CN105579853A - 用于检测gaba(a)相关性自身免疫疾病的诊断方法和相关主题 - Google Patents

用于检测gaba(a)相关性自身免疫疾病的诊断方法和相关主题 Download PDF

Info

Publication number
CN105579853A
CN105579853A CN201480052000.4A CN201480052000A CN105579853A CN 105579853 A CN105579853 A CN 105579853A CN 201480052000 A CN201480052000 A CN 201480052000A CN 105579853 A CN105579853 A CN 105579853A
Authority
CN
China
Prior art keywords
gaba
fragment
homologue
antibody
patient
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201480052000.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105579853B (zh
Inventor
J·达尔毛
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institucio Catalana de Recerca i Estudis Avancats ICREA
Institut dInvestigacions Biomediques August Pi i Sunyer IDIBAPS
Original Assignee
Institucio Catalana de Recerca i Estudis Avancats ICREA
Institut dInvestigacions Biomediques August Pi i Sunyer IDIBAPS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institucio Catalana de Recerca i Estudis Avancats ICREA, Institut dInvestigacions Biomediques August Pi i Sunyer IDIBAPS filed Critical Institucio Catalana de Recerca i Estudis Avancats ICREA
Publication of CN105579853A publication Critical patent/CN105579853A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105579853B publication Critical patent/CN105579853B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4713—Autoimmune diseases, e.g. Insulin-dependent diabetes mellitus, multiple sclerosis, rheumathoid arthritis, systemic lupus erythematosus; Autoantigens
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/564—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for pre-existing immune complex or autoimmune disease, i.e. systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, rheumatoid factors or complement components C1-C9
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/94—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving narcotics or drugs or pharmaceuticals, neurotransmitters or associated receptors
    • G01N33/9406—Neurotransmitters
    • G01N33/9426—GABA, i.e. gamma-amino-butyrate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70571—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for neuromediators, e.g. serotonin receptor, dopamine receptor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/2857—Seizure disorders; Epilepsy

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Rehabilitation Therapy (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

本发明提供GABA(A)R、GABA(A)R片段或其同源物或表达GABA(A)R、GABA(A)R片段或其同源物的细胞用于预测、诊断或治疗受试者中自身免疫疾病的用途，预测、诊断或治疗自身免疫疾病的方法、与GABA(A)R、GABA(A)R片段或其同源物结合的自身抗体，用于分离与GABA(A)R、GABA(A)R片段或其同源物结合的抗体的方法，以及包含GABA(A)R、GABA(A)R片段或其同源物的检验试剂盒、药物组合物和医用或诊断装置。

Description

用于检测GABA(A)相关性自身免疫疾病的诊断方法和相关主题
发明领域
本发明涉及预测、诊断和治疗新鉴定的自身免疫疾病、提供新的细胞表面自体抗原和用于检测及治疗所述自身免疫疾病的相关手段和方法。
背景技术
存在证据表明癫痫发作(seizure)和癫痫持续状态(statusepilepticus)可以因针对兴奋性或抑制性突触受体或结合这些受体的蛋白质的免疫反应产生。6这些包括N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDAR)、α-氨基-3-羟-5-甲基-4-异唑丙酸受体(AMPAR)、γ-氨基丁酸-B受体(GABA(B)R)、亮氨酸丰富胶质瘤灭活型蛋白1(LGI1)、接触蛋白相关的蛋白样2(Caspr2)和DPPX(Kv4.2钾通道的调节亚基)。21除非鉴定免疫机制并进行治疗，否则伴随这些病症中任一者的癫痫发作经常抵抗抗癫痫疗法。2,15,22在一些患者中，癫痫发作或癫痫持续状态可以是疾病的首次表现，需要大剂量镇静或延长型药理学昏迷。3,17这些治疗可以掩盖其他症状如运动失调或精神病性改变，造成疾病识别延误。直至最近，自身免疫性的癫痫相关的主要抑制性受体靶是GABA(B)R。22大部分具有GABA(B)R抗体的患者出现早期和明显的癫痫发作或癫痫持续状态作为边缘性脑炎的组成部分。大约50％的这些患者患有基础性小细胞肺癌(SCLC)。11,16
鉴于这些自身免疫疾病直至最近仍是未知的，相对高频率的某些疾病已经是令人惊讶的。例如，在致力于脑炎诊断和流行病学的研究中心(加利福尼亚州脑炎项目)，抗NMDAR脑炎的频率超过任何单种病毒性脑炎的频率。32出于这些理由，在病因学未知的脑炎背景(一种经常出现的情况)下快速形成渐进性神经精神病学症状的患者中日益考虑相似的免疫机制。如今，在充分评价传染性病因学后，约70％的病因学不明脑炎仍未诊断。33在这种背景下，鉴定针对神经元细胞表面抗原的自身抗体转向对使用免疫疗法管理并且在否则可能认为无效的情况下可以扩大重症监护支持。
鉴于以上，作为本发明基础的问题分别在于提供用于诊断和治疗先前不明的自身免疫脑炎或病因学未知的脑炎的手段。
发明简述
这个问题由权利要求的主题物解决，尤其通过以下方式解决：将γ-氨基丁酸-A受体(GABA(A)R)(一种涉及自身免疫疾病的新颖自体抗原，其用于预测、诊断或治疗受试者中自身免疫疾病、尤其脑炎的方法中)提供给表达这类GABA(A)R、GABA(A)R片段或其同源物的细胞；将与所述GABA(A)R、GABA(A)R片段或其同源物结合的抗体提供给用于分离这类抗体的方法、提供给涉及这类GABA(A)R、GABA(A)R片段或其同源物或这类细胞或抗体的体外预测或诊断方法和检验试剂盒、提供给包含这类GABA(A)R、GABA(A)R片段或其同源物或这类细胞的药物组合物，提供给用这类GABA(A)R、GABA(A)R片段或其同源物、这种细胞、这种抗体或这种药物组合物包覆的医用装置以及提供用于治疗受试者中自身免疫疾病(尤其脑炎)的方法。
尽管上文中提到GABA(B)R属于促代谢的G蛋白偶联受体类别，但是GABA(A)R是一种先前尚未作为自身免疫的靶认识的配体门控离子通道。我们在这里报告，确定GABA(A)R作为来自18名患者抗体的靶，其中所述患者构成两个免疫组：一个组以伴随明显癫痫发作或癫痫持续状态发生的血清和CSF中高水平抗体为特征，并且另一个组以伴随一系列更广泛症状发生的血清中低水平抗体或CSF中不存在抗体为特征，在这个组中癫痫发作、视性眼阵挛、僵者综合征和重叠性自身免疫性的频率高。此外，我们显示患者抗体特异地改变大鼠海马神经元培养物中突触GABA(A)R的水平。
本发明的一个优点在于以下事实：诊断病因学未知的脑炎能够将疾病鉴定为自身免疫脑炎，分别与其他(非自身免疫)形式的脑炎或其他疾病或相关症状区分，并且因此用例如免疫抑制剂为患者提供特效治疗。
本发明的另一个优点在于开启了作为免疫抑制的备选或除其之外的治疗选项，例如通过靶向特定自身抗体做到。
附图简述
图1显示来自患者1的脑MRI图像；
图2显示来自患者2的脑MRI图像；
图3显示来自患者1和患者2的EEG记录；
图4显示CSF抗体与大鼠脑的反应性；
图5以高放大率显示患者CSF与大鼠海马和小脑的反应性；
图6显示CSF抗体与表达GABA(A)R的HEK细胞的反应性；
图7显示使用表达GABA(A)R的HEK细胞的免疫吸附结果；
图8显示采用患者抗体的免疫竞争研究的结果；并且
图9显示患者抗体结合GABA(A)R的选择性和影响。
发明详述
根据本发明，“多肽”理解为2、3、4、5、6、7或8个或更多个或至多数千个氨基酸的聚合物，所述氨基酸可以包括标准氨基酸以及非标准氨基酸。术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中互换地使用。
就本发明的多肽、肽和蛋白质而言，术语“片段”指小于所述多肽、肽或蛋白质的全长序列，涵盖例如在一个或两个末端处截短一个或多个氨基酸的氨基酸序列。备选或额外地，这样的肽序列可以包含一个或多个氨基酸的内部缺失。因而，片段的残余长度等于或超过一个或多个连续表位或构象表位的长度。当涉及包含多于一种多肽、肽或蛋白质的复合物时，术语“片段”指仅具有其组分子集的复合物，这意指多肽、肽或蛋白质(即构成复合物的亚基)的数目减少和/或意指复合物中的一个或多个组分是末端截短的和/或携带如上文所述的内部缺失。
就本发明的多肽、肽和蛋白质而言，术语“同源物(homolog)”理解为意指与原始序列相比显示出一个或多个氨基酸序列偏差的多肽、肽和蛋白质。这些偏差可以是交换或插入一个或多个氨基酸或蛋白质基序或蛋白质结构域。例如，同源物可以与相应的原始序列具有至少70％、75％、80％、90％、92％、94％、96％、98％或99％序列同一性。备选地，同源性的范围可以限于原始序列的7、8、9、10、11、12、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100个或更多个氨基酸。另外在这种情况下，例如在较大的非同源蛋白质背景下单一蛋白结构域或基序的同源性情况时，同源物可以与相应的原始序列具有至少70％、75％、80％、90％、92％、94％、96％、98％或99％序列同一性。当涉及包含多于一种多肽、肽或蛋白质或其片段的复合物时，术语“同源物”指其至少一个亚基由如本文上述的同源物替换的复合物。
就本发明而言，术语“自身免疫疾病”指与针对GABA(A)R的抗体相关的疾病。如下文报道，显示这种自身免疫疾病的患者出现多种症状，所述症状包括记忆问题、意识模糊、疲乏、倦怠、社交焦虑、行为变化、精神病、抑郁、缄默症、认知功能障碍、恶心、眩晕、闪光性暗点、头痛、癫痫发作、持续性部分性癫痫、癫痫持续状态、视性眼阵挛、视性眼阵挛-肌阵挛、僵者综合征、舌张力障碍性运动、累及四肢和躯干的舞蹈症、渐进性轻偏瘫、共济失调、累及四肢和躯干的舞蹈症。这些症状主要累及神经系统并且更具体地至少部分地与中枢神经系统的缺陷相关。因此，本发明的自身免疫疾病可以是自身免疫脑炎。
在本发明的范围内，“表位”理解为一种或几种蛋白质的片段，所述片段可以由抗体特异性识别(即结合)。表位可以是由来自单一蛋白的氨基酸序列的不连续片段或衍生自几种不同蛋白质的不连续片段组成的构象表位或由某个长度的来自单一蛋白的氨基酸序列的连续片段组成的线性表位。例如，线性MHCI类表位长约8至11个氨基酸。除以上之外，术语“表位”还涵盖从蛋白质或多种蛋白质的原始序列衍生的表位。
就表位而言，在本发明的范围内，术语“衍生”指从多肽或蛋白质的一级氨基酸序列的不连续或连续片段形成的表位。本领域已知，表位中的一个或多个氨基酸可以基本上在不改变抗体-结合强度或特异性的情况下例如由保守性氨基酸替换(例如谷氨酸盐替换成天冬氨酸E—>D、谷氨酰胺替换成天冬酰胺Q—>N、苯丙氨酸替换成酪氨酸F—>Y、亮氨酸替换成异亮氨酸L—>I)。因此，术语“衍生”也涉及这类表位，其中尽管以基酸序列差异为特征，但与具有原始氨基酸序列的表位相比时，所述表位显示未改变的或基本上未改变的或增强的抗体强度或特异性。
根据本发明，“核酸”涉及DNA聚合物或RNA聚合物，还包括其化学衍生物或合成性类似物如肽核酸或吗啉代核酸。本领域已知，归因于遗传密码简并性，核酸密码的某些变化不导致其所编码的肽序列的变化。因此，术语“核酸”还涵盖了在序列上与原始核酸序列不同，只要编码相同肽序列的核酸序列，例如其中密码子选择为某些表达系统中表达而优化的序列。
本发明的“载体”理解为环形或线性核酸序列，所述核酸序列包含插入物，例如编码所需蛋白质的基因或核酸序列，和其他特征如为载体复制，表达插入物、正选择携带载体的宿主细胞或表达标记蛋白所需要的序列。这类载体和序列从现有技术充分已知。
在本发明的范围内，“细胞”是能够用载体转化的任何原核或真核宿主细胞。例如，细胞可以是细菌细胞如大肠杆菌(Escherichiacoli)细胞或真核细胞如人永生化培养细胞。人永生化培养细胞的一个例子是HEK293细胞。
在本发明的范围内，“受试者”是哺乳动物，尤其是人。
术语“γ-氨基丁酸-A受体”、“GABA(A)受体”、“GABAAR”或“GABA(A)R”指包含其全部已知组分和组分组合的受体。如一开始所提及，GABA(A)R，是响应于抑制性神经递质γ-氨基丁酸的配体门控离子通道。如下文将更详细地讨论，该受体由源自8个基因家族的5个亚基组成，所述的8个基因家族编码19种不同的已知亚基类型。GABA(A)R出现在神经组织中，主要在中枢神经系统和脊髓中。它还可以存在于外周神经系统中，例如存在于运动神经元中。最丰富的亚基是α-型和β-型亚基，它们是任何GABA(A)R的必需组分。GABA(A)R如此高度保守，从而即便来自仅与人类远缘相关的物种的GABA(A)R也适于通过人类抗GABA(A)R抗体激发特异性结合作用。对于GABA(A)R的亚基的确是这样。如上文中提到，例如，线性MHCI类表位长约8至11个氨基酸。因此，在GABA(A)R同源物中，在相应物种和人类之间保守的长度在8至11个氨基酸之间的区域已经原则上足以通过人类抗GABA(A)R抗体激发特异性结合作用。在这一方面，构成构象表位的保守序列可以甚至更短。因此，就本发明而言，“GABA(A)R”、“GABAAR”或“GABA(A)R”涉及源自脊椎动物、优选地哺乳动物或更优选地智人(Homosapiens)的GABA(A)R的蛋白质亚基的任何已知同工型。
发明人已经将GABA(A)R鉴定为自身免疫脑炎的靶抗原。描述了具有针对GABA(A)R的抗体的18位患者，并且证实患者的抗体从突触部位移除GABA(A)R。这些研究结果是重要的，因为高滴度的抗体通常与需要药理所致昏迷的明显癫痫发作和难治性癫痫持续状态相关，而低滴度可能随癫痫发作、视性眼阵挛-肌阵挛或僵者综合征发生，经常伴有针对其他氨基丁酸能蛋白(GAD)的抗体或提示自身免疫性倾向的TPO。
下文在实施例中更详细讨论的五组实验确立GABA(A)R作为血清和CSF中具有高水平抗体的患者中相关的自体抗原：1)受体被患者抗体直接免疫沉淀，2)表达GABA(A)R的α1和/或β3亚基的HEK细胞被患者抗体特异性免疫染色，3)用GABA(A)R的α1/β3亚基进行免疫吸附后，消除患者抗体与脑神经毯的反应性，4)患者的抗体竞争相同的GABA(A)R表位，和5)展示患者抗体在不影响桥连蛋白(在突触后部位锚定受体的支架蛋白)的情况下造成选择性移除突触GABA(A)R。
成熟脑中大部分快速抑制性神经传递由配体门控的GABA(A)R介导。29这些受体是其五个亚基源自8个基因家族的五聚物，所述8个基因家族含有多个同工型(α1-6、β1-3、γ1-3、δ、ε、θ、π和ρ1-3)。受体的亚基组成决定通道的固有特性如对GABA的亲和力、受体电导、动力学和调节作用。10这些19种亚基可以按多种不同方式组合以形成有功能的受体，但是突触部位处的大部分受体含有按γ-β-α-β-α顺序布置的两个α亚基(α1-3同工型)、两个β亚基和一个γ亚基。相反，位于突触周围部位或突触外部位处的受体主要由与β和δ亚基组合的α4或α6亚基组成。31在全部18位患者的血清和CSF中鉴定的抗体均与共表达α1/β3亚基的细胞反应，并且当可以评估与各个亚基的反应性时，α1总是由CSF识别。使用大鼠海马神经元的培养物，患者的CSF抗体导致特异性位于突触部位处的GABA(A)R的密度下降。GABA(A)R(包括突触受体和突触外受体)的总密度不受影响，提示受体从突触部位重定位至突触外部位。这与其他自身免疫脑炎(如其中突触部位和突触外部位处相应受体出现减少的抗NMDAR或AMPA受体脑炎)相关的抗体的影响相反。
GABA(A)R的α1亚基中的四个显性突变与全身性癫痫相关；体外研究已经展示这些突变的每一者均导致α1亚基功能或表达水平明显丧失。31此外，β3亚基的突变也已经在失神癫痫儿童中报道。28与这些研究结果一致，具有高滴度针对GABA(A)Rα1/β3亚基的血清抗体和CSF抗体的患者的频现特征是癫痫发作、癫痫持续状态或持续性部分性癫痫频繁出现。其他症状，包括行为和认知改变、意识模糊或局灶性神经系统功能缺损，和CSF脑脊液细胞异常增多或寡克隆条带的存在大多数类似于病毒或免疫介导的其他形式脑炎中出现的那些。9
在血清中抗体滴度低或CSF中不存在抗体的患者组中，癫痫发作在50％的病例中发生。具有非局灶性脑炎临床现象的全部患者均出现癫痫发作；一位最年轻的患者(3岁儿童)因难治性癫痫持续状态而需要药理学所致昏迷。在这个组中，其他相关自身免疫性的频繁存在可能解释更宽范围的症状。实际上，4名僵者综合征(与针对其他抑制性受体或相关蛋白质的自身抗体相伴出现的病症)患者中有两位具有共存的GAD65抗体，并且另一位患者具有造成该临床现象(典型的抗NMDAR脑炎)的NMDAR抗体。有趣地，抗NMDAR脑炎患者的CSF显示高滴度的NMDAR抗体，但没有显示GABA(A)R抗体。在所述患者中，仅在血清中鉴定到GABA(A)R抗体，提示免疫反应的不同区室化。此外，两个研究结果引人注目，1)在低滴度组的2/12(17％)患者中鉴定到视性眼阵挛-肌阵挛(整个系列的3/18[17％])，这使得GABA(A)R成为视性眼阵挛-肌阵挛患者中报告的最常见神经元抗原之一，和2)与2/4(50％)病例中出现的其他更频繁识别的抗GAD相关性病症(例如，僵者综合征)相比，抗GAD相关性脑炎或癫痫发作的病例数出乎意料(低滴度组中3/5，60％)。这些研究结果强调，在归因于GAD抗体的脑炎或癫痫发作患者中，应当考虑更有意义的针对细胞表面蛋白或突触蛋白如GABA受体的抗体存在。4,24数目日益增加的因病因学不明性脑炎背景下检出TPO抗体先前表征作为桥本氏脑炎的患者患有其他病症。8,22在本研究中，4/18患者(22％)具有TPO抗体。
大部分具有GABA(A)R抗体和癫痫发作的患者出现经常显示多灶性癫痫活动并且在两个病例中显示广泛化周期性放电的异常EEG。这些研究结果与具有高滴度血清GABA(A)R抗体的6/6(100％)患者中(全部具有CSF抗体)和抗体滴度低的3/12(25％)患者中的广泛脑MRI异常相关。这些MRI异常优势地涉及皮质区域和皮质下区域；然而，少数患者中累及基底神经节、脑干或小脑表明，脑的任何区域可以显示放射学异常。因此，与患有其他类型的抗体相关脑炎的患者相比，
具有针对GABA(A)R的抗体和癫痫发作的那些患者显示经常更广泛和多样的脑MRI异常。作为一个例子，仅30％抗NMDAR脑炎患者具有初始的MRI异常(通常为一过性并且较不广泛)28，并且大部分存在AMPAR抗体19、GABA(B)R抗体11,16或LGI1抗体14,20的患者具有高度限于内侧颞叶的异常MRI结果，与典型边缘性脑炎一致。
与其他类型的自身免疫突触脑炎的比较显示出几种额外差异。39％存在GABA(A)R抗体的患者低于18岁，而大部分的其他类型脑炎(抗NMDAR例外)出现在成年和更年长个体中。21另外，存在GABA(A)R抗体的患者很少患有基础性肿瘤，而在一些其他脑炎(AMPAR、GABA(B)R)中，约50％患者患有肿瘤23，或在抗NMDAR脑炎的情况下，肿瘤的频率依据患者的年龄和性别变动。28
存在证据表明癫痫持续状态和其他形式的脑损伤可以导致慢性癫痫。慢性癫痫形成之前通常有一个沉默阶段，在此期间存在过度兴奋不断增加伴随突触GABA(A)R簇集物进展性减少。10这种效应已经部分地归因于锚定GABA(A)R的蛋白质(桥蛋白)的破坏。10,25这些数据和抗体介导的本文所报道突触GABA(A)R减少提示这样的模式，其中受体由患者的抗体从突触移除，导致癫痫发作和癫痫持续状态，后者转而将导致受体进一步减少，从而产生病理性强化作用。这将解释与血清和CSF中高水平GABA(A)R抗体相关的癫痫发作的严重程度和不应性。即便如此，9/12可评估患者对免疫疗法(7)、对症治疗(2)和延长重症监护支持作出部分反应或完全反应。
重要的是前瞻性评估患者以更好地表征高滴度组与低滴度组，以及评估全部患者(包括视性眼阵挛-肌阵挛和僵者综合征那些)的CSF。此外，迅速和更激进的免疫疗法可能导致更好的结局。
总体上，应当在(1)患有与提示炎症过程的MRI和CSF结果相关的病因学不明性严重癫痫发作或癫痫持续状态的患者中、(2)视性眼阵挛-肌阵挛或僵者综合征患者亚群，(3)具有GAD抗体或TPO抗体或提示自身免疫性倾向的其他特征的前述任一者中考虑GABA(A)R抗体的存在。未来的研究应当在患有新发生的病因学不明性癫痫发作或癫痫持续状态和视性眼阵挛-肌阵挛患者当中前瞻性确定GABA(A)R自身免疫性的发生率。此外，合理的是，具有僵者综合征和GABA(A)R抗体的患者可能比针对GAD65(一种胞内蛋白)的抗体的患者对免疫疗法具有更好的反应。我们的研究结果，即患者的抗体从突触特异性消除GABA(A)R，提供有用试剂(纯化的IgG抗体)以确定这些受体的选择性破坏如何导致神经元过度兴奋、癫痫发作、慢性癫痫或视性眼阵挛。
在这种背景下，本发明提供了用于预测、诊断或治疗受试者自身免疫疾病的方法中的GABA(A)R、GABA(A)R片段或其同源物。本发明的同源物包括GABA(A)R的同源物以及本文中提到的GABA(A)R片段或亚基的同源物。在这一方面，可以理解GABA(A)R、GABA(A)R片段或其同源物可以包括源自不同生物的亚基、同源物或蛋白质片段的混合物或更一般地，可以包括同源物和非同源物的混合物。优选地，GABA(A)R、GABA(A)R片段或其同源物包含至少一种人类GABA(A)R亚基、更优选地两种或更多种GABA(A)R亚基。在这一方面，与单个亚基相比，在人组织中GABA(A)R内部相邻位置存在的两个亚基可以由自身抗体更强烈地结合，原因是跨越来自两个亚基的表面的构象表位形成。
此外，本发明提供在预测、诊断或治疗受试者自身免疫疾病的方法中使用的细胞，其特征在于该细胞表达GABA(A)R、GABA(A)R片段或其同源物。本发明的细胞可以构成已经从生物分离但尚未基因修饰的细胞，或已经基因修饰的细胞。优选地，根据本发明使用的细胞是真核细胞。更优选地，细胞是神经源细胞或已经被人工诱导以走向神经命运的细胞，如体细胞或成体干细胞。根据本发明的另一个实施方案，细胞已经通过转染以遗传方式改变，优选地，已经转染细胞以表达或过量表达本发明的GABA(A)R、GABA(A)R片段或其同源物。这种细胞可以构成一种用于检测抗体与GABA(A)R、GABA(A)R片段或其同源物结合的诊断手段，例如通过在细胞表面上呈递GABA(A)R、GABA(A)R片段或其同源物来检测。
根据本发明的实施方案，根据本发明使用的GABA(A)R、GABA(A)R片段或其同源物或根据本发明使用的细胞其特征在于所述GABA(A)R、GABA(A)R片段或其同源物包含根据SEQIDNO:1、SEQIDNO:2和/或SEQIDNO:5的序列。
SEQIDNO:1对应于人类GABA(A)R亚基α1，而SEQIDNO:2对应于人类GABA(A)R亚基β3以及SEQIDNO:5对应于人类GABA(A)R亚基γ2。
在这一方面，根据一个优选实施方案，本发明GABA(A)R、GABA(A)R片段或其同源物包含一个或多个α1亚基、一个或多个β3亚基和/或一个或多个γ2亚基。
在另一个实施方案中，GABA(A)R、GABA(A)R片段或其同源物包含与根据SEQIDNO:1、SEQIDNO:2和/或SEQIDNO:5的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％或至少99％序列同一性的序列。
在又一个实施方案中，本发明涉及GABA(A)R的一个或多个片段，所述片段包含下述序列的至少7、8、9、10、11、12、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、200个或更个连续氨基酸，所述序列是根据SEQIDNO:1、SEQIDNO:2和/或SEQIDNO:5的序列或与根据SEQIDNO:1、SEQIDNO:2和/或SEQIDNO:5的序列具有至少70％％、至少75％、至少80％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98或至少99％序列同一性的序列。
根据本发明的一个优选实施方案，GGABA(A)R、GABA(A)R片段或其同源物包含其他氨基酸，所述其他氨基酸是N末端或C末端连接的并促进GABA-A受体或其片段的纯化。
在GABA(A)R或其同源物的情况下或在GABA(A)R或其同源物的片段由几种多肽、肽或蛋白质组成的情况下，可以将额外的氨基酸添加至构成GABA(A)R、GABA(A)R片段或其同源物的至少一种或直至全部多肽、肽或蛋白质上。如果额外的氨基酸与GABA(A)R、GABA(A)R片段或其同源物中的仅一种多肽、肽或蛋白质连接，则优选所述多肽、肽或蛋白质应当是α1亚基或其片段。然而，还可能将额外的氨基酸添加至通过直接或间接蛋白质-蛋白质相互作用与α1亚基或其片段结合的一个不同多肽、肽或蛋白质。在这一方面，例如当蛋白质复合物在涉及可能影响直接或间接蛋白质-蛋白质相互作用的条件的方法中待使用时，可以优选将GABA(A)R、GABA(A)R片段或其同源物的多肽、肽或蛋白质(包括α1亚基或其片段)彼此交联。用于交联蛋白质的方法是本领域已知的。
这类额外的氨基酸可以例如构成由其他分子、优选地蛋白质、更优选地抗体特异性识别的某些序列或标签。这类标签是本领域广泛已知的并且包括例如flag-标签、myc-标签或链霉亲和素-标签。
根据另一个优选实施方案，本发明的GABA(A)R、GABA(A)R片段或其同源物或细胞与报道分子或固相连接。
类似于上文所述的额外氨基酸，构成GABA(A)R、GABA(A)R片段或其同源物的至少一种或直至全部多肽、肽或蛋白质可以与报道分子或固相连接。如果GABA(A)R、GABA(A)R片段或其同源物中的仅一种多肽、肽或蛋白质与报道分子或固相连接连接，则优选所述多肽、肽或蛋白质应当是α1亚基或其片段。然而，还可能的是，通过直接或间接蛋白质-蛋白质相互作用与α1亚基或其片段结合的一个不同多肽、肽或蛋白质与报道分子或固相连接。也在这一方面，例如当蛋白质复合物在涉及可能影响直接或间接蛋白质-蛋白质相互作用的条件方法中待使用时，可以优选将GABA(A)R、GABA(A)R片段或其同源物的多肽、肽或蛋白质(包括α1亚基或其片段)彼此交联。
本发明的细胞可以与报道分子或固相按照取决于其中表达的GABA(A)R、GABA(A)R片段或其同源物的方式(例如GABA(A)R、GABA(A)R片段或其同源物是否构成包含本文所述的改变之一和/或作为特异性抗体的靶发挥作用的融合分子)连接。此外，本发明的细胞可以例如与其中表达的GABA(A)R、GABA(A)R片段或其同源物无关地连接至报道分子或固相，例如通过与抗体结合或通过化学交联作用连接。
在本发明的范围内，报道分子理解为允许直接或间接检测与之连接的GABA(A)R、GABA(A)R片段或其同源物不存在或存在或与之结合的抗体不存在或存在的分子。许多类型的报道分子是本领域已知的，例如包括放射性标记物，荧光染料或蛋白质(例如荧光素、四甲基罗丹明、绿色荧光蛋白(GFP))、半抗原(例如生物素)或酶(例如α-半乳糖苷酶A、萤光素酶、碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶，适于使用酶可转化染料的检测法)。可以将这类报道分子在蛋白质合成期间(掺入放射性标记的氨基酸、产生融合蛋白)或在蛋白质合成后通过化学偶联添加至靶蛋白。
与本发明相关的固相涉及多肽可以例如通过直接或间接共价结合作用或通过借助氢键和/或亲脂相互作用的亲和结合作用与之连接的任何固态基材。例如，本发明的GABA(A)R、GABA(A)R片段或其同源物可以与微量滴定板的材料、磁珠表面、膜(例如硝酸纤维素或PVDF膜)或与层析柱或薄片的固相连接。
此外，本发明提供与本发明GABA(A)R、GABA(A)R片段或其同源物结合的抗体，其中该抗体是自身抗体和/或用于预测或诊断受试者中自身免疫疾病的方法中。根据一个优选实施方案，本发明的抗体处于分离或固定的形式。
本发明还提供编码本发明GABA(A)R、GABA(A)R片段或其同源物的核酸和载体。
根据本发明的一个优选实施方案，这种核酸或载体的特征在于所述这类包含根据SEQIDNO:3、SEQIDNO:4和/或SEQIDNO:6的序列或其互补序列。
SEQIDNO:3对应于编码人类GABA(A)R亚基α1的ORF，而SEQIDNO:4对应于编码人类GABA(A)R亚基β3的ORF并且SEQIDNO:6对应于编码人类GABA(A)R亚基γ2的ORF。
在另一个实施方案中，本发明的核酸或载体包含与根据SEQIDNO:3、SEQIDNO:4和/或SEQIDNO:6的序列或其互补序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％或至少99％序列同一性的序列。
在又一个实施方案中，本发明涉及包含一个序列的核酸或载体，这个序列具有下述序列的至少7、8、9、10、11、12、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、200个或更个连续碱基或分别地具有下述序列的碱基对，所述序列是根据SEQIDNO:3、SEQIDNO:4和/或SEQIDNO:6的序列或其互补序列或者与根据SEQIDNO:3、SEQIDNO:4和/或SEQIDNO:6的序列或其互补序列具有至少70％％、至少75％、至少80％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98或至少99％序列同一性的序列。
在一个优选实施方案中，调节本发明的载体以表达本发明GABA(A)R、GABA(A)R片段或其同源物。在这一方面，为了表达GABA(A)R、其同源物、由几种多肽或其同源物组成的GABA(A)R片段，可以在单个载体上合并构成GABA(A)R、GABA(A)R片段或其同源物的全部多肽、肽或蛋白质的编码性序列或可以提供一组不同载体，所述载体例如转移入细胞或细胞群体时，可以发挥作用以表达包含全部相应组分的GABA(A)R、GABA(A)R片段或其同源物。当然，还可能在独立的细胞群体中表达GABA(A)R、GABA(A)R片段或其同源物的不同组分。
在这一方面，经遗传修饰以表达或过量表达本发明(A)R、GABA(A)R片段或其同源物的细胞可以包含根据本发明的一种或多种载体(例如一组如上文所述的载体)。这种细胞可以通过本领域已知的方法用来产生载体副本或用来表达本发明的GABA(A)R、GABA(A)R片段或其同源物。在这一方面，优选细胞是真核细胞，更优选地是哺乳动物细胞，甚至更优选地是人细胞，并且，最优选地是人类永生化细胞如HEK细胞。
本发明还提供预测或诊断自身免疫疾病的体外方法，所述方法包括步骤：
a.使来自受试者的包含抗体的液体样品与GABA(A)R、GABA(A)R片段或其同源物或与本发明的细胞接触，或使包含来自受试者的组织样品与本发明的抗体接触，并且
b.检测抗体与GABA(A)R、GABA(A)R片段或其同源物、与细胞或与组织样品的结合作用。
因此，本发明的体外方法涵盖一种方法，其中，在第一步骤中，使来自受试者的包含抗体的液体样品与本发明的GABA(A)R、GABA(A)R片段或其同源物接触，并且在第二步骤中，检测来自液体样品的抗体与ABA(A)R、GABA(A)R片段或其同源物或与本发明细胞(即表达或过量表达ABA(A)R、GABA(A)R片段或其同源物的细胞)的结合。
另外，本发明的体外方法涵盖一种方法，其中，在第一步骤中，使来自受试者的组织样品与本发明的抗体接触，并且在第二步骤中，检测所述抗体与所述组织样品的结合。
根据一个优选实施方案，在上文描述步骤之前的步骤中，提供来自受试者的液体样品或组织样品。
本发明的液体样品可以是任何体液，只要它含有抗体。例如，样品可以是脑脊液(CSF)、血液或血浆、淋巴液、间质液。
本发明的组织样品可以由单个细胞或细胞聚集物构成或者彼此直接或通过胞外基质连接。根据一个优选实施方案，组织样品是神经来源的，例如来自中枢神经系统、外周神经系统或自主神经系统。备选地，组织样品可以是淋巴结组织。
与本发明教导相符的抗体与GABA(A)R、其同源物片段的结合作用可以使用本领域技术人员已知的多种检测方法利用，所述检测方法例如是免疫荧光显微术或光谱法、发光法、NMR光谱法、放射性活度法、化学交联法、表面等离子体共振法、天然凝胶电泳法或酶活性法。尽管这些方法中某些方法允许直接检测复合物，但优选的是，将结合配偶体、优选地抗体或更优选地与抗体结合的第二抗体之一如此标记，从而复合物可以因标记物的固有特性(例如荧光、放射性活度、酶活性、NMR或MRI谱中的可视性等)而特异性检出。在一个优选实施方案中，使用选自蛋白质印迹法、点印迹法、蛋白质微阵列法、ELISA法、细线印迹法、间接免疫荧光显微术的方法，实施诊断或预测。备选地，这些方法中多于一种方法可以按互补方式使用以获得更可靠的结果。
在一个优选实施方案中，与本发明教导相符的预后、诊断、方法或检验试剂盒构思了细线印迹法(lineblot)的应用。本领域技术人员是熟悉现有技术中描述的细线印迹法实验设计。34,35简而言之，一个或多个目的抗原，在本发明情况下，GABA(A)R、其包含一个亚基的至少部分的同源物片段，可以结合至载体(例如硝酸纤维素膜)并且经常与其他抗原和对照组合。硝酸纤维素载体随后暴露于包含抗体的患者样品如稀释的血清。如果样品包含与该抗原结合的抗体，则形成可以检出的复合物，优选地通过与结合于第一抗体恒定区的第二抗体温育检出，所述第二抗体包含可检测标记物，例如放射性同位素、荧光染料，或在优选的实施方案中，融合于或连接至第二抗体的活性酶，如碱性磷酸酶，所述活性酶可以使用生色底物、随后简单视验轻易地确定。合适的试剂、装置和软件包是可商业获得的，例如从德国吕贝克EUROIMMUN可商业获得。
在另一个优选实施方案中，与本发明教导相符的预测、诊断、方法或检验试剂盒构思了间接免疫荧光法的用途。本领域技术人员是熟悉现有技术中描述的这类技术和合适样品的制备。36,37,38简而言之，载体，如用于显微术的盖玻片，用包含抗原(在本发明情况下GABA(A)R，其包含一个亚基的至少部分的同源物片段)的细胞或组织切片包覆。包含抗原的载体暴露于包含抗体的患者样品如稀释的血清。如果样品包含与该抗原结合的抗体，则可以检出产生的复合物，优选地通过与包含荧光染料如荧光素的第二抗体温育，随后使用荧光显微术视验来检出。合适的试剂，装置和软件包是可商业获得的，例如从德国吕贝克EUROIMMUN可商业获得。
另外，在本发明的背景下提供一种检验试剂盒，所述检验试剂盒包含一种或多种GABA(A)R、GABA(A)R片段或其同源物、本发明的细胞和/或抗体。根据一个优选实施方案，检验试剂盒用于检测抗体并且包含处于一种或多种本发明GABA(A)R、GABA(A)R片段或其同源物或细胞形式的抗原。在这一方面，检验试剂盒可以包含例如GABA(A)R的不同单个亚基或可能地包含其免疫原性片段或同源物，或这类化合物的组合。根据一个备选实施方案，本发明的检验试剂盒用于检测来自受试者的样品例如组织样品中的GABA(A)R、GABA(A)R片段或其同源物，并且包含本发明的抗体。当然可以提供可用于检测抗体以及GABA(A)R、GABA(A)R片段或其同源物的检验试剂盒。
此外，本发明提供一种包含本发明GABA(A)R、GABA(A)R片段或其同源物和/或细胞的药物组合物。
除本发明的多肽之外，本发明的药物组合物可以包含一种或多种药物活性物质。此外，本发明的药物组合物可以包含一种或多种药物赋形剂。本发明的药物组合物根据特别可用于结合/吸附来自受试者血液或血浆的不同类别(IgA、IgG)的抗体并且尤其用于体外治疗自身免疫疾病。例如，所述药物组合物可以用于免疫血浆取出法中。在这一方面，本发明还提供用本发明GABA(A)R、GABA(A)R片段或其同源物或药物组合物包覆的医用装置。例如，所述医用装置可以是这样的装置，所述装置在常规血浆交换或免疫血浆取出法中使用并且包含接触待治疗受试者的血液或血浆的表面。
此外，本发明提供一种用本发明GABA(A)R、GABA(A)R片段或其同源物、用本发明细胞和/或用本发明药物组合物包覆的医用或诊断装置。
这种医用或诊断装置可以是可以使其与来自受试者的液体样品或组织样品接触的装置，如显微镜载玻片、盖玻片、磁珠或其他载体，微量滴定板或在其中培养细胞的装置，例如皮式培养皿或培养板。根据另一个实施方案，这种装置可以是在血浆去除术或免疫血浆取出法中使用的装置，所述装置与接触患者的血浆以结合并提取自身抗体。合适的诊断装置如生物芯片、ELISA用微量平板、细线印迹物或包覆珠是可商业获得的，例如从德国吕贝克EUROIMMUN可商业获得。
另外，本发明还提供一种用于治疗受试者中自身免疫疾病的方法，所述方法包括步骤
a.使来自受试者的包含抗体的液体样品经历本发明的体外诊断方法，并且
b.用至少一种合适的药用物质和/或血浆交换治疗受试者。
本发明的合适药用物质可以包括调节、尤其抑制受试者免疫系统或其特定部分的物质。根据本发明的一个优选实施方案，合适的药用物质可以是如选自利妥昔单抗、泼尼松、甲泼尼龙、环磷酰胺、吗替麦考酚酯、静脉用免疫球蛋白、他克莫司、环孢菌素、甲氨蝶呤和硫唑嘌呤的免疫抑制药物。
除施用免疫抑制剂之外，患者也可以用合适的药用物质治疗，所述药用物质用于治疗与待治疗的自身免疫疾病有关或由其引起的症状和病状。根据一个优选实施方案，上文所提及的步骤b因此还包括施用其他化合物如抗癫痫药物。这类抗癫痫药物可以选自氯硝西泮、苯妥英、拉莫三嗪、苯巴比妥、丙戊酸、左乙拉西坦、卡马西平、噻加宾、非尔氨酯、普瑞巴林、扑米酮和加巴喷丁。
根据又一个优选的实施方案，免疫抑制剂和抗癫痫药物可以向患者同时或依次施用。
另外，本发明提供一种用于治疗受试者中自身免疫疾病的方法，所述方法包括步骤
a.从受试者取得血液或血浆，
b.使血液或血浆与本发明的药物组合物或医用装置接触以移除疾病相关的抗体，并且
c.再施用血液或血浆至受试者。
在这种方法(例如免疫血浆取出法)中，通过使血液或血浆与本发明的固定化GABA(A)R、GABA(A)R片段或其同源物接触，从受试者的血浆移除疾病相关的抗体。已经例如描述了根据β-肾上腺素能药受体的序列治疗扩张性心肌病的相应方法。39
根据一个优选实施方案，免疫血浆取出法可以联用其他治疗模式，例如施用免疫抑制性化合物或用于治疗与本文所述的自身免疫疾病相关的症状的化合物。
本发明还提供一种用于分离与GABA(A)R、GABA(A)R片段或其同源物结合的抗体的方法，所述方法包括步骤
a.使包含与GABA(A)R、GABA(A)R片段或其同源物结合的抗体的样品与根据权利要求1、3或4中任一项所述的GABA(A)R、GABA(A)R片段或其同源物或根据权利要求2至4中任一项所述的细胞接触，
b.分离包含GABA(A)R、GABA(A)R片段或其同源物和抗体的复合物，
c.解离步骤c中分离的复合物，并且
d.将抗体与GABA(A)R、GABA(A)R片段或其同源物或细胞分离。
根据一个优选实施方案，步骤A之前是又一个步骤：提供包含与GABA(A)R、GABA(A)R片段或其同源物结合的抗体(例如本发明抗体)的样品。这种样品可以例如是如上文中提到的液体样品，或例如是来自组织样品或细胞培养物的上清液。
根据本发明的一个优选实施方案，自身免疫疾病是神经系统的自身免疫疾病，优选地自身免疫脑炎。备选地，本发明涉及外周神经系统或自主神经系统的自身免疫疾病。
附图说明
图1:患者#1中的MRI结果
在入院第3日，这位患者的MRI显示涉及左侧颞叶矢状窦旁区和额叶矢状窦旁区(A、E)的FLAIR/T2信号升高的多个皮质-皮质下异常。在第10日，重复的MRI显示颞区病灶的大小增加和左额叶中新的皮质病灶(B、F)。在第22和第48日的重复MRI未显示明显变化(未显示)。疾病发作后4个月获得的另一次MRI显示多个新多灶性异常，连同弥散性萎缩和脑室尺寸增加(C、G)。2个月后、症状发作后6个月的重复MRI显示异常得以明显改善和消退以及脑室扩张改善(D、H)。
图2：索引患者#2中的MRI结果
在入院第2日，这位患者的MRI显示多个FLAIR/T2信号异常区域，这些区域主要涉及皮层区域(A-C)、无水肿、占位效应或对比度增强(未显示)，但灰色-白质交界模糊。在第14日，重复的MRI显示涉及皮质-皮质下的间距增加，伴右颞叶内水肿(D-F)。后续的MRI显示这些异常明显加重，现在广泛涉及皮质区域和皮质下区域(G-I)。
图3：具有脑炎和GABA(A)R抗体的患者中广泛化周期性放电
A中的记录对应于患者#1入院后一个月获得的EEG；注意存在广泛化癫痫样放电。B中的记录对应于患者#2；这位患者起初在右颞叶中显示癫痫样活动，在后续记录中伴随广泛化倾向性，如B中所显示。
图4：具有GABA(A)R抗体的患者的CSF与大鼠脑的反应性
该患者的CSF显示皮质区域和皮质下区域的神经毯的广泛性和弥散性免疫染色(A)。神经毯反应性的这种样式提示存在针对神经元细胞表面抗原的抗体，这在活大鼠海马神经元的培养物中得到证实(B)。小图C和D显示使用无GABA(A)R抗体的对照个体的CSF的相似研究。在B和D中，神经元的胞核用DAPI复染。比例尺在C中是2mm并且在D中是20微米。
图5：以高放大率所示的患者CSF与大鼠海马和小脑的反应性
小图A和B显示患者CSF(1:4)与大鼠海马和小脑的反应性。小图C显示对照CSF缺少反应性。比例尺为500微米。
图6：患者血清与表达GABA(A)R的活HEK细胞的反应性
表达人类GABA(A)Rα1亚基和β3亚基的活HEK细胞与患者血清和抗α1亚基的单克隆抗体的反应性(B)。C中显示合并的反应性。(D-F)中显示采用来自正常个体的血清的相似测定法。在C和F中用DAPI显示细胞的胞核。注意患者抗体与表达GABA(A)R的细胞的特异反应性和与商业抗体的反应性的良好共定位。比例尺为20微米。
图7：血清抗体脑和神经元反应性的GABA(A)R免疫吸附
小图A和C显示用未转染的HEK细胞免疫吸附后患者血清的反应性。小图B和D显示在已经用表达GABA(A)R的HEK细胞免疫吸附血清后，这种反应性消除。A和C中的比例尺是500微米，B和D中的比例尺是20微米。
图8：免疫竞争研究显示患者的抗体识别相同的GABA(A)R表位
来自具有GABA(A)R抗体的患者的生物素酰化IgG与大鼠脑的反应性，其中所述组织已经与来自正常个体(A和B)的血清、来自其IgG已经生物素酰化的相同患者的血清(C、D)和另一位具有GABA(A)R抗体的患者的血清预温育。注意小图E和F中与A和B相比反应性大幅度下降(竞争相同的GABA(A)R表位)。小图C和D(与相同患者的血清竞争起到显示背景反应性的作用)。A、C、E的比例尺为1mm；B、D和E的比例尺为200微米。
图9：患者的抗体选择性结合GABA(A)R并且改变GABA(A)R在活神经元中的定位
A)将14体外日(div)的活神经元用含有GABA(A)R抗体的患者CSF着染(绿色，右小图，最上方图像)，随后固定和用商业GABA(A)R抗体(红色，右小图，中部图像)着染。B)对患者CSF抗体和商业GABA(A)R抗体之间共定位的定量显示89±3％由患者抗体标记的受体用针对GABA(A)R的商业抗体共标记，并且11±3％由患者抗体标记的受体未以这种抗体标记。C)将14体外日的神经元与患者的CSF温育48小时并且随后针对突触后GABA(A)R(绿色，左小图)和突触前vGAT(红色，右小图，与来自左小图的叠加信号)染色。用患者的CSF处理后，突触GABA(A)R(对照条件下显示为黄色点)大大减少。
D)沿患者CSF处理的神经元树突的GABA(A)R簇集物数目与对照CSF处理的神经元并无不同(Mann-Whitney检验，p＝0.6)。E)与之相反，与对照CSF处理的神经元相比，患者CSF处理的神经元中，定位于突触内的GABA(A)R的数目显著地减少(与作为100％的对照相比，40％±0.3，Mann-Whitney检验，p<0.0001)。F)与对照CSF的影响相比时，患者CSF不影响vGAT(突触前)共标记的桥连蛋白(突触后)沿树突的簇集物(Mann-Whitney检验，p＝0.5)。
实施例
实施例1:患者
从2012年8月至2013年2月，前瞻性鉴定具有脑炎、难治性癫痫发作和下述CSF的两位患者，所述CSF显示与大鼠脑的神经毯的细胞表面蛋白相似的的反应性样式(索引患者1和2)。临床现象的严重程度和未知的抗原身份促使我们分离并且表征它以及回顾性评审具有相似特征的患者的临床信息和免疫信息。
从2006年4月至2013年4月，在宾夕法尼亚大学医院神经科或巴塞罗那大学医院门诊部神经服务中心(现在是，神经免疫学中心，Institutd’lnvestigacionsBiomediquesAugustPiiSunyer[IDIBAPS])研究了1134位患有疑似为自身免疫性的脑炎和癫痫发作的患者的血清和CSF。
在1134位患者中，356位(44％)具有与已知的细胞表面/突触抗原反应的血清抗体或CSF抗体，并且140位患者三重地具有三重性脑炎、癫痫发作和针对大鼠脑的神经毯的未知抗原的抗体。对这些患者的血清和CSF再检验与索引病例的那些特征具有相似特征的抗体反应性。此外，类似地检验30位正常个体(血液供体)的血清和217位患有各异疾病的患者的血清或CSF，这些患者包括65位具有针对谷氨酸脱羧酶65(GAD65)的抗体的患者、25位具有NMDAR抗体的患者、21位具有GABA(B)R抗体的患者、23位视性眼阵挛-肌阵挛患者、12位具有LGI1抗体的患者、12位具有Hu抗体的患者、9位单纯疱疹病毒后脑炎患者、30位多发性硬化患者和20位非炎性退行性疾病患者。
研究由宾夕法尼亚大学和巴塞罗那大学的机构审查委员会批准。
a)索引病例1
这位16岁女孩因4天重度疲乏和头痛史伴随眩晕、恶心和闪光性暗点而前往医院。她主诉几个月来记忆困难、认知功能障碍、焦虑、情感低落和疲乏。其既往病史因自10个月前完成化疗和辐射依赖处于消退状态的霍奇金淋巴瘤而引人注目。在入院第五日，她出现全身性强直阵挛癫痫发作并快速进展成出现频繁癫痫发作。全血细胞计数、C反应蛋白和红细胞沉降率正常。抗甲状腺过氧化物酶、抗甲状腺球蛋白、抗核抗体、抗嗜中性粒细胞胞浆抗体和副肿瘤抗体(Hu、Ri、Yo、CRMP5、双载蛋白(amphiphysin)检验为阴性。脑MRI在第3日展示两侧半球内T2/FLAIR信号升高的多个病灶(图1A、E)。CSF分析未显示开放压力，23个白细胞(WBC)/mm3(69％淋巴细胞)、正常细胞学和蛋白质浓度及葡萄糖浓度。单纯疱疹病毒、肠病毒和肺炎支原体(Mycoplasmapneumoniae)的革兰氏染色、常规培养物和PCR检验呈阴性。巨细胞病毒、Epstein-Barr病毒、虫媒病毒、汉氏巴尔通体(Bartonellahenselae)和莱姆病的血清学呈阴性。
在第7日启动大剂量甲泼尼龙治疗。需要极高剂量的苯巴比妥以抑制脑电图癫痫发作。按日交替的后续血浆去除术疗程1周未能改善癫痫发作样式。在第10日，重复脑MRI显示FLAIR/T2异常的规模增加，主要地在左颞叶中，及两侧大脑半球内新的多灶性皮质病变和皮质下病变(图1B、F)。在第14日脑活组织检查展示遍及皮层的强烈弥散性反应性星形神经胶质增生伴随小胶质细胞活化和反应性T淋巴细胞群体。几天后，在她的CSF中鉴定到针对神经元细胞表面抗原的抗体。她接受大剂量皮质类固醇、静脉用免疫球蛋白、利妥昔单抗和环磷酰胺。苯巴比妥昏迷持续四个月，在此期间如果允许苯巴比妥水平降低，则出现突破性癫痫发作。EEG记录展示在入院首月稍后广泛化周期性放电(图3，A)。
在三个月后，EEG显示更多局灶性右侧癫痫样放电。苯巴比妥剂量撤除并且她开始缓慢的神经系统恢复，脑病EEG样式逐步消退。入院后4个月，重复腰椎穿刺显示白细胞增多症消退；然而，重复MRI显示多个新的多灶性病变遍布脑，伴随弥散性萎缩和中度脑室外扩张(图1C、G)。在初始就医后6个月，她开始显示更快的神经系统恢复。复查MRI展示无新的病变、全部先病变均改善或消退及先前所见的弥散性萎缩减少(图1D，H)。就医后7个月，将她转移至住院患者康复设施并且在后续三个月期间获得显著好转至如此程度，从而她能够交流、自行饮食、穿衣和梳洗。她能够在最低辅助情况下短距离行走。在她首次就医后10个月，她出院回家，能够独立进行大部分日常生活活动。
b)索引病例2
一位51岁男子因行为变化和新发作性精神病的快速进展性症状而入院。入院前，该患者在另一家医院的急诊科中就诊数次，在那里，诊断他患有新发作性抑郁并用舍曲林和阿普唑仑治疗。此外，他主诉全身性搔痒症并且出现加重的高血压。在几个场合，家人听到该患者声称要杀死他人和自己。入院前数天，他拒绝起床，并且变得淡漠，语音发声几乎完全减少。其既往病史就高血压、糖尿病、高胆固醇血症、卒中(他已经从中完全恢复)和数年前以脾切除术和类固醇治疗的血栓性血小板减少性紫癜而言有意义。
入院时，临床现象类似于无动性缄默症，伴以患者自发说出数个不连续句子的短暂时间。入院当日，记录他出现涉及面部左侧和左臂的阵挛型发作，这种阵挛型发作用静脉用地西泮和左乙拉西坦消退。接下来24小时，他出现因肺炎所致的急性呼吸衰竭，需要插管和入住重症监护室。两天后，他出现癫痫持续状态，特征在于面部左侧和左臂阵挛型运动，与抵抗全部治疗(包括左乙拉西坦、拉考沙胺和苯妥英)的左向连续扫视性眼运动相关。依次使用咪达唑仑、丙泊酚、和硫喷妥(thiopental)，维持该患者处于药理学昏迷。癫痫发作持续直至该患者在就医后10周死亡。
初始EEG显示右颞叶中的癫痫样活动伴广泛化倾向性，这种倾向性在后续记录中进展成样式广泛化周期性波浪活动(图3，B)。MRI显示多个FLAIR/T2信号升高异常，在无占位效应或对比增强情况下广泛涉及皮层，致使灰质-白质交界模糊(图2A-C)。初始CSF检查为正常，但是几日后重复CSF分析显示IgG和IgM寡克隆条带，无匹配性血清条带。以下检验为阴性：1)梅毒、乙型和丙型肝炎病毒、马尔他布氏杆菌(Brucellamelitensis)、伯氏包柔氏螺旋体(Borreliaburgdorferi)、刚地弓形虫(Toxoplasmagondii)、肺炎链球菌属(Streptococcuspneumonia)和嗜肺军团菌(Legionellapneumophila)的血液感染性疾病检查；2)细菌性和真菌性感染、单纯疱疹病毒1和2；人疱疹病毒6、巨细胞病毒、水痘带状疱疹病毒、JC病毒和肠病毒的CSF检查、3)副肿瘤性抗体组、和风湿病/结缔组织病(DNAdc、Sm、Rib-P、PCNA、Ul-RNP、SS-A/Ro、SS-B/La、Scl-70、CENP-B、RNAPolIII、Jo-1、Mi-2、PM-Scl和ANCA的抗体)、补体水平、4)血清蛋白电泳、5)肿瘤标记：CEA、AFP、Ca19.9、PSA和B-2-微球蛋白。发现该患者具有低水平的甲状腺过氧化物酶抗体(156IU/ml)和甲状腺球蛋白抗体(158IU/ml)。
在排除感染性病因学后，对该患者启用皮质类固醇和IVIG，无显著效果。1周后，他接受5次血浆交换治疗，无临床效果且MRI无变化(图2D-F)。截止此时，实验室检查揭示针对神经元细胞表面的血清和CSF抗体，并且对他启用环磷酰胺(1g/m2/月)和利妥昔单抗(每2周1g)。尽管给予这些治疗，该患者仍未显示临床或放射学改善和持续纯在脑电癫痫持续状态。重复MRI显示新的FFAIR/T2异常，弥散性涉及皮层(图2G-I)，并且该患者入院后两个月死亡。
c)结果
其血清用于免疫沉淀法的6名患者(包括两个索引病例)和其血清用于免疫竞争研究的4个额外病例导致GABA(A)R初步表征为病症的自体抗原(下文描述)。血清和CSF与大鼠脑的神经毯显示相似反应性(免疫竞争研究中分别阻断其余者的反应性)的全部6位患者(5男性；年龄范围3-63岁，中位数22岁)均形成一种快速进展性脑病，这种脑病最终在全部患者中导致难治性癫痫发作，并在5名患者中导致癫痫持续状态和/或持续性部分性癫痫(表1)。在全部患者中，癫痫症状前是行为或认知变化或与之相关；另外，一些患者出现意识模糊、运动失调、精神病症状、言语功能障碍或局灶性运动缺陷。一名最年轻的患者(男性3岁)具有额外的GABA(B)R抗体；除了癫痫发作外，他还出现意识模糊、视性眼阵挛、共济失调和舞蹈症。五位患者具有异常的CSF，包括轻度脑脊液细胞异常增多(中位75WBC/微升，范围23-154)、蛋白质浓度升高(中位数60，范围59-60mg/dl)和/或寡克隆条带。全部六位患者均具有异常的脑MRI，频繁显示广泛性FLAIR/T2异常，在无对比增强情况下伴多灶性或弥散性皮质累及(图1和图2)；一位患者还具有基底神经节累及。在全部患者中，EEG均显示癫痫活动；其中两者出现定期广泛化放电(图3)。除GABA(A)R抗体之外，3位患者具有甲状腺过氧化物酶(TPO)抗体，1位患者具有谷氨酸的酸脱羧酶65(GAD65)抗体，并且2位患者具有GABA(B)R抗体(见下文)。提示自身免疫性或免疫失调倾向性的其他结果包括一位患者中霍奇金淋巴瘤既往史和另一位患者中特发性血小板减少性紫癜既往史。
全部6位患者中中治疗和随访均可评估：1名儿童在无免疫疗法情况下接受左乙拉西坦并且基本上恢复(长期随访情况不可获得)。其他5位接收免疫疗法和多种抗癫痫药，其中4位需要药理学所致昏迷。这些患者中三位出现完全恢复或部分恢复，并且2位因癫痫持续状态而住院期间的败血症而死亡。这些患者中1位是具有上文所示共存性GABA(B)R抗体的儿童(GABA(A)R抗体在其死亡后在归档的血清和CSF样品中鉴定；前述临床细节和病理学细节18)。这个系列的最年长患者(63岁)也具有GABA(B)R抗体；他从严重GABA(A)相关的和GABA(B)相关的脑病完全恢复，并且7年后出现复视及偏侧共济失调伴GAD抗体，他也从该疾病完全恢复。
除6位患者具有高血清和CSF滴度的GABA(A)R抗体之外，12位患者在血清中具有低抗体滴度。这些患者中三位具有阴性CSF抗体检查结果并且未从其他9位患者获得CSF。在这12位患者中，GABA(A)R抗体的存在仅可以用活CBA(表达GABA(A)R的α1/β3亚基的HEK细胞)展示；用大鼠脑切片未检出GABA(A)R相关的反应性并且仅样品7-13显示与培养的神经元有轻度反应性。表3中显示临床的信息。简言之，全部6位脑炎患者均具有癫痫发作，它们中出现难治性癫痫持续状态的一位患者(病例#7；2岁男性)需要药理学所致昏迷。其他6位患者当中，2位出现视性眼阵挛-肌阵挛，并且4位出现僵者综合征。
总体上，12位患者中有6位具有除GABA(A)R抗体之外的其他神经元抗体：5位具有GAD抗体和1位具有NMDAR抗体。提示自身免疫性或免疫失调倾向性的额外研究结果包括1位患者中的TPO抗体、2位患者中的I型糖尿病和1位患者中的桥本甲状腺炎。
可评估6位患者中的治疗和随访情况。在5/6位患者中使用免疫疗法：1位患者已经完全恢复，3位患者部分恢复并且1位患者死亡。未接受免疫疗法的患者患有以氯巴占和巴氯芬对症控制的僵者综合征。
实施例2：大鼠脑的免疫组织化学
处死成年雌性Wistar大鼠，不进行灌流，将脑取出并通过在4℃浸没于4％多聚甲醛中1小时进行固定，在40％蔗糖中冷冻保护48小时，包埋于冷冻复合介质中并在用液氮致冷的异戊烷中急冻。7微米厚的组织切片随后依次与0.3％H2O2温育15分钟，与5％山羊血清温育1小时，并且与患者血清或对照血清(1:200)、CSF(1:5)在4℃温育过夜。
在使用适宜生物素酰化第二抗体(山羊抗人BA-3000，稀释1:2000)后，如报道那样，将反应性用抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶方法显色。1
实施例3：神经元培养物上的免疫细胞化学
如报道那样制备大鼠海马神经元培养物。5将盖玻片上培育的活神经元在37℃与患者血清或对照血清(最终稀释度1:200)或CSF(1:10)温育1小时。在移除培养基并用磷酸盐缓冲盐水(PBS)充分洗涤后，将神经元用4％多聚甲醛固定，用0.1％TritonX-100透化，并且用AlexaFluor488山羊抗人IgG(稀释度1:1000，Invitrogen，A11013)免疫标记。在荧光显微镜下使用ZeissAxiovision软件(Zeiss，Thomwood，NY)，将结果照相。
实施例4：HEK293细胞上的免疫细胞化学
a)固定的细胞
将HEK293细胞用含有GABA(A)R人类α1亚基(登录号：NM000806.3；Origene目录号：SC119668；SEQIDNO:1)或受体的人类β3亚基(登录号：NM_000814.3；Origene目录号：SC125324；SEQIDNO:2)的质粒转染；细胞用作为对照使用的无插入物的质粒转染。在评定前转染后，将细胞培育24小时。将转染的细胞在4％多聚甲醛中固定，用0.3％TritonX-100透化并且随后在室温与患者血清(1:20和更高连稀释度的续稀释物)或CSF(1:5和更高稀释度的连续稀释物)连同商业小鼠抗GABA(A)Rα1亚基抗体(稀释度1:5000，Millipore，MAB339)或商业小鼠抗GABA(A)Rβ3亚基抗体(稀释度1:5000，AbeamAB4046)温育2小时，并随后与相应的荧光第二抗体(AlexaFluor488山羊抗人IgG，A11013，稀释度1:1000；和AlexaFluor594山羊抗小鼠IgG，A11032，稀释度1:1000；二者均来自Invitrogen)温育。在荧光显微镜下使用ZeissAxiovision软件，将结果照相。
b)活细胞
将活HEK细胞与患者的血清(1:20和稀释度更高的连续稀释物)或CSF(1:5和稀释度更高的连续稀释物)连同上文所示的相同GABA(A)R商业抗体在37℃温育1小时，洗涤，用4％多聚甲醛固定5分钟。在洗涤后，细胞随后与上文所示的相应AlexaFluor第二抗体温育。
实施例5：免疫沉淀法和免疫印迹
将如上获得的活神经元在100mm平板中培育(密度1.5x106个神经元/平板)，并且在37℃与过滤的患者血清(稀释度1:200)温育1小时。随后，将神经元用PBS洗涤，用含有蛋白酶抑制剂(P8340；SigmaLabs)的缓冲液(NaCl150mM，EDTA1mM，三(羟甲基)氨基甲烷[Tris]-HCl100mM，脱氧胆酸0.5％，1％TritonX-100，pH7.5)裂解并且在4℃以16.1x103g离心20分钟。将上清液留下并且与蛋白A/G琼脂糖珠(20423；Pierce,Rockford,IL)在4℃温育过夜，离心，随后，将含有珠连同与靶细胞表面抗原结合的患者抗体的沉淀物用裂解缓冲液洗涤，等分，并保存在-80℃。将这种沉淀物的等分试样重悬于Laemmli缓冲液中，煮沸5分钟，以4％至15％十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，并且蛋白质用EZBlue凝胶染液(G1041；SigmaLabs)可视化。由于患者样品和对照样品的EZBlue可视条带之间缺少差异，使用质谱法分析沿凝胶分开的全部沉淀的蛋白质。
实施例6：质谱法
在宾夕法尼亚大学Abramson癌症中心的蛋白质组学设施进行质谱法。将蛋白质条带胰蛋白酶消化并用纳米液相色谱(纳米LC)/纳米喷雾/线性离子阱(LTQ)质谱仪(ThermoElectronCorporation,SanJose,CA)如报道那样分析。27简而言之，将3ml胰蛋白酶消化的样品用来自Eksigent(Dublin,CA)的自动进样器进样。使用来自Eksigent的纳米LC以200ml/分钟流量，45分钟梯度，在10cmC18柱上分离消化的样品。在线纳米喷雾法用来将分离的肽喷至LTQ中，并且利用Xcalibur软件(ThermoScientific,Waltham,MA)获得原始数据。使用Mascot(MatrixScience,Boston,MA)对NCBI和Swissprot数据库(瑞士生物信息研究所(巴赛尔，瑞士)检索原始数据文件。
实施例7：免疫吸附研究和免疫竞争研究
为了确定患者抗体的脑反应性是否特异地归因于GABA(A)R结合作用，将表达GABA(A)的HEK293细胞的六块60mm平板依次与患者的血清(1:200)温育，每块平板在37℃1小时。与六块平板温育后，免疫吸附的血清如上文那样与大鼠海马切片温育。用未转染的HEK293细胞吸附的患者血清充当对照。
为了确定患者的抗体是否针对GABA(A)R的相似抗原和表位，开展免疫竞争研究。如报道(参考文献)那样，使用蛋白A和G琼脂糖珠，将IgG从其血清含有高水平针对GABA(A)R的IgG抗体的患者分离，并且随后洗脱并用生物素标记。随后，将大鼠脑切片与其他的患者血清或对照血清(1:5稀释)在4℃温育过夜，在PBS中洗涤并且随后在室温与所示的人生物素酰化含有IgG的GABA(A)R抗体(稀释度1:40)温育1小时，并且使用抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶方法，将反应性显色。当组织与一种血清的预温育消除另一种患者IgG的反应性时，认为两种血清竞争相同的GABA(A)R表位。
实施例8：通过患者抗体定量分析神经元GABA(A)R免疫标记
为了确定GABA(A)R被患者抗体免疫标记的程度，将14体外日(div)的大鼠海马神经元与代表性患者CSF(稀释度1:20)温育30分钟，随后洗涤，固定，并且与针对β2/3亚基(其为大部分GABA(A)R的亚基30)中所含序列的商业小鼠单克隆抗体(Millipore05-474；1:500)温育，随后与适宜的荧光缀合的第二抗体AlexaFluor488山羊抗人IgG(A11013；稀释度1:200)和AlexaFluor594驴抗小鼠IgG(A21203；稀释度1:200，二者均来自Invitrogen)温育。用激光扫描共聚焦显微镜(LeicaTCSSP5)获得图像。在每个实验中调整激光水平和检测器增益及偏置，从而在任何处理条件下无像素值被饱和。对图像设定阈值，并且使用交互式软件(ImageJ)确定沿神经元树突的独立簇集物数目。
实施例9：分析患者抗体对GABA(A)R簇集物的结构性影响
为了确定患者抗体对GABA(A)R簇集物数目和定位的影响，将14体外日的大鼠海马神经元用患者CSF或对照CSF(在Neuro-Basal+B27培养基中1:20稀释；GIBCO,Carlsbad,CA)处理2日。每日，从每个培养孔内的300微升培养基取出20微升并更换为20微升新鲜患者CSF或对照CSF。在16体外日，将神经元在新鲜制备的多聚甲醛(磷酸盐缓冲盐水中4％多聚甲醛、4％蔗糖)中固定5分钟，在0.25％TritonX-100中透化10分钟，并且在5％正常山羊血清中封闭1小时。神经元随后与所示的抗GABA(A)Rβ2/3单克隆抗体(稀释度1:500)、或小鼠抗桥连蛋白单克隆抗体(稀释度1:200，SynapticSystems，147011)、或豚鼠抗囊泡GABA转运蛋白多克隆抗体(VGAT，稀释度1:1000；SynapticSystems，131004)或兔抗GluNl抗体(抗NMDAR1，稀释度1:100；Millipore，AB9864R)温育2小时，随后与适宜的荧光缀合第二抗体(AlexaFluor488山羊抗小鼠IgG，A-11001，稀释度1:200；AlexaFluor594山羊抗豚鼠IgG，A-11076，稀释度1:200；Cy5驴抗兔IgG，稀释度1:200，JacksonImmunoResearch711-175-152)温育。获得图像并如上文分析。
实施例10：鉴定靶抗原为GABA(A)R
使用大鼠脑免疫组织化学，两位索引患者和4位额外患者的血清和CSF产生相似的神经毯反应性样式(图4，A；图5)。采用活啮齿类海马神经元培养物的后续研究展示靶抗原在细胞表面上(图4，B)。使用患者血清免疫沉淀靶抗原，随后蛋白质电泳分离和EZBlue凝胶染色，与对照血清相比，没有产生任何特异性条带(数据未显示)。全部所分离蛋白质的质谱法显示，患者血清，而非对照血清，沉淀出含有GABA(A)R的三种序列的蛋白质片段(β3亚基；表2)。
实施例11：患者的抗体识别HEK细胞上表达的GABA(A)R亚基(基于细胞的测定法)
因为β3亚基与GABA(A)Rα1亚基形成复合体，所以我们检验患者抗体与人类α1亚基或β3亚基或二者组合转染的HEK细胞的反应性。这些实验显示，全部患者血清或CSF均识别α1/β3亚基的共表达，但是当单独评估亚基时，4份患者样品识别α1亚基和β3亚基，1份患者样品仅识别α1亚基，并且另一份患者样品需要α1/β3的共表达。出于这个原因，两种亚基的共表达用于确定滴度(表1)。为了优化CBA，使用活的或固定并透化的表达GABA(A)R的α1/β3亚基的HEK细胞(活-CBA或固定的-CBA)，我们比较了测定法的灵敏度。这些研究显示，全部患者CSF抗体均可用活CBA或固定的CBA检出，但是血清抗体优势地随活CBA可见(图6)。
用表达GABA(A)Rα1/β3亚基的HEK细胞免疫吸附代表性血清(其与其他5种患者抗体竞争相同的脑表位)导致消除与大鼠脑和神经元培养物的反应性，从而进一步证实这种反应性是与GABA(A)R的反应性(图7)。
实施例12：鉴定两个患者免疫组
使用所示的活CBA，鉴定到12位具有GABA(A)R亚基抗体的额外患者。在这12位患者中，使用样品连续稀释物时，血清抗体滴度总是<1:160；可从这些患者中的3位患者(病例#7、12和18)获得CSF并且全部为阴性；不可从其他9位患者获得CSF。上文讨论并且表3中显示了这些患者的总结情况。简言之，5位患者出现脑炎伴明显癫痫发作(一位难治性癫痫持续状态患者需要药理所致昏迷)，1位患者出现抗NMDAR脑炎、2位患者出现视性眼阵挛-肌阵挛，并且4位患者出现僵者综合征(其中2者与GAD抗体相关)。
总体，这些实验揭示出两个患者免疫组，(1)在血清(>1:160)和CSF中具有高滴度抗体的上述6位患者，和(2)血清中具有低滴度抗体和/或CSF中不存在抗体的12位患者。尽管用三项技术(对大鼠脑、培养的神经元和CBA的免疫组织化学)展示了第一组患者中的抗体，第二组患者中的抗体仅用活CBA(全部病例)和培养的活神经元(病例#7-13)可检出。
实施例13：患者的抗体选择性地与神经元GABA(A)R结合并且从突触移除受体
以下研究用其脑反应性仅对GABA(A)R抗体特异的代表性患者的CSF进行。通过用表达GABA(A)R的HEK细胞预吸附(与图7相似)和通过采用来自具有高滴度抗体的其他5位患者的抗体的免疫竞争测定法，消除这种反应性，从而表明全部患者的抗体均靶向相同的表位(图8)。为了检验GABA(A)R被患者CSF抗体识别的程度，通过共聚焦显微术定量GABA(A)R免疫标记过程(图9A)。这些结果表明89％的患者抗体标记含有GABA(A)R的簇集物(图9B)。为了检验患者抗体对含有GABA(A)R的抑制性突触的影响，将神经元用患者CSF抗体或对照CSF处理48小时。这些研究显示，GABA(A)R簇集物沿树突的密度未显著地降低(图9C，左小图，绿色点，图9D)，但是突触中的GABA(A)R簇集物(计量为突触前标志物vGAT共标记的点密度)大幅度减少(图9C，右小图黄色点，作为绿色点和红色点之间的重叠，图9E)。这项研究结果表明，存在于患者CSF中、但不存在于对照CSF中的抗体从突触部位移除GABA(A)R。这种影响对GABA(A)R特异的，因为其他突触标志物如桥连蛋白(图9F)和NMDAR的GluNl亚基(数据未显示)的簇集物密度不受影响。
参考文献列表
1.AncesBM,VitalianiR,TaylorRA,LiebeskindDS,VoloschinA,HoughtonDJ,GalettaSL,DichterM,AlaviA,RosenfeldMR,DalmauJ.Treatment-responsivelimbicencephalitisidentifiedbyneuropilantibodies:MRIandPETcorrelates.Brain2005；128:1764-1777.
2.AndradeDM,TaiP,DalmauJ,WennbergR.Tonicseizures:adiagnosticclueofanti-LGIlencephalitis？Neurology2011；76:1355-1357.
3.BayreutherC,BourgV,DellamonicaJ,BorgM,BernardinG,ThomasP.Complexpartialstatusepilepticusrevealinganti-NMDAreceptorencephalitis.EpilepticDisord2009；11:261-265.
4.BlancF,RuppertE,KleitzC,ValentiMP,CretinB,HumbelRL,HonnoratJ,NamerIJ,HirschE,ManningL,deSezeJ.Acutelimbicencephalitisandglutamicaciddecarboxylaseantibodies:areality？JNeurolSci2009；287:69-71.
5.BuchhalterJR,DichterMA.Electrophysiologicalcomparisonofpyramidalandstellatenonpyramidalneuronsindissociatedcellcultureofrathippocampus.BrainResBull1991；26:333-338.
6.DalmauJ.Statusepilepticusduetoparaneoplasticandnonparaneoplasticencephalitides.Epilepsia2009；50Suppl12:58-60.
7.DalmauJ,GleichmanAJ,HughesEG,RossiJE,PengX,LaiM,DessainSK,RosenfeldMR,Balice-GordonR,LynchDR.Anti-NMDA-receptorencephalitis:caseseriesandanalysisoftheeffectsofantibodies.LancetNeurol2008；7:1091-1098.
8.FloranceNR,DavisRL,LamC,SzperkaC,ZhouL,AhmadS,CampenCJ,MossH,PeterN,GleichmanAJ,GlaserCA,LynchDR,RosenfeldMR,DalmauJ.Anti-N-methyl-D-aspartatereceptor(NMDAR)encephalitisinchildrenandadolescents.AnnNeurol2009；66:11-18.
9.GlaserCA,HonarmandS,AndersonLJ,SchnurrDP,ForghaniB,CossenCK,SchusterFL,ChristieLJ,TureenJH.Beyondviruses:clinicalprofilesandetiologiesassociatedwithencephalitis.ClinInfectDis2006；43:1565-1577.
10.GonzalezMI.ThepossibleroleofGABAAreceptorsandgephyrininepileptogenesis.FrontCellNeurosci2013；7:113.
11.R.,Titulaer,M.J.,Sabater,L.等人,EncephalitisandGABA(B)ReceptorAntibodies:NovelFindingsinaNewCaseSeriesof20Patients.Neurology.2013.
12.HonnoratJ,SaizA,GiomettoB,VincentA,BrievaL,deAndresC,MaestreJ,FabienN,VighettoA,CasamitjanaR,ThivoletC,TavolatoB,AntoineJ,TrouillasP,GrausF.Cerebellarataxiawithanti-glutamicaciddecarboxylaseantibodies:studyof14patients.ArchNeurol2001；58:225-230.
13.HughesEG,PengX,GleichmanAJ,LaiM,ZhouL,TsouR,ParsonsTD,LynchDR,DalmauJ,Balice-GordonRJ.Cellularandsynapticmechanismsofanti-NMDAreceptorencephalitis.JNeurosci2010；30:5866-5875.
14.IraniSR,AlexanderS,WatersP,KleopaKA,PettingillP,ZulianiL,PelesE,BuckleyC,LangB,VincentA.AntibodiestoKvlpotassiumchannel-complexproteinsleucine-rich,gliomainactivated1proteinandcontactin-associatedprotein-2inlimbicencephalitis,Morvan'ssyndromeandacquiredneuromyotonia.Brain2010；133:2734-2748.
15.IraniSR,MichellAW,LangB,PettingillP,WatersP,JohnsonMR,SchottJM,ArmstrongRJ,ZagamiS,BleaselA,SomervilleER,SmithSM,VincentA.FaciobrachialdystonieseizuresprecedeLgilantibodylimbicencephalitis.AnnNeurol2011；69:892-900.
16.JefferyOJ,LennonVA,PittockSJ,GregoryJK,BrittonJW,McKeonA.GABABreceptorautoantibodyfrequencyinserviceserologicevaluation.Neurology2013；81:882-887.
17.JohnsonN,HenryC,FesslerAJ,DalmauJ.Anti-NMDAreceptorencephalitiscausingprolongednonconvulsivestatusepilepticus.Neurology2010；75:1480-1482.
18.Kruer,M.C.,Lim,K.Y.,Hoftberger,R.,Svoboda,M.D.,Woltjer,R.L.,Dalmau,J.Opsoclonus,Ataxia,Chorea,andSeizuresinPediatricGABA(B)ReceptorAutoimmunity.JAMANeurol.2013.
19.LaiM,HughesEG,PengX,ZhouL,GleichmanAJ,ShuH,MataS,KremensD,VitalianiR,GeschwindMD,BatallerL,KalbRG,DavisR,GrausF,LynchDR,Balice-GordonR,DalmauJ.AMPAreceptorantibodiesinlimbicencephalitisaltersynapticreceptorlocation.AnnNeurol2009；65:424-434.
20.LaiM,HuijbersMG,LancasterE,GrausF,BatallerL,Balice-GordonR,CowellJK,DalmauJ.InvestigationofLGI1astheantigeninlimbicencephalitispreviouslyattributedtopotassiumchannels:acaseseries.LancetNeurol2010；9:776-785.
21.LancasterE,DalmauJ.Neuronalautoantigens-pathogenesis,associateddisordersandantibodytesting.NatRevNeurol2012；8:380-390.
22.LancasterE,LaiM,PengX,HughesE,ConstantinescuR,RaizerJ,FriedmanD,SkeenMB,GrisoldW,KimuraA,OhtaK,IizukaT,GuzmanM,GrausF,MossSJ,Balice-GordonR,DalmauJ.AntibodiestotheGABA(B)receptorinlimbicencephalitiswithseizures:caseseriesandcharacterisationoftheantigen.LancetNeurol2010；9:67-76.
23.LancasterE,Martinez-HernandezE,DalmauJ.Encephalitisandantibodiestosynapticandneuronalcellsurfaceproteins.Neurology2011；77:179-189.
24.MalterMP,HelmstaedterC,UrbachH,VincentA,BienCG.Antibodiestoglutamicaciddecarboxylasedefineaformoflimbicencephalitis.AnnNeurol2010；67:470-478.
25.MukherjeeJ,KretschmannovaK,GouzerG,MarieHM,RamsdenS,TretterV,HarveyK,DaviesPA,TrillerA,SchindelinH,MossSJ.TheresidencetimeofGABA(A)Rsatinhibitorysynapsesisdeterminedbydirectbindingofthereceptoralpha1subunittogephyrin.JNeurosci2011；31:14677-14687.
26.SaizA,BlancoY,SabaterL,GonzalezF,BatallerL,CasamitjanaR,Ramio-TorrentaL,GrausF.Spectrumofneurologicalsyndromesassociatedwithglutamicaciddecarboxylaseantibodies:diagnosticcluesforthisassociation.Brain2008；131:2553-2563.
27.StraderMB,TabbDL,HerveyWJ,PanC,HurstGB.Efficientandspecifictrypsindigestionofmicrogramtonanogramquantitiesofproteinsinorganic-aqueoussolventsystems.AnalChem2006；78:125-134.
28.TitulaerMJ,McCrackenL,GabilondoI,ArmangueT,GlaserC,lizukaT,HonigLS,BenselerSM,KawachiI,Martinez-HernandezE,AguilarE,Gresa-ArribasN,Ryan-FloranceN,TorrentsA,SaizA,RosenfeldMR,Balice-GordonR,GrausF,DalmauJ.Treatmentandprognosticfactorsforlong-termoutcomeinpatientswithanti-NMDAreceptorencephalitis:anobservationalcohortstudy.LancetNeurol2013；12:157-165.
29.TretterV,MossSJ.GABA(A)ReceptorDynamicsandConstructingGABAergicSynapses.FrontMolNeurosci2008；1:7.
30.VithlaniM,TerunumaM,MossSJ.ThedynamicmodulationofGABA(A)receptortraffickinganditsroleinregulatingtheplasticityofinhibitorysynapses.PhysiolRev2011；91:1009-1022.
31.ZhouC,HuangZ,DingL,DeelME,ArainFM,MurrayCR,PatelRS,FlanaganCD,GallagherMJ.AlteredcorticalGABAAreceptorcomposition,physiology,andendocytosisinamousemodelofahumangeneticabsenceepilepsysyndrome.JBiolChem2013；288:21458-21472.
32.GableMS,SheriffH,DalmauJ,TilleyDH,GlaserCA.TheFrequencyofAutoimmuneN-Methyl-D-AspartateReceptorEncephalitisSurpassesThatofIndividualViralEtiologiesinYoungIndividualsEnrolledintheCaliforniaEncephalitisProject.ClinInfectDis2012.
33.GableMS,GavaliS,RadnerA,TilleyDH,LeeB,DynerL等人,Anti-NMDAreceptorencephalitis:reportoftencasesandcomparisonwithviralencephalitis.EurJClinMicrobiolInfectDis2009；28:1421-1429.
34.Raoult,D.和Dasch,G.A.(1989),Thelineblot:animmunoassayformonoclonalandotherantibodies.Itsapplicationtotheserotypingofgram-negativebacteria.J.Immunol.Methods,125(1-2),57-65.
35.WO2013041540
36.US4647543
37.Voigt,J.,Krause,C.,E,Saschenbrecker,S.,Hahn,M.,Danckwardt,M.,Feirer,C.,Ens,K,Fechner,K,Barth,E,Martinetz,T.和
W.(2012),AutomatedIndirectImmunofluorescenceEvaluationofAntinuclearAutoantibodiesonHEp-2Cells,”ClinicalandDevelopmentalImmunology,vol.2012,doi:10.1155/2012/651058.
38.Bonilla,E.,Francis,L.,Allam,F.etal.,“Immunofluorescencemicroscopyissuperiortofluorescentbeadsfordetectionofantinuclearantibodyreactivityinsystemiclupuserythematosuspatients,”ClinicalImmunology,vol.124,no.1,pp.18-21,2007.
39.W,BrinckmannR,EgnerR,GebauerF,WinklerD,JekowP等人.Peptidebasedadsorbersfortherapeuticimmunoadsorption.TherApherDial2003Feb；7(1):91-7.

Claims (15)

1.GABA(A)R、GABA(A)R片段或其同源物或表达GABA(A)R、GABA(A)R片段或其同源物的细胞用于预测、诊断或治疗受试者中自身免疫疾病的用途。
2.预测、诊断或治疗受试者中自身免疫疾病的方法，包括步骤：检测样品中来自受试者的与GABA(A)R结合的自身抗体。
3.与GABA(A)R、GABA(A)R片段或其同源物结合的自身抗体，其中所述GABA(A)R、GABA(A)R片段或其同源物包含
A)根据SEQIDNO:1和/或SEQIDNO:2的序列；
B)与根据A)的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％或至少99％序列同一性的序列；和/或
C)包含根据A)或B)的序列的至少7、8、9、10、11、12、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、200个或更多个连续氨基酸的一个或多个片段。
4.用于预测或诊断自身免疫疾病的体外方法，包括步骤：
a.使来自受试者的包含自身抗体的液体样品与GABA(A)R、GABA(A)R片段或其同源物或表达GABA(A)R、GABA(A)R片段或其同源物的细胞接触，或使包含来自受试者的组织样品与根据权利要求3所述的自身抗体接触，并且
b.检测自身抗体与GABA(A)R、GABA(A)R片段或其同源物、与细胞或与组织样品的结合作用。
5.根据权利要求4所述的体外方法，其中使用免疫荧光显微术或光谱法、NMR光谱法、质谱法、放射性活度、化学交联、表面等离子体共振法、天然凝胶电泳、色谱或酶活性实施步骤b)。
6.检验试剂盒，其特征在于它包含GABA(A)R、GABA(A)R片段或其同源物，表达GABA(A)R、GABA(A)R片段或其同源物的细胞，和/或根据权利要求3所述的自身抗体。
7.药物组合物，其特征在于它包含GABA(A)R、GABA(A)R片段或其同源物和/或表达GABA(A)R、GABA(A)R片段或其同源物的细胞。
8.医用或诊断装置，其被GABA(A)R、GABA(A)R片段或其同源物或表达GABA(A)R、GABA(A)R片段或其同源物的细胞或根据权利要求3所述的自身抗体包覆和/或用根据权利要求7所述的药物组合物包覆。
9.治疗受试者中自身免疫疾病的方法，所述方法包括步骤
a.使来自受试者的包含抗体的液体样品经历根据权利要求2、4或5中任一项所述的方法，并且
b.用至少一个合适的药用物质和/或血浆交换治疗受试者。
10.根据权利要求9所述的方法，其中至少一种合适的药用物质选自利妥昔单抗、泼尼松、甲泼尼龙、环磷酰胺、吗替麦考酚酯、静脉用免疫球蛋白、他克莫司、环孢菌素、甲氨蝶呤、硫唑嘌呤、氯硝西泮、苯妥英、拉莫三嗪、苯巴比妥、丙戊酸、左乙拉西坦、卡马西平、噻加宾、非尔氨酯、普瑞巴林、扑米酮和加巴喷丁和根据权利要求7所述的药物组合物。
11.治疗受试者中自身免疫疾病的方法，所述方法包括步骤
a.从受试者取得血液或血浆，
b.使血液或血浆与根据权利要求7所述的药物组合物或根据权利要求8所述的医用装置接触以移除疾病相关的抗体，并且
c.再施用从步骤b产生的血液或血浆至受试者。
12.用于分离与GABA(A)R、GABA(A)R片段或其同源物结合的抗体的方法，所述方法包括步骤
a.使包含与GABA(A)R、GABA(A)R片段或其同源物结合的抗体的样品与GABA(A)R、GABA(A)R片段或同源物接触或与表达GABA(A)R、GABA(A)R片段或其同源物的细胞接触，
b.分离包含GABA(A)R、GABA(A)R片段或其同源物和抗体的复合物，
c.解离步骤c中分离的复合物，并且
d.将抗体与GABA(A)R、GABA(A)R片段或其同源物或细胞分离。
13.根据权利要求1所述的用途、根据权利要求2、4、5、9和10至12中任一项所述方法、根据权利要求6所述的检验试剂盒或根据权利要求8所述的医用或诊断装置，其中GABA(A)R、GABA(A)R片段或其同源物与报道分子或固相连接。
14.根据权利要求1或13所述的用途、根据权利要求2、4、5、9至13中任一项所述方法、根据权利要求6所述的检验试剂盒、根据权利要求7所述的药物组合物或根据权利要求8所述的医用或诊断装置，特征在于所述GABA(A)R、GABA(A)R片段或其同源物包含
A)根据SEQIDNO:1和/或SEQIDNO:2的序列；
B)与根据A)的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％或至少99％序列同一性的序列；和/或
C)包含根据A)或B)的序列的至少7、8、9、10、11、12、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、200个或更多个连续氨基酸的一个或多个片段。
15.根据权利要求1、13和14中任一项所述的用途、根据权利要求2、4、5、9至11、13和14中任一项所述方法，其中自身免疫疾病是神经系统的自身免疫疾病。
CN201480052000.4A 2013-10-17 2014-10-16 用于检测gaba(a)相关性自身免疫疾病的诊断方法和相关主题 Active CN105579853B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP13189172.3 2013-10-17
EP13189172.3A EP2863231A1 (en) 2013-10-17 2013-10-17 Diagnostic method for detecting a GABA(A) related autoimmune disease and related subject-matter
PCT/EP2014/072252 WO2015055776A1 (en) 2013-10-17 2014-10-16 Diagnostic method for detecting a gaba(a) related autoimmune disease and related subject-matter

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105579853A true CN105579853A (zh) 2016-05-11
CN105579853B CN105579853B (zh) 2020-11-06

Family

ID=49447977

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201480052000.4A Active CN105579853B (zh) 2013-10-17 2014-10-16 用于检测gaba(a)相关性自身免疫疾病的诊断方法和相关主题

Country Status (8)

Country Link
US (1) US11041005B2 (zh)
EP (2) EP2863231A1 (zh)
CN (1) CN105579853B (zh)
DK (1) DK3058376T3 (zh)
ES (1) ES2768609T3 (zh)
PL (1) PL3058376T3 (zh)
SI (1) SI3058376T1 (zh)
WO (1) WO2015055776A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114689863A (zh) * 2020-12-30 2022-07-01 广州市微米生物科技有限公司 脑炎联检试剂

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201409234D0 (en) 2014-05-23 2014-07-09 Isis Innovation Method
KR101739703B1 (ko) * 2016-09-13 2017-05-24 (주) 어드밴스드 엔티 Trail 기반 뇌염 감별진단 방법 및 장치
CN109142740A (zh) 2017-06-16 2019-01-04 欧蒙医学诊断技术有限公司 神经自身免疫疾病的诊断
DE102018009721A1 (de) 2017-12-29 2019-07-04 Euroimmun Medizinische Labordiagnostika Ag Verfahren zur Diagnose einer Bornavirus-Infektion
EP3872492A1 (en) 2020-02-28 2021-09-01 Seramun Diagnostica GmbH Identifying borna disease virus (bodv) infection through detection of antibodies against the bodv glycoprotein
DE202022104518U1 (de) 2021-08-10 2023-06-20 Fundació Clínic Per A La Recerca Biomèdica (Fcrb) Autoantikörper und Mittel zum Nachweis eines Autoantikörpers

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090029388A1 (en) * 2005-12-15 2009-01-29 David Beeson Detection of Antibodies
CN103116030A (zh) * 2013-01-30 2013-05-22 山东东兴生物科技股份有限公司 一种检测i型糖尿病自身免疫抗体试剂盒及其检测方法
WO2013113864A1 (fr) * 2012-02-01 2013-08-08 Centre National De La Recherche Scientifique Puces a proteines, preparation et utilisations

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3376359D1 (en) 1983-02-25 1988-05-26 Stocker Winfried Processes and devices for examinations on immobilised biological material
US5529898A (en) * 1993-08-19 1996-06-25 Duke University Methods of detecting disorders of the central nervous system by detecting autoantibodies which specifically bind ionotropic glutamate receptors
US5731410A (en) * 1994-11-28 1998-03-24 University Of Utah Research Foundation Peptide for blocking autoantibody-evoked activation of glutamate receptor type 3 (GLUR3)
US7029870B1 (en) 1997-07-03 2006-04-18 Human Genome Sciences, Inc. Gabaa receptor epsilon subunits
EP1337859A1 (en) 2000-10-05 2003-08-27 Hanns Mohler Selective anxiolytic therapeutic agents
WO2002083822A2 (en) * 2001-04-13 2002-10-24 Mitrovich Michael J Solid lubricant and composition
CA2585876A1 (en) * 2003-11-06 2005-05-26 Grace Laboratories, Inc. Immunosorbent tests for assessing paroxysmal cerebral discharges
AU2006251647A1 (en) * 2005-05-20 2006-11-30 Genentech, Inc. Pretreatment of a biological sample from an autoimmune disease subject
AU2009223153A1 (en) 2008-03-12 2009-09-17 Emory University Use of GABAa receptor antagonists for the treatment of excessive sleepiness and disorders associated with excessive sleepiness
KR100966333B1 (ko) 2008-03-17 2010-06-28 (주)지노믹트리 Gabra１ 유전자를 함유하는 유전자전달체를 포함하는 대장암 세포의 증식 억제제
CN102308212A (zh) * 2008-12-04 2012-01-04 加利福尼亚大学董事会 用于确定前列腺癌诊断和预后的材料和方法
BR112012004777A2 (pt) * 2009-09-03 2019-09-24 Genentech Inc métodos para tratar diagnósticar e monitorar artrite reumatoide
US8685656B2 (en) * 2009-09-29 2014-04-01 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods for diagnosing and treating encephalitis or epilepsy
KR20130056855A (ko) * 2010-03-01 2013-05-30 카리스 라이프 사이언스 룩셈부르크 홀딩스 치료진단용 생물학적 지표들
DE202011106093U1 (de) 2011-09-24 2011-10-19 Euroimmun Medizinische Labordiagnostika Ag Kalibrationsstreifen für einen Immunoblot
WO2013098419A1 (en) * 2011-12-28 2013-07-04 Immunoqure Ag Method of providing monoclonal auto-antibodies with desired specificity
GB201409234D0 (en) * 2014-05-23 2014-07-09 Isis Innovation Method
ES2693465T3 (es) * 2014-06-06 2018-12-11 Uroimmun Medizinische Labordiagnostika Ag Diagnóstico de una enfermedad neurológica
ES2748117T3 (es) * 2015-04-22 2020-03-13 Euroimmun Medizinische Labordiagnostika Ag Diagnóstico de una nueva enfermedad autoinmune

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090029388A1 (en) * 2005-12-15 2009-01-29 David Beeson Detection of Antibodies
WO2013113864A1 (fr) * 2012-02-01 2013-08-08 Centre National De La Recherche Scientifique Puces a proteines, preparation et utilisations
CN103116030A (zh) * 2013-01-30 2013-05-22 山东东兴生物科技股份有限公司 一种检测i型糖尿病自身免疫抗体试剂盒及其检测方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A MATHIEU ET AL: "Defective cerebral gamma-aminobutyric acid-A receptor density in patients with systemic lupus erythematosus and central nervous system involvement. An observational study", 《LUPUS》 *
GENBANK: "NP 000797.2", 《GENBANK》 *
GENBANK: "NP 000805.1", 《GENBANK》 *
PETER R SCHOFIELD ET AL: "Sequence and expression of human GABAA receptor αl and βl subunits", 《FEBS LETTERS》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114689863A (zh) * 2020-12-30 2022-07-01 广州市微米生物科技有限公司 脑炎联检试剂

Also Published As

Publication number Publication date
CN105579853B (zh) 2020-11-06
EP3058376A1 (en) 2016-08-24
EP2863231A1 (en) 2015-04-22
US20160326227A1 (en) 2016-11-10
WO2015055776A1 (en) 2015-04-23
PL3058376T3 (pl) 2020-06-01
US11041005B2 (en) 2021-06-22
DK3058376T3 (da) 2020-02-24
SI3058376T1 (sl) 2020-02-28
EP3058376B1 (en) 2019-11-27
ES2768609T3 (es) 2020-06-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105579853A (zh) 用于检测gaba(a)相关性自身免疫疾病的诊断方法和相关主题
Srivastava et al. Potassium channel KIR4. 1 as an immune target in multiple sclerosis
Prüss et al. N‐methyl‐D‐aspartate receptor antibodies in herpes simplex encephalitis
EP2483417B1 (en) Methods for diagnosing and treating encephalitis or epilepsy
Dhaunchak et al. Implication of perturbed axoglial apparatus in early pediatric multiple sclerosis
Gambichler et al. Neurological disorders in patients with bullous pemphigoid: clinical and experimental investigations
EP2895507B1 (en) Diagnostic method for detecting an autoimmune disease and related subject-matter
US20110065205A1 (en) Method for determining prognosis of acute central nervous system disorder
US9250250B2 (en) Methods for diagnosing and treating an LGI1 related autoimmune disease
Fukuyama et al. Semi-quantitative analyses of antibodies to N-methyl-d-aspartate type glutamate receptor subunits (GluN2B & GluN1) in the clinical course of Rasmussen syndrome
EP2620770A1 (en) Novel testing method and testing reagent for angiitis
US20230039907A1 (en) Assessing and treating autoimmune ataxia
US9977036B2 (en) Diagnostic markers for multiple sclerosis
DE102018004759A1 (de) Diagnose einer Neuroautoimmunkrankheit
US12000844B2 (en) Diagnostic drug and diagnostic method for Alzheimer&#39;s disease
CN103370620B (zh) 阿尔茨海默病的诊断药和诊断方法
Yanagida et al. Serum proteome analysis in patients with rheumatoid arthritis receiving therapy with tocilizumab: an anti‐interleukin‐6 receptor antibody
WO2021157634A1 (ja) タウオパチーおよび認知症関連疾患の判定薬および判定方法
Kumakura et al. A patient with epilepsia partialis continua with anti-glutamate receptor ε2 antibodies
US20220120744A1 (en) Assessing and treating germ cell tumors and paraneoplastic autoimmunity
CN116359511A (zh) Crmp5作为癫痫的诊断、治疗、预后分子标志物的应用
CN116359512A (zh) Crmp3作为癫痫的诊断、治疗、预后分子标志物的应用
Constantinescu et al. Antibodies to the GABA (B) receptor in limbic encephalitis with seizures: Case series and characterisation of the...

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
EE01 Entry into force of recordation of patent licensing contract
EE01 Entry into force of recordation of patent licensing contract

Application publication date: 20160511

Assignee: European medical laboratory diagnostics Inc

Assignor: Institucio Catalana de Recerca|Auguste. Yale biomedical research institute loose skin.

Contract record no.: 2017990000283

Denomination of invention: Diagnostic methods and related topics for the detection of GABA (A) related autoimmune diseases

License type: Exclusive License

Record date: 20170717

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant