DE202020000743U1

DE202020000743U1 - Träger und Kit zur Diagnose einer neurologischen Autoimmunkrankheit

Info

Publication number: DE202020000743U1
Application number: DE202020000743.9U
Authority: DE
Original assignee: Euroimmun Medizinische Labordiagnostika AG
Current assignee: Euroimmun Medizinische Labordiagnostika AG
Priority date: 2020-02-24
Filing date: 2020-02-24
Publication date: 2020-03-17
Anticipated expiration: 2030-02-25

Abstract

Diagnostisch nützlicher Träger umfassend eine Zelle, die AP3B2 oder eine Variante davon überexprimiert, oder aufgereinigtes AP3B2 oder eine Variante davon, wobei die Variante spezifisch an einen Autoantikörper gegen AP3B2 spezifisch binden kann.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft einen diagnostisch nützlichen Träger umfassend eine Zelle, die AP3B2 oder eine Variante davon überexprimiert, oder aufgereinigtes AP3B2 oder eine Variante davon, wobei die Variante spezifisch an einen Autoantikörper gegen AP3B2 binden kann, ein Kit umfassend den Träger und wenigstens ein Reagenz, bevorzugt alle Reagenzien aus der Gruppe umfassend einen sekundären Antikörper mit Markierung, bevorzugt Fluoreszenzmarkierung, eine Waschlösung und einen Antikörper gegen AP3B2 sowie eine Verbindung eines Antikörpers gegen AP3B2 oder des Trägers oder Kits zur Diagnose einer Autoimmunkrankheit.
Die Entwicklung diagnostischer Systeme für neurologische Krankheiten ist eine kontinuierliche Herausforderung in den biomedizinischen Wissenschaften, nicht zuletzt deshalb, weil viele Symptome der neurologischen Krankheiten verschiedene Ursachen haben können, z. B. genetisch vererbte Krankheiten, Drogenmissbrauch, Fehlernährung, Infektion, Verletzung, psychischer Stress, Immundefizite und Krebs.
Weil eine neurologische Krankheit selten mit einem charakteristischen Muster klinischer Symptome assoziiert ist, ist es häufig schwierig, eine zuverlässige Diagnose lediglich aufgrund der Beobachtung und Untersuchung der Patienten und ihrer medizinischen Historie zu erstellen.
Die Wichtigkeit einer frühen Diagnose kann nicht überbetont werden. Viele neurologische Krankheiten, insbesondere Alzheimer und Parkinson wie auch Multiple Sklerose, können nicht geheilt werden, aber es sind Medikamente verfügbar, die verwendet werden können, um ihr Fortschreiten zu verlangsamen. Zudem sind verschiedene seltene Arten von Krebs mit neurologischen Symptomen assoziiert. Je früher die Diagnose zur Verfügung steht, desto besser sind die Chancen, das Spektrum verfügbarer Therapien zum größtmöglichen Nutzen des Patienten einzusetzen.
Dies gilt besonders im Fall neurologischer Krankheiten, die mit Autoantikörpern assoziiert sind. In einigen Fällen ist die Verbindung zwischen einem spezifischen Nachweis bei einem Autoantikörper und einer Krankheit ausreichend gesichert, um eine sofortige Diagnose zu gestatten.
Doch selbst wenn das nicht der Fall ist, kann der Nachweis von Autoantikörpern den behandelnden Arzt auf therapeutische Mittel aufmerksam machen, die verwendet werden können, um die Krankheit des Patienten zu lindern. Es gibt eine Vielzahl von breit eingesetzten Immunsuppressiva, die unabhängig von der Natur des Targets des Autoantikörpers verwendet werden können. In vielen Fällen können Patienten ein normales Leben führen, wenn eine neurologische Autoimmunkrankheit früh diagnostiziert und behandelt wird.
Diagnostische Assays basierend auf dem Nachweis von Autoantikörpern können auch dazu beitragen, die Diagnose anderer Krankheiten zu untermauern. Sind spezifische Autoantikörper in einer Blutprobe nicht nachweisbar, so kann der behandelnde Arzt eine Reihe von Krankheiten ausschließen und das Spektrum möglicher Ursachen einengen.
Beispiele für neurologische Krankheiten, die mit Autoantikörpern assoziiert sind, umfassen Neuromyelitis optica, eine Krankheit, die mit dem Verlust der visuellen Wahrnehmung und Rückenmarksfunktion gekennzeichnet ist, sowie Anti-NMDA-Rezeptor-Enzephalitis, die mit Hypoventilation, Ataxie, Hemiparese oder Bewusstseinsverlust assoziiert ist. Viele dieser Krankheiten können mittlerweile diagnostiziert und effizient behandelt werden, weil Tests zum Nachweis von Autoantikörpern zur Verfügung stehen.
Ein weiteres Beispiel ist Neuropathie, eine neurologische Krankheit mit Symptomen, die Koordinationsmangel, Muskelschwäche und Lähmungen umfassen können. Die Neuropathie kann eine Autoimmunkrankheit sein, sie kann aber auch andere Ursachen haben, beispielsweise Diabetes, Infektionen, Nierenkrankheit, Leberkrankheit und Schilddrüsenunterfunktion.
Darnell et al. (1991) offenbaren das Antiserum eines Patienten mit cerebellärer Degeneration, das gegen ein unbekanntes Autoantigen bindet. (Darnell, R. B., Furneaux, H. M., Posner, J. B. (1991), Antiserum from a Patient with Cerebellar Degeneration Identifies a Novel Protein in Purkinje Cells, Cortical Neurons, and Neuroectodermal Tumors, The Journal of Neuroscience, 1991 May; 11(3): 1224-1230).
Newman et al. (1995) offenbaren, dass das Autoantigen gegen das Antiserum, das Darnell et al. verwendeten, β-NAP ist (Newman, L. S., McKeever, M. O , Okano H. J., Darnell, R. B. (1995), β-NAP, a Cerebellar Degeneration Antigen, Is a Neuron-Specific Vesicle Coat Protein. Cell, Vol. 82, September 1995: 773-783).
Vor diesem Hintergrund besteht Bedarf an der Entwicklung von Tests zur Diagnostizierung und zur Differentialdiagnose neurologischer Krankheiten, die mit Autoantikörpern zusammenhängen, und ihre Abgrenzung von anderen Krankheiten. Weiterhin besteht Bedarf an Reagenzien, um eine durch Autoimmunität bedingte Neuropathie von anderen Neuropathien unterscheiden zu können.
Daher liegt der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, neue Reagenzien, Vorrichtungen und Verwendungen bereitzustellen, die für diese Zwecke verwendet werden können.
Die der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende Aufgabe wird durch den Gegenstand der unabhängigen und abhängigen Ansprüche gelöst.
In einem ersten Aspekt wird die Aufgabe gelöst durch einen diagnostisch nützlichen Träger umfassend eine Zelle, die AP3B2 oder eine Variante davon überexprimiert, oder aufgereinigtes AP3B2 oder eine Variante davon, wobei die Variante spezifisch an einen Autoantikörper gegen AP3B2 binden kann.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der Träger aufgereinigtes AP3B2 oder eine Variante davon, das rekombinant hergestellt wurde.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der Träger einer Zelle, die AP3B2 oder eine Variante davon überexprimiert, wobei es sich um eine eukaryontische Zelle handelt, bevorzugt HEK293.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Träger aus der Gruppe ausgewählt, die eine Mikrotiterplatte für ELISA, einen Bead, einen Blot; bevorzugt Western Blot, Lineblot oder Dot Blot; einen Immunfluoreszenztestträger mit fixierten Zellen, bevorzugt für eine mikroskopische Analyse, eine Lateral Flow-Vorrichtung, ein zellulosebasiertes Polymer, einen Biochip, einen Mikroarray, und ein Chromatographiesäulenmaterial umfasst und besonders bevorzugt ein Immunfluoreszenztestträger mit fixierten Zellen. In einer bevorzugten Ausführungsform liegt AP3B2 oder eine Variante davon im Komplex mit einem Autoantikörper gegen AP3B2 vor.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der Komplex zusätzlich ein Mittel zum Nachweisen eines Autoantikörpers, bevorzugt einen sekundären Antikörper, noch bevorzugter mit Fluoreszenzmarkierung.
In einem zweiten Aspekt wird die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe gelöst durch ein Kit umfassend den erfindungsgemäßen Träger und wenigstens ein Reagenz, bevorzugt alle Reagenzien aus der Gruppe umfassend einen sekundären Antikörper mit Markierung, bevorzugt Fluoreszenzmarkierung, eine Waschlösung und einen Antikörper gegen AP3B2.
In einer bevorzugten Ausführungsform liegt das AP3B2 auf dem Träger oder die Variante davon in Komplex mit einem Autoantikörper vor, erhältlich aus einem Verfahren umfassend die Schritte:

a) Kontaktieren des Trägers mit einer flüssigen Probe unter Bedingungen, die die Bildung eines Komplexes zwischen AP3B2 und einem Autoantikörper gegen AP3B2 zulässt,
b) Trennen von Träger und Probe,
c) Waschen des Trägers,
d) Kontaktieren des Trägers mit einem Mittel zum Nachweisen eines Autoantikörpers aus der Probe, bevorzugt einem sekundären Antikörper, noch bevorzugter mit Fluoreszenzmarkierung,
e) Waschen des Trägers.

In einem dritten Aspekt wird die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe gelöst durch die Verwendung eines Autoantikörpers gegen AP3B2 oder des erfindungsgemäßen Trägers oder Kits oder von AP3B2 oder einer Variante davon, die spezifisch einen Autoantikörper gegen AP3B2 binden kann, zur Diagnose einer Autoimmunkrankheit, bevorzugt einer neurologischen Autoimmunkrankheit.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Autoimmunkrankheit aus der Gruppe ausgewählt, die Neuropathie und Ataxie umfasst und ist bevorzugt Neuropathie.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Differenzierung gegenüber Creutzfeldt-Jakob-Krankheit, Systemischem Lupus Erythematodes, Multipler Sklerose und Amyotropher Lateralsklerose ermöglicht.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Autoantikörper gegen AP3B2 mittels Immunfluoreszenz detektiert.
Die vorliegende Erfindung basiert auf der überraschenden Erkenntnis der Erfinder, dass das Nachweisen von Autoantikörpern einen Beitrag zur Diagnose der erfindungsgemäß diagnostizierbaren Krankheiten leisten kann, wenn festgestellt wird, ob ein Autoantikörper gegen AP3B2 vorhanden ist. Insbesondere ist der Autoantikörper spezifisch mit den diagnostizierbaren Krankheiten assoziiert, insbesondere Ataxie und Neuropathie, besonders Neuropathie, und tritt weder im Serum von Gesunden noch im Serum von Kranken mit ähnlichen Symptomen auf.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Test unter Verwendung eines diagnostisch nützlichen Trägers mit einer Festphase durchgeführt, an dem ein Mittel zum spezifischen Einfangen eines Autoantikörpers gegen AP3B2 immobilisiert ist. Bei dem Mittel handelt es sich bevorzugt um AP3B2 oder eine Variante davon, wobei die Variante spezifisch an einen Autoantikörper gegen AP3B2 binden kann.
Ein erfindungsgemäß benutzter oder in einem Kit enthaltener sekundärer Antikörper bindet bevorzugt an Antikörper der Klasse IgG.
In einer bevorzugten Ausführungsform bezeichnet der Begriff „immobilisiert“, wie hierin verwendet, dass das Mittel zum Nachweisen, ob ein Autoantikörper vorhanden oder nicht vorhanden ist, an die Festphase des Trägers gebunden ist, bevorzugt über eine kovalente Bindung, elektrostatische Interaktion, oder über hydrophobe Interaktion, wobei das Mittel gegenüber der Umgebung derart exponiert bleibt, dass es für Autoantikörper in einer flüssigen Probe zugänglich ist. Verschiedene geeignete Träger, z. B. Papier, Polystyrol, Metall, Silikon oder Glasoberflächen, mikrofluidische Kanäle, Membranen, Beads wie magnetische Beads, Chromatographie-Säulenmedien, Biochips, Polyacrylamid Gele und dergleichen sind in der Literatur beschrieben, z. B. in Kim, D., and Herr, A. E. (2013), Protein immobilization techniques for microfluidic assays, Biomicrofluidics 7(4), 041501. Auf diese Weise kann das immobilisierte Mittel zusammen mit dem unlöslichen Träger von einer wässrigen Lösung auf einfache Weise getrennt werden, z. B. durch Filtrierung, Zentrifugieren oder Dekantieren. Ein immobilisiertes Mittel kann reversibel oder irreversibel immobilisiert sein. Z. B. ist die Immobilisierung reversibel, wenn das Mittel mit dem Träger über eine ionische Interaktion interagiert, die durch Hinzufügen einer hohen Konzentration eines Salzes maskiert werden kann, oder wenn das Mittel über eine spaltbare kovalente Bindung wie eine Disulfidbrücke gebunden ist, die durch Hinzufügen von Thiol enthaltenen Reagenzien gespalten werden kann. Im Gegensatz dazu ist die Immobilisierung irreversibel, wenn das Mittel an dem Träger über eine kovalente Bindung befestigt ist, die nicht in wässriger Lösung gespalten werden kann, z. B. eine Bindung, die durch Reaktion einer Epoxidgruppe und einer Aminogruppe gebildet wird, wie sie häufig verwendet wird, um Lysinseitenketten an Affinitätssäulen zu binden. Das Mittel, bevorzugt ein Polypeptid, kann indirekt immobilisiert werden, z. B. durch Immobilisieren eines Antikörpers oder einer anderen Einheit mit Affinität an das Mittel, gefolgt von der Bildung eines Komplexes mit der Wirkung, dass der Mittel-Antikörper-Komplex immobilisiert ist. Es kann auch direkt immobilisiert sein, d.h. zur Beschichtung des Trägers in direktem Kontakt. Verschiedene Möglichkeiten zum Immobilisieren sind in der Literatur beschrieben, z. B. in Kim, D., and Herr, A. E. (2013), Protein immobilization techniques for microfluidic assays, Biomicrofluidics 7(4), 041501.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der diagnostisch nützliche Träger gemäß der vorliegenden Erfindung für die mikroskopische Immunfluoreszenz-Analyse geeignet. Ein solcher Träger kann ein Objektträger oder ein Glasträger sein. Die Zelle auf dem Träger kann mit einem Glycerin haltigen Abdeckpuffer bedeckt sein und ein Abdeckglas kann sich darauf befinden. Geeignete Objektträger mit Abdeckgläsern sind im Handel von EUROIMMUN Medizinische Labordiagnostika AG erhältlich. Jedoch kann jeder Träger verwendet werden, der mit der mikroskopischen Analyse von Fluoreszenzmustern kompatibel ist. Der Träger kann eine Negativkontrolle enthalten wie eine zum Schein transfizierte Zelle enthalten, die mit dem gleichen Vektor transfiziert wurde wie die Zelle, die AP3B2 exprimiert, aber ohne die Nukleinsäure, die für AP3B2 codiert. Der Träger ist für die Analyse unter Verwendung eines Immunfluoreszenzmikroskops konfiguriert.
Der Träger kann weitere Zellen mit neurologischen Autoantigenen oder Varianten davon umfassen, bevorzugt aus der Gruppe ausgewählt umfassend Hu, Yo, Ri, CV2, PNMA1, PNMA2, DNER/Tr, ARHGAP26, ITPR1, ATP1A3, NBC1, Neurochrondrin, CARPVIII, Zic4, Sox1, Ma, MAG, MP0, MBP, GAD65, Amphiphysin, Recoverin, GABA A receptor ( EP13189172.3 ), GABA B receptor ( EP2483417 ), Glycin-Receptor, Gephyrin, IgLON5 ( US2016/0349275 ), DPPX ( US2015/0247847 ), Aquaporin-4, MOG, NMDA-Rezeptor, AMPA -Rezeptoren, GRM1, GRM5, LGI1, VGCC und mGluR1 and CASPR2. Die Marker Neurochrondrin ( EP15001186 ), ITPR1 ( EP14003703.7 ), NBC1 ( EP14003958.7 ), ATP1A3 ( EP14171561.5 ), Flotillin1/2 ( EP3101424 ), NSF, STX1B und VAMP2 ( EP17001205.8 ) und RGS8 ( EP17000666.2 ) sind im Stand der Technik beschrieben.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine fixierte eukaryontische, bevorzugt Säugetier-, am bevorzugtesten immortalisierte menschliche Zelle verwendet. In einer bevorzugten Ausführungsform bedeutet der Begriff „fixierte“ Zelle, wie hierin verwendet, dass die Zelle mit einer reaktiven chemischen Verbindung derart behandelt wurde, dass die Zelle nicht länger stoffwechselaktiv ist, aber ihre Epitope zur Immunfärbung mit Antikörpern präsentiert, z. B. mittels Fluoreszenz. Bevorzugter ist die reaktive chemische Verbindung ausgewählt aus der Gruppe umfassend Aceton, Formalin, Methanol und Ethanol und Mischungen davon, bevorzugt alle dieser Verbindungen. Der Fachmann auf dem Gebiet ist mit Protokollen vertraut, die verwendet werden können, um fixierte Zellen zuzubereiten. Im Wesentlichen wird die Zelle, die mit einem festen Träger verbunden ist, mit Waschpuffer gewaschen, gefolgt vom Kontaktieren mit der reaktiven Verbindung, z. B. durch Eintauchen. Formalin oder reines Aceton oder wässrige Verdünnung der reaktiven chemischen Verbindungen können verwendet werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform bedeutet der Begriff „überexprimieren“ wie hierin verwendet, dass die Zelle mit einer Nukleinsäure, bevorzugt mit einem Vektor, transient oder stabil transfiziert wurde, stabil insbesondere in dem Sinne, dass die Nukleinsäure ins Genom der Zelle eingebaut wurde, wobei der Vektor eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die für das Polypeptid kodiert, das AP3B2 oder eine Variante davon enthält, unter der Kontrolle eines Promotors, bevorzugterweise eines starken Promotors. Im Ergebnis exprimiert die transfizierte Zelle mehr Polypeptid, das vom Autoantikörper erkannt wird, als eine nicht transfizierte Zelle der gleichen Art von Zelle, bevorzugt wenigstens 10, 20, 30, 50, 100, 200 oder 500% mehr Polypeptid wird beurteilt gemäß quantitativen Western Blot. Bevorzugterweise exprimiert die nicht transfizierte Zelle keine nachweisbaren Mengen des Polypeptides. Der Promotor kann ein induzierbarer Promotor sein, der die induzierbaren Expressionen durch Zugabe eines Induktors gestattet. Der Fachmann ist mit Protokollen und Vektoren zum transienten Überexprimieren eines Polypeptides in einer eukaryontischen Zelle vertraut, z. B. mit dem pTriEx-System von Novagen und mit Protokollen und Vektoren für das stabile Transfizieren einer eukaryontischen Zelle, z. B. dem PC DNA 4/TO-Vektorsystem von Invitrogen.
Bei AP3B2 handelt es sich bevorzugt um SEQ ID NO1, die Q13367 in der Datenbank Uni ProtKB entspricht. In Newman et al. (1995) ist ein N-terminales Fragment beschrieben, gegen das der Autoantikörper bindet.
Die erfindungsgemäß zu diagnostizierende Krankheit kann eine neurologische Krankheit oder eine Autoimmunkrankheit, bevorzugt eine neurologische Autoimmunkrankheit sein, bevorzugter des zentralen Nervensystems. Genauer kann es sich am bevorzugtesten um eine Krankheit aus der Gruppe umfassend Neuropathie und Ataxie, bevorzugt Neuropathie handeln. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei Neuropathie um eine sensorische Neuropathie oder eine Myeloneuropathie. Erfindungsgemäß ist eine Differenzierung zu anderen Neuropathien möglich, insbesondere metabolischen oder ernährungsbedingten Neuropathien, durch Infektion bedingten Neuropathien, durch Gefäßkrankheiten bedingte Neuropathien, durch Drogen bedingte Neuropathien und vererbbare Neuropathien. Die Symptome und das Verständnis der verschiedenen Neuropathien entspricht dem Verständnis des Fachmanns zum frühsten Prioritäts- bzw. Anmeldetag dieser Anmeldung und kann Lehrbüchern entnommen werden, bevorzugt Simon/Greenberg/Aminoff, Clinical Neurology, siebte Ausgabe, 2009 (Lange Verlag).
Der Nachweis des Autoantikörpers kann qualitativ oder quantitativ sein. In einer bevorzugten Ausführungsform wird unter dem Begriff „qualitativ“ verstanden, dass lediglich nachgewiesen wird, ob der Autoantikörper anwesend ist oder nicht, nicht jedoch, in welcher Konzentration. Insbesondere wird nicht festgestellt, ob die Konzentration des Autoantikörpers einen gewissen Wert überschreitet, der weitere Information zur vorliegenden Erkrankung erbringt, beispielsweise zur Schwere der Krankheit, zur Entwicklung, zum Therapieerfolg oder zu bestimmten Symptomen. In einer bevorzugten Ausführungsform wird unter dem Begriff „quantitativ“ verstanden, dass eine Aussage hinausgehend über diejenige getroffen wird, dass der Autoantikörper nachgewiesen werden kann. Insbesondere kann ein absoluter oder relativer Wert bestimmt werden oder wenigstens eine Zuordnung zu einem von mehreren definierten Konzentrationsbereichen.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform bedeutet der Begriff „spezifisch binden“, wie hierin verwendet, bei einem Antikörper, dass er gegen das entsprechende Antigen in einer Bindungsreaktion bindet, die durch eine Dissoziationskonstante gekennzeichnet ist, die 1 × 10^-5 M, bevorzugter 1 × 10^-7 M, bevorzugter 1 × 10^-8 M, bevorzugter 1 × 10^-9 M, bevorzugter 1 × 10^-10 M, bevorzugter 1 × 10^-11 M, bevorzugter 1 × 10^-12 M beträgt oder eine stärkere Bindungsreaktion. Bevorzugt wird die Dissoziationskonstante dabei durch Surface Plasmon Resonanz unter Verwendung eines Biacore-Gerätes bei 25 °C und in PBS-Puffer bei pH 7 gemessen und unter Verwendung der vom Hersteller angebotenen Software berechnet.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird unter dem Begriff „Diagnose“, wie hierin verwendet, eine Vorgehensweise verstanden, bei der Information gewonnen wird, die die Einschätzung unterstützt oder überhaupt erst gestattet, ob ein Subjekt unter einer Krankheit leidet oder mit höherer Wahrscheinlichkeit als eine durchschnittliche Person unter einer Krankheit leidet oder in der Vergangenheit litt oder in der Zukunft leiden wird, ebenso, ob eine Krankheit fortschreitet oder wie sie sich in der Zukunft entwickeln wird oder um einzuschätzen, ob eine bestimmte Behandlung anschlagen wird.
Bevorzugt ist es ausreichend für die Diagnose oder zum Unterstützen der Diagnose, lediglich nachzuweisen, ob der Antikörper vorhanden ist, wobei bestimmt werden kann, ob nachweisbare Konzentrationen des Antikörpers in der Probe vorhanden sind. In einer bevorzugten Ausführungsform wird bestimmt, ob die relative Konzentration des Antikörpers bei einem zu diagnostizierenden Patienten höher ist als bei einem durchschnittlichen Gesunden. Es kann bestimmt werden, ob die Konzentration um den Faktor 1,1, bevorzugter 1,2, 1,5, 1, 2, 5, 10, 20, 25, 50, 100, 200, 500, 1000, 10000 or 100000 höher ist als in einer Probe von einem durchschnittlichen Gesunden. Die höhere Konzentration stützt die Diagnose, dass der Patient, von dem die Probe stammt, an einer erfindungsgemäß zu diagnostizierenden Krankheit leidet bzw. zeigt an, dass der Patient mit erhöhter Wahrscheinlichkeit an einer erfindungsgemäß zu diagnostizierenden Krankheit leidet.
Das erfindungsgemäße Verfahren oder die erfindungsgemäße Verwendung erfolgt bevorzugt in vitro.
Der Fachmann versteht, dass ein solcher Nachweis in der Regel nicht allein eine umfassende Diagnose gestattet, sondern dass weitere Aspekte berücksichtigt werden müssen, beispielsweise weitere in einer Probe zu bestimmende Parameter, die medizinische Vorgeschichte, klinische Symptome, die Anamnese oder die Ergebnisse bildgebender Verfahren. Er versteht weiter, dass der Wert des erfindungsgemäßen Verfahrens darin bestehen kann, dass eine indirekte Diagnose oder Differentialdiagnose erfolgen kann, bei der der Ausschluss einer Krankheit anzeigt, dass der Patient unter einer anderen Krankheit mit ähnlichen Symptomen leidet.
Die zu untersuchende flüssige Probe ist eine Probe, die ein repräsentatives Set von Antikörpern des Patienten enthält, der bevorzugt ein Säugetier, noch bevorzugter ein Mensch ist. Bevorzugt ist sie aus der Gruppe ausgewählt, die Serum, Plasma, Speichel und CSF umfasst.
Die erfindungsgemäße Lehre kann nicht nur unter Verwendung der Wildtypsequenzen der angegebenen Polypeptide oder der Referenzsequenzen, wie sie in Form von SEQ ID NOs, zusammen von nun an als „Volllängen-Polypeptid“ bezeichnet, oder Datenbankencodes oder in sonstiger Weise, ggf. implizit, hier angegeben sind, ausgeführt werden, sondern auch unter Verwendung von Varianten dieser Sequenzen.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform bedeutet der Begriff „Variante“, wie hierin verwendet, dabei wenigstens ein Fragment des Volllängen-Polypeptids, das am C- und/oder N-terminalen Ende gegenüber dem Volllängen-Polypeptid um eine oder mehr als eine Aminosäure verkürzt ist. Ein solches Fragment kann eine Länge von 5, 6, 7, 8, 10, 12, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150 oder, 200 aufeinanderfolgende Aminosäuren aus der Sequenz des Volllängen-Polypeptides enthalten, bevorzugt 10 oder mehr.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst der Begriff „Variante“, wie hierin verwendet, nicht nur ein Fragment, sondern auch ein Polypeptid, das Aminosäuresequenzen mit in der Reihenfolge zunehmender Bevorzugung wenigstens 40, 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98 oder 99 % Sequenzidentität zum Volllängen-Polypeptid oder zum Fragment davon aufweist, wobei keine für die biologische Aktivität, z.B. die Fähigkeit eines Antigens, an einen für das Volllängen-Polypeptid-Antigen spezifischen Antikörper zu binden, essentielle Aminosäure deletiert oder nicht-konservativ substituiert wird. Der Stand der Technik offenbart Verfahren zur Feststellung der Sequenzidentität von Aminosäuresequenzen, z.B. in Arthur Lesk (2008), Introduction to bioinformatics, Oxford University Press, 2008, dritte Ausgabe. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die ClustalW-Software (Larkin, M. A., Blackshields, G., Brown, N. P., Chenna, R., McGettigan, P. A., McWilliam, H., Valentin, F., Wallace, I. M., Wilm, A., Lopez, R., Thompson, J. D., Gibson, T. J., Higgins, D. G. (2007). Clustal W and Clustal X version 2.0. Bioinformatics, 23, 2947-2948) unter Verwendung der Standardeinstellungen dazu benutzt.
Zusätzlich kann ein erfindungsgemäß verwendetes Polypeptid oder eine Variante davon chemische Modifikationen aufweisen, z.B. Isotopenlabel, kovalente Modifikationen wie Glykosylierung, Phosphorylierung, Acetylierung, Decarboxylierung, Citrullinierung, Methylierung, Hydroxylierung usw.
Varianten können auch Fusionsproteine mit Aminosäuren oder anderen bekannten Polypeptiden oder Varianten davon sein, bevorzugt mit einem Tag zur Aufreinigung, noch bevorzugter aus der Gruppe umfassend His-Tag, Thioredoxin, Maltose-bindendes Protein, Streptavidin, Glutathion-S-Transferase oder einer Variante davon, und aktive Teile oder Domänen sein oder aufweisen, bevorzugt mit einer Sequenzidentität von wenigstens 70, 75, 80, 85, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98 oder 99 % zum Volllängen-Polypeptid. In einer bevorzugten Ausführungsform wird unter dem Begriff „aktive Teile oder Domänen“ ein Fragment des Volllängen-Polypeptids oder eine Variante verstanden, das bzw. die wenigstens einen Teil der biologischen Aktivität des Volllängen-Polypeptids behält.
Es ist essentiell, dass die Variante des Volllängen-Polypeptids biologische Aktivität aufweist. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der biologischen Aktivität um die Fähigkeit eines Mittels, bevorzugt Polypeptides, einen Autoantikörper gegen AP3B2 einzufangen oder daran zu binden, bevorzugt spezifisch zu binden, wie er in Proben von Patienten vorkommt, die an einer erfindungsgemäß zu diagnostizierenden Krankheit erkrankt sind. Als Referenz für Versuche kann der Autoantikörper aus solchen Proben gewonnen werden. Varianten eines sekundären Antikörpers, der zum Nachweis eines Autoantikörpers dient, sind sämtliche Moleküle, die die gleiche Bindungsspezifität wie der sekundäre Antikörper aufweisen, bevorzugt die Fähigkeit, gegen alle Antikörper der menschlichen Klasse IgG zu binden. Sie umfassen beispielsweise Fragmente und Derivate des sekundären Antikörpers.
Bei der Herstellung von Varianten oder der Einschätzung, ob diese die biologische Aktivität zeigen können, kann sich der Fachmann an den Arbeiten von Newman et al. (1995) orientieren. Durch Mutationen und weitere Trunkierungen kann er weitere Varianten generieren. Mittels indirekter Immunfluoreszenz, ausgeführt wie in den Beispielen, kann er bestätigen, dass die biologische Aktivität erhalten bleibt.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird unter dem Begriff „Autoantikörper“, wie hierin verwendet, ein Antikörper verstanden, der spezifisch an eine Struktur, bevorzugt ein Autoantigen, aus dem Organismus bindet, welcher ihn herstellt. Ein solcher Autoantikörper weist eine konstante Region auf, wie sie andere Antikörper der gleichen Klasse aus dem gleichen Organismus aufweisen. Besonders bevorzugt handelt es sich um einen Säugetier-, noch bevorzugter um einen menschlichen Autoantikörper, noch bevorzugter um einen menschlichen Autoantikörper der Klasse IgG. Die variable Domäne ist in der Lage, gegen das Autoantigen spezifisch zu binden.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das AP3B2 oder die Variante davon zum Einfangen ein isoliertes und/oder aufgereinigtes Polypeptid, das besonders bevorzugt rekombinant ist. Unter einem „isolierten“ Polypeptid wird dabei verstanden, dass das Polypeptid aus seiner natürlichen Umgebung bzw. der Umgebung, in der es exprimiert wurde, entfernt wurde. Unter einem „aufgereinigten“ Polypeptid wird in einer bevorzugten Ausführungsform ein Polypeptid verstanden, das unter Verwendung von chromatographischen Verfahren gegenüber der Konzentration und/oder Reinheit in seiner natürlichen Umgebung angereichert wurde, die bevorzugt aus der Gruppe ausgewählt sind, die Affinitätschromatographie, Gelfiltrationschromatographie und lonenaustausch-Chromatographie umfasst. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist ein Polypeptid aufgereinigt, wenn es eine Reinheit von wenigstens 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 98, 99 oder 99,5% hat, was visuell oder, bevorzugt, durch Intensitätsmessung von Banden auf einem SDS-PAGE-Gel nach Coomassie-Färbung beurteilt werden kann. Unter einem „rekombinanten“ Polypeptid kann dabei verstanden werden, dass es unter Verwendung gentechnischer Methoden hergestellt wird, beispielsweise durch Kombination der kodierenden DNA mit einem heterologen Promoter, der bevorzugt eine starke Überexpression gestattet, mit einer Nucleotidsequenz, die für ein Tag kodiert, und/oder durch gentechnisches Mutieren, durch Exprimieren in einem heterologen Wirt oder Deletieren von Aminosäuren aus der Wildtypsequenz.
Die Zelle auf dem erfindungsgemäßen Träger ist bevorzugt eine eukaryontische Zelle, bevorzugter eine Insekten-, Pflanzen- oder Säugetierzelle, noch bevorzugter eine Säugetierzelle wie eine menschliche Zelle, am bevorzugtesten eine HEK293-Zelle.
Ein Polypeptid als Mittel kann in gefalteter Form oder in ungefalteter Form bereitgestellt werden und ist bevorzugt gefaltet. Bevorzugt wird die Faltung mittels CD-Spektroskopie in einem Puffer gemessen, der die Messung gestattet und in dem das Protein seine dreidimensionale Faltung annehmen kann (siehe beispielsweise Banaszak L. J. (2008), Foundations of Structural Biology, Academics Press, oder Teng Q. (2013), Structural Biology: Practical Applications, Springer), z. B. in 10 mM Natriumphosphat bei pH 7. Bevorzugt nimmt das Protein eine Faltung an, die von dem nachzuweisenden Autoantikörper erkannt wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Autoantikörper nach dem Einfangen durch eine Methode aus der Gruppe nachgewiesen, die die Messung von Immundiffusion, Immunoelektrophorese, Lichtstreuung, Agglutination, Radioaktivität, enzymatische Aktivität, (Elektro)-Chemolumineszenz und Immunfluoreszenz umfasst. Im Falle einer Detektion durch Radioaktivität, enzymatische Aktivität, (Elektro-)Chemolumineszenz und Immunfluoreszenz kann eine detektierbare Markierung eingesetzt werden. Sie ist bevorzugt an einem sekundären Antikörper angebracht, der an den nachzuweisenden Antikörper bindet. Nachweismethoden sind beispielsweise in Zane, H. D. (2001), Immunology - Theoretical & Practical Concepts in Laboratory Medicine, W. B. Saunders Company, besonders in Kapitel 14 beschrieben.
Bevorzugt wird der Autoantikörper erfindungsgemäß mittels Immunfluoreszenz nachgewiesen. Dazu wird ein fluoreszenzmarkiertes Molekül verwendet, bevorzugt ein fluoreszenzmarkierter sekundärer Antikörper oder ein fluoreszenzmarkiertes Antigen, bei dem es sich um ein Polypeptid umfassend AP3B2 oder eine Variante davon handelt. In einer bevorzugten Ausführungsform weist ein fluoreszenzmarkiertes Molekül einen Fluorophor auf, wobei es sich um ein fluoreszenzfähiges Molekül handelt, das für die Immunfluoreszenz-Färbung einer eukaryontischen Zelle geeignet ist, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe umfassend Fluorescein und Derivate davon, bevorzugt das gemischte Isothiocyanat-Isomer (FITC), Tetramethylrhodaminisothiocyanat (TRITC) und Derivate davon, Rhodamin und Derivate davon, 4,6'-Diamidino-2-phenylindol Dihydrochlorid (DAPI) und Derivate davon, 2'-(4-Etoxyphenyl)-5-(4-Methyl-1-piperazinyl)-2,5'-bi-1H-benzimidazol-Trihydrochloridtrihydrat und Derivate davon (Hoechst 33342), und es bevorzugt Fluorescein oder ein Derivat davon ist.
Erfindungsgemäß wird ein Kit bereitgestellt, der den erfindungsgemäßen Träger umfasst, wobei der Kit ein oder mehr als ein Reagenz, bevorzugt alle Reagenzien aus der Gruppe enthält, die eine Waschlösung, wenigstens eine Kalibratorlösung, einen Antikörper gegen AP3B2, und ein Mittel zum Detektieren des Autoantikörpers, bevorzugt einen sekundären Antikörper, noch bevorzugter einen sekundären Antikörper gegen IgG-Antikörper oder AP3B2 oder eine Variante davon, bevorzugt mit nachweisbarer Markierung, einen Verdünnungspuffer zum Verdünnen der Probe, eine Positivkontrolle, eine Negativkontrolle, ein Abdeckmedium und ein Detergenz umfassen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Positivkontrolle eine verdünnte Probe von einem Patienten umfassend einen Autoantikörper oder eine Lösung eines monoklonalen Antikörpers gegen AP3B2. Die Negativkontrolle kann eine Probe von einem Gesunden sein, z.B. einem Blutspender. Der sekundäre Antikörper kann eine Fluoreszenzmarkierung enthalten, bevorzugt FITC oder ein Derivat davon. Das Kit kann Anweisungen zur Durchführung des Tests umfassen.
Unter einer Kalibratorlösung, wie sie beim erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt wird, wird eine Lösung mit einer definierten Menge eines Antikörpers verstanden, der gegen das gleiche Polypeptide im Assay, bevorzugt Antigen bindet wie der nachzuweisende Autoantikörper und bevorzugt zur gleichen Ig-Klasse gehört wie der nachzuweisende Antikörper, wobei das Antigen bevorzugt AP3B2 oder ein Epitop davon ist. Die Kalibratorlösung kann eine in absolutem oder relativem Maßstab bekannte Menge des Antikörpers enthalten. Z. B. kann eine Kalibratorlösung zehn Mal so viel Antikörper enthalten wie eine andere. Bei dem in definierter Menge vorhandenen Antikörper kann es sich um einen Autoantikörper aus einer Probe handeln oder um einen rekombinanten, monoklonalen Antikörper. Bevorzugt werden mehr als zwei, bevorzugt 3, 4, 5 oder 6 Kalibratorlösungen mit jeweils unterschiedlichen Konzentrationen des Antikörpers in das Kit gegeben oder erfindungsgemäß verwendet, insbesondere parallel zu einer Probe untersucht, so dass eine Kalibrationskurve zur semiquantitativen oder quantitativen Bestimmung der Autoantikörpers gegen AP3B2 aufgezeichnet werden kann. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der Kalibratorlösung einen Autoantikörper oder Antikörper gegen AP3B2.
In der vorliegenden Patentanmeldung sind neue Polypeptide und/oder Nukleinsäuren aufgeführt. Sie haben die folgenden Sequenzen:
Im Folgenden wird die Erfindung unter Bezugnahme auf die Figur anhand von Ausführungsbeispielen erläutert. Die beschriebenen Ausführungsformen sind in jeder Hinsicht lediglich beispielhaft und nicht als einschränkend zu verstehen, und verschiedene Kombinationen der angeführten Merkmale sind vom Umfang der Erfindung umfasst.

1 zeigt eine beispielhafte erfindungsgemäße Immunfluoreszenzfärbung von Geweben des Zentralen Nervensystems. Die Kryoschnitte wurden im ersten Schritt mit 1:100 verdünntem Patientenserum und im zweiten Schritt mit FITC-markiertem anti-human IgG aus Ziege inkubiert. Die Färbung der Zellkerne erfolgte mit TO-PRO-3 lodide (blau). Auf Kleinhirn (Ratte und Primat) zeigte sich eine granuläre Fluoreszenz der Molekularschicht und der Purkinjezellen sowie eine fleckige Fluoreszenz der Körnerschicht. Auf Hippocampus (Ratte) wurde eine granuläre Fluoreszenz der Molekularschicht sowie eine starke granuläre Fluoreszenz des Hilus beobachtet. A) Kleinhirn Ratte, B) Hippocampus Ratte, C) Kleinhirn Primat.
2: Immunfluoreszenzanalyse von transfizierten HEK293 Zellen. Das Patientenserum (1:100 verdünnt) wurde mit Aceton-fixierten rekombinanten HEK293 Zellen inkubiert, welche AP3B2 exprimieren (A) oder mit Kontrollzellen, welche mit einem Leervektor transfiziert wurden (B).

Beispiel:
Patienten:
Es wurden Proben von zehn Patienten untersucht, die ein identisches Färbemuster bei einem Neuropilschnitt in der Immunfluoreszenz zeigten, das der Färbung mit Autoantikörpern gegen Amphiphysin ähnelte. Zu neun der zehn Patienten standen klinische Informationen zur Verfügung, und ihre Proben wurden in der Folge mittels Immunfluoreszenz untersucht. Drei der Patienten litten unter Myeloneuropathie, und jeweils zwei unter peripherer sensorischer Neuropathie, zerebellarer Ataxie und spinozerebellarer Ataxie. Alle neun Patienten litten unter Störung des Bewegungsganges.
Indirekte Immunfluoreszenz mit fixierten Zellen:

Die spezifische Reaktivität der Proben mit AP3B2 wurde mittels indirekter Immunfluoreszenz gezeigt. Dabei wurden die Proben mit HEK293-Zellen kontaktiert, die mit Volllängen-AP3B2 Isoform 1 kodierender DNA transfiziert worden waren (Swissprot Nr. Q13367). Kontrollzellen wurden mit leerem Vektor transfiziert. Alle Zellen wurden auf Glasobjektträgern wachsen gelassen, mit eiskaltem Aceton fixiert und in Form von millimetergroßen Biochipfragmenten auf Objektträgern als Mosaik umfassend AP3B2-exprimierende und Kontrollzellen vorbereitet.

Als Kontrollen dienten Serumproben von 317 gesunden Subjekten, 94 Patienten mit Verdacht auf paraneoplastische Krankheiten und Reaktivität gegen N-Typen-Calciumkanal-Antikörper, 63 Krebspatienten ohne neurologische Krankheit und 90 Patienten mit anderen neurologischen Krankheiten (Creutzfeldt-Jakob-Krankheit, CNS Systemische Lupus Erythematodes, Multiple Sklerose und ALS).
Ergebnisse:
Die Seren aller zehn Patienten zeigten eine starke Immunoreaktivität mit den transfizierten Zellen, die Volllängen-AP3B2 exprimierten (1), aber keine Reaktivität mit Zellen, die mit dem leeren Vektor transfiziert wurden.
Hingegen waren alle Kontrollseren, die mittels indirekter Immunfluoreszenz getestet wurden, negativ. Diese Ergebnisse zeigen, dass ein Träger, der Zellen aufweist, die AP3B2 überexprimieren, oder der isoliertes, rekombinantes AP3B2 aufweist, verwendet werden kann, um die Diagnose von Patienten zu unterstützen, die unter Verdacht stehen, unter neurologischen Autoimmunkrankheiten zu leiden, insbesondere unter Neuropathie oder Ataxie.
Sequenzprotokoll

<110> EUROIMMUN Medizinische Labordiagnostika AG
<120> Träger und Kit zur Diagnose einer neurologischen Autoimmunkrankheit
<130> 19PU285DE
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1 <211> 1082 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 1

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

EP 13189172 [0031]
EP 2483417 [0031]
US 2016/0349275 [0031]
US 2015/0247847 [0031]
EP 15001186 [0031]
EP 14003703 [0031]
EP 14003958 [0031]
EP 14171561 [0031]
EP 3101424 [0031]
EP 17001205 [0031]
EP 17000666 [0031]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

Darnell, R. B., Furneaux, H. M., Posner, J. B. (1991), Antiserum from a Patient with Cerebellar Degeneration Identifies a Novel Protein in Purkinje Cells, Cortical Neurons, and Neuroectodermal Tumors, The Journal of Neuroscience, 1991 May; 11(3): 1224-1230 [0010]
Newman, L. S., McKeever, M. O , Okano H. J., Darnell, R. B. (1995), β-NAP, a Cerebellar Degeneration Antigen, Is a Neuron-Specific Vesicle Coat Protein. Cell, Vol. 82, September 1995: 773-783 [0011]
Kim, D., and Herr, A. E. (2013), Protein immobilization techniques for microfluidic assays, Biomicrofluidics 7(4), 041501 [0029]
Arthur Lesk (2008), Introduction to bioinformatics, Oxford University Press, 2008 [0045]
Larkin, M. A., Blackshields, G., Brown, N. P., Chenna, R., McGettigan, P. A., McWilliam, H., Valentin, F., Wallace, I. M., Wilm, A., Lopez, R., Thompson, J. D., Gibson, T. J., Higgins, D. G. (2007). Clustal W and Clustal X version 2.0. Bioinformatics, 23, 2947-2948 [0045]
Banaszak L. J. (2008), Foundations of Structural Biology, Academics Press [0053]
Teng Q. (2013), Structural Biology: Practical Applications, Springer [0053]

Claims

Diagnostisch nützlicher Träger umfassend eine Zelle, die AP3B2 oder eine Variante davon überexprimiert, oder aufgereinigtes AP3B2 oder eine Variante davon, wobei die Variante spezifisch an einen Autoantikörper gegen AP3B2 spezifisch binden kann.
Träger nach Anspruch 1, wobei der Träger aufgereinigtes AP3B2 oder eine Variante davon umfasst, das rekombinant hergestellt wurde.
Träger umfassend eine Zelle, die AP3B2 oder eine Variante davon überexprimiert, wobei es sich um eine eukaryontische Zelle handelt, bevorzugt HEK293.
Träger nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Träger aus der Gruppe ausgewählt ist, die eine Mikrotiterplatte für ELISA, einen Bead, einen Blot; bevorzugt Western Blot, Lineblot oder Dot Blot; einen Immunfluoreszenztestträger mit fixierten Zellen, bevorzugt für eine mikroskopische Analyse, eine Lateral Flow-Vorrichtung, ein zellulosebasiertes Polymer, einen Biochip, einen Mikroarray, und ein Chromatographiesäulenmaterial umfasst und besonders bevorzugt ein Immunfluoreszenztestträger mit fixierten Zellen ist.
Träger gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei AP3B2 oder eine Variante davon im Komplex mit einem Autoantikörper gegen AP3B2 vorliegt.
Träger nach Anspruch 5, wobei der Komplex zusätzlich ein Mittel zum Nachweisen eines Autoantikörpers enthält, bevorzugt einen sekundären Antikörper, noch bevorzugter mit Fluoreszenzmarkierung.
Kit umfassend den Träger gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 und wenigstens ein Reagenz, bevorzugt alle Reagenzien aus der Gruppe umfassend einen sekundären Antikörper mit Markierung, bevorzugt Fluoreszenzmarkierung, eine Waschlösung und einen Antikörper gegen AP3B2.
Träger gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das AP3B2 oder die Variante davon in Komplex mit einem Autoantikörper vorliegt, erhältlich aus einem Verfahren umfassend die Schritte: a) Kontaktieren des Trägers mit einer flüssigen Probe unter Bedingungen, die die Bildung eines Komplexes zwischen AP3B2 und einem Autoantikörper gegen AP3B2 zulässt, b) Trennen von Träger und Probe, c) Waschen des Trägers, d) Kontaktieren des Trägers mit einem Mittel zum Nachweisen eines Autoantikörpers aus der Probe, bevorzugt einem sekundären Antikörper, noch bevorzugter mit Fluoreszenzmarkierung, e) Waschen des Trägers.
Verwendung eines Autoantikörpers gegen AP3B2 oder des Trägers oder Kits nach einem der Ansprüche 1 bis 8 oder von AP3B2 oder einer Variante davon, die spezifisch an einen Autoantikörper gegen AP3B2 binden kann, zur Diagnose einer Autoimmunkrankheit, bevorzugt einer neurologischen Autoimmunkrankheit.
Verwendung nach Anspruch 9, wobei die Autoimmunkrankheit aus der Gruppe ausgewählt ist, die Neuropathie und Ataxie umfasst und bevorzugt Neuropathie ist.
Verwendung nach Anspruch 9 oder 10, wobei eine Differenzierung gegenüber Creutzfeldt-Jakob-Krankheit, Systemischem Lupus Erythematodes, Multipler Sklerose und Amyotropher Lateralsklerose ermöglicht wird.
Verwendung nach einem der Ansprüche 9 bis 11, wobei der Autoantikörper gegen AP3B2 mittels Immunfluoreszenz detektiert wird.