JPH07506339A

JPH07506339A - 細胞毒性薬剤の不活性化

Info

Publication number: JPH07506339A
Application number: JP5512252A
Authority: JP
Inventors: バグショー，ケニース　ドーソン
Original assignee: エンザクタ　アール　アンド　ディ　リミテッド
Priority date: 1992-01-09
Filing date: 1993-01-11
Publication date: 1995-07-13
Also published as: GB2276624B; CA2124217A1; GB2276624A; EP0620742A1; WO1993013806A1; GB9410237D0; GB9200415D0; GB9204104D0

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】のこの発明は、細胞毒性薬剤の治療に関し、より詳しくはそれらの副作用を抑えるための細胞毒性薬剤の不活性化に関するものである。

従来の細胞毒性薬剤栗の主な制限の一つは、癌細鞄と、完全に正常な組織と体の機能のために必須である通常の複製細胞との間の区別を欠いていることである、これらの通常組織に関する細胞毒性薬の影響は、細ａＩｌ性治療の投薬量又はその投与の持続により制限される。！１！！毒性薬による治療はそれ故に、通常の組織を回復させるために、しばしば間隔をおいて中断される。そのような中断はまた、残存するｇＡＩＩ胞を回復させ、薬剤抵抗性を出現させるであろう。

治療における非投薬間隔の持続期間は、細胞毒性薬剤の投与の持続期間を超える。これは細胞毒性薬剤の全ての形態に適用されるが、細胞のサイクルのＳ相の間のＤＮＡ複製に妨げるこれらの薬剤の場合において特に明白である。

抗体支配酵素薬剤前駆体治療（＾ｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｐｒｏ−ｄｒｕｇ　Ｔｈｅｒａｐｙ（八ＤＥＰＴ））として知られる種々の癌の治療の方法は記述されており（Ｂａｇｓｈａｗｓ　１９８７　Ｂｒ、Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ５６，５３１−２；１９８９６０，２７５−２８１）　、抗体または抗体破片において臨床試験が早期になされ、癌の標的中の少なくともいくつかの細胞によって発現された腫瘍結合抗原に向けられ、酵素に接合させ、かつその酵素を癌の部位に運ぶのに用いられる。接合体中の酵素は、その後投与される、比較的無毒な物質でありかつ１１１票の基質となる薬剤前駆体と整合する。その反応の最終生成物は、腫瘍を通して拡散することができ、かつ標的抗原が発現することのない細胞に達する活性な細胞毒性薬剤である。このような治療において、使用される酵素がヒトの体液の中に重要な鳳で通常存在しないであろうし、薬剤前駆体は標的ＷＩ累による活性な栗に転化を受けることが望ましい（国際公開ＷＯ３８７０７３７８号）。

ヌードマウスにおける絨毛癌の異種移植片の実施例では、国際公開ＷＯ３Ｂ１０７３７８号が引用されるように、抗体酵素接合のクリアランスは、免疫接合の形態となる血漿における標的抗原の比較的多量の存在によって加速される。この場合、加速されるクリアランスは腫瘍部位で抗体［１Ｋ接合の局在を妨げることはないが、一般に、血漿からの抗体酵素接合体の急なりリアランスは、乏しい腫瘍の局在を起こす。

抗体酵素薬剤前駆体の原理（５ｅｎｔｅｒら（１９８８１Ｐｒｏｃ、Ｈａｔｌ　、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、１１ＳＡ８５．４８４２−４８４６）の別の例証では、標的酵素、アルカリホスファターゼは、薬剤前駆体の活性化が、腫瘍部位に生じることに加えてこれら全ての部位に惹起させねばならないように血漿を含む体の組織中に広く分配される。このような条件下で活性な薬の増加を生じさせる腫瘍はほんの少しで良い。

抗体＊素薬剤前駆体アプローチ（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｅｎｚｙｍｅ　ｐｒｏ−ｄｒｕｇ　ａｐｐｒｏａｃｈ）の目的は、腫瘍部位への細胞毒性薬剤の作用を制限することにある。これは、通常の組織が大きな毒性の影響を負うことなしに腫瘍部位で作用する薬剤の濃度を大きくさせる利点がある。また、目下使用中の多くの細胞毒性の栗は発癌性であり、一つの癌からの残存体は、通常の組織への１Ｋまたは放射線の影響を通して、以前の癌の治療により誘尋された癌に屈するであろうし、癌の部位に制限される変異原性の莱剖は、成豚性の癌の危険を減少させるであろう。

触媒作用により毒性の少ない薬剤前駆体から生じた活性な細胞毒性の薬の治療方法は、明らかなように、触媒が標的部位に制限されるならば、目的を唯一達成できる。抗体またはその破片、または抗体を含む接合体、またはそれの破片と酵素が、抗体に対応する抗原を細胞の表面に発現させる腫瘍を生産する宿主中に注入するとき、抗体または接合体が優先的に腫瘍部位に局在する。すなわち、腫瘍部位の酵素の濃度は、多分数時間または数日の間隔をおいた後、他の組織より高くなるであろう、しかしながら、抗体または接合に投与されるものの多くは、他の組織中に保有され、ある程度の血液を含む、末期癌の！Ｐ、ｆは、まれに体重の１０％以上を意味する数キログラムの腫瘍を持つかもしれないが、治療は一般に、８体の荷重が数グラムから約１キログラムの範囲にあるときになされる。このように、抗体酵素接合による腫瘍部位に達する酵素の高濃度の有効性は、低濃度の＃素を保有する大量の通常の組織によって相段される。酵素莱則＠四体の反応は、平均成人男性のａｈ漿徽が２−３リツトルで、全＃ｌｌｊ！外スペースが約１５リツトルなのに対し１キログラムの腫瘍中１−２００ミリリットルを越えないであろう間胃液（細胞外での空間）に起こる。これらの結果は、抗体−酵素接合体に基づく治療方法と続いて投与される莱削ｆ＋ｊｌ　１１体とが通常の組織上細胞毒性の薬の作用を通して投与量に限る効果に依然として従うものと考えられる。それは、かなりの量の血漿中にｗＩ索がまだ存在するとき、重大な効果を速やかに達し得る薬剤前駆体が与えられたなら、ヒト結腸癌のｎ橿移植片を移植したヌードマウスにおいて示されている（Ｂａｇｓｈａｗｅ（１９８９）Ｂｒｉｔ、Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ、６０．２７５−２８１）。

抗体−酵素接合体は一般的に１２−２４時間以内に腫瘍部位で最高濃度に達してから、血漿と他の体液からの浄化に数日を要するであろうことから、抗体−酵素接合体のクリアランスを促進させ、血液中に存在する特異な酵素を不活性化させるのに有利であることも示されている。これが達成されるようないくつかの手段が述べられている（国際公開ＷＯ３９／１０１４ｏ号）。

浄化および／または血漿中の酵素の不活性化は著しい効果を持ち、投与される薬剤前駆体を大量に投与することを許す、多くの臨床と実験的経験が、腫瘍の酵素の局在化が達成された後、血液中の酵素を速やかに不活性化させるガラクトシル化抗酵素の抗体を使用して得られている。抗酵素抗体のガラクトシル化は、肝細胞上のガラクトースレセプターによる取り寄せを通して血液からの迅速なりリアランスを生じ、かつ酵素を不活性化させる腫瘍上の管区間（ｖａｓｃｕｌａｒ　ｃｏＩＩｐａｒｔｓｅｎｔ）からそれが回避するのを防ぐ必要がある。そのような方法の使用における血漿酵素一度の落下は、国際公開ＷＯ３９／１０１４０号に記述された別な方法においては抗体酵素接合が血漿区画に引き戻して拡散するような通常組織中の抗原に結合されない原因となる。血液に戻る酵素は、例えば、抗酵素抗体の緩速注入によって不活性化させることができる。これらクリアランスの促進と不活性化の方法とは抗体酵素薬剤前駆体の治療に広く適用されるが何らかの活性薬剤は管区間にまだ入っており、細胞再生組繊、特に血液生成組織に到達し、投薬を制限することができる。腫瘍が比較的大きい所では、活性薬剤のかなりの量が直接拡散、またはリンパ線類を経由し、さらに通常組織中の残余の５Ｋ票活性によって形成されるいずれかの活性兼剤の添加により血液中に入れられる。

これらの方法を用いる細胞毒性薬剤の生成は、特異な＃＊が局在化し、癌部位に優勢な所のそれら部位に制限される。

体内の至る所で生成する細胞毒性薬剤は、細胞外の液体を通して拡散し、抗体が尋かれる標識抗原を現すことのない近くの細胞に到達することができる。それはまた管区間に戻り、そして、細胞再生組織に運ばれる。もし腫瘍の塊が大きく、薬剤が数秒以上の半減期を持っていれば、通常組織に関する効果がなお投与量の限界を立証するであろう。

それ故に、活性薬剤が血液中に存在することは望ましくない。

抗腫瘍抗体は、はとんどまたは全く血液生成組織に結合しないで存在するが、血液生成が毛管中または近接した有窓性毛管で起こり、血液生成細胞は、血液中に存在するｌＩｌ胞毒性薬剤の作用で弱化する。

この血液媒介効果は、活性系剤が短い半減期を持つことを確実にすることにより制限してよい（Ｂａｇｓｈａｗｅ　１９１１７）　＊体内のいずれかの場所に生じた薬剤は、循環する血液を経由し、２０−３０秒以内にいずれの組織にも到達できる。いくつかの価値ある細胞毒性薬剤は比較的長い半減期を持ち、付加的なメカニズムの欠如において、これらは考慮から除かれる。また、非毒性の薬剤前駆体から生成できるかなり活性のある短い半減期の薬を同定すること旬困ｌｌ′ ｔｌあることが証明されている。さらなる研究として、非常に短い半減期は、発現する抗原とそれにより生成する活性系剤の位置から離れた腫瘍の項中の部位に達することのできる活性薬剤の１度を制限するであろう。

この発明の目的は、少なくとも部分的に、血液中に存在するなんらかの活性な薬剤、それは血液中に生産されているか、或いは腫瘍、又は通常組織から血液への接近を獲得するうちのいずれかであるような薬剤を阻害することにある。

この発明の第一の態様は、それが管区ｍ（血管区画など）に投与され、かつより少ない毒性の物質に細胞毒性薬剤を転化し得る不活性化部分であるときに宿主の管区間からの放出を少なくとも部分的に抑制し得る部分を含む化合物を擾乱す管区間中の不活性化薬剤を保有するのに使用される方法は、活性な栗の性質によって順に決定されるであろう不活性化薬の性質により部分的に決定されるであろう。

その保有成分は血液の全ての作用と体の器官とに生物学的に融和される必要があり、たとえその崩壊がゆっくりであろうとも生物分解性とすべきである。腫瘍細胞外に残余の成分が入ることを最小限とするべきであることが要求される。その結果として、遊離の不活性化部分が血液から速やかに取除かれるから腫瘍の細胞外の空間へのそれの接近を制限することがもしなければ、不活性化部分は保持部分から遊離の状態で開放されないようすべきことが後者の必要条件になる。

その制限部分は、赤血球であって良い、好ましくは、その化合物は、赤血球の中に原因分子を入れるための分野において周知の技法の使用によって赤血球に包含させ或いは内包させて良い、その不活性部分は赤血球の腹に固着させて良く或いは赤血球に入れかつそれを保持させるように形成しても良い。

細胞内容物の許容されない損失の無い哺乳類の赤血球内に所望の薬剤を尋人する方法は開示されている（参照によってこの中に合併された米国特許第４９３１２７６号）、この方法は、（ａ）細胞の内と外に速やかに拡散される化合物を含んだ溶液中に細胞を；濁及びインキュベートすること、その化合物の濃度を、細胞の内容物が高優性になるようにその細胞内への拡散を引き起こすことが十分となるようにする、（ｂ）細胞が結果的に膨張すること及び外部膜の透水性を増加させるように水分の拡散を引き起こすことの！＋１発性のある少なくとも１つの薬剤の存在する等損性の水性媒体とともに高張性の細胞を含んだ溶液の希釈によって膜を通して浸透の勾配を速やかに生成すること、（Ｃ）細胞内へのその化合物の移動と細胞外への上記化合物の拡散とを単に許容するに十分な時間のためにその膜の浸透性の増加を維持すること、を備えている。この方法は特に、細胞負荷のための米国特許第４４７８８２４号の２浸透性パルス′機構のために有用である。

米国特許第４５５２４４９号（ＩＩ照によりここに合併された）には哺乳類の赤血球内の生物学的に活性な物質のカプセル化のための更なる方法として、（ａ）透析ユニットの主要な区画、赤血球の溶解を引き起こすように赤血球懸濁物については低張性である水性溶壇を含む第２の区画、の中に赤血球の水性懸濁物を連続的に供給することと、（ｂ）赤血球溶解物を生物学的に活性な化合物との接触を引き起こし或いは接触させ、吹いて溶解物の腫張および／または浸透性圧力の増加によって赤血球膜を再封止すること、が述べられている。

抑制部分は選択的に、リポソーム、＋！！いはデキストラン又はマクログロブリンのようなタンパク質のような高分子１　（＞２５０００ダルトン、好ましくは少なくとも４００００ダルトン）ポリマーで良い。

長い循環時間をもつリポソームはまた、不活性化部分のための潜在的な媒体である。長いｌｉ環時間をもつリポソームは各種の手法において構築されている。これらは、ガングリオシドＧＭＩ、またはスフィンゴミエリンの混合物、卵のホスファチジルコリンとコレステロール、または他の比較的硬直な媒体脂質の使用を含む、リポソームの各々の型のために、分粒による最適化は血管内の常在を延長させるように最適化するのがまた望ましい、ギヤとシン（Ｇａｂｉｔｏｎ）とパパファジョボーラス（Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ）　（（１９１１８）Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ８５．６９４９−６X ５３））は、１１００ｎの平均粒径が最適であることを見い出した。しかしながら、長い循環時間を持つリポソームは、これらが腫瘍の中の重要でない取り込みを示すのみであれば適当である。

デキストランは、主に１−６結合で結合されたαグルコースの単位からなる多ｗＩｌｌ［である０部分的に加水分解され、分割されたデキストランは、血漿増量剤として広く使用されている。それらは、肝臓、牌臓、腎臓、腸の粘膜、結腸に存在するデキストラナーゼにより精製される（１（１３ｇｎｆｅｌｄら（＋９５９）Ｂｉｏｋｈｉｍｉａ［Ｅｎｇｌ］２４．９６５−９７０：＾ｍｅａｎ（１９６３）Ｅｎｚｙｍｏ　ｌｏｇ　１ａ２５　、２４５−２５１　Ｈ５ｅｒｒｙ＆）ｌｅｈｒｅ（＋９５U）Ｊ　、Ｂａｃｔｅｒｉ　ｏｌ。

７１．３７３−３８０）　、デキストランは、　４０　ｋ　Ｄ　（Ｇｅｎｔｒａｎ４０．Ｒｈｅｏｍａｃｒｏｄｅｘ）　、　７０−７５　ｋ　Ｄ　（Ｇｅｎｔｒａｎ７０．Ｍａｃｒｏｄｅｘ）　、ｌ　１０　ｋ　Ｄの平均分子量のものが広く利用できる。これらは潜在的に抗原性であり、先天的な抗体を持つ人もいるが、しかし、デキストランの反応は、他の広く使用される製薬上の薬よりも高くなくかつ柔和な特性であると報告されている（ＱＨｄｍａｎとＧｉｌｍａｎ、　Ｔｈｅ　Ｐｈａｒｓａｃｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｂａ５ｉｓ　ｏｆ　Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、８ｔｈ　Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｐｅｒｇａｍｏｎ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、０ｘｆｏｒｄA＋９９０）　＊他のポリマーの薬剤媒体は、炭水化物、ペプチド、脂質から開発されている。

これらのいくつかは、不活性な部分がここで定義される基準（ｃｒｉｔｅｒｉａ）を満たすそれらを提供する不活性化部分のための選択される抑制部分が好適であろう。

抑制部分は、負の電荷を持ち、低い脂肪親和性（ｌｉｐｏｐｈｉｌｉｃｉｔｙ）を持つと有利であろう。

好ましくは、抑制部分は生物分解性である。

“生物分解性”とは、保持部分が患者の体の中で減じることを意味し、そのため、例えば７２時間より少なく、望ましくは４８時間より少ない比較的短い半減期を有する。

この発明の第二の態様は、宿主への上記化合物の投与を含む宿主の管区間における細胞毒性薬剤の不活性化の方法を提供する。

このように、活性な薬がアルキル化試薬であること、血管内の不活性化の方法が還元されるグルタチオンの反応によるものであり、この反応はグルタチオンＳトランスフェラーゼにより触媒作用を及ぼすものであることが望ましい、非蛋白質のチオールのグルタチオンは、主に内生的な還元試薬として見なされる。グルタチオンとグルタチオン−８−トランスフェラーゼの両方は通常の赤血球中に存在し、赤血球中グルタチオンのレベルは、脚部の癌を持つ患者の従来の化学療法の栗の応答に関連し、高レベルが乏しい応答性に関連付けられている（　Ｈｅｒｂｅｒｇｓら（１９９２１Ｔｈｅ　Ｌａｎｃｅｔ３３９．＋０７４−６）　、赤血球のグルタチオンの含有率は、高張性の透析と等損性の再封止の手続により実質上（３かも４倍に）増加させることができる（Ｆａｚｉ　ら（＋９９１）Ｂｉｏｔｅｃｈ　ａｎｄ　Ａｐｐ、Ｂｉｏｃｈｅｓｉｓｔｒｙ　１４．６Ｏ−６８）　＊血液中のアルキル化剤の不活性化は、それ故にグルタチオンを負荷し過ぎた赤血球を用いることが可能となる。これが有効であるため、活性薬剤は、銹導した薬剤前駆体より直ちに不活性化されることが望まれる。

活性薬剤と薬剤前駆体との間を区別する抗体が投与されることがさらに好ましい、薬剤前駆体は、通常活性薬剤中に存在しない切断された半分を所有することから、これは上３８抗体が唯一薬剤と結合できるように、薬剤前駆体と薬剤との間の構造的な差異を供する。

モノクローナル抗体は、それらが免疫原性の制限により人体に適合させることができるという効果を有する。このような抗体は、それが腫瘍部位での活性薬剤の別な方法で不活性化されるであろうことから、管区間の内部に保持させる必要がある。管区間の制限は、肝細胞のガラクトースレセプターによる取り込みを通して短い半減期を与えたガラクトシル化抗体によって達成して良い（Ｓｈａｒｓａら＋　１９９０）Ｂｒｉｔ、Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ６１．６５９−６６２）、抗体上のガラクトースを半減させるほど、半減期は短くなる。短い血漿の半減期は組織の浸透力により制限するが、効果的には、活性薬剤の発生の期間を通して連続的な静脈内の注入が要求されるだろう。

また、抗体は、デキストランのような生物分解性の多糖類にゆっくりと接合されて良い。

さらに、投与された薬剤前駆体に関し、活性薬剤を減じる、または細胞膜を交差できないことが与えられ、及び効果を持たない、または効果が非常に少ないか細胞膜を横切ることができず、効果がないかまたはずっと効果が少ない酵素がより好適である。ある環境において、抗体が化学量論的に（例えば１つの抗体が１つの活性薬剤分子の不活性化に要求される）作用するであろうことに対し１つの酵素分子が活性薬剤分子の大部分を不活性化するであろうことから不活性化抗体に比べて不活性化酵素の使用は有効である。非−ヒト酵素は免疫原性であることの不利益を有し、それ故免疫学的な対照の幾つかの形態が要求されるが、しかしグルクロニダーゼ、キナーゼ、スルファターゼと他の薬剤不活性化酵素を含むヒトの酵素は活性薬剤の基質に従って使用されて良い、ヒトに適合化された触媒的な抗体は有効となろう。

酵素は、グルタチオンの合併のためにそこで述べた浸透性技法により、赤血球の中に合併され、または、長い循環時間を持つリポソーム中に合併される。或いは、醇素は緩慢な生物分解性ポリマーの薬剤媒体の多くの型のうちの１つへの接合によって管区間の内部に保持されて良い（Ｋｒｉｎｉｃｋ＆Ｋｏｐｅｃｅｋ（１９９１）ｉｎ　Ｔａｒｇｅｔｅｄｄｒｕｇ　ｄｅｌｉｖｅｒｙ、ｐｐ１０５−１７９（Ｅｄ、Ｒ，Ｌ、Ｊｕｌｉａｎｏ）Ｓｐｒｉｎｇｅｒ　Ｖｅｒｌａｇ　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋj　。

この発明の第三の態様は、標的細胞特異的部分（ａ　ｔａｒｇｅｔ　ｃｅｌｌ− ｓｐｅｃｉＨｃ　ｐｏｒｔｉｏｎ）と薬剤前駆体を細胞毒性薬剤に転換できる酵素的活性部分を含む第一の成分と、前記酵素的活性部分により該細胞毒性薬剤に転換できる薬剤前駆体である第二の成分と、前記化合物を管区間に投与したときに該成分が宿主の管区間をはなれることを少なくとも部分的に抑制できる部分を含む第三の成分と、樟的外の細胞部位で細胞毒性薬剤を毒性の少ない物質に転換できる不活性化する部分とを備えているパーツの３成分キットを提供する。

このようにして、該細胞毒性薬剤の作用は、薬剤の臨床上の有用性が実質上増加するように、従来の療法で可能な期間よりも、かなり長い期間腫瘍部位で持続されることができる０本発明の方法によれば、管区画に到達するどのような薬剤も少なくとも部分的に破壊されるかまたは不活性化されるのに対して、細胞毒性薬剤は標的細胞部位に生成され、それによって、該細胞毒性薬剤の作用を延長させる。

該パーツキットの該第−の成分の該標的細胞特異的部分に！！識される被認識物としては、腫瘍細胞、ウィルス感染細胞、病原性微生物、遺伝子瞭法の一部分として尋人された細胞、または特定の理由のため破壊が望まれる通常ｓｉｎなどで発現される適当なものであればよい、その被認識物は、他の治療手段に機能的に置き換えることのできない宿主のいかなる通常組織の中よりも、破壊されるべき細胞上又は細胞内にかなり高濃度で、存在するかまたは標的化する（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）部分にとって接触可能でなければならない。

被認識物は、しばしば抗原である。ａ癌特異的抗原は、これらが細胞膜上に発現されるかまたは腫瘍の細胞外液に分泌されたときに、抗体からの標的としての役割を果たす、“腫瘍”という詔は、あらゆる形態の腫瘍性の（ｒ＋ｅｏｐｌａｓｔｉｃ）　ｌｌｉ胞増殖と関連して理解され、肺、肝臓、皮膚、膵臓、結腸、前立腺、子宮、または胸の腫瘍を含む、ｖｉ主は、哺乳類が好ましく、ヒトが最も好ましいが、本質的にはいかなるを椎動物であってもよい。

抗原特異的部分は、抗体全体く通常、便宜性および特異性の理由から、モノクローナル抗体）、それらの部分（例えば、Ｆａｂ片、または、Ｆ　（ａｂ’　）２）、一本鎖の抗体断片または合成抗体またはその部分であってもよい、抗体の成分は、ヒトのものまたはヒトに適応化したもの（ｈｕ＋ａａｎｉｓｅｄ）でもよく、または触媒性抗体でもよい、抗体部分だけを含む接合体は、腫瘍のより高い浸透圧のため有利かもしれないし、Ｆｃ部分による非特異的結合を受けにくいかもしれない。選択された抗原に適したモノクローナル抗体は、例えば”Ｍｏｎｏｅｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　：Ａｍａｎｕａｌ　ｏｒ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ″、　Ｉ（、Ｚｏｌａ（ＣＲＣＰｒｅｓｓ、＋９８８１と、　”Ｈｏｎｏｃｌｏｎａｌ　）ｌｙｂ窒奄р盾■ ａ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　：Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”　、Ｊ、Ｇ、Ｒ，ＨｕｒｒｅｌｌｆＣＲＣＰｒ■唐刀A１９８２）において開示されたような周知の技術により調製し得る。この明細書で言及された全ての文献は、参照文献としてここに記載されている。二重特異的（Ｂｉｓｐａｃｉｆｉｃ）抗体は、細胞融合により、−価断片の再会合により、または全ての抗体の化学的クロスリンク（ｃｒｏｓｓ−１ｉｎｋｉｎｇ）により、結果として生じる細胞特異的抗原に向けられた二重特異的抗体の一部分と酵素へ向けられた他の部分を有して調製し得る。該二重特異的抗体は該酵素と結合して投与することもできるし、又ははじめに二重特異的抗体が投与されたあと、該酵素が投与されてもよい、二重特異的抗体の調製方法は、Ｃｏｒｖａｌｅｎら（＋９８７）Ｃａｎｃｅｒ　ＴＩＩＩｕｎｏｌ、Ｉ−＊ｕｎｏｔｈｅｒ、２４，１２７− １３２と１３３−１３７と１３８−１４３と　Ｇ１１１ｓｌａｎｄ　ら（１９８８）Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ８５，V７１９− ７７２３に開示されている。

該抗体の可変Ｈ（ＶＨ）と可変Ｌ（ＶＬ）ドメインは抗原Ｉ！識に関わっており、このことは初期のプロテアーゼ消化実験により、最初に認識された事実である。

替歯動物の抗体の“ヒト適応化（ｈｕｍａｎｉｓａｔｉｏｎ）″によってさらに確認がなされた。ｉｉ歯動物由来の可変ドメインは、結果として生じる抗体かもとの替歯動物の抗体の抗原特異性を保持するようにして、ヒト由来の不変ドメインと融合されてもよい（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら（１９８４）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＬＩＳＡ　８１．６１１５１−６８５５）　B 該抗原特異性が、可変ドメインにより付与され不変ドメインから独立であることは、一つまたはそれ以上の可変ドメインを全てが含む抗体断片の細菌での発現に関する実験により知られている。このような分子としてはＦａｂのような分子（Ｂｅｔｔｅｒら（１９８８）　５ｃｉｅｎｃｅ　２４０．１０４１）　、　Ｆｖ分子（Ｂｉｒｄら＋１９８８１５ｃｉｅｎｃｅ　２４０、１０３８）　、　ＶＨとｖＬとのパートナ−ドメインがフレキシブルなオリゴペプチドを介して結合される一本［Ｆｖ（ＳｃＦｖ）分子（Ｂｉｒｄら（１９８８）　５ｃｉｅｎｃｅ　２４２゜４２３　：Ｈｕｓｔｏｎら（１９８８）　Ｐｒｏｅ、　Ｎａｔｌ、　／、ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８５．５８７９）　、単離されたＶドメインを含む単一ドメイン抗体（ｄＡｂｓ）（ｌｌａｒｄら（＋９８９）　Ｎａｔｕｒｅ　３４１，５４４）が含まれている。これらの特異的結合部位を保有する抗体の断片（フラグメント）ノ合成に関した技術の一般的概説は’）ＩｉｎｔｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎ　（１９９１）　Ｎａｔｕｒｅ　３４９．２９３−２９９にある。

ここで″５ｃＦｖ５ｃＦｖは、ｖＨとＶＬどのパートナ−ドメインがフレキシブルなオリゴペプチドを介して結合されている分子を意味する。

抗体全体を用いずに、抗体断片を用いると、何倍もの利点が得られる。小さいサイズの該断片は固体組織での浸透圧をより高めるように、薬理学的な性質を改善させることができる。補体結合のような、抗体全体のエフェクター（ｅｆｆｅｃｔｏｒ）の機能が除去される＊　Ｆａｂ、Ｆｖ、５ｃＦｖ、およびｄＡｂ抗体断片は、全て発現され、大腸菌から分泌され、こうして上記断片の大量生産が容易となる。

抗体全体とＦ　（ａｂ’　）２は、″二価°°である。ここで“二価”とは、上記抗体とＦ　（ａｂ’　）２断片が二つの抗原結合部位を有することを意味する。これと対照的に、Ｆａｂ、Ｆｖ、５ｃＦｖ、およびｄＡｂ断片は、−価であり、ただ一つの抗原結合部位を有する。Ｆ　（ａｂ’　）２断片を生産するためのインタクトな（ｉｎｔａｃｔ）免疫グロブリンの断片化（ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ）は、Ｈａｒｗｏｏｄら（１９８５）　Ｅｕｒ、　Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ　Ｃｌ１ｎ、０ｎｃｏ１．２１．１５１５−１５２２．に開示されている。

ＩｇＧクラスの抗体が好ましい。

あるいは、該被認識物は、抗原性のものでもよいし、そうでなくてもよいが、別の方法で認識されて選択的に結合することが可能である６例えば、それは黒色腫細胞中に多数発現されるメラニン細胞刺激ホルモン（ＭＳＨ）のレセプターのような特徴的な細胞表面のレセプターであってもよい、、該細胞特異的部分は、例えば、ＩＩ胞衣表面酵素基質又はそれの類似物として、又はメツセンジャーとして、非免疫的に、特異的に該被認識物に結合する化合物であってもよいし、またはその部分であってもよい。

薬剤前駆体を細胞毒性薬剤に転換できる酵素を選択的に発現させるために、正常細胞と腫瘍性細胞における転写の違いを用いる腫瘍性細胞の選択的致死として、ウィルス支配酵素薬剤前駆体治療（ｖｉｒｕｓ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｅｎｚｙｍｅ−ｐｒｏ−ｄｒｕｇ　ｔｈｅｒａｐｙ（ＶＤＥＰＴ））のアプローチが開示されている（Ｈｕｂｅｒら（１９９１１Ｆ’ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８８．８０３９−８０４３）　。

細胞間の転写の違いは、組織特異的なプロモータと関連していてもよいし、または腫瘍性の状態での活性化因子（ａｃｔｉｖａｔｏｒ）または抑制化因子（ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ）分子中の変化によるものでもよい８例えばその−例として、肝臓関連のアルブミン転写調節配列は、肝細胞性の１！！腫の患者の治療において、阻害剤不活性化酵素の発現を引き起こすのに役立つかもしれない。正常細胞と腫瘍性細胞との間のさらなる転写の違いは、既に発見されており、これらの違いの多くがこの発明の方法において活用されるかもしれないと考えられる。

遺伝子構造物（例えば、阻害剤不活性化酵素をコードする遺伝子を加えたプロモーター）の分配に好適である組換型の複製欠損性レトロウィルスが、開示されている（　Ｈｕｂｅｒも（１９９１）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｉ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＬＩＳＡ　８８．８０３９−８０４３）　。

例えば、一つの実施態様としては、該キットの該第−の成分が、ＶＤＥＰＴのために適当な遺伝子構造物を分配するシステムであってもよい。

すでに腫瘍関連の抗原に対する抗体とその断片についてかなりの研究が行われており、８肛抗原（ＣＥＡ）に向けられた抗体または抗体断片、またはヒト絨毛膜ゴナノドトロビン（ｈＣＧ）に向けられた抗体または抗体断片はカルボキシペプチダーゼＧ２と接合することができ、その結果として生じる接合体は、抗原結合性と触媒作用の両方を保持する。これらの接合体を静脈内に接種すると、これらは、ＣＥＡまたはｈＣＧを各々発現させる腫瘍中に選択的に局在する。他の抗体は、それに対応する抗原を発現する腫瘍中に局在することが知られている。このような腫瘍は、ヒト患者において初期転移性結腸直腸癌（ＣＥＡ）や絨毛癌（ｈＣＧ）であってもよいし、他の型の癌であってもよい、このような抗体−酵素接合体は、各々の抗原を発現する正常組織の中にも局在するかもしれないが、抗原の発現は、正常組繊の中ではより拡散されている。このような抗体−酵素接合体は、各々の抗原を介して細胞膜に結合されていてもよいし、または間質空間（ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ　５ｐａｃｅ）中の抗原にトラップされていてもよい。

細胞特異的抗原の例を、表１に表す。

［以下余白］艮Ｊ１・仄凰真Ｗ腹区凰　乳体　１里癌胚抗原　（Ｃ４６（＾−ｅｒｓｈａｍ）　結ｌｌｌ１／直腸腫瘍ノＩｉ像化（８５Ａ　１２　（Ｕｎｉｐａｔｈ）　（ｉｍａｇｉｎｇ）と治療胎盤アルカリ性　Ｈ１７Ｅ　２　（ＩＣＲＦ、Ｔｒａｖｅｒｓ　ｊｉ巣と卵巣の癌のＩｉ像化ホスファターゼ　＆Ｂｏｄｍｅｒ）　（ｉｓａｇｉｎｇ）と治蒙全癌！Ｉ　ＮＲ− ＬＵ−１０（ＮｅｏＲｘ　小細胞肺癌を含む各種の（Ｐａｎ　Ｃａｒｃｉｎｏｓａ）　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｎ）　癌の画Ｃ象化　（ｉｍａｇｉｎｇ）と治療多形の上皮ムチン　ＨＭ　Ｆ　Ｇ　１　（Ｔａｙｌｏｒ−卵巣癌、胸膜流出の画像（ヒト乳脂肪血球）　Ｐａｐａｄｉｍｉｔｒｉｏｕ　ＩＣＲＦ）　化（ｉ＋ｓａｇｉｎｇ）と治療β−ヒト絨毛ｆｆｌ　、　Ｗ１４　ヌードマウス中のヒトゴナドトロピン　異種移植片への酵素絨毛癌　の標的（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ＞（ＣＰＧ　２）ｆＳｅａｒｌｅら（＋９８１１Ｂｒ、Ｊ、Ｃａｎｃｓｒ４４．＋３７−＋４４）ヒト癌の炭水化物　Ｌ６　（ＩｇＧ２ａ）１　アルカリ性ホスファターゼの標的（Ｓｅｎｔｅｒら（１９８８）Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、ｓｃｉ。

ＵＳＡ　８５．４８４２−４８４６１Ｂリンパ腫（正常と　ＩＦ５　（ＩｇＧ２ａ）２　アルカリ性ホスファターゼ腫瘍性）上の　の標的（ＳｅｎｔｅｒらＣＤ２０抗原　（１９８８）Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｅｉ。

８５　、４８４２−４８４６　）Ｉ　Ｈｅ１ｌｓｔｒｏ＊　ａｔ　ａｌ（１９８６）Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、４６．３９１？−３９２３２Ｃ１ａｒｋｅ　ｅｔ　ａｌ（１９８５）Ｐｒｏｅ、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、ｓｃｉ、８２．１７６６−１７７０他の抗原は、アルファフェトロブロチイン（ａｌｐｈａｆｏｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ）　、Ｃａ−Ｌ　２５、および前立腺特異的抗原を含む。

２、鬼飛豆！」１１Ｗ里全（Ｐａｎ）Ｔリンパ球　ＯＫ　Ｔ　−３ｆｏｒｔｈｏ）　腎臓移植の抗拒絶線法表面抗原（ＣＤ３）Ｂリンパ球　ＲＦ　Ｂ　４　（Ｊａｎｏｓｓｙ　Ｂ細胞リンパ腫の免疫毒素表面抗原（ＣＤ　２２　）　Ｒｏｙａｌ　Ｆｒｅｅ　Ｈｏ５ｐｉｔａｌ　１　療法全（ＰａｎｌＴリンパ球　Ｈ６５（Ｂｏｄ＋＊ｅｒ、Ｋｎｏｗｌｅｓ　宿主に病気対する急性移植表面抗原（ＣＤ　５　）　ＩＣＲＦ、Ｌｉｃｅｎｓｅｄ　ｔｏ　組繊、慢性関節リウマチのＸｏｍａ　Ｃｏｒｐ、、ＬＩＳＡ　免疫Ｓ素処理３、覧免秩夕１」！Ｌバ凰耳下線炎ウィルス関連　抗耳下線炎の　耳下線炎の治療のためシフ多クローン性の抗体　テリア毒素に接合する抗体Ｂ型肝炎表面抗原　抗ＨＢｓＡｇ　肝癌に対する免疫毒素該第−の成分の該酵素的活性部分は、該細胞特異的部分から分離して活性であるかもしれないが、（ａ）それが該細胞特異的部分に組み込まれ、（ｂ）該化合物が標的細胞に付着されるかまたは近接しているときに、それがＷＩ素的に活性になることだけが必要である。

従来の酵素を使用することは必要でないかもしれない、触媒能力を持つ抗体が開発され（Ｔｒａｓｏｎｔａｎｏら５ｃｉｅｎｃｅ　２３４．１５６６−１５７０）　、’アブザイム（ａｂｚｙｍｅｓ）　’として知られている。これらは、これらの免疫原性を減少させるためにヒト適応化（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）することができる利点を持つ可能性がある。

この発明の該パーツキットの該第−の成分の該二つの部分は、Ｏ’　Ｓｕｌ　１ｉｖａｎら（１９７９）＾れａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、ＩＱｏ、１００−１０８に一般的に述べられているように、従来のクロスリンクする（ｃｒｏｓｓ−１ｉｎｋｉｎｇ）ポリペプチドのいずれかの方法によって、−緒に結合されていてもよい。例えば、該抗体部分は、チオール基と、これらのチオール基と反応できる二重機能莱（ａ　ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ａｇｅｎｔ）と反応した酵素部分により、質的に向上される。該二重機能薬の例としては、ヨード酢酸のＮ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル（Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ　ｅｓｔｅｒ　ｏｆ　１ｏｄｏａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ（Ｎ）ｌｒＡ））またはＮ− スクシニミジル−３−（２−ビリジルジヂオ）プロピオン酸塩（Ｓ　Ｐ　Ｄ　Ｐ　）　（Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−３−＋２−ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏ）ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅｌがある。アミh とチオエーテル結合は、例えば、ｍ−マレイン酸ベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル（ｍ−＋５ａｌｅｉ＋ｎ１ｄｏｂｅｎｚｏｙｌ−Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｉｓｉｄｅ　ｅｓｔｅｒ）により得られ、一般に、二硫化物の結合より生体内でずっと安定である。

該酵素全体が、該パーツキットの該第−の成分に存在する必要はないかもしれないが（または、該第三の成分が該薬剤を代謝するなら、該第三の成分）、もちろん、触媒部分は存在しなければならない。

あるいは、上記第一の成分は、組み換えＤＮＡ技術により融合化合物として生産されるが、それによって、ＤＮＡの長さは、互いに隣接するか、あるいは該化合物の所望の性質を破壊しないリンカ−ペプチドをコードした領域により分離される、この発明の該化合物の該二つの部分をコードした各々の領域を含む、おそらく、該化合物の該二つの部分は、全体的または部分的に重なり合うであろう。

そして、＆＆ＤＮＡは、この発明の該化合物を含むポリペプチドを生産するのに適した宿主中で発現される。このように、この発明の該化合物を構成する該ポリペプチドをコードした該ＤＮＡは、この発明の該ポリペプチドの発現と生産に適当な細胞を形質転換するためにそのとき使用される発現ベクターを構築するため、ここに記載された示唆にしたがって適当に修正された既知の技術に従って使用されることができる。このような技術には、Ｒｕｔｔｅｒらの１９８４年４月３日発行の米国特許第４，４４０，８５９号、Ｗｅｉｓｓｍａｎらの１９８５年７月２３日発行の第４，５３０，９０１号、Ｃｒｏｗｌの１９８６年４月１５日発行の第４，５８２，８００号、Ｍａｒｋらの１９８７年６月３０発行の第４，６７７．０６３号、Ｇｏｅｄｄｅｌの１９８７年７月７日発行の第４，６７８゜７５１号、Ｉｔａｋｕｒａらの１９８７年１１月３日発行の第４，７０４，３６２号、　Ｈｕｒｒａｙの１９８７年１２月１日発行の第４，７１０，４６３号、Ｔｏｏｌｅ、Ｊｒ、らの１９８８年７月１２日発行の第４，７５７，００６号、Ｇｏｅｄｄｅｌらの１９８８年８月２３日発行の第４，７６６．０７５号、５ｔａｌｋｅｒの１９８９年３月７日発行の第４，８１０，６４８号が含まれ、これらの全てが参照文献としてここに含まれる。

この発明の該化合物を構成する該ポリペプチドをコードした該ＤＮＡは、適当な宿主中に導入するために広範なｍｍの他のＤＮＡ配列と結合されることができる。該同伴ＤＮＡは、該宿主の性質と、該宿主中への該ＤＮＡの導入方法とに依存し、かつエビソームの保存か組み込みのいずれが好ましいかに依存する。

一般的に、該ＤＮＡは、発現のための適当な向きと正しいリーディングフレームにおいて、プラスミドなどの発現ベクター中に挿入される。一般的に、該所望の宿主により認識される適当な転写と翻訳の調節制御は、発現ベクターの中て利用できるようになっているが、必要ならば、該ＤＮＡはこのような該所望の宿主により認識される適当な転写と翻訳の調節制御ヌクレオチド配列に結合されてもよい。そして、該ベクターは、通常の技術によって該宿主中に尋人される。一般的に、全ての該宿主が、該ベクターにより形質転換される訳ではないであろう。

それゆえ、形質転換された宿主細胞を選択することが必要となるであろう、一つの選択技術としては、該形質転換された細胞中の抗生物質耐性のような選択可能な特性をコードする何らかの必要な制御要素を有するＤＮＡ配列を、該発現ベクター中に組み入れることを含む、あるいは、このような選択可能な特性の該遺伝子は、該所望の宿主細胞を共形質転換させる（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｏｒｍ）ために使用される別のベクター上にあってもよい。

そして、この発明の該組み換えＤＮＡにより形質転換された宿主細胞は、このとき回復される該ポリペプチドの発現をさせるため、ここで開示された当業者に周知の適当な条件の下、十分な時間培養される。

細ＩＩ（例えば、Ｌ匹■と堕０旦叩５ｕｂｔｉｌｉｓ）　、酵母（例えば、鎮匹か二１匹競江江旺紅■）、糸状菌（例えば、ｂ匹」１はｕ）、検切細胞、動物細胞、および昆虫細胞を含む多くの発現システムが知られている。

たとえ該ベクターが他の井原植生物の細胞タイプの発現に使用されることになっても、該ベクターは原核生物の繁殖のためのＣｏ１Ｅｌ　ｏｒｉのような原核生物のレプリコンを含む、該ベクターもまた、それによって形質転換された大腸ｌ１ｌ（鳳、ｃｏｌｉ）のような細菌宿主細胞中の該遺伝子の発現（転写と翻訳）を支配できる原核生物のプロモーターのような適当なプロモーターを含むことができる。

プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼの結合と転写が起ることを可能にするＤＮＡ配列によって形成された発現制御要素である。４５Ｉ範的な細菌宿主と共存可能なプロモーター配列は、この発明のＤＮＡ断片の挿入のために都合のよい制限部位を含むプラスミドベクターの中に典型的に供給される。　典型的な原核生物のベクターのプラスミドは、バイオラドラボラトリーズ（Ｂｉｏｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）　（米国、カリフォルニア州、すνチモノド（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、　ＣＡ、　ＵＳＡ））から入手可能なｐＵｃ１８．ｐＵｃ１９、ｐＢＲ３２２、及びｐＢＲ３２９と、米国、ニューシャーシー州、ビス力夕ウェイ、ファーマシアｆＰｈａｒ＋５ａｃｉａ、　Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、　ＮＪ、　ＬＩＳＡ）から入手可能なｐＴｒｃ９９ＡとｐＫＫ２２３−３である。

典型的な晴乳類細胞ベクタープラスミドは、米国、ニューシャーシー州、ビス力夕ウェイ、ファーマシアから入手可能なｐＳＶＬである。このベクターは、クローン化された遺伝子の発現を引き起こす５Ｖ４（１期プロモーターを用いるが、発現の最高の水準はＣＯ３−１ｍ胞のようなＴ抗原生成細胞中に見られる。

誘導性哨乳類発現ベクターの例はｐ　Ｍ　Ｓ　Ｇてあり、これもファーマシアから入手可能である。このベクターは、クローン化された遺伝子の発現を引き起こす、マウスの乳房の腫瘍ウィルスの長い末端重複のグルココルチコイド誘導性プロモーターを用いる。

有効な酵母プラスミドベクターは、ｐＲ３４０３−４０６とｐＲｓ４１３−４１６とであり、一般的に、米国、カリフォルニア州９２０３７．う・ジョラ、ストラタジーシクローニングシステムズ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍｓ、　Ｌｍ　Ｊｏｌｌａ、　ＣＡ９２０３７、１１３人）から入手可能である。プラスミドｐＲ３４０３、ｐＲｓ４０４、ｐＲ３４０５、及びｐＲ３４０６は、酵母組込みプラスミド（ＹＩｐｓ）であり、酵母選択マーカーｈｉｓ３、ｔｒｐｌ、１ｅｕ２、及びｕｒａ３を取り込んテいる。プラスミドｐＲＳ４１３−４１６は、酵母動原体プラスミド（ＹＣｐｓ）である。

相補的付着端を介してＤＮＡをベクターに機能的に結合させるために、様々な方法が開発されている０例えば、相補的ホモポリマー束は、ベクターＤＮＡに挿入されるようにＤＮＡ断片に加えられる。次に、このベクターとＤＮＡ断片とは、組み換えＤＮＡ分子を形成する相補的ホモポリマーの末尾の間で水素結合によって結合される。

一つまたはそれ以上の制限部位を含む合成リンカ−は、ＤＮＡセグメントをベクターに結合する択一的な方法を提供する。ＤＮＡセグメントは、前に述べたエンドヌクレアーゼの制限消化によって生じるが、３’−５’−エキソヌクレオリチック（ｅｘｏｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ）活性を有する突出した３°−−ｆｆｉ頗端を取り除き、かつ凹部に配！された３＋−末端を重合活性で満たすような酵素である、バクテリオファージＴ４　ＤＮＡポリメラーゼまたは大腸Ｃ１（Ｅ、　凶す、１ＤＮＡポリメラーゼエで処理される。

それゆえ、これらの活性の組み合わせは、平滑断端化されたＤＮＡ断片を生じる０次に、この平滑断端化された断片（セグメント）は、バクテリオファージＴ４　ＤＮＡリガーゼのような、平滑断端化されたＤＮＡ分子の連結反応に触媒作用を及ぼすことができる酵素の存在下で、大過剰モルのリンカ−分子を用いてインキュベートされる。このように、反応生成物は、末端に重合性のリンカ−配列を携えているＤＮＡ断片である６次に、これらＤＮＡ断片は、適当な制限酵素で切断され、ＤＮＡ断片の末端と共存可能な末端を生成するＷＩｊｌ［で切断された発現ベクターと結合される。

様々な制限エンドヌクレアーゼ部位を含む合成リンカ−は、米閃、コネチカット州、二１−　ヘ−ｊ　ン（Ｎｅｗ　Ｒａｖｅｎ）　＋　インターナショナルバイオテクノロジーズ社（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　Ｉｎｃ、、　Ｎｅｗ　Ｈａｖｅｎ＋　ＣＮ、　ＵＳＡ）を含む多く■ 供給元から商業的に入手可能である。

本発明のポリペプチドをエンコードするＤＮＡを変性する望ましい方法は、サイキ（Ｓａｉｋｉ１他（１９８８）サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２３９，４８７ −４９１によって開示されているような、ポリメラーゼの連鎖反応を用いることである。

この方法において、酵素的に増幅されるＤＮＡの側面には２つの特異的オリゴヌクレオチドプライマーがあり、これら自身は増幅されたＤＮＡにか合体される、上記の特異的プライマーは、当該技術分野で知られる方法を用いる発現ベクターにクローニングするために使用できる制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含んでいてもよい。

本発明の実施に役立つと考えられる酵母の具体的な属は、ピッチア（Ｐｉｃｈｉａ）、サツカロミセス（ＳａＣＣｈａ「０ＩＩＣｅＳ）、クリベロミセス（ＫｌｕｖｅｒＯＩＩＣｅＳ）、カンデイダＣＣａｎｔ匡ｄａ）、）ルロプシス（−■ ｂ剋■）　、ハンセヌラ（ｈ」ｌ１膓）、シゾサツカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍ　ｃｅｓ）　、シテロミセス（虹還」■１競）、パシソレン（Ｐａｃｈ■ｏｌｅｎ）　、デバロミセス（Ｄｅｂａμ県匹競）、メトシュニコウィア（＞ｌｅｔｓｃｈｕｎｉｋｏｗｉａ）　、ロドスボリディウム（ＲｈＯｄＯ５ｏｒ１ｄｉｕ−）、ロイコスボリディウム（ＬｅｕＣＯ３Ｏｒ１ｄ１ｕＩ１１）、ボトリオアスクス（ｋなＬｌに並）　、スボリジオボルス（１匣」遅山江用）、エンドマイコブシス（堕鼓肛規匹ｎ）等である。望ましい属は、ピッチア（Ｐｉｃｈｉａ）　、サツカロミセス（５６Ｃｃｈａｒｏ■ｃｅｓ）　、クリベロミセス（Ｋｌｕｖｅｒｏｌｃｅｓ）、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）　、及びハンセヌラ（狼勉見堕）からなる群から選ばれる属である。サツカロミセス（５１（ｃｈａｒｏ腸ｃｅｓ）ノ例ハ、サツカロミセス　セレビシｘ−（ＳａＣＣｈａｒＯａＣｅＳｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）　、サッカロミセスイタリクス（隙匹地 μｌ二競１ｔａｌｉｃｕｓ）　、及びサツカロミセスルーキシ−（踵蝦用１Ｌ野匹■亘）である、クリベロミセス（Ｋｌｕｖｅｒｏｌｃｅｓ）の例は、クリベロミセスフラギリス（Ｋｌｕｖｅｒｏｌｌｃｅｓ住■旦ｎ）及びクリベロミセスラクティス（肋１側１Ｌ射１　ａ　ｃ　ｔ　ｉ　ｓ　）である、ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）の例は、ハンセヌラポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ　匹ｎ鯨葎血）　、ハンセヌラアノマラ（Ｈａｎｓｅｎｔ山、　ａｎｏｓａｌａ）　、及びハンセヌラアノマラタ（）Ｉａｎｓｅｎｕｌａ　□）である、ヤロウィアリボリチヵ（Ｙａｒｒｏｗｉａ旦四江ｕ」）は、適当なＹａｒｏｗム種の例である。

Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの形質転換の方法は、ＥＰ　２５１７４４、ＥＰ　２５８０６７、国際公ＩＲＩＷＯ９０１０１０６３号に概括的に開示されており、これらの全てが援用により本明ｌｉｍに組み込まれる。

Ｓ、ｃｅｒｅｖｉ　５ｉａｅの適当なプロモーターは、ＰＧＫ１遺伝子、ＧＡＬＩまたはＧＡＬＩＯ遺伝子、ＣＹＣＩ、ＰＨ０５、ＴＲＰｌ、ＡＤＨＩ、ＡＤＨ２や、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、グルコキナーゼ、α接合因子フェロモン、α接合因子フェロモンのための遺伝子と関連するプロモータと、ＰＲＢ　Ｉプロモーター、ＧＵＴ２プロモーター、及び５１調ｆ１５領域の部分をその他のプロモータの５＋調節領域の部分とあるいは上流の活性化部位とハイブリッド形成したものを含むハイブリッドプロモーター（例えば、ＥＰ−＾−２５８０６７のプロモーター）を含む。

転写終結シグナルは、転写終結とポリアゾニレ−ジョン（ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ）とのための適当なシグナルを含む真核遺伝子の３１の側面に位置する配列であることが望ましい、適当な３′の側面に位置する配列は、例えば、用いられる発現制御配列に本来結合される遺伝子の配列でよく、すなわちプロモーターに対応してもよい、あるいは、これらは異なっていてもよく、この場合には各、岨胆ｎ紅並ＡＨＤＩ　遺伝子の終結シグナルが望ましい。

キットの第二の成分は薬前駆体（ｐｒｏ−ｄｒｕｇ）であり、これは相対的に非毒性であり、全体の第１の構成要素の中の酵素のための基質であり、そして細胞毒性物質に変換される。この細胞毒性物質は、アルキル化剤、ＤＮＡ中にインターカレーションを起こし、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、チミジンシンセターゼ、リボヌクレオチドレダクターゼ、ヌクレオシドキナーゼあるいはトポイソメラーゼ等のあらゆる鍵醇票を抑制し、又は他の細胞の成分との相互作用による細胞の壊死に影響を及ぼす薬剤など、あらゆる現存する抗癌某であってもよい、エトポシドは、トポイソメラーゼ抑制剤の一例である。

パーツのキットの第三の成分を形成する本発明の化合物の不活性化する部分は、生じた活性薬剤に適合するように選択されなければならないことは明白である。

標的部位での活性薬剤の望ましくない不活性化を避けるように、細胞毒性薬剤の不活性化の殆どは血管区画などの管区画に限定される必要がある。

また、この化合物の不活性化する部分は、血液中にも存在し得る薬剤前駆体を、これが細胞毒性薬剤に変換されるのを妨げるような方法により、不活性化しないことも認められるであろう、薬剤前駆体が恩瘍部位に到達でき、そこで細胞毒性薬剤に変換されるように、薬剤前駆体を血液中に存在させておくことが望ましい。

それゆえに、本発明の望ましい態様によれば、体内の特定部位で薬剤前駆体から生じた活性薬剤が患者の血液中で不活性化されるが、この際血液中に存在するいずれの薬剤前駆体の同様の不活性化をも用いない様な手段が提供される。

この不活性化する部分は酵素的に活性な部分であって、活性薬剤を毒性がより少ない物質に変換する能力がある部分であってもよい。酵素全体が存在する必要はないであろうが、触媒部分はもちろん存在しなければならない０例えば、活性薬剤がメトトレキセートの場合、不活性化する部分は酵素カルボキシペプチダーゼＧ２又は他のフオレートーデグルタメーテイング（ｆｏｌａｔｅ−ｄｅｇｌｕｔａｍａｔｉｎｇ）＃索であってもよく、そうすることにより、これらはそれを不活性化するメトトレキセートを分解する。

細菌の酵素カルボキシペプチダーゼＧｌ及び０２　（ＣＰＧＩ及びＣＰＧ２）は、末端のグルタミン酸の切断によって、メトトレキセートを含むフオレート（ｆｏｌａｌｅｓ）を分解する。この２つの酵素の作用は同じと考えられる０本発明の望ましい態様に関する以下の記述は、ＣＰＧ２について述べているが、ＣＰＧＩ及び同様の基質に作用する他の酵素にも適用でき、また同様の基質に作用するアブザイム（ａｂｚｙｍｅｓｌにも適用できる。

Ｐｓｅｕｄｏｉｏｎａｓ上菌株Ｒ３１６かもの力ルポキベブチダーゼＧ２の単離、精製、及びその特性のイくツかは、シャーウッド（Ｓｈｅｒｖｏｏｄ　ｌら（１９８４）　Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１４８．４４７−４５３によって開示された。上記カルボキシペプチダーゼＧ２をエンコードする遺伝子のクローニングと、そのヌクレオチド配列と、その大腸菌（監、　ｃｏｌｉ）での発現とは、ミントン（Ｍｉｎｔｏｎ）他（１，９８４”Ｉ遺伝子（Ｇｅｎｅ１３１．３１−３１１及びミントンら（１９８３）　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１５６．１２２２−１２２７により開示された。ＣＰ２Ｇ２は、イギリス、ソールズベリー、ボートンダウン、応用微生物学研究センター、生物工学課（ｔｈｅ　Ｄｉｖｉｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、　Ｃｅｎｔｒｅ　ｆｏｒ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　Ｐｏｒｔｏｎ　Ｄｏｗｎ、　５ａｌｉｓｂｕｒｙ、　ＵＫ）から入手可能である。カルボキシペプチダーゼＧｌ　（ＣＰＧｌ）は、チャブナ−（Ｃｈａｂｎｅｒ　ｌら（＋９７２）癌（ｃａｎｃｅｒｌ　Ｒｅｇ、　３２．２１１４−２１１９により開示されている。

この不活性化する部分は、二者択一的に、活性細胞毒性薬と自発的に反応するか又は適当な触媒の存在下でより効果的にその様にする化学的な部分であってもよい０例えば、薬がアルキル傷薬の場合、不活性化する部分はチオール含有物質を含んでいてもよく、不活性化は、高分子体中又は上に携えられたグルタチオントランスフェラーゼによって触媒される。

例えば、この不活性化する部分は、二者択一的に、抗体であるか、又は活性薬剤には結合するが対応する薬剤前駆体には結合しないか若しくはより限られた程度においてのみそうする様な、あるいはそうすることによりそれを不活性化する薬剤前駆体に対しては触媒的に活性であるがその薬に対しては活性でない様な、抗体の一部分であってもよい。

細胞毒性薬剤の様な低分子量化合物に対する抗体の生成は、公知のハブテナイゼーション（ｈａｐｔｅｎｉｓａｔｉｏｎ）の技術によって促進されてもよく、これによれば、この低分子量の分子は、キーホール　リンベットヘモシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅ　１ｉｓｐｅｔｈａｅ■ｏｃｙａｎｉｎ）又は他の媒体分子の様な高免疫原性のタンパク質に接合される。

薬剤前駆体が、薬剤前駆体の部分の触媒的な切断によって活性薬剤に変換される場合には、薬剤前駆体と活性薬剤とを区別する能力を有する抗体の生成が行われるのが好ましい、なぜなら、薬剤前駆体において不活性な部分は、抗薬抗体が薬剤前駆体のこの様に隠れた薬剤部分に結合するのを立体化学的に抑制することができるからである。

この不活性化する部分は当該技術分野において公知の結合方法によって制限部分に接合されてもよく、それによって管区間中で本発明の化合物が保持される。

さらに他の成分によって、非腫瘍部位からの特異的Ｗｌ素の不活性化及び／又は抗体−酵素接合体の清浄化の促進が達成されてもよい、これが達成される様ないくつかの手段についての記述がある（国際公ＩＲＩＷ０８９７１０１４０号、及びバグショ（Ｂａｇｓｈａｗｅｌ　１９８９）　、例えば、一つの方法としては、Ｆｉｇ素に向けられた抗体が使用される。このような抗体が腫瘍部位で酵素と結合したりあるいは不活性化するのを防止するために、この第二の抗体と抗体− 酵素接合体とが、ガラクトースレセプターに富んだ肝細胞に結合することにより、確実に血液からすばやく清浄化されるような、追加のガラクトース残基が加えられる。

抗体−酵素接合体を不活性化又はＦＲｆｐ化するために用いられる抗体は、抗腫瘍抗体上の抗原結合部位、又は酵素の活性部位、又は抗体−酵素接合体上の他のいずれかの部位に向けられ得る。この様な抗体は、清浄化を促進するために加えられる追加的なガラクトース残基又は他の糖を有していてもよく、あるいは脱シアル酸化されていてもよい、抗体のガラクトシレージョン（ｇａｌａｃｔｏｓｙｌａｔｉｏｎ）の結果、それは肝細胞上のガラクトースレセプターによる取り込みを介して急速に清浄化される。あるいは、又はさらに、この抗体−Ｗｌｌ接接合体ガラクトシル化され（ｇａｌａｃｔｏｓｙｌａｔｅｄ）、そして肝臓のガラクトースレセプターがアシアロ−ウシ顎下腺ムコタンパク質か、肝臓のガラクトースレセプターに向けられた抗体か、ガラクトースレセプターに関して高親和力を有する他の分子かによって遮断された後に与えられる。この遮断物質は、２４時間までの期間血漿中に保持され、その結果抗体−抗原錯体は腫瘍部位に局在化するが、ガラクトースレセプター遮断の停止に続いて、このガラクトシル化された抗体−抗原は、利用可能なガラクトースレセプターを介して、すばやく清浄化される。

また、異質タンパク質に対する宿主の免疫応答によって課されるかもしれない制約を避けるために、ある構成要素が必要とされるかもしれない、この成分の性質は、免疫学的制御の方法の開発段階に従って変わってもよい、異質のタンパク質に対する宿主の応答を克服するために用いることのできる方法は、当該技術分野において公知である。異質のタンパク質の免疫原性を減少させるための技術は、抗体−＃集液合体にも適用でき、ポリエチレングリコールの形態への接合のものである（ウィルキンソン（Ｗｉ　１ｋｉｎｓｏｎｌら（１９８７）　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１３９．３２６−３３１）。

あるいは、又はさらに、免疫抑制か免疫寛容誘導する薬ＰＩかを投与することによって、免疫原性の問題を克服してもよい。シクロスポリン及びＦＫ５０６は、組織移植の際に免疫抑制を達成するために広く用いられる薬である。シクロスポリンは異質のタンパク質に対する宿主抗体応答を遅延させることが示された（レダーマン（Ｌｅｄｅｒｍａｎｌら（１９８８）　Ｂｒ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ　５ｇ、　５６２−５６６及び６５４−６５７）　、宿主が、リンパ球上のＣＤ４エピトープに向けられた抗体を受容した後で最初に異質の問題に遭遇する際の異質のタンパク質に対する寛容性についての開示がある（ワルドマン（Ｗａｌｄ＋＋ａｎｌ他（＋９８１１）　、アレルギーにおける進歩（Ｐｒｏｇｒｅｓｓ　ｉｎ　Ａｌｌｅｒｇｙｌ　（シザタ（Ｓｈｉｚａｔａｌ及びウオクスマン（ｗｏｋｓｍａｎ）ＩＩ、ニューヨーク）　ｐｐ　１６−３０）、これを達成するためのさらに他の手段は他のものにも記載されており、異質の抗原に対する宿主の抗体応答の制御が改善されれば、それにつれて変わり得る、触媒的抗体（アプザイム）を、それらの免疫原性を減じるか取り除くことにより′ヒト化°してもよい。

本発明の第４の態様は、宿主中の標的細胞を破壊する方法を提供し、この方法は上述した様々な構成要素を宿主に投与することを含む。

本発明の構成！！素は、いずれかの適当な方法、すなわち通常は腸管外で、例えば、静脈内、腹腔内、又は膀胱内に、標準的滅菌の、非発熱性の、希釈液と媒体を有する製剤として投与される。

腫瘍関連抗原に向けられた抗体、又は抗体−抗原接合体が、宿主が有する適当な腫瘍中に注入されるとき、この抗体又は接合体のほんの小さい断片が腫瘍部位に局在化し、そしてその大部分が血液及び他の通常の組織中に数日間留まる。従って、酵素の腫瘍濃度は通常の細胞中より高くなるが、通常の組織の体積はかなり大きくなる。従って、通常の組織及び血液中に残留する酵素の量を最小限化するため、血液から過剰の抗体−酵素接合体を不活性化して清浄化するために、国際公開ＷＯ３９／１０１４０号、パグシ＝ｓ　−（１９８９）　Ｂｒ１ｔ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ　６０．２７５−２８１　；及びシャーマ（Ｓｈａｒｍａｌら（＋９９０）　Ｂｒ１ｔ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ　６１．６５９−６６２に開示されてし）る方法と共に、本発明の方法を用いることが望ましいであろう。

癌の撲滅を達成しようとする際に、造血機能の抑制（を髄抑制（吋ｅｌｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎｌ）を避けることはできないであろう。尤も、腫瘍標的上に与えられた効果に関しては、ここに記載されている系を用いれば、それはかなり少なくなると予想される。同様に、を髄抑制の与えられた程度に関しては、より大き１）腫瘍効果が予想される。それゆえに、造血組織に作用する成長抑制因子又は成長因子を、ここに記載されている系と組み合わせて有益に利用してもよい。

ここに記載されている系を、他の治療形態と共に用いてもよい、これらには、従来の細胞毒性剤が含まれ、そして１以上の代謝物を不活性化するような複数の触媒の配送（ｄｅｌｉｖｅｒｙ）の利用が含まれる。

同様に、抗体により腫瘍部位に配送された酵素は、薬剤前駆体を活性化させ、かつ、通常の組繊を保護する代謝物を不活性化させるように機能する。ここに記載されているようなカルボキシペプチダーゼＧ２は、腫瘍細胞をトリメトレキセート（ｔｒｉｓｅｔｒｅｘａｔｅ　）に対して非保護にしておくように、腫瘍部位でフォリン酸を不活性化する。同じ腫瘍に位置する酵素は、細胞毒性マスタード（＠ｕｎｔ龜ｒｄｌを形成する安息香酸薬剤前駆体を活性化することができる。

（バグショー（＋９８９）Ｂｒｉｔ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ　６０．　２７５− ２８１に開示）。

本発明の化合物と方法とは、ｌ１ｔｌＬカルボキシペプチダーゼＧ２によって不活性化される、薬剤メトトレキセートを利用する細胞毒性治療に特に言及して、以下の実施例及び図面において論じられる。薬剤アミノプテリンは、酵素カルボキシペプチダーゼＧ２によって不活性化される、別の強力なＩｌｉｍＩｌ性薬である。

図１は、メトトレキセートとフォリン酸との構造を図示したものである。

図２は、（Ｉ）薬剤前駆体と、カルボキシペプチダーゼＧ２を有する（Ｉ）の切断後に生成される（＋１）細胞毒性薬剤（安息香酸マスタード）との構造を図示したものである。

面３は、キーホールリンベット　ヘモシアニンにアミノ安息香酸を接合するための概要を図示したものである。

図４は、第一の成分がカルボキシペプチダーゼＡ　（ＣＰＡ）に連結される標的 −細胞特異性抗体であり、第二の成分がアラニン−メトトレキセートであり；そして第三の成分がカルボキシペプチダーゼＧ２　（ＣＰＧ）に連結される制限部位である、本発明の概略図である。

本発明は、一般的な原理に関し、他の細胞毒性薬に応用されてもよい。

１：Ａｌａ−レキセー　カルボキシル基　ダーゼＡ　Ｇ２　い庭１ｚ久ヱム広く使用されるメトトレキセート剤は、葉酸拮抗薬であり、その作用は、栄養要素である葉酸の、醇索ジヒドロ葉酸還元酵素による、その還元形、５−メチルテトラヒドロ葉１１（フォリン酸、シトロボラム因子）への転化を妨げる。フォリン酸は、ＤＮＡ合成の一つの炭素転移に使用される。フォリン酸の欠如の場合、細胞の再生はＳ相中で妨げられ、引続き細胞死が起こる。メトトレキセートは、悪性疾患の広い範囲の治療に使用される。それはまた、既に述べたメカニズムを経由して、通常細胞の再生組織の中で細胞死の原因となる。その効果の重要性は、主として、巣への組ａ露出を持続させる機能であり、持続が長い程、毒性の効果が大きくなる。メトトレキセートの作用への感染性は、その内部崩壊の遅れと、持続の作用が好ましい細胞からのその排出物とによる栗のポリグルタミン酸化（ｐｏｌｙｇｌｕｔａｓａｔｉｏｎ）から生じると考えられる。メトトレキセートの効果は、一般に５−ホルミルテトラヒドロ葉酸の形で与えられるフォリン酸によって迂回させることができる。フォリン酸を持つメトトレキセートの投与量の制御された投与と注意深く合わせた時間とが、数種の癌の治療におけるメトトレキセートだけの使用にわたって有効であることが見出されている。こうして、メトトレキセートの大量投与が、フォリン酸の′救援″により、１２−２４時間後に、一般に引き続いて起きる。同様に、−日おきの少ないメトトレキセートと毎日のフォリン酸の投与は、好結果と、栄Ｉ膜の腫瘍のいくつかの形態をもつ多くの患者のための低毒性治療とを提供している（　ｉｌａｇｓｈａｗｅら＋＋９８９）Ｂｒｉｔ、　Ｊ、　Ｏｂ、　Ｇｙｎａｅ　９６．７９５−ｇｏｚ）　。

メトトレキセートのαカルボキシル基へのアミド結合を経てアラニン部分を導入することにより、メトトレキセートが修正されたときに、その結果生じる化合物は効率的に細胞から除外され、アラニン形態の毒性は、生体外で標的細胞中自然なメトトレキセートのそれより、５０−１００倍少ないことが示されている（Ｋｕｅｆｎｅｒら（１９８９）　Ｂｉｏｃｈｅｓｉｓｔｒｙ　２８．２２８８−２２９７）　、アラニン部分は、自然のメトトレキセートを出た酵素カルボキシペプチダーゼへの作用により、分裂される。アラニンメトトレキセートは、酵素カルボキシペプチダーゼＧ２によって新陳代謝されない、カルボキシペプチダーゼＧ２は、グルタミン酸部分の分裂により、メトトレキセーＦと自然の葉酸とを減じる。

この実施例では、この発明のシステムの第一の成分は、抗体、又は、抗原である癌胚抗原に結合する腫瘍に支配されるカルボキシペプチダーゼＡと接合する抗体断片を有する。

もちろん、カルボキシペプチダーゼＡではないが同様の基質の特異性を有する他のカルボキシペプチダーゼを、カルボキシペプチダーゼＡの代りに使用しても良い、カルボキシペプチダーゼＡは、ウシからのものと、細菌供給源（例えば、カルビオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅａ）、ノッチンガム（Ｎｏｔｔｉｎｇｈａ＠）、ＵＫ）とから利用でき、ヒトの膵臓中にも存在する。該酵素は、オリゴペプチドをポリペプチド鎖のＣ末端から、または遊離カルボキシル基を有する接合アミノ酸を含有する他の化合物から加水分解する。カルボキシペプチダーゼＡは、芳香性の残余の選択物を有する。それは、通常、鴫乳類の供給源から、膵臓で製進された３つのサブユニットの複合集合物のトリプシン処理によって形成される。

さらなる成分は、増進させたクリアランス、又は非腫瘍部位からのカルボキシペプチダーゼＡの不活性化を達成する。

第二の成分は、活性な薬メトトレキセートをカルボキシペプチダーゼＡの作用により生じさせてからの薬剤前駆体であるアラニンメトトレキセート（Ｋｕｅｆｎｅｒら　＋９８９１である。

第三の成分は、デキストランのような巨大分子構造に接合するカルボキシペプチダーゼＧ２である。巨大分子の目的は、管区画にＣＰＧ２活性を制限することである。

例えば、ＣＰＧ２は、メルトン（Ｍｅｌｔｏｎ）も（１９８７）の方法に従（風可溶なデキストラン（Ｌｏｍｏｄｅｘ　４０．　Ｌｏｍｏｄｅｘ　７０．　ＤｅｘｔｒａｖｅｎｌｌＯとＤｅｘｔｒａｖｅｎ１５０．全て商標：　Ｆｉｓｏｎｓ、　Ｌｏｕｇｈｂｏｒｏｕｇｈ、　Ｌｅｉｃｓ、、　ＵＫ）　ｌこ結合される。

０．９％のＮａＣ１中に１ｇのデキストランを含むデキストラン調製物の容量は、０，９％のＮａＣ１を用いて１００ｍ１に希釈し、臭化シアン（ＣＮＢｒ＋　Ｓｉｇｍａ、　Ｐｏｏｌｓ、　Ｄｏｒｓｅｔ。

ＵＫ）と反応させる。４０−７０，０００ダルトンのデキストランを活性化させる！　ためＣＮＢｒ　（０，５ｇ）が使用され、高分子量のデキストランのためには０．４ｇが使用される。この還元は、１１０，０００と１５０，０００ダルトンのデキストランの沈殿を防止するのに必要とされる６反応混合物は、室温でよく撹拌し、２Ｍ　ＮａＯＨを加えることによりｐＨ装置（ラジオメーター、コペンハーゲン、デンマーク（Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、　Ｄｅｎｍａｒｋｌ）の中でｐＨ１０，７±０．１単位に維持する。ＣＮＢｒは、２０分の間隔で二つの等しい部分中に細かく分離した粉末として加え、二番目の部分は、反応混合物のｐＨが１０６７に安定するまで反応させておき；そして、ｐＨは９．０に調整し、混合物は２時間４℃の水道水で透析する。ＬＭのＮａＯＨを用いて、ｐＨを９．０に戻し、ｐＨ７，３の０．１Ｍ１７）トリス塩酸緩衝剤中の１ｍ１Ｗ素溶液（１２６５Ｕ；　２．３ｍｇ）を加える。混合物は、過剰の反応部位を閉塞するために０．２５ｇのグリシンを加えた後に、４℃で一夜にわたって反応させる。混合物をさらに３０分間撹拌し、ＰＭＩＯ超ろ過膜（Ａａｉｃｏｎ、５ｔｏｎｅｈｏｕｓｅ、ＵＫ）を用いて２０２型濃縮器の中で４０ｍ１の容量に濃縮する。混合物（４０ｍｌ）は、４．４Ｍ８７ｃｍのカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉｉ、　Ｕｐｐｓａｌａ、　Ｓｗｅｄｅｎ）中、Ｇ１５０セフアデツクス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）の１．３リツトル床容量上でクロマトグラフィーを行い、ｐＨ７，０，０，０５Ｍのリン酸カリウム緩衝剤を用いて溶離する。その画分（１０ｍｌ）を集め、酵素活性のために検査する。また、炭水化物の含量は、ｏ−ｔｏｏμｇ／ｍｌ（セファデックスは登録商標）の範囲を標準として、デキストラン７０を用いてフェノール硫酸法（Ｍ、　Ｄｕｂｏｉｓら（１９５６）＾ｎａｌｙｔ、　Ｃｈｅｗ、　２８．３５０）によって定量する。

ピーク画分を保留し、前述したように１０−１２の容量に濃縮する。酵素活性と炭水化物の含量とが定量され、蛋白質含量は、ｏ−ｔｏｏμｇ、／ｍｌの範囲を標準としてウシ血清アルブミン断片Ｖを用いるクーマツシブルー（Ｃｏｏ＠ａｓｓｉｅ　ｂｌｕｅ　＠ｅｔｈａｄ）法（に、に、Ｂｒａｄｆａｒｄ（１９７６１Ａｎａｌｙｔ−Ｂｉａｃｈｅ＋＋、　７２．２４８）により測定される。濃縮物質は、フィルター滅菌しくミリボア（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅどＭｉｌｌｅｘＧＳ″ ″。

０．２２μｍの孔径）、−２０℃で保存する＊　Ｍａｌｌｅｔ　ＧＳは登録商標〒ある。

抗体−カルボキシペプチダーゼへ接合体は、ネズミ起源の抗体とウシ起源の酵素とを有するならば免疫原性である。同様に、カルボキシペプチダーゼＧ２巨大分子接合体もまた、ＣＰＧ２か細菌性起源であることより免疫原性である。それゆえその免疫原性を減じ、または免疫抑制又は免疫耐性を導入する手段を用（するのが望ましい。

２　方法外来性蛋白質に対する宿主応答に打ち勝つことができる成分の投与は、成分１の投与の４８時間前に開始する。！ｊ１初の試験は、蛋白質成分の如何なるものに対しても！！者による異常反応をできる限り排除することで達成される。抗体− ＣＰＡ接合体は、静脈内、望ましくは遅い注入により、典型的には２時間以上で与えられる。抗体−ＣＰＡ接合体の最大腫ａｍ度は数時間後に達成されるが、この時間では血漿中ＣＰＡ活性が依然高レベルにある。薬剤前駆体の投与の可能な限り前に、この活性を排除するのが望ましい、この排除過程は、増長されたクリアランス又は非腫瘍部位からのＣＰＡの不活性化を達成可能な成分の投与によって達成される。この成分は、数時間、典型的には６−２４時間、又は＋１！素がもはや血漿中に検出されなくなるまで、静脈内に投与され、そして、薬剤前駆体の投与期間を通して低濃度で注入して良い、この時間中、細胞外の液体の中のＦｉＩＩＡは、醇累の血漿中のレベルが下降するように、血漿中に散り戻る。血漿からの酵素活性の試験は、血ＭＣＰＡ活性が検出不可能であることを保証するため、典型的には８−２４時間の期間で続けられる。もし必要であればＣＰＡ活性を除去する上記成分以外のものが与えられる。クリアランスを増加させる相互的な方法は既述されている。

そして、投与する成分３は、一連の塊注入（ｂｏｌｕｓ　１ｎｊｅｃｔｉｏｎｓ）によるか、緩速注入のいずれかで開始される。

成分２と３とは同時的に開始されることが望ましい（例えば、薬剤前駆体と不活性化合物）。

薬剤前駆体は、一連の塊注入としてか、又は連続注入により与えられる。成分２と３との投与は通常的４−７日続くが、成分ｌの特別な実施態様では、多少長い期間腫瘍部位で酵素活性が十分に持続することを保証する。

成分の投与倹約７−１０日で、膿瘍部位で酵素活性を再検８１するのが望ましい。外来の蛋白質への宿主応答に打ち勝つことのできる成分の投与は継続され、成分２は中止し、成分３は中止して良い。

成分１は予め再注入し、予め血漿ＣＰ　Ａ活性を排除する成分によって継続される。上述した同様の手順が、成分２の再開前に継続される。

そのサイクルは繰り返して良い、制限因子は、アラニンメトトレキセート又は使用される外来蛋白質のいずれかに対する宿主抗体の発育に対し毒性となる。

３、キナゾリン　ｕｉｎａｚｏｌｉｎｅ　ａｎｔｉｆｏｌａｔｅｓ　の実施例１と２に開示された同様のシステムは、既述（Ｊｏｎｅｓ他（＋９８６）Ｊ、　Ｍａｄ。

Ｃｈｅｗ、　２９．４６８−４７２；　Ｊｏｄｒｅｌｌ他（１９９１）Ｂｒｉｔ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ　６４．８３３−８；　Ｈａｒｒａ髄■i １９８９）＾ｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　ｅｒ＋ｚｙｍｅ　ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　２９．　＋６１；　Ｊａｃｋｍａｎ他（１９９＋１＾ｄｖａ獅モ■刀@Ｅｎｚｙｍｅ　Ｒｅｇｕｌａｔ、３１．　＋３；　Ｊｏｄｒｅｌｌ　他（１９９０）Ｐｒｏｅ、Ａｊ　ＡＳ３０Ｃ，Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、３１．@３４１）の一連のキナゾリン抗葉酸の少なくともいくつかに使用され得る。これらの栗では、例えばＮＩＯの位置とベンゾイル環の中の置換に関して自然の葉酸とメトトレキセートとが異なるが、自然の葉酸のようなものとメトトレキセートとは、ベンゾイル環に結合する末端グルタミン酸部分を持つ、それ故、このシリーズの薬の少なくともいくつかは、グルタミン酸のα位置のアラニンのように、ペプチド置換により不活性化され、そして、このようなアラニン又は他のペプチド置換訝導体がクフナー（Ｋｕｅｆｎｅｒ）等の引用文献中又はその分野で既知の種々のものにより述べられている系統的分類法を用いて合成されるように、ペプチド結合換により不活性化される。同様に、このようなキナゾリン抗葉酸は、脱グルタミン酸され（ｄｅｇＩｕｔａｓａｔｅｄ）　、その結果、カルボキシペプチダーゼＧ２又は同様の酵素により不活性化される。これらの化合物は、これらがチミジル酸シンセターゼの阻害により作用するため、特に有効である。このような栗の化学的な適用は、カルボキシペプチダーゼＡによる活性な化合物とカルボキシペプチダーゼＧ２により減じられた血漿中の活性な薬剤とに転化された薬剤前駆体の形で投与されることにより大きく広がるであろう。

施例４　活性　剤と　剤献駆体とを区別するへ体の生産薬剤前駆体（Ｉ）でないが活性な薬（ＩＩ）を認識する抗体を生成するため、化合物は、二つの分子（Ｉ）と（ＩＩ）　（図３）の間の大きな分岐の領域を描写して合成される。この領域は、安息香酸マスタード某（Ｈ）の酸の部分に相当する。

安息香酸は、それ自身免疫原性が十分に大きくないため、Ｉｉ！領域のために特異な抗体を生ずる最も効果的な方法は、キーホールリンベットヘモシアニン（Ｋｅｙｈｏｌｅ　Ｌｉｍｐｅｔ　１ｌａｅｓｏｃｉａｎｉｎ；　Ｋ　Ｌ　Ｈ）に予め接合されている安息香酸類似物を持つ動物に接種することが考えられる。化合物は、アミノ安息香酸（Ｖｌｌ）に結合するアミドを通して結合するしリジンアミノ酸から成るものが合成される。そして、（／１１１１）は、特異な免疫原（Ｖｌｌ＋）を生成する、分子のリジン部分にε−ＮＨ２基を用いる従来の方法により、ＫＬＨに接合される。

上エエＵ［立且ｋＮαＮε−ジーｔｅｒｔ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジン（Ｉｖ）は、そのジシクロヘキシルアンモニウム塩（ＩＩＩ）がら遊離させた。概略的には、（ＩＩＩ）　（４１鳳ｏ１）を、酢酸エチル（１００ｍｌ）中に！！濁し、そして、冷クエン酸（１０％）で洗浄した。その有機に層を分離し、硫酸ナトリウムで乾燥し、乾燥揮発した（ＩＶ）　、白色ゴム状、収率１００％、ＮＭＲ（Ｍｅ２ＳＯ−６６）６１．４（ｂｄ、ｓ、　２２Ｈ１、１，６（ｍ、　２８）、　２．９　（ｄ、２Ｈ１３，８（ｓ、　１）ｌ）、　６．７（ｓ、１８１．７．０（ｄ、ＩＨｌ。

１２工■Ｌ血困ｌ化合物（ＩＶ）は、ペプチド結合の文献方法（（１９８９１Ｊ、　Ｍｅｄ、　Ｃｈｅｗ、　３１．１６３）の変法により４−アミノベンゾイルｔｅｒｔ−ブチルエステル（Ｖ）に結合させた。

（ＴＶ＞　（２ａｓｏｌ）と、−２０℃に冷却したＴＨＦ　（２ｍｌ）中のＮ− メチルモルホリン（２ｍｍｏｌ）と＋７１Ｉｔ袢溶液に、イソブチルクロロホルム（ｉｇｏｂｕｔｙｌ　ｅｈｌｏｒｏｆｏｒｎａｔｅ）　（２＋１ｎｏｌ　）を加えた。１０分後、Ｎメチルモルホリン（２ｍｍｏｌ）を含むＴＨＦ（２ｍｉ）中の（Ｖ）　（２ｍｍｏｌ）の懸濁液を加えた。撹拌は一２０℃で１０分間継続し、そして、混合物を室温に加温した。Ｎ−メチルモルホリン塩酸塩を濾過し、その瀘Ａ？ｌｉを蒸発乾固した。得られた粗混合物はシリカゲル上で二度のクロマトグラフィーを行い、オレンジ油（Ｖりのような新規な純粋な生産物を得た。

収率４％、ＮＭＲ（Ｍｅ２ＳＯ−６６）δ１．３６（ｓ、９Ｈ）、　１．３８（ｓ、ｌ３Ｈ１，１，５４（ｓ、９Ｈ）、１．６１＋＝、２Ｈ）、２．９０（ｄ、２Ｈ）、４．０２（＋＋、１）１）、６．７３（１，１１１１，７，０Ｏ（ｄ、１）１）、７D７１（ｄ、２Ｈ）、７．８５（ｄ、２Ｈ）、Ｉｏ、２２（ｓ、ｌＨｌ、質量スペクトルｍ／ｚ　５２１　（Ｍ）　−１−工■ＵＪυ」」化合物（Ｖｌ）　（０、１ｍ１ＩＩａｌ）の脱係ａｌｌ　（ｄｅｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）は、ＴＦＡ　（２ｍＬ）中の；濁液により行った。４０分後、溶液を蒸発乾固し、白色固体のような新規生成物（ｎｌ）を得た。収率１００％、ＮＭＲ（Ｍｅ２ＳＯ−６６）δ１．４０（ｍ、２Ｈ１，１，５５ｆｓ、２）１１．１．８２（＋＋、２Ｈ１，２，７６（ｍ、２）！１．３．９７（−、ＩＨ）、７．６５（ｂｄ、ｓ、２Ｈ）、７．７R（ｄ、２１１１．７．９７（ｄ、２）１１．８．２７（ｂｄ、ｓ、２Ｈ１，１０，７５（ｓ、］Ｈ１−質量スベ質量用ベクトル）ｍ／ｚ２６５（ＣＭ十Ｈ＋］　）　。

１２工■旦り旦！■ キーホールリンベットヘモシアニン（ＫＬＨ）への化合物（Ｖｌｌ）のカップリングは、ハンコックとエパン（ｌｌａｎｃｏｃｋ　ａｎｄ　Ｅｖａｎ）　（（＋９９２）Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙｌｏ、２３）の文献の方法の変法により行った。概略的には、（Ｖｌｌ）が、ＫＬＨ（Ｉｉｌに対して等重量）に加えられ、その混合物は、重炭酸ナトリウムとグルタルアルデヒドで、それぞれ０．１間と０．０５％の最終濃度に調整された。その混合物は、０．１Ｍの最終濃度にグリシンエチルエステルを加える前に、２４時間撹拌した。その反応混合物は、冷アセトン（３６ｍｌ）を添加する前に３０分間放置した。さらに３０分後、沈殿した接合体を遠心分離し、その上清を除去し、ベレットを空気乾燥して桃色の固体を生じた。接合体は、接種の前、−２０℃で保存した。

５、のた　の　Ｖｌｌ１　の接合体は、１ｍｇ／ｍｌの最終濃度に塩水（０，９％）中に懸濁した。そして、懸濁液は、接種の前、フロインドアジュバント（完全又は未完全）中に乳化した。

ポリクローナルとモノクローナル抗体は、当該技術分野で周知の方法を用いる接合で培養した。

モノクローナル抗体の場合は、通常の条件下で培養したハイプリドーマ細胞のクローンからの上清は、薬剤前駆体への結合とそれの細胞毒性訝尋のために試験をした。殆どのクローンは、某前駆体と活性な東の両方とに反応した。二つのクローンからの上清は、活性な栗にだけに結合した。

５　：ＡＤＨＰＴのＡＤＥＰＴ概念は、腫瘍部位で不活性な前駆物質から細胞毒性の薬剤を生じる抗体−酵素接合体を使用する０本発明は、ＡＤＨＰＴに関連して用いられる。活性薬剤は、ＡＤＨＰＴ抗体−酵素接合体を用いる腫瘍部位に生じる。血液区画に入るなんらかの活性な薬は、制止部分に結合する不活性化薬剤を用いる血液から精製される。

ＡＤＨＰＴ処理の場合、ヒトの絨毛癌部位（ＣＣ３）を培養したヌードマウスは、抗ＨＣＧ　（１１０８８７０７３７８に開示されたＷ１４Ｆａｂ２）に接合するＣＰＧ２の２９のユニットを受け取り、２４又は４８時間後、某前駆体（４１ μＭ／ｋｇ）を受けた。不活性化抗体の量は、最適の保護効果を与えるように調整される。

６：　に　して　１　るモノクローナル　の精製ＣＥＡは、結腸腫瘍の転移から調製された。６μ０１μｇ−１の特異な活性に対する放射性ヨウ素化は、ヨードゲン（ｉｏｄｏｇｅｎ）方法により行われた。希釈用緩衝液は、０，１％のウシ血清アルブミンを含む、ｐＨ７，４の０．１５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液として調製した。低イオン強度での研究は、ｐＨ７，４，０゜０２Ｍのトリス−ＨＣｌａ衝液中で行われた。

免疫のスケジュール：　モノクローナル抗体Ａ３Ｂ７は、精製に対して生じ、熱処理ＣＥＡは次の手順を用いた。ｇ４製されたＣＥＡの１ミリグラムは、１■ｇｖｓ１−１の濃度で、０．０５Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７）中、３５分間、８５ ℃に加熱した。１０％の硫酸アルミニウムカリウム（ａｌｕｌｌ）の水溶液１ｍｌを混合した後、ｐＨは、ＮａＯＨ溶液の滴下により、絶えず撹拌して６．５− ７に調製した。３０分間室温で撹拌した後、生じた沈殿物は、３回塩水で洗浄した。そして、正式な百日咳１１！ｌ（ウェルカムリサーチ研究所の好意で供給された）を１０１０と混合した。３つの異なった免疫スケジュールが使用された。

免疫化マウスからの牌臓細胞は、ＳＰ２１０−Ａｇ１４またはＰ３−ＮＳ／１− Ａｇ４−１骨髄ｖａｍ胞（フロー研究所、ＵＫ）のいずれか一方と、単一細胞転換によってクローン化された抗ＣＥＡを生じるハイブリドーマと融合した。

寒轟　７：ＡＢのＦ　ａｂ′　う　−のこの研究で使用したモノクローナル抗ＣＥＡ　（Ａ５Ｂ？）は、前述されかつＮＣＡとの低い交差反応と、免疫精製（ｉｍａｕｎｏｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）と放射性同位元素標識の安定性のために選択された＋Ｆ　（ａｂ’　）２断片は、ラモイ（Ｌａｍｏｙｉ）と二〜ノノフ（Ｎｉｓｏｎｏｆｆ）　（１９８３）Ｊ、　ｌ＋ｎ＋ａｕｎｏ１．　Ｍｅｔｈｏｄｓ　５６．２３５−２４３の方法によりｌｌ＋製した。セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）　Ｓ　２００の消化混合物を分離した後、その画分を、７．５％のゲルを用いた５ＤＳ−ＰＡ、ＧＥにより分析した。Ｆ　（ａｂ’　）２を含む画分を濃縮し、ｐＨ７の０．１５Ｍのリン酸緩衝液で透析した。完全なＡ３Ｂ７と該断片の両方は、免疫学的な活性と、ニトロセルロース紙を載せ＋２５Ｉ標識ＣＥＡを被せたＳＤＳゲルのエレク（ｆｆ）プロッティング（ａｌｅｃｔｒｏｂｌｏｔｔｉｎｇ）により相対的な均質性とを示した。完全なＡ３Ｂ７とそのＦ（ａｂ’）２断片は、それぞれ５．６と５．２μＣｉ／μｇの特異な活性剤へのクロラミンＴ法により、放射性標識化した。共に標識された調製品は、アミノセルロースに結合したＣＥＡを用いて固相ラジオイムノアッセイ（Ｒｏｇｅｒｓ他（１９８３）Ｅａｒ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｃ１１ｎ、　Ｏｎｃ。

１、１９．６２９−６３９１により免疫学的な活性を保有することが示された。

６０％活性の過剰分をそれぞれの場合で保留した。

８：　カルボキシペプチダーゼＡに　して　のモノクローナル　の１醒カルボキシペプチダーゼに対して産生されるモノクローナル抗体は、二重特異的（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体（次の実施例を参照）を製造するため、及び、非腫瘍部位における残留酵素活性のクリアランス及び不活性化のために使用される。

そのモノクローナル抗体は次の方法で作製した。Ｂａ１ｂ／Ｃネズミ（６−８週齢）は、完全フロイント助剤中の腹腔内５０μｇＣＰＡで免疫化し、引続き、１ケ月間隔をおいて、完全フロイント助剤中のＣＰＡ　（各腹腔内に５０ＭｇＣＰＡ）を注入し、融合の二日前に１日に二重の注入（ＰＢＳ、静脈中５０μｇと１００μｇ）した。免疫性の牌臓細胞は、コフラー（Ｋｏｈｌｅｒ）とミルシュタイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）　（１９７５）のハイブリドーマ法に従って５Ｐ２１０骨髄腫細胞を分泌する非免疫グロブリンに融合した。

抗ＣＰＡ抗体の存在は、固相間接放射線免疫検定法によって検出した。０．０５Ｍリンリン酸緩衝喰中μｇｍｌ−１のＣＰＡ溶液は、ポリビニルのマイクロタイタープレートｆ−ｉｃｒｏｔｉｔｒｅ　ｐｌａｔｅｓｌ上に配しく各ウェル（ｗｅｌｌ）に１０１００ｎ、乾燥し、メタノールで固定し、０．０５％ツイーンと０．１％のウシ血清アルブミンを含むＰＢＳ＆Ｉ衝液で洗浄した。上清または精製された抗体サンプルは、ＰＢＳ中で希釈し、３７℃で４時間、ＣＰＡ被覆したマイクロタイタープレート（各ウェル毎に１００μｍ）で培養し、そして、１２５工で識別されたウサギの抗ネズミＩｇ’Ｇで１時間培養した。ウェルは、各段階間でＰＢＳ−ツイーン緩衝液でミロ洗浄し、最後の洗浄が終わった後、個々のウェルを切り離し、ガンマカウンターで計数した。

９：ＣＰＡ　ＴＪＣＥＡに　Ｌ　、の二ｌ　ｆｆＡ３Ｂ７を生産するハイブリドーマ、ＣＥＡに対し反応性のモノクローナル抗体は、バーウッド（Ｈａｒｗｏｏｄ）ら（１９８６）　Ｂｒ１ｔ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ　５４．７５−８２に開示されており、ハイブリドーマ、ＣＰＡに対し反応性のモノクローナル抗体の製造方法は、実施例８に開示されている。

その融合のプロトコール（ｐｒｏｔｏｃｏｌ　）は、任意の二つの抗体生産ハイブリドーマを融合させることができ、それは既に開示されている（Ｃ１ａｒｋ　＆　１ｌａｌｄａａｎｎ　（＋９８７）　Ｊ、Ｎａｔｌ、Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔ、７９．＋３９３−１４０１）　、概略的には、ヒポキサンホスホリボシルトランスフェラーゼ陰性の変異体の選択によって、予めレンダードヒボキサンチン／アミノプテリン／チミジン（ＨＡＴ）感応性とされた、ある腸管外ハイブリドーマの５　Ｘ　ｌ　０６から３．５ｘ１０７の細胞は、５０％（重Ｉ／容量）のポリエチレングリコール溶液１　ｍ　ｌを用い、致死量の１０ｍＭヨードアセトアミドで前処理された第２の腸管外ハイブリドーマ細胞と、１１．１またはｌＯ：１の比で融合される。過剰のポリエチレングリコールは洗い落とし、細胞は、２４ウエルプレート中で、ミリリットル当たり５ｘｉｏｓからミリリットル当たり２×１０５の濃度で、５％（容量／容Ｉ）のウシ胎児血清を追加した重炭酸塩緩衝の、イスコブの変形したダルベツコの媒体（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ　＋＊ｏｄｉｆｉｅｄ　Ｄｕｌｂｅｅｃｏｏｓ　ｍｅｄｉｕｍ）（ＩＭＤＭ）中で培養した。

２４時間培養後、ハイブリッド・ハイブリドーマを、ＨＡＴ含有媒体中で選択した。

１０°　部”における　、のＭ癌部位ではなく、非腫瘍部位での酵素−抗体複合体の酵素部分を不活性化するのが望ましい、この効果を達成する一つの方法は、ガラクトース残基と複合した酵素部分に対して生じる本発明の抗体の化合物を用いて処理されている患者に投与することである。

ＣＰＡに指向されたモノクローナル抗体は、酵素を不活性化する。ｍ癌部位で抗体が酵素を不活性化することを阻害するため、付加的なガラクトース残基がそれと複合され、よってそれが静脈内紅路により与えらたとき、それはまだ血漿中のＷＩ素を不活性化できる、しかし、その不活性化抗体は、血漿及び肝細胞上のガラクトースレセプターとから即座に取り除かれる。

ガラクトシル化された抗ＣＰＡモノクローナル抗体は、血漿中の酵素活性を除去するために、そして、他の非組織中の残存酵素活性を不活性化するための量の非ガラクトシル化抗ＣＰＡモノクローナル抗体を与えるために与えられる。

モノクローナル抗体は、次のプロトコールを用いてガラクトシル化きれる。活性化された誘導体の貯蔵溶液が、次のように調整される。無水メタノール（１０ｍｌ）中のシアノメチル２，３，４．６−チトラーＯ−アセチルー１−千オーβ− Ｄ−ガラクトピラノシド（シグマＣ−４１４１）［４００ｍｇ１は、４８時間室温で無水メタノール１ｍｌ中の５．４ｍｇのナトリウムメトキシドで処理される。その混合物は、わずかにグリースを塗ったストッパーを嵌合した２５ｍ１のクイックフィツト三角フラスコに保持される。

モノクローナル抗体（１，３ｍｇ／ｍｌ）の貯蔵溶液は、０．２５Ｍのホウ酸ナトリウム緩衝液、ｐ’Ｈ８，５中で調整した。必要とされる量の活性化されたガラクトシル誘導体の部分量（８０，４０，２０，１０μｍ）を、３ｍｌの刀ラスアンプルに調剤し、窒素気流中でガラス性の残留物になるまで蒸発した。抗体（２００μｇ）の溶液を、その残留物が溶解するまで添加し混合した。室温で２時間後、溶液を３種のＰＢＳで透析した。

この調整は、上述した容量の倍数を取ることによってスケール・アップすることができる。

奎３−（献１、　Ｂａｇｓｈａｖｅ　（＋９８７）　Ｂｒ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ　５６．５３１−２；　（１９８９）　６０．２７５−２８１゜２、　Ｍ、Ｍ、Ｂｒａｄｆｏｒｄ　（１９７５）Ａｎａｌｙｔ、　Ｂｉｏｃｈｅ＋ｓ、　７２．２４８゜３、Ｃｏｒｖａｌａｎ　ら　（１９８７）　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｍ＋ｏｕｎｏ１．　Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ、２４．　１２７−１３２．　１３R−１３７及び１３８−１４３゜４、　Ｍ、Ｄｕｂｏｉｓら（１９５６）　Ａｎａｌｙｔ、　Ｃｈｅｗ、　２８．３５０゜５、　Ｊ、Ｇ、Ｒ，Ｈｕｒｒｅｌｌ　（ＣＲＣＰｒｅｓｓ、　＋９８２）　’モノクローナルハイプリドーマ抗体：技術と応用（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ｈｙｂｒｉｄｏｓ＋ａ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ａｎｄ、Ａｐｐｌｉｃａｔｉ盾獅唐■ 」６．Ｋｕｅｆｎｅｒら（１９８９）　Ｂｉｏｃｈｅｓ＋１Ｓｔｒｙ　２８．２２８８−２２９７゜７、０’５ｕ１１ｉｖａｎら（１９７９）＾ｎａ１．　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１００．１００−１０８゜８、　Ｒ，Ｚｏｌａ　（ＣＲＣＰｒｅｓｓ、　１９８８）　’モノクローナル抗体：技術の手引（Ｍａｎｏｃｌｏｎａｌ＾ｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：　Ａ　ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）」９、Ｍｅｌｔｏｎ　ら　（１９８７１Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｐｈａｒｍ、３６（１１，１０５−１１２゜１０、Ｍｅｌｔｏｎ　ら　（１９８７）Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｐｈａｒｍ、３６（１１，１１３−１２１゜＋１．　Ｋｏｈｌｅｒ　＆　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ　（１９７５）　Ｎａｔｕｒｅ　２５６．４９５゜１図１】フォリン酸１図２」【ｒｉ！Ｊ４１（不活性）補正器の翻訳文の提出書（特許法第１８４条の８）平成６年６月２７−

Claims

【特許請求の範囲】

１．化合物が管区画に投与されたときに、その化合物か宿主の管区画から離れることを少なくとも部分的に抑制できる部分と、細胞毒性薬剤を毒性の少ない基質に転化できる不活性化部分とを備えた化合物。
２．化合物が宿主の管区面から離れることを抑制できる部分が、巨大分子部分であることを特徴とする請求の範囲第１項記載の化合物。
３．巨大分子部分が、巨大グロブリン、リボソーム、デキストラン、または他の高分子量ポリマーであることを特徴とする請求の範囲第２項記載の化合物。
４．化合物が宿主の管区面から離れることを抑制できる部分が、赤血球であることを特徴とする請求の範囲第１項記載の化合物。
５．不活性化部分が、酵素的に活性な部分を含むことを特徴とする請求の範囲第１項から第４項のいずれかに記載の化合物。
６．不活性化部分が、細胞毒性試薬のメトトレキセートとアミノプテリンとを毒性の少ない基質に分解できるカルボキシペブチダーゼＧ２の、少なくとも触媒性部分を含むことを特徴とする請求の範囲第５項記載の化合物。
７．不活性化部分が、細胞毒性のアルキル化試薬を毒性の少ない基質に不活性化できるグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼの、少なくとも触媒性部分を含むこヒを特徴とする請求の範囲第５項記載の化合物。
８．不活性化部分が、細胞毒性試薬に結合する抗体またはその一部を含むことを特徴とする請求の範囲第１項から第４項のいずれかに記載の化合物。
９．不活性化部分が、細胞毒性試薬に結合するチオールを含むことを特徴とする請求の範囲第１項から第４項のいずれかに記載の化合物。
１０．チオールが、グルタチオン、またはその類似化合物であることを特徴とする請求の範囲第９項記載の化合物。
１１．宿主の管区画内て細胞毒性試薬を少なくとも部分的に破壊する方法であって、請求の範囲第１項から第１０項のいずれかに従う化合物を宿主に投与することを備える上記の方法。
１２．標的細胞特異的部分と、細胞毒性の薬剤前駆体を細胞毒性薬剤こ転化できる醇素的に活性な部分とを含む第一の成分、前記醇素的に活性な部分によって、細胞毒性の薬剤前駆体を細胞毒性薬剤に転化できる第二の成分、及び、該化合物が管区画に投与されたときに、その成分が宿主の管区画から離れることを少なくとも部分的に抑制できる部分と、細胞毒性薬剤を毒性の少ない基質に転化できる不活性化部分とを含む第三の成分、とを具備したバーツの３成分キット。
１３．非標的細胞部位で上記第一の成分の酵素的に活性な部分を除去または不活性化する手段を更に備えたことを特徴とする請求の範囲第１２項記載のバーツのキット。
１４．標的細胞特異的部分が、抗体またはその一部を含むことを特徴とする請求の範囲第１２項と第１３項のいずれかに記載のバーツのキット。
１５．標的細胞特異的部分が、腫瘍細胞を認識しかつ選択的に結合することを特徴とする請求の範囲第１２項から第１４項のいずれかに記載のバーツのキット。
１６．第一の成分の酵素的に活性な部分か、カルボキシベブチダーセＡの少なくとも触媒性部分を含むことを特徴とする請求の範囲第１２項から第１５項のいずれかに記載のバーツのキット。
１７．薬剤が、メトトレキセートまたはアミノプテリンまたはキナゾリン抗薬酸であることを特徴とする請求の範囲第１６項記載のバーツのキット。
１８．第三の成分の不活性化部分が、カルボキシベブチダーゼＧ２の少なくとも触媒性部分であることを特徴とする請求の範囲第１７項記載のバーツのキット。
１９．薬剤が、アルキル化試薬であることを特徴とする請求の範囲第１２項から第１５項のいずれかに記載のバーツのキット。
２０．不活性化部分が、チオールであることを特徴とする請求の範囲第１９項記載のバーツのキット。
２１．不活性化部分が、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼの少なくとも触媒性部分であることを特徴とする請求の範囲第１９項記載のバーツのキット。
２２．第三の成分の抑制部分が、巨大グロブリン、リポソーム、高分子量ポリマー、または赤血球であることを特徴とする請求の範囲第１２項から第１８項のいずれかに記載のバーツのキット。
２３．各種の成分を宿主に投与することを含み、標的細胞を破壊する方法に使用する請求の範囲第１２項から第２２項のいずれかに記載のバーツのキット。
２４．宿主中の標的細胞を破壊する方法であって、（ｉ）請求の範囲第１２項から第１５項のいずれかに定義された第一の成分、（ｉｉ）請求の範囲第１２項、第１３項、第１７項及び第１９項のいずれかに定義された第二の成分、及び（ｉｉｉ）請求の範囲第１２項、第１３項、第１８項及び第２０項から第２２項のいずれかに定義された第三の成分を、宿主に投与することを備える上記の方法。
２５．各成分が、静脈内経路によって投与されることを特徴とする請求の範囲第２４項記載の方法。