JP5696316B2 - 細胞表面に発現したタンパク質に対する抗体作製法 - Google Patents

Description

本発明は、細胞表面に発現したタンパク質に対する抗体を抗体ライブラリーから単離する方法及びかかる方法によって作製された抗体に関する。

抗体は特定の抗原を認識することで、様々な生体内現象を惹起し、生体内防御の担い手として重要な役割を果たしている。特に抗体による抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ；ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）活性や、補体依存性細胞障害（ＣＤＣ；ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）活性は、ガン細胞等の除去に有効であることから、制ガン剤としての用途に用いられている。このような抗体の作用に着目し、実用化された抗体製剤も多く、良好な治療効果を示す製剤も少なくない。さらに、医薬製剤としの用途以外においても、例えば、種々の診断検査薬、あるいは、研究開発上の有効なツールとして広く使用されている。従って種々の生体内現象において重要な役割を果たすタンパク質を抗原として認識する抗体を作製することが必要となってくる。

生体内現象において重要な役割を果たすタンパク質として細胞膜を貫通するタンパク質（以下膜貫通タンパク質とする）が挙げられる。膜貫通タンパク質には、例えば、各種受容体タンパク質やイオンチャンネルタンパク質等を挙げることができる。その多くのものは、細胞内外での情報や物質の伝達・移動に関与することで細胞の生存・増殖・分化等に重要な役割を果たしているため、該膜貫通タンパク質を認識しうる抗体を作製することは、上記の医薬製剤、診断検査薬や研究開発ツールとして極めて大きな意味を持つ。

これまでに、任意の抗原に対する抗体作製法として様々な方法が開発されてきた（ハイブリドーマ作製法、ＤＮＡ免疫法、ファージディスプレイ法など）。特に近年、高い特異性を持つ抗体を多量かつ容易に生産する技術として、ＡＤＬｉｂシステム（又はＡＤＬｉｂ法）と称する方法が注目を浴びつつある（特許文献１，非特許文献１参照）。この方法によると、所望の特異性及び親和性を有する抗体を簡便な方法により提供することができる。

しかし、前記の各種抗体作製法による膜貫通タンパク質に対する抗体作製には以下のような問題点がある。
膜貫通タンパク質を発現した細胞を抗原として免疫動物に直接投与することで免疫反応を起こさせる方法においては、該膜貫通タンパク質は発現細胞膜上では生理的な立体構造で発現するが、該発現細胞は生体内でタンパク質分解を受けるため、生理的な条件下での膜貫通タンパク質に対して抗体を作製することは困難である。
ＤＮＡ免疫法は、膜貫通タンパク質のｃＤＮＡを適当なほ乳類動物細胞用発現ベクターに組み込み、そのベクターを直接免疫動物に投与する方法である（非特許文献２参照）。この方法によると、生体内において、該膜貫通タンパク質の細胞膜上での立体構造は再現される可能性があるものの、該タンパク質の作用メカニズムに不明な点が多く、生理的な条件下における膜貫通タンパクに対して抗体が作製されているかどうか明らかではない。
ファージディスプレイ法は大腸菌ウイルスの一種である繊維状ファージのコートタンパク質にファージの感染能を失わないように抗体の可変領域遺伝子を融合タンパク質として発現させるシステムである（非特許文献３，４参照）。該方法では、ファージ粒子を膜貫通タンパク質と反応させて所望の抗体を選択する際に、精製した膜貫通タンパク質を使用する必要があり、ターゲットとする膜貫通タンパク質が生理的機能を保持しているかどうか保証されない。
これらの問題点は、免疫細胞で体細胞相同組換えを促進することで多様な抗体分子を該免疫細胞表面に提示させるＡＤＬｉｂ法においても該当し、生理的な状態での精製が困難な膜貫通タンパクに対する抗体の選択は必ずしも容易ではない。
以上のように、膜貫通タンパク質に対する抗体作製は、いずれの作製法においても困難であった。

国際公開公報ＷＯ２００４／０１１６４４

Ｓｅｏら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ． ２３：７３１−７３５、２００５ Ｔａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ ３５６：１５２、１９９２ ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２−５５４、１９９０ Ｍａｒｋｓら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ ２２２：５８１−５９７、１９９１

本発明者らは、上記事情に鑑み鋭意研究を行った結果、膜貫通タンパク質及びマーカータンパク質を細胞表面上に発現する細胞を利用し、抗体集団から、膜貫通タンパク質に対する抗体を調製することに成功した。
よって本発明は、細胞表面上に発現するタンパク質、特に膜貫通タンパク質に対する抗体作製方法の提供を目的とする。

本発明者らは、膜貫通タンパク質に対する抗体を作製するにあたり、ＡＤＬｉｂ法による抗体作製法において従来用いていた精製抗原をコートした磁気ビーズの代わりに、膜貫通タンパク質及びマーカータンパク質を細胞表面上に発現する細胞を準備し、該細胞を抗原として用いることにより、ＡＤＬｉｂライブラリーからの抗体提示細胞のスクリーニングを行った。その後、該マーカータンパク質と特異的に結合する分子を用いて該細胞−抗体提示細胞の複合体を単離した。このような手法だけでは、生理的な状態の膜貫通タンパク質に対する特異的な抗体を的確に選択できるかは不明であったが、解析の結果、意外にも有効な特異性及び親和性をもつ抗体を獲得できることが確認された。この方法によれば、従来の方法によって作製が困難であった膜貫通タンパク質に対する抗体を得ることができ、該膜貫通タンパク質を生理的な状態で提示することで、該膜貫通タンパク質の機能に影響を及ぼす機能性抗体を取得する確度を高めることができる。また、細胞に任意の膜貫通タンパク質を発現することで、いかなる膜貫通タンパク質についても精製することなくスクリーニングすることが可能であるという利点もある。

すなわち、本発明は以下の（１）〜（６）に関する。
（１）本発明の第１の態様は、「標的抗原タンパク質を細胞表面上に発現した細胞に、抗体ライブラリーを接触させ、該細胞を単離することにより、該標的タンパク質と複合体を形成する抗体ライブラリーの構成物を分離する方法」である。
（２）本発明の第２の態様は、「抗体ライブラリーが細胞表面に抗体を提示した細胞集団である上記（１）記載の方法」である。
（３）本発明の第３の態様は、「標的抗原タンパク質を細胞表面上に発現した細胞を単離する方法が、該細胞に発現している標的抗原タンパク質以外の細胞表面上の抗原であるマーカー抗原とマーカー抗原に対する抗体との結合を利用する上記（１）記載の方法」である。
（４）本発明の第４の態様は、「マーカー抗原が、外来タンパク質である上記（３）に記載の方法」である。
（５）本発明の第５の態様は、「標的抗原タンパク質が外来タンパク質である上記（４）に記載の方法」である。
（６）本発明の第６の態様は、「細胞表面に抗体を提示した細胞集団がＤＴ４０である上記（２）乃至（５）いずれか記載の方法」である。

本発明では、細胞膜上に発現する任意のタンパク質、特に膜貫通タンパク質遺伝子を組み込んだ発現ベクターを用いて抗原となる該タンパク質を任意の細胞（抗原分子発現細胞）の表面に発現させ、本細胞と、ＡＤＬｉｂ法における抗体発現細胞に代表される各種抗体ライブラリーを混合し、該抗体ライブラリーを構成する抗体発現細胞やウイルス等の内、該抗原分子発現細胞と結合するもののみを濃縮・単離することで、抗体の取得を可能にしている。
従来の抗体作製法と比較した場合、抗原タンパク質を精製する必要がないため、精製が困難である複数回膜貫通タンパク質についても抗体作製が可能である。また、該膜貫通タンパク質を生理的な状態で提示することで、該膜貫通タンパク質を認識できるのみならず、該膜貫通タンパク質の機能にも影響を及ぼすいわゆる機能性抗体を取得する確度を高めることが出来る。

図１は、細胞表面に発現した膜タンパク質を用いたＡＤＬｉｂセレクションの流れを示す。 図２は、ヒトＥＧＦＲ及びＣＤ４共発現ＣＨＯ−Ｓ細胞を用いて選択したＡＤＬｉｂライブラリー構成細胞と陰性対照細胞におけるトリＩｇＭ及び抗ヒトＥＧＦＲ抗体の両方を発現する細胞の割合をＦＡＣＳ解析にて解析した結果を示す。 図３は、ＡＤＬｉｂライブラリーよりスクリーニングした抗ヒトＥＧＦＲ抗体産生細胞と非産生細胞におけるトリＩｇＭ及び抗ヒトＥＧＦＲ抗体の両方を発現する細胞の割合をＦＡＣＳ解析にて解析した結果を示す。 図４は、抗ヒトＥＧＦＲ抗体産生細胞より産生された抗体の抗原特異性を示すＥＬＩＳＡの結果を示す。 図５は、抗ＥＧＦＲ抗体産生細胞の培養上清を用いたＡ４３１細胞及びＣＨＯ−Ｓ細胞のＦＡＣＳ染色の結果を示す。 図６は、抗Ｃｌａｕｄｉｎ２抗体産生細胞の培養上清を用い、Ｃｌａｕｄｉｎ２発現ＣＨＯ及び未処理ＣＨＯ細胞への反応性を細胞ＥＬＩＳＡで調べた結果を示す。

１．抗体ライブラリー
本発明において使用する抗体ライブラリーは、一群の抗体を提示するものであればいかなるものでも使用することが出来、細胞表面上に抗体を提示する細胞であっても、コートタンパク質に抗体を提示するウイルスであってもよく、適したライブラリーを選択することは当業者であれば容易に行うことが出来る。好ましくは、抗体を産生するＢ細胞が使用され、特に好ましくは、ニワトリ由来Ｂ細胞の株化培養細胞であるＤＴ４０細胞である。特に好ましい抗体ライブラリーは、ＡＤＬｉｂ法によって作製されたものである（ＡＤＬｉｂ法の詳細については、例えば、特許文献１を参照のこと）。

本発明で用いる抗体ライブラリーの維持条件は当該技術分野において周知の方法によって行われるが、選択される抗体ライブラリーに適した条件下で行われることは言うまでもない。しかして、選択される抗体ライブラリーがＤＴ４０細胞集団からなる場合、例えば、該細胞集団を維持するための培地はＩＭＤＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用い、５％のＣＯ_２存在下３９．５℃で培養する。

さらに、上記のＤＴ４０細胞は、体細胞相同組換えを促進し、多様な抗体分子を細胞表面に提示する処理を加えられているものも含む。体細胞相同組換えを促進する方法は、当業者であれば容易に選択できるものを含むが、例えばトリコスタチンＡ等のヒストン脱アセチル化酵素阻害剤と接触等させることにより、該ＤＴ４０細胞の抗体遺伝子座におけるクロマチン構造を弛緩させることで、該抗体遺伝子座における体細胞相同組換えを促進する方法、例えば、ＡＤＬｉｂ法などが挙げられる。

２．抗原タンパク質及びマーカー抗原
本発明を実施するにあたり、目的の抗原タンパク質は、細胞内にて発現後、細胞表面に提示されるタンパク質であれば、細胞に元々存在するものであっても、外来性のものであっても、いかなるものでも使用することが出来、好ましくは、細胞膜を貫通するタンパク質、例えば、ＥＧＦＲ、ＩＧＦ−１Ｒなどの増殖因子受容体タンパク質群、ＣＤ８１など４回膜貫通性タンパク質群、ＣＸＣＲ４などのケモカイン受容体及びスフィンゴ脂質受容体などを含む７回膜貫通タンパク質群などが挙げられる。
該細胞を上記の抗体ライブラリーと結合させた後、抗原タンパク質と抗体（又は抗体を提示した細胞）との複合体を単離するのに用いられるマーカー抗原は、抗原タンパク質を発現した細胞を特異的に識別するための、いわばタグのような機能を果たす分子であればいずれも使用することができる。マーカー抗原として使用できる分子は、例えば、タンパク質又は糖鎖など、該細胞膜上に存在する分子などを挙げることができ、該細胞膜上に元々存在するものであってもよく、又は、該細胞には元々存在していないかった外来性の分子であってもよい。該細胞膜上に元々存在するマーカー抗原は、抗原タンパク質を発現している細胞を識別するために使用できるものであれば、必ずしも分子として同定されている必要はない。例えば、抗原タンパク質を発現させた細胞の細胞表面上に存在する生体分子群に対し抗体（群）等が得られていれば、これらの抗体を使用して抗原タンパク質を識別又は選択することができるため、これらの生体分子群の素性が明らかになっていなくてもよい。マーカー抗原として外来性の分子を使用する場合、例えば、細胞表面上に発現するタンパク質などを使用することができる。マーカー抗原として外来性のタンパク質を使用する場合、細胞内にて発現後、細胞表面に提示されるタンパク質であればいかなるものでも使用することができ、細胞膜表面上に発現される膜タンパク質などは勿論のこと、分泌タンパク質など本来膜に表示されない分子であっても、膜貫通領域を融合させることにより、マーカー抗原として使用することができる。マーカー抗原としては、例えば、ＣＤ４、ＭＨＣクラス２分子等を使用することができる。

上記の抗原タンパク質及びマーカータンパク質（マーカー抗原としてタンパク質を用いる場合）の遺伝子の調製は、当該技術分野における通常の技術常識に基づいて行うことが出来る。例えば、適当な細胞等からＲＴ−ＰＣＲ法等を用いて、目的の抗原タンパク質及びマーカータンパク質の遺伝子領域を増幅し、適当なベクター等にクローニングすることが出来る。また、マーカータンパク質が融合タンパク質である場合には、融合される各々のタンパク質をコードする遺伝子を同様の方法で増幅し、各々を各別には又は融合した状態にて、適当なベクター等にクローニングすることが出来る。この場合、ＲＴ−ＰＣＲ法に用いるプライマーは、目的とする抗原タンパク質及びマーカータンパク質（融合タンパク質の場合には、融合される各タンパク質）の遺伝子に関する公知のデータベース等から配列情報を取得し、この情報に基づいて容易に設計することが出来る。

３．抗原タンパク質及びマーカータンパク質を共発現する細胞
本発明を実施するにあたり、マーカーにタンパク質を使用する場合、上記の抗原タンパク質及びマーカータンパク質を共発現させる細胞は、これらのタンパク質が細胞内にて発現後、該細胞の表面に提示される細胞であればいかなるものでも使用することが出来、当業者であれば容易に選択することが出来る。特に、該抗原タンパク質及びマーカータンパク質がヒト由来である場合は、生理的な翻訳後修飾や細胞内局在が惹起されることが期待されるヒト由来の細胞が好ましく、また、取り扱いの簡便な株化培養細胞（例えばＣＨＯ−Ｓ細胞等）が好ましい。

作製した抗原タンパク質遺伝子及びマーカータンパク質遺伝子を、適当な発現ベクターに組み込むことにより、所望の抗原タンパク質及びマーカータンパク質を上記の細胞に発現させることが出来る。マーカータンパク質として融合タンパク質を使用する場合には、目的のアミノ酸配列を持つ所望の融合タンパク質が発現されるように、各遺伝子のフレームを調整して発現させる。発現ベクターとしては、該細胞内で目的タンパク質を発現可能にする、プロモーター、エンハンサー等の構成要素を有するものがよい。
作製した発現ベクターの上記細胞への導入は、ＤＥＡＥデキストラン法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、カチオン性脂質による方法等、公知の方法を使用して容易に行うことが出来る。

４．抗原タンパク質及びマーカータンパク質共発現細胞による抗体ライブラリー内の所望するライブラリー構成物のセレクション
本実験を実施するにあたり、上記の抗原タンパク質及びマーカータンパク質を共発現する細胞を抗体ライブラリーと適当な条件下（例えば、生理的なイオン強度、ｐＨ）にて懸濁、混合し、適当な時間（例えば、１時間から一晩）及び温度（例えば、４℃〜３７℃程度）にてインキュベートすることで、抗体ライブラリー中の該抗原タンパク質に特異性を有する特定の抗体に対応する抗体ライブラリー構成物（例えば、抗体発現細胞）との結合反応を行う。
結合反応を行った後、該共発現細胞及び抗体ライブラリー構成物の結合体を、マーカーを介した適当な方法で単離する。この際、回収する抗体ライブラリー構成物、例えば抗体発現細胞に対し非侵襲的な方法であることが好ましく、当業者であれば容易に選択できるすべてのものを含む。例えば、マーカーがタンパク質又は糖鎖などの生体分子である場合、これらの生体分子に対する特異的な抗体をコートした磁気ビーズ、例えば、ＭＡＣＳビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）、あるいは、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｖｅｒｉｔａｓ社）を用い、これを該結合体と適当な条件下にて混和した後、ＭＡＣＳ法、あるいは、Ｄｙｎａｂｅａｄｓスタンド法を用いた方法により単離することが出来る。また、Ｄｙｎａｂｅａｄｓを用いた場合は、キングフィッシャー磁気粒子プロセッサ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて単離することもできる。

以下に実施例を示すが、本発明はこれに限定されるものではない。

１．細胞培養
ＤＴ４０細胞の細胞培養は、基本的に以下の方法で行った。培養機はＣＯ_２恒温槽を用い、５％のＣＯ_２存在下３９．５℃で培養した。培地は、ＩＭＤＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用い、１０％ウシ血清、１％ニワトリ血清、ペニシリン１００単位／ｍＬ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍＬ，２−メルカプトエタノール ５５μＭを加えて使用した。また、トリコスタチンＡ（和光純薬）は、ＤＭＳＯに２ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解したものをストックとし、最終濃度が１．２５ｎｇ／ｍＬ、２．５ｎｇ／ｍＬとなるように、適宜培地で希釈して用いた。
ＣＨＯ−Ｓ細胞の細胞培養は、基本的に以下の方法で行った。培養機はＣＯ_２恒温槽を用い、５％のＣＯ_２存在下３７℃で培養した。培地は、ＣＨＯ−Ｓ ＳＦＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いた。
ＥＧＦＲ＃３６クローンは、ＥＧＦＲ−Ｆｃ組換えタンパク（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社）を用い、ＡＤＬｉｂシステムによるセレクションから、抗ＥＧＦＲ ＩｇＭを産生するクローンとして単離した。
ＡＤＬｉｂシステムのライブラリーはトリコスタチンＡ（和光純薬社）を毎日最終濃度が１．２５ｎｇ／ｍＬ、２．５ｎｇ／ｍＬとなるように培地に添加して維持し、使用前日からはトリコスタチンＡを除いた培地にて培養した。

２．ＣＨＯ−Ｓ細胞へのＥＧＦＲ、ＣＤ４遺伝子のトランスフェクション
ＥＧＦＲの発現ベクターはＰｙｒｏｂｅｓｔ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社）によりＰＣＲを用いて以下の手順で作製した。Ｈｕｍａｎ ＥＧＦＲ ｃＤＮＡクローン（Ｏｐｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社，Ｃｌｏｎｅ ＩＤ ３０５２８２３１，Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＢＣ０９４７６１）を鋳型とし、プライマーはＮｈｅＩ＿ＥＧＦＲ−Ｆ、ｈＥＧＦＲｃＤＮＡ−３’（ＢＣ０９４７６１）を用いて全長ｃＤＮＡを増幅した。反応条件は以下の通りである。９５℃３０秒の後、９５℃３０秒、５８℃３０秒、７２℃３分を３０サイクルの後、７２℃で８分反応させた。ここで得られたＨｕｍａｎ ＥＧＦＲ ｃＤＮＡは、ＥｘＴａｑ（タカラバイオ社）を加えて７２℃１５分反応させることで「Ａ」を付加し、ＤＨ５α株（タカラバイオ社）を用いてｐＧＥＭ−Ｔ ｅａｓｙ ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）へサブクローニングした（クローン１）。このクローン１はｅｘｏｎ４を欠いていたため、Ａ４３１細胞からｔｏｔａｌ ＲＮＡをＱｕｉｃｋＧｅｎｅ ＲＮＡ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｃｅｌｌ ｋｉｔ Ｓ（富士フイルム社）を用いて抽出し、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ ｆｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて、５０℃５０分、８５℃５分で逆転写反応を行った。得られたｆｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲでｃＤＮＡ合成を行い、ｐＧＥＭ−Ｔ ｅａｓｙ ｖｅｃｔｏｒへサブクローニングした。プライマーはＮｈｅＩ＿ＥＧＦＲ−Ｆ、ＥＧＦＲ−Ｒ（ＮＭ＿００５２２８）を用いた。

このクローン（クローン２）は、Ｅｘｏｎ４を含んでいたが、その他の配列に多数の突然変異を持っていたため、クローン２のＥｘｏｎ４を、クローン１にＰＣＲを用いて挿入することとした。クローン２からプライマーｈＥＧＦＲ＿ｅｘ４−５’とｈＥＧＦＲ＿ｅｘ４−３’を用いてＥｘｏｎ４断片を合成した。合成したＥｘｏｎ４断片とクローン１を混合したものを鋳型として、プライマーＮｈｅＩ＿ＥＧＦＲ−ＦとｈＥＧＦＲ＿ｅｘ４−３’（クローン１．１の合成に使用）、およびｈＥＧＦＲ＿ｅｘ４−５’とｈＥＧＦＲｃＤＮＡ−３’（ＢＣ０９４７６１）（クローン１．２の合成に使用）を用いてそれぞれＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物（クローン１．１およびクローン１．２）を混合したものを鋳型として、プライマーＮｈｅＩ＿ＥＧＦＲ−ＦとｈＥＧＦＲｃＤＮＡ−３’（ＢＣ０９４７６１）を用いてＰＣＲを行い、ｐＧＥＭ−Ｔ ｅａｓｙ ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）へサブクローニングした（クローン３）。シークエンスの確認はＡＢＩ社ＡＢＩｐｒｉｓｍ３７７シーケンサーにより行った。

クローン３をＨｉｎｄＩＩＩで切断後、Ｋｌｅｎｏｗ ｆｒａｇｍｅｎｔ（タカラバイオ社）により平滑化し、さらにＮｈｅＩにより切断し、インサート断片を得た。同様にｐＩＲＥＳｐｕｒｏ３（タカラバイオ社）を、ＥｃｏＲＩで切断後、平滑化した後ＮｈｅＩにより切断し、ベクター断片を得た。ベクター、インサート断片ともにＱｉａｑｕｉｃｋ ＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）により精製したのち、Ｌｉｇａｔｉｏｎ−Ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｃｅ Ｋｉｔ（ニッポンジーン社）よりライゲーションを行い、ＤＨ５α株にトランスフォーメーションし、ｐＩＲＥＳｐｕｒｏ３ＥＧＦＲ発現ベクターを得た。
（プライマー配列）
ＮｈｅＩ＿ＥＧＦＲ−Ｆ；ＴＴＧＣＴＡＧＣＣＣＡＧＴＡＴＴＧＡＴＣＧＧＧＡＧＡＧＣ（配列番号１）
ｈＥＧＦＲｃＤＮＡ−３’（ＢＣ０９４７６１）；ＣＡＧＧＣＴＣＧＧＴＣＡＴＧＴＧＴＴＴＡ（配列番号２）
ＥＧＦＲ−Ｒ（ＮＭ＿００５２２８）；ＧＣＡＣＣＴＧＴＡＡＡＡＴＧＣＣＣＴＧＴ（配列番号３）
ｈＥＧＦＲ＿ｅｘ４−５’；ＧＣＣＣＡＴＧＡＧＡＡＡＴＴＴＡＣＡＧＧＡＡＡＴＣ（配列番号４）
ｈＥＧＦＲ＿ｅｘ４−３’；ＣＡＧＣＴＴＧＧＡＴＣＡＣＡＣＴＴＴＴＧＧＣＡ（配列番号５）
ｈＥＧＦＲ＿ｅｘ４−５’；ＧＣＣＣＡＴＧＡＧＡＡＡＴＴＴＡＣＡＧＧＡＡＡＴＣ（配列番号６）
ｈＥＧＦＲ＿ｅｘ４−３’；ＣＡＧＣＴＴＧＧＡＴＣＡＣＡＣＴＴＴＴＧＧＣＡ（配列番号７）
ＣＤ４の発現ベクターは、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ社のＭＡＣｓｅｌｅｃｔ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎキットのｐＭＡＣＳ４．１ ｐｌａｓｍｉｄを用いた。

トランスフェクションはＣｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｋｉｔ Ｖ（Ａｍａｘａ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用い、基本的に添付のプロトコールに準じて行った。１ｘ１０^６個の細胞を回収しＰＢＳ１００μＬに懸濁した。懸濁した液にｐＩＲＥＳｐｕｒｏ３ＥＧＦＲ、ｐＭＡＣＳ４．１をそれぞれ１μｇ加えプログラムＵ−０２４を用いてトランスフェクションを行い、細胞を回収してＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ培地にて１６時間培養した。

３．ＥＧＦＲとＣＤ４を発現するＣＨＯ−Ｓ細胞によるＡＤＬｉｂライブラリー中の抗ＥＧＦＲ抗体発現細胞のセレクション
３−１．ＥＧＦＲとＣＤ４を発現するＣＨＯ−Ｓ細胞とＡＤＬｉｂライブラリー中の抗ＥＧＦＲ抗体発現細胞の結合：
ＥＧＦＲとＣＤ４を発現するＣＨＯ−Ｓ細胞とＡＤＬｉｂライブラリー １ｘ１０^８細胞を２％ウシ血清（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を含むＤＭＥＭ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に懸濁、混合し４℃、１時間振とうしながらインキュベートし、ＡＤＬｉｂライブラリー中の抗ＥＧＦＲ抗体発現細胞の結合反応を行った。インキュベートした細胞は１２０×ｇ、５分の遠心にて回収し、１０％のトリ血清を含むＭＡＣＳ ｂｕｆｆｅｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ社） に懸濁した。

３−２．ＭＡＣＳによる抗ＥＧＦＲ発現ＤＴ４０とＥＧＦＲ，ＣＤ４共発現ＣＨＯ細胞結合体の濃縮：
基本的にＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ社のプロトコールに従って行った。上記にてＭＡＣＳ ｂｕｆｆｅｒに懸濁した細胞に抗ＣＤ４マイクロビーズ２００μＬを加え混和し、１５分間氷上に静置した。ＬＳ ｃｏｌｏｍｎ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）はまず１０％トリ血清を含むＭＡＣＳ ｂｕｆｆｅｒ ３ｍＬにて平衡化した。次に上記の細胞・マイクロビーズ混合物に１０％トリ血清を含むＭＡＣＳ ｂｕｆｆｅｒ １ｍＬを加え総量２ｍＬとし、カラムにアプライした。カラムは１０％トリ血清を含むＭＡＣＳ ｂｕｆｆｅｒ ５ｍＬを３回アプライし、非特異的にカラムに結合する細胞を洗浄して除いた。その後、カラムを磁気スタンドからはずし、１０％トリ血清を含まないＭＡＣＳ ｂｕｆｆｅｒ ５ｍＬによりＣＤ４マイクロビーズに結合していた細胞を回収した。この操作は２回繰り返した。回収された細胞は上記のＤＴ４０培養用の培地にて一晩培養した。

３−３．抗ＥＧＦＲ発現ＤＴ４０とＥＧＦＲ，ＣＤ４共発現ＣＨＯ細胞結合体の濃縮のＦＡＣＳ解析による確認：
３−２にて一晩培養された細胞を５ｘ１０^５個、１，１００ｇ、４℃、５分間の遠心にて回収し、ＦＡＣＳ ｂｕｆｆｅｒ（０．３％ウシ血清アルブミンを含むリン酸緩衝生理食塩水）で１回洗浄した後、ＥＧＦＲ−Ｆｃタンパク（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社：リン酸緩衝生理食塩水で０．２μｇ／ｍＬにて使用）にて細胞を懸濁し、氷上で２０分静置した。この際、１０分おきにタッピングを行い細胞の再懸濁を促した。上記と同様に細胞を回収し、ＦＡＣＳ ｂｕｆｆｅｒで２回洗浄後、ＦＩＴＣコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、２００倍希釈で使用）およびＰＥコンジュゲート抗トリＩｇＭ抗体（Ｂｅｃｋｍａｎｎ ｃｏｕｒｌｔｅｒ社：２００倍希釈にて使用）にて細胞を懸濁し、氷上で２０分静置した。このさい１０分おきにタッピングを行い細胞の再懸濁を促した。上記と同様に細胞を回収し、ＦＡＣＳ ｂｕｆｆｅｒで２回洗浄後、１μｇ／ｍＬ ヨウ化プロピジウムを含むＦＡＣＳ Ｂｕｆｆｅｒ ４００μＬに細胞を懸濁したのちＦＡＣＳ解析に供し、ＦＩＴＣ とＰＥ 両方が陽性となる細胞（トリＩｇＭ、抗ＥＧＦＲ抗体の両方を発現する細胞）の割合を解析した。ＦＡＣＳにはＣｅｌｌ Ｌａｂ Ｑｕａｎｔａ ＳＰ ＭＰＬ （Ｂｅｃｋｍａｎｎ ｃｏｕｌｔｅｒ社）を用い、解析ソフトウェアとしてはＦｌｏｗｊｏ（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ社）を用いた。図２にこの実験の結果の一例を示す。図２ＢはＥＧＦＲに反応するＤＴ４０クローンを含まない細胞集団に対してこの操作を行ったものであるが、四角の中で示される、ＥＧＦＲ特異的な細胞の濃縮は全く見られない。これに対し、ＡＤＬｉｂライブラリー細胞を用いた実験結果を図２Ａに示すが、四角の中に０．３２％までの細胞の濃縮が見られ、これはこの実験が正しく行われたことを示している。

４．抗トリＩｇＭ抗体、ＥＧＦＲ Ｆｃキメラ陽性細胞のＦＡＣＳソーティングと、単離された細胞のＦＡＣＳ解析
ライブラリーから回収された細胞中で、３−３のＦＡＣＳ解析において抗トリＩｇＭ抗体およびＥＧＦＲ−Ｆｃタンパク共に陽性のシグナルを示した細胞群（図２Ａにおいて四角枠で囲った部分 についてＦＡＣＳソーティングを行った。ソーターはＢｅｃｋｍａｎｎ ｃｏｕｌｔｅｒ社ＥＰＩＣＳ Ｅｌｉｔｅ ＥＳＰを用いた。図２の枠内にある細胞を、ＤＴ４０用メディウムを満たした９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ社）に分取した。これを約１週間培養し、１細胞由来からのコロニーを形成させた。５５個のコロニーが回収された。これらについて、抗ＥＧＦＲ抗体の発現に関してＦＡＣＳ解析により確認した。染色、解析方法は３−２に準じて行った。その結果、５５クローン中５３クローンについてＥＧＦＲ Ｆｃキメラによる染色が認められ、ＥＧＦＲに対する抗体を産生するものであることが確認された。このうちの１クローン（クローン＃３３）について図３Ａに示す。２クローンに関しては抗ＥＧＦＲの産生は認められなかった。これに属するクローンの一つ（クローン＃１１）を図３Ｂに示す。

５．単離されたクローンの特異性検討のためのＥＬＩＳＡ解析
ＥＬＩＳＡは以下のとおりに行った。
まず４において単離した５５クローンについて、各１Ｘ１０^６細胞をそれぞれ１ｍＬ の、トリ血清を含まないＤＴ４０用培地にて２日間培養し、ＩｇＭを産生させ、この培養上清を回収した。培養上清中のＩｇＭ濃度は、Ｃｈｉｃｋｅｎ ＩｇＭ ＥＬＩＳＡ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＢＥＴＨＹＬ社）を用い、添付のプロトコールにしたがって行った。ＥＬＩＳＡ解析は各クローンについて１μｇ／ｍＬのＩｇＭ濃度で行った。
ＥＧＦＲ−Ｆｃを１μｇ／ｍＬで９６穴イムノプレートＵ−９６ Ｍａｘｉｓｏｒｐ （Ｎｕｎｃ社）に１００μＬずつ分注し一晩インキュベートした。なお、抗体の特異性を検討するためのコントロールとしｈｕｍａｎ ＩｇＧ、ＢＳＡも同様にプレートに固定した。翌日プレートの中身を捨て、ブロッキングバッファー（０．５％ スキムミルクを含むＰＢＳ）２００μＬを入れ、室温で２時間インキュベートした。ＥＬＩＳＡ洗浄バッファー（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）２００μＬで３回洗浄した。その抗ＥＧＦＲ発現候補クローン５３クローンとＣＬ１８クローン由来の培養上清それぞれ１００μＬを入れ、室温で１時間インキュベートした。ＥＬＩＳＡ洗浄バッファー２００μＬで５回洗浄したのち、二次抗体（ａｎｔｉ−ｃｈｉｃｋｅｎ ＩｇＭ−ＨＲＰ：ＢＥＴＨＹＬ社）をＰＢＳで５０００倍に希釈したものを１００μＬ入れ、室温で４５分インキュベートした。なお二次抗体はａｎｔｉ−ｃｈｉｃｋｅｎ ＩｇＭ−ＨＲＰ（ＢＥＴＨＹＬ社）を使用した。ＥＬＩＳＡ洗浄バッファー２００μＬで５回洗浄したのち、ＴＭＢ＋（Ｄａｋｏ社）を１００μＬ入れ、１０分インキュベートした。その後反応を１Ｎの硫酸１００μＬで停止し、４５０ｎｍの吸光度を測定し、ＥＧＦＲに特異的な抗体を産生するクローンの数と番号を解析した。クローン＃３３、＃１１および非特異的なクローン（ＣＬ１８Ｍ＋）についての結果をそれぞれ、図４Ａ、４Ｂ、４Ｃに示す。これによりクローン＃３３が産生している抗体はＥＧＦＲ特異的であることが明らかとなった。同様の結果は他の５２クローンのＥＧＦＲ特異的なクローンについても見られた。

６．単離されたクローンの特異性検討のためのＦＡＣＳ解析
単離されたクローンの特異性をさらに検討するため、ＥＧＦＲを高いレベルで発現していることが知られている扁平上皮癌由来細胞株Ａ４３１細胞を用いてＦＡＣＳ解析を行った。
Ａ４３１の細胞培養は、基本的に以下の方法で行った。培養機はＣＯ_２恒温槽を用い、５％のＣＯ_２存在下３７℃で培養した。培地は、ＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用い、１０％ウシ血清、ペニシリン１００単位／ｍＬ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍＬを加えて使用した。
ＦＡＣＳ解析は以下の要領で行った。Ａ４３１細胞を１サンプルあたり５Ｘ１０^６個１．５ｍＬチューブに回収し、ＦＡＣＳ ｂｕｆｆｅｒにて１回洗浄した。その後５）で調製した５５クローンの培養上清で細胞を懸濁し、氷上で２０分放置した。その後ＦＡＣＳ ｂｕｆｆｅｒにて２回洗浄し、ＦＩＴＣコンジュゲート抗トリＩｇＭ抗体（ＢＥＴＨＹＬ社、１０００倍希釈にて使用）にて懸濁し、２０分間氷上で放置した。その後ＦＡＣＳ ｂｕｆｆｅｒで２回洗浄後、１μｇ／ｍＬヨウ化プロピジウムを含むＦＡＣＳ Ｂｕｆｆｅｒ ４００μＬに細胞を懸濁したのちＦＡＣＳ解析に供した。用いた５５クローンの培養上清のうち、Ａ４３１細胞に対して結合を示したクローンの例を、図５に示す。ＦＡＣＳにはＣｅｌｌ Ｌａｂ Ｑｕａｎｔａ ＳＣ ＭＰＬ （Ｂｅｃｋｍａｎｎ ｃｏｕｌｔｅｒ社）を用い、解析ソフトウェアとしてはＦｌｏｗｊｏ （Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ社）を用いた。その結果を図５に示す。クローン＃３３および＃１１の培養上清を用いた実験を図５Ａおよび５Ｂに、また図５Ｃには市販の抗ＥＧＦＲ抗体を用いた結果を示す。これにより、クローン＃３３の産生する抗体が、Ａ４３１細胞上のＥＧＦＲ分子に対して生理的条件下で反応することが明らかとなった。同様の結果は他の５２クローンのＥＧＦＲ特異的クローンについても得られた。ネガティブコントロールとしてＡ４３１細胞の変わりに浮遊系ＣＨＯ細胞を用いて同様の解析を行った。

７．Ｃｌａｕｄｉｎ２発現ベクター作製とＣｌａｕｄｉｎ２安定発現ＣＨＯ細胞の作製
４回膜貫通型蛋白質であるヒトＣｌａｕｄｉｎ２遺伝子のコーディング領域に相当する配列をｐＭＣ１ｎｅｏベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）のマルチクローニングサイトに組み込みＣｌａｕｄｉｎ２発現ベクターとしてｐＭＣ−ＣＬ２を構築した。
これをＣＨＯ細胞にトランスフェクションし、次いでＧｅｎｅｔｉｃｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）による薬剤セレクションを実施することでＣｌａｕｄｉｎ２安定発現ＣＨＯ細胞としてＣＬＣＮ２／ＣＨＯを確立した。

８．Ｃｌａｕｄｉｎ２一過性発現ＣＨＯ−Ｓ細胞を用いたセレクション
８−１．ネガティブセレクションによるＡＤＬｉｂライブラリー中の不要抗体発現ＤＴ４０の除去：
ＣＨＯ−Ｓ １×１０^７細胞にＣＤ４発現ベクターであるｐＭＡＣＳ４．１ ｐｌａｓｍｉｄ ２．５μｇをＣｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｋｉｔ Ｖを用いてトランスフェクションした。この操作を５回繰り返し、細胞を回収してＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ培地にて１６時間培養した。次いでマイトマイシンＣ（ナカライテスク社）を終濃度１０μｇ／ｍＬ添加し更に３時間培養を続けた。マイトマイシンＣ処理によってＣＨＯ−Ｓ細胞膜上へのＣＤ４の発現は維持されつつ、細胞の増殖は抑制される。

マイトマイシンＣ処理後の細胞を回収し、生細胞として１×１０^７細胞のＣＤ４発現ＣＨＯ-Sに対して予め調製したビオチン標識抗ＣＤ４マウスモノクローナル抗体（バイオレジェンド社）を固定化したストレプトアビジン標識Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｖｅｒｉｔａｓ社）５×１０^７個を反応させた。こうして調製されたＤｙｎａｂｅａｄｓが結合したＣＤ４発現ＣＨＯ−Ｓ全量（１×１０^７細胞）をＡＤＬｉｂライブラリー １×１０^８細胞に懸濁、混合し４℃、３０分間振とうしながらインキュベートし、ＣＤ４発現ＣＨＯ−ＳとＡＤＬｉｂライブラリー中に含まれる不要抗体発現ＤＴ４０と反応させた。反応終了後の細胞懸濁をキングフィッシャー磁気粒子プロセッサ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）にセットし、磁気ビーズであるＤｙｎａｂｅａｄｓと細胞からなる複合体を磁石で吸着することでＡＤＬｉｂライブラリー中に含まれる不要抗体発現ＤＴ４０を除去した（ネガティブセレクション）。吸着しなかったＤＴ４０細胞集団を次のステップであるポジティブセレクションに使用するＡＤＬｉｂライブラリーとした。

８−２．ポジティブセレクションによる抗Ｃｌａｕｄｉｎ２抗体産生ＤＴ４０の単離：
ＣＨＯ−Ｓ １×１０^７細胞にＣＤ４発現ベクターであるｐＭＡＣＳ４．１ ｐｌａｓｍｉｄ ２．５μｇおよびＣｌａｕｄｉｎ２発現ベクターであるｐＭＣ−ＣＬ２ ２．５μｇをＣｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｋｉｔ Ｖを用いてコトランスフェクションした。細胞を回収してＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ培地にて１６時間培養した。次いでマイトマイシンＣ（ナカライテスク社）を終濃度１０μｇ／ｍＬ添加し更に３時間培養を続けた。マイトマイシンＣ処理によってＣＨＯ−Ｓ細胞膜上へのＣＤ４およびＣｌａｕｄｉｎ２の発現は維持されつつ、細胞の増殖は抑制される。

マイトマイシンＣ処理後の細胞を回収し、生細胞として１×１０^６細胞のＣＤ４およびＣｌａｕｄｉｎ２共発現ＣＨＯ−Ｓに対して予め調製したビオチン標識抗ＣＤ４マウスモノクローナル抗体（バイオレジェンド社）を固定化したストレプトアビジン標識Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｖｅｒｉｔａｓ社）５×１０^６個を反応させた。こうして調製されたＤｙｎａｂｅａｄｓが結合したＣＤ４およびＣｌａｕｄｉｎ２共発現ＣＨＯ−Ｓ全量（１×１０^６細胞）を上記のネガティブセレクションの処理を施したＡＤＬｉｂライブラリー（約１×１０^８細胞）に懸濁、混合し４℃、３０分間振とうしながらインキュベートし、ＣＤ４およびＣｌａｕｄｉｎ２共発現ＣＨＯ−ＳとＡＤＬｉｂライブラリーとを反応させた。

反応終了後の細胞懸濁をキングフィッシャー磁気粒子プロセッサ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）にセットし、磁気ビーズであるＤｙｎａｂｅａｄｓと細胞からなる複合体を磁石で吸着および解放することを洗浄液中で繰り返すことで非特異的に反応しているＤＴ４０を洗浄除去した。洗浄後に回収した細胞全量を９６ウェルプレート２枚に撒き込み約１０日後に培養上清を回収し、その培養上清中に含まれる抗Ｃｌａｕｄｉｎ２抗体の存在を細胞ＥＬＩＳＡによって調べた。

細胞ＥＬＩＳＡは以下の方法に準じて実施した。Ｃｌａｄｉｎ２安定発現細胞であるＣＬＤＮ２／ＣＨＯあるいは未処理のＣＨＯ細胞を３×１０^４細胞／ウェルで播種し、２日間、５％のＣＯ_２存在下３７℃で培養したプレートを用意した。このプレートの培養上清を除いた後、ポジティブセレクション後の細胞培養上清１００μＬを入れて室温で１時間反応させた。０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳでウェルを洗浄し、次いで１０，０００倍に希釈したａｎｔｉ−ｃｈｉｃｋｅｎ ＩｇＭ−ＨＲＰ（ＢＥＴＨＹＬ社）１００μＬを二次抗体として反応させた。０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで洗浄したのち、発色液としてＴＭＢ＋（Ｄａｋｏ社）を１００μＬ入れ、３０分インキュベートした。その後反応を１Ｎの硫酸１００μＬで停止し、４５０ｎｍの吸光度を測定することで、ポジティブセレクションで回収された細胞培養上清中の抗Ｃｌａｕｄｉｎ２抗体の存在を調べた。ポジティブセレクション回収後の細胞を撒き込んだ９６ウェルプレート２枚について調べた結果、図６に示すように未処理のＣＨＯに反応せず、Ｃｌａｕｄｉｎ２安定発現細胞であるＣＬＤＮ２／ＣＨＯに特異的に反応するウェルが高率で認められた。図中、ＰＣはＣｌａｕｄｉｎ２の細胞外ループのひとつに相当する合成ペプチドを抗原としてＡＤＬｉｂセレクションによって確立された抗体であり陽性コントロールとして使用した。また、ＮＣはＡＤＬｉｂセレクションによって確立されたストレプトアビジンに対する抗体であり、陰性コントロールとして使用したものである。

以上のように、本発明は１回膜貫通型タンパク質であるＥＧＦＲのみならず、抗体取得が困難とされる４回膜貫通型タンパク質の抗体作製にも適用できることが証明された。

本発明は、従来抗体取得が困難であった所望の膜貫通タンパク質に対する抗体の作製を可能にし、かつ、該膜貫通タンパク質の機能にも影響を及ぼすいわゆる機能性抗体を取得する確度を高めることができるため、抗体製剤、抗体診断薬等の分野、または、研究上のツールとして広く利用可能である。

Claims (5)

1. 複数回膜貫通タンパク質である標的抗原タンパク質を細胞表面上に発現した細胞であって、マイトマイシンＣで処理した該細胞に、細胞表面に抗体を提示した細胞集団である抗体ライブラリーを接触させ、該標的抗原タンパク質を細胞表面上に発現した細胞を単離することにより、該標的抗原タンパク質と複合体を形成する抗体ライブラリーの構成物を分離する方法。
2. 標的抗原タンパク質を細胞表面上に発現した細胞を単離する方法が、該細胞に発現している標的抗原タンパク質以外の細胞表面上の抗原であるマーカー抗原とマーカー抗原に対する抗体との結合を利用する請求項１記載の方法。
3. マーカー抗原が、外来タンパク質である請求項２に記載の方法。
4. 標的抗原タンパク質が外来タンパク質である請求項３に記載の方法。
5. 細胞表面に抗体を提示した細胞集団がＤＴ４０である請求項１乃至４のいずれかに記載の方法。