DE202022104518U1

DE202022104518U1 - Autoantikörper und Mittel zum Nachweis eines Autoantikörpers

Info

Publication number: DE202022104518U1
Application number: DE202022104518.6U
Authority: DE
Original assignee: Fundacio Clinic Per A La Recerca Biomedica Fcrb; Fundacio Clinic per a la Recerca Biomedica FCRB; Institucio Catalana de Recerca i Estudis Avancats ICREA; Institut dInvestigacions Biomediques August Pi i Sunyer IDIBAPS
Current assignee: FUNDACIO CLINIC PER A LA RECERCA BIOMEDICA (FC, ES; FUNDACIO DE RECERCA CLINIC BARCELONA-INSTITUT , ES; Institucio Catalana de Recerca i Estudis Avancats ICREA
Priority date: 2021-08-10
Filing date: 2022-08-09
Publication date: 2023-06-20
Anticipated expiration: 2032-08-10
Also published as: US20240011982A9; US20230053910A1

Abstract

Autoantikörper, der spezifisch an eines oder mehrere aus der Gruppe, umfassend Glukl, Gluk2, Gluk3, Gluk4 und Gluk5, vorzugsweise Gluk2, bindet, der vorzugsweise in einer Lösung vorliegt, die einen/eines oder mehrere, mehr bevorzugt alle aus der Gruppe, umfassend einen künstlichen Puffer, ein Konservierungsmittel und ein künstliches Antikoagulans, umfasst.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren, das den Schritt eines Nachweisens in einer Probe eines Autoantikörpers, der spezifisch an eines oder mehrere aus der Gruppe, umfassend Gluk1, Gluk2, Gluk3, Gluk4 und Gluk5, vorzugsweise Gluk2, bindet, einen Autoantikörper, der spezifisch an eines oder mehrere aus der Gruppe, umfassend Gluk1, Gluk2, Gluk3, Gluk4 und Gluk5, vorzugsweise Gluk2, bindet, einen diagnostisch verwendbaren Träger mit einer festen Phase mit einem immobilisierten Polypeptid, umfassend eines oder mehrere aus der Gruppe, umfassend Gluk1, Gluk2, Gluk3, Gluk4 und Gluk5, vorzugsweise Gluk2, oder eine Variante davon, und eine Verwendung des Autoantikörpers zur Diagnose einer neurologischen Autoimmunerkrankung oder von Krebs.
Neurologische Autoimmunerkrankungen sind selten, aber sie sind potenziell behandelbar. Ihr Kennzeichen ist das Auftreten von neurologischen Symptomen und einer Autoimmunantwort, in der Regel das Auftreten eines Autoantikörpers, der spezifisch an Strukturen in dem Hirn, wie Polypeptide, die wichtige Funktionen für die Neurotransmission haben, bindet. Sie können einen jeglichen Bereich des Nervensystems betreffen, einschließlich des zentralen, peripheren und autonomen Nervensystems. Obwohl die Systembeteiligung oft multifokal ist, wie Enzephalomyelitis, kann sie auch ein einzelnes System betreffen, z. B. zerebelläre Degeneration.
Autoimmunenzephalitis ist eine schwere neurologische Autoimmunerkrankung, insbesondere Anti-NMDA-Rezeptor-Autoimmunenzephalitis, von der 1,5 Patienten pro Million pro Jahr betroffen sind. Symptome wie Paranoia, Psychose und gewalttätiges Verhalten erscheinen zunächst in der Regel psychiatrischer Natur, aber wenn die Krankheit fortschreitet, kann dies von Krampfanfällen, beeinträchtigter Kognition, Gedächtnisdefizit und Sprachproblemen begleitet werden. In einem späteren Stadium kann eine Behandlung auf einer Intensivstation erforderlich sein, wenn Patienten unter medizinisch dringenden Symptomen, einschließlich zerebellärer Ataxie, autonomer Dysfunktion und Katatonie, leiden. Ein Autoantikörper gegen die NR1-Untereinheit des NMDA-Rezeptors wurde als die Ursache entdeckt (Dalmau et al. (2008): Anti-NMDA-receptor encephalitis: case series and analysis of the effects ofantibodies, Lancet Neurology, Band 7, Ausgabe 12).
Eine frühzeitige Diagnose und Behandlung neurologischer Autoimmunerkrankungen ist wichtig, da eine jegliche Verzögerung zu einem raschen Fortschreiten und irreversiblem neurologischen Schaden führen kann. Im Gegensatz dazu kann eine frühzeitige und angemessene Behandlung, in der Regel durch irgendeine Form von Immunsuppressionstherapie, einige der Schäden rückgängig machen. In einigen Fällen ist eine vollständige Heilung möglich. Beispielsweise haben 80 % der Patienten, die an NMDA-Rezeptor-Enzephalitis leiden, mit Behandlung einen guten Ausgang, obwohl langfristige psychische Probleme oder ein Rezidiv möglich sind.
Eine Diagnose neurologischer Autoimmunerkrankungen ist jedoch oft schwierig. Einer der Gründe dafür ist das Fehlen eines bestimmten klinischen Musters und das Fehlen spezifischer Bildgebung und Laboranomalien. Um eine frühzeitige Diagnose zu stellen, muss eine Kombination aus klinischen und Laboruntersuchungen eingesetzt werden. Eine Behandlung der zugrundeliegenden Krebserkrankung, sofern vorhanden, ist wichtig für die Behandlung des neurologischen Zustands.
Neurologische Autoantikörper sind hilfreich für die Diagnose. Ihr Vorliegen, allein oder in Kombination mit anderen Indikatoren, hilft, die autoimmune Natur der Krankheit festzustellen, was dem Kliniker hilft, die neuen neurologischen Symptome einer neurologischen Autoimmunerkrankung von einem neurologischen Zustand zu unterscheiden, der das Ergebnis einer Infektion, behandlungsbedingter Komplikationen wie toxischer Neuropathien, Drogenmissbrauch und psychiatrischer Erkrankungen ist. Außerdem sind sie hilfreich bei der Erkennung des Rezidivs der Krankheit bei bereits seropositiven Patienten.
Viele Patienten, bei denen der Verdacht besteht, dass sie an einer neurologischen Autoimmunerkrankung leiden, werden jedoch keine mit Tests aus dem neuesten Stand der Technik nachweisbaren Antikörper aufweisen, nicht zuletzt, weil viele diagnostisch relevante Antikörper noch unbekannt sind. Es besteht die Gefahr, dass diese Patienten nicht diagnostiziert oder sogar fehldiagnostiziert werden. In der Vergangenheit wurden einige von ihnen in psychiatrische Anstalten eingewiesen, obwohl sie mit einer angemessenen immunsuppressiven Behandlung einigermaßen normale Leben hätten führen können.
Daher besteht die der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende Aufgabe darin, Reagenzien und Verfahren für die Diagnose einer neurologischen Autoimmunerkrankung und/oder von Krebs, vorzugsweise verbunden mit dem Vorliegen eines Autoantikörpers, der spezifisch an eines oder mehrere aus der Gruppe, umfassend Gluk1, Gluk2, Gluk3, Gluk4 und Gluk5, vorzugsweise Gluk2, bindet, bereitzustellen.
Eine weitere der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende Aufgabe ist es, zwischen einer Autoimmunenzephalitis und einer durch eine Infektion verursachten Enzephalitis zu unterscheiden.
Eine weitere der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende Aufgabe ist es, einen Assay mit einer erhöhten diagnostischen Zuverlässigkeit, insbesondere hinsichtlich Spezifität und/oder Sensitivität, für die Diagnose einer neurologischen Autoimmunerkrankung oder von Krebs, gegebenenfalls in Kombination mit Assays aus dem neuesten Stand der Technik, bereitzustellen.
Die der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende Aufgabe wird durch den Gegenstand der beigefügten unabhängigen und abhängigen Ansprüche gelöst.
In einem ersten Aspekt wird die der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende Aufgabe durch ein Verfahren gelöst, das den Schritt eines Nachweisens in einer Probe eines Autoantikörpers, der spezifisch an eines oder mehrere aus der Gruppe, umfassend Gluk1, Gluk2, Gluk3, Gluk4 und Gluk5, vorzugsweise Gluk2, bindet, umfasst.
In einem zweiten Aspekt wird die der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende Aufgabe durch ein Verfahren zum Isolieren eines Antikörpers, der an eines oder mehrere aus der Gruppe, umfassend Gluk1, Gluk2, Gluk3, Gluk4 und Gluk5, vorzugsweise Gluk2, bindet, gelöst, das die Schritte umfasst

a) Immobilisieren eines oder mehrerer Polypeptid/e, das/die jeweils ein oder mehrere Antigen/e aus der Gruppe, umfassend Gluk1, Gluk2, Gluk3, Gluk4 und Gluk5, vorzugsweise Gluk2, oder eine Variante davon, umfasst/umfassen, auf einem Träger,
b) Inkontaktbringen einer Probe, die Antikörper umfasst, mit dem/den Polypeptid/en unter Bedingungen, die mit einer Bildung eines Komplexes kompatibel sind, wobei der Antikörper an das Polypeptid bindet,
c) Abtrennen des in Schritt a) gebildeten Komplexes von der Probe und
d) Abtrennen des Antikörpers von dem Polypeptid.

In einem dritten Aspekt wird die der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende Aufgabe durch ein Verfahren gelöst, das die Schritte umfasst

a) Immobilisieren eines oder mehrerer Polypeptid/e, das/die jeweils ein oder mehrere Antigen/e aus der Gruppe, umfassend Gluk1, Gluk2, Gluk3, Gluk4 und Gluk5, vorzugsweise Gluk2, oder eine Variante davon, umfasst/umfassen, auf einem Träger,
b) Inkontaktbringen des Trägers mit einer Flüssigkeit, worin ein Arzneimittelkandidat vorliegt und/oder die Flüssigkeit keine Probe von einem zu diagnostizierenden Lebewesen umfasst, umfassend einen Antikörper, der spezifisch an eines oder mehrere aus der Gruppe, umfassend Gluk1, Gluk2, Gluk3, Gluk4 und Gluk5, vorzugsweise Gluk2, bindet,
c) Inkontaktbringen des Trägers mit einem Mittel zum Nachweisen eines immobilisierten Antikörpers und
d) Nachweisen des Vorliegens, vorzugsweise in quantitativer Weise.

In einem vierten Aspekt wird die Aufgabe durch einen Autoantikörper, der spezifisch an eines oder mehrere, vorzugsweise ein Antigen, aus der Gruppe, umfassend Gluk1, Gluk2, Gluk3, Gluk4 und Gluk5, vorzugsweise Gluk2, mehr bevorzugt in einer Lösung, umfassend ein oder mehrere, mehr bevorzugt alle, aus der Gruppe, umfassend einen künstlichen Puffer, ein Konservierungsmittel und ein künstliches Antikoagulans, bindet, gelöst.
In einem fünften Aspekt ein diagnostisch verwendbarer Träger mit einer festen Phase mit einem oder mehreren Polypeptid/en, das/die jeweils ein oder mehrere Antigen/e aus der Gruppe, umfassend Gluk1, Gluk2, Gluk3, Gluk4 und Gluk5, vorzugsweise Gluk2, oder eine Variante davon, umfasst/umfassen, das/die an der festen Phase immobilisiert ist/sind, und a) einer Negativkontrolle und/oder b) mindestens einem zusätzlichen diagnostisch verwendbaren Antigen, wobei das Polypeptid und die Negativkontrolle oder das zusätzliche Antigen räumlich getrennt auf dem Träger angeordnet sind, oder
ein erster diagnostisch verwendbarer Träger mit einer festen Phase, umfassend ein oder mehrere Polypeptid/e, das/die jeweils ein oder mehrere Antigen/e aus der Gruppe, umfassend Gluk1, Gluk2, Gluk3, Gluk4 und Gluk5, vorzugsweise Gluk2, oder eine Variante davon, umfasst/umfassen, immobilisiert an der festen Phase, und ein zweiter diagnostisch verwendbarer Träger, der eine feste Phase, umfassend eine immobilisierte a) Negativkontrolle und/oder b) mindestens ein zusätzliches immobilisiertes Polypeptid, umfassend ein Antigen oder eine Variante davon, umfasst.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das mindestens eine zusätzliche Antigen mindestens ein Antigen, vorzugsweise alle Antigene, aus der Gruppe, umfassend NMDAR, Lgl1, AMPA1, AMPA2, CASPR2, GABA B, GABA A, DPPX, IGLON5, Hu, Yo, CV2/CRMP5, Ri, Ma2, Amphiphysin, Recoverin, RGS8, DAGLA, STX1B, AK5, AP3B2, Flotillin1+2, GRM1, GRM2, GRM5, GLURD2, ITPR1, KCNA2, NCDN, Septin 3+5+6+7+11 und Sez6L2.
In einem sechsten Aspekt wird die Aufgabe gelöst durch eine Verwendung a) des Autoantikörpers gemäß der vorliegenden Erfindung oder b) der Kombination aus einem oder mehreren aus der Gruppe, umfassend Gluk1, Gluk2, Gluk3, Gluk4 und Gluk5, vorzugsweise Gluk2, und einem Mittel zum Nachweisen oder Einfangen eines Autoantikörpers, vorzugsweise IgG-Antikörpers, oder c) des Trägers gemäß der vorliegenden Erfindung zur Diagnose einer neurologischen Autoimmunerkrankung oder von Krebs.
In einem siebten Aspekt wird die Aufgabe durch ein Kit gelöst, umfassend ein Polypeptid, das eines oder mehrere aus der Gruppe, umfassend Gluk1, Gluk2, Gluk3, Gluk4 und Gluk5, vorzugsweise Gluk2, oder eine Variante davon, umfasst, und einen diagnostisch verwendbaren Träger, vorzugsweise gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei

a) das Polypeptid auf einem diagnostisch verwendbaren Träger, vorzugsweise gemäß der vorliegenden Erfindung, immobilisiert ist und das Kit ferner ein Mittel zum Nachweisen eines Autoantikörpers, der spezifisch an eines oder mehrere aus der Gruppe, umfassend Gluk1, Gluk2, Gluk3, Gluk4 und Gluk5, vorzugsweise Gluk2, bindet, vorzugsweise immobilisiert, umfasst,
b) das Polypeptid und der Träger zum Immobilisieren des Polypeptids auf der Oberfläche des Trägers, vorzugsweise über ein Affinitätstag und einen Liganden, der an das Affinitätstag bindet, konfiguriert sind und das Kit ferner ein Mittel zum Nachweisen eines immobilisierten Antikörpers, der spezifisch an eines oder mehrere aus der Gruppe, umfassend Gluk1, Gluk2, Gluk3, Gluk4 und Gluk5, vorzugsweise Gluk2, bindet, umfasst,
c) der Träger mit einem Mittel zum Einfangen eines Antikörpers immobilisiert ist und das Kit ferner ein Mittel zum Nachweisen eines eingefangenen Antikörpers, der spezifisch an den Transporter bindet, welches vorzugsweise ein Polypeptid, das eine nachweisbare Markierung umfasst, ist, umfasst, oder
d) der Träger und ein Mittel zum Einfangen eines Antikörpers zum Immobilisieren des Mittels zum Einfangen eines Antikörpers auf der Oberfläche des Trägers, vorzugsweise über ein Affinitätstag und einen Liganden, der an das Affinitätstag bindet, konfiguriert sind und das Kit ferner ein Mittel zum Nachweisen eines eingefangenen Antikörpers, der spezifisch an eines oder mehrere aus der Gruppe, umfassend Gluk1, Gluk2, Gluk3, Gluk4 und Gluk5, vorzugsweise Gluk2, bindet, umfasst, welches vorzugsweise das Polypeptid, das eine nachweisbare Markierung umfasst, ist,

In einem achten Aspekt wird die Aufgabe durch eine Verwendung eines Polypeptids, das eines oder mehrere aus der Gruppe, umfassend Gluk1, Gluk2, Gluk3, Gluk4 und Gluk5, vorzugsweise Gluk2, oder eine Variante davon, umfasst, oder eines Autoantikörpers, der spezifisch an eines oder mehrere aus der Gruppe, umfassend Gluk1, Gluk2, Gluk3, Gluk4 und Gluk5, vorzugsweise Gluk2, bindet, oder eines rekombinanten Antikörpers, der spezifisch an ein Polypeptid aus der Gruppe, umfassend Gluk1, Gluk2, Gluk3, Gluk4 und Gluk5, vorzugsweise Gluk2, bindet, zur Herstellung eines Kits oder einer medizinischen Vorrichtung, vorzugsweise diagnostischen Vorrichtung, für die Diagnose einer Krankheit gelöst.
In einem neunten Aspekt wird die Aufgabe durch eine Verwendung eines Autoantikörpers, der spezifisch an eines oder mehrere aus der Gruppe, umfassend Gluk1, Gluk2, Gluk3, Gluk4 und Gluk5, vorzugsweise Gluk2, bindet, oder eines rekombinanten Antikörpers, der spezifisch an eines oder mehrere aus der Gruppe, umfassend Gluk1, Gluk2, Gluk3, Gluk4 und Gluk5, vorzugsweise Gluk2, bindet, der vorzugsweise von sekundären Antikörpern gegen menschliche IgG-Klasse-Immunglobuline erkannt wird, als eine Positivkontrolle für den Nachweis in einer Probe eines Autoantikörpers, der spezifisch an eines oder mehrere aus der Gruppe, umfassend Gluk1, Gluk2, Gluk3, Gluk4 und Gluk5, vorzugsweise Gluk2 bindet, gelöst.
In einem zehnten Aspekt wird die Aufgabe durch ein ex vivo-Verfahren zum Entfernen eines Autoantikörpers, der spezifisch an eines oder mehrere aus der Gruppe, umfassend Gluk1, Gluk2, Gluk3, Gluk4 und Gluk5, vorzugsweise Gluk2, bindet, aus Blut, vorzugsweise Serum, eines Patienten gelöst.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Polypeptid ein rekombinantes, isoliertes und/oder aufgereinigtes Polypeptid.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Antikörper oder Autoantikörper ein Säugetier-, vorzugsweise menschlicher, Autoantikörper oder ist die Probe eine Säugetier-, vorzugsweise menschliche, Probe, die einen repräsentativen Satz von Antikörpern umfasst, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe, umfassend Vollblut, Plasma, Serum, zerebrospinale Flüssigkeit und Speichel.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Autoantikörper oder Komplex unter Verwendung eines Nachweisverfahrens, das ausgewählt ist aus der Gruppe, umfassend Immundiffusion, Immunelektrophorese, Lichtstreuungsimmunassays, Agglutination, markierte Immunassays, wie solche aus der Gruppe, umfassend radioaktiv markierten Immunassay, Enzymimmunassays, mehr bevorzugt ELISA, Chemilumineszenz-Immunassays, vorzugsweise Elektrochemilumineszenzimmunassay, und Immunfluoreszenz, vorzugsweise indirekte Immunfluoreszenz, nachgewiesen.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Träger ausgewählt aus der Gruppe, umfassend einen Glas-Objektträger, vorzugsweise zur Mikroskopie, einen Biochip, eine Mikrotiterplatte, eine Lateral-Flow-Vorrichtung, einen Teststreifen, eine Membran, vorzugsweise einen Line-Blot, eine Chromatographiesäule und ein Bead, vorzugsweise ein magnetisches oder fluoreszierendes Bead.
Die vorliegende Erfindung basiert auf dem überraschenden Befund der Erfinder, dass Antikörper gegen Gluk1, Gluk2, Gluk3, Gluk4 und Gluk5 existieren und in Proben von Patienten, die an einer neurologischen Autoimmunerkrankung und/oder Krebs leiden, nachgewiesen werden können, nicht aber in Proben von gesunden Lebewesen. Daher können sie zur Unterstützung bei der Diagnose von Krankheiten oder zur Diagnose von Krankheiten verwendet werden.
Die Kainatrezeptoren sind tetramere ionotrope Glutamatrezeptoren, die GluK1, GluK2, GluK3, GluK4 oder GluK5, früher bekannt als GluR5, GluR6, GluR7, KA1 und KA2, einschließen können. GluK1, GluK2 und GluK3 bilden funktionelle homo- und heterotetramere Rezeptoren, während GluK4 und GluK5 nur dann funktionelle Rezeptoren bilden, wenn sie mit GluK1 bis GluK3 co-exprimiert werden. Wie in dem Fall der GluA2-Untereinheit der AMPARs weisen GluK1 und GluK2 Q/R-Edierung an der zweiten Transmembrandomäne (TM2) auf. Diese Q-zu-R-Substitution hebt Ca²⁺-Permeabilität auf, während sie Cl^--Permeation des Kanals erhöht. Darüber hinaus sind Q-Reste für eine größere Leitfähigkeit und Einwärtsgleichrichtung verantwortlich.
Die Kainatrezeptoren sind unkonventionelle Mitglieder der Glutamatrezeptorfamilie, da sie im Gegensatz zu NMDAR oder AMPAR nicht überwiegend in exzitatorischen postsynaptischen Komplexen zu finden sind. Neben einer Funktion als ionotrope Rezeptoren wirken Kainatrezeptoren als Modulatoren für eine synaptische Übertragung und neuronale Erregbarkeit, die mit metabotropen Signalwegen interagieren. Sie spielen eine entscheidende Rolle als präsynaptische Regulatoren der Neurotransmitterfreisetzung sowohl an exzitatorischen als auch inhibitorischen Synapsen durch nicht vollständig verstandene Mechanismen, sind in der Lage, Kurzzeit- und Langzeitplastizität zu erleichtern und können als Modulatoren GABA-erger Übertragung wirken.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird Gluk1 durch SEQ ID NO1 oder NP_000821.1 oder P39086, vorzugsweise SEQ ID NO1, dargestellt. In einer bevorzugten Ausführungsform wird Gluk2 durch SEQ ID NO2 oder NP_068775.1 oder Q13002, vorzugsweise SEQ ID NO2, dargestellt. In einer bevorzugten Ausführungsform wird Gluk3 durch SEQ ID NO3 oder NP_000822.2 oder Q13003, vorzugsweise SEQ ID NO3, dargestellt. In einer bevorzugten Ausführungsform wird Gluk4 durch SEQ ID NO4 oder NP_055434.2 dargestellt. In einer bevorzugten Ausführungsform wird Gluk5 durch SEQ ID NO5 oder NP_002079.3 dargestellt. Während Gluk1, Gluk2 und Gluk3 als Homomere exprimiert werden können, die nur aus Gluk1-, Gluk2- oder Gluk3-Untereinheiten bestehen, müssen Gluk4 und Gluk5 jeweils als Heteromere co-exprimiert werden, die a) eine Gluk4- oder Gluk5-Untereinheit und b) eine Gluk1-, eine Gluk2- oder eine Gluk3-Untereinheit umfassen. Die Sequenzen, auf die hier Bezug genommen wird, stellen die Version dar, die in Datenbanken unter dem entsprechenden Code verfügbar ist, sie sind die, die an dem Anmeldetag oder an dem ersten Prioritätstag dieser Anmeldung online verfügbar waren, je nachdem, was früher ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird der NMDAR-Rezeptor durch seine NR1-Untereinheit dargestellt, die durch SEQ ID NO7 aus der EP3505935 gekennzeichnet ist, und dies ist das Polypeptid, an das ein Autoantikörper gegen NMDAR bindet oder das zum Nachweis eines solchen Autoantikörpers verwendet wird, beispielsweise in der Form eines Polypeptids, das von einem Träger umfasst ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist LG11 durch SEQ ID NO2 aus der US9,250,250 gekennzeichnet, und dies ist das Polypeptid, an das ein Autoantikörper gegen es bindet oder das zum Nachweis eines solchen Autoantikörpers verwendet wird, beispielsweise in der Form eines Polypeptids, das von einem Träger umfasst ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist GABA B durch SEQ ID NO1 aus der US8, 685,656 (B1-Untereinheit) gekennzeichnet, und dies ist das Polypeptid, an das ein Autoantikörper gegen es bindet oder das zum Nachweis eines solchen Autoantikörpers verwendet wird, zum Beispiel in der Form eines Polypeptids, das von einem Träger umfasst ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist GABA A durch SEQ ID NO1 der (alpha1-) oder SEQ ID NO2 (beta3-) oder SEQ IDNO (gamma2-) Untereinheit aus der US11,041,005 gekennzeichnet, und dies sind Polypeptide, an die ein Autoantikörper bindet oder von denen eines oder mehrere zum Nachweis eines solchen Autoantikörpers verwendet wird/werden, zum Beispiel in der Form eines oder mehrerer Polypeptide, die von einem Träger umfasst sind.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist ITPR1 durch Aminosäuren 1-1251 des Datenbankcodes Q14643, wie in der EP3018478 offenbart, gekennzeichnet, und dies ist das Polypeptid, an das ein Autoantikörper gegen es bindet oder das zum Nachweis eines solchen Autoantikörpers verwendet wird, beispielsweise in der Form eines Polypeptids, das von einem Träger umfasst ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist MA2 durch SEQ ID NO7 aus der US6,387,639 gekennzeichnet, und dies ist das Polypeptid, an das ein Autoantikörper gegen es bindet oder das zum Nachweis eines solchen Autoantikörpers verwendet wird, beispielsweise in der Form eines Polypeptids, das von einem Träger umfasst ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist IGLON5 durch SEQ ID NO1 aus der US10,962,554 gekennzeichnet, und dies ist das Polypeptid, an das ein Autoantikörper gegen es bindet oder das zum Nachweis eines solchen Autoantikörpers verwendet wird, zum Beispiel in der Form eines Polypeptids, das von einem Träger umfasst ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist DPPX durch SEQ ID NO1 aus der US9,719,993 gekennzeichnet, und dies ist das Polypeptid, an das ein Autoantikörper gegen es bindet oder das zum Nachweis eines solchen Autoantikörpers verwendet wird, beispielsweise in der Form eines Polypeptids, das von einem Träger umfasst ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind Flotillin1 und Flotillin2 durch die Datenbankcodes 075955 bzw. Q14254 gekennzeichnet, und dies sind Polypeptide, an die ein Autoantikörper bindet oder von denen eines oder mehrere zum Nachweis eines solchen Autoantikörpers verwendet wird/werden, beispielsweise in der Form von zwei Polypeptiden, die von einem Träger umfasst sind.
Weitere Antigene, an die Autoantikörper binden und die zusätzlich zu Gluk1, Gluk2, Gluk3, Gluk4 und Gluk5, vorzugsweise Gluk2, auf dem Träger immobilisiert sein können und zum Nachweis solcher Autoantikörper verwendet werden können, beispielsweise in der Form eines Polypeptids, das ein Antigen umfasst, schließen AMPA1, AMPA2, CASPR2 ( US9188587 BB), GABA B, GABA A, DPPX, IGLON5, Hu, Yo, CV2/CRMP5, Ri, Ma2, Amphiphysin, Recoverin, RGS8, DAGLA, STX1B, AK5, AP3B2, Flotillin1+2, GRM1, GRM2, GRM5, GLURD2, ITPR1 ( EP14003703.7 ), ATP1A3, NBC1 ( EP14003958.7 ), Neurochondrin ( EP15001186 ), KCNA2, Septin 3+5+6+7+11 und Sez6L2 ein. Vorzugsweise ist das Antigen mit einer neurologischen Autoimmunerkrankung, vorzugsweise Autoimmunenzephalitis, assoziiert. Vorzugsweise werden zwei, drei, vier, fünf, sechs, sieben, acht, neun, zehn, fünfzehn, zwanzig oder mehr solcher Antigene zusätzlich verwendet, mehr bevorzugt ist NMDAR eines von ihnen. Varianten, die an einen Autoantikörper binden, der mit der neurologischen Autoimmunerkrankung assoziiert ist, können verwendet werden. Diese Antigene sind im Stand der Technik beschrieben, zum Beispiel in Darnell/Posner, Paraneoplastic Syndromes, Oxford University Press, 2011.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der Begriff „ein Polypeptid, umfassend eines oder mehrere aus der Gruppe, umfassend Gluk1, Gluk2, Gluk3, Gluk4 und Gluk5“, wie hier verwendet, eines oder mehrere von Gluk1, Gluk2, Gluk3, Gluk4 und Gluk5, die, in dem Falle von zwei oder mehreren Polypeptiden separate Polypeptide, räumlich getrennt oder in einem Gemisch, oder Teil eines Polypeptids sind, wobei die zwei oder mehrere von Gluk1, Gluk2, Gluk3, Gluk4 und Gluk5 Teil eines Fusionspolypeptids sind. Ein Polypeptid kann so gestaltet sein, dass es gefaltet ist oder zusammen mit einem anderen Polypeptid einen gefalteten Komplex bildet, zum Beispiel wenn beide Polypeptide separate Untereinheiten eines Rezeptors umfassen, wie GABA A oder der Komplex, umfassend Flotillin1 und Flotillin 2. In dem Falle von Gluk1, Gluk2 und Gluk3 kann der Komplex ein homomerer Komplex sein. In dem Falle von Gluk4 oder Gluk5 umfasst er a) eines von Gluk4 oder Gluk5 und b) eines von Gluk1, Gluk2 und Gluk3. Eine Variante von jedem von Gluk1, Gluk2, Gluk3, Gluk4 und Gluk5 kann in jedem Fall verwendet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Polypeptid ein Gluk1-Homomer oder eine Variante davon. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Polypeptid ein Gluk2-Homomer oder eine Variante davon. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Polypeptid ein Gluk3-Homomer oder eine Variante davon. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Polypeptid ein Gluk4-Heteromer oder eine Variante davon. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Polypeptid ein Gluk5-Heteromer oder eine Variante davon.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung den Schritt eines Bereitstellens des Trägers gemäß der vorliegenden Erfindung. Ein Polypeptid, das eines oder mehrere aus der Gruppe, umfassend Gluk1, Gluk2, Gluk3, Gluk4 und Gluk5, vorzugsweise Gluk2, oder eine Variante davon, umfasst, kann auf einer festen Oberfläche des Trägers immobilisiert werden, oder die Mittel können zur Immobilisierung des Polypeptids auf dem Träger konfiguriert sein, was zu einer späteren Phase, jedoch vor einem Entfernen der Probe und Waschen des Trägers geschehen kann. Der Träger kann dann mit der Probe, die in Verdacht steht, den Antikörper zu umfassen, unter Bedingungen in Kontakt gebracht werden, die eine Bindung jeglicher Antikörper an eines oder mehrere aus der Gruppe, umfassend Gluk1, Gluk2, Gluk3, Gluk4 und Gluk5, vorzugsweise Gluk2, ermöglichen. Die Probe kann dann entfernt werden und der Träger kann gewaschen werden, um jegliche verbliebene Probe zu entfernen. Ein Mittel zum Nachweisen des Autoantikörpers, das eine nachweisbare Markierung wie einen Fluoreszenzfarbstoff trägt, kann dann mit dem Träger unter Bedingungen in Kontakt gebracht werden, die eine Bildung eines Komplexes zwischen einem jeglichen gebundenen Autoantikörper und dem Mittel ermöglichen. Der Träger kann erneut gewaschen werden. Schließlich wird das Vorliegen des Autoantikörpers nachgewiesen, indem geprüft wird, ob das Mittel, wie ein sekundärer Antikörper, nachgewiesen werden kann. Vorzugsweise wird ein ELISA oder ein Immunfluoreszenzassay unter Verwendung einer Säugetierzelle oder eines Säugetiergewebes verwendet, die/das ein Polypeptid exprimiert, das eines oder mehrere aus der Gruppe, umfassend Gluk1, Gluk2, Gluk3, Gluk4 und Gluk5, vorzugsweise Gluk2, oder eine Variante davon, umfasst. In dem Falle einer Immunfluoreszenz weist ein eindeutiges Muster, das durch das Expressionsmuster des Transporters in der Zelle oder dem Gewebe bestimmt wird, auf das Vorliegen des Antikörpers hin, wie in den Beispielen ausgeführt oder gezeigt. In dem Falle eines ELISA oder eines anderen halbquantitativen oder quantitativen Nachweisverfahrens weist ein Wert oberhalb eines Grenzwertes, der wie im Stand der Technik bekannt bestimmt wird, auf das Vorliegen des Antikörpers hin.
Ein kompetitiver Assay, ein Capture-Bridge-Assay, ein immunometrischer Assay, ein klassenspezifischer zweiter Antikörper an der festen Phase, ein direkter oder indirekter Klassen-Einfang-Assay können ebenfalls verwendet werden. Das Prinzip jedes dieser Formate wird in The Immunoassay Handbook, 3. Auflage, herausgegeben von David Wild, Elsevier, 2005, ausführlich beschrieben. Kurz gesagt kann der nachzuweisende Antikörper in einem kompetitiven Format mit einem rekombinanten Antikörper um Bindungsstellen auf dem Antigen konkurrieren, welches eines oder mehrere aus der Gruppe, umfassend Gluk1, Gluk2, Gluk3, Gluk4 und Gluk5, vorzugsweise Gluk2, oder eine Variante davon, ist. Alternativ kann in einer Reaktion eine den Antikörper umfassende Probe mit dem Antigen vorinkubiert werden, gefolgt von Exposition gegenüber immobilisiertem Antigen oder für Immobilisierung konfiguriertem Antigen, und kann in einer anderen Reaktion ohne Vorinkubation gegenüber dem Antigen exponiert werden, um eine spezifische Bindung zu zeigen. Bei einem Capture-Bridge-Assay binden zwei Antigenmoleküle an zwei Antigenbindungsstellen auf dem nachzuweisenden (Auto-)Antikörper. Eines der Antigenmoleküle ist markiert und das andere immobilisiert oder zur Immobilisierung konfiguriert, vorzugsweise über ein Affinitätstag und einen Liganden, der spezifisch an das Affinitätstag bindet. In einem immunometrischen Assay bindet der nachzuweisende Antikörper an das Antigen, das nach oder vor der Bindung immobilisiert wird. Der Antikörper wird unter Verwendung eines Mittels zum Nachweisen eines Antikörpers, wie ein markierter sekundärer Antikörper, nachgewiesen. Bei einem direkten Klassen-Einfang-Assay wird der nachzuweisende Antikörper unter Verwendung eines Mittels zum Einfangen eines Antikörpers immobilisiert und unter Verwendung eines markierten Antigens nachgewiesen. Bei einem indirekten Klassen-Einfang-Assay wird der nachzuweisende Antikörper unter Verwendung eines Mittels zum Einfangen eines Antikörpers immobilisiert. Er wird unter Verwendung von mindestens einem, vorzugsweise zwei Molekül/en des Antigens, das an den nachzuweisenden Antikörper bindet, und einem Mittel zum Nachweis eines Antikörpers, wie einem markierten Sekundärantikörper, nachgewiesen.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind der Träger und ein Mittel zum Einfangen und/oder ein Mittel zum Nachweis eines Antikörpers zum Immobilisieren des Mittels auf der festen Oberfläche des Trägers konfiguriert. Eine besonders bevorzugte Art der Konfiguration oder der Immobilisierung ist ein Modifizieren des Trägers und/oder des Mittels so, dass sie ein Affinitätstag und einen Liganden zu dem Affinitätstag umfassen. Alternativ kann der Träger oder das Mittel auch reaktive chemische Gruppen wie Thiol-, Amino-, Epoxid-, Ester- und Anhydridgruppen aufweisen. In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft der Begriff „immobilisiert“, wie er hier verwendet wird, ein Molekül, das an einen festen Träger gebunden ist, der in einer wässrigen Lösung unlöslich ist, mehr bevorzugt über eine kovalente oder nichtkovalente Bindung, elektrostatische Wechselwirkungen, Verkapselung, unspezifische Absorption, Bedrucken oder Einschluss, zum Beispiel durch Denaturieren eines globulären Polypeptids in einem Gel, oder über hydrophobe Wechselwirkungen, am meisten bevorzugt über eine oder mehrere kovalente Bindungen. Verschiedene geeignete Träger, zum Beispiel Papier, Polystyrol, Metall-, Silizium- oder Glasoberflächen, mikrofluidische Kanäle, Membranen, Beads wie magnetische Beads, Säulenchromatographiemedien, Biochips, Polyacrylamidgele und dergleichen wurden in der Literatur beschrieben, zum Beispiel in Kim, D., und Herr, A. E. (2013), Protein immobilization techniques for microfluidic assays, Biomicrofluidics 7(4), 041501. Auf diese Weise kann das immobilisierte Molekül zusammen mit dem unlöslichen Träger auf einfache Weise aus einer wässrigen Lösung abgetrennt werden, zum Beispiel durch Zentrifugieren oder Dekantieren. Ein immobilisiertes Molekül kann auf eine reversible oder irreversible Weise immobilisiert werden. Die Immobilisierung ist beispielsweise reversibel, wenn das Molekül mit dem Träger über ionische Wechselwirkungen interagiert, die durch Zugabe einer hohen Salzkonzentration maskiert werden können, oder wenn das Molekül über eine spaltbare kovalente Bindung wie eine Disulfidbrücke gebunden ist, die durch Zugabe von thiolhaltigen Reagenzien gespalten werden kann. Im Gegensatz dazu ist die Immobilisierung irreversibel, wenn das Molekül über eine kovalente Bindung, die in wässriger Lösung nicht gespalten werden kann, zum Beispiel eine Bindung, die durch Reaktion einer Epoxidgruppe und einer Amingruppe gebildet wird, wie sie häufig zur Kopplung von Lysinseitenketten an Affinitätssäulen verwendet wird, an den Träger gebunden ist. Das Protein kann indirekt immobilisiert werden, zum Beispiel durch Immobilisierung eines Antikörpers oder einer anderen Einheit, die Affinität zu dem Molekül aufweist, gefolgt von Bildung eines Komplexes, was bewirkt, dass der Molekül-Antikörper-Komplex immobilisiert wird. In der Literatur werden verschiedene Methoden zur Immobilisierung von Molekülen beschrieben, zum Beispiel in Kim, D., Herr, und A. E. (2013), Protein immobilization techniques for microfluidic assays, Biomicrofluidics 7(4), 041501. Darüber hinaus sind verschiedene Reagenzien und Kits für Immobilisierungsreaktionen kommerziell erhältlich, zum Beispiel von Pierce Biotechnology.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann eine Zelle bereitgestellt werden, die einen oder mehrere Expressionsvektoren umfasst, der/die eine Nukleotidsequenz, die ein Polypeptid kodiert, das eines oder mehrere aus der Gruppe, umfassend Gluk1, Gluk2, Gluk3, Gluk4 und Gluk5, vorzugsweise Gluk2, oder eine Variante davon, unter der Kontrolle eines Promotors, gegebenenfalls eines starken und/oder induzierbaren Promotors, umfasst, umfasst/umfassen. In dem Falle von Gluk1, Gluk2 oder Gluk3 kann die Zelle nur einen Vektor umfassen, der eine Nukleotidsequenz umfasst, die das entsprechende Polypeptid kodiert, da Homomere gebildet werden können. In dem Falle von Gluk4 und Gluk5 umfasst die Zelle mindestens zwei Vektoren, einer umfassend eine Nukleotidsequenz, die Gluk1, Gluk2 und Gluk3 kodiert, und einer umfassend eine Nukleotidsequenz, die Gluk4 oder Gluk5 kodiert. Der Vektor kann ein N-terminales oder C-terminales Affinitätstag, das an eines oder mehrere aus der Gruppe, umfassend Gluk1, Gluk2, Gluk3, Gluk4 und Gluk5, vorzugsweise Gluk2, in einem Polypeptid, das eines oder mehrere aus der Gruppe, umfassend Gluk1, Gluk2, Gluk3, Gluk4 und Gluk5, vorzugsweise Gluk2, umfasst, vorzugsweise über eine Linker-Sequenz fusioniert ist, kodieren. Die Zelle kann unter Bedingungen kultiviert werden, die die Expression von Gluk1, Gluk2, Gluk3, Gluk4 und/oder Gluk5, vorzugsweise von Gluk2, ermöglichen. Ein jegliches exprimiertes Gluk1, Gluk2, Gluk3, Gluk4 und Gluk5, vorzugsweise Gluk2, kann dann aufgereinigt werden, vorzugsweise unter Verwendung des Affinitätstags. In einigen Ausführungsformen kann jedoch auch ein nicht aufgereinigtes Gluk1, Gluk2, Gluk3, Gluk4 und Gluk5, vorzugsweise Gluk2, verwendet werden. Anschließend wird es auf dem Träger gemäß der vorliegenden Erfindung immobilisiert. In einer bevorzugten Ausführungsform kann die Zelle, die Nukleinsäure oder der Vektor zur Herstellung eines Kits für die Diagnose einer neurologischen Autoimmunerkrankung verwendet werden.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann eine medizinische oder diagnostische Vorrichtung wie der diagnostisch verwendbare Träger durch Expression eines rekombinanten Polypeptids, das eine Variante eines oder mehrerer aus der Gruppe, umfassend Gluk1 , Gluk2, Gluk3, Gluk4 und Gluk5, vorzugsweise Gluk2, die ein Affinitätstag, gegebenenfalls mit einem künstlichen Linker, der eine Protease-Spaltstelle einschließen kann, umfasst, in einer Zelle wie einer eukaryotischen oder prokaryotischen Zelle hergestellt werden. Inkontaktbringen des Polypeptids mit einem Liganden, der spezifisch an das Affinitätstag bindet, wobei der Ligand an einer festen Phase immobilisiert ist, Waschen der festen Phase, so dass nicht-spezifisch gebundenes Material von der Zelle entfernt wird, und Eluieren der exprimierten Variante von der festen Phase, vorzugsweise durch Zugabe eines Überschusses an nicht-immobilisiertem Liganden. Die Variante kann dann an der Vorrichtung immobilisiert werden. Gegebenenfalls kann das Affinitätstag durch Inkontaktbringen der Variante mit einer Protease, vorzugsweise einer Protease, die die Proteaseschnittstelle erkennt, vor der Immobilisierung entfernt werden. Das Affinitätstag kann ausgewählt sein aus der Gruppe von Tags, umfassend His, immobilisiertes Nickel, Glutathion, Chitin, 18A, ACP, Aldehyd, Avi, BCCP, Calmodulin, chitinbindendes Protein, E-Tag, ELK16, FLAG, Flash, Polyglutamat, Polyaspartat, GST, GFP, HA, Isope, maltosebindendes Protein, myc, nus, NE, ProtA, ProtC, Tho1d4, S-Tag, SnoopTag, SpyTag, SofTag, Streptavidin, Strep-Tag II, T7-Epitop-Tag, TAP, TC, Thioredoxin, Ty, V5, VSV, Biotin, Xpress-Tag und einen rekombinanten Antikörper, der an den Liganden zu einem Affinitätstag bindet. Verwendbare Proteasen schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf, TEV, Thrombin, Faktor Xa oder Enteropeptidase. Geeignete Linker sind Teil von Vektoren, zum Beispiel der pET-Vektorserie (Novagen).
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Fehlen oder Vorliegen von zwei oder mehreren Antikörpern gegen zwei oder mehrere Antigene simultan, d. h. zur gleichen Zeit, nachgewiesen.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird das Vorliegen oder Fehlen mindestens eines anderen Autoantikörpers als eines Antikörpers, der spezifisch an eines oder mehrere aus der Gruppe, umfassend Gluk1, Gluk2, Gluk3, Gluk4 und Gluk5, vorzugsweise Gluk2, bindet, vorzugsweise aus der Gruppe, umfassend einen Autoantikörper, der spezifisch an NMDAR bindet, einen Autoantikörper, der spezifisch an Lgl1 bindet, einen Autoantikörper, der spezifisch an AMPA1 bindet, einen Autoantikörper, der spezifisch an AMPA2 bindet, einen Autoantikörper, der spezifisch an CASPR2 bindet, einen Autoantikörper, der spezifisch an GABA B bindet, einen Autoantikörper, der spezifisch an GABA A bindet, einen Autoantikörper, der spezifisch an DPPX bindet, einen Autoantikörper, der spezifisch an IGLON5 bindet, einen Autoantikörper, der spezifisch an Hu bindet, einen Autoantikörper, der spezifisch an Yo bindet, einen Autoantikörper, der spezifisch an CRMP5 bindet, einen Autoantikörper, der spezifisch an Ri bindet, einen Autoantikörper, der spezifisch an Ma2 bindet, einen Autoantikörper, der spezifisch an Amphiphysin bindet, einen Autoantikörper, der spezifisch an Recoverin bindet, einen Autoantikörper, der spezifisch an RGS8 bindet, einen Autoantikörper, der spezifisch an DAGLA bindet, einen Autoantikörper, der spezifisch an NSF bindet, einen Autoantikörper, der spezifisch an STX1B bindet, einen Autoantikörper, der spezifisch an DNM1 bindet, einen Autoantikörper, der spezifisch an VAMP2 bindet, einen Autoantikörper, der spezifisch an Anna-3 bindet, einen Autoantikörper, der spezifisch an Zic-4 bindet, einen Autoantikörper, der spezifisch an SOX1 ( US7314721 ) bindet, einen Autoantikörper, der spezifisch an PCA2 bindet, einen Autoantikörper, der spezifisch an Tr bindet, einen Autoantikörper, der spezifisch an Glutaminsäure-Decarboxylase bindet, einen Autoantikörper, der spezifisch an AK5 bindet, einen Autoantikörper, der spezifisch an AP3B2 bindet, einen Autoantikörper, der spezifisch an Flotillin1/2 bindet, einen Autoantikörper, der spezifisch an GRM1 bindet, einen Autoantikörper, der spezifisch an GRM2 bindet, einen Autoantikörper, der spezifisch an GRM5 bindet, einen Autoantikörper, der spezifisch an GLURD2 bindet, einen Autoantikörper, der spezifisch an ITPR1 bindet, einen Autoantikörper, der spezifisch an KCNA2 bindet, einen Autoantikörper, der spezifisch an NCDN bindet, einen Autoantikörper, der spezifisch an Septin 3+5+6+7+11 bindet, und einen Autoantikörper, der spezifisch an Sez6L2 bindet, nachgewiesen. In einer bevorzugten Ausführungsform unterstützt der Nachweis des Vorliegens eines jeglichen dieser Autoantikörper bei der Diagnose einer neurologischen Autoimmunerkrankung oder impliziert eine solche Diagnose. In einer bevorzugten Ausführungsform werden zwei oder mehrere Autoantikörper in der gleichen Probe und vorzugsweise im Wesentlichen simultan nachgewiesen. Der erfindungsgemäße Träger kann zum Nachweisen von zwei oder mehreren Autoantikörpern in der gleichen Probe, vorzugsweise im Wesentlichen simultan, konfiguriert sein. In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Träger, das Polypeptid oder das Kit gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet, um das Vorliegen oder Fehlen von zwei oder mehreren Autoantikörpern nachzuweisen, von denen einer spezifisch an Gluk1, Gluk2, Gluk3, Gluk4 oder Gluk5, vorzugsweise Gluk5, bindet, mehr bevorzugt zur Diagnose oder zur Unterstützung der Diagnose eines Lebewesens oder zur Bestimmung, ob die Probe von einem Lebewesen mit einer erhöhten Wahrscheinlichkeit stammt, in der Vergangenheit, Gegenwart und/oder Zukunft an einer Krankheit wie einer Krebserkrankung und/oder einer neurologischen Autoimmunerkrankung, vorzugsweise einer neurologischen Autoimmunerkrankung, zu leiden.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Vorliegen oder Fehlen von zwei oder mehreren Antikörpern nachgewiesen und kann unterschieden werden. Mit anderen Worten weis ein Signal, das auf das Vorliegen eines Antikörpers hinweist, darauf hin, welcher der beiden Antikörper vorliegt. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Fehlen oder Vorliegen von zwei oder mehreren Antikörpern in räumlich getrennten Reaktionen, mehr bevorzugt in verschiedenen Reaktionsgemischen in getrennten Gefäßen, nachgewiesen. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform kann ein Signal, das auf das Vorliegen eines der beiden Autoantikörper hinweist, von einem Signal unterschieden werden, das auf das Vorliegen des anderen Autoantikörpers hinweist. Dies kann durch Verwenden unterschiedlicher nachweisbarer Markierungen, mehr bevorzugt unterscheidbarer Fluorophore, erreicht werden. Beispielsweise können ein Fluorophor, das grünes Licht emittiert, und ein anderes, das rotes Licht emittiert, verwendet werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Vorliegen oder Fehlen von zwei oder mehreren Antikörpern nachgewiesen, kann jedoch nicht unterschieden werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird ihr Fehlen oder Vorliegen in einer Ein-Topf-Reaktion, vorzugsweise in zwei oder mehreren Reaktionen in dem gleichen Reaktionsgefäß ohne räumliche Trennung und ohne Signalunterscheidung nachgewiesen. Mit anderen Worten weist ein Signal darauf hin, dass mindestens einer der beiden Antikörper vorliegt, aber nicht welcher. In einer bevorzugten Ausführungsform können zwei oder mehrere Antigene in einem Gemisch vorliegen.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Probe einen repräsentativen Satz von Antikörpern, mehr bevorzugt IgG-, -IgA- und -IgM-Klasse-Antikörper, am meisten bevorzugt IgG-Klasse-Antikörper. Sie ist vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe, umfassend Vollblut, Plasma, Serum, zerebrospinale Flüssigkeit und Speichel. Die Probe kann eine flüssige Probe oder ein getrockneter Blutpunkt sein, der unter Verwendung der Probe, vorzugsweise Vollblut, Plasma, Serum oder Kapillarblut, vorzugsweise Kapillarblut, hergestellt wurde.
In einer bevorzugten Ausführungsform stammt die Probe von einem Organismus, der ein Hirn aufweist und Autoantikörper produziert, vorzugsweise aus der Gruppe, umfassend Säugetier und Vögel, mehr bevorzugt von einem Säugetier aus der Gruppe, umfassend einen Menschen, einen nichtmenschlichen Primaten, ein Nagetier, eine Kuh, ein Pferd, einen Hund, eine Katze, einen Bären, einen Esel, ein Schaf, eine Ziege, ein Kamel und ein Dromedar, am meisten bevorzugt einen Menschen. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform stammt sie von einem Vogel, mehr bevorzugt aus der Gruppe, umfassend ein Huhn, einen Papageien und einen Falken. Das Tier kann eine umfangreiche Ausbildung durchlaufen haben, zum Beispiel zur Unterstützung von Menschen, die dessen bedürfen, zum Reiten oder zur Jagd.
Der nachzuweisende Autoantikörper oder ein Mittel zum Nachweisen oder Einfangen eines Antikörpers bindet spezifisch an seinen Interaktionspartner, der ein Antigen in dem Falle eines Autoantikörpers oder ein Antikörper in dem Falle eines Mittels zum Nachweisen eines Antikörpers ist, wobei der Autoantikörper vorzugsweise spezifisch an eines oder mehrere aus der Gruppe, umfassend Gluk1, Gluk2 und Gluk3, vorzugsweise Gluk2, bindet. In einer bevorzugten Ausführungsform bedeutet der Begriff „spezifisch bindend“, wie er hier verwendet wird, vorzugsweise, dass die Bindungsreaktion stärker ist als eine Bindungsreaktion, die durch eine Dissoziationskonstante von 1 × 10^-5 M, mehr bevorzugt 1 × 10^-1 M, mehr bevorzugt 1 × 10^-1 M, mehr bevorzugt 1 × 10^-9 M, mehr bevorzugt 1 × 10^-11 M, mehr bevorzugt 1 × 10^-11 M, mehr bevorzugt 1 × 10^-12 M gekennzeichnet ist, wie durch Oberflächenplasmonenresonanz unter Verwendung von Biacore-Ausrüstung bei 25 °C in PBS-Puffer bei pH-Wert 7 bestimmt.
In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft der Begriff „Autoantikörper“, wie er hier verwendet wird, einen Antikörper, der spezifisch an eine Struktur, vorzugsweise ein Antigen, aus dem Organismus bindet, der den Antikörper produziert. Der Organismus ist vorzugsweise ein Patient, bei dem der Verdacht auf eine Krankheit besteht oder der tatsächlich an einer Krankheit leidet, vorzugsweise ein Säugetier-, mehr bevorzugt ein menschlicher, Patient. Ein solcher Autoantikörper weist eine konstante Region auf, wie auch andere Antikörper der gleichen Klasse aus dem gleichen Organismus aufweisen. Besonders bevorzugt ist der Autoantikörper ein Säugetier-Autoantikörper, noch mehr bevorzugt ein menschlicher Autoantikörper, noch mehr bevorzugt ein menschlicher Autoantikörper der Klasse IgG, IgM oder IgA, vorzugsweise IgG. Die variable Domäne ist in der Lage, spezifisch an das Antigen zu binden. Die konstante Domäne bindet spezifisch an Moleküle, die die konstante Domäne von IgG-Klasse-Antikörpern erkennen, wie sekundäre Antikörper.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Antikörper bereitgestellt oder isoliert, der spezifisch an ein Polypeptid aus der Gruppe, umfassend Gluk1, Gluk2, Gluk3, Gluk4 und Gluk5, vorzugsweise Gluk2, bindet. Der Fachmann ist mit der Isolierung oder Aufreinigung von Antikörpern vertraut. Umfassende Anleitungen sind im Stand der Technik verfügbar, zum Beispiel in Affinity Chromatography Bd. 1 Antibody von GE Healthcare, April 2016 und Thermo Scientific Pierce Antibody Production and Purification Technical Handbook, Version 2, www.thermoscientific.com. Spezifische Aufreinigungsschritte können beispielsweise Affinitätschromatographie unter Verwendung eines Polypeptids, umfassend Gluk1, Gluk2, Gluk3, Gluk4 oder Gluk5, vorzugsweise Gluk2, oder eine Variante davon, das durch Kopplung unter Verwendung primärer Amine und/oder Protein G an Beads immobilisiert ist, umfassen.
Die Lehren der vorliegenden Erfindung können nicht nur unter Verwendung der Polypeptide, insbesondere eines Polypeptids, das die native Sequenz eines genannten Polypeptids umfasst, wie eines oder mehrere aus der Gruppe, umfassend Gluk1, Gluk2, Gluk3, Gluk4 und Gluk5, vorzugsweise Gluk2, oder von Nukleinsäuren, die die genauen Sequenzen aufweisen, auf die in dieser Anmeldung explizit, beispielsweise durch Funktion, Name, Sequenz oder Hinterlegungsnummer, oder implizit Bezug genommen wird, sondern auch unter Verwendung von Varianten solcher Polypeptide oder Nukleinsäuren durchgeführt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform kann der Begriff „Variante“, wie er hier verwendet wird, mindestens ein Fragment der Volllängensequenz, auf die Bezug genommen wird, insbesondere eine oder mehrere Aminosäure- oder Nukleinsäuresequenz/en, die im Vergleich zu der Volllängensequenz an einem oder beiden Termini um eine oder mehrere Aminosäuren verkürzt ist/sind, betreffen. Ein solches Fragment umfasst oder kodiert ein Peptid, das mindestens 6, 7, 8, 10, 12, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 620, 640 oder 660 aufeinanderfolgenden Aminosäuren der ursprünglichen Sequenz oder einer Variante davon aufweist. Die Gesamtlänge der Variante kann mindestens 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 450, 500, 520, 540, 560, 580, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 680, 700, 720, 740, 760, 780, 800, 820, 840, 860, 880 oder 900 oder mehr Aminosäuren betragen.
Der Begriff „Variante“ betrifft nicht nur mindestens ein Fragment, sondern auch ein Polypeptid oder ein Fragment davon, das Aminosäuresequenzen umfasst, die mindestens 40, 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,3, 99,4, 99,5, 99,6, 99,7, 99,8 oder 99,9, vorzugsweise mindestens 99,3 % identisch mit der Referenzaminosäuresequenz, auf die Bezug genommen wird, oder dem Fragment davon sind, wobei andere Aminosäuren als jene, die für die biologische Aktivität, zum Beispiel die Fähigkeit eines Antigens, an einen (Auto- )Antikörper zu binden, oder die Faltung oder Struktur des Polypeptids, essentiell sind, deletiert oder substituiert werden und/oder eine oder mehrere solcher essentiellen Aminosäuren auf eine konservative Weise ersetzt werden und/oder Aminosäuren hinzugefügt werden, so dass die biologische Aktivität des Polypeptids erhalten bleibt. Der Stand der Technik umfasst verschiedene Verfahren, die verwendet werden können, um zwei gegebene Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenzen zu alignen und den Identitätsgrad zu berechnen, siehe beispielsweise Arthur Lesk (2008), Introduction to bioinformatics, Oxford University Press, 2008, 3. Auflage. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Software ClustalW (Larkin, M. A., Blackshields, G., Brown, N. P., Chenna, R., McGettigan, P. A., McWilliam, H., Valentin, F., Wallace, I. M., Wilm, A., Lopez, R., Thompson, J. D., Gibson, T. J., Higgins, D. G. (2007): Clustal W and Clustal X, Version 2.0, Bioinformatics, 23, 2947-2948) unter Verwendung der Standardeinstellungen verwendet. Beim Desing von Varianten von Gluk1, Gluk2, Gluk3, Gluk4 oder Gluk5 wird der Fachmann vorzugsweise bedenken, dass der zu detektierende Autoantikörper an extrazelluläre Epitope bindet, deren Lage Datenbankeinträgen entnommen werden kann. Extrazelluläre Domänen von Gluk2 schließen zum Beispiel SEQ ID NO6 und SEQ ID NO7 ein. Dem Fachmann ist bekannt, dass Autoantikörper oft am besten an konformationelle Epitope binden. Daher wird die Verwendung eines Antigens, das gefaltete Teile der extrazellulären Domäne umfasst, bevorzugt. Zum Design von Varianten des NMDAR können verschiedene Veröffentlichungen herangezogen werden. Sharma et al. offenbarten, dass die N-terminale Domäne für die Epitop-Autoantikörper-Erkennung wesentlich ist (Sharma, R., A-Saleem, F. H., Puligedda, R. D., Rattelle, A., Lynch, D. R., und Dessain, S. K. (2018) Membrane-bound and soluble forms of an NMDA receptor extracellular domain retain epitopes targeted in auto-immune encephalitis, BMC Biotechnology 18:41). Sie zeigen, dass sie in einem Fusionsprotein verwendet werden kann. Es ist wichtig, dass mindestens eine NR1-Untereinheit verbleibt, die Aminosäuren 25-380 der NR1-Untereinheit umfasst, da die Erfinder der US7,972,976 gezeigt haben, dass dies der Teil des Antigens ist, der für Erkennung des Autoantikörpers wesentlich ist. Weitere Hinweise auf Grundlage ortsgerichteter Mutagenese können bei Gleichman et al. (2012) gefunden werden, die ein Epitop identifizierten, das N368 und G369 umfasst (Gleichman, A.J., Spruce, L. A., Dalmau, J., Seeholzer, S. H., and Lynch, D. R. (2012) Anti-NMDA Receptor Encephalitis Antibody binding Is Dependent on Amino Acid Identity of a Small Region within the GluN1 Amino Terminal Domain, J. Neuroscience, 32(32)11083-11094).
In einer bevorzugten Ausführungsform können das Polypeptid und Varianten davon zusätzlich chemische Modifikationen aufweisen, zum Beispiel Isotopenmarkierungen oder kovalente Modifikationen wie Glykosylierung, Phosphorylierung, Acetylierung, Decarboxylierung, Citrullinierung, Methylierung, Hydroxylierung und dergleichen. Der Fachmann ist mit Verfahren zur Modifizierung von Polypeptiden vertraut. Eine jegliche Modifikation ist so designt, dass sie die biologische Aktivität der Variante nicht aufhebt.
Darüber hinaus können Varianten auch durch N- oder/und C-terminale Fusion von Polypeptiden, Fragmenten oder Varianten davon mit anderen bekannten Polypeptiden oder Varianten davon oder künstlichen Sequenzen wie Linkern erzeugt werden und aktive Teile oder Domänen umfassen, die vorzugsweise eine Sequenzidentität von mindestens 70, 75, 80, 85, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98 oder 99 % aufweisen, wenn sie mit dem aktiven Teil der Referenzsequenz alignt werden, wobei der Begriff „aktiver Teil“, wie er hier verwendet wird, eine Aminosäuresequenz betrifft, die weniger als die Volllängen-Aminosäuresequenz ist bzw., in dem Falle einer Nukleinsäuresequenz, weniger als die Volllängen-Aminosäuresequenz kodiert, und/oder eine Variante der natürlichen Sequenz ist, aber mindestens einen Teil der biologischen Aktivität beibehält. Vorzugsweise ist der aktive Teil ein aktiver Teil von einem oder mehreren aus der Gruppe, umfassend Gluk1, Gluk2, Gluk3, Gluk4 und Gluk5, vorzugsweise Gluk2. Das Polypeptid kann zusätzliche Sequenzen, vorzugsweise künstliche Sequenzen, beispielsweise Linker oder Bindungsepitope, umfassen. Jegliche fusionierten Sequenzen sind so gewählt, dass die Fähigkeit eines oder mehrerer aus der Gruppe, umfassend Gluk1, Gluk2, Gluk3, Gluk4 und Gluk5, vorzugsweise Gluk2, oder einer Variante davon, spezifisch an den nachzuweisenden Antikörper zu binden, oder die diagnostische Zuverlässigkeit, insbesondere Sensitivität und/oder Spezifität, nicht wesentlich verändert, geschweige denn aufgehoben wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der Begriff „Variante“ einer Nukleinsäure Nukleinsäuren, deren komplementärer Strang, vorzugsweise unter stringenten Bedingungen, mit der Referenz- oder Wildtyp-Nukleinsäure hybridisiert. Stringenz von Hybridisierungsreaktionen kann von einem Fachmann ohne weiteres bestimmt werden und ist im Allgemeinen eine empirische Berechnung, die von Sondenlänge, Waschtemperatur und Salzkonzentration abhängt. Im Allgemeinen erfordern längere Sonden höhere Temperaturen für eine ordnungsgemäße Anlagerung, während kürzere Sonden dies weniger tun. Hybridisierung hängt im Allgemeinen von der Fähigkeit denaturierter DNA ab, sich an komplementäre Stränge, die in einer Umgebung unterhalb ihrer Schmelztemperatur vorliegen, wieder anzulagern: Je höher der Grad der gewünschten Homologie zwischen der Sonde und der hybridisierbaren Sequenz ist, desto höher ist die relative Temperatur, die verwendet werden kann. Als ein Ergebnis folgt daraus, dass höhere relative Temperaturen tendenziell die Reaktionsbedingungen stringenter machen würden, während niedrigere Temperaturen dies weniger tun. Für weitere Einzelheiten und Erläuterungen zur Stringenz von Hybridisierungsreaktionen siehe Ausubel, F. M. (1995), Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, Inc. Darüber hinaus kann der Fachmann die Anweisungen, die in dem Handbuch Boehringer Mannheim GmbH (1993) The DIG System Users Guide for Filter Hybridization, Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim, Deutschland und in Liebl, W., Ehrmann, M., Ludwig, W., und Schleifer, K. H. (1991) International Journal of Systematic Bacteriology 41: 255-260 zur Identifizierung von DNA-Sequenzen durch Mittel zur Hybridisierung gegeben werden, befolgen. In einer bevorzugten Ausführungsform werden für eine jegliche Hybridisierung stringente Bedingungen angewandt, d. h. Hybridisierung tritt nur auf, wenn die Sonde zu 70 % oder mehr mit der Zielsequenz identisch ist. Sonden, die einen geringeren Identitätsgrad in Bezug auf die Zielsequenz aufweisen, können hybridisieren, aber solche Hybride sind instabil und werden in einem Waschschritt unter stringenten Bedingungen entfernt werden, zum Beispiel durch Absenken der Salzkonzentration auf 2 × SSC oder, gegebenenfalls und anschließend, auf 0,5 × SSC, während die Temperatur, in Reihenfolge zunehmender Bevorzugung, etwa 50°C - 68°C, etwa 52°C - 68°C, etwa 54°C - 68°C, etwa 56°C - 68°C, etwa 58°C - 68°C, etwa 60°C - 68°C, etwa 62°C - 68°C, etwa 64°C -68°C, etwa 66°C - 68°C beträgt. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform beträgt die Temperatur etwa 64°C - 68°C oder etwa 66°C - 68°C. Es ist möglich, die Salzkonzentration auf 0,2 × SSC oder sogar 0,1 × SSC einzustellen. Nukleinsäuresequenzen können isoliert werden, die einen Identitätsgrad in Bezug auf die Referenz- oder Wildtypsequenz von mindestens 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 % aufweisen. In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft der Begriff Variante einer Nukleinsäuresequenz, wie er hier verwendet wird, eine jegliche Nukleinsäuresequenz, die die gleiche Aminosäuresequenz, vorzugsweise eine oder mehrere aus der Gruppe, umfassend Gluk1, Gluk2, Gluk3, Gluk4 und Gluk5, vorzugsweise Gluk2, und eine Variante davon, wie die Referenz-Nukleinsäuresequenz, im Einklang mit der Degeneriertheit des genetischen Codes, kodiert.
In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft der Begriff „Sensitivität“ die Anzahl korrekt als positiv bestimmter Proben im Verhältnis zu der Gesamtzahl untersuchter Proben. In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft der Begriff „Spezifität“ die Anzahl korrekt als negativ bestimmter Proben im Verhältnis zu der Gesamtzahl untersuchter Proben.
Die Variante des Polypeptids, insbesondere eines oder mehrerer aus der Gruppe, umfassend Gluk1, Gluk2 und Gluk3, vorzugsweise Gluk2, weist biologische Aktivität auf. In einer bevorzugten Ausführungsform ist eine solche biologische Aktivität die Fähigkeit, spezifisch an einen Autoantikörper zu binden, der spezifisch an eines oder mehrere aus der Gruppe, umfassend Gluk1, Gluk2, Gluk3, Gluk4 und Gluk5, vorzugsweise Gluk2, oder ein anderes Antigen wie NMDAR bindet, wie bei einem Patienten gefunden, der an einer neurologischen Autoimmunerkrankung leidet, die mit dem Vorliegen eines solchen Autoantikörpers in einer Probe verbunden ist, vorzugsweise Autoimmunenzephalitis. Ob eine Variante des Polypeptids eine solche biologische Aktivität aufweist oder nicht, kann beispielsweise dadurch überprüft werden, dass bestimmt wird, ob sie spezifisch an einen Autoantikörper aus einer Probe eines solchen Patienten, der einen Autoantikörper umfasst, der spezifisch an Wildtyp-Antigen bindet, vorzugsweise wie bestimmt durch indirekte Immunfluoreszenz, wie in dem experimentellen Teil dieser Anmeldung beschrieben, bindet oder nicht. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Isoform von Gluk1, die durch den Uniprot-Datenbankcode P39086-2 dargestellt wird, eine Variante von Gluk1. In einer bevorzugten Ausführungsform sind Isoformen von Gluk2, einschließlich derjenigen, die durch die Uniprot-Datenbankcodes Q13002-2, Q13002-3, Q13002-4, Q13002-5, Q13002-6 und Q13002-7 dargestellt werden, Varianten von Gluk2. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Isoform von Gluk3, die durch den Uniprot-Datenbankcode Q13003-2 dargestellt wird, eine Variante von Gluk3. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Isoform von Gluk5, die durch den Uniprot-Datenbankcode Q16478-2 dargestellt wird, eine Variante von Gluk5.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine Zelle, die ein Polypeptid überexprimiert, das eines oder mehrere aus der Gruppe, umfassend Gluk1, Gluk2, Gluk3, Gluk4 und Gluk5, vorzugsweise Gluk2, oder eine Variante davon, umfasst, vorzugsweise in Kombination mit mindestens einer zusätzlichen Zelle, die ein anderes Antigen aus der Gruppe, umfassend Hu, Yo, Ri, CV2, PNMA1, PNMA2, DNER/Tr, ARHGAP26, ITPR1 ( EP14003703.7 ), ATP1A3, NBC1 ( EP14003958.7 ), Neurochondrin ( EP15001186 ), CARPVIII, Zic4, SOX1 ( US7314721 ), Ma, MAG, MP0, MBP, GAD65, Amphiphysin, Recoverin, GABA A-Rezeptor, GABA B-Rezeptor, Glycinrezeptor, Gephyrin, IgLON5, DPPX, Aquaporin-4, MOG, NMDA-Rezeptor, AMPA-Rezeptoren, GRM1, GRM5, LGI1, VGCC, mGluR1, CASPR2, ATP1A3, auch bezeichnet als Alpha-3-Untereinheit der menschlichen neuronalen Na(+)/K(+)-ATPase ( EP14171561.5 ) und Flotillin1/2 ( EP3101424 ), eine Variante davon, umfasst in einem Polypeptid, vorzugsweise NMDA-Rezeptor (NMDAR), bereitgestellt.
In einer bevorzugten Ausführungsform bedeutet der Begriff „überexprimierend“, wie er hier verwendet wird, dass die Zelle mit einer Nukleinsäure transfiziert wurde, die eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die ein Polypeptid kodiert, das eines oder mehrere aus der Gruppe, umfassend Gluk1, Gluk2, Gluk3, Gluk4 und Gluk5, vorzugsweise Gluk2, oder das andere Antigen oder eine Variante davon, unter der Kontrolle eines Promotors umfasst. Infolgedessen exprimiert die transfizierte Zelle mehr Polypeptid, das von dem nachzuweisenden Autoantikörper, der spezifisch bindet, erkannt wird, als es der gleiche Zelltyp normalerweise tun würde, wahrscheinlich mindestens 10, 20, 30, 50, 100, 200 oder 500 % mehr, wie durch quantitativen Western Blot beurteilt. Der Promotor kann ein induzierbarer Promotor sein, der die Induktion einer Expression durch Zugabe eines Induktors ermöglicht. Der Fachmann ist mit Protokollen und Vektoren zur transiente Überexpression eines Polypeptids in einer eukaryontischen Zelle, zum Beispiel dem pTriEx-System von Novagen, und mit Protokollen und Vektoren zur stabile Transfektion einer eukaryontischen Zelle, zum Beispiel dem pcDNA™4/TO-Vektorsystem von Invitrogen, vertraut.
In einer bevorzugten Ausführungsform können eine oder mehrere fixierte Säugetierzellen verwendet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft der Begriff „fixierte“ Zelle, wie er hier verwendet wird, eine Zelle, die mit einer reaktiven chemischen Verbindung mit dem Effekt behandelt wurde, dass die Zelle nicht mehr metabolisch aktiv ist, aber immer noch ihre Epitope zur Immunfärbung mit Antikörpern und deren anschließendem Nachweis, beispielsweise durch Fluoreszenz, präsentiert. Mehr bevorzugt ist die reaktive chemische Verbindung ausgewählt aus der Gruppe, umfassend Aceton, Formalin, Methanol und Ethanol oder Gemische davon, vorzugsweise alle davon. Dem Fachmann sind Protokolle bekannt, die zur Herstellung fixierter Zellen verwendet werden können.
Gemäß der vorliegenden Erfindung befindet sich die Zelle oder befinden sich die Zellen auf einem Träger zur mikroskopischen Immunfluoreszenzanalyse. Ein solcher Träger kann ein Glas-Objektträger sein. Die Zelle auf dem Glas-Objektträger kann mit einem Einbettungspuffer bedeckt sein. Ein Einbettungsmedium ist eine Flüssigkeit, die dazu beiträgt, einen nahezu physiologischen pH-Wert aufrechtzuerhalten, um die molekulare Struktur jeglicher diagnostisch relevanten Moleküle und ihrer Epitope zu erhalten, mit der Emission eines Fluoreszenzsignals kompatibel ist und einen vorzeitigen Verlust von Fluoreszenz aufgrund des Ausbleichens des Fluorophors verhindert. Sie kann ausgewählt sein aus der Gruppe, umfassend Wasser, Glycerin, natürliches Öl oder Kunststoff oder ein Gemisch davon, vorzugsweise Wasser und Glycerin. Verschiedene Zusammensetzungen sind im Stand der Technik beschrieben, zum Beispiel in „Mountants and Antifades“, veröffentlicht von Wright Cell Imaging Facility, Toronto Western Research Institute University Health Network, (https://de.scribd.com/document/47879592/Mountants-Antifades), Krenek et al. (1989) J. Immunol. Meth 117, 91-97 und Nairn etal. (1969) Clin. Exp. Immunol. 4, 697-705.
Auf die Zusammensetzung umfassend die Probe und das Einbettungsmedium kann ein Deckglas gelegt werden. Objektträger mit Deckgläsern (FB 112d-1005-1 oder ZZ 3000-0112) sind bei der EUROIMMUN Medizinische Labordiagnostika, AG erhältlich. Es kann jedoch ein jeglicher Träger verwendet werden, der mit der mikroskopischen Analyse des Fluoreszenzmusters kompatibel ist. Der Träger kann eine mock-transfizierte Zelle, die mit dem gleichen Vektor transfiziert wurde wie die Zelle, die ein Polypeptid, das eines oder mehrere aus der Gruppe, umfassend Gluk1, Gluk2, Gluk3, Gluk4 und Gluk5, vorzugsweise Gluk2, oder eine Variante davon, umfasst, überexprimiert, jedoch ohne die für letzteres kodierende Nukleinsäure, umfassen. Eine solche mock-transfizierte Zelle kann als eine Negativkontrolle dienen. Der Träger ist zur Analyse unter Verwendung eines Immunfluoreszenzmikroskops konfiguriert.
In einer bevorzugten Ausführungsform kann der Träger ein Feld umfassen, das die erfindungsgemäße Zelle umfasst. Darüber hinaus kann der Träger zusätzliche Felder umfassen. Die Felder sind vorzugsweise von einer hydrophoben Oberfläche umgeben. Jedes dieser Felder kann eine Zelle umfassen, die ein anderes Antigen oder eine Variante davon überexprimiert. Ein Feld kann einen Abschnitt von Primaten-Zerebellum, Ratten-Zerebellum oder Ratten-Hippocampus und -Thalamus umfassen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Zelle eine eukaryotische Zelle, die das Polypeptid überexprimiert, wie eine Zelle, die ausgewählt ist aus der Gruppe, umfassend HEK-, Hela-, CHO- und Jurkat-Zellen und deren Derivate. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Zelle eine rekombinante Zelle, die das Polypeptid überexprimiert, das vorzugsweise unter der Kontrolle eines heterologen starken Promotors steht.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist der diagnostisch verwendbare Träger ein Bead. Verschiedene Beads für zahlreiche Anwendungen, hauptsächlich auf Kohlenhydratbasis, zum Beispiel Sepharose oder Agarose, oder Kunststoff, sind kommerziell erhältlich. Sie können aktive oder aktivierbare chemische Gruppen wie eine Carboxyl- oder Tosyl- oder Estergruppe umfassen, die für die Immobilisierung eines Mittels zum spezifischen Einfangen eines Antikörpers verwendet werden können. Vorzugsweise sind die Beads Beads, die einen durchschnittlichen Durchmesser von 0,1 µm bis 10 µm, von 0,5 µm bis 8 µm, von 0,75 µm bis 7 µm oder von 1 µm bis 6 µm aufweisen. Vorzugsweise wird das Bead in der Form einer wässrigen Suspension, die einen Beadgehalt von 10 bis 90 %, vorzugsweise von 20 bis 80 %, vorzugsweise von 30 bis 70 %, mehr bevorzugt von 40 bis 60 % (w/w) aufweist, bereitgestellt. Der Fachmann ist mit solchen Beads vertraut (Diamandis, E. P., Christopoulos, T. K., Immunoassays, 1996, Academic Press), die kommerziell erhältlich sind, zum Beispiel Bio-Plex COOH Beads MC10026-01 oder 171-506011 von Bio-Rad. Vorzugsweise umfasst der Träger mindestens zwei Beads, eines umfassend Gluk1, Gluk2, Gluk3, Gluk4 oder Gluk5, vorzugsweise Gluk2, oder eine Variante davon und eines umfassend ein anderes Antigen.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist der Träger eine Mikrotiterplatte, umfassend mindestens 8 Vertiefungen, die für ELISA verwendet werden kann. Mindestens eine der Vertiefungen ist mit dem Mittel zum spezifischen Einfangen eines Antikörpers, entweder direkt oder indirekt, vorzugsweise eines oder mehrerer aus der Gruppe, umfassend Gluk1, Gluk2, Gluk3, Gluk4 und Gluk5, vorzugsweise Gluk2, oder eine Variante davon, beschichtet. Zur Erstellung einer Kalibrierkurve zur semiquantitativen Analyse können mindestens 3, vorzugsweise 4, mehr bevorzugt 5 Kalibratoren in definierten Konzentrationen verwendet werden. Bei Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens können die Kalibratoren, die typischerweise einen Konzentrationsbereich abdecken, der die Kalibrierungskurve abdeckt, parallel zu den Proben prozessiert und entwickelt werden. Ein sekundärer Antikörper, der eine nachweisbare Markierung wie eine enzymatisch aktive Markierung enthält, zum Beispiel eine Markierung, die Meerrettichperoxidase-Aktivität oder Alkalische-Phosphatase-Aktivität aufweist, oder ein zur Chemilumineszenz fähiges Enzym, kann bereitgestellt werden.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist der Träger ein Teststreifen, vorzugsweise ein Blot, mehr bevorzugt ein Line-Blot (Raoult, D., und Dasch, G. A. (1989), The line blot: an immunoassay for monoclonal and other antibodies. Its application to the serotyping of gramnegative bacteria. J. Immunol. Methods, 125 (1-2), 57-65; WO2013041540 ). Eines oder mehrere aus der Gruppe, umfassend Gluk1, Gluk2, Gluk3, Gluk4 und Gluk5, vorzugsweise Gluk2, oder eine Variante davon, ist/sind in der Form einer Bande oder eines Punktes auf dem Teststreifen immobilisiert. In einer bevorzugten Ausführungsform ist/sind ein oder mehrere zusätzliche Antigene darauf immobilisiert, vorzugsweise aus der Gruppe, umfassend NMDAR, Lgl1, AMPA1, AMPA2, CASPR2, GABA B, GABA A, DPPX, IGLON5, Hu, Yo, CV2/CRMP5, Ri, Ma1, Ma2, Amphiphysin, Recoverin, RGS8, DAGLA, STX1B, AK5, AP3B2, Flotillin1+2, GRM1, GRM2, GRM5, GLURD2, ITPR1, KCNA2, NCDN, SOX1, TR(DNER), Zic4, Septin 3+5+6+7+11 und Sez6L2, mehr bevorzugt NMDAR, oder eine Variante davon. Wenn zwei oder mehrere Antigene verwendet werden, sind sie vorzugsweise räumlich getrennt auf dem Träger angeordnet. Vorzugsweise beträgt die Breite der Banden mindestens 30, vorzugsweise 40, 50, 60, 70 oder 80 % der Breite des Teststreifens. Der Teststreifen kann eine oder mehrere Kontrollbanden, vorzugsweise zur Bestätigung, dass er ausreichend lange und unter angemessenen Bedingungen mit einer Probe, vorzugsweise mit Serum oder CSF, in Kontakt gekommen ist, umfassen. Der Teststreifen kann eine oder mehrere Kontrollbanden zum Bestätigen, dass er mit allen zur Bandenentwicklung erforderlichen Reagenzien oder mit einem sekundären Antikörper, vorzugsweise einem markierten sekundären Antikörper, in Kontakt gebracht wurde, umfassen. Der Teststreifen kann eine negative Kontrollbande umfassen. Der Teststreifen kann eine positive Kontrollbande umfassen. Der Teststreifen kann eine Cut-off-Kontrollbande umfassen, die auf die Mindestfärbung hinweist, die als ein Hinweis darauf gilt, dass ein Autoantikörper nachgewiesen wurde. Der Teststreifen kann zwei oder mehrere Kalibratorbanden umfassen. Verschiedene Blots sind in der Fachliteratur beschrieben, zum Beispiel in van Oss, J. C., und Regenmortel, M. H. V., Immunochemistry, 1994, Marcell Dekker, insbesondere Kapitel 35.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist der Träger ein Microarray. In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft der Begriff „Microarray“, wie er hier verwendet wird, einen Chip, der mit einer Vielzahl räumlich getrennter Antigene, vorzugsweise mindestens 5, mehr bevorzugt 10, 20, 30, 40, 50, 80 oder 100, bespottet ist. Vorzugsweise ist jedes Antigen ein Peptid, das 5 bis 25, vorzugsweise 7 bis 15 aufeinanderfolgende Aminosäuren, die ein Fragment von einem Säugetier umspannen, umfasst oder daraus besteht. Mindestens ein Antigen ist ein Polypeptid, das eines oder mehrere aus der Gruppe, umfassend Gluk1, Gluk2, Gluk3, Gluk4 und Gluk5, vorzugsweise Gluk2, oder eine Variante davon, umfasst.
Vorzugsweise sind zwei oder mehrere Antigene ein Polypeptid, das eines oder mehrere aus der Gruppe, umfassend Gluk1 , Gluk2, Gluk3, Gluk4 und Gluk5, vorzugsweise Gluk2, oder eine Variante davon, umfasst. Für den Nachweis kann ein sekundärer Antikörper, der eine Markierung, vorzugsweise eine Fluoreszenzmarkierung, umfasst, verwendet werden. Vorzugsweise wird mindestens ein zusätzliches Antigen oder eine Variante davon aufgespottet.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Mittel zum Nachweisen eines Antikörpers oder ein Antikörper verwendet, der/das ein Molekül, das spezifisch an den Antikörper bindet und einen Nachweis ermöglicht, typischerweise umfassend eine nachweisbare Markierung, ist. In einer bevorzugten Ausführungsform kann eine nachweisbare Markierung verwendet werden, um eine Population von Molekülen unter Verwendung biophysikalischer Nachweisverfahren von anderen zu unterscheiden. Sie ist vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe, umfassend eine fluoreszierende, eine radioaktive, eine chemilumineszierende Markierung, ein Schwermetall wie eine Goldmarkierung, ein Nanopartikel, ein Bead oder eine enzymatisch aktive Markierung, vorzugsweise eine, die eine kolorimetrische Reaktion katalysiert. In einer bevorzugten Ausführungsform ist eine fluoreszierende Markierung ausgewählt aus der Gruppe, umfassend Alexa-Farbstoffe, FITC, TRITC und grün fluoreszierendes Protein (GFP). Jod-125 kann als radioaktive Markierung verwendet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform ist eine enzymatisch aktive Markierung ausgewählt aus der Gruppe, umfassend Meerrettichperoxidase, Glukoseoxidase, Beta-Galaktosidase, alkalische Phosphatase und Luziferase. In einer bevorzugten Ausführungsform ist eine chemilumineszente Markierung ausgewählt aus der Gruppe, umfassend Luminol oder ein Derivat, einen Acridiniumester und Luziferase. Der Fachmann ist in der Lage, geeignete Markierungen auszuwählen und sie an Proteine, Nukleinsäuren und andere Moleküle zu binden (Hassanzadeh L, Chen S, Veedu RN. Radiolabeling of Nucleic Acid Aptamers for Highly Sensitive Disease-Specific Molecular Imaging. Pharmaceuticals (Basel). 2018;11(4):106. Veröffentlicht am 15. Okt. 2018. doi: 10.3390/ph11040106, Hassanzadeh L, Chen S, Veedu RN. Radiolabeling of Nucleic Acid Aptamers for Highly Sensitive Disease-Specific Molecular Imaging. Pharmaceuticals (Basel). 2018;11(4):106. Veröffentlicht am 15. Okt. 2018. doi: 10.3390/ph 11040106, Bioconjugate Techniques, 3. Auflage (2013) von Greg T. Hermanson, Obermaier C, Griebel A, Westermeier R. Principles of protein labeling techniques. Methods Mol Biol. 2015; 1295: 153-65), und eine breite Palette markierter Moleküle ist kommerziell verfügbar. Gemäß der vorliegenden Erfindung ist ein Mittel zum Einfangen eines Antikörpers wie eines IgG-Klasse-Antikörpers ein Molekül, das spezifisch an den zu immobilisierenden Antikörper bindet und in der Lage ist, ihn zu immobilisieren, entweder weil es selbst immobilisiert oder zur Immobilisierung konfiguriert ist, vorzugsweise über ein Affinitätstag. Es kann ein sekundärer Antikörper, der an eine Klasse von Antikörpern, vorzugsweise an IgG-Klasse-Antikörper, mehr bevorzugt an humane IgG-Klasse-Antikörper, bindet, oder ein Aptamer oder ein Protein, wie Protein G, sein. Das Mittel zum Nachweisen eines eingefangenen Antikörpers ist ein Ligand, der spezifisch an eines oder mehrere aus der Gruppe, umfassend Gluk1, Gluk2, Gluk3, Gluk4 und Gluk5, vorzugsweise Gluk2, oder ein anderes Antigen bindet. Das Mittel zum Nachweisen eines immobilisierten Antikörpers ist ein Ligand, der spezifisch an die Klasse des nachzuweisenden Antikörpers bindet und kann ausgewählt sein aus der Gruppe, umfassend einen sekundären Antikörper und einen spezifisch bindenden Liganden, Protein G oder eine Variante davon oder ein Aptamer oder einen spezifisch an den immobilisierten Antikörper bindenden Antikörper.
Gemäß der vorliegenden Erfindung ist der Begriff „sekundärer Antikörper“ in seinem weitesten Sinne so zu verstehen, dass er eine jegliche Art von „Bindungsgruppe“, vorzugsweise ein Bindungsprotein, die in der Lage ist, spezifisch an einen IgA-, IgG- und/oder IgM-Klasse-Antikörper oder ein Fragment davon, wie eine konstante Domäne einer bestimmten Ig-Klasse einer ausgewählten Spezies, vorzugsweise der menschlichen Spezies, zu binden, betrifft. Nicht einschränkende Beispiele für Bindungsgruppen schließen Antikörper, zum Beispiel Antikörper, die immunologisch oder genetisch von einer jeglichen Spezies, zum Beispiel von Mensch, Huhn, Kamel, Lama, Lamprete, Hai, Ziege, Nagetier, Kuh, Hund, Kaninchen usw., abgeleitet sind, Antikörperfragmente, -domänen oder Teile davon, zum Beispiel Fab, Fab', F(ab')₂, scFab, Fv, scFv, VH, VHH, VL, VLRs und dergleichen, Diabodies, monoklonale Antikörper (mAks), polyklonale Antikörper (pAks), mAbdAbs, von Phage-Display abgeleitete Bindemittel, Affibodies, Heterokonjugat-Antikörper, bispezifische Antikörper, Evibodies, Lipocaline, Anticaline, Affibodies, Avimere, Maxibodies, Hitzeschockproteine wie GroEL und GroES, trans-Bodies, DARPins, Aptamere, C-Typ-Lectin-Domänen wie Tetranectine, von menschlichem γ-Kristallin und menschlichem Ubiquitin abgeleitete Bindemittel wie Affiline, von der PDZ-Domäne abgeleitete Bindemittel, Skorpiontoxin und/oder Kunitz-Typ-Domäne-Bindemittel, von Fibronektin abgeleitete Bindemittel wie Adnektine, Rezeptoren, Liganden, Lektine, Streptavidin, Biotin, einschließlich Derivate und/oder Kombinationen davon, wie bi- /multispezifische Formate, die aus zwei oder mehreren dieser Bindemoleküle gebildet werden, ein. Verschiedene von Antikörpern abgeleitete und alternative (d. h. Nicht-Antikörper-) Bindungsproteingerüste, einschließlich Verfahren zu deren Herstellung, sind in der Fachwelt bekannt (z. B. zusammengefasst in Chiu ML et al., Antibodies (Basel), (2019);8(4):55; Simeon R. & Chen Z., Protein Cell. (2018);9(1):3-14; und Kapitel 7 - Non-Antibody Scaffolds aus Handbook of Therapeutic Antibodies (2007), herausgegeben von Stefan Dübel, US 7,166,697 , Rothe C & Skerra A., BioDrugs. (2018);32(3):233-243; Gebauer M & Skerra A, Curr Opin Biotechnol. (2019); 60:230-241; Feldwisch, J & Tolmachev, V. (2012) Methods Mol. Biol. 899:103-126; Wikman M et al., Protein Eng Des Sel. (2004);17(5):455-62; Silverman J et al. (2005), Nat Biotechnol 23:1556-1561; Plückthun A., Annu Rev Pharmacol Toxicol. (2015);55:489-511; Hosse RJ et al. (2006). Protein Sci 15:14-27; Hackel BJ, et al. (2008) J Mol Biol 381:1238-1252. In einer bevorzugten Ausführungsform ist ein sekundärer Antikörper ein Antikörper, der an alle Antikörper einer Antikörper- oder Immunglobulinklasse, vorzugsweise einer menschlichen Antikörperklasse, vorzugsweise IgA- und/oder IgG- und/oder IgM-Antikörper, vorzugsweise IgG, bindet. Sekundäre Antikörper können die konstante Domäne der Klasse oder ein oder mehrere Epitope in der Sequenz oder 3D-Struktur erkennen, die von Antikörpern der Ig-Klasse von Interesse geteilt werden. Sekundäre Antikörper stammen typischerweise von einem anderen Säugetier als dem Menschen oder von einem Vogel, vorzugsweise von Huhn, Kaninchen, Maus, Ratte, Pferd, Schwein, Esel, Ziege, Kuh, Kamel, Lama oder einem nichtmenschlichen Primaten. Ein sekundärer Antikörper kann ein monoklonaler, vorzugsweise rekombinanter Antikörper sein oder kann ein polyklonaler Antikörper sein. Eine breite Palette von ihnen ist kommerziell erhältlich.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist ein Ligand zu einem Affinitätstag, wie er hier verwendet wird, eine künstliche Einheit, die spezifisch an ein Affinitätstag bindet, typischerweise eine chemisch synthetisierte Modifikation oder ein rekombinantes Protein oder Peptid, das an ein Molekül von Interesse gebunden ist. Der Ligand zu einem Affinitätstag hängt von der Art des gewählten Affinitätstags ab und kann ausgewählt sein aus der Gruppe, umfassend His, immobilisiertes Nickel, Glutathion, Chitin, 18A, ACP, Aldehyd, Avi, BCCP, Calmodulin, Chitin-bindendes Protein, E-Tag, ELK16, FLAG, Flash, Polyglutamat, Polyaspartat, GST, GFP, HA, Isope, maltosebindendes Protein, myc, nus, NE, ProtA, ProtC, Tho1d4, S-Tag, SnoopTag, SpyTag, SofTag, Streptavidin, Strep-Tag II, T7-Epitop-Tag, TAP, TC, Thioredoxin, Ty, V5, VSV, Biotin, Xpress-Tag und ein rekombinanter Antikörper, der an den Liganden zu einem Affinitätstag bindet.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Autoantikörper, der spezifisch an eines oder mehrere aus der Gruppe, umfassend Gluk1, Gluk2, Gluk3, Gluk4 und Gluk5, vorzugsweise Gluk2, bindet, nachgewiesen oder bereitgestellt, vorzugsweise in einer Lösung, die einen/eines oder mehrere, mehr bevorzugt alle aus der Gruppe, umfassend einen künstlichen Puffer, ein Konservierungsmittel, einen Stabilisator und ein künstliches Antikoagulans, umfasst. Ein künstlicher Puffer ist ein Puffer, der synthetisch ist und/oder in dem Körper des Patienten nicht vorkommen kann oder zumindest in Konzentrationen, die weit unter der verwendeten Konzentration liegen. Der Puffer kann ausgewählt sein aus der Gruppe, umfassend Tris, Phosphat, Tricin, Acetat, MOPS, MES, Carbonat, Citrat und HEPES. In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft der Begriff „Konservierungsmittel“, wie er hier verwendet wird, eine Substanz, die mikrobielles Wachstum und/oder chemische Degradation in einer flüssigen Lösung hemmt, und kann vorzugsweise ausgewählt sein aus der Gruppe, umfassend Säure, Milchsäure, Nitrat, Nitrit, Antibiotika, einen Proteaseinhibitor und Ethanol. In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft der Begriff „Stabilisator“ eine Substanz, die die unspezifische Absorption von Protein durch das Reaktionsgefäß verhindern oder verringern wird. Sie ist bevorzugt ein nichtmenschliches Protein, mehr bevorzugt ein Rinderserumalbumin. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Autoantikörper ein Autoantikörper, der spezifisch an ein Gluk1-Homomer bindet. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Autoantikörper ein Autoantikörper, der spezifisch an ein Gluk2-Homomer bindet. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Autoantikörper ein Autoantikörper, der spezifisch an ein Gluk3-Homomer bindet. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Autoantikörper ein Autoantikörper, der spezifisch an ein Heteromer bindet, das Gluk4 und mindestens eines von Gluk1, Gluk2 und Gluk3 umfasst. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Autoantikörper ein Autoantikörper, der spezifisch an ein Heteromer bindet, das Gluk5 und mindestens eines von Gluk1, Gluk2 und Gluk3 umfasst.
Verschiedene erfindungsgemäße Verfahren oder Verwendungen können mit einer Probe von einem Lebewesen, wie hier beschrieben, durchgeführt werden. Diese Verfahren oder Verwendungen können auch als „in vitro“-Verfahren oder „in vitro“-Verwendungen bezeichnet werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft der Begriff „chemische Lösung, die mit einer nachweisbaren Markierung reaktiv ist“ eine Verbindung in einer Flüssigkeit, die bei Exposition gegenüber der nachweisbaren Markierung ein nachweisbares Signal emittiert. Die Lösung kann ein chromogenes Substrat einer enzymatisch aktiven Markierung umfassen. Beispielsweise kann 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin/H₂O₂ verwendet werden, wenn die Markierung eine Peroxidase ist. Die Lösung kann eine kleine anorganische oder organische Verbindung umfassen, die in der Lage ist, mit einer chemilumineszenten Markierung zu reagieren. In dem Falle eines Acridiniumesters wird häufig ein Gemisch aus H₂O₂ und Natriumhydroxid als die chemische Lösung verwendet. Verschiedene andere chemische Lösungen und nachweisbare Markierungen sind in der Technik bekannt (Weeks, I., Beheshti, I., McCapra, F., Campbell, A. K., Woodhead, J. S. (1983): Acridinium esters as high specific activity labels in immunoassay, Clin Chem, Band 29, Seite 1474-1479), Thermo Scientific Pierce Antibody Production and Purification Technical Handbook, Version 2, www.thermoscientific.com).
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Begriff „Diagnose“, wie er hier verwendet wird, in seinem weitestmöglichen Sinne zu verstehen und kann eine jegliche Art von Verfahren bezeichnen, das darauf abzielt, Informationen zu erhalten, die für die Beurteilung hilfreich sind, ob ein bekannter Patient oder ein anonymes Lebewesen aus einer Kohorte an einer bestimmten Krankheit oder Störung leidet oder wahrscheinlich oder wahrscheinlicher als der Durchschnitt oder ein Vergleichslebewesen, wobei letzteres vorzugsweise ähnliche Symptome aufweist, daran in der Vergangenheit, zum Zeitpunkt der Diagnose oder in der Zukunft leidet, um herauszufinden, wie die Krankheit fortschreitet oder wahrscheinlich in Zukunft fortschreiten wird, oder um das Ansprechen eines Patienten oder von Patienten im Allgemeinen auf eine bestimmte Behandlung, zum Beispiel die Verabreichung von immunsuppressiven Arzneimitteln, zu bewerten, oder um herauszufinden, ob eine Probe von einem solchen Patienten stammt. Solche Information kann für eine klinische Diagnose verwendet werden, sie kann aber auch von einem Experimental- und/oder Forschungslabor für die Zwecke allgemeiner Forschung eingeholt werden, beispielsweise um den Anteil der an der Krankheit leidenden Lebewesen in einer Patientenkohorte oder in einer Population zu bestimmen. Mit anderen Worten umfasst der Begriff „Diagnose“ nicht nur Diagnose, sondern auch Prognose und/oder Überwachung des Verlaufs einer Krankheit oder Störung, einschließlich Überwachung der Antwort eines oder mehrerer Patienten auf die Verabreichung eines Arzneimittels oder eines Arzneimittelkandidaten, um beispielsweise dessen Wirksamkeit zu bestimmen. Während das Ergebnis bei klinisch-diagnostischen Anwendungen einem bestimmten Patienten zugeordnet werden kann und einem Arzt oder einer Einrichtung, der/die den Patienten behandelt, mitgeteilt werden kann, ist dies bei anderen Anwendungen nicht unbedingt der Fall, beispielsweise bei Diagnostiken zu Forschungszwecken, wo es ausreichend sein kann, die Ergebnisse einer Probe eines anonymisierten Patienten zuzuordnen. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird der Nachweis eines Autoantikörpers, der spezifisch an eines oder mehrere aus der Gruppe, umfassend Gluk1, Gluk2, Gluk3, Gluk4 und Gluk5, vorzugsweise Gluk2, bindet, als eine definitive Diagnose einer neurologischen Autoimmunerkrankung aufgrund des Vorliegens des Autoantikörpers implizierend angesehen.
In einer bevorzugten Ausführungsform können die Verfahren und Produkte gemäß der vorliegenden Erfindung für Interaktionsstudien verwendet werden, einschließlich eines Bestimmens, ob ein Arzneimittelkandidat oder eine andere Verbindung die Bindung eines Autoantikörpers, der spezifisch an eines oder mehrere aus der Gruppe, umfassend Gluk1, Gluk2, Gluk3, Gluk4 und Gluk5, vorzugsweise Gluk2, bindet, stören kann oder einen jeglichen nachgeschalteten Prozess oder die Stärke seiner Bindung an sein Ziel beeinträchtigen kann. In einer bevorzugten Ausführungsform können sie zum Überwachen der Immunantwort, mehr bevorzugt der Entstehung und/oder des Titers von Antikörpern gegen eines oder mehrere aus der Gruppe, umfassend Gluk1, Gluk2, Gluk3, Gluk4 und Gluk5, vorzugsweise Gluk2, nach der Verabreichung einer immunogenen Zusammensetzung, die ein Polypeptid umfasst, das eines oder mehrere aus der Gruppe, umfassend Gluk1, Gluk2, Gluk3, Gluk4 und Gluk5, vorzugsweise Gluk2, oder eine immunogene Variante davon, umfasst, beispielsweise an ein Säugetier, das ein anderes Säugetier als ein Mensch, wie ein Labortier, sein kann, verwendet werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform können die Verfahren und Produkte zum Bereitstellen von Reagenzien wie einem Antikörper gegen eines oder mehrere aus der Gruppe, umfassend Gluk1, Gluk2, Gluk3, Gluk4 und Gluk5, vorzugsweise Gluk2, verwendet werden, die als eine Positivkontrolle oder ein Kalibrator für einen diagnostischen Test oder zum Entwickeln und/oder Validieren eines diagnostischen Tests dienen können. In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft der Begriff „Validieren“, wie er hier verwendet wird, ein Verfahren zum Etablieren eines Assays in einer bestimmten Umgebung basierend auf einem zuvor bekannten Prinzip und zum Bestätigen, dass er verwendbare Ergebnisse liefert. Während diese Anmeldung beispielsweise die Verwendbarkeit eines Antikörpers gegen eines oder mehrere aus der Gruppe, umfassend Gluk1, Gluk2, Gluk3, Gluk4 und Gluk5, vorzugsweise Gluk2, als einen Marker für eine Diagnose offenbart, muss ein klinisches oder Forschungslabor möglicherweise den diagnostischen Wert der Ergebnisse bestätigen, bevor es den Test routinemäßig für seine Patienten oder eine neue Gruppe von Patienten, beispielsweise eine Gruppe von Tieren, von denen möglicherweise zuvor nicht bekannt war, dass sie an einer Krankheit oder einem Zustand leiden, verwendet.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform können die Verfahren und Produkte gemäß der vorliegenden Erfindung zum Bestimmen der Konzentration eines Antikörpers, der spezifisch an eines oder mehrere aus der Gruppe, umfassend Gluk1, Gluk2, Gluk3, Gluk4 und Gluk5, vorzugsweise Gluk2, vorzugsweise Gluk2, bindet, verwendet werden. In einer mehr bevorzugten Ausführungsform ist der Antikörper ein Autoantikörper von einem Patienten, der an einer neurologischen Autoimmunerkrankung leidet. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist der Antikörper ein rekombinanter Antikörper, der an eines oder mehrere aus der Gruppe, umfassend Gluk1, Gluk2, Gluk3, Gluk4 und Gluk5, vorzugsweise Gluk2, bindet, aber von einem sekundären Antikörper erkannt wird, der spezifisch an menschliche IgG-Klasse-Antikörper, vorzugsweise IgG1-, IgG2-, IgG3- und IgG4-Isotypen, bindet. In einer mehr bevorzugten Ausführungsform muss eine solche Konzentration für Forschungszwecke, für die Herstellung oder für Überwachung der Qualität von Reagenzien, Tiermodellen oder Geräten bestimmt werden, die für die Diagnose einer neurologischen Autoimmunerkrankung verwendet werden können oder nicht.
In vielen Fällen reicht der bloße Nachweis des Autoantikörpers, in anderen Worten Nachweisen, ob in der Probe nachweisbare Mengen des Antikörpers vorliegen oder nicht, für die Diagnose aus. In einer mehr bevorzugten Ausführungsform kann dies ein Bestimmen beinhalten, ob die Konzentration mindestens 10 %, vorzugsweise 20 %, 50 %, 100 %, 200 %, 500 %, 1.000 %, 2.000 %, 2.500 %, 5.000 %, 1.0000 %, 2.0000 %, 5.0000 %, 100.000 %, 1.000.000 % oder 10.000.000 % fach höher ist als die Konzentration des Antikörpers von Interesse, die bei einem durchschnittlichen gesunden Lebewesen gefunden wird. Wenn der Autoantikörper nachgewiesen werden kann, wird dies eine wichtige Information für die Diagnose eines Klinikers sein. Sie kann auf eine erhöhte Wahrscheinlichkeit hinweisen, dass der Patient an einer Krankheit leidet.
Der Fachmann wird wissen, dass ein Kliniker für gewöhnlich nicht allein auf der Basis eines einzigen diagnostischen Parameters zu dem Schluss kommt, ob der Patient an einer Krankheit, einem Zustand oder einer Störung leidet oder wahrscheinlich leiden wird oder nicht, sondern auch andere Aspekte berücksichtigen muss, zum Beispiel das Vorliegen anderer Autoantikörper, Marker, Blutparameter, die klinische Beurteilung der Symptome eines Patienten oder die Ergebnisse medizinischer Bildgebung oder anderer nichtinvasiver Verfahren wie der Polysomnographie, um zu einer schlüssigen Diagnose zu gelangen. Siehe Baenkler H. W. (2012), General aspects of autoimmune diagnostics, in Renz, H., Autoimmune diagnostics, 2012, de Gruyter, Seite 3. Der Wert eines diagnostischen Mittels oder Verfahrens kann auch in der Möglichkeit liegen, eine Krankheit auszuschließen, wodurch die indirekte Diagnose einer anderen ermöglicht wird. In einer bevorzugten Ausführungsform entspricht die Bedeutung von jeglichen Symptomen oder Krankheiten, auf die in dieser Anmeldung Bezug genommen wird, dem Verständnis des Fachmanns an dem Anmeldetag oder vorzugsweise an dem frühesten Prioritätstag dieser Anmeldung, wie durch Lehrbücher und wissenschaftliche Veröffentlichungen nachgewiesen. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die erfindungsgemäßen Verfahren oder Verwendungen oder Produkte nicht allein verwendet, um zu einer definitiven, endgültigen Diagnose zu gelangen.
In einer bevorzugten Ausführungsform können jegliche Information oder Daten, die das Vorliegen oder Fehlen des Autoantikörpers belegen, dem Patienten oder einem den Patienten behandelnden Arzt mündlich, vorzugsweise telefonisch, in einer schriftlichen Form, vorzugsweise per Fax oder Brief, oder in einer elektronischen Form per Fax oder über das Internet, beispielsweise als eine E-Mail oder Textnachricht, mitgeteilt werden.
Die erfindungsgemäßen Lehren können auch in einem Verfahren zur Vorbeugung oder Behandlung einer Krankheit, vorzugsweise nach einer Diagnose gemäß der vorliegenden Erfindung, verwendet werden, das die Schritte a) Verringern der Konzentration von Autoantikörpern, die an das erfindungsgemäße Polypeptid binden, in dem Blut des Lebewesens und/oder b) Verabreichen einer oder mehrerer immunsuppressiver pharmazeutischer Substanzen, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe, umfassend Rituximab, Prednison, Methylprednisolon, Cyclophosphamid, Mycophenolatmofetil, intravenöses Immunglobulin, Tacrolimus, Cyclosporin, Methotrexat und Azathioprin, umfasst.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann das Vorliegen eines Antikörpers in einer qualitativen oder quantitativen Weise bestimmt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform bedeutet der Begriff „Nachweisen in einer quantitativen Weise“, wie er hier verwendet wird, dass nicht nur das Vorliegen eines Antikörpers nachgewiesen wird, sondern dass ein Ergebnis erhalten wird, das Informationen betreffend die absolute oder relative Menge des Antikörpers in der Probe einschließt. In einer mehr bevorzugten Ausführungsform wird ein Wert erhalten, der eine absolute Konzentration darstellt. In einer weiteren mehr bevorzugten Ausführungsform wird ein Wert erhalten, der eine relative Konzentration oder Konzentrationsänderung darstellt. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform, die auch als „halbquantitativer“ Ansatz bezeichnet wird, wird die Konzentration des Antikörpers in eine von mehreren Gruppen eingeordnet, am meisten bevorzugt in ein Konzentrationsfenster, das bedeutet, dass er praktisch fehlt, ein Konzentrationsfenster, das bedeutet, dass ein grenzwertiges Ergebnis erhalten wird, und ein Konzentrationsfenster, das bedeutet, dass der Antikörper vorliegt. Eine weitere Unterscheidung in Kategorien wie „schwach positives“ oder „stark positives“ Signal ist möglich.
In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft der Begriff „Autoantikörper“, wie er hier verwendet wird, einen Antikörper, der spezifisch an ein endogenes Molekül des Tieres, vorzugsweise Säugetieres, mehr bevorzugt Menschen, bindet, das den Autoantikörper produziert, wobei das Niveau eines solchen Antikörpers mehr bevorzugt im Vergleich zu dem durchschnittlichen gesunden Lebewesen erhöht ist. Der Autoantikörper kann die Sequenz konstanter Regionen eines Antikörpers des Tieres, vorzugsweise Menschen, das ihn produziert, aufweisen, aber die variable Region ist in der Lage, spezifisch an das endogene Molekül des Tieres, insbesondere an eines oder mehrere aus der Gruppe, umfassend Gluk1, Gluk2, Gluk3, Gluk4 und Gluk5, vorzugsweise Gluk2, zu binden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Autoantikörper aus einer Probe, vorzugsweise Gewebe, Serum, Plasma, Blut oder CSF des Tieres, vorzugsweise Menschen, isoliert, angereichert und/oder aufgereinigt. Der Autoantikörper kann in einer Probe vorliegen, die vorzugsweise die Art der zu untersuchenden Probe ist, mehr bevorzugt Serum oder CSF. Der Autoantikörper kann als ein Gemisch polyklonaler, nativer Antikörper aus dem Tier oder Patienten isoliert werden. Es ist kein synthetischer, monoklonaler oder rekombinanter Antikörper. Ein rekombinanter Antikörper, der spezifisch an eines oder mehrere aus der Gruppe, umfassend Gluk1, Gluk2, Gluk3, Gluk4 und Gluk5, vorzugsweise Gluk2, bindet, kann unter Verwendung von Standardverfahren hergestellt werden. Er kann als eine Positivkontrolle und für Detektionsassays, zum Beispiel Sandwich-Assays oder kompetitive Assays, verwendbar sein.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist vorzugsweise ein in vitro-Verfahren.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann ein Polypeptid, vorzugsweise das Polypeptid, das eines oder mehrere aus der Gruppe, umfassend Gluk1, Gluk2, Gluk3, Gluk4 und Gluk5, vorzugsweise Gluk2, oder eine Variante davon, umfasst, ein rekombinantes Protein sein. In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft der Begriff „rekombinant“, wie er hier verwendet wird, ein Polypeptid, das unter Verwendung gentechnischer Verfahren in einem jeglichen Stadium des Produktionsprozesses hergestellt wird, zum Beispiel durch Fusion einer Nukleinsäure, die das Polypeptid kodiert, an einen starken Promotor zur Überexpression in Zellen oder Geweben oder durch Manipulieren der Sequenz des Polypeptids selbst. Der Fachmann ist mit Verfahren zum Manipulieren von Nukleinsäuren und kodierten Polypeptiden (zum Beispiel beschrieben in Sambrook, J., Fritsch, E. F. und Maniatis, T. (1989), Molecular Cloning, CSH oder in Brown T. A. (1986), Gene Cloning - an introduction, Chapman & Hall) und zum Herstellen und Aufreinigen nativer oder rekombinanter Polypeptide (z. B. Handbücher „Strategies for Protein Purification“, „Antibody Purification“, veröffentlicht von GE Healthcare Life Sciences, und in Burgess, R. R., Deutscher, M. P. (2009): Guide to Protein Purification) vertraut. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist ein gemäß der vorliegenden Erfindung bereitgestelltes oder verwendetes Polypeptid, wie ein Polypeptid, das ein Säugetier-Gluk2 umfasst, oder eine Variante davon oder ein Antikörper, ein isoliertes Polypeptid, wobei der Begriff „isoliert“ bedeutet, dass das Polypeptid im Vergleich zu seinem Zustand bei Herstellung unter Verwendung eines biotechnologischen oder synthetischen Ansatzes angereichert wurde und vorzugsweise rein ist, d. h. mindestens 60, 70, 80, 90, 95 oder 99 Prozent des Polypeptids in der entsprechenden Flüssigkeit bestehen aus dem Polypeptid, wie durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese gefolgt von Coomassie-Blau-Färbung und visueller Inspektion beurteilt. Vorzugsweise ist ein jegliches Polypeptid auf einem Träger, das als ein Mittel zum Einfangen eines Antikörpers verwendet wird, rein.
In einer bevorzugten Ausführungsform haben Patienten, die Autoantikörper gegen eines oder mehrere aus der Gruppe, umfassend Gluk1, Gluk2, Gluk3, Gluk4 und Gluk5, vorzugsweise Gluk2, aufweisen, ein erhöhtes Risiko, an einer Vielzahl von Krebsarten, umfassend Leukämie, Graft-versus-Host-Krankheit und Non-Hodgkin-Lymphom, zu leiden. In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft der Begriff „Krebs“, wie er hier verwendet wird, eine Gruppe von Krankheiten, die abnormales Zellwachstum mit dem Potenzial, andere Teile des Körpers zu invadieren oder sich dort auszubreiten, einbeziehen.
In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft der Begriff „Non-Hodgkin-Lymphom“, wie er hier verwendet wird, eine Gruppe von Blutkrebsarten, die alle Arten von Lymphomen außer Hodgkin-Lymphomen einschließt.
Weiterer Hintergrund und Definitionen in Bezug auf Krebserkrankungen und ihre Diagnosen oder Differentialdiagnosen, einschließlich des Nachweises von Autoantikörpern, können Neurologie-Lehrbüchern entnommen werden, die zu dem frühesten Prioritätsdatum oder Anmeldedatum dieser Veröffentlichung verfügbar sind, wie Kaye, Textbook of Medical Oncology, 3. Auflage, Taylor & Francis; Shoenfeld, Meroni und Gershwin, Autoantibodies, 3. Auflage, Elsevier, insbesondere Teil 11 einschließlich Kapitel 76; und Darnell und Posner, Paraneoplastic Syndromes, Oxford University Press, 2011.
In einer bevorzugten Ausführungsform haben Patienten, die Autoantikörper gegen eines oder mehrere aus der Gruppe, umfassend Gluk1, Gluk2, Gluk3, Gluk4 und Gluk5, vorzugsweise Gluk2, aufweisen, im Vergleich zu einem Lebewesen ohne solche Autoantikörper ein erhöhtes Risiko, an einer neurologischen Autoimmunerkrankung, vorzugsweise aus der Gruppe, umfassend PNS, zerebelläre Ataxie, Gangataxie, Polyneuropathie, Enzephalitis, vorzugsweise limbische Enzephalitis, Epilepsie, Demenz, zerebelläres Syndrom und hypersensitive Enzephalopathie, und an einer Krebserkrankung, vorzugsweise aus der Gruppe, umfassend Leukämie, Graft-versus-Host-Krankheit und Non-Hodgkin-Lymphom, zu leiden. In einer bevorzugten Ausführungsform können die Verfahren, Verwendungen und Produkte gemäß der vorliegenden Erfindung zur Diagnose oder zur Unterstützung der Diagnose verwendet werden, um eine Person mit einem erhöhten Risiko, an einer solchen neurologischen Autoimmunerkrankung und/oder einem solchen Krebs zu leiden, zu identifizieren.
In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft der Begriff „Ataxie“, wie er hier verwendet wird, einen Mangel an willentlicher Koordination von Muskelbewegungen, der Ganganomalien, Sprachveränderungen und Anomalien der Augenbewegungen einschließen kann. Ataxie ist eine klinische Manifestation, die auf eine Dysfunktion der Teile des Nervensystems, die Bewegung koordinieren, wie des Zerebellums, hinweist.
In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft der Begriff „Polyneuropathie“, wie er hier verwendet wird, eine Erkrankung, die periphere Nerven (periphere Neuropathie) in etwa den gleichen Bereichen auf beiden Seiten des Körpers betrifft und sich durch Schwäche, Taubheit und brennenden Schmerz auszeichnet.
In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft der Begriff „Enzephalopathie“, wie er hier verwendet wird, einen veränderten geistigen Zustand, der durch eine Beeinträchtigung der Kognition, der Aufmerksamkeit, der Orientierung, des Schlaf-Wach-Rhythmus und des Bewusstseins gekennzeichnet ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft der Begriff „Enzephalitis“, wie er hier verwendet wird, eine Entzündung des Hirns mit Symptomen, einschließlich verminderten oder wechselnden Bewusstseins, Persönlichkeitsveränderungen, psychotischen Wahnvorstellungen, Steifheit, Kopfschmerzen, Fieber, Verwirrung, eines steifen Nackens und Erbrechen. Komplikationen können Krampfanfälle, Halluzinationen, Sprachstörungen, Gedächtnisprobleme und Probleme mit dem Hören einschließen. Die Krankheit kann die Folge einer Infektion sein oder kann eine Autoimmunerkrankung sein, so dass der Nachweis eines erfindungsgemäßen Autoantikörpers zur Unterscheidung dieser beiden Arten von Enzephalitis verwendet werden kann.
In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft der Begriff „zerebelläres Syndrom“, wie er hier verwendet wird, eine beeinträchtigte zerebelläre Funktion, die typischerweise mit Ataxie, Nystagmus und Dysarthrie verbunden ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft der Begriff „paraneoplastisches neurologisches Syndrom“ (PNS), wie er hier verwendet wird, neurologische Syndrome, die mit dem Vorliegen einer Krebserkrankung, die mit Tumoren assoziiert ist, die ein Antigen präsentiert, das normalerweise ausschließlich in dem Nervensystem vorkommt, verbunden sind. Als ein Ergebnis wird ein Autoantikörper gebildet, der spezifisch an das neurologische Antigen bindet, was dann das Nervensystem schädigen kann. Manifestationen von PNS beinhalten, sind jedoch nicht beschränkt auf, Enzephalitis, die typischerweise mit Krampfanfällen einhergeht, psychiatrische Manifestationen wie Halluzinationen, Angstzustand und Depression, zerebelläre Symptome wie Ataxie, Nystagmus und Dysarthrie, Opsoklonus-Myoklonus und sensorische Neuronopathie und Lambert-Eaton-Myasthenie-Syndrom. Es sollte erwähnt werden, dass PNS-assoziierte Tumoren oft klein sind, langsam wachsen und noch nicht nachweisbar sein können, wenn neurologische Syndrome auftreten. PNS kann mit einem oder mehreren Antikörpern assoziiert sein, die spezifisch an ein Antigen aus der Gruppe, umfassend NMDAR, Lgl1, AMPA1, AMPA2, CASPR2, GABA B, GABA A, DPPX, IGLON5, Hu, Yo, CRMP5, Ri, Ma2, Amphiphysin, Recoverin, RGS8, DAGLA, NSF, STX1B, DNM1 und VAMP2, Hu, Ri, Ma, Anna-3, Zic-4, SOX1, Yo, PCA2, Tr und Glutaminsäure-Decarboxylase, binden.
Weitere/r Hintergrund und Definitionen im Zusammenhang mit neurologischen Syndromen und Symptomen und deren Diagnosen oder Differentialdiagnosen, einschließlich des Nachweises von Autoantikörpern, können Neurologie-Lehrbüchern entnommen werden, die zu dem frühesten Prioritätsdatum oder Anmeldedatum dieser Veröffentlichung verfügbar sind, wie Simon, Greenberg, Aminoff, Clinical Neurology, 7. Ausgabe, 2009, McGraw; Shoenfeld, Meroni und Gershwin, Autoantibodies, 3. Ausgabe, Elsevier, insbesondere Teil 11 einschließlich Kapitel 76; und Darnell und Posner, Paraneoplastic Syndromes, Oxford University Press, 2011.
Als Teil einer Diagnose, die die neurologischen Syndrome betrifft, die mit einem Autoantikörper in Verbindung stehen, der mit dem Vorliegen von einem oder mehreren aus der Gruppe, umfassend Gluk1, Gluk2, Gluk3, Gluk4 und Gluk5, vorzugsweise Gluk2, in Verbindung steht, wird der Kliniker zunächst eine Reihe von Tests und Risikofaktoren, die ihn entweder auf eine Autoimmunerkrankung oder eine Infektionskrankheit hinweisen können, für viele der Zustände, die mit dem Vorliegen eines Autoantikörpers verbunden sind, der spezifisch an Gluk1, Gluk2, Gluk3, Gluk4 und Gluk5, vorzugsweise Gluk2, bindet (Lancaster, J Clin Neurol. 2016 Jan;12(1) https://doi.org/10.3988/jcn.2016.12.1.1, Lee und Lee, The Laboratory Diagnosis of Autoimmune Encephalitis, Journal of Epilepsy Research 6 (2), 45), vorzugsweise Enzephalitis, in Betracht ziehen. Ein Nachweis eines Autoantikörpers, der spezifisch an eines oder mehrere aus der Gruppe, umfassend Gluk1, Gluk2, Gluk3, Gluk4 und Gluk5, vorzugsweise Gluk2, bindet, wird dann einen Autoimmunhintergrund bestätigen, während das Fehlen eines Autoantikörpers den Kliniker dazu verleitet, eine Autoimmunerkrankung, die mit anderen Autoantikörpern in Verbindung steht, in Betracht zu ziehen. Typischerweise wird dann jedoch das Vorliegen oder Fehlen einer Reihe von Autoantikörpern nachgewiesen, und ein negatives Ergebnis wird ein Hinweis auf Infektionskrankheiten sein.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Kit bereitgestellt, das die Zelle oder den Träger umfasst und ferner ein oder mehrere, vorzugsweise alle Reagenzien aus der Gruppe, umfassend einen sekundären Antikörper, der vorzugsweise mit einer nachweisbaren Markierung markiert ist, eine Waschlösung, eine Positivkontrolle, eine Negativkontrolle, ein Detergens, ein Deckglas, ein Einbettungsmedium und eine physiologische Salzlösung, vorzugsweise PBS, oder Salz, das für ihre Herstellung erforderlich ist, umfasst. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Positivkontrolle eine verdünnte Probe, vorzugsweise Serum oder CSF, von einem Patienten, der an einer neurologischen Autoimmunerkrankung leidet, oder ein monoklonaler Antikörper, der spezifisch an eines oder mehrere aus der Gruppe, umfassend Gluk1, Gluk2, Gluk3, Gluk4 und Gluk5, vorzugsweise Gluk2, bindet. Die Negativkontrolle kann eine verdünnte Probe eines gesunden Lebewesens, zum Beispiel eines Blutspenders, sein. Das Kit kann Anleitungen zur Durchführung des Assays umfassen. Vorzugsweise ist der sekundäre Antikörper ein sekundärer Antikörper, der spezifisch an IgG-Klasse-Antikörper, vorzugsweise menschliche IgG-Klasse-Antikörper, bindet.
In einer bevorzugten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung eine Verwendung der Zelle, des Polypeptids, des Trägers für die Herstellung eines Kits oder einer Zusammensetzung für die Diagnose einer Krankheit bereit.
In einer bevorzugten Ausführungsform kann ein jegliches Verfahren oder eine jegliche Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung für eine nicht-diagnostische Verwendung, d.h. Bestimmen des Vorliegens eines Autoantikörpers, der spezifisch an die Bindung an eines oder mehrere aus der Gruppe, umfassend Gluk1, Gluk2, Gluk3, Gluk4 und Gluk5, vorzugsweise Gluk2, bindet, für eine andere Verwendung als eine Diagnose eines Patienten, bestimmt sein. Beispielsweise kann das Verfahren oder die Verwendung zum Testen der Wirksamkeit einer medizinischen Vorrichtung, die zum Entfernen eines Autoantikörpers aus dem Blut eines Patienten designt ist, in vitro sein, wobei das Testen an einer anderen Flüssigkeit als Blut eines Patienten durchgeführt wird. Nach der Verwendung der medizinischen Vorrichtung bei einem Patienten kann ihre Kapazität, Autoantikörper zu entfernen, überprüft werden, indem eine Lösung, die Antikörper enthält, die spezifisch an eines oder mehrere aus der Gruppe, umfassend Gluk1, Gluk2, Gluk3, Gluk4 und Gluk5, vorzugsweise Gluk2, binden, durch die Vorrichtung laufen gelassen wird, gefolgt von der Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens, um zu bestätigen, dass weniger oder kein Antikörper in der Lösung, die durch die Vorrichtung geleitet wurde, vorliegt, d.h. zeigen, dass die Vorrichtung noch die Kapazität hat, Antikörper aus der Lösung zu entfernen.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann das Verfahren zum Testen der Wirksamkeit eines Arzneimittelkandidaten verwendet werden, der zur Behandlung von Patienten eingesetzt werden kann, die an einer neurologischen Autoimmunerkrankung leiden oder wahrscheinlich daran leiden. Ein solcher Arzneimittelkandidat kann ein jegliches Molekül sein, das in der Lage ist, die Wechselwirkung zwischen einem oder mehreren aus der Gruppe, umfassend Gluk1, Gluk2, Gluk3, Gluk4 und Gluk5, vorzugsweise Gluk2, und dem Autoantikörper zu stören.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform kann das Verfahren zum Bestätigen der Zuverlässigkeit eines diagnostischen Assays dienen und kann Nachweisen eines Antikörpers, der spezifisch an eines oder mehrere aus der Gruppe, umfassend Gluk1, Gluk2, Gluk3, Gluk4 und Gluk5, vorzugsweise Gluk2, bindet, in einer Lösung, die keine Probe von einem Patienten, der eine Diagnose benötigt, ist, aber von der bekannt ist, dass sie einen Antikörper enthält, der spezifisch an eines oder mehrere aus der Gruppe, umfassend Gluk1, Gluk2, Gluk3, Gluk4 und Gluk5, vorzugsweise Gluk2, bindet, vorzugsweise in bekannter Konzentration, beinhalten. Es kann zum Beispiel ein rekombinanter Antikörper oder eine in einem Verdünnungspuffer wie PBS verdünnte Probe eines anonymen Patienten, dessen Identität nicht zurückverfolgt werden kann, sein. Alternativ kann die Lösung auch eine Negativkontrolle sein, die den spezifisch bindenden Antikörper nicht umfasst, um den Hintergrund zu überprüfen. Ein solches Verfahren kann parallel zu, nach oder vor einem diagnostischen Verfahren durchgeführt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform kann ein jegliches erfindungsgemäßes Verfahren oder eine jegliche erfindungsgemäße Verwendung dazu dienen, ein Autoantikörperprofil, vorzugsweise zum Nachweisen einer Krankheit bei einem Säugetier, vorzugsweise einem Menschen, zu erstellen.
In einer bevorzugten Ausführungsform kann ein jegliches Verfahren oder eine jegliche Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung zur Identifizierung eines Lebewesens, bei dem das Risiko besteht, an einer Krankheit und/oder einem Tumor zu leiden oder eine/n solche/n zu entwickeln, sein.
In einer bevorzugten Ausführungsform kann das Verfahren zum Nachweisen eines Antikörpers, vorzugsweise eines Autoantikörpers, der spezifisch an eines oder mehrere aus der Gruppe, umfassend Gluk1, Gluk2, Gluk3, Gluk4 und Gluk5, vorzugsweise Gluk2, bindet, in einer Lösung, die keine Probe eines zu diagnostizierenden Säugetiers ist, oder zu dem Zweck des Bereitstellens einer Diagnose sein. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende Aufgabe durch ein Verfahren gelöst, umfassend den Schritt Inkontaktbringen einer Vorrichtung, die eine feste Phase umfasst, an der ein Polypeptid, das eines oder mehrere aus der Gruppe, umfassend Gluk1, Gluk2, Gluk3, Gluk4 und Gluk5, vorzugsweise Gluk2, oder eine Variante davon, umfasst, immobilisiert ist, mit einer gepufferten Lösung, die einen Antikörper umfasst, der spezifisch an eines oder mehrere aus der Gruppe, umfassend Gluk1, Gluk2, Gluk3, Gluk4 und Gluk5, vorzugsweise Gluk2, bindet, wobei die Lösung vorzugsweise keine Probe von einem Patienten ist, der einer Diagnose bedarf, wobei vorzugsweise

a) die Konzentration des Antikörpers in der Lösung bekannt ist und/oder
b) der Antikörper ein rekombinanter Antikörper ist und/oder
c) die medizinische oder diagnostische Vorrichtung mit zwei oder mehreren Lösungen, die den Antikörper umfassen, in Kontakt gebracht wird, wobei die zwei oder mehreren Lösungen eine unterschiedliche Konzentration des Antikörpers aufweisen, und/oder
d) der Antikörper von sekundären Antikörpern, die spezifisch an IgG-Antikörper binden, erkannt wird,

In einer bevorzugten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung eine Vorrichtung zum Analysieren einer Probe eines Patienten bereit, um einen Autoantikörper gegen eines oder mehrere aus der Gruppe, umfassend Gluk1, Gluk2, Gluk3, Gluk4 und Gluk5, vorzugsweise Gluk2, nachzuweisen, was auf eine erhöhte Wahrscheinlichkeit einer neurologischen Autoimmunerkrankung oder ihrer Entwicklung hinweist, umfassend:

a) einen Träger, der ein Mittel zum Einfangen des Autoantikörpers aus der Probe, wenn die Probe mit dem Träger in Kontakt gebracht wird, enthält, wobei das Mittel die Zelle und der Träger der Träger gemäß der vorliegenden Erfindung ist,
b) ein nachweisbares Mittel, das in der Lage ist, an den von dem Träger eingefangenen Antikörper zu binden, wenn das nachweisbare Mittel mit dem Träger in Kontakt gebracht wird, wobei das nachweisbare Mittel vorzugsweise ein markierter Sekundärantikörper ist, der in der Lage ist, an den auf dem Träger eingefangenen Autoantikörper zu binden,
c) gegebenenfalls ein Mittel zum Entfernen jeglicher Probe von dem Träger und dem nachweisbaren Mittel, vorzugsweise durch Waschen,
d) eine Nachweisvorrichtung zum Nachweisen des Vorliegens des nachweisbaren Mittels und zum Umwandeln der Ergebnisse in ein elektrisches Signal, beispielsweise ein Fluoreszenzlesegerät oder ein Fluoreszenzmikroskop, das mit einer Software verbunden ist, die in der Lage ist, ein Muster, das für eine gefärbte Zelle charakteristisch ist, die ein Polypeptid überexprimiert, das eines oder mehrere aus der Gruppe, umfassend Gluk1, Gluk2, Gluk3, Gluk4 und Gluk5, vorzugsweise Gluk2, oder eine Variante davon, umfasst, in einem von dem Fluoreszenzlesegerät oder der Kamera aufgenommenen Bild der Zelle zu erkennen, und

Gemäß der vorliegenden Erfindung, wird eine Vorrichtung zum Entfernen eines Autoantikörpers, der spezifisch an eines oder mehrere aus der Gruppe, umfassend Gluk1, Gluk2, Gluk3, Gluk4 und Gluk5, vorzugsweise Gluk2, bindet, aus Blut, vorzugsweise Serum, eines Patienten, der an einer neurologischen Autoimmunerkrankung leidet, wobei die Vorrichtung einen Träger mit einer festen Phase umfasst, an der ein Polypeptid, das eines oder mehrere aus der Gruppe, umfassend Gluk1, Gluk2, Gluk3, Gluk4 und Gluk5, vorzugsweise Gluk2, oder eine Variante davon, umfasst, immobilisiert ist, bereitgestellt, wie in einem ex vivo-Verfahren zum Entfernen eines Autoantikörpers, der spezifisch an eines oder mehrere aus der Gruppe, umfassend Gluk1, Gluk2, Gluk3, Gluk4 und Gluk5, vorzugsweise Gluk2, bindet, aus einem Patienten. Eine Vorrichtung, auf der ein Polypeptid, das eines oder mehrere aus der Gruppe, umfassend Gluk1, Gluk2, Gluk3, Gluk4 und Gluk5, vorzugsweise Gluk2, oder eine Variante davon, umfasst, oder ein sekundärer Antikörper oder Protein, der/das alle Klasse-IgG-Antikörper einfängt, darunter Klasse-IgG-Autoantikörper gegen eines oder mehrere aus der Gruppe, umfassend Gluk1, Gluk2, Gluk3, Gluk4 und Gluk5Gluk3, vorzugsweise Gluk2, kann verwendet werden. Geeignete Verfahren sind beschrieben in Eisei Noiri und Noria Hanafusa, The Concise Manual of Apheresis Therapy, Springer Tokyo, 2014. Hamilton, P., Kanigicherla, D., Hanumapura, P., Walz, L., Kramer, D., Fischer, M., Brenchley, P., and Mitra, S. (2018) J. Clin. Aph. 33(3), 283-290. Ein weiteres Verfahren ist in der EP3477300 offenbart.
Die vorliegende Erfindung umfasst eine Reihe von Polypeptidsequenzen, insbesondere

 SEQ ID NO1 (Gluk1, wie in P39086 aus Uniprot))
 MEHGTLLAQPGLWTRDTSWALLYFLCYILPQTAPQVLRIGGIFETVENEPVNVEELAFKFAVT
 SINRNRTLMPNTTLTYDIQRINLFDSFEASRRACDQLALGVAALFGPSHSSSVSAVQSICNAL
 EVPHIQTRWKHPSVDNKDLFYINLYPDYAAISRAILDLVLYYNWKTVTVVYEDSTGLIRLQELI
 KAPSRYNIKIKIRQLPSGNKDAKPLLKEMKKGKEFYVIFDCSHETAAEILKQILFMGMMTEYYH
 YFFTTLDLFALDLELYRYSGVNMTGFRLLNIDNPHVSSIIEKWSMERLQAPPRPETGLLDGM
 MTTEAALMYDAVYMVAIASHRASQLTVSSLQCHRHKPWRLGPRFMNLIKEARWDGLTGHIT
 FNKTNGLRKDFDLDIISLKEEGTEKAAGEVSKHLYKVWKKIGIWNSNSGLNMTDSNKDKSSN
 ITDSLANRTLIVTTILEEPYVMYRKSDKPLYGNDRFEGYCLDLLKELSNILGFIYDVKLVPDGK
 YGAQNDKGEWNGMVKELIDHRADLAVAPLTITYVREKVIDFSKPFMTLGISILYRKPNGTNPG
 VFSFLNPLSPDIWMYVLLACLGVSCVLFVIARFTPYEWYNPHPCNPDSDWENNFTLLNSFW
 FGVGALMQQGSELMPKALSTRIVGGIWWFFTLIIISSYTANLAAFLTVERMESPIDSADDLAK
 QTKIEYGAVRDGSTMTFFKKSKISTYEKMWAFMSSRQQTALVRNSDEGIQRVLTTDYALLM
 ESTSIEYVTQRNCNLTQIGGLIDSKGYGVGTPIGSPYRDKITIAILQLQEEGKLHMMKEKWWR
 GNGCPEEDNKEASALGVENIGGIFIVLAAGLVLSVFVAIGEFIYKSRKNNDIEQAFCFFYGLQC
 KQTHPTNSTSGTTLSTDLECGKLIREERGIRKQSSVHTV

 SEQ ID NO2 (Gluk2, wie in Q13002 aus Uniprot)
 MKIIFPILSNPVFRRTVKLLLCLLWIGYSQGTTHVLRFGGIFEYVESGPMGAEELAFRFAVNTI
 NRNRTLLPNTTLTYDTQKINLYDSFEASKKACDQLSLGVAAIFGPSHSSSANAVQSICNALGV
 PHIQTRWKHQVSDNKDSFYVSLYPDFSSLSRAILDLVQFFKWKTVTWYDDSTGLIRLQELIK
 APSRYNLRLKIRQLPADTKDAKPLLKEMKRGKEFHVIFDCSHEMAAGILKQALAMGMMTEYY
 HYIFTTLDLFALDVEPYRYSGVNMTGFRILNTENTQVSSIIEKWSMERLQAPPKPDSGLLDGF
 MTTDAALMYDAVHWSVAVQQFPQMTVSSLQCNRHKPWRFGTRFMSLIKEAHWEGLTGRI
 TFNKTNGLRTDFDLDVISLKEEGLEKIGTWDPASGLNMTESQKGKPANITDSLSNRSLIVTTIL
 EEPYVLFKKSDKPLYGNDRFEGYCIDLLRELSTILGFTYEIRLVEDGKYGAQDDANGQWNG
 MVRELIDHKADLAVAPLAITYVREKVIDFSKPFMTLGISILYRKPNGTNPGVFSFLNPLSPDIW
 MYILLAYLGVSCVLFVIARFSPYEWYNPHPCNPDSDWENNFTLLNSFWFGVGALMQQGSE
 LMPKALSTRIVGGIWWFFTLIIISSYTANLAAFLTVERMESPIDSADDLAKQTKIEYGAVEDGA
 TMTFFKKSKISTYDKMWAFMSSRRQSVLVKSNEEGIQRVLTSDYAFLMESTTIEFVTQRNCN
 LTQIGGLIDSKGYGVGTPMGSPYRDKITIAILQLQEEGKLHMMKEKWWRGNGCPEEESKEA
 SALGVQNIGGIFIVLAAGLVLSVFVAVGEFLYKSKKNAQLEKRSFCSAMVEELRMSLKCQRR
 LKHKPQAPVIVKTEEVINMHTFNDRRLPGKETMA

 SEQ ID NO3 (Gluk3, wie in Q13003 aus Uniprot)
 MTAPWRRLRSLVWEYWAGLLVCAFWIPDSRGMPHVIRIGGIFEYADGPNAQVMNAEEHAF
 RFSANIINRNRTLLPNTTLTYDIQRIHFHDSFEATKKACDQLALGVVAIFGPSQGSCTNAVQSI
 CNALEVPHIQLRWKHHPLDNKDTFYVNLYPDYASLSHAILDLVQYLKWRSATWYDDSTGLI
 RLQELIMAPSRYNIRLKIRQLPIDSDDSRPLLKEMKRGREFRIIFDCSHTMAAQILKQAMAMG
 MMTEYYHFIFTTLDLYALDLEPYRYSGVNLTGFRILNVDNPHVSAIVEKWSMERLQAAPRSE
 SGLLDGVMMTDAALLYDAVHIVSVCYQRAPQMTVNSLQCHRHKAWRFGGRFMNFIKEAQ
 WEGLTGRIVFNKTSGLRTDFDLDIISLKEDGLEKVGVWSPADGLNITEVAKGRGPNVTDSLT
 NRSLIVTTVLEEPFVMFRKSDRTLYGNDRFEGYCIDLLKELAHILGFSYEIRLVEDGKYGAQD
 DKGQWNGMVKELIDHKADLAVAPLTITHVREKAIDFSKPFMTLGVSILYRKPNGTNPSVFSFL
 NPLSPDIWMYVLLAYLGVSCVLFVIARFSPYEWYDAHPCNPGSEWENNFTLLNSFWFGMG
 SLMQQGSELMPKALSTRIIGGIWWFFTLIIISSYTANLAAFLTVERMESPIDSADDLAKQTKIEY
 GAVKDGATMTFFKKSKISTFEKMWAFMSSKPSALVKNNEEGIQRALTADYALLMESTTIEYV
 TQRNCNLTQIGGLIDSKGYGIGTPMGSPYRDKITIAILQLQEEDKLHIMKEKWWRGSGCPEE
 ENKEASALGIQKIGGIFIVLAAGLVLSVLVAVGEFVYKLRKTAEREQRSFCSTVADEIRFSLTC
 QRRVKHKPQPPMMVKTDAVINMHTFNDRRLPGKDSMACSTSLAPVFP

 SEQ ID NO4 (Gluk4, wie in NP_055434.2 aus NCBI)
 MPRVSAPLVLLPAWLVMVACSPHSLRIAAILDDPMECSRGERLSITLAKNRINRAPERLGKAK
 VEVDIFELLRDSEYETAETMCQILPKGWAVLGPSSSPASSSIISNICGEKEVPHFKVAPEEFV
 KFQFQRFTTLNLHPSNTDISVAVAGILNFFNCTTACLICAKAECLLNLEKLLRQFLISKDTLSVR 

 MLDDTRDPTPLLKEIRDDKTATIIIHANASMSHTILLKAAELGMVSAYYTYIFTNLEFSLQRMDS
 LVDDRVNILGFSIFNQSHAFFQEFAQSLNQSWQENCDHVPFTGPALSSALLFDAVYAWTAV
 QELNRSQEIGVKPLSCGSAQIWQHGTSLMNYLRMVELEGLTGHIEFNSKGQRSNYALKILQF
 TRNGFRQIGQWHVAEGLSMDSHLYASNISDTLFNTTLWTTILENPYLMLKGNHQEMEGND
 RYEGFCVDMLKELAEILRFNYKIRLVGDGVYGVPEANGTWTGMVGELIARKADLAVAGLTIT
 AEREKVIDFSKPFMTLGISILYRVHMGRKPGYFSFLDPFSPGVWLFMLLAYLAVSCVLFLVAR
 LTPYEWYSPHPCAQGRCNLLVNQYSLGNSLWFPVGGFMQQGSTIAPRALSTRCVSGVWW
 AFTLIIISSYTANLAAFLTVQRMDVPIESVDDLADQTAIEYGTIHGGSSMTFFQNSRYQTYQRM
 WNYMYSKQPSVFVKSTEEGIARVLNSNYAFLLESTMNEYYRQRNCNLTQIGGLLDTKGYGI
 GMPVGSVFRDEFDLAILQLQENNRLEILKRKWWEGGKCPKEEDHRAKGLGMENIGGIFWLI
 CGLIVAIFMAMLEFLWTLRHSEATEVSVCQEMVTELRSIILCQDSIHPRRRRAAVPPPRPPIPE
 ERRPRGTATLSNGKLCGAGEPDQLAQRLAQEAALVARGCTHIRVCPECRRFQGLRARPSP
 ARSEESLEWEKTTNSSEPE

 SEQ ID NO5 (Gluk5, wie in NP_002079.3 aus NCBI)
 MPAELLLLLIVAFASPSCQVLSSLRMAAILDDQTVCGRGERLALALAREQINGIIEVPAKARVE
 VDIFELQRDSQYETTDTMCQILPKGVVSVLGPSSSPASASTVSHICGEKEIPHIKVGPEETPR
 LQYLRFASVSLYPSNEDVSLAVSRILKSFNYPSASLICAKAECLLRLEELVRGFLISKETLSVR
 MLDDSRDPTPLLKEIRDDKVSTIIIDANASISHLILRKASELGMTSAFYKYILTTMDFPILHLDGI
 VEDSSNILGFSMFNTSHPFYPEFVRSLNMSWRENCEASTYLGPALSAALMFDAVHWVSAV
 RELNRSQEIGVKPLACTSANIWPHGTSLMNYLRMVEYDGLTGRVEFNSKGQRTNYTLRILEK
 SRQGHREIGVWYSNRTLAMNATTLDINLSQTLANKTLVVTTILENPYVMRRPNFQALSGNER
 FEGFCVDMLRELAELLRFRYRLRLVEDGLYGAPEPNGSWTGMVGELINRKADLAVAAFTITA
 EREKVIDFSKPFMTLGISILYRVHMGRKPGYFSFLDPFSPAVWLFMLLAYLAVSCVLFLAARL
 SPYEWYNPHPCLRARPHILENQYTLGNSLWFPVGGFMQQGSEIMPRALSTRCVSGVWWA
 FTLIIISSYTANLAAFLTVQRMEVPVESADDLADQTNIEYGTIHAGSTMTFFQNSRYQTYQRM
 WNYMQSKQPSVFVKSTEEGIARVLNSRYAFLLESTMNEYHRRLNCNLTQIGGLLDTKGYGI
 GMPLGSPFRDEITLAILQLQENNRLEILKRKWWEGGRCPKEEDHRAKGLGMENIGGIFIVLIC
 GLIIAVFVAVMEFIWSTRRSAESEEVSVCQEMLQELRHAVSCRKTSRSRRRRRPGGPSRAL
 LSLRAVREMRLSNGKLYSAGAGGDAGSAHGGPQRLLDDPGPPSGARPAAPTPCTHVRVC
 QECRRIQALRASGAGAPPRGLGVPAEATSPPRPRPGPAGPRELAEHE

 SEQ ID NO6 (Sequenz von extrazellulärer Domäne von Gluk2):
 TTHVLRFGGIFEYVESGPMGAEELAFRFAVNTINRNRTLLPNTTLTYDTQKINLYDSFEASKK
 ACDQLSLGVAAIFGPSHSSSANAVQSICNALGVPHIQTRWKHQVSDNKDSFYVSLYPDFSSL
 SRAILDLVQFFKWKTVTVVYDDSTGLIRLQELIKAPSRYNLRLKIRQLPADTKDAKPLLKEMKR
 GKEFHVIFDCSHEMAAGILKQALAMGMMTEYYHYIFTTLDLFALDVEPYRYSGVNMTGFRIL
 NTENTQVSSIIEKWSMERLQAPPKPDSGLLDGFMTTDAALMYDAVHVVSVAVQQFPQMTVS 

 SLQCNRHKPWRFGTRFMSLIKEAHWEGLTGRITFNKTNGLRTDFDLDVISLKEEGLEKIGTW
 DPASGLNMTESQKGKPANITDSLSNRSLIVTTILEEPYVLFKKSDKPLYGNDRFEGYCIDLLR
 ELSTILGFTYEIRLVEDGKYGAQDDANGQWNGMVRELIDHKADLAVAPLAITYVREKVIDFSK
 PFMTLGISILYRKPNGTNPGVFSFLNPLSP

 SEQ ID NO7 (Sequenz von extrazellulärer Domäne von Gluk2)
 AFLTVERMESPIDSADDLAKQTKIEYGAVEDGATMTFFKKSKISTYDKMWAFMSSRRQSVLV
 KSNEEGIQRVLTSDYAFLMESTTIEFVTQRNCNLTQIGGLIDSKGYGVGTPMGSPYRDKITIAI
 LQLQEEGKLHMMKEKWWRGNGCPEEESKEASALGVQN

SEQ ID NO8 (durch Massenspektrometrie identifiziertes Peptid)
 MESPIDSADDLAK

Die vorliegende Erfindung wird ferner durch die folgenden nicht einschränkenden Beispiele veranschaulicht, denen weitere Merkmale, Ausführungsformen, Aspekte und Vorteile der vorliegenden Erfindung entnommen werden können.

zeigt Hirnimmunfärbung mit CSF von Patienten mit GluK2-Aks im Vergleich zu der von Patienten mit AMPAR-, NMDAR- oder kombinierten Antikörpern. Sagittalschnitte von Rattenhirn, das mit CSF von zwei Patienten (Fall 1, A-C und Fall 2, D-F) immungefärbt wurde, zeigen ein neuartiges Muster der Neuropil-Reaktivität (anschließend als auf GluK2-Aks zurückzuführen charakterisiert). Die dritte Reihe der Panel (G-I) entspricht einem Patienten mit Antikörpern gegen AMPAR und GluK2. Beide Antikörper reagieren intensiv mit Hippocampus (H), was eine gemischte Immunfärbung hervorruft; in Zerebellum (I) stammt die Färbung der molekularen Schicht jedoch von AMPAR-Antikörpern und die Färbung der Granularzellen von GluK2-Antikörpern (I). Zum Vergleich mit anderen Glutamatrezeptor-Antikörpern entsprechen die vierten und fünften Reihen CSF eines Patienten mit Anti-AMPAR- (J-L) und eines Patienten mit NMDAR-Enzephalitis (M-O) und zeigen das unterschiedliche Muster von Hirnreaktivität jedes Antikörpers (keiner der beiden Fälle hatte GluK2-Antikörper). Skalenbalken, G = 2 mm; H = 250 µm; I = 250 µm.

: Hirn-MRIs bei 4 Patienten mit GluK2-Antikörper-assoziierter Zerebellitis. A-E (Patient 1) zeigen Fluid-attenuierte Inversion-Recovery (FLAIR)-T2 -MRI-Sequenzen ausgewählter axialer und sagittaler Schnitte, die zu Symptombeginn (A,B), zwei Wochen später (C,D) und bei der letzten Nachuntersuchung (E) aufgenommen wurden. Man beachte das Vorliegen beidseitiger zerebellärer Anomalien mit Ödem und Kompression des 4. Ventrikels zu Beginn, mit teilweiser Besserung zwei Wochen später und normalen Merkmalen 5 Jahre später. F-J (Patient 2) zeigen diffusionsgewichtete Bildgebungs- (DWI) (F,H,J) und FLAIR-T2- (G,I) MRI-Sequenzen, die zu Symptombeginn (F-I) und 2 Jahre später (J) erhalten wurden. Es gibt bilaterale, vorwiegend kortikale zerebelläre Anomalien, die am besten mit DWI zu sehen sind, mit Masseneffekt an dem 4. Ventrikel, und der Vermis war in ähnlicher Weise betroffen. Auf den Karten des scheinbaren Diffusionskoeffizienten (ADC) wurde keine Einschränkung beobachtet (nicht gezeigt). Bei der letzten Nachuntersuchung hatten sich die meisten DWI-Anomalien zurückgebildet, es bestand jedoch eine mäßige Restatrophie (J). K-O (Patient 5) zeigen DWI- (K,M,O) und FLAIR-T2- (L,N) MRI-Sequenzen, die zu Symptombeginn (K-N) und fünf Wochen später (O) erhalten wurden. Man beachte die ausgedehnten Anomalien, die beidseitig das Zerebellum und den Vermis einbeziehen, am besten zu sehen in DWI-Sequenzen; die Temporallappen sind weniger stark betroffen (links > rechts). Auf ADC-Karten wurde keine Einschränkung beobachtet. Fünf Wochen nach Symptombeginn hatten sich die meisten DWI-Anomalien gebessert. P-T (Patient 4) zeigen FLAIR- (P,S) und T1-mit-Kontrastmittel- (Q,R,T) MRI-Sequenzen, die bei Vorstellung (P-R) und 1,5 Jahre nach Krankheitsbeginn (S,T) erhalten wurden. Zu Krankheitsbeginn besteht ein mäßiges zerebelläres Ödem mit Größenreduktion des 4. Ventrikels.

: Zellbasierter Assay und Immunopräzipitation von GluK2. A, Spuren 2 und 3 zeigen die Silberfärbung mit Serum von Patient 1 (+) und einem Kontrollserum (-) präzipitierter Proteine. Molekulare Marker sind in Spur M zu sehen (Pfeilspitze ~96 kDa). Spuren 4 und 5 zeigen den entsprechenden Immunblot mit einem kommerziellen GluK2-Antikörper, der zeigt, dass die oberste Bande, die mit Patientenprobe präzipitiert wurde, GluK2 ist. B-D, zellbasierter Assay mit HEK293-Zellen, die GluK2 exprimieren, immunmarkiert mit Antikörpern aus Patientenserum (grün) oder einem kommerziellen Antikörper gegen Myc-Tag zur Bestätigung der Expression von GluK2 (rot). Panel D zeigt die zusammengefassten Reaktivitäten. Panel E-G entsprechen einem ähnlichen CBA unter Verwendung von Serum eines gesunden Lebewesens, das keine Reaktivität mit GluK2 zeigt (E). Die Kerne der Zellen (blau) sind mit 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) dargestellt. Maßstabsbalken = 20 µm. H, Immunblot, der die Immunpräzipitation von GluK2 aus lebenden HEK293-Zellen, die GluK2 exprimieren, und Patienten- oder Kontrollseren zeigt. Spuren (+) entsprechen mit Serum von 6 Patienten präzipitiertem GluK2; Spuren (-) zeigen das Fehlen von GluK2-Präzipitation unter Verwendung von Serum von 2 gesunden Teilnehmern; Spur M ist der Molekulargewichtsmarker; Spur T entspricht einem Lysat von HEK293-Zellen, die GluK2 exprimieren, und Spur UT entspricht einem Lysat von HEK293-Zellen, die nicht mit GluK2 transfiziert wurden. In allen Spuren wurde GluK2 mit einem polyklonalen GluK2-Antikörper, hergestellt in Kaninchen, nachgewiesen. I-R, Immunfärbung von Zerebellum von Wildtyp-Maus (I-M) und GluK2-Knockout-Maus (N-R) unter Verwendung von CSF von 5 verschiedenen Patienten: I,N Patient 1; J,O Patient 3; K,P Patient 5; L,Q Patient 10 (mit GluK2- und AMPAR-Antikörpern), und M,R Patient 14 (mit GluK2- und NMDAR-Antikörpern). Maßstabsbalken = 250 µm.

: Vorabsorption von Patientenserum mit GluK2 hebt Hirn-Immunreaktivität auf. Reaktivität von Patientenserum mit Zerebellum (A,B), lebenden Hippocampus-Neuronen (C,D) und einem Assay basierend auf lebenden Zellen, die GluK2 exprimieren (E,F). Panel auf der linken Seite entsprechen Patientenserum, das mit HEK293-Zellen, die GluK2 nicht exprimieren, vorabsorbiert wurde, und Panel auf der rechten Seite entsprechen dem gleichen Serum, das mit HEK293-Zellen, die GluK2 exprimieren, vorabsorbiert wurde. In C und D wurden Zellen mit Patientenserum (grüne Fluoreszenz) und einem kommerziellen GluK2-Antikörper (rote Fluoreszenz) co-inkubiert; die gelbe Färbung entspricht zusammengefassten Reaktivitäten. In E und F ist die rote Immunfluoreszenz ein kommerzieller Antikörper gegen Myc-Tag um zu bestätigen, dass die CBA-Zellen GluK2 exprimieren. Man beachte, dass Vorabsorption mit GluK2 die Reaktivität von Patientenserum mit Zerebellum, lebenden Neuronen und lebenden CBA aufhebt (B,D,F). Maßstabsbalken B, D, F = 20 µm.

: Patienten-Antikörper verursachen eine Verringerung an Zelloberfläche und synaptischem GluK2 in kultivierten Neuronen. A zeigt, dass die CSF eines repräsentativen Patienten (Fall 1), aber nicht Kontroll-CSF, eine fortschreitende Abnahme von GluK2-Clustern in repräsentativen Dendriten von Kulturen hippokampaler Rattenneuronen verursacht. Man beachte, dass sich das Niveau von Clustern nach Entfernen der Antikörper aus dem Medium und Ermöglichen, dass die Neuronen sich für 96 Stunden erholen, wieder normalisiert. Maßstabsbalken = 5 µm. B-D zeigen die Quantifizierung dieser Effekte unter Verwendung von CSF von Patient 1 und E-G von Patient 5 auf gesamtes neuronales Oberflächen-GluK2 (B,E) und synaptisches GluK2 (D,G, definiert durch die Co-Lokalisierung von Oberflächen-GluK2 mit PSD95). Die Auswirkungen auf GluK2 sind nach der 96-stündigen Erholung reversibel. Im Vergleich zu Kontroll-CSF veränderte die CSF der Patienten die PSD95-Niveaus nicht (C,F). n = 20 Dendriten pro Bedingung, drei unabhängige Experimente. Daten werden als Prozentsatz gegenüber dem Median der Kontrollen dargestellt. Boxplots zeigen den Median sowie 25. und 75. Perzentile; Whisker weisen auf die Minimal- und Maximalwerte hin. Signifikanz des Behandlungseffekts wurde durch Kruskal-Wallis mit multiplem Dunn-Vergleich ermittelt *p<0,05; **p<0,01; ****p<0,0001.

: Patientenserum vermindert GluK2-vermittelte Ströme: A,B entsprechen HEK293-Zellen, die GluK2 (Q) exprimieren, die für 30 Minuten oder 5 Stunden mit Kontrollserum oder Serum von 2 Patient behandelt wurden. Stromantworten wurden durch ultraschnelle Applikation von 10 mM Glutamat in den Zellen bei -60 mV aktiviert. In A zeigen die oberen Spuren die Stromantworten von Zellen, die für 30 Minuten mit den angegebenen Proben behandelt wurden, und die unteren Spuren zeigen die Stromantworten, derer, die 5 Stunden lang mit den gleichen Proben behandelt wurden (jede der Spuren stellt den Durchschnitt von 4-7 aufeinanderfolgenden Glutamatapplikationen dar). Der Mittelwert und S.E.M. der Glutamat-ausgelösten normalisierten Spitzenströme für unbehandelte (basale), mit Kontrollserum oder Serum von 2 Patienten inkubierte Zellen sind in B gezeigt. Kreise bezeichnen Einzelwerte für jedes Experiment. Die GluK2-vermittelten Ströme von Zellen, die für 30 Minuten (244,7 ± 45,39 pA/pF) oder 5 Stunden mit Kontrollserum (317± 36,84 pA/pF) behandelt wurden, waren ähnlich wie die von unbehandelten Zellen (246,6±49,40 pA/pF;) und auch ähnlich denen von Zellen, die für 30 Minuten mit Serum zweier verschiedener Patienten behandelt wurden (Patient 1=289,1±39,22 pA/pF; Patient 2=324,9±64,1 pA/pF); p>0,99; n=15 Aufzeichnungen für jede Gruppe aus drei unabhängigen Experimenten, Kruskal-Wallis mit Dunn-Vergleichstest. Zellen, die für 5 Stunden mit den gleichen zwei Patientenseren behandelt wurden, zeigten jedoch eine signifikante Reduzierung der GluK2-vermittelten Ströme im Vergleich zu dem Kontrollserum (Patient 1=142,3±45,41 pA/pF, Patient 5=145,8± 23,64 pA/pF vs. Kontrolle = 317± 36,84 pA/pF); **p=0,0019 bzw. **p=0,006; drei unabhängige Experimente und mindestens n=8 Aufnahmen; Kruskal-Wallis mit Dunn-Vergleichstest. C, Bindung von Patienten-Antikörpern an HEK-Zellen, die GluK2 exprimieren, nach Inkubationen von 30 Minuten und 5 Stunden. Internalisierung von Rezeptoren ist erst nach 5 Stunden sichtbar (rote Fluoreszenz). Obwohl nach 30 Minuten eine intensive Antikörperbindung vorliegt, wurden keine elektrophysiologischen Auswirkungen beobachtet (A, B). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Reduktion von GluK2-vermittelten Ströme sekundär auf die Antikörpervermittelte Internalisierung der Rezeptoren zurückzuführen ist und nicht auf eine direkte antagonistische (oder blockierende) Wirkung auf Rezeptorfunktion, in welchem Fall elektrophysiologische Veränderungen nach 30 Minuten sichtbar wären. Maßstabsbalken = 10 µm.

Beispiele Verfahren

Patienten und Proben

Von Januar 2013 bis September 2020 haben wir 127 Patienten identifiziert, deren Serum oder CSF im Hospital Clinic-IDIBAPS auf vermutete Autoimmunerkrankungen des ZNS untersucht wurde und die Antikörper aufwiesen, die stark mit dem Neuropil von Rattenhirn und Primärkulturen von hippocampalen oder zerebellären Granularneuronen der Ratte reagierten. Von diesen 127 Patienten wählten wir Serum- und CSF-Proben von 8 Patienten aus, die das gleiche Muster von Hirn-Immunfärbung, aber unterschiedlich zu denen, die mit Anti-AMPAR-, -NMDAR- oder einer jeglichen anderen bekannten Autoimmunenzephalitis in Zusammenhang stehen, aufwiesen. Als Kontrollen schlossen wir Serum von 23 gesunden Blutspendern und Serum oder CSF von 596 Patienten mit den folgenden Erkrankungen ein: 73 Multiple Systematrophie mit vorherrschendem zerebellärem Phänotyp, 73 Anti-NMDAR-Enzephalitis, 71 Anti-AMPAR-Enzephalitis, 48 Zerebellitis unbekannter Ätiologie, 40 Multiple Sklerose, 37 paraneoplastische zerebelläre Degeneration, 30 Opsoklonus-Myoklonus, 29 nicht erbliche degenerative Ataxie, 23 Neuromyelitis-optica-Spektrumstörung, 20 Enzephalitis mit anderen neuronalen Oberflächenantikörpern als NMDAR oder AMPAR, 20 progressive supranukleäre Lähmung, 13 Creutzfeldt-Jakob-Krankheit und die restlichen 119 Fälle der ursprünglichen Gruppe, aus der die 8 Fälle der Studie erhalten wurden.

Die Ethikkommission des Hospital Clinic, Barcelona, genehmigte die Studie (R091217-12). Patienten oder Bevollmächtigte gaben ihr Einverständnis zur Aufbewahrung und Verwendung von Serum, CSF und klinischer Information für Forschungszwecke.

Immunhistochemie mit Hirngewebe und Immunfluoreszenz mit kultivierten Neuronen

Immunfärbung von Rattenhirn und Hirn von Wildtyp- oder GluK2-Knockout-Mäusen (freundlicherweise von Dr. Juan Lerma¹ zur Verfügung gestellt) wurde mit Serum von Patienten (1:200 verdünnt) und CSF (1:2) unter Verwendung einer Standard-Immunperoxidase-Technik (Ances BM, Vitaliani R, Taylor RA, et al. (2005): Treatmentresponsive limbic encephalitis identified by neuropil antibodies: MRI and PET correlates, Brain, Band 128, Ausgabe 8) durchgeführt. Immunfluoreszenz mit Primärkulturen von Ratten-Hippocampus-Neuronen wurde mit Serum (1:200) und CSF (1:5) durchgeführt (Lai M, Hughes EG, Peng X, et al. (2009): AMPA receptor antibodies in limbic encephalitis alter synaptic receptor location, Ann Neurol, Band 65, Ausgabe 4).

Immunopräzipitation

Kulturen von zerebellären Ratten-Granularneuronen und Immunpräzipitation mit Patienten- oder Kontrollserum wurden wie zuvor berichtet durchgeführt (Landa J, Guasp M, Petit-Pedrol M, et al. (2020): Seizure-related 6 homolog like 2 autoimmunity: Neurologic syndrome and antibody effects, Neurol Neuroimmunol Neuroinflamm). Proteinpräzipitate wurden zunächst durch Silberfärbung (A44390, Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) bewertet, aber alle präzipitierten Proteine wurden durch Massenspektrometrie ohne Vorselektion spezifischer Banden charakterisiert. In anderen Experimenten wurden HEK293-Zellen, die das identifizierte Antigen (GluK2) exprimieren, mit Patienten- oder Kontrollserum inkubiert und anschließend wie vorstehend lysiert und präzipitiert. Präzipitate dieser HEK293-Zellen oder Neuronen wurden dann auf einem Gel laufen gelassen, auf Nitrocellulose übertragen, mit einem polyklonalen GluK2-Antikörper, hergestellt in Kaninchen, (1:500 verdünnt, HPA014623, Atlas antibodies, Schweden) inkubiert und die Reaktivität mit Chemilumineszenz entwickelt, wie berichtet (Landa J, et al. (2020): Seizure-related 6 homolog like 2 autoimmunity: Neurologic syndrome and antibody effects, Neurol Neuroimmunol Neuroinflamm).

Zell basierte Assavs (CBA)

Um das Repertoire der Antikörper von Patienten gegen jede der menschlichen Untereinheiten von Kainatrezeptoren (GluK1, GluK2, GluK3, GluK4, GluK5) zu bestimmen, wurden HEK293-Zellen mit Plasmiden transfiziert, die jede der Sequenzen menschlicher Untereinheiten, markiert mit MYC-DDK, (alle von Origene, Rockville, MD, USA) enthalten, einschließlich: GRIK1 (RC222898), GRIK2 (RC222369) oder GRIK3 (RC223571), die in der Lage sind, funktionelle homomere Kainat-gesteuerte Rezeptoren zu bilden. Für GRIK4 (RC214488) und GRIK5 (RC224695), die nur funktionelle Rezeptoren bilden, wenn sie mit GRIK1, GRIK2 oder GRIK3 co-exprimiert werden, verwendeten wir Co-Transfektionen mit GRIK3/GRIK4 oder GRIK3IGRIK5 sowie jede Untereinheit separat. Die Transfektions- und Inkubationstechniken für HEK293-Zellen mit Patientenproben (oder CBA) sind identisch mit denen, über die bereits berichtet wurde (Lai M, et al. (2009): AMPA receptor antibodies in limbic encephalitis alter synaptic receptor location, Ann Neurol, Band 65, Ausgabe 4. Lynch DR, Lawrence JJ, Lenz S, Anegawa NJ, Dichter M, Pritchett DB (1995): Pharmacological characterization of heterodimeric NMDA receptors composed of NR 1a and 2B subunits: differences with receptors formed from NR 1a and 2A, J Neurochem.). Kurz gesagt wurden lebende transfizierte HEK293-Zellen mit Serum (1:50) oder CSF (1:5) für 1 Stunde bei 37 °C inkubiert. Nach Fixierung mit 4 % Paraformaldehyd (PFA) und Permeabilisierung mit 0,3 % Triton X-100 wurden die Zellen mit einem Maus-MYC-Tag-Antikörper (verdünnt 1:2500, 2276S, Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA) für eine Stunde bei Raumtemperatur (RT) inkubiert, gefolgt von fluoreszierenden sekundären Antikörpern Alexa-Fluor-488-Ziege-anti-Mensch (1:1000, 109-545-088, Jackson ImmunoResearch, Newmarket, UK) und Alexa-Fluor-594-Ziege-anti-Maus (1:1000, A-11005, Thermo-Fisher).

Das Vorliegen von AMPAR- oder NMDAR-Antikörpern wurde mit CBA unter Expression von GluA1/GluA2-Untereinheiten von AMPARs oder GluN1/GluN2B-Untereinheiten von NMDARs untersucht (Lai M, et al. (2009): AMPA receptor antibodies in limbic encephalitis alter synaptic receptor location, Ann Neurol, Band 65, Ausgabe 4. Dalmau J, Tuzun E, Wu HY, et al. (2007): Paraneoplastic anti-N-methyl-D-aspartate receptor encephalitis associated with ovarian teratoma, Ann Neurol).
Um festzustellen, ob Antikörper von Patienten in der Lage waren, GluK2 in HEK293-Zellen zu internalisieren, wurden lebende Zellen für 30 Minuten oder 5 Stunden mit Patientenserum (1:100 in den Medien verdünnt) behandelt. Nach Waschen wurden lebende Zellen für eine Stunde mit einem Überschuss an Alexa-Fluor-488-Ziegen-anti-Mensch-IgG (1:20 verdünnt; Jackson ImmunoResearch) inkubiert, um das gesamte menschliche IgG an der Zelloberfläche zu blockieren, und dann gewaschen, permeabilisiert, und das internalisierte IgG wurde mit einem anders markierten sekundären Anti-Mensch-Antikörper (Alexa-Fluor-594-Ziegen-anti-Mensch-IgG, 1:1000 verdünnt; 109-585-088, Jackson ImmunoResearch) nachgewiesen. Alle CBA-Studien wurden mit einem Zeiss-Axiolmager-M2-Fluoreszenzmikroskop mit ApoTome.2-System (Carl Zeiss, Jena, Deutschland) untersucht und die Ergebnisse mit einem Zeiss LSM710 Konfokalmikroskop (Carl Zeiss) gescannt.

IgG-Unterklasse

Die IgG-Subklasse der Antikörper wurde unter Verwendung von CBA mit HEK293-Zellen, die GluK2 exprimieren, und sekundären Anti-Mensch-Antikörpern, die spezifisch für IgG1, IgG2, IgG3 und IgG4 sind, wie berichtet, untersucht (Arino H, Armangue T, Petit-Pedrol M, et al. (2016): Anti-LG11-associated cognitive impairment: Presentation and long-term outcome, Neurology).

Immunoabsorptionsstudien

Seren mit einer auf GluK2 restringierte Reaktivität (d. h. fehlende Reaktivität mit anderen GluK-Untereinheiten) oder Seren mit GluK1/2/3-Reaktivität wurden seriell mit 8 Petrischalen (60 mm Durchmesser), die lebende HEK293-Zellen, die GluK2 exprimieren, oder mock-transfizierte Zellen enthielten, inkubiert. Jede der 8 aufeinanderfolgenden Inkubationen wurde für 1 Stunde bei RT durchgeführt. Die immunabsorbierten Seren wurden dann mit Rattenhirn-Immunhistochemie, lebenden Hippocampus-Neuronen und CBA untersucht, wie berichtet (Sabater L, Gaig C, Gelpi E, et al. (2014): A novel non-rapid-eye movement and rapid-eyemovement parasomnia with sleep breathing disorder associated with antibodies to IgLON5: a case series, characterisation of the antigen, and post-mortem study, Lancet Neurol).

Quantitative Analyse von GluK2-Clustern in kultivierten Neuronen unter Verwendung konfokaler Mikroskopie

Ratten-Hippocampus-Neuronen wurden 14 DIV mit CSF von zwei Patienten (Fall #1 und Fall #5) oder Kontroll-CSF (beide 1:20 verdünnt) für 24h oder 72h behandelt. Fall 1 hatte Antikörper, die ausschließlich mit GluK2 reagierten; bei Fall 5 wurden einige der GluK2-Epitope mit GluK1 geteilt; keine anderen Antikörper lagen in diesen beiden Fällen vor. Nach Entfernen der Antikörper durch Wechsel des Mediums konnten sich Neurone für 4 Tage erholen. Zu den angegebenen Zeitpunkten (24h, 72h und nach der 4-tägigen Erholung) wurden Neurone, die Patienten- oder Kontroll-CSF ausgesetzt waren, gewaschen und mit aus Serum isoliertem menschlichem IgG mit GluK2-Aks (1:200, hier als primärer Antikörper verwendet) für 1h bei 37 °C inkubiert. Alle mit menschlichem IgG markierten GluK2-Zelloberflächenrezeptoren wurden dann mit Alexa-Fluor-488-Ziegen-anti-Mensch-IgG (1:1000, 109-545-088, Jackson Immuno Research) für 1 Stunde bei RT nachgewiesen. Anschließend wurden Zellen für 5 Minuten mit 4 % PFA fixiert, für 5 Minuten mit 0,3 % Triton X-100 permeabilisiert und für 1 Stunde mit polyklonalem Kaninchen-PSD95-Antikörper (1:200, ab18258, Abcam, Cambridge, UK) inkubiert, gefolgt von dem sekundären Antikörper Alexa-Fluor-594-Ziege-anti-Kaninchen-IgG (1:1000, A-11012, Thermo Fisher Scientific) für 1 Stunde bei RT. Gesamt- und synaptische Cluster von GluK2 wurden mit konfokaler Bildgebung (LSM710, Carl Zeiss, Jena, Deutschland) sichtbar gemacht. Bilder wurden unter Verwendung von Huygens Professional Version 17.04 (Scientific Volume Imaging, Niederlande) dekonvolviert und unter Verwendung der Imaris-8.1-Software (Oxford Instruments, Abingdon UK) quantifiziert, wie berichtet (Planaguma J, Leypoldt F, Mannara F, et al. (2016): Human N-methyl D-aspartate receptor antibodies alter memory and behaviour in mice, Brain. Planaguma J, Haselmann H, Mannara F, et al. (2016): Ephrin-B2 prevents N-methyl-D-aspartate receptor antibody effects on memory and neuroplasticity, Ann Neurol).

Elektrophysiologie in mit GluK2 transfizierten HEK293-Zellen

HEK293T-Zellen wurden mit 1 µg Gesamt-DNA von Konstrukten, die GluK2(Q) und eGFP kodieren, in einem Verhältnis von 9:1 (GluK2(Q):GFP) transfiziert, wie berichtet (Lai M, et al. (2009): AMPA receptor antibodies in limbic encephalitis alter synaptic receptor location, Ann Neurol, Band 65, Ausgabe 4. Lynch DR, et al. (1995): Pharmacological characterization of heterodimeric NMDA receptors composed of NR 1a and 2B subunits: differences with receptors formed from NR 1a and 2A, J Neurochem). Nach einer dreistündigen Transfektion wurden Zellen geteilt und in Glasdeckgläser gegeben, die mit Poly-L-Lysin in niedriger Dichte behandelt wurden. Vierundzwanzig Stunden nach der Transfektion wurden Deckgläser mit Patientenserum (Fall #1, Fall #5) oder Kontrollserum (1/100 verdünnt) für 30 Minuten oder 5 Stunden bei 37 °C und 5 % CO₂ behandelt.

Elektrophysiologische Aufzeichnungen wurden innerhalb von weniger als 1 Stunde, nachdem Serum entfernt wurde und Zellen in die Aufzeichnungskammer eingesetzt wurden, durchgeführt. Expression nicht markierter, nicht edierter GluK2(Q)-Untereinheit wurde durch Patchen von GFP-positiven Zellen bestimmt. Transfizierte Zellen wurden mit einem inversen Epifluoreszenzmikroskop (Axio-Vert.A1; Carl Zeiss) sichtbar gemacht. Zellen wurden bei RT kontinuierlich mit extrazellulärer physiologischer Lösung (in mM) perfundiert: 145 NaCl, 2,5 KCI, 1 CaCl₂, 1 MgCl₂, 10 HEPES und 10 Glucose, eingestellt auf pH 7,4 mit NaOH. Gesamtzellaufzeichnungen erfolgten an isolierten Zellen unter Verwendung von Elektroden mit Offene-Spitze-Widerständen von 2-4 MΩ (2,4 ± 0,1 MΩ), hergestellt aus Borosilikatglas (1,5 mm o.d., 0,86 mm i.d., Harvard Apparatus, Sandbach, UK), die mit einem P-97 Vertikal-Zieher (Narishige, London, UK) gezogen wurden und einen Serienendwiderstand von typischerweise 6-10 MΩ (8,7 ± 0,4 MΩ) ergeben. Glutamat 10 mM (Sigma-Aldrich) wurde durch piezoelektrische Translation (P-601.30; Physik Instrumente, Karlsruhe, Deutschland) eines Theta-Trommel-Applikationswerkzeugs, hergestellt aus Borosilikatglas (1,5 mm o.d.; Sutter Instruments), bei einem Haltepotential von -60 mV auf Zellen appliziert. Glutamatpulse wurden während 2s alle 20s appliziert, um homomeren GluK2-Rezeptoren zu ermöglichen, sich von der Desensibilisierung zu erholen. Am Ende jeder Aufzeichnung wurde die Angemessenheit des Lösungsaustauschs geprüft, indem die Versiegelung zerstört wurde und der Flüssigkeitsübergangsstrom an der offenen Pipette gemessen wurde (10-90 % Anstiegszeit, normalerweise 600-800 µs). Ströme wurden bei 5 kHz erfasst und bei 2 kHz tiefpassgefiltert mit einem Axopatch-200B-Verstärker, einer Digidata-1440A-Schnittstelle und der pClamp10-Software (Molecular Devices, CA, USA). Intrazelluläre Pipettenlösung enthielt (in mM): 145 CsCl, 2,5 NaCl, 10 HEPES, 1 Cs-EGTA und 4 MgATP, eingestellt auf pH-Wert 7,2 mit CsOH. Aufzeichnungen wurden unter Verwendung von IGOR Pro (Wavemetrics, OR, USA) mit NeuroMatic (Jason Rothman, UCL, UK) ausgewertet.

Statistische Analysen

Bei konfokalen Mikroskopiestudien werden Daten als Boxplots dargestellt, die den Median sowie das 25. und 75. Perzentil zeigen; Whiskers weisen auf die Minimal- und Maximalwerte hin. Die Auswirkung von Patientenserum im Vergleich zu Kontrollserum auf die Anzahl neuronaler Cluster von GluK2 und PSD95 wurde als Prozentsatz gegen den Median der Kontrollen normalisiert und mit Kruskal-Wallis mit multiplem Dunn-Vergleichstest analysiert. Bei elektrophysiologischen Studien werden Daten in den Abbildungen als Balkendiagramme des Mittelwerts mit Fehlerbalken, die den S.E.M. angeben, dargestellt. Vergleiche zwischen den Gruppen wurden unter Verwendung des nicht-parametrischen Kruskal-Wallis-Tests mit multiplem Dunn-Vergleichstest durchgeführt. Unterschiede wurden bei p<0,05 als signifikant angesehen. Statistische Analyse wurde mit GraphPad Prism Version 5.0d für Mac OS X (GraphPad Software, San Diego, Kalifornien, USA, www.graphpad.com) durchgeführt.

Ergebnisse

Zur Antigencharakterisierung wurden Seren von zwei Patienten verwendet. In beiden Fällen immunreagierten die Proben mit einem Antigen, das auf der Zelloberfläche von Neuronen exprimiert wird, und produzierten ein identisches Muster von Hirn-Immunfärbung ( ).

Patient #1:

Ein 24 Jahre alter Mann wurde wegen akut einsetzender Kopfschmerzen, Übelkeit und Erbrechen in die Notaufnahme gebracht. Acht Jahre zuvor war er wegen eines Hodgkin-Lymphoms behandelt worden und hatte seitdem keine Anzeichen einer Erkrankung mehr. Der Patient beschrieb den aktuellen Symptomen vorausgehende/n Schwindel und Photophobie für mehrere Wochen. Bei der Untersuchung waren das Gedächtnis, die Kognition und die Kranialnervenfunktion intakt, und es wurden keine motorischen oder sensorischen Defizite nachgewiesen. Die CSF zeigte 52 weiße Blutkörperchen/mm³ und erhöhte Proteinkonzentration (1,18 g/L). Wegen des Verdachts auf Herpes-simplex-Enzephalitis wurde er mit Aciclovir behandelt, bis die PCR-Ergebnisse negativ waren. An Tag 3 nach Aufnahme verschlimmerten sich die Kopfschmerzen, und er entwickelte klinische und MRI-Merkmale einer Zerebellitis mit Ödem und Masseneffekt, die einen obstruktiven Hydrozephalus verursachten ( , obere Reihe). Eine Behandlung mit intravenösen Steroiden und Mannitol führte zu einer neurologischen Besserung. Ein Fluordesoxyglukose- (FDG-) PET-Scan des Körpers zeigte eine hypermetabolische supraklavikuläre Adenopathie mit Biopsiebefunden, übereinstimmend mit Hodgkin-Lymphom. Er erhielt Chemotherapie und Strahlentherapie, was zu einer progressiven Besserung führte. Bei der letzten Nachuntersuchung, 60 Monate nach Symptombeginn, war er vollständig genesen.

Identifizierung von GluK2 als das Hauptzielantiqen

Immunpräzipitation von lebenden Neuronen mit dem angegebenen Patientenserum ergab 21 bzw. 25 einzigartige Peptide, die die 26 % bzw. die 33 % der Ratten-GluK2-Proteinsequenz (NP_062182.1) abdecken. Peptide von anderen GluK-Untereinheiten wurden ebenfalls immunpräzipitiert, jedoch mit geringerem Wert: GluK1 (2 einzigartige Peptide), GluK3 (2 einzigartige Peptide), GluK4 (3 einzigartige Peptide), GluK5 (5 einzigartige Peptide). Das häufigste Peptid wurde mit beiden Serumproben präzipitiert (Peptid: MESPIDSADDLAK) und entspricht einer identischen Sequenz, die von GluK1 (NCBI-Hinterlegungsnummer: NP_001104584; 664-676 Aminosäuren), GluK2 (NP_062182.1; 664-676 Aminosäuren) und GluK3 (NP_001 106187.1; 666-678 Aminosäuren) geteilt wird, gelegen in dem extrazellulären S2-Segment der Ligandenbindungsdomäne des Proteins. Silbergefärbtes Gel, das parallel zu einem Immunoblot, der die GluK2-Bande zeigt, durchgeführt wurde, ist in gezeigt.

GluK2-CBA-Test und IqG1-Antikörper-Subklasse

Alle 8 Patienten, die zunächst aufgrund ihres ähnlichen Musters von Hirn-Immunfärbung ausgewählt wurden, zeigten eine robuste Reaktivität mit HEK293-Zellen, die mit GluK2 transfiziert waren, was einen zellbasierten Assay (CBA) bereitstellte ( ). In Anbetracht der Tatsache, dass die Aminosäuresequenz von GluK2 zu ~80 % mit GluK1 und GluK3 und zu ~40 % mit GluK4 und GluK5 identisch ist (Bettler B, Egebjerg J, Sharma G, et al. (2020): Cloning of a putative glutamate receptor: a low affinity kainate-binding subunit, Neuron), untersuchten wir die Proben aller 8 Patienten auf zusätzliche Reaktivität mit GluK1 und GluK3, und verfügbare Proben von 7 Patienten auf GluK4- und GluK5-Reaktivität. In 2 Fällen wurden einige der GluK2-Epitope mit GluK1 oder GluK3 geteilt. In allen 8 Fällen betrugen die durch serielle Probenverdünnung gemessenen GluK2-Aks-Titer >1:50 CSF und >1:200 Serum, und alle waren IgG1 (nicht gezeigt).

Die Spezifität der GluK2-Antikörperreaktivität wurde durch CBA ( ), Immunpräzipitation ( und Immunhistochemie mit GluK2-Knockout-Hirngewebe ( ) bestätigt. Von den 8 Indexfällen reagierten Proben von 7 nicht mit GluK2-Knockout-Hirn, einschließlich der 2 Fälle, in denen einige GluK2-Epitope mit GluK1 oder GluK3 geteilt wurden, was darauf hindeutet, dass die geteilten Epitope nicht zu Gewebefärbung beitragen. Darüber hinaus hob Immunabsorption mit GluK2 die Reaktivität der Proben der 7 Patienten auf (Beispiel in gezeigt); der einzige Fall mit leichter Restreaktivität war Fall 4, der zusätzlich Antikörper mit niedrigem Titer gegen NMDAR, AMPAR und GlyR aufwies (nicht gezeigt).

Nachweis von GluK2-Aks bei anderer Anti-Glutamat-Rezeptor-Enzephalitis

Das Auffinden zusätzlicher Antikörper gegen andere Glutamatrezeptoren in Fall 4 und die Tatsache, dass GluK2 eine ~40 %ige Aminosäure-Identität mit GluA1/GluA2-Untereinheiten des AMPAR (die die Antigene bei Anti-AMPAR-Enzephalitis sind) und eine -25 %ige Aminosäure-Identität mit Untereinheiten der NMDARs aufweist, veranlasste uns, GluK2-Aks bei 71 zufällig ausgewählten Patienten mit Anti-AMPAR-Enzephalitis und 73 mit Anti-NMDAR-Enzephalitis zu bestimmen. Unter diesen 144 Fällen wurden GluK2-Aks bei 5/71 mit Anti-AMPAR-Enzephalitis und 1/73 mit Anti-NMDAR-Enzephalitis gefunden. Alle 6 GluK2-Akspositive Patienten in dieser Gruppe hatten hohe NMDAR- und AMPAR-Antikörpertiter (alle CBA, CSF-Titer >1:200) und relativ niedrige Titer von GluK2-Aks (CSF-CBA <1:50). Eine Zusammenfassung der klinischen Informationen, Antikörperassoziationen und Komorbiditäten ist in dem letzten Abschnitt der Ergebnisse bereitgestellt. In dem Serum oder CSF der übrigen 458 Patienten mit Autoimmun- oder neurodegenerativen Erkrankungen oder in dem Serum von 23 gesunden Blutspendern wurden keine GluK2-Aks gefunden.

Patienten-Antikörper verursachen eine Abnahme von GluK2-Clustern in lebenden Ratten-Hippocampus-Neuronen

Neuronen, die mit Patienten-CSF (Fälle 1 und 5) behandelt wurden, zeigten im Vergleich zu denen, die mit Kontroll-CSF behandelt wurden, eine signifikante Verringerung von GluK2-Clustern auf der Zelloberfläche ( ). Eine längere Behandlung mit Patienten-CSF (z. B. 72 gegenüber 24 Stunden) führte zu robusteren Effekten ( ). Im Gegensatz dazu blieben die PSD95-Cluster unbeeinflusst ( ). Nach Wechsel des Mediums, um die Antikörper zu entfernen, Ermöglichen, dass die Neurone sich für 4 Tage erholen, kehrten die Niveaus von GluK2-Cluster zu Werten zurück, die ähnlich denen der Kontrollen waren ( ).

Patienten-Antikörper beeinträchtigen GluK2-vermittelte Ströme

Die Auswirkungen von Patienten-Antikörpern auf GluK2-vermittelte Ströme wurden mit Proben von Patienten 1 und 5 unter Verwendung von HEK293-Zellen, die GluK2 exprimieren, untersucht ( ). Im Vergleich zu unbehandelten Zellen oder Zellen, die mit Serum eines gesunden Lebewesens behandelt wurden, zeigten die mit Patientenseren behandelten Zellen einen signifikanten Rückgang von GluK2-vermittelten Strömen ( ). Die Beeinträchtigung von GluK2-vermittelten Strömen trat nur bei Zellen auf, die für mehrere Stunden (-5 Stunden) Patientenserum ausgesetzt waren, nicht aber bei Zellen, die nur sehr kurz inkubiert wurden (z. B. 30 Minuten). Berücksichtigend, dass nach 30 Minuten Inkubation eine umfangreiche Antikörperbindung an GluK2 vorlag ( ), deutet das Fehlen elektrophysiologischer Effekte durch die gebundenen Antikörper darauf hin, dass sie GluK2-Funktion nicht blockieren oder darauf keine direkte antagonistische Wirkung haben. Daher ist die Verringerung von GluR2-vermittelten Strömen, beobachtet nach 5 Stunden, wahrscheinlich auf Rezeptor-Internalisierung und -Clustern zurückzuführen (Crisp SJ, Dixon CL, Jacobson L, et al. (2019): Glycine receptor autoantibodies disrupt inhibitory neurotransmission, Brain) Dieses Paradigma ähnelt dem von anderen Glutamatrezeptor-Antikörpern (NMDAR oder AMPAR), die Rezeptorfunktion hauptsächlich durch Internalisierung beeinträchtigen (Haselmann H, Mannara F, Werner C, et al. (2018): Human autoantibodies against the AMPA receptor subunit GluA2 induce receptor reorganization and memory dysfunction, Neuron. Moscato EH, Peng X, Jain A, Parsons TD, Dalmau J, Balice-Gordon RJ. (2014): Acute mechanisms underlying antibody effects in anti-N-methyl-D-aspartate receptor encephalitis, Ann Neurol), und unterscheidet sich von dem von Glycinrezeptor-Antikörpern, die funktionelle Blockade des Rezeptors nach sehr kurzen (<30) Inkubationen bewirken (Crisp SJ, et al. (2019): Glycine receptor autoantibodies disrupt inhibitory neurotransmission, Brain).

Klinisches und immunologisches Spektrum von GluK2-Autoantikörpern

Das mittlere Alter bei Krankheitsbeginn betrug 28 Jahre (Spanne: 14-75 Jahre), 5 waren männlich. Bei allen bis auf einen Patienten (der bereits zuvor HIV-bedingte neurologische Symptome hatte) schritt der erneute Beginn neurologischer Symptome rasch (<6 Wochen) bis zum Erreichen des Höhepunkts der Erkrankung voran. Vier Patienten, mittleres Alter 19 Jahre (Spanne 14-33), wiesen auffällige klinische Manifestationen auf, die mit Zerebellitis vereinbar waren, einschließlich Opsoklonus bei einem von ihnen. Zwei von ihnen entwickelten einen obstruktiven Hydrozephalus, der bei einem mit Ventrikeldrainage behandelt wurde und bei dem anderen mit Mannitol kontrolliert wurde. Drei Patienten (23, 67 und 75 Jahre alt) entwickelten eine diffusere Enzephalitis mit grippeähnlichen Prodromalsymptomen, gefolgt von Glieder- oder Gangataxie (2 Fälle) und Verwirrung, Desorientierung, wahnhaften Gedanken, psychomotorischer Unruhe, Myoklonus oder Krampfanfällen. Der andere Patient war ein 73-jähriger Mann mit einer Geschichte von Alkoholmissbrauch, seit 13 Jahren HIVpositiv (mit 4 antiretroviralen Medikamenten gut kontrolliert), der eine rasche (~3 Monate) neurologische Verschlechterung ohne Anzeichen einer HIV-Exazerbation (CD4-Zahl 240/ml; Viruslast unterdrückt) und entzündliche Befunde im CSF (20 WBC/ml; 5 oligoklonale Banden, normale Tau- und Phospho-Tau-Werte), die auf eine Autoimmunenzephalitis hindeuteten, entwickelte.

Von 7 Patienten waren MRI-Untersuchungen verfügbar: 4 zeigten multifokale T2-FLAIR-Anomalien in dem Zerebellum mit oder ohne zerebrale Beteiligung ( , Reihe), einer (Fall #5) hatte eine klinisch-radiologische Dissoziation mit milden zerebellären Symptomen, aber ausgedehnten zerebellären MRI-Anomalien ( , . Reihe). Ein weiterer Patient wies ein mäßiges zerebelläres Ödem ( , . Reihe) mit erhöhter FDG-PET-Aktivität auf, und die übrigen 2 Patienten hatten eine Hirn- und zerebelläre Atrophie (nicht gezeigt). Sechs dieser 7 Patienten hatten eine CSF-Pleozytose. Zwei Patienten hatten aktive Tumore (1 rezidivierendes Hodgkin-Lymphom und 1 Ovarial-Teratom), die erfolgreich behandelt wurden, und bei 1 wurde 1 Jahr vor Beginn neurologischer Symptome ein retroperitoneales Teratom entfernt, ohne Tumor-Rezidiv. Sieben Patienten wurden mit Steroiden behandelt, und 2 von ihnen erhielten Immunmodulation (Patient 6: IVIg; und Patient 4: IVIg, Plasmaaustausch, Rituximab, Cyclophosphamid). Drei Patienten erholten sich teilweise oder vollständig, 2 starben in der akuten Phase der Erkrankung (1 an multiplen systemischen Komplikationen, 1 an Sepsis), 1 mit HIV starb 27 Monate nach Krankheitsbeginn aus unbekannter Ursache, und 1 ging der Nachbeobachtung verloren. Von dem verbleibenden Patienten (Fall 3) waren über die Symptomdarstellung hinaus keine weiteren Informationen verfügbar; sie war jedoch ein 14 Jahre altes Mädchen, das eine Zerebellitis mit akuter zerebellärer Ataxie entwickelte.

Separat zu den 8 Indexfällen mit ausschließlich oder überwiegend GluK2-Antikörpern gab es 5 Patienten mit Anti-AMPAR- und 1 mit Anti-NMDAR-Enzephalitis, die gleichzeitig GluK2-Aks aufwiesen. Vier der 5 Fälle mit AMPAR-Antikörpern hatten Tumore (3 Thymome, 1 SCLC). Die 3 Fälle mit Thymomen wiesen mehrere zusätzliche Antikörper auf (2 CRMP5; 1 AChR, CASPR2 und GABAbR), und alle zeigten ein Muster von Hirn-Immunfärbung, das aus gemischten Reaktivitäten bestand ( , . Zeile). In einem der Fälle mit gleichzeitigen AMPAR-Antikörpern und in dem Fall mit NMDAR-Antikörpern wies die Hirn-Immunfärbung keine GluK2-Reaktivität auf. Keiner der 6 Patienten mit gleichzeitigen Antikörpern entwickelte klinisch-radiologische Merkmale einer zerebellären Dysfunktion, und alle zeigten ein Syndrom, das mit den gleichzeitigen Antikörpern vereinbar war.

Diskussion

Wir fanden, dass Glutamat-Kainat-Rezeptoren, die GluK2 (früher bekannt als GluR6) enthalten, bei einigen Patienten mit Enzephalitis oder Zerebellitis unklarer Ätiologie das Ziel von Antikörpern sind und dass diese Antikörper wahrscheinlich pathogen sind. Dies wird durch mehrere Befunde gestützt: 1) Die Antikörper reagieren mit extrazellulären GluK2-Epitopen in Kulturen von lebenden Ratten-Hippocampus-Neuronen und GluK2-exprimierenden HEK293-Zellen; 2) sie sind IgG1 und internalisieren GluK2-Rezeptoren, was zu einer signifikanten, aber reversiblen Abnahme synaptischer und extrasynaptischer GluK2-Cluster führt; 4) sie verursachen auch eine signifikante Verringerung GluK2-vermittelter Ströme in HEK293-Zellen, die diese Rezeptoren exprimieren, und 5) einige Patienten sprachen auf empirische Steroide oder Erstlinien-Immuntherapie an.

Die Kainatrezeptoren sind tetramerische ionotrope Glutamatrezeptoren, die GluK1, GluK2, GluK3, GluK4 oder GluK5, früher bekannt als GluR5, GluR6, GluR7, KA1 und KA2, einschließen können (Contractor A, Mulle C, Swanson GT (2011): Kainate receptors coming of age: milestones of two decades of research, Trends Neurosci). GluK1, GluK2 und GluK3 bilden funktionelle homo- und heterotetramerische Rezeptoren, während GluK4 und GluK5 nur funktionelle Rezeptoren bilden, wenn sie mit GluK1 bis GluK3 co-exprimiert werden (Contractor A, et al. (2011): Kainate receptors coming of age: milestones of two decades of research, Trends Neurosci). Wie in dem Fall der GluA2-Untereinheit der AMPARs zeigen GluK1 und GluK2 Q/R-Edierung an der zweiten Transmembrandomäne (TM2). Diese Q-zu-R-Substitution hebt Ca²⁺-Permeabilität auf, während sie Cl^--Permeation des Kanals erhöht.(Egebjerg J, Heinemann SF (1993): Ca2+ permeability of unedited and edited versions of the kainate selective glutamate receptor GluR6, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Band 90. Burnashev N, Villarroel A, Sakmann B (1996): Dimensions and ion selectivity of recombinant AMPA and kainate receptor channels and their dependence on Q/R site residues, J Physiol, Band 496, Teil 1, Seite 165-173) Außerdem sind Q-Reste für größere Leitfähigkeit und Einwärtsgleichrichtung verantwortlich (Sommer B, Kohler M, Sprengel R, Seeburg PH (1991): RNA editing in brain controls a determinant of ion flow in glutamate-gated channels, Cell). In der vorliegenden Studie hat Q/R-Edierung die Antikörperreaktivität mit GluK2 nicht verändert (Daten nicht gezeigt).

Die Kainatrezeptoren sind unkonventionelle Mitglieder der Glutamatrezeptorfamilie, da sie, im Gegensatz zu NMDAR oder AMPAR, nicht überwiegend in exzitatorischen postsynaptischen Komplexen gefunden werden. Neben einer Funktion als ionotrope Rezeptoren wirken Kainatrezeptoren als Modulatoren synaptischer Übertragung und neuronaler Erregbarkeit, wechselwirkend mit metabotropen Signalwegen (Contractor A, et al. (2011): Kainate receptors coming of age: milestones of two decades of research, Trends Neurosci). Sie spielen eine entscheidende Rolle als präsynaptische Regulatoren der Neurotransmitterfreisetzung sowohl an exzitatorischen als auch an inhibitorischen Synapsen durch Mechanismen, die nicht vollständig verstanden sind (Pinheiro PS, Mulle C (2006): Presynaptic glutamate receptors: physiological functions and mechanisms of action, Nat Rev Neurosci. Lerma J. Kainate (2006): receptor physiology, Curr Opin Pharmacol), sind in der Lage, kurz- und langfristige Plastizität zu ermöglichen (Contractor A, et al. (2011): Kainate receptors coming of age: milestones of two decades of research, Trends Neurosci. Schmitz D, Mellor J, Breustedt J, Nicoll RA (2003): Presynaptic kainate receptors impart an associative property to hippocampal mossy fiber longterm potentiation. Nat Neurosci) und können als Modulatoren der GABA-ergen Übertragung wirken (Lourenco J, Cannich A, Carta M, Coussen F, Mulle C, Marsicano G (2010): Synaptic activation of kainate receptors gates presynaptic CB(1) signaling at GABAergic synapses, Nat Neurosci, Seite 197-204).

Unser ursprüngliches Ziel, das Autoantigen einer Gruppe von 8 Patienten mit Antikörpern, die ein ähnliches Muster von Hirn-Immunfärbung aufwiesen, zu charakterisieren, wurde erweitert, nachdem wir herausgefunden hatten, dass das Antigen GluK2 war, das eine Proteinsequenz aufweist, die anderen Glutamatrezeptor-Untereinheiten sehr ähnlich ist (-80 % Identität mit GluK1, GluK3; - 40 % mit GluK4, GluK5 und GluA1, GluA2 von AMPAR; und -25 % mit NMDAR-Untereinheiten) (Bettler B, et al. (2020): Cloning of a putative glutamate receptor: a low affinity kainate-binding subunit, Neuron). Daher war es nicht überraschend, dass die Antikörper einiger Patienten mit Epitopen kreuzreagierten, die sie mit GluK1/GluK3 teilen, wie in Immunabsorptionsstudien gezeigt. Untersuchungen mit Patienten, die ansonsten eine klassische Anti-AMPAR- oder NMDAR-Rezeptor-Enzephalitis aufwiesen, führten jedoch zu der Identifizierung einer Gruppe von 6 Patienten, meist mit AMPAR-Antikörpern, die gleichzeitig GluK2-Aks aufwiesen. Im Vergleich zu den 8 Indexfällen mit ausschließlich oder überwiegend GluK-Antikörpern wiesen jene mit gleichzeitiger Anti-AMPAR- oder Anti-NMDAR-Enzephalitis mit größerer Wahrscheinlichkeit aktive Tumore (hauptsächlich Thymome), multiple Autoantikörper auf, und das Muster von Hirn-Immunfärbung bestand in der Regel aus dem erwarteten Gemisch von Immunreaktivitäten. Darüber hinaus stimmten bei dieser Patientengruppe das Syndrom und der Verlauf mit jenen der begleitenden Antikörper und Tumoren überein. Diese Befunde deuten darauf hin, dass sich die GluK2-Epitope in beiden Patientengruppen unterscheiden können und in der zweiten Gruppe wahrscheinlich weniger klinisch relevant sind. Zukünftige Studien mit Immunkompetition zwischen Proben, die für beide Patientengruppen repräsentativ sind, könnten diese Hypothese klären, aber die derzeit verfügbaren geringen Mengen an Serum/CSF verhindern die Durchführung dieses Experiments.

Wir fanden, dass eine längere Behandlung (>5 Stunden) von GluK2-exprimierenden HEK293-Zellen mit Patientenproben eine robuste Verringerung GluK2-vermittelter Ströme bewirkte, die nach einer kurzen Behandlung (-30 Minuten) nicht beobachtet wurde, was darauf hindeutet, dass die Beeinträchtigung von GluK2-Strömen sekundär zu den reduzierten Zelloberflächenrezeptoren (verbleibende Fraktion, nicht internalisiert) war und nicht eine antagonistische Wirkung des Antikörpers auf die Rezeptorfunktion. Dieses Paradigma ähnelt den pathogenen Mechanismen, die bei anderer Anti-Glutamat-Rezeptor-Enzephalitis (NMDAR (Hughes EG, Peng X, Gleichman AJ, et al. (2010): Cellular and synaptic mechanisms of anti-NMDA receptor encephalitis, J Neurosci. Mikasova L, P. DR, Bouchet D, et al. (2012): Disrupted surface crosstalk between NMDA and Ephrin-B2 receptors in anti-NMDA encephalitis, Brain, Seite 1606-1621) oder AMPAR (Haselmann H, Mannara F, Werner C, et al. (2018): Human autoantibodies against the AMPA receptor subunit GluA2 induce receptor reorganization and memory dysfunction, Neuron. Peng X, Hughes EG, Moscato EH, Parsons TD, Dalmau J, Balice-Gordon RJ (2015): Cellular plasticity induced by anti-alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid (AMPA) receptor encephalitis antibodies, Ann Neurol, Band 77, Seite 381-398)), die weitgehend durch Internalisierung von Rezeptoren vermittelt werden, beschrieben werden, während für GlyR-Antikörper eine robuste antagonistische Wirkung (zusammen mit einer leichten bis mittleren Internalisierung) nachgewiesen wurde. (Crisp SJ, et al. (2019): Glycine receptor autoantibodies disrupt inhibitory neurotransmission, Brain. Peng X, Hughes EG, Moscato EH, Parsons TD, Dalmau J, Balice-Gordon RJ (2015): Cellular plasticity induced by anti-alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid (AMPA) receptor encephalitis antibodies, Ann Neurol, Band 77, Seite 381-398).

Obwohl verschiedene Autoimmunenzephalitis mit zerebellären Symptomen manifestieren kann, tritt sie fast nie als akute Zerebellitis auf (Dalmau J, Graus F (2018): Antibody-mediated encephalitis, N Engl J Med, Band 378, Seite 840-851). Die Tatsache, dass 4/8 Patienten mit ausschließlich oder überwiegend GluK2-Antikörpern frühe und prominente klinische oder MRI-Befunde zerebellärer Hirnstamm-Dysfunktion oder Zerebellitis (die bei zwei obstruktiven Hydrocephalus verursachte) entwickelten, ist bemerkenswert und stellt einen Hinweis bereit, diese Erkrankung zu erwarten. Im Allgemeinen sind die meisten berichteten Patienten mit akuter Zerebellitis Kinder oder junge Erwachsene, und sie sprechen in der Regel auf Steroide an (Van Samkar A, Poulsen MNF, Bienfait HP, Van Leeuwen RB (2017): Acute cerebellitis in adults: a case report and review of the literature, BMC Res Notes. Emelifeonwu JA, Shetty J, Kaliaperumal C, et al. (2018): Acute Cerebellitis in Children: A Variable Clinical Entity, J Child Neurol, Band 33, Seite 675-684). GluK2-Aks stellen die ersten relevanten Antikörper dar, die bei Patienten mit diesem Syndrom gefunden wurden. Bei 5 japanischen Kindern mit akuter Zerebellitis wurden IgM- oder IgG-Antikörper gegen den Glutamatrezeptor Delta 2 nachgewiesen (Shimokaze T, Kato M, Yoshimura Y, Takahashi Y, Hayasaka K (2007): A case of acute cerebellitis accompanied by autoibodies against glutamate receptor delta2, Brain Dev, Band 29, Seite 224-226. Kubota M, Takahashi Y (2008): Steroid-responsive chronic cerebellitis with positive glutamate receptor delta 2 antibody, J Child Neurol, Band 23, Seite 228-230). Im Gegensatz zu den hier berichteten GluK2-Aks ist die klinische oder pathogene Bedeutung von Glutamatrezeptor-Delta-2-Antikörpern unklar, da sie auch bei mehreren anderen Erkrankungen beschrieben wurden (Berridge G, Menassa DA, Moloney T, et al. (2018): Glutamate receptor delta2 serum antibodies in pediatric opsoclonus myoclonus ataxia syndrome, Neurolog, Band 91, Seite 714-723. Fukuoka T, Takeda H, Ohe Y, Deguchi I, Takahashi Y, Tanahashi N (2012): Anti-glutamate receptor delta2 antibody-positive migrating focal encephalitis, Clin Neurol Neurosurg).

Im Gegensatz zu der Gruppe von Patienten mit ausschließlich oder überwiegend GluK2-Antikörpern entwickelte keiner der 6 Patienten mit GluK2-Aks mit gleichzeitiger Anti-AMPAR-Enzephalitis (mit oder ohne CRMP5-Antikörper) oder Anti-NMDAR-Enzephalitis und keiner der zusätzlichen zufällig ausgewählten 138 Patienten mit Anti-NMDAR- oder AMPAR-Enzephalitis akute Zerebellitis, obstruktiven Hydrozephalus oder Opsoklonus-Myoklonus (Daten nicht gezeigt). Einige dieser Merkmale, wie zerebelläre Dysfunktion bei AMPAR-Antikörpern (Joubert B, Kerschen P, Zekeridou A, et al. (2015): Clinical spectrum of encephalitis associated with antibodies against the alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid receptor: Case series and review of the literature, JAMA Neurol, Band 72, Seite 1163-1169), oder Opsoklonus mit NMDAR-Antikörpern wurden berichtet, und es ist nicht bekannt, ob sie GluK2-Aks aufwiesen.

Unsere Studie weist Einschränkungen auf, die sich aus der retrospektiven Analyse und der geringen Zahl an Fällen ergeben, die in der Regel bei Erstbeschreibungen von Autoimmunenzephalitis auftreten (Lai M, et al. (2009): AMPA receptor antibodies in limbic encephalitis alter synaptic receptor location, Ann Neurol, Band 65, Ausgabe 4. Dalmau J, et al. (2007): Paraneoplastic anti-N-methyl-D-aspartate receptor encephalitis associated with ovarian teratoma, Ann Neurol. Lancaster E, Lai M, Peng X, et al. (2010): Antibodies to the GABA(B) receptor in limbic encephalitis with seizures: case series and characterisation of the antigen, Lancet Neurol. Petit-Pedrol M, Armangue T, Peng X, et al. (2014): Encephalitis with refractory seizures, status epilepticus, and antibodies to the GABAA receptor: a case series, characterisation of the antigen, and analysis of the effects of antibodies, Lancet Neurol, Band 13, Seite 276-286) Das Langzeitergebnis von Patienten mit ausschließlich GluK-Antikörpern ist unklar, da nur 2 Immunmodulation erhielten (der Rest bewertbarer Fälle erhielt lediglich Steroide), 2 in der akuten Phase an systemischen Komplikationen starben und 1 27 Monate nach einer Episode mit raschem Fortschreiten der Symptome, die ein langsames Fortschreiten HIV-bedingter Defizite überlagerte, starb. 3 Patienten zeigten jedoch eine deutliche Besserung, 1 sogar eine vollständige Genesung, was darauf hindeutet, dass frühzeitige Diagnose und ein Immuntherapie-Ansatz, ähnlich dem, der auch bei anderer Autoimmunenzephalitis verwendet wird, wirksam sein können.

Die aktuellen Befunde haben wichtige klinische Implikationen. Mit GluK2-Antikörpern assoziierte Enzephalitis sollte vermutet werden in Fällen schneller Präsentation einer Enzephalitis unbekannter Ursache mit klinisch-radiologischer zerebellärer Beteiligung, die von leichten zerebellären Symptomen bis hin zu schwerer Zerebellitis reicht, die von ausgedehnten, nicht auf das Zerebellum beschränkten MRI-T2-FLAIR-Anomalien begleitet sein kann. Begleitbefunden können Enzephalopathie (Gedächtnisdefizit, Verhaltensänderung, Krampfanfälle), Anzeichen einer Beteiligung des kortikospinalen Trakts (Hyperreflexie, nach oben gerichtete Zehen, ataktisch-spastischer Gang) oder Opsoklonus-Myoklonus einschließen. Bei Symptombeginn sollten Patienten auf ein potenziell lebensbedrohliches Posterior-fossa-Ödem und obstruktiven Hydrocephalus überwacht werden. Wenn möglich, sollten Antikörper in CSF und Serum mittels CBA und Hirn-Immunfärbung untersucht werden. Das Vorliegen von gleichzeitigen AMPA- oder NMDAR-Antikörpern geht mit Syndromen und Komorbiditäten einher, die in der Regel mit diesen Antikörpern zusammenhängen. Künftige Studien sollten sich darauf konzentrieren, Epitop-Syndrom-Assoziationen zu verfeinern, die Wirksamkeit von Immuntherapie zu bewerten und Tiermodelle der Krankheit zu entwickeln.

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG

Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.

Zitierte Patentliteratur

EP 3505935 [0031]
US 9250250 [0032]
US 11041005 [0034]
EP 3018478 [0035]
US 6387639 [0036]
US 10962554 [0037]
US 9719993 [0038]
US 9188587 [0040]
EP 14003703 [0040, 0064]
EP 14003958 [0040, 0064]
EP 15001186 [0040, 0064]
US 7314721 [0048, 0064]
US 7972976 [0058]
EP 14171561 [0064]
EP 3101424 [0064]
WO 2013041540 [0072]
US 7166697 [0076]
EP 3477300 [0113]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

Larkin, M. A., Blackshields, G., Brown, N. P., Chenna, R., McGettigan, P. A., McWilliam, H., Valentin, F., Wallace, I. M., Wilm, A., Lopez, R., Thompson, J. D., Gibson, T. J., Higgins, D. G. (2007): Clustal W and Clustal X, Version 2.0, Bioinformatics, 23, 2947-2948 [0058]
Gleichman, A.J., Spruce, L. A., Dalmau, J., Seeholzer, S. H., and Lynch, D. R. (2012) Anti-NMDA Receptor Encephalitis Antibody binding Is Dependent on Amino Acid Identity of a Small Region within the GluN1 Amino Terminal Domain, J. Neuroscience, 32(32)11083-11094 [0058]
Ausubel, F. M. (1995), Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, Inc. Darüber hinaus kann der Fachmann die Anweisungen, die in dem Handbuch Boehringer Mannheim GmbH (1993) The DIG System Users Guide for Filter Hybridization, Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim, Deutschland und in Liebl, W., Ehrmann, M., Ludwig, W., und Schleifer, K. H. (1991) International Journal of Systematic Bacteriology 41: 255-260 [0061]
Krenek et al. (1989) J. Immunol. Meth 117, 91-97 [0067]
Nairn etal. (1969) Clin. Exp. Immunol. 4, 697-705 [0067]
Raoult, D., und Dasch, G. A. (1989), The line blot: an immunoassay for monoclonal and other antibodies. Its application to the serotyping of gramnegative bacteria. J. Immunol. Methods, 125 (1-2), 57-65 [0072]
Hassanzadeh L, Chen S, Veedu RN. Radiolabeling of Nucleic Acid Aptamers for Highly Sensitive Disease-Specific Molecular Imaging. Pharmaceuticals (Basel). 2018;11(4):106 [0075]
Chiu ML et al., Antibodies (Basel), (2019);8(4):55; Simeon R. & Chen Z., Protein Cell. (2018);9(1):3-14; und Kapitel 7 - Non-Antibody Scaffolds aus Handbook of Therapeutic Antibodies (2007) [0076]
Rothe C & Skerra A., BioDrugs. (2018);32(3):233-243 [0076]
Gebauer M & Skerra A, Curr Opin Biotechnol. (2019); 60:230-241 [0076]
Feldwisch, J & Tolmachev, V. (2012) Methods Mol. Biol. 899:103-126 [0076]
Wikman M et al., Protein Eng Des Sel. (2004);17(5):455-62 [0076]
Silverman J et al. (2005), Nat Biotechnol 23:1556-1561 [0076]
Plückthun A., Annu Rev Pharmacol Toxicol. (2015);55:489-511 [0076]
Hosse RJ et al. (2006). Protein Sci 15:14-27 [0076]
Hackel BJ, et al. (2008) J Mol Biol 381:1238-1252 [0076]
Weeks, I., Beheshti, I., McCapra, F., Campbell, A. K., Woodhead, J. S. (1983): Acridinium esters as high specific activity labels in immunoassay, Clin Chem, Band 29, Seite 1474-1479 [0080]
Eisei Noiri und Noria Hanafusa, The Concise Manual of Apheresis Therapy, Springer Tokyo, 2014. Hamilton, P., Kanigicherla, D., Hanumapura, P., Walz, L., Kramer, D., Fischer, M., Brenchley, P., and Mitra, S. (2018) J. Clin. Aph. 33(3), 283-290 [0113]
Egebjerg J, Heinemann SF (1993): Ca2+ permeability of unedited and edited versions of the kainate selective glutamate receptor GluR6, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Band 90. Burnashev N, Villarroel A, Sakmann B (1996): Dimensions and ion selectivity of recombinant AMPA and kainate receptor channels and their dependence on Q/R site residues, J Physiol, Band 496, Teil 1, Seite 165-173 [0146]
Contractor A, et al. (2011): Kainate receptors coming of age: milestones of two decades of research, Trends Neurosci. Schmitz D, Mellor J, Breustedt J, Nicoll RA (2003): Presynaptic kainate receptors impart an associative property to hippocampal mossy fiber longterm potentiation. Nat Neurosci) und können als Modulatoren der GABA-ergen Übertragung wirken (Lourenco J, Cannich A, Carta M, Coussen F, Mulle C, Marsicano G (2010): Synaptic activation of kainate receptors gates presynaptic CB(1) signaling at GABAergic synapses, Nat Neurosci, Seite 197-204 [0147]
Hughes EG, Peng X, Gleichman AJ, et al. (2010): Cellular and synaptic mechanisms of anti-NMDA receptor encephalitis, J Neurosci. Mikasova L, P. DR, Bouchet D, et al. (2012): Disrupted surface crosstalk between NMDA and Ephrin-B2 receptors in anti-NMDA encephalitis, Brain, Seite 1606-1621) [0149]
Haselmann H, Mannara F, Werner C, et al. (2018): Human autoantibodies against the AMPA receptor subunit GluA2 induce receptor reorganization and memory dysfunction, Neuron. Peng X, Hughes EG, Moscato EH, Parsons TD, Dalmau J, Balice-Gordon RJ (2015): Cellular plasticity induced by anti-alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid (AMPA) receptor encephalitis antibodies, Ann Neurol, Band 77, Seite 381-398 [0149]
Crisp SJ, et al. (2019): Glycine receptor autoantibodies disrupt inhibitory neurotransmission, Brain. Peng X, Hughes EG, Moscato EH, Parsons TD, Dalmau J, Balice-Gordon RJ (2015): Cellular plasticity induced by anti-alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid (AMPA) receptor encephalitis antibodies, Ann Neurol, Band 77, Seite 381-398 [0149]
Dalmau J, Graus F (2018): Antibody-mediated encephalitis, N Engl J Med, Band 378, Seite 840-851 [0150]
Van Samkar A, Poulsen MNF, Bienfait HP, Van Leeuwen RB (2017): Acute cerebellitis in adults: a case report and review of the literature, BMC Res Notes. Emelifeonwu JA, Shetty J, Kaliaperumal C, et al. (2018): Acute Cerebellitis in Children: A Variable Clinical Entity, J Child Neurol, Band 33, Seite 675-684 [0150]
Shimokaze T, Kato M, Yoshimura Y, Takahashi Y, Hayasaka K (2007): A case of acute cerebellitis accompanied by autoibodies against glutamate receptor delta2, Brain Dev, Band 29, Seite 224-226. Kubota M, Takahashi Y (2008): Steroid-responsive chronic cerebellitis with positive glutamate receptor delta 2 antibody, J Child Neurol, Band 23, Seite 228-230 [0150]
Berridge G, Menassa DA, Moloney T, et al. (2018): Glutamate receptor delta2 serum antibodies in pediatric opsoclonus myoclonus ataxia syndrome, Neurolog, Band 91, Seite 714-723. Fukuoka T, Takeda H, Ohe Y, Deguchi I, Takahashi Y, Tanahashi N (2012): Anti-glutamate receptor delta2 antibody-positive migrating focal encephalitis, Clin Neurol Neurosurg [0150]
Joubert B, Kerschen P, Zekeridou A, et al. (2015): Clinical spectrum of encephalitis associated with antibodies against the alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid receptor: Case series and review of the literature, JAMA Neurol, Band 72, Seite 1163-1169 [0151]
Lai M, et al. (2009): AMPA receptor antibodies in limbic encephalitis alter synaptic receptor location, Ann Neurol, Band 65, Ausgabe 4. Dalmau J, et al. (2007): Paraneoplastic anti-N-methyl-D-aspartate receptor encephalitis associated with ovarian teratoma, Ann Neurol. Lancaster E, Lai M, Peng X, et al. (2010): Antibodies to the GABA(B) receptor in limbic encephalitis with seizures: case series and characterisation of the antigen, Lancet Neurol. Petit-Pedrol M, Armangue T, Peng X, et al. (2014): Encephalitis with refractory seizures, status epilepticus, and antibodies to the GABAA receptor: a case series, characterisation of the antigen, and analysis of the effects of antibodies, Lancet Neurol, Band 13, Seite 276-286 [0152]

Claims

Autoantikörper, der spezifisch an eines oder mehrere aus der Gruppe, umfassend Glukl, Gluk2, Gluk3, Gluk4 und Gluk5, vorzugsweise Gluk2, bindet, der vorzugsweise in einer Lösung vorliegt, die einen/eines oder mehrere, mehr bevorzugt alle aus der Gruppe, umfassend einen künstlichen Puffer, ein Konservierungsmittel und ein künstliches Antikoagulans, umfasst.
Diagnostisch verwendbarer Träger mit einer festen Phase mit einem oder mehreren Polypeptid/en, das/die jeweils mindestens ein Antigen aus der Gruppe, umfassend Glukl, Gluk2, Gluk3, Gluk4 und Gluk5, vorzugsweise Gluk2, oder eine Variante davon, umfasst/umfassen, das/die an der festen Phase immobilisiert ist/sind, und a) einer Negativkontrolle und/oder b) mindestens einem zusätzlichen diagnostisch verwendbaren Antigen, wobei das Polypeptid und die Negativkontrolle oder das zusätzliche Antigen räumlich getrennt auf dem Träger vorliegen.
Erster diagnostisch verwendbarer Träger mit einer festen Phase, umfassend ein oder mehrere Polypeptid/e, das/die jeweils mindestens ein Antigen aus der Gruppe, umfassend Glukl, Gluk2, Gluk3, Gluk4 und Gluk5, vorzugsweise Gluk2, oder eine Variante davon, umfasst/umfassen, das/die an der festen Phase immobilisiert ist/sind, und zweiter diagnostisch verwendbarer Träger, der eine feste Phase mit a) einer immobilisierten Negativkontrolle und/oder b) mindestens einem zusätzlichen immobilisierten Polypeptid, das ein Antigen oder eine Variante davon umfasst, umfasst.
Träger gemäß einem der Ansprüche 2 bis 3, wobei das mindestens eine zusätzliche Antigen mindestens ein Antigen, vorzugsweise alle Antigene, aus der Gruppe, umfassend NMDAR, Lgll, AMPA1, AMPA2, CASPR2, GABA B, GABA A, DPPX, IGLON5, Hu, Yo, CV2/CRMP5, Ri, Ma2, Amphiphysin, Recoverin, RGS8, DAGLA, STX1B, AK5, AP3B2, Flotillinl+2, GRM1, GRM2, GRM5, GLURD2, ITPR1, KCNA2, NCDN, Septin 3+5+6+7+11, GLUK2 und Sez6L2, oder eine Variante davon, vorzugsweise aus der Gruppe, umfassend NMDAR, AMPA1, AMPA2, CASPR2, Lgll, IGLON5, DPPX und GABA B, oder eine Variante davon, mehr bevorzugt NMDAR oder eine Variante davon, ist.
Vorrichtung zum Entfernen eines Autoantikörpers, der spezifisch an eines oder mehrere aus der Gruppe, umfassend Glukl, Gluk2, Gluk3, Gluk4 und Gluk5, vorzugsweise Gluk2, bindet, aus Blut, vorzugsweise Serum, eines Patienten, der an einer Autoimmunerkrankung, vorzugsweise einer neurologischen Autoimmunerkrankung, und/oder Krebs leidet, die einen Träger mit einer festen Phase, an der ein Polypeptid, das mindestens ein Antigen aus der Gruppe, umfassend Glukl, Gluk2, Gluk3, Gluk4 und Gluk5, vorzugsweise Gluk2, oder eine Variante davon, umfasst, immobilisiert ist, umfasst.
Zelle, die einen oder mehrere Expressionsvektor/en, umfassend eine Nukleotidsequenz, die ein Polypeptid, das mindestens ein Antigen aus der Gruppe, umfassend Glukl, Gluk2, Gluk3, Gluk4 und Gluk5, vorzugsweise Gluk2, oder eine Variante davon, umfasst, unter der Kontrolle eines Promotors, gegebenenfalls eines starken und/oder induzierbaren Promotors, kodiert, wobei die Zelle auf einem Träger zur mikroskopischen Immunfluoreszenzanalyse vorliegt.
Zelle gemäß Anspruch 6, die eine eukaryotische Zelle, die das Polypeptid überexprimiert, oder eine rekombinante Zelle, die das Polypeptid überexprimiert, ist.
Zelle, die ein Polypeptid, das mindestens ein Antigen aus der Gruppe, umfassend Gluk1, Gluk2, Gluk3, Gluk4 und Gluk5, vorzugsweise Gluk2, oder eine Variante davon, umfasst, überexprimiert, wobei die Zelle in Kombination mit mindestens einer zusätzlichen Zelle vorliegt, die ein anderes Antigen aus der Gruppe, umfassend Hu, Yo, Ri, CV2, PNMA1, PNMA2, DNER/Tr, ARHGAP26, ITPR1, ATP1A3, NBC1, Neurochondrin, CARPVIII, Zic4, SOX1, Ma, MAG, MP0, MBP, GAD65, Amphiphysin, Recoverin, GABA A-Rezeptor, GABA B-Rezeptor, Glycinrezeptor, Gephyrin, IgLON5, DPPX, Aquaporin-4, MOG, NMDAR, AMPA-Rezeptoren, GRM1, GRM5, LGI1, VGCC, mGluR1, CASPR2, ATP1A3 und Flotillin1/2 oder eine Variante davon, umfasst in einem Polypeptid, vorzugsweise NMDAR, umfasst.
Kit, das eine Zelle, die ein Polypeptid, das mindestens ein Antigen aus der Gruppe, umfassend Gluk1, Gluk2, Gluk3, Gluk4 und Gluk5, vorzugsweise Gluk2, oder eine Variante davon, umfasst, überexprimiert, und mindestens eine zusätzliche Zelle, die ein anderes Antigen aus der Gruppe, umfassend Hu, Yo, Ri, CV2, PNMA1, PNMA2, DNER/Tr, ARHGAP26, ITPR1, ATP1A3, NBC1, Neurochondrin, CARPVIII, Zic4, SOX1, Ma, MAG, MP0, MBP, GAD65, Amphiphysin, Recoverin, GABA A-Rezeptor, GABA B-Rezeptor, Glycinrezeptor, Gephyrin, IgLON5, DPPX, Aquaporin-4, MOG, NMDAR, AMPA-Rezeptoren, GRM1, GRM5, LGI1, VGCC, mGluR1, CASPR2, ATP1A3 und Flotillin1/2 oder eine Variante davon, umfasst in einem Polypeptid, vorzugsweise NMDAR, umfasst, umfasst.
Zelle gemäß Anspruch 8 oder Kit gemäß Anspruch 9, wobei die Zelle auf einem Träger zur mikroskopischen Immunfluoreszenzanalyse vorliegt.
Zelle gemäß einem der Ansprüche 6 bis 7 und 10 oder Kit gemäß einem der Ansprüche 9 bis 10, wobei der Träger ein Glas-Objektträger ist, wobei die Zelle vorzugsweise mit einem Einbettungspuffer bedeckt ist.
Zelle gemäß einem der Ansprüche 6 bis 8 und 10 bis 11 oder Kit gemäß einem der Ansprüche 9 bis 11, wobei die Zelle eine fixierte Säugetierzelle ist.
Kit, das den diagnostisch verwendbaren Träger gemäß einem der Ansprüche 2 bis 4 oder die Zelle gemäß einem der Ansprüche 6 bis 8 und 10 bis 12 und ein oder mehrere, vorzugsweise alle Reagenzien aus der Gruppe, umfassend einen sekundären Antikörper, vorzugsweise markiert mit einer nachweisbaren Markierung, eine Waschlösung, eine Positivkontrolle, eine Negativkontrolle, ein Detergens, ein Deckglas, ein Einbettungsmedium und eine physiologische Salzlösung, vorzugsweise PBS, oder Salz, das zu deren Herstellung erforderlich ist, umfasst.
Verwendung von a) dem Träger gemäß einem der Ansprüche 2 bis 4, b) einem oder mehreren Polypeptiden, das/die jeweils mindestens ein Antigen umfasst/umfassen, oder c) mindestens einem Antigen, wobei das mindestens eine Antigen ausgewählt ist aus der Gruppe, umfassend Gluk1, Gluk2, Gluk3, Gluk4 und Gluk5, vorzugsweise Gluk2, oder eine Variante davon, zum Nachweisen eines Autoantikörpers, der spezifisch an das mindestens eine Antigen bindet, in einer Probe, vorzugsweise einer menschlichen Probe.
Verwendung von einem oder mehreren Polypeptid/en, das/die jeweils mindestens ein Antigen aus der Gruppe, umfassend Gluk1, Gluk2, Gluk3, Gluk4 und Gluk5, vorzugsweise Gluk2, oder eine Variante davon, umfasst/umfassen, zum Isolieren eines Antikörpers, der an das mindestens eine Antigen bindet.
Verwendung gemäß Anspruch 15, wobei Isolieren eines Antikörpers die Schritte umfasst a) Immobilisieren eines oder mehrerer Polypeptid/e, das/die jeweils mindestens ein Antigen aus der Gruppe, umfassend Gluk1, Gluk2, Gluk3, Gluk4 und Gluk5, vorzugsweise Gluk2, oder eine Variante davon, umfasst/umfassen, auf einem Träger, b) Inkontaktbringen einer Probe, die Antikörper umfasst, mit dem einen oder den mehreren Polypeptid/en unter Bedingungen, die mit einer Bildung eines Komplexes kompatibel sind, wobei die Antikörper an das eine oder die mehreren Polypeptid/e binden, c) Abtrennen des in Schritt a) gebildeten Komplexes von der Probe und d) Abtrennen der Antikörper von dem einen oder den mehreren Polypeptid/en.
Verwendung von einem oder mehreren Polypeptid/en, das/die jeweils mindestens ein Antigen aus der Gruppe, umfassend Gluk1, Gluk2, Gluk3, Gluk4 und Gluk5, vorzugsweise Gluk2, oder eine Variante davon, umfasst/umfassen, zum Nachweisen des Vorliegens eines Antikörpers, der spezifisch an Glukl, Gluk2, Gluk3, Gluk4 und Gluk5, vorzugsweise Gluk2, bindet, in einer Flüssigkeit, worin ein Arzneimittelkandidat vorliegt und/oder die Flüssigkeit keine Probe von einem zu diagnostizierenden Lebewesen umfasst, umfassend einen Antikörper, der spezifisch an Glukl, Gluk2, Gluk3, Gluk4 und Gluk5, vorzugsweise Gluk2, bindet.
Verwendung gemäß Anspruch 17, wobei Nachweisen des Vorliegens eines Antikörpers die Schritte umfasst a) Immobilisieren eines oder mehrerer Polypeptid/e, das/die jeweils mindestens ein Antigen aus der Gruppe, umfassend Gluk1, Gluk2, Gluk3, Gluk4 und Gluk5, vorzugsweise Gluk2, oder eine Variante davon, umfasst/umfassen, auf einem Träger, b) Inkontaktbringen des Trägers mit der Flüssigkeit, c) Inkontaktbringen des Trägers mit einem Mittel zum Nachweisen eines immobilisierten Antikörpers und d) Nachweisen des Vorliegens des Antikörpers, vorzugsweise in quantitativer Weise.
Verwendung von a) dem Autoantikörper gemäß Anspruch 1, b) einer Kombination von einem oder mehreren Polypeptid/en, das/die jeweils mindestens ein Antigen aus der Gruppe, umfassend Gluk1, Gluk2, Gluk3, Gluk4 und Gluk5, vorzugsweise Gluk2, oder eine Variante davon, umfasst/umfassen, und einem Mittel zum Nachweisen oder Einfangen eines Autoantikörpers oder c) dem Träger gemäß einem der Ansprüche 2 bis 4 zur Diagnose einer Krankheit oder zur Unterstützung bei der Diagnose einer Krankheit, wobei die Krankheit eine Autoimmunerkrankung, vorzugsweise eine neurologische Autoimmunerkrankung, und/oder Krebs ist.
Kit, umfassend ein Polypeptid, das eines oder mehrere aus der Gruppe, umfassend Gluk1, Gluk2, Gluk3, Gluk4 und Gluk5, vorzugsweise Gluk2, oder eine Variante davon, umfasst, und einen diagnostisch verwendbaren Träger, vorzugsweise gemäß einem der Ansprüche 2 bis 4, wobei a) das Polypeptid auf dem diagnostisch verwendbaren Träger immobilisiert ist und das Kit ferner ein Mittel zum Nachweisen eines Autoantikörpers, der spezifisch an eines oder mehrere aus der Gruppe, umfassend Gluk1, Gluk2, Gluk3, Gluk4 und Gluk5, vorzugsweise Gluk2, bindet, vorzugsweise immobilisiert, umfasst, b) das Polypeptid und der Träger zum Immobilisieren des Polypeptids auf der Oberfläche des Trägers, vorzugsweise über ein Affinitätstag und einen Liganden, der an das Affinitätstag bindet, konfiguriert sind und das Kit ferner ein Mittel zum Nachweisen eines immobilisierten Antikörpers, der spezifisch an eines oder mehrere aus der Gruppe, umfassend Gluk1, Gluk2, Gluk3, Gluk4 und Gluk5, vorzugsweise Gluk2, bindet, umfasst, c) der Träger mit einem Mittel zum Einfangen eines Antikörpers immobilisiert ist und das Kit ferner ein Mittel zum Nachweisen eines immobilisierten Antikörpers, der spezifisch an eines oder mehrere aus der Gruppe, umfassend Gluk1, Gluk2, Gluk3, Gluk4 und Gluk5, vorzugsweise Gluk2, bindet, umfasst, wobei das Polypeptid vorzugsweise eine nachweisbare Markierung umfasst, oder d) der Träger und ein Mittel zum Einfangen eines Antikörpers zum Immobilisieren des Mittels zum Einfangen eines Antikörpers auf der Oberfläche des Trägers, vorzugsweise über ein Affinitätstag und einen Liganden, der an das Affinitätstag bindet, konfiguriert sind und das Kit ferner ein Mittel zum Nachweisen eines immobilisierten Antikörpers, der spezifisch an eines oder mehrere aus der Gruppe, umfassend Gluk1, Gluk2, Gluk3, Gluk4 und Gluk5, vorzugsweise Gluk2, bindet, umfasst, wobei das Polypeptid vorzugsweise eine nachweisbare Markierung umfasst, und vorzugsweise einen/eine/eines oder mehrere, mehr bevorzugt alle aus der Gruppe, umfassend einen rekombinanten Antikörper, der an eines oder mehrere aus der Gruppe, umfassend Gluk1, Gluk2, Gluk3, Gluk4 und Gluk5, vorzugsweise Gluk2, oder eine Variante davon, bindet, einen isolierten Autoantikörper, der an eines oder mehrere aus der Gruppe, umfassend Gluk1, Gluk2, Gluk3, Gluk4 und Gluk5, vorzugsweise Gluk2, bindet, eine chemische Lösung, die mit einer nachweisbaren Markierung reaktiv ist, eine Positivkontrolle, eine Negativkontrolle, ein wasserdichtes Gefäß zum Inkubieren einer Probe mit einem Träger oder Reagenz, einen Waschpuffer und einen Kalibrator, vorzugsweise einen Satz von Kalibratoren.
Verwendung von a) einem Polypeptid, das eines oder mehrere aus der Gruppe, umfassend Gluk1, Gluk2, Gluk3, Gluk4 und Gluk5, vorzugsweise Gluk2, oder eine Variante davon, umfasst, b) einem Autoantikörper, der spezifisch an eines oder mehrere aus der Gruppe, umfassend Gluk1, Gluk2, Gluk3, Gluk4 und Gluk5, vorzugsweise Gluk2, bindet, c) einem rekombinanten Antikörper, der spezifisch an eines oder mehrere aus der Gruppe, umfassend Gluk1, Gluk2, Gluk3, Gluk4 und Gluk5, vorzugsweise Gluk2, bindet, d) dem Träger gemäß einem der Ansprüche 2 bis 4 oder e) der Zelle gemäß einem der Ansprüche 6 bis 8 und 10 bis 12 zur Herstellung eines Kits, vorzugsweise des Kits gemäß einem der Ansprüche 9 bis 13 und 20, oder einer medizinischen Vorrichtung, vorzugsweise diagnostischen Vorrichtung, mehr bevorzugt der Vorrichtung gemäß Anspruch 5, zur Diagnose einer Krankheit oder zur Unterstützung bei der Diagnose einer Krankheit, wobei die Krankheit vorzugsweise eine Autoimmunerkrankung, mehr bevorzugt eine neurologische Autoimmunerkrankung, und/oder Krebs ist.
Verwendung eines Autoantikörpers, der spezifisch an eines oder mehrere aus der Gruppe, umfassend Gluk1, Gluk2, Gluk3, Gluk4 und Gluk5, vorzugsweise Gluk2, bindet, oder eines rekombinanten Antikörpers, der spezifisch an eines oder mehrere aus der Gruppe, umfassend Gluk1, Gluk2, Gluk3, Gluk4 und Gluk5, vorzugsweise Gluk2, bindet, der vorzugsweise von sekundären Antikörpern gegen menschliche IgG-Klasse-lmmunglobuline erkannt wird, als eine Positivkontrolle für den Nachweis eines Antikörpers, der spezifisch an eines oder mehrere aus der Gruppe, umfassend Gluk1, Gluk2, Gluk3, Gluk4 und Gluk5, vorzugsweise Gluk2, bindet, in einer Probe.
Verwendung einer Vorrichtung zum Entfernen eines Autoantikörpers, der spezifisch an eines oder mehrere aus der Gruppe, umfassend Gluk1, Gluk2, Gluk3, Gluk4 und Gluk5, vorzugsweise Gluk2, bindet, aus Blut, vorzugsweise Serum, eines Patienten.
Verwendung gemäß Anspruch 23, wobei die Vorrichtung einen Träger mit einer festen Phase umfasst, an der ein oder mehrere Polypeptid/e, das/die jeweils mindestens ein Antigen aus der Gruppe, umfassend Gluk1, Gluk2, Gluk3, Gluk4 und Gluk5, vorzugsweise Gluk2, oder eine Variante davon, umfasst/umfassen, immobilisiert ist/sind.
Verwendung von einem oder mehreren Polypeptid/en, das/die jeweils mindestens ein Antigen aus der Gruppe, umfassend Gluk1, Gluk2, Gluk3, Gluk4 und Gluk5, vorzugsweise Gluk2, umfasst/umfassen, zum Entfernen eines Autoantikörpers, der spezifisch an das mindestens eine Antigen bindet, aus Blut, vorzugsweise Serum, eines Patienten.
Träger gemäß einem der Ansprüche 2 bis 4, Zelle gemäß einem der Ansprüche 6 bis 8 und 10 bis 12, Verwendung gemäß einem der Ansprüche 14 bis 19, 21 und 24 bis 25, Kit gemäß einem der Ansprüche 9 bis 13 oder Vorrichtung gemäß Anspruch 5, wobei das mindestens eine Antigen ein oder mehrere Antigen/e, ausgewählt aus der Gruppe, umfassend Gluk1, Gluk2, Gluk3, Gluk4 und Gluk5, vorzugsweise Gluk2, oder eine Variante davon, ist.
Träger gemäß einem der Ansprüche 2 bis 4 und 26, Zelle gemäß einem der Ansprüche 6 bis 8 und 10 bis 12 und 26, Verwendung gemäß einem der Ansprüche 14 bis 19 und 21 bis 26, Kit gemäß einem der Ansprüche 9 bis 13, 20 und 26 oder Vorrichtung gemäß Anspruch 5 oder 26, wobei das Polypeptid ein rekombinantes, isoliertes und/oder aufgereinigtes Polypeptid ist.
Autoantikörper gemäß Anspruch 1, Verwendung gemäß einem der Ansprüche 14 bis 19 und 21 bis 27, Kit gemäß einem der Ansprüche 13, 20 und 26 bis 27 oder Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 5 und 26 bis 27, wobei der Antikörper oder Autoantikörper ein Säugetier-, vorzugsweise menschlicher, Autoantikörper ist oder die Probe eine Säugetier-, vorzugsweise menschliche, Probe, die einen repräsentativen Satz von Antikörpern umfasst, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe, umfassend Vollblut, Plasma, Serum, zerebrospinale Flüssigkeit und Speichel, ist.
Autoantikörper gemäß Anspruch 1 oder 28, Verwendung gemäß einem der Ansprüche 14 bis 19 und 21 bis 28, Kit gemäß einem der Ansprüche 13, 20 und 26 bis 28 oder Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 5 und 26 bis 28, wobei der Antikörper, Autoantikörper oder Komplex unter Verwendung eines Nachweisverfahrens, das ausgewählt ist aus der Gruppe, umfassend Immundiffusion, Elektrophorese, Lichtstreuungsimmunassays, Agglutination, markierte Immunassays, wie denen aus der Gruppe, umfassend radioaktiv markierten Immunassay, Enzymimmunassays, mehr bevorzugt ELISA, Chemilumineszenzimmunassays, vorzugsweise Elektrochemilumineszenzimmunassay, und Immunfluoreszenz, vorzugsweise indirekte Immunfluoreszenz, nachgewiesen wird.
Träger gemäß einem der Ansprüche 2 bis 4 und 26 bis 27, Verwendung gemäß einem der Ansprüche 14, 16, 18 bis 19, 21, 24 und 26 bis 29, Kit gemäß einem der Ansprüche 10 bis 13, 20 und 26 bis 29, Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 5 und 26 bis 29 oder Zelle gemäß einem der Ansprüche 6 bis 7, 10 bis 12 und 26 bis 29, wobei der Träger ausgewählt ist aus der Gruppe, umfassend einen Glas-Objektträger, vorzugsweise zur Mikroskopie, einen Biochip, eine Mikrotiterplatte, eine Lateral-Flow-Vorrichtung, einen Teststreifen, eine Membran, vorzugsweise einen Line-Blot, eine Chromatographiesäule und ein Bead, vorzugsweise ein magnetisches oder fluoreszierendes Bead.
Träger gemäß einem der Ansprüche 2 bis 4, 26 bis 27 und 30, Verwendung gemäß einem der Ansprüche 14, 16, 18 bis 19, 21, 24 und 26 bis 30, Kit gemäß einem der Ansprüche 10 bis 13, 20 und 26 bis 30, Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 5 und 26 bis 30 oder Zelle gemäß einem der Ansprüche 6 bis 7, 10 bis 12 und 26 bis 30, wobei der Träger ein Teststreifen, vorzugsweise ein Blot, mehr bevorzugt ein Line-Blot, ist.
Träger, Verwendung, Kit, Vorrichtung oder Zelle gemäß einem der Ansprüche 30 bis 31, wobei eines oder mehrere aus der Gruppe, umfassend Gluk1, Gluk2, Gluk3, Gluk4 und Gluk5, vorzugsweise Gluk2, oder eine Variante davon, in der Form einer Bande oder eines Punktes auf dem Teststreifen immobilisiert ist/sind.
Träger, Verwendung, Kit, Vorrichtung oder Zelle gemäß einem der Ansprüche 30 bis 32, wobei ein oder mehrere zusätzliche/s Antigen/e, vorzugsweise aus der Gruppe, umfassend NMDAR, Lgl1, AMPA1, AMPA2, CASPR2, GABA B, GABA A, DPPX, IGLON5, Hu, Yo, CV2/CRMP5, Ri, Ma1, Ma2, Amphiphysin, Recoverin, RGS8, DAGLA, STX1B, AK5, AP3B2, Flotillin1+2, GRM1, GRM2, GRM5, GLURD2, ITPR1, KCNA2, NCDN, SOX1, TR(DNER), Zic4, Septin 3+5+6+7+11 und Sez6L2, mehr bevorzugt NMDAR, oder eine Variante davon, auf dem Teststreifen immobilisiert ist/sind.
Träger gemäß einem der Ansprüche 2 bis 4, 26 bis 27 und 30 bis 33, Verwendung gemäß einem der Ansprüche 14, 16, 18 bis 19, 21, 24 und 26 bis 33, Kit gemäß einem der Ansprüche 10 bis 13, 20 und 26 bis 33, Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 5 und 26 bis 33, Zelle gemäß einem der Ansprüche 6 bis 7, 10 bis 12 und 26 bis 33, wobei der Träger zur Analyse unter Verwendung eines Immunfluoreszenzmikroskops konfiguriert ist.
Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 5 und 26 bis 34 oder Verwendung gemäß einem der Ansprüche 19, 21 und 26 bis 34, wobei der Krebs ausgewählt ist aus der Gruppe, umfassend Leukämie, Graft-versus-Host-Krankheit und Non-Hodgkin-Lymphom.
Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 5 und 26 bis 35 oder Verwendung gemäß einem der Ansprüche 19, 21 und 26 bis 35, wobei die Autoimmunerkrankung, vorzugsweise die neurologische Autoimmunerkrankung, ausgewählt ist aus der Gruppe, umfassend PNS, zerebelläre Ataxie, Gangataxie, Polyneuropathie, Enzephalitis, vorzugsweise limbische Enzephalitis, Epilepsie, Demenz, zerebelläres Syndrom und hypersensitive Enzephalopathie.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 19, 21 und 26 bis 36, wobei die Diagnose oder Unterstützung bei der Diagnose einer Krankheit Unterscheiden zwischen einer durch eine Infektion verursachten Enzephalitis und einer Autoimmunerkrankung, vorzugsweise Autoimmunenzephalitis, umfasst.
Autoantikörper gemäß einem der Ansprüche 1 und 28 bis 29, Träger gemäß einem der Ansprüche 2 bis 4, 26 bis 27 und 30 bis 34, Verwendung gemäß einem der Ansprüche 14 bis 19, 21 bis 37, Kit gemäß einem der Ansprüche 9 bis 13, 20 und 26 bis 34, Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 5 und 26 bis 36 oder Zelle gemäß einem der Ansprüche 6 bis 8, 10 bis 12, 26 bis 27 und 30 bis 34, wobei der Nachweis eines Antikörpers, der spezifisch an eines oder mehrere aus der Gruppe, umfassend Gluk1, Gluk2, Gluk3, Gluk4 und Gluk5, vorzugsweise Gluk2, bindet, zum Unterscheiden zwischen einer durch eine Infektion verursachten Enzephalitis und einer Autoimmunerkrankung, vorzugsweise Autoimmunenzephalitis, verwendet wird.
Träger gemäß einem der Ansprüche 2 bis 4, 26 bis 27, 30 bis 34 und 38, Verwendung gemäß einem der Ansprüche 14 bis 19, 21, 24 und 26 bis 38, Kit gemäß einem der Ansprüche 9 bis 13, 20, 26 bis 34 und 38, Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 5, 26 bis 36 und 38 oder Zelle gemäß einem der Ansprüche 6 bis 8, 10 bis 12, 26 bis 27, 30 bis 34 und 38, wobei die Variante mindestens 80 % Sequenzidentität mit einer Aminosäuresequenz aufweist, die ausgewählt ist aus der Gruppe, umfassend SEQ ID NOs 1-5.
Träger gemäß einem der Ansprüche 2 bis 4, 26 bis 27, 30 bis 34 und 38 bis 39, Verwendung gemäß einem der Ansprüche 14 bis 19, 21, 24 und 26 bis 39, Kit gemäß einem der Ansprüche 9 bis 13, 20, 26 bis 34 und 38 bis 39, Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 5, 26 bis 36 und 38 bis 39 oder Zelle gemäß einem der Ansprüche 6 bis 8, 10 bis 12, 26 bis 27, 30 bis 34 und 38 bis 39, wobei die Variante die Fähigkeit aufweist, spezifisch an einen Autoantikörper, der spezifisch an eines oder mehrere aus der Gruppe, umfassend Gluk1, Gluk2, Gluk3, Gluk4 und Gluk5, vorzugsweise Gluk2, bindet, zu binden.