FI120497B - Interleukiini-15-antagonisteja - Google Patents

Interleukiini-15-antagonisteja Download PDF

Info

Publication number
FI120497B
FI120497B FI973361A FI973361A FI120497B FI 120497 B FI120497 B FI 120497B FI 973361 A FI973361 A FI 973361A FI 973361 A FI973361 A FI 973361A FI 120497 B FI120497 B FI 120497B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
seq
peg
mutein
sequence
cells
Prior art date
Application number
FI973361A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI973361A0 (fi
FI973361A (fi
Inventor
Kenneth H Grabstein
Dean K Pettit
Raymond J Paxton
Original Assignee
Immunex Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=23550114&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=FI120497(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Immunex Corp filed Critical Immunex Corp
Publication of FI973361A0 publication Critical patent/FI973361A0/fi
Publication of FI973361A publication Critical patent/FI973361A/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI120497B publication Critical patent/FI120497B/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/244—Interleukins [IL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/48—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones
    • A61P5/50—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones for increasing or potentiating the activity of insulin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/5443—IL-15
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)

Description

In terleukiini-15-an tagoni s t©j a
Keksinnön aihepiiri
Esillä oleva keksintö koskee yleisesti antagoniste-5 ja nisäkkään epiteelistä peräisin olevalle T-solutekijäpo-lypeptidille, jota kutsutaan tässä interleukiini-15:ksi ("IL-IS"). Se koskee tarkemmin ottaen IL~15:n muteiineja, IL-15- ja IL-15-konjugaatti-vastaisia monoklonaalisia vasta-aineita, jotka kummatkin merkittävästi laskevat IL-15:n 10 kykyä stimuloida T-lymfosyyttien lisääntymistä in vitro CTLL-määrityksessä. Samoin keksintöön sisältyy menetelmiä sellaisten eri sairaustilojen hoitamiseksi nisäkkäissä, joissa lasku IL-15-aktiivisuudessa on toivottava.
Keksinnön tausta 15 Interleukiini-15 on tunnettu T-solukasvutekijä, jo ka voi tukea IL-2-riippuvaisen solulinjan CTLL-2 lisääntymistä. IL-15:n raportoivat ensiksi Grabstein et ai. julkaisussa Science 264 (1994) 965 erittyvänä sytokiininä, joka käsittää 162 aminohapon prekursoripolypeptidin, joka sisäl-20 tää 48 aminohapon johtosekvenssin, ja johtaa 114 aminohapon kypsään proteiiniin. Grabstein et ai. kuvaavat myös 162 aminohapon prekursoria koodittavan täysimittaisen ihmis-cDNA:n kloonaamista, joka sisältää 316 ep:n 5'-ei~kooditta-van alueen ja 486 ep:n avoimen lukukehyksen (tai 489 ep:n 25 avoimen lukukehyksen, jos 3 ep:n stop-kodoni luetaan mukaan) ja 400 ep:n 3'-ei-koodittavan alueen.
IL-15:llä ja IL-2:lla on yhteisenä monia ominaisuuksia. Näitä ominaisuuksia ovat ihmisen ja hiiren T-so-lujen lisääntyminen ja aktivaatio, lymfokiiniaktivoidun 30 tappajasolu- (LAK) aktiivisuuden, luonnollisen tappajasolu-(NK) aktiivisuuden ja sytotoksisen T-lymfosyytti- (CTL) aktiivisuuden indusointi sekä B-solujen lisääntymisen ja dif-ferentiaation kostimulaatio.
Lisäksi IL-15 ja IL-2 ovat rakenteellisesti homolo-35 gisia molekyylejä, jotka kykenevät sitoutumaan ainakin kolmeen erilliseen reseptorialayksikköön T-solumembraanipin- 2 nalla. IL-2-reseptorit sisältävät ainakin 3 alayksikköä, a, β ja y [Toshikazu et ai., Science 257 (1992) 379]. Sekä IL-15:lle että IL-2:lle on yhteistä sitoutuminen yleiseen β-γ-alayksikkökompleksiin, kun taas sekä IL-15 että IL-2 5 sitoutuvat spesifiseen α-reseptorialayksikköön (IL-15Ra ja vastaavasti IL-2Ra). IL-15Ra löydettiin vastikään, ja se muodostaa avoinna olevan hakemuksen sarjanumero 08/300 903 kohteen. Vasta-aineilla, jotka kohdistuvat vastaan IL-2-re-septorin α-ketjua (anti-IL-2Ra), ei ole mitään vaikutusta 10 IL-15:n sitoutumiseen (Grabstein et ai., supra). Kuitenkin IL-2-reseptorin β-alayksikköä vastaan kohdistuvat vasta-aineet, eli TU27, TU11 tai Miköl, kykenevät salpaamaan IL-15: n aktiivisuuden, mikä viittaa siihen, että IL-15 käyttää β-alayksikköä signallointiin. Vastaavasti IL-2-reseptorin 15 γ-ketjua tarvitaan signaalin siirtoon [Giri et ai., EMBO J. 13 (1994) 2822]. IL-15-reseptorikompleksin β- ja γ-ala- yksiköiden yhdistelmä sitoi, mutta kumpikaan alayksikkö yksinään ei sitonut, IL-15:n transfektoiduilla COS-soluilla.
T-solut välittävät tiettyjä sairaustiloja ja fysio-20 logisia tiloja. Tällaisia sairauksia ovat elinsiirrehyljin-tä, siirre-isäntäsairaus, autoimmuunisairaus, nivelreuma, tulehduksellinen suolisairaus, dermatologiset häiriöt, in-suliiniriippuvainen sokeritauti, silmän häiriöt ja idio-paattinen nefroottinen oireyhtymä/idiopaattinen membraa-25 ninefropatia. Itse asiassa siirrehyljintä ja siirre- isäntäsairaus (GVHD) on yhdistetty lisääntyneeseen IL-2-re-septori-iImentymiseen. Vasteena vieraan kudosyhteensopivuu-den antigeeneille aktivoituneet T-solut vaikuttavat ilmentävän IL-2-reseptorikompleksin. Erilaisia terapioita on eh-30 dotettu ja tutkittu. Esimerkiksi Tinubu et ai, [J. Immunol.
153 (1994) 4330] raportoivat, että monoklonaalinen anti-IL- 2RB~vasta-aine, Mi kβ1, pidentää kädellisen sydänsiirteen elinaikaa. Akuutin siirrehyljinnän yhteydessä tapahtuu lisäys IL-2RB-alayksikköilmentymisessä CD4:n ja CD8:n ilmen-35 tävillä soluilla, mikä viittaa siihen, että IL-2RB- alayksikköilmentyminen vaikuttaa lisääntyvän alloreaktiivi- 3 silla T-soluilla. Katso esimerkiksi Niguma et ai., Transplantation 52 (1991} 296.
Kuitenkaan ennen esillä olevaa keksintöä ei ole ollut terapioita, jotka keskittyisivät IL-15-ligandi-resepto-5 rivuorovaikutukseen keinona GVHD:n hoitamiseksi tai siirteen eloonjäännin edistämiseksi.
Yhteenveto keksinnöstä
Keksintö koskee IL-15-antagonisteja ja menetelmää näiden antagonistien käyttämiseksi ihmisen sairauksien hoi-10 toon. Erityisesti tällaisia hoitoja ovat siirteen eloon jäännin edistäminen nisäkkäissä ja GVHD:n hoito. IL-15-antagonistit ovat tehokkaita estämään IL-15:tä siirtämästä signaalia soluun IL-15-reseptorikompleksin joko β- tai γ-alayksikön välityksellä vastustaen siten IL-15:n biolo-15 gista aktiivisuutta. Tietyt keksinnön mukaisista antagonisteista voivat häiritä IL-15:n sitoutumista IL-15-resepto-rikompleksin β- tai γ-alayksikköön häiritsemättä oleellisesti IL-15:n sitoutumista IL-15Ra:aan.
Keksinnön mukaisia antagonisteja ovat kypsän, tai 20 natiivin, IL-15:n muteiinit, joissa IL-15:tä on mutageni- soitu yhdessä tai useammassa aminohappotähteessä tai yhdellä tai useammalla alueella, jotka saattavat esittää osaa sitoutumisessa IL-15-reseptorikompleksin β- tai γ-alayksikköön. Tällaiset muteiinit estävät IL-15:tä siirtämästä 25 signaalia soluihin IL-15-reseptorikompleksin joko β- tai γ-alayksikön välityksellä ylläpitäen kuitenkin IL-I5:n korkean affiniteetin IL~15Ra:n suhteen. Tyypillisesti tällaisia muteiineja luodaan lisäyksillä, deleetioilla tai substituutioilla avainasemissa, esimerkiksi vastaavasti apinan 30 ja ihmisen IL-15:n Asp56 tai Gin156 kuten esitetään sekvensseissä tunnusnumerot 1 ja 2. Uskotaan, että Asp56 vaikuttaa sitoutumiseen IL-15~reseptorikompleksin β-alayksikköön ja että Gin156 vaikuttaa sitoutumiseen sen γ-alayksikköön.
Keksintö koskee patenttivaatimuksen 1 mukaista in-35 terleukiini-15-aktiivisuuden antagonistia ja patenttivaatimuksen 6 mukaista eristettyä nukleiinihapposekvenssiä. Kek- 4 sinko koskee myös patenttivaatimuksen 11 mukaista yhdistel-mä-DNA-vektoria, patenttivaatimuksen 12 mukaista isäntäso-lua ja patenttivaatimuksen 13 mukaista menetelmää IL-15-muteiinin tuottamiseksi.
5 Lisäksi keksintöön liittyy monoklonaalisia vasta- aineita, jotka immuunireagoivat kypsän IL-I5:n kanssa ja estävät signaalin siirron IL-15-reseptorikompleksiin.
Samoin keksintöön liittyy modifioituja IL-15-mole-kyylejä, joilla on tallella kyky sitoutua IL-15Ra:aan, mut-10 ta joiden affiniteetti IL-15-reseptorikompleksin B- ja/tai γ-alayksikköjen suhteen on oleellisesti laskenut tai hävinnyt. Modifioidut IL-15-molekyylit voivat olla mitä tahansa muotoa kunhan modifikaatiot tehdään siten, että sitoutumista häiritään tai se estetään tavallisesti modifioimalla 15 kohteen sitoutumiskohtaa tai sen ympäristöä. Esimerkkejä tällaisista modifioiduista IL-15-molekyyleistä ovat kypsä IL-15 tai IL-15-muteiini, joka on kovalenttisesti konjugoi-tu yhteen tai useampaan kemialliseen ryhmään, jotka häiritsevät steerisesti IL-lS/IL-15-reseptori-sitoutumista. Esi-20 merkiksi kypsä IL-15 voi sisältää kohtaspesifisen glykosy-laation tai se voi olla kovalenttisesti sidottu ryhmiin kuten polyetyleeniglykoli (PEG), monometoksi-PEG (mPEG), deks-traani, polyvinyylipyrrolidoni (PVP), polyvinyylialkoholi (PVA), polyaminohapot kuten poly-L-lysiini tai polyhisti-25 diini, albumiini, gelatiini IL-15-molekyylin spesifisissä kohdissa, jotka ryhmät voivat häiritä IL-15:n sitoutumista IL-15-reseptorikompleksin β- tai γ-ketjuihin, jolloin kuitenkin IL-15:n korkea affiniteetti IL-15Ra:n suhteen säilytetään. Hyödyntämällä ryhmän steerinen esteominaisuuksia 30 sitoutumista spesifisiin reseptorialayksiköihin voidaan vastustaa. PEG-ketjujen konjugoinnin proteiineihin kuten IL-2, GM-CSF, asparaginaasi, immunoglobuliinit, hemoglobiini ja muut muitakin etuja tunnetaan alalla. Esimerkiksi tiedetään, että PEG pidentää puoliintumisaikoja verenkierrossa in vivo [katso Delgado et ai., Crit. Rev. Ther. Drug Carr. Syst. 9 (1992) 249], parantaa liukoisuutta [katso Katre et 5 ai., Proc. Natl. Äcad, Sei. 84 (1987) 1487] ja laskee immu-nogeenisyyttä [katso Katre, N.V., Immunol. 144 (1990) 209], Keksintö koskee myös näiden antagonistien käyttöä menetelmässä sairauden tai tilan hoitamiseksi, jossa IL-15-5 aktiivisuuden T-soluilla laskeminen on toivottavaa. Tällai sia sairauksia ovat elinsiirrehyljintä, siirre-isäntäsai-raus, autoimmuunisairaus, nivelreuma, tulehduksellinen suolisairaus, dermatologiset häiriöt, insuliiniriippuvainen sokeritauti, silmän häiriöt ja idiopaattinen nefroottinen 10 oireyhtymä/idiopaattinen membraaninefropatia. Erityisesti siirrehyljinnässä IL-15-aktiivisuus voi johtaa isännän immuunivasteeseen siirrettä vastaan ja lopulta hylkimiseen. Vastaavasti GVHD:ssä siirre, tyypillisesti luuydinsiirre, tuottaa immuunivasteen isäntää vastaan. Tällaisten aktiivi-15 suuksien suppressio keksinnön mukaisilla IL-15-antagonis- teilla saattaa olla eduksi siirteen eloonjäännin edistämiseksi ja eloonjääntiajan pidentämiseksi sekä GVHD:n hoitamiseksi .
Eri tutkijat ovat raportoineet siirteen eloonjään-20 tiajan pidentymisestä käytettyään vasta-aineita kuten anti- TAC, monoklonaalinen anti-ihmis-IL-2a-reseptorivasta-aine. Katso Reed et ai., Transplantation 47 (1989) 55 - 59, jossa julkaisussa anti-TAC:n osoitetaan edesauttaneen kädellisen munuaissiirteen siirtämistä. Niinikään Brown et ai., Proc. 25 Natl. Acad. Sei. 88 (1991) 2663, kuvaavat humanisoidun an- ti~TAC:n käyttöä kädellisen sydänsiirteen eloonjääntiajän pidentämiseksi. Kirkman et ai., Transplantation 51 (1991) 107, kuvaavat myös kliinistä koetta, jossa käytetään anti-TAC:tä siirteen varhaishyljinnän estämiseksi. Koska IL-30 15:llä on monia samankaltaisia biologisia aktiivisuuksia kuin IL-2:lla, jolloin sillä ja IL-2:lla on itse asiassa tiettyjä yhteisiä reseptorialayksiköitä, IL-15:n tuhoisaan aktiivisuuteen sairaustiloissa puuttumisella on selvää terapeuttista potentiaalia.
6
Yksityiskohtainen kuvaus keksinnöstä
Keksintö koskee IL-15-aktiivisuuden antagonistia, joka häiritsee IL-15:n signaalin siirtoa sen reseptorikompleksin välityksellä. Erityisesti keksinnön mukaiset IL-15-5 antagonistit valitaan ryhmästä, jonka muodostavat (a) kypsän, tai natiivin, IL-15:n muteiini, joka kykenee sitoutumaan XL-15-reseptorin α-alayksikköön ja joka ei kykene siirtämään signaalia IL-15-reseptorikompleksin β- ja/tai γ-alayksikön välityksellä; (b) IL-15-vastainen monoklonaali-10 nen vasta-aine, joka estää IL-15:n suorittamasta signaalin siirtoa IL-15-reseptorikompleksin β- ja/tai γ-alayksikön välityksellä; ja (c) IL-15-molekyyli, joka on kovalentti-sesti sidottu kemialliseen ryhmään, joka häiritsee IL-15:n kykyä suorittaa signaalin siirto IL-15-reseptorikompleksin 15 joko β- tai γ-alayksikön välityksellä mutta ei häiritse IL-15:n sitoutumista IL-15Ra:aan. Samoin esillä olevan keksinnön suojapiiriin kuuluvat edellä kuvattuja muteiineja koo-dittavat DNA-molekyylit.
Tässä käytettynä ilmaisuilla "yhdistelmä-DNA-tekno-20 logia" tai "yhdistelmä-DNÄ-teknisesti" tarkoitetaan tekniikoita ja menetelmiä spesifisten polypeptidien tuottamiseksi mikrobi- (esim. bakteeri-, hyönteis- tai hiiva-) tai nisä-kässoluista tai vastaavista organismeista (esim. siirto-geeniset organismit), jotka on transformoitu tai transfek-25 toitu kloonatuilla tai synteettisillä DNA-sekvensseillä he-terologisten peptidien biosynteesin saamiseksi. Natiiveihin glykosylaatiokuvioihin päästään vain nisäkässoluilmentämis-systeemeillä. Hiivat tuottavat tyypillisen glykosylaatioku-vion. Prokaryoottisella soluilmentämisellä (esim. coli) 30 saadaan yleensä polypeptidejä, jotka eivät ole glykosyloi-tuja.
"Nukleotidisekvenssi" viittaa polynukleotidiin erillisen fragmentin muodossa tai suuremman DNA-rakenteen rakenneosana, joka on saatu DNA:sta tai RNArsta, joka on 35 eristetty ainakin kerran oleellisesti puhtaassa muodossa (eli vapaana kontaminoivasta endogeenisestä materiaalista) 7 ja määränä tai pitoisuutena, joka mahdollistaa sen rakenne-osanukleotidisekvenssien identifioinnin, manipuloinnin ja talteenoton tavanomaisilla biokemiallisilla menetelmillä (jollaisia kuvataan julkaisussa Sambrook et ai., "Molecular 5 Cloning: A Laboratory Manual", 2. painos, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Tällaiset sekvenssit annetaan edullisesti käyttöön avoimen lukukehyksen muodossa, jota eivät katkaise sisäiset ei käännetyt sekvenssit, tai intronit, joita tyypillisesti esiintyy eu-10 karyoottisissa geeneissä. Ei-käännettyjä DNA-sekvenssejä voi esiintyä 5' tai 3' avoimesta lukukehyksestä silloin, kun nämä eivät häiritse kooditusalueiden manipulaatiota tai ilmentämistä.
"Yhdistelmä-DNA-ilmentämisvektori" viittaa plasmi-15 diin, joka käsittää transkriptionaalisen yksikön, joka koostuu (1) yhdestä tai useammasta geneettisestä elementistä jolla/joilla on säätelevä rooli geeni-ilmentyrnisessä, esimerkiksi promoottorit tai tehostajat, (2) rakenne- tai kooditussekvenssistä, joka koodittaa IL-15:tä tai IL-15-20 muteiinia, ja (3) tarkoituksenmukaisista transkription ja translaation käynnistyssekvensseistä, ja haluttaessa pää-tössekvensseistä. Edustavia esimerkkejä erilaisista sääte-lyelementeistä, joita voidaan käyttää, käsitellään alla (katso yhdistelmä-DNA-tekniikoita käsittelevä osuus). Hii-25 vailmentämissysteemeissä käytettäviksi tarkoitetut rakenne- elementit sisältävät edullisesti johtosekvenssin, joka mahdollistaa käännetyn polypeptidin erityksen solun ulkopuolelle hiivaisäntäsolun toimesta. Vaihtoehtoisesti bakteeri-ilmentämissysteemissä yhdistelmä-DNA-polypeptidi voi sisäl-30 tää N-terminaalisen metioniinitähteen. N-terminaalinen me-tioniinitähde voidaan sittemmin pilkkoa ilmennetystä yhdis-telmä-DNA-polypeptidistä jatkopuhdistukseen sopivan tuotteen saamiseksi.
"Yhdistelmä-DNA-mikrobi-ilmentämissysteemillä" tar-35 koitetaan sopivien isäntämikro-organismien oleellisesti ho mogeenistä mono-viljelmää, esimerkiksi bakteeri- kuten EL_ 8 coli -soluviljelmää tai hiiva- kuten cerevisiae -soluviljelmää, jossa kromosomi-DNA:hän on stabiilisti integroitu yhdistelmä-DNÄ-transkriptioyksikkö tai jossa yh~ distelmä-DNA-transkriptioyksikkö on "asukas"~plasmidin ra-5 kenneosana. Yleensä yhdistelmä-DNA-mikrobi~ilmentämissys~ teemin muodostavat solut ovat yhden ainoan transformoidun kantasolun jälkeläisiä. Yhdistelmä-DNA-mikrobi-ilmentämis-systeemit ilmentävät heterologisia polypeptidejä indusoitaessa säätelyelementit, jotka on kytketty ilmennettävään ra-10 kennenukleotidisekvenssiin.
"IL-15-muteiinilla" tai "IL-15:n muteiineilla" tarkoitetaan kypsiä, tai natiiveja apina-IL-15-molekyylejä, joiden sekvenssi on aminohapposekvenssi 49 - 162 sekvenssistä tunnusnumero 1, tai ihmisen IL-15-molekyylejä, joiden 15 sekvenssi on aminohapposekvenssi 49 - 162 sekvenssistä tun nusnumero 2, joita on mutagenisoitu keksinnön mukaan IL-15-antagonistin tuottamiseksi. Tällaiset IL-15-muteiinit kykenevät sitoutumaan IL-15Ra-alayksikköön, eivätkä ne kykene siirtämään signaalia IL-15-reseptorikompleksin β~ ja/tai 20 γ-alayksikön välityksellä.
IL-15:n valmistus
Ihmis- tai apina-IL-15:tä voidaan saada menettelyjen mukaan, joita kuvaavat Grabstein et ai,, Science 264 (1994) 965, joka julkaisu sisällytetään tähän viitteeksi, 25 tai tavanomaisilla menettelyillä kuten polymeraasiketjure aktio (PCR). Ihmisen IL-15-cDNA talletettiin talletuslaitokseen American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD, USA 19. helmikuuta 1993, ja se sai siellä hakunumeron 69245. Tallenteelle annettiin nimeksi "141-hETF". Talletus 30 tehtiin Budapestin sopimuksen ehtojen mukaisesti.
IL-15-mutexinit Löytyy monia mahdollisia IL-15:n mutaatioita, jotka kykenevät tuottamaan antagonisteja. Tällaisia mutaatioita voidaan tehdä spesifisiin aminohappokohtiin, joiden usko-35 taan olevan vastuussa B- tai γ-alayksikkösignalloinnista; tai mutaatioita voidaan tehdä kokonaisille IL-15-alueille, 9 joiden katsotaan olevan välttämättömiä β- tai y-alayksikkö-signallointiin. Tyypillisesti mutaatioita voidaan tehdä aminohappotähteiden additioina, substituutioina tai delee-tioina. Ensisijaisesti suositaan substituutio- ja deleetio-5 muteiineja, jolloin edullisimpia ovat substituutiomuteii-nit.
Uskotaan, että Asp56 vaikuttaa sitoutumiseen IL-15-reseptorikompleksin β-alayksikköön ja että Gin156 vaikuttaa sitoutumiseen sen γ-alayksikköön. Muiden luonnollisesti 10 esiintyvien aminohappotähteiden lisääminen tai korvaaminen Asp56- ja Gln156-kohtiin tai lähelle niitä voi vaikutttaa IL-15:n sitoutumiseen IL-15-reseptorikompleksin joko β- tai γ-alayksikköön tai molempiin. Itse asiassa negatiivisesti varatun asparagiinihappotähteen poistaminen ja sen korvaa-15 minen toisella negatiivisesti varatulla tähteellä ei mahdollisesti ole yhtä tehokasta reseptorisitoutumisen salpaa-miseksi kuin olisi, mikäli asparagiinihappo korvattaisiin positiivisesti varatulla aminohapolla kuten arginiini, tai ei-varatuilla tähteillä kuten seriini tai kysteiini.
20 IL-15-muteiinin yhdistelmä-DNA-tuotanto edellyttää ensiksi IL-15-muteiinia koodattavan DNA-kloonin (eli cDNA:n) eristämistä. cDNA-klooneja saadaan primaarisoluista tai so-lulinjoista, jotka ilmentävät nisäkkään IL-15-polypeptidejä. Ensin kokonaissolu-mRNA eristetään, minkä jälkeen mRNAista 25 valmistetaan cDNA-kirjasto käänteisellä kopioinilla, cDNA-klooni voidaan eristää ja identifioida käyttäen tässä annettua DNA-sekvenssi-informaatiota ristilajihybridisaatio-koettimen tai PCR-alukkeen suunnittelemiseksi edellä kuvatun mukaisesti. Tällaisten cDNA-kloonien nukleiinihappose-30 kvenssi on 1 - 486 sekvensseissä tunnusnumerot 1 ja 2.
Eristetty cDNA on edullisesti avoimen lukukehyksen muodossa, jota eivät katkaise sisäiset ei käännetyt sekvenssit, tai intronit. Genomi-DNA:ta, joka sisältää nisäkkään IL-15-polypeptidejä koodittavat oleelliset nukleoti-35 disekvenssit, voidaan myös käyttää kooditussekvenssien ra kentamiseksi käyttökelpoisen geneettisen informaation läh- 10 teenä. Eristettyä cDNArta voidaan mutagenisoida alalla tunnettuja tekniikoita käyttäen IL-15-antagonistiaktiivisuuden saamiseksi. Alla esimerkissä 1 kuvataan spesifistä menetelmää, jota voidaan käyttää IL-15-muteiinien valmistamiseksi.
5 Keksintö kattaa ekvivalenttiset DNA-rakenteet, jot ka koodattavat, aminohappotähteiden tai -sekvenssien erilaisia additioita tai substituutioita tai aktiivisuuden kannalta ei välttämättömien terminaalisten tai sisäisten tähteiden tai sekvenssien deleetioita. Esimerkiksi IL-15:n 10 N-glykosylaatiokohtia voidaan modifioida glykosylaation sulkemiseksi pois, jolloin mahdollistuu "riisutun" hiili-hydraattianalogin ilmentyminen nisäkäs- tai hiivailmentä-misysteemeissä. N-glykosylaatiokohdille eukaryoottisissa po-lypeptideissä on karakteristinen aminohappotripletti Asn-X-15 Y, jossa X on mikä tahansa aminohappo paitsi Pro ja Y on Ser tai Thr. Apinan IL-15-proteiini käsittää kaksi tällaista triplettiä, sekvenssin tunnusnumero 1 mukaisissa aminohapoissa 127 - 129 ja 160 - 162. Ihmisen IL-15-proteiini käsittää kolme tällaista triplettiä, sekvenssin tunnusnume-20 ro 2 mukaisissa aminohapoissa 119 - 121, 127 - 129 ja 160 - 162. Näitä triplettejä koodittavan nukleotidisekvens-sin sopivat substituutiot, additiot tai deleetiot johtavat hiilihydraattitähteiden kiinnittymisen Asn-sivuketjuun estymiseen. Yhden nukleotidin muutos, joka valitaan siten, 25 että Asn tulee korvatuksi jollain toisella aminohapolla esimerkiksi, riittää inaktivoimaan N-glykosylaatiokohdan. Tunnettuja menettelyjä N~glykosylaatiokohtien inaktivoimi-seksi ovat menettelyt, joita kuvataan US-patenttijulkaisussa 5 071 972 ja EP-julkaisussa 276 846, jotka julkaisut 30 sisällytetään tähän viitteiksi.
Yhdistelmä-DNA-ilmentämisvektoreihin kuuluvat IL-15-muteiinia koodittavat synteettiset tai cDNA-peräiset DNA-fragmentit. IL-15-muteiinia koodittava DNA on operatiivisesti kytketty sopivaan transkription tai translaation sää-35 tely- tai rakennenukleotidisekvenssiin, joka on saatu nisäkäs-, mikrobi-, virus- tai hyönteisgeeneistä. Esimerkkejä 11 säätelysekvensseistä ovat esimerkiksi geenisekvenssi, jolla on säätelevä rooli geeni-ilmentymisessä (esim. transkription promoottorit tai tehostajat), mahdollinen operaattorise-kvenssi transkription kontrolloimiseksi, sopivia mRNA:n ri-5 bosomisitoutumiskohtia koodittava sekvenssi ja sopivat sekvenssit, jotka kontrolloivat transkription ja translaation käynnistymistä ja päättämistä. Nukleotidisekvenssit on operatiivisesti kytketty, kun säätelysekvenssi on funktionaalisessa suhteessa rakennegeeniin. Esimerkiksi signaalipep-10 tidin DNA-sekvenssi (erityksen johtosekvenssi) voi olla operatiivisesti kytketty IL-15-muteiinin rakennegeeni-DNA-sekvenssiin, jos signaalipeptidi ilmentyy osana prekurso-riaminohapposekvenssiä ja osallistuu IL~15-muteiinin eritykseen. Edelleen promoottorinukleotidisekvenssi on opera-15 tiivisesti kytketty kooditussekvenssiin (esim. rakennegee- ni-DNA), jos promoottorinukleotidisekvenssi kontrolloi ra-kennegeeninukleotidisekvenssin transkriptiota. Samoin edelleen ribosomisitoutumiskohta voi olla operatiivisesti kytketty rakennegeeninukleotidikooditussekvenssiin (esim. IL-15-20 muteiini), jos ribosomisitoutumiskohta on sijoitettu vektoriin translaation edistämiseksi.
Sopivia isäntäsoluja IL-15-muteiinin ilmentämiseksi ovat prokaryoottiset, hiiva- tai korkeammat eukaryoottiset solut sopivien promoottorien kontrollissa. Prokaryootteja 25 ovat gram-positiiviset organismit, esimerkiksi Eb_ coli tai basillit. Sopivia prokaryoottisia isäntäsoluja transformoitaviksi ovat esimerkiksi coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium ja erilaiset muut lajit suvuista Pseudomonas, Streptomyces ja Staphylococcus. Kuten alla yksityis-30 kohtaisesti esitetään, esimerkkejä sopivista isäntäsoluista löytyy myös hiivoista kuten cerevisiae, nisäkässolulin-joista kuten kiinalaisen hamsterin munasarjasolut (CHO), tai hyönteissoluista. Soluvapaitakin translaatiosysteemejä voitaisiin käyttää IL-15-muteiinin tuottamiseksi, jolloin 35 käytettäisiin tässä julkistetuista DNA-rakenteista saatuja RNA-sekvenssejä. Sopivia kloonaus- tai ilmentämisvektoreita 12 käytettäviksi bakteeri-, hyönteis-, hiiva- ja nisäkässo-luisäntien kanssa kuvataan esimerkiksi julkaisussa Pouwels et ai., "Cloning Vectors: A Laboratory Manual", Elsevier,
New York, 1985.
5 Kun IL-15-muteiini ilmennetään hiivaisäntäsolussa, IL-15-muteiinia koodittavaan nukleotidisekvenssiin (esim. rakennegeeni) voi sisältyä johtosekvenssi. Johtosekvenssi saattaa parantaa käännetyn polypeptidin eritystä hiivaisän-täsolun ulkopuolelle.
10 IL-15-muteiineja voidaan ilmentää hiivaisäntäso- luissa, edullisesti suvusta Saccharomyces (esim. £Κ_ cere-visiae). Muitakin hiivasukuja kuten Pichia tai Kluyveromy-ces voidaan käyttää. Hiivavektorit sisältävät usein repli-kaatioalkukohtasekvenssin 2p-hiivaplasmidista, itsenäisesti 15 replikoituvan sekvenssin (ARS), promoottorialueen, poly- adenylaatiosekvenssit ja sekvenssit transkription päättämiseksi. Edullisesti hiviavektorit sisältävät replikaatioal-kukohtasekvenssin ja valikointimerkin. Sopivia promootto-risekvenssejä hiivavektoreille ovat promoottorit seuraavil-20 le: metallotioneiini, 3-fosfoglyseraattikinaasi [Hitzeman et ai., J. Biol. Chem. 255 (1980) 2073] tai muut glykolyyt-tiset entsyymit [hess et ai., J. Adv. Enzyme Res. 7 (1968) 149; ja Holland et ai., Biochem. 17 (1978) 4900], kuten enolaasi, glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasi, hekso-25 kinaasi, pyruvaattidekarboksylaasi, fosfofruktokinaasi, glukoosi-6-fosfaatti-isomeraasi, 3-fosfoglyseraattimutaasi, pyruvaattikinaasi, trioosifosfaatti-isomeraasi, fosfoglu-koosiisomeraasi ja glukokinaasi. Muita sopivia vektoreita ja promoottoreita hiivailmennyksessä käytettäviksi kuvaa 30 edelleen Hitzeman, EP-hakemusjulkaisu 73 657.
Hiivavektoreita voidaan koota esimerkiksi käyttäen DNA-sekvenssejä pBR322:sta valikointiin ja replikaatioon E, colissa (Ampr-geeni ja replikaatioalkukohta). Muita hii-vasekvenssejä, joita voidaan sisällyttää hiivailmentämisra-35 kenteeseen, ovat glukoosin repressoima ADH2-promoottori ja α-tekijäeritysjohtaja. ADH2-promoottoria ovat kuvanneet 13
Russell et ai. [J. Biol. Chem. 258 (1982) 2674] ja Beier et ai. [Nature 300 (1982) 724]. Hiivan α-tekijäjohtosekvenssi ohjaa heterologisten polypeptidien eritystä, α-tekijäjohtosekvenssi insertoidaan monasti promoottori- ja rakenne-5 geenisekvenssien väliin. Katso esim. Kurjan et ai., Cell 30 (1982) 933; ja Bitter et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81 (1984) 5330. Johtosekvenssiä voidaan modifioida sen 3’-pään läheisyydessä yhden tai useamman restriktiokohdan mukaan sisällyttämiseksi. Tämä helpottaa johtosekvenssin fuusiota 10 rakennegeeniin.
Protokollat hiivojen transformoimiseksi ovat alan ammattilaisille tuttuja. Yhtä tällaista protokollaa kuvaavat Hinnen et ai., Proc. Natl. Äcad. Sei. USA 75 (1978) 1929.
Hinnenin et ai. protokollassa valitaan Trp+-transformantit 15 selektiivisessä kasvualustassa, joka koostuu 0,67 %:sta hiivatyppipohjaa, 0,5 %:sta cas-aminohappoja, 2 %:sta glukoosia, pitoisuuksista 10 mg/ml adeniinia ja 20 mg/ml urasiilia.
ADH2-promoottorisekvenssin sisältävillä vektoreilla 20 transfromoituja hiivaisäntäsoluja voidaan kasvattaa ilmen tymisen indusoimiseksi "rikkaassa" eli runsaasti ravinteita sisältävässä kasvualustassa. Esimerkki rikkaasta kasvualustasta on kasvualusta, joka sisältää 1 %:n hiivauutetta, 2 % peptonia ja 1 % glukoosia ja jota on täydennetty pitoisuuk-25 silla 80 mg/ml adeniinia ja 80 mg/ml urasiilia. ADH2-pro- moottorin repressio menetetään glukoosin loppuessa kasvualustasta .
Vaihtoehtoisesti prokaryoottisessa isäntäsolussa, kuten Ε^_ coli, IL-15-muteiini voi sisältää N-terminaalisen 30 metioniinitähteen yhdistelmä-DNA-polypeptidin ilmentämisen helpottamiseksi prokaryoottisessa isäntäsolussa. N-termi-naalinen Met voidaan lohkaista ilmennetystä yhdistelmä-DNA-IL-15-muteiinista.
Yhdistelmä-DNA-ilmentämisvektorit, jotka käsittävät 35 yhdistelmä-DNA-IL-15-muteiinirakennegeenin nukleotidisekvens- 14 sin, transfektoidaan tai transformoidaan sopivaan isäntämik-ro-organismiin tai nisäkässolulinjaan.
Prokaryoottisiin isäntäsoluihin transfektoidut il™ mentämisvektorit käsittävät yleensä yhden tai useamman, fe-5 notyypin suhteen valikoinnin mahdollistavan merkin. Feno-tyyppivalikointimerkki on esimerkiksi geeni, joka koodittaa proteiineja, jotka tuottavat antibioottiresistenssin tai jotka täyttävät autotrofisen vaatimuksen, ja isännän tunnistaman replikaatioalkukohdan, jotta monistaminen isännäs-10 sä olisi mahdollista. Muut prokaryoottisille isäntäsoluille käyttökelpoiset ilmentämisvektorit sisältävät bakteerialku-perää olevan valikointimerkin saatuna kaupallisesti saatavan olevista plasmideista. Tämä valikointimerkki voi käsittää geneettisiä elementtejä kloonausvektorista pBR322 (ATCC 15 37017). pBR322 sisältää geenit ampisilliini- ja tetrasyk- liiniresistenssille suoden täten yksinkertaisen keinon transfromoitujen solujen identifioimiseksi. pBR322:n "run-ko"-osat on yhdistetty sopivaan promoottori- ja IL-15-muteiinirakennegeenisekvenssiin. Muita kaupallisesti saata-20 vana olevia vektoreita ovat esimerkiksi pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Ruotsi) ja pGEMl (Promega Biotec, Madison, WI, USA).
Promoottorisekvenssejä käytetään yleisesti yhdis-telmä-DNA-prokaryootti-isäntäsoluilmentämisvektoreille. Ta-25 vallisia promoottorisekvenssejä ovat β-laktamaasi- (pe-nisillinaasi) laktoosipromoottorisysteemi [Chang et ai., Nature 275 (1978) 615; ja Goeddel et ai., Nature 281 (1979) 544], tryptofaani- (trp) promoottorisysteemi [Goeddel et ai., Nucl. Acids Res. £ϊ (1980) 4057; ja EPÄ 36 776] ja tac-30 promoottori (Sambrook et ai., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989). Erityisen edullisessa prokaryoottisessa isäntäsoluilmentämissys-teemissä käytetään lambda-fagin Ρι,-promoottori- ja lämpöla-biilia cl857ts-repressorisekvenssiä. Plasmidivektoreita, 35 joita on saatavana talletuslaitokselta American Type Culture Collection ja jotka sisältävät lambda-PL-promoottori- 15 johdannaisia, ovat plasmidit pHUB2 [olemassa coli - kannassa JMB9 (ATCC 37092] ja pPLc28 [olemassa EL_ coli RR1:ssä (ATCC 53082].
Myös nisäkäs- tai hyönteisisäntäsoluviljelmäsystee-5 mejä voitaisiin käyttää yhdistelmä-DNA-IL-15-muteiinien ilmentämiseksi. Esimerkkejä sopivista nisäkäsisäntäsolulin-joista ovat apinan munuaissolujen COS-7-solulinjat [Glutz-man et ah, Cell 23 (1981) 175; ATCC CRL 1651], L-solut, C127-solut, 3T3-solut (ATCC CCL 163), CHO-solut, HeLa-solut 10 (ATCC CCL 2) ja BHK- (ATCC CRL 10) solulinjat. Sopivat ni- säkäsilmentämisvektorit sisältävät ei kopioituja elementtejä kuten replikaatioalkukohta, promoottorisekvenssi, raken-negeeniin kytketty tehostaja, muita 5'- tai 3'-sivuavia ei kopioituja sekvenssejä, kuten ribosomisitoutumissekvenssit, 15 polyadenylaatiokohta, silmikoinnin luovuttaja- ja vastaan- ottajakohdat ja transkription päätössekvenssit.
Nisäkäsisäntäsoluilmentämisvekuoreiden transkription ja translaation kontrollisekvenssit voidaan saada virus-lähteistä. Esimerkiksi yleisesti käytettyjä nisäkässolupro-20 moottorisekvenssejä ja tehostajasekvenssejä saadaan poly- omaviruksesta, adenoviruksesta 2, apinaviruksesta 40 (SV40) ja ihmisen sytomegaloviruksesta. SV40-virusgenomista saatuja DNA-sekvenssejä, esimerkiksi SV40:n alkua, varhais- ja myöhäispromoottoria, tehostajaa, silmikointi- ja polyade-25 nylaatiokohtia voidaan käyttää niiden muiden geneettisten elementtien saamiseksi, joita tarvitaan rakennegeenise-kvenssin ilmentämiseksi nisäkäsisäntäsolussa. Viraaliset varhais- ja myöhäispromoottorit ovat erityisen edullisia, koska molemmat saadaan helposti virusgenomista fragmentti-30 na, joka saattaa sisältää myös viruksen replikaatioalkukoh-dan [Fiers et ai., Nature 273 (1978) 113]. Pienempiä tai suurempia SV40-fragmentteja voidaan niinikään käyttää edellyttäen, että mukana on se noin 250 ep:n sekvenssi, joka ulottuu Hindlll-kohdasta Sgll-kohtaan, joka sijaitsee 35 SV40:n viraalisessa replikaatioalkukohdassa.
16
Mallinisäkäsilmentämisvektoreita voidaan rakentaa kuten julkistavat Okayama ja Berg [Mol. Cell. Biol. 3 (1983) 280]. Muita käyttökelpoisia nisäkäsilmentämisvekto- reita kuvataan US-patenttihakemusjulkaisussa sarjanumero 5 07/480 694, joka jätettiin 14. helmikuuta 1990, ja US-pa- tenttijulkaisussa 5 350 683.
Yhdi s telmä-DNA- IL-15 -muteni inien puhdi s taminen
Yleensä ottaen IL-15-muteiinipolypeptidejä voidaan valmistaa viljelemällä transformoituja isäntäsoluja IL-15-10 muteiinipolypeptidien ilmentämiseksi vaadituissa viljely- olosuhteissa. Saatu ilmennetty muteiinia voidaan sitten puhdistaa viljelykasvualustasta tai solu-uutteista. IL-15-muteiinia voidaan konsentroida käyttäen kaupallisesti saatavana olevaa proteiinin konsentrointisuodatinta, esimer-15 kiksi Amicon tai Milliporen Pellicon -ultrasuodatusyksik- köä. Käyttäen tai käyttämättä konsentrointivaihetta kasvualusta voidaan panostaa puhdistusmatriisiin kuten hydrofobiseen kromatografiaväliaineeseen. Edullinen väliaine on Phenyl SepharoseR CL-4B (Pharmacia). Vaihtoehtoisesti voi-20 daan käyttää anioninvaihtohartsia, esimerkiksi matriisia tai substraattia, jossa on "riippuvia" dietyyliaminoetyyli-(DEAE) ryhmiä. Matriisit voivat olla akryyliamidia, aga-roosia, dekstraania, selluloosaa tai edustaa muuta, proteiinien puhdistuksessa tavanomaisesti käytettyä tyyppiä. 25 Vaihtoehtoisesti geelisuodatusväliainetta voidaan käyttää.
Lopuksi IL-15-muteiinien edelleen puhdistamiseksi voidaan käyttää yhtä tai useampaa käänteisfaasikor-keapainenestekromatografia- (RP-HPLC) vaihetta, joissa käytetään hydrofobista RP-HPLC-väliainetta, esim. silikagee-30 liä, jossa on riippuvia butyyli- tai muita alifaattisia ryhmiä. S Sepharose (Pharmacia) -kationinvaihtokolonnia voidaan myös käyttää lopullisena puskurivaihtovaiheena. Joitakin tai kaikkia edeltäviä tavanomaisia puhdistusvai-heita eri yhdistelminä voidaan niinikään käyttää oleelli-35 sesti homogeenisen yhdistelmä-DNA-proteiinin saamiseksi.
17
Bakteeriviljelmässä tuotettu yhdistelmä-DNA-prote-iini eristetään tavallisesti aluksi rikkomalla isäntäsolut, minkä jälkeen sentrifugoidaan, solupellettejä uutetaan, jos polypeptidi on ei-liukoinen, tai supernatanttia, mikäli po-5 lypeptidi on liukoinen, minkä jälkeen suoritetaan yksi tai useampi konsentrointi-, "salting out" -, ioninvaihto- tai kokoekskluusiokromatografiavaihe. Lopuksi RP-HPLC:tä voidaan käyttää loppupuhdistusvaiheissa. Mikrobisolut voidaan rikkoa millä tahansa kätevällä menetelmällä mukaan lukien 10 jäädytys-sulatuskierrätys, sonikointi, mekaaninen rikkomi nen tai solulyysiaineiden käyttö.
IL-15-muteiinin ilmentämiseksi eritettynä polypep-tidinä käytetään edullisesti transformoituja hiivaisän-täsoluja. Hiivaisäntäsolusta fermentoinnissa eritettyä yh-15 distelmä-DNA-polypeptidiä voidaan puhdistaa menetelmillä, jotka ovat analogisia Urdalin et ai. julkistamiin [J. Chro-matogr. 296 (1984) 171]. Urdal et ai. kuvaavat kahta perättäistä käänteisfaasi-HPLC-vaihetta yhdistelmä-DNA-ihmis-IL-2:n puhdistamiseksi preparatiivisessa HPLC-kolonnissa.
20 Edullisesti käytetään IL-15:n muteiinia, josta ai nakin yksi IL-15:n (jolloin apina-IL-15:n sekvenssi vastaa aminohappotähteitä 49 - 162 kuten esitetään sekvenssinä tunnusnumero 1 tai jolloin ihmisen IL~15:n sekvenssi vastaa aminohappotähteitä 49 - 162 kuten esitetään sekvenssinä 25 tunnusnumero 2) aminohappotähteistä Asp55 tai Gin156 on dele-toitu tai substituoitu muulla luonnollisesti esiintyvällä aminohappotähteellä. Voidaan tehdä substituutioiden ja/tai deleetioiden mikä tahansa yhdistelmä. Esimerkiksi Asp56 voidaan deletoida, kun puolestaan Gin156 substituoidaan millä 30 tahansa muulla aminohapolla, tai sekä Asp56 että Gln1Se kumpikin substituoidaan samalla tai erilaisella aminohapporyh-mällä. Edelleen Asp56 voidaan substituoida millä tahansa aminohapolla, kun taas Gin156 deletoidaan. Yleensä ottaen substituutiomuteiinit ovat edullisia, ja edullisempia ovat 35 ne (substituutiot), jotka eivät vakavasti vaikuta IL-15-molekyylin luonnolliseen laskostumiseen. Substituutiomute- 18 ixneihin sisältyvät edullisesti ne, joissa Asp56 on substi-tuoitu seriinillä tai kysteiinillä; tai joissa Gin156 on substituoitu seriinillä tai kysteiinillä, tai joissa sekä Asp56 että Gin156 kumpikin on substituoitu seriinillä tai 5 kysteiinillä. Esimerkkejä deleetiomuteiineista ovat ne, joista kypsän IL-15:n sekä Asp56 että Gin156 kumpikin on de-letoitu; joista vain Asp56 on deletoitu; tai joista vain Gin156 on deletoitu. On mahdollista, että muitakin aminohappotähteitä joko Aspi)6:n tai Gln15$:n alueella voidaan substi-10 tuoida tai deletoida säilyttäen edelleen signaalinsiirron estovaikutus IL-15-reseptorikompleksin joko β- tai γ-ala-yksikön tai molempien välityksellä. Tämän vuoksi keksintö käsittää lisäksi muteiinit, joissa aminohappotähteitä joko Asp56:n ja Gln156:n alueella on joko substituoitu tai dele-15 toitu ja joilla on IL-15-antagonistiaktiivisuutta. Tällaisia muteiineja voidaan valmistaa käyttäen tässä kuvattuja menetelmiä ja niiden IL-15-antagonistiaktiivisuus voidaan määrittää käyttäen tavanomaisia menetelmiä. Tarkemmin menetelmää, jota voidaan käyttää keksinnön mukaisten IL-15-20 muteiinien luomiseksi, kuvataan esimerkissä 1.
Konjugoituja IL-15-molekyylejä ja IL-15-nuiteiineja Tässä julkistettuja kypsiä IL-15-polypeptidejä (jolloin apina-IL-15:n sekvenssi vastaa aminohappotähteitä 49 - 162 kuten esitetään sekvenssinä tunnusnumero 1 ja jol-25 loin kypsän ihmis-IL-15:n sekvenssi vastaa aminohappotähteitä 49 - 162 kuten esitetään sekvenssinä tunnusnumero 2) sekä IL-15-muteiineja voidaan modifioida muodostamalla ko-valenttisia tai aggregatiivisia konjugaatteja muiden kemiallisten ryhmien/aineiden kanssa. Tällaisia aineita voivat 30 olla PEG, mPEG, dekstraani, PVP, PVA, polyaminohapot kuten poly-L-lysiini taipolyhistidiini, albumiini ja gelatiini IL-15-molekyylillä spesifisissä kohdissa, jotka voivat häiritä IL-15:n sitoutumista IL-15-reseptorikompleksin β- tai γ-ketjuihin samalla, kun IL-15:n korkea affiniteetti IL-35 15Ra:n suhteen säilytetään. Lisäksi IL-15 voidaan spesifisesti glykosyloida kohdissa, jotka voivat häiritä IL-15:n 19 sitoutumista IL-15-reseptorikompleksin β- tai γ-ketjuihin samalla, kun IL~15:n korkea affiniteetti IL-15Ra:n suhteen säilytetään. Edullisia ryhmiä konjugointiin ovat PEG, deks-traani ja PVP. Keksinnössä käytettäväksi edullisin on PEG, 5 jolloin PEG:n molekyylipaino on edullisesti noin 1 000 - noin 20 000. Molekyylipaino noin 5 000 on edullinen IL-15:n konjugointiin käytettäväksi, joskin sopivia olisivat myös muita painoja vastaavat PEG-molekyylit. Lukuisat eri PEG-muo-dot sopivat keksinnössä käytettäviksi. Esimerkiksi PEG:tä 10 voidaan käyttää sukkinimidyylisukkinaatti-PEG: n muodossa (SS-PEG), joka tarjoaa hydrolyyttiselle pilkkomiselle in vivo äitiin esterisidoksen, sukkinimidyylikarbonaatti-PEG (SC-PEG), joka tarjoaa uretaanisidoksen ja on stabiili hyd-rolyyttisen pilkkomisen in vivo suhteen, sukkinimidyylipro-15 pionaatti-PEG (SPA-PEG), joka antaa käyttöön in vivo stabiilin eetterisidoksen, vinyylisulfonyyli-PEG (VS-PEG) ja maleimidi-PEG (Mal-PEG), joita kaikkia on kaupallisesti saatavana yritykseltä Shearwater Polymers, Inc. (Huntsville, AL). Yleensä ottaen SS-PEG, SC-PEG ja SPA-PEG reagoivat 20 spesifisesti lysiinitähteiden polypeptidissä kanssa, kun taas VS-PEG ja Mal-PEG kumpikin reagoivat vapaiden kyste-iinitähteiden kanssa. Kuitenkin Mal-PEG varmasti reagoi lysiinitähteiden kanssa alkalisessa pH:ssa. Edullisesti etusijalle asetetaan SC-PEG ja VS-PEG, jolloin edullisin on 25 SC-PEG stabiilisuutensa jin vivo ja spesifisyytensä lysiini-tähteille johdosta.
PEG-ryhmät voidaan sitoa IL-15:een strategisiin kohtiin PEG:n suuren molekyylikoon hyödyntämiseksi. Kuten edellä on kuvattu, PEG-ryhmiä voidaan sitoa IL-15:een käyt-30 täen proteiinissa luonnollisesti esiintyviä lysiini- tai kysteiinitahteitä tai paikkaspesifisellä PEG-yloinnilla. Yksi paikkaspesifisen PEG-yloinnin menetelmistä on käyttää proteiinimanipulointimenetelmiä, joissa kysteiini- tai ly-siinitähteitä sijoitetaan IL-15:een spesifisiin aminohappo-35 paikkoihin. IL-15:een konjugoitujen yhden tai useamman PEG-ketjun suuren molekyylikoon arvellaan salpaavan IL-15:n sen 20 alueen, joka sitoutuu IL-15-reseptorikompleksin B- ja/tai γ-alayksikköön mutta ei sen α-alayksikköön. Konjugointeja voidaan suorittaa yksinkertaisella additioreaktiolla, jossa PEG:tä lisätään IL-15:tä sisältävään emäksiseen liuokseen.
5 Tyypillisesti PEG-ylointi suoritetaan joko (1) pH:ssa noin 9,0 SC-PEG/lysiinitähde-moolisuhteissa noin 1:1 - 100:1, tai enemmän; tai (2) pH:ssa noin 7,0 VS-PEG/kysteiinitähde-moolisuhteissa noin 1:1 - 100:1 tai enemmän.
Konjugoituja PEG-yloituja IL-15-molekyylejä voidaan 10 karakterisoida SDS-PAGE:lla 4 ~ 20 %:n gradientin polyak-ryyliamidigeelissä, jota on saatavana yritykseltä Novex Corp., San Diego, Kalifornia. Tavanomaista hopeavärjäystä tai tavanomaisia Western blot -tekniikoita voidaan käyttää runsaasti PEG-yloiduille proteiineille, jotka hopeavärjäyk-15 sellä ovat vaikeasti visualisoitavissa. PEG-yloidut IL-15-molekyylit voidaan puhdistaa käyttäen kokoekskluusiokroma-tografiaa, dialyysiä, ultrasuodatusta tai affiniteettipuh-distusta.
PEG-yloidun IL-15:n modifioinnin laajuus ja hetero-20 geenisyys voidaan määrittää käyttäen tavanomaista mat- riisiavusteista laser-desorptio-ionisointimassaspektromet-riaa (MALDI). Ihmis-IL-15:n molekyylipainon ollessa noin 13 000 ja käytettäessä PEG 5000:tä MALDI osoittaa, että valmisteet, jotka painavat 13 000, eivät ole PEG-yloituja, 25 18 000 painavissa yksi IL-15-molekyyli on sidottu yhteen PEG-molekyyliin; 23 000 painavissa yksi IL-15-molekyyli on sidottu kahteen PEG-molekyyliin jne.
IL-15-vastaisia monoklonaalisia vasta-aineita
Vaihtoehtoisesti keksinnön mukainen antagonisti voi 30 olla IL-15-vastaisen monoklonaalisen vasta-aineen muodossa, joka häiritsee IL-15:n sitoutumista IL-15-reseptorikomp-leksin mihin tahansa a-, B- tai γ-alayksikköön. Keksinnön yhden näkökohdan puitteissa IL-15:tä mukaan lukien sen johdannaisia sekä näiden proteiinien osia tai fragmentteja ku-35 ten IL-15-peptidejä voidaan käyttää IL-15:een spesifisesti sitoutuvien vasta-aineiden valmistamiseksi. Keksinnön puit- 21 teissä ilmaisulla "vasta-aineet" tarkoitetaan polyklonaali-sia vasta-aineita, monoklonaalisia vasta-aineita, niiden fragmentteja kuten F(ab')2- ja Fab-fragmentit sekä yhdis-telmä-DNA-teknisesti tuotettuja sitoutumispartnereita. Mo-5 noklonaalisen vasta-aineen tai sitoutumispartnerin affini teetin pystyy alan keskimääräinenkin taitaja helposti määrittämään [katso Scatchard, Ann. N,Y. Acad. Sei. 51 (1949) 660 - 672] . Spesifisiä esimerkkejä tällaisista monoklonaa-lisista vasta-aineista annetaan tässä julkaisussa esimer-10 kissä 2.
Yleensä ottaen IL-15-vastaisia monoklonaalisia vasta-aineita voidaan muodostaa käyttäen seuraavaa menettelyä. Puhdistettua IL-15:tä, sen fragmenttia, synteettisiä peptidejä tai IL-15:n ilmentäviä soluja voidaan käyttää 1L-15-15 vastaisten monoklonaalisten vasta-aineiden muodostamiseksi käyttäen sinänsä tunnettuja tekniikoita, esimerkiksi tekniikoita, joita kuvataan US-patenttijulkaisussa 4 411 993. Lyhyesti, hiiriä immunoidaan IL-I5:llä immunogeeninä, joka on emulgoitu täydelliseen Freundin tehosteeseen tai RIBI-20 tehosteeseen (RIBI Corp., Hamilton, Montana) ja jota ruis kutetaan määrinä 10 - 100 pg ihonalaisesti tai vatsaonte-lonsisäisesti. 10 - 12 päivän kuluttua immunoiduille eläi mille annetaan tehosteena lisää epätäydelliseen Freundin tehosteeseen emulgoitua IL-15:tä. Sen jälkeen hiirille an-25 netaan tehosteita immunointiohjelman mukaan kerran viikossa tai kahdessa. Seeruminäytteitä otetaan ajoittain ottamalla verta silmäkuopasta tai hännänpäätä leikkaamalla IL-15-vasta-aineiden suhteen testaamiseksi dot blot -määrityksellä, ELISA:11a (entsyymiliitteinen immunosorbenttimääri-30 tys) tai IL-15-aktiivisuuden inhibition suhteen testaami seksi CTLL-2-soluilla.
Kun on todettu sopiva vasta-ainetiitteri, positiivisille eläimille annetaan vielä laskimonsisäisenä ruiskeena IL-15:tä suolaliuoksessa. 3-4 päivän kuluttua eläimet 35 uhrataan, pernasolut otetaan talteen ja pernasolut fuusioidaan hiiren myeloomasolulinjaan, esim. NS1 tai edullisesti 22 P3x63Ag8.653 (ATCC CRL 1580). Fuusiossa muodostuu hybridoomasoluja, jotka maljataan usealle mikrotiitterilevylle selektiiviseen HAT- (hypoksantiini, aminopteriini ja tymidii-ni) kasvualustaan ei-fuusioitujen myeloomasolujen ja mye-5 loomahybridien lisääntymisen estämiseksi.
Hybridoomasoluja seulotaan ELISA:11a reaktiivisuuden suhteen vastaan puhdistettua IL-15:tä käyttämällä sovellutuksia tekniikoista, jotka julkistetaan julkaisussa Engvall et ai., Immunochem. 8 (1971) 871, ja US-pa- 10 tenttijulkaisussa 4 703 004. Edullinen seulontatekniikka on vasta-ainesieppaustekniikka, jota kuvataan julkaisussa Beckmann et ai. [J. Immunol. 144 (1990) 4212]. Positiivisia hybridoomasoluja voidaan ruiskuttaa vatsaontelonsisäisesti syngeenisiin Balb/c-hiiriin askiittinesteen tuottamiseksi, 15 joka sisältää korkeita pitoisuuksia monoklonaalisia anti- IL-15-vasta-aineita. Vaihtoehtoisesti hybridoomasoluja voidaan kasvattaa kolveissa tai rullapulloissa in vitro eri tekniikoin. Hiiren askiittinesteeseen tuotetut monoklonaaliset vasta-aineet voidaan puhdistaa ammoniumsulfaatilla 20 saostamalla, minkä jälkeen suoritetaan geeliekskluusiokro- matografia. Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää myös affini-teettikromatografiaa, joka perustuu vasta-aineen sitoutumiseen proteiini-A:hän tai proteiini-G:hen, kuten voidaan käyttää myös sitoutumiseen IL-15:een perustuvaa affiniteet-25 tikromatografiaa.
Muita "vasta-aineita" voidaan valmistaa käyttäen tässä esitettyä julkistusta, jolloin nämä siis kuuluvat keksinnön suojapiiriin. Humanisoitujen vasta-aineiden muodostamiseksi käytettyjä menettelyjä on löydettävissä US-pa-30 tentti julkaisuista 4 816 567 ja WO 94/10 332; menettelyjä mikrokappaleiden muodostamiseksi voidaan löytää W0-julkai-susta 94/09 817; ja menettelyjä siirtogeenisten vasta-aineiden muodostamiseksi on löydettävissä GB-hakemusjulkaisusta 2 272 440, jotka kaikki julkaisut sisällytetään tähän 35 viitteiksi.
23
Sen määrittämiseksi, mitkä monoklonaaliset vasta-aineet ovat antagonisteja, käytetään edullisesti seulonta-määritystä. Tähän tarkoitukseen edullinen on CTLL-2-lisääntymismääritys. Katso Gillis ja Smith, Nature 268 5 (1977) 154, joka julkaisu sisällytetään tähän viitteeksi.
Keksinnön mukaisilla antagonisteja voidaan käyttää kuten kuvataan edellä ja yksityiskohtaisemmin alla siirteen eloonjäännin edistämiseksi ja potilaiden hoitamiseksi, joilla on siirre-isäntäsairaus. Muu uskottava käyttö anta-10 gonisteille on myöhäisvaiheen HTLV- (ihmisen T-solulymfo-trofinen virus) I-indusoidun täysikasvuisen T-soluleukemia-lymfoman hoito, katso Burton et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. 91 (1994) 4935]. Muita uskottavia käyttöjä on kyky estää B-solu- tai T-solustimulaatio in vitro, reseptori-ligan-15 divuorovaikutuksen tutkiminen, diagnoosipakkaukset tarttu vaan sairauteen ja häiriöihin ruoansulatuselimistön alueella. Keksinnön mukaisten antagonistien aktiivisuuden ansiosta uudet menetelmät tiettyjen sairauksien hoitamiseksi kuuluvat keksinnön suojapiiriin. Esimerkiksi julkistetaan me-20 netelmä siirrehyljinnän estämiseksi sitä tarvitsevassa potilaassa, ja menetelmä GVHD:n hoitamiseksi sitä tarvitsevassa potilaassa, jolloin kummankin menetelmän vaiheena annetaan farmaseuttista koostumusta, joka käsittää IL-15-antagonistia määrän, joka on tehokas IL-15-aktiivisuuden 25 inhiboimiseksi, ja farmaseuttisesti hyväksyttävää kantajaa tai laimenninta. Samankaltaiset menetelmät ovat käyttökelpoisia muiden sairauksien hoitamiseksi, joissa kohdesolut (solut, joiden uskotaan pääasiassa olevan vastuussa sairaustilasta, tai sairaustilan oireesta) ilmentävät IL-15-30 reseptorikompleksia ja joissa signaalin siirron IL-15- reseptorin β- tai γ-alayksikön välityksellä salpaaminen tai inhibitio on toivottava. Tällaisia sairaustiloja voidaan mahdollisesti hoitaa keksinnön mukaisilla antagonisteilla havaittaessa kohdesolujen ilmentävän IL-15-reseptorikomp-35 leksin. Itse asiassa GVHD:n ja siirrehyljinnän lisäksi täl laisia sairaustiloja voivat olla esimerkiksi lymfomat, syö- 24 vät, leukemiat, poikkijuovaisen lihaksen sarkoomat ja tietyt autoimmuunihäiriöt kuten nivelreuma. Sitä seikkaa, ettei edeltävä luettelo ole kattava kaikkien sairaustilojen osalta, joissa kohdesolut ilmentävät tarvittavan IL-15-re-5 septorikompleksin, ei tulisi tulkita keksinnön suojapiiriä rajoittavaksi.
Kuten edellä kuvataan, keksinnön toisen suoritusmuodon muodostavat nukleiinihapot, jotka koodittavat keksinnön mukaisia IL-15-muteiineja. Tällaiset nukleiinihapot 10 käsittävät joko RNA:ta tai cDNA:ta, jonka nukleotidisek- venssi on sekvenssi 144 - 486 sekvenssistä tunnusnumero 1 ja 144 - 486 sekvenssistä tunnusnumero 2. Edelleen keksinnön suojapiiriin kuuluvat ilmentämisvektorit, jotka käsittävät IL-15-muteiinia koodittavan cDNA:n, ja tällaisella 15 ilmentämisvektorilla transformoidut tai transfektoidut isäntäsolut. Transformoidut isäntäsolut ovat soluja, jotka on transformoitu tai transfektoitu yhdistelmä-DNA-ilmentä-misvektorilla vakiomenettelyjä käyttäen. Ilmennetty nisä-käs-IL-15 sijaitsee isäntäsolussa ja/tai se on eritetty 20 viljelysupernatanttiin riippuen isäntäsolun ja isäntäsoluun insertoidun geenirakenteen luonteesta. Farmaseuttiset koostumukset, jotka käsittävät jotain edellä kuvatuista IL-15-antagonisteista, kuuluvat myös tämän keksinnön suojapiiriin .
25 IL-15-antagonisti©n antaminen
Esillä oleva keksintö antaa käyttöön menetelmiä farmaseuttisten koostumusten käyttämiseksi, jotka käsittävät tehokkaan määrän IL-15-antagonistia sopivassa laimenti-messa tai kantajassa. Keksinnön mukainen IL-15-antagonisti 30 voidaan koostaa tunnettujen menetelmien mukaan, joita käytetään farmaseuttisesti käyttökelpoisten koostumusten valmistamiseksi. IL-15-antagonisti voidaan yhdistää seokseksi joko ainoana aktiivisena materiaalina tai muiden tunnettujen aktiivisten materiaalien kanssa, farmaseuttisesti sopi-35 vien laimentimien (esim. Tris-HCl, asetaatti, fosfatti), säilytysaineiden (esim. Thimerosal, bentsyylialkoholi, pa- 25 rabeenit), emulgaattorien, liuottimien, tehostimien ja/tai kantajien kanssa. Sopivia kantajia ja niiden koostumuksia kuvataan käsikirjassa "Remington's Pharmaceutical Sciences", 16. painos, Mack Publishing Co., 1980. Lisäksi 5 tällaiset koostumukset voivat sisältää IL-15-antagonistia, joka on kompleksoitu polyetyleeniglykoliin (PEG), metalli-ioneihin tai sisällytetty polymeerisiin yhdisteisiin kuten polyetikkahappo, polyglykolihappo, hydrogeelit jne., tai sisällytetty liposomeihin, mikroemulsioihin, miselleihin, 10 uni- tai multilamellaarisiin rakkuloihin, erytrosyyttiaa- veisiin tai sferoblasteihin. Tällaiset koostumukset vaikuttavat IL-15-antagonistin fysikaaliseen tilaan, liukoisuuteen, stabiilisuuteen, vapautumisen in vivo nopeuteen ja poistumisen in vivo nopeuteen. IL-15-antagonisti voidaan 15 myös konjugoida kudosspesifisten reseptorien, ligandien tai antigeenien vastaisiin vasta-aineisiin tai kytkeä kudoss-pesifisten reseptorien ligandeihin.
Keksinnön mukainen IL-15-antagonisti voidaan antaa paikallisesti, ruoansulatuskanavan ulkopuolisesta, peräsuo-20 Ien kautta tai inhalaattorilla. Ilmaisun "ruoansulatuskana van ulkopuolisesti" piiriin kuuluvat ihonalaiset ruiskeet, laskimonsisäiset, lihaksensisäiset, selkäytimensisäisenä ruiskeena tai infuusiotekniikoilla. Nämä koostumukset sisältävät tyypillisesti tehokkaan määrän IL-15-antagonistia, 25 yksinään tai yhdistettynä tehokkaaseen määrään jotain tois ta aktiivista materiaalia. Tällaiset annostukset ja halutut lääkepitoisuudet, jotka sisältyvät koostumuksiin, voivat vaihdella riippuen monista tekijöistä mukaan lukien aiottu käyttö, potilaan ruumiinpaino ja ikä ja antotie. Alustavat 30 annokset voidaan määrittää eläinkokeiden perusteella, ja annostukset voidaan muuntaa ihmiskäyttöön alalla hyväksytyn käytännön mukaan.
Edeltävän lisäksi seuraavat esimerkit esitetään nimenomaisten suoritusmuotojen havainnollistamiseksi eikä 35 keksinnön suojapiirin rajoittamiseksi.
26
Esimerkki 1 IL-15-muteiinit Tässä esimerkissä kuvataan menetelmää kypsän tai natiivin IL-15:n muteiinien saamiseksi, jotka toimivat 5 IL-15-antagonisteina. IL-15, kuten IL-2, kykenee sitoutu maan IL-2R-B-Y-kompleksiin ja signalloimaan sen välityksellä, ja tämä huomioon ottaen esitetään, että sillä on IL~2:n kanssa yhteisiä rakenteellisia ominaisuuksia. Ekvivalentti-set tähteet IL-15:ssä, joiden on aiemmin IL-2:ssa osoitettu 10 olevan kriittisiä vuorovaikutukselle IL-2R~B~ketjun ja -γ-ketjun kanssa [Zurawski et ai., EMBO J, 12:13 (1993) 5113], määritettiin "best fit"- (parhaimman sopivuuden) sekvenssi-rlnnanasettelulla asparagiinihapoksi, tähde 56 (Asp) B~ ketjulle, ja glutamiiniksi, tähde 156 (Gin) y-ketjulle 15 (aminohapponumerointi perustuu peptidin sekvenssiin esitettynä sekvenssien tunnusnumerot 1 ja 2 aminohappotähteillä 1 - 162) .
Suunniteltiin ja rakennettiin oligonukleotidialuk-keita, jotka monistaisivat ihmis-IL-15:tä ja liittäisivät 20 mukaan kodonin, joka koodittaa joko seriinin tai kysteiinin tähteeksi 56 tai vastaavasti 156. Kummankin mutantin rakentamiseksi suoritettiin kaksi erillistä PCR-monistuskierros-ta (katso seuraava diagrammi). Primaarisessa PCR-reaktiossa monistaminen tapahtui alukepareilla, jotka joko toivat mu-25 kanaan tarkoituksenmukaisen mutaation, tai monistivat kypsän sekvenssin. Sekundaarisessa PCR-reaktiossa materiaalia 1. kierrokselta uudelleenmonistettiin alukesarjaa käyttäen, joka toi mukanaan restriktiokohdat kloonaukselle pcfADH2-hiivailmentämisvektoriin pIXY456. Katso Price et ai., Gene 30 5_5 (1987) 287, ja Price et ai. , Meth. Enzym. 185 (1990) 308.
27
Sekundaarinen primaarinen PCR-aluke (3') FCB-aluke (51) ^-ZILA_i ._____ -----1 - . . T...........i" ... I 1----- e-v^=-
Primaarinen Sekundaarinen PCR-aiuke (3'| PCR-aluku <3'1
Seuraavassa taulukossa on lueteltu oligonukleoti-dialukeparit, joita käytettiin kunkin muteiinin primaariseksi monistamiseksi. Oligonukleotidejä NTFIL15B (5'-aluke) 5 ja NCTFIL15F (3'~aluke) käytettiin primaarimonistamxseen toivottaessa kypsän sekvenssin säilymistä.
hntinohappo- , substituutiot ..... _ .
Kloonin y~····—~Γ~ΤΐΤ Odotettu Pnm. PCR- Prim. PC8~ niml_L>30 (J i jO fenotyyppi S'-aluka_ 3 '-aiuko
DQ D Q NTFIllSB NCTFIL15F
SQ S Q β - / γ + D56SER5 NCTFIL15F
OS Ό S β + / γ - NTFIL15B Q156SER3 SS S S β - / y - D56SER5 Q156SER3
CQ C Q β - / γ + D56CYS5 NCTFIL15F
DC D C β + / γ- NTFIU5B Q156CYS3 CC C C β * / Y - D56CYS5 Q156CYS3
Alukkee» nimi sekvenssi
Prim, PCR
D56Cys5 (5'-AATGTAATAAGTCGTTTGAAAAAAATT-3*) SEQ ID NO: 3 D56Ser5 (S-AATGTAATAAGTTCPTTGAAAAAAATT-dj SEQ ID NO: 4 Q156Cys3 (S'-GTTGATGAACATGCAGACAATATG-3j SEQ ID NO: 5 Q156Ser3 (51-gttgaTGAACATAGAGACAATATG~3’) SEQ ID NO: 6 NTFJL15B (S'-GTCCTCGCAACTAAGTCGACTAACTGGGT- GAATGTAATA-3 j SEQ ID NO: 7 NCTHL15F (F-GAGTCAfTCTCGACTTGCGGCCGCACCAG- AAGTGTTGATGAACAT-äj SEQ ID NO: 8
Sek. PCR
ELI SPIXYF5 (5'-AATATGGT AC CTTTGGATAAAAGAGACTA ~ CAAGGACGACGATGACAAGAACTGGGTGAAT- gtaataagt-3’) SEQ ID NO: 9 ELI 5FIXY3 (S'-GCGATATATCCATGGTCAAGAAGTGT'TGA*- TGAACAT-31) SEQ ID NO: 30 28
Vaihtoehtoisesti oligonukleotidi NTFIL15B voitaisiin substituoida oligonukleotidillä IL15PIXYF5 ja oligonukleotidi NCTFIL15F voitaisiin substituoida oligonukleotidillä IL15PIXY3. Primaarinen PCR-monistaminen suoritettiin 5 100 pl:ssa lx Taq-polymeraasipuskuria (Boehringer}, joka sisälsi 250 μΜ dNTP ja 50 pmol 5'- ja 3'-ol.igo-nukleotidialuketta. DNA-templaattina käytettiin noin 50 ng pIXY764:ää. Vektori pIXY764 on samankaltainen kuin edellä kuvattu vektori pIXY456, joka sisältää ihmis-FLAG-IL-15:tä 10 koodittavaa DNA:ta, jolloin ihmis-IL-15:n N~kytketyt gly-kosylaatiokohdat on inaktivoitu käyttäen edellä kuvattuja menettelyjä. Reaktioseoksien päälle sijoitettiin kerrokseksi mineraaliöljyä ja kuumennettiin 94 °C:seen lämpökierrät-timessä 5 minuutiksi, minkä jälkeen lisättiin 2 yksikköä 15 Taq-polymeraasia (Boehringer) ja aloitettiin lämpökierrä-tys. Kierrätysolosuhteet olivat denaturointi 94 °C:ssa 45 sekunnin ajan, juottaminen 45 °C:ssa 45 sekunnin ajan ja laajentaminen 72 °C:ssa 1 minuutin ajan kaikkiaan 30 kierrosta .
20 Noin 20 ng geelipuhdistettua tuotetta primaari- monistamisesta käytettiin templaattina sekundaarisessa PCR-monistuksessa. Kaikkia rakenteita monistettiin IL15PIXYF5:llä ja ILl5PIXY3:lla käyttäen samoja puskuriolosuhteita kuin edellä. Kierrätysolosuhteet olivat denaturointi 94 °C:ssa 25 45 sekunnin ajan, juottaminen 60 °C:ssa 45 sekunnin ajan ja laajentaminen 72 °C:ssa 1 minuutin ajan kaikkiaan 20 kierrosta .
Monistustuotteita puhdistettiin geelissä ja pilkottiin Asp718:lla (Boehringer) ja NcoI:llä (new England Bio-30 labs) yön yli 37 °C:ssa lx Boehringer-puskurissa B. Re-striktiotuotteet ligatoitiin pIXY456-hiivailmentämisvekto-riin, jota oli pilkottu Asp718:lla ja NcoI:llä. Tällä DNA:11a transformoitiin kannan DH10B EX_ coli -soluja elektroporaa-tiolla.
35 Plasmidi-DNA yksittäisistä transformanteista sek- ventoitiin sekvenssi-integriteetin varmistamiseksi, ja sil- 29 lä transformoitiin XV2181 cerevisiae. Biologinen aktiivisuus määritettiin käyttäen hiivasupernatanttia 30 tunnin indusoinnin jälkeen.
Näissä kokeissa käytettiin mutagenisoinnissa PCR-5 pohjaista strategiaa sen perusteella, että mutagenisoitavat kohdat sijaitsivat lähellä lL-15-geenin päitä. Kuitenkin nämä ja mitkä tahansa muut yksittäiset tai monipistemutaa-tiot voitaisiin tehdä tavanomaisin paikkakohdenteisin muta-genisointitekniikoin.
10 Esimerkki 2 IL-15-vastaisia monoklonaalisia vasta-aineita Tässä esimerkissä kuvataan menetelmää, jota käytettiin kolmen monoklonaalisen anti-IL-15-vasta-aineen saamiseksi, jotka toimivat IL-15-antagonisteina. Kaikki menetel-15 mät ovat tavanomaisia tekniikoita ellei toisin ole mainittu .
Balb/c-hiiriin ruiskutettiin vatsaontelonsisäisesti kahdessa yhteydessä 3 viikon välein 10 yg hiivaperäistä ih-mis-IL-15:tä RIBI-tehosteen läsnä ollessa (RIBI Corp., Ha-20 milton, Montana) . Hiiriseerumi määritettiin sitten tavan omaisella dot blot -tekniikalla, vasta-ainesieppaus- (ABC) ja neutralointimäärityksellä (CTLL-2-määritys) sen määrittämiseksi, mikä eläin sopisi parhaiten fuusioon. 3 viikkoa myöhemmin hiirille annettiin laskimonsisäisesti tehosteena 25 3 yg ihmis-IL-15:tä suspendoituna steriiliin PBSrään. 3 päi vän kuluttua tästä hiiret uhrattiin ja pernasolut fuusioitiin Ag8.653-myeloomasoluihin (ATCC) noudattaen vakiintuneita protokollia. Lyhyesti, Ag8.653-solut pestiin moneen kertaan seerumivapaassa kasvualustassa ja fuusioitiin hii-30 ren pernasoluihin suhteessa 3 pernasolua/1 myeloomasolu.
Fuusiointiaineena oli 50 % PEG: 10 % DMSO (Sigma). Fuu- siotuote maljattiin 20:Ile 96-kuoppaiselle tasapohjaiselle levylle (Corning), joilla kuopat sisälsivät HAT:llä täydennettyä DMEM-kasvualustaa, ja annettiin kasvaa 8 päivän 35 ajan. Supernatantit saaduista hybridoomista kerättiin talteen ja lisättiin 60 minuutiksi 96-kuoppaiselle levylle, 30 joka oli ensin päällystetty vuohen anti-hiiri-Ig:llä. Pesujen jälkeen kuhunkin kuoppaan lisättiin 125I~IL-15: tä, inku-boitiin 60 minuuttia huoneenlämpötilassa ja pestiin 4 kertaan. Positiiviset kuopat todettiin sitten autoradiografi-5 sesti -70 °C:ssa käyttäen Kodak X-Omat S -filmiä. Positiivisia klooneja kasvatettiin eräviljelmänä, ja saatuja su-pernatantteja puhdistettiin sitten proteiini A -kolonnissa (Pharmacia). M110:ksi, Milliksi ja M112:ksi nimetyt kloonit isotyypitettiin sitten kukin monoklonaaliseksi IgGl-vasta-10 aineeksi. Monoklonaalisia vasta-aineita MHO, Mill ja M112 tuottavat hybridoomat on talletettu talletuslaitokseen American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA (ATCC) 13. maaliskuuta 1996, ja niille on annettu siellä hakunume-rot HB-12Q61, BH-12062 ja vastaavasti HB-12063. Kaikki tal-15 lenteet on tehty Budapestin sopimuksen ehtojen mukaisesti.
Muodostettujen monoklonaalisten vasta-aineiden IL-15-antagonistiaktiivisuus voidaan määrittää käyttäen CTLL-2-määritystä oleellisesti kuten kuvaavat Gillis et ai., supra.
20 Esimerkki 3
Modifioituja IL-15-molekyylejä Tässä esimerkissä kuvataan menetelmää sellaisten modifioitujen IL-15-molekyylien saamiseksi, jotka toimivat IL-15-antagonisteina.
25 PEG-yloitu IL-15
Kaikissa konjugointireaktioissa käytettiin PEGitä, jonka molekyylipaino oli 5 000 ja joka saatiin sukkinimi-dyylisukkinaatti-PEG:nä (SS-PEG), sukkinimidyylikarbonaat-ti-PEG:nä (SC-PEG), VS-PEG:nä ja Mal-PEG:nä yritykseltä 30 Shearwater Polymers, Inc. (Huntsville, AL). Sekä SS-PEG että SC-PEG reagoivat lysiinin ε-aminoryhmän kanssa, jolloin SS-PEG:n kohdalla muodostuu hydrolyyttisesti epästabiili esterisidos ja SC-PEG:n kohdalla hydrolyyttisesti stabiili uretaanisidos. PEG-ylointi suoritettiin 50 nM NaH2P04-35 liuoksessa pHissa 9,0 SS-PEG:n ja SC-PEG:n kohdalla; ja pH:ssa 7,0 reaktioille, jotka sisälsivät VS-PEG.tä ja Mal- 31 PEG.tä. Reaktiot suoritettiin 0,5 ml:n tilavuuksissa pitoisuuden ollessa 100 pg/ml. Kussakin reaktiossa PEG:tä lisättiin reaktioseoksiin PEG/lysiini-moolisuhteissa 1:1, 3:1, 10:1 ja 100:1 (kussakin apina-IL-15-molekyylissä on 9 ly-5 siinitähdettä). Reaktiot etenivät yön yli 4 °C:ssa.
PEG-ylointu apina-IL-15 karakterisoitiin SDS-PAGE:lla 4 - 20 %:n gradientin polyakryyliamidigeeleissä (Novex, San Diego, Kalifornia). Ei-modifoiduille IL-proteiineille, joita panostettiin noin 0,5 pg/vyöhyke, käytettiin tavanomai-10 siä hopeavärjäystekniikoita. Runsaasti PEG-yloidut apina-IL-15-proteiinit vaativat suurempien määrien proteiinia panostamista geeliin visualisoinnin saamiseksi. Runsaasti PEG-yloidun IL-15:n karakterisoimiseksi käytettiin myös Western blot -määrityksiä. Näissä kokeissa PEG-yloitu api-15 na-IL-15 erotettiin SDS-PAGE:11a, siirrettiin nitrosellu- loosamembraanille, inkuboitiin monoklonaalisella vasta-aineella Mill, minkä jälkeen inkuboitiin vuohen anti-hiiri-HRP:llä ja visualisoitiin lopuksi käyttäen 4 CN Membrane Peroxidase Substrate System -järjestelmää (Kirkegaard & 20 Perry Laboratories, Gaithersburg, MD) . PEG-yloitua apina- IL-15: ta karakterisoitiin myös kokoekskluusiokromatografia-(SEC) HPLC:llä käyttäen Biosil SEC-250 -kokoekskluusioko-lonnia (Biorad, Richmond, CA) tavanomaisten tekniikoiden mukaan.
25 Testattiin SC-PEG-yloidun FLAG-apina-IL-15:n kykyä sitoutua transfektoituihin COS-soluihin, jotka ilmensivät IL-15:n a-, β- ja γ-reseptorialayksiköitä solumembraanin pinnalla. PEG-yloitu IL-15 inhiboi radioleimatun IL-15:n sitoutumisen IL-15R-a-alayksikön ilmentäviin COS-soluihin, 30 mikä osoitti PEG-yloidun IL-15:n kilpailevan IL-15Ra-alayksikkösitoutumisesta. Edelleen PEG-yloitu IL-15 ei inhiboinut radioleimatun IL-15:n sitoutumista B- ja y-re-septorialayksiköitä ilmentäviin COS-soluihin, mikä osoitti, ettei PEG-yloitu IL-15 sitoudu IL-15-reseptorikompleksin 35 β- ja/tai γ-reseptorialayksiköihin. Täten PEG-yloitu IL-15 estää endogeenisen IL-15:n suorittamasta signaalin siirtoa 32 IL-15-reseptorikompleksin β- ja γ-reseptorialayksiköiden kautta.
Esimerkki 4 IL-15-aktiivisuuden inhibitio CTLL-2-määrityksessä 5 Tässä esimerkissä havainnollistetaan edelleen mene telmää, jolla määritetään IL-15:n signaalin siirron estyminen IL-15-reseptorikompleksin β- ja γ-reseptorialayksiköi-den kautta keksinnön mukaisilla antagonisteilla.
Monoklonaalisten vasta-aineiden, PEG-yloidun 1L-I5:n 10 ja IL-15-muteiinien antagonistiaktiivisuus voidaan määrittää käyttäen modifioitua CTLL-2-solu-3H~tymidiini-inkorpo-raatiomääritystä (Gillis et ai., supra). Antagonistin sar-jalaimennoksia voidaan tehdä 96-kuoppaisille tasapohjaisille kudosviljelylevyille (Costar, Cambridge, MA) DMEM-kas-15 vualustaan (jossa on täydennyksenä 5 % FCS, NEAA, Na- pyruvaatti, HEPES pH 7,4, 2-me, PSG) 50 μΐ: n lopputilavuu-teen. Sitten kaikkiin määrityskuoppiin lisätään optimaalisen alittava eli suboptimaalinen määrä IL-15:tä (loppupi-toisuus 20-40 pg/ml; 5 μΐ/kuoppa) näytteiden sarjalaimen-20 tamisen jälkeen ja ennen solujen lisäämistä. Pestyjä CTLL-2-soluja lisätään (noin 2 000/kuoppa 50 pl:ssa) ja levyjä inkuboidaan 24 tunnin ajan 37 °C:ssa kostutetussa ilmakehässä, jossa on 10 % CO^ita ilmassa. Tätä seurasi 5 tunnin inkubointi määrällä 0,5 pCi 3H-tymidiiniä (25 Ci/mmol, 25 Amersham, Arlington Heights, IL). Sitten viljelmät kerätään lasikuitusuodattimille ja lasketaan avalanche-kaasuionisaa-tiolla joko suoralla monidetektori-ft-laskijalla (Matrix 96, Packard Instrument Company, Meridien, CT) tai β-tuike-laskijalla. Määrityksellä saadut tuikkeita minuutissa 30 arvot (CPM) muutetaan prosentuaaliseksi inhibitioksi, ja kunkin titratun antagonistinäytteen prosentuaalisen inhibition arvoja käyttäen lasketaan antagonistiaktiivisuus yksi-köinä/ml.
Seuraavassa taulukossa I esitetään tulostiedot, 35 joista ilmenee pitoisuus, joka tarvitaan neutraloimaan 40 pg/ml IL~15:tä CTLL-inhibitiomäärityksessä. Seuraavassa 33 taulukossa II esitetään IL-15:n (agonistin) ja IL-15-antagonistien aktiivisuus CTLL- ja CTLL-inhibitiomääri-tyksissä.
Taulukko Ϊ IL--15~antagoniatien spesifinen aktiivisuus
Antogonistipitoisnus, joka tarvitaan neutraloimaan 40 pg/ml lb-15:tä CTLL-inhibitiomSkri tyksessä
Antagonisti_ Pitoisuus Proteiinimkar itysmenetelma huIL-15-muteiinit. 848,-2560 pgfail RULSAiarvioitu MAi »ta ΜΠΟ,ΜΙΠ 5 ng/rn) od PEGhuIL-i5 D56C 7,7 ng/mS arvioitu ΑΛΛ: ata ΜΠ2 40ng/ml oo PEGf~S'IL15 140-196 ng/mi OD = optinen tiheys sbsorbanssi 280 junsssä; ekstinfcfciokerroin 1,35 ΛΑΑ *= aminohappoanalyyai
PEGf'S-r.r,15 >= PEG-ylöitu PLAG-apina-IL-lS
Taulukko n IL-l5;n ja iL-lS-antagonistien aktiivisuus CTLL- ja CTLL-inhibitiortiäärityksissä CTLL-raHäritys CTLL·· inhibit iomäaritys yksikköS/ml yksikköK/inl (Agonlstl- (antagonistiaktiivi- NKyto aktiivisuus) _ suusi ΕΠ3 7,09 X 10s ' 279 CL-15-Q156C - 3 X 106 IL-15-Q156S - 1,5 X 106 IL-15-D56C - 2 X Ι0ό XL-15-D56C-QI56C - 2X105 IL-15-D56C-Q156S - 7X105 IL-J5-D56S - 2,2 X 105
IL-15-DS6S-Q156S - 7,2 X
vektorikontroLli - 1141
IL-15 3,7 X 10» NA
PEG-CL-15 - 2,3 XlO6 PEG-H-15.D56C - 7,96 X 10* IL-15-D56C - 5 X 10ό
IL-15 5,6 X 10» NA
PEG-EL-15 N A 1,7 X CO5 Q1560 = GinIs6 substituoitu Cys Q156S = Gln>56 substituoitu Sei" D56C « Asp56 substituoitu Cys D56S * Asp56 substituoitu Ser NA; ei määritetty 34
Sekvenssilistaus (1) YLEISET TIEDOT: (1) HAKIJA: Grabstein, Kenneth 5 Paxton, Raymond
Pettit, Dean {ii) KEKSINNÖN NIMITYS: Interleukiini- 15~~antagonisteja 10 (lii) SEKVENSSIEN LUKUMÄÄRÄ: 10 (iv) KIRJEENVAIHTO-OSOITE: (A) VASTAANOTTAJA: Immunex Corporation (B) KATU: 51 University Street 15 (C) KAUPUNKI: Seattle (D) OSAVALTIO TAI LÄÄNI: Washington
(E) MAA: USA
(F) POSTINUMERO: 98101 20 (v) KONEKOODIMUOTO: (A) VÄLINETYYPPI: Levyke {B} TIETOKONE: Apple Macintosh (C) KÄYTTÖJÄRJESTELMÄ: Järjestelmä 7, Word 5.1a 25 (D) OHJELMISTO: Patentin Release #1.0, versio #1.25 (vi) NYKYISEN HAKEMUKSEN TIEDOT: (A) HAKEMUSNUMERO: odottaa hakemusnumeroa 30 (B) JÄTTÖPÄIVÄMÄÄRÄ: 21.02.1996 (C) LUOKITUS: (viii) ASIAMIESTÄ KOSKEVAT TIEDOT: (A) NIMI: Malaska, Sephen L.
35 (B) REKISTERINUMERO: 32 655
(C) VIITE/LUETTELONUMERO: 2831-WO
(ix) TIETOLIIKENNEYHTEYSTIEDOT: (A) PUHELIN: 206-587-0430 40 (2) SEKVENSSIN NRO 1 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: 45 (A) PITUUS: 486 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen 35
(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA
(iii) HYPOTEETTINEN: ei 5 (iv)ANTISENSE: ei (ix)OMINAISPIIRTEET:
(A) NIMI/SELITYS: CDS
(B) ASEMA: 1..342 10 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 1: ATG AGA ATT TCG ΑΑΛ CCA CAT TTG AGA AGT ATT TCC ATC CAG TGC TAC 48
Met Arg Ile Ser Lys Pro His Leu Arg Ser Tie Sex lie Gin Cys Tyr 15 10 15 CTG TGT TTA CTT CTA AAG AGT CAT TTT CTA ACT GAA GCT GGC ATT CAT 56
Leu Cys Leu Leu Leu Lys Ser Kis Phe Leu Thr Gin Ala Gly Ile HiS
20 25 30 14 4
GTC TTC ATT TTG GGC TGT TTC AGT GCA GGG CTC CCT AAA ACA GAA GCC
Vai Phe Ile Leu Gly Cys Phe Ser Ala Gly Leu Pro Lys Thr Glu Ala 35 40 45 AAC TGG GTG AAT GTA ATA AGT GAT TTG AAA AAA ATT GAA GAT CTT ATT 192
Asn Trp Vai Asn Vai Ile Ser Asp Leu Lys Lys He Glu Asp Leu Ile 50 55 60 740
CAA TCT ATG CAT ATT GAT GCT ACT TTA TAT ACA GAA AGT GAT GTT CAC
Gin Ser Met: His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Vai His 65 70 75 90 CCC AGT TGC AAG GTA ACA GCA ATG AAG TGC TTT CTC TTG GAG TTG CAA 388
Pro Ser cys Lys Vai Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gin 85 90 95 GTT ATT TCA CAT GAG TCC GGA GAT ACA GAT ATT CAT GAT ACA GTA GAA 336
Vai He Ser His Glu Ser Gly Asp Thr Asp Ile His Asp Thr Vai Glu 100 105 110 AAT CTT ATC ATC CTA GCA AAC AAC ATC TTG TCT TCT AAT GGG AAT ATA 384
Asr> Leu ilo Ile Leu Ala Asn Asn He Leu Ser Ser Asn Gly Asn He 115 120 125
ACA GAA TCT GGA TGC AAA GAA TGT GAG GAA CTA GAG GAA AAA AAT ATT
Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn He 130 135 140 AAA GAA TTT TTG CAG AGT TTT GTA CAT ATT GTC CAA ATG TTC ATC AAC 480
Lys Glu Phe Leu Gin Ser Phe Vai His Ile Vai Gin Mec Phe Ile Asn 145 150 155 160 ACT TCT TGA 483
Thr Ser (2) SEKVENSSIN NRO 2 TIEDOT: 15 (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 489 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: kaksisäikeinen 36
(D) TOPOLOGIA: lineaarinen (li)MOLEKYYLITYYPPI: cDNA
5 (ix) OMINAISPIIRTEET:
(A) NIMI/SELITYS: CDS
(B) ASEMA: 1..489 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 2: 10 ATG AGA ATT TCG AAA CCA CAT TTG AGA AGT ATT TCC ATC CAG TGC TAC 48 tiet Arg Ile Ser Lys Pro His Leu Arg Ser He Ser Ile Gin Cys Tyr 15 10 15 TTG TGT TTA OTT CTA AAC AGT CAT TTT CTA ACT GAA GCT GGC ATT CAT S 6
Leu Cys Leu Leu Leu Asn Ser His Phe Leu Thr Glu Ala Gly Ile His 20 25 30 GTC TTC ATT TTG GGC TGT TTC AGT GCA GGG CTT CCT AAA ACA GAA GCC 144
Vai Phe Ile Leu Gly Cys Phe Ser Ala Gly Leu Pro Lys Thr Glu Ala 35 40 45 AAC TGG GTG AAT GTA ATA AGT GAT TTG AAA AAA ATT GAA GAT CTT ATT 192
Asn Trp Vai Asn Vai Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile 50 55 60 CAA TCT ATG CAT ATT GAT GCT ACT TTA TAT ACG GAA AGT GAT GTT CAC 240
Gin Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Vai His 65 70 75 $0 CCC AGT TGC AAA GTA ACA GCA ATG AAG TGC TTT CTC TTG GAG TTA CAA 288
Pro Ser Cys Lys Vai Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gin 05 90 95 GTT ATT TCA CTT GAG TCC GGA GAT GCA AGT ATT CAT GAT ACA GTA GAA 336
Vai Ile Ser Leu' Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Vai Glu 100 10S HO
AAT CTG ATC ATC CTA GCA AAC AAC AGT TTG TCT TCT AAT GGG AAT GTA 3 84 • Asn Leu Ile He Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Vai 115 120 125 ACA GAA TCT GGA TGC AAA GAA TGT GAG GAA CTG GAG GAA AAA AAT ATT 432
Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn lie 130 135 140 AAA GAA TTT TTG CAG AGT TTT GTA CAT ATT GTC CAA ATG TTC ATC AAC 480
Lys Glu Phe Leu Gin Ser Phe Vai His Ile Vai Gin Met Phe He Asn 3<ä5 ISO 155 160 ACT TCT TGA 439
Thr Ser (2) SEKVENSSIN NRO 3 TIEDOT: 15 (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 27 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen 37 (il)MOLEKYYLITYYPPI: cDNA (lii) HYPOTEETTINEN: ei 5 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 3: AATGTAATAA GTTGTTTGAA AAAATT 27 10 (2) SEKVENSSIN NRO 4 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 27 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo 15 (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen
(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA
20 (Xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 4: AATGTAATAA GTTCTTTGAA AAAATT 27 25 (2) SEKVENSSIN NRO 5 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 24 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo 30 (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen
(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA
35 (lii) HYPOTEETTINEN: ei (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 5: GTTGATGAAC ATGCAGACAA TATG 24 38 (2) SEKVENSSIN NRO 6 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 24 emäsparia 5 (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen
(li)MOLEKYYLITYYPPI: cDNA
10 (lii) HYPOTEETTINEN: ei (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 6: 15 GTTGATGAA ATÄGAGACAA TATG 24 {2} SEKVENSSIN NRO 7 TIEDOT: 20 (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 39 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen 25
(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA
(iii) HYPOTEETTINEN: ei 30 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 7: GTCCTCGCAA CTAAGTCGAC TAACTGGGTG AATGTAATA 39 35 (2) SEKVENSSIN NRO 8 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: {A) PITUUS: 45 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo 40 (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen
(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA
45 (iii) HYPOTEETTINEN: ei (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 8: 39 GAGTCATTCT CGACTTGCGG CCGCACCAGA AGTGTTGATG AACAT 45 (2) SEKVENSSIN NRO 9 TIEDOT: 5 (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 69 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen 10
(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA
(iii) HYPOTEETTINEN: ei 15 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 9:
AATATGGTAC CTTTGGATAA AAGACACTAC AAGGACGACG ATGACAAGAA CTGGGTGAAT GTAATAAGT
69 (2) SEKVENSSIN NRO 10 TIEDOT: 20 (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 69 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen 25 (D) TOPOLOGIA: lineaarinen
(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA
(iii) HYPOTEETTINEN: ei 30 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 10: GCGATATATC CATGGTCAAG AAGTGTTGAT GAACAT 36

Claims (13)

1. Interleukiini-15- (IL-15) aktiivisuuden antagonisti, joka on natiivin IL-15:n muteiini, joka sitoutuu IL- 5 15-reseptorikompleksin IL-15-a-alayksikköön ja käsittää vä hintään yhden lisäyksen, substituution tai deleetion, a) sekvenssi nro l:n tai sekvenssi nro 2:n aminohapossa Asp56 tai b} sekvenssi nro l:n tai sekvenssi nro 2:n aminoha- 10 possa Gin156, joka estää IL-15 siirtämästä signaalia IL-15 resep-torikompleksin β- tai γ-alayksikön kautta.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen antagonisti, joka on IL-15:n muteiini, jossa ainakin yksi aminohappotähteistä
15 Asp56 tai Gin156 on joko deletoitu tai substituoitu jollain toisella luonnollisesti esiintyvällä aminohappotähteellä.
3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen antagonisti, jossa joko Asp56 tai Gin156 tai ne molemmat on kumpikin substituoitu seriinillä tai kysteiinillä.
4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen antagonisti, jos sa Asp56 on substituoitu seriinillä tai kysteiinillä.
5. Patenttivaatimuksen 3 mukainen antagonisti, jossa Gin156 on substituoitu seriinillä tai kysteiinillä.
6. Eristetty nukleiinihapposekvenssi, joka koodit- 25 taa patenttivaatimuksen 1 mukaista IL-15-muteiinia.
7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen eristetty nukleiinihappo, kun lL-15-muteiinissa ainakin yksi aminohappotähteistä Asp56 tai Gin156 on joko deletoitu tai substituoitu jollain toisella luonnollisesti esiintyvällä aminohappotäh- 30 teellä.
8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen eristetty nukleiinihappo, kun joko Asp56 tai Gin156 tai ne molemmat on kumpikin substituoitu seriinillä tai kysteiinillä.
9. Patenttivaatimuksen 7 mukainen eristetty nukle- 35 iinihappo, kun Asp56 on substituoitu seriinillä tai kyste iinillä.
10. Patenttivaatimuksen 7 mukainen eristetty nukleiinihappo, kun Gin156 on substituoitu seriinillä tai kyste-iinillä.
11. Yhdistelmä-DNA-vektori, joka käsittää patentti-5 vaatimuksen 6 mukaista nukleiinihappoa.
12. Isäntäsolu, joka on transformoitu tai transfek-toitu patenttivaatimuksen 11 mukaisella vektorilla.
13. Menetelmä patenttivaatimuksen 1 mukaisen IL-15-muteiinin tuottamiseksi, joka menetelmä käsittää patentti- 10 vaatimuksen 12 mukaisen isäntäsolun viljelyn viljelyolosuhteissa, jotka johtavat tällaisen IL-15-muteiinin ilmentymiseen.
FI973361A 1995-02-22 1997-08-15 Interleukiini-15-antagonisteja FI120497B (fi)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/392,317 US5795966A (en) 1995-02-22 1995-02-22 Antagonists of interleukin-15
US39231795 1995-02-22
PCT/US1996/002520 WO1996026274A1 (en) 1995-02-22 1996-02-21 Antagonists of interleukin-15
US9602520 1996-02-21

Publications (3)

Publication Number Publication Date
FI973361A0 FI973361A0 (fi) 1997-08-15
FI973361A FI973361A (fi) 1997-10-15
FI120497B true FI120497B (fi) 2009-11-13

Family

ID=23550114

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI973361A FI120497B (fi) 1995-02-22 1997-08-15 Interleukiini-15-antagonisteja
FI20060080A FI121571B (fi) 1995-02-22 2006-01-27 Interleukiini-15-antagonisteja

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI20060080A FI121571B (fi) 1995-02-22 2006-01-27 Interleukiini-15-antagonisteja

Country Status (16)

Country Link
US (5) US5795966A (fi)
EP (2) EP0811065B2 (fi)
JP (2) JPH11500908A (fi)
KR (1) KR19980702238A (fi)
AT (1) ATE339505T1 (fi)
AU (1) AU708549B2 (fi)
CA (2) CA2210491C (fi)
DE (1) DE69636538T3 (fi)
DK (1) DK0811065T4 (fi)
ES (1) ES2271951T5 (fi)
FI (2) FI120497B (fi)
MX (1) MX9706294A (fi)
NO (2) NO321990B1 (fi)
NZ (1) NZ303843A (fi)
PT (1) PT811065E (fi)
WO (1) WO1996026274A1 (fi)

Families Citing this family (64)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5574138A (en) 1993-03-08 1996-11-12 Immunex Corporation Epithelium-derived T-cell factor
US7192935B1 (en) * 1993-03-08 2007-03-20 Amgen Inc. Polynucleotides encoding epithelium-derived T-cell factor and uses thereof
JPH09512165A (ja) * 1994-04-06 1997-12-09 イミュネックス・コーポレーション インターロイキン１５
US5795966A (en) * 1995-02-22 1998-08-18 Immunex Corp Antagonists of interleukin-15
US7008624B1 (en) * 1995-02-22 2006-03-07 Immunex Corporation Antagonists of interleukin-15
AUPN378095A0 (en) * 1995-06-23 1995-07-20 Bresagen Limited Haemopoietic growth factor antagonists and uses therefor
US6451308B1 (en) 1996-04-26 2002-09-17 Beth Israel Deaconess Medical Center Antagonists of interleukin-15
EP1627918A1 (en) * 1996-04-26 2006-02-22 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Antagonists of interleukin-15
US6001973A (en) * 1996-04-26 1999-12-14 Beth Israel Deaconess Medical Center Antagonists of interleukin-15
WO1998016254A1 (en) * 1996-10-17 1998-04-23 Immunomedics, Inc. Non-antigenic toxin-conjugate and fusion protein of internalizing receptor system
US5874566A (en) * 1996-10-25 1999-02-23 Hisamitsu Pharmaceutical Co. Inc. Il-15 triplex oligonucleotides
DE69830257T3 (de) * 1997-02-21 2009-10-15 Amgen Inc., Thousand Oaks Verwendung von Interleukin-15
WO2000001851A1 (en) * 1998-07-07 2000-01-13 Hisamitsu Pharmaceutical Co., Inc. Antisense oligonucleotides targeted to il-15
GB9814892D0 (en) * 1998-07-10 1998-09-09 Kennedy Rheumatology Inst Treatment of celiac disease
US5985663A (en) * 1998-11-25 1999-11-16 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense inhibition of interleukin-15 expression
US6307024B1 (en) * 1999-03-09 2001-10-23 Zymogenetics, Inc. Cytokine zalpha11 Ligand
CA2366921C (en) * 1999-03-09 2013-12-17 Zymogenetics, Inc. Novel cytokine zalpha11 ligand
AU6689700A (en) * 1999-07-06 2001-01-22 Silvia Bulfone-Paus Method of treating psoriasis with il-15 antagonist
WO2001025277A1 (en) * 1999-10-07 2001-04-12 Maxygen Aps Single-chain antagonist polypeptides
AU6158501A (en) 2000-05-12 2001-11-26 Beth Israel Hospital Compositions and methods for achieving immune suppression
DE60138222D1 (de) 2000-09-14 2009-05-14 Beth Israel Hospital Modulierung von il-2 und il-15 vermittelten t zellantworten
AU2002320630A1 (en) 2001-07-17 2003-03-03 University Of Florida Detecting and treating reproductive tract disorders
ATE531390T1 (de) * 2001-08-23 2011-11-15 Genmab As Interleukin-15-(il-15-)spezifische menschliche antikörper
US7329405B2 (en) * 2001-08-23 2008-02-12 Genmab A/S Human antibodies specific for interleukin 15 (IL-15)
US7247304B2 (en) * 2001-08-23 2007-07-24 Genmab A/S Methods of treating using anti-IL-15 antibodies
US7533270B2 (en) * 2002-04-15 2009-05-12 Ntt Docomo, Inc. Signature schemes using bilinear mappings
CU23093A1 (es) * 2002-10-09 2005-10-19 Ct Ingenieria Genetica Biotech Composición vacunal que comprende interleucina-15 (il-15)
EA015897B1 (ru) * 2003-02-26 2011-12-30 Генмаб А/С Применение человеческого моноклонального антитела к ил-15 в составе композиции и лекарственного препарата (варианты), композиция и лекарственный препарат, его включающие
US8604159B2 (en) 2003-07-22 2013-12-10 Nektar Therapeutics Method for preparing functionalized polymers from polymer alcohols
ATE516305T1 (de) * 2004-02-27 2011-07-15 Inst Nat Sante Rech Med Il-15-bindungsstelle für il-15-ralpha und spezifische il-15-mutanten mit wirkung als agonisten/antagonisten
WO2006020849A2 (en) * 2004-08-11 2006-02-23 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Mutant interleukin-15 polypeptides
CU23472A1 (es) * 2004-09-17 2009-12-17 Ct Ingenieria Genetica Biotech Péptido antagonista de la interleucina-15
US20060104945A1 (en) * 2004-10-05 2006-05-18 Choi Yong S Enhancement of B cell proliferation by IL-15
NZ581779A (en) 2005-05-17 2011-09-30 Univ Connecticut Composition and methods for immunomodulation in an organism comprising interleukin-15 polypeptide and interleukin-15 receptor subunit A polypeptide complex
EP1777294A1 (en) 2005-10-20 2007-04-25 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) IL-15Ralpha sushi domain as a selective and potent enhancer of IL-15 action through IL-15Rbeta/gamma, and hyperagonist (IL15Ralpha sushi -IL15) fusion proteins
US8055951B2 (en) * 2007-04-10 2011-11-08 International Business Machines Corporation System, method and computer program product for evaluating a virtual machine
ES2470772T3 (es) 2007-05-11 2014-06-24 Altor Bioscience Corporation Moléculas de fusión y variantes de IL-15
CU23716A1 (es) 2008-09-30 2011-10-05 Ct Ingenieria Genetica Biotech Péptido antagonista de la actividad de la interleucina-15
US20100145285A1 (en) * 2008-12-09 2010-06-10 Cook Critical Care, Incorporated Multi-lumen catheter configuration
WO2012136231A1 (en) 2010-09-08 2012-10-11 Chemotherapeutisches Forschungsinstitut Georg-Speyer-Haus Interleukin 15 as selectable marker for gene transfer in lymphocytes
US11053299B2 (en) 2010-09-21 2021-07-06 Immunity Bio, Inc. Superkine
CN107880136B (zh) 2010-09-21 2021-11-12 阿尔托生物科学有限公司 多聚体il-15可溶性融合分子与其制造与使用方法
LT2665486T (lt) 2011-01-18 2020-04-10 Bioniz, Llc Kompozicijos, skirtos gama-c-citokino aktyvumui moduliuoti
WO2015089217A2 (en) 2013-12-10 2015-06-18 Bionz, Llc Methods of developing selective peptide antagonists
EP2986312B1 (en) 2013-04-19 2021-12-15 Cytune Pharma Cytokine derived treatment with reduced vascular leak syndrome
MA39711A (fr) 2014-04-03 2015-10-08 Nektar Therapeutics Conjugués d'une fraction d'il-15 et d'un polymère
AU2015284248B2 (en) 2014-06-30 2020-04-16 Altor Bioscience Corporation IL-15-based molecules and methods of use thereof
US10333696B2 (en) 2015-01-12 2019-06-25 X-Prime, Inc. Systems and methods for implementing an efficient, scalable homomorphic transformation of encrypted data with minimal data expansion and improved processing efficiency
US11400134B2 (en) 2015-10-09 2022-08-02 Bioniz, Llc Modulating gamma-c-cytokine activity
MA45488A (fr) 2015-10-22 2018-08-29 Juno Therapeutics Gmbh Procédés, kits et appareil de culture de cellules
US11306140B2 (en) * 2016-01-07 2022-04-19 The Schepens Eye Research Institute, Inc. Therapeutics for ocular immunoinflammatory diseases
JP7185530B2 (ja) 2016-06-13 2022-12-07 トルク セラピューティクス， インコーポレイテッド 免疫細胞機能を促進するための方法および組成物
WO2018041989A1 (en) 2016-09-02 2018-03-08 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for diagnosing and treating refractory celiac disease type 2
WO2018073248A1 (en) 2016-10-17 2018-04-26 Icm (Institut Du Cerveau Et De La Moelle Épinière) Prognosis of demyelinating diseases patients and treatment thereof
CN118562016A (zh) 2016-10-21 2024-08-30 艾尔特生物科技公司 基于多聚体il-15的分子
AR110414A1 (es) 2016-12-21 2019-03-27 Cephalon Inc Anticuerpos que se unen específicamente a il-15 humana y usos de estos
CU24546B1 (es) 2016-12-30 2021-09-07 Ct Ingenieria Genetica Biotecnologia Composición vacunal que comprende un mutante de la interleucina-15 humana
CN111093688A (zh) 2017-05-15 2020-05-01 尼克塔治疗公司 长效白细胞介素-15受体激动剂以及相关免疫治疗组合物和方法
EP3678701A4 (en) 2017-09-05 2021-12-01 Torque Therapeutics, Inc. THERAPEUTIC PROTEIN COMPOSITIONS AND METHOD FOR MANUFACTURING AND USING THEREOF
CU24545B1 (es) 2017-12-29 2021-09-07 Ct Ingenieria Genetica Biotecnologia Péptido antagonista de la actividad de la interleucina-15
WO2020227019A1 (en) 2019-05-03 2020-11-12 Bioniz, Llc Modulating the effects of gamma-c-cytokine signaling for the treatment of alopecia and alopecia associated disorders
TW202128757A (zh) 2019-10-11 2021-08-01 美商建南德克公司 具有改善之特性的 PD-1 標靶 IL-15/IL-15Rα FC 融合蛋白
WO2023086772A1 (en) 2021-11-12 2023-05-19 Xencor, Inc. Bispecific antibodies that bind to b7h3 and nkg2d
WO2024102636A1 (en) 2022-11-07 2024-05-16 Xencor, Inc. Bispecific antibodies that bind to b7h3 and mica/b

Family Cites Families (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ZA811368B (en) 1980-03-24 1982-04-28 Genentech Inc Bacterial polypedtide expression employing tryptophan promoter-operator
US4411993A (en) 1981-04-29 1983-10-25 Steven Gillis Hybridoma antibody which inhibits interleukin 2 activity
NZ201705A (en) 1981-08-31 1986-03-14 Genentech Inc Recombinant dna method for production of hepatitis b surface antigen in yeast
US4853332A (en) * 1982-10-19 1989-08-01 Cetus Corporation Structural genes, plasmids and transformed cells for producing cysteine depleted muteins of biologically active proteins
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4703004A (en) 1984-01-24 1987-10-27 Immunex Corporation Synthesis of protein with an identification peptide
US5206344A (en) * 1985-06-26 1993-04-27 Cetus Oncology Corporation Interleukin-2 muteins and polymer conjugation thereof
US5071972A (en) 1986-01-31 1991-12-10 Genetics Institute, Inc. DNA sequences encoding novel thrombolytic proteins
EP0276846A3 (en) 1987-01-29 1989-07-26 Zymogenetics, Inc. Colony-stimulating factor derivatives
AU643427B2 (en) 1988-10-31 1993-11-18 Immunex Corporation Interleukin-4 receptors
US5208020A (en) * 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5350683A (en) 1990-06-05 1994-09-27 Immunex Corporation DNA encoding type II interleukin-1 receptors
ATE158021T1 (de) 1990-08-29 1997-09-15 Genpharm Int Produktion und nützung nicht-menschliche transgentiere zur produktion heterologe antikörper
GEP20033082B (en) * 1991-03-15 2003-10-27 Amgen Inc Pegylation of Polypeptides
US5440021A (en) * 1991-03-29 1995-08-08 Chuntharapai; Anan Antibodies to human IL-8 type B receptor
GB9223377D0 (en) 1992-11-04 1992-12-23 Medarex Inc Humanized antibodies to fc receptors for immunoglobulin on human mononuclear phagocytes
EP0627932B1 (en) 1992-11-04 2002-05-08 City Of Hope Antibody construct
US5552303A (en) * 1993-03-08 1996-09-03 Immunex Corporation DNA encoding epithelium-derived T-cell factor
US5747024A (en) * 1993-03-08 1998-05-05 Immunex Corporation Vaccine adjuvant comprising interleukin-15
US5574138A (en) * 1993-03-08 1996-11-12 Immunex Corporation Epithelium-derived T-cell factor
US5591630A (en) * 1994-05-06 1997-01-07 Immunex Corporation Monoclonal antibodies that bind interleukin-15 receptors
US5696234A (en) * 1994-08-01 1997-12-09 Schering Corporation Muteins of mammalian cytokine interleukin-13
US5795966A (en) * 1995-02-22 1998-08-18 Immunex Corp Antagonists of interleukin-15
DE69637481T2 (de) † 1995-04-27 2009-04-09 Amgen Fremont Inc. Aus immunisierten Xenomäusen stammende menschliche Antikörper gegen IL-8
AU2466895A (en) † 1995-04-28 1996-11-18 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice

Also Published As

Publication number Publication date
JPH11500908A (ja) 1999-01-26
EP1770163A2 (en) 2007-04-04
ES2271951T3 (es) 2007-04-16
FI20060080A (fi) 2006-01-27
EP0811065B2 (en) 2010-06-30
FI973361A0 (fi) 1997-08-15
NZ303843A (en) 1999-04-29
US6177079B1 (en) 2001-01-23
DK0811065T3 (da) 2006-11-20
CA2210491A1 (en) 1996-08-29
FI973361A (fi) 1997-10-15
US5795966A (en) 1998-08-18
US6168783B1 (en) 2001-01-02
FI121571B (fi) 2011-01-14
EP1770163A3 (en) 2008-10-22
KR19980702238A (ko) 1998-07-15
DE69636538D1 (de) 2006-10-26
NO973705D0 (no) 1997-08-12
AU5027596A (en) 1996-09-11
DE69636538T2 (de) 2007-05-16
US6165466A (en) 2000-12-26
AU708549B2 (en) 1999-08-05
ATE339505T1 (de) 2006-10-15
NO321990B1 (no) 2006-07-31
MX9706294A (es) 1997-10-31
CA2637795C (en) 2011-01-18
EP0811065B1 (en) 2006-09-13
NO20060194L (no) 1997-10-22
ES2271951T5 (es) 2010-11-29
NO973705L (no) 1997-10-22
EP0811065A1 (en) 1997-12-10
JP2008133276A (ja) 2008-06-12
CA2210491C (en) 2008-11-18
DE69636538T3 (de) 2010-10-28
CA2637795A1 (en) 1996-08-29
WO1996026274A1 (en) 1996-08-29
US6013480A (en) 2000-01-11
DK0811065T4 (da) 2010-08-23
PT811065E (pt) 2007-01-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI120497B (fi) Interleukiini-15-antagonisteja
US7763434B2 (en) Antagonists of interleukin-15
KR100607609B1 (ko) Ｉｌ-2 선택성 작용제 및 길항제
KR102219124B1 (ko) 비글리코실화 Fc-함유 폴리펩티드
WO2015103928A1 (zh) Il-15异源二聚体蛋白及其用途
US20100041586A1 (en) Method of improving efficacy of biological response-modifying proteins and the exemplary muteins
JP2000103799A (ja) 巨核球の成長と分化を刺激するｍｇｄｆの誘導体とその製造方法
CN1382158A (zh) 多细胞因子－抗体复合物
CA2210724A1 (en) Human interleukin-1 receptor accessory protein
JP2008528039A (ja) Ｉｌ−３１の均質調製物
NZ234479A (en) Antagonists of gm-csf derived from the carboxyl terminus, antibodies, hybridomas and pharmaceutical compositions containing anti-idiotypic antibodies
WO2007075899A2 (en) Dual agonist compounds and uses thereof
WO1997010338A1 (en) Improved interleukin-6 receptor antagonist
WO1997010338A9 (en) Improved interleukin-6 receptor antagonist
CA2157785A1 (en) Pharmaceutical compositions comprising soluble interleukin-4 receptor and interleukin-4
CA2255906A1 (en) Human interleukin-1j and antagonists thereof
KR20220077590A (ko) Candida Utilis 유래 요산산화효소-알부민 복합체 및 이의 제조 방법

Legal Events

Date Code Title Description
FG Patent granted

Ref document number: 120497

Country of ref document: FI

MM Patent lapsed