FI121571B - Interleukiini-15-antagonisteja - Google Patents

Description

Interleukiini-15-antagonisteja Tämä hakemus on jakamalla erotettu hakemuksesta FI973361 5 Keksinnön aihepiiri

Esillä oleva keksintö koskee yleisesti antagonisteja nisäkkään epiteelistä peräisin olevalle T-solutekijä- polypeptidille, jota kutsutaan tässä interleukiini-15:ksi ("IL-15"). Se koskee tarkemmin ottaen IL-15 -vastaisia mo-10 noklonaalisia vasta-aineita, jotka merkittävästi laskevat IL-15:n kykyä stimuloida T-lymfosyyttien lisääntymistä in vitro CTLL-määrityksessä. Samoin keksintöön sisältyy vasta-aineiden käyttö valmistettaessa lääkettä eri sairaustilojen hoitamiseksi nisäkkäissä, joissa lasku IL-15-aktiivisuu-15 dessa on toivottava.

Keksinnön tausta

Interleukiini-15 on tunnettu T-solukasvutekijä, joka voi tukea IL-2-riippuvaisen solulinjan CTLL-2 lisääntymistä. IL-15:n raportoivat ensiksi Grabstein et ai. julkai-20 sussa Science 264 (1994) 965 erittyvänä sytokiininä, joka käsittää 162 aminohapon prekursoripolypeptidin, joka sisältää 48 aminohapon johtosekvenssin, ja johtaa 114 aminohapon kypsään proteiiniin. Grabstein et ai. kuvaavat myös 162 aminohapon prekursoria koodittavan täysimittaisen ihmis-25 cDNA:n klonaamista, joka sisältää 316 ep:n 5'-ei- koodittavan alueen ja 486 ep:n avoimen lukukehyksen (tai ° 489 ep:n avoimen lukukehyksen, jos 3 ep:n stop-kodoni lue- o <m taan mukaan) ja 400 ep:n 3'-ei-koodittavan alueen.

i ^ IL-15:llä ja IL-2:lla on yhteisenä monia ominai- i 30 suuksia. Näitä ominaisuuksia ovat ihmisen ja hiiren T- x solujen lisääntyminen ja aktivaatio, lymfokiiniaktivoidun °· tappajasolu- (LAK) aktiivisuuden, luonnollisen tappajasolu ja § (NK) aktiivisuuden ja sytotoksisen T-lymfosyytti- (CTL) ak- § tiivisuuden indusointi sekä B-solujen lisääntymisen ja dif-

O

35 ferentiaation kostimulaatio.

2

Lisäksi IL-15 ja IL-2 ovat rakenteellisesti homologisia molekyylejä, jotka kykenevät sitoutumaan ainakin kolmeen erilliseen reseptorialayksikköön T-solumembraani-pinnalla. IL-2-reseptorit sisältävät ainakin 3 alayksik-5 köä, a, β ja γ [Toshikazu et ai., Science 257 (1992) 379] . Sekä IL-15:lie että IL-2:lie on yhteistä sitoutuminen yleiseen β-7-alayksikkökompleksiin, kun taas sekä IL-15 että IL-2 sitoutuvat spesifiseen a-reseptorialayksikköön (IL-15R0! ja vastaavasti IL-2Ro;) . IL-15Ro; löydettiin vast' -10 ikään, ja se muodostaa avoinna olevan hakemuksen sarjanumero 08/300 903 kohteen. Vasta-aineilla, jotka kohdistuvat vastaan IL-2-reseptorin α-ketjua (anti-IL-2Ro!) , ei ole mitään vaikutusta IL-15:n sitoutumiseen (Grabstein et ai, suora). Kuitenkin IL-2-reseptorin β-alayksikköä vastaan 15 kohdistuvat vasta-aineet, eli TU27, TU11 tai Mikfil, kykenevät salpaamaan IL-15:n aktiivisuuden, mikä viittaa siihen, että IL-15 käyttää β-alayksikköä signallointiin. Vastaavasti IL-2-reseptorin 7-ketjua tarvitaan signaalin siirtoon [Giri et ai., EMBO J. 13 (1994) 2822] . IL-15-re-20 septorikompleksin β- ja 7-alayksiköiden yhdistelmä sitoi, mutta kumpikaan alayksikkö yksinään ei sitonut, IL-15:n transfektoiduilla COS-soluilla.

T-solut välittävät tiettyjä sairaustiloja ja fysiologisia tiloja. Tällaisia sairauksia ovat elinsiirre-25 hyijintä, siirre-isäntäsairaus, autoimmuunisairaus, nivelreuma, tulehduksellinen suolisairaus, dermatologiset o häiriöt, insuliiniriippuvainen sokeritauti, silmän häiriöt t— ^ ja idiopaattinen nefroottinen oireyhtymä/idiopaattinen ^ membraaninefropatia. Itse asiassa siirrehyljintä ja siir- st- 30 re-isäntäsairaus (GVHD) on yhdistetty lisääntyneeseen IL- x 2-reseptori-ilmentymäseen. Vasteena vieraan kudosyhteenso- ir pivuuden antigeeneille aktivoituneet T-solut vaikuttavat § ilmentävän IL-2-reseptorikompleksin. Erilaisia terapioita o g on ehdotettu ja tutkittu. Esimerkiksi Tinubu et ai. [J, o 35 Immunol. 153 (1994) 4330] raportoivat, että monoklonaali- 3 nen anti-IL-2R£-vasta-aine, MikSl, pidentää kädellisen sydänsiirteen elinaikaa. Akuutin siirrehyljinnän yhteydessä tapahtuu lisäys IL-2R£-alayksikköilmentymisessä CD4:n ja CD8:n ilmentävillä soluilla, mikä viittaa siihen, että 5 IL-2R£-alayksikköilmentyminen vaikuttaa lisääntyvän allo- reaktiivisilla T-soluilla. Katso esimerkiksi Niguma et ai., Transplantation 52 (1991) 296.

Kuitenkaan ennen esillä olevaa keksintöä ei ole ollut terapioita, jotka keskittyisivät IL-15-ligandi-re-10 septorivuorovaikutukseen keinona GVHD:n hoitamiseksi tai siirteen eloonjäännin edistämiseksi.

Yhteenveto keksinnöstä

Keksintö koskee IL-15-antagonisteja ja menetelmää näiden antagonistien käyttämiseksi ihmisen sairauksien 15 hoitoon. Erityisesti tällaisia hoitoja ovat siirteen eloonjäännin edistäminen nisäkkäissä ja GVHD:n hoito. IL-15-antagonistit ovat tehokkaita estämään IL-15:tä siirtämästä signaalia soluun lL-15-reseptorikompleksin joko β-tai y-alayksikön välityksellä vastustaen siten IL-15:n 20 biologista aktiivisuutta. Tietyt keksinnön mukaisista antagonisteista voivat häiritä IL-15:n sitoutumista IL-15-reseptorikompleksin β- tai γ-alayksikköön häiritsemättä oleellisesti IL-15:n sitoutumista IL-15RO!:aan.

Keksinnön mukaisia antagonisteja ovat kypsän, tai 25 natiivin, IL-15:n muteiinit, joissa IL-15:tä on mutageni-soitu yhdessä tai useammassa aminohappotähteessä tai yh-o dellä tai useammalla alueella, jotka saattavat esittää ^ osaa sitoutumisessa IL-15-reseptorikompleksin β- tai 7- ^ alayksikköön. Tällaiset muteiinit estävät IL-15:tä siirtä- ct 30 mästä signaalia soluihin IL-15-reseptorikompleksin joko β- c\j x tai 7-alayksikön välityksellä ylläpitäen kuitenkin IL-15:n tr korkean affiniteetin IL-15Ra:n suhteen. Tyypillisesti täl- § laisia muteiineja luodaan lisäyksillä, deleetioilla tai o § substituutioilla avainasemissa, esimerkiksi vastaavasti o 35 apinan ja ihmisen IL-15:n Asp56 tai Gin156 kuten esitetään 4 sekvensseissä tunnusnumerot 1 ja 2. Uskotaan, että Asp56 vaikuttaa sitoutumiseen IL-15-reseptorikompleksin β-alayk-sikköön ja että Gin156 vaikuttaa sitoutumiseen sen 7-alayk-sikköön.

5 Lisäksi keksintöön kuuluu monoklonaalisia vasta- aineita, jotka immuunireagoivat kypsän IL-15:n kanssa ja estävät signaalin siirron IL-15-reseptorikompleksiin.

Samoin keksinnön suojapiiriin kuuluu modifioituja IL-15-molekyylejä, joilla on tallella kyky sitoutua IL-10 15Ro!:aan, mutta joiden affiniteetti IL-15-reseptorikomp-leksin β- ja/tai 7-alayksikköjen suhteen on oleellisesti laskenut tai hävinnyt. Modifioidut IL-15-molekyylit voivat olla mitä tahansa muotoa kunhan modifikaatiot tehdään siten, että sitoutumista häiritään tai se estetään tavaili-15 sesti modifioimalla kohteen sitoutumiskohtaa tai sen ympäristöä. Esimerkkejä tällaisista modifioiduista IL-15-mole-kyyleistä ovat kypsä IL-15 tai IL-15-muteiini, joka on kovalenttisesti konjugoitu yhteen tai useampaan kemialliseen ryhmään, jotka häiritsevät steerisesti IL-15/IL-15-20 reseptori-sitoutumista. Esimerkiksi kypsä IL-15 voi sisältää kohtaspesifisen glykosylaation tai se voi olla kovalenttisesti sidottu ryhmiin kuten polyetyleeniglykoli (PEG), monometoksi-PEG (mPEG), dekstraani, polyvinyylipyr-rolidoni (PVP), polyvinyylialkoholi (PVA), polyaminohapot 25 kuten poly-L-lysiini tai polyhistidiini, albumiini, gelatiini IL-15-molekyylin spesifisissä kohdissa, jotka ryhmät o voivat häiritä IL-15:n sitoutumista IL-15-reseptorikomp- ° leksin β- tai 7-ketjuihin, jolloin kuitenkin IL-15:n kor- kea affiniteetti IL-15Ra:n suhteen säilytetään. Hyödyntä-30 mällä ryhmän steerinen esteominaisuuksia sitoutumista Βρει sifisiin reseptorialayksiköihin voidaan vastustaa. PEG-

(X

“ ketjujen konjugoinnin proteiineihin kuten IL-2, GM-CSF, g asparaginaasi, immunoglobuliinit, hemoglobiini ja muut § muitakin etuja tunnetaan alalla. Esimerkiksi tiedetään, o o 35 että PEG pidentää puoliintumisaikoja verenkierrossa in 5 vivo [katso Delgado et ai. , Crit. Rev. Ther. Drug Carr. Svst. 9. (1992) 249] , parantaa liukoisuutta [katso Katre et ai.. Proc. Natl. Acad. Sei. 84 (1987) 1487] ja laskee im-munogeenisyyttä [katso Katre, N.V., Immunol. 144 (1990) 5 209] .

Keksintö koskee myös näiden antagonistien käyttöä menetelmässä sairauden tai tilan hoitamiseksi, jossa IL-15-aktiivisuuden T-soluilla laskeminen on toivottavaa. Tällaisia sairauksia ovat elinsiirrehyljintä, siirre-10 isäntäsairaus, autoimmuunisairaus, nivelreuma, tulehduk sellinen suolisairaus, dermatologiset häiriöt, insuliini-riippuvainen sokeritauti, silmän häiriöt ja idiopaattinen nefroottinen oireyhtymä/idiopaattinen membraaninef ropatia . Erityisesti siirrehyljinnässä IL-15-aktiivisuus voi johtaa 15 isännän immuunivasteeseen siirrettä vastaan ja lopulta hylkimiseen. Vastaavasti GVHD:ssä siirre, tyypillisesti luuydinsiirre, tuottaa immuunivasteen isäntää vastaan. Tällaisten aktiivisuuksien suppressio keksinnön mukaisilla IL-15-antagonisteilla saattaa olla eduksi siirteen eloon-20 jäännin edistämiseksi ja eloonjääntiajan pidentämiseksi sekä GVHD:n hoitamiseksi.

Eri tutkijat ovat raportoineet siirteen eloonjääntiajan pidentymisestä käytettyään vasta-aineita kuten an-ti-TAC, monoklonaalinen anti-ihmis-IL-2a-reseptorivasta-25 aine. Katso Reed et ai. . Transplantation 47 (1989) 55 - 59, jossa julkaisussa anti-TAC:n osoitetaan edesauttaneen o kädellisen munuaissiirteen siirtämistä. Niinikään Brown et ^ ai.. Proc. Natl. Acad. Sei. 88 (1991) 2663, kuvaavat huma- nisoidun anti-TAC:n käyttöä kädellisen sydänsiirteen 4- 30 eloonjääntiajan pidentämiseksi . Kirkman et ai. , Transplan- c\i tation 51 (1991) 107, kuvaavat myös kliinistä koetta, jos-cc sa käytetään anti-TAC:tä siirteen varhaishyljinnän estämi- § seksi. Koska IL-15:llä on monia samankaltaisia biologisia o g aktiivisuuksia kuin IL-2:lla, jolloin sillä ja IL-2:lla on o , o 35 itse asiassa tiettyjä yhteisiä reseptorialayksikoitä, IL- 6 15 :n tuhoisaan aktiviisuuteen sairaustiloissa puuttumisella on selvää terapeuttista potentiaalia.

Yksisityiskohtainen kuvaus keksinnöstä Keksintö koskee IL-15-aktiivisuuden antagonistia, 5 joka häiritsee IL-15:n signaalin siirtoa sen reseptori-kompleksin välityksellä. Erityisesti keksinnön mukaiset IL-15-antagonistit valitaan ryhmästä, jonka muodostavat (a) kypsän, tai natiivin, IL-15:n muteiini, joka kykenee sitoutumaan IL-15-reseptorin a-alayksikköön ja joka ei 10 kykene siirtämään signaalia IL-15-reseptorikompleksin β-ja/tai γ-alayksikön välityksellä; (b) IL-15-vastainen mo-noklonaalinen vasta-aine, joka estää IL-15:n suorittamasta signaalin siirtoa IL-15-reseptorikompleksin β- ja/tai γ-alayksikön välityksellä; ja (c) IL-15-molekyyli, joka on 15 kovalenttisesti sidottu kemialliseen ryhmään, joka häiritsee IL-15:n kykyä suorittaa signaalin siirto IL-15-resep-torikompleksin joko β- tai γ-alayksikön välityksellä mutta ei häiritse IL-15:n sitoutumista IL-15RQ!:aan. Samoin esillä olevan keksinnön suojapiiriin kuuluvat edellä kuvattuja 20 muteiineja koodittavat DNA-molekyylit.

Tässä käytettynä ilmaisuilla "yhdistelmä-DNA-teknologia" tai "yhdistelmä-DNA-teknisesti" tarkoitetaan tekniikoita ja menetelmiä spesifisten polypeptidien tuottamiseksi mikrobi- (esim. bakteeri-, hyönteis- tai hiiva-) 25 tai nisäkässoluista tai vastaavista organismeista (esim.

siirtogeeniset organismit), jotka on transformoitu tai o transfektoitu kloonatuilla tai synteettisillä DNA-sekvens- ^ seillä heterologisten peptidien biosynteesin saamiseksi.

•A Natiiveihin glykosylaatiokuvioihin päästään vain nisäkäs- 30 soluilmentämissysteemeillä. Hiivat tuottavat tyypillisen

CM

glykosylaatiokuvion. Prokaryoottisella soluilmentämisellä ^ (esim. Ε_^ coli) saadaan yleensä polypeptidejä, jotka eivät § ole glykosyloituja.

o o "Nukleotidisekvenssi" viittaa polynukleotidiin o 35 erillisen fragmentin muodossa tai suuremman DNA-rakenteen

CM

7 rakenneosana, joka on saatu DNA:sta tai RNArsta, joka on eristetty ainakin kerran oleellisesti puhtaassa muodossa (eli vapaana kontaminoivasta endogeenisestä materiaalista) ja määränä tai pitoisuutena, joka mahdollistaa sen raken-5 neosanukleotidisekvenssien identifioinnin, manipuloinnin ja talteenoton tavanomaisilla biokemiallisilla menetelmillä (jollaisia kuvataan julkaisussa Sambrook et ai. , "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2. painos, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989). 10 Tällaiset sekvenssit annetaan edullisesti käyttöön avoimen lukukehyksen muodossa, jota eivät katkaise sisäiset ei käännetyt sekvenssit, tai intronit, joita tyypillisesti esiintyy eukaryoottisissä geeneissä. Ei-käännettyjä DNA-sekvenssejä voi esiintyä 5' tai 3' avoimesta lukukehykses-15 tä silloin, kun nämä eivät häiritse kooditusalueiden manipulaatiota tai ilmentämistä.

"Yhdistelmä-DNA-ilmentämisvektori" viittaa plasmi-diin, joka käsittää transkriptionaalisen yksikön, joka koostuu (1) yhdestä tai useammasta geneettisestä elemen-20 tistä jolla/joilla on säätelevä rooli geeni-ilmentymisessä, esimerkiksi promoottorit tai tehostajat, (2) rakenneta! kooditussekvenssistä, joka koodittaa IL-15:tä tai IL-15-muteiinia, ja (3) tarkoituksenmukaisista transkription ja translaation käynnistyssekvensseistä, ja haluttaessa 25 päätössekvensseistä. Edustavia esimerkkejä erilaisista säätelyelementeistä, joita voidaan käyttää, käsitellään o alla (katso yhdistelmä-DNA-tekniikoita käsittelevä osuus).

Hiivailmentämissysteemeissä käytettäviksi tarkoitetut ra-kenne-element it sisältävät edullisesti johtosekvenssin, 4· 30 joka mahdollistaa käännetyn polypeptidin erityksen solun

CM

ulkopuolelle hiivaisäntäsolun toimesta. Vaihtoehtoisesti cc bakteeri-ilmentämissysteemissä yhdistelmä-DNA-polypeptidi § voi sisältää N-terminaalisen metioniinitähteen. N-termi- o o naalinen metioniimtähde voidaan sittemmin pilkkoa ilmen- o o

CM

8 netystä yhdistelmä-DNA-polypeptidistä jatkopuhdistukseen sopivan tuotteen saamiseksi.

" Yhdistelmä-DNA-mikrobi - ilment ämissysteemi 1 lä11 tarkoitetaan sopivien isäntämikro-organismien oleellisesti 5 homogeenistä mono-viljelmää, esimerkiksi bakteeri- kuten E. coli -soluviljelmää tai hiiva- kuten £L_ cerevisiae -soluviljelmää, jossa kromosomi-DNA:hän on stabiilisti integroitu yhdistelmä-DNA-transkriptioyksikkö tai jossa yhdistelmä -DNA- transkriptioyksikkö on "asukas"-plasmidin raken-10 neosana. Yleensä yhdistelmä-DNA-mikrobi-ilmentämissystee- min muodostavat solut ovat yhden ainoan transformoidun kantasolun jälkeläisiä. Yhdistelmä-DNA-mikrobi-ilmentämis-systeemit ilmentävät heterologisia polypeptidejä indusoitaessa säätelyelementit, jotka on kytketty ilmennettävään 15 rakennenukleotidisekvenssiin.

" IL-15-muteiinilla" tai " IL-15 :n muteiineilla" tarkoitetaan kypsiä, tai natiiveja apina-IL-15-molekyylejä, joiden sekvenssi on aminohapposekvenssi 49 - 162 sekvenssistä tunnusnumero 1, tai ihmisen IL-15-molekyylejä, joi-20 den sekvenssi on aminohapposekvenssi 49 - 162 sekvenssistä tunnusnumero 2, joita on mutagenisoitu keksinnön mukaan IL-15-antagonistin tuottamiseksi. Tällaiset IL-15-muteii-nit kykenevät sitoutumaan IL-lSRa-alayksikköön, eivätkä ne kykene siirtämään signaalia IL-15-reseptorikompleksin β-25 ja/tai 7-alayksikön välityksellä.

IL-15:n valmistus 0 Ihmis- tai apina-IL-15:tä voidaan saada menettelyin jen mukaan, joita kuvaavat Grabstein et ai.. Science 264 A (1994) 965, joka julkaisu sisällytetään tähän viitteeksi, 4 30 tai tavanomaisilla menettelyillä kuten polymeraasiketju- c\j reaktio (PCR). Ihmisen IL-15-cDNA talletettiin talletusta laitokseen American Type Culture Collection (ATCC), Rock- § ville, MD, USA 19. helmikuuta 1993, ja se sai siellä ha- o o kunumeron 69245. Tallenteelle annettiin nimeksi "141-

(O

o o

CM

9 hETF". Talletus tehtiin Budapestin sopimuksen ehtojen mukaisesti .

IL-15-muteiinit Löytyy monia mahdollisia IL-15:n mutaatioita, jotka 5 kykenevät tuottamaan antagonisteja. Tällaisia mutaatioita voidaan tehdä spesifisiin aminohappokohtiin, joiden uskotaan olevan vastuussa S- tai 7-alayksikkösignalloinnista; tai mutaatioita voidaan tehdä kokonaisille IL-15-alueille, joiden katsotaan olevan välttämättömiä β- tai 7-alayksik-10 kösignallointiin. Tyypillisesti mutaatioita voidaan tehdä aminohappotähteiden additioina, substituutioina tai delee-tioina. Ensisijaisesti suositaan substituutio- ja delee-tiomuteiineja, jolloin edullisimpia ovat substituutiomute-iinit.

15 Uskotaan, että Asp56 vaikuttaa sitoutumiseen IL-15- reseptorikompleksin β-alayksikköön ja että Gin156 vaikuttaa sitoutumiseen sen y-alayksikköön. Muiden luonnollisesti esiintyvien aminohappotähteiden lisääminen tai korvaaminen Asp56- ja Gin156-kohtiin tai lähelle niitä voi vaikutttaa IL-20 15:n sitoutumiseen IL-15-reseptorikompleksin joko β- tai 7-alayksikköön tai molempiin. Itse asiassa negatiivisesti varatun asparagiinihappotähteen poistaminen ja sen korvaaminen toisella negatiivisesti varatulla tähteellä ei mahdollisesti ole yhtä tehokasta reseptorisitoutumisen sal-25 paamiseksi kuin olisi, mikäli asparagiinihappo korvattaisiin positiivisesti varatulla aminohapolla kuten arginii-o ni, tai ei-varatuilla tähteillä kuten seriini tai kysteii- ° ni.

^ IL-15-muteiinin yhdistelmä-DNA-tuotanto edellyttää ^ 30 ensiksi IL-15-muteiinia koodittavan DNA-kloonin (eli x cDNA:n) eristämistä. cDNA-klooneja saadaan primaariso- cc “ luista tai solulinjöistä, jotka ilmentävät nisäkkään ILOT 15-polypeptidejä. Ensin kokonaissolu-mRNA eristetään, § minkä jälkeen mRNArsta valmistetaan cDNA-kirjasto kään tö o 35 teisellä kopioinilla. cDNA-klooni voidaan eristää ja 10 identifioida käyttäen tässä annettua DNA-sekvenssi-informaatiota ristilajihybridisaatiokoettimen tai PCR-alukkeen suunnittelemiseksi edellä kuvatun mukaisesti. Tällaisten cDNA-kloonien nukleiinihapposekvenssi on 1 - 486 sekvens-5 seissä tunnusnumerot 1 ja 2.

Eristetty cDNA on edullisesti avoimen lukukehyksen muodossa, jota eivät katkaise sisäiset ei käännetyt sekvenssit, tai intronit. Genomi-DNA:ta, joka sisältää nisäkkään IL-15-polypeptidejä koodittavat oleelliset nuk-10 leotidisekvenssit, voidaan myös käyttää kooditussekvens-sien rakentamiseksi käyttökelpoisen geneettisen informaation lähteenä. Eristettyä cDNA:ta voidaan mutagenisoida alalla tunnettuja tekniikoita käyttäen IL-15-antagonisti-aktiivisuuden saamiseksi. Alla esimerkissä 1 kuvataan 15 spesifistä menetelmää, jota voidaan käyttää IL-15-muteii-nien valmistamiseksi.

Keksintö kattaa ekvivalenttiset DNA-rakenteet, jotka koodittavat aminohappotähteiden tai -sekvenssien erilaisia additioita tai substituutioita tai aktiivisuuden 20 kannalta ei välttämättömien terminaalisten tai sisäisten tähteiden tai sekvenssien deleetioita. Esimerkiksi IL-15:n N-glykosylaatiokohtia voidaan modifioida glykosylaation sulkemiseksi pois, jolloin mahdollistuu "riisutun" hiili- hydraattianalogin ilmentyminen nisäkäs- tai hiivailmentä- 25 misysteemeissä. N-glykosylaatiokohdille eukaryoottisissa polypeptideissä on karakteristinen aminohappotripletti o Asn-X-Y, jossa X on mikä tahansa aminohappo paitsi Pro ja ® Y on Ser tai Thr. Apinan IL-15-proteiini käsittää kaksi ^ tällaista triplettiä, sekvenssin tunnusnumero 1 mukaisissa 30 aminohapoissa 127 - 129 ja 160 - 162. Ihmisen IL-15-prote- x iini käsittää kolme tällaista triplettiä, sekvenssin tun- cc nusnumero 2 mukaisissa aminohapoissa 119 - 121, 127 - 129 § ja 160 - 162. Näitä triplettejä koodittavan nukleotidisek- o § venssin sopivat substituutiot, additiot tai deleetiot joh- o o 35 tavat hulihydraattitähteiden kiinnittymisen Asn-sivuket- 11 juun estymiseen. Yhden nukleotidin muutos, joka valitaan siten, että Asn tulee korvatuksi jollain toisella aminohapolla esimerkiksi, riittää inaktivoimaan N-glykosylaa-tiokohdan. Tunnettuja menettelyjä N-glykosylaatiokohtien 5 inaktivoimiseksi ovat menettelyt, joita kuvataan US-pa-tenttijulkaisussa 5 071 972 ja EP-julkaisussa 276 846, jotka julkaisut sisällytetään tähän viitteiksi.

Yhdistelmä-DNA-ilmentämisvektoreihin kuuluvat IL-15-muteiinia koodittavat synteettiset tai cDNA-peräiset 10 DNA-fragmentit. IL-15-muteiinia koodittava DNA on opera tiivisesti kytketty sopivaan transkription tai translaation säätely- tai rakennenukleotidisekvenssiin, joka on saatu nisäkäs-, mikrobi-, virus- tai hyönteisgeeneistä. Esimerkkejä säätelysekvensseistä ovat esimerkiksi geeni-15 sekvenssi, jolla on säätelevä rooli geeni-ilmentymisessä (esim. transkription promoottorit tai tehostajat), mahdollinen operaattorisekvenssi transkription kontrolloimiseksi, sopivia mRNA:n ribosomisitoutumiskohtia koodittava skevenssi ja sopivat sekvenssit, jotka kontrolloivat 20 transkription ja translaation käynnistymistä ja päättämistä. Nukleotidisekvenssit on operatiivisesti kytketty, kun säätelysekvenssi on funktionaalisessa suhteessa ra-kennegeeniin. Esimerkiksi signaalipeptidin DNA-sekvenssi (erityksen johtosekvenssi) voi olla operatiivisesti kyt-25 ketty IL-15-muteiinin rakennegeeni-DNA-sekvenssiin, jos signaalipeptidi ilmentyy osana prekursoriaminohapposek-o venssiä ja osallistuu IL-15-muteiinin eritykseen. Edelleen promoottorinukleotidisekvenssi on operatiivisesti kytketty -r- kooditussekvenssiin (esim. rakennegeeni-DNA) , jos promoot- 3 0 torinukleotidisekvenssi kontrolloi rakennegeeninukleoti-

CNJ

x disekvenssin transkriptiota. Samoin edelleen ribosomisi- cc toutumiskohta voi olla operatiivisesti kytketty rakenne- § geeninukleotidikooditussekvenssiin (esim. IL-15-muteiini), o § jos ribosomisitoutumiskohta on sijoitettu vektoriin trans it o 35 laation edistämiseksi.

CM

12

Sopivia isäntäsoluja IL-15-muteiinin ilmentämiseksi ovat prokaryoottiset, hiiva- tai korkeammat eukaryoottiset solut sopivien promoottorien kontrollissa. Prokaryootteja ovat gram-positiiviset organismit, esimerkiksi Eb_ coli tai 5 basillit. Sopivia prokaryoottisia isäntäsoluja transformoitaviksi ovat esimerkiksi Eh. coli, Bacillus subtilis. Salmonella typhimurium ja erilaiset muut lajit suvuista Pseudomonas. Streptomyces ja Staphylococcus. Kuten alla yksityiskohtaisesti esitetään, esimerkkejä sopivista isän-10 täsoluista löytyy myös hiivoista kuten S_j_ cerevisiae. ni-säkässolulinjöistä kuten kiinalaisen hamsterin munasarja-solut (CHO), tai hyönteissoluista. Soluvapaitakin trans-laatiosysteemejä voitaisiin käyttää IL-15-muteiinin tuottamiseksi, jolloin käytettäisiin tässä julkistetuista DNA-15 rakenteista saatuja RNA-sekvenssejä. Sopivia kloonaus- tai ilmentämisvektoreita käytettäviksi bakteeri-, hyönteis-, hiiva- ja nisäkässoluisäntien kanssa kuvataan esimerkiksi julkaisussa Pouwels et ai. , "Cloning Vectors: A Laboratory Manual", Elsevier, New York, 1985.

20 Kun IL-15-muteiini ilmennetään hiivaisäntäslussa, IL-15-muteiinia koodittavaan nukleotidisekvenssiin (esim. rakennegeeni) voi sisältyä johtosekvenssi. Johtosekvenssi saattaa parantaa käännetyn polypeptidin eritystä hiiva-isäntäsolun ulkopuolelle.

25 IL-15-muteiineja voidaan ilmentää hiivaisäntäso- luissa, edullisesti suvusta Saccharomvces (esim. S^_ cere-o visiae). Muitakin hiivasukuja kuten Pichia tai Kluweromy- ^ ces voidaan käyttää. Hiivavektorit sisältävät usein repii- A kaatioalkukohtasekvenssin 2u-hiivaplasmidista, itsenäises- 30 ti replikoituvan sekvenssin (ARS) , promoottorialueen, po-

C\J

lyadenylaatiosekvenssit ja sekvenssit transkription päät-cc tämiseksi. Edullisesti hiviavektorit sisältävät replikaa- § tioalkukohtaskevenssin ja valikointimerkin. Sopivia pro to o moottorisekvensse;ja hiivavektoreille ovat promoottorit o 35 seuraaville: metallotioneiini, 3-fosfoglyseraattikinaasi 13 [Hitzeman et ai., J. Biol. Chem. 255 (1980) 2073] tai muut glykolyyttiset entsyymit [hess et ai. , J. Adv. Enzyme Res. 7 (1968) 149; ja Holland et aJU, Biochem. 17 (1978) 4900], kuten enolaasi, glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasi, 5 heksokinaasi, pyruvaattidekarboksylaasi, fosfofruktokinaa-si, glukoosi-6-fosfaatti-isomeraasi, 3-fosfoglyseraatti-mutaasi, pyruvaattikinaasi, trioosifosfaatti-isomeraasi, fosfoglukoosiisomeraasi ja glukokinaasi. Muita sopivia vektoreita ja promoottoreita hiivailmennyksessä käytettä-10 viksi kuvaa edelleen Hitzeman, EP-hakemusjulkaisu 73 657.

Hiivavektoreita voidaan koota esimerkiksi käyttäen DNA-sekvenssejä pBR322:sta valikointiin ja replikaatioon E. colissa (Ampr-geeni ja replikaatioalkukohta) . Muita hiivasekvenssejä, joita voidaan sisällyttää hiivailmentä-15 misrakenteeseen, ovat glukoosin repressoima ADH2-promoot-tori ja α-tekijäeritysjohtaja. ADH2-promoottoria ovat kuvanneet Russell et ai. iJ. Biol. Chem. 258 (1982) 2674] ja Beier et ai. [Nature 300 (1982) 724] . Hiivan α-tekijäjoh-tosekvenssi ohjaa heterologisten polypeptidien eritystä. 20 a-tekijäjohtosekvenssi insertoidaan monasti promoottori-ja rakennegeenisekvenssien väliin. Katso esim. Kurjan et ai. , Cell 30 (1982) 933; ja Bitter et ai. . Proc. Natl.

Acad. Sei. USA 81 (1984) 5330. Johtosekvenssiä voidaan modifioida sen 3'-pään läheisyydessä yhden tai useamman 25 restriktiokohdan mukaan sisällyttämiseksi. Tämä helpottaa johtosekvenssin fuusiota rakennegeeniin. o Protokollat hiivojen transformoimiseksi ovat alan £3 ammattilaisille tuttuja. Yhtä tällaista protokollaa kuvaa- vat Hinnen et ai. , Proc, Natl. Acad. Sei. USA 75 (1978) 4 30 1929. Hinnenin et ai. protokollassa valitaan Trp+-trans-

<M

x formantit selektiivisessä kasvualustassa, joka koostuu cc 0,67 % : sta hiivatyppipohjaa, 0,5 %:sta cas-aminohappoja, § 2 %:sta glukoosia, pitoisuuksista 10 mg/ml adeniinia ja o § 20 mg/ml urasiilia.

o o

CM

14 ADH2-promoottorisekvenssin sisältävillä vektoreilla transfromoituja hiivaisäntäsoluja voidaan kasvattaa ilmentymisen indusoimiseksi "rikkaassa" eli runsaasti ravinteita sisältävässä kasvualustassa. Esimerkki rikkaasta kasvu-5 alustasta on kasvualusta, joka sisältää 1 %:n hiivauutet-ta, 2 % peptonia ja 1 % glukoosia ja jota on täydennetty pitoisuuksilla 80 mg/ml adeniinia ja 80 mg/ml urasiilia. ADH2-promoottorin repressio menetetään glukoosin loppuessa kasvualustasta.

10 Vaihtoehtoisesti prokaryoottisessa isäntäsolussa, kuten Ek. coli IL-15-muteiini voi sisältää N-terminaalisen metioniinitähteen yhdistelmä-DNA-polypeptidin ilmentämisen helpottamiseksi prokaryoottisessa isäntäsolussa. N-terminaalinen Met voidaan lohkaista ilmennetystä yhdistelmä-15 DNA-IL-15-muteiinista.

Yhdistelmä-DNA-ilmentämisvektorit, jotka käsittävät yhdistelmä-DNA-IL-15-muteiinirakennegeenin nukleotidisek-venssin, transfektoidaan tai transformoidaan sopivaan isäntämikro-organismiin tai nisäkässolulinjaan.

20 Prokaryoottisiin isäntäsoluihin transfektoidut il- mentämisvektorit käsittävät yleensä yhden tai useamman, fenotyypin suhteen valikoinnin mahdollistavan merkin. Fe-notyyppivalikointimerkki on esimerkiksi geeni, joka koo-dittaa proteiineja, jotka tuottavat antibioottiresistens-25 sin tai jotka täyttävät autotrofisen vaatimuksen, ja isännän tunnistaman replikaatioalkukohdan, jotta monistaen minen isännässä olisi mahdollista. Muut prokaryoottisille o isäntäsoluille käyttökelpoiset ilmentämisvektorit sisäl- -A tävät bakteerialkuperää olevan valikointimerkin saatuna 4 30 kaupallisesti saatavan olevista plasmideista. Tämä vali on kointimerkki vox käsittää geneettisiä elementtejä kloo- ^ nausvektorista pBR322 (ATCC 37017). pBR322 sisältää geenit g ampisilliini- ja tetrasykliiniresistenssille suoden täten o o yksinkertaisen keinon transfromoitujen solujen identifioi- o 35 miseksi. pBR322:n "runko"-osat on yhdistetty sopivaan

CM

15 promoottori- ja IL-15-muteiinirakennegeenisekvenssiin. Muita kaupallisesti saatavana olevia vektoreita ovat esimerkiksi pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Ruotsi) ja pGEMl (Promega Biotec, Madison, WI, USA).

5 Promoottorisekvenssejä käytetään yleisesti yhdis- telmä-DNA-prokaryootti-isäntäsoluilmentämisvektoreille. Tavallisia promoottorisekvenssejä ovat β-laktamaasi- (pe-nisillinaasi) laktoosipromoottorisysteemi [Chang et ai. , Nature 275 (1978) 615; ja Goeddel et ai. . Nature 281 10 (1979) 544], tryptofaani- (trp) promoottorisysteemi [Goeddel et ai.. Nucl. Acids Res. 8 (1980) 4057; ja EPÄ 36 776] ja tac-promoottori (Sambrook et ai., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989). Erityisen edullisessa prokaryoottisessa isäntäso-15 luilmentämissysteemissä käytetään lambda-fagin PL-promoot-tori- ja lämpölabiilia cI857ts-repressorisekvenssiä. Plas-midivektoreita, joita on saatavana talletuslaitokselta American Type Culture Collection ja jotka sisältävät lamb-da-PL-promoottorijohdannaisia, ovat plasmidit pHUB2 [ole-20 massa EL. coli -kannassa JMB9 (ATCC 37092] ja pPLc28 [ole massa EL coli RR1:ssä (ATCC 53082].

Myös nisäkäs- tai hyönteisisäntäsoluviljelmäsys-teemejä voitaisiin käyttää yhdistelmä-DNA-IL-15-muteiinien ilmentämiseksi. Esimerkkejä sopivista nisäkäsisäntäsolu-25 linjoista ovat apinan munuaissolujen C0S-7-solulinjat [Glutzman et alj., Cell 23 (1981) 175; ATCC CRL 1651], L-o solut, C127-solut, 3T3-solut (ATCC CCL 163), CHO-solut, ° HeLa-solut (ATCC CCL 2) ja BHK- (ATCC CRL 10) solulinjat.

^ Sopivat nisäkäsilmentämisvektorit sisältävät ei kopioituja i 30 elementtejä kuten replikaatioalkukohta, promoottori- x sekvenssi, rakennegeeniin kytketty tehostaja, muita 5'- tr tai 3'-sivuavia ei kopioituja sekvenssejä, kuten riboso- oo misitoutumissekvenssit, polyadenylaatiokohta, silmikoinnin o g luovuttaja- ja vastaanottajakohdat ja transkription pää- o 35 tössekvenssit.

CM

16

Nisäkäsisäntäsoluilmentämisvektoreiden transkription ja translaation kontrollisekvenssit voidaan saada viruslähteistä. Esimerkiksi yleisesti käytettyjä nisäkäs-solupromoottorisekvenssejä ja tehostajasekvenssejä saadaan 5 polyomaviruksesta, adenoviruksesta 2, apinaviruksesta 40 (SV40) ja ihmisen sytomegaloviruksesta. SV40-virusgenomis-ta saatuja DNA-sekvenssejä, esimerkiksi SV40:n alkua, varhais- ja myöhäispromoottoria, tehostajaa, silmikointi-ja polyadenylaatiokohtia voidaan käyttää niiden muiden 10 geneettisten elementtien saamiseksi, joita tarvitaan ra-kennegeenisekvenssin ilmentämiseksi nisäkäsisäntäsolussa. Viraaliset varhais- ja myöhäispromoottorit ovat erityisen edullisia, koska molemmat saadaan helposti virusgenomista fragmenttina, joka saattaa sisältää myös viruksen repli-15 kaatioalkukohdan [Fiers et ai, , Nature 273 (1978) 113] .

Pienempiä tai suurempia SV40-fragmentteja voidaan niinikään käyttää edellyttäen, että mukana on se noin 250 ep:n sekvenssi, joka ulottuu HindiII-kohdasta Bgll-kohtaan, joka sijaitsee SV40:n viraalisessa replikaatioalkukohdas-20 sa.

Mallinisäkäsilmentämisvektoreita voidaan rakentaa kuten julkistavat Okayama ja Berg ΓΜοΙ. Cell. Biol. 3. (1983) 280] . Muita käyttökelpoisia nisäkäsilmentämisvek- toreita kuvataan US-patenttihakemusjulkaisussa sarjanumero 25 07/480 694, joka jätettiin 14. helmikuuta 1990, ja US-pa- tenttijulkaisussa 5 350 683.

o Yhdistelmä-DNA-IL-15-muteniinien puhdistaminen £3 Yleensä ottaen IL-15-muteiinipolypeptidejä voidaan valmistaa viljelemällä transformoituja isäntäsoluja IL-15- tj- 30 muteiinipolypeptidien ilmentämiseksi vaadituissa viljely- c\j χ olosuhteissa. Saatu ilmennetty muteiinia voidaan sitten

CC

puhdistaa viljelykasvualustasta tai solu-uutteista. IL-15- § muteiinia voidaan konsentroida käyttäen kaupallisesti sää tö g tavana olevaa proteiinin konsentrointisuodatinta, esimer- o 35 kiksi Amicon tai Milliporen Pellicon -ultrasuodatusyksik- 17 köä. Käyttäen tai käyttämättä konsentrointivaihetta kasvualusta voidaan panostaa puhdistusmatriisiin kuten hydrofobiseen kromatografiaväliaineeseen. Edullinen väliaineon Phenyl SepharoseR CL-4B (Pharmacia). Vaihtoehtoisesti voi-5 daan käyttää anioninvaihtohartsia, esimerkiksi matriisia tai substraattia, jossa on "riippuvia" dietyyliamino-etyyli- (DEAE) ryhmiä. Matriisit voivat olla akryyliami-dia, agaroosia, dekstraania, selluloosaa tai edustaa muuta, proteiinien puhdistuksessa tavanomaisesti käytettyä 10 tyyppiä. Vaihtoehtoisesti geelisuodatusväliainetta voidaan käyttää.

Lopuksi IL-15-muteiinien edelleen puhdistamiseksi voidaan käyttää yhtä tai useampaa käänteisfaasikorkeapai-nenestekromatografia- (RP-HPLC) vaihetta, joissa käytetään 15 hydrofobista RP-HPLC-väliainetta, esim. silikageeliä, jos sa on riippuvia butyyli- tai muita alifaattisia ryhmiä. S Sepharose (Pharmacia) -kationinvaihtokolonnia voidaan myös käyttää lopullisena puskurivaihtovaiheena. Joitakin tai kaikkia edeltäviä tavanomaisia puhdistusvaiheita eri yh-20 distelminä voidaan niinikään käyttää oleellisesti homogeenisen yhdistelmä-DNA-proteiinin saamiseksi.

Bakteeriviljelmässä tuotettu yhdistelmä-DNA-pro-teiini eristetään tavallisesti aluksi rikkomalla isäntä-solut, minkä jälkeen sentrifugoidaan, solupellettejä uu-25 tetaan, jos polypeptidi on ei-liukoinen, tai supernatant-tia, mikäli polypeptidi on liukoinen, minkä jälkeen suo-o ritetaan yksi tai useampi konsentrointi-, "salting out" -, ^ ioninvaihto- tai kokoekskluusiokromatografiavaihe. Lopuksi i ^ RP-HPLC:tä voidaan käyttää loppupuhdistusvaiheissa. Mikro- i -V 30 bisolut voidaan rikkoa millä tahansa kätevällä menetelmää -

C\J

x lä mukaan lukien jäädytys-sulatuskierrätys, sonikointi, cc “ mekaaninen rikkominen tai solulyysiaineiden käyttö.

§ IL-15-muteiinin ilmentämiseksi eritettynä polypep- § tidinä käytetään edullisesti transformoituja hiivaisäntä- o o 35 soluja. Hiivaisäntäsolusta fermentoinnissa eritettyä yh- 18 distelmä-DNA-polypeptidiä voidaan puhdistaa menetelmillä, jotka ovat analogisia Urdalin et ai. julkistamiin fj. Chromatogr. 296 (1984) 171] . Urdal et ai. kuvaavat kahta perättäistä käänteisfaasi-HPLC-vaihetta yhdistelmä-DNA-5 ihmis-IL-2:n puhdistamiseksi preparatiivisessa HPLC-ko-lonnissa.

Edullisesti käytetään IL-15:n muteiinia, josta ainakin yksi IL-15:n (jolloin apina-IL-15:n sekvenssi vastaa aminohappotähteitä 49 - 162 kuten esitetään sekvenssinä 10 tunnusnumero 1 tai jolloin ihmisen IL-15:n sekvenssi vastaa aminohappotähteitä 49 - 162 kuten esitetään sekvenssinä tunnusnumero 2) aminohappotähteistä Asp56 tai Gin156 on deletoitu tai substituoitu muulla luonnollisesti esiintyvällä aminohappotähteellä. Voidaan tehdä substituutioiden 15 ja/tai deleetioiden mikä tahansa yhdistelmä. Esimerkiksi Asp56 voidaan deletoida, kun puolestaan Gin156 substituoidaan millä tahansa muulla aminohapolla, tai sekä Asp56 että Gin156 kumpikin substituoidaan samalla tai erilaisella aminohap-poryhmällä. Edelleen Asp56 voidaan substituoida millä ta-2 0 hansa aminohapolla, kun taas Gin156 deletoidaan. Yleensä ottaen substituutiomuteiinit ovat edullisia, ja edullisempia ovat ne (substituutiot) , jotka eivät vakavasti vaikuta IL-15-molekyylin luonnolliseen laskostumiseen. Substituu-tiomuteiineihin sisältyvät edullisesti ne, joissa Asp56 on 25 substituoitu seriinillä tai kysteiinillä; tai joissa Gin156 on substituoitu seriinillä tai kysteiinillä, tai joissa o sekä Asp56 että Gin156 kumpikin on substituoitu seriinillä ^ tai kysteiinillä. Esimerkkejä deleetiomuteiineista ovat i ne, joista kypsän IL-15:n sekä Asp56 että Gin156 kumpikin on i 30 deletoitu; joista vain Asp56 on deletoitu; tai joista vain x Gin156 on deletoitu. On mahdollista, että muitakin aminohap- potähteitä joko Asp56: n tai Gin156: n alueella voidaan subst ίο g tuoida tai deletoida säilyttäen edelleen signaalinsiirron o g estovaikutus IL-15-reseptorikompleksin joko β- tai γ-ala- ^ 35 yksikön tai molempien välityksellä. Tämän vuoksi keksintö 19 käsittää lisäksi muteiinit, joissa aminohappotähteitä joko Asp56:n ja Gln156:n alueella on joko substituoitu tai dele-toitu ja joilla on IL-15-antagonistiaktiivisuutta. Tällaisia muteiineja voidaan valmistaa käyttäen tässä kuvattuja 5 menetelmiä ja niiden IL-15-antagonistiaktiivisuus voidaan määrittää käyttäen tavanomaisia menetelmiä. Tarkemmin menetelmää, jota voidaan käyttää keksinnön mukaisten IL-15-muteiinien luomiseksi, kuvataan esimerkissä 1.

Konjugoituja IL-15-molekyylejä ja IL-15-muteiineja 10 Tässä julkistettuja kypsiä IL-15-polypeptidejä (jolloin apina-IL-15:n sekvenssi vastaa aminohappotähteitä 49 - 162 kuten esitetään sekvenssinä tunnusnumero 1 ja jolloin kypsän ihmis-IL-15:n sekvenssi vastaa aminohappotähteitä 49 - 162 kuten esitetään sekvenssinä tunnusnumero 15 2) sekä IL-15-muteiineja voidaan modifioida muodostamalla kovalenttisia tai aggregatiivisia konjugaatteja muiden kemiallisten ryhmien/aineiden kanssa. Tällaisia aineita voivat olla PEG, mPEG, dekstraani, PVP, PVA, polyaminohapot kuten poly-L-lysiini taipolyhistidiini, albumiini ja gela-20 tiini IL-15-molekyylillä spesifisissä kohdissa, jotka voivat häiritä IL-15:n sitoutumista IL-15-reseptorikompleksin β- tai γ-ketjuihin samalla, kun IL-15:n korkea affiniteetti IL-15Roi:n suhteen säilytetään. Lisäksi IL-15 voidaan spesifisesti glykosyloida kohdissa, jotka voivat häiritä 25 IL-15:n sitoutumista IL-15-reseptorikompleksin β- tai 7- ketjuihin samalla, kun IL-15:n korkea affiniteetti IL-o 15Ro!:n suhteen säilytetään. Edullisia ryhmiä konjugointiin £3 ovat PEG, dekstraani ja PVP. Keksinnössä käytettäväksi edullisin on PEG, jolloin PEG:n molekyylipaino on edulli-4- 30 sesti noin 1 000 - noin 20 000. Molekyylipaino noin 5 000

(M

on edullinen IL-15:n konjugointiin käytettäväksi, joskin a: sopivia olisivat myös muita painoja vastaavat PEG-molekyy- § lit. Lukuisat eri PEG-muodot sopivat keksinnössä käytettä- o g viksi. Esimerkiksi PEGrtä voidaan käyttää sukkinimidyyli- o 35 sukkinaatti-PEG:n muodssa (SS-PEG), joka tarjoaa hydro- 20 lyyttiselle pilkkomiselle in vivo äitiin esterisidoksen, sukkinimidyylikarbonaatti-PEG (SC-PEG), joka tarjoaa ure-taanisidoksen ja on stabiili hydrolyyttisen pilkkomisen in vivo suhteen, sukkinimidyylipropionaatti-PEG (SPA-PEG), 5 joka antaa käyttöön in vivo stabiilin eetterisidoksen, vinyylisulfonyyli-PEG (VS-PEG) ja maleimidi-PEG (Mal-PEG), joita kaikkia on kaupallisesti saatavana yritykseltä Shearwater Polymers, Inc. (Huntsville, AL). Yleensä ottaen SS-PEG, SC-PEG ja SPA-PEG reagoivat spesifisesti lysiini-10 tähteiden polypeptidissä kanssa, kun taas VS-PEG ja Mal-PEG kumpikin reagoivat vapaiden kysteiinitähteiden kanssa. Kuitenkin Mal-PEG varmasti reagoi lysiinitähteiden kanssa alkalisessa pH:ssa. Edullisesti etusijalle asetetaan SC-PEG ja VS-PEG, jolloin edullisin on SC-PEG stabiilisuuten-15 sa in vivo ja spesifisyytensä lysiinitähteille johdosta.

PEG-ryhmät voidaan sitoa IL-15:een strategisiin kohtiin PEG:n suuren molekyylikoon hyödyntämiseksi. Kuten edellä on kuvattu, PEG-ryhmiä voidaan sitoa IL-15:een käyttäen proteiinissa luonnollisesti esiintyviä lysiini-20 tai kysteiinitähteitä tai paikkaspesifisellä PEG-yloin-nilla. Yksi paikkaspesifisen PEG-yloinnin menetelmistä on käyttää proteiinimanipulointimenetelmiä, joissa kysteiini-tai lysiinitähteitä sijoitetaan IL-15:een spesifisiin ami-nohappopaikkoihin. IL-15:een konjugoitujen yhden tai use-25 ämmän PEG-ketjun suuren molekyylikoon arvellaan salpaavan IL-15:n sen alueen, joka sitoutuu IL-15-reseptorikomplek-o sin β- ja/tai 7-alayksikköön mutta ei sen a-alayksikköön.

^ Konjugointeja voidaan suorittaa yksinkertaisella additio- f- reaktiolla, jossa PEG:tä lisätään IL-15:tä sisältävään 3 0 emäksiseen liuokseen. Tyypillisesti PEG-ylointi suorite- C\) x taan joko (1) pH:ssa noin 9,0 SC-PEG/lysiinitähde-mooli-

GC

“ suhteissa noin 1:1 - 100:1, tai enemmän; tai (2) pH:ssa § noin 7,0 VS-PEG/kysteiinitähde-moolisuhteissa noin 1:1 - o g 100:1 tai enemmän.

o o

<M

21

Konjugoituja PEG-yloituja IL-15-molekyylejä voidaan karakterisoida SDS-PAGE:lla 4 - 20 %:n gradientin polyak-ryyliamidigeelissä, jota on saatavana yritykseltä Novex Corp., San Diego, Kalifornia. Tavanomaista hopeavärjäystä 5 tai tavanomaisia Western blot -tekniikoita voidaan käyttää runsaasti PEG-yloiduille proteiineille, jotka hopeavär-jäyksellä ovat vaikeasti visualisoitavissa. PEG-yloidut IL-15-molekyylit voidaan puhdistaa käyttäen kokoekskluu-siokromatografiaa, dialyysiä, ultrasuodatusta tai affini- 10 teettipuhdistusta.

PEG-yloidun IL-I5:n modifioinnin laajuus ja heterogeenisyys voidaan määrittää käyttäen tavanomaista mat-riisiavusteista laser-desorptio-ionisointimassaspektro-metriaa (MALDI). Ihmis-IL-15:n molekyylipainon ollessa 15 noin 13 000 ja käytettäessä PEG 5000:tä MALDI osoittaa, että valmisteet, jotka painavat 13 000, eivät ole PEG-yloituja, 18 000 painavissa yksi IL-15-molekyyli on sidottu yhteen PEG-molekyyliin; 23 000 painavissa yksi IL-15-mole-kyyli on sidottu kahteen PEG-molekyyliin jne.

20 IL-15-vastaisia monoklonaalisia vasta-aineita

Vaihtoehtoisesti keksinnön mukainen antagonisti voi olla IL-15-vastaisen monklonaalisen vasta-aineen muodossa, joka häiritsee IL-15:n sitoutumista IL-15-reseptorikomp-leksin mihin tahansa a-, S- tai 7-alayksikköön. Keksinnön 25 yhden näkökohdan puitteissa IL-15:tä mukaan lukien sen johdannaisia sekä näiden proteiinien osia tai fragmentteja o kuten IL-15-peptidejä voidaan käyttää IL-15:een spesifi- ^ sesti sitoutuvien vasta-aineiden valmistamiseksi. Keksin- ^ nön puitteissa ilmaisulla "vasta-aineet" tarkoitetaan po- ^j- 30 lyklonaalisia vasta-aineita, monoklonaalisia vasta-ainei-

<N

x ta, niiden fragmentteja kuten F(ab')2- ja Fab-fragmentit cc sekä yhdistelmä-DNA-teknisesti tuotettuja sitoutumispart-00 nereita. Monoklonaalisen vasta-aineen tai sitoutumispart-

O

§ nerin affiniteetin pystyy alan keskimääräinenkin taitaja o o 35 helposti määrittämään [katso Scatchard, Ann. N.Y. Acad.

22

Sei. 51 (1949) 660 - 672] . Spesifisiä esimerkkejä tällaisista monoklonaalisista vasta-aineista annetaan tässä julkaisussa esimerkissä 2.

Yleensä ottaen IL-15-vastaisia monoklonaalisia 5 vasta-aineita voidaan muodostaa käyttäen seuraavaa menettelyä. Puhdistettua IL-15:tä, sen fragmenttia, synteettisiä peptidejä tai IL-15:n ilmentäviä soluja voidaan käyttää IL-15-vastaisten monoklonaalisten vasta-aineiden muodostamiseksi käyttäen sinänsä tunnettuja tekniikoita, 10 esimerkiksi tekniikoita, joita kuvataan US-patenttijul-kaisussa 4 411 993. Lyhyesti, hiiriä immunoidaan IL-15:llä immunogeeninä, joka on emulgoitu täydelliseen Freundin tehosteeseen tai RIBI-tehosteeseen (RIBI Corp., Hamilton, Montana) ja jota ruiskutetaan määrinä 10 - 100 μg ihon-15 alaisesti tai vatsaontelonsisäisesti. 10 - 12 päivän kuluttua immunoiduille eläimille annetaan tehosteena lisää epätäydelliseen Freundin tehosteeseen emulgoitua IL-15:tä. Sen jälkeen hiirille annetaan tehosteita immunointiohjel-man mukaan kerran viikossa tai kahdessa. Seeruminäytteitä 20 otetaan ajoittain ottamalla verta silmäkuopasta tai hän-nänpäätä leikkaamalla IL-15-vasta-aineiden suhteen testaamiseksi dot blot -määrityksellä, ELISA:11a (entsyymiliit-teinen immunosorbenttimääritys) tai IL-15-aktiivisuuden inhibition suhteen testaamiseksi CTLL-2-soluilla.

25 Kun on todettu sopiva vasta-ainetiitteri, positii visille eläimille annetaan vielä laskimonsisäisenä ruis-o keena IL-15:tä suolaliuoksessa. 3-4 päivän kuluttua eläimet uhrataan, pernasolut otetaan talteen ja pernasolut fuusioidaan hiiren myeloomasolulinjaan, esim. NS1 tai -st- 3 0 edullisesti P3x63Ag8.653 (ATCC CRL 1580) . Fuusiossa muo-

C\J

x dostuu hybridoomasoluja, jotka maljataan usealle mikro- <r “ tiitterilevylle selektiiviseen HAT- (hypoksantiini, ami- § nopteriini ja tymidiini) kasvualustaan ei-fuusioitujen o § myeloomasolujen ja myeloomahybridien lisääntymisen estä- o o 35 miseksi.

23

Hybridoomasoluja seulotaan ELISA:11a reaktiivisuuden suhteen vastaan puhdistettua IL-15:tä käyttämällä sovellutuksia tekniikoista, jotka julkistetaan julkaisussa Engvall et ai., Immunochem. 8 (1971) 871, ja US-patentti-5 julkaisussa 4 703 004. Edullinen seulontatekniikka on vasta-ainesieppaustekniikka, jota kuvataan julkaisussa Beckmann et ai. [J. Immunol. 144 (1990) 4212] . Positiivi sia hybridoomasoluja voidaan ruiskuttaa vatsaontelonsi-säisesti syngeenisiin Balb/c-hiiriin askiittinesteen 10 tuottamiseksi, joka sisältää korkeita pitoisuuksia mono- klonaalisia anti-IL-15-vasta-aineita. Vaihtoehtoisesti hybridoomasoluja voidaan kasvattaa kolveissa tai rulla-pulloissa in vitro eri tekniikoin. Hiiren askiittinestee-seen tuotetut monoklonaaliset vasta-aineet voidaan puh-15 distaa ammoniumsulfaatilla saostamalla, minkä jälkeen suoritetaan geeliekskluusiokromatograf ia . Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää myös affiniteettikromatografiaa, joka perustuu vasta-aineen sitoutumiseen proteiini-A:han tai pro-teiini-G:hen, kuten voidaan käyttää myös sitoutumiseen IL-20 15:een perustuvaa affiniteettikromatografiaa.

Muita "vasta-aineita" voidaan valmistaa käyttäen tässä esitettyä julkistusta, jolloin nämä siis kuuluvat keksinnön suojapiiriin. Humanisoitujen vasta-aineiden muodostamiseksi käytettyjä menettelyjä on löydettävissä 25 US-patenttijulkaisuista 4 816 567 ja WO 94/10 332; menet telyjä mikrokappaleiden muodostamiseksi voidaan löytää WO-o julkaisusta 94/09 817; ja menettelyjä siirtogeenisten vas- w ta-aineiden muodostamiseksi on löydettävissä GB-hakemus- julkaisusta 2 272 440, jotka kaikki julkaisut sisällyte- i 3 0 tään tähän viitteiksi.

x Sen määrittämiseksi, mitkä monoklonaaliset vasta- cc aineet ovat antagonisteja, käytetään edullisesti seulonee g tamaaritysta. Tähän tarkoitukseen edullinen on CTLL-2-li- § sääntymismääritvs. Katso Gillis ja Smith, Nature 268 o ^ 35 (1977) 154, joka julkaisu sisällytetään tähän viitteeksi.

24

Keksinnön mukaisilla antagonisteja voidaan käyttää kuten kuvataan edellä ja yksityiskohtaisemmin alla siirteen eloonjäännin edistämiseksi ja potilaiden hoitamiseksi, joilla on siirre-isäntäsairaus. Muu uskottava käyttö 5 antagonisteille on myöhäisvaiheen HTLV- (ihmisen T-solu-lymfotrofinen virus) I-indusoidun täysikasvuisen T-solu-leukemia-lymfoman hoito, katso Burton et ai,, Proc. Natl. Acad. Sei. 91 (1994) 4935]. Muita uskottavia käyttöjä on kyky estää B-solu- tai T-solustimulaatio in vitro, resep-10 tori-ligandivuorovaikutuksen tutkiminen, diagnoosipakkauk- set tarttuvaan sairauteen ja häiriöihin ruoansulatuselimistön alueella. Keksinnön mukaisten antagonistien aktiivisuuden ansiosta uudet menetelmät tiettyjen sairauksien hoitamiseksi kuuluvat keksinnön suojapiiriin. Esimerkiksi 15 julkistetaan menetelmä siirrehyljinnän estämiseksi sitä tarvitsevassa potilaassa, ja menetelmä GVHD:n hoitamiseksi sitä tarvitsevassa potilaassa, jolloin kummankin menetelmän vaiheena annetaan farmaseuttista koostumusta, joka käsittää IL-15-antagonistia määrän, joka on tehokas IL-15-20 aktiivisuuden inhiboimiseksi, ja farmaseuttisesti hyväksyttävää kantajaa tai laimenninta. Samankaltaiset menetelmät ovat käyttökelpoisia muiden sairauksien hoitamiseksi, joissa kohdesolut (solut, joiden uskotaan pääasiassa olevan vastuussa sairaustilasta, tai sairaustilan oireesta) 25 ilmentävät IL-15-reseptorikompleksia ja joissa signaalin siirron IL-15-reseptorin S- tai γ-alayksikön välityksellä o salpaaminen tai inhibitio on toivottava. Tällaisia sai- ^ raustiloja voidaan mahdollisesti hoitaa keksinnön mukai- A silla antagonisteilla havaittaessa kohdesolujen ilmentävän 4- 30 IL-15-reseptorikompleksin. Itse asiassa GVHD:n ja siirre-

OJ

hyljinnän lisäksi tällaisia sairaustiloja voivat olla esi-tr merkiksi lymfomat, syövät, leukemiat, poikkijuovaisen li- § haksen sarkoomat ja tietyt autoimmuunihäiriöt kuten nivel en o reuma. Sitä seikaa, ettei edeltävä luettelo ole kattava o 35 kaikkien sairaustilojen osalta, joissa kohdesolut ilmentä- C\J j ' j 25 vät tarvittavan IL-15-reseptorikompleksin, ei tulisi tulkita keksinnön suojapiiriä rajoittavaksi.

Kuten edellä kuvataan, keksinnön toisen suoritusmuodon muodostavat nukleiinihapot, jotka koodittavat kek-5 sinnön mukaisia IL-15-muteiineja. Tällaiset nukleiinihapot käsittävät joko RNA:ta tai cDNA:ta, jonka nukleotidisek-venssi on sekvenssi 144 - 486 sekvenssistä tunnusnumero 1 ja 144 - 486 sekvenssistä tunnusnumero 2. Edelleen keksinnön suojapiiriin kuuluvat ilmentämisvektorit, jotka käsit-10 tävät IL-15-muteiinia koodittavan cDNA:n, ja tällaisella ilmentämisvektorilla transformoidut tai transfektoidut isäntäsolut. Transformoidut isäntäsolut ovat soluja, jotka on transformoitu tai transfektoitu yhdistelmä-DNA-ilmentämisvektorilla vakiomenettelyjä käyttäen. Ilmennetty nisä-15 käs-IL-15 sijaitsee isäntäsolussa ja/tai se on eritetty viljelysupernatanttiin riippuen isäntäsolun ja isäntäso-luun insertoidun geenirakenteen luonteesta. Farmaseuttiset koostumukset, jotka käsittävät jotain edellä kuvatuista IL-15-antagonisteista, kuuluvat myös tämän keksinnön suo-20 japiiriin.

IL-15-antagonistien antaminen

Esillä oleva keksintö antaa käyttöön menetelmiä farmaseuttisten koostumusten käyttämiseksi, jotka käsittävät tehokkaan määrän IL-15-antagonistia sopivassa lai-25 mentimessa tai kantajassa. Keksinnön mukainen IL-15-anta-gonisti voidaan koostaa tunnettujen menetelmien mukaan, o joita käytetään farmaseuttisesti käyttökelpoisten koostu- £3 musten valmistamiseksi. IL-15-antagonisti voidaan yhdistää Ά seokseksi joko ainoana aktiivisena materiaalina tai muiden 4 30 tunnettujen aktiivisten materiaalien kanssa, farmaseuttis en x esti sopivien laimentimien (esim. Tris-HCl, asetaatti, cc fosfatti) , säilytysaineiden (esim. Thimerosal, bentsyyli- § alkoholi, parabeenit), emulgaattorien, liuottimien, tehos- o g timien ja/tai kantajien kanssa. Sopivia kantajia ja niiden o 35 koostumuksia kuvataan käsikirjassa "Remington's Pharma- 26 ceutical Sciences", 16. painos, Mack Publishing Co., 1980. Lisäksi tällaiset koostumukset voivat sisältää IL-15-anta-gonistia, joka on kompleksoitu polyetyleeniglykoliin (PEG), metalli-ioneihin tai sisällytetty polymeerisiin yh-5 disteisiin kuten polyetikkahappo, polyglykolihappo, hyd-rogeelit jne., tai sisällytetty liposomeihin, mikroemulsi-oihin, miselleihin, uni- tai multilamellaarisiin rakkuloihin, erytrosyyttiaaveisiin tai sferoblasteihin. Tällaiset koostumukset vaikuttavat IL-15-antagonistin fysikaaliseen 10 tilaan, liukoisuuteen, stabiilisuuteen, vapautumisen in vivo nopeuteen ja poistumisen in vivo nopeuteen. IL-15-antagonisti voidaan myös konjugoida kudosspesifisten reseptorien, ligandien tai antigeenien vastaisiin vasta-aineisiin tai kytkeä kudosspesifisten reseptorien ligandei-15 hin.

Keksinnön mukainen IL-15-antagonisti voidaan antaa paikallisesti, ruoansulatuskanavan ulkopuolisesta, peräsuolen kautta tai inhalaattorilla. Ilmaisun "ruoansulatuskanavan ulkopuolisesta" piiriin kuuluvat ihonalaiset 20 ruiskeet, laskimonsisäiset, lihaksensisäiset, selkäyti-mensisäisenä ruiskeena tai infuusiotekniikoilla. Nämä koostumukset sisältävät tyypillisesti tehokkaan määrän IL-15-antagonistia, yksinään tai yhdistettynä tehokkaaseen määrään jotain toista aktiivista materiaalia. Tällaiset 25 annostukset ja halutut lääkepitoisuudet, jotka sisältyvät koostumuksiin, voivat vaihdella riippuen monista tekijöis-o tä mukaan lukien aiottu käyttö, potilaan ruumiinpaino ja ikä ja antotie. Alustavat annokset voidaan määrittää T- eläinkokeiden perusteella, ja annostukset voidaan muuntaan i -sr 30 ihmiskäyttöön alalla hyväksytyn käytännön mukaan.

CM

x Edeltävän lisäksi seuraavat esimerkit esitetään cc nimenomaisten suoritusmuotojen havainnollistamiseksi eikä § keksinnön suojapiirin rajoittamiseksi.

o o

CO

o o

CM

27

Esimerkki 1 IL-15-muteiinit Tässä esimerkissä kuvataan menetelmää kypsän tai natiivin IL-15:n muteiinien saamiseksi, jotka toimivat IL-5 15-antagonisteina. IL-15, kuten IL-2, kykenee sitoutumaan IL-2R-lS-7-kompleksiin ja signalloimaan sen välityksellä, ja tämä huomioon ottaen esitetään, että sillä on IL-2:n kanssa yhteisiä rakenteellisia ominaisuuksia. Ekvivalent-tiset tähteet IL-15:ssä, joiden on aiemmin IL-2:ssa osoi-10 tettu olevan kriittisiä vuorovaikutukselle IL-2R-S-ketjun ja -γ-ketjun kanssa [Zurawski et ai. . EMBO J. 12:13 (1993) 5113], määritettiin "best fit"- (parhaimman sopivuuden) sekvenssirinnanasettelulla asparagiinihapoksi, tähde 56 (Asp) β-ketjulle, ja glutamiiniksi, tähde 156 (Gin) γ-ket-15 julle (aminohapponumerointi perustuu peptidin sekvenssiin esitettynä sekvenssien tunnusnumerot 1 ja 2 aminohappotähteillä 1 - 162) .

Suunniteltiin ja rakennettiin oligonukleotidialuk-keita, jotka monistaisivat ihmis-IL-15:tä ja liittäisivät 20 mukaan kodonin, joka koodittaa joko seriinin tai kysteii-nin tähteeksi 56 tai vastaavasti 156. Kummankin mutantin rakentamiseksi suoritettiin kaksi erillistä PCR-monistus-kierrosta (katso seuraava diagrammi). Primaarisessa PCR-reaktiossa monistaminen tapahtui alukepareilla, jotka joko 25 toivat mukanaan tarkoituksenmukaisen mutaation, tai monistivat kypsän sekvenssin. Sekundaarisessa PCR-reaktiossa o materiaalia 1. kierrokselta uudelleenmonistettiin aluke- ^ sarjaa käyttäen, joka toi mukanaan restriktiokohdat kloofs naukselle paADH2-hiivailmentämisvektoriin pIXY456. Katso 4- 30 Price et ai. , Gene 55 (1987) 287, ja Price et ai. , Meth.

cg x Enzvm. 185 (1990) 308.

cc Q- o 00 o o

CD

O

O

cg 28

Sekundaarinen Primaarinen PCR-aluke {5') PCR-aluke (5') -----1 I...........< t— 5 ' .-r~~vlF—\

Primaarinen Sekundaarinen PCR-aluke (3 *) PCR-aluke (3·)

Seuraavassa taulukossa on lueteltu oligonukleoti-dialukeparit, joita käytettiin kunkin muteiinin primaari-10 seksi monistamiseksi. Oligonukleotidejä NTFIL15B (5'-alu-ke) ja NCTFIL15F (3'-aluke) käytettiin primaarimonistami-seen toivottaessa kypsän sekvenssin säilymistä.

Arainohappo- ... , substituutiot _. . . .

Kloonin ——---- Odotettu Prim. PCR- Prim. PCR- 1 5 nimi_D56_Q156 fenotyyppi_5 1 -aluke_31 -aluke_

DQ D Q NTFIL15B NCTFIL15F

SQ S Q β - / γ + D56SER5 NCTFIL15F

DS D S β + / γ - NTFIL15B Q156SER3 SS S S β - / γ - D56SER5 Q156SER3

CQ C Q β - / γ + D56CYS5 NCTFIL15F

20 DC D C β + /γ- NTFIL15B Q156CYS3 CC C C β - / γ - D56CYS5 Q156CYS3

Alukkeen nimi Sekvenssi

Prim. PCR

D56Cys5 (5'-AATGTAATAAGTTGTTTGAAAAAAATT-3 j SEQ ID NO: 3 25 D56Ser5 (5'-AATGTAATAAGTTCTTTGAAAAA?mTT-3') SEQ ID NO: 4 Q156Cys3 (5'-GTTGATGAACATGCAGACAATATG-3') SEQ ID NO: 5 Q156Ser3 (5'-GTTGATGAACATAGAGACAATATG-3') SEQ ED NO: 6 0 NTFEL15B (5'-gtcctcgcaactaagtcgactaactgggt- 5 GAATGTAATA-3') SEQ ED NO: 7 ™ NCTFIL15F (5'-GAGTCATTCTCGACTTGCGGCCGCACCAG- ^ AAGTGTTGATGAACAT-3') SEQ ED NO: 8

Τφ 30 Sek- pCR

^ ILI5PIXYF5 (5-AATATGGTACCTTTGGATAAAAGAGACTA- a. CAAGGACGACGATGACAAGAACTGGGTGAAT - “ GTAATAAGT-3') SEQ ID NO: 9 O IL15PIXY3 (5-GCGATATATCCATGGTCAAGAAGTGTTGA- o TGAACAT-3') SEQ ED NO: 10

CD

o o

(M

29

Vaihtoehtoisesti oligonukleotidi NTFIL15B voitaisiin substituoida oligonukleotidillä IL15PIXYF5 ja oligonukleotidi NCTFIL15F voitaisiin substituoida oligonukleotidillä IL15PIXY3. Primaarinen PCR-monistaminen suoritet-5 tiin 100 μΐ:ssa lx Taq-polymeraasipuskuria (Boehringer), joka sisälsi 250 μΜ dNTP ja 50 pmol 5'- ja 3'-oligonuk-leotidialuketta. DNA-templaattina käytettiin noin 50 ng pIXY764:ää. Vektori pIXY764 on samankaltainen kuin edellä kuvattu vektori pIXY456, joka sisältää ihmis-FLAG-IL-15:tä 10 koodittavaa DNA:ta, jolloin ihmis-IL-15:n N-kytketyt gly-kosylaatiokohdat on inaktivoitu käyttäen edellä kuvattuja menettelyjä. Reaktioseoksien päälle sijoitettiin kerrokseksi mineraaliöljyä ja kuumennettiin 94 °C:seen lämpökier-rättimessä 5 minuutiksi, minkä jälkeen lisättiin 2 yksik-15 köä Taq-polymeraasia (Boehringer) ja aloitettiin lämpö-kierrätys. Kierrätysolosuhteet olivat denaturointi 94 °C:ssa 45 sekunnin ajan, juottaminen 45 °C:ssa 45 sekunnin ajan ja laajentaminen 72 °C:ssa 1 minuutin ajan kaikkiaan 30 kierrosta.

2 0 Noin 2 0 ng geelipuhdistettua tuotetta primaarimo- nistamisesta käytettiin templaattina sekundaarisessa PCR-monistuksessa. Kaikkia rakenteita monistettiin IL15PIXYF-5:llä ja IL15PIXY3:11a käyttäen samoja puskuriolosuhteita kuin edellä. Kierrätysolosuhteet olivat denaturointi 25 94 °C:ssa 45 sekunnin ajan, juottaminen 60 °C:ssa 45 sekun nin ajan ja laajentaminen 72 °C:ssa 1 minuutin ajan kaikki- o aan 20 kierrosta.

o <N Monistustuotteita puhdistettiin geelissä ja pilkot- i tiin Asp718:lla (Boehringer) ja NcoI:llä (new England Bio- i 30 labs) yön yli 37 °C:ssa lx Boehringer-puskurissa B. Rest- x riktiotuotteet ligatoitiin pIXY456-hiivailmentämisvekto- riin, jota oli pilkottu Asp718:lla ja NcoI:llä. Tällä o g DNA:11a transformoitiin kannan DHIOE EL, coli -soluja elek- § troporaatiolla.

o

(V

30

Plasmidi-DNA yksittäisistä transformanteista sek-ventoitiin sekvenssi-integriteetin varmistamiseksi, ja sillä transformoitiin XV2181 S_;_ cerevisiae. Biologinen aktiivisuus määritettiin käyttäen hiivasupernatanttia 30 5 tunnin indusoinnin jälkeen.

Näissä kokeissa käytettiin mutagenisoinnissa PCR-pohjaista strategiaa sen perusteella, että mutagenisoita-vat kohdat sijaitsivat lähellä IL-15-geenin päitä. Kuitenkin nämä ja mitkä tahansa muut yksittäiset tai moni-10 pistemutaatiot voitaisiin tehdä tavanomaisin paikkakoh- denteisin mutagenisointitekniikoin.

Esimerkki 2 IL-15-vastaisia monoklonaalisia vasta-aineita Tässä esimerkissä kuvataan menetelmää, jota käy-15 tettiin kolmen monoklonaalisen anti-IL-15-vasta-aineen saamiseksi, jotka toimivat IL-15-antagonisteina. Kaikki menetelmät ovat tavanomaisia tekniikoita ellei toisin ole mainittu.

Balb/c-hiiriin ruiskutettiin vatsaontelonsisäisesti 20 kahdessa yhteydessä 3 viikon välein 10 //g hiivaperäistä ihmis-IL-15:tä RIBI-tehosteen läsnä ollessa (RIBI Corp., Hamilton, Montana). Hiiriseerumi määritettiin sitten tavanomaisella dot blot -tekniikalla, vasta-ainesieppaus-(ABC) ja neutralointimäärityksellä (CTLL-2-määritys) sen 25 määrittämiseksi, mikä eläin sopisi parhaiten fuusioon. 3 viikkoa myöhemmin hiirille annettiin laskimonsisäisesti o tehosteena 3 μg ihmis-IL-15:tä suspendoituna steriiliin T“ £3 PBSrään. 3 päivän kuluttua tästä hiiret uhrattiin ja per- ^ nasolut fuusioitiin Ag8.653-myeloomasoluihin (ATCC) nou- i ^ 30 dattaen vakiintuneita protokollia. Lyhyesti, Ag8.653-solut x pestiin moneen kertaan seerumivapaassa kasvualustassa ja cc fuusioitiin hiiren pernasoluihin suhteessa 3 pernasolua/l

§ myeloomasolu. Fuusiointiaineena oli 50 % PEG:10 % DMSO

o § (Sigma). Fuusiotuote maljattiin 20:lie 96-kuoppaiselle o o 35 tasapohjaiselle levylle (Corning), joilla kuopat sisälsi- 31 vät HAT:llä täydennettyä DMEM-kasvualustaa, ja annettiin kasvaa 8 päivän ajan. Supernatantit saaduista hybridoomis-ta kerättiin talteen ja lisättiin 60 minuutiksi 96-kuop-paiselle levylle, joka oli ensin päällystetty vuohen anti-5 hiiri-Ig:llä. Pesujen jälkeen kuhunkin kuoppaan lisättiin I-IL-15:ta, mkuboitiin 60 minuuttia huoneenlämpötilassa ja pestiin 4 kertaan. Positiiviset kuopat todettiin sitten autoradiografisesti -70 °C:ssa käyttäen Kodak X-Omat S -filmiä. Positiivisia klooneja kasvatettiin eräviljelmänä, 10 ja saatuja supernatantteja puhdistettiin sitten proteiini A -kolonnissa (Pharmacia). M110:ksi, Milliksi ja M112iksi nimetyt kloonit isotyypitettiin sitten kukin monoklonaali-seksi IgGl-vasta-aineeksi. Monoklonaalisia vasta-aineita MHO, Mill ja M112 tuottavat hybridoomat on talletettu 15 talletuslaitokseen American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA (ATCC) 13. maaliskuuta 1996, ja niille on annettu siellä hakunumerot HB-12061, BH-12062 ja vastaavasti HB-12063. Kaikki tallenteet on tehty Budapestin sopimuksen ehtojen mukaisesti.

20 Muodostettujen monoklonaalisten vasta-aineiden IL- 15-antagonistiaktiivisuus voidaan määrittää käyttäen CTLL-2-määritystä oleellisesti kuten kuvaavat Gillis et. ai.. supra.

Esimerkki 3 25 Modifioituja IL-15-molekyylejä Tässä esimerkissä kuvataan menetelmää sellaisten o modifioitujen IL-15-molekyylien saamiseksi, jotka toimivat o cm IL-15-antagonisteina.

^ PEG-yloitu IL-15 30 Kaikissa konjugointireaktloissa käytettiin PEG itä, x jonka molekyylipaino oli 5 000 ja joka saatiin sukkinimi- dyylisukkinaatti-PEGinä (SS-PEG) , sukkinimidyylikarbo- § naatti-PEGinä (SC-PEG), VS-PEG:nä ja Mal-PEGinä yrityk- § seltä Shearwater Polymers, Inc. (Huntsville, AL). Sekä SS- o ^ 35 PEG että SC-PEG reagoivat lysiinin ε-aminoryhmän kanssa, 32 jolloin SS-PEG:n kohdalla muodostuu hydrolyyttisesti epästabiili esterisidos ja SC-PEG:n kohdalla hydrolyyttisesti stabiili uretaanisidos. PEG-ylointi suoritettiin 50 nM NaH2P04-liuoksessa pH:ssa 9,0 SS-PEG:n ja SC-PEG:n kohdal-5 la; ja pH:ssa 7,0 reaktioille, jotka sisälsivät VS-PEG.tä ja Mal-PEG.tä. Reaktiot suoritettiin 0,5 ml:n tilavuuksissa pitoisuuden ollessa 100 μg/ml. Kussakin reaktiossa PEG:tä lisättiin reaktioseoksiin PEG/lysiini-moolisuhteis-sa 1:1, 3:1, 10:1 ja 100:1 (kussakin apina-IL-15-molekyy-10 Iissä on 9 lysiinitähdettä). Reaktiot etenivät yön yli 4 °C:ssa.

PEG-ylointu apina-IL-15 karakterisoitiin SDS-PAGE:lla 4 - 20 %:n gradientin polyakryyliamidigeeleissä (Novex, San Diego, Kalifornia). Ei-modifoiduille IL-pro-15 telineille, joita panostettiin noin 0,5 /zg/vyöhyke, käytettiin tavanomaisia hopeavärjäystekniikoita. Runsaasti PEG-yloidut apina-IL-15-proteiinit vaativat suurempien määrien proteiinia panostamista geeliin visualisoinnin saamiseksi. Runsaasti PEG-yloidun IL-15:n karakterisoima-20 seksi käytettiin myös Western blot -määrityksiä. Näissä kokeissa PEG-yloitu apina-IL-15 erotettiin SDS-PAGE:11a, siirrettiin nitroselluloosamembraanille, inkuboitiin mo-noklonaalisella vasta-aineella Mill, minkä jälkeen inkuboitiin vuohen anti-hiiri-HRP:llä ja visualisoitiin lo-25 puksi käyttäen 4 CN Membrane Peroxidase Substrate System -järjestelmää (Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaith-o ersburg, MD). PEG-yloitua apina-IL-15:tä karakterisoitiin w myös kokoekskluusiokromatografia- (SEC) HPLC:llä käyttäen i

Biosil SEC-250 -kokoekskluusiokolonnia (Biorad, Richmond, i 30 CA) tavanomaisten tekniikoiden mukaan.

x Testattiin SC-PEG-yloidun FLAG-apina-IL-15:n kykyä °· sitoutua transfektoituihin COS-soluihin, jotka ilmensivät o g IL-15:n a-, β- ja γ-reseptorialayksiköitä solumembraanin § pinnalla. PEG-yloitu IL-15 inhiboi radioleimatun IL-15:n

O

° 35 sitoutumisen IL-15R-a-alayksikön ilmentäviin COS-soluihin, 33 mikä osoitti PEG-yloidun IL-15:n kilpailevan IL-15Ra-ala-yksikkösitoutumisesta. Edelleen PEG-yloitu IL-15 ei inhiboinut radioleimatun IL-15:n sitoutumista β- ja γ-resepto-rialayksiköitä ilmentäviin COS-soluihin, mikä osoitti, 5 ettei PEG-yloitu IL-15 sitoudu IL-15-reseptorikompleksin S- ja/tai γ-reseptorialayksiköihin. Täten PEG-yloitu IL-15 estää endogeenisen IL-15:n suorittamasta signaalin siirtoa IL-15-reseptorikompleksin S- ja γ-reseptorialayksiköiden kautta.

10 Esimerkki 4 IL-15-aktiivisuuden inhibitio CTLL-2-määrityksessä Tässä esimerkissä havainnollistetaan edelleen menetelmää, jolla määritetään IL-15:n signaalin siirron estyminen IL-15-reseptorikompleksin β- ja γ-reseptorialayk-15 siköiden kautta keksinnön mukaisilla antagonisteilla.

Monoklonaalisten vasta-aineiden, PEG-yloidun IL-15: n ja IL-15-muteiinien antagonistiaktiivisuus voidaan määrittää käyttäen modifioitua CTLL-2-solu-3H-tymidiini-inkorporaatiomääritystä (Gillis et ai. , supra) . Antago-20 nistin sarjalaimennoksia voidaan tehdä 96-kuoppaisille tasapohjaisille kudosviljelylevyille (Costar, Cambridge, MA) DMEM-kasvualustaan (jossa on täydennyksenä 5 % FCS, NEAA, Na-pyruvaatti, HEPES pH 7,4, 2-me, PSG) 50 /xl: n lopputilavuuteen. Sitten kaikkiin määrityskuoppiin lisä-25 tään optimaalisen alittava eli suboptimaalinen määrä IL-15 :tä (loppupitoisuus 20 - 40 pg/ml; 5 /xl/kuoppa) näyt-o teiden sarjalaimentarnisen jälkeen ja ennen solujen lisää- cm mistä. Pestyjä CTLL-2-soluja lisätään (noin 2 000/kuoppa 50 μΐ-.ssa) ja levyjä inkuboidaan 24 tunnin ajan 37 °C:ssa i 30 kostutetussa ilmakehässä, jossa on 10 % C02:ta ilmassa.

x Tätä seurasi 5 tunnin inkubointi määrällä 0,5 /zCi 3H-ty- midiiniä (25 Ci/mmol, Amersham, Arlington Heights, IL) . o g Sitten viljelmät kerätään lasikuitusuodattimille ja las- § ketään avalanche-kaasuionisaatiolla joko suoralla monide- o ^ 35 tektori-fi-laskijalla (Matrix 96, Packard Instrument Comp- 34 any, Meridien, CT) tai β-tuikelaskijalla. Määrityksellä saadut tuikkeita minuutissa -arvot (CPM) muutetaan prosentuaaliseksi inhibitioksi, ja kunkin titratun antagonist inäytteen prosentuaalisen inhibition arvoja käyttäen 5 lasketaan antagonistiaktiivisuus yksiköinä/ml.

Seuraavassa taulukossa I esitetään tulostiedot, joista ilmenee pitoisuus, joka tarvitaan neutraloimaan 40 pg/ml IL-15:tä CTLL-inhibitiomäärityksessä. Seuraavassa taulukossa II esitetään IL-15:n (agonistin) ja IL-15-an-10 tagonistien aktiivisuus CTLL- ja CTLL-inhibitiomäärityk- sissä.

o δ c\j

Ovi

X

cc

CL

o 00

O

O

CD

O

O

<N

35

Taulukko X

IL~15-antagonistien spesifinen aktiivisuus

Antagonistipitoisuus, joka tarvitaan neutraloimaan 40 pg/ml IL-15:tä CTL1,-inhibitiomSärityksessä

Antagonisti Pitoisuus ProteiinimääritysmenetelmS

5 huIL-15-niuteiinit 848-2560 pg/ml ELISA/arvioitu AAA:sta

Ml 10, Ml 11 5 ng/ml od PEGhuIL-15 D56C 7,7 ng/ml arvioitu AAA:sta

Ml 12 40 ng/ml od 10 PEGf-s-IL15 3 40-196 ng/ml OD = optinen tiheys absorbanssi 280 nm:ssä; ekstinktiokerroin 1,35 AAA = aminohappoanalyysi PEGf-s-ILl5 = PEG-yLoitu FLAG-apina-IL-15

Taulukko II

IL-15:n ja IL-15-antagonistien aktiivisuus CTLL- ja CTLL-inhibitiomäärityksissä CTLL-määritys CTLL-inhibitiomääritys yksikköä/ml yksikköä/ml (Agonisti- (antagonistlaktiivi- Näyte aktiivisuus) suus) __ 7,09 X 105 279 IL-15-Q156C - 3 X K)6 EL-15-Q156S - 1,5 X106 IL-15-D56C -· 2X106 IL-15-D56C-Q15 6C - 2X105 BL-15-D56C-Q156S - 7X105 IL-15-D56S - 2,2X105 2S IL-15-D56S-Q156S - 7,2X105 vektorikontrolli - 1141

IL-15 3,7 X ΙΟ» NA

o PEG-IL-15 - 2,3 Xl O6 o PEG-IL-15-D56C - 7,96 X 106 ^ IL-15-D56C - 5 X 106

4- 30 IL-15 5,6X10» NA

^ PEG-IL-15 NA 1,7 X 105 * Q156C = Gln156 substituoitu Cys o Q156S = Gln,56 substituoitu Ser o D56C = Asp56 substituoitu Cys § D56S = Asp56 substituoitu Ser § 35 NA’ ei määritetty

CM

Claims (12)

42

1. Sekvenssin nro 1 tai sekvenssin nro 2 mukaista IL-15:ta vastaan muodostettu monoklonaalinen vasta-aine, 5 joka spesifisesti estää IL-15:ää siirtämästä signaalia IL-15-reseptorikompleksin β- tai γ-alayksikön kautta.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen monoklonaalinen vasta-aine, tunnettu siitä, että vasta-aine on humanisoitu .

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen monoklonaalinen vasta-aine, tunnettu siitä, että vasta-aine on trans-geeninen.

4. Farmaseuttinen koostumus, joka käsittää minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-3 mukaista monoklonaalista 15 vasta-ainetta sekä farmaseuttisesti hyväksyttävää kantajaa tai laimenninta.

5. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-3 mukainen monoklonaalinen vasta-aine käytettäväksi elinsiirrehyljin-nän, käänteishyljintäsairauden, autoimmuunisairauden, ni- 20 velreuman, tulehduksellisen suolisairauden, lymfooman, syövän, leukemian, poikkijuovaislihassarkooman, dermatologisen häiriön, mahasuolikanavan häiriön, insuliiniriippuvaisen sokeritaudin, silmän häiriöiden, idiopaattisen nefroottisen oireyhtymän/idiopaattisen membraninoosin munuaiskerästuleh- 25 duksen ja HTLV-l-indusoidun täysikasvuisen T-solu-leukemia-lymfooman hoidossa.

° 6. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-3 mukainen O ^ monoklonaalinen vasta-aine käytettäväksi nivelreuman hoi- <- dossa. i

7. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-3 mukainen monoklonaalinen vasta-aine käytettäväksi dermatologisen CL häiriön hoidossa, o

§ 8. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-3 mukaisen o g monoklonaalisen vasta-aineen käyttö lääkkeen valmistamisek- w 35 si elinsiirrehyljinnän, käänteishyljintäsairauden, autoimmuunisairauden, nivelreuman, tulehduksellisen suolisairau- 43 den, lymfooman, syövän, leukemian, poikkijuovaislihassar-kooman, dermatologisen häiriön, mahasuolikanavan häiriön, insuliiniriippuvaisen sokeritaudin, silmän häiriöiden, idio-paattisen nefroottisen oireyhtymän/idiopaattisen membrani-5 noosin munuaiskerästulehduksen ja HTLV-l-indusoidun täysi kasvuisen T-solu-leukemia-lymfooman hoitamiseksi.

9. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-3 mukaisen monoklonaalisen vasta-aineen käyttö lääkkeen valmistamiseksi nivelreuman hoitamiseksi.

10. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-3 mukai sen monoklonaalisen vasta-aineen käyttö lääkkeen valmistamiseksi dermatologisen häiriön hoitamiseksi.

11. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-3 mukaisen monoklonaalisen vasta-aineen käyttö lääkkeen valmista- 15 miseksi käänteishyljintäsairauden hoitamiseksi.

12. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-3 mukaisen monoklonaalisen vasta-aineen käyttö lääkkeen valmistamiseksi toisesta saman lajin yksilöstä saadun siirteen elinajan pidentämiseksi potilaassa. o δ (M sj- (M X CC CL O 00 o o CD O o (M 44