体组合;细胞洗涤两次后FACS缓冲液重悬,用流式细胞仪检测。
(2-5)CAR-T细胞表型检测:
取适量CAR-T细胞,FACS缓冲液洗涤一次,重悬后加入含LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain FACS缓冲液,室温染色10-15min,洗涤两次,加入PerCP-Cy5.5-CD3(BD,560835)、BUV805-CD8(BD,749366)、APC-Cy7-CD45RA(Biolegend,304127)、FITC-CCR7(Biolegend,353206)或PerCP-Cy5.5-CD3(BD,560835)、BUV805-CD8(BD,749366)、BUV737-CD28(BD,564438)、PE-CD27(BD,557330)抗体组合,4℃染色30~45min,细胞洗涤两次后FACS缓冲液重悬,用流式细胞仪检测。
图4A显示了分别用实施例1构建的7种CAR转导T细胞后,CD3
+T细胞、CD8
-(CD4
+)T细胞、CD8
+T细胞亚群中CAR的表达,结果表明这些经转导的T细胞中CAR表达阳性率约为15%~60%。
图4B显示了分别用实施例1构建的7种CAR转导T细胞后,各CAR-T细胞上CD45RA、CCR7的表达。结果表明CAR-T细胞由CD45RA
+CCR7
+初始或干性记忆性T细胞(T
N/T
SCM)、CD45RA
-CCR7
+中心记忆性T细胞(T
CM)、CD45RA-CCR7-效应记忆性T细胞(T
EM)、CD45RA+CCR7-效应T细胞(T
E)亚群构成,且CAR-T细胞大部分为T
N/T
SCM、T
CM细胞。
图4C显示了分别用实施例1构建的7种CAR转导T细胞后,各CAR-T细胞上CD27、CD28的表达。结果表明CAR-T细胞大部分为CD27
+CD28
+细胞。
实施例3、检测肿瘤细胞的CLDN18.2表达
取适量处于对数生长期经消化后收获的肿瘤细胞,分别为AGS、SNU601、SNU620、NUGC4胃癌细胞系和稳定转染表达CLDN18.2的DAN-G18.2人胰腺癌细胞系细胞(Innoventbio新药部门构建,具体构建方法同专利申请PCT/CN2021/100870中记载的DAN-G-CLDN18.2肿瘤细胞系的构建),FACS缓冲液洗涤2次,加入HB37A6抗体(该抗体为抗CLDN18.2抗体,其氨基酸序列如SEQ ID NO:41所示,也参见专利申请PCT/CN2021/100870),作为染色对照的细胞不加入CLDN18.2抗体,4℃染色30~45min,洗涤两次,加入APC-F(ab')
2片段山羊抗人IgG抗体,4℃染色30~45min,细胞洗涤两次后FACS缓冲液重悬,用流式细胞仪检测。
图5的代表性流式细胞图显示了AGS、SNU601、SNU620、NUGC4胃癌细胞系和稳定转染表达CLDN18.2的DAN-G18.2人胰腺癌细胞系细胞中CLDN18.2分子的表达。由图5可见,DAN-G18.2细胞有最高水平的CLDN18.2表达,NUGC4中等水平表达CLDN18.2,SNU601、SNU620低水平表达CLDN18.2,AGS细胞不表达CLDN18.2。表1显示了每种细胞对照及CLDN18.2抗体染色平均荧光强度值(MFI)及阳性染色与对照的MFI比值。
表1
实施例4、CLDN18.2特异性WT抗体及P329G突变抗体的合成及功能活性检测
(4-1)CLDN18.2特异性抗体的合成
从专利中(专利申请号:PCT/CN2021/100870)获得CLDN18.2抗体HB37A6(本文中也简称为A6抗体)克隆轻重链可变区(SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35);Hz69H9(本文中也简称为H9)克隆轻重链可变区(SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37)序列;从US10813996B2专利中获得175D10 克隆轻重链可变区序列,作为阳性对照抗体(Zolbetuximab,Zmab);采用全基因合成抗体轻重链可变区核苷酸序列,装入含有WT的人源IgG1重链恒定区(SEQ ID NO:38)或P329G点突变的人源IgG1重链恒定区(SEQ ID NO:39)和κ轻链恒定区(SEQ ID NO:40)序列的pcDNA3.4表达载体(购自上海伯英)上。将轻重链表达载体按照2:3摩尔比通过PEI共转染到HEK293细胞中,培养5~7天后收集培养基上清。含有抗体的上清培养基通过Protein A柱进行一步纯化,之后用PBS透析。采用NanoDrop仪器读取280nm吸光度值检测浓度,并用SDS-PAGE和SEC-HPLC方法检测样品纯度。
(4-2)P329G A6抗体与作为抗原的CLDN18.2的特异性结合活性检测:
用FACS缓冲液将P329G A6抗体、P329G H9抗体、P329G Zmab抗体配制成5倍梯度稀释的不同浓度抗体溶液,分别与1E5个表达CLDN18.2分子作为抗原的靶细胞4℃孵育30分钟,用FACS缓冲液清洗后,再与APC-山羊抗人IgG,Fcγfragment specific(Jackson ImmunoResearch,109-136-098)在4℃孵育30分钟。采用流式细胞术检测与细胞结合的P329G抗体,分析APC通道MFI,以抗体浓度为X轴,APC通道MFI为Y轴进行绘图并计算结合的EC50。
图6A显示了不同浓度的A6、H9和Zmab抗体与稳定表达人、恒河猴、小鼠及大鼠CLDN18.1和CLDN18.2的CHO-GS细胞(Innoventbio新药部门构建,具体构建方法同专利申请PCT/CN2021/100870中记载的人源CLDN18.1和CLDN18.2过表达CHO-S细胞株:CHO-hCLDN18.1、CHO-hCLDN18.2的构建)结合能力。结果表明,A6、H9和Zmab抗体均能够与不同种属CLDN18.2结合;H9和Zmab抗体对CLDN18.2的结合具有高度特异性,它们不识别人、猴、鼠CLDN18.1,而A6抗体仅在高浓度(200nM)情况下与小鼠和大鼠CLDN18.1有微弱结合。图6A还显示了不同浓度WT和P329G突变A6抗体与CLDN18.2表达阳性肿瘤细胞SUN601、NUGC4、DAN-G18.2的结合。结果表明,P329G A6抗体能够与CLDN18.2表达阳性肿瘤细胞结合并呈现浓度依赖性。
下表2总结了A6、H9和Zmab抗体作为3种不同的克隆抗体与不同种属CLDN18.2和CLDN18.1的结合EC50和EC90值。
表2
(4-3)P329G A6抗体与P329G CAR的结合活性检测:
复苏实施例2制备的P329G CAR-T细胞,用含有10%FBS的RPMI 1640培养基重悬,并在37℃培养稳定24小时。用FACS缓冲液将P329G A6抗体以及野生型抗体分别配制成5倍梯度稀释的不同浓度抗体溶液,分别与1E5个P329G CAR阳性细胞4℃孵育30分钟,用FACS缓冲液清洗后,再与APC山羊抗人IgG,Fcγ片段特异的(Jackson ImmunoResearch,109-136-098)4℃孵育30分钟。采用流式细胞术检测与P329G CAR-T细胞结合的抗体,分析APC通道MFI,以抗体浓度为X轴,APC通道MFI为Y轴进行绘图并计算结合的EC50。
图6B显示了WT和P329G突变A6抗体与P329G CAR-T细胞的结合情况,结果表明,只有P329G突变抗体(文中有时也简称为“PG抗体”、“PG Ab”)显示与P329G CAR结合,而WT抗体(WT Ab)不结合。
(4-4)PBMC通过野生型/PG A6抗体介导ADCC效应的功能检测
复苏不同供者的PBMC细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cells,外周血单个核细胞)(供者PBMC信息见表3),用RPMI 1640培养基重悬,并在37℃稳定1-2小时。按照效应细胞与靶细胞之比20:1混合PBMC和靶细胞(DAN-G18.2肿瘤细胞),并与不同浓度的WT和P329G突变A6抗体混合,37℃继续培养24小时,用LDH检测试剂盒(Promega,G1780)检测抗体介导的PBMC对靶细胞的杀伤效应,并以抗体浓度为X轴,细胞裂解比例为Y轴进行绘图和分析。
表3
图6C显示了WT和P329G突变A6抗体是否介导PBMC通过ADCC发挥细胞杀伤功能。 测试了供者3来源的PBMC,结果表明,只有WT抗体介导了PBMC对CLDN18.2表达阳性DAN-G18.2肿瘤细胞的ADCC杀伤效应,而P329G突变抗体缺乏诱导PBMC对CLDN18.2表达阳性DAN-G18.2肿瘤细胞发挥ADCC效应的能力。
(4-5)P329G A6抗体CDC效应功能检测
将不同浓度的P329G A6抗体和野生型A6抗体分别与靶细胞(DAN-G18.2肿瘤细胞)在37℃孵育30分钟,之后加入10μl人血清补体(Sigma,S1764-1ML)继续培养3小时,用CellTiter-Glo(Promega,G9242)检测活细胞比例,以抗体浓度为X轴,活细胞比例为Y轴进行绘图并分析抗体的CDC效应。
图6D显示了WT和P329G突变A6抗体是否介导补体通过CDC发挥细胞杀伤功能,结果表明,只有WT抗体介导了对CLDN18.2表达阳性DAN-G18.2肿瘤细胞的CDC杀伤效应,而P329G突变抗体缺乏诱导CDC效应的能力。
实施例5、P329G CAR候选分子筛选
(5-1)对表达CLDN18.2的肿瘤靶细胞的体外反复动态杀伤实验:
采用xCELLigence RTCA MP仪器(Agilent)动态实时检测实施例2制备的CAR-T细胞对表达CLDN18.2的靶细胞的连续杀伤情况。在第一块96孔E-Plates板(Agilent,3006000910)中添加50μL培养基,仪器读取基准值后,添加50μL肿瘤靶细胞(30000个细胞),放置仪器内动态检测。同时复苏UNT以及实施例2制备的CAR-T细胞,置于37℃培养箱过夜。约24h小时后,使用UNT细胞将所有CAR-T细胞的阳性率调整一致,按E:T比例1:2加入供者3PBMC制备的不同CAR-T细胞,并于对应孔内添加WT或P329G突变A6抗体。xCELLigence RTCA MP仪器系统动态监测P329G CAR-T细胞对靶细胞杀伤情况,持续72-96小时。在第一块E-Plates板中完成第一轮杀伤实验后,将所有悬浮细胞(主要含有CAR-T细胞)转移至96孔V底板中,离心弃上清,加入新鲜培养基重悬,添加至第二块含有靶肿瘤细胞的E-Plates板中,并于对应孔内重新添加抗体,持续监测72-96小时,如此反复进行2-4轮杀伤实验。
图7A显示了来自供者3(PCH20201100004:allcells,cat:PB004F-C,39岁女性)制备的HuR968B、HuR9684M、Hu28HR968CAR-T细胞在E:T比例1:5情况下反复杀伤SNU601细胞的实验结果。所有CAR-T细胞维持了3轮杀伤活性,在第4轮杀伤实验中,仅HuR968B CAR-T细胞维持了杀伤活性,且优于传统8E5 CAR-T细胞的杀伤活性,而作为阳性对照的CD16 CAR-T细胞在第4轮杀伤实验中也失去杀伤活性。
图7B显示来自供者3(PCH20201100004:allcells,cat:PB004F-C,39岁女性)制备的HuR968B、HuR9684M、Hu28HR968CAR-T细胞在E:T比例1:10情况下反复杀伤SNU601细胞的实验结果。3个不同CAR-T细胞维持了2轮杀伤活性,在第3轮杀伤实验中,仅HuR9684M、HuR968B CAR-T细胞维持了杀伤活性;在第4轮杀伤实验中,所有CAR-T细胞基本丧失杀伤活性。作为阳性对照的传统8E5 CAR-T细胞维持了3轮杀伤活性,在第4轮杀伤实验中活性丧失,而CD16CAR-T细胞仅维持了2轮杀伤活性。
实施例6、HuR968B、HuR9684M CAR-T细胞体外功能研究
(6-1)对表达CLDN18.2的肿瘤靶细胞的动态杀伤实验:
采用xCELLigence RTCA MP仪器动态实时检测CAR-T细胞对靶细胞的杀伤情况。在E-Plates板中添加50μL培养基,仪器读取基准值后,添加50μL肿瘤靶细胞(30000个细胞),放置仪器内动态检测。同时复苏UNT以及CAR-T细胞,置于37℃培养箱过夜。约24h小时后,使用UNT细胞将所有CAR-T细胞的阳性率调整一致,按E:T比例1:2加入同一供者PBMC制备的不同CAR-T细胞,并于对应孔内添加WT或P329G突变A6抗体。xCELLigence RTCA MP仪器系统动态监测P329G CAR-T细胞对靶细胞杀伤情况,持续72-96小时。
图8A显示了自供者3(PCH20201100004:allcells,cat:PB004F-C,39岁女性)制备的HuR968B、HuR9684M CAR-T细胞对DAN-G18.2肿瘤细胞杀伤效应。在E:T比例1:2情况下,加入100ng/ml P329G A6抗体诱导HuR968B、HuR9684M CAR-T细胞对DAN-G18.2细胞的完全杀伤效应,加入WT A6抗体不能诱导上述CAR-T细胞的杀伤活性;阳性对照的传统8E5 CAR-T细胞在加入P329G和WT A6抗体都能产生杀伤效应,而阴性对照的未转导UNT细胞不产生杀伤效应。
图8E显示了HuR968B CAR-T细胞在不同P329G A6抗体浓度情况下对DAN-G18.2肿瘤细胞的杀伤效应。在CLDN18.2高表达的DAN-G18.2肿瘤细胞中,低至12.8pM P329G A6抗体就能够诱导HuR968B CAR-T细胞对靶细胞的完全杀伤效应;而在CLDN18.2低表达的SNU601肿瘤细胞中,64pM P329G A6抗体能够诱导HuR968B CAR-T细胞对靶细胞的完全杀伤效应。
(6-2)细胞因子检测:
使用BD
TM Cytometric Bead Array(CBA)Human Th1/Th2Cytokine Kit II对细胞因子进行检测。将试剂盒内Capture Beads等体积混匀后,以25μL/孔进行布板。添加等体积的杀伤实验中的上清液或上清稀释液或标准品。混匀后添加25μL等体积的Human Th1/Th2 PE Detection Reagent,室温避光孵育3h。使用Wash缓冲液洗涤两次后重悬,用流式细胞仪检测,通过PE通道MFI值计算细胞因子浓度。
图8B-图8D分别显示了来自供者3(PCH20201100004:allcells,cat:PB004F-C,39岁女性)的HuR968B、HuR9684M CAR-T细胞与肿瘤细胞共培养后效应细胞因子释放结果。在加入WT情况下,HuR968B、HuR9684M CAR-T细胞没有被激活,不分泌IL-2、IFN-γ、TNF-α等效应细胞因子,只有在加入P329G A6抗体情况下,P329G CAR-T细胞被激活,分泌效应细胞因子。与HuR968相比较,HuR9684M分泌更高水平细胞因子。阳性对照的传统8E5细胞在加入WT或P329G A6抗体情况下都分泌高水平细胞因子,水平略高于HuR9684M CAR-T细胞。
(6-3)CAR-T细胞增殖实验:
CFSE染色法:复苏CAR-T细胞并在37℃培养稳定过夜,使用CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit(Invitrogen,C34554)标记CAR-T细胞。使用PBS稀释WT或P329G A6抗体,4℃孵育过夜包被96孔平底板。将标记后的细胞分别添加至包被抗体的孔板内;作为阳性对照,在CAR-T细胞中直接加入CD3/CD28偶联磁珠(Gibco,11132D)(磁珠数:细胞数比例1:1);37℃培养72~120h,收集细胞,洗涤重悬后加入含LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain FACS缓冲液,室温染色10-15min,洗涤两次,流式检测分析CAR-T细胞CFSE荧光稀释情况;CellTiter法:复苏CAR-T细胞并在37℃培养稳定过夜。使用PBS稀释WT或P329G A6抗体,4℃孵育过夜包被孔板。将过夜恢复后的CAR-T细胞添加至包被了抗体的孔板内,作为阳性对照,在CAR-T细胞中直接加入CD3/CD28偶联磁珠(磁珠数:细胞数比例3:1);37℃培养48~72h,采用
Luminescent Cell Viability Assay(Promega,G7572)检测细胞发光值。
图8F显示了来自供者3(PCH20201100004:allcells,cat:PB004F-C,39岁女性)的HuR9684M CAR-T细胞受板包被的WT或P329G A6抗体刺激后的增殖情况。CFSE标记的HuR9684M CAR-T细胞在板包被的P329G A6抗体刺激下产生增殖,刺激5天后增殖尤其明显(平均69.5%细胞发生增殖),而在WT A6抗体刺激下虽然也产生增殖(平均42.8%细胞发生增殖),但显著低于P329G抗体刺激诱导的增殖效应。作为阳性对照的CD3/CD28抗体偶联磁珠显著刺激CAR-T细胞增殖。
图8G显示了来自供者3(PCH20201100004:allcells,cat:PB004F-C,39岁女性)的HuR968B CAR-T细胞受板包被的WT或P329G A6抗体刺激后的增殖情况。HuR968B CAR-T细胞在板包被的P329G A6抗体刺激下产生增殖。与使用WT抗体刺激相比较,P329G A6抗体刺激2天或3天后,HuR968B CAR-T细胞分别增殖了约2倍或3.3倍;而UNT细胞在P329G抗体刺激下相比较WT抗体未产生显著增殖;HuR968B CAR-T细胞和UNT细胞在CD3/CD28抗体偶联磁珠刺激情况都产生显著增殖。
实施例7、P329G A6抗体体内药代动力学研究
(7-1)抗体注射及取样
将BALB/c小鼠(年龄4-6周,体重15-17g,雌性)分成2组,每组9只,即P329G A6抗体组(PG Ab)、WT A6(WT Ab)抗体组;将抗体用1×PBS稀释至0.1mg/mL,每只鼠给药体积10mL/kg,即抗体给药剂量1mg/kg;给药方式为静脉注射,给药频率为单次。抗体给药后5min、30min、2h、6h、24h、48h、96h、168h、336h和504h小鼠眼眶后静脉丛采集血液样本100μL,3000g离心,吸取上清液用于血药浓度测定。
(7-2)A6抗体检测
提前一天包被96孔酶标板。用包被液将4C6-mIgG2a(百英合成)稀释至4μg/mL,每孔100μL,封板膜封板,室温过夜。倒掉被溶液,在吸水纸上拍干,然后每孔加入300μL洗液,振荡混匀10秒,拍干洗液后,重复洗涤3次。排枪加入封闭液,每孔200μL,封板膜封板,室温孵育2h。随后洗板1次。将稀释好的标准曲线(由已知浓度的A6-PG抗体梯度稀释,制备标准 曲线)、质量控制样品(A6-PG、WT-PG,百英合成)和待测样本每孔100μL,室温孵育2h。倒掉预包被溶液,在吸水纸上拍干,然后每孔加入300μL洗液,振荡混匀10秒,拍干洗液后,重复洗涤3次。重复一次。将山羊抗人IgG-Fc-HRP(BETHYL)稀释至20ng/mL,每孔加入100μL,室温孵育1h。随后洗板1次。将TMB底物加入到96孔酶标板中,每孔100μL,室温下避光显色5~15分钟。每孔加入100μL ELISA终止液,震荡10秒,读取OD450nm和OD620nm的值。
图9A显示了在小鼠中A6抗体药代动力学实验取样时间点及A6抗体ELISA检测示意图。
图9B显示了小鼠中A6抗体药代动力学实验结果。静脉注射1mg/kg P329G或WT A6抗体后,血清中P329G抗体和WT抗体暴露量(C
max和AUC
last)相似,各主要药代动力学参数无差异。如表4所示,P329G A6抗体AUC
0-inf,C
max,CL,T
1/2分别为2875μg*h/mL,21.5ug/ml,0.35ml/kg/h、279h;WT A6抗体AUC
0-inf,C
max,CL,T
1/2分别为2090μg*h/mL,23.1ug/ml,0.48ml/kg/h、141h,P329G A6抗体半寿期略长于WT抗体。
表4
实施例8、HuR968B、HuR9684M CAR-T细胞联合Zmab抗体体内抗肿瘤效应研究
(8-1)小鼠肿瘤接种及处理、以及抗肿瘤效应
用1x PBS重悬DAN-G18.2细胞,制备成细胞浓度为5×10
6个/mL细胞悬液。NOG小鼠(年龄4-6周,体重15-17g,雌性)右侧背部剃毛,皮下注射5×10
6个/mL的DAN-G18.2细胞悬液,注射体积0.2mL/只,即接种量为1×10
6个细胞/只小鼠。肿瘤细胞接种后10天,将小鼠肿瘤体积在135.98~243.23mm
3的小鼠分成7组,分为载剂组(即,施用PBS组)、PG Ab组(即,施用P329G Zmab抗体组)、仅4M CAR-T组(即,仅施用HuR9684M CAR-T组,下文中也将HuR9684M简写为“4M”)、4M CAR-T+Zmab-PG组、仅8B CAR-T组(即,仅施用HuR968B CAR-T组,下文中也将HuR968B简写为“8B”)、8B CAR-T+Zmab-PG组、8E5 CAR-T共7组,每组5只小鼠。用1x PBS分别重悬CAR-T细胞,制备成CAR
+细胞为2.5×10
7个/mL细胞悬液。尾静脉注射细胞悬液0.2mL/只,即回输CAR+细胞5×10
6个/只小鼠。CAR-T细胞回输后第1天,进行第1次抗体给药(0.3mg/kg);1周后,第2次抗体给药(1mg/kg);第2次抗体给药3周后,第3次抗体给药(1mg/kg/只小鼠),给药方式为腹腔注射。每周监测小鼠体重、肿瘤组织最大长轴(L)和最大宽轴(W)两次。
图10A显示在接种人DAN-G18.2肿瘤细胞的免疫缺陷荷瘤小鼠中HuR968B、HuR9684M CAR-T细胞的治疗效应。结果显示,单独HuR968B、HuR9684M CAR-T细胞或P329G Zmab抗体治疗未产生抗肿瘤效应,只有同时接受CAR-T细胞和P329G Zmab抗体治疗的小鼠才产 生显著抗肿瘤效应,在同时给予P329G Zmab抗体后1周左右肿瘤生长开始被抑制,2周左右肿瘤抑制达到最高点,此时同时给予HuR968B、HuR9684M CAR-T细胞组肿瘤生长抑制率(TGI)分别为93%和74%,而单独CAR-T细胞或抗体处理组小鼠基本未见抗肿瘤药效,TGI分别为1.3%、7.0%、4.9%。此外,作为阳性对照的传统8E5 CAR-T细胞,在同等给药剂量下导致严重毒性,小鼠在CAR-T细胞给药后一周内死亡。
图10B显示该实验中小鼠体重变化。结果显示,经HuR968B或HuR9684M CAR-T细胞和P329G Zmab抗体联合治疗的小鼠体重变化与未处理的小鼠(即,载剂对照处理组)类似,表明联合治疗未诱导明显毒性。相反,传统8E5 CAR-T细胞治疗的小鼠在CAR-T细胞输注后1周内体重快速下降,平均下降16.6%,所有小鼠达到处死终点,表明传统8E5 CAR-T细胞治疗在小鼠中产生严重毒性。
(8-2)体内CAR-T细胞检测
取30μL小鼠血液样本,加入96孔V孔板中,标注为样本检测孔;取10μL小鼠血液样本,加入96孔V孔板中,标注为对照孔。向所有孔内加入100μL含有LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain以及TruStain FcX
TM(anti-mouse CD16/32)(Biolegend)的FACS缓冲液,轻轻混匀,4℃避光孵育15min;随后向样本检测孔内加入Biotin-F(ab')
2片段山羊抗人IgG抗体,4℃避光孵育30min;随后向样本检测孔中各加入100μL FACS缓冲液,400g离心,弃上清;向所有孔中各加入100μL含有APC-Cy7anti-human CD45(Biolegend)、PerCP-Cy5.5-CD3(BD Biosciences)和APC-链亲和素(Biolegend)的FACS buffer,轻轻混匀,4℃避光孵育30min;然后向所有孔中加入200μL/孔FACS缓冲液,400g离心,弃上清;随后加入250μL/孔1X RBC Lysis/Fixation solution(Biolegend),混匀,室温避光孵育20min;400g离心,弃上清;用100μL FACS缓冲液重悬细胞后,每孔加入10μL 123count eBeads,使用流式细胞仪检测。
图10C显示在实施例8-1的实验中HuR968B、HuR9684M CAR-T细胞在小鼠体内扩增情况。结果显示,HuR968B CAR-T细胞回输小鼠体内1周开始扩增,2周后扩增达到较高水平(2166个细胞/100μl外周血),3周后仍维持在高水平(2726个细胞/100μl外周血),同时给予P329G抗体极大促进了HuR968B CAR-T细胞体内扩增,2周及3周CAR-T数量分别为14507、17617个细胞/100μl外周血,是未给予抗体的6-7倍。HuR9684M CAR-T细胞同样在回输小鼠体内1周开始扩增,2周后扩增达到峰值水平(51个细胞/100μl外周血),远低于HuR968B细胞。同时给予P329G抗体同样极大促进了HuR9684M CAR-T细胞体内扩增,2周后峰值扩增水平达到3260个细胞/100μl外周血,3周后CAR-T细胞数量开始下降。两种CAR-T细胞在给予抗体情况下总T细胞扩增动力学类似,2周后达到并维持在较高水平,远高于未同时给予抗体处理的小鼠中总T细胞扩增。在未给予抗体的情况下,HuR9684M单独处理小鼠中总T细胞2周后显著扩增并维持持续扩增,而HuR968B单独处理小鼠中总T细胞2周后扩增达到峰值,3周后开始下降。
实施例9、HuR968B CAR-T细胞联合A6抗体单次给药体内抗肿瘤效应研究
(9-1)小鼠肿瘤接种及处理、以及抗肿瘤效应
用1x PBS重悬DAN-G18.2细胞,制备成细胞浓度为5×10
6个/mL细胞悬液。NOG小鼠右侧背部剃毛,皮下注射5×10
6个/mL的DAN-G18.2细胞悬液,0.2mL/只,即接种量为1×10
6个/只小鼠。肿瘤细胞接种后7天,将小鼠肿瘤体积在72.13~113.94mm
3的小鼠分成5组,分为载剂组、仅8B CAR-T组(HuR968B CAR-T缩写为“8B CAR-T”)、8B CAR-T+A6-PG(0.03mg/kg)组、8B CAR-T+A6-PG(0.1mg/kg)组和8B CAR-T+A6-PG(0.3mg/kg)组,每组7-14只小鼠。用1x PBS重悬8B CAR-T细胞,制备成8B CAR
+细胞为2.5×10
7个/mL细胞悬液。尾静脉注射细胞悬液0.2mL/只小鼠,即回输CAR
+细胞5×10
6个/只小鼠。CAR-T细胞回输后第1天,即在肿瘤细胞接种后的第8天,抗体给药,给药频率为单次,给药方式为腹腔注射。每周监测小鼠体重、肿瘤组织最大长轴(L)和最大宽轴(W)两次。
图11A显示了在接种人DAN-G18.2肿瘤细胞的免疫缺陷荷瘤小鼠中HuR968B CAR-T细胞联合不同剂量P329G A6抗体的治疗效应。结果显示,在同时给予一个低至0.03mg/kg剂量的P329G A6抗体情况下,HuR968B CAR-T细胞诱导了显著的抗肿瘤效应,增加P329G A6抗体剂量至0.1、0.3mg/kg,HuR968B CAR-T细胞诱导的抗肿瘤最大效应未显著增加,但抗肿瘤效应维持的更持久。治疗后2周,0.03、0.1、0.3mg/kg处理组肿瘤生长抑制率(TGI)分别为84.6%、88.7%、91.3%,而治疗后3周TGI分别为75.9%、77.6%、90.0%。单独CAR-T细胞组未显示抗肿瘤效应。
图11B显示了该实验中小鼠体重变化。结果显示,经HuR968B CAR-T细胞和P329G A6抗体治疗的小鼠,其体重在接受处理后开始下降,在同时给予P329G A6抗体后9天下降至最低点,0.03、0.1、0.3mg/kg处理组体重平均下降13.5%、20.6%、24.4%。其后,小鼠体重开始回复,0.03、0.1mg/kg处理组小鼠4天内体重恢复正常,而0.3mg/kg处理组小鼠1周后体重也恢复至正常水平。结果表明,HuR968B CAR-T细胞联合低剂量P329G A6抗体治疗诱导了显著抗肿瘤效应,但也产生了短暂的可耐受毒副效应。
(9-2)体内CAR-T细胞检测:
方法同实施例8-2。
图11C显示了实施例9-1的实验中HuR968B CAR-T细胞在小鼠体内扩增情况。结果显示,HuR968B CAR-T细胞回输小鼠体内1周开始扩增,2周后扩增达到峰值水平,然后快速下降,于3周后回到基线水平。CAR-T细胞体内扩展依赖P329G A6抗体,未同时给予抗体组小鼠未展现明显的细胞扩增;此外,CAR-T细胞扩增呈现一定P329G A6抗体剂量依赖性,更高剂量组小鼠有更高水平的CAR-T细胞扩增,0.03、0.1、0.3mg/kg剂量组峰值扩增水平分别为121783、135765、180927细胞/100μl外周血,远高于未同时给予抗体组(12160细胞/100μl外周血)。
实施例10、HuR968B CAR-T细胞联合A6抗体多次给药体内抗肿瘤效应研究
实施了小鼠肿瘤接种及处理。用1x PBS重悬DAN-G18.2细胞,制备成细胞浓度为5×10
6 个/mL细胞悬液。NOG小鼠右侧背部剃毛,皮下注射5×10
6个/mL的DAN-G18.2细胞悬液,0.2mL/只,即接种量为1×10
6个/只小鼠。肿瘤细胞接种后8天,将小鼠肿瘤体积在65.00~102.85mm
3的小鼠分成6组,分为载剂组、Comb PG Ab组(为Zmab-PG、H9-PG、A6-PG抗体联合)、仅8B CAR-T组、8B CAR-T+Zmab-PG(1mg/kg)组、8B CAR-T+H9-PG(1mg/kg)组和8B CAR-T+A6-PG(0.1mg/kg)组,每组7只小鼠。用1x PBS重悬8B CAR-T细胞,制备成8B CAR+细胞为2.5×10
7个/mL细胞悬液。尾静脉注射细胞悬液0.2mL/只小鼠,即回输CAR
+细胞5×10
6个/只小鼠。CAR-T细胞回输后第1天,即在肿瘤细胞接种后的第9天,抗体给药,给药频率为先间隔1周给药,随后再间隔2周给药;给药方式为腹腔注射。每周监测小鼠体重、肿瘤组织最大长轴(L)和最大宽轴(W)两次。
图12A显示了在接种人DAN-G18.2肿瘤细胞的免疫缺陷荷瘤小鼠中HuR968B CAR-T细胞联合多个剂量P329G抗体的治疗效应。结果表明,给予多次剂量P329G(Zmab、H9或A6)抗体能够诱导产生更持久抗肿瘤效应,结果也显示,在停止给予P329G抗体后,随着时间的推移,小鼠体内P329G抗体浓度逐渐降低,CAR-T细胞作用也开始减弱。
图12B显示了该实验中小鼠的体重变化。结果显示,虽然治疗期间各处理组小鼠体重存在波动,但相比较对照处理小鼠未有显著改变,提示HuR968B CAR-T细胞联合多剂量P329G抗体处理未诱导显著毒性。
实施例11、HuR968B CAR-T细胞联合A6抗体不同给药顺序体内抗肿瘤效应研究
实施了小鼠肿瘤接种及处理。用1x PBS重悬DAN-G18.2细胞,制备成细胞浓度为5×10
6个/mL细胞悬液。NOG小鼠右侧背部剃毛,皮下注射5×10
6个/mL的DAN-G18.2细胞悬液,注射体积0.2mL/只,即接种量为1×10
6个/只小鼠。肿瘤细胞接种后6天,将小鼠肿瘤体积在62.05~122.04mm
3的小鼠分成6组,分为载剂组、仅8B CAR-T组、8B CAR-T+A6-PG(0.03mg/kg)组、8B CAR-T+A6-PG(0.1mg/kg)组、A6-PG(0.03mg/kg)+8B CAR-T组和A6-PG(0.1mg/kg)+8B CAR-T组,每组7只小鼠。肿瘤细胞接种后第7天,用1x PBS重悬8B CAR-T细胞,制备成8B CAR+细胞为2.5×10
7个/mL细胞悬液。8B CAR-T+A6-PG(0.03mg/kg)组和8B CAR-T+A6-PG(0.1mg/kg)组小鼠经尾静脉注射细胞悬液0.2mL/只小鼠;A6-PG(0.03mg/kg)+8B CAR-T组和A6-PG(0.1mg/kg)+8B CAR-T组小鼠分别抗体给药,给药剂量分别为0.03mg/kg和0.1mg/kg,给药方式为腹腔注射。肿瘤细胞接种后第8天,8B CAR-T+A6-PG(0.03mg/kg)组和8B CAR-T+A6-PG(0.1mg/kg)组小鼠给予抗体,给药方式为腹腔注射;A6-PG(0.03mg/kg)+8B CAR-T组和A6-PG(0.1mg/kg)+8B CAR-T组小鼠经尾静脉注射细胞悬液0.2mL/只小鼠。每周监测小鼠体重、肿瘤组织最大长轴(L)和最大宽轴(W)两次。
图13A和图13B显示了在接种人DAN-G18.2肿瘤细胞的免疫缺陷荷瘤小鼠中不同HuR968B CAR-T细胞和P329G A6抗体给药顺序产生的抗肿瘤效应。结果表明,不论先给予CAR-T细胞还是P329G抗体,最终并未对抗肿瘤效应产生影响,2种不同给药方案诱导了相似的抗肿瘤效应:在0.03mk/kg剂量组,先给予CAR-T细胞和先给予抗体组最大TGI分别为 70.4%、75.4%;在0.1mk/kg剂量组,先给予CAR-T细胞和先给予抗体组最大TGI分别为86.4%、76.7%。
实施例12、低亲合力抗体表达纯化及体外结合能力研究
(12-1)抗体的表达和纯化
将针对CLDN18.2的Hz3G3抗体(该抗体为抗CLDN18.2抗体,抗体序列已在专利申请PCT/CN2021/100870中披露,本文中也简称为G3抗体)轻重链可变区(SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43)、Hz69H9-1.2抗体(本文中也简称为H9-1.2抗体)轻重链可变区(SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45)、Hz69H9-2.1抗体(本文中也简称为H9-2.1抗体)轻重链可变区(SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47)、Hz69H9-SA抗体(本文中也简称为H9-SA抗体)轻重链可变区(SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49)序列分别装入含有P329G点突变的人源IgG1重链恒定区(SEQ ID NO:39)和κ轻链恒定区(SEQ ID NO:40)序列的pcDNA3.4表达载体(上海伯英)上,其中Hz69H9-1.2、Hz69H9-2.1、Hz69H9-SA抗体为亲本Hz69H9抗体突变体,对VH或VL部分氨基酸进行了点突变。将轻重链表达载体按照2:3摩尔比通过PEI共转染到HEK293细胞中,培养5~7天后收集培养基上清。含有抗体的上清培养基通过蛋白A柱进行一步纯化,之后用PBS透析获得Hz69H9-1.2PG抗体,Hz69H9-2.1 PG抗体,Hz69H9-SA PG抗体、Hz3G3 PG抗体。采用NanoDrop仪器读取280nm吸光度值检测抗体浓度,并用SDS-PAGE和SEC-HPLC方法检测样品纯度。
(12-2)抗体体外结合能力研究
用FACS缓冲液将抗体配制成5倍梯度稀释的不同浓度抗体溶液,分别与1E5个靶细胞(CHO-GS、DAN-G18.2、NUGC-4)4℃孵育30分钟,用FACS缓冲液清洗后,再与APC-山羊抗人IgG,Fcγfragment specific(Jackson ImmunoResearch,109-136-098)在4℃孵育30分钟。采用流式细胞术检测与细胞结合的抗体,分析APC通道MFI,以抗体浓度为X轴,APC通道MFI为Y轴进行绘图并计算结合的EC50。
图14A显示了基于细胞学实验获得的7个不同抗CLDN18.2抗体与CLDN18.2的结合能力。总体上,A6(HB37A6抗体)、H9(Hz69H9抗体)抗体具有高结合能力,H9-SA、H9-2.1、H9-1.2、Zmab和G3等抗体结合能力相对较低。
表5总结了图14A的实验中7个不同抗CLDN18.2抗体与3种不同CLDN18.2表达细胞的结合EC50值,结果表明,在CLDN18.2高表达的CLDN18.2-CHO-GS细胞中,结合能力排序依次为A6>H9>H9-2.1>H9-1.2>G3>Zmab>H9-SA;在CLDN18.2高表达的DNA-G18.2细胞中,结合能力排序依次为A6>H9>H9-2.1>G3>H9-SA>H9-1.2>Zmab;在CLDN18.2低表达的SNU601细胞中,结合能力排序依次为A6>H9>H9-SA>H9-2.1>G3>H9-1.2>Zmab。
表5
EC50(nM) | A6 | H9 | H9.2.1 | H9-SA | G3 | H9.1.2 | Zmab |
CHO-GS-hCLDN18.2 | ~1.605 | 6.854 | 8.21 | 113.6 | 12.57 | 11.06 | 14.37 |
DAN-G18.2 | 2.11 | 5.977 | 6.95 | 92.14 | 20.83 | 174.4 | 562.9 |
SUN601 | 0.6034 | 2.754 | 261.0 | 49.25 | 794.1 | ~8234 | ~97876 |
(12-3)抗体亲合力(avidity)检测
根据制造商说明,使用氨基偶联试剂盒(GE Healthcare,BR-1000-50),将人Claudin18.2-His(Acro,CL2-H5546)偶联在CM5芯片上(GE Healthcare,29-1496-03),偶联后加入1M乙醇胺对剩余活化位点进行封闭。通过Biacore(GE Healthcare,T200)检测表面抗原与流动相中抗体的结合和解离获得亲合力参数。将稀释后的抗体由低浓度到高浓度的顺序流过芯片,最后使用10mM甘氨酸pH1.5(GE Healthcare,BR-1003-54)对芯片进行再生。最后数据通过Biacore T200分析软件进行分析。
图14B展示了采用表面等离子共振法(SPR)测定上述中的6个抗体与重组人CLDN18.2蛋白的代表性亲合力图谱。结果显示,A6、H9抗体具有最高亲合力(KD分别为<5.043E-12、<5.269E-12),其次为H9-SA、H9-1.2(KD分别为3.254E-10、9.804E-10),然后为Zmab和G3抗体(KD分别为1.378E-9、2.502E-9)。
表6展示了具体的检测结果。这些结果与细胞学结合实验结果一致,表明A6、H9为高亲合力抗体,而H9-SA、H9-1.2、Zmab、G3等与A6、H9抗体相比,为低亲合力抗体。
表6
抗体 | KD(M) | ka(1/Ms) | kd(1/s) |
A6 PG | <4.085E-12 | 2.448E+6 | <1.000E-5 |
A6 WT | <5.043E-12 | 1.983E+6 | <1.000E-5 |
H9 | <5.269E-12 | 1.898E+6 | <1.000E-5 |
H9-SA | 3.254E-10 | 4.709E+5 | 1.532E-4 |
H9.1.2 | 9.804E-10 | 1.886E+6 | 1.849E-3 |
Zmab | 1.378E-9 | 1.648E+6 | 2.270E-3 |
G3 | 2.502E-9 | 7.090E+5 | 1.774E-3 |
实施例13、低亲合力抗体体外功能研究
(13-1)细胞因子释放实验
复苏CAR-T细胞并在37℃培养稳定过夜。将肿瘤靶细胞和CAR-T细胞按照E:T为1:1进行混合,并添加5倍梯度稀释的不同浓度抗体溶液,放于37℃培养约24h后离心取细胞上清液。使用BD
TM Cytometric Bead Array(CBA)Human Th1/Th2 Cytokine Kit II(BD,551809)对细胞上清液中因子进行检测,具体操作如下:将试剂盒内Capture Beads等体积混匀后,以25μL/孔在96孔V底板中进行布板。添加等体积的上清液或上清稀释液以及标准品。混匀后添加等体积的Human Th1/Th2 PE Detection Reagent,室温避光孵育3h。使用Wash缓冲液洗涤两次后重悬,采用流式细胞仪器进行检测,通过PE通道MFI值计算细胞因子浓度。
图15A-图15C分别显示了在与DAN-G18.2或SNU601肿瘤细胞共培养的实验中,7个不同抗体诱导HuR968B CAR-T细胞释放效应细胞因子IL-2、IFN-γ、TNF-α的结果。在加入不同浓度P329G突变抗体情况下,HuR968B CAR-T细胞被激活,分泌IL-2、IFN-γ、TNF-α等效应细胞因子,细胞因子释放水平呈现抗体剂量依赖性;以Zmab抗体作为对照,在高表达CLDN18.2的DAN-G18.2细胞刺激下,A6(A6 PG)、H9(H9 PG)高亲合力抗体诱导轻微更高水平的IFN-γ、TNF-α分泌,其他4个低亲合力抗体诱导的效应细胞因子分泌未见显著差别;但在低表达CLDN18.2的SNU601细胞刺激下,A6(A6 PG)、H9(H9 PG)高亲合力抗体诱导的效应细胞因子水平显著高于Zmab(Zmab PG)及其他低亲合力抗体,H9-2.1(H9-2.1 PG)、H9-2.1(H9-2.1 PG)抗体诱导的细胞因子分泌水平也稍高于Zmab(Zmab PG)抗体,尤其在高浓度情况下更显著,这一结果与上述抗体亲合力结果相一致。
(13-2)终点杀伤实验
复苏实施例2制备的CAR-T细胞并在37℃培养稳定过夜。将肿瘤靶细胞和CAR-T细胞按照E:T为1:1进行混合,并添加5倍梯度稀释的不同浓度抗体溶液至总体积为200μL,放于37℃培养约24h后离心,转移细胞上清液至96孔白底酶标板中。使用CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay(Promega,G1780)以及酶标仪(Molecular Devices,SpectraMax i3x)测量上清液中的LDH值,计算杀伤效率。
图15D显示了实施例12的7个不同抗体诱导HuR968B CAR-T细胞对DAN-G18.2肿瘤细胞的杀伤效应。在以高表达CLDN18.2的DAN-G18.2细胞作为靶细胞情况下,高或低亲合力抗体诱导HuR968B CAR-T细胞的杀伤效应并未有显著差异,与实施例13-1的效应细胞因子结果相一致。
(13-3)动态杀伤实验比较高或低亲合力抗体诱导CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤效应
采用xCELLigence RTCA MP仪器动态实时检测CAR-T细胞对靶细胞的杀伤情况。在E-Plates板中添加50μL培养基,仪器读取基准值后,添加50μL肿瘤靶细胞,放置仪器内动态检测。同时复苏CAR-T细胞,置于37℃培养箱过夜。约24h小时后,按照E:T比例1:1添加CAR-T细胞,并于对应孔内添加梯度稀释的不同浓度抗体溶液,放置于xCELLigence RTCA MP仪器系统动态监测P329G CAR-T细胞对靶细胞杀伤情况,持续72-96小时。
图15E和图15F分别显示了采用动态杀伤实验比较高或低亲合力抗体诱导HuR968B CAR-T细胞对CLDN18.2高或低表达肿瘤细胞的杀伤效应。图15E结果显示,高(A6、H9)或低亲合力(Zmab、G3、H9-SA)抗体诱导了同等程度的HuR968B CAR-T细胞对CLDN18.2高表达DAN-G18.2肿瘤细胞杀伤,在低至12.8-64pM浓度情况下就能够在短时间内(8h)诱导HuR968B CAR-T细胞对肿瘤细胞的完全杀伤效应。图15F结果显示,高(A6、H9)亲合力抗体在12.8-64pM浓度情况下仍然能够诱导对CLDN18.2低表达SNU601肿瘤细胞的完全杀伤,但低亲合力(Zmab、G3、H9-SA)抗体需要在64pM浓度以上才能够诱导完全杀伤效应;此外,相比较对CLDN18.2高表达DAN-G18.2肿瘤细胞的杀伤,对CLDN18.2低表达SNU601肿瘤细胞的完全杀伤需要更长的时间(36h以上)。
实施例14、HuR968B CAR-T细胞联合低亲合力抗体体内抗肿瘤效应研究
实施了小鼠肿瘤接种及处理。用1x PBS重悬DAN-G18.2细胞,制备成细胞浓度为5×10
6个/mL细胞悬液。NOG小鼠右侧背部剃毛,皮下注射5×10
6个/mL的DAN-G18.2细胞悬液,0.2mL/只,即接种量为1×10
6个/只小鼠。肿瘤细胞接种后7天,将小鼠肿瘤体积在76.25~125.62mm
3的小鼠分成6组,分为载剂组、仅8B CAR-T组、8B CAR-T+Zmab-PG组、8B CAR-T+H9-PG组、8B CAR-T+H9.1.2-PG组、8B CAR-T+H9.SA-PG和8B CAR-T+G3-PG组,每组7只小鼠。分组完成后抗体给药,给药剂量为1mg/kg,3周后第2次抗体给药。抗体给药后第1天,即在肿瘤细胞接种后的第8天,用1x PBS重悬8B CAR-T细胞,制备成8B CAR+细胞为2.5×10
7个/mL细胞悬液。尾静脉注射细胞悬液0.2mL/只小鼠,即回输CAR+细胞5×10
6个/只小鼠。每周监测小鼠体重、肿瘤组织最大长轴(L)和最大宽轴(W)两次。
图16A显示了在接种人DAN-G18.2肿瘤细胞的免疫缺陷荷瘤小鼠中HuR968B CAR-T细胞联合不同CLDN18.2抗体的治疗效应。结果显示,HuR968B CAR-T细胞输注联合2个剂量不同P329G抗体(间隔3周)处理后,肿瘤生长显著受到抑制,治疗后约2周(图16A中的D24)左右达到最大抗肿瘤效应,联合Zmab PG抗体、H9 PG抗体、H9-1.2 PG抗体、H9-SA PG抗体、G3 PG抗体处理组小鼠TGI分别为93.8%、97.0%、94.6%、85.0%、89.5%;其中,联合H9-1.2 PG抗体处理组小鼠维持了持续的抗肿瘤效应,在处理后30天(图16A中的D38)TGI仍然在94.0%;而联合Zmab PG、H9-SA PG、G3 PG抗体处理组小鼠肿瘤生长的TGI分别为84.4%、64.3%、75.1%。高亲合力抗体H9 PG虽然诱导了很好的抗肿瘤效应,但由于同时产生了毒性,这组小鼠需要提前处死。
图16B显示该实验中小鼠的体重变化。结果显示,经HuR968B CAR-T细胞联合Zmab PG、H9-1.2 PG、H9-SA PG、G3 PG抗体治疗的小鼠,其体重相比较对照小鼠未见显著变化。但接受联用H9 PG抗体处理小鼠在接受第1剂抗体后1周内快速下降,平均体重下降8.9%,然后体重于1周左右恢复至正常水平,但是在给予第2剂抗体后,小鼠体重再次快速下降,需要处死。结果表明,在联用较高(1mg/kg)抗体剂量情况下,联用高亲合力的H9 PG抗体诱导显著抗肿瘤效应同时也产生了不可耐受毒性,而联用低亲合力的Zmab PG、H9-1.2 PG、H9-SA PG、G3 PG抗体诱导了相似的抗肿瘤效应,但未诱导显著毒性效应。
实施例15、PG CAR脱靶结合位点筛选及功能检测
(15-1)膜蛋白组阵列(Membrane Proteome Array,MPA)研究方案
该研究于Intergral Molecular公司完成。MPA是一种用于分析抗体靶标特异性的高通量方法(图17A),该方法使用流式细胞术直接检测受试抗体与未固定细胞中表达的膜蛋白的结合。将目的抗体针对约6000种天然的人膜蛋白文库进行反应性测试,包括94%的所有单次跨膜、多次跨膜和GPI锚定蛋白所有筛查的目标蛋白都具有天然构象和适当的翻译后修饰。高通量发现结合靶点后,后续实验进一步确认目的抗体与膜蛋白的结合反应性。为优化测试抗体检测条件,HEK-293T细胞(ATCC,CRL-3216;18,000个细胞/孔)和QT6细胞(ATCC,CRL-1708;18,000个细胞/孔)采用DMEM(Corning,10-017-CM)完全培养基(添加10%FBS(Tissue Culture Biologicals,101),2mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(Corning,25-015-CI),青霉素/链霉素(Corning,30-002-CI),MEM NEAA(Corning,25-025-CI)和HEPES 10mM(Corning,25-060-CI))在384孔细胞培养板(Corning,3764)中铺板,用编码蛋白A(结合抗体Fc段;阳性对照)或空载体(pUC;阴性对照)质粒转染,在37℃、5%CO
2孵育36小时,测试抗体(PG-Fc,图17B;SEQ ID NO:52)以20μg/ml开始进行四次四倍稀释(含10%正常羊血清[Sigma,G6767]的PBS作为稀释剂),一式四份添加到转染细胞中,然后加入固定浓度二抗(AlexaFluor 647-AffiniPure Goat Fab Anti-Human IgG,Jackson ImmunoResearch,109-606-008),采用高通量免疫荧光流式细胞术检测。使用ForeCyt软件(Intellicyt)确定每个抗体稀释度的平均荧光强度(MFI)值,并使用Excel(Microsoft)绘图。每个抗体浓度所检测的MFI值转换为由靶标结合(阳性信号)和阴性对照(背景信号)构成的信号比值,据此确定测试抗体最佳筛选浓度。在此基础上,将含有约6000个膜蛋白cDNA克隆的质粒转染到HEK-293T细胞,每孔含有一个独特cDNA的质粒,同时用编码GFP质粒或膜结合蛋白A构建体作为转染效率和阳性结合对照。孵育36小时后,使用CellStripper(Corning,25-056-CI)将细胞剥离,使用JANUS自动化工作站(Perkin-Elmer,AJL8M01)在新384孔板中重新细胞铺板,将测试抗体以上述优化浓度添加到膜蛋白质组阵列中,然后加入固定浓度二抗(AlexaFluor 647-AffiniPure Goat Fab Anti-Human IgG,Jackson ImmunoResearch,109-606-008),采用高通量免疫荧光流式细胞术检测,使用ForeCyt软件(Intellicyt)分析流式数据。对第一轮筛查后发现的结合靶点,再次采用上述方法通过第二轮筛查进行验证。
图17C显示了待测试PG-Fc融合蛋白与膜蛋白结合的第一轮高通量筛选结果,表明PG–Fc融合蛋白除了与作为阳性对照的FCGR1A蛋白结合之外,还能够与根据国际人类基因命名委员会(HUGO Gene Nomenclature Committee,HGNC)命名的GALNT1蛋白和GPR149蛋白结合。
图17D显示了待测试PG-Fc融合蛋白与膜蛋白结合的第二轮实验验证结果,表明PG-Fc融合蛋白与GALNT1蛋白和GPR149蛋白结合。
由此表明相对于PG-Fc融合蛋白与靶标P329G抗体的结合而言,与PG-Fc融合蛋白结合的GALNT1蛋白和GPR149蛋白是PG-Fc融合蛋白结合的脱靶蛋白。
(15-2)脱靶基因过表达细胞系构建
从Uniprot数据库下载GPR149(G蛋白偶联受体149(G protein-coupled receptor 149))和GALNT1(多肽N-乙酰半乳糖胺转移酶1(polypeptide N-acetylgalactosaminyltransferase 1))基因编码序列,其中GPR149的Uniprot登录号是Q86SP6,GALNT1的Uniprot登录号是Q10472,交由金维智全基因合成并克隆入pRK慢病毒载体中,构建同时表达脱靶蛋白和EGFR荧光蛋白的慢病毒载体质粒,构建表达CH2-PG慢病毒载体作为阳性对照(CH2-PG的氨基酸序列如SEQ ID NO:53所示,文中的CH2-PG相当于是将CAR识别的PG抗体段表达在细胞表面);与实施例2-1类似地制备慢病毒,以MOI=5感染CHO GS(ATCC,CRL-3216)悬浮和293T(ATCC,CRL-3216)贴壁细胞,3天后利用EGFR荧光流式分选获得高纯度EGFR表达阳性细胞,扩增后用于后续实验。
(15-3)脱靶基因表达检测
采用流式及免疫组化(IHC)检测上述过表达细胞系脱靶基因表达。对于流式检测,制备上述过表达细胞的单细胞悬液,加入梯度稀释的PG-Fc融合蛋白(0.004-400nM),4℃孵育30min,FACS缓冲液洗涤2遍,加入APC-山羊抗人IgG,Fcγfragment specific(Jackson ImmunoResearch,109-136-098)二抗,4℃孵育30分钟,FACS缓冲液洗涤2遍,重选后用流式细胞仪检测。对于IHC检测,收集过表达细胞,10%中性福尔马林固定8小时,离心制成细胞团,置于全自动脱水机进行脱水、浸蜡;脱水浸蜡完毕,将细胞团置于石蜡包埋机进行石蜡包埋;石蜡细胞块在切片机上进行切片,厚度3um;将细胞团块石蜡切片置于Ventana全自动免疫组化染色仪(Ventana Discovery ULTRA)进行染色,采用下述抗体:抗GALNT1多抗:(HPA012628,Sigma)、抗GPR149多抗:(HPA018020,Sigma),染色完毕的3种细胞团块切片用中性树胶进行封片,显微镜观察染色切片、数字病理扫描仪进行扫描拍照。
图17E显示了采用IHC在过表达脱靶基因的CHO-GS细胞中检测到GALNT1和GPR149蛋白表达,GALNT1以胞浆表达为主,GPR149以胞膜表达为主。
图17F显示了采用IHC在过表达脱靶基因的293T细胞中检测到GALNT1和GPR149蛋白表达,GALNT1也以胞浆表达为主,GPR149也以胞膜表达为主。
(15-4)脱靶基因对P329G CAR-T细胞激活效应:
复苏P329G CAR-T细胞并在37℃培养稳定过夜。将脱靶基因过表达细胞和CAR-T细胞分别按照E:T为3:1、10:1和20:1进行混合,并添加适量完全培养基至总体积均为200μL,放于37℃培养约24小时后离心,收集细胞,用FACS缓冲液洗涤2次,重悬后加入含LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain、Fragment山羊抗人IgG(Jackson ImmunoResearch,109-066-006)的FACS缓冲液,4℃染色30分钟,洗涤两次,加入CD4、CD8、CD25、CD69和APC-链亲和素抗体组合,上述细胞抗体混合液于4℃染色30分钟,洗涤两次,FACS缓冲 液重悬,用流式细胞仪检测。
图17G显示了流式细胞术检测的脱靶基因表达,CH2-PG表达细胞作为阳性对照。
图17H显示了HuR968B CAR-T细胞对不同靶细胞的激活效应。不论是野生型293T,还是表达脱靶基因GALNT1或GPR149的293T细胞,均不能介导P329G CAR-T的激活效应,只有表达含P329G突变的CH2-PG-293T细胞能特异性介导CAR
+-T的激活,上调CD25、CD69的表达水平,且对CD4-CAR
+和CD8-CAR
+细胞无差异激活,并具有对E:T比率的梯度依赖性。
(15-5)细胞因子检测:上述实验中离心收集细胞上清,使用BD
TM Cytometric Bead Array(CBA)Human Th1/Th2 Cytokine Kit II对细胞因子进行检测。将试剂盒内Capture Beads等体积混匀后,以25μL/孔进行布板。添加等体积的上清液或上清稀释液或标准品。混匀后添加25μL等体积的Human Th1/Th2 PE Detection Reagent,室温避光孵育3小时。使用Wash缓冲液洗涤两次后重悬,用流式细胞仪检测,通过PE通道MFI值计算细胞因子浓度。
图17I显示了P329G CAR-T细胞与不同靶细胞共培养后效应细胞因子释放结果。不论是野生型293T,还是表达脱靶蛋白GALNT1和GPR149的293T细胞,均不能激活P329G CAR-T CAR-T细胞分泌IL-2、IFN-γ、TNF等效应细胞因子,只有在加入表达含P329G突变的CH2-PG-293T细胞情况下,P329G CAR-T细胞被激活,分泌效应细胞因子,并具有对E:T比率的梯度依赖性。
(15-6)杀伤效率检测:采用xCELLigence RTCA MP仪器动态实时检测上述CAR-T细胞对表达脱靶基因的靶细胞的杀伤情况。在E-Plates板中添加50μL培养基,仪器读取基准值后,添加50μL脱靶基因过表达细胞(10000个细胞),放置仪器内动态检测。同时复苏UNT以及CAR-T细胞,置于37℃培养箱过夜。约24小时后,使用UNT细胞将所有CAR-T细胞的阳性率调整一致,分别按E:T比例为6.7:1、13:1和20:1加入同一供者PBMC制备的不同CAR-T细胞,并于对应孔内添加适量完全培养基至总体积均为200μL。xCELLigence RTCA MP仪器系统动态监测P329G CAR-T细胞对靶细胞杀伤情况,持续110小时。
图17J显示了P329G CAR-T细胞在E:T比例分别为6.7:1、13:1和20:1情况下对不同靶细胞的持续杀伤结果。在3种E:T比率条件下,只有表达含P329G突变的CH2-PG-293T细胞能激活P329G CAR-T,进而产生持续杀伤靶细胞效应。表达脱靶蛋白GALNT1和GPR149的293T细胞与野生型293T阴性对照组结果一致,均不能诱导P329G CAR-T细胞对靶细胞的杀伤,且具有对E:T比率的梯度依赖性,该结果与上述CAR-T细胞激活及效应细胞因子具有对E:T比率的梯度依赖性的结果相一致。
以上描述了本发明的示例性实施方案,本领域技术人员应当理解的是,这些公开内容仅是示例性的,在本发明的范围内可以进行各种其它替换、适应和修改。因此,本发明不限于文中列举的具体实施方案。
序列表
Claims (19)
- 分子开关调控型嵌合抗原受体(CAR)多肽,其包含(1)人源化抗P329G突变scFv序列,其中所述scFv序列包含能够特异性结合包含P329G突变的抗体Fc结构域,但不能特异性结合未突变的亲本抗体Fc结构域的如下序列:(i)重链可变区,其包含根据Kabat编号的(a)氨基酸序列RYWMN(SEQ ID NO:54)所示的重链互补决定区CDR H1、或所述CDR H1的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体;(b)氨基酸序列EITPDSSTINYAPSLKG(SEQ ID NO:55)所示的CDR H2、或所述CDR H2的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体;和(c)氨基酸序列PYDYGAWFAS(SEQ ID NO:56)所示的CDR H3、或所述CDR H3的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体;和(ii)轻链可变区,其包含根据Kabat编号的(d)氨基酸序列RSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO:57)所示的轻链互补决定区(CDR L)1、或所述CDR L1的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体;(e)氨基酸序列GTNKRAP(SEQ ID NO:58)所示的CDR L2、或所述CDR L2的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体;和(f)氨基酸序列ALWYSNHWV(SEQ ID NO:59)所示的CDR L3、或所述CDR L3的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体;其中所述氨基酸变化是氨基酸的添加、缺失或取代(2)铰链区/间隔区,其选自(i)(G 4S) n、(SG 4) n或G 4(SG 4) n肽接头,其中“n”是1至10的整数,例如2至4的整数,例如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5所示的序列;(ii)IgG4间隔区(SEQ ID NO 6;ESKYGPPCPPCP),或其具有至少80%的序列同一性的间隔区;(iii)CD28铰链区(SEQ ID NO 7;IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP),或其具有至少80%的序列同一性的间隔区;(3)跨膜区(TM),其选自(i)CD28跨膜结构域或其具有1-5个氨基酸修饰的变体,例如,SEQ ID NO:8所示的序列或其具有1-2个氨基酸修饰的变体;(ii)CD8跨膜结构域或其具有1-5个氨基酸修饰的变体,例如,SEQ ID NO:9所示的序列或其具有1-2个氨基酸修饰的变体;(4)共刺激信号结构域(CSD)其选自:(i)4-1BB共刺激结构域或其具有1-5个氨基酸修饰的变体,例如,SEQ ID NO:11所示的序列或其具有1-2个氨基酸修饰的变体;(ii)CD28共刺激结构域或其具有1-5个氨基酸修饰的变体,例如,SEQ ID NO:10所示的序列或其具有1-2个氨基酸修饰的变体,例如,SEQ ID NO:12所示的序列;(5)刺激信号结构域(SSD),为CD3ζ信号传导结构域或其具有1-10个氨基酸修饰的变体,例如,SEQ ID NO:13所示的序列或其具有1-10个、1-5个氨基酸修饰的变体;优选地,所述CAR多肽包含(1)人源化抗P329G突变scFv序列,其中所述scFv序列包含能够特异性结合包含P329G突变的抗体Fc结构域,但不能特异性结合未突变的亲本抗体Fc结构域的如下序列:(i)重链可变区,其包含根据Kabat编号的(a)氨基酸序列RYWMN(SEQ ID NO:54)所示的CDR H1;(b)氨基酸序列EITPDSSTINYAPSLKG(SEQ ID NO:55)所示的CDR H2;和(c)氨基酸序列PYDYGAWFAS(SEQ ID NO:56)所示的CDR H3;和(ii)轻链可变区,其包含根据Kabat编号的(d)氨基酸序列RSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO:57)所示的CDR L1;(e)氨基酸序列GTNKRAP(SEQ ID NO:58)所示的CDR L2;和(f)氨基酸序列ALWYSNHWV(SEQ ID NO:59)所示的CDR L3;例如,(i)重链可变区,其包含SEQ ID NO:2的序列或与其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列,和(ii)轻链可变区,其包含SEQ ID NO:3的序列或与其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列;例如,(i)重链可变区,其包含SEQ ID NO:2的序列,和(ii)轻链可变区,其包含SEQ ID NO:3的序列;(2)铰链区/间隔区,其选自(i)(G 4S) n、(SG 4) n、(G 4S) n或G 4(SG 4) n肽接头,其中“n”是1至10的整数,例如2至4的整数,例如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5所示的序列;(ii)IgG4间隔区(SEQ ID NO 6;ESKYGPPCPPCP),或其具有至少90%的序列同一性的间隔区;(iii)CD28铰链区(SEQ ID NO 7;IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP),或其具有至少90%、至少95%的序列同一性的间隔区;(3)跨膜区(TM),其选自(i)SEQ ID NO:8所示的CD28跨膜结构域或其具有1个氨基酸修饰的变体;(ii)SEQ ID NO:9所示的CD8跨膜结构域或其具有1个氨基酸修饰的变体;(4)共刺激信号结构域(CSD)其选自:(i)SEQ ID NO:11所示的4-1BB共刺激结构域或其具有1个氨基酸修饰的变体;(ii)SEQ ID NO:10所示的CD28共刺激结构域或其具有1个氨基酸修饰的变体,例如, SEQ ID NO:12所示的序列;(5)刺激信号结构域(SSD),为SEQ ID NO:13所示的CD3ζ信号传导结构域或其具有1个氨基酸修饰的变体;其中所述氨基酸修饰是氨基酸的添加、缺失或取代。
- 根据权利要求1所述的分子开关调控型CAR多肽,其还包含位于N端的信号肽序列,例如,SEQ ID NO:1所示的信号肽序列,优选地,所述分子开关调控型CAR多肽具有SEQ ID NO:21、23或25所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求1或2所述的分子开关调控型CAR多肽,其还包含位于跨膜区(TM)和共刺激信号结构域(CSD)之间的近膜胞内结构域,例如,CD3ε链的近膜胞内信号结构域,例如,CD3ε链的如SEQ ID NO:14所示的近膜胞内信号结构域。
- 编码权利要求1-3中任一项所述的分子开关调控型CAR多肽的核酸分子,优选地,其包含SEQ ID NO:22、24或26所示的核苷酸序列。
- 载体,其包含权利要求4所述的核酸分子,例如,所述载体选自DNA载体、RNA载体、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体或逆转录病毒载体。
- 细胞,其包含权利要求1-3中任一项所述的CAR多肽、权利要求4所述的核酸、或权利要求5所述的载体,所述细胞是例如免疫效应细胞,例如,所述免疫效应细胞是T细胞,例如,所述T细胞是自体T细胞或同种异体T细胞,例如,所述免疫效应细胞是自人PBMC分离T细胞后制备的。
- 制备权利要求6的细胞的方法,包括用权利要求5所述的载体导入所述细胞,例如,自人PBMC分离T细胞,用权利要求5所述的载体转导所述分离的T细胞。
- 药物组合,其包含(i)选自表达权利要求1-3中任一项所述的分子开关调控型CAR多肽的免疫效应细胞(例如,T细胞)、编码权利要求1-3中任一项所述的分子开关调控型CAR多肽的核酸分子、权利要求5的载体、和它们的任意组合;和(ii)包含P329G突变的特异性结合CLDN18.2分子的抗体或抗原结合片段(也称为P329G突变抗体),例如,所述P329G突变抗体包含突变Fc结构域,其中根据EU编号的P329位置处的氨基酸突变为甘氨酸(G),与未突变的亲本抗体Fc结构域的Fcγ受体结合相比,突变Fc结构域的Fcγ受体结合降低;以及任选地可药用辅料。
- 根据权利要求8所述的药物组合,其中所述特异性结合CLDN18.2分子的抗体或抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区,其中:(a)所述重链可变区包含根据Kabat编号的氨基酸序列SYVMS(SEQ ID NO:60)所示的CDR H1、或所述CDR H1的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体;氨基酸序列TISHSGGSTYYADSVKG(SEQ ID NO:61)所示的CDR H2、或所述CDR H2的不超过2 个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体;和氨基酸序列DAPYYDILTGYRY(SEQ ID NO:62)所示的CDR H3、或所述CDR H3的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体;所述轻链可变区包含根据Kabat编号的氨基酸序列RASQSISSWLA(SEQ ID NO:63)所示的CDR L1、或所述CDR L1的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体;氨基酸序列KASSLES(SEQ ID NO:64)所示的CDR L2、或所述CDR L2的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体;和氨基酸序列QQYNSYSYT(SEQ ID NO:65)所示的CDR L3、或所述CDR L3的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体;(b)所述重链可变区包含根据Kabat编号的氨基酸序列SYNIH(SEQ ID NO:66)所示的CDR H1、或所述CDR H1的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体;氨基酸序列YIAPFQGDSRYNQKFKG(SEQ ID NO:67)所示的CDR H2、或所述CDR H2的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体;和氨基酸序列LNRGNSLDY(SEQ ID NO:68)所示的CDR H3、或所述CDR H3的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体;所述轻链可变区包含根据Kabat编号的氨基酸序列KSSQSLFNSGNQRNYLT(SEQ ID NO:69)所示的CDR L1、或所述CDR L1的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体;氨基酸序列WASTRES(SEQ ID NO:70)所示的CDR L2、或所述CDR L2的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体;和氨基酸序列QNNYIYPLT(SEQ ID NO:71)所示的CDR L3、或所述CDR L3的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体;(c)所述重链可变区包含根据Kabat编号的氨基酸序列SYNIH(SEQ ID NO:72)所示的CDR H1、或所述CDR H1的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体;氨基酸序列YIAPFQGDARYNQKFKG(SEQ ID NO:73)所示的CDR H2、或所述CDR H2的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体;和氨基酸序列LNRGQSLDY(SEQ ID NO:74)所示的CDR H3、或所述CDR H3的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体;所述轻链可变区包含根据Kabat编号的氨基酸序列KSSQSLFNAGNQRNYLT(SEQ ID NO:75)所示的CDR L1、或所述CDR L1的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体;氨基酸序列WASTRES(SEQ ID NO:76)所示的CDR L2、或所述CDR L2的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体;和氨基酸序列QNNYIYPLT(SEQ ID NO:77)所示的CDR L3、或所述CDR L3的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体;(d)所述重链可变区包含根据Kabat编号的氨基酸序列SYNIH(SEQ ID NO:78)所示的CDR H1、或所述CDR H1的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体;氨基酸序列YIAPFQGDARYNQKFKG(SEQ ID NO:79)所示的CDR H2、或所述CDR H2的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体;和氨基酸序列LNRGNALDY(SEQ ID NO:80)所示的CDR H3、或所述CDR H3的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体;所述轻链可变区包含根据Kabat编号的氨基酸序列KSSQSLFQSGNQRNYLT(SEQ ID NO:81)所示的CDR L1、或所述CDR L1的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体;氨基酸序列WASTRES(SEQ ID NO:82)所示的CDR L2、或所述CDR L2的不超过2个氨基酸 变化或不超过1个氨基酸变化的变体;和氨基酸序列QNNYIYPLT(SEQ ID NO:83)所示的CDR L3、或所述CDR L3的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体;(e)所述重链可变区包含根据Kabat编号的氨基酸序列SYNIS(SEQ ID NO:84)所示的CDR H1、或所述CDR H1的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体;氨基酸序列YIAPFQGDARYNQKFKG(SEQ ID NO:85)所示的CDR H2、或所述CDR H2的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体;和氨基酸序列LNRGNSLDY(SEQ ID NO:86)所示的CDR H3、或所述CDR H3的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体;所述轻链可变区包含根据Kabat编号的氨基酸序列KSSQSLFNSGNQRNYLT(SEQ ID NO:87)所示的CDR L1、或所述CDR L1的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体;氨基酸序列WASTRES(SEQ ID NO:88)所示的CDR L2、或所述CDR L2的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体;和氨基酸序列QNNYIYPLT(SEQ ID NO:89)所示的CDR L3、或所述CDR L3的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体;或(f)所述重链可变区包含根据Kabat编号的氨基酸序列TYWMH(SEQ ID NO:90)所示的CDR H1、或所述CDR H1的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体;氨基酸序列LIDPSDSETRLNQKFKD(SEQ ID NO:91)所示的CDR H2、或所述CDR H2的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体;和氨基酸序列NRWLLG(SEQ ID NO:92)所示的CDR H3、或所述CDR H3的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体;所述轻链可变区包含根据Kabat编号的氨基酸序列KSSQSLLNSGNQKNYLT(SEQ ID NO:93)所示的CDR L1、或所述CDR L1的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体;氨基酸序列WASTRES(SEQ ID NO:94)所示的CDR L2、或所述CDR L2的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体;和氨基酸序列QNDYSYPLT(SEQ ID NO:95)所示的CDR L3、或所述CDR L3的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体;其中所述氨基酸变化是氨基酸的添加、缺失或取代;例如,其中(a)所述重链可变区包含根据Kabat编号的氨基酸序列SYVMS(SEQ ID NO:60)所示的CDR H1;氨基酸序列TISHSGGSTYYADSVKG(SEQ ID NO:61)所示的CDR H2;和氨基酸序列DAPYYDILTGYRY(SEQ ID NO:62)所示的CDR H3;所述轻链可变区包含根据Kabat编号的氨基酸序列RASQSISSWLA(SEQ ID NO:63)所示的CDR L1;氨基酸序列KASSLES(SEQ ID NO:64)所示的CDR L2;和氨基酸序列QQYNSYSYT(SEQ ID NO:65)所示的CDR L3;(b)所述重链可变区包含根据Kabat编号的氨基酸序列SYNIH(SEQ ID NO:66)所示的CDR H1;氨基酸序列YIAPFQGDSRYNQKFKG(SEQ ID NO:67)所示的CDR H2;和氨基酸序列LNRGNSLDY(SEQ ID NO:68)所示的CDR H3;所述轻链可变区包含根据Kabat编号的氨基酸序列KSSQSLFNSGNQRNYLT(SEQ ID NO:69)所示的CDR L1;氨基酸序列WASTRES(SEQ ID NO:70)所示的CDR L2;和氨基酸序列QNNYIYPLT(SEQ ID NO:71)所示的CDR L3;(c)所述重链可变区包含根据Kabat编号的氨基酸序列SYNIH(SEQ ID NO:72)所示的CDR H1;氨基酸序列YIAPFQGDARYNQKFKG(SEQ ID NO:73)所示的CDR H2;和氨基酸序列LNRGQSLDY(SEQ ID NO:74)所示的CDR H3;所述轻链可变区包含根据Kabat编号的氨基酸序列KSSQSLFNAGNQRNYLT(SEQ ID NO:75)所示的CDR L1;氨基酸序列WASTRES(SEQ ID NO:76)所示的CDR L2;和氨基酸序列QNNYIYPLT(SEQ ID NO:77)所示的CDR L3;(d)所述重链可变区包含根据Kabat编号的氨基酸序列SYNIH(SEQ ID NO:78)所示的CDR H1;氨基酸序列YIAPFQGDARYNQKFKG(SEQ ID NO:79)所示的CDR H2;和氨基酸序列LNRGNALDY(SEQ ID NO:80)所示的CDR H3;所述轻链可变区包含根据Kabat编号的氨基酸序列KSSQSLFQSGNQRNYLT(SEQ ID NO:81)所示的CDR L1;氨基酸序列WASTRES(SEQ ID NO:82)所示的CDR L2;和氨基酸序列QNNYIYPLT(SEQ ID NO:83)所示的CDR L3;(e)所述重链可变区包含根据Kabat编号的氨基酸序列SYNIS(SEQ ID NO:84)所示的CDR H1;氨基酸序列YIAPFQGDARYNQKFKG(SEQ ID NO:85)所示的CDR H2;和氨基酸序列LNRGNSLDY(SEQ ID NO:86)所示的CDR H3;所述轻链可变区包含根据Kabat编号的氨基酸序列KSSQSLFNSGNQRNYLT(SEQ ID NO:87)所示的CDR L1;氨基酸序列WASTRES(SEQ ID NO:88)所示的CDR L2;和氨基酸序列QNNYIYPLT(SEQ ID NO:89)所示的CDR L3;或(f)所述重链可变区包含根据Kabat编号的氨基酸序列TYWMH(SEQ ID NO:90)所示的CDR H1;氨基酸序列LIDPSDSETRLNQKFKD(SEQ ID NO:91)所示的CDR H2;和氨基酸序列NRWLLG(SEQ ID NO:92)所示的CDR H3;所述轻链可变区包含根据Kabat编号的氨基酸序列KSSQSLLNSGNQKNYLT(SEQ ID NO:93)所示的CDR L1;氨基酸序列WASTRES(SEQ ID NO:94)所示的CDR L2;和氨基酸序列QNDYSYPLT(SEQ ID NO:95)所示的CDR L3;例如,其中:(a)重链可变区包含SEQ ID NO:34的序列或与其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列,且轻链可变区包含SEQ ID NO:35的序列或与其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列;(b)重链可变区包含SEQ ID NO:36的序列或与其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列,且轻链可变区包含SEQ ID NO:37的序列或与其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列;(c)重链可变区包含SEQ ID NO:44的序列或与其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列,且轻链可变区包含SEQ ID NO:45的序列或与其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列;(d)重链可变区包含SEQ ID NO:46的序列或与其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列,且轻链可变区包含SEQ ID NO:47的序列或与 其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列;(e)重链可变区包含SEQ ID NO:48的序列或与其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列,且轻链可变区包含SEQ ID NO:49的序列或与其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列;或(f)重链可变区包含SEQ ID NO:42的序列或与其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列,且轻链可变区包含SEQ ID NO:43的序列或与其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列;例如,其中:(a)重链可变区包含SEQ ID NO:34的序列,且轻链可变区包含SEQ ID NO:35的序列;(b)重链可变区包含SEQ ID NO:36的序列,且轻链可变区包含SEQ ID NO:37的序列;(c)重链可变区包含SEQ ID NO:44的序列,且轻链可变区包含SEQ ID NO:45的序列;(d)重链可变区包含SEQ ID NO:46的序列,且轻链可变区包含SEQ ID NO:47的序列;(e)重链可变区包含SEQ ID NO:48的序列,且轻链可变区包含SEQ ID NO:49的序列;或(f)重链可变区包含SEQ ID NO:42的序列,且轻链可变区包含SEQ ID NO:43的序列;例如,所述抗体是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体;优选地,其是IgG1或IgG4抗体;更优选地,其是IgG1抗体;例如,所述抗原结合片段是Fab、Fab’、F(ab’) 2、Fv、单链Fv、单链Fab、双体抗体(diabody)。
- 根据权利要求8或9所述的药物组合,其中所述突变Fc结构域是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体的突变Fc结构域,优选地,所述突变Fc结构域是IgG1或IgG4抗体的突变Fc结构域;更优选地,所述突变Fc结构域是IgG1抗体的突变Fc结构域;例如,所述抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO:39所示的重链恒定区序列或与其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列且其中根据EU编号的P329位置处的氨基酸突变为G;例如,所述抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO:39所示的重链恒定区序列或与其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列且其中根据EU编号的P329位置处的氨基酸突变为G;和SEQ ID NO:40所示的轻链恒定区序列或与其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列。
- 根据权利要求8-10中任一项所述的药物组合,其中(i)所述免疫效应细胞是自体T细胞或同种异体T细胞制备的表达权利要求1-3中任一项所述的分子开关调控型CAR多肽的T细胞,例如,所述免疫效应细胞是自人PBMC分离的T细胞制备的表达权利要求1-3中任一项所述的分子开关调控型CAR多肽的T细胞;(ii)所述P329G突变抗体是HB37A6 PG Ab、Hz69H9 PG Ab、Hz69H9-1.2 PG Ab、Hz69H9-2.1 PG Ab、Hz69H9-SA PG Ab、和/或Hz3G3 PG Ab。
- 根据权利要求8-11中任一项所述的药物组合,其中(i)以1×10 6个细胞-1×10 12个免疫效应细胞、优选地为5×10 6个细胞-1×10 11个、更优选地为1×10 7个细胞-1×10 10个免疫效应细胞、例如5×10 7个细胞、2.5×10 8个细胞、7.5×10 8个细胞、1.25×10 9个免疫效应细胞的剂量以单次或多次静脉内施用;和(ii)为0.1-10mg/kg、优选地为0.3mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg、3mg/kg、5mg/kg、7mg/kg或9mg/kg的剂量单元的形式,优选为胃肠外、更优选静脉内施用剂型。
- 根据权利要求8-12中任一项所述的药物组合,其中(i)和(ii)分开、同时或依次施用,例如,第一天静脉内施用(i),第二天施用(ii),然后按照一定频率多次施用(ii),同时通过监测(i)的体内浓度和期望的治疗功效终点,确定是否多次施用(i);或者第一天施用(ii),第二天静脉内施用(i),然后按照一定频率多次施用(ii),同时通过监测(i)的体内浓度和期望的治疗功效终点,确定是否多次施用(i);例如,(i)和(ii)各施用一次,然后按照每3-4天一次、每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次的给药频率多次施用(ii),同时通过检测(i)的体内浓度和期望的治疗功效终点,确定是否多次施用(i)。
- 根据权利要求8-13中任一项所述的药物组合的用途,用于在受试者中治疗与CLDN18.2相关的疾病,包括向受试者施用治疗有效量的权利要求8-13中任一项所述的药物组合,优选地,所述与CLDN18.2相关的疾病是例如表达或过表达CLDN 18.2的癌症,所述癌症是例如CLDN18.2阳性实体瘤。
- 根据权利要求8-13中任一项所述的药物组合在制备用于治疗与CLDN18.2相关的疾病的药物中的用途,所述与CLDN18.2相关的疾病是例如表达或过表达CLDN 18.2的癌症,所述癌症是例如CLDN18.2阳性实体瘤。
- 用于治疗与CLDN18.2相关的疾病的方法,所述方法包括向受试者施用治疗有效量的权利要求8-13中任一项所述的药物组合,所述与CLDN18.2相关的疾病是例如表达或过表达CLDN 18.2的癌症,所述癌症是例如CLDN18.2阳性实体瘤。
- 成套药盒,其包含权利要求8-13中任一项所述的药物组合,优选地所述药盒为药物剂量单元形式。
- 一种药物复合物,其是一种由(i)包含表达权利要求1-3中任一项所述的分子开关调控型CAR多肽的免疫效应细胞(例如,T细胞);和(ii)包含P329G突变的特异性结合CLDN18.2分子的抗体或抗原结合片段(也称为P329G突变抗体),例如,所述P329G突变抗体包含突变Fc结构域,其中根据EU编号的P329位置处的氨基酸突变为甘氨酸(G),与未突变的亲本抗体Fc结构域的Fcγ受体结合相比,突变Fc结构域的Fcγ受体结合降低;免疫效应细胞通过CAR多肽的胞外结构域中的人源化抗P329G突变scFv序列与P329G突变抗体的Fc结构域结合而产生的复合物;例如,其中所述免疫效应细胞是自自体T细胞或同种异体T细胞制备的表达权利要求1-3中任一项所述的分子开关调控型CAR多肽的T细胞,例如,所述免疫效应细胞是自人PBMC分离的T细胞制备的表达权利要求1-3中任一项所述的分子开关调控型CAR多肽的T细胞;例如,其中所述P329G突变抗体是HB37A6 PG Ab、Hz69H9 PG Ab、Hz69H9-1.2 PG Ab、Hz69H9-2.1 PG Ab、Hz69H9-SA PG Ab、和/或Hz3G3 PG Ab。
- 根据权利要求18所述的药物复合物的用途,用于在受试者中治疗与CLDN18.2相关的疾病,优选地,所述与CLDN18.2相关的疾病是例如表达或过表达CLDN 18.2的癌症,所述癌症是例如CLDN18.2阳性实体瘤。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication |