JP2001510687A - 標的細胞の指向細胞溶解、細胞溶解を引き起こす薬剤および組成物、ならびにそのような薬剤を製造するために使用できる化合物 - Google Patents

標的細胞の指向細胞溶解、細胞溶解を引き起こす薬剤および組成物、ならびにそのような薬剤を製造するために使用できる化合物

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ランド，ペーテル
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カランド，テリエ
ドールステン，ミカエル
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フアーマシア・アンド・アツプジヨン・アー・ベー
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Abstract

(57)【要約】 免疫調節因子の存在下で２種類の細胞をスーパー抗原（ＳＡＧ）と接触させることによって、Ｔ細胞の存在下で標的細胞を不活性化するための方法は、少なくとも１つのスーパー抗原および免疫調節因子が、「遊離型」スーパー抗原（Ｓａｇ）と、標的細胞にコンジュゲートを標的化する部分とのコンジュゲートの形態であることを特徴とする。スーパー抗原コンジュゲートは、式（Ｉ）の（Ｔ）ｘ（Ｓａｇ）ｙ（ＩＭ）ｚを満たす：ただし、ａ）Ｔは標的化部分であり、Ｓａｇは遊離型スーパー抗原に対応し、ＩＭはスーパー抗原でない免疫調節因子であり、そしてＴ、ＳａｇおよびＩＭは有機リンカーＢを介してともに結合し；ｂ）ｘ、ｙおよびｚは、典型的には０〜１０の中から選択される整数であり、そしてそれぞれ、コンジュゲート分子におけるＴ、ＳａｇおよびＩＭの各部分の数を表し、そしてｙ＞０であり、そしてｘおよびｚの一方または両方は＞０である。スーパー抗原コンジュゲートは、好ましくは、三重融合タンパク質である。標的化される免疫調節因子は、それが、標的化部分（Ｔ’’’）と改変された免疫調節因子（ＩＭ’’’）とのコンジュゲートであることを特徴とする。このコンジュゲートは、改変された免疫調節因子の存在が必須であることを除いて、式（Ｉ）に類似する式を満たす。スーパー抗原部分は存在し得る。ＤＮＡ分子は、スーパー抗原および免疫調節因子をコードする。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （発明の分野） 本発明は、機能的なスーパー抗原によって活性化されたＴ細胞による標的細胞
の不活性化／細胞溶解に関する。細胞溶解は、治療およびインビトロアッセイに
適用することができる。
【０００２】 （定義） スーパー抗原。（１９８８年〜１９９３年頃の）ごく最初の定義では、スーパ
ー抗原は、細胞内プロセシングに先立つことなくＭＨＣクラスＩＩ抗原に結合し
得る細菌性タンパク質またはウイルス性タンパク質であり、そしてＴ細胞レセプ
ター（ＴＣＲ）のＶβ鎖可変領域（Ｖβ）に結合することによってＴ細胞を活性
化する。そのような結合は、比較的大きな割合／サブセットのＴ細胞のＶβファ
ミリーに限定的な活性化をもたらし、そしてＭＨＣクラスＩＩ発現細胞の溶解（
スーパー抗原依存性細胞によって媒介される細胞溶解＝ＳＤＣＣ）をもたらす。
通常、Ｔ細胞のスーパー抗原によって活性化される割合は、個体のＴ細胞総数の
約１％〜３０％である。
【０００３】 上記の定義によるよく知られている野生型スーパー抗原は、ブドウ球菌のエン
テロトキシン（ＳＥＡ、ＳＥＢ、ＳＥＣ１、ＳＥＣ２、ＳＥＤ、ＳＥＥおよびＳ
ＥＨ）である。さらなる例には、トキシックショック症候群トキシン１（ＴＳＳ
Ｔ−１、これもまたブドウ球菌起源である）、剥脱性毒素（ＥＸｆｔ）、連鎖球
菌の発熱性外毒素Ａ、ＢおよびＣ（ＳＰＥ Ａ、ＢおよびＣ）、マウス乳腫瘍ウ
イルスタンパク質（ＭＭＴＶ）、連鎖球菌Ｍタンパク質、クロストリジウム・パ
ーフリンゲンスのエンテロトキシン（ＣＰＥＴ）、マイコプラズマ関節炎スーパ
ー抗原などがある。スーパー抗原およびその性質の総説に関しては、Ｋｏｔｚｉ
ｎら（１９９３）を参照のこと。
【０００４】 野生型スーパー抗原およびキメラ状スーパー抗原もまた、低下したＭＨＣクラ
スＩＩ結合性および／またはＴＣＲＶβ結合性を有するように、あるいはそのよ
うな結合性を有さないように変異されている（Ｋａｐｐｌｅｒら、国際特許公開
ＷＯ９３１４２６４；Ｋａｐｐｌｅｒら、１９９３；Ｂｌａｎｃｏら；Ａｂｒａ
ｈｍｓｅｎら、国際特許公開ＷＯ９６０１６５０；Ａｎｔｏｎｓｓｏｎら、ＷＯ
９７３６９３２；Ａｎｔｏｎｓｓｏｎら、１９９７）。このようなタイプのスー
パー抗原は、毒性がいっそう低くなっている。スーパー抗原がＭＨＣクラスＩＩ
またはＴＣＲＶβに対する結合能を完全に失っている場合、スーパー抗原は、そ
のＴ細胞活性化能を失っているので、もはや機能的なスーパー抗原ではない。
【０００５】 構造が類似する野生型スーパー抗原を変異させることによって、機能的に活性
なキメラ状スーパー抗原（ハイブリッドスーパー抗原）を構築することができる
（Ｌａｍｐｈａｅｒら、１９９６；およびＡｎｔｏｎｓｓｏｎら、国際特許公開
ＷＯ９７３６９３２）。
【０００６】 野生型スーパー抗原を、細胞表面の構造体に結合し得る標的探知部分と結合さ
せた場合に、活性化およびその後の細胞溶解が、ＭＨＣクラスＩＩに依存しない
様式で生じ得ることが発見されている（Ｄｏｈｌｓｔｅｎら、国際特許公開ＷＯ
９２０１４７０）。この新規なエフェクターの機構は、スーパー抗原抗体依存性
細胞によって媒介される細胞溶解（＝ＳＡＤＣＣ）と呼ばれている。これには、
抗体以外の部分を標的化するための類似した機構が含まれる（Ａｂｒａｈｍｓｅ
ｎら、国際特許公開ＷＯ９６０１６５０；Ａｎｔｏｎｓｓｏｎら、国際特許公開
ＷＯ９７３６９３２）。
【０００７】 従って、スーパー抗原の今日の概念には、細胞内のプロセシングを伴うことな
く、細胞表面の構造体（標的構造体）および１つまたは複数の多型ＴＣＲ鎖（特
に、Ｖβ鎖）に結合し、それによって、結合に関与する特定のＴＣＲ鎖を発現す
るＴ細胞集団を活性化し得る任意の化合物（好ましくは、ポリペプチド構造体）
が含まれる。次いで、このＴ細胞は細胞傷害性になり、そしてそのような表面構
造体を有する細胞（標的構造体、標的細胞）に対するその細胞傷害性を導く。従
って、本発明に関連して使用されるスーパー抗原（ＳＡＧ）の定義は、別途示さ
れていない場合、標的化部分と、ＳＡＤＣＣに関して上記に記載されているよう
な遊離型スーパー抗原とのコンジュゲートを包含する。
【０００８】 スーパー抗原の用語には、別途示されていない場合、機能的なスーパー抗原の
みが包含される。
【０００９】 遊離型スーパー抗原（Ｓａｇ）は、変異または改変されていると考えられる野
生型のスーパー抗原であり、これは標的部分または免疫調節因子に結合していな
い。遊離型スーパー抗原のＭＨＣクラスＩＩ結合能は固有の標的化特性である。
遊離型スーパー抗原は、結合した標的化部分を有していないので、ＳＤＣＣ作用
を示すだけである。
【００１０】 結合型スーパー抗原は、遊離型スーパー抗原と標的化部分または免疫調節因子
とのコンジュゲートである。結合型スーパー抗原は、ＳＤＣＣ作用およびＳＡＤ
ＣＣ作用のいずれか一方またはその両方を示す。
【００１１】 免疫調節因子（ＩＭ）は、免疫系を調節し得る化合物である。本発明に関連し
て、スーパー抗原は別々に処理されるが、免疫調節因子の用語が使用されている
場合には含まれない。免疫調節因子は、多くの場合、対応するリンパ球レセプタ
ーなどに対する固有の標的化能を有する。別途示されていない限り、免疫調節因
子は非結合型形態である。
【００１２】 標的化部分（Ｔ）は、細胞表面の構造体および／または組織の構造体に結合し
得る部分である。
【００１３】 コンジュゲートは、互いに共有結合される２つ以上のＳａｇ、ＩＭ、Ｔなどの
部分から構成される。
【００１４】 活性成分の可溶型形態は、血清および血漿などの身体に由来する液体に可溶性
である形態を意味する。
【００１５】 （背景技術−スーパー抗原の治療的使用） 非結合型の野生型スーパー抗原および変異型スーパー抗原は、処置すべき疾患
に関連するクラスＩＩ発現細胞において局所的に、あるいは全身的な活性化とし
て、免疫系を活性化することによって達成されると考えられる治療作用による治
療法が提案されている（Ｋａｌｌａｎｄら、国際特許公開ＷＯ９１０４０５３；
Ｔｅｒｍａｎら、国際特許公開ＷＯ９１１０６８０および国際特許公開ＷＯ９３
２４１３６；Ａｎｔｏｎｓｓｏｎら、国際特許公開ＷＯ９７３６９３２；および
Ｎｅｗｅｌｌら、１９９１）。野生型スーパー抗原は毒性が非常に激しいために
、この方法は、癌の処置に関して、すべての癌の非常に少ない割合にしか適用す
ることができない。
【００１６】 標的探知部分に結合させたスーパー抗原を使用することもまた提案されている
（Ｄｏｈｌｓｔｅｎら、国際特許公開ＷＯ９２０１４７０；Ａｂｒａｈｍｓｅｎ
ら、国際特許公開ＷＯ９６０１６５０、Ａｎｔｏｎｓｓｏｎら、国際特許公開Ｗ
Ｏ９７３６９３２、およびＯｃｈｉら、１９９３）。３つの刊行物はすべて、参
照により本明細書に組込まれる。
【００１７】 Ｔ細胞が媒介する細胞傷害性活性のＩＬ−２によるインビボでのスーパー抗原
誘導のダウンレギュレーションの防止に関する研究に関連して、ＩＬ−２を未結
合型の野生型スーパー抗原および抗体結合型の野生型スーパー抗原と同時に投与
することは有益であり得ると考えられている（Ｂｅｌｆｒａｇｅ、学位論文、８
月／９月、１９９６；Ｂｅｌｆｒａｇｅら、１９９４；Ｂｅｌｆｒａｇｅら、１
９９５；Ｂｅｌｆｒａｇｅら、１９９７ａ；Ｂｅｌｆｒａｇｅら、１９９７ｂ（
野生型スーパー抗原））。
【００１８】 細胞膜に固定されたＣＤ８０は、ＭＨＣクラスＩＩ抗原の非存在下においてＴ
細胞のスーパー抗原による活性化における役割を有していることもまた提案され
ている（Ｌａｎｄｏら、１９９３および１９９６）。
【００１９】 Ｌａｎｄｏら（１９９６）の図４は、単独で抗体に結合させたスーパー抗原の
能力、およびヒトの休止Ｔ細胞の増殖を誘導するためにＩＬ−２と組み合わせて
抗体に結合させたスーパー抗原の能力を分析した実験を示している。この４日間
の実験において、結合型スーパー抗原を、元のＣＨＯ細胞と、クラスＩＩまたは
Ｃ２１５またはクラスＩＩ＋Ｃ２１５を発現するトランスフェクションＣＨＯ細
胞とで呈示させた。ＩＬ−２の作用はわずかであった。
【００２０】 Ｋａｐｐｌｅｒら（国際特許公開ＷＯ９３１４６３４）は、（ワクチンに関連
し、そしてスーパー抗原の毒性作用を中和するための薬剤として）ＶβまたはＭ
ＨＣクラスＩＩに対するその結合能を喪失させるように変異させた非結合型の野
生型ＳＥＢを提案している。Ａｂｒａｈｍｓｅｎら（国際特許公開ＷＯ９６０１
６５０）は、クラスＩＩ抗原に対する結合能を改変し、好ましくは低下させた結
合型スーパー抗原による癌治療を提案している。Ａｎｔｏｎｓｓｏｎら（国際特
許公開ＷＯ９７３６９３２）は、キメラ状スーパー抗原および血清反応性を低下
させたスーパー抗原による治療を提案している（Ａｂｒａｈｍｓｅｎらもまた参
照のこと）。Ａｂｒａｈｍｓｅｎら（国際特許公開ＷＯ９６０１６５０）および
Ａｎｔｏｎｓｓｏｎら（国際特許公開ＷＯ９７３６９３２）によって記載されて
いる変異体には、処置すべき哺乳動物において、全身性毒性を低下させ、免疫原
性を低下させ、および／または血清反応性を低下させたスーパー抗原が含まれる
。
【００２１】 野生型スーパー抗原をコードする核酸を投与することによる治療が提案されて
いる（Ｔｅｒｍａｎら、国際特許公開ＷＯ９１１０６８０；国際特許公開ＷＯ９
３２４１３６；およびＤｏｗら、国際特許公開ＷＯ９６３６３６６）。Ｄｏｗら
はさらに進め、そしてサイトカインまたはケモカインをコードする核酸を、スー
パー抗原をコードする核酸と同時に投与することを提案している。実験的な支持
は得られていないが、国際特許公開ＷＯ９６３６３６６はまた、二シストロン性
遺伝子構築体の形態の構築体を提案している：この二シストロン性遺伝子構築体
において、一方のシストロンは、スーパー抗原をコードする遺伝子を含有し、も
う一方のシストロンは、サイトカインまたはケモカインをコードする遺伝子を含
有する。
【００２２】 実験的な支持は得られていないが、Ｐｏｕｌｅｔｔｙ Ｐ（Ｓａｎｇｓｔａｔ
、欧州特許ＥＰ５１０９４９）は、ＩＬ−２などの標的化部分と野生型スーパー
抗原とのコンジュゲートは、ＩＬ−２レセプターを発現する細胞を不活性化する
ために有用であり得ると推測している。
【００２３】 （背景技術−不活性化され得る細胞に特異的な抗体と組み合わせた免疫調節
因子の治療的使用） 抗体を生物学的応答調節剤、例えば、ケモカインまたはサイトカイン（ＩＬ−
２など）と結合させることが以前に提案されている（Ｆｅｌｌら、欧州特許ＥＰ
４３９０９５；Ｒｏｓｅｎｂｌｕｍらの欧州特許３９６３８７、Ｐａｎｃｏｏｋ
ら、１９９６；およびＢｅｃｋｅｒら、１９９６）。
【００２４】 （本発明が解決しようとする問題） 本発明は、処置すべき哺乳動物において望ましくない標的細胞を不活性化する
ために、免疫系の活性化を含むスーパー抗原療法に関連する改善を提供しようと
するものである。特に、そのような改善は、１）最初の処置サイクル中の活性化
期間を局所的に、例えば、腫瘍において延長すること；２）活性化されたＴ細胞
はアネルギーに流出し易いことによる低応答性の発生に対抗すること；３）ＭＨ
ＣクラスＩＩに依存しないＴ細胞の腫瘍領域での活性化を容易にすること；およ
び４）スーパー抗原の活性化による細胞溶解の治療範囲を広げることに関する。
今回、これらの改善が、スーパー抗原（ＳＡＧ）の投与を可溶型形態の免疫調節
因子の投与と組み合わせた場合に、完全に、または部分的に達成され得ることが
発見された。この場合、少なくとも１つのスーパー抗原および免疫調節因子は、
不活性化され得る細胞に対する標的化特性を有する部分とのコンジュゲートの形
態である。
【００２５】 （本発明の第１の主要な態様：標的細胞の不活性化方法） 本発明の第１の態様は、治療およびインビトロアッセイの両方を包含し、そし
てスーパー抗原（Ｓａｇ）でない免疫調節因子（ＩＭ）の存在下において、２種
類の細胞をスーパー抗原（ＳＡＧ）と接触させることによって、特に、ＴＣＲＶ
βに対する結合によってＴ細胞を活性化するスーパー抗原と接触させることによ
って、望ましくない標的細胞をＴ細胞の存在下で不活性化するための方法である
。この方法は、その最も広い態様において、少なくとも１つのスーパー抗原と免
疫調節因子とが、不活性化され得る細胞に対する標的化特性を有する部分（Ｔ）
とのコンジュゲートの形態であることを特徴とする。その従属的な態様において
、本発明は下記の特徴を有する： ａ．スーパー抗原（ＳＡＧ）および免疫調節因子は、スーパー抗原（Ｓａｇ）
と、標的細胞に対する標的化部分（Ｔ）と、免疫調節因子（ＩＭ）とを含む三重
コンジュゲートの形態で使用されること（Ｔ、ＩＭ、Ｓａｇ−コンジュゲート）
、 ｂ．スーパー抗原（ＳＡＧ）は、スーパー抗原（Ｓａｇ）と標的細胞に対する
標的化部分（Ｔ）との二重コンジュゲートを、免疫調節因子（ＩＭ）と標的細胞
に対する標的化部分（Ｔ’）との二重コンジュゲートと組み合わせた形態で使用
されること（Ｔ、Ｓａｇ−コンジュゲート＋Ｔ’、ＩＭ−コ−コンジュゲート）
、 ｃ．スーパー抗原（ＳＡＧ）は、スーパー抗原（Ｓａｇ）と標的細胞に対する
標的化部分（Ｔ）との二重コンジュゲートの形態で使用され、そして免疫調節因
子（ＩＭ）は遊離型形態（すなわち、標的細胞に関する標的化部分に結合してい
ない形態）で使用されること（Ｔ、Ｓａｇ−コンジュゲート＋ＩＭ、； ｄ．スーパー抗原（ＳＡＧ）は遊離型形態（Ｓａｇ）で使用され、そして調節
因子は結合型形態（すなわち、免疫調節因子（ＩＭ）とスーパー抗原（Ｓａｇ）
との二重コンジュゲートの形態）で使用されること（Ｓａｇ＋Ｔ、ＩＭ−コンジ
ュゲート）、および ｅ．スーパー抗原（ＳＡＧ）および免疫調節因子は、スーパー抗原（Ｓａｇ）
と免疫調節因子（ＩＭ）との二重コンジュゲートの形態で使用されること（Ｓａ
ｇ、ＩＭ−コンジュゲート）。
【００２６】 スーパー抗原および免疫調節因子は、同じタイプの細胞に対して、例えば、同
一または交差反応する構造体／エピトープに対して、あるいは同じ組織内の異な
るタイプの細胞に対して標的化することができる。標的化は、正常な細胞に対し
て、あるいは１つの組織および同じ組織に関連する疾患細胞に対して行うことが
できる。スーパー抗原および免疫調節因子のいずれか一方またはその両方は、１
つまたは数個の抗体によって標的化され得る。
【００２７】 （本発明の方法によって処置され得る疾患） 処置され得る疾患は、特に、スーパー抗原に関して以前に提案されている疾患
と同じである。例えば、上記の「背景．．．」の表題部を参照のこと。例示的な
例には、癌、自己免疫疾患、寄生虫感染、ウイルス感染、ならびに細胞表面にお
いて、ＭＨＣクラスＩＩ抗原、および／または個々の疾患に特異的で、本発明の
概念（式Ｉ）に従ってスーパー抗原に組み込まれる標的探知部分に結合される他
の構造体を発現する細胞に関連する他の疾患である。細菌感染もまた、本発明を
使用することによって処置され得る。
【００２８】 本発明に関連する重要な癌の形態は、メラノーマ、カルシノーマ、造血系新形
成および繊維肉腫であり、そして扁平上皮癌、乳癌、頭部カルシノーマおよび頸
部カルシノーマ、甲状腺癌、軟組織癌、骨肉腫、精巣癌、前立腺癌、卵巣癌、膀
胱癌、皮膚癌、脳癌、血管肉腫（ａｎｇｉｏｓａｒｃｏｍａ、ｈｅｍａｎｇｉｏ
ｓａｒｃｏｍａ）、マスト細胞腫瘍、原発性肝癌、肺癌、頸部癌、腎細胞癌、白
血病およびリンパ腫などの特定の形態を含む。任意のタイプの悪性腫瘍または良
性腫瘍も、多薬物耐性癌、転移性癌、化学的に誘導されるかまたはウイルス（ヘ
ルペス、ＳＶ４０、ＨＩＶなど）によって誘導される様々な形態の癌と同様に含
まれる。
【００２９】 （本発明の第２の主要な態様：本発明のスーパー抗原コンジュゲート） 本発明のこの態様は、下記の式を満たすコンジュゲートを含む： （Ｔ）ｘ（Ｓａｇ）ｙ（ＩＭ）ｚ （式Ｉ） Ｔは標的化部分であり、Ｓａｇは遊離型スーパー抗原に対応し、そしてＩＭは
スーパー抗原でない免疫調節因子である。Ｔ、ＳａｇおよびＩＭは、１つまたは
同じコンジュゲート分子または物質において異なっていてもよく、あるいは同じ
であってもよい有機リンカーＢを介して結合される。式Ｉによるコンジュゲート
には、化学的なコンジュゲートならびに組換え産生のコンジュゲート（融合タン
パク質）が含まれる。ｘ、ｙおよびｚは、典型的には０〜１０の中から選択され
る整数（０〜５など）であり、それぞれ、コンジュゲート分子におけるＴ、Ｓａ
ｇおよびＩＭの数を表す：ただし、ｙ＞０であり、そしてｘおよびｚの一方また
は両方は＞０である。化学的なコンジュゲートは、通常、異なるコンジュゲート
分子の混合物を含有するコンジュゲート物質である。従って、化学的なコンジュ
ゲートにおいて、ｘ、ｙおよびｚはまた、０〜１０の範囲内の非整数であり、０
〜５などの範囲内の非整数であり得る。
【００３０】 式Ｉの第１の従属的な態様において、ＳａｇおよびＩＭおよびＴがコンジュゲ
ートに存在する（ｘおよびｙおよびｚは＞０である：Ｔ、Ｓａｇ、Ｍ−コンジュ
ゲート）。ｘ、ｙおよびｚは、典型的には１〜３の整数であり、好ましくは１〜
２の整数である。ｘ、ｙおよびｚの典型的な関係は、ｘ＝ｙ＝ｚ、ｘ＝ｙ＝０．
５ｚ、ｘ＝０．５ｙ＝０．５ｚ、およびｚ＝０．５ｙ＝ｚである。
【００３１】 式Ｉによる第２の従属的な態様において、標的化部分は存在しない（ＩＭ／Ｓ
ａｇ−コンジュゲート、ｘ＝０）。ｙおよびｚは、典型的には、１〜３の整数で
ある。ｘおよびｙの好ましい関係は、ｘ＝ｙ、ｘ＝０．５ｙ、０．５ｘ＝ｙ、ｘ
＝１／３ｙ、および１／３ｘ＝ｙである。
【００３２】 両方の従属的な態様において、整数または関係は、主として、標的化部分が、
１個、２個、３個または４個のポリペプチド鎖を含有するタンパク質であり得る
融合タンパク質で、それぞれのコンジュゲート分子において１個のＴが存在する
融合タンパク質に関する。
【００３３】 第２の従属的な態様によるコンジュゲートに関する式Ｉは下記のようになる：
（Ｓａｇ）ｙ（ＩＭ）ｚ （式ＩＩ） このタイプのコンジュゲートは、ＭＨＣクラスＩＩ抗原を発現する細胞に関連す
る疾患、特に、造血系の癌などのＭＨＣクラスＩＩを発現する癌、およびいくつ
かの自己免疫疾患、ウイルス感染、および寄生虫感染の処置に主に適合化される
が、免疫調節因子に対する細胞膜固定型レセプターに関連する疾患、例えば、Ｉ
Ｌ−２レセプターを発現する、例えば、Ｔ細胞リンパ腫についても適合化される
。
【００３４】 （Ａ．式Ｉにおける免疫調節因子） ＩＭは、遊離型または結合型のスーパー抗原でない免疫調節因子を意味する。
【００３５】 免疫調節因子は、サイトカインまたはケモカインであり得る。例示的なサイト
カインは、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死
因子αおよび腫瘍壊死因子β（ＴＮＦαおよびＴＮＦβ）、マクロファージコロ
ニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、ＩＬ−１、ＩＬ
−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、
およびＩＧＦである。例示的なケモカインは、Ｃ５ａ、ＩＬ−８、単球走化性タ
ンパク質１α（ＭＩＰ１α）または単球走化性タンパク質１β（ＭＩＰ１β）、
単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ−１）、単球走化性タンパク質２（ＭＣＰ−２
）、単球走化性タンパク質３（ＭＣＰ−３）、血小板活性化因子（ＰＡＦＲ）、
Ｎ−ホルミル−メチオニル−ロイシル−フェニルアラニン（ＦＭＬＰＲ）、ロイ
コトリエンＢ４（ＬＴＢ４Ｒ）、ガストリン放出ペプチド（ＧＲＰ）、ＲＥＮＴ
ＥＳ、エオタキシン、リンホタクチン、ＩＰ１０、Ｉ−３０９、ＥＮＡ７８、Ｇ
ＣＰ−２、ＮＡＰ−２、ＭＧＳＡ／ｇｒｏ、ＤＣ−ＣＫ１、Ｆｌｔ３Ｌ（異所性
ドメイン）、フラクタルキン、ＰＦ−４などである。
【００３６】 別のタイプの免疫調節因子は、同時刺激などの開始される免疫応答の調節に関
与している細胞膜固定型レセプター／リガンド対（例えば、リンパ球表面に結合
したレセプターおよび対応する細胞結合リガンド）に由来する因子である。例示
的な例は、ＣＤ４０Ｌ／ＣＤ４０、４−ＢＢ１／４−ＢＢ１Ｌ、ＣＤ２８／Ｂ７
、ＣＴＬＡ−４／Ｂ７などから選択されるものである。Ｂ７には、ＣＤ８０およ
びＣＤ８６などの変種が含まれるが、好ましくはＣＤ８０である。好ましい形態
は可溶性であり、細胞外部分（異所性ドメイン）を含有し、そして細胞内部分お
よび膜結合部分を有していない。
【００３７】 特に好ましい免疫調節因子は、例えば、スーパー抗原で活性化されたＴ細胞の
アネルギーへの流出に対抗することによって、インビボでスーパー抗原の作用を
増強し得る。典型的で適切な細胞結合型レセプター／リガンドは、上記に示され
ているような類似体およびフラグメントを含むＣＤ２８／Ｂ７である。このグル
ープの典型的なサイトカインは、ＣＤ２８／Ｂ７シグナル変換の主要な下流エフ
ェクターであるＩＬ−２、およびＩＬ−２様サイトカインのＩＬ−７およびＩＬ
−１５である。Ｔ細胞表面結合型レセプター／リガンド対の中で、活性化され得
るＴ細胞に結合しないものが、本発明によるコンジュゲートに組み込まれるため
には好ましい。ＣＤ４０Ｌ／ＣＤ４０、４−ＢＢ１／４−ＢＢ１ＬおよびＣＤ２
８／Ｂ７に関して、これは、可溶型形態のＣＤ４０、４−ＢＢ１ＬおよびＢ７を
意味し、好ましくは上記に示されている通りである。本明細書の実験の部には、
優先権主張日において、本発明において最適であることが見出された免疫調節因
子の変種が例示されている。
【００３８】 免疫調節因子は、好ましくは、処置され得る個体と同じ種起源であり得る。サ
イトカインおよびケモカインなどの天然の免疫調節因子は、多くの場合、哺乳動
物において、大きな全身毒性および比較的短い半減期を示す。文献は、免疫調節
因子を改変して、酸化に対する安定性を増大させ、インビボでの半減期を長くし
、毒性を低くし、組換え技術によって産生されるときの折り畳みを改善する方法
などに関して多岐にわたっている。例えば、米国特許第５，２２９，１０９号（
Ｇｒｉｍｍら）は、レセプターのｐ５５αサブユニットに対する結合をなくすこ
とによって高親和性ＩＬ−２レセプター（ＩＬ−２Ｒ）の親和性を低下させたＩ
Ｌ−２の低毒性類似体を記載している。この類似体は、主として、ＩＬ−２の３
３位〜４６位のアミノ酸に対するコドンを変異させることによって調製される（
例えば、Ａｒｇ３８ＡｌａおよびＰｈｅ４２ＬｙｓまたはＰｈｅ４２Ａｌａ）。
Ａｓｐ２０Ｌｙｓ変異体は、ｐ５５に対する結合を変化させることなく、ＩＬ−
２レセプターのｐ７５／β鎖に対して１／１００〜１／５００に低下した親和性
を有する（Ｃｏｌｌｉｎｓら、１９８８）。他の変異体（例えば、Ａｓｐ２０Ｓ
ｅｒ）は重大な作用をほとんど有していない（Ｂｅｒｎｄｔら、１９９４）。ネ
ズミ類のＩＬ−２に対する研究により、ヒトＩＬ−２のＡｓｐ８４およびＡｓｎ
８８もまた、ｐ７５の結合に関与していることが示されている（Ｚｕｒａｗｓｋ
ｉら、１９９３）。これは、ヒトＩＬ−２とそのレセプターとの間の結合をモデ
ル化することによって支持されている（Ｂａｍｂｏｒｏｕｇｈら、１９９４）。
これらの変異の親和性の予想される低下は、Ａｓｐ２０＞Ａｓｎ８８＞Ａｓｐ８
４である。
【００３９】 Ａｒｇ３８およびＰｈｅ４２における変異を８８位および２０位における変異
と組み合わせることによって、ＩＬ−２Ｒの親和性はさらに低くなる。優先権主
張日において好ましい別の強力なＩＬ−２変異はＴｈｒ５１Ｐｒｏであり、これ
により、細胞のインターナリゼーション速度が低下し、その免疫調節作用の継続
時間が長くなったＩＬ−２類似体が得られる（Ｃｈａｎｇら、１９９６）。
【００４０】 アミノ酸位置の番号は、Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら（１９８３）に従っている。
【００４１】 Ｇｒｉｍｍら、Ｃｏｌｌｉｎｓら（１９８８）、Ｂｅｒｎｄｔら（１９９４）
、Ｚｕｒａｗｓｋｉら（１９９３）、Ｂａｍｂｏｒｏｕｇｈら（１９９４）、Ｃ
ｈａｎｇら（１９９６）、およびＴａｎｉｇｕｃｈｉら（１９８３）による刊行
物は参照により本明細書に組込まれる。
【００４２】 上記のコンジュゲートにおけるその正常なレセプターに対する親和性が低下し
たサイトカイン類似体およびケモカイン類似体を使用することによって、予め選
択された標的細胞に対するその標的化が強化される。そのそれぞれの細胞レセプ
ターに結合したときの細胞の低下したインターナリゼーション速度が得られるよ
うに変異され、そして式Ｉによるコンジュゲートに組み込まれたサイトカインお
よびケモカインによって、スーパー抗原の活性は、天然型形態の免疫調節因子と
の対応するコンジュゲートと比較した場合延長されていることが考えられる。
【００４３】 従って、免疫調節因子（ＩＭ）の用語は、対応する天然型形態の免疫調節因子
の作用に対するアゴニスト作用またはアンタゴニスト作用を有し得る任意の改変
型形態、例えば、任意の変異型形態を包含する。
【００４４】 （Ｂ．式Ｉにおけるスーパー抗原部分ＳＡＧ） 式Ｉ中のＳａｇは遊離のスーパー抗原として定義されるスーパー抗原を表し、
上記の表題“背景．．．”においては、すなわち、例えば変異により、 ａ．対応する野生型スーパー抗原と比較し、ＭＨＣクラスＩＩ抗原への結合能
力が低下するように（例えばＡｂｒａｈｍｓｅｎら、ＷＯ９６０１６５０を参照
のこと）、 ｂ．対応する野生型スーパー抗原と比較し、ヒト血清中での血清反応性が低下
するように（例えばＡｂｒａｈｍｓｅｎら、ＷＯ９６０１６５０、Ａｎｔｏｎｓ
ｓｏｎら、ＷＯ９７３６９３２及びＡｎｔｏｎｓｓｏｎら、１９９７を参照のこ
と）、 ｃ．対応する野生型スーパー抗原と比較し、ヒトにおける免疫原性を低下する
ように（例えばＡｎｔｏｎｓｓｏｎら、ＷＯ９７３６９３２及びＡｎｔｏｎｓｓ
ｏｎら、１９９７を参照のこと）、 ｄ．二つ以上の類似の野生型スーパー抗原間で、第一の野生型スーパー抗原の
ある領域を第二の類似スーパー抗原の対応する領域で置換してキメラとなるよう
に、 修飾される可能性のある野生型スーパー抗原を表す。当該領域はＴＣＲＶβへの
結合を決定する領域であり得、例えばＳＥＥ／ＳＥＡおよびＳＥＡ／ＳＥＥキメ
ラとして定義されるものがある（例えばＡｎｔｏｎｓｓｏｎら、ＷＯ９７３６９
３２、Ａｎｔｏｎｓｓｏｎら、１９９７及びＬａｍｐｈａｅｒら、１９９６を参
照のこと）。
【００４５】 また、例えば真核細胞で生産された際の余計な糖鎖形成を避けるといったよう
な、適当と考えられる他の修飾／変異も含まれる。
【００４６】 優先権でのＳＥＡ／ＳＥＥ様スーパー抗原の典型的な変異は、以下のようなも
のであった（Ａｎｔｏｎｓｓｏｎら、１９９７及びＡｎｔｏｎｓｓｏｎらＷＯ９
７３６９３２と同様に番号付ける）： ａ．ＭＨＣクラスＩＩ結合性の低下：Ａｓｐ２２７Ａｌａ（＝ＳＥＡｍ９）、
Ｐｈｅ４７Ａｌａおよび／またはＡｓｐ７０Ａｒｇ。変異Ｐｈｅ４７Ａｌａ／Ａ
ｓｐ２２７Ａｌａ＝ＳＥＡｍ２３。
【００４７】 ｂ．およびｄ．対応する複合化スーパー抗原のＳＡＤＣＣ能力を保持すると同
時に、ヒトでの血清反応性を低下させることを目的とした、ＳＥＡとＳＥＥ間の
キメラ：以下の置換Ｇｌｙ２０Ａｒｇ、Ｔｈｒ２１Ａｓｎ、Ｇｌｙ２４Ｓｅｒ、
Ｌｙｓ２７Ａｒｇを有するＳＥＥ。
【００４８】 実験部で用いた変異体は、ＳＥＡ（Ａｓｐ２２７Ａｌａ）＝ＳＥＡｍ９、ＳＥ
Ａ（Ｐｈｅ４７Ａｌａ／Ａｓｐ２２７Ａｌａ）＝ＳＥＡｍ２３、およびＳＥＡ（
Ｐｈｅ４７Ａｌａ／Ａｓｎ１０２Ｑ／Ａｓｎ１４９Ａｓｐ／Ｔｈｒ２１８Ｖａｌ
／Ａｓｐ２２７Ａｌａ）＝ＳＥＡｍ５７である。
【００４９】 優先出願における好ましいスーパー抗原は、 １．二つのＭＨＣクラスＩＩ結合部位を示すスーパー抗原（Ｓａｇ）（例えば
、ブドウ球菌エンテロトキシンＡおよびＥ）、 ２．その非変異型では、ＭＨＣクラスＩＩへの至適結合にＺｎイオンを必要と
するスーパー抗原（Ｓａｇ）（例えば、ＳＥＡ、ＳＥＥ、およびＳＨＥ）、 ３．ブドウ球菌エンテロトキシンの中から選択された。
【００５０】 本発明によるコンジュゲートに組み入れられるＳａｇ分子は機能的なスーパー
抗原である必要はなく、大事な点は、最終的なコンジュゲートが先に概説したよ
うなＳＡＤＣＣとＳＤＣＣの一方あるいは両方の能力を示すことによりそうであ
ることである。
【００５１】 Ｃ． 式Ｉにおける標的部分Ｔ Ｔは原則として、細胞表面構造、好ましくは疾病特異的構造に結合可能などん
な構造でもよい。Ｔが標的とする構造は、通常、（ａ）Ｓａｇが結合する多型性
ＴＣＲ鎖エピトープ、および（ｂ）Ｓａｇが結合するＭＨＣクラスＩＩエピトー
プとは異なる。標的部分は、インターロイキン（例えばインターロイキン−２）
、ホルモン、抗体の抗原結合断片を含む抗体、成長因子等から選択する。例えば
、Ｗｏｏｄｗｏｒｔｈ １９９３（参考により本明細書に組込まれる）を参照の
こと。
【００５２】 よって、標的部分は、１、２、３、あるいは４本のポリペプチド鎖を含むタン
パク質でよい。
【００５３】 優先日では、Ｔは、上述の抗体型の機能的に活性のあるあらゆる切断型を含め
、抗体（完全長抗体、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２、Ｆｖ、ＳｃＦｖ（一本鎖抗体）、
複数の一本鎖抗体（ＳｃＦｖ）ｎ、およびあらゆる他の抗原結合抗体断片）であ
ることが好ましい。他の変種として、モノスペシフィックとバイスペシフィック
がある。抗体は原則的に、抗体活性断片（Ｆａｂ等）を特に重要視し、あらゆる
疾病に関連する／特異的な細胞表面構造を標的とすることができ、例えば上述し
た癌型のいずれかに関連した構造に対して可能である。典型的に、抗体は大腸お
よび／または膵臓特異的エピトープを標的とし、例えば、いわゆるＣ２４２エピ
トープ（Ｌｉｎｄｈｏｌｍら、ＷＯ９３０１３０３）、５Ｔ４抗体のエピトープ
（Ｓｔｅｒｎら、ＷＯ８９０７９４７）等の肺がん特異的エピトープ、ＣＤ１９
等に存在するリンパ種特異的エピトープ、ＨＭＷ−ＭＡＡ等のメラノーマ特異的
エピトープ等を標的とする。
【００５４】 “抗体”という用語はモノクローナルおよびポリクローナル変種を含むが、モ
ノクローナル剤が好ましい。
【００５５】 標的部分がＦａｂ断片である場合には、通常重および軽Ｆａｂ鎖に一緒に結合
しているシステイン残基は、好ましくはセリン等のジスルフィド形成を許容しな
いアミノ酸と置換しておく。Ａｎｔｏｎｓｓｏｎら、ＷＯ９７３６９３２も参照
のこと。
【００５６】 上述した中には、疾病の発生を制御あるいは調節するほぼ健常な細胞に特有の
構造をＴが標的とすることも含まれる。
【００５７】 Ｄ． リンカーＢ リンカーＢは以前に記述されたように（Ｄｏｈｌｓｔｅｎら、ＷＯ９２０１４
７０；Ａｂｒａｈｍｓｅｎら、ＷＯ９６０１５０及びＡｎｔｏｎｓｓｏｎら、Ｗ
Ｏ９７３６９３２）選択し、すなわちＢは好ましくは親水性であり、アミド、チ
オエーテル、ジスルフィド等の中から選択した一つあるいはそれ以上の構造を示
す。最も顕著なリンカーは組換え技術により得られたものであり、すなわちゲノ
ムレベルで複合化を起こしたもので、その結果、オリゴペプチドリンカーを生じ
る。典型的には、オリゴペプチドリンカーは、好ましくはリンカー全体で親水性
になるよう選択した例えば１〜２０といった１〜３０のアミノ酸残基を含む。従
ってリンカー残基は、好ましくはＧｌｎ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ、Ｈ
ｉｓ、およびＡｒｇ等の親水性アミノ酸残基から選択する。典型的なオリゴペプ
チドリンカーは、トリペプチドＧｌｙＧｌｙＰｒｏあるいはアミノ末端をｇｌｙ
−ｐｒｏで修飾した可能性のあるいわゆるＱリンカー（Ｗｏｏｔｔｏｎら、１９
８９、参考により本明細書に組込まれる）を含む。
【００５８】 Ｅ． Ｔ、Ｓａｇ、およびＩＭの結合点 化学的コンジュゲートは、典型的に、結合点の異なるコンジュゲート分子の混
合物を含む。コンジュゲート物質は、ホモコンジュゲートと同様にヘテロコンジ
ュゲートを含む。
【００５９】 組換えコンジュゲート（融合タンパク質）については、得られるコンジュゲー
ト物質は結合点に関して均一である。それぞれ個々のサブユニット（Ｔ、Ｓａｇ
、ＩＭ）については、アミノ末端を別のサブユニットのカルボキシル末端に融合
する、あるいはその逆で、好ましくは挿入したオリゴペプチド架橋を介する。コ
ンジュゲートがＴ、ＩＭ、Ｓａｇのそれぞれ一つずつを含む場合の組み合わせは
、Ｔ−ＩＭ−Ｓａｇ、ＩＭ−Ｔ−Ｓａｇ、Ｓａｇ−ＩＭ−Ｔ、Ｓａｇ−Ｔ−ＩＭ
、Ｔ−Ｓａｇ−ＩＭ、ＩＭ−Ｓａｇ−Ｔ（Ｂのリンカー構造の存在は示していな
い）である。一つあるいはそれ以上のサブユニットが二本以上のポリペプチド鎖
を含んでいる場合には、組み合わせの可能性の数は増加する。Ｔが抗体Ｆａｂ断
片である場合には、組み合わせの可能性は（オリゴペプチドリンカーＢは示して
いない）：
【００６０】 １．Ｓａｇ−Ｆａｂ（軽鎖）−ＩＭ ２．Ｆａｂ（軽鎖） Ｆａｂ（重鎖） Ｓａｇ−Ｆａｂ（重鎖）−ＩＭ ３．Ｓａｇ−Ｆａｂ（軽鎖） ４．Ｆａｂ（軽鎖）−ＩＭ Ｆａｂ（重鎖）−ＩＭ Ｓａｇ−Ｆａｂ（重鎖） ５．Ｓａｇ−Ｆａｂ（軽鎖） ６．ＩＭ−Ｆａｂ（軽鎖） ＩＭ−Ｆａｂ（重鎖） Ｓａｇ−Ｆａｂ（重鎖） ７．Ｆａｂ（軽鎖）−Ｓａｇ ８．Ｆａｂ（軽鎖）−ＩＭ Ｆａｂ（重鎖）−ＩＭ Ｆａｂ（重鎖）−Ｓａｇ となる。さらなる変種では、免疫調節因子とスーパー抗原は、抗体のいずれかの
鎖のいずれかの末端に次々に融合される。
【００６１】 優先日では組換えコンジュゲートが好ましく、最も好ましくは標的部分として
はＦａｂ断片を用い、遊離のスーパー抗原のアミノ末端を重（ＣＨ１）あるいは
軽抗体鎖であり、第一定常ドメインに結合し、免疫調節因子を残りのカルボキシ
ル末端に結合する（式Ｉ〜ＩＶに有効）。
【００６２】 至適な生産と機能のため、融合タンパク質は組換えにより、スーパー抗原が３
〜１１残基の可動性親水性アミノ酸リンカーを介して抗体Ｆａｂ断片のＣＨ１ド
メインＣ末端に融合した二本鎖産物として発現させる。このリンカーは、Ｇｌｙ
−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ、あるいはＰｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ
−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ（配列番号１９）、あるいは配列番
号１９に基づく４〜９残基の配列を有し、中でも配列番号１９が好ましい。免疫
調節因子部分は、親水性かつ中性あるいは正に荷電した１０〜２０残基のリンカ
ー（リンカーＱ）を介して、軽鎖のＣ末端に融合する。好ましくは、リンカーＱ
は以下の配列、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｌ
ｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａ
ｒｇ（配列番号２３）、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｇ
ｌｕ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｇ
ｌｕ−Ａｒｇ（配列番号２０）、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｌ
ｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｔ
ｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ（配列番号２１）、あるいはＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｇ
ｌｕ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｓ
ｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ（配列番号２２）を有し、配列番号２０
および２１が最も好ましい（詳細については実施例２を参照のこと）。
【００６３】 アミノ末端での類似の組み合わせ、あるいはＶＨおよびＶＬドメインのアミノ
およびカルボキシル末端での結合の組み合わせでは、現段階では、コンジュゲー
トの活性はあるものの効果は低いと考えられる。
【００６４】 Ｆ． 式Ｉを満たさないが、本発明の方法で上記ａ〜ｅの組み合わせに従って利
用できる活性物質 遊離のスーパー抗原（Ｓａｇ）：表題“定義”を参照のこと。典型的なＳａｇ
は、表題“背景”および“Ｂ． 式ＩにおけるＳａｇのスーパー抗原部分”に示
してある。
【００６５】 非複合化免疫調節因子：表題“定義”を参照のこと。原則的には、表題“Ａ． 式Ｉにおける免疫調節因子ＩＭ”に示したものと同様の免疫調節因子が利用で
きる。サイトカインとケモカインが好ましく、特にＩＬ−２とＩＬ−２様サイト
カインが好ましい。
【００６６】 標的免疫調節因子（Ｔ，ＩＭ−コンジュゲート）：これらのコンジュゲートは
一般式 （Ｔ’）ｘ（ＩＭ’）ｚ 式ＩＩＩ を満たし、式中、Ｔ’およびＩＭ’は有機リンカーＢ’により結合する。Ｔ’、
ＩＭ’、およびＢ’はＴ、ＩＭ、およびＢと同様の化合物／構造グループの中か
ら選択する。ｘおよびｚは式Ｉ（ｙ＝０）と同様に定義され、Ｔ’およびコンジ
ュゲート分子当たりＩＭ’は一つあるいは二つが好ましい。Ｔ’とＩＭ’間の結
合点は式Ｉと同様に定義される。表題“Ｅ． 結合点．．．”も参照のこと。こ
こで、式１〜８とそれについてのコメントは、Ｓａｇが省略されることを除きＴ
，ＩＭ−コンジュゲートにも適用できる。式ＩＩＩのコンジュゲートは既知の技
術、すなわち従来の化学的結合あるいは組換え技術（融合タンパク質）に従って
作製可能であり、中でも後者が好ましい（Ｆｅｌｌら、ＥＰ ４３９０９５、Ｒ
ｏｓｅｎｂｌｕｍら、ＥＰ ３９６３８７）。特に重要なＴ，ＩＭ−コンジュゲ
ートは、例えば変異により、先に定義したように親和性を低下させるように、お
よび／またはインターナリゼーション率を低下させるように修飾したＩＭ’−部
分を含む。
【００６７】 標的スーパー抗原（Ｔ，Ｓａｇ−コンジュゲート）：これらのコンジュゲート
は一般式 （Ｔ’’）ｘ（Ｓａｇ’’）ｙ 式ＩＶ を満たし、式中、Ｔ’’およびＳａｇ’’は有機リンカーＢ’’により結合する
。Ｔ’’、Ｓａｇ’’、およびＢ’’はＴ、ＩＭ、およびＢと同様の化合物／構
造グループの中から選択する。ｘおよびｙは式Ｉ（ｚ＝０）と同様に定義され、
Ｔ’’およびコンジュゲート分子当たりＳａｇ’’は一つあるいは二つが好まし
い。Ｔ’’とＳａｇ’’間の結合点は式Ｉと同様に定義される。表題“Ｅ． 結
合点．．．”も参照のこと。ここで、式１〜８とそれについてのコメントは、Ｉ
Ｍが式から省略されることを除きＴ，Ｓａｇ−コンジュゲートにも適用できる。
式ＩＩのコンジュゲートは既知の技術、すなわち従来の化学的結合あるいは組換
え技術（融合タンパク質）に従って作製可能であり、中でも前者が好ましい。例
えば、Ｄｏｈｌｓｔｅｎら、ＷＯ９２０１４７０、Ａｂｒａｈｍｓｅｎら、ＷＯ
９６０１６５０、Ａｎｔｏｎｓｓｏｎら、ＷＯ９７３６９３２を参照のこと。
【００６８】 本発明の第三の主要な態様：修飾した免疫調節因子を含むコンジュゲート これらの新規コンジュゲートは式： （Ｔ’’’）ｘ（Ｓａｇ’’’）ｙ（ＩＭ’’’）ｚ 式Ｖ を満たし、式中、Ｔ’’’およびＳａｇ’’’は式ＩのＴおよびＳａｇと同様の
化合物から選択する。ＩＭ’’’は、例えば変異により、（対応する天然型と比
較して）細胞膜アンカーレセプターへの親和性を低下させるように、および／ま
たはレセプターへの結合を介するインターナリゼーション率を低下させるように
修飾した免疫調節因子である。ＩＭ’’は、好ましくはサイトカインあるいはケ
モカインである。さらに表題“Ａ． 式Ｉにおける免疫調節因子ＩＭ”を参照の
こと。本発明のこの態様における重要な免疫調節因子の一つは、修飾したＩＬ−
２である。ｘ、ｙおよびｚは式Ｉと同様に定義される。
【００６９】 式Ｖによるコンジュゲートの第一の副態様では、Ｔ’’’、Ｓａｇ’’’、お
よびＩＭ’’’は常に存在し（ｘ、ｙ、およびｚはすべて＞０）、すなわちＴ，
Ｓａｇ，ＩＭ−コンジュゲートである。ｘ、ｙ、およびｚは典型的に整数１〜３
であり、好ましくは１〜２である。ｘ、ｙ、およびｚ間の典型的な関係は：ｘ＝
ｙ＝ｚ；ｘ＝ｙ＝０．５ｚ；ｘ＝０．５ｙ＝０．５ｚ；およびｘ＝０．５ｙ＝ｚ
である。
【００７０】 式Ｖによるコンジュゲートの第二の副態様では、スーパー抗原部分が存在せず
（Ｙ＝０）、すなわちＴ，ＩＭ−コンジュゲートである。ｘとｚは典型的に整数
１〜３である。ｘとｚ間の関係は：ｘ＝ｚ；ｘ＝０．５ｚ；０．５ｘ＝ｚ；ｘ＝
１／３ｚ；および１／３ｘ＝ｚである。
【００７１】 式Ｖによるコンジュゲートの両副態様では、与えられた整数の範囲およびそれ
らの相互関係は、主に、標的部分が１、２、３あるいは４本のポリペプチド鎖を
含むタンパク質であり、それぞれのコンジュゲート分子内に一つのＴが存在する
融合タンパク質に当てはまる。式Ｖの融合タンパク質の結合点は、式Ｉを満たし
これに対応する融合タンパク質と同様である。表題“Ｅ． 結合点．．．”も参
照のこと。ここで、式１〜８とそれについてのコメントは、第二の副態様でＳａ
ｇが省略されていることを除いて、Ｔ，ＩＭ−コンジュゲートにも適用できる。
【００７２】 先に定義したコンジュゲートの作製 コンジュゲートの作製は、原則的に二つの主要な経路により実施する： １．個々のサブユニットＴ、Ｓａｇ、およびＩＭの化学的結合。それぞれ個々
のサブユニットあるいはそれらの組み合わせは組換え技術により生産する。
【００７３】 ２．先に示したいずれかの式で定義したコンジュゲートを直接提供する組換え
技術。
【００７４】 実際の方法は当業者には既知であり、非常に多くの変法を含む。
【００７５】 化学的結合は、典型的に、スーパー抗原、タンパク質性免疫調節因子、および
タンパク質性標的部分の様々な位置に通常天然に存在する官能基（例えば、一級
アミノ基、カルボキシル基、メルカプト基、カルボヒドレート基）を利用する。
この技術は当分野では周知である。
【００７６】 スーパー抗原と免疫調節因子間の本発明によるコンジュゲート（非複合化型と
融合型）を大量に組換え生産するための主な宿主細胞は、大腸菌である。この宿
主は原則的に二つの経路：細胞内生産と分泌により提供する。ペリプラズムおよ
び培養液から正しく折りたたまれた（ｆｏｌｄｅｄ）タンパク質が精製できるこ
とから、後者の変法が好ましい。上記のことは、酵母や哺乳類細胞といった例え
ば真核細胞等の他の宿主細胞においても、活性を有するコンジュゲートを生産で
きるという可能性を除外しない。予備段階での結果から、これまでに、例えばＢ
７やその類似体のようなＣＤ２８と相互作用する免疫調節因子を組み入れるには
、哺乳類細胞等の真核細胞が好ましいことが示されている。
【００７７】 本発明の第四の態様：新規発明のコンジュゲートをコードする遺伝子構築体 本発明の第四の態様は、先に定義したようなスーパー抗原および免疫調節因子
、好ましくは先に定義したようなＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５
、ＩＬ−１８、ＲＡＮＴＥＳ、ＣＤ８０の異所性ドメイン、ＣＤ８６の異所性ド
メイン、４−ＢＢ１Ｌ、Ｆｌｔ３Ｌ、およびこれらの類似体をコードする、好ま
しくはｃＤＮＡ等のＤＮＡ、あるいはＲＮＡである組換え核酸分子である。本発
明のこの態様では、核酸は典型的に、免疫調節因子とスーパー抗原を発現する宿
主細胞と共存可能な翻訳調節配列、複製開始点、スーパー抗原と免疫調節因子の
一方あるいは両方に対する分泌シグナル配列等の制御配列を含まなくてはならな
い。スーパー抗原および免疫調節因子をコードする部分配列間の領域は、バイシ
ストロン性遺伝子構築体等に存在するリボソーム侵入部位をコードする配列を含
んでもよい。後者では、コンジュゲートに含まれるそれぞれのポリペプチド鎖を
別々に発現することになる。ＩＭ，Ｓａｇ，標的部分コンジュゲートおよび適当
なシグナル配列を含む複数鎖コンジュゲート組み合わせの場合には、バイシスト
ロン性構築体により、折りたたみおよびＩＭが鎖の一方に結合した完全に活性の
あるコンジュゲートへのアセンブリーが促進される。このことは、標的部分が二
本鎖抗体分子であり、スーパー抗原（Ｓａｇ）と免疫調節因子の少なくとも一方
が抗体鎖の末端に融合している場合に重要となる。上記を参照のこと。
【００７８】 薬剤組成物、投与量、および投与経路 本発明の第四の態様は、この発明によるスーパー抗原（Ｓａｇ）、標的部分（
Ｔ）、および免疫調節因子（ＩＭ）の組み合わせを含む薬剤組成物である。本発
明のこの態様に特有の特徴は、スーパー抗原と免疫調節因子の少なくとも一方が
、上述のように不活化すべき細胞を標的とすることを可能とするコンジュゲート
の形をとっていることである。
【００７９】 意図した組成物は、この発明のコンジュゲートの組み合わせを含むことを除外
すれば、この分野では既知である。特定の組成物においては、組合せは、 ａ．スーパー抗原（Ｓａｇ）、標的細胞用の標的部分（Ｔ）、および免疫調節
因子（ＩＭ）を含む三重コンジュゲート（Ｔ，ＩＭ，Ｓａｇ−コンジュゲート）
、 ｂ．二つの二重コンジュゲート−標的抗体（Ｔ）とスーパー抗原間のコンジュ
ゲートと標的抗体（Ｔ’）と免疫調節因子間のコンジュゲート（すなわち、Ｔ，
Ｓａｇ−コンジュゲート ＋ Ｔ，ＩＭ−コンジュゲート）。エピトープの特性
に関して、ＴとＴ’は異なる、あるいは同一である、 ｃ．スーパー抗原（Ｓａｇ）と標的部分（Ｔ）間の二重コンジュゲートにおい
て、遊離型である免疫調節因子（ＩＭ）（Ｔ，Ｓａｇ−コンジュゲート ＋ Ｉ
Ｍ）； ｄ．免疫調節因子（ＩＭ）と標的部分（Ｔ）間の１つの二重コンジュゲートで
、遊離型であるスーパー抗原（Ｓａｇ）（Ｔ，ＩＭ−コンジュゲート ＋ Ｓａ
ｇ）、あるいは ｅ．二重コンジュゲート型のスーパー抗原（Ｓａｇ）と免疫調節因子（ＩＭ）
（Ｓａｇ，ＩＭ−コンジュゲート）を含む。
【００８０】 さらに上記の本発明の方法の内容を参照のこと。組成物が二つの活性成分（上
記のｂ〜ｄ）を含む場合には、組成物は投与の時点まで成分を分けて保存してよ
い。
【００８１】 組成物は、凍結粒子剤、無菌のあるいは無菌的に生産された溶液、錠剤、アン
プル等の剤形でありうる。水等のビヒクル（好ましくは、ＰＢＳ等により生理学
的に許容可能なｐＨ値に緩衝して）あるいは他の不活性固体または液体が存在し
うる。一般的には、組成物はおそらくはコンジュゲートを非複合化活性成分と組
み合わせて、混合、溶解、結合し、さもなければ一つあるいはそれ以上の水溶性
または非水溶性の水性または非水性ビヒクルと併用して調製する。必要であれば
、適当な添加剤やアジュバントも加えて調製する。ビヒクルや条件が、先のａ〜
ｅに定義したような活性成分の活性に不利な影響を与えてはならないことは必須
である。
【００８２】 通常は、本発明に用いるスーパー抗原（ＳＡＧ）は市販され、ここで示した結
果に基づき１ｐｇ〜５０ｍｇの範囲になると考えられるが、それぞれ有効ＳＡＧ
量を含む予め分注した投与量で投与される。正確な投与量は、患者の体重や年齢
、用いるＳＡＧに特異的な抗体の前タイター、投与経路、疾病の型、標的探索部
分、スーパー抗原、結合（−Ｂ−）、免疫調節因子等に依存して、場合によって
異なる。
【００８３】 この発明の方法に用いる組み合わせの投与量を決定する重要な要因は、スーパ
ー抗原と免疫調節因子が至適な投与量範囲を示すことである。投与量が低すぎる
と効果は見られないあるいは最適以下となり、高すぎると致死的ともなる傷害性
等の許容できない副作用を起こす。従って、先に示した範囲が広範であるのは、
この発明の方法の全変法について可能な範囲をすべて包含することを目的とした
ためであることを強調されたい。よって、この発明の方法によるそれぞれの特異
的組み合わせには、０．１ｐｇ〜５０ｍｇの範囲内にある投与量副範囲が存在す
る。このことにより、さらなる開発と結果からこの範囲をはずれる投与量レベル
が見出されることが除外されることはない。
【００８４】 投与経路は当分野で通常意図されるものであり、すなわち本発明によるスーパ
ー抗原−免疫調節因子組み合わせを標的殺傷有効量あるいは治療的有効量投与し
、標的細胞に作用させる。先に述べた指示では、これは殆どの場合、ヒト等の哺
乳類への（皮下、静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内）注射または注入等の非経口
投与を意味する。本発明のコンジュゲートの組合せは局所的あるいは全身系的に
投与されうる。
【００８５】 “標的殺傷有効量”という用語により、その量がＴ細胞を活性化して標的細胞
を破壊させるのに有効であることを意図している。
【００８６】 優先日段階での好ましい投与経路は、Ｄｏｈｌｓｔｅｎら、ＷＯ９２０１４７
０；Ａｂｒａｈｍｓｅｎら、ＷＯ９６０１６５０及びＡｎｔｏｎｓｓｏｎら、Ｐ
ＣＴ／９７／００５３７に従って、スーパー抗原コンジュゲートについて意図さ
れたものと同様である。これは、解熱剤（アセトアミノフェン）と併用した、一
日当たり１〜５時間の静脈内注入（好ましくは４時間）を意味する。コンジュゲ
ートに向けて抗体を追加免疫するリスクを考慮し、投与は数日間、例えば５〜８
日間繰り返す。最も望ましくは、一日間以上の治療、続いて一日間以上の安静期
を一サイクルとし、その治療サイクルを数回繰り返す。例えば、治療と安静がそ
れぞれ５日間および２日間のサイクルである。
【００８７】 本発明の組成物は、主要な治療法として、あるいは好ましくは手術や他の薬剤
と併用したアジュバント治療法として投与しうる。 実施例１． Ｓａｇ標的Ｆａｂとの同時刺激腫瘍治療に利用するＣＤ８０−Ｃ２
１５Ｆａｂ融合タンパク質の生物活性
【００８８】 要約：ＣＤ８０−Ｃ２１５ＦａｂおよびＣＤ８０−Ｃ２１５Ｆａｂ−ＳＡＥｍ
５７融合タンパク質は、ヒトＣＤ８０の細胞外ドメインを含むように構築した。
この融合タンパク質は哺乳類細胞により生産し、ＣＨＯ細胞トランスフェクタン
トを用いてＣＤ２８への結合を、Ｃｏｌｏ２０５細胞を用いてＣ２１５抗原への
結合を試験した。どちらの融合タンパク質もＣＤ２８およびＣ２１５抗原に結合
したが、後者の結合はＣ２１５Ｆａｂ−ＳＥＡと比較して１００倍低かった。Ｃ
Ｄ８０がＬ鎖のＮ末部分に結合しているため、ＣＤ８０部分によりＣ２１５Ｆａ
ｂの結合が阻害される可能性がある。両融合タンパク質がＳＡＧ活性化ヒトＴ細
胞を同時刺激することから、可溶性ＣＤ８０が生物学的機能を保持することが示
される。
【００８９】 材料と方法 組換えＤＮＡ技術と酵素：プラスミドＤＮＡの調製および他の操作は、基本的
にＳａｍｂｒｏｏｋら（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）に従って実施した。宿
主株には、大腸菌ＨＢ１０１（Ｂｏｙｅｒら、１９６９）を用いた。制限酵素と
ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントはベーリンガーマンハイム社ある
いはニューイングランドバイオラボ社から入手し、メーカーの推奨する方法に従
って使用した。Ｔａｑポリメラーゼはパーキンエルマー社から入手した。ｃＤＮ
Ａは、ＧｅｎｅＡｍｐ ＲＮＡ ＰＣＲキット（パーキンエルマー社）を用いて
、全ＲＮＡから作製した。オリゴヌクレオチドは、Ｇｅｎｅ Ａｓｓｅｍｂｌｅ
ｒ（ファルマシアバイオテックＡＢ社）あるいはＡＢＩ ３９２ ＤＮＡ／ＲＮ
Ａシンセサイザー（アプライドバイオシステム社）で合成し、ＦＰＬＣシステム
（ファルマシアバイオテック社）で逆相クロマトグラフィーにより精製した。配
列決定は、ジデオキシチェーンターミネーション原理（Ｓａｎｇｅｒら、１９７
７）に従ってアプライドバイオシステム社のＴａｑ ＤｙｅＤｅｏｘｙ Ｔｅｒ
ｍｉｎａｔｉｏｎ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔを用いて行い、
産物はＤＮＡシークエンサーＡＢＩ ３７３Ａ（アプライドバイオシステム社）
で分離し検出した。種々のプラスミドを有する細菌は、２ Ｘ ＹＴおよびリッ
トル当たり１５ｇのアガーベースを含み７０ｍｇ／Ｌカナマイシンあるいは１０
０ｍｇ／Ｌアンピシリンを補足したプレート上で選択した。液体培地には２ Ｘ ＹＴを用いた（リットル当たり：１０ｇ酵母抽出（ディフコ社）、１６ｇトリ
プトン（ディフコ社）、および５ｇ ＮａＣｌ）。
【００９０】
【表１】
【００９１】 プラスミド構築体 マウス抗体Ｃ２１５の可変ドメインを含むＦａｂフラグメントをコードする遺
伝子は、以前に記述されたように構築した（Ｄｏｈｌｓｔｅｎら、１９９４）。
ブドウ球菌エンテロトキシンＡ（ＳＥＡ）遺伝子のクローニングとＦ４７Ａおよ
びＤ２２７Ａの置換を生じる突然変異誘発については、以前に記述されている（
Ａｂｒａｈｍｓｅｎら、１９９５）。プライマーＬＡＫＱ８８〜９３（用いたオ
リゴヌクレオチドはすべて表１にまとめてある）を用いて三つの他の変異体をＳ
ＥＡ遺伝子に導入し、ＳＥＡ変異型５７を得た。ヒト脾臓全ＲＮＡから、ＬＡＫ
Ｑ５とＬＡＫＱ７をＲＴ−ＰＣＲに使用し、上流にＫｏｚａｋボックスを導入し
、シグナルペプチドとヒトＣＤ８０の細胞外部分をコードする遺伝子をクローニ
ングした。そのヌクレオチド配列は、ジーンバンクのＣＤ８０配列（受託番号Ｍ
２７５３３）と一致することが認められたた。３’末端に異なるクローニング部
位を有するＣＤ８０遺伝子の二つの変種を作製した：別々のＰＣＲにおいてＬＡ
ＫＱ３０とＬＡＫＱ１０８プライマーを使用し、それぞれＢｓｓＨＩＩあるいは
ＭｒｏＩ部位を作製した。Ｑリンカー（Ｗｏｏｔｏｎら、１９８９）を介してκ
鎖の上流にＣＤ８０をコードする融合遺伝子は、当該ＣＤ８０遺伝子とκ遺伝子
直前のＤｓａＩ部位間に、ＤＮＡリンカーＬＡＫＱ３７／３８ ＢｓｓＨＩＩ−
Ｅｓｐ３Ｉを挿入することにより構築した。プラスミドｐＫＧＥ９８７は、上流
にＣＤ８０シグナルペプチドを有するＣＤ８０−（Ｑリンカー）−κをコードす
る融合遺伝子をベクターに挿入することにより作製した。ベクターには、ＣＭＶ
プロモーターやポリＡテイルに加え、トランスフォーマントを選択するのに用い
るネオマイシン遺伝子が含まれている。ＣＤ８０遺伝子の最終版は、それがＦｄ
−ＳＥＡ変異型５７融合遺伝子の上流に存在する融合遺伝子を構築するのに用い
た：ＣＤ８０遺伝子のＭｒｏＩ切断部位とＣ２１５ ＶＨ遺伝子のコドン４およ
び５に存在するＰｓｔＩ切断部位間に、ＱリンカーをコードするＤＮＡフラグメ
ント（ＬＡＫＱ１１７／１１８）を挿入した。この融合遺伝子を第二のＣＭＶプ
ロモーターベクターに挿入してプラスミドｐＭＢ１８９を作製した。つまり、Ｃ
Ｄ８０シグナルペプチドと細胞外部分、その下流に３残基スペーサーＧＧＰを介
してＦｄとＳＥＡ変異型５７をコードする。プラスミドｐＫＧＥ９６１では、Ｆ
ｄ遺伝子をシグナル配列（他のマウスＶＨ遺伝子由来）の下流に挿入した。プラ
スミドｐＭＢ１５６は天然のシグナルペプチドを上流に有する天然のκ鎖をコー
ドし、ネオマイシン遺伝子を含む。
【００９２】 生産 ハムスター胚性腎臓２９３細胞をｐＫＧＥ９６１とｐＫＧＥ９８７、あるいは
ｐＭＢ１５６とｐＭＢ１８９でトランスフェクションし、それぞれＣＤ８０−Ｃ
２１５Ｆａｂ、ＣＤ８０−Ｃ２１５Ｆａｂ−ＳＥＡｍ５７を産生する細胞株を取
得した。安定性細胞株を取得するための選択培地には、フェノールレッド（ファ
ルマシア社番号ＭＳ ０１２７）なしでＬ−グルタミン（ギブコＢＲＬ社番号２
５０３０−２４）、１０％子ウシ血清、およびジェネティシン１ｍｇ／ｍｌを追
加したＤＭＥＭを用いた。生産培地には、フェノールレッドなしでＬ−グルタミ
ンと０．１％ ＨＳＡ（（ファルマシア ＆ アップジョンＡＢ社、スウェーデ
ン）を補足したＤＭＥＭを用いた。融合タンパク質は、ろ過した（Ｓａｒｔｏｂ
ｒａｎ ０．６５−０．４μｍ）培養液から、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ Ｓｅｐｈａ
ｒｏｓｅ ＦＦ（ファルマシアバイオテックＡＢ社）の親和性クロマトグラフィ
ー、続いて抗ＣＤ８０親和性精製（固定化抗ヒトＣＤ８０抗体；Ｃａｍｆｏｌｉ
ｏ Ｌ３０７．４）あるいはＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（ファルマシアバ
イオテック社）のイオン交換クロマトグラフィーにより精製した。
【００９３】 試薬。２ｍＭ Ｌ−グルタミン（ギブコ社、ミドルエセックス、イギリス）、
０．０１ Ｍ ＨＥＰＥＳ（バイオロジカルインダストリー社、イスラエル）、
１ｍＭ ＮａＨＣＯ３（バイオクロムＫＧ社、ベルリン、ドイツ）、０．１ｍｇ
／ｍｌ硫酸ゲンタマイシン（バイオロジカルインダストリー社、Ｋｉｂｂｕｔｚ Ｂｅｉｔ Ｈａｅｍｅｋ、イスラエル）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（ＪＲ
Ｈ バイオサイエンスインダストリー社、アメリカ）、および１０％熱非働化ウ
シ胎児血清（ギブコ社、ミドルエセックス、イギリス）を補足したＲＰＭＩＩ１
６４０培地（ギブコ社、ミドルエセックス、イギリス）を完全培地として、細胞
培養すべてに用いた。
【００９４】 抗体。ヒトＣＤ５７に対するｍＡｂ（ＨＮＫ１）およびＣＤ５６に対するｍＡ
ｂ（ＨＢ５５）は、ｍＡｂ産生ハイブリドーマ細胞（アメリカンタイプカルチャ
ーコレクション（ＡＴＣＣ）、ロックビル、メリーランド州）から入手した。Ｐ
Ｅ標識した抗マウスκ鎖ｍＡｂは、ベクトンディッキンソン社（サンホセ、カリ
フォルニア州）から入手した。
【００９５】 細胞。ファルマシア＆アップジョン社、ストックホルム、スウェーデンにおい
て、ＣＤ２８遺伝子をコードするヒトｃＤＮＡでチャイニーズハムスター卵巣（
ＣＨＯ）Ｋ１細胞をトランスフェクションした。トランスフェクタントは、常套
的に、同様の抗原発現レベルにおいてＦＡＣＳソーティングによりＣＤ２８の発
現を解析し、維持した。ヒト大腸癌細胞株Ｃｏｌｏ２０５はＡＴＣＣから入手し
た。細胞株はすべてマイコプラズマを含まなかった。
【００９６】 Ｔリンパ球増殖アッセイ。Ｔ細胞は、以前に記述されたように（Ｌａｎｄｏら
、１９９６）、ＣＤ５７、ＨＬＡ−ＤＲ４、ＣＤ１４、およびＣＤ５６ ｍＡｂ
でパニングするネガティブ選択によりヒト末梢血単球（ＰＢＭ）から得た。Ｔ細
胞に対する試験はすべて、平底９６ウェルプレート（ヌンク社、Ｒｏｓｋｉｌｄ
ｅ、デンマーク）を用いて、２００μｌ量中０．１ｘ１０６細胞／ウェルで実施
した。ＤＮＡ合成は、先に示されたように（１０）、培養細胞を［３Ｈ］−チミ
ジン［３Ｈ］ＴｄＲ（０．５ｍＣｉ／ウェル）へ曝露した後調査した。
【００９７】 フローサイトメトリーによる解析。フローサイトメトリーによる解析およびソ
ーティングは、ＦＡＣＳｔａｒＰｌｕｓフローサイトメーター（ベクトンディッ
キンソン社、マウンテンビュー、カリフォルニア州）での標準設定に従って実施
した。ＣＤ８０のＣＤ２８に対する親和性が低いため、ＣＤ８０−Ｃ２１５Ｆａ
ｂ融合タンパク質によるＣＨＯ−ＣＤ２８細胞の染色は、細胞の洗浄を省略して
実施した。
【００９８】 サイトカインアッセイ。ＩＬ−２の生産は、ＩＬ−２ ＥＬＩＳＡキット（ｈ
ｕＩＬ−２ Ｄｕｏｓｅｔ、ジェンザイム社）を用いて解析した。
【００９９】 結果。 ＣＤ８０−Ｆａｂ融合タンパク質についての説明。このＦａｂ部分はＩｇＧ２Ａ
／ｋモノクローナル抗体Ｃ２１５の可変ドメインを含むが（Ｄｏｈｌｓｔｅｎら
、１９９５）、マウスのＩｇＧ１／ｋアイソタイプのものである。トリペプチド
配列ＧＧＰは、ＣＨ１ドメイン内の鎖内ジスルフィド形成システインに続く。Ｃ
Ｄ８０−Ｃ２１５Ｆａｂ−ＳＥＡｍ５７三重融合タンパク質内で、これはＦｄと
五つの置換を有するブドウ球菌エンテロトキシンＡ変異型（ＳＥＡ；Ｂｅｔｌｅ
ｙら１９８８）間のスペーサーとして機能する。Ｆ４７ＡおよびＤ２２７Ａ置換
はＭＨＣクラスＩＩへの親和性を低下させるために導入し（Ａｂｒａｈｍｓｅｎ
ら、１９９５）、Ｎ１０２Ｑ、Ｎ１４９Ｄ、およびＴ２１８Ｖ置換は真核細胞で
生産した場合に起こる偶発性の糖鎖形成を避けるために導入した。これら後者の
置換は、Ｘ線構造の助けにより選択した（Ｓｕｎｄｓｔｒｏｍら、１９９６）。
五つの変異体の変異型は、ＳＥＡ変異型５７と命名した。両融合タンパク質は、
ヒトＣＤ８０の細胞外ドメインを含む（末端はＦＰＤＮで終結する）。天然のＣ
Ｄ８０シグナルペプチドを使用し、精製ＣＤ８０−Ｃ２１５Ｆａｂをアミノ酸配
列決定により決定されるように、成熟タンパク質はＶＩＨＶで開始することが認
められた。１８アミノ酸のスペーサーは、ＣＤ８０−Ｃ２１５Ｆａｂ内ではκ鎖
と共にＣＤ８０に結合し、ＣＤ８０−Ｃ２１５Ｆａｂ−ＳＥＡｍ５７三重融合タ
ンパク質内ではＦａｂフラグメントのＦｄ部分に結合する。スペーサーはＱリン
カー（Ｗｏｏｔｏｎら、１９９６）に似ており、それぞれＳＡＲＱＡＮＥＬＰＧ
ＡＰＳＱＥＥＲＡ（配列番号１５）およびＳＡＲＱＡＮＥＬＰＧＡＰＳＱＥＥＲ
Ｐ（配列番号１６）の配列を有する。
【０１００】 ＦＡＣＳ解析：ＣＤ８０−Ｃ２１５融合タンパク質のＣＤ２８陽性細胞および
Ｃ２１５陽性細胞への結合。
【０１０１】 ＣＤ２８陽性細胞：ＣＨＯ−ＣＤ２８細胞は、ＣＤ８０−Ｃ２１５Ｆａｂ、Ｃ
Ｄ８０−Ｃ２１５Ｆａｂ−ＳＥＡｍ５７、あるいＣ２１５Ｆａｂ−ＳＥＡで染色
した後、ＰＥ標識した抗マウスκ鎖ｍＡＢと共にインキュベーションした。染色
は４℃にて行い、洗浄は省略した。
【０１０２】 ＣＤ８０−Ｃ２１５Ｆａｂも三重融合タンパク質も、ＣＨＯ細胞上に発現した
ＣＤ２８に用量依存的に結合した。予想通り、コントロールの融合タンパク質Ｃ
２１５Ｆａｂ−ＳＥＡでは染色は見られなかった。
【０１０３】 Ｃ２１５陽性細胞。Ｃ２１５抗原に対する融合タンパク質の結合は、Ｃｏｌｏ
２０５細胞において評価した。Ｃｏｌｏ２０５細胞は、ＣＤ８０−Ｃ２１５Ｆａ
ｂ、ＣＤ８０−Ｃ２１５Ｆａｂ−ＳＥＡｍ５７、あるいＣ２１５Ｆａｂ−ＳＥＡ
で染色した後、ＰＥ標識した抗マウスκ鎖ｍＡＢと共にインキュベーションした
。染色は４℃にて行い、各染色ステップの間に３回洗浄した。
【０１０４】 結果（図１〜２）：ＣＤ８０−Ｃ２１５ＦａｂもＣＤ８０−Ｃ２１５Ｆａｂ−
ＳＥＡｍ５７も、Ｃ２１５抗原陽性Ｃｏｌｏ２０５細胞に用量依存的に結合した
。結合は、Ｃ２１５Ｆａｂ−ＳＥＡと比較して５０〜１００倍低かった。このこ
とから、ＣＤ８０を融合タンパク質のＮ末端部分へ導入することにより、Ｃ２１
５Ｆａｂ部分のＣ２１５抗原への結合が阻害されうることが示唆された。
【０１０５】 二重融合。スーパー抗原活性化Ｔ細胞の同時刺激。
【０１０６】 融合タンパク質の生物活性を測定するため、それらをスーパー抗原活性化Ｔ細
胞の同時刺激について試験した。
【０１０７】 増殖：Ｔ細胞をＣｏｌｏ２０５細胞、４μＭ Ｃ２４２Ｆａｂ−ＳＥＡ、およ
び様々な量のＣＤ８０−Ｃ２１５Ｆａｂと共に４日間インキュベーションし、そ
の後取り込まれた３Ｈ−チミジンをカウントすることにより増殖を測定した。Ｃ
Ｄ８０−Ｃ２１５Ｆａｂなしで得られた活性は、２００３９ ｃｐｍ ± １７
５０であった。
【０１０８】 ＩＬ−２生産。Ｔ細胞をＣｏｌｏ２０５細胞、４μＭ Ｃ２４２Ｆａｂ−ＳＥ
Ａ、および様々な量のＣＤ８０−Ｃ２１５Ｆａｂと共に４日間インキュベーショ
ンし、その後上清を回収しＩＬ−２量を測定した。ＣＤ８０−Ｃ２１５Ｆａｂな
しで得られたＩＬ−２量は、２８４９ｐｇ／ｍｌであった。
【０１０９】 結果（図３〜４）：ＣＤ８０−Ｃ２１５Ｆａｂは、増殖とＩＬ−２生産の両方
で見られるように、用量依存的にＣ２４２Ｆａｂ−ＳＥＡの誘導するＴ細胞活性
化を同時刺激した。
【０１１０】 三重融合。スーパー抗原活性化Ｔ細胞の同時刺激。
【０１１１】 三重融合タンパク質の生物活性を試験するため、精製したＴ細胞をＣｏｌｏ２
０５細胞上に提示されたＣ２１５Ｆａｂ−ＳＥＡｍ２３（ｍ２３は、三重融合タ
ンパク質に用いたのと同様のＭＨＣクラスＩＩ結合に影響を与えるＳＥＡ変異型
である、すなわちＰｈｅ４７Ａｌａ／Ａｓｐ２２７Ａｌａ）またはＣＤ８０−Ｃ
２１５Ｆａｂ−ＳＥＡｍ５７と共にインキュベーションした。増殖：４日後、取
り込まれた３Ｈ−チミジンをカウントした。ＩＬ−２生産：４日後、上清を回収
しＩＬ−２含量を測定した。
【０１１２】 結果（図５〜６）：三重融合タンパク質は、Ｃｏｌｏ２０５細胞上に提示され
た場合に、Ｔ細胞の活性化およびＩＬ−２産生を誘導した。Ｃ２１５Ｆａｂ−Ｓ
ＥＡｍ２３ではそのような活性が見られなかったことから、活性化にはＣＤ８０
による同時刺激が重要であることが示唆される。三重融合タンパク質の結合親和
性が低いため（Ｃ２１５Ｆａｂ−ＳＥＡと比較して５０−１００倍低い、ＦＡＣ
Ｓデータを参照のこと）、細胞に結合したＣ２１５Ｆａｂ−ＳＥＡｍ２３の実際
量は、実質的には三重融合タンパク質よりも高いようである。
【０１１３】 実施例２．標的ＩＬ−２は、ＦａｂＳＥＡのＴ細胞活性化に対する効果と腫瘍
治療における効果を増強し維持する。
【０１１４】 方法と材料： ＩＬ−２発現プラスミドの構築。ＩＬ−２ ｃＤＮＡは、スーパー抗原ＳＥＡで
２４時間刺激したヒト末梢血単球（ＰＢＭ）から調製したｍＲＮＡを用いて、Ｒ
Ｔ−ＰＣＲによりクローニングした。ｍＲＮＡは、Ｄｙｎａｌ社、オスロのＲＮ
Ａ Ｄｉｒｅｃｔ キットを用いてメーカーの指示する方法に従い、５ｘ１０６ 細胞から単離した。オリゴ（ｄＴ）２６コーティングしたマグネティックビーズ
にアニールしたｍＲＮＡは、９５℃に加熱することにより溶出した。続いて、Ｔ
ａｑポリメラーゼのもつＲＴおよびＤＮＡポリメラーゼ活性を利用し、ＲＴ−Ｐ
ＣＲによりＰＣＲ産物を得た。溶出したｍＲＮＡの１／１０量をＰＣＲプライマ
ーＩＬ２−１およびＩＬ２−２と混合し、標準のＰＣＲ反応を行った（３０ラウ
ンド）。ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動に供し、バンドをゲルから切りだ
し、Ｐｒｅｐ−ａ−ｇｅｎｅキット（バイオラッド社）を用いて精製した。その
フラグメントをＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで消化した後、ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ
で消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳＩＩにクローニングした。インサート
をシークエンシングし、以前に報告されたＩＬ−２ ｃＤＮＡ（Ｔａｎｉｇｕｃ
ｈｉら、１９８３）と同一であることを確認した。しかし、ＰＣＲ反応の結果、
Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−
Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ（配列番号
２３）“Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｑリンカー”をコードするＤＮＡセグメントを、成熟
ヒトＩＬ−２をコードする部分の５’に付加済みである。Ｑ−ｈＩＬ２は、研究
室所有のプラスミド（ＲｓｒＩＩ−ＸｂａＩで切断した）にＲｓｒＩＩ−Ｎｈｅ
Ｉフラグメントとしてクローニングした。結果として得られるプラスミドｐＭＳ
３０６により、Ｃ２１５ＦａｂＳＥＡ−Ｑ−ｈＩＬ２が大腸菌のペリプラズムに
分泌される。部分間のリンカーは、以下のようにさらに至適化した。Ｐｒｏ−Ａ
ｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐ
ｒｏ（配列番号１９）（本来のＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏを置換している）をコー
ドするリンカーコード領域を、部位特異的突然変異誘発を利用して、スーパー抗
原とＦａｂ部分コード領域間に導入した。同様に、リンカーＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ａ
ｒｇ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐ
ｒｏ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ（配列番号２０）、Ｇｌｙ−Ｐ
ｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａ
ｌａ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ（配列番号２１）、あ
るいはＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｐ
ｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ（配
列番号２２）を用い、ＩＬ−２とＦａｂ部分間の元のＱリンカーを置換した。二
重融合タンパク質との組み合わせにおいて、ＩＬ−２を重鎖あるいは軽鎖に融合
した構築体もそれぞれ比較した。
【０１１５】 プライマー：
【０１１６】
【表２】
【０１１７】 発酵槽での融合タンパク質の発現。融合タンパク質は、カナマイシン耐性遺伝子
およびｌａｃＵＶ５プロモーターを有するプラスミドを用いて、大腸菌 Ｋ−１
２株ＵＬ ６３５（ｘｙｌ−７，ａｒａ−１４，Ｔ４Ｒ，ｄｅｌｔａｏｍｐＴ）
で発現させた。凍結保存由来の細菌は、（ＮＨ４）２ＳＯ４、２．５；ＫＨ２Ｐ
Ｏ４、４．４５；Ｋ２ＨＰＯ４、１１．８５；クエン酸ナトリウム、０．５；Ｍ
ｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１；グルコース一水和物、１１、０．１１ｍＭカナマイシ
ン、および１ｍｌ／ｌ微量元素溶液（Ｆｏｒｓｂｅｒｇら、１９８９）を含みＮ
ａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏを含まない振盪フラスコ内で、２５℃にて約２１時間イ
ンキュベーションした。細胞はＯＤ６００が１〜２になるまで増殖させ、４５０
ｍｌの培養液を発酵槽（Ｃｈｅｍａｐ社、スイス）を播種するのに用い、最終用
量５ｌとした。発酵槽の培地は、（ＮＨ４）２ＳＯ４、２．５；ＫＨ２ＰＯ４、
９；Ｋ２ＨＰＯ４、６；クエン酸ナトリウム、０．５；グルコース一水和物、２
２；ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１（ｇ／ｌ）、０．１１ｍＭカナマイシン、１ｍｌ
アデカノール（アサヒデンカコウギョウ株式会社、日本）、および１ｍｌ／ｌ微
量元素溶液を含んだ。２５％アンモニアでの滴定によりｐＨを７．０に保ち、温
度は２５℃とし、大気５ｌ／分で通気した。溶存酸素の分圧は、バッチ相では撹
拌を３００から１０００ｒｐｍに上昇することにより、流加バッチ相では６０％
（ｗ／ｖ）グルコースの添加を制御することにより、３０％に調節した。産物の
形成は、ＯＤ６００が５０の時点で０．１ｍＭイソプロピルβ−Ｄチオガラクト
ピラノシド、ＩＰＴＧを加えることにより誘導した。発酵後、４℃にて８０００
ｘｇで４０分間遠心分離し、細胞を除去した。清澄化培養液は直接解析し精製す
るか、あるいは−２０℃にて保存した。
【０１１８】 融合タンパク質の精製。清澄化培養液中に存在するＤＮＡは、０．１９％ポリ
エチレンイミンと０．２Ｍ ＮａＣｌを用いて３０分間共沈させることにより（
ＡｔｋｉｎｓｏｎとＪａｃｋ、１９７３）除去した。先のように遠心分離した後
、上清を回収しＮａＣｌ濃度を０．５Ｍに調整した。この培養液を、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ８０を含む１０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、
ｐＨ７．４、ＰＢＳＴで平衡化したＰｒｏｔｅｉｎ Ｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカ
ラム（ファルマシアバイオテックＡＢ社、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）に供
した。次にカラムを５カラム容量のＰＢＳＴで洗浄し、結合したタンパク質を０
．１Ｍ酢酸、０．０２％ Ｔｗｅｅｎ ８０、ｐＨ３．２で溶出した。１ Ｍ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０でサンプルのｐＨを５．０に調整し、５０ｍＭ酢
酸アンモニウム、０．０２％ Ｔｗｅｅｎ ８０で平衡化したＳＰ Ｓｅｐｈａ
ｒｏｓｅ ＨＰカラム（ファルマシアバイオテック社）に供した。次にカラムを
２カラム容量の平衡化バッファーで洗浄し、１０カラム容量以上の５０から５０
０ｍＭ酢酸アンモニウムの線状濃度勾配を利用して融合タンパク質を溶出した。
分離の際、Ｃ２１５Ｆａｂ−ＳＥＡ−ＩＬ２三重融合タンパク質についてはｐＨ
は５．７を用い、Ｃ２１５Ｆａｂ−ＩＬ２融合タンパク質についてはｐＨ６．０
を用いた。融合タンパク質は０．２２μｍフィルターで濾過し、−７０℃にて保
存した。濃度が０．５〜１ｍｇ／ｍｌよりも薄い場合には、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ ３０（アミコン社）を用いメーカーの指示する方法にしたがって、最終濃度０
．５〜１ ｍｇ／ｍｌになるよう濃縮した。
【０１１９】 細胞傷害性アッセイ。ＭＨＣクラスＩＩ依存性および非依存性の細胞傷害性ア
ッセイは、以前に記述されたように（Ｄｏｈｌｓｔｅｎら、１９９０）実施した
。簡単に説明すると、ＭＨＣクラスＩＩ依存性アッセイでは、５１Ｃｒ−標識Ｒ
ａｊｉ細胞（最終用量２００μｌでウェル当たり２，５００細胞）を、低レベル
の組換えｈＩＬ−２存在下でヒトＰＢＭをインキュベーションすることにより作
製したＳＥＡ依存性エフェクター細胞株と混合した。エフェクター：標的細胞比
は３０：１であった。ＭＨＣクラスＩＩ非依存性アッセイでは、５１Ｃｒ−標識
Ｃ２１５＋Ｃｏｌｏ２０５細胞（２，５００細胞）をＳＥＡ依存性エフェクター
細胞と、エフェクター：標的細胞比４５：１で混合した。４時間インキュベーシ
ョンした後、培養液に遊離した５１Ｃｒをシンチレーションカウントすることに
より測定した。
【０１２０】 精製ヒトＴ細胞でのインビトロ同時刺激アッセイ。天然のヒトＴ細胞は、基本
的にＬａｎｄｏら（１９９３）により記述された方法で精製した。簡単に説明す
ると、天然のヒトＴ細胞は、フィコール勾配遠心分離によりヒト血液ＰＢＭから
精製後、ゼラチンカラムで分離し、最後にＨＮＫ１とＨＬＡ−ＤＲ ｍＡｂを含
むペトリ皿でパニングすることによりネガティブ選択した。天然ヒトＴ細胞を用
いての増殖実験は、基本的にＬａｎｄｏら（１９９６）により記述された方法で
実施した。簡単に説明すると、全量２００μｌの補足物を含むＲＰＭＩ−１６４
０中で、天然のヒトＴ細胞（ウェル当たり１００，０００細胞）を照射したＣＨ
Ｏトランスフェクタント（ウェル当たり１０，０００細胞）とあわせた（Ｌａｎ
ｄｏら、１９９３）。ＩＬ−２を含む融合タンパク質を用いた実験では、細胞を
１ｎＭの表示物質存在下で７日間インキュベーションした。実験の最終日に、細
胞を３Ｈ−チミジンでパルスし、分裂細胞へのＤＮＡへの取り込みを測定した。
【０１２１】 Ｂ１６−Ｃ２１５腫瘍の治療。治療は、基本的に以前に記述されたように（Ｄ
ｏｈｌｓｔｅｎら、１９９４；Ｈａｎｓｓｏｎら、１９９７）実施した。０日目
に、Ｃ５７ Ｂｌ／６マウスの尾静脈に、７５，０００〜１５０，０００個の同
系Ｂ１６−Ｆ１０メラノーマ細胞を静脈内注射した。これらのＢ１６細胞は、Ｃ
２１５ｍＡｂにより認識されるヒトＧＡ−７３３抗原を発現していた。１、３、
あるいは５日目に、Ｃ２１５Ｆａｂタンパク質による治療を開始した。２１日目
に実験を終了し、その時、肺を摘出して播種性肺腫瘍をカウントした。
【０１２２】 免疫組織化学法は、基本的に以前記述されたように（Ｄｏｈｌｓｔｅｎら、１
９９５）、１８日目のＢ１６−Ｃ２１５腫瘍を保有する動物の肺において実施し
た。最終注射から４時間後に、サンプルを摘出した。染色領域は手で測定した。
【０１２３】 免疫薬理学法は、基本的に以前記述されたように（Ｒｏｓｅｎｄａｈｌら、１
９９６）実施した。毎日１あるいは３回注射したＣ５７ Ｂｌ／６マウスの脾臓
を最終注射から４８時間後に摘出し、Ｒａｊｉ細胞を標的として使用し、上記し
た標準５１Ｃｒ遊離アッセイによりＳＥＡ依存性細胞傷害を測定した。エフェク
ター：標的細胞比は１００：１であった。
【０１２４】 結果と考察： ＩＬ−２を含む融合タンパク質の生産と精製。Ｃ２１５ＦａｂＳＥＡ−Ｑ−ｈＩ
Ｌ２三重融合タンパク質をコードする大腸菌発現ベクターを構築した。このベク
ターは、ＬａｃＵＶ５プロモーターから転写されるバイシストロン性ｍＲＮＡ上
に、三重融合タンパク質の二つのサブユニットをコードする。二つのサブユニッ
トはそれぞれ、大腸菌のペリプラスム空間に輸送するシグナルペプチドを上流に
有する。第一のサブユニットはＣ２１５ＦａｂのＶＨであり、これにＧｌｙ−Ｇ
ｌｙ−Ｐｒｏリンカーが続く（ＶＨ−ＣＨ１−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＳＥＡ
）。もう一方のサブユニットはＣ２１５ＦａｂのＶＫであり、次にＣ２４２Ｆａ
ｂのＣＫが続くが、これはＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｑリンカーを介してヒトＩＬ−２に
結合する（Ｖｋ−Ｃｋ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｑ−ｈＩＬ２）。Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｑ
リンカー配列（配列番号２３）は、ＯｍｐＲ 大腸菌タンパク質に見られる天然
リンカー（Ｗｏｏｔｔｏｎら、１９８９）をわずかに修飾したものである。さら
に完全な情報については、材料と方法を参照のこと。また、Ｃ２１５Ｆａｂ−Ｑ
−ｈＩＬ２融合タンパク質も生産した。これは、タンパク質のＧｌｙ−Ｇｌｙ−
Ｐｒｏ−ＳＥＡ部分が除去されていることを除けば、Ｃ２１５ＦａｂＳＥＡ−Ｑ
−ｈＩＬ２と同一である。したがって、発現ベクター内でこれに相当するＤＮＡ
配列は除去してある。Ｃ２１５ＦａｂＳＥＡ−Ｑ−ｈＩＬ２の変異派生体は、標
準的な方法であるＰＣＲを介した部位特異的突然変異誘発により作製し、Ｃ２１
５ＦａｂＳＥＡＤ２２７Ａ−Ｑ−ｈＩＬ２やＣ２１５ＦａｂＳＥＡＤ２２７Ａ−
Ｑ−ｈＩＬ２Ｆ４２Ａ等の種々のタンパク質を生成した。三重融合タンパク質の
後半の変種では、サブユニット間のシステインは二つのセリン残基で置換してい
る。この変化は生物活性に影響を与えない。
【０１２５】 ＩＬ−２を含むタンパク質をコードするプラスミドを大腸菌生産株ＵＬ６３５
に形質転換し、続いて発酵を行った。融合タンパク質は、プロテインＧ親和性ク
ロマトグラフィーにより培養液から精製した。イオン交換クロマトグラフィーに
より、融合タンパク質の切断変種を除去した。得られた産物は、ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ（材料と方法）により調べたところ、少なくとも９０ ％が完全長融合タンパ
ク質であった。融合タンパク質について最適な設計を使用して、１３０ｍｇ／ｌ
までの融合タンパク質が増殖培地中に得られ、典型的には１ｌの培地から７０ｍ
ｇの三重融合タンパク質が得られた。
【０１２６】 ＩＬ−２を含むＦａｂ融合タンパク質の機能的性質。Ｃ２１５ＦａｂＳＥＡ−
Ｑ−ｈＩＬ２やＣ２１５Ｆａｂ−Ｑ−ｈＩＬ２等のＩＬ−２を含む融合タンパク
質がＩＬ−２依存性マウス細胞株ＣＴＬＬ−２の増殖を誘導する能力は、モルベ
ースにおいて基本的に組換えＩＬ−２のものと類似している（データは示さず）
。さらに、Ｃ２１５ＦａｂＳＥＡ−Ｑ−ｈＩＬ２とＣ２１５ＦａｂＳＥＡの抗原
結合およびＳＥＡ活性は、種々のアッセイにおいて区別不可能なほど同程度であ
り、このことから分子にＩＬ−２を導入しても悪影響を及ぼさないことが示唆さ
れた。これらのアッセイには、４時間の５１Ｃｒ遊離アッセイにおける、ＳＥＡ
反応性Ｔ細胞エフェクター細胞株によるＣ２１５＋ヒト大腸癌細胞株ｃｏｌｏ２
０５のＭＨＣクラスＩＩ非依存性傷害を誘導する能力が含まれる。ＳＥＡ反応性
エフェクターＴ細胞によるＭＨＣクラスＩＩ＋ Ｒａｊｉ（ラットリンパ腫）細
胞のＭＨＣクラスＩＩ依存性傷害も、同様の効率で起こった（データは示さず）
。Ｃ２１５抗原とＭＨＣクラスＩＩへの結合が確実であるというより直接的証拠
は、ＦＡＣＳ解析により得た。Ｒａｊｉ細胞へのＣ２１５ＦａｂＳＥＡとＣ２１
５ＦａｂＳＥＡ−Ｑ−ｈＩＬ２の用量依存的な結合は、モルベースにおいて同様
であることが見出された（データは示さず）。ｃｏｌｏ２０５細胞へのＣ２１５
ＦａｂＳＥＡ−Ｑ−ｈＩＬ２とＣ２１５Ｆａｂ−Ｑ−ｈＩＬ２の用量依存的な結
合が、Ｃ２１５ＦａｂＳＥＡで見られたものと同様であることも認められ（デー
タは示していない）、このことからＩＬ−２を含む融合タンパク質において抗原
結合が確実であることが示唆された。
【０１２７】 ＦａｂＳＥＡによるＩＬ−２依存性増殖。至適なＴ細胞増殖と活性化を誘導す
るためには、休止ヒトＴ細胞はシグナル１とシグナル２の両方を必要とする（Ｓ
ｃｈｗａｒｔｚら、１９９０）。スーパー抗原は細胞上に提示された場合、シグ
ナル１を伝達できる。Ｂ７／ＣＤ２８シグナル伝達の主要な下流エフェクターで
あるＩＬ−２は、シグナル２を与えると予測される。
【０１２８】 ここで我々は、ヒト血液から精製した休止Ｔ細胞を用い、Ｃ２１５ＦａｂＳＥ
Ａ−Ｑ−ｈＩＬ２三重融合タンパク質、あるいはＣ２１５Ｆａｂ−Ｑ−ｈＩＬ２
または組換えヒトｈＩＬ−２と組み合わせたＣ２１５ＦａｂＳＥＡが、インビト
ロにおいて確かにＴ細胞増殖を誘導することを示している（図７）。
【０１２９】 ＩＬ−２（Ｃ２１５Ｆａｂ−Ｑ−ｈＩＬ２、Ｃ２１５ＦａｂＳＥＡ−Ｑ−ｈＩ
Ｌ２、あるいは組換えヒトＩＬ−２の形で）存在下で、休止ヒトＴ細胞を標的Ｓ
ＥＡと共にインキュベーションした。ＳＥＡは、Ｃ２１５抗原（Ｆａｂ部分を介
して）、ＳＥＡに結合するＭＨＣクラスＩＩ／Ｄｒでトランスフェクションした
照射ＣＨＯ細胞上に提示された。トランスフェクションしていないＣＨＯ細胞を
対照とした。Ｔ細胞をＣＨＯトランスフェクタントおよび当該物質とインキュベ
ーションしてから７日後、３Ｈ−チミジンのＤＮＡへの取り込みにより増殖を測
定した。
【０１３０】 Ｃ２１５ＦａｂＳＥＡ−Ｑ−ｈＩＬ２は、Ｆａｂが標的とするヒトＣ２１５抗
原でトランスフェクションしたＣＨＯ細胞上に提示された場合に（ＣＨＯ−Ｃ２
１５）、ヒトＴ細胞の増殖を誘導した（図７）。同様に、このタンパク質がＣＨ
Ｏ−Ｄｒ（ヒトＭＨＣクラスＩＩ）に提示された場合にも増殖が誘導されたが、
トランスフェクションしていないＣＨＯ細胞（ＣＨＯ）の存在下、あるいはＣＨ
Ｏ細胞の非存在下（Ｒ１０）では増殖は見られなかった。Ｃ２１５ＦａｂＳＥＡ
あるいはＣ２１５Ｆａｂ−Ｑ−ｈＩＬ２はＣＨＯ細胞上に提示されても顕著な増
殖を誘導せず、このことは、増殖の誘導にはＳＥＡとＩＬ−２の両者が実際に必
要であることが示された。これは、Ｃ２１５ＦａｂＳＥＡとＣ２１５Ｆａｂ−Ｑ
−ｈＩｌ２あるいはＣ２１５ＦａｂＳＥＡと組換えヒトＩＬ−２の組み合わせが
、Ｃ２１５ＦａｂＳＥＡ−Ｑ−ｈＩＬ２により誘導されたものと質的に同様の効
果を誘導することから、確認された。これにより、このアッセイではＩＬ−２は
必要であるが、ＳＥＡとは異なり細胞に結合している必要がないことも示される
。
【０１３１】 Ｃ２１５ＦａｂＳＥＡとＣ２１５Ｆａｂ−Ｑ−ｈＩＬ２の組み合わせと同様に
Ｃ２１５ＦａｂＳＥＡ−Ｑ−ｈＩＬ２も、Ｔ細胞活性化の増強と維持を引き起こ
し、インビボでの腫瘍浸潤を改善した。標的細胞のＳＥＡ依存性傷害を誘導する
能力により測定されるように、Ｃ２１５Ｆａｂ−Ｑ−ｈＩＬ２ ＋ Ｃ２１５Ｆ
ａｂＳＥＡとＣ２１５ＦａｂＳＥＡ−Ｑ−ｈＩＬ２の両方ともが、Ｃ２１５Ｆａ
ｂＳＥＡよりも強力なＴ細胞活性化インデューサーであった（図８）。簡単に説
明すると、示したタンパク質を毎日１あるいは３回マウスに注射投与した。最終
注射から２日後、処理したマウスから脾臓を摘出し、ＳＥＡコーティングしたＲ
ａｊｉ細胞に対する細胞傷害活性を標準の４時間５１Ｃｒ遊離アッセイにて測定
した。
【０１３２】 Ｃ２１５ＦａｂＳＥＡ−Ｑ−ｈＩＬ２とＣ２１５ＦａｂＳＥＡ／Ｃ２１５Ｆａ
ｂ−Ｑ−ｈＩＬ２は、Ｔ細胞の活性化を増強した上にこれを維持した。ＩＦＮγ
等の血清サイトカインレベルは、Ｃ２１５ＦａｂＳＥＡの４度目の注射後に急激
に減少するが、Ｃ２１５ＦａｂＳＥＡ−Ｑ−ｈＩＬ２の４度目の注射後では非常
に高レベルのまま留まった（データは示さず）。概して、ＩＦＮγとＴＮＦαレ
ベルはＣ２１５ＦａｂＳＥＡの場合よりも極めて高かった（１０倍まで）。
【０１３３】 Ｃ２１５ＦａｂＳＥＡとＣ２１５Ｆａｂ−Ｑ−ｈＩＬ２の組み合わせ治療によ
る、樹立Ｂ１６−Ｃ２１５腫瘍の改良療法。ＦａｂＳａｇ腫瘍治療でのＩＬ−２
による効果を、ネズミＢ１６メラノーマモデルで実験した（図９）。示した例で
は、０日目に、８〜１２週齡のＣ５７ Ｂｌ／６雌マウスに、Ｃ２１５ ｍＡｂ
が標的とするヒト腫瘍抗原ＧＡ−７３３でトランスフェクションした１５０，０
００個のＢ１６細胞を接種した（以下ではＢ１６−Ｃ２１５と示す）。５、６、
および７日目に、示した物質を注射した。データはそれぞれ７匹の動物に対応す
るものである。２１日目に動物を殺し、肺にコロニー形成したメラニン色素性の
Ｂ１６腫瘍をカウントした。種々の実験において、Ｃ２１５ＦａｂＳＥＡとＣ２
１５Ｆａｂ−Ｑ−ｈＩＬ２の組み合わせは、未処理の対照と比較するとＣ２１５
ＦａｂＳＥＡよりも優れた治療効果をもたらすことが示された（図９）。示した
実験では、Ｃ２１５ＦａｂＳＥＡ／Ｃ２１５Ｆａｂ−Ｑ−ｈＩＬ２の組み合わせ
治療は、Ｃ２１５ＦａｂＳＥＡ−Ｑ−ｈＩＬ２三重融合タンパク質よりもすぐれ
た治療効果を示した。
【０１３４】 続く免疫組織化学的研究では、Ｃ２１５ＦａｂＳＥＡ単独またはＣ２１５Ｆａ
ｂＳＥＡとＣ２１５Ｆａｂ−Ｑ−ｈＩｌ２の組み合わせにより、同程度の数のＢ
１６−Ｃ２１５腫瘍浸潤ＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞を生じることが明らかにな
った。しかしながら興味深いことに、Ｔ細胞活性化の良いマーカーであるＣＤ２
５（ＩＬ２Ｒａ）陽性細胞は、Ｃ２１５ＦａｂＳＥＡ／Ｃ２１５Ｆａｂ−Ｑ−ｈ
ＩＬ２の３回目と４回目の注射間に急激に増加した（図１０）。対照的に、Ｃ２
１５ＦａｂＳＥＡの場合には減少し、これはアネルギーの開始を示す。浸潤する
Ｔ細胞の質は、このようにＣ２１５ＦａｂＳＥＡ単独よりも組み合わせ治療の場
合に高くなり、これにより治療効果が改善されたことが説明できる。同様に、Ｔ
細胞活性化により二次的に産生されるインターフェロンγ等の血清サイトカイン
は、ＦａｂＳＥＡの４回目の注射後に顕著に減少する（図１１）。しかし、Ｆａ
ｂＳＥＡ−Ｑ−ｈＩＬ２三重融合タンパク質では、４回目の注射後でもインター
フェロンレベルは高いまま維持された。この結果から、構築体中にＩＬ−２を含
むことで、Ｆａｂ−ＳＥＡの誘導するＴ細胞アネルギーが阻害されることも示さ
れた。
【０１３５】 Ｃ２１５ＦａｂＳＥＡＤ２２７Ａ−Ｑ−ｈＩＬ２によるＢ１６−Ｃ２１５腫瘍
の改良療法。スーパー抗原はマウスよりもヒトにおいて毒性が強く、一部にはヒ
トでのＭＨＣクラスＩＩへの親和性がかなり高いためである（Ｈａｎｓｓｏｎら
、１９９７）。よって、ＦａｂＳＥＡタンパク質の全身性毒性がヒトでの治療に
おいて大きな限界になると予想される。全身性免疫活性化（ＳＥＡ−ＭＨＣクラ
スＩＩ依存性）に対して腫瘍での部分的活性化（Ｆａｂ依存性）を上昇させる一
手段は、ＳＥＡのＭＨＣクラスＩＩに対する親和性を減少させることである。我
々はＳＥＡの結晶構造に基づいて、ＭＨＣクラスＩＩに対する親和性が１００倍
低いＣ２１５ＦａｂＳＥＡの変異型、Ｃ２１５ＦａｂＳＥＡＤ２２７Ａを作製し
た。これは野生型のＣ２１５ＦａｂＳＥＡとは異なり、ＭＨＣクラスＩＩ分子に
架橋する能力をもたない。この架橋が、ＳＥＡを介する全身性毒性の主要な理由
であると考えられている（Ｈａｎｓｓｏｎら、１９９７）。
【０１３６】 Ｖｂ３ ＴＣＲトランスジェニックマウスの１日目Ｂ１６−Ｃ２１５腫瘍の治
療における効果的な治療と毒性間の幅は、Ｃ２１５ＦａｂＳＥＡと比較してＣ２
１５ＦａｂＳＥＡＤ２２７Ａの方が少なくとも５０倍広範であった（Ｈａｎｓｓ
ｏｎら、１９９７）。この観察に従い、免疫組織化学法により、同様の治療効果
をもたらす二つのタンパク質の用量では、腫瘍において同程度の免疫活性化が見
られたが、全身性免疫活性化はＣ２１５ＦａｂＳＥＡＤ２２７Ａで治療した脾臓
の方が極度に低いことが示された（Ｈａｎｓｓｏｎら、１９９７）。さらに、ウ
サギでの薬物動態学的研究により、ほとんどのＭＨＣクラスＩＩ＋細胞が局在す
る脾臓や他のリンパ系器官へのＣ２１５ ＦａｂＳＥＡＤ２２７Ａの標的化が、
Ｃ２１５ＦａｂＳＥＡの場合と比較して顕著に減少することが示された（データ
は示さず）。
【０１３７】 臨床での使用には、Ｆａｂ−ＳＥＡ−ＩＬ２三重融合タンパク質は、変異した
スーパー抗原を含むことが予測される。それゆえ我々は、Ｃ２１５ＦａｂＳＥＡ Ｄ２２７Ａ −Ｑ−ｈＩＬ２三重融合タンパク質を作製した。生産されたタンパク
質は休止ヒトＴ細胞の増殖を誘導し（データは示さず）、６回注射までマウスで
の維持されたＳＥＡ依存性ＣＴＬ活性を誘導した（図１２）。対照的に、Ｃ２１
５ＦａｂＳＥＡＤ２２７Ａ（＜ １０％−データは示さず）およびＣ２１５Ｆａ
ｂ−Ｑ−ｈＩＬ２（＜ １５％−データは示さず）では、バックグラウンドのＣ
ＴＬ活性が見られた。正常Ｃ５７ Ｂｌ／６マウスにおいてこのタンパク質の日
に一度の注射投与を８回繰り返すことにより、樹立（３日目）Ｂ１６−ＧＡ７３
３腫瘍の治療は、Ｃ２１５ＦａｂＳＥＡの至適投与量でと同程度の良好な効果を
もたらした（図１３）。Ｃ２１５ＦａｂＳＥＡＤ２２７Ａはマウスではなくヒト
での至適活性をデザインしたもので、このシステムではわずかな効果しか示さな
かった（図１３）。しかしながら、最高投与量では、Ｃ２１５ＦａｂＳＥＡＤ２ ２７Ａ −Ｑ−ｈＩＬ２による毒性がいくらか認められた。対照的に、様々な治療
実験で、Ｃ２１５ＦａｂＳＥＡＤ２２７ＡとＣ２１５Ｆａｂ−Ｑ−ｈＩＬ２との
組み合わせにより（８回注射）、Ｖｂ３ ＴＣＲトランスジェニックマウスでの
３日目Ｂ１６−ＧＡ７３３腫瘍の治療がＣ２１５ＦａｂＳＥＡＤ２２７Ａ単独と
比較して実質的に改善されることが示された（データは示さず）。正常マウスで
は１０〜２０％のＴ細胞がＳＥＡに反応するのに対し、Ｖｂ３ ＴＣＲトランス
ジェニックマウスでは、＞９０％のＴ細胞がＳＥＡに反応する。興味深いことに
、Ｃ２１５ＦａｂＳＥＡＤ２２７Ａ−Ｑ−ｈＩＬ２を繰り返し注射した（８回ま
で）ウサギでは（２０μｇ／ｋｇでの繰り返し注射後、０／４のウサギが死亡）
、ＩＬ−２なしでのＣ２１５ＦａｂＳＥＡＤ２２７Ａの場合（２０μｇ／ｋｇで
の繰り返し注射後、０／４のウサギが死亡；２０μｇ／ｋｇで４／４のウサギが
死亡）よりも毒性があるとは認められず、Ｃ２１５ＦａｂＳＥＡの場合（１μｇ
／ｋｇでの繰り返し注射後、１／４のウサギが死亡）よりも毒性はかなり低かっ
た。同時に、免疫活性化の維持（リンパ球リバウンド効果）がＣ２１５ＦａｂＳ
ＥＡＤ２２７Ａ−Ｑ−ｈＩＬ２での治療後のみに見られ、Ｃ２１５ＦａｂＳＥＡ Ｄ２２７Ａ やＣ２１５ＦａｂＳＥＡでの治療後にはは見られないことから、ＩＬ
−２を含むことによりＦａｂＳＥＡの誘導するＴ細胞アネルギーが阻害されるこ
とが示された。
【０１３８】 ＩＬ−２を変異したＣ２１５ＦａｂＳＥＡＤ２２７Ａ−Ｑ−ｈＩＬ２タンパク
質による、Ｂ１６−Ｃ２１５腫瘍の療法。ＩＬ−２を含む三重融合タンパク質が
細胞毒性が高く、Ｃ２１５ＦａｂＳＥＡ−Ｑ−ｈＩＬ２の場合に治療効果が低い
ことは、一１部には、ＳＥＡ活性がリンパ系組織への“再標的化”することによ
ると考えられる。この再標的化効果は、ＩＬ２のレセプターに対する親和性が高
いためであり（Ｋｄ＝１０ｐＭ）、レセプターは主に脾臓や他のリンパ系組織に
存在するＴ細胞上に見られる。この疑問を解くため、我々は、ＩＬ２Ｒ＋細胞へ
の親和性およびそれによって起こる全身性活性化を低下させるようにＩＬ−２部
分を変異させた、Ｃ２１５ＦａｂＳＥＡＤ２２７Ａ−Ｑ−ｈＩＬ２の派生物を作
製した。原則的には、Ｃ２１５ＦａｂＳＥＡＤ２２７Ａタンパク質の治療幅を改
善した際に用いたものと同様のアプローチである。
【０１３９】 ＩＬ−２とその高親和性レセプター間の相互関係は詳細に研究されている。レ
セプターはａ、ｂ、およびｇの３つのサブユニットを含む。ｂとｇの架橋が生物
活性に必要であり、ａサブユニットは至適な結合に必要である。我々の戦略は、
ａサブユニットの結合を除去することによりＩＬ−２の高親和性レセプター（ａ
ｂｇ）への親和性を低下させ、続いて必要に応じてｂおよびｇサブユニットの結
合を除去ではなく減少させるというものである。
【０１４０】 ＩＬ２Ｒａ結合を除去するように（Ｆ４２Ａ， Ｆ４２Ｋ）、さらにＩＬ２Ｒ
ｂ結合を低下させるように（Ｆ４２Ａ／Ｄ２０Ｓ）、Ｃ２１５ＦａｂＳＥＡＤ２ ２７Ａ −Ｑ−ｈＩＬ２の三つの変異型を設計した。これらのタンパク質は、ＩＬ
−２依存性ネズミ細胞株ＣＴＬＬ−２の増殖誘導において、それぞれ１００倍（
Ｆ４２Ａ）、１０００倍（Ｆ４２Ｋ）、および３０００倍（Ｆ４２Ａ／Ｄ２０Ｓ
）低い活性を有する。これらのタンパク質について詳しく調べるため、特に活性
化ヒトＴ細胞とＩＬ−２レセプターへの結合親和性とその比に関して調べるため
、実験は進行中である。最初の治療実験により、このようなストラテジーは可能
であると考えられる（図１４、図１５）。ここで示した実験では、３日目Ｂ１６
−ＧＡ７３３腫瘍を保有するＶｂ３ ＴＣＲトランスジェニックマウスに８回注
射した（＞９０％のＴ細胞がＳＥＡにより活性化される）。最高投与量では依然
毒性はいくらか見られるものの、Ｃ２１５ＦａｂＳＥＡＤ２２７Ａ−Ｑ−ｈＩＬ
２Ｆ４２ＡあるいはＣ２１５ＦａｂＳＥＡＤ２２７Ａ−Ｑ−ｈＩＬ２４２Ｋを用
いた場合（８回目注射）にはＣ２１５ＦａｂＳＥＡＤ２２７Ａ−Ｑ−ｈＩＬ２Ｆ
を用いた場合（６回目注射）よりも遅れて起こり、ＰＢＳ処理した対照と比較し
て最高投与量での治療では一貫して９０％を超える腫瘍減少が見られた（図１４
）。我々は最近、毒性幅の治療をさらに改善するため、ＳＥＡとＩＬ−２部分に
さらなる変異を導入することにより、高く期待されるこのアプローチを探索して
いる。
【０１４１】 さらに、作業はＩＬ−２部分にＴｈｒ５１Ｐｒｏ変異を含むＣ２１５ＦａｂＳ
ＥＡ− Ｑ−ｈＩＬ２三重融合タンパク質の作製段階にある（Ｃｈａｎｇら、１
９９６）。この変異により、ＩＬ−２の生物活性を損なうことなく、融合タンパ
ク質のＩＬ２Ｒを介するインターナリゼーションを阻害できる。融合タンパク質
がこの経路により除去されるのを減少させ、よって薬剤の局在濃度と効果が上昇
するため、これは重要であると思われる。Ｔｈｒ５１Ｐｒｏ変異したタンパク質
は、ＳＥＡおよびＩＬ−２部分に、それぞれＭＨＣクラスＩＩおよびＩＬ２レセ
プターへの親和性を減少させるさらなる変異を含むこともある。
【０１４２】 実施例３。（Ｓａｇ，ＩＭ）−コンジュゲートの効果を検証する実験。ＩＭレ
セプター陽性あるいはＭＨＣクラスＩＩ陽性細胞標的細胞。
【０１４３】 Ｓａｇ−ＩＭ分子はＭＨＣクラスＩＩを発現している細胞に結合し、それゆえ
ＳＤＣＣを促進する。また、ＩＭレセプターを発現している細胞も標的とされる
。よって、Ｓａｇ−ＩＭ分子が、ＩＭレセプターを発現している有害細胞の傷害
を誘導するのに有効である可能性がある。
【０１４４】 Ｃ２１５ＦａｂＳＥＡ−ｈＩＬ２三重融合タンパク質は、エフェクターも標的
細胞もＣ２１５Ｆａｂに認識される抗原を発現していない場合のＳａｇ−ＩＭ分
子であると考えられる。エフェクター細胞は、ＶβサブタイプのＴ細胞である。
標的細胞は、例えばある白血病やリンパ腫に存在するようなＩＬ−２レセプター
を発現している異常な造血細胞である。
【０１４５】 実験Ａ：インビトロでの概念の証明：エフェクターＴ細胞（ＳＥＡで繰り返し
刺激したヒトＴ細胞）と標的細胞（例えば、ヒト“Ｒａｊｉ”Ｂ細胞リンパ腫細
胞）を、ＭＨＣクラスＩへの結合を減少させるように変異したＣ２１５ＦａｂＳ
ＥＡ−ＩＬ２三重融合タンパク質と共にインキュベーションする。これは、ＳＤ
ＣＣアッセイの標準セットアップである（エフェクターＴ細胞、Ｒａｊｉ細胞、
実験物質）。我々は、実際に、ＭＨＣクラスＩＩへの親和性を大きく減少させた
Ｃ２１５ＦａｂＳＥＡＤ２２７Ａ−ｈＩＬ２タンパク質が、Ｒａｊｉ細胞の傷害
性においてＣ２１５ＦａｂＳＥＡＤ２２７Ａよりも約１０倍高い効力を有するこ
とを見出した。三重融合タンパク質がＲａｊｉ細胞に発現するＩＬ−２レセプタ
ー上に提示されることが、効力が上昇したことの明らかな説明となる。
【０１４６】 実験Ｂ：インビボでの概念の証明：ネズミリンパ腫モデル（Ｃ５７ Ｂｌ／６
マウスでのＲＢＬ−５リンパ腫等）が確立されている（Ｈｏｇｌｕｎｄら、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １６８：１４６９−１４７４）。そのようなモデルでの
Ｓａｇ−ＩＭタンパク質によるＩＬ−２レセプターあるいは他のＩＭ−Ｒの標的
化は、インビボにおけるＩＭレセプター陽性細胞標的化の概念の証明となる。
【０１４７】 ＩＭ−Ｒ陽性細胞のＳａｇ−ＩＭ標的化は、エフェクターと標的細胞の両方が
ＩＭに対するレセプターを頻繁に発現する事実により複雑化する。それにもかか
わらず、ある状況下では、治療のこの方法は効果的である。標的細胞上のＩＭ−
Ｒ発現密度、標的細胞の数や位置等の要因が、役割を果たしているようである。
例えばＴ細胞活性化においてＩＬ２Ｒαは単にアップレギュレートされ、よって
エフェクター細胞上ではなく標的細胞上にＩＭ−Ｒが多量に発現される一時的な
範囲があることも強調されるべきである。
【０１４８】 ＳａｇがＭＨＣクラスＩＩへの親和性を減少させるように変異した野生型スー
パー抗原を表すＳａｇ−ＩＭ融合タンパク質も、同様に利用可能である。
【０１４９】 参考文献 ＊ラベルした文献は、他の文献に比べて、より免疫調節因子に関連している。
【０１５０】
【表３】
【０１５１】
【表４】
【０１５２】
【表５】
【０１５３】
【表６】
【０１５４】
【表７】
【０１５５】
【表８】
【０１５６】
【表９】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 ＣＤ８０−Ｃ２１５Ｆａｂ、ＣＤ８０−Ｃ２１５Ｆａｂ−ＳＥＡｍ５７、ある
いはＣ２１５Ｆａｂ−ＳＥＡで染色した後、ＰＥ標識した抗マウスκ鎖ｍＡｂと
共にインキュベーションしたＣＨＯ−ＣＤ２８細胞のＦＡＣＳ解析。染色は洗浄
なしで行った。縦軸：平均チャネル。
【図２】 ＣＤ８０−Ｃ２１５Ｆａｂ、ＣＤ８０−Ｃ２１５Ｆａｂ−ＳＥＡｍ５７、ある
いはＣ２１５Ｆａｂ−ＳＥＡで染色した後、ＰＥ標識した抗マウスκ鎖ｍＡｂと
共にインキュベーションしたＣｏｌｏ２０５細胞のＦＡＣＳ解析。染色は４℃に
て行い、各染色ステップの間に３回洗浄した。縦軸：平均チャネル。横軸：標的
細胞（Ｔ）に対するエフェクター（Ｅ）比。
【図３】 増殖。Ｔ細胞をＣｏｌｏ２０５細胞、４ μＭ Ｃ２４２Ｆａｂ−ＳＥＡ、お
よび様々な量のＣＤ８０−Ｃ２１５Ｆａｂと共に４日間インキュベーションし、
その後取り込まれた３Ｈ−チミジンをカウントした。ＣＤ８０−Ｃ２１５Ｆａｂ
なしで得られた活性は、２０，０３９ｃｐｍ ± １，７５０であった。
【図４】 ＩＬ−２生産。Ｔ細胞をＣｏｌｏ２０５細胞、４ μＭ Ｃ２４２Ｆａｂ−Ｓ
ＥＡ、および様々な量のＣＤ８０−Ｃ２１５Ｆａｂと共に４日間インキュベーシ
ョンし、その後上清を回収しＩＬ−２量を測定した。ＣＤ８０−Ｃ２１５Ｆａｂ
なしで得られたＩＬ−２量は、２，８４９ｐｇ／ｍｌであった。
【図５】 増殖。Ｔ細胞をＣｏｌｏ２０５細胞と様々な量のＣＤ８０−Ｃ２１５Ｆａｂ−
ＳＥＡｍ５７またはＣ２１５Ｆａｂ−ＳＥＡｍ２３と共に４日間インキュベーシ
ョンし、その後取り込まれた３Ｈ−チミジンを測定した。
【図６】 ＩＬ−２生産。Ｔ細胞をＣｏｌｏ２０５細胞と様々な量のＣＤ８０−Ｃ２１５
Ｆａｂ−ＳＥＡｍ５７またはＣ２１５Ｆａｂ−ＳＥＡｍ２３と共に４日間インキ
ュベーションし、その後上清を回収しＩＬ−２量を測定した。
【図７】 表示したタンパク質および照射したトランスフェクトされたＣＨＯ細胞（ＳＥ
Ａの提示のため）と共に７日間インキュベーションした、ヒト血液Ｔ細胞の増殖
能力。縦軸：３Ｈ−チミジンの取り込み（ｃｐｍ）
【図８】 標的ＳＥＡとＩＬ−２を同時に投与すると、インビボにおけるＴ細胞の活性化
が増強される。Ｃ２１５ＦａｂＳＥＡ（ＦＳ）、Ｃ２１５Ｆａｂ−Ｑ−ｈＩＬ２
（ＦＩ）、これら二つの組み合わせ（ＦＳ ＋ ＦＩ）、あるいはＣ２１５Ｆａ
ｂＳＥＡ−Ｑ−ｈＩＬ２（ＦＳＩ）を１または３回注射処理したマウス由来脾細
胞の、ＳＥＡコーティングしたＭＨＣクラスＩＩ＋ Ｒａｊｉ細胞に対する細胞
傷害性（パーセンテージで示す）。エフェクター：標的細胞比は３０：１とし、
細胞傷害性は、標準４時間の５１Ｃｒ遊離アッセイにて測定した。
【図９】 Ｃ２１５ＦａｂＳＥＡ（ＦＳ）、Ｃ２１５Ｆａｂ−Ｑ−ｈＩＬ２（ＦＩ）、Ｃ
２１５ＦａｂＳＥＡ ＋ Ｃ２１５Ｆａｂ−Ｑ−ｈＩＬ２（ＦＳ ＋ ＦＩ）、
あるいはＣ２１５Ｆａｂ−Ｑ−ｈＩＬ２（ＦＳＩ）の３回注射（腫瘍接種後５、
６、および７日目）による、Ｃ５７ Ｂｌ／６マウスの５日目Ｂ１６−Ｃ２１５
腫瘍の治療。等モルのＦａｂＳＥＡとＦａｂ−Ｑ−ｈＩＬ２を用いた。横軸：注
射したタンパク質量。縦軸：パーセンテージ表示による腫瘍の減少。
【図１０】 Ｃ２１５Ｆａｂ−ＳＥＡ（ＦＳ）、Ｃ２１５Ｆａｂ−Ｑ−ｈＩＬ２（ＦＩ）、
あるいはＣ２１５ＦａｂＳＥＡ−Ｑ−ｈＩＬ２治療後の、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の腫
瘍浸潤の増加。樹立Ｂ１６−ＧＡ７３３肺腫瘍を保有するマウスの肺に浸潤する
ＣＤ２５陽性細胞を、免疫組織化学法により測定した。縦軸：染色された部位の
パーセンテージ。横軸：１＝ＰＢＳ；２＝注射１回目；３＝注射２回目；４＝注
射３回目；５＝注射４回目。
【図１１】 日に一度の Ｃ２１５ＦａｂＳＥＡ−Ｑ−ｈＩＬ２（ＦＳＩ）注射（３７ｍｇ
／注射）を４回まで行った後の、インターフェロンγの持続レベル。血液は最終
注射から４時間後に回収した。インターフェロンγ含量（縦軸）は、組換えネズ
ミインターフェロンγ（ファーミンジェン社）を標準物質として用い、ＥＬＩＳ
Ａ測定により決定した。Ｃ２１５ＦａｂＳＥＡ（ＦＳ）を等モル量（３０ｍｇ／
注射）用いて、同様の実験を実施した。
【図１２】 ＰＢＳまたはＣ２１５ＦａｂＳＥＡＤ２２７Ａ−Ｑ−ｈＩＬ２（＝ＦＳｍ９−
ＩＬ２）を１、４、あるいは６回注射したマウス由来脾細胞の、ＳＥＡコーティ
ングしたＭＨＣクラスＩＩ＋Ｒａｊｉ細胞に対する細胞傷害性（縦軸にパーセン
テージで示す）。細胞傷害性は、標準４時間の５１Ｃｒ遊離アッセイにて測定し
た。ＰＢＳは陰性対照として用いる。
【図１３】 ８回のＣ２１５ＦａｂＳＥＡＤ２２７Ａ（＝ＦＳｍ９）またはＣ２１５Ｆａｂ
ＳＥＡＤ２２７Ａ−Ｑ−ｈＩＬ２（＝ＦＳｍ９−ＩＬ２）注射に続く、Ｃ５７Ｂ
ｌ／６マウスの３日目Ｂ−１６−Ｃ２１５腫瘍の治療。治療は８日間続けて毎日
行った。２１日目に動物を殺し、肺転移をカウントした。縦軸：パーセンテージ
表示による腫瘍の減少。
【図１４】 Ｃ２１５ＦａｂＳＥＡＤ２２７Ａ−Ｑ−ｈＩＬ２Ｆ４２Ａ（＝ＦＳｍ９−ＩＬ
２（Ｆ４２Ａ））、Ｃ２１５ＦａｂＳＥＡＤ２２７Ａ−Ｑ−ｈＩＬ２（＝ＦＳｍ
９−ＩＬ２）、あるいはＣ２１５ＦａｂＳＥＡＤ２２７Ａ（＝ＦＳｍ９−ＩＬ２
）の８回注射に続く、Ｖｂ３ ＴＣＲトランスジェニックマウスの３日目Ｂ−１
６−Ｃ２１５腫瘍の治療。治療は８日間続けて毎日行った。２１日目に動物を殺
し、肺転移をカウントした。縦軸：パーセンテージ表示による腫瘍の減少。
【図１５】 Ｃ２１５ＦａｂＳＥＡＤ２２７Ａ−Ｑ−ｈＩＬ２Ｆ４２Ａ（Ｆ４２Ａ）、Ｃ２
１５ＦａｂＳＥＡＤ２２７Ａ−Ｑ−ｈＩＬ２ Ｆ４２Ｋ（Ｆ４２Ｋ）、あるいは
Ｃ２１５ＦａｂＳＥＡＤ２２７Ａ−Ｑ−ｈＩＬ２Ｆ４２Ａ／Ｄ２０Ｓ（Ｆ４２Ａ
／Ｄ２０Ｓ）の８回注射による、Ｖｂ３ ＴＣＲトランスジェニックマウスの３
日目Ｂ−１６−Ｃ２１５腫瘍の治療。治療は８日間続けて毎日行った。２１日目
に動物を殺し、肺転移をカウントした。縦軸：パーセンテージ表示による腫瘍の
減少。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 35/00 Ｃ０７Ｋ 14/31 ４Ｈ０４５ 37/00 14/715 Ｃ０７Ｋ 14/31 16/00 14/715 19/00 16/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ 19/00 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＵ ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ， ＪＰ，ＫＲ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＧ，Ｓ Ｉ，ＵＡ，ＵＳ (72)発明者 ランド，ペーテル スウエーデン国、エス−211 46・マルメ、 カール・グスターフ・ベーグ・26・アー (72)発明者 フオシユベリイ，イエーラン スウエーデン国、エス−226 49・ルンド、 クリイランデン・15・アー (72)発明者 カランド，テリエ スウエーデン国、エス−246 32・レツド チエーピンゲ、ドンベルベーゲン・４ (72)発明者 ドールステン，ミカエル スウエーデン国、エス−223 62・ルンド、 イエルダガータン・12・ベー Ｆターム(参考） 4B024 AA11 BA21 BA31 CA03 CA04 DA02 EA04 GA11 HA01 4B065 AA90X AA91Y AA93Y AC14 BA02 CA24 CA46 4C076 AA12 AA29 AA95 BB11 CC07 CC27 CC34 CC35 CC41 CC50 EE41 4C084 AA02 AA13 BA44 CA04 CA53 DA01 DA14 DA33 DA45 MA17 MA43 MA66 NA05 ZB022 ZB262 ZB332 ZB372 4C085 AA13 BB17 BB41 CC21 DD62 EE03 FF13 GG01 4H045 AA10 BA10 BA41 CA40 DA01 DA50 EA20 EA50 FA72 FA74

Claims (34)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 免疫調節因子の存在下において２種類の細胞をスーパー抗原
    （ＳＡＧ）と接触させることによって、Ｔ細胞の存在下で標的細胞を不活性化す
    るための方法であって、少なくとも１つの前記スーパー抗原および前記免疫調節
    因子は、「遊離型」スーパー抗原（Ｓａｇ）と、コンジュゲートを前記標的細胞
    に標的化する部分とのコンジュゲートの形態であることを特徴とする方法。
  2. 【請求項２】 ａ．前記スーパー抗原（ＳＡＧ）および前記免疫調節因子は
    、スーパー抗原（Ｓａｇ）と、標的細胞に対する標的化部分（Ｔ）と、免疫調節
    因子（ＩＭ）とを含む三重コンジュゲートの形態で使用されること（Ｔ、ＩＭ、
    Ｓａｇ−コンジュゲート）、 ｂ．前記スーパー抗原（ＳＡＧ）は、スーパー抗原（Ｓａｇ）と標的細胞に対
    する標的化部分（Ｔ）との二重コンジュゲートを、免疫調節因子（ＩＭ）と標的
    細胞に対する標的化部分（Ｔ’）との二重コンジュゲートと組み合わせた形態で
    使用されること（Ｔ、Ｓａｇ−コンジュゲート＋Ｔ’、ＩＭ−コ−コンジュゲー
    ト）、 ｃ．前記スーパー抗原（ＳＡＧ）は、スーパー抗原（Ｓａｇ）と標的細胞に対
    する標的化部分（Ｔ）との二重コンジュゲートの形態で使用され、そして前記免
    疫調節因子（ＩＭ）は遊離型形態（すなわち、標的細胞に対する標的化部分に結
    合していない形態）で使用されること（Ｔ、Ｓａｇ−コンジュゲート＋ＩＭ）、 ｄ．前記スーパー抗原（ＳＡＧ）は遊離型形態（Ｓａｇ）で使用され、そして
    前記調節因子は結合型形態（すなわち、前記免疫調節因子と標的化部分との二重
    コンジュゲートの形態）で使用されること（Ｓａｇ＋Ｔ、ＩＭ−コンジュゲート
    ）、および ｅ．前記スーパー抗原（ＳＡＧ）および前記免疫調節因子は、スーパー抗原（
    Ｓａｇ）と免疫調節因子（ＩＭ）との二重コンジュゲートの形態で使用されるこ
    と（Ｓａｇ、Ｍ−コンジュゲート） の特徴を有する、請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 ａが代替的に使用されることを特徴とする、請求項２に記載
    の方法。
  4. 【請求項４】 前記免疫調節因子コンジュゲートにおける標的化部分は、前
    記スーパー抗原コンジュゲートにおける標的化部分と異なり得る可能性とともに
    、ｂが代替的に使用されることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
  5. 【請求項５】 ｃが代替的に使用されることを特徴とする、請求項２に記載
    の方法。
  6. 【請求項６】 ｅが代替的に使用され、そしてＩＭおよびＴは共通しており
    、例えば、レセプターを有するコンジュゲート細胞を標的化するためのＩＬ−２
    などのサイトカインレセプターであることを特徴とする、請求項２に記載の方法
    。
  7. 【請求項７】 前記細胞は、標的細胞に関連する疾患、例えば、癌に罹って
    いる個体においてインビボで不活性化されることを特徴とする、請求項１〜６の
    いずれか１項に記載の方法。
  8. 【請求項８】 前記標的化部分は抗体であり、好ましくは、Ｆａｂフラグメ
    ントまたはＦａｂ２フラグメントなどのその抗原結合フラグメントあるいは単鎖
    抗体であることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 【請求項９】 前記スーパー抗原Ｓａｇは、 ａ．対応する野生型スーパー抗原と比較してＭＨＣクラスＩＩ抗原に対する低
    下した結合能を有するように、 ｂ．対応する野生型スーパー抗原と比較してヒト血清における低下した血清反
    応性を有するように、 ｃ．対応する野生型スーパー抗原と比較してヒトにおける低下した免疫原性を
    有するように、 ｄ．２つ以上の遊離型スーパー抗原との間のキメラ体であるように 例えば、変異によって改変されていることを特徴とする、請求項１〜８のいずれ
    か１項に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 前記スーパー抗原は、例えば、ＭＨＣクラスＩＩの親和性
    に重要なアミノ酸残基をコードするコドンの変異によって、ＭＨＣクラスＩＩに
    対する低下した親和性を有するように改変されていることを特徴とする、請求項
    １〜９のいずれか１項に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 前記免疫調節因子は、 ａ．ＩＬ−２などのサイトカイン、または ｂ．ケモカイン、または ｃ．リンパ球表面結合型レセプターの細胞外部分およびリガンド、例えば、Ｃ
    Ｄ８０およびＣＤ８６などのＢ７分子の細胞外部分 から選択されることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法
    。
  12. 【請求項１２】 前記調節因子は、例えば、スーパー抗原で活性化されたＴ
    細胞のアネルギーへの流出に対抗することによって、スーパー抗原の作用をイン
    ビボで高めることができる免疫調節因子の中から選択されることを特徴とする、
    請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
  13. 【請求項１３】 前記調節因子は、ＣＤ８０またはＣＤ８６などのＢ７リガ
    ンドの細胞外部分であるか、あるいはＩＬ−２などのＣＤ２８／Ｂ７シグナル伝
    達の下流エフェクターであることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか１項
    に記載の方法。
  14. 【請求項１４】 前記調節因子は、例えば、対応する天然型形態と比較して
    、そのリンパ球レセプターに対する低下した親和性を示すように変異によち改変
    されていることを特徴とする、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
  15. 【請求項１５】 前記調節因子は、ＩＬ−２、またはＣＤ８０の細胞外部分
    、または請求項１４に従って改変されたその形態であることを特徴とする、請求
    項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
  16. 【請求項１６】 下記の式： （Ｔ）ｘ（Ｓａｇ）ｙ（ＩＭ）ｚ （式Ｉ） （上式において、 ａ．Ｔは標的化部分であり、Ｓａｇは遊離型スーパー抗原に対応し、ＩＭはス
    ーパー抗原でない免疫調節因子であり、そして、Ｔ、ＳａｇおよびＩＭは有機リ
    ンカーＢ（これは、１つのコンジュゲート分子および同じコンジュゲート分子に
    おいて異なっていてもよく、あるいは同じであってもよい）を介してともに結合
    し、 ｂ．ｘ、ｙおよびｚは、典型的には、０〜１０から選択される整数（例えば、
    ０〜５）であり、それぞれ、Ｔ、ＳａｇおよびＩＭの各部分の数を表す（ただし
    、ｙは＞０であり、そしてｘおよびｚの一方またはその両方は＞０である）） を満たすスーパー抗原コンジュゲート。
  17. 【請求項１７】 前記スーパー抗原コンジュゲートは、すべてのｘおよびｙ
    およびｚは１〜３の整数であり、好ましくは１〜２の整数であり、そして、ｘ、
    ｙおよびｚの典型的な関係は、ｘ＝ｙ＝ｚ、ｘ＝ｙ＝０．５ｚ、ｘ＝０．５ｙ＝
    ０．５ｚ、およびｘ＝０．５ｙ＝ｚの中から選択される融合タンパク質であるこ
    とを特徴とする、請求項１６に記載のスーパー抗原コンジュゲート。
  18. 【請求項１８】 前記スーパー抗原コンジュゲートは、２つの鎖の産物とし
    て発現される融合タンパク質であることを特徴とする、請求項１６に記載のスー
    パー抗原コンジュゲート。
  19. 【請求項１９】 前記スーパー抗原部分ＳＡＧは標的化部分Ｔ’のＣ端に融
    合され、そして前記免疫調節因子ＩＭは標的化部分Ｔ’’のＣ端に融合される、
    請求項１８に記載の融合タンパク質。
  20. 【請求項２０】 Ｔ’およびＴ’’は請求項８において定義されている通り
    であり、および／またはＳＡＧは請求項９〜１０のいずれか１項において定義さ
    れている通りであり、および／またはＩＭは請求項１１〜１５のいずれか１項に
    おいて定義されている通りである、請求項１９に記載の融合タンパク質。
  21. 【請求項２１】 ＳＡＧはブドウ球菌のエンテロトキシンＡ（ＳＥＡ）であ
    り、Ｔ’はＣ２１５ＦａｂフラグメントのＣＨ−１ドメインであり、Ｔ’’はＣ
    ２１５抗体の軽鎖であり、そしてＩＭはインターロイキン−２である、請求項２
    ０に記載の融合タンパク質。
  22. 【請求項２２】 ＳＡＧは、アミノ酸残基が３個〜１１個の柔軟性の親水性
    アミノ酸リンカーＢ’を介してＴ’に融合され、そして、ＩＭは、１０個〜２０
    個のアミノ酸残基を有する親水性で中性荷電または正荷電のアミノ酸リンカーＱ
    を介してＴ’’に融合される、請求項１９〜２１に記載の融合タンパク質。
  23. 【請求項２３】 Ｂ’は、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＰｒｏおよびＰｒｏ−Ａｌａ−
    Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ（
    配列番号１９）からなる群より選択され、そしてＱは、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ
    −Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ
    −Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ（配列番号２３）、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ
    −Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ
    −Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ（配列番号２０）、Ｇｌｙ
    −Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ
    −Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ（配列番号２１）
    、およびＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−
    Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ（
    配列番号２２）からなる群より選択される、請求項２２に記載の融合タンパク質
    。
  24. 【請求項２４】 前記スーパー抗原コンジュゲートは融合タンパク質であり
    、前記標的化部分は非存在（ｘ＝０）であり、そしてｙおよびｚは１〜３の整数
    であり、好ましくは１〜２の整数であり、そしてｘおよびｙの好ましい関係は、
    ｘ＝ｙ、ｘ＝０．５ｙ、０．５ｘ＝ｙ、ｘ＝１／３ｙ、および１／３ｘ＝ｙの中
    から選択されることを特徴とする、請求項１６に記載のスーパー抗原コンジュゲ
    ート。
  25. 【請求項２５】 式：（Ｓａｇ）ｙ（ＩＭ）ｚ （式ＩＩ） （ただし、ｙ＝ｚ＝１） を有することを特徴とする、請求項１６に記載のスーパー抗原コンジュゲート。
  26. 【請求項２６】 前記標的化部分は請求項８において定義されている通りで
    あり、および／または前記スーパー抗原部分は請求項９〜１０のいずれか１項に
    おいて定義されている通りであり、および／または前記免疫調節因子は請求項１
    １〜１５のいずれか１項において定義されている通りであることを特徴とする、
    請求項１６、１７、２４または２４に記載のスーパー抗原コンジュゲート。
  27. 【請求項２７】 標的化部分（Ｔ’’’）と、例えば、（対応する天然型形
    態と比較して）そのリンパ球レセプターに対する低下した親和性を有するか、ま
    たはそのリンパ球レセプターに対する結合が形成されたときに低下したインター
    ナリゼーション速度を有するように改変されている非スーパー抗原の免疫調節因
    子（ＩＭ’’’）とのコンジュゲートは下記の式： （Ｔ’’’）ｘ（Ｓａｇ’’’）ｙ（ＩＭ’’’）ｚ （式Ｖ） （上式において、 ａ．Ｔ’’’は標的化部分であり、Ｓａｇ’’’は遊離型スーパー抗原に対応
    し、ＩＭ’’’は改変された免疫調節因子であり、そして、ＳａｇおよびＩＭは
    有機リンカーＢ’’’（これは、１つのコンジュゲート分子および同じコンジュ
    ゲート分子において異なっていてもよく、あるいは同じであってもよい）を介し
    てともに結合し、 ｂ．ｘ、ｙおよびｚは、典型的には、０〜１０から選択される整数（例えば、
    ０〜５）であり、それぞれ、Ｔ’’’、Ｓａｇ’’’およびＩＭ’’’の各部分
    の数を表す：ただし、ｚは＞０であり、そしてｘおよびｙの一方またはその両方
    は＞０である。） を満たすことを特徴とする標的化された免疫調節因子。
  28. 【請求項２８】 前記の標的化された免疫調節因子は、すべてのｘおよびｙ
    およびｚが１〜３の整数であり、好ましくは１〜２の整数であり、そしてｘ、ｙ
    およびｚの典型的な関係は、ｘ＝ｙ＝ｚ、ｘ＝ｙ＝０．５ｚ、ｘ＝０．５ｙ＝０
    ．５ｚ、およびｘ＝０．５ｙ＝ｚの中から選択される融合タンパク質であること
    を特徴とする、請求項２７に記載の標的化された免疫調節因子コンジュゲート。
  29. 【請求項２９】 前記の標的化された免疫調節因子は融合タンパク質であり
    、前記スーパー抗原部分は非存在（ｙ＝０）であり、そしてｘおよびｚは１〜３
    の整数であり、好ましくは１〜２の整数であり、そしてｘおよびｙの好ましい関
    係は、ｘ＝ｙ、ｘ＝０．５ｙ、０．５ｘ＝ｙ、ｘ＝１／３ｙ、および１／３ｘ＝
    ｙの中から選択されることを特徴とする、請求項２７に記載の標的化された免疫
    調節因子。
  30. 【請求項３０】 前記の標的化された免疫調節因子は下記の式： （Ｔ’’’）ｙ（ＩＭ’’’）ｚ （ただし、ｙ＝ｚ＝１。） を満たすことを特徴とする、請求項２９に記載の標的化された免疫調節因子。
  31. 【請求項３１】 スーパー抗原と、スーパー抗原でないＩＬ−２などの免疫
    調節因子とをコードするＤＮＡ分子。
  32. 【請求項３２】 前記ＤＮＡ分子は、 ａ．第１のシストロンは、請求項９〜１０において定義されているように改変
    され得る未結合のスーパー抗原（Ｓａｇ）を含むポリペプチドＩをコードする配
    列Ｉを含有し、そして ｂ．第２のシストロンは、請求項１１〜１５項において定義されているように
    改変され得る免疫調節因子を含むポリペプチドＩＩをコードする配列ＩＩを含有
    する、 二シストロン性構築体の形態であることを特徴とする、請求項３１に記載のＤＮ
    Ａ分子。
  33. 【請求項３３】 配列Ｉおよび配列ＩＩのいずれか一方またはその両方は、
    ポリペプチドＩおよびポリペプチドＩＩが会合して、遊離型スーパー抗原、免疫
    調節因子および抗体を含む三重コンジュゲートを形成し得るように、抗体の少な
    くとも一部をコードする個々の配列に融合されることを特徴とする、請求項３２
    に記載のＤＮＡ分子。
  34. 【請求項３４】 前記スーパー抗原は未結合のスーパー抗原であり、そして
    前記スーパー抗原をコードする配列は、可能であればオリゴヌクレオチドリンカ
    ーをコードする配列を介して、前記免疫調節因子をコードする配列に融合される
    ことを特徴とする、請求項３１に記載のＤＮＡ分子。
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