KR19980702238A - 인터루킨-15의 길항제 - Google Patents

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케네쓰 에이치 그랩스타인
딘 케이 피티트
레이몬드 제이 팍스톤
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크리스토퍼 엘. 와이트
임뮤넥스 코포레이션
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Abstract

포유동물 인터루킨-15 (IL-15)의 길항제가 개시되어 있으며, 이 길항제에는 각각 IL-15Rα-서브유닛에 결합할 수 있고 IL-15 수용체 복합체의 β- 또는 γ-서브유닛 중 어느 하나를 통한 시그날 형질도입은 할 수 없는 IL-15의 뮤테인 및 변형된 IL-15 분자가 포함된다. 또한, IL-15 수용체 복합체의 β- 또는 γ-서브유닛 중 어느 하나를 통한 IL-15의 시그날 형질도입을 방지하는 IL-15에 대한 모노클로날 항체가 포함된다. 또한, 이인자형이식편 거부 반응 및 이식편 대 숙주 질병의 치료를 포함한 각종 질병 상태의 치료 방법이 개시되어 있다.

Description

인터루킨-15의 길항제
인터루킨-15는 IL-2-의존성 세포주, CTLL-2의 증식을 지지할 수 있는 공지된 T-세포 성장 인자이다. IL-15는 그랩스타인 등의 문헌[Grabstein 등, in Science, 264:965 (1994)]에 114-아미노산의 성숙형 단백질로 되는 48-아미노산 리더 서열을 함유하는 162-아미노산 전구체 폴리펩티드로 이루어진 분비된 사이토킨으로서 처음 보고되었다. 그랩스타인 등은 또한 316 bp 5' 비코딩 영역 및 486 bp 오픈 리딩 프레임(또는 정지 코돈을 위한 3 bp를 포함할 때 489 bp 오픈 리딩 프레임) 및 400 bp 3' 비코딩 영역을 함유하는, 162-아미노산 전구체를 코딩하는 완전 길이 인간 cDNA의 클로닝에 관해 기재하고 있다.
IL-15는 IL-2와 많은 특성을 공유하고 있다. 이 특성에는 인간 및 마우스 T-세포의 증식 및 활성화, 림포카인 활성화된 킬러 세포(LAK) 활성, 천연 킬러 세포(NK) 활성, 및 세포독성 T 림프구(CTL) 활성의 유도, 및 B 세포 증식 및 분화의 동시 자극이 포함된다.
추가로, IL-15 및 IL-2는 T 세포 막 표면 상의 3가지 이상의 다른 수용체 서브유닛에 결합할 수 있는 구조적으로 상동성인 분자이다. IL-2 수용체는 3가지 이상의 서브유닛, α, β 및 γ를 함유한다[Toshikazu 등, Science, 257: 379 (1992) 참조]. IL-15 및 IL-2는 둘다 공통의 β-γ-서브유닛 복합체에 대한 결합을 공유하는 반면, IL-15 및 IL-2는 각각 특이적 α-수용체 서브유닛(각각, IL-15Rα 및 IL-2Rα)에 결합한다. 최근에, IL-15Rα가 발견되었으며, 그것은 동시 계류중인 미국 특허 출원 제08/300,903호의 주제이다. IL-2 수용체의 α-연쇄에 대한 항체(항-IL-2Rα)는 IL-15 결합에 대해 효과가 없다(Grabstein 등, Id.). 그러나, IL-2 수용체의 β-서브유닛에 대한 항체, 즉 TU27, TU11, 또는 Mikβ1은 IL-15의 활성을 차단할 수 있으며, 이것은 IL-15가 시그날링을 위해 β-서브유닛을 사용한다는 것을 암시한다. 마찬가지로, IL-2 수용체의 γ-연쇄는 시그날 형질도입에 필요하다[Giri 등, EMBO J., 13, 2822 (1994) 참조]. IL-15 수용체 복합체의 β 및 γ-서브유닛은 단독적으로서가 아니라 공동으로 형질이입된 COS 세포 상의 IL-15에 결합하였다.
임의의 질병 상태 및 생리학적 조건은 T 세포에 의해 매개된다. 그러한 질병으로는 기관 이식 거부, 이식편 대 숙주 질병, 자기면역 질병, 류머티스성 관절염, 장 염증, 피부 질환, 인슐린 의존성 당뇨병, 안구 질환 및 특발성 신장증 증후군/특발성 막 신증이 있다. 사실상, 이인자형이식편 거부 반응 및 이식편 대 숙주 질환(GVHD)는 증가된 IL-2 수용체 발현과 관련이 있다. 외부 조직 적합 항원과의 반응에서 활성화된 T 세포는 IL-2 수용체 복합체를 발현하는 것으로 나타났다. 이에 대한 각종 요법이 제안되고 연구되어 왔다. 예를 들면, 티누부(Tinubu) 등은 항-IL-2Rβ 모노클로날 항체, Mikβ1이 영장류의 심장 이인자형이식편 생존을 연장시키는 것으로 보고하였다[J. Immunol., 153: 4330 (1994) 참조]. 급성 이인자형이식편 거부 반응과 관련있는 CD-4 및 CD-8 발현 세포에 대한 IL-2Rβ-서브유닛 발현이 증가되며, 이것은 IL-2Rβ-서브유닛 발현이 이인자형반응성 T 세포 상에서 증가되는 것으로 보이는 것을 나타낸다[예를 들면, Niguma 등, Transplantation, 52:296 (1991) 참조].
그러나, 본 발명 이전에 GVHD를 치료하거나 또는 이인자형이식편 생존을 촉진시키는 수단으로서 IL-15 리간드-수용체 상호작용에 초점을 둔 치료법은 발표된 바 없었다.
발명의 요약
본 발명은 IL-15 길항제 및 이 길항제를 사용한 인간 질병의 치료 방법에 관한 것이다. 특히, 그러한 치료는 포유 동물에서의 이인자형이식편 생존을 촉진시키고 GVHD를 치료하는 것을 포함한다. IL-15 길항제는 IL-15가 IL-15 수용체 복합체의 β- 또는 γ-서브유닛 중 어느 하나를 통해 세포로 시그날을 형질도입하는 것을 방지함으로써 효과를 발휘하게 되고, 따라서 IL-15의 생물학적 활성을 길항한다. 본 발명에 따른 임의의 길항제는 IL-15Rα에 대한 IL-15의 결합을 실질적으로 간섭하지는 않으면서 IL-15 수용체 복합체의 β- 또는 γ-서브유닛에 대한 IL-15의 결합을 간섭할 수 있다.
본 발명에 따른 길항제에는 IL-15가 IL-15 수용체 복합체의 β- 또는 γ-서브유닛에 대한 결합에 역할을 하는 1가지 이상의 아미노산 잔기 또는 영역에서 돌연변이된, 성숙형 또는 천연 IL-15의 뮤테인이 포함된다. 그러한 뮤테인은 IL-15Rα에 대한 IL-15의 고친화력을 유지하면서, IL-15가 IL-15 수용체 복합체의 β- 또는 γ-서브유닛을 통해 세포로 시그날을 형질도입하는 것을 방지한다. 전형적으로, 그러한 뮤테인은 각각 서열 1 및 2에 나타낸 바와 같은 원숭이류 및 인간 IL-15의 주요 위치, 예를 들면 Asp56또는 Gln156에서의 삽입, 삭제 또는 치환에 의해 형성된다. Asp56은 각각 IL-15 수용체 복합체의 β-서브유닛과의 결합에 영향을 미치고, Gln156은 γ-서브유닛과의 결합에 영향을 미치는 것으로 생각된다.
또한, 본 발명은 성숙형 IL-15와 면역반응하며 IL-15 수용체 복합체로의 시그날 형질도입을 방지하는 모노클로날 항체를 포함한다.
또한, 본 발명의 영역에는 IL-15Rα에 결합하는 능력은 유지하지만, IL-15 수용체 복합체의 β- 및(또는) γ-서브유닛에 대한 친화력이 실질적으로 감소되거나 또는 친화력이 없는 변형된 IL-15 분자가 포함된다. 변형된 IL-15 분자는 일반적으로 표적 결합 부위 또는 그 부근에서의 변형에 의해 결합을 간섭하거나 또는 방지하기 위한 방법으로 변형이 일어나는 한 어느 형태든 취할 수가 있다. 그러한 변형된 IL-15 분자의 예는 IL-15/IL-15 수용체 결합을 입체적으로 간섭하는 1개 이상의 화학기에 공유 콘쥬게이션된 성숙형 IL-15 또는 IL-15의 뮤테인을 포함한다. 예를 들면, 성숙형 IL-15는 부위 특이적 글리코실화를 함유하거나 또는 IL-15Rα에 대한 IL-15의 고친화력을 유지하면서 IL-15 수용체 복합체의 β- 또는 γ-연쇄에 대한 IL-15의 결합을 간섭할 수 있는 IL-15 분자 상의 특정 부위에서 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 모노메톡시 PEG(mPEG), 덱스트란, 폴리비닐피롤리돈(PVP), 폴리비닐 알코올(PVA), 폴리 아미노산, 예를 들면 폴리-L-리신 또는 폴리히스티딘, 알부민, 젤라틴과 같은 기에 공유 결합될 수 있다. IL-2, GM-CSF, 아스파라기나제, 이뮤노글로불린, 헤모글로빈 등과 같은 단백질에 PEG 연쇄를 콘쥬게이션시키는 다른 잇점은 당업계에 알려져 있다. 예를 들면, PEG는 생체내의 순환 반감기를 연장시키며(Delgado 등, Crit. Rev. Ther. Drug Carr. Syst., 9: 249 (1992) 참조), 용해도를 증가시키고(Katre, 등, Proc. Natl. Acad. Sci., 84: 1487 (1987) 참조), 면역원성을 감소시키는 것으로 알려져 있다(Katre, N.V., Immunol. 144: 209 (1990) 참조).
본 발명은 또한 T 세포에 대한 IL-15 활성의 감소가 필요한 질병 또는 상태를 치료하는 방법에서의 상기 길항제의 용도에 관한 것이다. 그러한 질병으로는, 기관 이식 거부, 이식편 대 숙주 질병, 자기면역 질병, 류머티스성 관절염, 장 염증, 피부 질환, 인슐린 의존성 당뇨병, 안구 질환 및 특발성 신장증 증후군/특발성 막 신증이 있다. 특히, 이인자형이식편 거부 반응에서, IL-15 활성은 이식편에 대항하는 숙주 면역 반응을 유발할 수 있고, 결국에는 거부 반응이 일어난다. 마찬가지로, GVHD에서 이식편, 전형적으로는 골수 이식 조직은 숙주에 대항하는 면역 반응을 부여한다. 본 발명에 따른 IL-15 길항제에 의한 그러한 활성의 억제는 이식편 생존을 촉진시키고 연장시키는데에 또한 GVHD를 치료하는데 유리하다.
많은 연구가들이 항-TAC, 항-인간 IL-2α-수용체 모노클로날 항체와 같은 항체를 이용하여 이식편 생존의 연장을 보고한 바 있다. 예를 들면, 리드 등은 항-TAC가 영장류의 신장 이인자형이식편 이식술을 개선시킨다고 보고하였다[Reed 등, Transplantation, 47: 55-59 (1989) 참조]. 또한, 브라운 등은 영장류 심장 이인자형이식편 생존을 연장시키는데 있어서의 인간화된 항-TAC의 사용을 개시하고 있다[Brown 등, Proc. Natl. Acad. Sci., 88: 2663 (1991) 참조]. 커크만 등은 초기의 이인자형이식편 거부 반응을 방지하기 위한 항-TAC를 포함한 임상학적 시도를 개시하고 있다[Kirkman 등, Transplantation, 51: 107 (1991) 참조]. IL-15는 IL-2와 유사한 많은 생물학적 활성을 가지며, 실제로 IL-2와 임의의 수용체 서브유닛을 공유하기 때문에, 질병 상태에서의 IL-15의 유해한 활성의 간섭은 분명한 치료학적 가능성을 갖는다.
본 발명은 일반적으로 본 명세서에 인터루킨-15(IL-15)로 언급되는 포유 동물 상피세포로부터 유도된 T-세포 인자 폴리펩티드의 길항제에 관한 것이다. 본 발명은 특히 시험관내 CTLL 분석에서 T-림프구의 증식을 자극하는 IL-15의 능력을 상당히 감소시키는 IL-15의 뮤테인, IL-15에 대한 모노클로날 항체 및 IL-15 콘쥬게이트에 관한 것이다. 또한, 본 발명에는 IL-15 활성 감소가 필요한 포유 동물의 각종 질병 상태의 치료 방법이 포함된다.
본 발명은 IL-15의 수용체 복합체를 통한 IL-15의 시그날 형질도입을 간섭하는 IL-15 활성의 길항제에 관한 것이다. 특히, 본 발명의 IL-15 길항제는 (a) IL-15 수용체의 α-서브유닛에 결합할 수 있고 IL-15 수용체 복합체의 β- 및(또는) γ-서브유닛을 통한 시그날 형질도입은 할 수 없는 성숙형 또는 천연 IL-15의 뮤테인; (b) IL-15가 IL-15 수용체 복합체의 β- 및(또는) γ-서브유닛을 통한 시그날 형질도입을 실시하는 것을 방지하는 IL-15에 대한 모노클로날 항체; 및 (c) IL-15 수용체 복합체의 β- 또는 γ-서브유닛 중 어느 하나를 통한 시그날 형질도입을 실시하는 IL-15의 능력을 간섭하지만, IL-15Rα에 대한 IL-15 결합은 간섭하지 않는 화학기와 공유 결합된 IL-15 분자로 이루어진 군에서 선택된다. 또한, 본 발명의 영역에는 상기 뮤테인을 코딩하는 DNA가 포함된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 재조합 DNA 기술 또는 재조합이란 이종 펩티드를 생합성하도록 클로닝 또는 합성된 DNA 서열로 형질전환 또는 형질이입된 미생물(예를 들어, 세균, 곤충 또는 효모) 또는 포유 동물 세포 또는 생물체(예, 유전자 전환체)로부터 특정 폴리펩티드를 생산하는 기술 및 과정을 이른다. 원래의 글리코실화 패턴은 포유 동물 세포 발현계에서만 얻어질 것이다. 효모는 특유의 글리코실화 패턴을 제공한다. 원핵 세포 발현(예, 이. 콜리)에서는 일반적으로 글리코실화되지 않은 폴리펩티드가 얻어진다.
뉴클레오티드 서열이란 분리된 단편 형태 또는 보다 큰 DNA 구조물의 성분으로서의 폴리뉴클레오티드를 말하며, 이는 적어도 1회는 실질적으로 순수한 형태 (오염하는 내생 물질이 없음)로, 또한 표준 생화학적 방법[예를 들어, Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)]에 의해 그의 성분 뉴클레오티드 서열의 확인, 조작 및 회수를 가능하게 하는 양 또는 농도로 단리된 DNA 또는 RNA로부터 유도된 것이다. 그러한 서열은 내부 비번역 서열 또는 진핵 유전자에 전형적으로 존재하는 인트론에 의해 차단되지 않은 오픈 리딩 프레임의 형태로 제공되는 것이 바람직하다. 비번역 DNA 서열은 오픈 리딩 프레임의 5' 또는 3'에 존재할 수 있으며, 이 경우에는 코딩 서열의 조작 또는 발현에 간섭하지 않는다.
재조합 발현 벡터는 (1) 예를 들면, 프로모터 또는 인핸서와 같은 유전자 발현에서 조절 기능을 갖는 유전 요소(들), (2) IL-15 또는 IL-15 뮤테인을 코딩하는 구조 또는 코딩 서열 및 (3) 적절한 전사 및 번역 개시 서열, 및 필요시에 종결 서열의 조립체로 이루어진 전사 단위를 포함하는 플라스미드를 의미한다. 사용할 수 있는 다양한 조절 요소의 대표적 예를 하기에 논의한다(재조합 DNA 기술 참조). 효모 발현계에서 사용하기 위한 구조적 요소는 바람직하게는 효모 숙주 세포가 번역된 폴리펩티드를 세포외 분비할 수 있도록 하는 유도 서열을 포함한다. 이와 달리 세균 발현계에서는, 재조합 폴리펩티드에 N-말단 메티오닌 잔기를 포함시킬 수 있다. N-말단 메티오닌 잔기가 나중에 발현된 재조합 폴리펩티드로부터 절단되어 추가 정제에 적합한 생성물을 얻을 수 있다.
재조합 미생물 발현계는 재조합 전사 단위를 염색체 DNA 내로 안정적으로 통합시켰거나 또는 내재하는 플라스미드의 성분으로서 재조합 전사 단위를 함유하는, 예를 들면, 이. 콜리 등의 세균, 또는 에스. 세레비시애 (S. cerevisiae) 등의 효모와 같은 적당한 숙주 미생물의 실질적으로 균질한 단일 배양을 의미한다. 일반적으로 재조합 미생물 발현계를 이루는 숙주 세포는 한 개의 선대 형질전환 세포의 후대이다. 재조합 미생물 발현계는 발현될 구조 뉴클레오티드 서열에 연결된 조절 요소의 유도시에 이종 폴리펩티드를 발현할 것이다.
IL-15 뮤테인 또는 IL-15의 뮤테인이란 IL-15의 길항제를 생산하기 위해 본 발명에 따라 돌연변이된, 서열 1의 아미노산 49-162의 서열을 갖는 성숙형 또는 천연의 원숭이 IL-15 분자 또는 서열 2의 아미노산 49-162의 서열을 갖는 성숙형 또는 천연의 인간 IL-15 분자를 의미한다. 그러한 IL-15 뮤테인은 IL-15Rα 서브유닛에는 결합할 수 있지만, IL-15 수용체 복합체의 β- 또는 γ-서브유닛을 통한 시그날 형질도입은 할 수가 없다.
IL-15의 제조
인간 또는 원숭이 IL-15는 본 명세서에 참고로 인용한 문헌[Grabstein 등, Science, 264: 965 (1994)]에 기재된 방법에 따라 또는 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)과 같은 통상의 방법에 의해 얻을 수 있다. 인간 IL-15 cDNA는 부다페스트 조약에 따라 미국 메릴랜드주 록크빌의 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection)에 1993년 2월 19일, 수탁 번호 ATCC 69245로 기탁하였다. 기탁 명칭은 I41-hETF였다.
IL-15 뮤테인
길항제를 생산할 수 있는 IL-15의 많은 가능한 변종이 있다. 그러한 변종은 β- 또는 γ-서브유닛의 시그날링의 원인이 되는 것으로 생각되는 특정 아미노산 부위에서 이루어질 수 있거나, 또는 변종은 β- 또는 γ-서브유닛의 시그날링에 필요한 것으로 생각되는 IL-15의 전체 영역에 대해 이루어질 수 있다. 전형적으로, 변종은 아미노산 잔기의 삽입, 치환 또는 삭제에 의해 형성될 수 있다. 치환 및 삭제 뮤테인이 바람직하며, 치환 뮤테인이 가장 바람직하다.
Asp56은 IL-15 수용체 복합체의 β-서브유닛과의 결합에 영향을 미치고, Gln156은 γ-서브유닛과의 결합에 영향을 미치는 것으로 생각된다. Asp56및 Gln156부위를 또는 그 부근을 다른 천연 아미노산 잔기로 치환하거나 또는 삽입함으로써 IL-15 수용체 복합체의 β- 또는 γ-서브유닛 중의 어느 하나 또는 둘다에 대한 IL-15의 결합에 영향을 미칠 수 있다. 사실상, 음하전된 아스파르트산 잔기를 제거하고 그것을 다른 음하전된 잔기로 대체하면, 아스파르트산을 아르기닌과 같은 양하전된 아미노산 또는 세린 또는 시스테인과 같은 비하전된 잔기로 대체한 것 처럼 효과적으로 수용체 결합을 차단할 수는 없다.
IL-15 뮤테인의 재조합 생산은, 우선 IL-15 뮤테인을 코딩하는 DNA 클론 (즉, cDNA)의 단리를 요구한다. cDNA 클론은 포유 동물 IL-15 폴리펩티드를 발현하는 일차 세포 또는 세포주로부터 유래된다. 먼저, 전체 세포 mRNA를 단리하고, 이어서 cDNA 라이브러리를 역전사에 의해 mRNA로부터 작제한다. cDNA 클론은 본 명세서에서 상기 교차종 혼성화 프로브 또는 PCR 프라이머를 고안하기 위해 제공된 DNA 서열 정보를 이용하여 단리해서 확인할 수 있다. 그러한 cDNA 클론은 서열 1 및 서열 2의 핵산 1-486의 서열을 갖는다.
단리된 cDNA는 내부 비번역 서열 또는 인트론에 의해 단속되지 않는 오픈 리딩 프레임 형태인 것이 바람직하다. 포유 동물 IL-15 폴리펩티드를 코딩하는 관련 뉴클레오티드 서열을 포함하는 게놈 DNA는 또한 코딩 서열을 작제하는데 유용한 게놈 정보의 공급원으로서 사용될 수도 있다. 단리된 cDNA는 IL-15 길항제 활성을 나타내는 당업계 공지 기술에 의해 돌연변이시킬 수 있다. 이하에, 실시예 1은 IL-15 뮤테인을 제조하는데 사용될 수 있는 특정 방법을 기재하고 있다.
아미노산 잔기 또는 서열의 각종 삽입 또는 치환, 또는 활성에 필요하지 않은 말단 또는 내부 잔기 또는 서열의 삭제를 코딩하는 동등한 DNA 구조물이 본 발명에 포함된다. 예를 들면, IL-15 내의 N-글리코실화 부위는 포유 동물 및 효모 발현계에서의 환원된 탄수화물 유사체의 발현은 가능하게 하면서 글리코실화되지 않도록 변형될 수 있다. 진핵 세포 폴리펩티드내의 N-글리코실화 부위는 아미노산 삼중체 Asn-X-Y(여기서, X는 Pro을 제외한 아미노산이고, Y는 Ser 또는 Thr임)에 의해 특징화된다. 원숭이 IL-15 단백질은 서열 1의 아미노산 127-129 및 160-162에서 그러한 삼중체 2개를 포함한다. 인간 IL-15 단백질은 서열 2의 아미노산 119-121, 127-129 및 160-162에서 그러한 삼중체 3개를 포함한다. 그러한 삼중체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 대해 적절한 치환, 삽입 또는 삭제를 행한다면 Asn 측쇄에서 탄수화물 잔기의 부착을 방지하게 될 것이다. Asn이 다른 아미노산으로 대체되도록 선택된 단일 뉴클레오티드의 변화는 예를 들면 N-글리코실화 부위를 불활성화시키는데 충분하다. 단백질내의 N-글리코실화 부위를 불활성화시키는 공지된 방법은 본 명세서에 참고로 인용한 미국 특허 제5,071,972호 및 유럽 특허 제276,846호에 기재되어 있다.
재조합 발현 벡터는 IL-15 뮤테인을 코딩하는 합성 또는 cDNA 유래 DNA 단편을 포함한다. IL-15 뮤테인을 코딩하는 DNA는 포유 동물, 미생물, 바이러스 또는 곤충 유전자로부터 유래된 것과 같은 적당한 전사 또는 번역 조절 또는 구조 뉴클레오티드 서열에 조작가능하게 연결된다. 조절 서열의 예로는 유전자 발현시 조절 역할을 갖는 유전자 서열 (예: 전사 프로모터 또는 인핸서), 전사를 조절하는 임의적인 오퍼레이터 서열, 적당한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 번역 개시 및 종결을 조절하는 적당한 서열을 들 수 있다. 뉴클레오티드 서열은 조절 서열이 구조 유전자와 기능적으로 관련있는 경우 조작가능하게 연결된다. 예를 들면, 시그날 펩티드를 위한 DNA 서열 (분리 리더)은 이것이 전구 아미노산 서열의 일부로서 발현되고 IL-15 뮤테인의 분비에 참여하는 경우에 IL-15 뮤테인을 위한 구조 유전자 DNA 서열에 조작가능하게 연결될 수 있다. 또한, 프로모터 뉴클레오티드 서열은 이것이 구조 유전자 뉴클레오티드 서열의 전사를 조절하는 경우에 코딩 서열(예를 들면: 구조 유전자 DNA)에 조작가능하게 연결된다. 게다가, 리보좀 결합 부위는 이것이 벡터 내에서 번역을 촉진하도록 위치하는 경우에 구조 유전자 뉴클레오티드 코딩 서열(예를 들면: IL-15 뮤테인)에 조작가능하게 연결될 수 있다.
IL-15 뮤테인의 발현을 위한 적당한 숙주 세포는 적당한 프로모터 조절 하의 원핵 세포, 효모 또는 고등 진핵 세포를 포함한다. 원핵 세포는 그람 음성 또는 그람 양성 생물체, 예를 들면 이. 콜리 또는 바실러스를 포함한다. 형질전환을 위한 적당한 원핵 숙주 세포는 예를 들면 이. 콜리, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 살모넬라 팁히무리움(Salmonella typhimurium) 및 슈도모나스(Pseudomonas), 스트렙토마이세스(Streptomyces) 및 스타필로코쿠스(Staphylococcus) 종에 속하는 여러가지 다른 종을 들 수 있다. 하기하는 바와 같이, 적당한 숙주 세포의 예로는 에스. 세레비시애 (S. cerevisiae)와 같은 효모, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포와 같은 포유 동물 세포주, 또는 곤충 세포를 또한 들 수 있다. 본 명세서에 기재된 DNA 작제물로부터 유래된 RNA를 사용하여 IL-15 뮤테인을 생산하는데 무세포 번역 시스템을 이용할 수도 있다. 세균, 곤충, 효모, 및 포유 동물 세포 숙주와 함께 이용하기 위한 적당한 클로닝 및 발현 벡터는 예를 들면 문헌[Pouwels 등, Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York, 1985]에 기재되어 있다.
IL-15 뮤테인을 효모 숙주 세포 내에서 발현시키는 경우, IL-15 뮤테인을 코딩하는 뉴클레오티드 서열(예: 구조 유전자)는 리더 서열을 포함할 수 있다. 리더 서열은 효모 숙주 세포에 의한 번역된 폴리펩티드의 향상된 세포외 분비를 가능케한다.
IL-15 뮤테인은 효모 숙주 세포, 바람직하게는 사카로마이세스 (Saccharomyces) 종 (예: 에스. 세레비시애)으로부터 유래된 효모 숙주 세포에서 발현될 수 있다. 피치아(Pichia) 또는 클루이베로마이세스(Kluyveromyces)와 같은 다른 효모종도 사용될 수 있다. 효모 벡터는 종종 2 μ 효모 플라스미드로부터의 복제 서열원, 자기 복제 서열(ARS), 프로모터 영역, 폴리아데닐화를 위한 서열, 및 전사 종결을 위한 서열을 함유할 것이다. 바람직하게는, 효모 벡터는 복제 서열원 및 선택가능한 마커를 포함한다. 효모 벡터를 위한 적당한 프로모터 서열은 메탈로티오네인, 3-포스포글리세레이트 키나제 (Hitzeman 등, J. Biol. Chem. 255:2073, 1980) 또는 다른 글리콜 분해 효소 (Hess 등, J. Adv. Enzyme Reg. 7:149, 1968; 및 Holland 등, Biochem, 17:4900, 1978), 예를 들면 에놀라제, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제, 헥소키나제, 피루베이트 데카르복실라제, 포스포프럭토키나제, 글루코스-6-포스페이트 이소머라제, 3-포스포글리세레이트 뮤타제, 피루베이트 키나제, 트리오스포스페이트 이소머라제, 포스포글루코스 이소머라제 및 글루코키나제를 위한 프로모터를 포함한다. 효모 발현에 사용하기 위한 다른 적당한 벡터 및 프로모터에 대해서는 문헌 [Hitzeman, 유럽 특허 공개 제73,657호]에 상세히 기재되어 있다.
효모 벡터는 예를 들면 이. 콜리에서 선택 및 복제를 위한 pBR322로부터의 DNA 서열을 이용하여 어셈블리할 수 있다 (Ampr유전자 및 복제원). 효모 발현 작제물에 포함될 수 있는 다른 효모 DNA 서열은 글루코스 억제성 ADH2 프로모터 및 α-인자 분비 리더를 포함한다. ADH2 프로모터는 문헌 [Russell 등, J. Biol. Chem. 258:2674, 1982; 및 Beier 등, Nature 300:724, 1982]에 기재되어 있다. 효모 α-인자 리더 서열은 헤테로로거스 폴리펩티드의 분비를 지시한다. α-인자 리더 서열은 종종 프로모터 서열과 구조 유전자 서열 사이에 삽입된다(Kurjan 등, Cell 30:933, 1982; 및 Bitter 등, Proc. Natl. Acad. Sci, USA 81:5330, 1984 참조). 리더 서열은 1개 이상의 제한 부위를 포함하도록 3' 말단 근처에서 변성시킬 수 있다. 이것은 구조 유전자에 대한 리더 서열의 융합을 촉진시킨다.
효모 형질전환 프로토콜은 당업계의 숙련자에게 공지되어 있다. 이러한 프로토콜 중의 하나는 문헌 [Hinnen 등, Proc. Natl. Sci. USA 75:1929, 1978]에 기재되어 있다. 이 문헌에 기재된 프로토콜은 0.67% 효모 질소 기질, 0.5% 카스아미노산, 2% 글루코스, 10mg/ml 아데닌 및 20 mg/ml 우라실로 이루어진 선택 배지에서 Trp+형질전환체를 선택한다.
ADH2 프로모터 서열을 함유하는 벡터에 의해 형질전환된 효모 숙주 세포는 풍부 배지에서 성장시켜 발현을 유도할 수 있다. 풍부 배지의 예는 1% 효모 추출물, 2% 펩톤 및 1% 글루코스에 80mg/ml 아데닌 및 80 mg/ml 우라실이 보충되어 이루어진 것이다. 글루코스가 배지에서 고갈될 때 ADH2 프로모터의 억제 해제가 일어난다.
별법으로, 이. 콜리.와 같은 원핵 숙주 세포에서, IL-15 뮤테인은 원핵 숙주 세포에서 재조합 폴리펩티드의 발현을 촉진하기 위해 N-말단 메티오닌 잔기를 포함할 수 있다. N-말단 Met는 발현된 재조합 IL-15 뮤테인으로부터 분절될 수 있다.
재조합 IL-15 뮤테인 구조 유전자 뉴클레오티드 서열을 함유하는 재조합 발현 벡터는 적당한 숙주 미생물 또는 포유 동물 세포주 내로 형질이입 또는 형질전환된다.
원핵 숙주 세포 내로 형질이입되는 발현 벡터는 일반적으로 1개 이상의 표현형의 선택가능한 마커를 포함한다. 표현형의 선택가능한 마커는 예를 들면 항생물 내성을 부여하거나 또는 오토트로픽 요건 및 숙주 내에서의 증폭을 위해 숙주에 의해 인식되는 복제원을 공급하는 단백질을 코딩하는 유전자이다. 원핵 숙주 세포를 위한 다른 유용한 발현 벡터는 시판 플라스미드로부터 유래되는 세균원의 선택가능한 마커를 포함한다. 이 선택가능한 마커는 클로닝 벡터 pBR322(ATCC 37017)의 유전 요소를 포함할 수 있다. pBR322는 암피실린 및 테트라사이클린 내성을 위한 유전자를 함유하므로, 형질전환된 세포의 확인을 위한 간단한 수단을 제공한다. pBR322 골격 부분은 적당한 프로모터 및 IL-15 뮤테인 구조 유전자 서열과 결합된다. 다른 시판 벡터는 예를 들면 pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden) 및 pGEM1(Promega Biotec, Madison, WI, USA)을 포함한다.
재조합 원핵 숙주 세포 발현 벡터를 위해서는 흔히 프로모터 서열이 사용된다. 흔히 사용되는 프로모터 서열은 β-락타마제(페닐실리나제), 락토스 프로모터계 (Chang 등, Nature 275:615, 1978; 및 Goeddel 등, Nature 281:544, 1979), 트립토판 (trp) 프로모터계(Goeddel 등, Nucl. Acids Res. 8:4057, 1980; 및 EPA 36,776) 및 tac 프로모터 (Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1989))를 포함한다. 특히 유용한 원핵 숙주 세포 발현계는 파지 λPL프로모터 및 cI857ts 열불안정성 리프레서 서열을 사용한다. λPL프로모터의 유도체를 혼입시킨, 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (American Type Culture Collection)으로부터 입수 가능한 플라스미드 벡터는 플라스미드 pHUB2 (이. 콜리. 균주 JMB9 (ATCC37092) 내에 존재함) 및 pPLc28 (이. 콜리 RR1 (ATCC 53082) 내에 존재함)을 포함한다.
재조합 IL-15 뮤테인을 발현하는데는 포유 동물 또는 곤충 숙주 세포 배양계도 사용할 수 있다. 적당한 포유 동물 숙주 세포주의 예로는 원숭이 신장 세포의 COS-7주 (Gluzman 등, Cell 23:175, (1981); ATCC CRL 1651), L 세포, C127 세포, 3T3 세포 (ATCC CCL 163), CHO 세포, HeLa 세포 (ATCC CCL 2) 및 BHK (ATCC CRL 10) 세포주를 포함한다. 적당한 포유 동물 발현 벡터는 비전사 요소, 예를 들면 복제원, 프로모터 서열, 구조 유전자에 연결된 인핸서, 및 리보좀 결합 부위, 폴리아데닐화 부위, 스플라이스 도너 및 어셉터 부위와 같은 다른 5' 또는 3' 플랭킹 비전사 서열, 및 전사 말단 서열을 포함한다.
포유 동물 숙주 세포 발현 벡터에서 전사 및 번역 조절 서열은 바이러스원으로부터 제공될 수 있다. 예를 들면, 흔히 사용되는 포유 동물 세포 프로모터 서열 및 인핸서 서열은 폴리오마(Polyoma), 아데노바이러스(Adenovirus) 2, 원숭이 바이러스 40(SV 40), 및 사람 사이토메갈로바이러스로부터 유래된다. 포유 동물 숙주 세포 내의 구조 유전자 서열의 발현에 요구되는 다른 유전 요소를 제공하는데는 SV40 바이러스 게놈으로부터 유래되는 DNA 서열, 예를 들면 SV40원, 초기 및 후기 프로모터, 인핸서, 스플라이스 및 폴리아데닐화 부위를 사용할 수 있다. 바이러스의 초기 및 후기 프로모터는 이들이 바이러스 복제원을 함유할 수도 있는 단편으로서 바이러스 게놈으로부터 쉽게 얻을 수 있기 때문에 특히 유용하다 (Fiers 등, Nature 273:113, 1978). SV40 바이러스 복제원 부위에 위치한 Hind III 부위부터 Bgl I 부위까지 연장되는 약 250 bp 서열이 포함되는 한, 더 작거나 또는 더 큰 SV40 단편도 사용될 수 있다.
포유 동물 발현 벡터의 예는 문헌[Okayama 및 Berg (Mol. Cell. Biol. 3:280, 1983)]에 기재된 바에 의해 작제될 수 있다. 추가의 유용한 포유 동물 발현 벡터는 미국 특허 출원 제07/480,694호(1990년 2월 14일자로 출원됨) 및 미국 특허 제5,350,683호에 기재되어 있다.
재조합 IL-15 뮤테인의 정제
일반적으로, IL-15 뮤테인 폴리펩티드는 IL-15 뮤테인 폴리펩티드를 발현하는데 필요한 배양 조건 하에서 형질전환된 숙주 세포를 배양함으로써 제조될 수 있다. 이어서, 이와같이 하여 발현된 뮤테인을 배양 배지 또는 세포 추출물로부터 정제할 수 있다. IL-15 뮤테인은 시판 단백질 농축 필터, 예를 들면 아미콘 (Amicon) 또는 밀리포어 펠리콘 (Millipore Pellicon) 한외여과 유닛을 사용하여 농축시킬 수 있다. 농축 단계를 수행하거나 또는 수행하지 않고 배양 배지를 소수성 크로마토그래피 배지와 같은 정제 매트릭스에 적용할 수 있다. 페닐 세파로스(등록상표) CL-4B (Pharmacia)가 바람직한 배지이다. 별법으로, 음이온 교환 수지, 예를 들면 펜던트 디에틸아미노에틸 (DEAE)기를 갖는 매트릭스 또는 기질이 사용될 수 있다. 매트릭스는 아크릴아미드, 아가로스, 덱스트란, 셀룰로오스, 또는 단백질 정제에 흔히 사용되는 다른 종류일 수 있다. 별법으로, 겔 여과 배지를 사용할 수도 있다.
마지막으로, 소수성 RP-HPLC 배지, 예를 들면 펜던트 부틸 또는 다른 지방족기를 갖는 실리카겔을 사용하는 1종 이상의 역상 고속 액체 크로마토그래피 (RP-HPLC) 단계를 IL-15 뮤테인의 추가 정제에 사용할 수 있다. 세파로스(Pharmacia사 제품) 양이온 교환 수지 칼럼은 최종 완충액 교환 단계로서 이용될 수도 있다. 실질적으로 균질한 재조합 단백질을 제공하는데 상기 정제 단계의 일부 또는 전부를 다양하게 조합하여 사용할 수도 있다.
세균 배양에서 생산된 재조합 단백질은 통상적으로 먼저 숙주 세포의 파괴, 원심분리, 세포 펠릿으로부터의 추출 (불용성 폴리펩티드인 경우) 또는 상징액으로부터의 추출(가용성 폴리펩티드인 경우)에 이어서 1회 이상의 농축, 염석, 이온 교환 또는 크기 배제 크로마토그래피 단계에 의해 단리된다. 최종적으로, 최종 정제 단계에는 RP-HPLC를 사용할 수 있다. 미생물 세포는 냉동-해동 사이클, 음파 분해, 기계적 파괴 또는 세포 용해제의 이용을 포함하는 임의의 편리한 방법에 의해 파괴될 수 있다.
분비된 폴리펩티드로서 IL-15 뮤테인을 발현하는데는 형질전환된 효모 숙주 세포를 사용하는 것이 바람직하다. 효모 숙주 세포 발효로부터 분비된 재조합 폴리펩티드는 문헌 [Urdal 등, J. Chromatog. 296: 171, 1984]에 기재된 바와 유사한 방법으로 정제할 수 있다. 이 문헌에서는 예비 HPLC 칼럼으로 재조합 인간 IL-2를 정제하기 위한 2개의 연속적인 역상 HPLC 단계를 기재하고 있다.
바람직하게는, IL-15(서열 1에 나타낸 아미노산 잔기 49-162의 서열을 갖는 원숭이 IL-15 또는 서열 2에 나타낸 아미노산 잔기 49-162의 서열을 갖는 인간 IL-15)의 아미노산 잔기 Asp56또는 Gln156중 적어도 하나가 삭제되거나 또는 다른 천연 아미노산 잔기로 대체된 IL-15의 뮤테인이 사용된다. 치환 및(또는) 삭제의 어떠한 조합도 이루어질 수 있다. 예를 들면, Gln156이 다른 아미노산으로 치환되면서 Asp56이 삭제될 수 있거나, 또는 Asp56및 Gln156이 둘다 각각 동일하거나 또는 상이한 아미노산 잔기로 치환될 수 있다. 또한, Gln156이 삭제되면서 Asp56이 임의의 아미노산으로 치환될 수 있다. 일반적으로, 치환 뮤테인이 바람직하며, 더욱 바람직한 것은 IL-15 분자의 자연 폴딩에 심각한 영향을 주지 않는 것이다. 바람직한 치환 뮤테인은 Asp56이 세린 또는 시스테인으로 치환된 것 또는 Gln156이 세린 또는 시스테인으로 치환된 것 또는 Asp56및 Gln156이 둘다 각각 세린 또는 시스테인으로 치환된 것이다. 삭제 뮤테인의 예로는 성숙형 IL-15의 Asp56및 Gln156이 둘다 삭제된 것, Asp56만이 삭제된 것 또는 Gln156만이 삭제된 것이 있다. Asp56및 Gln156영역내의 다른 아미노산 잔기가 치환되거나 또는 삭제될 수 있으며, 여전히 IL-15 수용체 복합체의 β- 또는 γ-서브유닛 중 어느 하나 또는 둘다를 통한 시그날 형질도입을 방지하는 효과를 가질 수 있다. 그러므로, 본 발명은 또한 Asp56및 Gln156의 영역내의 아미노산 잔기가 치환 또는 삭제되고 IL-15 길항제 활성을 갖는 뮤테인을 포함한다. 그러한 뮤테인은 본 명세서에 사용된 방법을 이용하여 형성될 수 있고 통상의 방법을 이용하여 IL-15 길항 활성에 대해 분석될 수 있다. 본 발명에 따른 IL-15 뮤테인을 형성하는데 사용될 수 있는 방법은 실시예 1에 추가로 설명되어 있다.
콘쥬게이트된 IL-15 분자 및 IL-15 뮤테인
본 명세서에 기재된 성숙형 IL-15 폴리펩티드(서열 1에 나타낸 아미노산 잔기 49-162의 서열을 포함하는 성숙형 원숭이 IL-15 또는 서열 2에 나타낸 아미노산 잔기 49-162의 서열을 포함하는 성숙형 인간 IL-15) 및 IL-15 뮤테인은 다른 화학 잔기와 공유성 또는 집합성 콘쥬게이트를 형성함으로써 변형될 수 있다. 그러한 잔기로는 IL-15Rα에 대한 IL-15의 고친화력을 유지하면서 IL-15 수용체 복합체의 β- 또는 γ-연쇄에 대한 IL-15의 결합을 간섭할 수 있는 IL-15 분자 상의 특정 부위에서 결합될 수 있는 PEG, mPEG, 덱스트란, PVP, PVA, 폴리아미노산, 예를 들면 폴리-L-리신 또는 폴리히스티딘, 알부민 및 젤라틴을 포함할 수 있다. 또한, IL-15는 IL-15Rα에 대한 IL-15의 고친화력을 유지하면서 IL-15 수용체 복합체의 β- 또는 γ-연쇄에 대한 IL-15의 결합을 간섭할 수 있는 부위에서 특이적으로 글리코실화될 수 있다. 콘쥬게이션하기에 바람직한 기는 PEG, 덱스트란 및 PVP이다. 본 발명에 사용하기에 가장 바람직한 것은 분자량이 약 1,000 내지 약 20,000인 PEG이다. 분자량이 약 5,000인 것이 IL-15를 콘쥬게이션하는데 사용하기에 바람직하지만, 다른 분자량의 PEG 분자도 적합하게 사용될 것이다. 각종 형태의 PEG가 본 발명에 적합하게 사용될 수 있다. 예를 들면, PEG는 생체내에서의 가수분해 분절에 민감한 에스테르 결합을 제공하는 숙신이미딜 숙시네이트 PEG(SS-PEG), 생체내에서의 가수분해 분절에 안정한 우레탄 결합을 제공하는 숙신이미딜 카보네이트 PEG(SC-PEG), 생체내에서 안정한 에테르 결합을 제공하는 숙신이미딜 프로피오네이트 PEG(SPA-PEG), 비닐 술폰 PEG(VS-PEG) 및 말레이미드 PEG(Mal-PEG)의 형태로 사용될 수 있으며, 그들은 모두 쉐어워터 폴리머스, 인크.사(Shearwater Polymers, Inc.(Huntsville, AL 소재))로부터 시판된다. 일반적으로, SS-PEG, SC-PEG 및 SPA-PEG는 폴리펩티드내의 리신 잔기와 특이적으로 반응하지만, VS-PEG 및 Mal-PEG는 각각 자유 시스테인 잔기와 반응한다. 그러나, Mal-PEG는 알칼리성 pH에서 리신 잔기와 반응하기 쉽다. SC-PEG 및 VS-PEG가 바람직하며, SC-PEG가 생체내 안정성 및 리신 잔기에 대한 특이성 때문에 가장 바람직하다.
PEG 잔기는 PEG의 큰 분자 크기의 잇점을 취할 수 있는 특정 위치에서 IL-15에 결합될 수 있다. 상기한 바와 같이, PEG 잔기는 단백질에서 자연 발생된 리신 또는 시스테인 잔기를 이용하거나 또는 부위 특이적 PEG화에 의해 IL-15에 결합될 수 있다. 부위 특이적 PEG화의 한가지 방법은 시스테인 또는 리신 잔기를 특정 아미노산 위치에서 IL-15에 도입시키는 단백질 공학 방법이다. IL-15에 콘쥬게이트된 큰 분자 크기의 PEG 연쇄(들)은 IL-15 수용체 복합체의 β- 및(또는) γ-서브유닛에는 결합하지만 α-서브유닛에는 결합하지 않는 IL-15의 영역을 차단하는 것으로 믿어진다. 콘쥬게이션은 PEG를 IL-15를 함유하는 염기성 용액에 첨가하는 간단한 부가 반응에 의해 이루어질 수 있다. 전형적으로, PEG화는 (1) 약 pH 9.0 및 리신 잔기에 대한 SC-PEG의 약 1:1 내지 100:1의 몰비에서, 또는 (2) 약 pH 7.0 및 시스테인 잔기에 대한 VS-PEG의 약 1:1 내지 100:1 이상의 몰비에서 수행된다.
콘쥬게이트된 PEG화 IL-15 분자의 특징화는 노벡스 코포레이션사(Novex Corp., San Diego, California)에서 시판되는 4-20 % 구배 폴리아크릴아미드 겔 상의 SDS-PAGE에 의해 수행될 수 있다. 통상의 은 염색법이 이용될 수 있거나, 또는 은 염색에 의해 쉽게 가시화되지 않는 고 PEG화 단백질을 위해서 통상의 웨스턴 블롯팅 기술이 이용될 수 있다. PEG화 IL-15 분자의 정제는 크기 배제 크로마토그래피, 투석, 한외여과 또는 친화성 정제를 이용하여 행해질 수 있다.
PEG화 IL-15의 변형 및 이질성 정도는 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화 매스 분광 분석법(MALDI)을 이용하여 결정될 수 있다. 인간 IL-15가 약 13,000의 분자량을 가지며 5,000의 분자량을 갖는 PEG를 이용하므로, MALDI는 제조 중량이 13,000인 것은 PEG화 되지 않은 것, 중량이 18,000인 것은 IL-15 분자 하나가 1개의 PEG 분자에 결합된 것, 중량이 23,000인 것은 IL-15 분자 하나가 2개의 PEG 분자와 결합한 것을 나타낸다.
IL-15에 대한 모노클로날 항체
또한, 본 발명에 따른 길항제는 IL-15 수용체 복합체의 α-, β- 또는 γ-서브유닛에 대한 IL-15의 결합을 간섭하는 IL-15에 대한 모노클로날 항체의 형태를 취할 수 있다. 본 발명의 한 면에서, 그의 유도체를 포함한 IL-15 및 IL-15 펩티드와 같은 이러한 단백질의 일부 또는 단편은 IL-15에 특이적으로 결합하는 항체를 제조하는데 사용될 수 있다. 본 발명에서, 항체란 용어는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 그의 단편, 예를 들면 F(ab')2 및 Fab 단편 뿐만 아니라 재조합으로 생산된 결합 파트너를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 모노클로날 항체 또는 결합 파트너의 친화도는 당업계의 통상의 숙련인에 의해 쉽게 결정될 수 있다[Scatchard, Ann, N.Y. Acad. Sci., 51: 660-672 (1949) 참조]. 그러한 모노클로날 항체의 특정 예는 실시예 2에 제공되어 있다.
일반적으로, IL-15에 대한 모노클로날 항체는 다음의 절차를 이용하여 형성될 수 있다. 정제된 IL-15, 그의 단편, IL-15를 발현하는 합성 펩티드 또는 세포는 당업계에 공지된 기술, 예를 들면 미국 특허 제4,411,993호에 기재된 기술을 이용하여 IL-15에 대한 모노클로날 항체를 생산하는데 이용될 수 있다. 간략하게 설명하면, 마우스를 불완전 프로인트(Freund's) 보조액 또는 RIBI 보조액에 유화된 면역원으로서의 IL-15로 면역화시키고 10-100 ㎍의 양으로 피하 또는 복강내 주입한다. 10일 내지 12일 후에, 면역화된 동물을 불완전 프로인트(Freund's) 보조액에 유화된 IL-15로 추가로 면역화시켰다. 그후에, 마우스를 1주일 내지 2주일 마다의 면역화 스케쥴로 정기적으로 추가로 면역화시켰다. 혈청 시료를 도트 블롯 분석, ELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) 또는 CTLL-2 세포에 대한 IL-15 활성의 억제에 의해 IL-15 항체를 시험하기 위해 안와(眼窩) 뒤 (retro-orbital) 출혈 또는 꼬리 끝(tail-tip) 절제에 의해 정기적으로 취하였다.
적절한 항체 타이터의 검측에 이어서, 양성 동물에게 염수 중의 IL-15를 추가로 정맥내 주사하였다. 3 내지 4일 후에, 동물을 희생시키고, 비장 세포를 수거하고, 비장 세포를 마우스의 골수종 세포주, 예를 들면 NS1 또는 바람직하게는 P3x63A8.653(ATCC CRL 1580)에 융합시켰다. 융합 결과 하이브리도마 세포를 형성시켰고, 이것을 HAT(하이포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘) 선택 배지 중의 다중 마이크로타이터 플레이트에 놓아서 비융합된 골수종 세포 및 골수종 하이브리드의 증식을 억제하였다.
하이브리도마 세포를 문헌[Engvall 등, Immunochem. 8:871, 1971; 및 미국 특허 제4,703,004호]에 기재된 기술에 따라 정제된 IL-15에 대한 반응성에 대해 ELISA법에 의해 스크리닝하였다. 바람직한 스크리닝 기술은 벡크만(Beckmann) 등의 문헌(J. Immunol. 144: 4212, 1990)에 기재된 항체 포획 기술이다. 양성 하이브리도마 세포는 공통 유전형 Balb/c 마우스에 복강내 주입하여 고농도의 항-IL-15 모노클로날 항체를 함유하는 복수증을 유발할 수 있다. 별법으로, 하이브리도마 세포를 각종 기술에 의해 플라스크 또는 롤러 병 중에서 생체외로 성장시킬 수 있다. 복수증 마우스에서 생성된 모노클로날 항체는 암모늄 설페이트 침전에 이어서 겔 배제 크로마토그래피에 정제될 수 있다. 별법으로, IL-15에 대한 결합을 기초로 한 친화성 크로마토그래피와 같이, 단백질 A 또는 단백질 G에 대한 항체의 결합을 기초로 한 친화성 크로마토그래피가 사용될 수도 있다.
다른 항체는 본 명세서에 제공된 기술을 이용하여 제조될 수 있으며, 따라서 그것도 본 발명의 영역내에 포함된다. 인간화된 항체를 형성하는데 사용된 절차는 미국 특허 제4,816,567호 및 국제 특허 공개 제94/10332호에 기재되어 있으며, 마이크로바디를 형성하는 절차는 국제 특허 공개 제94/09817호에 기재되어 있고, 이식 유전자 항체를 형성하는 절차는 독일 특허 제2 272 440호에 기재되어 있으며, 그것을 모두 본 명세서에 참고로 인용하였다.
모노클로날 항체가 길항제인가를 결정하기 위해서 스크리닝 분석을 이용하는 것이 바람직하다. CTLL-2 증식 분석이 이 목적을 위해 바람직하다. 이것은 본 명세서에 참고로 인용한 문헌[Gillis and Smith, Nature 268: 154 (1977)]에 기재되어 있다.
본 발명에 따른 길항제는 상기한 바 있고 이후에 더욱 상세히 설명되는 용도에서, 이인자형이식편 생존을 촉진시키는데 또한 이식편 대 숙주 질환을 가진 환자를 치료하는데 사용될 수 있다. 길항제의 다른 확실한 용도에는 말기 HTLV(인간 T-세포 림포트로픽 바이러스) I-유도된 성인 T-세포 백혈병-림프종의 치료가 포함된다[Burton 등, Proc. Natl. Acad. Sci., 91: 4935 (1994) 참조]. 다른 확실한 용도는 시험관내에서의 B 세포 또는 T-세포 자극의 방지, 수용체-리간드 상호작용의 조사, 위장 경로의 감염증 및 질환의 진단 키트에 있다. 본 발명에 따른 길항제의 활성으로 인해 임의의 질환을 치료하는 새로운 방법이 본 발명의 범위에 포함된다. 예를 들면, 이인자형이식편 거부 반응을 일으키는 환자에서 그것을 방지하는 방법 및 GVHD 치료를 필요로 하는 환자를 치료하는 방법이 있으며, 각 방법은 IL-15 활성을 억제하는 유효량의 IL-15 길항제 및 제약학상 허용되는 담체 또는 희석제로 이루어진 제약 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 표적 세포(질병 상태 또는 질병 상태의 징후에 일차적으로 원인이 된다고 생각되는 세포)가 IL-15 수용체 복합체를 발현하고 있으며 IL-15 수용체의 β- 또는 γ-서브유닛을 통한 시그날 형질도입의 차단 또는 억제가 요망되는 다른 질환을 치료하는데 유사한 방법이 유용하다. 그러한 질병 상태는 표적 세포가 IL-15 수용체 복합체를 발현하는 것을 알게될 때 본 발명의 길항제로 치료될 수 있다. 사실상, GVHD 및 이인자형이식편 거부 반응 이외에, 그러한 질병 상태로는 예를 들면 림프종, 악성 종양, 백혈병, 횡문근육종, 및 임의의 자기면역 질환, 예를 들면 류머티스성 관절염이 있다. 상기 리스트가 표적 세포가 필요한 IL-15 수용체 복합체를 발현하고 있는 모든 질병 상태를 다 나타낸 것은 아니라는 사실이 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 간주되어서는 안된다.
상기한 바와 같이, 본 발명의 다른 실시태양은 본 발명의 IL-15 뮤테인을 코딩하는 핵산을 포함한다. 그러한 핵산은 서열 1의 아미노산 144-486 및 서열 2의 아미노산 144-486의 뉴클레오티드 서열을 갖는 RNA 또는 cDNA를 포함한다. 또한, 본 발명의 범위내에는 IL-15 뮤테인을 코딩하는 cDNA로 이루어진 발현 벡터 및 그러한 발현 벡터로 형질전환 또는 형질이입된 숙주 세포가 포함된다. 형질전환된 숙주 세포는 표준 기술을 이용하여 재조합 발현 벡터로 형질전환 또는 형질이입된 세포이다. 발현된 포유 동물 IL-15는 숙주 세포 및 숙주 세포로 삽입된 유전자 작제물의 특성에 따라서 숙주 세포내에 위치하고 (또는) 배양 상징액으로 분비될 것이다. 상기 IL-15 길항제를 포함하는 제약 조성물도 또한 본 발명의 범위에 포함된다.
IL-15의 길항제의 투여
본 발명은 유효량의 IL-15 길항제를 적당한 희석제 또는 담체 중에 함유시켜 이루어지는 치료 조성물의 사용 방법을 제공한다. 본 발명의 IL-15 길항제는 제약학상 유용한 조성물을 제조하는데 사용된 공지 방법에 따라서 제제화될 수 있다. IL-15 길항제는 단독 활성 물질로서 또는 다른 공지된 활성 물질과 함께, 제약학적으로 적합한 희석제(예를 들면, Tris-HCl, 아세테이트, 포스페이트), 보존제(예를 들면, 티메로잘, 벤질 알코올, 파라벤), 유화제, 가용화제, 보조제 및(또는) 담체와의 조합물로 배합될 수 있다. 적합한 담체 및 그의 배합은 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th ed. 1980, Mack Publishing Co.]에 기재되어 있다. 또한, 그러한 조성물은 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 금속 이온과 착체화되거나, 또는 폴리아세트산, 폴리글리콜산, 히드로겔 등과 같은 중합성 화합물에 혼입되거나, 또는 리포좀, 마이크로에멀젼, 미셀, 유니라멜 또는 멀티라멜 비히클, 진핵 환영 세포 또는 구형 아세포에 혼입된 IL-15 길항제를 함유할 수 있다. 그러한 조성물은 IL-15 길항제의 물리적 상태, 용해도, 안정성, 생체내 방출 속도 및 생체내 정화 속도에 영향을 미칠 것이다. IL-15 길항제는 조직 특이적 수용체, 리간드 또는 항원에 대한 항체에 콘쥬게이션되거나, 또는 조직 특이적 수용체의 리간드에 커플링될 수도 있다.
본 발명의 IL-15 길항제는 국소적으로, 비경구적으로, 직장내로 또는 흡입에 의해 투여될 수 있다. 비경구란 용어는 피하 주입, 정맥내, 근육내, 지망막하조내 주입 또는 주입 기술을 포함한다. 이러한 조성물은 전형적으로 단독으로 또는 유효량의 다른 활성 물질과 함께 사용된 유효량의 IL-15 길항제를 함유할 것이다. 그러한 투약량 및 조성물에 함유된 소정의 약물 농도는 사용 용도, 환자의 체중 및 연령 및 투여 경로 등의 여러 요인에 따라서 변화될 수 있다. 예비 복용량은 동물 시험에 따라서 결정될 수 있으며, 인체 투여를 위한 투약량의 조정은 업계의 관행에 따라서 행해질 수 있다.
상기한 바 이외에, 다음 실시예는 발명의 범위를 제한하는 것이 아니라 특정 실시태양을 예시하기 위한 것이다.
실시예 1
IL-15의 뮤테인
이 실시예는 IL-15의 길항제로서 기능하는 성숙형, 또는 천연 IL-15의 뮤테인을 얻기 위한 방법을 설명하고 있다. IL-15는 IL-2와 마찬가지로 수용체 복합체의 IL-2Rβγ 복합체에 결합하고 그를 통해 시그날링할 수 있고, 그 자체는 IL-2와 구조적 유사성을 갖도록 제안되어 있다. IL-2Rβ- 및 γ-연쇄와의 상호작용에 있어서 중요한 것으로 IL-2내에서 미리 밝혀진 IL-15 내의 동등한 잔기는(Zurawski, 등, EMBO J., 12 (13): 5113 (1993) 참조) β-연쇄에 대해서는 아스파르트산, 잔기 56(Asp)이고, γ-연쇄에 대해서는 글루타민, 잔기 156(Gln)인 것으로 최적 서열 정렬에 의해 결정되었다(아미노산 넘버링은 서열 1 및 2의 아미노산 잔기 1-162에 의해 밝혀진 펩티드의 서열을 기초로 한 것이다).
올리고뉴클레오티드 프라이머는 인간 IL-15를 증폭시키고 잔기 56 또는 156 중 어느 하나에서 세린 또는 시스테인 중 어느 하나를 코딩하는 코돈을 도입할 것으로 정해졌다. 각 돌연변이체의 작제를 위해 2개의 개별적인 PCR 증폭 라운드를 수행하였다(하기 다이아그램 참조). 제1 PCR 반응에서, 적절한 돌연변이를 도입하거나 또는 성숙형 서열을 증폭시키는 프라이머 쌍으로 증폭시켰다. 제2 PCR 반응에서, 제1 라운드로부터 얻은 물질을 클로닝을 위한 제한 부위를 pαADH2 효모 발현 벡터 pIXY456으로 도입한 프라이머 세트로 재증폭시켰다[Price 등, Gene, 55:287 (1987) and Price 등, Meth. Enzym. 185: 308 (1990) 참조].
하기 표는 각 뮤테인의 제1 증폭을 위해 사용된 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍의 목록을 기재한 것이다. 올리고뉴클레오티드 NTFIL 15B(5' 프라이머) 및 NCTFIL 15F(3' 프라이머)는 성숙형 서열의 유지가 요망될 때 제1 증폭을 위해 사용하였다.
클론 명칭 아미노산 치환 예상된 표현형 제1 PCR5' 프라이머 제1 PCR3' 프라이머
D56 Q156
DQ D Q 성숙형 NTFIL15B NCTFIL15F
SQ S Q β- / γ+ D56SER5 NCTFIL15F
DS D S β+ / γ- NTFIL15B Q156SER3
SS S S β- / γ- D56SER5 Q156SER3
CQ C Q β- / γ+ D56CYS5 NCTFIL15F
DC D C β+ / γ- NTFIL15B Q156CYS3
CC C C β- / γ- D56CYS5 Q156CYS3
또한, 올리고뉴클레오티드 NTFIL15B는 올리고뉴클레오티드 IL15PIXYF5로 치환될 수 있고, 올리고뉴클레오티드 NCTFIL15F는 올리고뉴클레오티드 IL15PIXY3으로 치환될 수 있다. 제1 PCR 증폭은 250 μM dNTPs 및 5' 및 3' 올리고뉴클레오티드 프라이머 50 pmol을 함유한 1xTaq폴리머라제 완충액(Boehringer사 제품) 100 ㎕에서 수행하였다. 사용된 DNA 주형은 pIXY764 약 50 ng이었다. 벡터 pIXY764는 인간 IL-15의 N-결합된 글리코실화 부위가 상기 절차에 따라 불활성화된 인간 플래그 IL-15를 코딩하는 DNA를 함유하는 상기 벡터 pIXY456과 유사하다. 반응 혼합물을 미네랄 오일로 덮어씌우고,Taq폴리머라제(Boehringer사 제품) 2 유닛의 첨가 및 열 순환의 개시전에 5분 동안 열 순환기에서 94 ℃로 가열시켰다. 총 30 주기 동안 순환 조건은 94 ℃에서 45초 동안 변성시키고, 45 ℃에서 45초 동안 어닐링시키고 72 ℃에서 1분 동안 연장시키는 것이었다.
제1 증폭으로부터 얻은 겔 정제된 생성물 약 20 ng을 제2 PCR 증폭의 주형으로서 사용하였다. 모든 작제물을 상기한 바와 동일한 완충 조건을 이용하여 IL15PIXYF5 및 IL15PIXY3으로 증폭시켰다. 총 20 주기 동안 순환 조건은 94 ℃에서 45초 동안 변성시키고, 60 ℃에서 45초 동안 어닐링시키고 72 ℃에서 1분 동안 연장시키는 것이었다.
증폭 생성물을 겔 정제시키고, 1 x 베링거(Boehringer) 완충액 B중에서 37 ℃에서 밤새도록 Asp718(Boehringer사 제품) 및 NcoI(New England Biolabs사 제품)로 분해시켰다. 제한 생성물을 Asp718 및 NcoI로 분해시킨 pIXY456 효모 발현 벡터로 결합시켰다. 이 DNA를 일렉트로포레이션에 의해 DH10β 이. 콜리 세포를 형질전환시키는데 이용하였다.
단일 형질전환체로부터 얻은 플라스미드 DNA를 서열화하여 서열 보전을 확인하고, XV2181 에스. 세레비시애(S. Cerevisiae)를 형질전환시키는데 사용하였다. 30시간 동안 유도한 뒤에 효모 상징액을 이용하여 생물학적 활성을 분석하였다.
이 실험은 IL-15 유전자의 말단 부근에 위치한 변이유발 부위로 인한 변이 유발을 위해 PCR 기본 방법을 이용하였다. 그러나, 이들 및 다른 단일 또는 다중점 돌연변이는 통상의 부위 유도된 변이 유발 기술에 의해 도입될 수 있었다.
실시예 2
IL-15에 대한 모노클로날 항체
이 실시예는 IL-15의 길항제로서 기능하는 3가지의 항-IL-15 모노클로날 항체를 얻기 위한 방법을 설명하고 있다. 모든 사용 방법은 명시한 것을 제외하고는 통상적인 기술이었다.
Balb/c 마우스를 RIBI 보조제(RIBI Corp., Hamilton, Montana)의 존재하에 효모 유도된 인간 IL-15 10 ㎍으로 3주 간격으로 2회 복강내 주입하였다. 마우스 혈청을 통상의 도트 블롯 기술, 항체 포획(ABC) 및 중화 분석(CTLL-2 분석)에 의해 분석하여 동물이 융합하기에 최상의 상태였는지를 결정하였다. 3주 후에, 멸균 PBS 중에 현탁된 인간 IL-15 3 ㎍을 추가로 정맥내 주입하였다. 3일 후에, 마우스를 희생시키고 비장 세포를 정해진 절차에 따라서 Ag8.653 골수종 세포(ATCC)와 융합시켰다. 간략하게 설명하면, Ag8.653 세포를 무혈청 배지에서 수회 세척하고 1개의 골수종 세포에 3개의 비장 세포의 비율로 마우스 비장 세포에 융합시켰다. 융합제는 50% PEG:10% DMSO(Sigma사 제품)였다. 융합물을 HAT 보충된 DMEM 배지를 함유하는 20개의 96-웰 평반 플레이트(Corning사 제품)로 플레이팅시키고 8일 동안 성장시켰다. 형성된 하이브리도마로부터의 상징액을 모으고 염소 항-마우스 Ig로 먼저 코팅된 96-웰 플레이트로 60분 동안 첨가시켰다. 세척에 이어서,125I-IL-15를 각 웰에 첨가하고, 실온에서 60분 동안 인큐베이션시키고 4회 세척하였다. 이어서, 양성 웰을 코닥(Kodak) X-Omat S 필름을 사용하여 -70 ℃에서 자동방사선 사진술에 의해 검측하였다. 양성 클론을 벌크 배양액에서 성장시키고 이어서 상징액을 프로테인 A 칼럼(Pharmacia사 제품) 상에서 정제시켰다. M110, M111 및 M112로 명명된 클론을 각각 IgG1 모노클로날 항체로서 이소타입화하였다. 모노 클로날 항체 M110, M111 및 M112를 생산하는 하이브리도마는 미국 메릴랜드주 록크빌의 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection)에 일자로 수탁 번호 , 및 으로 기탁하였다. 모든 기탁은 부타페스트 조약에 따라 이루어졌다.
형성된 모노클로날 항체는 질리스(Gillis, 등, Id.) 등에 의해 설명된 CTLL-2 분석을 이용하여 IL-15 길항제 활성에 대해 분석할 수 있다.
실시예 3
변형된 IL-15 분자
이 실시예는 IL-15 길항제로서 기능하는 변형된 IL-15 분자를 얻기 위한 방법을 설명한다.
PEG화 IL-15
모든 콘쥬게이션 반응을 쉐어워터 폴리머스, 인크.(Shearwater Polymers, Inc.; Huntville, AL 소재)사 제품인 숙신이미딜 숙시네이트 PEG(SS-PEG), 숙신이미딜 카보네이트 PEG(SC-PEG), VS-PEG 및 Mal-PEG의 형태로 얻은 분자량이 5000인 PEG로 수행하였다. SS-PEG 및 SC-PEG는 둘다 리신의 ε-아미노기와 반응하여, SS-PEG의 경우 가수분해적으로 불안정한 에스테르 결합을 형성하고, SC-PEG의 경우에는 가수분해적으로 안정한 우레탄 결합을 형성하였다. SS-PEG 및 SC-PEG에 대해서는 pH 9.0에서, VS-PEG 및 Mal-PEG를 함유하는 반응에 대해서는 pH 7.0에서 50 nM NaH2PO4에서 PEG화를 실시하였다. 각 반응에서, PEG를 리신에 대한 PEG의 1:1, 3:1, 10:1 및 100:1의 몰비로 반응 혼합물에 첨가하였다(각 원숭이 IL-15 분자에는 9개의 리신 잔기가 있음). 이 반응을 4 ℃에서 밤새 진행시켰다.
PEG화 원숭이 IL-15의 특징화는 4-20% 구배 폴리아크릴아미드 겔(Novex사 제품, San Diego, California) 상에서 SDS-PAGE에 의해 이루어졌다. 약 0.5 ㎍/레인에 위치한 비변형된 IL-15 단백질을 위해 통상의 은 염색 기술을 이용하였다. 고 PEG화 원숭이 IL-15 단백질은 가시화를 위해서 겔 상으로의 다량의 단백질의 로딩을 필요로 하였다. 웨스턴 블롯을 이용하여 고 PEG화 IL-15를 특징화하였다. 이 실험에서, PEG화 원숭이 IL-15를 SDS-PAGE에 의해 분리시키고, 니트로셀룰로오스 막에 전이시키고, 모노클로날 항체 M111과 함께 인큐베이션시키고, 이어서 염소 항-마우스 HRP와 함께 인큐베이션시키고, 마지막으로 4 CN 멤브레인 페록시다아제 서브스트레이트 시스템(Membrane Peroxidase Substrate System; Kirkegaard Perry Laboratories사 제품, Gaithersburg, MD 소재)으로 가시화하였다. PEG화 원숭이 IL-15는 통상의 기술에 따라서 바이오실(Biosil) SEC-250 사이즈 칼럼(Biorad, Richmond사 제품, CA 소재)을 사용한 크기 배제 크로마토그래피(SEC) HPLC에 의해 특징화시켰다.
SC-PEG화 플래그 원숭이 IL-15를, 세포 막에 IL-15α- 또는 β- 및 γ-수용체 서브유닛을 발현시키는 형질이입된 COS 세포에 결합하는 그의 능력에 대해 시험하였다. PEG화 IL-15는 IL-15Rα-서브유닛를 발현하는 COS 세포에 대한 방사표지된 IL-15의 결합을 억제하였으며, 이것은 PEG화 IL-15가 IL-15Rα-서브유닛 결합에 대해 경쟁한다는 것을 나타낸다. 또한, PEG화 IL-15는 β- 및 γ- 수용체 서브유닛을 발현하는 COS 세포에 대한 방사표지된 IL-15의 결합은 억제하지 않았으며, 이것은 PEG화 IL-15가 IL-15 수용체 복합체의 β- 및(또는) γ-서브유닛에 결합하지 않는다는 것을 나타낸다. 따라서, PEG화 IL-15는 IL-15 수용체 복합체의 β- 및(또는) γ-서브유닛을 통한 내생 IL-15의 시그날 형질도입을 방지한다.
실시예 4
CTLL-2 분석에서의 IL-15 활성의 억제
이 실시예는 IL-15 수용체 복합체의 β- 및 γ- 수용체 서브유닛을 통한 IL-15의 시그날 형질도입이 본 발명에 따른 길항제에 의해 억제되는지를 결정하는 방법을 예시한다.
모노클로날 항체, PEG화 IL-15 및 IL-15 뮤테인의 길항제 활성은 변형된 CTLL-2 세포3H-티미딘 혼입 분석을 이용하여 평가할 수 있다(Gillis, 등, Id.). 길항제의 연속적인 희석은 50 ㎕의 최종 용적에서 DMEM 배지(5% FCS, NEAA, NaPyruvate, HEPES pH 7.4, 2-me, PSG로 보충됨) 중의 96 웰 평저 조직 배양물 플레이트(Costar, Cambridge사 제품, MA 소재)에서 이루어질 수 있다. 시료의 연속 희석 후 및 세포의 첨가 전에 모든 분석 웰(5 ㎕/웰)에 최적 미달량(최종 농도: 20-40 pg/ml)의 IL-15를 첨가하였다. 세척된 CTLL-2세포를 첨가하고(50 ㎕에서 웰 당 약 2000), 플레이트를 공기 중의 10% CO2의 습윤 대기하에서 37 ℃에서 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 이후에,3H-티미딘 0.5 μCi(25 Ci/mMol, Amersham, Arlington Heights, IL)와 함께 5시간 동안 인큐베이션시켰다. 배양액을 유리 섬유 필터 상에 수거하고 멀티 디텍터 다이렉트 베타 계수기(Matrix 96, Packard Instrument Company, Meridien, CT) 또는 베타 신틸레이션 계수기 상에서 가스 사태 이온화에 의해 계수하였다. 분석에 의해 밝혀진 분당 개수(CPM)는 억제 백분율로 전환하고 각각의 적정화된 길항제 시료의 억제 백분율값을 이용하여 길항제 활성을 유닛/ml 단위로 계산하였다.
CTLL 억제 분석에서 IL-15 40 pg/ml를 중화하는데 필요한 농도를 나타내는 데이터를 하기 표 I에 나타내었다. 하기 표 II에는 CTLL 및 CTLL 억제 분석에서의 IL-15(작동질) 및 IL-15 길항제의 활성을 나타내었다.
IL-15 길항제의 특이적 활성
CTLL 억제 분석에서 40 pg/ml IL-15를 중화시키는데 필요한 길항제의 농도
길항질 농도 단백질 측정 방법
huIL-15 뮤테인 848-2560 pg/ml ELISA/AAA로부터 평가됨
M110, M111 5 ng/ml OD
PEGhuIL-15 D56C 7.7 ng/ml AAA로부터 평가됨
M112 40 ng/ml OD
PEGf-s-IL-15 140-196 ng/ml AAA
OD = 280 nm에서의 광학 밀도 흡수도; 1.35의 흡광 계수AAA = 아미노산 분석PEGf-s-IL-15 = PEG화 플래그 원숭이 IL-15
CTLL 및 CTLL 억제 분석에서의 IL-15 및 IL-15 길항제의 활성
시료 CTLL 분석유닛/ml (작동질 활성) CTLL 억제 분석유닛/ml (길항질 활성)
IL-15 7.09 x 105 279
IL-15-Q156C - 3 x 106
IL-15-Q156S - 1.5 x 106
IL-15-D56C - 2 x 106
IL-15-D56C-Q156C - 2 x 105
IL-15-D56C-Q156S - 7 x 105
IL-15-D56S - 2.2 x 105
IL-15-D56S-Q156S - 7.2 x 105
벡터 대조군 - 1141
IL-15 3.7 x 108 NA
PEG-IL-15 - 2.3 x 106
PEG-IL-15-D56C - 7.96 x 106
IL-15-D56C - 5 x 106
IL-15 5.6 x 108 NA
PEG-IL-15 NA 1.7 x 105
Q156C = Cys으로 치환된 Gln156Q156S = Ser으로 치환된 Gln156D56C = Cys으로 치환된 Asp56D56S = Ser으로 치환된 Asp56NA = 분석되지 않음
〈서열표〉
(1) 일반적 정보 :
(i) 출원인: 그랩스타인, 케네쓰
팍스톤, 레이몬드
피티트, 딘
(ii) 발명의 명칭: IL-15의 길항제
(iii) 서열수: 10
(iv) 통신 주소:
(A) 수신인: 임뮤넥스 코포레이션
(B) 거리: 유니버시티 스트리트 51
(C) 도시: 시애틀
(D) 주: 워싱톤
(E) 국가: 미국
(F) 우편번호: 98101
(v) 컴퓨터 판독 형태
(A) 매체 유형: 플로피 디스켓
(B) 컴퓨터: 애플 맥킨토쉬
(C) 작동 시스템: 시스템 7, 워드 5.1a
(D) 소프트웨어: 패턴트인 릴리스 #1.0, 버전 #1.25
(vi) 현출원 데이타:
(A) 출원번호:
(B) 출원일: 1996. 2. 21
(C) 분류:
(viii) 변호사/대리인 정보:
(A) 성명: 말라스카, 스티븐 엘.
(B) 등록 번호: 32,655
(C) 참조/사건 번호: 2831-WO
(ix) 통신 정보:
(A) 전화: 206-587-0430
(2) 서열 1에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 486 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA
(iii) 가상: 아님
(iv) 안티센스: 아님
(ix) 특징:
(A) 명칭/기호: CDS
(B) 위치: 1..342
(xi) 서열 설명: 서열 1:
(2) 서열 2에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 489 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA
(ix) 특징:
(A) 명칭/기호: CDS
(B) 위치: 1..489
(xi) 서열 설명: 서열 2:
(2) 서열 3에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 27 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA
(iii) 가상: 아님
(xi) 서열 설명: 서열 3:
(2) 서열 4에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 27 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA
(xi) 서열 설명: 서열 4:
(2) 서열 5에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 24 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA
(iii) 가상: 아님
(xi) 서열 설명: 서열 5:
(2) 서열 6에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 24 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA
(iii) 가상: 아님
(xi) 서열 설명: 서열 6:
(2) 서열 7에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 39 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA
(iii) 가상: 아님
(xi) 서열 설명: 서열 7:
(2) 서열 8에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 45 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA
(iii) 가상: 아님
(xi) 서열 설명: 서열 8:
(2) 서열 9에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 69 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA
(iii) 가상: 아님
(xi) 서열 설명: 서열 9:
(2) 서열 10에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 69 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA
(iii) 가상: 아님
(xi) 서열 설명: 서열 10:

Claims (25)

  1. IL-15 수용체 복합체의 β- 또는 γ-서브유닛 중 어느 하나를 통한 IL-15의 시그날 형질도입을 방지하는, IL-2 수용체 복합체에 대한 모노클로날 항체가 아닌 인터루킨-15(IL-15) 활성의 길항제.
  2. 제1항에 있어서,
    (a) IL-15Rα-서브유닛에 결합할 수 있고 IL-15 수용체 복합체의 β- 또는 γ-서브유닛을 통한 시그날 형질도입은 할 수 없는 천연 IL-15의 뮤테인;
    (b) IL-15 수용체 복합체의 β- 또는 γ-서브유닛을 통한 IL-15의 시그날 형질도입을 방지하는 IL-15에 대한 모노클로날 항체; 및
    (c) 성숙형 IL-15가 PEG, mPEG, PVP 및 덱스트란으로 이루어진 군에서 선택된 큰 불활성 잔기에 공유 결합되어 있는 것이며, IL-15Rα-서브유닛에 결합할 수 있고 IL-15 수용체 복합체의 β- 또는 γ-서브유닛을 통한 시그날 형질도입은 할 수 없는 콘쥬게이트된 IL-15 분자로 이루어진 군에서 선택된 길항제.
  3. 제2항에 있어서, 아미노산 잔기 Asp56또는 Gln156중 적어도 하나가 삭제되거나 또는 다른 천연 아미노산 잔기로 치환된 IL-15의 뮤테인인 길항제.
  4. 제3항에 있어서, Asp56및 Gln156중 어느 하나 또는 둘다가 각각 세린 또는 시스테인으로 치환된 길항제.
  5. 제4항에 있어서, Asp56이 세린 또는 시스테인으로 치환된 길항제.
  6. 제4항에 있어서, Gln156이 세린 또는 시스테인으로 치환된 길항제.
  7. 제2항에 있어서, IL-15 수용체 복합체의 β- 또는 γ-서브유닛을 통한 IL-15의 시그날 형질도입을 방지하는 IL-15에 대한 모노클로날 항체인 길항제.
  8. 제7항에 있어서, ATCC 수탁 번호 을 갖는 하이브리도마로부터 얻은 모노클로날 항체인 길항제.
  9. 제7항에 있어서, M110인 길항제.
  10. 제7항에 있어서, M111인 길항제.
  11. 제7항에 있어서, M112인 길항제.
  12. 제2항에 따른 IL-15의 뮤테인을 코딩하는 단리된 핵산 서열.
  13. 제12항에 있어서, IL-15의 뮤테인이, 제거되거나 또는 다른 천연 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 잔기 Asp56또는 Gln156중 적어도 하나를 갖는 단리된 핵산.
  14. 제13항에 있어서, Asp56및 Gln156중 어느 하나 또는 둘다가 각각 세린 또는 시스테인으로 치환된 단리된 핵산.
  15. 제13항에 있어서, Asp56이 세린 또는 시스테인으로 치환된 단리된 핵산.
  16. 제13항에 있어서, Gln156이 세린 또는 시스테인으로 치환된 단리된 핵산.
  17. 제12항에 따른 핵산을 포함하는 재조합 벡터.
  18. 제17항에 따른 벡터로 형질전환 또는 형질이입된 숙주 세포.
  19. 제2항에 따른 IL-15 뮤테인을 발현하게 하는 배양 조건하에서 제18항에 따른 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하는, 제2항에 따른 IL-15 뮤테인의 제조 방법.
  20. IL-15 활성 억제 유효량의 제1항에 따른 길항제, 및 제약학상 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는 제약 조성물.
  21. 제20항에 있어서, 길항제가 IL-15Rα-서브유닛에 결합할 수 있고 IL-15 수용체 복합체의 β- 또는 γ-서브유닛을 통한 시그날 형질도입은 할 수 없는 천연 IL-15의 뮤테인인 제약 조성물.
  22. 제20항에 있어서, 길항제가 IL-15 수용체 복합체의 β- 또는 γ-서브유닛을 통한 IL-15의 시그날 형질도입을 방지하는 IL-15에 대한 모노클로날 항체인 제약 조성물.
  23. 제20항에 있어서, 길항제가 PEG에 공유 결합되어 있고, IL-15Rα-서브유닛에 결합할 수 있고 IL-15 수용체 복합체의 β- 또는 γ-서브유닛을 통한 시그날 형질도입은 할 수 없는 IL-15 분자인 제약 조성물.
  24. 제20항에 따른 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 이식편 대 숙주 질병의 징후를 갖는 환자의 치료 방법.
  25. 제20항에 따른 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 이인자형이식편 생존의 연장을 필요로 하는 환자의 이인자형이식편 생존을 연장시키는 방법.
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